技術 ダイズの収量予測方法

0001

本発明はダイズの収量を早期に予測する方法に関する。

0002

ダイズは、重要な穀物であり、日本を始め世界中で広く食されている。また他の代表的な穀物である米、麦、トウモロコシと異なり、タンパク質及び脂質の割合が高く栄養価も豊富である。そのため飼料や油脂原料としても重要であり、収量を増加させる技術の開発が行われている。
ダイズの生育期間は、品種や栽培条件によって若干異なるが、通常、播種から収穫まで４−５か月という長期間を要する。よって、ダイズの収量を増加させる技術の開発において、収量評価を行うには栽培に多くの時間を必要とする。さらに、日本のような季節・気候条件では、収穫まで４−５か月を要するダイズの栽培は年に１回が一般的である。屋外栽培での収量評価が年に１度しかできず収量増加技術の開発の障害となっていることから、早期に収量を予測する方法が求められてきた。また、実際の生産場面において、早期に収量を予測することができれば、生産者は安定した収量確保のために費用コストのかかる追加技術を投入すべきかどうかの判断を容易に下すことができる。

0003

これまでにも生育中の植物体の発育状態と収量との相関性を利用した早期に収量性を評価する方法が種々検討されている。例えば、非特許文献１ではダイズの播種後４０日程度に測定した主茎長と収量との相関（ｒ＝０．５１）を利用する方法、非特許文献２では、播種後６０−７０日程度に測定した地上部の乾燥重量と収量との相関（ｒ＝０．６６）を利用する方法が開示されている。また、非特許文献３及び４では、画像診断技術を用いて、圃場においてＮＤＶＩ（正規化植生指標）やＬＡＩ（葉面積指数）及び群落分光反射率を測定し、生育や収量性を評価する試みが開示されている。

0004

しかしながら、非特許文献１の方法は、比較的早期に収量を予測できる可能性がある一方で相関性が十分でなく、また非特許文献２の方法では相関性は向上するものの予測時期が栽培開始から２か月以上であり生育期間の半分が経過すること、及び地上部乾燥重を測定するため侵襲的であり、個体毎の予測因子と収量とを対応させたい場合の評価には向いていない。非特許文献３及び４の方法は非破壊で簡易的な測定であるといえるが、予測時期が開花期、すなわち播種後５０日前後以降になること、また精度の面でも十分とは言えない。

0005

このほかイネにおいて、播種後１５日程度の地上部から抽出される代謝物をＧＣ−ＭＳにより網羅的に測定し、それらのデータを用いてハイブリッドライス収量予測モデルを作成したことが報告されているが（非特許文献５）、この報告では、通常の予測モデル構築の際に行われるクロスバリデーションというモデルの予測性評価が行われておらず、検証が十分とは云えない。また、侵襲的であり、個体毎の予測因子と収量とを対応させたい場合の評価には向いていない。

0006

藤田与一ら、平成２１年度「関東東海北陸農業」研究成果情報、「重粘度地帯におけるダイズ「エンレイ」の多収事例に基づく収量構成要素と生育指標」、http://www.naro.affrc.go.jp/org/narc/seika/kanto21/12/21_12_04.html
井上健一、高橋正樹、第２２９回日本作物学会講演会要旨集、２０１０、ｐ５０、「物質生産と窒素の蓄積から見たダイズの多収生育相」
長南友也ら、第２４５回日本作物学会講演会要旨集、２０１８、ｐ８３、「ダイズの簡易的な開花前生育診断技術」
渡邊智也ら、第２４５回日本作物学会講演会要旨集、２０１８、ｐ８４、「非破壊計測と畳み込みニューラルネットワークを利用したダイズの収量評価」
Dan,Z.et al., Scientific Reports,2016,6,21732

0007

本発明は、ダイズの収量を早期に精度よく予測する方法を提供することに関する。

0008

本発明者らは、ダイズの収量性評価について種々検討した結果、葉中に含まれる代謝物にはその存在量が収量と相関する成分があること、そして、播種後１か月程度という早期に展開葉を１枚採取し、葉中に含まれる成分を分析し、解析することで最終的な収量を個体レベルで評価できることを見出した。

0009

すなわち、本発明は、ダイズから採取された葉サンプルから１以上の成分の分析データを取得し、当該データとダイズ収量との相関性を利用してダイズの収量を予測する、ダイズの収量予測方法であって、成分が２−ヒドロキシピリジン、コリン、クエン酸、グリセリン酸、グリシン、Ｌ−ピログルタミン酸、マロン酸、スクロース及びトレイトールから選ばれる１種以上である、方法を提供する。

0010

本発明の方法によれば、ダイズの収量を早期に予測できる。これにより、例えば、収量確保のための追加技術投入の判断が容易となるほか、収量増加技術の開発の大幅な効率化を図ることができる。

0011

全１２５データを用いて構築されたＯＰＬＳモデルによる収量の予測値と実測値との関係を示す図。
図１のモデルにおけるＶＩＰ値１位以下、２位以下、３位以下、４位以下、５位以下及び６位以下のすべての成分データを用いてＯＰＬＳ法により構築した各々のモデルのＲ２（図中ではＲ２Ｙと表示）値及びＱ２（図中ではＱ２と表示）値を示す図。
図１のモデルにおけるＶＩＰ値１位及び２位、ＶＩＰ値１位〜３位及びＶＩＰ値１位〜４位の成分データを用いてＯＰＬＳ法により構築した各々のモデルのＲ２（図中ではＲ２Ｙと表示）値及びＱ２（図中ではＱ２と表示）値を示す図。
図１のモデルにおけるＶＩＰ値上位１位〜４位、２位〜５位、３位〜６位、４位〜７位、５位〜８位及び６位〜９位の成分データを用いてＯＰＬＳ法により構築した各々のモデルのＲ２（図中ではＲ２Ｙと表示）値及びＱ２（図中ではＱ２と表示）値を示す図。
図１のモデルにおけるＶＩＰ値上位１位〜５位、２位〜６位、３位〜７位、４位〜８位及び５位〜９位の成分データを用いてＯＰＬＳ法により構築した各々モデルのＲ２（図中ではＲ２Ｙと表示）値及びＱ２（図中ではＱ２と表示）値を示す図。
図１のモデルにおけるＶＩＰ値上位１位〜６位、２位〜７位、３位〜８位及び４位〜９位の成分データを用いてＯＰＬＳ法により構築した各々のモデルのＲ２（図中ではＲ２Ｙと表示）値及びＱ２（図中ではＱ２と表示）値を示す図。
図１のモデルにおけるＶＩＰ値上位１位〜７位、２位〜８位及び３位〜９位の成分データを用いてＯＰＬＳ法により構築した各々のモデルのＲ２（図中ではＲ２Ｙと表示）値及びＱ２（図中ではＱ２と表示）値を示す図。

0012

本発明において、ダイズとは、マメ科の一年草である大豆（学名 Glycine max）を意味する。その品種はフクユタカ、エンレイ、里のほほえみ、湯上がり娘、リュウホウ、スズユタカ等、多岐にわたるが、本発明においてはそれに限定されるものではない。

0013

ダイズの出芽から落葉までの生育ステージは、ＶＣ：初生葉展開期（播種後7日前後）、Ｒ１−２：開花期（播種後５０日前後）、Ｒ３−４：着莢期（播種後７０日前後）、Ｒ５−６：子実肥大期（播種後９０日前後）に分けられる（Fehr, W.R., Caviness, C.E., 1977. Stages of soybean development. Cooperative Extension Service, Agriculture and Home Economics Experiment Station, Iowa State University, Ames, Iowa）。本発明において、サンプルとして使用されるダイズの葉の採取時期は、葉が採取可能な初生葉展開期（ＶＣ）から子実肥大期（Ｒ５−６）までの間に行われればよく、好ましくは初生葉展開期〜Ｒ３−４期、より好ましくは播種後１４日〜Ｒ３−４期、より好ましくは播種後２１日〜Ｒ１−２期、さらに好ましくは播種後２８日〜Ｒ１−２期のダイズが挙げられる。尚、上記各生育ステージにおける前後の日数幅は１０日間以内が好適である。
或いは、ダイズの葉の採取時期は、播種後７日以上、好ましくは１４日目以上、より好ましくは２１日目以上、さらに好ましくは２８日以上で、且つ好ましくは播種後５０日より前、より好ましくは播種後４０日より前、さらに好ましくは３５日目より前であり得る。また、播種後７〜５０日目、好ましくは１４〜４０日目、より好ましくは２８〜３５日目であり得る。例えば、播種後３０日±３〜５日目のダイズから葉を採取するのが好適である。

0014

葉の採取部位は、特に限定されないが、例えば、最上位に展開する本葉の１または２葉齢古い本葉を構成する複葉３枚の内、中央の複葉を採取することが挙げられる。

0015

本発明において、取得される成分の分析データ（「成分データ」とも称する）としては、本発明で規定する成分を同定することができるものであれば特に限定されず、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、イオンクロマトグラフィー、質量分析（ＭＳ）、近赤外分光分析（ＮＩＲ）、フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴ−ＩＲ）、核磁気共鳴分析（ＮＭＲ）、フーリエ変換核磁気共鳴分析（ＦＴ−ＮＭＲ）、誘導結合プラズマ質量分析計（ＩＣＰ−ＭＳ）、ガスクロマトグラフや液体クロマトグラフと質量分析とを組合せたＧＣ−ＭＳ、ＬＣ−ＭＳ等の機器分析手段を用いて分析・測定されたデータが挙げられるが、好ましくは質量分析データであり、より好ましくはＧＣ−ＭＳによる質量分析データである。
質量分析データとしては、精密質量（「ｍ／ｚ値」）、イオン強度、保持時間等が挙げられるが、好ましくは精密質量の情報である。なお、精密質量とは、小数点以下４桁以上の精度にて測定された質量をさす。

0016

葉サンプルを、上記機器分析手段に適用するためには、分析手段に応じて適宜前処理されるが、通常、採取した葉はアルミホイルで包み直ちに液体窒素中で凍結して代謝反応を停止させ、凍結乾燥にかけて乾燥した後、抽出操作に供される。
抽出は、凍結乾燥した葉サンプルを、ビーズ粉砕機等を用いて粉砕した後、抽出溶媒を添加して撹拌することにより行われる。ここで用いられる抽出溶媒としては、メタノール、エタノール、ブタノール、アセトニトリル、クロロホルム、酢酸エチル、ヘキサン、アセトン、イソプロパノール、水等及びそれらを混合したものが挙げられる。分析手段としてＧＣ−ＭＳを用いる場合には、メタノール／水／クロロホルムの混合溶媒等が好適に使用される。

0017

本発明において、分析される葉中の成分としては、２−ヒドロキシピリジン（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｉｄｉｎｅ）、コリン（ｃｈｏｌｉｎｅ）、クエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）、グリセリン酸（ｇｌｙｃｅｒｉｃ ａｃｉｄ）、グリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）、L-ピログルタミン酸（Ｌ−ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍｉｃ ａｃｉｄ）、マロン酸（ｍａｌｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）及びトレイトール（ｔｈｒｅｉｔｏｌ）から選ばれる１種以上である。
当該９成分はダイズの代謝物質から選択抽出されたものであり、その選択方法は詳細には実施例に示すとおりであるが、概略すると、１）２０１５年〜２０１７年にかけて、土壌、品種、肥料を変えたダイズ１２５株を栽培し、２）それぞれ播種後１ヶ月前後に葉を１枚採取し、３）メタノール／水／クロロホルムの混合溶媒（５：２：２, ｖ/ｖ/ｖ）を用いて成分抽出を行い誘導体化を行った後、４）ＧＣ／ＭＳ分析を行い、得られた各成分由来ピーク情報（保持時間、質量情報）を既存のＧＣ／ＭＳ質量スペクトルライブラリと照合することによりピークを同定し、５）分析データと対応する収量データとの相関解析を行い、収量と相関すると判定した成分を取得する、というものである。

0018

取得した１２５個の葉中９成分の分析データと対応する収量データとの相関解析の結果（各成分の分析データのピーク面積と収量との単相関係数ｒ及び無相関の検定によりｐ値を算出）は後記表３に示すとおりであり、このうち、２−ヒドロキシピリジン、グリシン、L-ピログルタミン酸及びスクロースの４種は相関係数の絶対値|ｒ|が０．５１を超えている。したがって、本発明における分析対象成分としては、２−ヒドロキシピリジン、グリシン、L-ピログルタミン酸及びスクロースから選ばれる１種以上を含むのがより好ましい。

0019

したがって、ダイズの収量の予測手段は、予測したいサンプルについて、上記９成分、好ましくは２−ヒドロキシピリジン、グリシン、Ｌ−ピログルタミン酸及びスクロースから選ばれる１種以上の分析データを取得し、既知の収量とピーク面積との相関関係から収量値を推定することができる。

0020

また、上記９成分の分析データから複数を使用し、多変量解析手法を用いて構築された収量予測モデルと照合することにより、収量を予測することができる。
すなわち、播種から所定期間経過後のダイズの葉を採取し、分析サンプルを得、該分析サンプルを機器分析に供して機器分析データ得、該機器分析データを、収量予測モデルと照合することにより、当該ダイズの収量を予測することができる。

0021

収量予測モデルは、説明変数に例えば各成分の分析データのピーク面積値を、また目的変数に収量値を用いた回帰分析を行うことにより構築できる。回帰分析法としては、例えば主成分回帰分析、ＰＬＳ（Partial least squares projection to latent structures）回帰分析、ＯＰＬＳ（Orthogonal projections to latent structures）回帰分析、一般化線形回帰分析の他、バギング、サポートベクターマシン、ランダムフォレスト、ニューラルネットワーク回帰分析等の機械学習・回帰分析手法等の多変量回帰分析手法が挙げられる。このうち、ＰＬＳ法、ＰＬＳ法の改良版であるＯＰＬＳ法、或いは機械学習・回帰分析手法を用いるのが好ましい。ＯＰＬＳ法は、ＰＬＳ法に比べ予測性は同じだが、解釈のための視覚化がより容易になる点が今回のような目的においては優れている。ＰＬＳ法及びＯＰＬＳ法は、共に高次元のデータから情報を集約し少数の潜在変数に置き換え、その潜在変数を用いて目的変数を表現する方法である。潜在変数の数を適切に選ぶことが重要であり、潜在変数の数を決めるのによく利用されるのがクロスバリデーション（交差検証）である。すなわち、モデル構築用データをいくつかのグループに分割し、あるグループをモデル検証に、その他のグループをモデル構築に用いて予測誤差を見積り、この作業を、グループを入れ替えながら繰り返して、予測誤差の合計が最小となる潜在変数の数が選ばれる。

0022

予測モデルの評価は、主に２つの指標で判断される。１つは予測精度を表すＲ２、もう１つは予測性を表すＱ２である。Ｒ２は予測モデル構築に使用したデータの実測値とモデルで計算した予測値との相関係数の２乗であり、１に近いほど予測精度が高いことを示している。一方、Ｑ２は、上記クロスバリデーションの結果であり、実測値と、繰り返し実施したモデル検証の結果である予測値との相関係数の２乗を表している。本発明のダイズ収量予測モデルにおいては、Ｑ２＞０．５０をモデル評価の基準とするのが好ましい。なお、常にＲ２＞Ｑ２となるため、Ｑ２＞０．５０は同時にＲ２＞０．５０を満たすこととなる。
以下に、上記９成分の質量分析データのピーク面積値と、子実収量を用いた種々のダイズ収量予測モデルを作成しその精度を検証した結果を示す。

0023

（１）全ての成分情報を用いた収量予測モデルの構築
１データ当り９個の成分の分析データのピーク面積値と収量値を持つ全１２５個のデータマトリックスからＯＰＬＳモデル（図１）を構築した。なお、構築の際は、各成分の分析データのピーク面積値及び収量データはオートスケーリングにより平均０、分散１に変換した。Ｒ２＝０．５６、Ｑ２＝０．５５であり、高い予測性能を持つモデルといえる。なお、Ｌ−ピログルタミン酸の分析データのみで構築したモデルはＲ２＝３２、Ｑ２＝０．２９であるため、複数の成分データを用いることでより高い精度のモデルを構築することができる。
上記モデルではＶＩＰ（Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ,投影における変数重要性）値とよばれる各成分に与えられるモデル性能への寄与度が算出される。
ＶＩＰ値は、下記式１により求められる。

0024

0025

ＶＩＰ値はその値が大きいほどモデルへの寄与度が大きく、相関係数の絶対値とも相関する。ＶＩＰ値のリストを後記表４に示す。

0026

（２−１）ＶＩＰ値が下位の成分由来ピークを用いたモデル
ＶＩＰ値１位以下の成分の分析データすべて、ＶＩＰ値２位以下の成分の分析データすべて、又はＶＩＰ値３位以下の成分の分析データすべて、を用いて構築されたＯＰＬＳモデルはＱ２＞０．５０を満たし、収量予測モデルとして好ましい（図２）。ＶＩＰ値４位以下及び５位以下の成分の分析データすべてを用いて構築されたＯＰＬＳモデルは何れもＱ２＞０．５０を満たさなかった。

0027

（２−２）ＶＩＰ値上位の成分の分析データを複数個用いたモデル
９個の成分の分析データから選ばれる任意の４個以上のデータを用いて構築されたモデルのうち、Ｑ２＞０．５０を満たすモデルは収量予測モデルとして好ましい。具体的には、以下の１）〜４）に示すモデルが挙げられる。
１）ＶＩＰ値上位から順に連続する４個の成分の分析データを用いたモデル
ＶＩＰ値６位以上の成分についてＶＩＰ値上位から順に連続する４個の成分の分析データを用いて構築されたＯＰＬＳモデルはＱ２＞０．５０を満たし、収量予測モデルとして好ましい。また、ＶＩＰ値３位〜６位の成分の分析データを用いて構築されたＯＰＬＳモデルＱ２＞０．５０を満たしたことから、ＶＩＰ値６位以上であれば、任意の４個の成分の分析データを用いることで、Ｑ２＞０．５０を満たす予測モデルが得られると考えられる。
例えば、ＶＩＰ値上位１位〜４位、２位〜５位、３位〜６位の成分の分析データを用いて構築されたＯＰＬＳモデルが挙げられる（図４）。

0028

２）ＶＩＰ値上位から順に連続する５個の成分の分析データを用いたモデル
ＶＩＰ値７位以上の成分についてＶＩＰ値上位から順に連続する５個の成分の分析データを用いて構築されたＯＰＬＳモデルはＱ２＞０．５０を満たし、収量予測モデルとして好ましい。また、ＶＩＰ値３位〜７位の成分の分析データを用いて構築されたＯＰＬＳモデルＱ２＞０．５０を満たしたことから、ＶＩＰ値７位以上であれば、任意の５個の成分の分析データを用いることで、Ｑ２＞０．５０を満たす予測モデルが得られると考えられる。
例えば、ＶＩＰ値上位１位〜５位、２位〜６位、３位〜７位の成分の分析データを用いて構築されたＯＰＬＳモデルが挙げられる（図５）。

0029

３）ＶＩＰ値上位から順に連続する６個の成分の分析データを用いたモデル
ＶＩＰ値８位以上の成分についてＶＩＰ値上位から順に連続する６個の成分の分析データを用いて構築されたＯＰＬＳモデルはＱ２＞０．５０を満たし、収量予測モデルとして好ましい。また、ＶＩＰ値３位〜８位の成分の分析データを用いて構築されたＯＰＬＳモデルＱ２＞０．５０を満たしたことから、ＶＩＰ値８位以上であれば、任意の６個の成分の分析データを用いることで、Ｑ２＞０．５０を満たす予測モデルが得られると考えられる。
例えば、ＶＩＰ値上位１位〜６位、２位〜７位、３位〜８位の成分の分析データを用いて構築されたＯＰＬＳモデルが挙げられる（図６、図２）。

0030

４）ＶＩＰ値上位から順に連続する７個の成分の分析データを用いたモデル
ＶＩＰ値上位から順に連続する７個の成分の分析データを用いて構築されたＯＰＬＳモデルはＱ２＞０．５０を満たし、収量予測モデルとして好ましい。また、ＶＩＰ値３位〜９位の成分の分析データを用いて構築されたＯＰＬＳモデルＱ２＞０．５０を満たしたことから、９個の成分の内、任意の７個の成分の分析データを用いることで、Ｑ２＞０．５０を満たす予測モデルが得られると考えられる。
例えば、ＶＩＰ値上位１位〜７位、２位〜８位又は３位〜９位の成分の分析データを用いて構築されたＯＰＬＳモデルが挙げられる（図７）。

0031

本発明の態様及び好ましい実施態様を以下に示す。
＜１＞ダイズから採取された葉サンプルから１以上の成分の分析データを取得し、当該データとダイズ収量との相関性を利用してダイズの収量を予測する、ダイズの収量予測方法であって、成分が２−ヒドロキシピリジン、コリン、クエン酸、グリセリン酸、グリシン、Ｌ−ピログルタミン酸、マロン酸、スクロース及びトレイトールから選ばれる１種以上である、方法。
＜２＞成分が、２−ヒドロキシピリジン、グリシン、Ｌ−ピログルタミン酸及びスクロースから選ばれる１種以上である、＜１＞記載の方法。
＜３＞葉サンプルが、初生葉展開期から子実肥大期のダイズから採取される、＜１＞又は＜２＞記載の方法。
＜４＞葉サンプルが、初生葉展開期から開花期までのダイズから採取される、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の方法。
＜５＞分析データが、質量分析データである＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の方法。
＜６＞葉サンプルから取得された成分の分析データを、前記９成分から選択される分析データを用いて構築された収量予測モデルと照合する工程を含む、＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の方法。
＜７＞収量予測モデルが、前記９成分中の分析データうち、ＶＩＰ値が６位以上の成分について任意の４個のデータを用いる、＜６＞に記載の方法。
＜８＞収量予測モデルが、前記９成分の分析データうちＶＩＰ値が７位以上の成分について任意の５個のデータを用いる、＜６＞に記載の方法。
＜９＞収量予測モデルが、前記９成分の分析データうちＶＩＰ値が８位以上の成分について任意の６個のデータを用いる、＜６＞に記載の方法。
＜１０＞収量予測モデルが、前記９成分の分析データうち、任意の７個のデータを用いる、＜６＞に記載の方法。
＜１１＞収量予測モデルが、前記９成分の分析データうち、ＶＩＰ値１位以下の成分のデータすべて、ＶＩＰ値２位以下の成分のデータすべて、又はＶＩＰ値３位以下の成分のデータすべてを用いる、＜６＞に記載の方法。

0032

＜１２＞収量予測モデルが、前記９成分の分析データうち、ＶＩＰ値上位１位〜４位、２位〜５位又は３位〜６位の成分の分析データを用いる、＜６＞に記載の方法。
＜１３＞収量予測モデルが、前記９成分の分析データうち、ＶＩＰ値上位１位〜５位、２位〜６位又は３位〜７位の成分の分析データを用いる、＜６＞に記載の方法。
＜１４＞収量予測モデルが、前記９成分の分析データうち、ＶＩＰ値上位１位〜６位、２位〜７位又は３位〜８位の成分の分析データを用いる、＜６＞に記載の方法。
＜１５＞収量予測モデルが、前記９成分の分析データうち、ＶＩＰ値上位１位〜７位、２位〜８位又は３位〜９位の成分の分析データを用いる、＜６＞に記載の方法。
＜１６＞収量予測モデルが、ＯＰＬＳ法を用いて構築されたモデルである＜６＞〜＜１５＞のいずれかに記載の方法。
＜１７＞収量予測モデルが、回帰分析手法を用いて構築されたモデルである＜６＞〜＜１５＞のいずれかに記載の方法。
＜１８＞質量分析データが小数点以下４桁以上の精度である、＜５＞〜＜１５＞のいずれかに記載の方法。

0033

１．各栽培試験
２０１５年から２０１７年に実施した屋外ポット栽培試験データについて詳述する。試験は全部で５試験実施した。
１）２０１５年ポット試験（１）：
栃木県内にてポット栽培を実施した。土壌は国内の圃場土を用い、窒素：リン酸：カリウム＝３：６：６（Ｋｇ/１０ａ）となるように施肥を行い、土壌を耕耘機で耕耘した。土壌はこの耕耘後の土壌を用いた。ポットには１／２０００ａワグネルポットを用い、上記土壌を１ポットあたり約８Ｌ詰め、１５ポットを準備した。２０１５年６月２５日に３粒播きで各ポット内２カ所に播種した（１ポットあたり６粒使用）。なお、品種は、「里のほほえみ」を用いた。初生葉展開期に１ヵ所につき１本に間引きし、各ポット２株立てとした。収穫は１１月９日に実施した（播種後１３７日）。なお、収量予測用には５ポット１０株を用いた。

0034

２）２０１５年ポット試験（２）：
和歌山県内にてポット栽培を実施した。土壌は国内の圃場土を用い、窒素：リン酸：カリウム＝１：６：６、３：６：６及び１０：６：６（Ｋｇ/１０ａ）となるように施肥を行い、耕耘後の土壌を用いた（窒素量のみ異なる3種の施肥条件を設定した）。ポットには１／２０００ａワグネルポットを用い、上記土壌を１ポットあたり約８Ｌ詰め、各施肥条件でそれぞれ１５ポット計４５ポットを準備した。２０１５年７月１日に３粒播きで各ポット内２カ所に播種した（各ポット６粒使用）。なお、品種は、「フクユタカ」を用いた。初生葉展開期に1ヵ所につき１本に間引きし、各ポット２株立てとした。収穫は、１１月１１日に実施した（播種後１３３日）。なお、収量予測用には各５ポット１０株を用いる計画だったが、１株が欠株したため、計２９株を用いた。

0035

３）２０１６年ポット試験：
栃木県内にてポット栽培を実施した。土壌は国内圃場土壌を用い、試験を実施した。ポットには１／２０００ワグネルポットを用い、上記土壌を１ポットあたり約８Ｌ詰め、７５ポットを準備した。数日間静置後、２０１５年同様に播種をおこなった。播種は、２０１６年７月１日におこない、１１月１５日に収穫をおこなった。なお、品種は「里のほほえみ」を用いた。また、収量予測用には２３ポット、４６株を用いた。

0036

４）２０１７年ポット試験：
栃木県内にてポット栽培を実施した。土壌は、国内圃場土を用い、そこへ肥料として苦土石灰（協和）を１２５ｇ／ｍ２及びリン酸入り油かす（大栄物産）を１００ｇ／ｍ２添加した土壌（１×）及び肥料を添加した土壌と未添加土壌を半量ずつ混和した土壌（０．５×）の２種類を用いた。また品種は、「里のほほえみ」、「フクユタカ」、「エンレイ」及び「湯上がり娘」の４品種を用いた。ポットには１／２０００ａワグネルポットを用い、上記土壌を１ポットあたり約８Ｌ詰め、各土壌で５ポットずつ、４品種で計４０ポットを準備した。数日間静置後、品種ごとに４粒播きで各ポット内２カ所に播種した（各ポット８粒使用）。初生葉展開期に1ヵ所につき１本に間引きし、各ポット２株立てとした。播種は、２０１７年７月４日におこない、収穫は１０月以降、成熟期に達し収穫適期と判断した株から順次収穫をおこなった。

0037

２．葉のサンプリング
葉のサンプリングは、それぞれの栽培試験において播種後２８〜３２日となる日の日中に実施した（おおむね１０時—１５時）。この際のダイズ生育ステージは年度、栽培条件、品種により若干異なるが概ね葉齢５−７程度であった。ここでいう葉齢は、初生葉を１とした際に最上位に展開した本葉が下から数えて何枚目かを数えた際の値とした。葉のサンプリングは、最上位に展開する本葉の１または２葉齢古い本葉を構成する複葉３枚の内、中央の複葉を採取した。しかしながら、中央の複葉が虫害等著しく損傷を受けている場合は、別の複葉を採取した。採取した葉はアルミホイルで包み直ちに液体窒素中で凍結し、代謝反応を停止させた。凍結サンプルは凍結状態を維持したまま実験室へ持ち帰り、凍結乾燥にかけて乾燥させた。この乾燥したサンプルを後述の抽出操作に供試した。なお、２０１５年及び２０１６年のポット栽培試験では１個体ごとに採取し、収量データは対応する個体のものを用いた。一方、２０１７年ポット栽培試験では１ポット毎、すなわち２個体毎にまとめてサンプリングを実施し、収量データは２個体の平均値を用いた。
また、葉をサンプリングした際の播種からの日数は以下のとおりである。
＊２０１５年ポット試験(1)：２０１５年７月２５日（播種後３０日）
＊２０１５年ポット試験(2)：２０１５年７月２９日（播種後２８日）
＊２０１６年ポット試験：２０１６年８月２日（播種後３２日）
＊２０１７年ポット試験：２０１７年８月３日（播種後３０日）

0038

３．最終的な子実収量の測定
栽培試験後の各個体から全子実を回収し、８０℃にて２−３日間乾燥させた。収量データはこの乾燥重量（ｇＤＷ／個体）を用いた。２で既述したように２０１７年の試験における２個体（１ポット毎）の平均データは１つとしてカウントし、２０１５−１７年のポット試験データは計１２５個となった。収量データは表２ａ〜２ｃに示すように最小で０．９ｇＤＷ／個体、最大で４２．５ｇＤＷ／個体であった。

0039

0040

0041

0042

４．採取した葉の成分の抽出
凍結乾燥した葉サンプルは、スパーテルを用いて手作業にて可能な限り粉砕をおこなった。粉砕後、２ｍＬのチューブ（セーフロックチューブ，エッペンドルフ）に１０ｍｇを秤量し、直径５ｍｍのジルコニア製ボール１つをチューブに加えて、ビーズ粉砕機（ＭＭ４００，Ｒｅｔｓｃｈ）にて２５Ｈｚで１分間さらに粉砕をおこなった。ここへ、メタノール（ＨＰＬＣグレード，関東化学）、純水（ｍｉｌｌｉＱ,メルクミリポア）、クロロホルム（特級、関東化学）の混合溶媒（５：２：２, ｖ/ｖ/ｖ）を１ｍＬ加え、３７℃で３０分間抽出をおこなった。抽出後、２０００×ｇ程度の卓上遠心機（チビタン）にて５分間遠心分離をおこない、固形物と分離した。遠心分離後、上清６００μＬを１．５ｍＬチューブに分注し、そこへ純水３００μＬを添加した。ボルテックスを用いて混合した後、再度５分間遠心分離をおこなった。遠心後の上清４００μＬを新たに１．５ｍＬチューブに分注した。データのクオリティチェック及び保持時間の補正に用いたＱＣサンプルは遠心分離後の各サンプルから４００μＬとは別に２００μＬずつ集約し、それより４００μＬを別途１．５ｍＬチューブに分注した。各サンプルに残存するメタノールをスピードバック（ＳＣ−２１０Ａ，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１０分間、濃縮をおこなった。濃縮後、残存した水分を液体窒素にて凍結し、一晩凍結乾燥をおこなった。

0043

５．誘導体化
４で得られた抽出物に、５μＬのミリスチン酸−ｄ２７（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のピリジン溶液（５０μｇ／ｍＬ）を内部標準（後述のライブラリ照合用）として添加した。さらに別の内部標準（サンプル間のピーク強度補正）としてリビトール（東京化成工業）のピリジン溶液（５０μｇ/ｍＬ）を５μＬ加えた。さらに、１００μＬのメトキシアミン塩酸塩のピリジン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ）を添加し、３７℃で９０分間インキュベーションをおこなった（第１の誘導体化「メトキシム化」）。インキュベート後、卓上遠心機で不溶物と分離後、上清５０μＬをバイアルビンに分注した。次にＧＣシステムのオートサンプラー（Ａｇｉｌｅｎｔ ７６９３）に搭載の自動分注器を用いて、第２の誘導体化をおこなった。メトキシム化後のピリジン溶液が入ったバイアルに５０μＬのＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセタミド（ＭＳＴＦＡ： ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を分析前に自動で添加するようにプログラムを組み、加温部分にて３７℃で３０分間インキュベート後（第２の誘導体化「シリル化」）、そのままＧＣ−ＭＳ分析をおこなった。なお、溶媒に用いたピリジンは脱水ピリジン（関東化学）を用いた。

0044

６．ＧＣ−ＭＳ分析
５で得られた１μＬの分析サンプルを、スプリットモードでＧＣ−ＭＳに注入した（１０：１，ｖ/ｖ）。ＧＣ−ＭＳ装置は、Ａｇｉｌｅｎｔ ７８９０ＢＧＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）、シングル四重極分析計Ａｇｉｌｅｎｔ ５９７７Ｂ ＧＣ/ＭＳＤ（Ａｇｉｌｅｎｔ）ならびにＡｇｉｌｅｎｔ ７６９３Ａオートサンプラ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を連結したものを用いた。このシステムに０．２５μｍの膜厚をもち３０ｍの分析カラムに１０ｍのガードカラムが組み込まれた４０ｍ×０．２５ｍｍ Ｉ.Ｄのヒューズドシリカキャピラリーカラム（ＺＯＲＢＡＸ ＤＢ５−ＭＳ＋１０ｍ Ｄｕｒａｇａｒｄ Ｃａｐｉｌｌａｒｙ Ｃｏｌｕｍｎ， １２２−５５３２Ｇ， Ａｇｉｌｅｎｔ）を装着して用いた。注入温度は、２５０℃とし、カラムを通るヘリウムガスの流速は０．７ｍＬ/ｍｉｎに設定した。カラム温度は、１分間６０℃で等温に保ち、次いで１０℃／分で３２５℃まで上昇させ、そして１０分間等温に保った。搬送ライン及びイオンソース温度は、それぞれ３００℃及び２３０℃とした。イオンを（７０．０ｋＶ）電子衝撃（ＥＩ）によって生成した上で、ｍ／ｚ５０−６００の質量範囲にわたって１秒当たり２．７回のスキャンを行ってデータを記録した。加速電圧は、５．９分の溶媒遅延後に作動させた。
なお、ＱＣサンプルはサンプルの分析サンプルの５−６分析毎に１つ入れた。

0045

７．データ行列の作成
ＧＣ−ＭＳで取得したデータは、ｎｅｔＣＤＦファイル形式に変換し、ピーク検出及びアラインメントソフトウェアであるＭｅｔＡｌｉｇｎ（Ｗａｇｅｎｉｎｇｅｎ Ｕｎｉｖ.）でデータ行列を作製した。サンプル間の各ピークの保持時間及びピーク強度の補正には、別途、内部標準として添加したリビトールを指標におこなった。
最終的にデータ行列はｃｓｖ形式で作成した。そこへ各ダイズサンプルの収量値を統合し、データ解析に用いた。

0046

８．ピーク同定
ＧＣ−ＭＳ分析によって得られた分析データは、内部標準物質として添加したミリスチン酸ｄ２７の保持時間を基準としてＡｇｉｌｅｎｔ社製のＦｉｅｈｎメタボロミクスＲＴＬライブラリ（以下、Ｆｉｅｈｎライブラリ）を用いてピーク同定をおこなった。ピーク同定の基準はＦｉｅｈｎライブラリによるスペクトル一致率が７０％以上の候補代謝物から保持時間の誤差が０．０５分以内であることとした。

0047

９．収量と相関する成分候補の探索
２０１６年データを用いて収量と相関する成分候補の探索を行った。表２に示す２０サンプルを用いて、葉中成分由来のピーク及び各サンプルに対応する収量データのマトリックスデータを用いて解析をおこなった。同一と考えられる成分由来ピークを保持時間により整理・重複を除外したのち、各成分由来ピークデータと収量との相関解析をおこなった。

0048

0049

各ピークデータと収量との相関解析では、単相関係数ｒ及び無相関の検定によりｐ値を算出した。また各成分由来ピーク情報（保持時間、質量情報）からＦｉｅｈｎライブラリと照合することで、収量と相関すると同定した成分の候補として９種の成分、すなわち、２−ヒドロキシピリジン、コリン、クエン酸、グリセリン酸、グリシン、Ｌ−ピログルタミン酸、マロン酸、スクロース及びトレイトールを選抜した。選抜した９種の成分を用いて、残りのサンプルも含め、２０１５−２０１７年の全サンプル１２５サンプルの分析を行った。

0050

まず、全分析データを用いて、各成分相対量と収量との相関解析を行った。
既存技術では、ダイズの生育過程における指標を用いて、収量との相関性を解析した研究が報告されている。例えば、非特許文献（「重粘度地帯におけるダイズ「エンレイ」の多収事例に基づく収量構成要素と生育指標」新潟農総研）では、播種後４０日における主茎長が収量と相関し、その相関係数ｒが０．５１であることが示されており、また非特許文献６（「土壌理化学性の改善による麦跡作付地帯での大豆多収栽培体系の確立」福井県農試、福井県大）では播種後５０−６０日における根粒活性が収量と相関し、その相関係数が０．６３であることが示されており、さらに別の既報（「物質生産と窒素の蓄積から見たダイズの多収生育相」福井県農試）では播種後６０−７０日における地上部乾物重が収量と相関し、その相関係数が０．６６であることが示されている。これらの知見は、上述した播種後日数で特定の指標を評価することで一定の収量予測が可能であることを示している。しかしながら、本技術における播種後３０日程度という予測時期はいずれの従来技術よりも早いことから、少なくとも相関係数の絶対値が０．５１より大きい成分由来ピークは従来技術よりも優れた収量予測指標であると言える。
解析の結果、９種の成分の収量との相関は表３に示すようになり、相関係数の絶対値が０．５１を超えるものとして、２−ヒドロキシピリジン、グリシン、Ｌ−ピログルタミン酸及びスクロースの４種が見いだされた。

0051

0052

１０．モデル構築・評価
２つ以上の複数の成分の分析データを用いた収量予測モデルの構築には多変量解析手法を用い、解析ツールとしてＳＩＭＣＡ ｖｅｒ．１４（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ）を用いた。予測モデルは、説明変数に各成分の分析データのピーク面積値を、また目的変数に収量値を用いた回帰分析をおこなった。回帰分析はＰＬＳ法の改良版であるＯＰＬＳ法でおこなった。

0053

予測モデルの評価方法は、主に２つの指標で判断される。１つは予測精度を表すＲ２、もう１つは予測性を表すＱ２である。Ｒ２は予測モデル構築に使用したデータの実測値とモデルで計算した予測値との相関係数の２乗であり、１に近いほど予測精度が高いことを示している。一方、Ｑ２は、上記クロスバリデーションの結果であり、実測値と繰り返し実施したモデル検証の結果である予測値との相関係数の２乗を表している。予測の観点から、少なくともＱ２＞０．５０であれば、そのモデルは良好な予測性を持つとされていることから（Triba, M. N. et al., Mol. BioSyst. 2015, 11, 13-19.）、Ｑ２＞０．５０をモデル評価の基準とした。なお、常にＲ２＞Ｑ２となるため、Ｑ２＞０．５０は同時にＲ２＞０．５０を満たすこととなる。

0054

１０−１．全データを用いたモデルの構築・評価
１データ当り９成分の相対量と収量値を持ち、全１２５個のデータマトリックスから、収量を予測するＯＰＬＳモデルを構築した。構築の際、各成分由来ピーク及び収量データはオートスケーリングにより平均０、分散１に変換した。モデル構築の結果、予測精度を示すＲ２＝０．５６、予測性を示すＱ２＝０．５５であった。結果を図１に示す。モデルの予測性能の基準として設定したＱ２＞０．５０を満たしていた。この予測モデルにより、栽培１カ月程度の葉に含まれる成分組成を用いることで、一定の予測性能を持つモデルが構築でき、早期収量予測が可能であることが示された。

0055

１０−２．ＶＩＰ値の算出
１０−１で構築したモデルではＶＩＰ（Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ,投影における変数重要性）値とよばれる各成分由来ピークに与えられるモデル性能への寄与度が与えられる。ＶＩＰ値はその値が大きいほどモデルへの寄与度が大きく、相関係数の絶対値とも相関する。ＶＩＰ値のリストを表４に示す。

0056

0057

１０−３．ＶＩＰ値を指標としたモデル構築（２個以上の成分ピーク情報を用いたモデル）
１０−１で構築したモデルへの各成分由来ピークの寄与度であるＶＩＰ値のランキング（１０−２）を基に複数の成分でモデルを構築した。特に限定されるわけではないが、モデル性能の基準を便宜上Ｑ２＞０．５０とした。

0058

１０−３−１．ＶＩＰ値が下位の成分由来ピークを用いたモデル
ＶＩＰ値１位以下、２位以下、３位以下、４位以下、５位以下及び６位以下のすべての成分データを用いてそれぞれＯＰＬＳモデルの構築をおこなった。その結果、Ｑ２＞０．５０を満たすのはＶＩＰ値１位以下すべて〜３位以下すべての成分データを用いたモデルであり、ＶＩＰ値４位以下の成分データすべてを用いてもＱ２＞０．５０とはならないことがわかった（図２）。

0059

１０−３−２．ＶＩＰ値上位の成分データを複数個用いたモデル
ＶＩＰ値上位から順に複数個の成分データ、すなわち、ＶＩＰ値１位及び２位、ＶＩＰ値１位〜３位及びＶＩＰ値１位〜４位の成分データを用いてＯＰＬＳモデルの構築をおこなった。その結果、上位３成分ではＱ２＞０．５０を満たさず、上位４位まで使用することでＱ２＞０．５０を満たすことがわかった。このことからモデル構築の場合は、少なくとも、９個の中から４つ以上の成分データを用いる必要があることが示唆された（図３）。
すなわち、９個の成分データから選ばれる任意の４個以上の成分データを用いて構築したモデルのうち、Ｑ２＞０．５０を満たすモデルは予測性があると判断される。具体的には、以下のモデルが挙げられる。

0060

１）ＶＩＰ値上位から順に連続する４個の成分データを用いたモデル
ＶＩＰ値上位１位〜４位、２位〜５位、３位〜６位、４位〜７位、５位〜８位及び６位〜９位の成分データを用いて、それぞれＯＰＬＳモデルの構築をおこなった。その結果、ＶＩＰ値４位〜７位の成分データを用いた際のモデルで初めてＱ２＞０．５０を満たさなかった。それ以降Ｑ２は低下する傾向であった。このことから、ＶＩＰ値６位以上であればその中から任意の４個の成分データを用いることでＱ２の基準を概ね満たすが、ＶＩＰ値４位以下から選ばれる任意の成分データ４個のみでは基準を満たさないことが示唆された（図４）。

0061

２）ＶＩＰ値上位から順に連続する５個の成分データを用いたモデル
ＶＩＰ値上位１位〜５位、２位〜６位、３位〜７位、４位〜８位及び５位〜９位の成分データを用いて、それぞれＯＰＬＳモデルの構築をおこなった。その結果、ＶＩＰ値４位〜８位の成分データを用いた際のモデルで初めてＱ２＞０．５０を満たさなかった。それ以降Ｑ２は低下する傾向であった。このことから、ＶＩＰ値７位以上であればその中から任意の５個の成分データを用いることでＱ２の基準を概ね満たすが、ＶＩＰ値４位以下から選ばれる任意の成分データ５個のみでは基準を満たさないことが示唆された（図５）。

0062

３）ＶＩＰ値上位から順に連続する６個の成分データを用いたモデル
ＶＩＰ値上位１位〜６位、２位〜７位、３位〜８位及び４位〜９位の成分データを用いて、それぞれＯＰＬＳモデルの構築をおこなった。その結果、ＶＩＰ値４位〜９位の成分データを用いた際のモデルで初めてＱ２＞０．５０を満たさなかった。このことから、ＶＩＰ値８位以上であればその中から任意の６個の成分データを用いることでＱ２の基準を概ね満たすが、ＶＩＰ値４位以下から選ばれる任意の成分データ６個のみ、すなわち４位以下すべてでは基準を満たさないことが分かった（図６、図２）。

0063

４）ＶＩＰ値上位から順に連続する７個の成分データを用いたモデル
ＶＩＰ値上位１位〜７位、２位〜８位及び３位〜９位の成分データを用いて、それぞれＯＰＬＳモデルの構築をおこなった。その結果、すべてのモデルでＱ２＞０．５０を満たした。このことから、９個の成分データのうち任意の７個以上の成分データを用いることでＱ２の基準を概ね満たすことが分かった（図７）。