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課題

破骨細胞による骨吸収を抑制する作用を有し、骨粗鬆症骨折リウマチ関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である骨強化用組成物、及び該組成物を含有する飲食品飼料医薬等の骨強化用製品を提供することを課題とする。

解決手段

Ile−Arg、Ile−Gln、Leu−Lys、Ser−Pro、Lys−Gly、Thr−Pro、Val−Leu、Leu−Glu、Asn−Pro−Thrからなる群から選択される1つ以上のペプチドを含む骨強化用組成物、及び前記骨強化用組成物を含むことを特徴とする骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品。

概要

背景

近年、世界的規模で、高齢化等に伴い、骨粗鬆症骨折あるいは腰痛などの種々の骨に関連する疾患が増加しており、大きな社会問題となっている。これは、カルシウムの摂取不足カルシウム吸収能力の低下、閉経後ホルモンアンバラスなどが原因であるとされている。骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患を予防するためには、若齢期から骨芽細胞による骨形成を促進して体内骨量をできるだけ増加させ、最大骨量や骨強度骨密度骨質)を高めることが有効であるとされている。なお、骨質とは、骨の微細構造代謝回転微小骨折石灰化を指すものである。また、骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患を予防する方法としては、破骨細胞による骨吸収を抑制することも考えられる。骨はバランスのとれた吸収と形成を絶えず繰り返している(リモデリング)が、閉経後のホルモンのバランス変化等により、骨吸収が骨形成を上回り、これが骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患の原因となる。したがって、破骨細胞による骨吸収を抑制して骨強度を一定に保つことにより、結果的に骨を強化することが可能である。

このような現状から、骨を強化する目的で、炭酸カルシウムリン酸カルシウム乳酸カルシウムなどのカルシウム塩ならびに乳清カルシウム牛骨粉、卵殻などの天然カルシウム剤を、それぞれ単独で医薬品や飲食品飼料などに添加して摂取する、あるいは、これらのカルシウム剤カゼインホスホペプチドオリゴ糖などのカルシウム吸収促進効果を有する物質と共に医薬品や飲食品、飼料などに添加して摂取している。しかしながら、これらのカルシウム塩や天然カルシウム剤を飲食品に添加して摂取した場合、カルシウムの吸収率は50%以下であり、半分以上のカルシウムが吸収されず体外に排出されてしまうといわれている。また、体内に吸収されたカルシウムも、その形態や同時に摂取される他の栄養成分の種類によって骨への親和性が異なるので、必ずしも骨代謝の改善や骨強化作用を示さないこともある。

その他、骨粗鬆症治療や骨強化のための医薬として、女性ホルモン製剤や活性型ビタミンD3製剤 やビタミンK2製剤、ビスフォスフォネート製剤、カルシトニン製剤などが知られており、抗RANKL抗体などの新薬開発が進められている。しかし、これらの医薬品を用いた場合、耳鳴り頭痛食欲不振などの副作用を伴うことがある。また、服用期間に制限があるものもある。さらに、これらの物質は安全性及びコストなどの面から、現在のところ飲食品に添加することができない状況にある。したがって、骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患の疾病性質から、長期的に副作用が無く、摂取することができ、骨形成促進的及び/または骨吸収抑制的に作用して骨強度を高め、その予防または治療効果が期待できるような骨強化剤や、骨強化剤を含有する飲食品、飼料の開発が望まれている。

こうしたなかで、最近の研究成果として、例えば、天然植物由来抽出物が、骨形成を促進することが報告されている(例えば、特許文献1や特許文献2)。また、例えば食品由来成分として、卵黄タンパク質加水分解処理したペプチドを含む組成物が、骨形成を促進することが報告されている(特許文献3)。しかしながら、これらは植物由来の抽出物あるいは卵黄タンパク質加水分解物を含む、組成物の骨強化作用であり、特定の配列のペプチドに骨吸収抑制作用を通じた骨強化作用があることはこれまで知られていなかった。

概要

破骨細胞による骨吸収を抑制する作用を有し、骨粗鬆症や骨折、リウマチ関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である骨強化用組成物、及び該組成物を含有する飲食品、飼料、医薬等の骨強化用製品を提供することを課題とする。Ile−Arg、Ile−Gln、Leu−Lys、Ser−Pro、Lys−Gly、Thr−Pro、Val−Leu、Leu−Glu、Asn−Pro−Thrからなる群から選択される1つ以上のペプチドを含む骨強化用組成物、及び前記骨強化用組成物を含むことを特徴とする骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品。なし

目的

したがって、骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患の疾病の性質から、長期的に副作用が無く、摂取することができ、骨形成促進的及び/または骨吸収抑制的に作用して骨強度を高め、その予防または治療効果が期待できるような骨強化剤や、骨強化剤を含有する飲食品、飼料の開発が望まれている

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

Ile−Arg、Ile−Gln、Leu−Lys、Ser−Pro、Lys−Gly、Thr−Pro、Val−Leu、Leu−Glu、Asn−Pro−Thrからなる群から選択される1つ以上のペプチドを有効成分として含む骨強化用組成物

請求項2

請求項1に記載の骨強化用組成物を含むことを特徴とする骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品。

技術分野

0001

本発明は、破骨細胞による骨吸収を抑制する作用を有し、骨強化作用に優れ、骨粗鬆症骨折治療リウマチ関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有効であるペプチドに関する。さらに、本発明は、該ペプチドを含有する、骨強化剤、骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品に関する。

背景技術

0002

近年、世界的規模で、高齢化等に伴い、骨粗鬆症や骨折あるいは腰痛などの種々の骨に関連する疾患が増加しており、大きな社会問題となっている。これは、カルシウムの摂取不足カルシウム吸収能力の低下、閉経後ホルモンアンバラスなどが原因であるとされている。骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患を予防するためには、若齢期から骨芽細胞による骨形成を促進して体内骨量をできるだけ増加させ、最大骨量や骨強度骨密度骨質)を高めることが有効であるとされている。なお、骨質とは、骨の微細構造代謝回転微小骨折石灰化を指すものである。また、骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患を予防する方法としては、破骨細胞による骨吸収を抑制することも考えられる。骨はバランスのとれた吸収と形成を絶えず繰り返している(リモデリング)が、閉経後のホルモンのバランス変化等により、骨吸収が骨形成を上回り、これが骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患の原因となる。したがって、破骨細胞による骨吸収を抑制して骨強度を一定に保つことにより、結果的に骨を強化することが可能である。

0003

このような現状から、骨を強化する目的で、炭酸カルシウムリン酸カルシウム乳酸カルシウムなどのカルシウム塩ならびに乳清カルシウム牛骨粉、卵殻などの天然カルシウム剤を、それぞれ単独で医薬品や飲食品、飼料などに添加して摂取する、あるいは、これらのカルシウム剤カゼインホスホペプチドオリゴ糖などのカルシウム吸収促進効果を有する物質と共に医薬品や飲食品、飼料などに添加して摂取している。しかしながら、これらのカルシウム塩や天然カルシウム剤を飲食品に添加して摂取した場合、カルシウムの吸収率は50%以下であり、半分以上のカルシウムが吸収されず体外に排出されてしまうといわれている。また、体内に吸収されたカルシウムも、その形態や同時に摂取される他の栄養成分の種類によって骨への親和性が異なるので、必ずしも骨代謝の改善や骨強化作用を示さないこともある。

0004

その他、骨粗鬆症治療や骨強化のための医薬として、女性ホルモン製剤や活性型ビタミンD3製剤 やビタミンK2製剤、ビスフォスフォネート製剤、カルシトニン製剤などが知られており、抗RANKL抗体などの新薬開発が進められている。しかし、これらの医薬品を用いた場合、耳鳴り頭痛食欲不振などの副作用を伴うことがある。また、服用期間に制限があるものもある。さらに、これらの物質は安全性及びコストなどの面から、現在のところ飲食品に添加することができない状況にある。したがって、骨粗鬆症や骨折、腰痛などの種々の骨疾患の疾病性質から、長期的に副作用が無く、摂取することができ、骨形成促進的及び/または骨吸収抑制的に作用して骨強度を高め、その予防または治療効果が期待できるような骨強化剤や、骨強化剤を含有する飲食品、飼料の開発が望まれている。

0005

こうしたなかで、最近の研究成果として、例えば、天然植物由来抽出物が、骨形成を促進することが報告されている(例えば、特許文献1や特許文献2)。また、例えば食品由来成分として、卵黄タンパク質加水分解処理したペプチドを含む組成物が、骨形成を促進することが報告されている(特許文献3)。しかしながら、これらは植物由来の抽出物あるいは卵黄タンパク質加水分解物を含む、組成物の骨強化作用であり、特定の配列のペプチドに骨吸収抑制作用を通じた骨強化作用があることはこれまで知られていなかった。

先行技術

0006

特開2017−209108号公報
特表2017−524671号公報
特開2013−224277号公報

発明が解決しようとする課題

0007

本発明の課題は、破骨細胞による骨吸収を抑制する作用があり、骨を強化することができ、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である骨強化作用を有する素材を提供することである。また、本発明の課題は、破骨細胞による骨吸収を抑制する作用があり、骨を強化することができ、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である骨強化作用を有する素材を配合した骨強化剤、骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品を提供することである。

課題を解決するための手段

0008

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を進めた結果、多数存在するジペプチドまたはトリペプチドの中から特定配列のジペプチドあるいはトリペプチドに骨強化作用があることを見出したことにもとづく発明であり、以下の構成が含まれる。
(1)Ile−Arg、Ile−Gln、Leu−Lys、Ser−Pro、Lys−Gly、Thr−Pro、Val−Leu、Leu−Glu、Asn−Pro−Thrからなる群から選択される1つ以上のペプチドを有効成分として含む骨強化用組成物
(2)前記(1)に記載の骨強化用組成物を含むことを特徴とする骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品。

発明の効果

0009

本発明の骨強化用組成物は、安全性が高く、破骨細胞の分化ならびに該細胞による骨吸収を抑制する作用を介した骨強化作用が顕著であり、該骨強化用組成物は、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である。また、本発明は、破骨細胞の分化ならびに該細胞による骨吸収を抑制する作用があり、骨を強化することができ、骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療に有用である骨強化用組成物を配合した骨強化用飲食品、骨強化用栄養組成物、骨強化用飼料又は骨強化用医薬品を提供するものである。

0010

本発明のIle−Arg、Ile−Gln、Leu−Lys、Ser−Pro、Lys−Gly、Thr−Pro、Val−Leu、Leu−Glu、及び/またはAsn−Pro−Thrの配列からなるペプチドについて、以下に詳細に説明する。

0011

(本発明のペプチドとその製造方法)
本発明のペプチドは、Ile−Arg、Ile−Gln、Leu−Lys、Ser−Pro、Lys−Gly、Thr−Pro、Val−Leu、Leu−Glu、及びAsn−Pro−Thrからなる群からから選択される1つ以上を用いることができる。
これらのペプチドは、上記した配列を有するものであればどのように調製されたものでもよく、調製方法としてペプチド合成装置を用いた固相法液相法などの化学合成法遺伝子工学的手法、酵素工学的手法、微生物による産生等を例示できる。また、精製され、市販されているペプチドを使用することも可能である。さらに、該アミノ酸配列を有する各種のタンパク質やペプチドを原料に、タンパク質加水分解酵素を用いて酵素分解して得ることもできる。原料とするタンパク質に制限はないが、動物性タンパク質植物性タンパク質を用いることが可能であり、例えば、牛乳大豆小麦とうもろこし、牛肉鶏肉豚肉などが挙げられる。

0012

(ペプチドの摂取量)
本発明のペプチドの摂取量は、破骨細胞の分化ならびに該細胞による骨吸収を抑制する作用を介した骨強化作用を示す量であれば特に制限はないが、Ile−Arg、Ile−Gln、Leu−Lys、Ser−Pro、Lys−Gly、Thr−Pro、Val−Leu、Leu−Glu、及び/またはAsn−Pro−Thrからなる群から選択されるペプチドを成人1日あたり0.1mg以上摂取すればよく、1mg以上が好ましく、10mg以上がさらに好ましく、50mg以上が最も好ましい。前記群から複数種のペプチドを摂取する場合は、その合計量が上記量以上になればよい。本発明のペプチドは、そのまま経口摂取してもよいが、飲食品、栄養組成物、飼料および経口用医薬等への配合する場合は、上記した摂取量となるように配合量を調整すればよい。なお、非経口医薬の場合は、経口投与した場合の上記投与量と同等の効果を示す有効量を投与すればよい。

0013

(本発明のペプチドの飲食品及び医薬品への使用方法について)
本発明のペプチドは、それぞれを単独もしくは、任意の組み合わせでそのまま骨強化用組成物として使用してもよいが、破骨細胞の分化ならびに該細胞による骨吸収を抑制する作用を介した骨強化作用を失わない範囲で必要に応じて常法に従い、粉末剤顆粒剤錠剤カプセル剤ドリンク剤等に製剤化して用いることもできる。また、そのまま又は製剤化した後に、栄養剤粉乳乳飲料乳酸菌飲料発酵乳清涼飲料水チーズマーガリンクリームプリンゼリーウエハース等の飲食品、栄養組成物、飼料及び医薬品に配合することも可能である。
本発明のペプチドは、他の飲食品、飼料及び医薬に通常含まれる安定剤や糖類、脂質、フレーバービタミンミネラルフラボノイドポリフェノール等の原材料とともに使用することができる。

0014

製剤化に際しては、通常使用される充填剤増量剤結合剤崩壊剤界面活性剤滑沢剤等の希釈剤又は賦形剤を用いることができる。賦形剤としては、例えばショ糖乳糖デンプン結晶性セルロースマンニット軽質無水珪酸アルミン酸マグネシウム合成珪酸アルミニウムメタ珪酸アルミン酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウムリン酸水素カルシウムカルボキシルメチルセルロースカルシウム等の1種又は2種以上を組み合わせて加えることができる。

0015

以下に実施例、試験例を示し、本発明について詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。

0016

(実施例1)
カゼインタンパク質10%水溶液5Lに、パパイン50U/g・カゼインタンパク質及びプロレザー(天野エンザイム社製)150U/g・カゼインタンパク質を加え、pH8に調整し、55℃において6時間カゼインタンパク質を変性させながら酵素分解を行った。反応液を100℃で15秒間以上加熱して酵素失活させ、遠心分離して上清回収して、カゼインタンパク質加水分解物を得た。このカゼインタンパク質加水分解物をSuperdex Peptide(GEヘルスケア社製)を充填したカラム通液し、分子サイズで分画し、平均分子量200〜350Daの画分を得た。この画分を、Poroshell 120 SB−C18(アジレント・テクノロジー社製)を充填した逆相カラムに通液して、Ile−Gln、Ser−Pro、Thr−Proを含む画分をそれぞれ回収した。これらのフラクション凍結乾燥して、Ile−Gln、Ser−Pro、Thr−Pro(実施例品1)を得た。これらIle−Gln、Ser−Pro、Thr−ProをHPLCによって分析したところ、純度はそれぞれ90%以上であった。このようにして得られたIle−Gln、Ser−Pro、Thr−Proは、そのまま本発明の骨強化作用を有するペプチドとして使用できる。

0017

(実施例2)
卵白タンパク質10%水溶液5Lに、パパイン50U/g・卵白タンパク質及びプロレザー(天野エンザイム社製)150U/g・卵白タンパク質を加え、pH8に調整し、55℃において6時間卵白タンパク質を変性させながら酵素分解を行った。反応液を100℃で15秒間以上加熱して酵素を失活させ、遠心分離して上清を回収して、卵白タンパク質加水分解物を得た。この卵白タンパク質加水分解物をSuperdex Peptide(GEヘルスケア社製)を充填したカラムに通液し、分子サイズで分画し、平均分子量200〜350Daの画分を得た。この画分を、Poroshell 120 SB−C18(アジレント・テクノロジー社製)を充填した逆相カラムに通液して、Ile−Arg、Val−Leu、Leu−Gluを含む画分をそれぞれ回収した。これらのフラクションを凍結乾燥して、Ile−Arg、Val−Leu、Leu−Glu(実施例品2)を得た。これらIle−Arg、Val−Leu、Leu−GluをHPLCによって分析したところ、純度はそれぞれ90%以上であった。このようにして得られたIle−Arg、Val−Leu、Leu−Gluは、そのまま本発明の骨強化作用を有するペプチドとして使用できる。

0018

(実施例3)
卵黄タンパク質10%水溶液5Lに、パパイン50U/g・卵黄タンパク質及びプロレザー(天野エンザイム社製)150U/g・卵黄タンパク質を加え、pH8に調整し、55℃において6時間卵黄タンパク質を変性させながら酵素分解を行った。反応液を100℃で15秒間以上加熱して酵素を失活させ、遠心分離して上清を回収して、卵黄タンパク質加水分解物を得た。この卵黄タンパク質加水分解物をSuperdex Peptide(GEヘルスケア社製)を充填したカラムに通液し、分子サイズで分画し、平均分子量200〜350Daの画分を得た。この画分を、Poroshell 120 SB−C18(アジレント・テクノロジー社製)を充填した逆相カラムに通液して、Ile−Gln、Lys−Gly、Asn−Pro−Thrを含む画分をそれぞれ回収した。これらのフラクションを凍結乾燥して、Ile−Gln、Lys−Gly、Asn−Pro−Thr(実施例品3)を得た。これらIle−Gln、Lys−Gly、Asn−Pro−ThrをHPLCによって分析したところ、純度はそれぞれ90%以上であった。このようにして得られたIle−Gln、Lys−Gly、Asn−Pro−Thrは、そのまま本発明の骨強化作用を有するペプチドとして使用できる。

0019

(実施例4)
小麦タンパク質10%水溶液5Lに、パパイン50U/g・小麦タンパク質及びプロレザー(天野エンザイム社製)150U/g・小麦タンパク質を加え、pH8に調整し、55℃において6時間小麦タンパク質を変性させながら酵素分解を行った。反応液を100℃で15秒間以上加熱して酵素を失活させ、遠心分離して上清を回収して、小麦タンパク質加水分解物を得た。この小麦タンパク質加水分解物をSuperdex Peptide(GEヘルスケア社製)を充填したカラムに通液し、分子サイズで分画し、平均分子量200〜350Daの画分を得た。この画分を、フェニルイソチオシアネートにより誘導化し、Supersphere RP−18(アジレント・テクノロジー社製)を充填した逆相カラムに通液して、Ser−Pro、Thr−Proを含む画分をそれぞれ回収した。これらのフラクションを凍結乾燥して、Ser−Pro、Thr−Pro(実施例品4)を得た。これらSer−Pro、Thr−ProをHPLCによって分析したところ、純度はそれぞれ90%以上であった。このようにして得られたSer−Pro、Thr−Proは、そのまま本発明の骨強化作用を有するペプチドとして使用できる。

0020

(実施例5)
大豆タンパク質10%水溶液5Lに、パパイン50U/g・大豆タンパク質及びプロレザー(天野エンザイム社製)150U/g・大豆タンパク質を加え、pH8に調整し、55℃において6時間大豆タンパク質を変性させながら酵素分解を行った。反応液を100℃で15秒間以上加熱して酵素を失活させ、遠心分離して上清を回収して、大豆タンパク質加水分解物を得た。この大豆タンパク質加水分解物をSuperdex Peptide(GEヘルスケア社製)を充填したカラムに通液し、分子サイズで分画し、平均分子量200〜350Daの画分を得た。この画分を、フェニルイソチオシアネートにより誘導化し、Supersphere RP−18(アジレント・テクノロジー社製)を充填した逆相カラムに通液して、Leu−Lys、Lys−Gly、Leu−Gluを含む画分をそれぞれ回収した。これらのフラクションを凍結乾燥して、Leu−Lys、Lys−Gly、Leu−Glu(実施例品5)を得た。これらLeu−Lys、Lys−Gly、Leu−GluをHPLCによって分析したところ、純度はそれぞれ90%以上であった。このようにして得られたLeu−Lys、Lys−Gly、Leu−Gluは、そのまま本発明の骨強化作用を有するペプチドとして使用できる。

0021

(実施例6)
トリ由来コラーゲンタンパク質10%水溶液5Lに、パパイン50U/g・トリ由来コラーゲンタンパク質及びプロレザー(天野エンザイム社製)150U/g・トリ由来コラーゲンタンパク質を加え、pH8に調整し、55℃において6時間トリ由来コラーゲンタンパク質を変性させながら酵素分解を行った。反応液を100℃で15秒間以上加熱して酵素を失活させ、遠心分離して上清を回収して、トリ由来コラーゲンタンパク質加水分解物を得た。このトリ由来コラーゲンタンパク質加水分解物をSuperdex Peptide(GEヘルスケア社製)を充填したカラムに通液し、分子サイズで分画し、平均分子量200〜350Daの画分を得た。この画分を、フェニルイソチオシアネートにより誘導化し、Supersphere RP−18(アジレント・テクノロジー社製)を充填した逆相カラムに通液して、Ile−Arg、Leu−Lys、Val−Leuを含む画分をそれぞれ回収した。これらのフラクションを凍結乾燥して、Ile−Arg、Leu−Lys、Val−Leu(実施例品6)を得た。これらIle−Arg、Leu−Lys、Val−LeuをHPLCによって分析したところ、純度はそれぞれ90%以上であった。このようにして得られたIle−Arg、Leu−Lys、Val−Leuは、そのまま本発明の骨強化作用を有するペプチドとして使用できる。

0022

(試験例1)
ウサギの全骨髄細胞を用いて、実施例品2のIle−Arg、実施例品1のIle−Gln、及び実施例品5のLeu−Lysの配列からなるペプチドの、骨代謝改善効果を調べた。5日齢のウサギの脛骨及び大腿骨摘出し、軟組織を除去した後、5%FBSを含むα‐MEM培地中で機械的に細切した破骨細胞を含む全骨髄細胞を500,000cells/wellになるように結晶性リン酸カルシウムプレート(Corning社製)のウェル上に撒き込み、培養した。培養2時間後に、新しい培地へと交換した後、本発明のペプチドIle−Argを2mM、Ile−GlnとLeu−Lysを4mMの濃度となるように添加して72時間培養した。そして、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加することで細胞を取り除いた後、リン酸カルシウムプレートのウェル上にできた骨吸収ピット)を実体顕微鏡下で撮影し、画像解析によってその面積を測定することにより破骨細胞による骨吸収を抑制する効果を調べた(野悍二ら,研究テーマ動物培養細胞マニュアル,p.199−200,1993)。その結果を表1に示す。

0023

この結果、培地に実施例品2のIle−Arg、実施例品1のIle−Gln、及び実施例品5のLeu−Lysの配列からなるペプチドを添加した場合は、培地のみに比べ、有意にピットの面積が減少した。この結果から、本発明のIle−Arg、Ile−Gln、及びLeu−Lysの配列からなるペプチドには破骨細胞による骨吸収を抑制する作用があることがわかった。

0024

(試験例2)
ウサギの全骨髄細胞を用いて、実施例品4のSer−Pro、実施例品5のLys−Gly、実施例品4のThr−Pro、実施例品6のVal−Leu、実施例品2のLeu−Glu、及び実施例品3のAsn−Pro−Thrの配列からなるペプチドの、骨代謝改善効果を調べた。5日齢のウサギの脛骨及び大腿骨を摘出し、軟組織を除去した後、5%FBSを含むα‐MEM培地中で機械的に細切した破骨細胞を含む全骨髄細胞を500,000cells/wellになるように結晶性リン酸カルシウムプレート(Corning社製)のウェル上に撒き込み、培養した。培養2時間後に、新しい培地へと交換した後、本発明のペプチドSer−Pro、Lys−Gly、Thr−Pro、Val−Leu、Leu−Glu、及びAsn−Pro−Thrを10mMの濃度となるように添加して72時間培養した。そして、5%次亜塩素酸ナトリウム溶液を添加することで細胞を取り除いた後、リン酸カルシウムプレートのウェル上にできた骨吸収窩(ピット)を実体顕微鏡下で撮影し、画像解析によってその面積を測定することにより破骨細胞による骨吸収を抑制する効果を調べた(瀬野悍二ら,研究テーマ別動物培養細胞マニュアル,p.199−200,1993)。その結果を表2に示す。

0025

この結果、培地に実施例品4のSer−Pro、実施例品5のLys−Gly、実施例品4のThr−Pro、実施例品6のVal−Leu、実施例品2のLeu−Glu、及び実施例品3のAsn−Pro−Thrの配列からなるペプチドを添加した場合は、培地のみに比べ、有意にピットの面積が減少した。この結果から、本発明のSer−Pro、Lys−Gly、Thr−Pro、Val−Leu、Leu−Glu、及びAsn−Pro−Thrの配列からなるペプチドには破骨細胞による骨吸収を抑制する作用があることがわかった。

0026

(実施例7)
(骨強化用カプセル剤の調製)
表3に示す配合で原材料を混合後、常法により造粒し、カプセルに充填して、本発明の骨強化用カプセル剤を製造した。

0027

0028

(実施例8)
(骨強化用錠剤の調製)
表4に示す配合で原材料を混合後、常法により1gに成型打錠して本発明の骨強化用錠剤を製造した。

0029

0030

(実施例9)
(骨強化用液状栄養組成物の調製)
Leu−Lys(実施例品5)2.5gを4997.5gの脱イオン水に溶解し、40℃まで加熱後、TKホモミクサー(TK ROBOMICS;特殊機化工業社製)にて、6,000rpmで10分間撹拌混合して2.5g/5kgのLeu−Lys溶液を得た。このLeu−Lys溶液5.0kgに、カゼイン5.0kg、大豆タンパク質5.0kg、魚油1.0kg、シソ油3.0kg、デキストリン17.0kg、ミネラル混合物6.0kg、ビタミン混合物1.95kg、乳化剤2.0kg、安定剤4.0kg、香料0.05kgを配合し、200mlのレトルトパウチに充填し、レトルト殺菌機(第1種圧力容器、TYPE: RCS−4CRTGN、日阪製作所製)で121℃、20分間殺菌して、本発明の骨強化用液状栄養組成物50kgを製造した。なお、本発明の骨強化用液状栄養組成物200gには、Leu−Lysが10mg含まれていた。

0031

(実施例10)
(骨強化用飲料の調製)
実施例品4のSer−Pro0.5gを699.5gの脱イオン水に溶解した後、40℃まで加熱後、ウルトラディスパーサー(ULTRA−TURRAX T−25;IKAジャパン社製)にて、9,500rpmで20分間撹拌混合した。マルチトール100g、酸味料2g、還元水20g、香料2g、脱イオン水176gを添加した後、100mlのガラス瓶に充填し、95℃、15秒間殺菌後、密栓し、本発明の骨強化用飲料10本(100ml入り)を調製した。なお、本発明の骨強化用飲料100gには、Ser−Proが50mg含まれていた。

0032

(実施例11)
イヌ用骨強化用飼料の調製)
実施例品3のLys−Gly2gを3,998gの脱イオン水に溶解し、40℃まで加熱後、TKホモミクサー(MARK II 160型;特殊機化工業社製)にて、3,600rpmで20分間撹拌混合して2g/4kgのLys−Gly溶液を得た。このLys−Gly溶液2kgに大豆粕1kg、脱脂粉乳1kg、大豆油0.4kg、コーン油0.2kg、パーム油2.3kg、トウモロコシ澱粉1kg、小麦粉0.9kg、ふすま0.2kg、ビタミン混合物0.5kg、セルロース0.3kg、ミネラル混合物0.2kgを配合し、120℃、4分間加熱殺菌して、本発明の骨強化用飼料10kgを製造した。なお、本発明の骨強化用飼料100gには、Lys−Glyが10mg含まれていた。

0033

(実施例12)
(骨強化用粉乳の調製)
実施例品1のThr−Pro1g、脱脂粉乳9.999kg、脱イオン水90kgを混合し、40℃まで加熱後、TKホモミクサー(TK ROBOMICS;特殊機化工業社製)にて、6,000rpmで10分間撹拌混合した。この溶液を噴霧乾燥して本発明の骨強化用粉乳10kgを製造した。なお、本発明の骨強化粉乳10gにはThr−Proが1mg含まれていた。

0034

(実施例13)
(骨強化用乳飲料の調製)
実施例品6のVal−Leu1g、牛乳9.999kgを混合し、40℃まで加熱後、TKホモミクサー(TK ROBOMICS;特殊機化工業社製)にて、6,000rpmで10分間撹拌混合した。130℃で2秒間、加熱殺菌した後、10℃以下まで冷却して本発明の骨強化用乳飲料10kgを製造した。なお、本発明の骨強化用乳飲料200gにはVal−Leuが20mg含まれていた。

0035

(実施例14)
(骨強化用発酵乳の調製)
実施例品5のLeu−Glu0.01g、脱脂粉乳1700g、グルコース300g、脱イオン水7699.99gを混合し、95℃で2時間保持することで加熱殺菌した。これを37℃まで冷却し、乳酸菌スターター(Lb.casei)を300g植菌し、攪拌混合後、37℃に保持したインキュベーター内でpH4.0まで発酵させた。pH4.0到達後10℃以下まで冷却し、本発明の骨強化用発酵乳10kgを製造した。なお、本発明の骨強化用発酵乳200gには、Leu−Gluが0.2mg含まれていた。

0036

(実施例15)
(骨強化用乳酸菌飲料の調製)
脱脂粉乳1700g、グルコース300g、脱イオン水7700gを混合し、95℃で2時間保持することで加熱殺菌した。これを37℃まで冷却し、乳酸菌スターター(Lb.casei)を300g植菌し、攪拌混合後、37℃に保持したインキュベーター内でpH4.0まで発酵させた。pH4.0到達後、攪拌しながら10℃以下まで冷却し、発酵ベースを得た。また、実施例品3のAsn−Pro−Thr4g、上白糖1800g、酸味料20g、香料10g、脱イオン水8166gを混合し、90℃で10分間殺菌後10℃以下まで冷却し、糖液を得た。前述の発酵ベース2000gと糖液8000gを混和し、均質機で組織を滑らかにし、200ml入り紙容器50本に分注後、アルミ蓋密封し、本発明の骨強化用乳酸菌飲料10kgを製造した。なお、本発明の骨強化用乳酸菌飲料200mlには、Asn−Pro−Thrが64mg含まれていた。

0037

(実施例16)
(骨強化用清涼飲料水の調製)
Ile−Arg(GL Biochem社製)3g、50%乳酸0.75kg、エリスリトール5.7kg、香料1kg、脱イオン水42.547kgを混合し、40℃まで加熱後、TKホモミクサー(TK ROBOMICS;特殊機化工業社製)にて、6,000rpmで10分間撹拌混合した。この溶液を90℃で10分間殺菌後10℃以下まで冷却することで、本発明の骨強化用清涼飲料水50kgを製造した。なお、本発明の骨強化用清涼飲料水200mlには、Ile−Argが12mg含まれていた。

0038

(実施例17)
(骨強化用チーズの調製)
ゴーダチーズ9.5kg、チェダーチーズ9.5kg、Ile−Gln(GL Biochem社製)4g、クエン酸ナトリウム200g、脱イオン水796gを混合し、85℃で乳化した。乳化後にチーズをカルトンに充填して2昼夜、5℃で冷却して、本発明の骨強化用チーズ20kgを製造した。なお、本発明の骨強化用チーズ100gには、Ile−Glnが20mg含まれていた。

0039

(実施例18)
(骨強化用マーガリンの調製)
大豆硬化油2kg、大豆白絞油4kg、パーム油2.5kg、グリセリン脂肪酸エステル50gを混合して油層を調製した。次に、Leu−Lys(GL Biochem社製)20g、乳酸10g、脱イオン水1420gを混合し、油層へ添加して油中水型乳化物を得た、この乳化物をマーガリン製造機で冷却、固化および練圧して、本発明の骨強化用マーガリン10kgを製造した。なお本発明の骨強化マーガリン10gには、Leu−Lysが20mg含まれていた。

0040

(実施例19)
(骨強化用クリームの調製)
ナタネ硬化油4.5kg、レシチン40g、モノグリセリン脂肪酸エステル10g、ソルビタン脂肪酸エステル10gを混合し、油相を調製した。次に、Ser−Pro(ジェンスクリプト社製)40g、脱脂粉乳400g、カゼインナトリウム10g、シュガーエステル20g、リン酸塩10g、キサンタンガム5g、脱イオン水4.955kgを混合して、水相を調製した。水相を65℃に加温し、70℃に加温した油相を少量ずつ攪拌しながら添加し、TKホモミクサー(TK ROBOMICS;特殊機化工業社製)にて、6,000rpmで10分間撹拌混合した。これを均質機で均質処理して本発明の骨強化クリーム10kgを製造した。なお、本発明の骨強化クリーム10gには、Ser−Proが40mg含まれていた。

0041

(実施例20)
(骨強化用プリンの調製)
はちみつ2000g、Lys−Gly(GL Biochem社製)4g、脱脂粉乳800g、マスカルポーネ300g、液状水700g、グラニュー糖500g、生クリーム250g、バター200g、加糖卵黄400g、ゼラチン40g、寒天15g、ローカストビーンガム120g、脱イオン水4671gを混合して、プリンミックスとした。このプリンミックスをTKホモミクサー(TK ROBOMICS;特殊機化工業社製)にて、6,000rpmで10分間撹拌混合し、60℃に加熱して溶解した後、100gずつ容器へ充填して冷却することで、本発明の骨強化用プリン100個を製造した。なお、本発明の骨強化プリン100gには、Lys−Glyが40mg含まれていた。

0042

(実施例21)
(骨強化用ゼリーの調製)
Thr−Pro(ジェンスクリプト社製)4.4g、果糖2000g、グラニュー糖1500g、水500g、寒天100g、香料10g、脱イオン水5885.6gを混合し、TKホモミクサー(TK ROBOMICS;特殊機化工業社製)にて、6,000rpmで10分間撹拌混合し、50℃に加熱して溶解した後、100gずつ容器へ充填して冷却することで、本発明の骨強化用ゼリー100個を製造した。なお、本発明の骨強化用ゼリー100gには、Thr−Proが44mg含まれていた。

実施例

0043

(実施例22)
(骨強化用ウエハースの調製)
Val−Leu(GL Biochem社製)9.2g、小麦粉8.5kg、コーンスターチ1.21kg、パーム油0.22kg、膨張剤0.05kgを混合した後、脱イオン水を適量加えてバッターを調製した後、ウエハース焼成機焼成して、本発明の骨強化用ウエハース10kgを製造した。なお、本発明の骨強化用ウエハース50gには、Val−Leuが46mg含まれていた。

0044

本発明によれば長期摂取が可能で、安全性が高く、破骨細胞の分化ならびに該細胞による骨吸収を抑制する作用を介した骨強化作用が顕著な骨強化用組成物を提供することが可能である。したがって、本発明の摂取により骨粗鬆症や骨折、リウマチ、関節炎などの種々の骨疾患の予防や治療が可能である。

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