図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2020年10月22日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (7)

課題

アルファ−1抗トリプシン融合分子のための組成物、方法および使用を提供すること。

解決手段

本明細書における実施形態は、アルファ−1抗トリプシン融合ポリペプチドまたはそのペプチド誘導体の組成物を報告する。ある実施形態において、組成物および方法は、アルファ−1抗トリプシン療法または治療を必要とする被験体を治療するために、薬学的に許容され得る組成物における使用のための構築物を生成することに関する。他の実施形態において、本明細書において開示される組成物および方法は、アルファ−1抗トリプシンまたはその誘導体免疫フラグメントに対して連結することに関する。

概要

背景

AAT
アルファ−1抗トリプシン(AAT)の正常な血漿濃度は、1.3〜3.5mg/mlの範囲にわたる。ある条件下で、AATは、組織空間の中に容易に拡散し、標的プロテアーゼ、主に好中球エラスターゼと1:1複合体を形成する。トリプシンキモトリプシンカテプシンG、プラスミントロンビン組織カリクレイン、および第Xa因子などのような他の酵素もまた、基質として果たすことができる。酵素/阻害剤複合体は、次いで、セルピン酵素複合体(SEC)受容体に結合することによって血液循環から除去され、肝臓および脾臓によって異化される。

概要

アルファ−1抗トリプシン融合分子のための組成物、方法および使用を提供すること。本明細書における実施形態は、アルファ−1抗トリプシン融合ポリペプチドまたはそのペプチド誘導体の組成物を報告する。ある実施形態において、組成物および方法は、アルファ−1抗トリプシン療法または治療を必要とする被験体を治療するために、薬学的に許容され得る組成物における使用のための構築物を生成することに関する。他の実施形態において、本明細書において開示される組成物および方法は、アルファ−1抗トリプシンまたはその誘導体免疫フラグメントに対して連結することに関する。なし

目的

項目26)
上記状態が、上記被験体におけるAAT欠乏症であり、上記治療が、上記被験体に対してAAT代償療法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

本願明細書に記載の発明。

技術分野

0001

優先権
このPCT出願は、2011年6月24日に出願された米国仮出願第61/500,795号に対する優先権を主張する。この出願は、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される。

0002

本明細書における実施形態は、組換えアルファ−1抗トリプシン(α−1抗トリプシン、AAT)の組成物に関する。ある実施形態において、本明細書において開示される組換えAATは、AATの他の形態よりも直ちに精製することができる。他の実施形態において、組換えAATは、天然に存在するAATまたはAATの他の市販の製剤と比較して、抗炎症および抗免疫活性が増強している。さらに他の実施形態において、2倍、10倍、または100倍少ない組換えAAT(rAAT)は、被験体における状態または疾患の予防または治療のために、血漿由来のAATの任意のおよびすべての現在の形態の代わりに、使用され得る。いくつかの実施形態において、rAATは、様々な組織もしくは器官の炎症、感染症、または他の健康状態などのような状態を有する被験体を治療するために使用することができる。

背景技術

0003

AAT
アルファ−1抗トリプシン(AAT)の正常な血漿濃度は、1.3〜3.5mg/mlの範囲にわたる。ある条件下で、AATは、組織空間の中に容易に拡散し、標的プロテアーゼ、主に好中球エラスターゼと1:1複合体を形成する。トリプシンキモトリプシンカテプシンG、プラスミントロンビン組織カリクレイン、および第Xa因子などのような他の酵素もまた、基質として果たすことができる。酵素/阻害剤複合体は、次いで、セルピン酵素複合体(SEC)受容体に結合することによって血液循環から除去され、肝臓および脾臓によって異化される。

課題を解決するための手段

0004

本明細書における実施形態は、市販で入手可能なAAT組成物に対して優れた特性を有するアルファ−1抗トリプシンの組換え構築物を生成するおよび使用することを報告する。他の実施形態は、治療上の使用のための組換えAAT産生を精製するおよびスケールアップするための方法を報告する。これらの実施形態に従って、組換えAATは、たとえば抗炎症剤、免疫モデュレータ、および/またはセリンプロテアーゼ阻害剤として、任意のAATに関連した活性のための使用のために単離することができる。

0005

ある実施形態において、本明細書において開示される組換えAATは、当技術分野において知られている任意の組換え技術によって生成される完全長分子またはそのカルボキシ末端ペプチド誘導体を含む。いくつかの実施形態は、たとえば、AATの急速な精製および活性保存に使用するためのまたはAATもしくはそのペプチドの活性を増大させるための、AATと結合した免疫学的エレメントを有するAATまたはそのカルボキシ末端誘導体を含む構築物に関する。他の実施形態は、それぞれが免疫学的エレメント(たとえばFcフラグメント)と結合し、1つのユニットとして同時に精製されるAAT分子を有する、1つを超える構築物の同時の合成に関する。他の実施形態は、本明細書において開示される組成物、方法、および使用のための構築物を形成するために、たとえば、1つまたはそれより多い免疫分子と結合した分子の最後の80AA(カルボキシ末端上の)のフラグメントまたはそのサブフラグメント(たとえば約40、約30、約20、もしくは約10AA、または約5AA)を含む、AATの1つまたはそれより多いカルボキシ末端誘導体またはフラグメントの構築物を生成することに関することができる。

0006

本明細書において企図される構築物のAAT分子は、天然に存在するアルファ−1抗トリプシン(たとえばヒト)またはAATの最も豊富な形態またはその他の天然に存在する形態またはそのフラグメントもしくは誘導体または有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有していないAATの変異体形態またはその対立遺伝子(たとえば、およそ100の天然に存在するAAT改変体があり、これらの改変体のいずれも、本明細書において開示される構築物において使用することができる)またはそのアナログまたはその融合タンパク質(たとえばヒトIgGもしくはヒトIgGのフラグメント)に関するものとすることができる。これらの実施形態に従って、最終構築物または融合ポリペプチドは、それぞれが共通の免疫学的フラグメント(たとえばFcフラグメント)と結合した2つのAAT分子または融合ポリペプチドを含んでいてもよく、AAT免疫フラグメント構築物が、二量体AAT免疫フラグメント融合分子を形成するように、ジスルフィド結合によって相互に連結される(たとえば図2Aおよび図6A〜6Bを参照されたい)。

0007

本明細書において開示されるある方法において、免疫分子と結合したAATまたはAATペプチドの精製は、市販で入手可能な製剤または天然のAATと比較して、AAT組成物の活性を有意に増大させる。そのうえ、精製までの時間は、構築物または融合分子の決定的な活性を保護しながら、複数の精製ステップを排除することによって、劇的に低下する。他の実施形態において、本明細書において企図される融合分子の回収の改善は、AAT分子および免疫フラグメントの間のリンカー分子を使用して、より直ちに実現することができる。本明細書において開示されるある融合分子は、コントロール(たとえば、天然に存在するAATの典型的な精製および市販で入手可能な配合薬(formula)の精製)と比較して、サイトカイン阻害することができ、分子の免疫および炎症機能を調整する。これらの実施形態に従って、2つ以上のAAT免疫構築物(またはAATフラグメント)を含むユニットは、精製し、本明細書において開示される組成物および方法において使用することができる。Fc−huAATは、本明細書において企図される任意の方法または組成物において使用することができる。他の実施形態は、AAT分子の活性を保護するために、急速な精製方法によって精製されるAAT分子に連結されるIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、またはIGDFcフラグメントを使用することを含む。たとえば、本明細書において開示されるある実施形態は、当技術分野において知られている他の方法の有害な影響を回避するために、最少のステップ(たとえばワンステップ)精製としてプロテインAを使用することに関する。本明細書におけるいくつかの実施形態は、市販で入手可能な産物(たとえばAralast(商標)、Prolastin(商標))に使用される標準的な精製と比較しておよび/または血漿中に見つけられる天然に存在するAATと比較して、85%、90%、95%、またはそれ以上の抗炎症性活性を保護することに関する。一実施形態において、本出願の組換え分子は、市販で入手可能な製剤と比較して、2〜10、10〜100、およびある実施形態において、2〜100倍大きい活性を実証した。インビボにおけるまたは天然のAATに類似し、ある実施形態においてそれより優れた活性を有する構築物を作り出し、回収するための方法が、本明細書において開示される。AATに関して関心があるとして知られている、ある活性は、免疫調節性または炎症調整活性を含むが、これらに限定されない。たとえば、本明細書において記載される融合分子は、IL−1受容体アンタゴニスト(IL−1Ra)、CTLA−4、IL−18結合タンパク質、および/またはIL−10、ならびにその他同種のものなどのような、天然に存在する抗炎症分子の誘発により、抗炎症分子として作用することができる。記載される構築物は、単離し、セリンプロテアーゼ阻害剤活性以外のものとなり得る活性について、評価することができることが、本明細書において企図される。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される構築物は、市販で入手可能な組成物と比較して、より高いIL−1受容体アンタゴニスト活性を有する。

0008

ある実施形態において、組成物(たとえば構築物または融合ポリペプチド組成物)および方法は、被験体に対する放射線副作用を調整することに関する。いくつかの実施形態において、組成物および方法は、たとえば、癌を有するまたは悪性疾患発症もしくはコントロール不良の細胞の増殖が疑われる被験体に投与される場合に、放射線療法または放射線を有する被験体を治療することに関する。本明細書において開示される他の実施形態は、たとえば偶然にまたは目的のある行為によって、放射線に対して曝露されたことがある被験体を治療することに関する。

0009

他の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、被験体が放射線および/または化学療法を受けるごとに、被験体に投与することができる。本明細書において開示されるいくつかの実施形態は、癌療法を受けている被験体の治療に関する。癌治療は、膀胱乳房腎臓白血病骨髄腫脂肪肉腫リンパ腫前立腺結腸子宮癌黒色腫膵臓、眼、および他の知られている癌のための治療を含むが、これらに限定されない。

0010

本明細書において開示されるいくつかの実施形態は、前立腺癌を有する被験体を治療することに関する。これらの実施形態に従って、前立腺癌を有する男性の被験体は、前立腺癌療法の共通の副作用であるインポテンスまたは勃起障害の発症を低下させるために、放射線および/または化学療法の前に、その間に、またはその後に、本明細書において開示される組成物により治療することができる。

0011

他の実施形態は、癌関連性の療法を受けている被験体の治療のための併用療法に関する、たとえば、本明細書において開示される組成物は、腫瘍縮小させる、もしくは排除する、または被験体の腫瘍の転移を低下させる、または被験体の癌の他の側面を治療することが知られている任意の他の作用物質と組み合わせることができる。

0012

ある実施形態において、正常な細胞の傷害を調整するために、本明細書において包含される組成物により被験体を治療することが、組成物により治療されない被験体と比較して、少なくとも10%、または少なくとも20%、または少なくとも30%、または少なくとも40%、または少なくとも50%、または少なくとも60%、または少なくとも70%、または少なくとも80%、または少なくとも90%とすることができる。

0013

いくつかの実施形態は、AAT療法を必要とする被験体に対して、組換え技術を使用することによって生成されるAATを投与することに関する。これらの実施形態に従い、被験体は、AAT欠乏症、炎症もしくは免疫状態、または当技術分野において知られている他のAATに関連した状態を有し得る。本明細書における、ある実施形態は、そのような治療を必要とする被験体に対して、少なくとも1つの構築物および薬学的に許容され得るキャリアを有する組成物を投与することを含む。ある実施形態において、被験体に対して投与される用量は、市販で入手可能な製剤と比較して、被験体に対する用量における2倍、10倍、または100倍の低下を含むことができる。ある実施形態において、用量は、10mg/kg〜100mg/kg(共通して使用される、Aralast(商標)またはProlastin C(商標)などのような市販で入手可能なAATの濃度)と比較して、被験体に対して約0.01mg/kg、0.1mg/kg〜約10mg/kgとすることができる。

0014

本発明のいくつかの実施形態は、心組織リモデリング(たとえば心組織の拡大および壊死)、たとえば左または右心室(LV)リモデリングの発病または進行を調整することを報告する。これらの実施形態に従って、たとえば、本明細書において開示される組成物の投与による介入が、心筋損傷をもたらし得る心イベントの前に、その間に、またはその後に、発病、重症度(たとえば損傷の)、または進行を調整することができる。さらに他の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、初期または末期梗塞サイズを低下させるべき心臓状態を有する被験体に投与することができる。これらの実施形態に従って、初期の梗塞は、手術または他の心イベントの前に(たとえばベースライン)、その間に、またはその後48時間以内に測定されるものとすることができる。他の実施形態において、末期の梗塞は、手術または他の心イベントの48時間後にまたはその後数日もしくは数週間までに、たとえば、心イベントの7日後に測定されるものとすることができる。さらに他の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、これらの組成物により治療されない被験体と比較して、約5%、または約10%、または約15%、または約20%、または約25%、または約30%、またはそれ以上、心イベントの結果としての心拡大および機能不全を調整するために、心イベント(たとえば心筋梗塞)を有する被験体を治療するために使用することができる。

0015

ある実施形態は、心イベントを有する被験体を治療するための組成物に関する。これらの実施形態に従って、組成物は、組換えアルファ−1抗トリプシン(たとえばヒト)またはその融合タンパク質もしくはペプチドまたは組換え体または有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有していないその変異体またはその対立遺伝子(たとえば、およそ100の天然に存在するAAT改変体がある)またはそのアナログまたはその融合タンパク質(たとえばヒトIgGもしくはヒトIgGのフラグメント(Fc))を含むことができる。いくつかの実施形態は、LVリモデリングを調整するために、心イベントを有するまたは有したことがある被験体に対して、天然に存在するAATを投与することに関する。他の実施形態は、たとえば、394AAの天然に存在するAAT(配列番号1および33)の最後の80AAのフラグメントを含む、AATの1つまたはそれより多いカルボキシ末端誘導体またはフラグメントの組成物を投与することに関する。ある実施形態は、心臓の状態を寛解させるために、本明細書において開示される、組換えで産生された融合AATペプチドにより、心臓の状態を有する被験体を治療することに関する。

0016

他の実施形態は、感染症(たとえば細菌もしくはウイルス感染症)を有する被験体を治療することまたは本明細書において開示される組成物を使用して、被験体が感染症にかかるのを予防することを含む。

0017

いくつかの実施形態は、移植片拒絶を低下させるまたは予防するための、本明細書において開示される組成物に関する。他の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、移植片対宿主病(GVHD)の発生率を低下させるまたはそれを予防するために使用することができる。他の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、細胞の移植拒絶反応またはその副作用を低下させるために使用することができる。細胞の移植は、島細胞幹細胞角膜上皮細胞肝細胞、皮膚、または他の同様の移植を含むことができる。いくつかの実施形態は、移植を受けている被験体において、炎症活性および/または不利な免疫応答を低下させることに関する。

0018

他の本明細書における実施形態は、被験体において、その状態を治療するおよび/または不利益な免疫応答を阻害するために、自己免疫障害を有する被験体を治療することに関する。

0019

ある実施形態において、投与のための組成物は、1mlまたは1mgの製剤当たり約0.1ng〜約10mgの範囲とすることができる。AATペプチドまたはAATもしくはペプチドと同様の活性を有する構築物の治療有効量は、モル濃度で測定されてもよく、約1nM〜約10mMの範囲にわたってもよい。製剤はまた、薬学的にまたは美容的に許容され得るキャリアと組み合わせて企図される。詳細な用量は、不必要な実験作業を伴うことなく、よく知られているルーチン的臨床試験によって確立することができる。一実施形態において、被験体は、1回の用量(たとえば、コントロールと比較して、構築物組成物の効力に依存して、IV注入により0.6mg/kg〜0.8mg/kg)の活性作用物質(たとえばAAT構築物またはそのAATペプチド誘導体)により、状態について治療されてもよい。この実施形態に従って、被験体は、医療従事者によって決定されるように、継続する治療により治療することができる(たとえば、1回の用量後、5〜10日間またはそれ以上)。他の実施形態は、プラセボを有するコントロール集団を使用すること(たとえばヒト血清アルブミン投与または他の同等のプラセボ)および本明細書において開示される組成物を受けている集団プラセボ効果を比較することを含むことができる。

0020

本明細書において開示される組成物を投与するための任意の方法が、企図される。ある実施形態において、組成物は、静脈内に、鼻腔内に、皮下に、経口的に、吸入によって、皮膚に対して、たとえば局所的に適用して、坐剤によって、腟内に(vaginally)、または当技術分野において知られている任意の方法によって、その必要のある被験体に対して投与することができる。

0021

ある実施形態において、被験体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。さらに他の実施形態において、被験体は、妊娠している女性または幼い子供である。他の実施形態において、被験体は、ペット家畜化された(domesticated)動物、または家畜である。

0022

他の実施形態において、被験体または哺乳動物は、捕獲されたまたは自由な野生動物などのような家畜化されていない(non−domesticated)哺乳動物とすることができる。

0023

ある実施形態において、ヒトAAT変異体を含む組成物は、有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有していなくてもよく、記載される方法において使用するために、本明細書において開示される構築物において使用することができる(たとえばAAT融合ペプチド誘導体または反応中心ループ(Reactive Center Loop)(RCL)関連性の変異体融合ポリペプチド)。これらの実施形態に従って、本明細書において開示される組換え分子または融合タンパク質構築物は、有意なセリンプロテアーゼ阻害活性を有していない。免疫分子(たとえばFc)と結合しているこれらの構築物を生成することができる。たとえば、免疫分子との融合は、融合ポリペプチドの急速な精製のための好都合な方法を提供し、それによって、精製ステップを減らすことによって、AATまたはそのカルボキシ末端の活性を保護することができる。ある実施形態において、精製ステップは、アフィニティープロセス(たとえばプロテインA)を使用する単一のステップである。これらのプロセスは、他の市販で入手可能な製剤(たとえばAralast(商標)、Prolastin C(商標))において使用される有害な精製ステップを減らすことによって、本明細書において開示される構築物のコンホメーションを保護する。他の実施形態は、有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有しないように改作された、AAT由来のフラグメント構築物に関する。本明細書における他の構築物は、免疫分子(たとえばIgG分子)に連結された、AATに対応するカルボキシ末端のペプチドもしくはアミノ末端のペプチドを含む構築物、そのアナログ、セルピン−酵素複合体(SEC)受容体に結合するAATカルボキシ末端の任意の誘導体、またはその組み合わせを含むことができるが、これらに限定されない。

0024

本明細書において企図される医薬組成物は、被験体の必要に依存して、抗炎症剤、免疫抑制剤免疫調節剤抗ウイルス剤、抗病原性作用物質、抗菌剤プロテアーゼ阻害剤、およびその組み合わせからなる群から選択される作用物質をさらに含んでいてもよい。これらの作用物質のいくつかは、単独でまたは一緒に使用される、1つまたはそれより多いインターフェロンベタセロン(betaseron)を含むインターフェロン誘導体、ベータ−インターフェロン、イロプロストを含むプロスタン誘導体、シカロストコルチゾールプレドニゾロンメチル−プレドニゾロン、デキサメタゾンを含むグルココルチコイドシクロスポリンA、FK−506、メトキサレン(methoxsalene)、サリドマイドスルファサラジンアザチオプリンメトトレキサートを含む免疫抑制薬(immunsuppressive);ジロートン(zileutone)、MK−886、WY−50295、SC−45662、SC−41661A、BI−L−357を含むリポキシゲナーゼ阻害剤ロイコトリエンアンタゴニストACTHおよびそのアナログを含むペプチド誘導体;可溶性TNF受容体;TNF抗体インターロイキン、他のサイトカイン、T細胞タンパク質可溶性受容体;インターロイキン、T細胞タンパク質の受容体に対する抗体;ならびにカルシポトリオール;Celcept(登録商標)、ミコフェノール酸モフェチル、およびその類似体を含むが、これらに限定されない。

0025

そのため、当業者らは、本開示が基礎を置く概念を、本発明の実施形態のいくつかの特徴および利点を実行するための他の方法を設計するための基礎として直ちに使用することができることを十分に理解するであろう。

0026

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本明細書において開示される、ある実施形態をさらに実証するために含まれる。実施形態は、本明細書において示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、1つまたはそれより多いこれらの図面に対する参照によって、より理解されてもよい。
例えば、本発明は、以下の項目を提供する:
(項目1)
タンパク質のアミノ末端から始まって、(i)アルファ−1抗トリプシンまたはそのカルボキシ末端フラグメントに存在する連続アミノ酸、(ii)ペプチドリンカーに存在する連続アミノ酸、および(iii)免疫フラグメントに存在する連続アミノ酸に対応する連続アミノ酸を含む融合ポリペプチドであって、上記連続アミノ酸(i)が、精製された場合、(iii)に対して結合したままである、融合ポリペプチド。
(項目2)
上記免疫フラグメントが、Fcフラグメントを含む、項目1に記載の融合タンパク質。
(項目3)
上記Fcフラグメントが、IgG2を含む、項目2に記載の融合タンパク質。
(項目4)
アルファ−1抗トリプシン(AAT)またはそのフラグメントもしくはペプチド切断分子をコードする核酸
リンカー、および
免疫フラグメントをコードする核酸を含む核酸構築物であって、上記免疫フラグメントが免疫グロブリン分子である、核酸構築物。
(項目5)
AATをコードする上記核酸が、天然に存在するAAT(配列番号1)をコードする核酸を含む、項目4に記載の構築物。
(項目6)
上記AATペプチド切断分子をコードする上記核酸が、天然に存在するAATの1つまたはそれより多いカルボキシ末端フラグメントをコードする核酸を含む、項目4に記載の構築物。
(項目7)
カルボキシ末端フラグメントが、配列番号1の最後の80アミノ酸またはその10またはそれより多い連続アミノ酸を含む、項目4に記載の構築物。
(項目8)
上記カルボキシ末端フラグメントが、配列番号34のアミノ酸配列を含む、項目6に記載の構築物。
(項目9)
項目2に記載のポリペプチドをコードする、項目4に記載の構築物。
(項目10)
上記免疫フラグメントが、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、またはIgDフラグメントを含む、項目4に記載の構築物。
(項目11)
上記構築物が、上記免疫フラグメントに、AATまたはそのカルボキシ末端フラグメントを、そのN−末端を通して連結することによって、形成される、項目4に記載の構築物。
(項目12)
配列番号48のポリペプチドをコードする、項目4に記載の構築物。
(項目13)
項目4に記載の核酸構築物または項目1に記載の融合ポリペプチドを含む、組換え細胞クローン
(項目14)
タンパク質またはペプチドの混合物から、項目2に記載の融合ポリペプチドを精製するためのプロセスであって、
a.マトリックスと結合したプロテインAに対して、タンパク質またはペプチドの上記混合物を曝露するステップおよび
b.構築物または融合分子の免疫フラグメントを、上記マトリックスと結合したプロテインAと結合させるステップ、
c.上記混合物のうちの結合していないタンパク質またはペプチドを除去するステップ、ならびに
d.競合結合分子を使用して、プロテインAから上記タンパク質または上記ペプチドを溶出するステップを含む、プロセス。
(項目15)
上記免疫フラグメントが、上記構築物または上記融合分子から切断される、項目14に記載のプロセス。
(項目16)
上記競合的結合分子が、Fc受容体である、項目14に記載のプロセス。
(項目17)
回収された上記構築物または上記融合分子が、血漿由来のAAT調製物と比較して、少なくとも10%増大した抗炎症活性を有する、項目14に記載のプロセス。
(項目18)
項目1に記載の融合ポリペプチドまたはタンパク質および薬学的に許容され得る賦形剤を含む医薬組成物。
(項目19)
上記融合ポリペプチドが、治療有効量で上記組成物中に存在する、項目18に記載の組成物。
(項目20)
項目4に記載の核酸構築物を含むベクター
(項目21)
項目20に記載のベクターを含む形質転換細胞
(項目22)
項目1に記載の融合タンパク質を含む、発現された封入体の単離調製物。
(項目23)
被験体において、状態を治療するための方法であって、治療有効量の項目1に記載の融合ポリペプチドおよび薬学的に許容され得るキャリアまたはその塩の組成物を上記被験体に対して投与するステップを含み、上記投与が、上記被験体において、上記状態を治療する、方法。
(項目24)
上記状態が、I型糖尿病またはII型糖尿病である、項目23に記載の方法。
(項目25)
上記被験体が、器官または非器官移植を受けており、上記治療が、上記被験体において移植拒絶反応を調整する、項目23に記載の方法。
(項目26)
上記状態が、上記被験体におけるAAT欠乏症であり、上記治療が、上記被験体に対してAAT代償療法を提供する、項目23に記載の方法。
(項目27)
上記状態が、痛風であり、上記組成物の上記投与が、上記被験体において、痛風を調整する、項目23に記載の方法。
(項目28)
上記状態が、心臓の状態であり、上記投与が、上記被験体において、上記心臓の状態を調整する、項目23に記載の方法。
(項目29)
上記被験体に対する上記組成物の投与が、上記組成物を有していないコントロール被験体と比較して、心臓のリモデリングを低下させる、項目28に記載の方法。
(項目30)
上記状態が、感染症であり、上記投与が、上記被験体において上記感染症を調整する、項目23に記載の方法。
(項目31)
上記感染症が、ウイルス感染症または細菌性感染症である、項目30に記載の方法。
(項目32)
上記状態が、再建手術または形成外科手術の副作用であり、上記組成物が、上記被験体において炎症を低下させる、項目23に記載の方法。
(項目33)
上記状態が、上記状態に関連する過剰な炎症であり、上記組成物が、上記被験体において炎症を低下させる、項目23に記載の方法。
(項目34)
投与が、静脈内投与気管内投与、皮内投与、鼻腔内投与、吸入による投与、皮下投与局所投与投与、または他の様式の投与のうちの1つまたはそれより多くを含む、項目23に記載の方法。
(項目35)
上記状態が、自己免疫性の状態であり、上記組成物が、上記被験体において上記自己免疫性の状態を治療する、項目23に記載の方法。
(項目36)
上記組成物の投与が、月に1回、週に1回、週に2回、または1日1回である、項目23に記載の方法。
(項目37)
被験体における移植のための器官、組織、または細胞を保存するための方法であって、上記方法は、項目1に記載の融合ポリペプチドおよび薬学的に許容され得るキャリアまたはその塩の組成物に対して上記器官、上記組織、または上記細胞を曝露するステップを含み、上記投与が、融合ポリペプチドでないアルファ−1抗トリプシンの投与と比較して、低減され、上記組成物が、移植または保存のために、上記器官、上記組織、または上記細胞を保存するのに有効である、方法。
(項目38)
セリンプロテアーゼ阻害活性が、有意に低下している、反応中心ループ(RCL)に変異を有する変異体AATをコードする核酸、および
免疫グロブリン分子である免疫フラグメントをコードする核酸、
を含む、核酸構築物。
(項目39)
放射線に対して曝露されたことがある被験体を治療するための方法であって、項目1に記載の融合ポリペプチドおよび薬学的に許容され得るキャリアまたはその塩の組成物を上記被験体に対して投与するステップを含み、上記投与が、上記被験体において、放射線の副作用を低下させ、投与される上記組成物が、融合ポリペプチドでないアルファ−1抗トリプシンの投与と比較して、低減される、方法。
(項目40)
上記被験体が、癌療法により放射線に対して曝露される、項目39に記載の方法。
(項目41)
上記被験体が、前立腺癌を有し、上記治療が、放射線療法を受けている上記被験体において、インポテンスまたは勃起障害の発症を低減させる、項目39に記載の方法。

図面の簡単な説明

0027

図1は、本明細書において開示されるいくつかの実施形態に使用するために企図されるAAT構築物の概略図を示す図である。
図2Aは、本明細書において開示される、いくつかの実施形態に使用するために企図される、免疫分子が結合したヒトAAT構築物の概略図を示す図である。
図3は、Fc−AATの存在下または非存在下における細胞のモデルにおけるIL−8産生のヒストグラムプロットを示す図である。
図4は、本明細書において記載される、ある実施形態の融合分子(たとえばFc−AAT)の存在下における、抗炎症分子(IL−1受容体アンタゴニスト(IL−1Ra))の発現の産生についてのヒストグラムプロットを示す図である。
図5は、本明細書において企図される、提案される融合分子を示す図である。
図6A〜6Bは、本明細書において企図される例示的な構築物を示す図である。
図7は、増大性の量の、本明細書において企図される融合分子の存在下における、IL−1受容体アンタゴニスト(IL−1Ra)の産生を示す図である。

0028

例証となる実施形態の説明
定義
本明細書において使用するとき、「1つの(a)」または「1つの(an)」は、1つのまたは1つを超える要素を意味することができる。

0029

本明細書において使用するとき、「約」は、プラスまたはマイナス10%を意味することができ、たとえば、約10分は、9〜11分を意味することができる。

0030

詳細な説明
以下のセクションにおいて、様々な例示的な組成物および方法は、本発明の様々な実施形態を詳述するために記載される。様々な実施形態の実行は、本明細書において述べられる特定の細部のすべてまたはいくつかさえ利用することを必要とせず、むしろ、濃度、時間、および他の特定の細部は、ルーチン的な実験作業を通して変更されてもよいことは、当業者にとって明白であろう。ある場合には、よく知られている方法または構成成分は、説明に含まれていない。

0031

AAT(アルファ−1抗トリプシン)抗炎症活性は、セリンプロテアーゼ、特に好中球エラスターゼを阻害するその能力に起因すると従来より考えられてきた。これは、AAT欠乏症を有するヒトのための代償療法におけるその使用のための基礎となっている。ヒトへの使用のための、現在市販で入手可能なAATは、他のAATに関連した活性についてではなく、その抗エラスターゼユニットによって規格化される。これらの市販で入手可能な製剤は、プールされたヒト血漿から精製されるが、これらは、それらが他のヒト血清タンパク質を含有するので、純粋ではない(いくつかは他のものよりも純粋であるが)。ヒトAATインビトロおよびインビボモデルに関する大多数の研究は、それぞれがヒトにおける使用について承認されている、セリンプロテアーゼ阻害活性に関する、これらの市販で入手可能な調製物の使用に依存する。AATの注入は、様々なAAT欠乏状態を有するヒトにおいて、安全であると考えられるが、混入しているタンパク質の役割は、未知のままである。本明細書におけるある実施形態は、混入している同時精製血漿タンパクについての問題を克服するための、高純度で高活性のAATの組換え形態の迅速な産生を報告する。

0032

過剰な炎症または炎症活性化は、いくつかの慢性疾患、たとえば慢性破壊性または消耗性疾患の開始、進行、および破壊性の性質をもたらし得る。これらは、関節リウマチなどのような自己免疫性疾患、免疫攻撃によってインスリン産生ベータ細胞破壊され得る1型などのような糖尿病を含むが、これらに限定されない。本明細書において開示される組成物および方法によって治療されてもよい他の状態は、2型糖尿病を含む。自己免疫性疾患に加えて、冠動脈慢性炎症は、心臓発作または心発作の危険性を増大させ得る。慢性炎症はまた、腸における炎症(たとえばクローン病炎症性腸疾患(IBD)、または潰瘍性大腸炎)の一因ともなる。被験体において炎症をコントロールする、いくつかの天然に存在するタンパク質は、被験体において毎日産生される。AATは、これらのタンパク質のうちの1つである。AATによる療法の1つの欠点は、市販で入手可能なAATが、ヒト血液ドナーの血漿から単離され、そのため、供給が、入手可能な血漿に限られるということである。治療用AATの使用は、その適用が、慢性肺閉塞性疾患(COPD)およびAAT代償療法などのような現在の使用に限られないので、増えている。

0033

AATによる療法の1つの欠点は、市販で入手可能なAATが、ヒト血液ドナーの血漿から単離され、そのため、供給が、入手可能な血漿に限られるということである。治療用AATの使用は、その適用が、慢性肺閉塞性疾患、気腫嚢胞性線維症細気管支炎(bronchiocytis)、肺線維症、およびAAT代償療法などのような現在の使用に限られないので、増えている。

0034

ある実施形態において、Fc分子は、たとえば、その免疫分子を通してジスルフィド結合によって連結された、Fc−AATの二量体を作製するために、AAT分子と結合されてもよい。他の実施形態において、Fc−AATの単量体分子は、本明細書において開示される方法において生成し、使用することができる。本明細書において記載される分子のいずれも、活性を保護するための急速な分離のために、たとえばプロテインAカラム、他のアフィニティー精製方法もしくはマトリックス、または他の迅速な精製もしくは濃縮方法を使用して、速やかに精製することができる。

0035

本明細書における実施形態は、現在の市販で入手可能なAAT組成物に対して優れた特性を有する、アルファ−1抗トリプシン(AAT)またはそのカルボキシ末端フラグメントの構築物を生成することを報告する。他の実施形態は、融合タンパク質またはペプチドを速やかに精製するための方法および本明細書において開示される精製AAT融合分子についての続く使用を報告する。血漿に由来する、市販で入手可能なAATは、供給不足であり、AATの重要な特性を破壊する方法によって現在、精製されており、合成的に産生されたAATが、AATの天然の形態またはAAT由来のペプチドよりも好適ではないにしても、同様に働くことができる、この分子の合成バージョンまたは最新の精製方法についての必要性が存在することが企図される。

0036

セリンプロテアーゼ阻害以外のAAT活性に関して、AATは、いくつかのメカニズムによって抗炎症性特性を発揮する。抗プロテアーゼ部位の変異(たとえば、抗プロテアーゼ活性をわずかなレベルまで低下させるための)を使用する予備データは、AATの活性のうちのいくつかが、AATの抗プロテアーゼ特性を必要としないという概念を支持する。ある実施形態において、天然に存在するヒトAAT(たとえば394AA、分子量約51,000または他のAAT製剤)の異なる組換え切断型形態および変異体形態が、分子の抗炎症特性を評価するために生成される。このアプローチは、様々な組成のAAT分子を産生することを可能にし、これは、血漿由来のAATの標準的な方法を使用すると、非常に困難となる。AATの抗炎症性特性は、市販で入手可能な組成物について現在、使用されている精製手順によって酸化され得ることが実証されており、したがって、AATの融合分子を調製するおよび精製するための本発明の方法は、現在の方法より優れている。本明細書において開示される方法は、本明細書において記載される融合分子および構築物において、AATに関連した活性を保護するための優れた急速な精製方法を提供する。

0037

ある以前に開示された方法において、AATは、マウスモデルおよびヒト膵島細胞のIL−1βの毒性の活性をブロックすることが実証された。本明細書におけるいくつかの実施形態は、融合分子またはAAT融合分子の組換え産生がこの活性を模倣することができるかどうかを試験し、検証することに関する。ある実施形態において、ヒトAATのカルボキシル末端領域の組換えで産生された融合ペプチドが、IL−1βの毒性の活性または産生をブロックするためにおよびカスパーゼ−1活性を低下させるために、生成される。これらの融合ペプチドは、炎症促進性の分子の産生または活性をブロックするまたは低下させるのに有用であり、そのため、コントロール不良の炎症応答に関する多くの健康状態の治療および予防に有用である。

0038

AATは、セルピンスーパーファミリーに属するプロテアーゼ阻害剤として最初に分類された。AATは、一般に、血清トリプシン阻害剤として知られている。AATが種々様々のプロテアーゼを阻害するので、AATはまた、アルファ−1プロテイナーゼ阻害剤(A1PI)と呼ぶこともできる。AATは、好中球エラスターゼなどのような、炎症細胞の酵素から組織を防御し、典型的に、約1.5〜3.5グラムリットルの、血液における範囲を有する。α1−抗トリプシンの100を超える異なる改変体が、様々な集団において記載されている。AATの最も一般的な種類は、IEゲルにおけるその移動に基づいて、Mと称される。他の改変体は、それらがMのバンドに対して近位にまたは遠位に流れるかどうかに依存して、A〜LおよびN〜Zと称される。IEF上の、基準からはずれたバンドの存在は、AAT欠乏症の存在を示し得る。上記に示されるように、MタイプのAATは、いくつかのサブタイプを有し、これらのサブタイプはすべて、本明細書における使用が企図される。AATの任意の改変体は、本明細書において開示される構築物の設計を使用して、融合分子として使用することができることが企図される。

0039

AATの治療用濃縮物を得るための現在の傾向は、血液ドナー(たとえばヒトドナー)の血漿からAATを調製することである。これは、非常に限られた資源であり、市場性のある産物を得るために大規模な精製ステップを必要とする。これまでに、United States Food & Drug Administrationは、ヒト血漿に由来する、いくつかの市販の製品の使用を承認してきた。たとえば、これらの製品のうちのいくつかは、Prolastin(登録商標)、ProlastinC(登録商標)、(Talecris(現在Grifols、Raleigh、N.C.))、Zemaira(登録商標)、およびAralast(登録商標)(Baxter)を含み、Kamadaは、エアロゾルおよび静脈内製品(Kamada、Israel)の両方を有する。これらの製剤のほとんどは、AAT欠損患者におけるAAT療法のために静脈内に投与され、患者当たり1年につき$100,000もコストがかかる。血漿から単離されたAATは、血液に由来するAATと比較して、活性が低下していることが実証された。そのうえ、現在の精製プロトコールは、一般に、有意に低下した活性および血漿由来のAATをもたらす。本明細書において開示される組成物は、血漿由来のAATの抗炎症活性ではなく、血液の抗炎症活性と同様に、抗炎症活性が増大しており、また、抗炎症活性ではなく抗プロテアーゼ活性に基づく活性を有する、現在の市販で入手可能な製剤よりも、活性が高い。

0040

ある研究により、FDAにより承認された製品のうちの3つが、その一次構造およびグリコシル化の点から分析され、比較された。製品のいくつかのものは、正常なヒト血漿AATと比較して、おそらく、精製手順の間に持ち込まれる差異を示した。そのうえ、ある研究における、市販の製剤の比較により、セリンプロテアーゼ阻害活性およびAAT純度に関して大きなばらつきがあったことが以前に実証された。最近、標準的な市販で入手可能な製剤のうちの1つ、Prolastin(登録商標)が、評価され、新しい製剤ProlastinC(登録商標)は、最終製品における抗プロテアーゼ活性(たとえばセリンプロテアーゼ阻害活性)を増大させるために、Prolastin(登録商標)とは別のやり方で精製された。これらの市販の製品について報告された活性はすべて、抗炎症または免疫調節活性または代わりとなるAATに関連した活性ではなく、セリンプロテアーゼ阻害活性の評価に関する。したがって、現在の市販の製品は、量が不足しているだけではなく、天然に存在する製剤に対して、品質においても粗悪である。

0041

AAT製剤を改善するための努力にもかかわらず、入手可能な血漿AATの供給には限界があり、そのため、組換えAAT分子が、求められてきたが、今まで、ほとんどまたは全く成功していない。以前に生成された組換え分子は、以前に示された市販で入手可能な製剤と比較して、セリンプロテアーゼ阻害剤アッセイによってアッセイされた場合、時に同等であったが、多くの場合、それほど活性ではなかった。したがって、供給が限られた血漿および過去の粗悪な組換えAAT分子は、以前のおよび最近発見された方法論における使用のための十分な供給量のAATの生成について、空白を残した。

0042

本明細書におけるいくつかの実施形態は、当技術分野において知られている任意のAAT方法または治療における使用のための、市販で入手可能な製剤と比べて高度に活性で、高度に機能的な組換えAAT構築物の生成に関する。ある実施形態において、本明細書において開示される組換えAATは、完全長分子またはそのカルボキシ末端ペプチド誘導体を含む。いくつかの実施形態は、それぞれが免疫学的エレメント(たとえばジスルフィド結合によって連結されたFcフラグメントまたは他のフラグメント)と結合し、同時に精製されて、二量体を生成する、AAT分子を有する、1つを超える構築物の同時の合成に関する。他の実施形態は、本明細書において開示される方法および使用のための構築物を形成するために、1つまたはそれより多い免疫分子と結合されたまたは融合された、たとえば、分子のカルボキシ末端の最後の80、70、60、50、40、30アミノ酸のフラグメントまたは他のフラグメントを含む、AATの1つまたはそれより多いカルボキシ末端誘導体またはフラグメントの構築物を生成することに関するものとすることができる。

0043

本明細書において企図される構築物のAAT分子は、天然に存在するアルファ−1抗トリプシン(たとえばヒトもしくは他の哺乳動物)全体(またはシグナル配列もしくは他の指示配列を有する)、またはそのフラグメントもしくは誘導体、またはAATの変異体形態、有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有していない任意のAAT分子、またはその対立遺伝子(たとえば、およそ100の天然に存在するAAT改変体がある)またはそのアナログまたはその融合タンパク質(たとえばヒトIgGもしくはヒトIgGのフラグメント)に関するものとすることができる。これらの実施形態に従って、構築物が、免疫学的フラグメント(たとえばAATの2つの分子を連結するFcフラグメント)と結合した二量体AAT構築物を含むことができ、Fc−AAT構築物が、1つまたはそれより多いジスルフィド結合によって相互に連結される。たとえば、本明細書において開示される図2Aおよび図6A〜6Bを参照されたい。ある方法において、組換えAATまたはAATペプチドおよび免疫分子複合体の精製が、精製ステップを著しく減らし、AATまたはAATペプチドの効力を著しく増大させることによって、AATまたはAATペプチドの活性を増大させる。これらの実施形態に従って、本明細書において企図される組換えAAT分子は、融合ポリペプチド(たとえば二量体もしくは単量体形態)として使用することができるまたは精製の後にその免疫分子から切断し、市販で入手可能な製剤と比較して、濃度を低下させて使用することができる。いくつかの実施形態は、市販で入手可能な製剤と比較して、1/2、1/4、1/10〜1/100の濃度の使用に関する。ある実施例において、これらの分子が、コントロール(たとえば、天然に存在するAATの典型的な精製および市販で入手可能な配合薬の精製)と比較して、サイトカインを阻害するまたは分子の免疫および炎症機能を調整するための組成物において使用することができる。一実施形態において、本出願の組換え分子が、現在の市販で入手可能な製剤よりも多くの活性を実証した。本発明のAAT構築物に関して関心があるとして知られている、ある活性は、免疫調節性または炎症調整活性を含む。いくつかの実施形態において、本明細書において開示される構築物は、市販で入手可能な組成物と比較して、IL−1β受容体アンタゴニスト活性が増大している。

0044

ある実施形態において、被験体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。さらに他の実施形態において、被験体は、男性、女性、妊娠している女性、小児、または年少者である。

0045

健康状態の治療における組換えAATのいくつかの使用
本明細書において報告されるいくつかの実施形態は、AAT療法を必要とする被験体を治療するために、組換えAATまたは融合タンパク質またはそのカルボキシ末端フラグメント融合分子を使用することに関する。AAT治療は、アポトーシス関連性の状態、一酸化窒素関連性の状態、虚血再灌流機能不全誘発性の状態、移植片拒絶および細胞性拒絶、糖尿病、気腫、他の肺の状態、細菌性感染症の治療および予防、ウイルス感染症の治療および予防、放射線誘発性の傷害、ならびにその他同種のものを含むが、これらに限定されない様々な状態における使用について報告されてきた。

0046

本明細書におけるいくつかの実施形態は、炎症障害(たとえばIBD、関節炎)を治療するために使用する組成物に関し、その状態を治療するための組成物は、セリンプロテアーゼ活性が低下しているまたは排除されている。

0047

ある実施形態において、本明細書において開示される組成物および方法は、被験体において、炎症腸障害の発病を低下させるまたは予防するために使用することができる。これらの実施形態に従って、被験体における、IBSと関連する状態における低下は、おおよそ、約10〜20%、または約30〜40%、または約50〜60%、または約75〜100%の低下または阻害であり得る。これらの実施形態に従って、IBSまたはIBDを有する被験体は、そのような組成物を受けていないコントロール被験体と比較して、消耗を低下させるまたはバリア機能損失を低下させるもしくはそれを回復させるために、AATまたはAATカルボキシ末端ペプチドの組換えまたは融合タンパク質の薬学的に許容され得る組成物により治療されてもよい。

0048

本明細書におけるいくつかの実施形態は、急性または慢性の状態を有する被験体において、腸または腸管透過性亢進を回復させることに関する。これらの実施形態に従って、腸または腸管の透過性亢進またはバリア機能の損失は、全身性炎症反応症候群(SIRS)、炎症性腸疾患、1型糖尿病、アレルギー、および喘息などのような慢性疾患によるものとすることができる。ある実施形態において、腸または腸管の透過性亢進を有する被験体は、毎日、毎週2回、毎週、または他の所定のレジメンなどのような所定のレジメンによって医療従事者によって治療することができる。

0049

ある実施形態において、本明細書において開示される組成物は、糖尿病(たとえば1型および2型)、自己免疫性疾患などのような免疫疾患炎症疾患、心障害伝染病、および他を含むが、これらに限定されない、ある徴候を治療するために使用することができる。本明細書において開示されるいくつかの疾患は、炎症疾患、自己免疫性疾患、もしくは肺疾患または他と見なすことができる喘息などのように、1つを超えるカテゴリー下に入ってもよい。ある実施形態において、本明細書において開示される組成物は、関節リウマチなどのようなリウマチ性疾患全身性エリテマトーデスSLE)、I型糖尿病、ならびに甲状腺消化管、および中枢神経系の自己免疫性疾患(たとえば関節リウマチ、エリテマトーデスシェーグレン症候群強皮症混合結合組織病皮膚筋炎多発筋炎ライター症候群、およびベーチェット病);中枢神経系の自己免疫性疾患(たとえば多発性硬化症重症筋無力症、または脳脊髄炎);胃腸系の自己免疫性疾患:(たとえばクローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患、セリアック病スプルー);甲状腺の自己免疫性疾患:(たとえば橋本甲状腺炎またはグレーブス病);ならびに目の自己免疫性疾患(たとえばブドウ膜炎)を含むが、これらに限定されない自己免疫性疾患を治療するために使用することができる。本明細書において企図される自己免疫障害は、円形脱毛症強直性脊椎炎(nkylosing spondylitis,)、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性アジソン病副腎の自己免疫性疾患、自己免疫性溶血性貧血自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および精巣炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡心筋症セリアックスプルー皮膚炎慢性疲労免疫異常症候群(CFIDS)、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシーチャーグ−ストラウス症候群瘢痕性類天疱瘡、CRES症候群、クローン病、円板狼瘡クリオグロブリン血症線維筋痛線維筋炎糸球体腎炎ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症特発性血小板減少性紫斑病ITP)、過敏性腸疾患(IBD)、IgAニューロパシー若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、1型または免疫媒介性真性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡悪性貧血結節性多発動脈炎、多発軟骨炎、多発内分泌腺症候群、リウマチ性多発筋痛症(Polymyalgia rheumatic)、多発筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症原発性胆汁性肝硬変乾癬乾癬性関節炎レイノー現象(Raynauld’s phenomenon)、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティッフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎側頭動脈炎(Temporal arteristis)/巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、疱疹状皮膚炎脈管炎(dermatitis herpetiformis vasculitis)などのような脈管炎、白斑ウェゲナー肉芽腫症、T細胞媒介性自己免疫性疾患、リウマチ性疾患、リウマチ性関節炎、ならびにエリテマトーデスに関するものとすることができる。

0050

ある実施形態は、本明細書において開示される組成物により肝臓状態を治療することに関する。本明細書において開示される肝臓の状態は、肝臓疾患肝硬変(cirrohosis)、ウイルス感染症(たとえば肝炎)、および過剰な炎症または免疫障害によって引き起こされる他の肝臓状態を含むが、これらに限定されない。

0051

本明細書において開示される、ある実施形態において、組成物は、被験体において、自己免疫性疾患を治療するために使用することができる。本明細書において企図される自己免疫性疾患は、急性播種性脳脊髄炎(ADEM)、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、抗合成酵素症候群(Antisynthetase syndrome)、アトピー性アレルギーアトピー性皮膚炎、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性心筋症、自己免疫性消化器病、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性内耳疾患、自己免疫性リンパ増殖性症候群、自己免疫性の末梢性ニューロパシー、自己免疫性膵炎、自己免疫性多内分泌腺症候群、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎(Autoimmune progesterone dermatitis)、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性じんま疹、自己免疫性ブドウ膜炎、バロー病/バロー同心円性硬化症(Balo concentric sclerosis)、ベーチェット病、ベルガー病、ビッカースタッフ脳炎ブラウ症候群、水疱性類天疱瘡、癌、キャッスルマン病、セリアック病、シャガス病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、慢性再発性多発性骨髄炎慢性閉塞性肺疾患、チャーグ−ストラウス症候群、良性粘膜類天疱瘡コーガン症候群寒冷凝集素症補体成分2欠乏症(Complement component 2 deficiency)、接触皮膚炎頭蓋動脈炎、CREST症候群、クローン病(2つのタイプの特発性炎症性腸疾患「IBD」のうちの1つ)、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、デゴス病、ダーカム病、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病1型、びまん性皮膚全身性硬化症(Diffuse cutaneous systemic sclerosis)、ドレスラー症候群薬剤誘発性エリテマトーデス、円板状エリテマトーデス湿疹子宮内膜症付着部炎関連関節炎(Enthesitis−related arthritis)、好酸球性筋膜炎好酸球胃腸炎後天性表皮水疱症結節性紅斑胎児性赤芽球症、クリオグロブリン血症、エバンス症候群、進行性骨化性線維形成異常症線維肺胞炎(または特発性肺線維症)、胃炎胃腸類天疱瘡(Gastrointestinal pemphigoid)、巨細胞性動脈炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、ギラン−バレー症候群(GBS)、橋本脳症、橋本甲状腺炎、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病妊娠性疱疹妊娠性天疱瘡(Gestational Pemphigoid)、汗腺膿瘍ヒューズ−ストーヴィン症候群、低ガンマグロブリン血症、特発性炎症性脱髄疾患、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病(自己免疫性血小板減少性紫斑病)、IgA腎症封入体筋炎、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、川崎病ランバート−イートン筋無力症候群白血球芽細胞性脈管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、線状IgA病(LAD)、ルーゲーリック病、筋萎縮性側索硬化症、ルポイド肝炎、別名自己免疫性肝炎、エリテマトーデス、マジード症候群、顕微鏡多発血管炎ミラー−フィッシャー症候群、ギラン−バレー症候群、混合結合組織病、斑状強皮症、ムッハ−ハーベルマン病、急性痘瘡苔癬状粃糠疹、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎ナルコレプシー視神経脊髄炎、デビック病、神経性筋強直症眼類天疱瘡(Occular cicatricial pemphigoid)、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、オード甲状腺炎(Ord’s thyroiditis)、回帰性リウマチ、PANDAS(連鎖球菌と関連する小児自己免疫性の神経精神障害)、傍腫瘍性小脳変性症発作性夜間血色素尿症PNH)、パリーロンベルク症候群、パーソネージ−ターナー症候群毛様体扁平部炎、尋常性天疱瘡、悪性貧血、静脈周囲脳脊髄炎、POEMS症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、POEMS症候群、結節性多発動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、多発筋炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎進行性炎症性ニューロパシー、乾癬、乾癬性関節炎、壊疽性膿皮症赤芽球癆ラズムッセン脳炎レイノー症状、再発性多発軟骨炎、ライター症候群、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、関節リウマチ、リウマチ熱、サルコイドーシス、統合失調症シュミット症候群、シュニッツラー症候群、強膜炎、強皮症、血清病、シェーグレン症候群、脊椎関節症スティル病若年性関節リウマチ全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎SBE)、スザック症候群、スウィート症候群、シデナム舞踏病交感性眼炎全身性紅斑性狼瘡、高安の動脈炎、側頭動脈炎、血小板減少症、トロサ−ハント症候群横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化脊椎関節症、未分化結合組織疾患、じんま疹様血管炎、じんま疹様血管炎、脈管炎白斑、およびウェゲナー肉芽腫症を含むが、これらに限定されない。

0052

他の実施形態において、本明細書において開示される組成物は、アレルギー性疾患、たとえば関節炎、炎症性の骨溶解、喘息、慢性炎症(たとえば慢性ウイルスまたは細菌感染症由来の)、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、脳炎、炎症性腸疾患(IBD)、乾癬(たとえば性乾癬膿疱性乾癬乾癬性紅皮症滴状乾癬、または逆性乾癬(inverse psoriasis))、肺線維症、未分化関節症(undifferentiated arthropathy)、未分化脊椎関節症を含むが、これらに限定されない、炎症性の状態などのような状態を治療することを含むことができる。他の状態は、呼吸器系の状態、たとえば喘息、COPD、気腫を含むことができるが、これらに限定されない。嚢胞性線維症および閉塞性細気管支炎などのような、他の肺の状態が、企図される。

0053

放射線防護および癌
ある実施形態において、組成物(たとえば構築物組成物)および方法は、被験体に対する放射線の副作用を調整することに関する。いくつかの実施形態において、組成物および方法は、たとえば、癌を有するまたは悪性疾患の発症もしくはコントロール不良の細胞の増殖が疑われる被験体に対して投与される場合に、放射線療法または放射線を有する被験体を治療することに関する。本明細書において開示される他の実施形態は、放射線治療の不利な副作用を低下させるために、たとえば偶然にまたは目的のある行為によって、放射線に対して曝露されたことがある被験体を治療することに関する。

0054

本明細書において開示されるいくつかの実施形態は、癌療法を受けている被験体の治療に関する。これらの実施形態に従って、癌療法を受けている被験体は、治療の有害な影響(たとえば放射線および/または化学療法による治療からの)を低下させるまたは予防するために、本明細書において開示される組成物により治療することができる。癌治療は、膀胱癌乳癌腎臓癌、白血病、肺癌、骨髄腫、脂肪肉腫、リンパ腫、舌癌、前立腺癌、胃癌結腸癌、子宮癌、黒色腫、膵癌、脳癌、眼癌、皮膚癌、および他の知られている癌のための治療を含むが、これらに限定されない。

0055

他の実施形態において、本明細書において開示される組成物が、癌を有する被験体を治療するために使用することができる。これらの実施形態について企図される癌は、線維肉腫粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫骨原性肉腫脊索腫血管肉腫内皮肉腫(endotheliosarcoma)、リンパ管肉腫カポジ肉腫リンパ管内皮肉腫(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜腫中皮腫ユーイング腫瘍平滑筋肉腫横紋筋肉腫横紋肉腫、結腸直腸がん、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、黒色腫、扁平上皮がん基底細胞がん腺がん汗腺がん、脂腺がん、乳頭状がん、乳頭腺癌嚢胞腺がん、髄様がん気管支原性がん、腎細胞がん肝癌胆管がん絨毛がんセミノーマ、胎児性がん、ウィルムス腫瘍子宮頸癌精巣腫瘍肺がん小細胞肺がん膀胱がん上皮がん神経膠腫星状細胞腫髄芽腫頭蓋咽頭腫脳室上衣腫松果体腫血管芽細胞腫聴神経腫乏突起膠腫髄膜腫神経芽細胞腫網膜芽細胞腫、骨髄腫、リンパ腫、白血病、または他の知られている癌を含むが、これらに限定されない。

0056

他の実施形態は、本明細書において開示される放射能障害予防および組成物に関して、化学療法の間の、ホルモン療法と組み合わせての、および/または免疫療法の併用としての、三叉神経痛のための治療、重度甲状腺眼疾患のための治療、翼状片のための治療、色素性絨毛結節性滑膜炎のための治療、ケロイド瘢痕増殖の予防、異所性骨化の予防、美容、形成、または再建手術の適用による外科手術(たとえば瘢痕形成を低下させる)を含み、それに関するものとすることができる。本明細書におけるある実施形態において、融合ポリペプチドを含有する組成物は、形成外科手術を受けているまたは受けたことがある被験体において、炎症を低下させるために使用することができる。そのような組成物の投与は、被験体の炎症および瘢痕を低下させるために使用されてもよい。

0057

ある副作用は、放射線被曝の間におよび放射線療法または化学療法の副作用としてさえ生じ得る。本明細書におけるいくつかの実施形態は、本明細書において開示される組成物により、被験体を治療することによる、被験体におけるこれらの副作用の低下または予防に関する。組成物は、AATの組換え形態および/またはAATカルボキシ末端ペプチドの組換え形態(たとえば80アミノ酸長、36アミノ酸長など)を含むことができる。放射線療法の副作用は、細胞の損傷、痛み、腫脹局所刺激線維症瘢痕化、組織の完全性の損失、組織脆弱性の増大、嚥下困難、および放射線治療または被曝と関連する他の症状を含むことができるが、これらに限定されない。低下させるまたは予防することができる他の副作用は、たとえば骨髄移植の間の全身照射(TBI)からの副作用に関する。これらの副作用は、上記のものならびにそのうえ、急性および慢性免疫不全ならびに日和見感染症を含むことができる。

0058

本明細書において開示されるいくつかの実施形態は、前立腺癌を有するまたは発症が疑われる被験体を治療することに関する。これらの実施形態に従って、前立腺癌を有するまたはその発症が疑われる男性の被験体は、これらの療法に起因する副作用を低下させるために、放射線および/または化学療法による治療の前に、その間に、またはその後に、本明細書において開示される組成物(複数可)により治療することができる。たとえば、副作用は、インポテンスまたは勃起障害の発症を含むが、これらに限定されない。

0059

本明細書において企図される他の状態は、全身性紅斑性狼瘡(SLEまたは狼瘡)、関節リウマチ、敗血症、全身性紅斑性狼瘡(SLEまたは狼瘡)、関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血症、自己免疫性疾患、アテローム性動脈硬化症アルツハイマー病、関節炎、筋ジストロフィーダウン症候群、多発性硬化症、発作神経変性障害、他の炎症疾患または状態、および血清陰性脊椎関節症を含む。

0060

移植片拒絶および移植片生着
他の実施形態において、本明細書において企図される組換えまたは融合ポリペプチド(たとえばFc−AATまたはFc−AATフラグメント)は、器官または非器官(たとえば細胞の)移植などのような移植を受けている被験体を治療するために使用することができる。ある実施形態において、細胞の移植は、骨髄、島細胞(たとえば島同種移植)、角膜細胞、幹細胞、皮膚(たとえば細胞もしくはそれよりも大きな)、皮膚の一時的な死体からの移植(たとえば軟部組織顔面、もしくは他)、または移植片対宿主病(GVHD)などのような細胞の移植拒絶反応に関する状態を含むことができる。本発明の実施形態は、移植されたまたはそれを必要とする被験体が経験した症状またはサインを寛解させるための方法を提供する。これらの実施形態に従って、症状またはサインは、移植片対宿主病(GVHD)または移植片拒絶と関連する状態を含んでいてもよい。一実施例において、本明細書において開示される方法が、骨髄移植を受けている被験体を治療するために使用されてもよい。他の実施形態において、本明細書において開示される方法は、幹細胞または他の細胞の移植を受けている被験体を治療するために使用されてもよい。これらの実施形態に従って、被験体が、移植拒絶を低下させる、移植の細胞を保護する、および/または移植された細胞(移植片生着延長するために治療されてもよい。他の実施形態は、心臓、肺、腸管、肝臓、膵臓、腎臓、または他の臓器移植などのような臓器移植を受けている被験体を治療することを含むことができる。

0061

一実施例において、本明細書において開示される方法が、骨髄移植を受けている被験体を治療するために使用されてもよい。これらの実施形態に従って、被験体は、被験体において、移植片拒絶および/またはGVHDを低下させるまたは予防するために、骨髄移植の前に、その間に、またはその後に治療することができる。

0062

他の実施形態において、本明細書において開示される組成物および方法は、臓器移植拒絶の発生を予防するまたは低下させることに関する。他の実施形態において、本明細書において開示される組成物および方法は、器官移植を延長することに関する。本明細書において企図される移植は、腎臓、心臓、肝臓、軟部組織の移植、顔の構成成分移植、腸管移植、および移植に関する。そのうえ、本明細書において開示される組成物は、器官または非器官の移植と関連する症状の低下または予防に関する。本明細書において開示される組成物による移植を受けている被験体を治療することによって低下させるまたは予防することができる症状は、移植片拒絶、腎不全肺不全心不全粘膜潰瘍、島機能の低下(グルコースの増大、真性糖尿病)、移植片対宿主病(GVHD)、胃腸(GI潰瘍、肺の不全皮膚潰瘍凝血異常CNS機能不全、および昏睡を含むことができる。

0063

本発明の実施形態は、被験体において、移植片生着および機能の延長を促すための方法であって、組換えAATまたはその融合タンパク質の物質および薬学的に許容され得る賦形剤を含む、治療有効量の組成物を、その必要のある被験体に対して投与するステップを含む、方法を提供する。

0064

ある実施形態において、被験体は、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒトである。さらに他の実施形態において、被験体は、男性、女性、妊娠している女性、小児、または年少者である。

0065

本発明のさらに他の態様は、移植前の器官または細胞保存に関する。たとえば、凍結保護または輸送の間の保護または他の保存方法は、本明細書において開示される組成物に対して、器官、組織、または細胞を曝露することによって増強されてもよい。本明細書における、ある実施形態は、移植のためのまたは凍結保護のための調製において、器官、組織、または細胞を保護するための、本明細書において開示される組成物の使用に関する。これらの実施形態に従って、器官、組織、または細胞は、本明細書において開示されるもののいずれか、たとえば、膵島細胞、幹細胞、骨髄細胞、腎臓、肝臓、肺、および他の器官または細胞の移植を含むことができる。

0066

本発明のある実施形態において、本明細書において開示される組成物は、併用療法をさらに含むことができる。たとえば、併用療法は、単独でまたは一緒に使用される、1つまたはそれより多いインターフェロン、ベタセロンを含むインターフェロン誘導体、ベータ−インターフェロン、イロプロストを含むプロスタン誘導体、シカプロスト;コルチゾール、プレドニゾロン、メチル−プレドニゾロン、デキサメタゾンを含むグルココルチコイド;シクロスポリンA、FK−506、メトキサレン(methoxsalene)、サリドマイド、スルファサラジン、アザチオプリン、メトトレキサートを含む免疫抑制薬;ジロートン、MK−886、WY−50295、SC−45662、SC−41661A、BI−L−357を含むリポキシゲナーゼ阻害剤;ロイコトリエンアンタゴニスト;ACTHおよびそのアナログを含むペプチド誘導体;可溶性TNF受容体;TNF抗体;インターロイキン、他のサイトカイン、T細胞タンパク質の可溶性受容体;インターロイキン、他のサイトカイン、T細胞タンパク質の受容体に対する抗体;ならびにカルシポトリオール;Celcept(登録商標)、ミコフェノール酸モフェチル、およびその類似体を含むが、これらに限定されない。

0067

ある実施形態において、心筋梗塞を有するまたはそれを有することが疑われる被験体に対して、心臓の状態の症状または副作用を寛解させるために、本明細書において開示される組成物を投与することができる。ある実施形態において、本明細書において開示される組成物は、心臓の心室リモデリングを低下させるまたは予防するために使用することができる。本明細書において開示される任意の状態を治療するための方法は、心イベントの前に、その間に、またはその後に、組成物を投与することを含むことができる。ある実施形態において、組成物は、心イベントが被験体において生じた後に、最適の効能を有するように医療従事者によって決定される期間、被験体に対して投与することができる。たとえば、被験体は、イベント後に、1週間まで、2週間まで、またはそれ以上、組成物により治療されてもよい。ある実施形態において、本明細書において記載される被験体に対して投与される組成物は、1用量当たり.001mg/kg〜10mg/kgの組換えまたはAAT融合分子などのように、市販で入手可能なAAT製剤(たとえばAralast(商標)、Prolastin C(商標))を使用するよりも、5倍、10倍、100倍、または1,000倍少ないものとすることができる。

0068

糖尿病
そのうえ、本明細書において開示される組成物は、被験体において、疾患を治療するために、糖尿病を有する任意の被験体に対して投与されてもよい。1型または2型糖尿病を有する被験体は、その疾患を治療するまたは疾患症状を治療するために、本明細書において開示される組成物を投与されることができる。これらの治療は、糖尿病について当技術分野において知られている任意の治療と組み合わせることができる。ある実施形態において、本明細書において開示される組成物は、糖尿病を有する被験体を治療するために、現在入手可能な市販の製剤と比較して、レベル(たとえば濃度)を低下させて、被験体に対して投与することができる。これらの実施形態に従って、糖尿病を有する被験体は、たとえば、検出できるc−ペプチドレベルによりおよび/または検出できるインスリン産生によりおよび/または残存している島細胞機能により、5以内に診断されるものなどのような、早期発症型糖尿病1型を有する被験体とすることができる。

0069

他の実施形態は、インビボにおいて(たとえば、島細胞機能を保護するもしくは復活させるために)またはインビトロにおいて(たとえば移植のための輸送の間に)、島細胞を防御するための、本明細書において開示される組成物の使用に関するものとすることができる。本明細書において開示される組成物は、いくつかの残っている島細胞機能を有する糖尿病を有する被験体を治療するおよび/または島細胞を保護するために被験体において移植前に島細胞を治療するために使用することができることが企図される。そのため、被験体は、島細胞移植前に、その間に、またはその後に治療されてもよい。他の実施形態において、糖尿病治療は、インスリン抵抗性糖尿病、I型、およびII型を有する被験体を治療することを含むことができる。

0070

心臓の状態
本発明のいくつかの実施形態は、心臓の状態を有するまたは心臓病の介入(たとえば外科手術、予防の治療)を受けている被験体を治療することを含む。これらの実施形態に従って、心臓の状態を有する被験体は、以下の状態、心筋梗塞、心筋虚血、慢性全身性動脈性および静脈性高血圧肺動脈および静脈高血圧、先天性心疾患心臓内シャンティングを有するおよび有していない)、心臓弁膜症、特発性拡張型心筋症感染性および非感染性心筋炎ストレス心筋症(救急疾患(critical care illness)、物理的および情動ストレス、ならびに頭蓋内出血および発作と関連して見られるような)、敗血症性心筋症、心房性および心室性不整脈心内膜炎心膜炎、心筋に対する損傷、心臓麻痺心停止急性心筋梗塞(AMI)、心筋虚血再灌流傷害、心室リモデリング、求心性肥大遠心性肥大、ならびに他の知られている心臓の状態を含むが、これらに限定されない、1つまたはそれより多い状態を有していてもよい。

0071

ある実施形態において、心筋梗塞を有するまたはそれを有することが疑われる被験体に対して、心臓の状態の症状または副作用を寛解させるために、本明細書において開示される組成物を投与することができる。ある実施形態において、本明細書において開示される組成物は、心臓の心室リモデリングを低下させるまたは予防するために使用することができる。本明細書において開示される任意の状態を治療するための方法は、心イベントの前に、その間に、またはその後に、組成物を投与することを含むことができる。ある実施形態において、組成物は、心イベントが被験体において生じた後に、最適の効能を有するように医療従事者によって決定される期間、被験体に対して投与することができる。たとえば、被験体は、イベント後に、1週間まで、2週間まで、またはそれ以上、組成物により治療されてもよい。ある実施形態において、本明細書において記載される被験体に対して投与される組成物は、1用量当たり.001mg/kg〜10mg/kgの組換えまたはAAT融合分子などのように、市販で入手可能なAAT製剤(たとえばAralast(商標)、Prolastin C(商標))を使用するよりも、5倍、10倍、100倍、または1,000倍少ないものとすることができる。

0072

胃腸障害
本発明のいくつかの実施形態は、胃腸障害または状態(たとえば間欠性孤立性、または慢性状態)を有する被験体を治療することを含む。これらの実施形態に従って、胃腸状態を有する被験体は、炎症性腸疾患(たとえばIBSまたはIBD)、潰瘍性大腸炎(UC)、クローン病(CD)、全身性炎症反応症候群(SIRS)、アレルギー関連性の腸疾患、1型糖尿病に関連性の腸疾患、他の大腸炎のタイプ(たとえばコラーゲン形成大腸炎、虚血性大腸炎、便流変更性大腸炎(diversion colitis)、未確定の大腸炎)、腸の炎症と関連するベーチェット症候群、および他の腸障害を含むが、これらに限定されない、1つまたはそれより多い状態を有していてもよい。ある実施形態において、腸障害の症状または副作用が、本明細書において開示される組成物によって治療することができる。たとえば、腸障害の副作用は、皮膚症状発現、体重減少、結腸短縮、腸粘膜、腸または腸管の透過性亢進を含むが、これらに限定されない。ある実施形態は、障害を有する被験体において、体重減少を低下させるまたは予防するために、本明細書において開示される組成物により、腸障害を有する被験体を治療することを含むことができる。

0073

細菌性の状態
本発明のいくつかの実施形態は、細菌性感染症を有する被験体を治療することを含む。他の実施形態は、被験体において、細菌性感染症を予防するために、本明細書において開示される組成物を投与することを含むことができる。本明細書において企図される細菌性感染症は、グラム陰性もしくはグラム陽性細菌またはマイコバクテリウム生物を含むが、これらに限定されない。グラム陰性細菌は、N.gonorrhoeae、N.men ingitidi、M.catarrhalis、H.injiuenzae、大腸菌、すべてのKlebsiela種、すべてのEnterobacter種、すべてのSerratia種、すべてのSalmonella種、Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、すべてのProvidencia種、すべてのMorganella種、Pseudomonas aeruginosa、すべてのCitrobacter種、すべてのPasteurella種、すべてのAeromonas種、Pseudomonas cepacia、すべてのShigella種、Stenotrophomonas maltophilia、すべてのAcinetobacter種、すべてのLegionella種、Y.enterocolitica、他のYersinoiiosis、H.ducreyeii、すべてのChlamyidia種、Mycoplasma pneumonia、Mycoplasma hominis、Bacteroides fragilis、P.melaninogenica、すべてのMoraxella種、すべてのBortedella種、およびP.multocidaを含むことができるが、これらに限定されない。

0074

本明細書において企図されるマイコバクテリウムは、M.bovis、M.tuberculosis、マイコバクテリウムアビウムコンプレックス(MAC)生物、M.intracellular、M.avium、M.paratuberculosis、ハンセン病を引き起こす(M.leprae、M.flavascens、M.lepraemurium、M.microti、M.chelonei、M.africanum、M.marinium、M.buruli、M.fortuitum、M.haemophilum、M.kansasii、M.littorale、M.malmoense、M.marianum、M.simiae、M.szulgai、M.ulcerans、M.gordonae、M.gastri、M.phlei、M.nonchromogenicum、M.smegmatis、M.terrae、M.trivial、M.scrofulaceum、M.xenopi、M.gordonae、M.haemophilum、M.genavense、M.simiae、M.vaccaeを含むことができるが、これらに限定されない。

0075

本明細書において企図されるグラム陽性細菌は、C.tetani、C.botulinum、C.difficile、A、B、C、およびG群Streptococcus、Streptococcus pneumonia,Streptococcus milleri群、Viridans streptococcus、すべてのListeria種、すべてのStaphylococcus種、S.aureus(MSSA)、S.aureus(MRSA)、S epidermidis、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、すべてのClostridium種、C.diptheriea、C.jeikium、すべてのRhodococcus種、すべてのLeukonostoc種、ならびにBacillus anthracis(たとえば、炭疽を引き起こす)を含むが、これらに限定されない。

0076

ある実施形態において、本明細書において開示される組成物は、細菌性の状態を有する被験体を治療するために使用され、細菌関連性の状態の発病を低下させるまたは予防することができる。

0077

ウイルス性の状態
本発明のいくつかの実施形態は、ウイルス感染症を有する被験体を治療することを含む。他の実施形態は、被験体において、ウイルス感染症を予防するまたはウイルス感染症を治療するために、本明細書において開示される組成物を投与することを含むことができる。本明細書において企図されるウイルス感染症は、ヒト免疫不全ウイルスHIVAIDS、インフルエンザウイルス(たとえばA、B、C、インフルエンザA H1N1、H1N2、H3N2、H9N2、H7N2、H10N7型)、帯状疱疹単純ヘルペスヒトパピローマウイルス大痘瘡ウイルス(痘瘡)、ラッサ熱ウイルス鳥インフルエンザ、AIDS関連症候群、水痘水疱瘡)、サイトメガロウイルスコロラドダニ熱ウイルスデング熱エボラ出血熱手足口病、肝炎、HPV感染性単核症ムンプス灰白脊髄炎、進行性多巣性白質脳症(Progressive multifocal leukoencephalopathy)、狂犬病風疹SARS、ウイルス性脳炎、ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎西ナイル病、黄熱病マールブルグ出血熱麻疹、および他のウイルス関連性の障害を含むことができるが、これらに限定されない。

0078

本明細書において開示される他の実施形態は、被験体において、ウイルス複製および/または感染症を阻害することによって、ウイルスによって誘発される癌を低下させるまたは予防することに関する。ウイルスによって誘発される癌は、ラウス肉腫誘発性の癌、ヒトパピローマウイルス(HPV)誘発性の癌、ポリオーマ誘発性の癌、B型肝炎ウイルス誘発性の癌、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、血管肉腫、脊索腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、横紋肉腫、結腸直腸がん、膵癌、乳癌、黒色腫、前立腺癌、卵巣癌、扁平上皮がん、基底細胞がん、脂腺がん、腺がん、汗腺がん、乳頭状がん、肝癌、嚢胞腺がん、乳頭腺癌、気管支原性がん、髄様がん、腎細胞がん、セミノーマ、胆管がん、子宮頸癌、ウィルムス腫瘍、胎児性がん、肺がん、絨毛がん、精巣腫瘍、膀胱がん、上皮がん、小さな細胞肺がん、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、星状細胞腫、神経膠腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫(menangioma)、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、骨髄腫、リンパ腫、および白血病を含むことができるが、これらに限定されない。さらに他の実施形態は、ウイルス性肺炎および気管支肺炎に関する。

0079

ある実施形態において、本明細書において開示される組成物は、ウイルス感染症を有する被験体を治療するために使用され、ウイルス関連性の状態の発病を低下させるまたは予防することができる。たとえば、本明細書において開示される組成物は、被験体において、ウイルスの伝染を低下させ、ウイルス複製を低下させるために、ウイルス感染症を有する被験体を治療するために使用することができる(たとえば、被験体から被験体に伝染するインフルエンザまたは他の疾患)。

0080

他の例示的な実施形態において、本明細書において開示される組成物は、被験体において、炎症および尿酸結晶の産生を低下させるように、被験体において、痛風を治療するために使用することができる。これについては、痛風性関節炎のモデルは、痛風の炎症におけるIL−1βの役割に基づいて用いることができる(市販で入手可能な製剤を使用して以前に示されるモデル)。このモデルにおいて、MSUおよびC18脂肪酸を混合し、マウスモデルとしてのC57Black6マウスの膝蓋下の空間に注射することができる。組換えヒトFc−AATは、マウスの膝蓋下の空間に、2μgで、単独で関節内(i.a.)注射し、検査することができる。他の試験グループでは、マウスにMSU/C18を注射することができる。マウスの他のセットにおいて、MSU/C18および本明細書において開示される組成物の組み合わせを注射することができる。マウスのは、次いで、血漿由来のAATによるモデルにおいて行われるように、炎症について検査することができる。一実施例において、滑膜浸潤する細胞の数を、観察することができる。

0081

様々なペプチドの構築物
本明細書における実施形態は、組換えAATまたはAATに由来する1つまたはそれより多いカルボキシ末端ペプチド(たとえば、AATの最後の80アミノ酸において見つけられる、AATのカルボキシ末端ペプチド、もしくはAATの最後の36アミノ酸において見つけられる、AATのカルボキシ末端ペプチドなど)を有する組換え体の生成および使用を提供する。これらの実施形態に従って、たとえば、ペプチドの半減期を増大させるおよび/または免疫分子結合を通して融合ポリペプチドをさらに指示するために免疫分子を使用するために免疫分子に連結される融合ポリペプチドを、生成することができる。本明細書において設計される構築物は、市販で入手可能な製剤と同じくらい活性なものとすることができるか、または市販の製剤よりも、特定の活性、たとえば抗炎症活性においてより活性なものとすることができる。

0082

本発明の一実施形態において、組成物は、AAT療法(たとえば哺乳動物由来AATによる治療または補充)を必要とする被験体を治療するための、たとえば、AATおよびその誘導体に対応するカルボキシ末端アミノ酸ペプチドを含む、一連のペプチドを投与するための構築物を含んでいてもよい。これらのペプチドは、融合構築物の一部である

0083

およびその任意の組み合わせを含むペンタペプチドを含むことができる。

0084

他の実施形態において、本明細書における構築物、医薬組成物、および方法における使用のために企図されるAATペプチドは、カルボキシ末端アミノ酸と結合した、配列番号1または配列番号33のそれらの特定のAATペプチドのいずれかおよびすべてを含むように意図される(最も一般的な形態が、サブタイプM1、M2、M3などを有するMタイプである、394アミノ酸の天然に存在するAATもまた、本明細書において企図される)。抗炎症性活性および/または免疫制御活性を持つAATポリペプチドはすべて、本明細書において開示される方法における使用について企図される。315〜394の範囲にわたるアミノ酸、325〜384、358〜394、340〜380などの範囲にわたるアミノ酸などのような、AATのまたはAAT様の活性をまねる連続アミノ酸の任意の組み合わせが、使用されてもよい。そのうえ、カルボキシ末端の5アミノ酸長、10アミノ酸長、15アミノ酸長、20アミノ酸長、25アミノ酸長、30アミノ酸長、35アミノ酸長などのような連続アミノ酸配列の組み合わせもまた、使用することができる。たとえば、配列番号1 AA 314〜394由来の5アミノ酸長、10アミノ酸長、15アミノ酸長、20アミノ酸長の連続アミノ酸の任意の組み合わせは、本明細書において企図される構築物を開発するまたは精製するのに使用することができる。

0085

ある実施形態は、組換え融合ポリペプチドまたはタンパク質を生成することに関し、AAT分子全体(たとえば配列番号1もしくは33)またはAATのカルボキシ末端アミノ酸領域に由来するペプチド分子を、IgGまたはそのフラグメントに連結することを含む。AATの一般的な1つの形態は、配列番号33によって示される。本明細書において企図される1つの構築物は、配列番号32(たとえばAAT全体、リーダー配列、および免疫グロブリン分子のFc部分)ならびに配列番号48(リンカーを有するAAT全体および免疫グロブリン分子のFc部分)として参照される。これらの構築物は、本明細書において開示される組成物において二量体としてまたは単量体形態として使用することができる。これらの実施形態に従って、薬学的に許容され得る組成物は、Fc−AATの二量体またはFc−AATの単量体またはFcから切断されたAATまたはその組み合わせおよび薬学的に許容され得る賦形剤を含むことができる。そのうえ、点変異は、ヒンジ領域の可動性を低下させ、かつ新規なFc−AAT分子を生成するために、Fc領域中に作製することができる。

0086

他の実施形態において、AATプロテアーゼ結合ドメインは、分子のプロテアーゼ機能を低下させ、または排除し、かつエラスターゼ活性を阻害しないように、変異させることができ、これらの分子は、本明細書において企図される任意の構築物において使用することができる。ある実施形態において、変異AATは、本明細書において開示される方法によってAAT構築物を生成するために使用することができる。他の実施形態において、変異分子(たとえば、プロテアーゼ活性が低下した、またはプロテアーゼ活性が本質的にない)は、その抗炎症効果および/または免疫調節性の効果を保持し、AAT療法を必要とする被験体において、抗炎症分子として使用することができる。当業者は、AATの非プロテアーゼ結合ドメインおよび天然に存在するAATのカルボキシ末端の最後の80アミノ酸と称されるものを理解するであろう。

0087

上記の列挙される方法のそれぞれにおいて、α1−抗トリプシンまたはそのカルボキシ末端ペプチド誘導体は、本明細書における組成物における使用について企図される。これらのペプチド誘導体は、AATの最後の80のカルボキシ末端由来アミノ酸を含有するアミノ酸ペプチド、

0088

、またはその任意の組み合わせを含んでいてもよいが、これらに限定されない。ある実施形態において、AATのカルボキシ末端ペプチドは、配列番号33によって同定される、天然に存在するMタイプのアミノ酸配列に対して、80%、または85%、または90%、または95%、または99%同一である。ある実施形態において、約2、約3、もしくは約4、または約5つのアミノ酸が、Mタイプの配列のカルボキシ末端由来の80アミノ酸長と異なり得る(たとえば様々な点変異)。

0089

ある実施形態は、配列番号32または配列番号48の構築物の組成物を含む。これらの実施形態に従って、組成物は、医薬組成物とすることができる。

0090

ある実施態様において、SEC受容体に結合することができる組換えAATもしくはAAT由来のカルボキシ末端ペプチドの組成物またはAAT様の活性を有する組成物が、その必要のある被験体に対して投与されてもよい。本明細書において開示されるように、AATのカルボキシ末端領域は、配列番号31または配列番号33または他のヒトAAT分子または他の天然に存在するAAT分子の最後の80アミノ酸を含む。他の実施形態において、AATに由来するペプチドは、5アミノ酸長、10アミノ酸長、20アミノ酸長、25アミノ酸長、30アミノ酸長、35アミノ酸長、40アミノ酸長、50アミノ酸長、および80アミノ酸長までのAAT分子を含むことができ、企図されるペプチドのいずれも、有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有さず、AATのカルボキシ末端に由来し、かつ放射線を受けている被験体または偶然もしくは他の原因によって多量の線量の放射線に対して曝露された被験体を治療するために使用することができる。

0091

一実施形態において、構築物は、SEC受容体と関係するまたは結合する化合物を含んでいてもよい。列挙される方法のいくつかにおいて、有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有しない、AAT変異体またはAAT由来ペプチド(たとえば哺乳動物由来の)は、AATに対応するカルボキシ末端アミノ酸ペプチドを含む、一連のペプチドを含むことができる、本発明の組成物および使用内での使用のために企図される。そのうえ、5アミノ酸長、または10アミノ酸長、または20アミノ酸長、または30アミノ酸長、またはそれ以上のアミノ酸の組み合わせもまた、使用することができる。たとえば、1つまたはそれより多い5アミノ酸長または10アミノ酸長または20アミノ酸長などは、配列番号1として示される天然に存在するAATのAA 315から始まり、AA 394で終わる連続アミノ酸を含むことができる。本明細書において企図されるように、カルボキシ端に向う、配列の後半部分は、カルボキシ末端と呼ばれる。ある実施形態において、カルボキシル末端から後方に行くAATのカルボキシルドメインは、異なる種の間でほとんど保存されており、AATのプロテアーゼ結合ドメインに関与しないアミノ酸として定義される。そのうえ、他の実施形態において、AATプロテアーゼ結合ドメインは、分子のプロテアーゼ機能を低下させるまたは排除するために変異させることができ、この分子は、本明細書において企図される任意の組成物において使用することができる。他の実施形態において、変異させたAAT関連分子は、その抗炎症および/または免疫調節性の効果を保持することができる。カルボキシルドメインが、他のAAT活性を有する非プロテアーゼ結合ドメインであるということもまた、本明細書において企図される。当業者は、AATの非プロテアーゼ結合ドメインを理解するであろう。

0092

上記に列挙される方法のそれぞれにおいて、本明細書における組成物は、AATのカルボキシ末端に由来するペプチドを含んでいてもよい。ある実施形態において、本明細書における方法および組成物において使用されるAAT結合分子は、配列番号1、天然に存在するAAT(血清から単離されたAATのおよそ90%を構成する394AA長の分子)、他のAAT M−タイプ、または他のAAT分子の組成物を含むことができるが、これらに限定されない。

0093

本明細書における使用のうちで、本明細書において開示される融合分子の組換え体との比較および/またはコントロールのための市販で入手可能な製剤は、Aralast(商標)(Baxter)、Zemaira(商標)(Aventis Behring)、Prolastin(商標)もしくはProlastinC(商標)(Talecris)、Aprotonin(商標)もしくはTrasylol(商標)(Bayer Pharmaceutical Corporation)、Ulinistatin(商標)(Ono Pharmaceuticals, Inc.)、ならびに吸入および/もしくは注射用AAT(Kamada, Ltd.、Israel)または他の市販で入手可能なAAT組成物またはその任意の組み合わせを含むことができる。

0094

他の実施形態は、ヒトAATの変異体に関し、変異体は、抗炎症活性が増大している。変異体を生成するための、当技術分野において知られている任意の方法が、企図される。いくつかの実施形態は、有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有しないhATTを生成するために部位特異的変異誘発を使用することを含む(実施例のセクションおよびpEF−hAATを参照されたい)。いくつかの実施形態において、組成物は、変異ヒトアルファ−1抗トリプシン(hAAT)を有する医薬組成物とすることができ、AATが、AATの反応中心ループ(RCL)内のAATのプロテアーゼ結合部位に1つまたはそれより多い点変異を有するAATを含む。これらの1つ以上点変異は、コントロールヒトAATと比較して、AATのセリンプロテアーゼ阻害活性を有意に低下させるまたは排除することができる。他の方法は、hAATの加熱などのような他の破壊方法によってhAATのセリンプロテアーゼ阻害領域を破壊することまたはセリンプロテアーゼ阻害剤活性を排除するまたは劇的に低下させるための、RCL内の357位でのシステイン残基へのプロリンの修飾によりRCL変異体などのような他の変異体を生成することを含む。ある実施形態において、融合分子は、FC(たとえばIgG1、2、3、または4)を、RCL内の1つまたはそれより多いアミノ酸(たとえば天然のAATのアミノ酸355〜363)に1つまたはそれより多い点変異を有するAAT変異体に連結することを含むことができ、AAT変異体が、有意なセリンプロテアーゼ阻害活性を有さず、RCLはインタクトなままである。

0095

医薬組成物
本明細書における実施形態は、インビボにおける医薬投与に適した、生物学的に適合性の形態における被験体に対する組成物の投与を提供する。「インビボにおける投与に適した、生物学的に適合性の形態」によって、活性な作用物質の治療効果がいかなる毒作用にも勝る、投与されることになっている活性な作用物質の形態(たとえば、実施形態の医薬化学物質、タンパク質、遺伝子、抗体など)が意味される。治療上活性な量の治療用組成物の投与は、所望の結果を実現するのに必要である投薬量のおよび期間の有効な量として定義される。たとえば、化合物の治療上活性な量は、個体の疾患状態年齢性別、および体重ならびに抗体が個体において所望の応答を誘発する能力などのような因子によって異なってもよい。投薬量レジメンは、最適な治療応答をもたらすように調節されてもよい。

0096

AATまたはそのペプチドフラグメントもしくはそのアナログもしくはその変異体もしくはその機能的誘導体(たとえば、実施形態のいくつかの医薬化学物質、タンパク質、ペプチド)を含有する医薬組成物が、たとえば、皮下、静脈内、心臓内、冠内筋肉内によって、経口投与によって、吸入、経皮適用、膣内適用、局所適用内もしくは直腸内投与によって、被験体に対して投与されてもよい。投与のルートに依存して、活性化合物は、化合物を不活性化し得る酵素、酸、および他の天然の条件による分解から化合物を防御するための材料中にコーティングされてもよい。好ましい実施形態において、化合物は、経口的に投与されてもよい。他の好ましい実施形態において、化合物は、静脈内に投与されてもよい。ある特定の実施形態において、組成物は、吸入などのように、鼻腔内に投与されてもよい。

0097

本明細書において開示されるいくつかの実施形態は、癌を有するまたは癌治療が疑われる被験体に対して、1つまたはそれより多い化学療法剤(たとえば本明細書において開示される組成物に加えて)を送達するためにステントまたはカテーテルを使用することに関する。腫瘍部位に1つまたはそれより多い作用物質を直接、送達することができる、当技術分野において知られている任意のステントまたは他の送達方法が、企図される。これらの送達技術は、単独でまたは他の送達方法と組み合わせて使用することができる。

0098

化合物(たとえばペプチド、タンパク質、融合タンパク質、またはその混合物)は、適切なキャリアまたは希釈剤において被験体に対して投与され、酵素阻害剤と共にまたはリポソームなどのような適切なキャリアにおいて同時投与されてもよい。本明細書において使用される用語「薬学的に許容され得るキャリア」は、食塩水および水性バッファー溶液などのような希釈剤を含むことが意図される。その不活性化を妨げるための材料により化合物をコーティングするまたはそれと共に化合物を同時投与することが必要であってもよい。活性な作用物質はまた、非経口的にまたは腹腔内に投与されてもよい。分散液はまた、グリセロール液体ポリエチレングリコール、およびその混合物において、ならびに油において調製することもできる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を妨げるために保存剤を含有してもよい。

0099

注射用の使用に適した医薬組成物は、当技術分野において知られている手段によって投与されてもよい。たとえば、滅菌注射用溶液または分散液の即時調製のための滅菌水溶液水溶性である場合)または分散液および滅菌粉末が、使用されてもよい。

0100

滅菌注射用溶液は、必要に応じて、上記に列挙される成分のうちの1つまたはその組み合わせと共に、適切な溶剤中に、必要とされる量で、活性化合物(たとえばセリンプロテアーゼ活性を低下させる化合物)を組み込み、その後、ろ過滅菌(filtered sterilization)することによって、調製することができる。

0101

水性組成物は、薬学的に許容され得るキャリアまたは水性媒体中に溶解されたまたは分散された、有効量の治療用化合物、ペプチド、エピトープコア領域刺激物質、阻害剤、およびその他同種のものを含むことができる。本明細書において開示される化合物および生体物質は、当技術分野において知られている手段によって精製することができる。遊離塩基または薬理学的に許容され得る塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどのような界面活性剤と適切に混合された水において調製することができる。

0102

製剤に際して、溶液は、投薬製剤と適合性の方式でおよび治療上有効である量で投与されるであろう。製剤は、上記に記載される注射用溶液のタイプなどのような、様々な剤形で容易に投与される。緩効性カプセル徐放性微粒子、およびその他同種のものもまた用いることができることが企図される。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与にとりわけ適している。

0103

活性治療剤は、用量当たり約0.0001〜1.0ミリグラムまたは約0.001〜0.1ミリグラムまたは約0.1〜1.0またはさらに約1〜10グラムを含むように混合物内に製剤されてもよい。1回の用量または複数の用量はまた、毎日、週に2回(biweekly)、毎週、隔月などのように、所定の条件について適切なスケジュールで投与することもできる。医薬組成物は、副作用を調整するのに有効である量でおよび頻度で投与される。治療の正確な投薬量および継続期間は、知られている試験プロトコールを使用してまたは当技術分野において知られているモデル系において組成物を試験し、それから推定することによって、経験的に決定されてもよい。投薬量はまた、状態の重症度により変化してもよい。ある実施形態において、組成物の範囲は、被験体に対して毎日または毎週、導入される10〜75mg/kgとすることができる。α1−抗トリプシン、ペプチド、またはα1−抗トリプシンもしくはペプチドと同様の活性を有する薬剤の治療有効量はまた、モル濃度で測定することもでき、約1nM〜約2mMの範囲にわたることができる。

0104

他の実施形態において、経鼻溶液もしくは噴霧剤、エアロゾル、または吸入剤が、関心のある化合物を送達するために使用されてもよい。投与の他の様式に適したさらなる製剤は、坐剤および腟坐薬を含んでいてもよい。直腸腟坐薬または坐剤もまた、使用されてもよい。一般に、坐剤については、従来のバインダーおよびキャリアは、たとえばポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを含んでいてもよく、そのような坐剤は、0.5%〜10%、好ましくは1%〜2%の範囲で活性成分を含有する混合物から形成されてもよい。

0105

リポソームまたは微粒子は、治療用送達系として使用することができ、知られている実験用の技術に従って調製することができる。そのうえ、以前に記載されるように調製された乾燥脂質または凍結乾燥リポソームは、活性な作用物質(たとえば核酸、ペプチド、タンパク質、または化学薬品)の溶液および当業者らに知られている、適した溶剤により適切な濃度まで希釈された溶液において、還元されてもよい。被包された活性な作用物質の量は、標準的な方法に従って決定することができる。

0106

いくつかの実施形態において、医薬構築物組成物は、有意なセリンプロテアーゼ阻害剤活性を有さないが、その他のα1−抗トリプシン活性を有する、AAT分子に由来する構築物またはそのアナログに関し、被験体を治療するために、1回の治療量、急性の方式、または慢性の方式で使用されてもよい。たとえば、本明細書において企図される融合ポリペプチドは、有意なプロテアーゼ阻害活性を有しない融合ポリペプチドとすることができる。

0107

ある実施形態において、本明細書における組成物は、経口的に、全身的に、移植片を介して、徐放もしくは緩効性組成物(たとえばゲル、微粒子など)、静脈内に、局所的に、鞘内に、皮下に、吸入によって、経鼻的に、もしくは当技術分野において知られている他の手段、またはその組み合わせによって、投与することができる。

0108

発現タンパク質および構築物
一旦、標的遺伝子または遺伝子の一部分が決定されたら、遺伝子は、適切な発現系の中に挿入することができる。遺伝子は、大量のポリペプチド産物を生成するために、任意の数の様々な組換えDNA発現系において発現することができ、これは、次いで、本明細書において開示される組成物および方法において精製し、使用することができる。

0109

当業者に知られている発現系の例は、大腸菌などのような細菌、Pichia pastorisなどのような酵母バキュロウイルス、およびCosまたはCHO細胞においてなどの哺乳動物発現系を含む。完全な遺伝子を発現することができ、またはその代わりに、ポリペプチドの一部分をコードする遺伝子のフラグメントを産生することができる。

0110

融合ポリペプチドをコードするAAT遺伝子または遺伝子フラグメントは、標準的なサブクローニング技術によって発現ベクターの中に挿入されてもよい。融合タンパク質として組換えポリペプチドを産生する大腸菌発現ベクターが、使用され、タンパク質の急速なアフィニティー精製を可能にしてもよい。そのような融合タンパク質発現系の例は、グルタチオンS−トランスフェラーゼ系(Pharmacia、Piscataway、NJ)、マルトース結合タンパク質系(NEB、Beverley、MA)、FLG系(IBI、New Haven、CT)、および6xHis系(Qiagen、Chats worth、CA)である。

0111

ポリペプチドのアミノ酸配列改変体もまた、調製されてもよい。これらは、たとえば、集団内の天然の変異により生じるポリペプチドのマイナーな配列改変体であってもよく、またはそれらは、他の種において見つけられるホモログであってもよい。それらはまた、天然に生じないが、十分に類似しており、同様に機能するおよび/またはポリペプチドの天然の形態と交差反応する免疫応答を誘発する配列であってもよい。配列改変体は、膜貫通配列を除去するための、本明細書において記載されるものなどのような、部位特異的変異誘発の標準的な方法によって調製されてもよい。

0112

ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、置換、挿入、または欠失改変体であってもよい。欠失改変体は、機能または免疫原性活性にとって本質的ではない、天然のタンパク質の1つまたはそれより多い残基を欠き、膜貫通配列を欠く改変体によって例証される。

0113

原核生物系または真核生物系における発現のためのDNAセグメント(複数可)の遺伝子操作は、組換え発現において当業者らに一般に知られている技術によって実行されてもよい。事実上、任意の発現系が、主張される核酸配列の発現において用いられてもよいことが考えられる。

0114

本明細書において使用されるように、用語「遺伝子操作された」および「組換え」細胞は、cDNAまたは遺伝子などのような外因性のDNAセグメントまたは遺伝子が人の手を通して導入された細胞を指すことが意図される。そのため、遺伝子操作された細胞は、組換えで導入された外因性のDNAセグメントまたは遺伝子を含有しない天然に存在する細胞から識別が可能である。組換え細胞は、導入されたcDNAまたはゲノム遺伝子を有するものを含み、また、特定の導入された遺伝子と天然に関連しない異種プロモータに隣接して位置する遺伝子をも含む。

0115

変異体か野生型かにかかわらず、組換えコードタンパク質またはペプチドを発現するために、本明細書におけるいくつかの実施形態に従って、1つまたはそれより多いプロモータのコントロール下のまたはそれに適切に作用するように連結された、主張される単離核酸のうちの1つを含む発現ベクターを調製することができる。プロモータ「のコントロール下に」コード配列を持ってくるために、一般に、約1〜約50ヌクレオチド転写リーディングフレーム転写開始部位の5’端を、選ばれたプロモータの「下流」(つまり3’)に位置づける。「上流の」プロモータは、DNAの転写を刺激し、コードされた組換えタンパク質の発現を促す。これは、この状況における「組換え発現」を意味する。

0116

多くの標準的な技術は、様々な宿主−発現系においてタンパク質またはペプチド発現を実現するために、適切な核酸および転写/翻訳コントロール配列を含有する発現ベクターを構築するのに利用可能である。発現に利用可能な細胞型は、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNA発現ベクターにより形質転換された大腸菌およびB.subtilisなどのような細菌を含むが、これらに限定されない。

0117

原核生物宿主のある例は、大腸菌株RR1、大腸菌LE392、大腸菌B、大腸菌X 1776(ATCCNo.31537)ならびに大腸菌W3110(F−、lambda−、原栄養、ATCC No.273325);Bacillus subtilisなどのようなバチルス;ならびにSalmonella typhimurium、Serratia marcescens、および様々なPseudomonas種などのような他の腸内細菌科である。

0118

一般に、宿主細胞と適合性の種に由来するレプリコンおよびコントロールの配列を含有するプラスミドベクターは、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは、通常、複製部位および形質転換細胞において表現型選択をもたらすことができるマーキング配列を持つ。たとえば、大腸菌は、多くの場合、大腸菌種に由来するプラスミドであるpBR322を使用して、形質転換される。pBR322は、アンピシリンおよびテトラサイクリン抵抗性についての遺伝子を含有し、したがって、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。pBRプラスミドまたは他の微生物プラスミドまたはファージはまた、それ自体のタンパク質の発現のために微生物生物によって使用され得るプロモータをも含有しなければならない、またはそれを含有するように修飾されなければならない。

0119

そのうえ、宿主微生物と適合性のレプリコンおよびコントロール配列を含有するファージベクターは、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用されてもよい。たとえば、ファージラムダGEM(商標)−11は、大腸菌LE392などのような宿主細胞を形質転換するために使用されてもよい組換えファージベクターを作製する際に利用されてもよい。

0120

さらに有用なベクターは、pINベクター(Inouyeら、1985);ならびに後半の精製および分離または切断のためにグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)可溶性融合タンパク質を生成する際の使用のためのpGEXベクターを含む。他の適した融合タンパク質は、β−ガラクトシダーゼユビキチン、またはその他同種のものを有するものである。

0121

組換えDNA構築において最も共通して使用されるプロモータは、β−ラクタマーゼペニシリナーゼ)、ラクトース、およびトリプトファン(trp)プロモータ系を含む。これらが最も共通して使用されるが、他の微生物プロモータが、発見され、利用されており、それらのヌクレオチド配列に関する細部について、公開されており、当業者らが、プラスミドベクターとそれらを機能的にライゲーションすることが可能である。

0122

Saccharomycesにおける発現については、プラスミドYRp7が、たとえば、共通して使用される(Stinchcombら、1979;Kingsmanら、1979;Tschemperら、1980)。このプラスミドは、トリプトファンにおいて成長するための能力を欠く酵母の変異株、たとえばATCCNo.44076またはPEP4−1(Jones、1977)に対して選択マーカーを提供するtrp1遺伝子を既に含有している。次いで、酵母宿主細胞ゲノム特質としてのtrp1機能傷害の存在は、トリプトファンの非存在下における増殖によって形質転換を検出するための有効な環境を提供する。

0123

酵母ベクターにおける適した促進配列は、3−ホスホグリセレートキナーゼ(Hitzemanら、1980)またはエノラーゼグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼヘキソキナーゼピルビン酸デカルボキシラーゼホスホフルクトキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、3−ホスホグリセリン酸ムターゼピルビン酸キナーゼトリオースリン酸イソメラーゼグルコースリン酸イソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどのような他の解糖酵素(Hessら、1968;Hollandら、1978)についてのプロモータを含む。適した発現プラスミドを構築する際に、これらの遺伝子と結合した終結配列もまた、mRNAポリアデニル化および終結をもたらすように、発現されることが所望される配列の3’に、発現ベクターの中にライゲーションされる。

0124

増殖条件によってコントロールされる転写についてさらなる利点を有する他の適したプロモータは、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロームC、酸性ホスファターゼ窒素代謝と関連する分解酵素、および前述のグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用を担う酵素についてのプロモータ領域を含む。

0125

微生物に加えて、多細胞生物に由来する細胞の培養物もまた、宿主として使用されてもよい。原則として、脊椎動物培養物由来か無脊椎動物培養物由来かにかかわらず、任意のそのような細胞培養が、使用可能である。哺乳動物細胞に加えて、これらは、組換えウイルス発現ベクター(たとえばバキュロウイルス)により感染させた昆虫細胞系;および組換えウイルス発現ベクター(たとえばカリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)により感染させたまたは1つまたはそれより多いコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(たとえばTiプラスミド)により形質転換された植物細胞系を含む。

0126

有用な昆虫系において、オウグラフカリフォルニア多汗症ウイルス(Autographa californica nuclear polyhidrosis virus)(AcNPV)は、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。ウイルスは、ヨトウガ細胞において成長する。単離された核酸コード配列は、ウイルスの非本質的な領域(たとえばポリドリン遺伝子)の中にクローニングされ、AcNPVプロモータ(たとえばポリヘドリンプロモータ)のコントロール下に配置される。コード配列の挿入の成功は、ポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉塞組換えウイルス(つまり、ポリヘドリン遺伝子によってコードされる、タンパク質性のコートを欠くウイルス)の産生をもたらす。次いで、これらの組換えウイルスは、挿入された遺伝子が発現されるヨトウガ細胞を感染させるために使用される(たとえば米国特許第4,215,051号(Smith))。

0127

有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、VEROおよびHeLa細胞チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株、W138、BHK、COS−7、293、HepG2、3T3、RIN、ならびにMDCK細胞株である。そのうえ、挿入された配列の発現を調整する、または所望される特定の様式において遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞株が、選ばれてもよい。タンパク質産物のそのような修飾(たとえばグリコシル化)およびプロセシング(たとえば切断)は、コードされたタンパク質の機能にとって重要であり得る。

0128

様々な宿主細胞は、タンパク質の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特有な特定のメカニズムを有する。適切な細胞株または宿主系は、発現される外来タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確実にするように選ばれてもよい。哺乳動物細胞における使用のための発現ベクターは、通常、任意の必要なリボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列と共に、複製開始点(必要に応じて)、発現されることになっている遺伝子の前に位置するプロモータを含む。複製開始点は、SV40もしくは他のウイルス(たとえばポリオーマ、アデノ、VSV、BPV)起源に由来し得るものなど、外因性の起点を含めるためのベクターの構築によって提供されてもよく、または宿主細胞染色体複製メカニズムによって提供されてもよい。ベクターが宿主細胞染色体の中に統合される場合、後者で十分であることが多い。

0129

プロモータは、哺乳動物細胞(たとえばメタロチオネインプロモータ)または哺乳動物ウイルス(たとえばアデノウイルス後期プロモータ;ワクシニアウイルス7.5Kプロモータ)のゲノムに由来してもよい。さらに、所望の遺伝子配列と通常、関連しているプロモータまたはコントロール配列を利用することもまた可能であり、望ましいかもしれない、ただし、そのようなコントロール配列が、宿主細胞系と適合性であることを条件とする。

0130

多くのウイルスベースの発現系は、本明細書において企図される分子を産生するために利用されてもよく、たとえば、共通して使用されるプロモータは、ポリオーマ、アデノウイルス2、および、最も頻繁にはシミアンウイルス40(SV40)に由来する。SV40ウイルスの初期および後期プロモータは、両方とも、SV40ウイルス複製開始点もまた含有するフラグメントとしてウイルスから容易に得られるので、特に有用である。より小さなまたはより大きなSV40フラグメントもまた、使用されてもよい、ただし、ウイルス複製開始点に位置する、Hind III部位〜Bgl I部位に伸長する、およそ250bpの配列が含まれることを条件とする。

0131

アデノウイルスが発現ベクターとして使用される、ある場合において、コード配列は、アデノウイルス転写/翻訳コントロール複合体、たとえば後期プロモータおよび三連リーダー配列(tripartite leader sequence)にライゲーションされてもよい。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロにおけるまたはインビボにおける組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入されてもよい。ウイルスゲノムの非本質的な領域(たとえば領域E1またはE3)における挿入は、生存可能であるが、侵襲性ではなく、感染した宿主においてタンパク質を発現することができる組換えウイルスをもたらすであろう。

0132

特定の開始シグナルもまた、主張される単離核酸コード配列の効率的な翻訳のために必要とされてもよい。これらのシグナルは、ATG開始コドンおよび隣接する配列を含む。ATG開始コドンを含む外因性の翻訳コントロールシグナルは、そのうえ、提供される必要があってもよい。当業者は、直ちに、これを決定し、必要なシグナルを提供することができるであろう。開始コドンが、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコード配列のリーディングフレームとインフレーム(またはインフェーズ(in−phase))でなければならないことはよく知られている。これらの外因性の翻訳コントロールシグナルおよび開始コドンは、天然および合成の、様々な起源のものであってもよい。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントまたは転写ターミネータの包含によって増強されてもよい。

0133

ある実施形態において、真核生物宿主細胞が、所望されるポリペプチドを発現することができ、多くの場合、その目的のために使用される。それらは、細胞の中に、好ましくは発現カセットの形態をした、本明細書において開示されるDNA分子の導入によって、得ることができる。ある実施形態において、発現カセットが、関心のある宿主細胞のゲノムに統合され、これは、様々な宿主細胞において様々に位置することができ、選択により、トランスジーンが適した位置に統合されるクローンが提供され、発現レベル、安定性、および増殖特質などの点から、所望の特性を有する宿主細胞クローンがもたらされるであろう。標的分子のDNAを含有する細胞についての選択は、当業者によって知られている、ルーチン的な方法を使用して、選択可能マーカーポリペプチドについて選択することによって実行することができる。

0134

宿主細胞は、当業者に知られている標準的な手順に従って、選択し、増殖させることができる安定性のクローン由来のものである。そのようなクローン培養物は、関心のあるポリペプチドを産生することができる。

0135

細胞において発現されることになっている核酸の導入は、当業者に知られているいくつかの方法のうちの1つによって行うことができ、また、導入されることとなる核酸の構成に依存する。方法は、トランスフェクション、感染、注射、形質転換、およびその他同種のものを含むことができるが、これらに限定されない。関心のあるポリペプチドを発現する、適した宿主細胞は、当技術分野において知られている任意の選択プロセスによって得ることができる。

0136

ある実施形態において、関心のあるDNA分子が、真核生物宿主細胞のゲノムの中に統合される。選択可能マーカーポリペプチドの存在についての、よって発現についての選択は、細胞を最初に得る間に実行することができる。ある実施形態において、選択作用物質は、選択可能マーカーポリペプチドを発現する細胞を選択するのに十分な濃度で、またはより低い濃度で、培養の間の少なくとも一部の時間、培養培地中に存在する。ある実施形態において、ポリペプチドが発現される場合、選択作用物質は、産生段階の間に培養培地中に、もはや存在しない。関心のあるポリペプチドは、任意のペプチドまたはタンパク質とすることができ、単量体タンパク質または多量体タンパク質(たとえば二量体)(の一部)であってもよい。多量体タンパク質は、少なくとも2つのポリペプチド鎖を含む。

0137

ある態様において、関心のあるポリペプチドを発現する宿主細胞を生成するための方法であって、複数の前駆細胞の中に、本発明のDNA分子または発現カセットを導入するステップ、選択条件下で、生成される細胞を培養するステップ、および関心のあるポリペプチドを産生する少なくとも1つの宿主細胞を選択するステップを含む方法が提供される。

0138

関心のある、1つまたはそれより多いポリペプチドを産生するための方法であって、本発明の宿主細胞を培養するステップを含む方法もまた、提供される。細胞の培養は、細胞が、代謝する、および/または成長する、および/または分裂する、および/または関心のある組換えタンパク質を産生するのを可能にするように行われる。これは、当技術分野においてよく知られている方法によって達成することができ、細胞に栄養素を提供することを含むが、これらに限定されない。培養は、たとえば、回分系、流加系、灌流系などのような連続系、およびその他同種のものを使用して、皿、ローラーボトルにおいて、またはバイオリアクターにおいて行うことができる。細胞培養を通して組換えタンパク質の大規模(連続)産生を実現するために、懸濁液中で成長することができる細胞を得ることが当技術分野において好ましく、動物もしくはヒト由来の血清または動物もしくはヒト由来の血清構成成分の非存在下において培養することができる細胞を得ることが好ましい。

0139

細胞を成長させるまたは増大させるための条件(たとえばTissue Culture、Academic Press、Kruse and Paterson, editors(1973)を参照されたい)および組換え産物の発現のための条件は、当業者に知られている。一般に、哺乳動物細胞培養物の生産性最大限にするための原理、プロトコール、および実践的技術は、Mammalian Cell Biotechnology:a Practical Approach(M.Butler, ed.、IRL Press、1991)において見つけることができる。

0140

ある実施形態において、発現タンパク質は、細胞からまたは培養培地からまたはその両方から、収集される(単離される)。次いで、それは、当技術分野において一般に知られている方法によって、知られている方法、たとえばろ過、カラムクロマトグラフイーなどを使用して、さらに精製されてもよい。

0141

真核生物の発現において、典型的に、適切なポリアデニル化部位(たとえば5’−AATAAA−3’)が、もとのクローニングセグメント内に含有されていなかった場合、転写ユニットの中に組み込まれることもまた、所望されるであろう。典型的に、ポリA追加部位は、転写終結前の位置の、タンパク質の終結部位の約30〜2000ヌクレオチド「下流に」配置される。

0142

組換えタンパク質の長期間、高収率の産生のために、安定性の発現を、使用することができる。たとえば、タンパク質をコードする構築物を安定して発現する細胞株は、遺伝子操作されてもよい。ウイルス複製開始点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞は、適切な発現コントロールエレメント(たとえばプロモータ、エンハンサー、配列、転写ターミネータ、ポリアデニル化部位など)および選択可能マーカーによってコントロールされるベクターにより形質転換されてもよい。外来性DNAの導入の後に、遺伝子操作された細胞は、1〜2日間、濃縮培地において成長させてもよく、次いで、選択培地切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択可能マーカーは、選択に対する抵抗性を付与し、細胞がそれらの染色体の中に安定してプラスミドを統合し、成長して、さらにはクローニングされ、細胞株へと増やされてもよいフォーカスを形成するのを可能にする。

0143

それぞれtk−、hgprt−、またはaprt−細胞において、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むが、これらに限定されない多くの選択系が、使用されてもよい。さらに、代謝拮抗物質抵抗性は、メトトレキサートに対する抵抗性を付与するdhfr;ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するgpt;アミノグリコシドG−418に対する抵抗性を付与するneo、およびヒグロマイシンに対する抵抗性を付与するhygro、または当技術分野において知られている任意の他の方法についての選択の基礎として使用されてもよい。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ