技術 糖鎖が固定化された固相及びウイルスの分類方法

0001

本発明は、糖鎖が固定化された固相及びウイルスの分類方法に関する。

0002

重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、インフルエンザ等の感染性ウイルスによる感染症が大きな社会問題となっている。これらのウイルスは、宿主細胞の表面を被う特定の糖鎖を認識して結合することで宿主に感染することが知られている。

0003

非特許文献１には、ウイルスの種類によって、ウイルスが結合し得る糖鎖の構造が異なることについて開示されている。

0004

Stencel-Baerenwald J. E., et al., The sweet spot : defining virus-sialic acid interactions, Nat. Rev. Microbiology., 12(11), 739-749, 2014.

0005

本発明は、ウイルスとの相互作用を高感度で、簡便且つ安価に測定することができる、糖鎖が固定化された固相を提供することを目的とする。

0006

本発明は以下のとおりである。
（１）α２，３結合型シアル酸含有糖鎖及び／又はα２，６結合型シアル酸含有糖鎖が固定された固相。
（２）ウイルス分類用である、（１）に記載の固相。
（３）前記ウイルスが、インフルエンザウイルス、レオウイルス、アデノウイルス又はロタウイルスである、（２）に記載の固相。
（４）前記α２，３結合型シアル酸含有糖鎖がα２，３結合型シアル酸含有糖鎖結合ペプチドを形成しており、前記α２，６結合型シアル酸含有糖鎖がα２，６結合型シアル酸含有糖鎖結合ペプチドを形成している、（１）〜（３）のいずれか一つに記載の固相。
（５）前記α２，６結合型シアル酸含有糖鎖が固定されており、下記測定方法により測定される吸光度が０．０５以上である、（１）〜（４）のいずれか一つに記載の固相。
［測定方法］
固相上のα２，６結合型シアル酸含有糖鎖が固定された領域に、２０μｇ／ｍＬのビオチン化Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ（ＳＮＡ）レクチンを４℃で８時間接触させた後洗浄する。続いて、０．２μｇ／ｍＬのストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を室温で６０分間接触させた後洗浄する。続いて、ペルオキシダーゼ用発色キット（型番「ＭＬ−１１２０Ｔ」、住友ベークライト社製）を室温、遮光下で１５分間接触させる。続いて、波長４５０ｎｍの吸光度を測定する。
（６）さらに、アシアロ糖鎖が固定された、（１）〜（５）のいずれか一つに記載の固相。
（７）前記アシアロ糖鎖がアシアロ糖鎖結合ペプチドを形成している、（６）に記載の固相。
（８）α２，３結合型シアル酸含有糖鎖及び／又はα２，６結合型シアル酸含有糖鎖が固定された固相にウイルスを接触させる工程と、前記固相に結合した前記ウイルスを検出する工程と、前記ウイルスと、前記α２，３結合型シアル酸含有糖鎖又は前記α２，６結合型シアル酸含有糖鎖との結合活性に基づいて前記ウイルスを分類する工程と、を備える、ウイルスの分類方法。
（９）前記ウイルスが、インフルエンザウイルス、レオウイルス、アデノウイルス又はロタウイルスである、（８）に記載のウイルスの分類方法。

0007

本発明によれば、ウイルスと糖鎖との相互作用を高感度で、簡便且つ安価に測定することができる。

0008

（Ａ）インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の構造を示した模式図である。（Ｂ）トリ及びヒトにおける糖鎖受容体のガラクトースとシアル酸の結合様式の違いを表した模式図である。
（Ａ）レオウイルスの外層カプシドタンパク質σ１の構造を示した模式図である。（Ｂ）Ｔ１レオウイルスの外層カプシドタンパク質σ１が結合し得る糖鎖受容体のガラクトースとシアル酸の結合様式を表した模式図である。（Ｃ）Ｔ３レオウイルスの外層カプシドタンパク質σ１が結合し得る糖鎖受容体のガラクトースとシアル酸の結合様式を表した模式図である。
（Ａ）Ｄ種アデノウイルス３７（Ａｄ３７）の外層カプシドタンパク質の構造を示した模式図である。（Ｂ）Ａｄ３７の外層カプシドタンパク質σ１が結合し得る糖鎖受容体のガラクトースとシアル酸の結合様式を表した模式図である。
（Ａ）ロタウイルスの外層カプシドタンパク質の構造を示した模式図である。（Ｂ）ヒトロタウイルスＨＡＬ１１６６のＶＰ８★サブユニットが結合し得る糖鎖受容体のガラクトースとシアル酸の結合様式を表した模式図である。
（Ａ）〜（Ｃ）本実施形態におけるα２，３結合型シアル酸含有糖鎖結合ペプチド、α２，６結合型シアル酸含有糖鎖結合ペプチド及びアシアロ糖鎖結合ペプチドの構造の一例を示した図である。
試験例１における過ヨウ素酸−シッフ塩基（ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ ｂａｓｅ：ＰＡＳ）法の結果を示したグラフである。
試験例２におけるＳＮＡ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ）レクチン反応の結果を示したグラフである。

0009

＜糖鎖が固定化された固相＞
一実施形態において、本発明は、α２，３結合型シアル酸含有糖鎖及び／又はα２，６結合型シアル酸含有糖鎖が固定された固相を提供する。

0010

本実施形態の固相によれば、ウイルスと糖鎖との相互作用を高感度で、簡便且つ安価に測定することができる。

0011

［シアル酸含有糖鎖］
本明細書において、「シアル酸（ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ）」とは、９炭糖であるノイラミン酸（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）のアミノ基やヒドロキシ基が置換された物質の総称を意味し、例えば、５位がアセチル化されたＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）や、グリコール酸で修飾されたＮ−グライコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）が挙げられる。
シアル酸は、糖タンパク質、糖脂質、糖ペプチド等の複合糖質の構成成分として生体内に広く分布しており、特に細胞膜表面に存在して、細胞の特異的認識機構に大きな役割を果たしているといわれている。置換基としてのシアル酸残基の種類は、代謝酵素、特にシアリダーゼの活性に対して強く影響し、複合糖質の転換率に影響する。複合糖質は、多種多様な細胞機能に関わっており、例えば、生体器官の表面に存在する複合糖質における酸性分子によって、生体器官の表面は酵素による攻撃や免疫学的な攻撃から保護される。しかし一方では、生体器官の表面の複合糖質は、様々な生理学的な受容体となって、ウイルスを含む微生物や毒素の認識部位ともなり、その感染を許すことにもつながる。多くのウイルス、特にインフルエンザウイルスは、細胞に感染する際にシアル酸残基に結合することが知られている。
本発明者らは、ウイルスの種類によって結合するシアル酸残基が異なる事に着目し、本発明を完成するに至った。

0012

［ウイルス］
本実施形態における固相は、ウイルス分類用として使用することができる。
本明細書において、分類可能なウイルスとしては、例えば、インフルエンザウイルス、レオウイルス、アデノウイルス、ロタウイルス等が挙げられる。この中でも、インフルエンザウイルスが好ましく、トリインフルエンザウイルス及びヒトインフルエンザウイルスがより好ましい。

0013

（１．インフルエンザウイルス）
インフルエンザウイルスは、哺乳類や鳥類に感染するオルソミクソウイルス科に属する１本鎖ＲＮＡウイルスであり、宿主細胞表面に存在する特定の構造を有する糖鎖を受容体（糖鎖受容体）として認識する。図１（Ａ）は、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質の構造を示した模式図である。また、図１（Ｂ）は、トリ及びヒトにおける糖鎖受容体のガラクトースとシアル酸の結合様式の違いを表した模式図である。３量体のヘマグルチニンタンパク質が宿主細胞への接着において、トリインフルエンザウイルスのほとんどは、通常、ガラクト−スとα２，３結合したシアル酸（ＳＡα２，３Ｇａｌ）を糖鎖末端にもつ受容体（トリ型受容体）に選択的に結合するのに対し、ヒトインフルエンザウイルスのほとんどは、通常、ガラクト−スとα２，６結合したシアル酸（ＳＡα２，６Ｇａｌ）を糖鎖末端にもつ受容体（ヒト型受容体）に選択的に結合することが知られている。

0014

（２．レオウイルス）
レオウイルスは、レオウイルス科に属するエンベロップ（外殻）を持たないウイルスであり、１０〜１２個の線状の２本鎖ＲＮＡをゲノムに有する。ほとんどすべての哺乳類が、レオウイルスの宿主として機能するが、病気は非常に若い時期に限定される。
図２（Ａ）は、レオウイルスの外層カプシドタンパク質σ１の構造を示した模式図である。レオウイルスの宿主細胞への接着は、ビリオンの表面から突き出た３量体の繊維状の外層カプシドタンパク質σ１により仲介される。はじめに、接合部接着分子Ａ（Ｊａｍ−Ａ）とレオウイルスσ１タンパク質の球状頭部中の領域とが相互作用する。さらに、σ1のシャフトドメインの配列が、細胞表面シアル酸と相互作用する。

0015

レオウイルスは３つの血清型からなり、１型（Ｔ１）と３型（Ｔ３）では異なる様式で糖鎖に結合する。図２（Ｂ）及び（Ｃ）は、Ｔ１レオウイルス及びＴ３レオウイルスの外層カプシドタンパク質σ１が結合し得る糖鎖受容体のガラクトースとシアル酸の結合様式の違いを表した模式図である。Ｔ１レオウイルスσ１は、ＧＭ２（ＮｅｕＡｃα１，３（ＧａｌＮＡｃβ１，４）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）糖鎖に特異的に結合し、ヒトやヒト以外の霊長類の赤血球を凝集させる。一方、Ｔ３レオウイルスσ１は、広い範囲のシアル酸化糖鎖（ガラクト−スとα２，３、α２，６又はα２，８結合したシアル酸糖鎖）に結合し、種々の哺乳類の赤血球を凝集させる。また、Ｔ３レオウイルスσ１は、赤血球に発現しているシアル酸化された糖タンパク質であるグリコフィリンに結合するが、Ｔ１レオウイルスσ１は結合しない。

0016

さらに、Ｔ１レオウイルス及びＴ３レオウイルスの糖鎖結合サイトは、σ１タンパク質の異なるドメインにある（図２（Ａ）参照）。Ｔ１レオウイルスのσ１タンパク質では頭部ドメインがＧＭ２糖鎖に結合するが、Ｔ３レオウイルスのσ１タンパク質では胴体部ドメインが糖鎖結合領域となっており、ガラクト−スとα２，３、α２，６又はα２，８結合したシアル酸糖鎖に結合する。Ｔ１レオウイルス及びＴ３レオウイルスにおいて、σ１タンパク質の頭部ドメインは、Ｊａｍ−Ａと結合するが、Ｔ１レオウイルスのσ１タンパク質のＧＭ２糖鎖結合サイトとは異なっており、Ｔ１レオウイルスのσ１タンパク質は双方の受容体に独立に相互作用できる。

0017

（３．アデノウイルス）
アデノウイルスは、ヒト、他の哺乳類、鳥類に感染するアデノウイルス科に属するエンベロップを持たない２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ウイルスである。いくつかのアデノウイルスの系統は、ヒトで結膜炎や上気道での疾患を引き起こすが、他のものは免疫応答性の個体にまれに症候群を起こすのみである。アデノウイルスの血清型は、レオウイルスと同様に、シアル酸への結合が異なっている。例えば、ほとんどのアデノウイルスはタンパク質の受容体を用いるが、Ｄ種アデノウイルス３７（Ａｄ３７）は、ノイラミニダーゼ感受性の様式でヒトの赤血球を凝集させ、シアル酸に結合することが知られている。

0018

図３（Ａ）は、Ｄ種アデノウイルス３７（Ａｄ３７）の外層カプシドタンパク質の構造を示した模式図である。レオウイルスのσ１タンパク質と同様に、アデノウイルスの外層カプシドタンパク質は２０面体の１２個の頂点から伸びている繊維状の３量体ファイバーを使って宿主細胞に結合する。図３（Ｂ）は、Ａｄ３７の外層カプシドタンパク質が結合し得る糖鎖受容体のガラクトースとシアル酸の結合様式を表した模式図である。Ａｄ３７の外層カプシドタンパク質σ１が、α２，３結合型シアル酸において、分岐型６糖であるＧＤ１ａ（Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（Ｎｅｕ５Ａｃα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）糖鎖に特異的に結合することが知られている。

0019

（４．ロタウイルス）
ロタウイルスは、レオウイルス科に属するエンベロップを持たない２本鎖ＲＮＡウイルスであり、世界的に子供の下痢の主な原因となるウイルスである。図４（Ａ）は、ロタウイルスの外層カプシドタンパク質の構造を示した模式図である。ロタウイルスの接着は糖鎖に依存しており、３量体の外層カプシドタンパク質ＶＰ４により仲介される。ロタウイルスの感染力は、ＶＰ４の３量体のＮ−末端側のＶＰ８★とＣ−末端側のＶＰ５★サブユニットのプロテアーゼによる切断により増加する。ＶＰ８★サブユニットは、細胞表面の糖鎖への結合によるウイルスの接着を仲介し、ＶＰ５★サブユニットは、膜への貫入を引き起こす。

0020

図４（Ｂ）は、ヒトロタウイルスＨＡＬ１１６６のＶＰ８★サブユニットが結合し得る糖鎖受容体のガラクトースとシアル酸の結合様式を表した模式図である。アカゲザルロタウイルス（ＲＲＶ）を含む多くの動物のロタウイルスは、ガングリオシドＧＭ３（Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）の末端にシアル酸を含む受容体に結合する。ヒトロタウイルス（例えば、Ｗａ遺伝子群など）は、シアル酸が、ガングリオシドＧＭ１（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ１，４（Ｎｅｕ５Ａｃα２，３）Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃ）のような２分岐の糖鎖の一つの枝に連結したシアル酸化受容体に結合する。他のヒトロタウイルス系統（例えば、ＨＡＬ１１６６など）は、Ａ型ＨＢＧＡｓ（ｈｉｓｔｏ−ｂｌｏｏｄ ｇｒｏｕｐ ａｎｔｉｇｅｎｓ）に特異的に結合することが知られている。ＨＢＧＡｓは、赤血球や上皮細胞、あるいは粘膜分泌物にも発現しているオリゴ糖である。さらに、新生児に下痢を引き起こすヒトＰ［１１］型ロタウイルス系統は、ＨＢＧＡｓ前駆体に結合する。

0021

このように、ウイルスの種類によって、ウイルスが結合し得るシアル酸と糖との結合の様式が異なるため、ウイルスが結合するシアル酸含有糖鎖の種類を調べることによって、ウイルスを分類することができる。

0022

［アシアロ糖鎖］
本実施形態の固相において、さらに、アシアロ糖鎖が固定されていることが好ましい。アシアロ糖鎖には、ウイルスが結合しないため、本実施形態の固相において、アシアロ糖鎖が固定された区分は、反応のネガティブコントロールとして活用することができる。

0023

本明細書において、「アシアロ糖鎖」とは、糖鎖構造の非還元末端にシアル酸が付加していない糖鎖を意味する。例えば、Ｎ−結合型糖鎖の場合には、ガラクトースが非還元末端に存在するアシアロ糖鎖が挙げられる。

0024

［固相に結合された糖鎖の量］
本実施形態の固相に結合された糖鎖の量は、α２，６結合型シアル酸含有糖鎖の量を基準として管理することが好ましい。α２，６結合型シアル酸含有糖鎖の量は、下記測定方法により測定される吸光度が例えば０．０５以上であってもよく、例えば０．１以上であってもよく、例えば０．５以上であってもよい。また、上記の吸光度の上限は、例えば２．０であってもよい。

0025

（測定方法）
固相上のα２，６結合型シアル酸含有糖鎖が固定された領域に、２０μｇ／ｍＬのビオチン化ＳＮＡレクチンを４℃で８時間接触させた後洗浄する。続いて、０．２μｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＨＲＰを室温で６０分間接触させた後洗浄する。続いて、ペルオキシダーゼ用発色キット（型番「ＭＬ−１１２０Ｔ」、住友ベークライト社製）を室温、遮光下で１５分間接触させる。続いて、波長４５０ｎｍの吸光度を測定する。ビオチン化ＳＮＡレクチンとしては、例えば、後述の実施例で使用したビオチン化ＳＮＡレクチン（ＶＥＣＴＯＲ社製）等が挙げられる。ストレプトアビジン−ＨＲＰとしては、例えば、ストレプトアビジン１分子あたりＨＲＰ１．５分子が結合したもの等が挙げられる。

0026

本実施形態の固相は、固相に結合された糖鎖の量が上述した範囲であることにより、ウイルスの種類を正確に分類することができる。なお、固相に結合された糖鎖の量が上述した範囲を超える場合、糖鎖を過剰に固定していることからコスト的に不利となる場合がある。

0027

［固相］
本明細書において、糖鎖を固定化する固相としては、基板、粒子等が挙げられる。

0028

（固相の材質）
固相の材質としては、例えば無機物質としてシリカ、アルミナ、ガラス、金属等が挙げられる。また、有機高分子物質として熱可塑性樹脂等が挙げられる。糖鎖を固定した固相担体を蛍光観察に用いる場合は、前記熱可塑性樹脂は、蛍光発生量の少ないものが好ましい。蛍光発生量の少ない樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン樹脂；環状ポリオレフィン樹脂；含フッ素樹脂等が挙げられる。中でも、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、成形性に特に優れる飽和環状ポリオレフィン樹脂を用いることが好ましい。本明細書において、飽和環状ポリオレフィン樹脂とは、環状オレフィン構造を有する単独重合体又は環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体に水素添加した飽和重合体を指す。

0029

（１．固相基板）
固相基板としては、具体的には、マルチウェルプレート、板状基板、膜等が挙げられる。中でも、マルチウェルプレートが好ましい。マルチウェルプレートは、任意の数のウェルが配置されているものが挙げられる。ウェルの数としては、プレート１枚当たり、例えば、２４、９６、３８４、１５３６個等が挙げられる。

0030

（２．固相粒子）
固相担体のうち粒子状のものを固相粒子と呼ぶ。固相粒子の形状は球であることが好ましく、平均粒径０．１μｍ以上５００μｍ以下のポリマー粒子がより好ましい。このような範囲の粒径を有する担体の粒子は、遠心分離、フィルタ等による回収が容易であり、かつ、充分な表面積を有しているために糖鎖との反応効率も高いと考えられる。平均粒径が５００μｍ以下の場合、表面積が小さ過ぎず、糖鎖との反応効率が高い。平均粒径０．１μｍ以上の場合、フィルタによる粒子の回収を効率よく行うことができ、粒子をカラムに充填して用いる場合に、通液の際の圧力損失が大きくなるおそれがない。

0031

前記固相担体の表面は、糖鎖を固定化するための官能基（以下、「固定化基」という場合がある。）を有する高分子化合物でコーティングされていてもよい。高分子化合物は、好ましくは、エチレン系不飽和重合性モノマー単位を構成単位とする高分子化合物を基本構造として有する。エチレン系不飽和重合性モノマー単位としては、（メタ）アクリル系樹脂、オレフィン系樹脂（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリシクロオレフィンなど）、スチレン系樹脂（ポリスチレン、アクリロニトリル−スチレン共重合体、メタクリル酸メチル−スチレン共重合体、スチレン−ブタジエン−スチレンブロック共重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、メタクリル酸メチル−ブタジエン−スチレン共重合体など）、塩素含有樹脂（ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなど）、フッ素含有樹脂などの樹脂を構成可能なモノマー単位が挙げられる。コーティング層を構成し得る高分子化合物は、固定化基を有していれば、上記の単位から選択される１種を単独で含む高分子化合物であってもよいし、複数種が組み合わされた高分子化合物であってもよい。

0032

固定化基は、糖鎖と共有結合又は非共有結合が可能な基であれば特に限定されず、たとえば、化学的に活性な（つまり糖鎖との反応性が高くなるように活性化された）基、受容体基、リガンド基等が挙げられる。糖鎖は、固定化基と共有結合又は非共有結合が可能となるように修飾されていてもよい。

0033

具体的な例としては、活性化されたカルボキシル誘導基、カルボキシル基、アルデヒド基、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチニル基、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アミノオキシ基、アジド基、アミド基、スルホネート基、アビジン、ストレプトアビジン、金属キレート等があるがこれらに限定されない。これらの中でもアミノ基との反応性の点から、アルデヒド基、活性化されたカルボキシル誘導基、エポキシ基、ビニルスルホン基が好ましく、また結合定数が高いビオチニル基も好ましい。特に、糖鎖に結合したアミノ基を介して結合させる場合には、アミノ基との反応性と保存安定性のバランスから、活性化されたカルボキシル誘導基が好ましい。一方で、糖鎖をその還元末端を介して結合させる場合には、反応性が高いため、アミノオキシ基又はヒドラジド基が好ましい。

0034

このような固定化基を有する単位の由来元となるモノマーとしては、例えば、下記の一般式［１Ａ］で表されるエチレン系不飽和モノマーが挙げられる。

0035

0036

上記式［１Ａ］のエチレン系不飽和モノマーは、（メタ）アクリル基に、活性化されたカルボキシル誘導基が、アルキレングリコール残基またはアルキル基の連結基を介して結合している。より具体的には、式［１Ａ］中、Ｒ１は水素原子またはメチル基を示し、Ｘ１は炭素数１以上１０以下であってよいアルキレングリコール残基又はアルキレン基である二価の連結基を示し、Ｗは活性化されたカルボキシル誘導基を示す。ｐは１以上１００以下の整数であってよい。

0037

アルキレングリコール残基は、それ自体がタンパク質の非特異吸着を抑制する性質を有している。このため、上記式［１Ａ］のエチレン系不飽和モノマーは、連結基Ｘがアルキレングリコール残基である場合、糖鎖を固定化する性質と、糖鎖の非特異吸着を抑制する性質とを併せ持つ。

0038

式［１Ａ］で、連結基Ｘ１がアルキレングリコール残基である場合、Ｘ１の炭素数は１以上１０以下であってよく、好ましくは１以上６以下であり、より好ましくは２以上４以下であり、さらに好ましくは２以上３以下であり、最も好ましくは２である。

0039

なお、アルキレングリコール残基とは、アルキレングリコール（ＨＯ−Ｒ−ＯＨ、ここでＲはアルキレン基）の片側末端または両末端の水酸基が他の化合物と縮合反応した後に残る、アルキレンオキシ基（−Ｒ−Ｏ−、ここでＲはアルキレン基）をいう。例えば、メチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２−ＯＨ）の場合のアルキレングリコール残基はメチレンオキシ基（−ＣＨ２−Ｏ−）であり、エチレングリコール（ＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ）の場合のアルキレングリコール残基はエチレンオキシ基（−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−）である。

0040

Ｘ１の繰り返し数ｐは、１以上１００以下の整数であってよく、Ｘ１がアルキレングリコール残基の場合、より好ましくは２以上５０以下の整数であり、さらに好ましくは２以上３０以下の整数であり、最も好ましくは２以上２０以下の整数である。高分子化合物が、ｐの数が異なる複数種の単位によって構成されている場合には、ｐは、当該高分子化合物全体における平均値として特定される。繰り返し数ｐが２以上の場合は、繰り返されるＸ１は同一であっても、異なっていてもよい。

0041

式［１Ａ］で、連結基Ｘ１がアルキレン基である場合、ｐ個分のアルキレン基（（Ｘ１）ｐ）の炭素数の合計が１以上１００以下であることが好ましく、１以上２０以下であることがより好ましい。アルキレン基は特に構造を限定されるものではなく、直鎖であっても、分岐していても、環状になっていてもよい。

0042

活性化されたカルボン酸誘導基（Ｗ）は、カルボキシル基が活性化された基であり、下記式［１Ｂ］に示されるように、カルボニル基に脱離基Ａ（水酸基を除く。）が結合した基である。

0043

0044

上記式［１Ｂ］で示される活性化されたカルボン酸誘導基は、脱離基Ａとして酸性度の高い電子求引性基を有することにより求核反応に対して活性化された基である。具体的には、活性化されたカルボン酸誘導基としては、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸等のカルボン類のカルボキシル基が、活性エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性化アミドに変換された基が挙げられる。

0045

活性エステル基として、より具体的には、例えば下記式［１Ｂ−１］又は下記式［１Ｂ−２］で表されるようにＯＣＲ２またはＯＮＲ３を脱離基Ａとして有する基等が挙げられる。

0046

0047

上記式［１Ｂ−１］及び式［１Ｂ−２］において、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ、一価の有機基であってよく、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式［１Ｂ−１］において、Ｒ２はＣとともに脂肪族環を形成する二価の基であってもよいし、Ｃとともに芳香族環を形成する基であってもよい。さらに、上記式［１Ｂ−２］において、Ｒ３はＮとともに脂肪族環を形成する二価の基であってもよいし、Ｎとともに芳香族環を形成する基であってもよい。なお、上記式［１Ｂ−１］及び式［１Ｂ−２］において、Ｒ２及びＲ３はがそれぞれＣまたはＮとともに芳香族環を形成する場合を除き、当該ＣおよびＮには、Ｒ２及びＲ３の価数に応じ、表示を省略したＨが結合している。

0048

活性エステル基のより具体的な例として、上記式［１Ｂ−１］に示されるＯＣＲ２基がｐ−ニトロフェニル基（下記式［１Ｂ−１−１］参照）等である置換または無置換のフェノール活性エステル基；および、上記式［１Ｂ−２］に示されるＯＮＲ３基がＮ−ヒドロキシスクシンイミド基（下記式［１Ｂ−２−１］参照）、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド基、Ｎ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド、等であるＮ−ヒドロキシイミド活性エステル基が挙げられる。中でも、保存安定性と反応性の高さとのバランスの点からｐ−ニトロフェノール活性エステル基またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェノール活性エステル基が特に好ましい。

0049

0050

活性エステルの他の例として、上記活性エステル基に対応するチオエステル基も挙げられる。好ましくは、置換または無置換のチオフェノールエステル基が挙げられる。

0051

活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れる点で好ましく用いられる。穏やかな条件としては、例えば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらに具体的にはｐＨ８．０とすることができる。

0052

酸無水物基としては、例えば下記式［１Ｂ−３−１］、式［１Ｂ−３−２］等に示される基が挙げられる。

0053

酸ハロゲン基としては、例えば上記式［１Ｂ］において−Ｃｌ及び−Ｆ等のハロゲンを脱離基Ａとして有する基等が挙げられる。

0054

活性化アミド基としては、例えば下記式［１Ｂ−４−１］等に示される基等が挙げられる。

0055

上記した固定化基を有する単位の由来元となるエチレン系不飽和重合性モノマーとして、特に好ましい化合物は、下記式に示すｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリ（エチレングリコール）メタクリレートである。下記式中、エチレングリコールの繰り返し数ｐは２以上２０以下が好ましい。

0056

固定化基がアミノオキシ基、ヒドラジド基など１級アミノ基を有するとき、これらの基を有するモノマーを重合して高分子化合物を得ることが困難な場合がある。このような場合はあらかじめ１級アミノ基が保護基で保護されたモノマーや１級アミノ基に変換しうる官能基を有するモノマーを用いて重合を行い、高分子化合物を得た後で保護基を外してもよく、又は化学反応で１級アミノ基を導入してもよい。

0057

１級アミノ基が保護基で保護されたモノマーとしては、特に構造を限定しないが、例えば、下記の一般式［２Ａ］で表されるエチレン系不飽和モノマー等が挙げられる。

0058

上記式［２Ａ］のエチレン系不飽和モノマーは、（メタ）アクリル基と、オキシルアミノ基又はヒドラジド基が、アルキレングリコール残基を含む連結基Ｘ２を介して結合している。より具体的には、式［２Ａ］中、Ｒ４は水素原子またはメチル基を示し、Ｘ２は−Ｏ−，−Ｓ−，−ＮＨ−，−ＣＯ−，−ＣＯＮＨ−で中断されていてもよい炭素数１〜２０の炭化水素鎖、又は炭素数１〜２０のアルキレングリコール基若しくはその繰り返し構造を示し、Ｚは酸素原子または−ＮＨ基（アミノ基）を示し、Ｙは保護基を示す。

0059

式［２Ａ］中の連結基Ｘ２としては、特別な限定はないが、−ＮＨ−，−ＣＯＮＨ−で中断されていてもよい炭素数２〜９の炭化水素鎖又はアルキレングリコール基若しくはその繰り返し構造であってもよい。

0060

保護基Ｙとしては、アミノ基を保護できるものであれば何ら制限を受けるものではなく、任意に用いることができる。例えば、ｔ—ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）やベンジロキシカルボニル基（Ｚ基、Ｃｂｚ基）、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）等が挙げられる。

0061

具体的なモノマーの例としては、下記式［２Ａ−１］で表されるようなもの等が挙げられる。

0062

１級アミノ基に変換しうる官能基を有するモノマーとしては、特に構造を限定しないが、例えば、アルコキシ基を有するモノマーであってもよい。アルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｔ−ブトキシ基等などが挙げられる。具体的なアルコキシ基を有するモノマーの例としては、下記式［２Ａ−２］で表されるようなもの等が挙げられる。

0063

官能基の返還方法としては、例えば、アルコキシ基とヒドラジン化合物を反応させて、ヒドラジド基を生成する方法等が簡便で好ましく挙げられる。ヒドラジン化合物としては、例えば、ヒドラジン一水和物等が挙げられる。

0064

固定化基を有する単位の割合は、特に限定されない。たとえば、高分子化合物が、親水性基、固定化基および疎水性基を有するものである場合、高分子化合物を構成する単位の総数に対して、１ｍｏｌ％以上３０ｍｏｌ％以下が好ましく、より好ましくは１ｍｏｌ％以上２０ｍｏｌ％以下、さらに好ましくは２ｍｏｌ％以上１５ｍｏｌ％以下である。またたとえば、高分子化合物が、親水性基、固定化基および架橋基を有するものである場合、高分子化合物を構成する単位の総数に対して、１ｍｏｌ％以上９９．７ｍｏｌ％以下が好ましく、より好ましくは１ｍｏｌ％以上７０ｍｏｌ％以下、最も好ましくは１ｍｏｌ％以上５０ｍｏｌ％である。

0065

また、高分子化合物は、親水性基を有することができる。親水性基は、優れた非特異吸着抑制効果を有する。具体的な例としては、ホスホリルコリン基およびアルキレングリコール残基が挙げられる。例えば、これらを有するモノマーと、固定化基を有する単位の由来元となるエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合することで、高分子化合物に親水性基を導入することができる。

0066

ホスホリルコリン基を有するモノマーとしては、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン；２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリンおよび１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン；アリルホスホリルコリン、ブテニルホスホリルコリン、ヘキセニルホスホリルコリン、オクテニルホスホリルコリン、およびデセニルホスホリルコリン等のアルケニルホスホリルコリン等が挙げられる。

0067

上記の中でも、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。これにより、非特異的吸着をより確実に抑制することができる。

0068

前記ホスホリルコリン基を有する単位の割合は特に限定されないが、高分子化合物を構成する単位の総数に対して、５ｍｏｌ％以上９５ｍｏｌ％以下が好ましく、より好ましくは１０ｍｏｌ％以上９０ｍｏｌ％以下、さらに好ましくは１５ｍｏｌ％以上９０ｍｏｌ％以下である。

0069

前記アルキレングリコール残基を有する単位の由来元となるモノマーとしては、たとえば、下記一般式［３Ａ］で表されるエチレン系不飽和モノマーが挙げられる。

0070

0071

上記式［３Ａ］のエチレン系不飽和モノマーは、（メタ）アクリル基がアルキレングリコール残基Ｘ３を含む。より具体的には、式［３Ａ］中、Ｒ５は、水素原子またはメチル基を示し、Ｒ６は水素原子または炭素数１以上２０以下のアルキル基を示す。Ｘ３は炭素数１以上１０以下であってよいアルキレングリコール残基を示し、ｑは１以上１００以下であってよい整数を示す。

0072

式［３Ａ］中のアルキレングリコール残基Ｘ３の炭素数は１以上１０以下であってよく、好ましくは１以上６以下であり、より好ましくは２以上４以下であり、さらに好ましくは２以上３以下であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｘ３の繰り返し数ｑは、特に限定されるものではないが、１以上１００以下の整数であってよく、好ましくは２以上１００以下の整数であり、より好ましくは２以上９５以下の整数であり、最も好ましくは５以上９０以下の整数である。コーティング層を構成する高分子化合物が、ｑの数が異なる複数種の単位によって構成されている場合には、ｑは、当該高分子化合物全体における平均値として特定される。繰り返し数ｑが２以上の場合は、Ｘ３は同一であっても、異なっていてもよい。

0073

アルキレングリコール残基を有する単位の由来元となるエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、より具体的には、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレートおよびその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレートおよびその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートおよびその水酸基の一置換エステル、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられる。

0074

これらのなかでも、糖鎖の非特異的吸着の少なさおよび入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートまたはエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。特に、エチレングリコール残基の平均繰り返し数が５以上９０以下であるメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートまたはエトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレートが、合成時の操作性（ハンドリング）の良さの点からより好ましく用いられる。

0075

アルキレングリコール残基を有する単位の割合は特に限定されないが、高分子化合物を構成する単位の総数に対して、０ｍｏｌ％以上９５ｍｏｌ％以下が好ましく、より好ましくは３０ｍｏｌ％以上９５ｍｏｌ％以下、さらに好ましくは５０ｍｏｌ％以上９０ｍｏｌ％以下である。

0076

また、高分子化合物は、疎水性基を有していても良い。疎水性基は、前記固相担体への吸着性を確保することができる。具体的な例としては、直鎖、分岐、および環状のアルキル基が挙げられる。アルキル基の炭素数は、たとえば１以上２０以下、好ましくは４以上２０以下である。疎水性基についても、例えば、これらを有するモノマーと、固定化基を有する単位の由来元となるエチレン系不飽和重合性モノマーとを共重合することで、高分子化合物に疎水性基を導入することができる。

0077

このような疎水性基を有する単位の由来元となるモノマーとしては、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ブチル（メタ）アクリレート、ｓｅｃ−ブチル（メタ）アクリレート、t−ブチル（メタ）アクリレート、ｎ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ネオペンチル（メタ）アクリレート、ネオペンチル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ヘキシル（メタ）アクリレート、ヘプチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ノニル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ノニル（メタ）アクリレート、ｎ−デシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−デシル（メタ）アクリレート、ｎ−ドデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ドデシル（メタ）アクリレート、ｎ−トリデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−トリデシル（メタ）アクリレート、ｎ−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−テトラデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ペンタデシル（メタ）アクリレート、ｎ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−ヘキサデシル（メタ）アクリレート、ｎ−オクタデシル（メタ）アクリレート、ｉｓｏ−オクタデシル（メタ）アクリレート、イソボニル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。これらのなかで特に好ましい基として、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、ｎ−ドデシルメタクリレート、ｎ−オクチルメタクリレートが挙げられる。

0078

疎水性基の単位の割合は特に限定されないが、高分子化合物を構成する単位の総数に対して、２０ｍｏｌ％以上９５ｍｏｌ％以下が好ましく、より好ましくは３０ｍｏｌ％以上９０ｍｏｌ％以下、さらに好ましくは３０ｍｏｌ％以上８０ｍｏｌ％以下である。

0079

また、高分子化合物は、架橋基を有していてもよい。架橋基は、例えば高分子化合物の主鎖を架橋させることにより、当該高分子化合物に不溶性を付与することができる。あるいは、前記固相担体表面に架橋して強固に結合することができる。
架橋基は、高分子化合物同士を架橋する基、または高分子化合物と固相担体表面とを架橋する基であれば特に限定されない。
このような架橋基は、架橋可能な官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが重合した後、架橋可能な官能基を反応させて、高分子化合物同士を架橋することによって生じさせることができる。

0080

架橋可能な官能基としては、エチレン系不飽和重合性モノマーの重合反応中には反応しない架橋性基であれば特に限定されない。例えば、加水分解によりシラノール基を生成する官能基やエポキシ基、（メタ）アクリル基、グリシジル基などが挙げられる。中でも、架橋処理が容易なことから、加水分解によりシラノール基を生成する官能基、エポキシ基、グリシジル基が好ましい。さらに、より低温で架橋できることから、加水分解によりシラノール基を生成する官能基が好ましい。

0081

加水分解によりシラノール基を生成する官能基とは、水と接触すると容易に加水分解を受けシラノール基を生成する基であり、例えば、ハロゲン化シリル基、アルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基等を挙げることができる。中でも、ハロゲンを含まないことから、アルコキシシリル基、フェノキシシリル基、アセトキシシリル基が好ましい。さらに、シラノール基を生成し易い点から、アルコキシシリル基が最も好ましい。

0082

加水分解によりシラノール基を生成する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、（メタ）アクリル基とアルコキシシリル基が直接または炭素数１以上２０以下のアルキル鎖を介して結合した一般式［４Ａ］で表されるエチレン系不飽和重合性モノマーであることが好ましい。

0083

0084

上記式［４Ａ］のエチレン系重合性不飽和モノマーは、（メタ）アクリル基が炭素数１以上２０以下のアルキル鎖Ｘ４を含む。より具体的には、式［４Ａ］中、Ｒ７は、水素原子またはメチル基を示し、Ａ１〜３は水素原子または炭素数１以上２０以下のアルキル基を示す。Ｘ４は炭素数１以上２０以下であってよいアルキル基を示す。

0085

アルコキシシリル基を含有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、例えば、３−（メタ）アクリロキシプロペニルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルビス（トリメチルシロキシ）メチルシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルジメチルエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−（メタ）アクリロキシプロピルトリス（メトキシエトキシ）シラン、８−（メタ）アクリロキシオクタニルトリメトキシシラン、１１−（メタ）アクリロキシウンデニルトリメトキシシラン等の（メタ）アクリロキシアルキルシラン化合物等を挙げることができる。中でも３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルジメチルエトキシシランがアルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとの共重合性が優れている点、入手が容易である点等から好ましい。これらのアルコキシシリル基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーは、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。

0086

架橋基の単位の割合は、特に制限されないが、高分子化合物を構成する単位の総数に対して、好ましくは１ｍｏｌ％以上２０ｍｏｌ％以下であり、より好ましくは２ｍｏｌ％以上１５ｍｏｌ％以下、さらに好ましくは２ｍｏｌ％以上１０ｍｏｌ％以下である。

0087

高分子化合物が、２成分以上の上記したモノマーの共重合によって得られる場合、その結合方式は、ランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態であってもよい。

0088

高分子化合物のコーティングは、例えば、０．０５〜１０質量％の濃度で有機溶媒に溶解した上記高分子化合物を、上記基板上に、浸漬、スプレー、スピンコーティング等により塗布した後、２０〜１２０℃程度の室温下又は加温下で乾燥させることにより行うことができる。上記有機溶媒としては、例えば、２−ブタノン、エタノール、メタノール、ｔ−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、アセトン、メチルエチルケトン等が挙げられる。

0089

基板の表面と高分子化合物との結合は、共有結合、静電的相互作用、水素結合、疎水効果による結合等どのような結合様式であってもよい。

0090

［糖鎖を固定化する方法］
糖鎖を固定化する方法については、共有結合又は非共有結合のいずれでもよく、固定化される固相の官能基に応じて、公知の方法に従って当業者が決定できる。なかでも共有結合による固定化が、糖鎖が脱離しにくいため好ましい。例えば、糖鎖又は糖鎖修飾物質を含有する溶液を、糖鎖と共有結合する官能基を備えた固相に接触させる方法等が挙げられる。糖鎖又は糖鎖修飾物質と共有結合する官能基としては、糖鎖固定化能を有するものであれば特に限定されない。例えば、糖鎖又は糖鎖修飾物質のアミノ基を介して固相に結合する場合には、効率的に糖鎖を固定化させることができる点から、活性化されたカルボキシル誘導基が好ましい。この場合、糖鎖又は糖鎖修飾物質を溶解する溶媒としては、特に限定されないが、ｐＨ７．０〜１０．０の一般的な緩衝液を用いてよく、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。糖鎖又は糖鎖修飾物質のアミノ基を介して固相に結合する場合は、固相のカルボキシル基と脱水縮合してもよい。この場合の溶媒としては、カルボジイミド等の縮合剤を含む溶液であってよく、そのｐＨは、ｐＨ３〜８であることが好ましく、ｐＨ４〜６であることがより好ましい。一方、糖鎖又は糖鎖修飾物質の還元末端を介して固相に結合する場合には、効率的に糖鎖を固定化させることができる点から、アミノオキシ基、ヒドラジド基が好ましい。この場合、糖鎖又は糖鎖修飾物質を溶解する溶媒としては、特に限定されないが、好ましくはｐＨ２〜７の緩衝液、より好ましくはｐＨ４〜６の緩衝液が挙げられる。

0091

[ブロッキング操作]
糖鎖固定後は、反応溶液を除去後、糖鎖の固定化に関与しなかった固定化基を不活性化処理することが好ましい。不活性化処理は、固定化基の種類に応じ、糖鎖との結合性を有しない他の基に変更させることによって行うことができる。たとえば、固定化基が活性エステル基、アルデヒド基などの場合は、アルカリ化合物、一級アミノ基などを有する化合物で不活化処理することができる。固定化基がアミノオキシ基、ヒドラジド基などの場合は、無水酢酸、無水コハク酸などの酸無水物で不活化処理することができる。

0092

一級アミノ基を有する化合物としては、例えばメチルアミン、エチルアミン、ブチルアミン、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレン等が挙げられる。この中でも、アミノエタノール、グリシンが好ましい。

0093

本実施形態において、上記のα２，３結合型シアル酸含有糖鎖はα２，３結合型シアル酸含有糖鎖結合ペプチドを形成していてもよく、上記の前記α２，６結合型シアル酸含有糖鎖はα２，６結合型シアル酸含有糖鎖結合ペプチドを形成していてもよく、上記のアシアロ糖鎖は、アシアロ糖鎖結合ペプチドを形成していてもよい。

0094

糖鎖結合ペプチドのアミノ基を固相との結合に利用することにより糖鎖を十分に露出することができる。

0095

ペプチドの長さは、特に限定されず、例えば５〜３０アミノ酸残基であってもよく、例えば５〜２０アミノ酸残基であってもよく、例えば５〜１０アミノ酸残基であってもよい。

0096

図５の（Ａ）〜（Ｃ）は、本実施形態におけるα２，３結合型シアル酸含有糖鎖結合ペプチド、α２，６結合型シアル酸含有糖鎖結合ペプチド及びアシアロ糖鎖結合ペプチドの構造の一例を示した図である。これらの糖鎖結合ペプチドによれば、固相上の官能基（例えば、カルボキシル基、活性エステル構造等）と、α２，３結合型シアル酸含有糖鎖結合ペプチド、α２，６結合型シアル酸含有糖鎖結合ペプチド及びアシアロ糖鎖結合ペプチドのアミノ基がアミド結合を形成することで基板上に各糖鎖を固定化することができる。

0097

＜ウイルスの分類方法＞
一実施形態において、本発明は、α２，３結合型シアル酸含有糖鎖又はα２，６結合型シアル酸含有糖鎖が固定された固相にウイルスを接触させる工程と、固相に結合したウイルスを検出する工程と、ウイルスと、α２，３結合型シアル酸含有糖鎖及びα２，６結合型シアル酸含有糖鎖の少なくとも一つとの結合活性に基づいてウイルスを分類する工程と、を備える、ウイルスの分類方法を提供する。

0098

本明細書において、分類可能なウイルスとしては、上述したインフルエンザウイルス、レオウイルス、アデノウイルス、ロタウイルス等が挙げられる。この中でも、分類の需要が高い観点から、インフルエンザウイルスが好ましく、トリインフルエンザウイルス及びヒトインフルエンザウイルスがより好ましい。

0099

本実施形態のウイルス分類方法について、以下に詳細を述べる。まず、α２，３結合型シアル酸含有糖鎖又はα２，６結合型シアル酸含有糖鎖が固定された固相にウイルスを接触させる。ウイルスを含む試料については、特別な限定はなく、例えば、被験者の血液、唾液等の体液、尿などの生体試料、細胞又はウイルス自体の懸濁液、飲用水、下水などが挙げられる。

0100

次に、固相に結合したウイルスを検出する。検出方法としては、特別な限定はなく、例えば抗ウイルス抗体を用いる方法、例えばウイルスが結合する前から結合した後まで、固相に一定の波長の光を照射し続けて、吸光度の変化を測定する方法等が挙げられる。

0101

続いて、ウイルスと、α２，３結合型シアル酸含有糖鎖又はα２，６結合型シアル酸含有糖鎖との結合活性に基づいてウイルスを分類する。上述したとおり、ウイルスの種類によって、ウイルスが結合し得るシアル酸と糖との結合の様式が異なるため、ウイルスが結合したシアル酸含有糖鎖の種類を調べることによって、ウイルスを分類することができる。例えば、α２，３結合型シアル酸含有糖鎖に結合したインフルエンザウイルスは、トリインフルエンザウイルスに分類することができる。また、α２，６結合型シアル酸含有糖鎖に結合したインフルエンザウイルスは、ヒトインフルエンザウイルスに分類することができる。

0102

以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

0103

［実施例１］糖鎖固定化プレートの作製
１．高分子化合物溶液の合成
（１）高分子化合物の合成
まず、コーティング層に用いる高分子化合物を調製した。２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、「ＭＰＣ」と記載）、ｎ−ブチルメタクリレート（以下、「ＢＭＡ」と記載）、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（以下、「ＭＥＯＮＰ」と記載。）を１ｍｏｌ／Ｌになるようにエタノールに溶解させた。なお、モノマー混合溶液中における、それぞれのモル比は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、ＭＥＯＮＰの順に２５：７０：５である。そこに、さらに２、２−アゾビスイソブチロニトリル（以下、「ＡＩＢＮ」と記載、和光純薬工業社製）を０．０１ｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、均一になるまで撹拌することで、モノマー混合溶液を作製した。

0104

続いて、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で６時間反応させ、反応溶液をジエチルエーテル／クロロホルム混合溶媒（容積比８０／２０）中に滴下し、沈殿を収集することにより高分子化合物を得た。なお、上述したＭＥＯＮＰについては、以下の（２）に示すようにして合成した。

0105

（２）ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成
０．０１ｍｏｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（日本油脂製、「Ｂｌｅｎｍｅｒ ＰＥ−２００」）を２０ｍLのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン（和光純薬工業社製）およびクロロホルム２０ｍLの均一溶液をゆっくりと滴下した。−３０℃にて１時間反応させた後、室温でさらに２時間溶液を攪拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してＭＥＯＮＰを得た。

0106

２．糖鎖プレートの準備
シクロオレフィン製９６穴プレートに上記の高分子化合物の０．３重量％エタノール溶液を３００μＬ/ｗｅｌｌずつ分注し、３０分以上室温で静置した。次に、高分子化合物溶液をｗｅｌｌから回収後、洗浄液(７５％エタノール)３００μＬを分注し、３分間静置した。溶液を除去し、乾燥した。

0107

続いて、固定化する糖鎖の溶液を準備した。糖鎖としては、図５（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）にそれぞれ示す構造を有するα２，３結合型シアル酸含有糖鎖結合ペプチド、α２，６結合型シアル酸含有糖鎖結合ペプチド、アシアロ糖鎖結合ペプチドを使用した。５Ｍリン酸カリウムバッファーを用いて、各糖ペプチド溶液を、０、０．０９、０．１９、０．３８、０．７５、１．５０、３．００、６．００μｇ／ｍＬの計８種類の濃度となるようにそれぞれ濃度調整を行った。

0108

続いて、各濃度の糖ペプチド溶液を１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で２時間静置した。その後、溶液を除去し、超純水で３００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注後、除去する操作を３回実施した。

0109

ブロッキング溶液（モノエタノールアミン）を３００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、室温で６０分静置した。その後、溶液を除去し、超純水で３００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注後、除去する操作を３回実施した。

0110

［試験例１］過ヨウ素酸−シッフ塩基（ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ ｂａｓｅ：ＰＡＳ）法による固定化糖鎖の検出
実施例１で作製したプレートに、１０μｇ/ｍＬ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を１００μＬ/ウェルずつ分注し、プレートシールで蓋をし、３７℃で３０分間静置した。続いて、純水で３回プレートを洗浄した。次に、ビオチンアミドヘキサン酸ヒドラジドを３００ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーで５０μＭとなるように希釈し、１００μＬずつ分注した。プレートシールで蓋をし、３７℃で一晩静置した。続いて、純水で３回プレートを洗浄した。
次に、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（型番「１８−１５２」、ミリポア社製）を０．２μｇ/ｍＬとなるように１％ＢＳＡ/ＰＢＳ溶液で希釈し、１００μＬずつ分注した。プレートシールで蓋をし、室温で６０分間静置した。続いて、純水で３回プレートを洗浄した。
次に、ペルオキシダーゼ用発色キット（型番「ＭＬ−１１２０Ｔ」、住友ベークライト社製）を１００μＬ/ウェルずつ分注し、室温、遮光下で１５分静置した。続いて、０．５Ｍ硫酸を１００μＬ/ウェルずつ分注し、吸光度測定器（ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００、テカン社製）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表１及び図６に示す。３種類全ての糖鎖ペプチドが固定化していることが確かめられた。

0111

0112

［試験例２］ＳＮＡ（Ｓａｍｂｕｃｕｓ ｎｉｇｒａ）レクチン反応試験
実施例１で作製したプレートに、α２，６結合型シアル酸含有糖鎖に結合することが知られているＳＮＡレクチンを反応させた。ＳＮＡレクチンは、ウイルスの代わりとして用いた。具体的には、実施例１で作製したプレートに、ビオチン化ＳＮＡレクチン（ＶＥＣＴＯＲ社製）を２０μｇ／ｍＬとなるように溶液で希釈し、１００μＬずつ分注した。プレートシールで蓋をして、４℃で一晩静置した。続いて、純水で３回プレートを洗浄した。
次に、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（型番「１８−１５２」、ミリポア社製）を０．２μｇ／ｍＬとなるように１％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液で希釈し、１００μＬずつ分注した。プレートシールで蓋をし、室温で６０分間静置した。続いて、純水で３回プレートを洗浄した。
次に、ペルオキシダーゼ用発色キット（型番「ＭＬ−１１２０Ｔ」、住友ベークライト社製）を１００μＬ／ウェルずつ分注し、室温、遮光下で１５分静置した。続いて、０．５Ｍ硫酸を１００μＬ／ウェルずつ分注し、吸光度測定器（ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００、テカン社製）を用いて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。結果を表２及び図７に示す。

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表２及び図７から、ＳＮＡレクチンがα２，６糖鎖シアリル糖鎖のみと反応することが確かめられた。

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本発明によれば、ウイルスとの相互作用を高感度で、簡便且つ安価に測定することができる、糖鎖が固定化された固相を提供できる。