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課題

化合物のDNAコードライブラリー、ならびにそのようなライブラリーの使用および作成方法の提供。

解決手段

オリゴヌクレオチド-コードされた化学実体を含む第1のライブラリーをタグ付けする方法、及びタグ付けしたライブラリーを提供する方法であり、第1官能基と第2官能基とを有し、少なくとも1つの2'-置換ヌクレオチドを含むヘッドピースを提供する工程、及び化学実体の前記第1構成成分に直接接続されるか、又は前記ヘッドピースは前記第2官能性リンカーによって前記第1構成成分に間接的に接続される前記ヘッドピースの第1官能基を結合させる工程、及び複合体を形成するよう、第1ビルディングブロックタグに前記ヘッドピースの前記第2官能基を結合させる工程を含む。

概要

背景

DNAコードされたコンビナトリアルライブラリーは、創薬のための多くの利点をもたらす。こうしたライブラリーは、迅速にスクリーニングして問い合わせる(interrogate)ことができる、数多くの多様な化合物を提供することが可能である。複雑さをさらに高めるために、創薬プロセスのさまざまな工程をプログラム化して自動化することができる。これらの工程には、原子または多原子足場ビルディングブロックを付加するための多段階スプリットアンドプール(split-and-pool)合成の使用、ならびに合成工程とビルディングブロックの両方をコードするDNAタグを付加するための酵素的および/または化学的ライゲーションの使用が含まれる。

これらの利点にもかかわらず、非常に大規模なまたは複雑なライブラリーを合成しかつデコンボリューションする必要がある場合には、非常に多くの問題が発生しうる。ライブラリーのサイズが大きくなるにつれて、タグライゲーションの高収率を提供するために、改善された方法が必要とされる。多様な反応条件下でライブラリーを作成するためには、安定したライゲートヌクレオチド構築物、例えば高pHおよび高温の条件下で安定である構築物など、が有益であろう。タグのデコンボリューションを簡略化するために、タグの配列はDNAまたはRNA依存性ポリメラーゼにより認識することが可能であり、その結果、タグ集団デモグラフィック(demographic)は鋳型依存的重合および配列決定により確定することができる。これらの有益な特質のすべてを備えたライブラリーを作成する際にはさまざまな困難が生じうる。したがって、DNAコードライブラリーにおいて小さい化合物をスクリーニングして同定するための、改善された、よりロバストな方法の必要性が存在している。

概要

化合物のDNAコードライブラリー、ならびにそのようなライブラリーの使用および作成方法の提供。オリゴヌクレオチド-コードされた化学実体を含む第1のライブラリーをタグ付けする方法、及びタグ付けしたライブラリーを提供する方法であり、第1官能基と第2官能基とを有し、少なくとも1つの2'-置換ヌクレオチドを含むヘッドピースを提供する工程、及び化学実体の前記第1構成成分に直接接続されるか、又は前記ヘッドピースは前記第2官能性リンカーによって前記第1構成成分に間接的に接続される前記ヘッドピースの第1官能基を結合させる工程、及び複合体を形成するよう、第1ビルディングブロックタグに前記ヘッドピースの前記第2官能基を結合させる工程を含む。なし

目的

こうしたライブラリーは、迅速にスクリーニングして問い合わせる(interrogate)ことができる、数多くの多様な化合物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

オリゴヌクレオチド-コードされた化学実体(chemical entity)を含む第1のライブラリータグ付けする方法であって:(i)第1官能基と第2官能基とを有するヘッドピースを提供する工程であって、ここで、該ヘッドピースは少なくとも1つの2'-置換ヌクレオチドを含む、工程;(ii)該化学実体の第1構成成分に該ヘッドピースの第1官能基を結合させる工程であって、ここで、該ヘッドピースは第1構成成分に直接接続されるか、または該ヘッドピースは2官能性リンカーによって第1構成成分に間接的に接続される、工程;および(iii)複合体を形成するよう、第1ビルディングブロックタグに該ヘッドピースの第2官能基を結合させる工程を含み、ここで、工程(ii)および(iii)は任意の順序で実施することができ、かつ第1ビルディングブロックタグは工程(ii)の結合反応をコードしており、それによって、タグ付けしたライブラリーを提供する、方法。

請求項2

前記ヘッドピースが、該ヘッドピースの5'末端、3'末端、または内部位置の1つ以上に2'-置換ヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。

請求項3

前記ヘッドピースが、5'末端または3'末端に2'-置換ヌクレオチドおよび第2官能基を含む、請求項2記載の方法。

請求項4

第1ビルディングブロックタグが少なくとも1つの2'-置換ヌクレオチドを含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。

請求項5

第1ビルディングブロックタグが、第1ビルディングブロックタグの5'末端、3'末端、または内部位置の1つ以上に2'-置換ヌクレオチドを含む、請求項4記載の方法。

請求項6

第1ビルディングブロックタグが、5'末端および3'末端の両方に2'-置換ヌクレオチドを含む、請求項5記載の方法。

請求項7

前記2'-O-置換ヌクレオチドが2'-O-メチルヌクレオチドまたは2'-フルオロヌクレオチドである、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。

請求項8

前記2'-O-置換ヌクレオチドが、2'-O-メチルグアニンまたは2'-O-メチルウラシルから選択される2'-O-メチルヌクレオチドである、請求項7記載の方法。

請求項9

前記2'-O-置換ヌクレオチドが、2'-フルオログアニンまたは2'-フルオロウラシルから選択される2'-フルオロヌクレオチドである、請求項7記載の方法。

請求項10

第1ビルディングブロックタグが3'末端または5'末端に保護基を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。

請求項11

工程(ii)が、前記ヘッドピースを直接、第1構成成分に結合させることを含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。

請求項12

前記構成成分が足場または第1ビルディングブロックである、請求項11記載の方法。

請求項13

工程(ii)が、前記ヘッドピースを間接的に、2官能性リンカーを介して第1構成成分に結合させることを含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。

請求項14

前記ヘッドピースを前記リンカーの第1官能基と結合させること、および第1構成成分を前記リンカーの第2官能基と結合させることを含む、請求項13記載の方法。

請求項15

第1構成成分が足場または第1ビルディングブロックである、請求項14記載の方法。

請求項16

(iv)前記複合体の5'末端または3'末端に第2ビルディングブロックタグを結合させる工程;および(v)第1構成成分に前記化学ライブラリーの第2構成成分を結合させる工程をさらに含み、ここで、工程(iv)および(v)は任意の順序で実施することができる、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。

請求項17

工程(iv)が、前記複合体の5'末端に第2ビルディングブロックタグを結合させることを含み;前記複合体が5'末端にリン酸基を含み;かつ第2ビルディングブロックタグが3'および5'末端の両方にヒドロキシル基を含む、請求項16記載の方法。

請求項18

工程(iv)が、前記複合体を精製すること、および前記複合体をポリヌクレオチドキナーゼと反応させて、第2ビルディングブロックタグを結合させる前に、5'末端にリン酸基を形成させること、をさらに含む、請求項17記載の方法。

請求項19

工程(iv)が、前記複合体の3'末端に第2ビルディングブロックタグを結合させることを含み;前記複合体が3'末端に保護基を含み;かつ第2ビルディングブロックタグが5'末端にリン酸基および3'末端に保護基を含む、請求項16記載の方法。

請求項20

工程(iv)が、前記複合体に第2ビルディングブロックタグを結合させる前に、前記複合体から前記保護基を放出させるために、前記複合体を加水分解剤と反応させることをさらに含む、請求項19記載の方法。

請求項21

第2ビルディングブロックタグが、第2ビルディングブロックタグの5'末端、3'末端、または内部位置の1つ以上に2'-置換ヌクレオチドを含む、請求項16〜20のいずれか一項記載の方法。

請求項22

第2構成成分が第1ビルディングブロックまたは第2ビルディングブロックである、請求項16〜21のいずれか一項記載の方法。

請求項23

工程(iv)が、前記複合体に第2ビルディングブロックタグを結合させるためのRNAリガーゼおよび/またはDNAリガーゼを含む、請求項16〜22のいずれか一項記載の方法。

請求項24

工程(iv)がRNAリガーゼを含み、かつ該RNAリガーゼがT4 RNAリガーゼである、請求項23記載の方法。

請求項25

工程(iv)がDNAリガーゼを含み、かつ該DNAリガーゼがssDNAリガーゼである、請求項23記載の方法。

請求項26

工程(iv)がRNAリガーゼおよびDNAリガーゼを含む、請求項23記載の方法。

請求項27

工程(iii)が、第1ビルディングブロックタグに前記ヘッドピースを結合させるためのRNAリガーゼおよび/またはDNAリガーゼを含む、請求項1〜26のいずれか一項記載の方法。

請求項28

工程(iii)がRNAリガーゼを含み、かつ該RNAリガーゼがT4 RNAリガーゼである、請求項27記載の方法。

請求項29

工程(iii)がDNAリガーゼを含み、かつ該DNAリガーゼがssDNAリガーゼである、請求項27記載の方法。

請求項30

工程(iii)がRNAリガーゼおよびDNAリガーゼを含む、請求項27記載の方法。

請求項31

工程(iii)および/または、存在する場合、工程(iv)が、ポリエチレングリコールおよび/または1種以上の可溶性多価カチオンを含む、請求項1〜30のいずれか一項記載の方法。

請求項32

工程(iii)および/または、存在する場合、工程(iv)が、前記ポリエチレンを約25%(w/v)〜約35%(w/v)の量で含む、請求項31記載の方法。

請求項33

前記ポリエチレングリコールが約3,000〜約5,500ダルトンの平均分子量を有する、請求項32記載の方法。

請求項34

前記ポリエチレングリコールが約4,600ダルトンの平均分子量を有する、請求項33記載の方法。

請求項35

工程(iii)および/または、存在する場合、工程(iv)が、1種以上の可溶性多価カチオンを約0.05mM〜約10.5mMの量で含む、請求項31〜34のいずれか一項記載の方法。

請求項36

1種以上の多価カチオンが、塩化マグネシウム塩化マンガン(II)、およびヘキサミン塩化コバルト(III)からなる群より選択される、請求項35記載の方法。

請求項37

1種以上の多価カチオンが約0.5mM〜約1.5mMの量である、請求項35または36記載の方法。

請求項38

結合させる工程(ii)〜(v)のいずれか1つの工程の前に、未反応タグまたは未反応ヘッドピースから前記複合体を分離することをさらに含む、請求項1〜37のいずれか一項記載の方法。

請求項39

結合させる工程(ii)〜(v)のいずれか1つの工程の前に、前記複合体を精製することをさらに含む、請求項1〜38のいずれか一項記載の方法。

請求項40

前記複合体に1つ以上の追加のビルディングブロックタグを結合させること、および前記複合体に1つ以上の追加の構成成分を結合させることをさらに含む、請求項1〜39のいずれか一項記載の方法。

請求項41

前記ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、プレアデニル化5'末端を含む、請求項1〜40のいずれか一項記載の方法。

請求項42

前記ヘッドピースがヘアピン構造を含む、請求項1〜41のいずれか一項記載の方法。

請求項43

前記ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、5〜20個のヌクレオチドを含む、請求項1〜42のいずれか一項記載の方法。

請求項44

第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、ほぼ同じ質量を有する、請求項43記載の方法。

請求項45

前記ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、第1のライブラリー識別配列をさらに含む、請求項1〜44のいずれか一項記載の方法。

請求項46

第1のライブラリー識別タグを前記複合体に結合させることをさらに含む、請求項1〜44のいずれか一項記載の方法。

請求項47

第2のライブラリーを提供すること、および第1のライブラリーを第2のライブラリーと組み合わせることをさらに含む、請求項45または46記載の方法。

請求項48

前記ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、使用配列および/または起源配列をさらに含む、請求項1〜47のいずれか一項記載の方法。

請求項49

前記複合体に使用タグおよび/または起源タグを結合させることをさらに含む、請求項1〜47のいずれか一項記載の方法。

請求項50

前記複合体にテイルピースを結合させることをさらに含む、請求項1〜49のいずれか一項記載の方法。

請求項51

オリゴヌクレオチド-コードされた化学実体を含む第1のライブラリーをタグ付けする方法であって:(i)第1官能基と第2官能基を有するヘッドピースを提供する工程であって、ここで、該ヘッドピースは、5'末端に2'-置換ヌクレオチド、任意でヘッドピースの内部位置に1個以上のヌクレオチド、ならびに3'末端で2'位置および/または3'位置に保護基を含む、工程;(ii)該化学実体の第1構成成分に該ヘッドピースの第1官能基を結合させる工程であって、ここで、該ヘッドピースは第1構成成分に直接接続されるか、または該ヘッドピースは2官能性リンカーによって第1構成成分に間接的に接続される、工程;および(iii)第1ビルディングブロックタグに該ヘッドピースの第2官能基を結合させる工程であって、ここで、第1ビルディングブロックタグは、5'末端に2'-置換ヌクレオチドおよびヒドロキシル基、任意で該タグの内部位置に1個以上のヌクレオチド、ならびに3'末端に2'-置換ヌクレオチドおよびヒドロキシル基を含む、工程を含み、ここで、工程(ii)および(iii)は任意の順序で実施することができ、かつ第1ビルディングブロックタグは工程(ii)の結合反応をコードしており、それによって、タグ付けしたライブラリーを提供する、方法。

請求項52

前記2'-置換ヌクレオチドが2'-O-メチルヌクレオチドである2'-O-メチルグアニンである、請求項51記載の方法。

請求項53

前記1個以上のヌクレオチドが前記ヘッドピースの内部位置に存在する、請求項51または52記載の方法。

請求項54

前記1個以上のヌクレオチドが前記タグの内部位置に存在する、請求項51〜53のいずれか一項記載の方法。

請求項55

前記ヘッドピースおよび/または前記タグの1個以上のヌクレオチドが1個以上の2'-デオキシヌクレオチドである、請求項53または54記載の方法。

請求項56

工程(iii)が、1種以上の可溶性多価カチオン、ポリエチレングリコール、およびRNAリガーゼを含む、請求項51〜55のいずれか一項記載の方法。

請求項57

前記ポリエチレングリコールが約4,600ダルトンの平均分子量を有し、かつ前記RNAリガーゼがT4 RNAリガーゼである、請求項56記載の方法。

請求項58

1種以上の多価カチオンが、塩化マグネシウム、塩化マンガン(II)、およびヘキサミン塩化コバルト(III)からなる群より選択される、請求項56または57記載の方法。

請求項59

前記ヘッドピースおよび/または第1ビルディングブロックタグが5〜20個のヌクレオチドを含む、請求項51〜57のいずれか一項記載の方法。

請求項60

第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、ほぼ同じ質量を有する、請求項59記載の方法。

請求項61

前記ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、第1のライブラリー識別配列をさらに含む、請求項51〜60のいずれか一項記載の方法。

請求項62

前記複合体に第1のライブラリー識別タグを結合させることをさらに含む、請求項51〜60のいずれか一項記載の方法。

請求項63

第2のライブラリーを提供すること、および第1のライブラリーを第2のライブラリーと組み合わせることをさらに含む、請求項61または62記載の方法。

請求項64

前記ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、使用配列または起源配列をさらに含む、請求項51〜63のいずれか一項記載の方法。

請求項65

前記複合体に使用タグおよび/または起源タグを結合させることをさらに含む、請求項51〜63のいずれか一項記載の方法。

請求項66

前記複合体にテイルピースを結合させることをさらに含む、請求項51〜65のいずれか一項記載の方法。

請求項67

前記2'-置換ヌクレオチドが、2'-O-メチルグアニン、2'-O-メチルウラシル、2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルチミジン、2'-O-メチルイノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルジアミノプリン、2'-フルオログアニン、2'-フルオロウラシル、2'-フルオロアデノシン、2'-フルオロチミジン、2'-フルオロイノシン、2'-フルオロシチジン、および2'-フルオロジアミノプリンからなる群より選択される、請求項1または51記載の方法。

請求項68

複数のヘッドピースを含む、請求項1〜67のいずれか一項記載の方法。

請求項69

前記複数のヘッドピースの各ヘッドピースが、同一の配列領域および異なるコード領域を含む、請求項68記載の方法。

請求項70

前記同一の配列領域がプライマー結合領域である、請求項69記載の方法。

請求項71

前記異なるコード領域が、前記ヘッドピースまたは初期構成成分の付加をコードする、初期ビルディングブロックタグである、請求項69または70記載の方法。

請求項72

工程(ii)〜(iv)の少なくとも1つにおける前記結合させる工程が、存在する場合、酵素的ライゲーションを含む、請求項1〜71のいずれか一項記載の方法。

請求項73

前記酵素的ライゲーションがRNAリガーゼおよび/またはDNAリガーゼの使用を含む、請求項72記載の方法。

請求項74

工程(ii)〜(iv)の少なくとも1つにおける前記結合させる工程が、存在する場合、化学的ライゲーションを含む、請求項1〜73のいずれか一項記載の方法。

請求項75

前記化学的ライゲーションが1つ以上の化学的共反応対の使用を含む、請求項74記載の方法。

請求項76

前記化学的共反応対が、置換されていてもよいアルキニル基と置換されていてもよいアジド基である、請求項75記載の方法。

請求項77

前記化学的共反応対が、ホスホロチオエート基とヨード基である、請求項75記載の方法。

請求項78

ホスホロチオエート基がオリゴヌクレオチドの5'末端にあり、かつヨード基がオリゴヌクレオチドの3'末端にある、請求項77記載の方法。

請求項79

前記化学的ライゲーションが、前記化学的共反応対間の結合反応においてスプリント・オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項77または78記載の方法。

請求項80

前記化学的共反応対が約4〜約24原子の長さを有するスペーサーをもたらす、請求項75〜79のいずれか一項記載の方法。

請求項81

前記スペーサーが約4〜約10原子の長さを有する、請求項80記載の方法。

請求項82

1つ以上のビルディングブロックタグの化学的ライゲーションが、逐次ビルディングブロックタグをライゲートするためのオルソゴナルな化学的共反応対を含む、請求項74〜81のいずれか一項記載の方法。

請求項83

前記オルソゴナルな化学的共反応対が、(i)置換されていてもよいアルキニル基と置換されていてもよいアジド基、および(ii)ホスホロチオエート基とヨード基を含む、請求項82記載の方法。

請求項84

前記複合体、前記ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、3'末端の末端ヌクレオチドと該末端ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドとの間に修飾リン酸基を含む、請求項1〜83のいずれか一項記載の方法。

請求項85

ヘッドピースおよびビルディングブロックタグを含む複合体であって、該タグが5〜20個のヌクレオチド、5'末端の2'-置換ヌクレオチド、および3'末端の2'-置換ヌクレオチドを含む、複合体。

請求項86

5'末端および/または3'末端の2'-置換ヌクレオチドが2'-O-メチルヌクレオチドまたは2'-フルオロヌクレオチドである、請求項85記載の複合体。

請求項87

前記ヘッドピースがヘアピン構造を含む、請求項85または86記載の複合体。

請求項88

前記ヘッドピースが、該ヘッドピースの5'末端、3'末端、または内部位置の1つ以上に2'-置換ヌクレオチドを含む、請求項85〜87のいずれか一項記載の複合体。

請求項89

前記ヘッドピースがプレアデニル化5'末端をさらに含む、請求項85〜88のいずれか一項記載の複合体。

請求項90

前記2'-置換ヌクレオチドが2'-O-メチルヌクレオチドまたは2'-フルオロヌクレオチドである、請求項85〜89のいずれか一項記載の複合体。

請求項91

前記2'-置換ヌクレオチドが、2'-O-メチルグアニン、2'-O-メチルウラシル、2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルチミジン、2'-O-メチルイノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルジアミノプリン、2'-フルオログアニン、2'-フルオロウラシル、2'-フルオロアデノシン、2'-フルオロチミジン、2'-フルオロイノシン、2'-フルオロシチジン、および2'-フルオロジアミノプリンからなる群より選択される、請求項90記載の複合体。

請求項92

テイルピースをさらに含む、請求項85〜91のいずれか一項記載の複合体。

請求項93

前記複合体、前記ヘッドピース、または前記ビルディングブロックタグが、3'末端の末端ヌクレオチドと該末端ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドとの間に修飾リン酸基を含む、請求項85〜92のいずれか一項記載の複合体。

請求項94

前記複合体がホスホロチオエートまたはトリアゾール基を含む、請求項85〜93のいずれか一項記載の複合体。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2011年9月7日に出願された米国仮出願第61/531,820号および2011年9月20日に出願された同第61/536,929号の恩典を主張するものであり、これらの各々は参照により本明細書に組み入れられる。

0002

一般的に、本発明は、化合物のDNAコードライブラリー、ならびにそのようなライブラリーの使用および作成方法に関する。本発明はまた、そのようなライブラリーで使用するための組成物に関する。

背景技術

0003

DNAコードされたコンビナトリアルライブラリーは、創薬のための多くの利点をもたらす。こうしたライブラリーは、迅速にスクリーニングして問い合わせる(interrogate)ことができる、数多くの多様な化合物を提供することが可能である。複雑さをさらに高めるために、創薬プロセスのさまざまな工程をプログラム化して自動化することができる。これらの工程には、原子または多原子足場ビルディングブロックを付加するための多段階スプリットアンドプール(split-and-pool)合成の使用、ならびに合成工程とビルディングブロックの両方をコードするDNAタグを付加するための酵素的および/または化学的ライゲーションの使用が含まれる。

0004

これらの利点にもかかわらず、非常に大規模なまたは複雑なライブラリーを合成しかつデコンボリューションする必要がある場合には、非常に多くの問題が発生しうる。ライブラリーのサイズが大きくなるにつれて、タグライゲーションの高収率を提供するために、改善された方法が必要とされる。多様な反応条件下でライブラリーを作成するためには、安定したライゲートヌクレオチド構築物、例えば高pHおよび高温の条件下で安定である構築物など、が有益であろう。タグのデコンボリューションを簡略化するために、タグの配列はDNAまたはRNA依存性ポリメラーゼにより認識することが可能であり、その結果、タグ集団デモグラフィック(demographic)は鋳型依存的重合および配列決定により確定することができる。これらの有益な特質のすべてを備えたライブラリーを作成する際にはさまざまな困難が生じうる。したがって、DNAコードライブラリーにおいて小さい化合物をスクリーニングして同定するための、改善された、よりロバストな方法の必要性が存在している。

0005

本発明は、ライブラリーを作成する方法(この方法はタグの一本鎖ライゲーションを改善する1つ以上の条件を含む)、およびライブラリーを作成する際に用いるための組成物を特徴とする。典型的な条件には、タグ内での1つ以上の2'-置換塩基(例えば、2'-O-メチルまたは2'-フルオロ)の使用;特定の長さのタグの使用;1種以上の酵素の使用;任意で、タグ設計におけるエラー認識機能の包含;および/またはライゲーション時の1種以上の剤の使用が含まれる。

0006

したがって、本発明は、オリゴヌクレオチド-コードされた化学実体(chemical entity)を含む第1のライブラリーをタグ付けする方法を特徴とし、該方法は以下の工程を含む:(i)第1官能基と第2官能基を有するヘッドピースを提供する工程、ここで、該ヘッドピースは少なくとも1つの2'-置換ヌクレオチドを含む;(ii)該ヘッドピースの第1官能基を化学実体の第1構成成分に結合させる工程、ここで、該ヘッドピースは第1構成成分に直接接続されるか、または該ヘッドピースは2官能性リンカー(例えば、ポリエチレングリコールリンカーまたは-(CH2CH2O)nCH2CH2-、ここでnは1〜50の整数である)によって第1構成成分に間接的に接続される;および(iii)該ヘッドピースの第2官能基を第1ビルディングブロックタグに結合させて複合体を形成する工程、ここで、工程(ii)および(iii)は任意の順序で実施することができ、第1ビルディングブロックタグは工程(ii)の結合反応をコードしており、それによってタグ付けしたライブラリーを提供する。

0007

いくつかの態様では、ヘッドピースは2'-置換ヌクレオチドをヘッドピースの5'末端、3'末端、または内部位置の1つ以上に含む。特定の態様では、ヘッドピースは2'-置換ヌクレオチドと第2官能基を5'末端または3'末端に含む。

0008

他の態様では、第1ビルディングブロックタグは、少なくとも1個(例えば、少なくとも2、3、4、5個、もしくはそれ以上)の2'-置換ヌクレオチドを含む。特定の態様では、第1ビルディングブロックタグは、2'-置換ヌクレオチドを第1ビルディングブロックタグの5'末端、3'末端、または内部位置の1つ以上に(例えば、2'-O-メチルヌクレオチドまたは2'-フルオロヌクレオチドを5'末端と3'末端の両方に)含む。いくつかの態様では、第1ビルディングブロックタグは、3'末端または5'末端に保護基を含む。

0009

本明細書に記載のいずれの態様でも、2'-置換ヌクレオチドは、2'-O-メチルヌクレオチド(例えば、2'-O-メチルグアニンもしくは2'-O-メチルウラシル)または2'-フルオロヌクレオチド(例えば、2'-フルオログアニンもしくは2'-フルオロウラシル)である。

0010

上記のいずれの態様でも、工程(ii)は、ヘッドピースを直接、第1構成成分(例えば、足場もしくは第1ビルディングブロック)に接合させる、結合させる、または機能的に会合させることを含み得る。さらに他の態様では、工程(ii)は、ヘッドピースを間接的に、2官能性リンカーを介して第1構成成分(例えば、足場もしくは第1ビルディングブロック)に結合させることを含む(該方法は、ヘッドピースを該リンカーの第1官能基と結合させること、および第1構成成分を該リンカーの第2官能基と結合させることを含む)。

0011

上記のいずれの態様でも、前記方法はさらに、(iv)第2ビルディングブロックタグを該複合体の5'末端または3'末端に結合させる工程;および(v)該化合物ライブラリーの第2構成成分(例えば、第1ビルディングブロックもしくは第2ビルディングブロック)を第1構成成分に結合させる工程を含むことができ、ここで、工程(iv)および(v)は任意の順序で実施することができる。いくつかの態様では、第2ビルディングブロックタグは工程(v)の結合反応をコードする。他の態様では、工程(iv)は第2ビルディングブロックタグを該複合体の5'末端に結合させることを含み得る;該複合体は5'末端にリン酸基を含む;そして第2ビルディングブロックタグは3'および5'末端の両方にヒドロキシル基を含む。他の態様では、工程(iv)はさらに、該複合体を精製すること、および該複合体をポリヌクレオチドキナーゼと反応させて、第2ビルディングブロックタグを結合させる前に、その5'末端にリン酸基を形成させることを含み得る。他の態様では、工程(iv)は第2ビルディングブロックタグを該複合体の3'末端に結合させることを含み得る;該複合体は3'末端に保護基を含む;そして第2ビルディングブロックタグは5'末端にリン酸基および3'末端に保護基を含む。さらに他の態様では、工程(iv)はさらに、第2ビルディングブロックタグを該複合体に結合させる前に該複合体から保護基を放出させるために、該複合体を加水分解剤と反応させることを含み得る。

0012

さらなる態様において、第2ビルディングブロックタグは、2'-置換ヌクレオチド(例えば、2'-O-メチルヌクレオチドまたは2'-フルオロヌクレオチド)を第2ビルディングブロックタグの5'末端、3'末端、または内部位置の1つ以上に(例えば、2'-O-メチルヌクレオチドおよび/または2'-フルオロヌクレオチドを5'および3'末端の両方に)含む。

0013

いくつかの態様では、工程(iv)は、第2ビルディングブロックタグを複合体に結合させるためのRNAリガーゼ(例:T4 RNAリガーゼ)および/またはDNAリガーゼ(例:ssDNAリガーゼ)の使用を含み得る(例えば、RNAリガーゼとDNAリガーゼの両方の使用を含み得る)。

0014

他の態様では、工程(iii)は、ヘッドピースを第1ビルディングブロックタグに結合させるためのRNAリガーゼ(例:T4 RNAリガーゼ)および/またはDNAリガーゼ(例:ssDNAリガーゼ)の使用を含み得る(例えば、RNAリガーゼとDNAリガーゼの両方の使用を含み得る)。

0015

さらなる態様において、工程(iii)および/または存在する場合の工程(iv)は、ポリエチレングリコールおよび/または1種以上の可溶性多価カチオン(例えば、塩化マグネシウム塩化マンガン(II)、もしくはヘキサミン塩化コバルト(III))の使用を含むことができる。いくつかの態様では、ポリエチレングリコールは約25%(w/v)〜約35%(w/v)(例えば、約25%(w/v)〜約30%(w/v)、約30%(w/v)〜約35%(w/v)、または約30%(w/v))の量である。他の態様では、ポリエチレングリコールは約3,000〜約5,500ダルトン(例えば、約4,600ダルトン)の平均分子量を有する。他の態様では、1種以上の可溶性多価カチオンは、約0.05mM〜約10.5mM(例えば、0.05mM〜0.5mM、0.05mM〜0.75mM、0.05mM〜1.0mM、0.05mM〜1.5mM、0.05mM〜2.0mM、0.05mM〜3.0mM、0.05mM〜4.0mM、0.05mM〜5.0mM、0.05mM〜6.0mM、0.05mM〜7.0mM、0.05mM〜8.0mM、0.05mM〜9.0mM、0.05mM〜10.0mM、0.1mM〜0.5mM、0.1mM〜0.75mM、0.1mM〜1.0mM、0.1mM〜1.5mM、0.1mM〜2.0mM、0.1mM〜3.0mM、0.1mM〜4.0mM、0.1mM〜5.0mM、0.1mM〜6.0mM、0.1mM〜7.0mM、0.1mM〜8.0mM、0.1mM〜9.0mM、0.1mM〜10.0mM、0.1mM〜10.5mM、0.5mM〜0.75mM、0.5mM〜1.0mM、0.5mM〜1.5mM、0.5mM〜2.0mM、0.5mM〜3.0mM、0.5mM〜4.0mM、0.5mM〜5.0mM、0.5mM〜6.0mM、0.5mM〜7.0mM、0.5mM〜8.0mM、0.5mM〜9.0mM、0.5mM〜10.0mM、0.5mM〜10.5mM、0.75mM〜1.0mM、0.75mM〜1.5mM、0.75mM〜2.0mM、0.75mM〜3.0mM、0.75mM〜4.0mM、0.75mM〜5.0mM、0.75mM〜6.0mM、0.75mM〜7.0mM、0.75mM〜8.0mM、0.75mM〜9.0mM、0.75mM〜10.0mM、0.75mM〜10.5mM、1.0mM〜1.5mM、1.0mM〜2.0mM、1.0mM〜3.0mM、1.0mM〜4.0mM、1.0mM〜5.0mM、1.0mM〜6.0mM、1.0mM〜7.0mM、1.0mM〜8.0mM、1.0mM〜9.0mM、1.0mM〜10.0mM、1.0mM〜10.5mM、1.5mM〜2.0mM、1.5mM〜3.0mM、1.5mM〜4.0mM、1.5mM〜5.0mM、1.5mM〜6.0mM、1.5mM〜7.0mM、1.5mM〜8.0mM、1.5mM〜9.0mM、1.5mM〜10.0mM、1.5mM〜10.5mM、2.0mM〜3.0mM、2.0mM〜4.0mM、2.0mM〜5.0mM、2.0mM〜6.0mM、2.0mM〜7.0mM、2.0mM〜8.0mM、2.0mM〜9.0mM、2.0mM〜10.0mM、および2.0mM〜10.5mM)の量である。いくつかの態様では、1種以上の多価カチオンは約1mM(例えば、0.5mM〜1.5mM)の量である。特定の態様では、多価カチオンはヘキサアミン塩コバルト(III)の形態である。

0016

他の態様において、前記方法はさらに、結合工程(ii)〜(v)のいずれか1つの工程の前に、複合体を未反応タグまたは未反応ヘッドピースから分離することを含む。他の態様では、前記方法はさらに、結合工程(ii)〜(v)のいずれか1つの工程の前に、複合体を精製することを含む。他の態様では、前記方法はさらに、1つ以上の追加の構成成分(例えば、足場もしくは第1ビルディングブロック)および1つ以上の追加のビルディングブロックタグを、任意の順序でかつ結合工程(ii)〜(v)のいずれか1つの工程の後に、結合させることを含む。

0017

本発明はまた、オリゴヌクレオチド-コードされた化学実体を含む第1のライブラリーをタグ付けする方法を特徴とし、該方法は以下の工程を含む:(i)第1官能基と第2官能基を有するヘッドピースを提供する工程、ここで、該ヘッドピースは、5'末端に2'-置換ヌクレオチド、任意でヘッドピースの内部位置に1個以上のヌクレオチド、ならびに3'末端で2'位置および/または3'位置に保護基を含む;(ii)該ヘッドピースの第1官能基を化学実体の第1構成成分に結合させる工程、ここで、該ヘッドピースは第1構成成分に直接接続されるか、または該ヘッドピースは2官能性リンカーによって第1構成成分に間接的に接続される;および(iii)該ヘッドピースの第2官能基を第1ビルディングブロックタグに結合させる工程、ここで、第1ビルディングブロックタグは、5'末端に2'-置換ヌクレオチドおよびヒドロキシル基、任意で該タグの内部位置に1個以上のヌクレオチド、ならびに3'末端に2'-置換ヌクレオチドおよびヒドロキシル基を含む;ここで、工程(ii)および(iii)は任意の順序で実施することができ、第1ビルディングブロックタグは工程(ii)の結合反応をコードしており、それによって、タグ付けしたライブラリーを提供する。

0018

いくつかの態様では、2'-置換ヌクレオチドは、2'-O-メチルヌクレオチド(例:2'-O-メチルグアニン)または2'-フルオロヌクレオチド(例:2'-フルオログアニン)である。他の態様では、ヘッドピースの内部位置の1個以上のヌクレオチドは2'-デオキシヌクレオチドである。さらに他の態様では、2官能性リンカーはポリエチレングリコールリンカー(例えば、-(CH2CH2O)nCH2CH2-、ここでnは1〜50の整数である)である。

0019

他の態様では、1個以上のヌクレオチド(例えば、1個以上の2'-デオキシヌクレオチド)はヘッドピースまたはタグの内部位置に存在する。

0020

いくつかの態様では、工程(iii)は、1種以上の可溶性多価カチオン(例えば、塩化マグネシウム、塩化マンガン(II)、もしくはヘキサアミン塩化コバルト(III))、ポリエチレングリコール(例えば、約4,600ダルトンの平均分子量を有する)、およびRNAリガーゼ(例えば、T4 RNAリガーゼ)の使用を含むことができる。

0021

別の局面において、本発明は、化学実体を同定および/または発見する方法を特徴とし、該方法は、オリゴヌクレオチド-コードされた化学実体を含む第1のライブラリーをタグ付けする工程(例えば、工程(i)〜(iii)を含み、任意で工程(iv)〜(v)を含む)、および特性または機能について選択する工程(例えば、オリゴヌクレオチドでコードされた化学実体または化学実体をタンパク質標的に暴露し、該タンパク質標的に結合する1つ以上のオリゴヌクレオチドでコードされた化学実体または化学実体を(例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを用いることによって)選択することを含む、タンパク質標的への結合について選択する工程)を含む。本発明はまた、ヘッドピースおよびビルディングブロックタグを含む複合体を特徴とし、ここで、該タグは、5〜20個のヌクレオチド、5'末端の2'-置換ヌクレオチド、および3'末端の2'-置換ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、5'末端および/または3'末端の2'-置換ヌクレオチドは、2'-O-メチルヌクレオチド(例えば、2'-O-メチルグアニンもしくは2'-O-メチルウラシル)または2'-フルオロヌクレオチド(例えば、2'-フルオログアニンもしくは2'-フルオロウラシル)である。特定の態様では、ヘッドピースはヘアピン構造を含む。いくつかの態様では、ヘッドピースは該ヘッドピースの5'末端、3'末端、または内部位置の1つ以上に2'-置換ヌクレオチドを含む。他の態様では、ヘッドピースはプレアデニル化(preadenylated)5'末端をさらに含む。さらに他の態様では、ヘッドピースは5〜20個のヌクレオチドを含む。

0022

上記のいずれの態様でも、ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、または存在する場合の1つ以上の追加のビルディングブロックタグは、プレアデニル化5'末端を含む。

0023

上記のいずれの態様でも、前記方法はさらに、1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10)の追加のビルディングブロックタグを複合体に結合させること、および1つ以上(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10)の追加の構成成分(例えば、足場もしくはビルディングブロック)を複合体に結合させることを含み、ここで、1つ以上の追加のビルディングブロックタグは1つ以上の追加の構成成分をコードするか、または1つ以上の追加の構成成分の結合反応をコードし、それによって、タグ付けしたライブラリーを提供する。

0024

上記のいずれの態様でも、2'-置換ヌクレオチドは、2'-O-メチルヌクレオチド、例えば2'-O-メチルグアニン、2'-O-メチルウラシル、2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルチミジン、2'-O-メチルイノシン、2'-O-メチルシチジン、または2'-O-メチルジアミノプリンである。あるいは、上記のいずれの態様でも、2'-置換ヌクレオチドは、2'-フルオロヌクレオチド、例えば2'-フルオログアニン、2'-フルオロウラシル、2'-フルオロアデノシン、2'-フルオロチミジン、2'-フルオロイノシン、2'-フルオロシチジン、または2'-フルオロジアミノプリンである。

0025

上記のいずれの態様でも、RNAリガーゼはT4 RNAリガーゼであり、かつ/またはDNAリガーゼはssDNAリガーゼである。

0026

上記のいずれの態様でも、前記方法は複数のヘッドピースを含む。この方法のいくつかの態様では、複数のヘッドピースの各ヘッドピースは、同一の配列領域および異なるコード領域を含む。特定の態様では、同一の配列領域はプライマー結合領域である。他の態様では、異なるコード領域は、ヘッドピースまたは初期構成成分の付加をコードする、初期ビルディングブロックタグである。

0027

上記のいずれの態様でも、工程(ii)〜(iv)の少なくとも1つにおける結合は、存在する場合、酵素的ライゲーションおよび/または化学的ライゲーションを含む。いくつかの態様では、酵素的ライゲーションはRNAリガーゼ(例:T4 RNAリガーゼ)またはDNAリガーゼ(例:ssDNAリガーゼ)の使用を含む。他の態様では、酵素的ライゲーションはRNAリガーゼ(例:T4 RNAリガーゼ)とDNAリガーゼ(例:ssDNAリガーゼ)の使用を含む。いくつかの態様では、化学的ライゲーションは1つ以上の化学的共反応対の使用を含み、例えば、置換されていてもよいアルキニル基と置換されていてもよいアジド基とを含む対;4π電子系を有する置換されていてもよいジエン(例えば、置換されていてもよい1,3-不飽和化合物、例えば、置換されていてもよい1,3-ブタジエン、1-メトキシ-3-トリメチルシリルオキシ-1,3-ブタジエン、シクロペンタジエンシクロヘキサジエン、またはフラン)と2π電子系を有する置換されていてもよいジエノフィル(dienophile)または置換されていてもよいヘテロジエノフィル(例えば、置換されていてもよいアルケニル基または置換されていてもよいアルキニル基)とを含む対;求核試薬(例えば、置換されていてもよいアミンまたは置換されていてもよいチオール)と歪を有するヘテロシクリル求電子試薬(例えば、置換されていてもよいエポキシドアジリジンアジリジニウムイオン、またはエピスルホニウムイオン)とを含む対;ホスホロチオエート基とヨード基とを(例えば、3'末端にホスホロチオエート基および5'末端にヨード基を)含む対;あるいはアルデヒド基アミノ基(例えば、ヒドラジド基を含む、一級アミノもしくは二級アミノ基)とを含む対である。特定の態様では、化学的共反応対は、約4〜約24原子(例えば、約4〜約10原子)の長さを有する、結果として得られたスペーサーをもたらす。他の態様では、化学的ライゲーションは(例えば、3'末端の)ホスホロチオエート基および(例えば、5'末端の)ヨード基の使用を含む。さらなる態様では、化学的ライゲーションは結合反応においてスプリント(splint)オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、化学的ライゲーションは、ホスホロチオエート基(例えば、ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、存在する場合の1つ以上の追加のビルディングブロックタグ、ライブラリー識別タグ、使用タグ、および/または起源タグの3'末端にある)、ヨード基(例えば、ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、存在する場合の1つ以上の追加のビルディングブロックタグ、ライブラリー識別タグ、使用タグ、および/または起源タグの5'末端にある)、およびスプリント・オリゴヌクレオチドの結合反応における使用を含み、その際、該使用は1つ以上の保護基の使用を回避する。他の態様では、複数のタグの化学的ライゲーションは、逐次タグをライゲートするための、オルソゴナルな化学的共反応対(例えば、本明細書に記載の任意の2つ以上の化学的共反応対)の交互の使用を含む。

0028

上記のいずれの態様でも、ヘッドピースは一本鎖(例えば、ヘアピン)構造を含むことができる。

0029

上記のいずれの態様でも、ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、存在する場合の1つ以上の追加のビルディングブロックタグ、ライブラリー識別タグ、使用タグ、および/または起源タグは、本明細書に記載の任意の配列(例えば、配列番号6〜21、26、27、または29〜31のいずれか1つの配列)と実質的に同一(例えば、少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一)である配列、または本明細書に記載の任意の配列(例えば、配列番号6〜21、26、27、または29〜31のいずれか1つの配列)と実質的に同一(例えば、少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一)である配列に相補的な配列を含む。特定の態様では、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、存在する場合の1つ以上の追加のビルディングブロックタグ、ライブラリー識別タグ、使用タグ、および/または起源タグは、配列番号1または配列番号2の配列と実質的に同一(例えば、少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%同一)である配列をさらに含む。

0030

上記のいずれの態様でも、前記方法または複合体は一本鎖分子のみを含み、ここで、ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または1つ以上の追加のビルディングブロックタグは一本鎖である。いくつかの態様では、一本鎖分子の1つ以上はヘアピン構造を有する。特定の態様では、ヘッドピースはヘアピン構造を含み、1つ以上のビルディングブロックタグはヘアピン構造を含まない。

0031

上記のいずれの態様でも、前記方法はさらに、本明細書に記載されるように、ライブラリーを多様化するための、またはライブラリーのメンバーを問い合わせるための、1つ以上の任意の工程を含む。いくつかの態様では、前記方法はさらに、治療上関心のあるタンパク質と結合する、または該タンパク質を不活性化する、小さい薬物様ライブラリーメンバーを同定することを含む。他の態様では、前記方法はさらに、ライブラリーのメンバーを生物学的標的と、ライブラリーの少なくとも1つのメンバーが該標的に結合するのに適した条件下で接触させ、該標的に結合しない1つ以上のライブラリーメンバーを除去し、それらと会合した1つ以上のオリゴヌクレオチドタグ分析することを含む。

0032

本明細書に記載されるように、一本鎖分子(例えば、ヘアピン分子を含む)の使用は非常に多くの利点を有し得る。したがって、本明細書に記載されるいずれの態様でも、前記方法および複合体は、1つ以上の二本鎖分子(例えば、二本鎖ヘッドピースまたは二本鎖ビルディングブロックタグ)を含む方法と比較して、質量の低下、溶解性(例えば、有機溶媒中)の向上、コストの低下、反応性の増加、標的接近性の増加、流体力学半径の減少、および/または分析評価の精度向上を有する、ヘッドピース、1つ以上のビルディングブロックタグ、複合体、化学実体、分子、またはタグ付けしたライブラリーの任意のメンバーを含む。いくつかの態様では、ビルディングブロックタグ(例えば、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または存在する場合の1つ以上の追加のビルディングブロックタグ)の各々は、ほぼ同じ質量を有する(例えば、各ビルディングブロックタグは、2つ以上のビルディングブロックタグ間の平均質量から約+/-10%である質量を有する)。特定の態様では、ビルディングブロックタグは、二本鎖タグ(例えば、約15,000ダルトン未満、約14,000ダルトン、約13,000ダルトン、または約12,000ダルトンの質量を有する二本鎖タグ)と比較して、減少した質量(例えば、約15,000ダルトン、約14,000ダルトン、約13,000ダルトン、約12,000ダルトン、約11,000ダルトン、約10,000ダルトン、約9,000ダルトン、約8,000ダルトン、約7,500ダルトン、約7,000ダルトン、約6,000ダルトン、約6,500ダルトン、約5,000ダルトン、約5,500ダルトン、約4,000ダルトン、約4,500ダルトン、または約3,000ダルトン)を有する。他の態様では、ビルディングブロックタグは、二本鎖タグ(例えば、約20ヌクレオチド未満、約19ヌクレオチド未満、約18ヌクレオチド未満、約17ヌクレオチド未満、約16ヌクレオチド未満、約15ヌクレオチド未満、約14ヌクレオチド未満、約13ヌクレオチド未満、約12ヌクレオチド未満、約11ヌクレオチド未満、約10ヌクレオチド未満、約9ヌクレオチド未満、約8ヌクレオチド未満、または約7ヌクレオチド未満の長さを有する二本鎖タグ)と比較して、短縮された長さを有する。いくつかの態様では、1つ以上のビルディングブロックタグまたはライブラリーのメンバーは、(例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを用いた選択などの、選択工程において)プライマー結合領域および/または定常領域を欠く。いくつかの態様では、1つ以上のビルディングブロックタグまたはライブラリーのメンバーは、短縮された定常領域(例えば、約30ヌクレオチド未満、約25ヌクレオチド未満、約20ヌクレオチド未満、約19ヌクレオチド未満、約18ヌクレオチド未満、約17ヌクレオチド未満、約16ヌクレオチド未満、約15ヌクレオチド未満、約14ヌクレオチド未満、約13ヌクレオチド未満、約12ヌクレオチド未満、約11ヌクレオチド未満、約10ヌクレオチド未満、約9ヌクレオチド未満、約8ヌクレオチド未満、または約7ヌクレオチド未満の長さ)を有する。他の態様では、前記方法は、分子、化学実体の一部、工程の結合反応(例えば、化学的もしくは酵素的ライゲーション)、またはライブラリーの正体(identity)をコードするヘッドピースを含み、ここで、コードするヘッドピースは、このような情報をコードするための追加のビルディングブロックタグの必要性を排除する。

0033

上記のいずれの態様でも、オリゴヌクレオチド(例えば、ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または存在する場合の1つ以上の追加のビルディングブロックタグ)は、ライブラリーの正体をコードする。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド(例えば、ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または存在する場合の1つ以上の追加のビルディングブロックタグ)は、第1ライブラリー識別配列を含み、ここで、該配列は第1ライブラリーの正体をコードする。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは第1ライブラリー識別タグである。いくつかの態様では、前記方法は、第1ライブラリー識別タグを提供すること(ここで、該タグは第1ライブラリーをコードする配列を含む)、および/または第1ライブラリー識別タグを複合体に結合させることを含む。いくつかの態様では、前記方法は、第2ライブラリーを提供すること、および第1ライブラリーを第2ライブラリーと組み合わせることを含む。さらなる態様では、前記方法は、第2ライブラリー識別タグを提供することを含み、ここで、該タグは第2ライブラリーをコードする配列を含む。

0034

上記のいずれの態様でも、オリゴヌクレオチド(例えば、ヘッドピースおよび/または1つ以上のビルディングブロック)は、ライブラリーのメンバーの使用(例えば、本明細書に記載されるように、選択工程または結合工程での使用)をコードする。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド(例えば、ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または存在する場合の1つ以上の追加のビルディングブロックタグ)は、使用配列を含み、ここで、該配列は1つ以上の工程(例えば、選択工程および/または結合工程)でのライブラリー中のメンバーのサブセットの使用をコードする。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは使用配列を含む使用タグである。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド(例えば、ヘッドピースおよび/または1つ以上のビルディングブロック)は、(例えば、ライブラリーの特定の部分における)ライブラリーのメンバーの起源をコードする。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド(例えば、ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または存在する場合の1つ以上の追加のビルディングブロックタグ)は、起源配列(例えば、約10、9、8、7または6ヌクレオチドの長さを有するランダム縮重配列)を含み、ここで、該配列はライブラリーのメンバーの起源をコードする。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは起源配列を含む起源タグである。いくつかの態様では、前記方法はさらに、使用タグおよび/または起源タグを複合体に接合させる、結合させる、または機能的に会合させることを含む。

0035

上記のいずれの態様でも、前記方法、組成物および複合体は、任意で、テイルピースを含み、ここで、テイルピースは、本明細書に記載されるように、ライブラリー識別配列、使用配列、または起源配列の1つ以上を含む。特定の態様では、前記方法はさらに、テイルピース(例えば、ライブラリー識別配列、使用配列、または起源配列の1つ以上を含む)を複合体に接合させる、結合させる、または機能的に会合させることを含む。

0036

上記のいずれの態様でも、前記方法、組成物および複合体、またはそれらの部分(例えば、ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または存在する場合の1つ以上の追加のビルディングブロックタグ)は、3'末端の末端ヌクレオチドと該末端ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドの間に修飾リン酸基(例えば、ホスホチエエートまたは5'-N-ホスホルアミダイト結合)を含む。特定の態様では、修飾リン酸基は、修飾リン酸基を欠く2つのオリゴヌクレオチド(例えば、ヘッドピースとビルディングブロックタグまたは第1ビルディングブロックタグと第2ビルディングブロックタグ)間のライゲーションと比較して、2つのオリゴヌクレオチド間の酵素的ライゲーション時のシャッフリングを最小限に抑える(例えば、ヘッドピースとビルディングブロックタグ間または第1ビルディングブロックタグと第2ビルディングブロックタグ間などの、ライゲートされる2つのオリゴヌクレオチドの配列と比較して、最終生成物または複合体における付加的ヌクレオチドの包含またはヌクレオチドの切除を最小限に抑える)。いくつかの態様では、複合体はホスホロチエエートまたはトリアゾール基を含むことができる。

0037

上記のいずれの態様でも、前記方法、組成物および複合体、またはそれらの部分(例えば、ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または存在する場合の1つ以上の追加のビルディングブロックタグ)は、半水性低水性(reduced-aqueous)、または非水性(例えば、有機)条件における溶解性を支援する修飾を含む。いくつかの態様では、2官能性リンカー、ヘッドピース、または1つ以上のビルディングブロックタグは、前記DNAコードされた化合物ライブラリーのメンバーの有機条件における溶解性を高めるように修飾される。いくつかの態様では、修飾は、アルキル鎖ポリエチレングリコール単位正電荷を有する分岐種、または疎水性環構造の1つ以上である。いくつかの態様では、修飾は、疎水性部分を有する1つ以上の修飾ヌクレオチド(例えば、TまたはC塩基のC5位置で脂肪族鎖により修飾されたもの、例えば、5'-ジメトキシトリチル-N4-ジイソブチルアミノメチリデン-5-(1-プロピニル)-2'-デオキシシチジン,3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホルアミダイト;5'-ジメトキシトリチル-5-(1-プロピニル)-2'-デオキシウリジン,3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホルアミダイト;5'-ジメトキシトリチル-5-フルオロ-2'-デオキシウリジン,3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホルアミダイト;および5'-ジメトキシトリチル-5-(ピレン-1-イル-エチニル)-2'-デオキシウリジン,3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホルアミダイト)または疎水性部分(例えば、アゾベンゼン)を有する挿入を含む。いくつかの態様では、ライブラリーのメンバーは、約1.0〜約2.5のオクタノール:水係数(例えば、約1.0〜約1.5、約1.0〜約2.0、約1.3〜約1.5、約1.3〜約2.0、約1.3〜約2.5、約1.5〜約2.0、約1.5〜約2.5、または約2.0〜約2.5)を有する。

0038

上記のいずれの態様でも、ヘッドピース、テイルピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、1つ以上の追加のビルディングブロックタグ、ライブラリー識別タグ、使用タグ、および/または起源タグは、存在する場合、5〜20ヌクレオチド(例えば、5〜7ヌクレオチド、5〜8ヌクレオチド、5〜9ヌクレオチド、5〜10ヌクレオチド、5〜11ヌクレオチド、5〜12ヌクレオチド、5〜13ヌクレオチド、5〜14ヌクレオチド、5〜15ヌクレオチド、5〜16ヌクレオチド、5〜17ヌクレオチド、5〜18ヌクレオチド、5〜19ヌクレオチド、6〜7ヌクレオチド、6〜8ヌクレオチド、6〜9ヌクレオチド、6〜10ヌクレオチド、6〜11ヌクレオチド、6〜12ヌクレオチド、6〜13ヌクレオチド、6〜14ヌクレオチド、6〜15ヌクレオチド、6〜16ヌクレオチド、6〜17ヌクレオチド、6〜18ヌクレオチド、6〜19ヌクレオチド、6〜20ヌクレオチド、7〜8ヌクレオチド、7〜9ヌクレオチド、7〜10ヌクレオチド、7〜11ヌクレオチド、7〜12ヌクレオチド、7〜13ヌクレオチド、7〜14ヌクレオチド、7〜15ヌクレオチド、7〜16ヌクレオチド、7〜17ヌクレオチド、7〜18ヌクレオチド、7〜19ヌクレオチド、7〜20ヌクレオチド、8〜9ヌクレオチド、8〜10ヌクレオチド、8〜11ヌクレオチド、8〜12ヌクレオチド、8〜13ヌクレオチド、8〜14ヌクレオチド、8〜15ヌクレオチド、8〜16ヌクレオチド、8〜17ヌクレオチド、8〜18ヌクレオチド、8〜19ヌクレオチド、8〜20ヌクレオチド、9〜10ヌクレオチド、9〜11ヌクレオチド、9〜12ヌクレオチド、9〜13ヌクレオチド、9〜14ヌクレオチド、9〜15ヌクレオチド、9〜16ヌクレオチド、9〜17ヌクレオチド、9〜18ヌクレオチド、9〜19ヌクレオチド、9〜20ヌクレオチド、10〜11ヌクレオチド、10〜12ヌクレオチド、10〜13ヌクレオチド、10〜14ヌクレオチド、10〜15ヌクレオチド、10〜16ヌクレオチド、10〜17ヌクレオチド、10〜18ヌクレオチド、10〜19ヌクレオチド、10〜20ヌクレオチド、11〜12ヌクレオチド、11〜13ヌクレオチド、11〜14ヌクレオチド、11〜15ヌクレオチド、11〜16ヌクレオチド、11〜17ヌクレオチド、11〜18ヌクレオチド、11〜19ヌクレオチド、11〜20ヌクレオチド、12〜13ヌクレオチド、12〜14ヌクレオチド、12〜15ヌクレオチド、12〜16ヌクレオチド、12〜17ヌクレオチド、12〜18ヌクレオチド、12〜19ヌクレオチド、12〜20ヌクレオチド、13〜14ヌクレオチド、13〜15ヌクレオチド、13〜16ヌクレオチド、13〜17ヌクレオチド、13〜18ヌクレオチド、13〜19ヌクレオチド、13〜20ヌクレオチド、14〜15ヌクレオチド、14〜16ヌクレオチド、14〜17ヌクレオチド、14〜18ヌクレオチド、14〜19ヌクレオチド、14〜20ヌクレオチド、15〜16ヌクレオチド、15〜17ヌクレオチド、15〜18ヌクレオチド、15〜19ヌクレオチド、15〜20ヌクレオチド、16〜17ヌクレオチド、16〜18ヌクレオチド、16〜19ヌクレオチド、16〜20ヌクレオチド、17〜18ヌクレオチド、17〜19ヌクレオチド、17〜20ヌクレオチド、18〜19ヌクレオチド、18〜20ヌクレオチド、および19〜20ヌクレオチド)を含むことができる。特定の態様では、ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、1つ以上の追加のビルディングブロックタグ、ライブラリー識別タグ、使用タグ、および/または起源タグは、存在する場合、20ヌクレオチド未満(例えば、19ヌクレオチド未満、18ヌクレオチド未満、17ヌクレオチド未満、16ヌクレオチド未満、15ヌクレオチド未満、14ヌクレオチド未満、13ヌクレオチド未満、12ヌクレオチド未満、11ヌクレオチド未満、10ヌクレオチド未満、9ヌクレオチド未満、8ヌクレオチド未満、または7ヌクレオチド未満)の長さを有する。

0039

特定の態様では、第1ビルディングブロックタグと第2ビルディングブロックタグは、同数のヌクレオチドを含む。他の態様では、第1ビルディングブロックタグまたは第2ビルディングブロックタグのいずれかは、8を超えるヌクレオチド(例えば、9を超えるヌクレオチド、10を超えるヌクレオチド、11を超えるヌクレオチド、12を超えるヌクレオチド、13を超えるヌクレオチド、14を超えるヌクレオチド、および15を超えるヌクレオチド)を含む。いくつかの態様では、第1ビルディングブロックタグは、8〜20ヌクレオチド(例えば、8〜9ヌクレオチド、8〜10ヌクレオチド、8〜11ヌクレオチド、8〜12ヌクレオチド、8〜13ヌクレオチド、8〜14ヌクレオチド、8〜15ヌクレオチド、8〜16ヌクレオチド、8〜17ヌクレオチド、8〜18ヌクレオチド、8〜19ヌクレオチド、8〜20ヌクレオチド、9〜10ヌクレオチド、9〜11ヌクレオチド、9〜12ヌクレオチド、9〜13ヌクレオチド、9〜14ヌクレオチド、9〜15ヌクレオチド、9〜16ヌクレオチド、9〜17ヌクレオチド、9〜18ヌクレオチド、9〜19ヌクレオチド、9〜20ヌクレオチド、10〜11ヌクレオチド、10〜12ヌクレオチド、10〜13ヌクレオチド、10〜14ヌクレオチド、10〜15ヌクレオチド、10〜16ヌクレオチド、10〜17ヌクレオチド、10〜18ヌクレオチド、10〜19ヌクレオチド、10〜20ヌクレオチド、11〜12ヌクレオチド、11〜13ヌクレオチド、11〜14ヌクレオチド、11〜15ヌクレオチド、11〜16ヌクレオチド、11〜17ヌクレオチド、11〜18ヌクレオチド、11〜19ヌクレオチド、11〜20ヌクレオチド、12〜13ヌクレオチド、12〜14ヌクレオチド、12〜15ヌクレオチド、12〜16ヌクレオチド、12〜17ヌクレオチド、12〜18ヌクレオチド、12〜19ヌクレオチド、12〜20ヌクレオチド、13〜14ヌクレオチド、13〜15ヌクレオチド、13〜16ヌクレオチド、13〜17ヌクレオチド、13〜18ヌクレオチド、13〜19ヌクレオチド、13〜20ヌクレオチド、14〜15ヌクレオチド、14〜16ヌクレオチド、14〜17ヌクレオチド、14〜18ヌクレオチド、14〜19ヌクレオチド、14〜20ヌクレオチド、15〜16ヌクレオチド、15〜17ヌクレオチド、15〜18ヌクレオチド、15〜19ヌクレオチド、15〜20ヌクレオチド、16〜17ヌクレオチド、16〜18ヌクレオチド、16〜19ヌクレオチド、16〜20ヌクレオチド、17〜18ヌクレオチド、17〜19ヌクレオチド、17〜20ヌクレオチド、18〜19ヌクレオチド、18〜20ヌクレオチド、および19〜20ヌクレオチド)を有する(例えば、本明細書で定義されるような)ドナータグである。

0040

定義
「2'-置換ヌクレオチド」とは、塩基のリボースの2'位置に置換を有するヌクレオチド塩基を意味する。

0041

「約」とは、記された値の+/-10%を意味する。

0042

「2官能性」とは、2つの化学的部分の結合を可能にする2つの反応性基をもつことを意味する。例えば、2官能性リンカーは、ヘッドピースと化学実体の結合を可能にする2つの反応性基をもつ、本明細書に記載されるような、リンカーである。

0043

「結合」とは、共有結合または非共有結合によって繋ぎ止めることを意味する。非共有結合には、ファンデルワールス力水素結合イオン結合封入もしくは物理カプセル化、吸収、吸着、および/または他の分子間力によって形成されるものが含まれる。結合は、酵素的結合(例えば、酵素的ライゲーション)または化学的結合(例えば、化学的ライゲーション)などの、有用な手段によって達成することができる。

0044

「ビルディングブロック」とは、化学実体の構造単位を意味し、ここで、該単位は他の化学構造単位に直接連結されるか、または足場を介して間接的に連結される。化学実体がポリマーまたはオリゴマーである場合、ビルディングブロックはそのポリマーまたはオリゴマーのモノマー単位である。ビルディングブロックは、1つ以上の他のビルディングブロックまたは足場の付加を可能にする1つ以上の多様性ノード(diversity node)をもつことができる。ほとんどの場合、各多様性ノードは、化学実体を形成するために1つ以上のビルディングブロックまたは足場と反応することが可能な官能基である。一般的に、ビルディングブロックは少なくとも2つの多様性ノード(または反応性官能基)を有するが、一部のビルディングブロックは1つの多様性ノード(または反応性官能基)を有してもよい。あるいは、コードされる化学または結合工程は、いくつかの化学成分を含むことができる(例えば、多成分縮合反応または多段階プロセス)。2つの異なるビルディングブロックの反応性基は、相補的であるべきであり、すなわち、共有結合または非共有結合を形成するために一緒に反応することが可能であるべきである。

0045

「ビルディングブロックタグ」とは、構成成分(すなわち、足場もしくはビルディングブロック)の(例えば、結合反応による)付加、ライブラリー内のヘッドピース、ライブラリーの正体、ライブラリーの使用、および/またはライブラリーメンバーの起源をコードする、ライブラリーのオリゴヌクレオチド部分を意味する。「アクセプタータグ」とは、反応性実体(reactive entity)(例えば、酵素的ライゲーションの場合には3'末端のヒドロキシル基)を有するビルディングブロックタグを意味する。「ドナータグ」とは、アクセプタータグの反応性実体と反応することが可能な実体(例えば、酵素的ライゲーションの場合には5'末端のホスホリル基)を有するビルディングブロックタグを意味する。

0046

「化学実体」とは、1つ以上のビルディングブロックおよび任意に足場を含む化合物を意味する。化学実体は、1つ以上の所望の特性、例えば、生物学的標的に結合する能力、溶解性、水素結合供与体および受容体利用可能性、結合の回転自由度、正電荷、負電荷など、を有するように設計または構築された、任意の小分子またはペプチド薬物もしくは薬物候補であり得る。特定の態様では、化学実体は、2官能性または3官能性(またはそれ以上)の実体としてさらに反応させることができる。

0047

「化学的共反応対」(chemically co-reactive pair)とは、高い収率および高い熱力学的利得でモジュラー反応に関与し、それゆえにスペーサーをもたらす、反応性基の対を意味する。例示的な反応および化学的共反応対としては、以下が挙げられる:置換されていてもよいアルキニル基と置換されていてもよいアジド基の対によるHuisgen 1,3-双極子環化付加反応;4π電子系を有する置換されていてもよいジエンと2π電子系を有する置換されていてもよいジエノフィルまたは置換されていてもよいヘテロジエノフィルの対によるDiels-Alder反応;求核試薬と歪のあるヘテロシクリル求電子試薬による開環反応;ホスホロチオエート基とヨード基によるスプリント・ライゲーション反応;および本明細書に記載されるような、アルデヒド基とアミノ基による還元的アミノ化反応

0048

「複合体」または「ライゲート複合体」とは、共有結合または非共有結合によって化学実体および/または1つ以上のオリゴヌクレオチドタグと機能的に会合しているヘッドピースを意味する。複合体は、任意で、化学実体とヘッドピースの間に2官能性リンカーを含むことができる。

0049

化学実体の「構成成分」とは、足場またはビルディングブロックのいずれかを意味する。

0050

「多様性ノード」とは、別のビルディングブロックの付加を可能にする、足場またはビルディングブロック内の位置にある官能基を意味する。

0051

「ヘッドピース」とは、化学実体の構成成分およびビルディングブロックタグに機能的に連結される、ライブラリー合成のための出発オリゴヌクレオチドを意味する。任意で、2官能性リンカーがヘッドピースを構成成分に接続する。

0052

「ライブラリー」とは、分子または化学実体のコレクションを意味する。任意で、分子または化学実体は、分子または化学実体の部分をコードする1つ以上のオリゴヌクレオチドに結合される。

0053

「リンカー」とは、ヘッドピースを化学実体に連結する化学的接続実体を意味する。

0054

「多価カチオン」とは、1つより多いリガンドまたはアニオンと1つより多い結合を形成することが可能なカチオンを意味する。多価カチオンは、イオン性錯体または配位錯体のいずれかを形成することができる。例示的な多価カチオンには、アルカリ土類金属(例:マグネシウム)および遷移金属(例:マンガン(II)もしくはコバルト(III))からのもの、ならびに1つ以上のアニオンおよび/または1つ以上の1価もしくは多座配位子、例えば塩化物、アミンおよび/またはエチレンジアミンなど、と任意に結合しているものが含まれる。

0055

「オリゴヌクレオチド」とは、5'末端、3'末端、および5'末端と3'末端の間の内部位置に1個以上のヌクレオチドを有するヌクレオチドのポリマーを意味する。オリゴヌクレオチドは、DNA、RNA、または合成することが可能で、塩基対認識のために使用することが可能な、当技術分野で知られたそれらの誘導体を含むことができる。オリゴヌクレオチドは連続した塩基をもつ必要はなく、リンカー部分が介在してもよい。オリゴヌクレオチドポリマーは、天然の塩基(例えば、アデノシン、チミジン、グアノシンシチジンウリジンデオキシアデノシンデオキシチミジンデオキシグアノシン、デオキシシチジン、イノシン、またはジアミノプリン)、塩基アナログ(例えば、2-アミノアデノシン、2-チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、3-メチルアデノシン、C5-プロピニルシチジン、C5-プロピニルウリジン、C5-ブロモウリジン、C5-フルオロウリジン、C5-ヨードウリジン、C5-メチルシチジン、7-デアザアデノシン、7-デアザグアノシン、8-オキソアデノシン、8-オキソグアノシン、O(6)-メチルグアニン、および2-チオシチジン)、修飾ヌクレオチド(例えば、2'-置換ヌクレオチド、例えば2'-O-メチル化塩基および2'-フルオロ塩基)、インターカレートされた塩基、修飾された糖(例えば、2'-フルオロリボース、リボース、2'-デオキシリボースアラビノース、およびヘキソース)、および/または修飾リン酸基(例えば、ホスホロチオエートおよび5'-N-ホスホルアミダイト結合)を含むことができる。他の修飾塩基は本明細書に記載される。「アクセプター・オリゴヌクレオチド」とは、反応性実体(例えば、酵素的ライゲーションの場合には3'末端のヒドロキシル基または化学的ライゲーションの場合には置換されていてもよいアジド基)を有するオリゴヌクレオチドを意味する。「ドナー・オリゴヌクレオチド」とは、アクセプター・オリゴヌクレオチドの反応性実体と反応することが可能な実体(例えば、酵素的ライゲーションの場合には5'末端のホスホリル基または化学的ライゲーションの場合には置換されていてもよいアルキニル基)を有するオリゴヌクレオチドを意味する。

0056

「機能的に連結された」または「機能的に会合された」とは、2つ以上の化学構造が、それらが受けると予想される各種の操作を通して連結されたままであるような方法で、直接または間接的に一緒に連結されることを意味する。典型的には、化学実体とヘッドピースは間接的な方法で(例えば、適切なリンカーを介して共有結合で)機能的に連結される。例えば、リンカーは、化学実体のための結合部位とヘッドピースのための結合部位を有する2官能性部分であり得る。また、化学実体とオリゴヌクレオチドタグは直接または間接的に(例えば、適切なリンカーを介して共有結合で)機能的に連結され得る。

0057

「保護基」とは、DNAコードライブラリーをタグ付けする1つ以上の工程において望ましくない反応からオリゴヌクレオチドの3'末端または5'末端を保護することを意図した基を意味する。一般的に使用される保護基は、Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis," 第4版(John Wiley & Sons, New York, 2007)に開示されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。例示的な保護基としては、以下が挙げられる:不可逆的な保護基、例えば、ジデオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオシド(ddNTPまたはddN)、より好ましくは、ヒドロキシル基のための可逆的な保護基、例えば、エステル基(例:O-(α-メトキシエチル)エステル、O-イソバレリルエステル、およびO-レブニルエステル)、トリチル基(例:ジメトキシトリチルおよびモノメトキシトリチル)、キサンテニル基(例:9-フェニルキサンテン-9-イルおよび9-(p-メトキシフェニル)キサンテン-9-イル)、アシル基(例:フェノキシアセチルおよびアセチル)、ならびにシリル基(例:t-ブチルジメチルシリル)。

0058

「精製」とは、逐次の工程で使用される化学物質または生物学的物質活性を低下させうる、反応混合物中に存在する未反応生成物または剤を除去することを意味する。精製は、除去すべき未反応生成物または試薬クロマトグラフィー分離電気泳動分離、および沈殿の1つ以上を含むことができる。

0059

「足場」とは、特有幾何学的配置で1つ以上の多様性ノードを表示する化学的部分(chemical moiety)を意味する。多様性ノードは、典型的には、ライブラリー合成中に足場に結合されるが、場合によって、1つの多様性ノードはライブラリー合成前に足場に結合され得る(例えば、1つ以上のビルディングブロックおよび/または1つ以上のタグの付加)。いくつかの態様では、足場は誘導体化されており、その結果、それはライブラリー合成中にオルソゴナルに脱保護され、続いて異なる多様性ノードと反応させることができる。

0060

「小分子」薬物または「小分子」薬物候補とは、約1,000ダルトン未満の分子量を有する分子を意味する。小分子は、有機もしくは無機であってよく、(例えば、化合物ライブラリーもしくは天然源から)単離することができるか、または既知化合物の誘導体化によって得ることができる。

0061

「実質的な同一性」または「実質的に同一」とは、参照配列と同じポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列を有するか、または2つの配列が最適にアライメントされたときに参照配列内の対応する位置で同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定の割合を有する、それぞれ、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、参照配列に「実質的に同一」であるアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の同一性を有する。ポリペプチドについて、比較配列の長さは、一般に、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個連続するアミノ酸、より好ましくは、少なくとも25、50、75、90、100、150、200、250、300、または350個連続するアミノ酸、最も好ましくは、完全長のアミノ酸配列であろう。核酸については、比較配列の長さは、一般に、少なくとも5個連続するヌクレオチド、好ましくは、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25個連続するヌクレオチド、最も好ましくは、完全長のヌクレオチド配列であろう。配列同一性は、配列解析ソフトウェアデフォルト設定で用いて測定することができる(例えば、Genetics Computer Group (University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)の配列解析ソフトウェアパッケージ)。このようなソフトウェアは、種々の置換、欠失、および他の改変相同性の程度を割り当てることによって、類似する配列をマッチさせることができる。

0062

「テイルピース」とは、ビルディングブロックタグのすべてを付加した後に複合体に結合され、かつライブラリーの正体、ライブラリーの使用、および/またはライブラリーメンバーの起源をコードする、ライブラリーのオリゴヌクレオチド部分を意味する。

0063

[本発明1001]
オリゴヌクレオチド-コードされた化学実体(chemical entity)を含む第1のライブラリーをタグ付けする方法であって:
(i)第1官能基と第2官能基とを有するヘッドピースを提供する工程であって、ここで、該ヘッドピースは少なくとも1つの2'-置換ヌクレオチドを含む、工程;
(ii)該化学実体の第1構成成分に該ヘッドピースの第1官能基を結合させる工程であって、ここで、該ヘッドピースは第1構成成分に直接接続されるか、または該ヘッドピースは2官能性リンカーによって第1構成成分に間接的に接続される、工程;および
(iii)複合体を形成するよう、第1ビルディングブロックタグに該ヘッドピースの第2官能基を結合させる工程
を含み、ここで、工程(ii)および(iii)は任意の順序で実施することができ、かつ第1ビルディングブロックタグは工程(ii)の結合反応をコードしており、それによって、タグ付けしたライブラリーを提供する、方法。
[本発明1002]
前記ヘッドピースが、該ヘッドピースの5'末端、3'末端、または内部位置の1つ以上に2'-置換ヌクレオチドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記ヘッドピースが、5'末端または3'末端に2'-置換ヌクレオチドおよび第2官能基を含む、本発明1002の方法。
[本発明1004]
第1ビルディングブロックタグが少なくとも1つの2'-置換ヌクレオチドを含む、本発明1001〜1003のいずれかの方法。
[本発明1005]
第1ビルディングブロックタグが、第1ビルディングブロックタグの5'末端、3'末端、または内部位置の1つ以上に2'-置換ヌクレオチドを含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
第1ビルディングブロックタグが、5'末端および3'末端の両方に2'-置換ヌクレオチドを含む、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記2'-O-置換ヌクレオチドが2'-O-メチルヌクレオチドまたは2'-フルオロヌクレオチドである、本発明1001〜1006のいずれかの方法。
[本発明1008]
前記2'-O-置換ヌクレオチドが、2'-O-メチルグアニンまたは2'-O-メチルウラシルから選択される2'-O-メチルヌクレオチドである、本発明1007の方法。
[本発明1009]
前記2'-O-置換ヌクレオチドが、2'-フルオログアニンまたは2'-フルオロウラシルから選択される2'-フルオロヌクレオチドである、本発明1007の方法。
[本発明1010]
第1ビルディングブロックタグが3'末端または5'末端に保護基を含む、本発明1001〜1009のいずれかの方法。
[本発明1011]
工程(ii)が、前記ヘッドピースを直接、第1構成成分に結合させることを含む、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1012]
前記構成成分が足場または第1ビルディングブロックである、本発明1011の方法。
[本発明1013]
工程(ii)が、前記ヘッドピースを間接的に、2官能性リンカーを介して第1構成成分に結合させることを含む、本発明1001〜1010のいずれかの方法。
[本発明1014]
前記ヘッドピースを前記リンカーの第1官能基と結合させること、および第1構成成分を前記リンカーの第2官能基と結合させることを含む、本発明1013の方法。
[本発明1015]
第1構成成分が足場または第1ビルディングブロックである、本発明1014の方法。
[本発明1016]
(iv)前記複合体の5'末端または3'末端に第2ビルディングブロックタグを結合させる工程;および
(v)第1構成成分に前記化学ライブラリーの第2構成成分を結合させる工程
をさらに含み、ここで、工程(iv)および(v)は任意の順序で実施することができる、本発明1001〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
工程(iv)が、前記複合体の5'末端に第2ビルディングブロックタグを結合させることを含み;前記複合体が5'末端にリン酸基を含み;かつ第2ビルディングブロックタグが3'および5'末端の両方にヒドロキシル基を含む、本発明1016の方法。
[本発明1018]
工程(iv)が、前記複合体を精製すること、および前記複合体をポリヌクレオチドキナーゼと反応させて、第2ビルディングブロックタグを結合させる前に、5'末端にリン酸基を形成させること、をさらに含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
工程(iv)が、前記複合体の3'末端に第2ビルディングブロックタグを結合させることを含み;前記複合体が3'末端に保護基を含み;かつ第2ビルディングブロックタグが5'末端にリン酸基および3'末端に保護基を含む、本発明1016の方法。
[本発明1020]
工程(iv)が、前記複合体に第2ビルディングブロックタグを結合させる前に、前記複合体から前記保護基を放出させるために、前記複合体を加水分解剤と反応させることをさらに含む、本発明1019の方法。
[本発明1021]
第2ビルディングブロックタグが、第2ビルディングブロックタグの5'末端、3'末端、または内部位置の1つ以上に2'-置換ヌクレオチドを含む、本発明1016〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
第2構成成分が第1ビルディングブロックまたは第2ビルディングブロックである、本発明1016〜1021のいずれかの方法。
[本発明1023]
工程(iv)が、前記複合体に第2ビルディングブロックタグを結合させるためのRNAリガーゼおよび/またはDNAリガーゼを含む、本発明1016〜1022のいずれかの方法。
[本発明1024]
工程(iv)がRNAリガーゼを含み、かつ該RNAリガーゼがT4 RNAリガーゼである、本発明1023の方法。
[本発明1025]
工程(iv)がDNAリガーゼを含み、かつ該DNAリガーゼがssDNAリガーゼである、本発明1023の方法。
[本発明1026]
工程(iv)がRNAリガーゼおよびDNAリガーゼを含む、本発明1023の方法。
[本発明1027]
工程(iii)が、第1ビルディングブロックタグに前記ヘッドピースを結合させるためのRNAリガーゼおよび/またはDNAリガーゼを含む、本発明1001〜1026のいずれかの方法。
[本発明1028]
工程(iii)がRNAリガーゼを含み、かつ該RNAリガーゼがT4 RNAリガーゼである、本発明1027の方法。
[本発明1029]
工程(iii)がDNAリガーゼを含み、かつ該DNAリガーゼがssDNAリガーゼである、本発明1027の方法。
[本発明1030]
工程(iii)がRNAリガーゼおよびDNAリガーゼを含む、本発明1027の方法。
[本発明1031]
工程(iii)および/または、存在する場合、工程(iv)が、ポリエチレングリコールおよび/または1種以上の可溶性多価カチオンを含む、本発明1001〜1030のいずれかの方法。
[本発明1032]
工程(iii)および/または、存在する場合、工程(iv)が、前記ポリエチレンを約25%(w/v)〜約35%(w/v)の量で含む、本発明1031の方法。
[本発明1033]
前記ポリエチレングリコールが約3,000〜約5,500ダルトンの平均分子量を有する、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記ポリエチレングリコールが約4,600ダルトンの平均分子量を有する、本発明1033の方法。
[本発明1035]
工程(iii)および/または、存在する場合、工程(iv)が、1種以上の可溶性多価カチオンを約0.05mM〜約10.5mMの量で含む、本発明1031〜1034のいずれかの方法。
[本発明1036]
1種以上の多価カチオンが、塩化マグネシウム、塩化マンガン(II)、およびヘキサミン塩化コバルト(III)からなる群より選択される、本発明1035の方法。
[本発明1037]
1種以上の多価カチオンが約0.5mM〜約1.5mMの量である、本発明1035または1036の方法。
[本発明1038]
結合させる工程(ii)〜(v)のいずれか1つの工程の前に、未反応タグまたは未反応ヘッドピースから前記複合体を分離することをさらに含む、本発明1001〜1037のいずれかの方法。
[本発明1039]
結合させる工程(ii)〜(v)のいずれか1つの工程の前に、前記複合体を精製することをさらに含む、本発明1001〜1038のいずれかの方法。
[本発明1040]
前記複合体に1つ以上の追加のビルディングブロックタグを結合させること、および前記複合体に1つ以上の追加の構成成分を結合させることをさらに含む、本発明1001〜1039のいずれかの方法。
[本発明1041]
前記ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、プレアデニル化5'末端を含む、本発明1001〜1040のいずれかの方法。
[本発明1042]
前記ヘッドピースがヘアピン構造を含む、本発明1001〜1041のいずれかの方法。
[本発明1043]
前記ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、5〜20個のヌクレオチドを含む、本発明1001〜1042のいずれかの方法。
[本発明1044]
第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、ほぼ同じ質量を有する、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、第1のライブラリー識別配列をさらに含む、本発明1001〜1044のいずれかの方法。
[本発明1046]
第1のライブラリー識別タグを前記複合体に結合させることをさらに含む、本発明1001〜1044のいずれかの方法。
[本発明1047]
第2のライブラリーを提供すること、および第1のライブラリーを第2のライブラリーと組み合わせることをさらに含む、本発明1045または1046の方法。
[本発明1048]
前記ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、使用配列および/または起源配列をさらに含む、本発明1001〜1047のいずれかの方法。
[本発明1049]
前記複合体に使用タグおよび/または起源タグを結合させることをさらに含む、本発明1001〜1047のいずれかの方法。
[本発明1050]
前記複合体にテイルピースを結合させることをさらに含む、本発明1001〜1049のいずれかの方法。
[本発明1051]
オリゴヌクレオチド-コードされた化学実体を含む第1のライブラリーをタグ付けする方法であって:
(i)第1官能基と第2官能基を有するヘッドピースを提供する工程であって、ここで、該ヘッドピースは、5'末端に2'-置換ヌクレオチド、任意でヘッドピースの内部位置に1個以上のヌクレオチド、ならびに3'末端で2'位置および/または3'位置に保護基を含む、工程;
(ii)該化学実体の第1構成成分に該ヘッドピースの第1官能基を結合させる工程であって、ここで、該ヘッドピースは第1構成成分に直接接続されるか、または該ヘッドピースは2官能性リンカーによって第1構成成分に間接的に接続される、工程;および
(iii)第1ビルディングブロックタグに該ヘッドピースの第2官能基を結合させる工程であって、ここで、第1ビルディングブロックタグは、5'末端に2'-置換ヌクレオチドおよびヒドロキシル基、任意で該タグの内部位置に1個以上のヌクレオチド、ならびに3'末端に2'-置換ヌクレオチドおよびヒドロキシル基を含む、工程
を含み、ここで、工程(ii)および(iii)は任意の順序で実施することができ、かつ第1ビルディングブロックタグは工程(ii)の結合反応をコードしており、それによって、タグ付けしたライブラリーを提供する、方法。
[本発明1052]
前記2'-置換ヌクレオチドが2'-O-メチルヌクレオチドである2'-O-メチルグアニンである、本発明1051の方法。
[本発明1053]
前記1個以上のヌクレオチドが前記ヘッドピースの内部位置に存在する、本発明1051または1052の方法。
[本発明1054]
前記1個以上のヌクレオチドが前記タグの内部位置に存在する、本発明1051〜1053のいずれかの方法。
[本発明1055]
前記ヘッドピースおよび/または前記タグの1個以上のヌクレオチドが1個以上の2'-デオキシヌクレオチドである、本発明1053または1054の方法。
[本発明1056]
工程(iii)が、1種以上の可溶性多価カチオン、ポリエチレングリコール、およびRNAリガーゼを含む、本発明1051〜1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
前記ポリエチレングリコールが約4,600ダルトンの平均分子量を有し、かつ前記RNAリガーゼがT4 RNAリガーゼである、本発明1056の方法。
[本発明1058]
1種以上の多価カチオンが、塩化マグネシウム、塩化マンガン(II)、およびヘキサミン塩化コバルト(III)からなる群より選択される、本発明1056または1057の方法。
[本発明1059]
前記ヘッドピースおよび/または第1ビルディングブロックタグが5〜20個のヌクレオチドを含む、本発明1051〜1057のいずれかの方法。
[本発明1060]
第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、ほぼ同じ質量を有する、本発明1059の方法。
[本発明1061]
前記ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、第1のライブラリー識別配列をさらに含む、本発明1051〜1060のいずれかの方法。
[本発明1062]
前記複合体に第1のライブラリー識別タグを結合させることをさらに含む、本発明1051〜1060のいずれかの方法。
[本発明1063]
第2のライブラリーを提供すること、および第1のライブラリーを第2のライブラリーと組み合わせることをさらに含む、本発明1061または1062の方法。
[本発明1064]
前記ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、使用配列または起源配列をさらに含む、本発明1051〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
前記複合体に使用タグおよび/または起源タグを結合させることをさらに含む、本発明1051〜1063のいずれかの方法。
[本発明1066]
前記複合体にテイルピースを結合させることをさらに含む、本発明1051〜1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
前記2'-置換ヌクレオチドが、2'-O-メチルグアニン、2'-O-メチルウラシル、2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルチミジン、2'-O-メチルイノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルジアミノプリン、2'-フルオログアニン、2'-フルオロウラシル、2'-フルオロアデノシン、2'-フルオロチミジン、2'-フルオロイノシン、2'-フルオロシチジン、および2'-フルオロジアミノプリンからなる群より選択される、本発明1001または1051の方法。
[本発明1068]
複数のヘッドピースを含む、本発明1001〜1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
前記複数のヘッドピースの各ヘッドピースが、同一の配列領域および異なるコード領域を含む、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記同一の配列領域がプライマー結合領域である、本発明1069の方法。
[本発明1071]
前記異なるコード領域が、前記ヘッドピースまたは初期構成成分の付加をコードする、初期ビルディングブロックタグである、本発明1069または1070の方法。
[本発明1072]
工程(ii)〜(iv)の少なくとも1つにおける前記結合させる工程が、存在する場合、酵素的ライゲーションを含む、本発明1001〜1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
前記酵素的ライゲーションがRNAリガーゼおよび/またはDNAリガーゼの使用を含む、本発明1072の方法。
[本発明1074]
工程(ii)〜(iv)の少なくとも1つにおける前記結合させる工程が、存在する場合、化学的ライゲーションを含む、本発明1001〜1073のいずれかの方法。
[本発明1075]
前記化学的ライゲーションが1つ以上の化学的共反応対の使用を含む、本発明1074の方法。
[本発明1076]
前記化学的共反応対が、置換されていてもよいアルキニル基と置換されていてもよいアジド基である、本発明1075の方法。
[本発明1077]
前記化学的共反応対が、ホスホロチオエート基とヨード基である、本発明1075の方法。
[本発明1078]
ホスホロチオエート基がオリゴヌクレオチドの5'末端にあり、かつヨード基がオリゴヌクレオチドの3'末端にある、本発明1077の方法。
[本発明1079]
前記化学的ライゲーションが、前記化学的共反応対間の結合反応においてスプリント・オリゴヌクレオチドをさらに含む、本発明1077または1078の方法。
[本発明1080]
前記化学的共反応対が約4〜約24原子の長さを有するスペーサーをもたらす、本発明1075〜1079のいずれかの方法。
[本発明1081]
前記スペーサーが約4〜約10原子の長さを有する、本発明1080の方法。
[本発明1082]
1つ以上のビルディングブロックタグの化学的ライゲーションが、逐次ビルディングブロックタグをライゲートするためのオルソゴナルな化学的共反応対を含む、本発明1074〜1081のいずれかの方法。
[本発明1083]
前記オルソゴナルな化学的共反応対が、(i)置換されていてもよいアルキニル基と置換されていてもよいアジド基、および(ii)ホスホロチオエート基とヨード基を含む、本発明1082の方法。
[本発明1084]
前記複合体、前記ヘッドピース、第1ビルディングブロックタグ、第2ビルディングブロックタグ、および/または、存在する場合、1つ以上の追加のビルディングブロックタグが、3'末端の末端ヌクレオチドと該末端ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドとの間に修飾リン酸基を含む、本発明1001〜1083のいずれかの方法。
[本発明1085]
ヘッドピースおよびビルディングブロックタグを含む複合体であって、該タグが5〜20個のヌクレオチド、5'末端の2'-置換ヌクレオチド、および3'末端の2'-置換ヌクレオチドを含む、複合体。
[本発明1086]
5'末端および/または3'末端の2'-置換ヌクレオチドが2'-O-メチルヌクレオチドまたは2'-フルオロヌクレオチドである、本発明1085の複合体。
[本発明1087]
前記ヘッドピースがヘアピン構造を含む、本発明1085または1086の複合体。
[本発明1088]
前記ヘッドピースが、該ヘッドピースの5'末端、3'末端、または内部位置の1つ以上に2'-置換ヌクレオチドを含む、本発明1085〜1087のいずれかの複合体。
[本発明1089]
前記ヘッドピースがプレアデニル化5'末端をさらに含む、本発明1085〜1088のいずれかの複合体。
[本発明1090]
前記2'-置換ヌクレオチドが2'-O-メチルヌクレオチドまたは2'-フルオロヌクレオチドである、本発明1085〜1089のいずれかの複合体。
[本発明1091]
前記2'-置換ヌクレオチドが、2'-O-メチルグアニン、2'-O-メチルウラシル、2'-O-メチルアデノシン、2'-O-メチルチミジン、2'-O-メチルイノシン、2'-O-メチルシチジン、2'-O-メチルジアミノプリン、2'-フルオログアニン、2'-フルオロウラシル、2'-フルオロアデノシン、2'-フルオロチミジン、2'-フルオロイノシン、2'-フルオロシチジン、および2'-フルオロジアミノプリンからなる群より選択される、本発明1090の複合体。
[本発明1092]
テイルピースをさらに含む、本発明1085〜1091のいずれかの複合体。
[本発明1093]
前記複合体、前記ヘッドピース、または前記ビルディングブロックタグが、3'末端の末端ヌクレオチドと該末端ヌクレオチドに隣接するヌクレオチドとの間に修飾リン酸基を含む、本発明1085〜1092のいずれかの複合体。
[本発明1094]
前記複合体がホスホロチオエートまたはトリアゾール基を含む、本発明1085〜1093のいずれかの複合体。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

図面の簡単な説明

0064

図1は、酵素的および/または化学的ライゲーションにより連続的に接合される一本鎖DNAタグを用いた化合物ライブラリーの一般的な合成のための例示的な方法を示す。「BB」はビルディングブロックを指す。
図2A〜2Bは、酵素的ライゲーションを用いたライブラリーの一本鎖DNAタギングのための例示的な方法を示す。図2Aは、保護した(再導入した)5'-一リン酸(5'-P)オリゴヌクレオチドとの一本鎖酵素的ライゲーションを用いてライブラリーをタグ付けするための例示的な方法を示し、ここで、灰色のボックスは2'-OMeヌクレオチドを指し、「X」は保護基または化学実体の構成成分を指し、「PNK」はポリヌクレオチドキナーゼを指す。
図2A〜2Bは、酵素的ライゲーションを用いたライブラリーの一本鎖DNAタギングのための例示的な方法を示す。図2Bは、保護した3'-OHオリゴヌクレオチドとの一本鎖ライゲーションを用いてライブラリーをタグ付けするための例示的な方法を示し、ここで、-O-に結合された黒のボックスは3'-OH末端の保護基を指し、「LC」は保護基の液体クロマトグラフィー分離を指す。
図3は、例えば化学実体によってブロックされた3'末端(「X-3'」と表示)を有する5'-プレアデニル化(「5'-App」と表示)オリゴヌクレオチド(ヘッドピース)との一本鎖ライゲーションを用いてライブラリーをタグ付けするための例示的な方法を示す。この方法は、5'-リン酸化オリゴヌクレオチドタグ(「タグA」と表示)をヘッドピースにライゲートし、3'-OH末端を有する追加のタグ(「タグB」および「タグC」と表示)を複合体にATPの存在下でライゲートするために使用することができる。
図4A〜4Eは、例示的な複合体を示し、各々はヘッドピース、リンカー、および足場(「S」)と多様性ノードA、B、Cを含む小分子を有する。濃い灰色のボックスは2'-OMeヌクレオチドを指し、点線は1個以上の相補的塩基の存在を指す。図4A〜4Bは、一本鎖の線状オリゴヌクレオチドヘッドピースを有する複合体の模式図であり、ここで、リンカーと小分子はヘッドピースの3'末端(図4A)または5'末端(図4B)に接続される。
図4Aの説明を参照のこと。
図4A〜4Eは、例示的な複合体を示し、各々はヘッドピース、リンカー、および足場(「S」)と多様性ノードA、B、Cを含む小分子を有する。濃い灰色のボックスは2'-OMeヌクレオチドを指し、点線は1個以上の相補的塩基の存在を指す。図4C〜4Dは、一本鎖のヘアピンオリゴヌクレオチドヘッドピースを有する複合体の模式図であり、ここで、リンカーと小分子はヘッドピースの内部位置(図4C)または3'末端(図4D)に接続される。
図4Cの説明を参照のこと。
図4A〜4Eは、例示的な複合体を示し、各々はヘッドピース、リンカー、および足場(「S」)と多様性ノードA、B、Cを含む小分子を有する。図4Eは、ヘアピンオリゴヌクレオチドヘッドピースを有するライブラリーをタグ付けするための例示的な方法を示し、ここで、星は化学的部分を指し、3'末端の「Y」は保護基を指す。オリゴヌクレオチドタグは1〜4と表示され、アダプター配列は5'末端の黒い線である。
図5A〜5Cは、T4RNAリガーゼまたはCircLigase(商標)ssDNAリガーゼによるオリゴヌクレオチドのライゲーションを示す。図5Aは、酵素的ライゲーション反応の模式図である。ドナー・オリゴヌクレオチドは5'-リン酸化されており、3'末端に化合物ライブラリーを有するヘッドピースを模倣して、3'-フルオレセイン標識を有する。アクセプター・オリゴヌクレオチドはリン酸化されていない。図5Bは、8M尿素/15%ポリアクリルアミドゲル(PAAG)上でのライゲーション反応のゲル電気泳動分析を示す。「SM」は蛍光標識したドナーを指し、「生成物」はライゲーション生成物を指し、「アデニル化ドナー」は上記のような5'App-ドナーを指す。図5Cは、酵素およびオリゴヌクレオチドの高濃度でT4 RNAリガーゼについて達成された高収率ライゲーションを示す。
図6A〜6Bは、T4 RNAリガーゼにより最高ライゲーション収率を達成するための、PEGの分子量(図6A)および濃度(図6B)の最適化を表す。反応条件は図5A〜5Cについて上述したとおりである。図6Aは、25%(w/v)のPEG(分子量300〜20,000(20K))とともに5時間または20時間インキュベートした後のMNA/DNA 15merドナーおよびアクセプタータグとのライゲーション反応の電気泳動分析定量化するグラフである。図6Bは、5%〜45%(w/v)のPEG4600の存在下で18〜20時間インキュベートした後のライゲーションに対する濃度の影響を示す。
図7A〜7Bは、CircLigase(商標)(図7A)およびT4 RNAリガーゼ(図7B)によるライゲーション効率と、ドナーまたはアクセプター・オリゴヌクレオチドの長さとの相関関係を示す。図7Aは、CircLigase(商標)ライゲーション反応でのライゲーション収率に対するアクセプターの長さの影響を定量化するグラフを示す。図7Bは、T4 RNAリガーゼによる一本鎖ライゲーションに対するアクセプターおよびドナーMNA/DNAタグのヌクレオチド長さの影響を定量化するグラフと表を示す。これらのデータは、450nm励起蛍光ゲルデンシトメトリーにより得られた2つの独立した実験の平均を表す。
図8A〜8Bは、リン酸化の前と後のMNA/DNAタグのLC-MSスペクトルである。データは、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(5nmoleのタグあたり50単位)との反応の前(図8A)および後(図8B)の15merタグ:5’-HO-mUACGTA TAC GAC TGmG-OH-3’ (SEQID NO: 13)(250μM)について示される。
図9は、タグA〜Cの逐次一本鎖ライゲーションについての電気泳動ゲルを示す。3'末端はライブラリー化合物(または化学実体)を表すためにフルオレセインを含んでおり、アスタリスク(*)はリン酸化前のライゲート生成物(または複合体)の精製を示す。
図10A〜10Bは、5原子の「短い」スペーサー(図10A)および24原子の「長い」スペーサー(図10B)をもたらす、ドナー・オリゴヌクレオチドとアクセプター・オリゴヌクレオチド間の「化学的共反応対」の反応の模式図を示す。
図11A〜11Eは、図10A〜10Bに示されるような、短いまたは長い単一のスペーサーを含む75mer DNA鋳型の逆転写(RT)およびPCR解析の結果を示す。図11Aは、RT反応の模式図である。
図11A〜11Eは、図10A〜10Bに示されるような、短いまたは長い単一のスペーサーを含む75mer DNA鋳型の逆転写(RT)およびPCR解析の結果を示す。RTのLC-MSスペクトルは、対照の75mer DNA鋳型(図11B)、単一の5原子(「短い」)スペーサーを含む75mer DNA鋳型(図11C)、および単一の24原子(「長い」)スペーサーを含む75mer DNA鋳型(図11D)について260nmと650nmの両方で記録された。
図11Bの説明を参照のこと。
図11Bの説明を参照のこと。
図11A〜11Eは、図10A〜10Bに示されるような、短いまたは長い単一のスペーサーを含む75mer DNA鋳型の逆転写(RT)およびPCR解析の結果を示す。図11Eは、対照の75mer DNA鋳型(「templ75」)、5原子スペーサーを含む75mer DNA鋳型(「短いクリック」)、および24原子スペーサーを含む75mer DNA鋳型(「長いクリック」)のRT-PCR解析を示す。
図12A〜12Gは、相補的スプリント・オリゴヌクレオチドの存在下または非存在下での5'-ヨード修飾DNAオリゴヌクレオチドと3'-ホスホロチオエートDNAオリゴヌクレオチド間の化学的ライゲーション反応の結果を示す。図12Aは、例示的な反応の模式図を示す。5'-ヨードオリゴヌクレオチドは3'末端で6-FAMにより標識されており、一方3'-ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは5'末端でCy5により標識されている。
図12A〜12Gは、相補的スプリント・オリゴヌクレオチドの存在下または非存在下での5'-ヨード修飾DNAオリゴヌクレオチドと3'-ホスホロチオエートDNAオリゴヌクレオチド間の化学的ライゲーション反応の結果を示す。図12Bは、相補的スプリントの存在下(+spl)または非存在下(-spl)でのライゲーション反応のゲル電気泳動分析を示す。CCy5およびCFLは、それぞれCy5およびフルオレセインで標識した出発物質可視バンドを示す。
図12A〜12Gは、相補的スプリント・オリゴヌクレオチドの存在下または非存在下での5'-ヨード修飾DNAオリゴヌクレオチドと3'-ホスホロチオエートDNAオリゴヌクレオチド間の化学的ライゲーション反応の結果を示す。図12Cは、Cy5(635nm)およびフルオレセイン(450nm)検出を用いて定量化された、上記条件下でのスプリント化(splinted)ライゲーション反応の時間経過を示す。
図12A〜12Gは、相補的スプリント・オリゴヌクレオチドの存在下または非存在下での5'-ヨード修飾DNAオリゴヌクレオチドと3'-ホスホロチオエートDNAオリゴヌクレオチド間の化学的ライゲーション反応の結果を示す。図12Dは、スプリントの非存在下(上、260nm、495nmおよび650nm)および存在下(下、260nm、495nmおよび650nm)でのCFLおよびCCy5のライゲーションのLC-MS分析を示し、その際、ライゲーション反応を7日間インキュベートした。
図12A〜12Gは、相補的スプリント・オリゴヌクレオチドの存在下または非存在下での5'-ヨード修飾DNAオリゴヌクレオチドと3'-ホスホロチオエートDNAオリゴヌクレオチド間の化学的ライゲーション反応の結果を示す。図12Eは、スプリントの非存在下でのCFLおよびCCy5のライゲーションのLC-MS分析(260nm、495nmおよび650nm)を示し、その際、ライゲーション反応を8日間インキュベートした。
図12A〜12Gは、相補的スプリント・オリゴヌクレオチドの存在下または非存在下での5'-ヨード修飾DNAオリゴヌクレオチドと3'-ホスホロチオエートDNAオリゴヌクレオチド間の化学的ライゲーション反応の結果を示す。図12Fは、CFLオリゴヌクレオチドとピペリジンとの反応のMS分析を示し、ここで、この反応はヨウ素を置き換えることを意図していた。反応条件は、100mMホウ酸バッファーpH9.5中の100μMのオリゴヌクレオチド、40mM(400当量)のピペリジンを室温で20時間(左);および200mMホウ酸バッファーpH9.5中の400μMのオリゴヌクレオチド、2M(4,000当量)のピペリジンを65℃で2時間(右)を含んでいた。
図12A〜12Gは、相補的スプリント・オリゴヌクレオチドの存在下または非存在下での5'-ヨード修飾DNAオリゴヌクレオチドと3'-ホスホロチオエートDNAオリゴヌクレオチド間の化学的ライゲーション反応の結果を示す。図12Gは、100mMホウ酸バッファーpH9.5中で400当量のピペリジンの存在下に室温で20時間行った50μMのCFLおよびCCy5オリゴヌクレオチドのスプリント化ライゲーション反応のMS分析を示す。
図13A〜13Cは、シャッフリングを最小限に抑えるための修飾オリゴヌクレオチドの使用を示す。図13Aは、5'-リン酸化ヘッドピースssHP(3,636 Da)と2'-Oメチルヌクレオチドを有するタグ(タグ15;2,469 Da)との一本鎖ライゲーション反応のLC-MS分析を示す。LC-MS分析は3本のピークを示した:タグ(2,469 Da)に対するピーク1;アデニル化ヘッドピース(3,965 Da)に対するピーク2;6,089 Da(期待されたライゲーション生成物)、5,769 Da(期待値6,089 Da-320 Da)、および6,409 Da(期待値6,089 Da+320 Da)の分子量を有する生成物を含む2本(ある場合には3本)のサブピークを有するピーク3。この320 Daの質量差は、余分な2'-O-Me Cヌクレオチドの除去または追加のいずれかにきっちりと対応する。
図13A〜13Cは、シャッフリングを最小限に抑えるための修飾オリゴヌクレオチドの使用を示す。図13B-1〜13B-3は、非限定的な提案されたヌクレオチドシャッフリング機構を示し、ここでは、反応の約90%が期待された(正常な)ライゲーション生成物を提供し、反応の約10%が異常なライゲーション生成物(「生成物-1 nt」および「生成物+1 nt」)を提供する。
図13B-1の説明を参照のこと。
図13B-1の説明を参照のこと。
図13A〜13Cは、シャッフリングを最小限に抑えるための修飾オリゴヌクレオチドの使用を示す。図13Cは、ヘッドピースHP-PSとタグ15とのライゲーションのLC-MS分析を示す。ヘッドピースHP-PSはヘッドピースssHPの配列を有するが、5'末端にホスホロチオエート結合を含む。LC分析は3本のピークを示した:タグ(2,469)に対するピーク1;アデニル化ヘッドピース(3,984)に対するピーク2;およびヌクレオチドシャッフリングがほとんど観察されない単一のライゲーション生成物(6,107)に対するピーク3。+/-320ピークの痕跡は、おそらく、ホスホロチオエート結合の天然ホスホジエステル結合への酸化的変換に相当するか、または不完全硫化に起因する。
図14は、サイズ排除クロマトグラフィーを用いたライブラリーメンバーの分離を示すグラフであり、標的に結合したライブラリーメンバー(グラフの左)は未結合のライブラリーメンバー(グラフの右)よりも短い時間で溶出する。
図15Aは、スプリント依存性でない単一の化学、例えば5'-アジド/3'-アルキニル、を用いたコードDNAタグの化学的ライゲーションを示す例示的な模式図である。反応性基は各タグ(タグA、B、およびC)の3'および5'末端に存在し、どちらかの末端(例えば、3'末端)にある反応性基の1つはタグの環化、重合、または誤サイクルライゲーションを防止するために保護されている。タグライゲーションのサイクルには、化学的ライゲーションと、その後の成長しつつあるライゲート実体を次のサイクルのライゲーションに適格にするための残存官能基の脱保護が含まれる。各サイクルにはさらに、1つ以上のビルディングブロック(BBA、BBB、およびBBC、それぞれタグA、B、およびCによりコードされる)の付加が含まれる。化学的ライゲーションのプロセスは、任意で、テイルピースの付加を含むことができる。
図15Bは、スプリント依存性である単一の化学を用いたコードDNAタグの化学的ライゲーションを示す例示的な模式図である。このアプローチの鋳型依存的性質は、タグの重合、タグの環化、ならびにミスタギング(mistagging)事象発生頻度を低減させる。図15Aと同様に、この模式図はタグ(タグA、B、およびC)とタグによりコードされる1つ以上のビルディングブロック(BBA、BBB、およびBBC)を含む。
図15Cは、PCR増幅および配列決定に適格であるcDNAを生成し、ならびに化学的にライゲートされた接合部(junction)を通り過ぎて読み取ることが可能な鋳型依存性ポリメラーゼを使用する、鋳型依存的重合のための鋳型としての一連の化学的にライゲートされたタグの使用を示す例示的な模式図である。
図16Aは、TIPS保護アルキニルタグおよび「クリック」ケミストリーを用いたコードDNAタグの化学的ライゲーションを示す例示的な模式図である。ライブラリー合成の各サイクルには、前回のサイクルからの脱保護アルキンへのTIPS保護タグのCu(I)触媒による化学的ライゲーションが含まれる。ライゲーション後、TIPS基は除去(脱保護)され、それによって、次の化学的ライゲーション工程のためのアルキンを活性化する。
図16Bは、3'末端に3'-O-TIPS-プロパルギルウリジンを有するオリゴヌクレオチドの固相合成を開始するために使用されるDMT-スクシニル-3'-O-TIPS-プロパルギルウリジンCPGの構造を示す。
図16Cは、PCR増幅および配列決定に適格であるcDNAを生成し、ならびに「クリック」ケミストリーでライゲートされた接合部を通り過ぎて読み取ることが可能な鋳型依存性ポリメラーゼを使用する、鋳型依存的重合のための鋳型としての一連の「クリック」ケミストリーでライゲートされたタグの使用を示す例示的な模式図である。
図17A〜17Cは、5'-ビオチン化「単一クリック」鋳型Y55およびY185の合成を示す。図17Aは、例示的な模式図を提供する。図17Bおよび図17Cは、それぞれ、Y55およびY185のLC-MS分析を示す。
図18A〜18Cは、「単一クリック」鋳型の「リードスルー(read-through)」のための例示的なアッセイを提供する。図18Aは、FAM標識プライマーをビオチン化鋳型にアニールして、メーカー推奨条件に従って、鋳型依存性ポリメラーゼとインキュベートする場合の模式図を示す。続いて、その複合体をストレプトアビジンビーズとインキュベートし、洗浄し、NaOHで溶出し、次いで中和する。中和後、サンプルをLC-MSで分析する。
図18A〜18Cは、「単一クリック」鋳型の「リードスルー (read-through)」のための例示的なアッセイを提供する。図18Bおよび図18Cは、それぞれ、鋳型Y55およびY185のクレノウ断片複製のLC-MSデータを示す。
図18Bの説明を参照のこと。
図19A〜19Dは、TIPS保護アルキニルタグを用いた5'-ビオチン化「二重クリック」鋳型YDCおよび「三重クリック鋳型」YTCの合成を提供する。図19Aおよび19Bは、この合成の例示的な模式図である。
図19Aの説明を参照のこと。
図19A〜19Dは、TIPS保護アルキニルタグを用いた5'-ビオチン化「二重クリック」鋳型YDCおよび「三重クリック鋳型」YTCの合成を提供する。図19Cおよび19Dは、それぞれ、YDCおよびYTC鋳型のLC-MS分析を示す。
図19Cの説明を参照のこと。
図20A〜20Cは、「二重クリック」および「三重クリック」鋳型を用いる例示的なクリック「リードスルー」アッセイを提供する。図20Aは、FAM標識プライマーをビオチン化鋳型にアニールして、メーカーが推奨する反応条件に従って、大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼIのクレノウ断片とインキュベートする場合の模式図である。その複合体をストレプトアビジンビーズとインキュベートし、洗浄し、NaOHで溶出して、中和する。中和後、サンプルをLC-MSで分析する。
図20A〜20Cは、「二重クリック」および「三重クリック」鋳型を用いる例示的なクリック「リードスルー」アッセイを提供する。図20Bおよび20Cは、それぞれ、鋳型YDCおよびYTCのクレノウ断片複製のLC-MSデータを示す。
図20Bの説明を参照のこと。
図21は、対照の「クリックなし」DNA鋳型と比較して、「単一クリック」、「二重クリック」および「三重クリック」鋳型を用いたクリック「リードスルー」の効率を示すグラフである。これらのデータは、本明細書に記載の「リードスルー」アッセイを用いて得られたものであり、収率は内部標準との比較によってLC-MS分析により測定した。
図22A〜22Cは、オルソゴナルケミストリー(orthogonal chemistry)による化学的ライゲーションの例示的な模式図を提供する。図22Aは、(ii)利用可能なリードスルー戦略のための(i)2つの逐次オルソゴナルケミストリーを利用したDNAコードタグの化学的ライゲーション戦略の模式図である。各タグは、各タグの5'末端と3'末端について異なる記号で示された、2つのオルソゴナル反応性基を含む。化学的ライゲーションの各逐次サイクルでは、オルソゴナルケミストリーが用いられる。この戦略はミスタギング事象の発生頻度を低減させ、また、反応性末端基の保護なしで使用することが可能である。
図22A〜22Cは、オルソゴナルケミストリー(orthogonal chemistry)による化学的ライゲーションの例示的な模式図を提供する。図22Bは、タグの配列を推定することができるcDNAを生成するための、オルソゴナルDNAタグのオルソゴナル化学的ライゲーションにより生成された鋳型の鋳型依存的重合「リードスルー」の模式図である。
図22A〜22Cは、オルソゴナルケミストリー(orthogonal chemistry)による化学的ライゲーションの例示的な模式図を提供する。図22Cは、図22Bと同じであるが、自己プライミングテイルピースを含み、これはPCR増幅時の鎖分離を容易にするために制限消化によって二本鎖にすることができる。
図23は、2つの特定の逐次オルソゴナルケミストリーを利用するDNAコードタグの化学的ライゲーション戦略を示す例示的な模式図である。各タグはクリック反応性基およびホスホロチオエート/ヨード反応性基を含む。3'および5'末端にオルソゴナル反応性基を有するタグは、重合することができず、かつミスタギング事象の発生頻度が低下する。限定されることを望まないが、このアプローチは、3'-アルキンのTIPS保護の必要性を排除することができる。サイクルAでは、5'-ヨード/3'-アルキニルタグを、スプリント依存的ライゲーションを用いて、3'-ホスホロチオエートヘッドピースにライゲートし、5'-アジド/3'-ホスホロチオエートタグへの化学的ライゲーションの次回のサイクルのために、反応性3'アルキンを残しておく。オルソゴナルライゲーションサイクルは任意で何度でも繰り返すことができる。
図24A〜24Bは、DNAタグ上の3'-ホスホロチオエート/5'-ヨード基の保護および使用を示す。図24Aは、これらのタグの保護基(PG)を使用するための例示的な模式図を示す。
図24A〜24Bは、DNAタグ上の3'-ホスホロチオエート/5'-ヨード基の保護および使用を示す。図24Bは、5'末端に共有結合で導入された化合物ライブラリーをコードする一連のコードDNAタグを化学的にライゲートするために、3'-ホスホロチオエート/5'-ヨードタグを使用するための例示的なスキームを示す。
図25A〜25Bは、DNAタグ上の3'-ホスホロチオエート基の保護および使用を示す。図25Aは、これらの基を保護するためのスキームを示す。
図25A〜25Bは、DNAタグ上の3'-ホスホロチオエート基の保護および使用を示す。図25Bは、5'末端に共有結合で導入された化合物ライブラリーをコードする一連のオルソゴナルなコードDNAタグを化学的にライゲートするために、3'-ホスホロチオエート/5'-アジドおよび3'-プロパルギル/5'-ヨードタグを使用するためのスキームを示す。

0065

詳細な説明
本発明は、化学実体-オリゴヌクレオチド複合体にオリゴヌクレオチドタグを導入するために一本鎖ライゲーションを使用する方法を特徴とする。この方法は、特定のタグと特定の化学反応またはビルディングブロックの間のコードされた関係を確立することによって、選択可能な化学実体の多様なライブラリーを作成するために使用することができる。1つ以上の化学実体を同定するために、オリゴヌクレオチドタグを増幅し、クローニングし、配列決定し、確立された関係を用いることによって相関させることができる。特に、タグの一本鎖ライゲーションを促進する反応条件が特定された。これらの条件には、以下が含まれる:タグ内での1つ以上の2'-置換ヌクレオチド(例えば、2'-O-メチルヌクレオチドもしくは2'-フルオロヌクレオチド)の使用、特定の長さ(例えば、5〜15ヌクレオチド)のタグの使用、1種以上の酵素(例えば、RNAリガーゼおよび/またはDNAリガーゼ)の使用、および/またはライゲーション時の1種以上の剤(例えば、ポリエチレングリコールおよび/またはCo(NH3)6Cl3などの可溶性多価カチオン)の使用。これらの方法はさらに、オリゴヌクレオチドを化学的に接合する方法を含み、その結果、接合されたオリゴヌクレオチド生成物の配列は鋳型依存性ポリメラーゼ反応のための鋳型として利用することができる。これらの複合体のライブラリーを作成してタグ付けする方法は、以下で詳細に説明される。

0066

コードライブラリーをタグ付けするための方法
本発明は、コードする関係がタグの配列と化学実体の構造単位(またはビルディングブロック)の間に確立され得るように、オリゴヌクレオチドタグを化学実体と機能的に連結するための方法を特徴とする。特に、化学実体の正体および/または履歴をオリゴヌクレオチドの塩基配列から推測することが可能である。この方法を用いて、多様な化学実体またはメンバー(例えば、小分子もしくはペプチド)を含むライブラリーは、特定のタグ配列によりアドレス指定され得る。

0067

一般に、これらの方法はヘッドピースの使用を含み、該ヘッドピースは化学的に合成され得る少なくとも1つの官能基と、一本鎖オリゴヌクレオチドが結合(またはライゲート)され得る少なくとも1つの官能基を有する。結合は、任意の有用な手段によって、例えば、酵素的結合(例えば、RNAリガーゼおよび/またはDNAリガーゼの1種以上によるライゲーション)によって、または化学的結合(例えば、求核試薬と脱離基などの、2つの官能基の間の置換反応)によって、達成することができる。

0068

ライブラリー内の多数の化学実体を生成するには、ヘッドピースを含む溶液を複数のアリコートに分割し、次いで、マルチウェルプレートウェルのような、物理的に隔離された多数の区画の中に配置することができる。一般的に、これは「スプリット(split)」の工程である。各区画またはウェル内で、各アリコート内の一本鎖タグを用いて逐次的な化学反応およびライゲーション工程を実施する。化学反応条件と一本鎖タグの配列の間の関係が記録される。反応およびライゲーション工程は任意の順序で行うことができる。その後、反応およびライゲートしたアリコートを合わせ、つまり「プール」し、任意でこの時点で精製を行ってもよい。これらのスプリット・アンド・プール工程は、任意で、繰り返すことができる。

0069

次に、ライブラリーは、本明細書に記載されるように、特性もしくは機能について試験および/または選択され得る。例えば、タグ付けした化学実体の混合物は、第1集団が特定の生物学的標的に結合し、第2集団が結合しない、少なくとも2つの集団に分離することができる。次に、第1集団を選択的に捕捉し(例えば、関心対象の標的を提供するカラムで溶出することによるか、またはアリコートを関心対象の標的とインキュベートすることによる)、任意で、任意の洗浄、精製、負の選択、正の選択、または分離の工程などにより、さらに分析または試験することができる。

0070

最後に、選択した集団内の1つ以上のメンバー(または化学実体)の化学的履歴を、機能的に連結されたオリゴヌクレオチドの配列によって決定することが可能である。その配列を特定のビルディングブロックと相関させることで、この方法は、所定の特性(例えば、標的タンパク質に結合し、それによって治療効果を誘発する傾向の増加)を有するライブラリーの個々のメンバーを同定することができる。さらなる試験と最適化のために、治療用候補化合物はその後、それらの会合したオリゴヌクレオチドタグの有無にかかわらず、同定したライブラリーメンバーを合成することによって、調製され得る。

0071

図1〜3には、ヘッドピースとの一本鎖ライゲーションを用いてライブラリーをタグ付けするための例示的な各種方法が提供され、ここでは、タグがヘッドピースの5'末端または3'末端にライゲートされ得る。タグがライゲートされる順序をコントロールするために、かつ副反応を低減させるために、これらの方法では必ず、ただ1つの反応性5'末端および1つの反応性3'末端がライゲーション時に存在するようにする。さらに、これらの例示的な方法では、タグ内で2'-置換ヌクレオチド(例えば、混合2'-デオキシ/2'-O-メチルヌクレオチド)を使用し、これらのタグは、鋳型依存的方法でヌクレオチドを重合することが可能なDNAまたはRNA依存性ポリメラーゼの鋳型として機能する。理論によって限定されることは望まないが、タグ内での1つ以上の2'-置換ヌクレオチド(例えば、2'-O-メチルヌクレオチドおよび/または2'-フルオロヌクレオチド)の使用は、記録媒体の物理的・化学的頑健性と、鋳型依存的重合を用いて配列情報を抽出する能力の両方を保持しつつ、RNAによく似ていることによって、RNAリガーゼによるライゲーションを促進することが可能である。

0072

図1は、副反応を低減するための例示的な方法を提供し、ここでは、ライゲートされた複合体およびタグは、反応性3'-OHおよび5'-一リン酸(「5'-P」)基の間の望ましくない反応を回避するように設計される。特に、このスキームはリン酸化-ライゲーションサイクルアプローチを示す。ライゲーションの間、1つの3'-OH基(タグ内)と1つの5'-P基(ヘッドピース内)のみが利用可能であり、それゆえ、ただ1つのライゲーション事象が可能である。ライゲーションおよび精製工程に続いて、5'-OH基が複合体に形成され、この基は後続のオリゴヌクレオチドタグを付加するために5'-Pに変換することができる。複合体の3'末端はXでブロックされ、Xは保護基または化学実体の構成成分(例えば、任意で、化学実体とヘッドピース間のスペーサーとして機能するリンカーを含む)であり得る。

0073

図1に示すように、例示的な方法は、ビルディングブロックタグ1(「タグ1」)をヘッドピースの5'末端にライゲートし、それによって複合体を生成し、該複合体の5'末端に逐次的にライゲートすることを含む。反応性5'末端は複合体上のリン酸基であり、そして反応性3'末端はタグ上のヒドロキシル基である。各タグの付加後、ライゲートされた複合体を、未反応の、ライゲートされていないヘッドピースおよびタグから分離し、また、他の試薬類(例えば、リン酸、コバルト、またはライゲーション工程の間に存在する他の試薬)から分離する。分離は、任意の有用な方法によって(例えば、ライゲート生成物と非ライゲート生成物のクロマトグラフィーもしくは電気泳動分離によって、または試薬の沈殿によって)達成することができる。次いで、ライゲートされた複合体は、該複合体の5'末端にリン酸基を形成するために剤(例えば、ポリヌクレオチドキナーゼまたは化学的リン酸化剤)に暴露される。分離工程とリン酸化工程はいずれの順序で行ってもよい。特に、リン酸化工程でキナーゼを使用する場合には、後続のタグ(やはり5'-OH基を含み得る)を付加させる前にキナーゼを不活性化または除去すべきであり、また、キナーゼを阻害し得る試薬は、リン酸化工程の前に反応混合物から除去すべきである。

0074

別の態様では、前記方法は、先のライゲート複合体の3'末端から逐次的なタグを結合させることを含む。この方法では、ライゲート複合体はライゲーション工程の直後に反応性3'-OH基を欠いているが、(例えば、保護基の放出によって)3'-OH基に変換され得る基を含む。図2Aは、複合体の3'末端をタグ付けするための例示的な方法を示す模式図を提供し、図2Bは、3'-連結した保護基の放出時に変換可能な3'-OH基を含む、保護した3'末端のための例示的な反応スキームを提供する。図2Aに示すように、ビルディングブロックタグ1(「タグ1」)は3'-保護した基を有する。第1工程において、例示的な方法は、ヘッドピースの3'末端への該タグのライゲーションを含み、それによって、複合体を生成する。複合体の3'末端への逐次的なライゲーションを実施する。反応性5'末端はタグ上のリン酸基であり、反応性3'末端は複合体上のヒドロキシル基である。各タグの付加後、ライゲート複合体は(例えば、加水分解剤の添加により)脱保護されて3'-保護基を放出する。

0075

さらに別の態様において、前記方法は、5'-プレアデニル化(5'-App)オリゴヌクレオチドおよびリガーゼ(例えば、T4RNAリガーゼ)を用いることによって逐次タグを結合させることを含む。ATPの存在下で、T4 RNAリガーゼは、ATP補因子を用いて、ライゲーションの前にアデニル化中間体を形成する。ATPの非存在下では、T4 RNAリガーゼはプレアデニル化オリゴヌクレオチドをライゲートするだけであり、5'-Pオリゴヌクレオチドとの可能な副反応は生じない。こうして、副反応の低減した一本鎖ライゲーションは、5'-一リン酸化タグの存在下に、化学的に合成した5'-Appオリゴヌクレオチドを用いて実施することができ、その場合に、5'-Appオリゴヌクレオチドはタグ付け前にヘッドピースに、または複数回のタグ付け後に形成された複合体に、ライゲートされ得る。

0076

図3は、プレアデニル化ヘッドピースの5'末端をタグ付けするための例示的な方法を示す模式図を提供する。5'-リン酸基でのドナー・ヌクレオチドのアデニル化はライゲーション反応の第1工程であり、この反応は一般に1分子のATPを必要とする。第2工程では、アクセプター・オリゴヌクレオチドの3'-OH基がアデニル化ドナーと反応して、2つのオリゴヌクレオチド間にジエステル結合を形成し、それゆえに1つのAMP分子を放出する。ドナー・オリゴヌクレオチドの化学的にアデニル化された5'-リン酸基はライゲーション反応の第1工程の生成物を模倣し、ATPの非存在下で第2オリゴヌクレオチドにライゲートすることができる。以下のスキームでは、5'-Appヘッドピースは、5'-リン酸化オリゴヌクレオチドタグ(「タグA」と表示)の3'-OH基にライゲートされる。オリゴヌクレオチドのアデニル化5'末端の存在のため、ライゲーションはATPの非存在下で起こり得る。これらの条件下で、タグAの5'-リン酸基はライゲーションのドナーとして機能しない。ビルディングブロックタグBは、ATPの存在下で、3'-OH末端をもつヌクレオチド(「タグB」と表示)を提供することによってライゲートすることができ、追加のタグ(「タグC」と表示)を含めることができる。

0077

図3において、ヘッドピースの3'末端は、任意の保護基(例えば、ddNなどの不可逆的な保護基、または可逆的な保護基)でブロックされ得る。第1工程では、この方法は、ATPの非存在下でのヘッドピースの5'末端へのタグのライゲーションを含み、それによって、複合体を生成する。該複合体の5'末端への逐次的なライゲーションがATPの存在下で実施される。この方法は、複合体の3'末端への逐次的なライゲーションを行うために、改変することができる。例えば、この方法は、5'-プレアデニル化タグおよび反応性3'-OH末端をもつヘッドピースの使用を含み得る。この方法はさらに、上記および図2で説明した方法のように、タグ間の交差反応を避けるために、タグの3'末端をブロックする必要があり得る。

0078

図3に提供された一般的な方法は、プライマーをヘッドピースと置き換えることによって改変することができる。この場合には、ヘッドピースはその5'末端で化学的にアデニル化されねばならず、タグAは5'末端でリン酸化される。アデニル化ヘッドピースへのこのリン酸化タグAのライゲーションは、本明細書に記載したのと同じ標準的な条件で起こるが、ATPを除外する。このライゲーション条件を用いることによって、リン酸化5'末端のライゲーションを防止することができる。次の工程では、タグBのライゲーションは、このタグが5'末端に遊離のヒドロキシル基を持っている(すなわち、非リン酸化されている)ことを必要とする。逐次的なライゲーション反応はATPの存在下で行うことができ、タグ(例えば、図3のタグC)のさらなる伸長が望まれる場合は、得られたオリゴヌクレオチドの5'末端のリン酸化が後に続く。

0079

本明細書に記載の方法は、ライブラリーを多様化するために、またはライブラリーのメンバーを問い合わせるために、任意の工程をいくつでも含むことができる。本明細書に記載される(例えば、図1〜3におけるような)タグ付け方法の場合、逐次的な「n」個の数のタグを、追加の「n」の数のライゲーション、分離、および/またはリン酸化工程により付加することができる。例示的な任意の工程としては、以下が挙げられる:1種以上の制限エンドヌクレアーゼを用いたライブラリーメンバーの制限;ライブラリー末端の一方または両方への1つ以上のアダプター配列(例えば、増幅および配列決定のためのプライミング配列を提供する、または配列の固定化のためのビオチンなどの標識を提供する1つ以上のアダプター配列)のライゲーション;逆転写酵素転写酵素、または他の鋳型依存性ポリメラーゼを用いた複合体中の集合(assembled)タグの逆転写または転写(任意で、その後の逆転写);複合体中の集合タグの、例えばPCRを用いた、増幅;例えば、細菌の形質転換エマルション形成、希釈、表面捕捉技術などによる、複合体中の集合タグの1つ以上の集団のクローン離物の生成;例えば、ヌクレオチドの鋳型依存的重合のための鋳型としてクローン単離物を用いることによる、複合体中の集合タグの1つ以上の集団のクローン単離物の増幅;ならびに、例えば、蛍光標識ヌクレオチドを用いた鋳型依存的重合のための鋳型としてクローン単離物を用いることによる、複合体中の集合タグの1つ以上の集団のクローン単離物の配列決定。オリゴヌクレオチドタグを増幅し、配列決定するためのさらなる方法は、本明細書に記載される。

0080

これらの方法は、特性または機能を備えたいくつもの化学実体を、例えば選択工程で、同定および発見するために使用することができる。望ましい特性または機能は、所望の機能を有するライブラリー中のメンバーまたは関連メンバーの少なくとも1つの付随する濃縮により、ライブラリーを少なくとも2つの部分に分割するための基礎として使用することができる。特定の態様において、この方法は、治療上関心のあるタンパク質と結合する、または該タンパク質を不活性化する、小さい薬物様ライブラリーメンバーを同定することを含む。別の態様では、規定された化学的条件下での所定のビルディングブロックの反応がコンビナトリアルな複数の分子(または分子のライブラリー)を生成し、その場合に1つ以上の分子が特定のタンパク質のための治療薬としての有用性をもち得るように、一連の化学反応が設計され、かつビルディングブロックのセットが選択される。例えば、化学反応およびビルディングブロックは、キナーゼ阻害剤に共通して存在する構造グループを有するライブラリーを作成するように選択される。これらの場合のいずれにおいても、タグはライブラリーメンバーの化学的履歴をコードしており、それぞれの場合に、化学的可能性のコレクションは特定のタグの組み合わせによって表すことができる。

0081

一態様では、化学実体のライブラリーまたはその一部を、生物学的標的と、該ライブラリーの少なくとも1つのメンバーが該標的に結合するのに適した条件下で接触させ、続いて該標的に結合しないライブラリーメンバーを除去し、それらに会合した1つ以上のオリゴヌクレオチドタグを解析する。この方法は、任意で、当技術分野で公知の方法によりタグを増幅することを含み得る。例示的な生物学的標的としては、酵素(例えば、キナーゼ、ホスファターゼメチラーゼデメチラーゼプロテアーゼ、およびDNA修復酵素)、タンパク質:タンパク質相互作用に関与するタンパク質(例えば、受容体のリガンド)、受容体標的(例えば、GPCRおよびRTK)、イオンチャンネル、細菌、ウイルス寄生虫、DNA、RNA、プリオン、および炭水化物が挙げられる。

0082

別の態様では、標的に結合する化学実体は、増幅に供されることなく、直接解析される。例示的な解析方法としては、エバネッセント共鳴フォトニック結晶解析を含む、マイクロアレイ解析;タグをデコンボリューションするためのビーズベースの方法(例えば、hisタグを用いることによる);ラベルフリーフォトニック結晶バイオセンサー分析(例えば、SRU Biosystems Inc. (Woburn, MA)製のBIND(登録商標)Reader);またはハイブリダイゼーションに基づくアプローチ(例えば、タグのライブラリー中に存在する配列に相補的な固定化オリゴヌクレオチドアレイを用いることによる)が挙げられる。

0083

さらに、化学的共反応対(または官能基)は、固相オリゴヌクレオチド合成スキームに容易に含めることができ、オリゴヌクレオチドの効率的な化学的ライゲーションを支持する。また、その結果得られるライゲートされたオリゴヌクレオチドは、1種以上のポリメラーゼを用いた鋳型依存的重合のための鋳型として働くことができる。したがって、コードライブラリーをタグ付けするための、本明細書に記載の結合工程はどれも、酵素的ライゲーションおよび/または化学的ライゲーション技術の1つ以上を含むように改変することができる。例示的なライゲーション技術には、例えば1種以上のRNAリガーゼおよび/またはDNAリガーゼを用いる、酵素的ライゲーション;ならびに、例えば化学的共反応対(例えば、置換されていてもよいアルキニルおよびアジド官能基を含む対)を用いる、化学的ライゲーションが含まれる。

0084

さらに、1つ以上のライブラリーは、スプリット-アンド-ミックス工程で組み合わせることができる。2つ以上のライブラリーの混合を可能にするために、ライブラリーメンバーは、本明細書に記載されるように、ライゲートされるビルディングブロックタグ中に、またはヘッドピース配列の一部として、ライブラリー識別タグ内になどに、1つ以上のライブラリー識別配列を含むことができる。

0085

質量の減少を有する方法
一本鎖コード戦略のための動機の多くは、二本鎖タグと比較して、一本鎖タグの質量の低下に起因する。質量の減少は、潜在的に、溶解性の向上、コストの低下、反応性の増加、標的接近性の増加、流体力学半径の減少、分析評価の精度向上などを含む、いくつかの利点を与える。一本鎖タギングの方法論を使用することに加えて、質量のさらなる減少は、以下の1つ以上の使用を含めることによって達成され得る:長さを短縮させた1つ以上のタグ、定常質量のタグのセット、コードするヘッドピース、プライマー結合領域および/または定常領域を欠くライブラリーの1つ以上のメンバー、定常領域を短縮させたライブラリーの1つ以上のメンバー、または本明細書に記載の他のいずれかの方法論。

0086

ライブラリーのメンバーの質量を最小にするために、1つ以上のビルディングブロックタグの長さは、例えば各スプリットサイズをコードするために可能な限り短い長さに、短縮することができる。具体的には、タグは20ヌクレオチド未満(例えば、19ヌクレオチド未満、18ヌクレオチド未満、17ヌクレオチド未満、16ヌクレオチド未満、15ヌクレオチド未満、14ヌクレオチド未満、13ヌクレオチド未満、12ヌクレオチド未満、11ヌクレオチド未満、10ヌクレオチド未満、9ヌクレオチド未満、8ヌクレオチド未満、または7ヌクレオチド未満)であり得る。以下の実施例に記載されるように、より短いタグ(例えば、約10ヌクレオチドまたはより短い)は、タグライゲーションに使用することができる。

0087

定常質量の戦略もまた使用することができ、これはライブラリー合成中の分析を助けることができる。さらに、定常質量のタグのセットは、すべての単一エラーの発生(例えば、配列の読み誤りまたはタグの化学的もしくは酵素的ライゲーションに起因するエラー)およびほとんどの多重エラーの発生の認識を可能にすることができる。定常質量の一本鎖タグのセットの長さとコード能力との関係(例えば、特定のビルディングブロックのスプリットサイズまたはライブラリーの正体などを支持するための最小の長さ)は、以下の表1に概説される。したがって、定常質量のタグのセットは、ライブラリー形成中のエラー認識を維持しつつ、有益なコード能力を提供するために使用することができる。

0088

0089

ライブラリーの質量を最小にするために、ヘッドピースは、化学的部分とタグとを連結するためだけでなく、特定のライブラリーの正体または特定の工程をコードするためにも使用することができる。例えば、ヘッドピースは情報をコードすることができ、例えば、複数のヘッドピースは、第1のスプリットまたはライブラリーの正体を、例えば特定のライブラリーに関連する特定の配列を用いることによって、コードすることができる。

0090

また、DNAコードされた化学実体のライブラリーからのプライマー結合(例えば、定常)領域は、選択工程中に除外することができる。その後、これらの領域は、例えば一本鎖ライゲーションによって、選択後に付加することができる。1つの例示的な戦略は、コードするオリゴヌクレオチドの5'末端に化学実体を提供し、任意の有用な特性または機能に基づいて特定の化学実体を選択し、そしてコードするオリゴヌクレオチドの3'末端に、プライマー結合配列を含みかつ任意で1つ以上のタグ、例えば本明細書に記載されるような「使用」タグ、「起源」タグなど、を含むことができる、テイルピースオリゴヌクレオチドをライゲートすることを含むだろう。このプライマー結合配列は、選択されたライブラリーメンバーに相補的なcDNA(またはcRNA)を生成するための鋳型依存的重合を開始するために使用することができる。該cDNAまたはcRNAは次に、プライマー結合配列を含むオリゴヌクレオチドにその3'末端でライゲートされ、この段階でコード情報にはプライマー結合配列が両側に隣接するので、該オリゴヌクレオチドは、本明細書に記載されるような、確立されたアプローチを用いて配列決定および/または増幅が可能である。

0091

質量はさらに、コードタグを分離する1つ以上の定常配列を省くか、またはそのサイズを減少することによって、最小化することができる。一本鎖ライゲーションは、ライゲートされるべき末端部間またはこれらの末端部とスプリント間に相補的な関係を必要としない。したがって、一定の配列は酵素的ライゲーションを支持するために必要とされない。タグ間の短い一定領域は、タグのインフォマテクス解析または他のインシリコ(in silico)デコンボリューションプロセスに有用であり得る。

0092

オリゴヌクレオチドタグ
本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドタグ(例えば、ビルディングブロックタグまたはヘッドピースの一部)は、例えば以下のような、有用な情報をコードするために使用することができる:分子、化学実体の一部、構成成分(例えば、足場もしくはビルディングブロック)の付加、ライブラリーのヘッドピース、ライブラリーの正体、1つ以上のライブラリーメンバーの使用(例えば、ライブラリーのアリコート内のメンバーの使用)、および/またはライブラリーメンバーの起源(例えば、起源配列の使用による)。

0093

オリゴヌクレオチド中の任意の配列は、任意の情報をコードするために使用することができる。したがって、1つのオリゴヌクレオチド配列は、2つ以上のタイプの情報をコードするか、または1つ以上のタイプの情報をもコードする出発オリゴヌクレオチドを提供するなど、2つ以上の目的を果たすことができる。例えば、第1ビルディングブロックタグは、第1ビルディングブロックの付加ならびにライブラリーの識別をコードすることができる。別の例において、ヘッドピースは、化学実体をビルディングブロックタグに機能的に連結する出発オリゴヌクレオチドを提供するために使用することができ、この場合、該ヘッドピースはライブラリーの正体をコードする配列(すなわち、ライブラリー識別配列)をさらに含む。したがって、本明細書に記載の情報はどれも、別個のオリゴヌクレオチドタグ中にコードされてもよいし、または同じオリゴヌクレオチド配列(例えば、ビルディングブロックタグなどのオリゴヌクレオチドタグ、もしくはヘッドピース)中に組み合わせて、コードされてもよい。

0094

ビルディングブロック配列は、ビルディングブロックの正体および/またはビルディングブロックを用いて行われた結合反応のタイプをコードする。このビルディングブロック配列はビルディングブロックタグに含まれ、該タグは、任意で、以下に記載する配列の1つ以上のタイプ(例えば、ライブラリー識別配列、使用配列、および/または起源配列)を含むことができる。

0095

ライブラリー識別配列は特定のライブラリーの正体をコードする。2つ以上のライブラリーの混合を可能にするために、ライブラリーメンバーは、例えば、ライブラリー識別タグ(すなわち、ライブラリー識別配列を含むオリゴヌクレオチド)内に、ライゲートされるビルディングブロックタグ内に、ヘッドピース配列の一部内に、またはテイルピース配列内に、1つ以上のライブラリー識別配列を含み得る。これらのライブラリー識別配列は、コード関係を推定するために使用することができ、この場合には、タグの配列が翻訳され、化学的(合成)履歴情報と相関される。したがって、これらのライブラリー識別配列は、選択、増幅、精製、配列決定などのために2つ以上のライブラリーを一緒に混合することを可能にする。

0096

使用配列は、ライブラリーの個々のアリコート中の1つ以上のライブラリーメンバーの履歴(すなわち、使用)をコードする。例えば、別個のアリコートは、異なる反応条件、ビルディングブロック、および/または選択工程を用いて処理され得る。特に、この配列を用いると、そのようなアリコートを識別し、かつそれらの履歴(使用)を推定することができ、それによって、選択、増幅、精製、配列決定などのためにサンプルを一緒に混合することを目的として、異なる履歴(使用)(例えば、明確に区別される選択実験)を有する同じライブラリーのアリコートを一緒に混合することが可能になる。こうした使用配列は、ヘッドピース、テイルピース、ビルディングブロックタグ、使用タグ(すなわち、使用配列を含むオリゴヌクレオチド)、または本明細書に記載される他のタグ(例えば、ライブラリー識別タグもしくは起源タグ)内に含めることができる。

0097

起源配列は、ライブラリーメンバーの起源をコードする、任意の有効な長さ(例えば、約6オリゴヌクレオチド)の縮重(ランダム)オリゴヌクレオチド配列である。この配列は、さもなければすべての点で同一であるライブラリーメンバーを、配列情報によって識別可能な実体へと確率的に細分するのに役立ち、その結果として、ユニークな祖先鋳型(例えば、選択されたライブラリーメンバー)に由来する増幅産物の観察は、同一の祖先鋳型(例えば、選択されたライブラリーメンバー)に由来する多数の増幅産物の観察から区別することができるようになる。例えば、ライブラリーの形成後であって選択工程の前に、各ライブラリーメンバーは、例えば起源タグ内に、異なる起源配列を含むことができる。選択の後、選択されたライブラリーメンバーを増幅して増幅産物を生成することができ、そして起源配列を(例えば、起源タグ内に)含んでいると予想されるライブラリーメンバーの部分を観察して、他のライブラリーメンバーの各々における起源配列と比較することができる。起源配列は縮重しているので、各ライブラリーメンバーの各増幅産物は異なる起源配列をもつはずである。しかし、増幅産物での同じ起源配列の観察は、反復した配列を生成する配列の増幅エラーまたは環化エラーなどのエラーの源を示すことができ、こうしたエラーの開始点または源は、ライブラリーを使用する各工程(例えば、各選択工程もしくは増幅工程)で起源配列を観察することによって追跡することができる。こうした起源配列は、ヘッドピース、テイルピース、ビルディングブロックタグ、起源タグ(すなわち、起源配列を含むオリゴヌクレオチド)、または本明細書に記載される他のタグ(例えば、ライブラリー識別タグもしくは使用タグ)内に含めることができる。

0098

本明細書に記載される配列のタイプはどれも、ヘッドピースに含めることができる。例えば、ヘッドピースは、ビルディングブロック配列、ライブラリー識別配列、使用配列、または起源配列の1つ以上を含むことができる。

0099

本明細書に記載されるこれらの配列のどれも、テイルピースに含めることができる。例えば、テイルピースは、ライブラリー識別配列、使用配列、または起源配列の1つ以上を含むことができる。

0100

これらの配列は、オリゴヌクレオチドについて本明細書で記載した任意の修飾を含むことができ、例えば、有機溶媒中での溶解性を促進する修飾(例えば、ヘッドピースについてなど、本明細書で記載したいずれか)、天然のホスホジエステル結合のアナログ(例えば、ホスホロチオエートアナログ)を提供する修飾、または1つ以上の非天然オリゴヌクレオチド(例えば、2'-置換ヌクレオチド(例:2'-O-メチル化ヌクレオチドおよび2'-フルオロヌクレオチドなど)、または本明細書で記載したいずれか)を提供する修飾の1つ以上を含むことができる。

0101

これらの配列は、オリゴヌクレオチドについて本明細書で記載した任意の特徴を含むことができる。例えば、これらの配列は、(本明細書に記載されるように)20ヌクレオチド未満であるタグ内に含めることができる。他の例において、これらの配列の1つ以上を含むタグは、ほぼ同じ質量を有する(例えば、各タグは2つ以上のタグ間の平均質量から+/-約10%の質量を有する);プライマー結合(例えば、定常)領域を欠く;定常領域を欠く;または短縮された長さ(例えば、30ヌクレオチド未満、25ヌクレオチド未満、20ヌクレオチド未満、19ヌクレオチド未満、18ヌクレオチド未満、17ヌクレオチド未満、16ヌクレオチド未満、15ヌクレオチド未満、14ヌクレオチド未満、13ヌクレオチド未満、12ヌクレオチド未満、11ヌクレオチド未満、10ヌクレオチド未満、9ヌクレオチド未満、8ヌクレオチド未満、もしくは7ヌクレオチド未満の長さ)の定常領域を有する。

0102

この長さのライブラリーおよびオリゴヌクレオチドについての配列決定戦略は、任意で、それぞれ、読み忠実度または配列決定の深度を増加させるためにコンカテネーション(concatenation)またはカテネーション(catenation)戦略を含むことができる。特に、プライマー結合領域を欠くコードライブラリーの選択は、SELEXについての文献に記載されており、例えば、Jarosch et al., Nucleic AcidsRes. 34: e86 (2006)に記載され、これは参照により本明細書に組み入れられる。例えば、ライブラリーメンバーは、複合体の5'末端に第1アダプター配列および複合体の3'末端に第2アダプター配列を含むように(例えば、選択工程の後で)修飾することができ、ここで、第1配列は第2配列に実質的に相補的であって、二重鎖の形成をもたらす。収率をさらに向上させるためには、2つの固定したダングリング(dangling)ヌクレオチド(例えば、CC)を5'末端に付加する。特定の態様では、第1アダプター配列は

であり、第2アダプター配列は

である。

0103

ヘッドピース
ライブラリーでは、ヘッドピースは、各化学実体をそのコードオリゴヌクレオチドタグに機能的に連結する。一般に、ヘッドピースは、さらに誘導体化され得る2つの官能基を有する出発オリゴヌクレオチドであり、ここで、第1官能基は化学実体(またはその構成成分)をヘッドピースに機能的に連結し、第2官能基は1つ以上のタグをヘッドピースに機能的に連結する。ヘッドピースと化学実体の間のスペーサーとして、任意で、リンカーを用いることができる。

0104

ヘッドピースの官能基は、化学実体の構成成分と共有結合を形成し、かつタグと別の共有結合を形成するために使用され得る。その構成成分は、小分子の任意の部分、例えば、多様性ノードを有する足場またはビルディングブロックとすることができる。あるいは、ヘッドピースは、リンカー(すなわち、ライブラリー内に形成される小分子からヘッドピースを隔離するスペーサー)を提供するように誘導体化することができ、該リンカーは、化学実体の構成成分と共有結合を形成するために用いられる、官能基(例えば、ヒドロキシル、アミン、カルボキシルスルフヒドリル、アルキニル、アジド、またはリン酸基)で終端する。リンカーは、ヘッドピースの5'末端に、内部位置の1つに、または3'末端に繋ぎ止めることができる。リンカーが内部位置の1つに繋ぎ止められる場合、リンカーは誘導体化された塩基(例えば、ウリジンのC5位置)に機能的に連結されるか、または当技術分野で公知の標準的な技術を用いてオリゴヌクレオチドに内部的に配置される。例示的なリンカーは本明細書に記載される。

0105

ヘッドピースは任意の有用な構造をもつことができる。ヘッドピースは、例えば、1〜100ヌクレオチド長、好ましくは、5〜20ヌクレオチド長、最も好ましくは、5〜15ヌクレオチド長であり得る。ヘッドピースは一本鎖または二本鎖であってよく、天然のヌクレオチドまたは本明細書に記載されるような修飾ヌクレオチドで構成され得る。ヘッドピースの特定の例示的な態様は図4A〜4Dに記載される。例えば、化学的部分は、ヘッドピースの3'末端(図4A)または5'末端(図4B)に機能的に連結することができる。特定の態様では、ヘッドピースは配列内の相補的な塩基によって形成されたヘアピン構造を含む。例えば、化学的部分は、ヘッドピースの内部位置(図4C)、3'末端(図4D)、または5'末端に機能的に連結することができる。

0106

一般に、ヘッドピースは5'末端または3'末端に非相補的な配列を含み、該配列は重合、酵素的ライゲーション、または化学反応によりオリゴヌクレオチドタグの結合を可能にする。図4Eでは、例示的なヘッドピースはオリゴヌクレオチドタグ(1〜4と表示)のライゲーションを可能にし、この方法は精製およびリン酸化の工程を含む。タグ4を付加した後、追加のアダプター配列をタグ4の5'末端に付加することができる。例示的なアダプター配列は、プライマー結合配列または標識(例えば、ビオチン)を有する配列を含む。多くのビルディングブロックおよび対応するタグが用いられる場合(例えば、100のタグ)、必要な数のタグを生成するためにオリゴヌクレオチド合成工程の間にミックス-アンド-スプリット戦略が採用され得る。DNA合成のためのこのようなミックス-アンド-スプリット戦略は当技術分野で知られている。得られたライブラリーメンバーは、関心対象の標的に対する結合実体について選択した後で、PCRにより増幅することができる。

0107

ヘッドピースまたは複合体は、任意で、1つ以上のプライマー結合配列を含むことができる。例えば、ヘッドピースは、ヘアピンのループ領域に、増幅のためのプライマー結合領域として機能する配列を有し、この場合に、そのプライマー結合領域は、ヘッドピース内の配列に対してよりも、その相補的なプライマー(例えば、隣接する識別子領域を含むことができる)に対して高い融解温度を有する。他の態様において、複合体は、1つ以上のビルディングブロックをコードする1つ以上のタグの両側に、(例えば、PCR反応を可能にするために)2つのプライマー結合配列を含む。あるいは、ヘッドピースは、5'または3'末端に1つのプライマー結合配列を含んでもよい。他の態様では、ヘッドピースはヘアピンであって、ループ領域がプライマー結合部位を形成するか、またはプライマー結合部位がループの3'側でヘッドピースへのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを介して導入される。ヘッドピースの3'末端に相同な領域を含みかつ(例えば、PCR反応を可能にするために)その5'末端にプライマー結合領域を有する、プライマーオリゴヌクレオチドは、ヘッドピースにハイブリダイズすることができ、かつビルディングブロックまたはビルディングブロックの付加をコードするタグを含むことができる。プライマーオリゴヌクレオチドは、バイオインフォマティクス分析のために含まれる、ランダム化されたヌクレオチドの領域(例えば2〜16ヌクレオチド長)などの、追加の情報を含んでもよい。

0108

ヘッドピースは、任意で、ヘアピン構造を含むことができ、この構造は有用な方法によって達成することができる。例えば、ヘッドピースは、ワトソン・クリックのDNA塩対形成(例えば、アデニン-チミンおよびグアニン-シトシン)および/またはゆらぎ塩基対形成(例えば、グアニン-ウラシル、イノシン-ウラシル、イノシン-アデニン、およびイノシン-シトシン)などによって、分子間塩基対形成パートナーを形成する相補的な塩基を含むことができる。別の例において、ヘッドピースは、非修飾ヌクレオチドと比較して、より高い親和性の二重鎖形成を形成し得る修飾または置換ヌクレオチドを含むことができ、こうした修飾または置換ヌクレオチドは当技術分野で公知である。さらに別の例では、ヘッドピースは、ヘアピン構造を形成するために1つ以上の架橋された塩基を含む。例えば、一本鎖内の塩基または異なる二本鎖内の塩基は、例えばソラーレン(psoralen)を用いることによって、架橋され得る。

0109

ヘッドピースまたは複合体は、任意で、検出を可能にする1つ以上の標識を含むことができる。例えば、ヘッドピース、1つ以上のオリゴヌクレオチドタグ、および/または1つ以上のプライマー配列は、アイソトープ放射性イメージング剤マーカートレーサー、蛍光標識(例:ローダミンもしくはフルオレセイン)、化学発光標識量子ドット、およびレポーター分子(例:ビオチンもしくはhisタグ)を含むことができる。

0110

他の態様において、ヘッドピースまたはタグは、半水性、低水性、または非水性(例えば、有機)条件での溶解性を促進するように修飾することができる。ヘッドピースまたはタグのヌクレオチド塩基は、それらの相補的塩基に水素結合する能力を有意に破壊することなく、例えば、TまたはC塩基のC5位置を脂肪族鎖で修飾することによって、より疎水性にすることができる。例示的な修飾または置換ヌクレオチドは、5'-ジメトキシトリチル-N4-ジイソブチルアミノメチリデン-5-(1-プロピニル)-2'-デオキシシチジン,3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホルアミダイト;5'-ジメトキシトリチル-5-(1-プロピニル)-2'-デオキシウリジン,3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホルアミダイト;5'-ジメトキシトリチル-5-フルオロ-2'-デオキシウリジン,3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホルアミダイト;および5'-ジメトキシトリチル-5-(ピレン-1-イル-エチニル)-2'-デオキシウリジン,3'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホルアミダイトである。

0111

また、ヘッドピースオリゴヌクレオチドには、有機溶媒中での溶解性を促進する修飾を組み入れることができる。例えば、アゾベンゼンホスホルアミダイトは、ヘッドピースの設計に疎水性部分を導入し得る。ヘッドピースへの疎水性アミイトのそうした挿入は、分子内のどこにでも行うことができる。しかし、挿入は、ライブラリー合成時の追加のDNAタグを用いた後続のタグ付け、または選択が完了した時点でのその後のPCR、またはタグのデコンボリューションのために使用する場合はマイクロアレイ分析、を妨害すべきでない。本明細書に記載のヘッドピースの設計へのこのような追加は、例えば15%、25%、30%、50%、75%、90%、95%、98%、99%、または100%の有機溶媒中にヘッドピースを可溶性にする。したがって、ヘッドピースの設計への疎水性残基の追加は、オリゴヌクレオチドタグ付けに対してヘッドピースを適格にしつつ、半水性または非水性(例えば、有機)条件での溶解性の向上を可能にする。さらに、ライブラリーにその後導入されるDNAタグは、TまたはC塩基のC5位置で修飾することができ、その結果、それらもまた、ライブラリー合成の後続の工程のためにライブラリーをより疎水性にし、かつ有機溶媒中により可溶性にする。

0112

特定の態様において、ヘッドピースおよび第1ビルディングブロックタグは、同じ実体であり得、すなわち、複数のヘッドピース-タグ実体は、すべてが共通の部分(例えば、プライマー結合領域)を共有し、かつすべてが他の部分(コード領域)で異なるように構築され得る。これらは「スプリット」工程で利用され、それらがコードしている事象が起こった後にプールされ得る。

0113

特定の態様において、ヘッドピースは、例えば、第1スプリット工程をコードする配列を含めることによって、または特定のライブラリーに関連した特定の配列を用いるなどして、ライブラリーの正体をコードする配列を含めることによって、情報をコードすることができる。

0114

酵素的ライゲーションおよび化学的ライゲーション技術
さまざまなライゲーション技術は、足場、ビルディングブロック、リンカー、ビルディングブロックタグ、および/またはヘッドピースを付加して複合体を形成するために使用され得る。したがって、本明細書に記載の結合工程はどれも、例えば、酵素ライゲーションおよび/または化学的ライゲーションなどの、有用なライゲーション技術を含むことができる。こうした結合工程は、ヘッドピースまたは複合体への1つ以上のビルディングブロックタグの付加;ヘッドピースへのリンカーの付加;およびヘッドピースまたは複合体への1つ以上の足場またはビルディングブロックの付加を含むことができる。特定の態様において、任意のオリゴヌクレオチドに用いられるライゲーション技術は、ライブラリーのデコーディング(decoding)または1種以上のDNAもしくはRNAポリメラーゼによる鋳型依存的重合を可能にするために転写および/または逆転写され得る、結果として生じた生成物を提供する。

0115

一般的に、酵素ライゲーションは、転写および/または逆転写され得る天然のホスホジエステル結合を有するオリゴヌクレオチドを生成する。酵素ライゲーションの例示的な方法は本明細書に提供され、以下のような1種以上のRNAまたはDNAリガーゼの使用を含む:T4RNAリガーゼ、T4 DNAリガーゼ、CircLigase(商標)ssDNAリガーゼ、CircLigase(商標)II ssDNAリガーゼ、およびThermoPhage(商標)ssDNAリガーゼ(Prokazyme Ltd., Reykjavik,アイスランド)。

0116

化学的ライゲーションもまた、転写または逆転写され得るオリゴヌクレオチドを生成するために使用することができる。化学的ライゲーションの1つの利点は、このようなオリゴヌクレオチドの固相合成を、効率的なライゲーション収率を支持するように最適化することができる、ことである。しかし、転写または逆転写され得るオリゴヌクレオチドを提供する化学的ライゲーション法の有効性は、試験される必要がある。この有効性は、例えば、液体クロマトグラフィー-質量分析、RT-PCR分析、および/またはPCR分析などの、任意の有用な方法によって試験することができる。こうした方法の例は実施例5に提供される。

0117

特定の態様において、化学的ライゲーションは、転写または逆転写され得るスペーサーを提供するための1つ以上の化学的共反応対の使用を含む。特に、化学的共反応対に適した反応は、環化プロセスのための好ましい候補である(Kolb et al., Angew. Chem. Int. Ed., 40:2004-2021 (2001); Van der Eycken et al., QSARComb. Sci, 26:1115-1326 (2007))。例示的な化学的共反応対は、以下を含む対である:Huisgen 1,3-双極子環化付加反応を介してトリアゾールスペーサーを形成するための、置換されていてもよいアルキニル基と置換されていてもよいアジド基;Diels-Alder反応を介してシクロアルケニルスペーサーを形成するための、4π電子系を有する置換されていてもよいジエン(例えば、置換されていてもよい1,3-不飽和化合物、例えば、置換されていてもよい1,3-ブタジエン、1-メトキシ-3-トリメチルシリルオキシ-1,3-ブタジエン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン、またはフラン)と2π電子系を有する置換されていてもよいジエノフィルまたは置換されていてもよいヘテロジエノフィル(例えば、置換されていてもよいアルケニル基または置換されていてもよいアルキニル基);開環反応を介してヘテロアルキルスペーサーを形成するための、求核試薬(例えば、置換されていてもよいアミンまたは置換されていてもよいチオール)と歪を有するヘテロシクリル求電子試薬(例えば、置換されていてもよいエポキシド、アジリジン、アジリジニウムイオン、またはエピスルホニウムイオン);5'-ヨードdTを含むオリゴヌクレオチドと3'-ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとのスプリント化ライゲーションにおけるなどの、ホスホロチオエート基とヨード基;ならびに3'-アルデヒド修飾オリゴヌクレオチド(任意で、市販の3'-グリセリル修飾オリゴヌクレオチドを酸化することによって得ることができる)と5'-アミノオリゴヌクレオチド(すなわち、還元的アミノ化反応)または5'-ヒドラジドオリゴヌクレオチドとの反応のような、アルデヒド基とアミノ基。

0118

他の態様において、化学的ライゲーションは、例えば、選択後PCR分析および配列決定のための、ホスホジエステル結合のアナログを導入することを含む。ホスホジエステルの例示的なアナログには、ホスホロチオエート結合(例えば、ホスホロチオエート基と、ヨード基などの脱離基の使用によって導入される)、ホスホルアミド結合、またはホスホロジチオエート結合(例えば、ホスホロジチオエート基と、ヨード基などの脱離基の使用によって導入される)が含まれる。

0119

酵素的ライゲーションまたは化学的ライゲーションを促進するための反応条件
本発明はまた、ヘッドピースとタグ間または2つのタグ間の酵素的または化学的ライゲーションを促進する1つ以上の反応条件を特徴とする。こうした反応条件としては、以下が挙げられる:本明細書に記載するように、タグ内で修飾ヌクレオチドを使用すること;異なる長さを有するドナータグとアクセプタータグを使用すること、およびそれらのタグの濃度を変化させること;異なるタイプのリガーゼ、ならびにそれらの組み合わせ(例えば、CircLigase(商標)DNAリガーゼおよび/またはT4RNAリガーゼ)を使用すること、およびそれらの濃度を変化させること;異なる分子量を有するポリエチレングリコール(PEG)を使用すること、およびそれらの濃度を変化させること;非PEGクラウディング剤(例えば、ベタインまたはウシ血清アルブミン)の使用;ライゲーションのための温度および持続時間を変化させること;ATP、Co(NH3)6Cl3、および酵母無機ピロリン酸を含むさまざまな剤の濃度を変えること;酵素的または化学的にリン酸化されたオリゴヌクレオチドタグを使用すること;3'-保護されたタグを使用すること;ならびにプレアデニル化されたタグを使用すること。これらの反応条件はまた、化学的ライゲーションを含む。

0120

ヘッドピースおよび/またはタグは、1つ以上の修飾または置換ヌクレオチドを含むことができる。好ましい態様において、ヘッドピースおよび/またはタグは、酵素的ライゲーションを促進する1つ以上の修飾または置換ヌクレオチドを含み、例えば、2'-O-メチルヌクレオチド(例:2'-O-メチルグアニンもしくは2'-O-メチルウラシル)、2'-フルオロヌクレオチド、またはライゲーションの基質として利用される他の修飾ヌクレオチドが含まれる。あるいは、ヘッドピースおよび/またはタグは、化学的ライゲーションを促進する1つ以上の化学的反応性基(例えば、置換されていてもよいアルキニル基および置換されていてもよいアジド基)を含むように修飾される。任意で、タグオリゴヌクレオチドは両末端で化学的反応性基により官能化され、任意で、これらの末端の一方は保護される。その結果として、これらの基は独立してアドレス指定され、かつ副反応が低減され得る(例えば、重合副反応の低減)。

0121

酵素的ライゲーションは1種以上のリガーゼを含むことができる。例示的なリガーゼとしては、以下が挙げられる:CircLigase(商標)ssDNAリガーゼ(EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI)、CircLigase(商標)II ssDNAリガーゼ(同様にEPICENTRE Biotechnologiesから)、ThermoPhage(商標)ssDNAリガーゼ(Prokazyme Ltd., Reykjavik,アイスランド)、T4RNAリガーゼ、およびT4 DNAリガーゼ。好ましい態様では、ライゲーションはRNAリガーゼまたはRNAリガーゼとDNAリガーゼの組み合わせの使用を含む。ライゲーションはさらに、1種以上のリガーゼとの組み合わせで、Co(NH3)6Cl3などの1種以上の可溶性多価カチオンを含むことができる。

0122

ライゲーション工程の前または後に、複合体は3つの理由のために精製され得る。第一に、交差反応を生じて、コードプロセスに「ノイズ」を導入する可能性がある、未反応のヘッドピースまたはタグを除去するために、複合体を精製することができる。第二に、リガーゼのライゲーション活性を阻害するまたは低下させる可能性がある、試薬類または未反応出発物質を除去するために、複合体を精製することができる。例えば、リン酸はライゲーション活性の低下を招く可能性がある。第三に、化学的またはライゲーション工程に導入された実体は、後続の化学的またはライゲーション工程を可能にするために、除去する必要があるかもしれない。複合体を精製する方法は本明細書に記載される。

0123

酵素的および化学的ライゲーションは、300ダルトンを超える分子量(例えば、600ダルトン超、3,000ダルトン、4,000ダルトン、または4,500ダルトン)を有するポリエチレングリコールを含むことができる。特定の態様では、ポリエチレングリコールは約3,000ダルトン〜9,000ダルトン(例えば、3,000ダルトン〜8,000ダルトン、3,000ダルトン〜7,000ダルトン、3,000ダルトン〜6,000ダルトン、および3,000ダルトン〜5,000ダルトン)の平均分子量を有する。好ましい態様では、ポリエチレングリコールは約3,000ダルトン〜約6,000ダルトン(例えば、3,300ダルトン〜4,500ダルトン、3,300ダルトン〜5,000ダルトン、3,300ダルトン〜5,500ダルトン、3,300ダルトン〜6,000ダルトン、3,500ダルトン〜4,500ダルトン、3,500ダルトン〜5,000ダルトン、3,500ダルトン〜5,500ダルトン、および3,500ダルトン〜6,000ダルトン、例えば4,600ダルトン)の平均分子量を有する。ポリエチレングリコールは、約25%(w/v)〜約35%(w/v)などの、任意の有用な量で、例えば30%(w/v)の量で、存在することができる。

0124

本発明の好ましい態様において、ビルディングブロックタグは、以下に概説するライゲーションプロトコルを用いて、一本鎖オリゴヌクレオチドと一本鎖オリゴヌクレオチドのライゲーションによって導入される:

さらなる態様では、前記プロトコルは37℃で20時間のインキュベーションを含む。実際のライブラリー構築においては、ヘッドピース、タグ、および/またはリガーゼのより高い濃度を使用することができ、これらの濃度に対する変更は、当業者には明らかであろう。

0125

ライブラリー内の化学実体をコードするための方法
本発明の方法は、オリゴヌクレオチドタグでコードされた多様な数の化学実体を有するライブラリーを合成するために使用することができる。ビルディングブロックおよびコードDNAタグの例は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2007/0224607号に見出される。

0126

各化学実体は、1つ以上のビルディングブロックおよび任意で足場から形成される。足場は、特定の形状(例えば、ヘテロアリール環のまわりに空間的に配置されたノードを提供するトリアジンまたは直線形状)で1つ以上の多様性ノードを提供するのに役立つ。

0127

ビルディングブロックおよびそれらのコードタグは、複合体を形成するためにヘッドピースに直接または(例えば、リンカーを介して)間接的に付加され得る。ヘッドピースがリンカーを含む場合、ビルディングブロックまたは足場はリンカーの末端部に付加される。リンカーが存在しない場合、ビルディングブロックはヘッドピースに直接付加され得るか、またはビルディングブロックそれ自体が、ヘッドピースの官能基と反応するリンカーを含むことができる。リンカーおよびヘッドピースの例は本明細書に記載される。

0128

足場は、任意の有用な方法で付加することができる。例えば、足場は、リンカーまたはヘッドピースの末端部に付加され、逐次的ビルディングブロックが足場の利用可能な多様性ノードに付加され得る。別の例では、ビルディングブロックAnが最初にリンカーまたはヘッドピースに付加され、その後、足場Sの多様性ノードがビルディングブロックAnの官能基と反応する。特定の足場をコードするオリゴヌクレオチドタグは、任意で、ヘッドピースまたは複合体に付加することができる。例えば、Snはn個の反応容器(ここでnは2以上の整数である)内で複合体に付加され、タグSn(すなわち、タグS1、S2、...Sn-1、Sn)は複合体の官能基に結合される。

0129

ビルディングブロックは複数の合成工程で付加することができる。例えば、ヘッドピース(任意で、結合されたリンカーを有する)のアリコートをn個の反応容器に分離する(ここでnは2以上の整数である)。第1工程で、ビルディングブロックAnをn個の反応容器のそれぞれに添加する(すなわち、ビルディングブロックA1、A2、...An-1、Anを反応容器1、2、...n-1、nに添加する)(ここでnは整数であり、各ビルディングブロックAnは唯一である)。第2工程では、足場Sを各反応容器に添加してAn-S複合体を形成する。任意で、足場Snを各反応容器に添加してAn-Sn複合体を形成することができる(ここでnは2を超える整数であり、各足場Snは唯一であり得る)。第3工程では、ビルディングブロックBnを、An-S複合体を含有するn個の反応容器のそれぞれに添加する(すなわち、ビルディングブロックB1、B2、...Bn-1、Bnを、A1-S、A2-S、... An-1-S、An-S複合体を含有する反応容器1、2、...n-1、nに添加する)(ここで各ビルディングブロックBnは唯一である)。さらなる工程で、ビルディングブロックCnを、Bn-An-S複合体を含有するn個の反応容器のそれぞれに添加することができる(すなわち、ビルディングブロックC1、C2、...Cn-1、Cnを、B1-A1-S ... Bn-An-S複合体を含有する反応容器1、2、...n-1、nに添加する)(ここで各ビルディングブロックCnは唯一である)。結果として得られるライブラリーは、n3個のタグをもつn3個の複合体を含むだろう。このようにして、追加の合成工程を用いて追加のビルディングブロックを結合させることにより、ライブラリーをさらに多様化することができる。

0130

ライブラリーを形成した後、得られた複合体を、任意で精製し、1つ以上のプライマーを用いて重合またはライゲーション反応に供してもよい。この一般的な戦略は、追加の多様性ノードおよびビルディングブロック(例えば、D、E、Fなど)を含むように拡張することができる。例えば、第1の多様性ノードはビルディングブロックおよび/またはSと反応されて、オリゴヌクレオチドタグでコードされる。次に、追加のビルディングブロックを得られた複合体と反応させ、後続の多様性ノードを追加のビルディングブロックで誘導体化して、これは重合またはライゲーション反応に用いられるプライマーによりコードされる。

0131

コードライブラリーを形成するために、オリゴヌクレオチドタグが各合成工程の後または前に複合体に付加される。例えば、ビルディングブロックAnを各反応容器に添加する前または後に、タグAnをヘッドピースの官能基に結合させる(すなわち、タグA1、A2、...An-1、Anを、ヘッドピースを含有する反応容器1、2、...n-1、nに添加する)。各タグAnは、唯一の各ビルディングブロックAnと相関する固有の配列を有し、タグAnの配列を決定することは、ビルディングブロックAnの化学構造を提供する。このように、追加のタグは、追加のビルディングブロックまたは追加の足場をコードするために使用される。

0132

さらに、複合体に付加された最後のタグは、プライマー配列を含むか、またはプライマー配列の(例えば、ライゲーションによる)結合を可能にするための官能基を提供することができる。プライマー配列は、複合体のオリゴヌクレオチドタグの増幅および/または配列決定のために使用され得る。増幅および配列決定のための例示的な方法には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、直鎖増幅(LCR)、ローリングサークル増幅(RCA)、または核酸配列の増幅もしくは決定のために当技術分野で知られている他の方法が含まれる。

0133

これらの方法を使用して、コードされた化学実体を多数有する大規模ライブラリーを形成することが可能である。例えば、ヘッドピースを、リンカーおよび1,000の異なる変異体を含むビルディングブロックAn(すなわち、n=1,000)と反応させる。各ビルディングブロックAnにつき、DNAタグAnをヘッドピースにライゲートさせるか、またはプライマー伸長させる。これらの反応は1,000ウェルプレートまたは10×100ウェルプレートで行うことができる。すべての反応をプールし、任意で精製し、第2セットのプレートに分割することができる。次に、同じ手順をビルディングブロックBnで実施することができ、ビルディングブロックBnもまた1,000の異なる変異体を含む。DNAタグBnをAn-ヘッドピース複合体にライゲートさせて、すべての反応をプールすることができる。得られたライブラリーは、タグの1,000,000の異なる組み合わせによってタグ付けされたAn×Bnの1,000×1,000の組み合わせ(すなわち、1,000,000の化合物)を含んでいる。同じアプローチは、ビルディングブロックCn、Dn、Enなどを付加するように拡張することができる。その後、作成されたライブラリーは、標的に結合する化合物を同定するために使用され得る。ライブラリーに結合する化学実体の構造は、任意で、濃縮された化合物を同定するためにDNAタグのPCRおよび配列決定により評価することができる。

0134

この方法は、各ビルディングブロックの付加後のタグ付けを回避するように、またはプールする(もしくは混合する)ことを回避するように、改変され得る。例えば、この方法は、ビルディングブロックAnをn個の反応容器に添加し(ここでnは2以上の整数である)、同一のビルディングブロックB1を各反応ウェルに添加することによって、改変することができる。ここで、B1は各化学実体について同一であり、したがって、このビルディングブロックをコードするオリゴヌクレオチドタグは必要とされない。ビルディングブロックを付加した後、複合体をプールしても、プールしなくてもよい。例えば、ライブラリーはビルディングブロック付加の最終工程の後にプールされず、標的に結合する化合物を同定するためにプールが個別にスクリーニングされる。合成後に反応のすべてをプールすることを避けるために、例えば、BIND(登録商標)リーダー(SRU Biosystems Inc.から)を用いて、ハイスループット形式(例えば、384ウェルプレートおよび1,536ウェルプレート)でセンサー表面上の結合をモニターすることができる。例えば、ビルディングブロックAnはDNAタグAnによりコードされ、そしてビルディングブロックBnはウェルプレート内のその位置によってコードされ得る。その後、候補化合物は、結合アッセイを用いることによって(例えば、SRU Biosystems Inc.から入手可能なBIND(登録商標)バイオセンサーを用いるか、またはELISAアッセイを用いる)、かつ配列決定、マイクロアレイ解析および/または制限消化解析でAnタグを解析することによって、同定することができる。この解析は、望ましい分子をもたらすビルディングブロックAnおよびBnの組み合わせの同定を可能にする。

0135

増幅の方法は、任意で、複数の水性マイクロリアクターを作成するために油中水型エマルションを形成することを含み得る。反応条件(例えば、複合体の濃度およびマイクロリアクターのサイズ)は、平均して、化合物ライブラリーの少なくとも1つのメンバーを有するマイクロリアクターを提供するように、調整することができる。各マイクロリアクターはまた、標的、複合体もしくは複合体の一部(例えば、1つ以上のタグ)に結合することが可能なおよび/または標的に結合することが可能な単一のビーズ、ならびに核酸増幅を実施するために必要な1種以上の試薬を含有する増幅反応溶液を含むことができる。マイクロリアクター内でタグを増幅した後、タグの増幅コピーマイクロリアクター中のビーズに結合し、被覆されたビーズは任意の有用な方法で識別することができる。

0136

関心対象の標的に結合する第1ライブラリーからのビルディングブロックが同定されると、第2ライブラリーが反復様式で作成され得る。例えば、多様性の1つまたは2つの追加のノードを付加することができ、第2ライブラリーは、本明細書に記載されるように、作成され、サンプリングされる。このプロセスは、所望の分子的および薬学的特性を有する分子を作成するために、任意で何回でも繰り返すことができる。

0137

さまざまなライゲーション技術が足場、ビルディングブロック、リンカー、およびビルディングブロックタグを付加するために使用され得る。したがって、本明細書に記載の結合工程はどれも、有用なライゲーション技術を含むことができる。例示的なライゲーション技術としては、本明細書に記載されるような、1種以上のRNAリガーゼおよび/またはDNAリガーゼの使用などの、酵素的ライゲーション;ならびに、本明細書に記載されるような、化学的共反応対の使用などの、化学的ライゲーションが挙げられる。

0138

足場およびビルディングブロック
足場Sは、単原子または分子足場であり得る。例示的な単原子足場としては、炭素原子ホウ素原子窒素原子、またはリン原子などが挙げられる。例示的な多原子足場としては、シクロアルキル基シクロアルケニル基ヘテロシクロアルキル基ヘテロシクロアルケニル基アリール基、またはヘテロアリール基が挙げられる。ヘテロアリール足場の特定の例としては、以下が挙げられる:トリアジン、例えば1,3,5-トリアジン、1,2,3-トリアジン、もしくは1,2,4-トリアジン;ピリミジン;ピラジンピリダジン;フラン;ピロールピロリンピロリジンオキサゾールピラゾールイソオキサゾールピランピリジンインドールインダゾール;またはプリン

0139

足場Sは、いずれかの有用な方法でタグに機能的に連結され得る。一例では、Sはヘッドピースに直接連結されるトリアジンである。この例示的な足場を得るために、トリクロロトリアジン(すなわち、3個の塩素を有するトリアジンの塩素化前駆体)をヘッドピースの求核基と反応させる。この方法を用いると、Sには、置換のために利用可能な塩素を有する3つの位置があり、そのうち2つの位置は多様性ノードに利用され、1つの位置はヘッドピースに繋ぎ止められる。次に、ビルディングブロックAnが足場の多様性ノードに付加され、ビルディングブロックAnをコードするタグAn(「タグAn」)がヘッドピースにライゲートされ、その際、これらの2工程は任意の順序で実施することができる。その後、ビルディングブロックBnが残りの多様性ノードに付加され、ビルディングブロックBnをコードするタグBnがタグAnの末端部にライゲートされる。別の例では、Sはタグのリンカーに機能的に連結されるトリアジンであり、この場合は、トリクロロトリアジンをタグのPEG、脂肪族、または芳香族リンカーの求核基(例えば、アミノ基)と反応させる。ビルディングブロックおよび関連するタグは、上記のように付加することができる。

0140

さらに別の例では、SはビルディングブロックAnに機能的に連結されるトリアジンである。この足場を得るために、2つの多様性ノード(例えば、Fmoc-アミノ酸などの、求電子基と求核基)を有するビルディングブロックAnをリンカーの求核基(例えば、ヘッドピースに繋ぎ止められる、PEG、脂肪族、または芳香族リンカーの末端基)と反応させる。その後、トリクロロトリアジンをビルディングブロックAnの求核基と反応させる。この方法を用いると、Sの3つすべての塩素位置が、ビルディングブロックのための多様性ノードとして用いられる。本明細書に記載されるように、追加のビルディングブロックおよびタグを付加することができ、また、追加の足場Snを付加することができる。

0141

例示的なビルディングブロックAnには、例えば、アミノ酸(例:α-、β-、γ-、δ-、およびε-アミノ酸、ならびに天然および非天然アミノ酸の誘導体)、アミンと化学的に共反応性反応物(例:アジドまたはアルキン鎖)、チオール反応物、またはこれらの組み合わせが含まれる。ビルディングブロックAnの選択は、例えば、リンカーで用いられる反応性基の性質足場部分の性質、および化学合成に用いられる溶媒に依存する。

0142

例示的なビルディングブロックBnおよびCnとしては、例えば以下のような、化学実体の有用な構造単位が挙げられる:置換されていてもよい芳香族基(例:置換されていてもよいフェニルまたはベンジル)、置換されていてもよいヘテロシクリル基(例:置換されていてもよいキノリニルイソキノリニルインドリルイソインドリル、アザインドリルベンズイミダゾリルアザベンズイミダゾリル、ベンズイソオキサゾリルピリジニルピペリジニル、またはピロリジニル)、置換されていてもよいアルキル基(例:置換されていてもよい直鎖もしくは分岐鎖C1-6アルキル基または置換されていてもよいC1-6アミノアルキル基)、または置換されていてもよいカルボシクリル基(例:置換されていてもよいシクロプロピルシクロヘキシル、もしくはシクロヘキセニル)。特に有用なビルディングブロックBnおよびCnには、1つ以上の反応性基、例えば、反応性基であるかまたは反応性基を形成するように化学的に改変され得る1つもしくは任意の置換基を有する、置換されていてもよい基(例えば、本明細書に記載の基)をもつものが含まれる。例示的な反応性基としては、以下の1つ以上が挙げられる:アミン(-NR2、ここで各Rは、独立して、Hまたは置換されていてもよいC1-6アルキル)、ヒドロキシアルコキシ(-OR、ここでRは置換されていてもよいC1-6アルキルであり、例えばメトキシなど)、カルボキシ(-COOH)、アミド、または化学的に共反応性の置換基。制限部位が、例えばタグBnまたはCnに、導入されてもよく、その場合、複合体は、PCRおよび対応する制限酵素の1つによる制限消化を行うことによって同定され得る。

0143

リンカー
ヘッドピースと化学実体間の2官能性リンカーは、適切なスペーサーを提供するために、および/または有機溶媒中のヘッドピースの溶解性を増大させるために変化させることができる。ヘッドピースを小分子ライブラリーと連結することができる、多種多様なリンカーが市販されている。リンカーは典型的には直鎖または分岐鎖からなり、以下を含むことができる:C1-10アルキル、1〜10原子のヘテロアルキル、C2-10アルケニル、C2-10アルキニル、C5-10アリール、3〜20原子の環式もしくは多環式系、ホスホジエステル、ペプチド、オリゴサッカライド、オリゴヌクレオチド、オリゴマー、ポリマー、ポリアルキルグリコール(例えば、ポリエチレングリコール、-(CH2CH2O)nCH2CH2-など、ここでnは1〜50の整数である)、またはこれらの組み合わせ。

0144

2官能性リンカーは、ヘッドピースとライブラリーの化学実体の間の適切なスペーサーを提供することができる。特定の態様では、2官能性リンカーは3つの部分を含む。部分1は、DNAと共有結合を形成する反応性基とすることができ、例えば、カルボン酸、好ましくはDNA上のアミノ基(例えば、アミノ修飾dT)と反応するようにN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルにより活性化されたもの、一本鎖ヘッドピースの5'または3'末端を改変するためのアミダイト(標準的なオリゴヌクレオチド化学を用いて達成される)、化学的共反応対(例えば、Cu(I)触媒の存在下でのアジド-アルキン環化付加、または本明細書に記載されるもの)、またはチオール反応性基であり得る。部分2もまた、化学実体、ビルディングブロックAnまたは足場のいずれかと共有結合を形成する反応性基とすることができる。こうした反応性基は、例えば、アミン、チオール、アジド、またはアルキンであり得る。部分3は、部分1と部分2の間に導入される、可変長の化学的に不活性なスペーサーとすることができる。こうしたスペーサーは、エチレングリコール単位の鎖(例えば、異なる長さのPEG)、アルカンアルケンポリエン鎖、またはペプチド鎖であり得る。リンカーは、有機溶媒中のヘッドピースの溶解性を改善するための疎水性部分(例えば、ベンゼン環など)、ならびにライブラリーの検出のために使用される蛍光部分(例えば、フルオレセインもしくはCy-3)を有する分岐部または挿入部を含むことができる。ヘッドピース設計における疎水性残基は、有機溶媒中でのライブラリー合成を容易にするためのリンカー設計によって変えることができる。例えば、ヘッドピースとリンカーの組み合わせは、オクタノール:水係数(Poct)が例えば1.0〜2.5である適切な残基をもつように設計される。

0145

リンカーは、ライブラリーを有機溶媒中で、例えば、15%、25%、30%、50%、75%、90%、95%、98%、99%、または100%の有機溶媒中で、合成することができるように、所与の小分子ライブラリー設計について経験的に選択され得る。リンカーは、有機溶媒中にヘッドピースを可溶化する適切な鎖長を選択するために、ライブラリー合成の前にモデル反応を用いて変化させることができる。例示的なリンカーには、アルキル鎖長の増加、ポリエチレングリコール単位の増加、正電荷をもつ分岐鎖種(ヘッドピース上の負のリン酸電荷を中和するため)、または疎水性量の増加(例えば、ベンゼン環構造の追加)を有するリンカーが含まれる。

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