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図面 (10)

課題

抗CD20糖操作抗体群およびその使用の提供。

解決手段

本開示は、Fcのそれぞれに同じN−グリカンを有する抗CD20IgG分子の均一な集団を含む新規クラスの抗CD20モノクローナル抗体に関する。本発明の抗体は、抗CD20モノクローナル抗体からFc糖鎖工学によって作製することができる。重要なことに、本発明の抗体は、糖鎖工学により操作されていない対応するモノクローナル抗体と比較してADCC活性が増大し、Fc受容体結合親和性が増大した、改善された治療的価値を有する。

概要

背景

免疫グロブリンおよびFc受容体は、免疫系の重要な糖タンパク質成分である。Fc受容体は、抗体分子のFc(エフェクター)領域に結合し、自然免疫系および適応免疫系内で情報を伝達する。抗体、特にIgGFc領域におけるグリコシル化は、抗体の活性の調節において重要な役割を果たす。同一の重鎖内のN−グリカンは、構造的完全性、Fc受容体との情報伝達および下流の免疫学的応答を維持するために重要であることが示されている。

Fcグリコシル化は、治療用モノクローナル抗体の分野において重要な主題となっている。Fcグリコシル化により、Fc受容体結合および補体活性化などのFcエフェクター機能を有意に改変する、したがって、治療用抗体のin vivoにおける安全性および有効性プロファイルに影響を及ぼすことができる。

遺伝子操作に基づくいくつかの発現系により治療用モノクローナル抗体が産生されることが報告されている。これらとしては、Pichia pastorisなどの酵母昆虫細胞株、および、さらには細菌が挙げられる。しかし、これらの発現系には、治療用抗体のエフェクター機能に負の影響を及ぼす可能性があるいくつかの欠点がある。

大多数生物製剤は、所望のグリコシル化パターンを有するタンパク質送達し、したがって、免疫原性の低下およびより高いin vivoにおける有効性および安定性を確実にするために、哺乳動物細胞培養系において産生される。CHO細胞またはNS0細胞などの非ヒト哺乳動物発現系は、複雑な、ヒト型グリカンを付加するために必要な機構を有する。しかし、これらの系において産生されるグリカンは、ヒトにおいて産生されるグリカンとは異なる可能性がある。それらのグリコシル化機構により、多くの場合、タンパク質フォールディングを変更させ、免疫原性を誘導し、薬物の循環寿命を短縮させる可能性がある望ましくない炭水化物決定因子が付加される。特に、N−アセチルノイラミン酸のようなシアル酸は大多数の哺乳動物細胞では効率的に付加されず、これらの細胞では6−結合が欠けている。シアル酸の移行に必要な種々の酵素活性を用いた細胞の工学的操作では、タンパク質薬にヒト様パターングリコフォーム成功裏にもたらすことが未だできていない。現在まで、動物細胞または糖タンパク質を工学的に操作してヒトタンパク質と可能な限り密接に類似した、高度にシアリル化された産物をもたらすことが必要とされている。

さらに、哺乳動物細胞培養では、全てが同じ性質を有するとは限らないグリコシル化パターンの不均一な混合物が送達される。治療用タンパク質の安全性、有効性および血清中半減期のような性質は、これらのグリコシル化パターンの影響を受ける可能性がある。

概要

抗CD20糖操作抗体群およびその使用の提供。本開示は、Fcのそれぞれに同じN−グリカンを有する抗CD20IgG分子の均一な集団を含む新規クラスの抗CD20モノクローナル抗体に関する。本発明の抗体は、抗CD20モノクローナル抗体からFc糖鎖工学によって作製することができる。重要なことに、本発明の抗体は、糖鎖工学により操作されていない対応するモノクローナル抗体と比較してADCC活性が増大し、Fc受容体結合親和性が増大した、改善された治療的価値を有する。なし

目的

さらに、本開示は、単独療法、または実質的に均一な本明細書に記載の糖操作抗体群と他の抗体および/もしくは他の治療剤とを含む併用療法に適した組合せ医薬組成物も提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

明細書に記載の発明。

技術分野

0001

関連出願
この出願は、2014年5月27日に出願された米国仮出願連続番号第(USSN)62/003,136号、2014年7月2日に出願されたUSSN 62/020,199号および2015年1月30日に出願されたUSSN 62/110,338号への優先権の利益を主張する。これらそれぞれの内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。

0002

CD20に結合する抗体、抗体バリアント、その抗原結合性断片およびコンジュゲート、ならびに関連する組成物および使用方法が本明細書に開示されている。使用方法としては、限定することなく、がん療法および診断が挙げられる。

背景技術

0003

免疫グロブリンおよびFc受容体は、免疫系の重要な糖タンパク質成分である。Fc受容体は、抗体分子のFc(エフェクター)領域に結合し、自然免疫系および適応免疫系内で情報を伝達する。抗体、特にIgGFc領域におけるグリコシル化は、抗体の活性の調節において重要な役割を果たす。同一の重鎖内のN−グリカンは、構造的完全性、Fc受容体との情報伝達および下流の免疫学的応答を維持するために重要であることが示されている。

0004

Fcグリコシル化は、治療用モノクローナル抗体の分野において重要な主題となっている。Fcグリコシル化により、Fc受容体結合および補体活性化などのFcエフェクター機能を有意に改変する、したがって、治療用抗体のin vivoにおける安全性および有効性プロファイルに影響を及ぼすことができる。

0005

遺伝子操作に基づくいくつかの発現系により治療用モノクローナル抗体が産生されることが報告されている。これらとしては、Pichia pastorisなどの酵母昆虫細胞株、および、さらには細菌が挙げられる。しかし、これらの発現系には、治療用抗体のエフェクター機能に負の影響を及ぼす可能性があるいくつかの欠点がある。

0006

大多数生物製剤は、所望のグリコシル化パターンを有するタンパク質送達し、したがって、免疫原性の低下およびより高いin vivoにおける有効性および安定性を確実にするために、哺乳動物細胞培養系において産生される。CHO細胞またはNS0細胞などの非ヒト哺乳動物発現系は、複雑な、ヒト型グリカンを付加するために必要な機構を有する。しかし、これらの系において産生されるグリカンは、ヒトにおいて産生されるグリカンとは異なる可能性がある。それらのグリコシル化機構により、多くの場合、タンパク質フォールディングを変更させ、免疫原性を誘導し、薬物の循環寿命を短縮させる可能性がある望ましくない炭水化物決定因子が付加される。特に、N−アセチルノイラミン酸のようなシアル酸は大多数の哺乳動物細胞では効率的に付加されず、これらの細胞では6−結合が欠けている。シアル酸の移行に必要な種々の酵素活性を用いた細胞の工学的操作では、タンパク質薬にヒト様パターングリコフォーム成功裏にもたらすことが未だできていない。現在まで、動物細胞または糖タンパク質を工学的に操作してヒトタンパク質と可能な限り密接に類似した、高度にシアリル化された産物をもたらすことが必要とされている。

0007

さらに、哺乳動物細胞培養では、全てが同じ性質を有するとは限らないグリコシル化パターンの不均一な混合物が送達される。治療用タンパク質の安全性、有効性および血清中半減期のような性質は、これらのグリコシル化パターンの影響を受ける可能性がある。

課題を解決するための手段

0008

本開示は、「糖操作抗体群(glycoantibodies)」という名称新規クラスのモノクローナル抗体の開発に関する。したがって、本開示の一態様は、Fcのそれぞれに同じN−グリカンを有する抗CD20IgG分子の均一な集団を含む抗CD20糖操作抗体群の組成物に関する。本発明の抗CD20糖操作抗体群は、抗CD20モノクローナル抗体からFc糖鎖工学によって作製することができる。重要なことに、抗CD20糖操作抗体群は、糖鎖工学により操作されていない対応するモノクローナル抗体と比較してADCC活性が増大し、Fc受容体結合親和性が増大した、改善された治療的価値を有する。さらに、本開示は、単独療法、または実質的に均一な本明細書に記載の糖操作抗体群と他の抗体および/もしくは他の治療剤とを含む併用療法に適した組合せ医薬組成物も提供する。医薬組成物は、共製剤(coformulation)として投与することもでき、共投与(co−administration)治療レジメンで使用することもできる。

0009

一実施形態では、N−グリカンがFc領域のAsn−297に付着している(CH2ドメイン)。

0010

一部の実施形態では、本明細書に記載の抗CD20糖操作抗体(glycoantibody)は、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。好ましい実施形態では、糖操作抗体は、リツキシマブ(Rituxan(登録商標))の軽鎖配列および重鎖配列を含む。異なる型の抗CD20抗体が2つ存在する(Cragg、M.S.ら、Blood、103巻(2004年)2738〜2743頁;およびCragg、M.S.ら、Blood、101巻(2003年)1045〜1052頁)。例えばリツキシマブ(通常のグリコシル化パターンを有する無フコシル化されていない(non−afocusylated)、糖鎖工学により操作されていない抗体、「RTX」とも称される)のようなI型抗体は、補体媒介性細胞傷害性において強力であるが、例えばトシツモマブ(B1)、11B8、AT80またはヒト化B−Ly1抗体のようなII型抗体は、同時のホスファチジルセリン曝露での、カスパーゼに依存しないアポトーシスによる標的細胞死滅を有効に開始させる。

0011

リツキシマブからFc糖鎖工学によって構築されるいくつかの機能的に活性な抗CD20糖操作抗体群が本明細書に開示されている。重要なことに、最適化グリコフォームを有する抗CD20糖操作抗体群は、リツキシマブと比較して有意に改善されたADCC活性を示す。これは、ADCC活性が増強された、均一にFc−グリコシル化された抗CD20抗体が成功裏に生成されたことを示す最初の報告である。

0012

一部の実施形態では、本明細書に記載の抗CD20糖操作抗体群は、糖操作抗体群がリツキシマブと比較してFcγRIIIAへの結合の増強を示すという点で特徴付けられる。ある特定の実施形態では、本発明による糖操作抗体の、結果として生じるADCC活性は、親抗体のADCC活性と比較して少なくとも8倍増大した、好ましくは少なくとも15倍、より好ましくは少なくとも35倍増大したADCC活性、好ましくは少なくとも50倍増大したADCC活性、好ましくは少なくとも60倍増大したADCC活性、最も好ましくは少なくとも80倍増大したADCC活性である。

0013

一部の実施形態では、本明細書に記載のN−グリカンは二分岐(biantennary)構造を有する。一部の実施形態では、N−グリカンは、バイクティング(bisecting)GlcNAcを含む。

0014

一部の実施形態では、本明細書に記載のN−グリカンは、α2−6末端シアル酸を少なくとも1つ含む。ある特定の実施形態では、N−グリカンは、α2−6末端シアル酸を1つ含む。好ましい実施形態では、N−グリカンは、α2−6末端シアル酸を2つ含む。

0015

一部の実施形態では、本明細書に記載のN−グリカンは、α2−3末端シアル酸を少なくとも1つ含む。ある特定の実施形態では、N−グリカンは、α2−3末端シアル酸を1つ含む。好ましい実施形態では、N−グリカンは、α2−3末端シアル酸を2つ含む。

0016

一部の実施形態では、本明細書に記載のN−グリカンは、ガラクトースを少なくとも1つ含む。ある特定の実施形態では、N−グリカンは、ガラクトースを1つ含む。好ましい実施形態では、N−グリカンは、ガラクトースを2つ含む。

0017

本開示によるN−グリカンは、コアフコースを含まないことが好ましい。

0018

一部の実施形態では、本明細書に記載のN−グリカンは、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAcMan3GlcNAc2およびMan3GlcNAc2からなる群より選択される配列を含む。

0019

好ましい実施形態では、本明細書に記載のN−グリカンは、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2およびGal2GlcNAc3Man3GlcNAc2からなる群より選択される配列を有する。

0020

本開示の別の態様は、本明細書に記載の抗CD20糖操作抗体群の組成物と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を特徴とする。

0021

本開示による医薬組成物は、治療薬に使用することができる。本開示には、患者においてがんを処置するための方法であって、患者に、有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与するステップを含む方法が含まれる。

0022

がんの例としては、これだけに限定されないが、CD20発現がん、B細胞リンパ腫、NHL、前駆Bリンパ芽球性白血病/リンパ腫および成熟B細胞新生物B細胞性慢性リンパ性白血病(CLL)/小リンパ球性リンパ腫(SLL)、B細胞性前リンパ性白血病リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫FL)、低悪性度、中悪性度および高悪性度(FL)、皮膚濾胞中心リンパ腫(cutaneous follicle center lymphoma)、辺縁層B細胞リンパ腫、MALT型辺縁層B細胞リンパ腫、節性辺縁層B細胞リンパ腫、脾臓型辺縁層B細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫形質細胞腫、形質細胞骨髄腫移植リンパ増殖性障害ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および未分化大細胞リンパ腫ALCL)が挙げられる。

0023

ある特定の実施形態では、がんは、非ホジキンリンパ腫などのB細胞リンパ腫である。

0024

さらに、本明細書に記載の医薬組成物は、自己免疫疾患または炎症性疾患を有する患者を処置するために使用することができる。処置方法は、患者に、有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与するステップを含む。ある特定の実施形態では、1つまたは複数の追加的な他の細胞傷害性剤化学療法剤もしくは抗がん剤、またはそのような薬剤の効果を増強する化合物もしくは電離放射線を共投与する。

0025

自己免疫疾患または炎症性疾患の例としては、これだけに限定されないが、関節リウマチ若年性関節リウマチ全身性エリテマトーデスSLE)、ウェゲナー病、炎症性腸疾患特発性血小板減少性紫斑病ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、自己免疫性血小板減少症多発性硬化症乾癬IgA腎症IgM多発ニューロパチー重症筋無力症血管炎糖尿病レイノー症候群(Reynaud’s syndrome)、クローン病潰瘍性大腸炎胃炎橋本甲状腺炎強直性脊椎炎C型肝炎関連クリオグロブリン血症性血管炎慢性限局性脳炎(chronic focal encephalitis)、水疱性類天疱瘡血友病A膜性増殖性糸球体腎炎(membranoproliferative glomerulnephritis)、成人皮膚筋炎および若年性皮膚筋炎、成人多発性筋炎慢性蕁麻疹原発性胆汁性肝硬変視神経脊髄炎グレーブス甲状腺異常症、水疱性類天疱瘡、膜性増殖性糸球体腎炎(membranoproliferative glonerulonephritis)、チャーグ・ストラウス症候群喘息乾癬性関節炎皮膚炎呼吸窮迫症候群髄膜炎、脳炎(encephalitits)、ぶどう膜炎、湿疹アテローム性動脈硬化症白血球接着不全症若年発症糖尿病ライター病ベーチェット病溶血性貧血アトピー性皮膚炎、ウェゲナー肉芽腫症、オーメン症候群、慢性腎不全急性伝染性単核球症HIVおよびヘルペス関連疾患、全身性硬化症シェーグレン症候群(Sjorgen’s syndrome)および糸球体腎炎、皮膚筋炎、ANCA、再生不良性貧血自己免疫性溶血性貧血AIHA)、第VIII因子欠損症、血友病A、自己免疫性好中球減少症キャッスルマン症候群、グッドパスチャー症候群固形臓器移植片拒絶反応移植片対宿主病(GVHD)、自己免疫性肝炎リンパ性間質性肺炎(HIV)、閉塞性細気管支炎(非移植)、ギランバレー症候群、大型血管炎(large vessel vasculitis)、巨細胞(高安)動脈炎中型血管炎(medium vessel vasculitis)、川崎病、および結節性多発性動脈炎が挙げられる。

0026

ある特定の実施形態では、自己免疫疾患または炎症性疾患は関節リウマチである。

0027

本明細書に記載のこれらの処置方法では、抗CD20糖操作抗体群の医薬組成物は、単独で、または、第2の抗体、もしくは化学療法剤もしくは免疫抑制剤などの第2の治療剤と併せて投与することができる。第2の抗体は、CD20もしくは異なるB細胞抗原、またはNK細胞抗原もしくはT細胞抗原に結合する抗体であってよい。

0028

本明細書に記載の抗CD20糖操作抗体群は、FDAによる認可を受けたまたは開発中の抗CD20モノクローナル抗体から生成することができる。抗CD20モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体ヒトモノクローナル抗体またはキメラモノクローナル抗体であってよい。

0029

本明細書に記載の抗CD20糖操作抗体群は、in vitroで作製することができる。抗CD20糖操作抗体群は、Fc糖鎖工学によって生成することができる。ある特定の実施形態では、抗CD20糖操作抗体群は、哺乳動物細胞培養によって得られた抗CD20モノクローナル抗体から酵素的にまたは化学酵素的に工学的に作製される。

0030

さらに別の態様では、本開示は、抗CD20糖操作抗体を作出する方法であって、(a)抗CD20モノクローナル抗体をアルファフコシダーゼおよび少なくとも1種のエンドグリコシダーゼと接触させ、それにより、Fc上に脱フコシル化単糖GlcNAcを有する抗CD20モノクローナル抗体を作製するステップと、(b)適切な条件下でGlcNAcに炭水化物部分を付加するステップとを含む方法に関する。

0031

一部の実施形態では、抗CD20糖操作抗体を作出するために使用される抗CD20モノクローナル抗体はリツキシマブである。

0032

一部の実施形態では、炭水化物部分は、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAcMan3GlcNAc2およびMan3GlcNAc2からなる群より選択される。

0033

好ましい実施形態では、炭水化物部分は、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2およびGal2GlcNAc3Man3GlcNAc2からなる群より選択される。

0034

ステップ(b)の付加は、トランスグリコシラーゼによって実施することができる。トランスグリコシラーゼとしては、これだけに限定されないが、EndoS、EndoS2、EndoH、EndoA、EndoM、EndoF、EndoF1、EndoF2およびEndoF3が挙げられる。

0035

本発明の方法に有用なエンドグリコシダーゼとしては、これだけに限定されないが、EndoS、EndoS2、EndoH、EndoA、EndoM、EndoF、EndoF1、EndoF2およびEndoF3が挙げられる。

0036

一部の実施形態では、アルファ−フコシダーゼは、配列番号5と少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

0037

ある特定の実施形態では、アルファ−フコシダーゼは、組換えBacteroidesアルファ−L−フコシダーゼである。

0038

本発明の1つまたは複数の実施形態の詳細が以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴または利点は、以下の図およびいくつかの実施形態の詳細な説明から、ならびに添付の特許請求の範囲からも明らかになるであろう。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
Fc領域のそれぞれに同じN−グリカンを有する抗CD20IgG分子の単離された均一な集団を含む抗CD20糖操作抗体群または抗CD20結合性断片の組成物。
(項目2)
前記抗CD20IgG分子が、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記抗CD20IgG分子が、リツキシマブの軽鎖配列および重鎖配列を含む、項目1に記載の組成物。
(項目4)
前記抗CD20糖操作抗体群が、リツキシマブよりも改善されたADCC活性を有する、項目1に記載の組成物。
(項目5)
前記ADCCが少なくとも約10倍改善される、項目4に記載の組成物。
(項目6)
前記抗CD20糖操作抗体群が、リツキシマブと比較して改善されたFcγRIIIAへの結合を示す、項目1に記載の組成物。
(項目7)
前記N−グリカンが前記Fc領域のAsn−297に付着している、項目1に記載の組成物。
(項目8)
前記N−グリカンがフコースを含まない、項目1に記載の組成物。
(項目9)
前記N−グリカンが、α2−6シアル酸を少なくとも1つ含む、項目1に記載の組成物。
(項目10)
前記N−グリカンがα2−6シアル酸を2つ含む、項目9に記載の組成物。
(項目11)
前記N−グリカンが、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAcMan3GlcNAc2およびMan3GlcNAc2からなる群より選択される、項目1に記載の組成物。
(項目12)
前記N−グリカンが、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2およびGal2GlcNAc3Man3GlcNAc2からなる群より選択される、項目11に記載の組成物。(項目13)
項目1から12までに記載の抗CD20糖操作抗体群またはその抗原結合性断片の実質的に純粋な集団と薬学的に許容される担体とを含む医薬製剤
(項目14)
患者においてがんを処置するための方法であって、それを必要とする前記患者に、有効量の項目13に記載の医薬製剤を投与するステップを含む、方法。
(項目15)
前記がんが、B細胞リンパ腫、NHL、前駆Bリンパ芽球性白血病/リンパ腫および成熟B細胞新生物、B細胞性慢性リンパ性白血病(CLL)/小リンパ球性リンパ腫(SLL)、B細胞性前リンパ性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫(MCL)、濾胞性リンパ腫(FL)、低悪性度、中悪性度および高悪性度(FL)、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁層B細胞リンパ腫、MALT型辺縁層B細胞リンパ腫、節性辺縁層B細胞リンパ腫、脾臓型辺縁層B細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、形質細胞腫、形質細胞骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および未分化大細胞リンパ腫(ALCL)からなる群より選択される、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記患者に、治療剤を投与するステップをさらに含む、項目14に記載の方法。
(項目17)
前記治療剤がリツキシマブを含む、項目14に記載の方法。
(項目18)
B細胞枯渇に基づく疾患処置を改善するための方法であって、治療有効量の項目13に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
(項目19)
治療有効量の項目13に記載の医薬組成物を共投与または共製剤として投与するステップを含む、項目18に記載の方法。
(項目20)
項目1に記載の抗CD20糖操作抗体または抗原結合性断片を作出する方法であって、
(a)抗CD20モノクローナル抗体をα−フコシダーゼおよび少なくとも1種のエンドグリコシダーゼと接触させ、それにより、単一のN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)を有する脱フコシル化抗体を得るステップと、
(b)適切な条件下でGlcNAcに炭水化物部分を付加するステップと
を含む、方法。
(項目21)
前記抗CD20モノクローナル抗体がリツキシマブである、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記抗CD20糖操作抗体群をin vitroで作製する、項目20に記載の方法。(項目23)
前記抗CD20糖操作抗体群を、細胞培養によって得られた抗体から酵素的に工学的に作製する、項目20に記載の方法。
(項目24)
前記炭水化物部分が、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAcMan3GlcNAc2およびMan3GlcNAc2からなる群より選択される、項目20に記載の方法。
(項目25)
前記炭水化物部分が、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2およびGal2GlcNAc3Man3GlcNAc2からなる群より選択される、項目24に記載の方法。
(項目26)
ステップ(b)の前記付加をトランスグリコシラーゼによって行う、項目20に記載の方法。
(項目27)
前記エンドグリコシダーゼが、EndoS、Endo S2、EndoH、EndoA、EndoM、EndoF、EndoF1、EndoF2またはEndoF3である、項目20に記載の方法。
(項目28)
前記α−フコシダーゼが、配列番号5と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、項目20に記載の方法。
(項目29)
前記α−フコシダーゼが組換えBacteroidesアルファ−L−フコシダーゼである、項目20に記載の方法。

図面の簡単な説明

0039

図1は、モノクローナル抗体のFc糖鎖工学の略図を示す。経路(A)はフコシル化抗体と非フコシル化抗体の混合物が生じる当技術分野で公知の方法を示す。経路(B)は均一な糖操作抗体群が生じる本発明の方法を示す。

0040

図2は、抗CD20GAbs 101、102、104、105、106、107、108、109、110、111、201およびリツキシマブのSDS−PAGE分析を示す。

0041

図3は、抗CD20GAbs 101、102、104、105、106、107、108、109、110および111のN−グリカンプロファイリングを示す。

0042

図4は、リツキシマブ、GAb101およびGAb104の(A)ラモス細胞および(B)SKW6.4細胞への結合、ならびに(C)リツキシマブ、GAb101およびGAb117のラモス細胞、ラジ細胞およびSU−DHL4細胞への結合を示す。

0043

図5は、リツキシマブ、GAb101およびGAb104による(A)ラモス細胞および(B)SKW6.4細胞に対するアポトーシスを示す。

0044

図6は、(A)リツキシマブ、GAb101およびGAb117;(B)GAb101、GAb104およびGAb108によって誘導される、ラモス細胞に対するCDCを示す。

0045

図7は、エフェクターPBMC細胞を使用して、リツキシマブ、GAb101、GAb104およびGAb117によって誘導される、(A)ラモス細胞および(B)(C)SKW6.4細胞に対するADCCを示す。
図7は、エフェクターPBMC細胞を使用して、リツキシマブ、GAb101、GAb104およびGAb117によって誘導される、(A)ラモス細胞および(B)(C)SKW6.4細胞に対するADCCを示す。

0046

図8は、3ドナー由来のPBMCにおける、自己由来血漿不在下で、リツキシマブおよび抗CD20GAbs101、102、105、106、107、108、109、110および111によるヒトB細胞の枯渇を示す。

0047

図9は、SCIマウスにおける、GAb101によるラモス腫瘍異種移植片の抑制を示す。

0048

リツキシマブ(Rituxan(登録商標))は、B細胞リンパ腫の95%超で発現するCD20タンパク質を標的とするキメラ抗CD20抗体である。抗CD20mAbリツキシマブを用いたモノクローナル抗体療法は、ここ30年のリンパ球増殖性障害の処置における最も重要な進歩のうちの1つを表すものである。リツキシマブは、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において産生される。哺乳動物細胞培養系では、全てが同じ性質を有するとは限らないグリコシル化パターンの不均一な混合物が送達される。抗体内のFcグリコシル化の多様性は、Fcエフェクター機能の多様性に対応する。したがって、このFcグリカンの不均一性は、IgG分子のFc受容体およびC1qへの結合に影響を及ぼし、それにより、抗体エフェクター機能に影響を及ぼすので、機能的重要性があり、また、患者における望ましくない影響を誘発する可能性があり、したがって、これらは安全性に懸念があるとみなされる。例えば、CD20陽性悪性疾患を有する患者の一部は、リツキシマブを含有する免疫化学療法に対して応答することができない、またはより一般には、リツキシマブを含有する免疫化学療法を受けた後に再発する。

0049

改善された抗CD20抗体を用いてモノクローナル抗体療法を改善することが依然として必要とされている。グリコシル化パターンの不均一な混合物中の数種類の特定のグリコフォームにより所望の生物学的機能が付与されることが公知である。したがって、治療目的で、所望のグリコフォームとして明確に定義されたグリカン構造および配列を含有する治療用抗体を生成することが大変興味深い。

0050

定義
本発明の実施では、別段の指定のない限り、当技術分野の技術の範囲内に入る分子生物学微生物学組換えDNA、および免疫学の従来の技法を使用する。そのような技法は、文献において十分に説明されている。例えば、Molecular Cloning A Laboratory Manual、第2版、Sambrook、FritschおよびManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年);DNA Cloning、I巻およびII巻(D. N. Glover編、1985年);Culture Of Animal Cells(R. I. Freshney、Alan R. Liss, Inc.、1987年);Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press、1986年);B. Perbal、A Practical Guide To
Molecular Cloning(1984年);論文集、MethodsIn
Enzymology(Academic Press, Inc.、N.Y.);Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J. H. MillerおよびM. P. Calos編、1987年、Cold Spring Harbor Laboratory);Methods In Enzymology、154巻および155巻(Wuら編)、Immunochemical
Methods In Cell And Molecular Biology(MayerおよびWalker編、Academic Press、London、1987年);Antibodies: A Laboratory Manual、HarlowおよびLanes(Cold Spring Harbor Laboratory
Press、1988年);およびHandbook Of Experimental Immunology、I〜IV巻(D. M. WeirおよびC. C. Blackwell編、1986年)を参照されたい。

0051

「糖操作抗体群(glycoantibodies)」という用語は、本発明者、Chi−Huey Wong博士により造り出されたものであり、単一の一様化されたグリコフォームがFc領域に結合したモノクローナル抗体(好ましくは、治療用モノクローナル抗体)の均一な集団を指す。基本的に均一な集団を構成する個々の糖操作抗体群は同一であり、同じエピトープに結合し、また、明確に定義されたグリカン構造および配列を有する同じFcグリカンを含有する。

0052

本明細書で使用される場合、「抗CD20糖操作抗体群」(「抗CD20GAbs」)という用語は、Fc上に同じグリコフォームを有する抗CD20IgG分子の均一な集団を指す。

0053

「抗CD20糖操作抗体」(「抗CD20GAb」)という用語は、抗CD20糖操作抗体群内の各々のIgG分子を指す。ある特定の実施形態では、抗CD20「分子」は抗原結合性断片も含むことができる。

0054

本明細書で使用される場合、「グリカン」という用語は、多糖オリゴ糖または単糖を指す。グリカンは糖残基単量体であってもポリマーであってもよく、直鎖であっても分枝していてもよい。グリカンとしては、天然の糖残基(例えば、グルコース、N−アセチルグルコサミン、N−アセチルノイラミン酸、ガラクトース、マンノース、フコース、ヘキソースアラビノースリボースキシロースなど)および/または修飾された糖(例えば、2’−フルオロリボース、2’−デオキシリボースホスホマンノース、6’スルホN−アセチルグルコサミンなど)が含まれ得る。グリカンとは、本明細書では、糖タンパク質、糖脂質グリコペプチドグリコプロテオームペプチドグリカンリポ多糖またはプロテオグリカンなどの複合糖質の炭水化物部分を指すためにも使用される。グリカンは、通常、単糖間のO−グリコシド結合のみからなる。例えば、セルロースはβ−1,4結合したD−グルコースで構成されるグリカン(または、より詳細にはグルカン)であり、キチンはβ−1,4結合したN−アセチル−D−グルコサミンで構成されるグリカンである。グリカンは、単糖残基ホモポリマーであってもヘテロポリマーであってもよく、直鎖であっても分枝していてもよい。グリカンは、糖タンパク質およびプロテオグリカンのようにタンパク質に付着して見いだされ得る。グリカンは、一般に、細胞の外表面上に見いだされる。O結合およびN結合グリカンは、真核生物では非常に一般的であるが、原核生物においても、一般的ではないが見いだされ得る。N結合グリカンは、シークオン(sequon)内のアスパラギンR基窒素(N)に付着して見いだされる。シークオンは、Asn−X−SerまたはAsn−X−Thr配列であり、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である。

0055

本明細書で使用される場合、「フコース」、「コアフコース」および「コアフコース残基」という用語は、互換的に使用され、N−アセチルグルコサミンとα1,6位結合したフコースを指す。

0056

本明細書で使用される場合、「N−グリカン」、「N結合グリカン」、「N結合グリコシル化」、「Fcグリカン」および「Fcグリコシル化」という用語は、互換的に使用され、Fcを含有するポリペプチド内のアスパラギン残基アミド窒素と結合したN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)が付着したN結合オリゴ糖を指す。「Fcを含有するポリペプチド」という用語は、Fc領域を含む、抗体などのポリペプチドを指す。

0057

本明細書で使用される場合、「グリコシル化パターン」および「グリコシル化プロファイル」という用語は、互換的に使用され、糖タンパク質または抗体から酵素的にまたは化学的に放出され、次いで、それらの炭水化物構造について、例えば、LC−HPLC、またはMALDI−TOF MSなどを使用して分析されたN−グリカン種の特徴的な「指紋」を指す。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Current Analytical Chemistry、1巻、1号(2005年)、28〜57頁の総説を参照されたい。

0058

本明細書で使用される場合、「糖鎖工学により操作されたFc」という用語は、本明細書で使用される場合、Fc領域上のN−グリカンが、酵素的にまたは化学的に変更または工学的に操作されていることを指す。「Fc糖鎖工学」という用語は、本明細書で使用される場合、糖鎖工学により操作されたFcを作出するために使用される酵素的または化学的なプロセスを指す。工学的操作の典型的な方法は、例えば、その内容が本明細書によって参照により組み込まれるWongら、USSN12/959,351に記載されている。

0059

「均一な(homogeneous)」、「一様な(uniform)」、「一様に(uniformly)」および「均一性(homogeneity)」という用語は、Fc領域のグリコシル化プロファイルに関しては、互換的に使用され、1つの所望のN−グリカン種によって単一のグリコシル化パターンが表され、前駆N−グリカンの痕跡量はほとんどないまたは全くないことを意味するものとする。ある特定の実施形態では、前駆N−グリカンの痕跡量は約2%未満である。

0060

「基本的に純粋な」タンパク質とは、組成物の総重量に基づいて、例えば、少なくとも約91重量%、少なくとも約92重量%、少なくとも約93重量%、少なくとも約94重量%、少なくとも約95重量%、少なくとも約96重量%、少なくとも約97重量%、少なくとも約98重量%、または少なくとも約99重量%を含め、少なくとも約90重量%のタンパク質を含む組成物を意味する。

0061

「基本的に均一な」タンパク質は、組成物の総重量に基づいて、例えば、少なくとも約98.5%、少なくとも約99%を含め、少なくとも約98重量%のタンパク質で構成される組成物を意味する。ある特定の実施形態では、タンパク質は、抗体、構造バリアント、および/またはその抗原結合性断片である。

0062

本明細書で使用される場合、「IgG」、「IgG分子」、「モノクローナル抗体」、「免疫グロブリン」、および「免疫グロブリン分子」という用語は、互換的に使用される。ある特定の実施形態では、抗CD20「分子」は抗原結合性断片も含むことができる。

0063

本明細書で使用される場合、「Fc受容体」または「FcR」という用語は、抗体のFc領域に結合する受容体について述べるものである。好ましいFcRは、ネイティブな配列のヒトFcRである。さらに、好ましいFcRはIgG抗体に結合するもの(ガンマ受容体)であり、それらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび代替的にスプライスされた形態を含め、FcγRIサブクラスの受容体(CD64)、FcγRIIサブクラスの受容体(CD32)、およびFcγRIIIサブクラスの受容体(CD16)が挙げられる。FcγRII受容体としてはFcγRIIA(「活性化受容体」)およびFcγRIIB(「抑制受容体(inhibiting receptor)」)があり、これらは、同様のアミノ酸配列を有し、主にその細胞質ドメインが異なる。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメイン内に免疫受容活性化チロシンモチーフ(ITAM)を含有する。抑制受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメイン内に免疫受容抑制性チロシンモチーフ(ITIM)を含有する(総説M. in Daeron、Annu. Rev. Immunol. 15巻:203〜234頁(1997年)を参照されたい)。FcRは、RavetchおよびKinet、Annu. Rev. Immunol 9巻:457〜92頁(1991年);Capelら、Immunomethods4巻:25〜34頁(1994年);およびde Haasら、J. Lab. Clin. Med. 126巻:330〜41頁(1995年)に概説されている。今後同定されるものを含めた他のFcRが本明細書における「FcR」という用語に包含される。この用語は、母系IgGの胎児への移行に関与する新生児受容体、FcRnも包含する(Guyerら、J. Immunol. 117巻:587頁(1976年)およびKimら、J. Immunol. 24巻:249頁(1994年))。

0064

「エフェクター機能」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体Fc領域のFc受容体またはリガンドとの相互作用によって生じる生化学的事象を指す。例示的な「エフェクター機能」としては、C1q結合;補体依存性細胞傷害;Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC);食作用細胞表面受容体(例えばB細胞受容体;BCR)の下方制御などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は、当技術分野で公知の様々なアッセイを使用して評価することができる。

0065

本明細書で使用される場合、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ADCC」という用語は、ある特定の細胞傷害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)上に存在するFc受容体(FcR)に結合した、分泌されたIgにより、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を有する標的細胞に特異的に結合し、その後、細胞毒により標的細胞を死滅させることが可能になる、細胞傷害性の形態を指す。抗体は、細胞傷害性細胞を「武装」させるものであり、そのような死滅に絶対必要なものである。ADCCを媒介する一次細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現するが、単球はFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIを発現する。造血細胞におけるFcR発現は、RavetchおよびKinet、Annu. Rev. Immunol 9巻:457〜92頁(1991年)の464頁、表3に要約されている。目的の分子のADCC活性を評価するために、米国特許第5,500,362号または米国特許第5,821,337号に記載されているものなどのin vitro ADCCアッセイを実施することができる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられる。その代わりにまたはそれに加えて、目的の分子のADCC活性は、in vivoにおいて、例えば、Clynesら、PNAS(USA)95巻:652〜656頁(1998年)に開示されているものなどの動物モデルにおいて評価することができる。

0066

「補体依存性細胞傷害」または「CDC」という用語は、本明細書で使用される場合、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典的な補体経路の活性化は、同族抗原に結合する抗体(適切なサブクラスのもの)に補体系の第1の構成成分(C1q)が結合することによって開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Gazzano−Santoroら、J. Immunol. Methods202巻:163頁(1996年)に記載のCDCアッセイを実施することができる。

0067

「キメラ」抗体(免疫グロブリン)は、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である重鎖および/または軽鎖の一部を有し、鎖(複数可)の残りは、別の種に由来するまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびに所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片、の対応する配列と同一または相同である(米国特許第4,816,567号;およびMorrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81巻:6851〜6855頁(1984年))。ヒト化抗体とは、本明細書で使用される場合、キメラ抗体サブセットである。

0068

非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小の配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分に関して、ヒト化抗体は、レシピエント超可変領域残基が所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラットウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)由来の超可変領域残基で置き換えられた、ヒト免疫グロブリン(レシピエントまたはアクセプター抗体)である。いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体においては見いだされない残基を含んでよい。これらの改変は、結合親和性などの抗体の性能をさらに磨くために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、一般には2つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変ループの全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンの超可変ループに対応し、FR領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のFR領域であるが、FR領域は結合親和性を改善する1つまたは複数のアミノ酸置換を含んでよい。FRにおけるこれらのアミノ酸置換の数は、一般には、H鎖では6以下であり、L鎖では3以下である。ヒト化抗体は、場合により、一般にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部分も含む。さらなる詳細に関しては、Jonesら、Nature 321巻:522〜525頁(1986年);Reichmannら、Nature 332巻:323〜329頁(1988年);およびPresta、Curr. Op. Struct. Biol. 2巻:593〜596頁(1992年)を参照されたい。以下の総説論文およびそこに引用されている参考文献も参照されたい:VaswaniおよびHamilton、Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1巻:105〜115頁(1998年);Harris、Biochem. Soc. Transactions 23巻:1035〜1038頁(1995年);HurleおよびGross、Curr. Op. Biotech. 5巻:428〜433頁(1994年)。

0069

本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、免疫応答を引き出すことができる任意の物質と定義される。本明細書で使用される場合、「抗原特異的」という用語は、特定の抗原または抗原の断片の供給により特異的な細胞増殖がもたらされるような細胞集団の性質を指す。

0070

本明細書で使用される場合、「免疫原性」という用語は、免疫応答を刺激する免疫原、抗原、またはワクチンの能力を指す。

0071

本明細書で使用される場合、「エピトープ」という用語は、抗体またはT細胞受容体抗原結合部位と接触する、抗原分子の一部と定義される。

0072

本明細書で使用される場合、「特異的に結合すること」という用語は、結合対(例えば、抗体と抗原)間の相互作用を指す。種々の例では、特異的に結合することは、約10−6モルリットル、約10−7モル/リットル、または約10−8モル/リットル、またはそれ未満の親和性定数によって具体化することができる。

0073

「単離された」抗体とは、同定され、その天然の環境の構成成分から分離および/または回収された抗体である。その天然の環境の混入構成成分は、抗体の研究、診断または治療的な使用に干渉する材料であり、それらとして、酵素ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質溶質が挙げられる。

0074

「実質的に類似した」、「実質的に同じ」、「等価の」、または「実質的に等価の」というは、本明細書で使用される場合、2つの数値(例えば、一方が分子に関連し、他方が参照/比較用(comparator)分子に関連する)間の類似性の程度が十分に高く、したがって、当業者により、前記値(例えば、Kd値、抗ウイルス効果など)により測定される生物学的特性文脈内で、その2つの値の差異生物学的および/または統計的有意性がほとんどまたは全くないとみなされるだろうことを示す。前記2つの値の差異は、参照/比較用分子についての値の関数として、例えば、約50%未満、約40%未満、約30%未満、約20%未満、および/または約10%未満である。

0075

「実質的に低下した」または「実質的に異なる」という句は、本明細書で使用される場合、2つの数値(一般に、一方が分子に関連し、他方が参照/比較用分子に関連する)の差異の程度が十分に高く、したがって、当業者により、前記値(例えば、Kd値)により測定される生物学的特性の文脈内で、その2つの値の差異が統計的に有意であるとみなされるだろうことを示す。前記2つの値の差異は、参照/比較用分子についての値の関数として、例えば、約10%超、約20%超、約30%超、約40%超、および/または約50%超である。

0076

「結合親和性」とは、一般に、分子(例えば、抗体)の単一の結合性部位とその結合パートナー(例えば、抗原)の間の非共有結合性の相互作用の総計の強度を指す。別段の指定のない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対(例えば、抗体と抗原)のメンバー間の1:1相互作用を反映する内因性の結合親和性を指す。分子XのそのパートナーYに対する親和性は、一般に、解離定数(Kd)によって表すことができる。親和性は、本明細書に記載のものを含めた当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、一般に、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般に、抗原により速く結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法は当技術分野で公知であり、そのいずれも本発明の目的に関して使用することができる。特定の例示的な実施形態は以下に記載されている。

0077

抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。これらのドメインは、一般に、抗体の最も可変性の部分であり、抗原結合部位を含有する。

0078

「可変性」という用語は、可変ドメインのある特定の部分が、その配列が抗体の間で広範囲にわたって異なり、特定の抗体のそれぞれのその特定の抗原に対する結合および特異性に使用されるという事実を指す。しかし、可変性は抗体の可変ドメイン全体を通して一様に分布しているのではない。可変性は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方にある相補性決定領域(CDR)または超可変領域と称される3つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク(FR)と称される。ネイティブな重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分がベータシート立体配置をとっている4つのFR領域を含み、これは、ベータ−シート構造の一部と接続し、いくつかの場合にはそれを形成するループを形成する3つのCDRと接続している。各鎖のCDRはFR領域の極めて近傍に一緒に保持され、他の鎖由来のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、National Institute of Health、Bethesda、Md(1991年)を参照されたい)。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害(antibody−dependent cellular toxicity)への抗体の関与などの、種々のエフェクター機能を示す。

0079

抗体のパパイン消化により、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Fab」断片と称される2つの同一の抗原結合性断片と、容易に結晶化できることが名称に反映されている残りの「Fc」断片とが生じる。ペプシン処理により、抗原結合性部位を2つ有し、なお抗原と架橋結合することが可能なF(ab’)2断片がもたらされる。

0080

「Fv」は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。二本鎖Fv種では、この領域は、密接に非共有結合により結びついた重鎖可変ドメイン1つと軽鎖可変ドメイン1つの二量体からなる。単鎖Fv種では、重鎖可変ドメイン1つと軽鎖可変ドメイン1つが柔軟なペプチドリンカーによって共有結合により連結していてよく、したがって、軽鎖および重鎖が二本鎖Fv種のものと類似した「二量体」構造で結びついていてよい。この立体配置では、各可変ドメインの3つのCDRが相互作用してVH−VL二量体の表面上の抗原結合部位が規定される。集合的に、6つのCDRによって抗原結合特異性が抗体に付与される。しかし、単一の可変ドメイン(または抗原に特異的なCDRを3つのみ含むFvの半分)でさえ、結合性部位全体よりも親和性は低いが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。

0081

Fab断片は、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)も含有する。Fab’断片は、抗体ヒンジ領域由来の1つまたは複数のシステインを含めた重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端の数残基の付加により、Fab断片とは異なる。Fab’−SHとは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基(複数可)に遊離チオール基を有するFab’に対する名称である。F(ab’)2抗体断片は、最初は、間にヒンジシステインを有するFab’断片の対として生じた。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。

0082

任意の脊椎動物種に由来する抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパκ)およびラムダ(λ)と称される、2つの明白に異なる型のうちの一方に割り当てることができる。

0083

抗体(免疫グロブリン)は、重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには主要なクラスが5つ存在する:IgAIgDIgE、IgGおよびIgM、これらの一部は、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および3次元立体配置は周知であり、一般に、例えば、Abbasら、Cellular and Mol. Immunology、第4版(2000年)に記載されている。抗体は、抗体と1つまたは複数の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合または非共有結合による結びつきによって形成されるより大きな融合分子の一部であってよい。

0084

全長抗体」、「インタクトな抗体」および「全抗体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、下で定義される通り、抗体断片ではなく実質的にインタクトな形態にある抗体を指す。この用語は、特に、Fc領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。

0085

「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分のみを含み、その部分は、インタクトな抗体内に存在する場合にその部分に通常付随する機能の少なくとも1つ、できるだけ多く、大多数または全てを保持する。一実施形態では、抗体断片は、インタクトな抗体の抗原結合部位を含み、したがって、抗原に結合する能力を保持する。別の実施形態では、抗体断片、例えば、Fc領域を含む断片は、FcRn結合、抗体半減期調節、ADCC機能および補体結合などの、Fc領域がインタクトな抗体内に存在する場合に通常付随する生物学的機能の少なくとも1つを保持する。一実施形態では、抗体断片は、インタクトな抗体と実質的に類似したin vivo半減期を有する一価抗体である。例えば、そのような抗体断片は、断片にin vivoにおける安定性を付与することが可能なFc配列に連結した抗原結合性アームを含んでよい。

0086

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、微量に存在し得る、可能性のある天然に存在する変異以外は同一である。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特性を示す。そのようなモノクローナル抗体は、一般には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、ここで、標的結合性ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合性ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られたものである。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローンファージクローンまたは組換えDNAクローンプールなどの複数のクローンから固有のクローンを選択することであってよい。例えば、標的に対する親和性を改善するため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養物中でのその産生を改善するため、in vivoにおけるその免疫原性を低下させるため、多重特異性抗体を創出するためなどで、選択された標的結合配列をさらに変更できること、および、変更された標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるべきである。一般には異なる決定因子(エピトープ)を対象とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子を対象とする。モノクローナル抗体調製物は、それらの特異性に加えて、一般には他の免疫グロブリンが混入していないという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、抗体の実質的に均一な集団から得られるという抗体の特性を示すものであり、任意の特定の方法による抗体の作製が必要であるとは解釈されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、ハイブリドーマ法(例えば、Kohlerら、Nature、256巻:495頁(1975年);Harlowら、Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、1988年);Hammerlingら、Monoclonal Antibodies and T−Cell hybridomas 563〜681頁(Elsevier、N.Y.、1981年))、組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号を参照されたい)、ファージディスプレイ技術(例えば、Clacksonら、Nature、352巻:624〜628頁(1991年);Marksら、J. Mol. Biol. 222巻:581〜597頁(1992年);Sidhuら、J.
Mol. Biol. 338巻(2号):299〜310頁(2004年);Leeら、J. Mol. Biol. 340巻(5号):1073〜1093頁(2004年);Fellouse、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101巻(34号):12467〜12472頁(2004年);およびLeeら、J. Immunol. Methods284巻(1〜2号):119〜132頁(2004年)を参照されたい)、およびヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の一部または全部を有する動物においてヒトまたはヒト様抗体を産生させるための技術(例えば、WO98/24893;WO96/34096;WO96/33735;WO91/10741;Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90巻:2551頁(1993年);Jakobovitsら、Nature 362巻:255〜258頁(1993年);Bruggemannら、Year in Immunol. 7巻:33頁(1993年);米国特許第5,545,807号;5,545,806号;5,569,825号;5,625,126号;5,633,425号;5,661,016号;Marksら、Bio.
Technology 10巻:779〜783頁(1992年);Lonbergら、Nature 368巻:856〜859頁(1994年);Morrison、Nature 368巻:812〜813頁(1994年);Fishwildら、Nature Biotechnol. 14巻:845〜851頁(1996年);Neuberger、Nature Biotechnol. 14巻:826頁(1996年)およびLonbergおよびHuszar、Intern. Rev. Immunol.
13巻:65〜93頁(1995年)を参照されたい)を含めた様々な技法によって作出することができる。

0087

本明細書のモノクローナル抗体は、詳細には、重鎖および/または軽鎖の一部が特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、鎖(複数可)の残りは、別の種に由来するまたは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体、ならびに所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片、の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体を含む(米国特許第4,816,567号;およびMorrisonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81巻:6851〜6855頁(1984年))。

0088

以下の総説論文およびそこに引用されている参考文献も参照されたい:VaswaniおよびHamilton、Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1巻:105〜115頁(1998年);Harris、Biochem. Soc. Transactions 23巻:1035〜1038頁(1995年);HurleおよびGross、Curr. Op. Biotech. 5巻:428〜433頁(1994年)。

0089

「超可変領域」、「HVR」、または「HV」という用語は、本明細書で使用される場合、配列内で超可変性であり、および/または構造的に定義されているループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、6つの超可変領域を含む;VHに3つ(H1、H2、H3)、およびVLに3つ(L1、L2、L3)。いくつもの超可変領域の記述が使用されており、本明細書に包含される。Kabat相補性決定領域(CDR)は配列の可変性に基づくものであり、最も一般的に使用されている(Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National
Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991年))。Chothiaは、その代わりに、構造ループの場所に言及する(ChothiaおよびLesk J. Mol. Biol. 196巻:901〜917頁(1987年))。AbM超可変領域は、Kabat CDRとChothia構造ループの折衷を示すものであり、Oxford Molecular’s AbM antibody modeling softwareに使用されている。「contact」超可変領域は、入手可能な複合体結晶構造の解析に基づくものである。これらの超可変領域のそれぞれに由来する残基を以下に示す。
ループ Kabat AbM Chothia Contact
L1 L24−L34 L24−L34 L26−L32 L30−L36
L2 L50−L56 L50−L56 L50−L52 L46−L55
L3 L89−L97 L89−L97 L91−L96 L89−L96
H1 H31−H35B H26−H35B H26−H32 H30−H35B
(Kabat番号付け
H1 H31−H35 H26−H35 H26−H32 H30−H35
(Chothia番号付け)
H2 H50−H65 H50−H58 H53−H55 H47−H58
H3 H95−H102 H95−H102 H96−H101 H93−H101

0090

超可変領域は、以下の通り「伸長された超可変領域」を含み得る:VLにおける24−36または24−34(L1)、46−56または50−56または49−56(L2)および89−97または89−96(L3)、ならびにVHにおける26−35(H1)、50−65または49−65(H2)および93−102、94−102、または95−102(H3)。可変ドメイン残基は、これらの定義のそれぞれについて、Kabatら、上記に従って番号付けされる。

0091

「フレームワーク」または「FR」残基とは、本明細書において定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。

0092

「Kabatと同様の可変ドメイン残基の番号付け」または「Kabatと同様のアミノ酸位番号付け」という用語およびその変形は、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991年)における抗体の編集物(compilation)の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのために使用される番号付け系を指す。この番号付け系を使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのFRまたはHVRにおける短縮、または挿入に対応して、より少ないまたは追加的なアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、H2の残基52の後ろに単一のアミノ酸挿入(Kabatに従って残基52a)、および重鎖FR残基82の後ろに挿入残基(Kabatに従って例えば残基82a、82b、および82cなど)を含み得る。所与の抗体について、「標準の」Kabat番号付けされた配列を有する抗体の配列の相同性の領域におけるアラインメントによって残基のKabat番号付けを決定することができる。

0093

「単鎖Fv」または「scFv」抗体断片は、抗体のVHドメインおよびVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。一般に、scFvポリペプチドは、VHドメインとVLドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これにより、scFvが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。scFvの概説については、Pluckthun、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、113巻、RosenburgおよびMoore編、Springer−Verlag、New York、269〜315頁(1994年)を参照されたい。

0094

ダイアボディ(diabody)」という用語は、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指し、断片は、同じポリペプチド鎖内で接続した重鎖可変ドメイン(VH)と軽鎖可変ドメイン(VL)(VH−VL)を含む。同じ鎖上の2つのドメイン間での対形成が可能になるには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは強制的に別の鎖の相補的なドメインと対形成し、2つの抗原結合部位が創出される。ダイアボディは、例えば、EP404,097;WO93/1161;およびHollingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90巻:6444〜6448頁(1993年)により詳細に記載されている。

0095

ヒト抗体」とは、ヒトによって産生された抗体および/または本明細書に開示されているヒト抗体を作出するための技法のいずれかを使用して作出された抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体を明確に排除する。

0096

「親和性成熟した」抗体とは、その1つまたは複数のHVRに1つまたは複数の変更を伴う抗体であり、その変更により、それらの変更(複数可)を有さない親抗体と比較して、抗体の抗原に対する親和性の改善がもたらされる。一実施形態では、親和性成熟した抗体は、標的抗原に対してナノモル濃度またはさらにはピコモル濃度の親和性を有する。親和性成熟した抗体は、当技術分野で公知の手順によって作製される。Marksら、Bio/Technology 10巻:779〜783頁(1992年)には、VHドメインおよびVLドメインシャッフリングによる親和性成熟が記載されている。CDRおよび/またはフレームワーク残基のランダム変異誘発は、Barbasら、Proc Nat. Acad. Sci. USA 91巻:3809〜3813頁(1994年);Schierら、Gene 169巻:147〜155頁(1995年);Yeltonら、J. Immunol. 155巻:1994〜2004頁(1995年);Jacksonら、J. Immunol. 154巻(7号):3310〜9頁(1995年);およびHawkinsら、J. Mol. Biol. 226巻:889〜896頁(1992年)により説明されている。

0097

遮断」抗体または「アンタゴニスト」抗体とは、それが結合する抗原の生物活性を阻害するまたは低下させる抗体である。ある特定の遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物活性を実質的にまたは完全に阻害する。

0098

アゴニスト抗体」とは、本明細書で使用される場合、目的のポリペプチドの機能活性の少なくとも1つを模倣する抗体である。

0099

「障害」とは、本発明の抗体を用いた処置から利益を得る任意の状態である。障害には、哺乳動物に問題の障害の素因を与える病的状態を含めた慢性および急性の障害または疾患が含まれる。本明細書において処置される障害の非限定的な例としてはがんが挙げられる。

0100

細胞増殖性障害」および「増殖性障害」という用語は、ある程度の異常な細胞増殖に関連する障害を指す。一実施形態では、細胞増殖性障害はがんである。

0101

腫瘍」とは、本明細書で使用される場合、悪性であるか良性であるかにかかわらず全ての新生細胞成長および増殖、ならびに全ての前がん性およびがん性細胞および組織を指す。「がん」、「がん性」、「細胞増殖性障害」、「増殖性障害」および「腫瘍」という用語は、本明細書で言及される場合、相互排他的なものではない。

0102

「がん」および「がん性」という用語は、一般に、調節されていない細胞成長/増殖を一般に特徴とする哺乳動物の生理的状態を指すまたは記述する。がんの例としては、これだけに限定されないが、癌腫、リンパ腫(例えば、ホジキンおよび非ホジキンリンパ腫)、芽細胞腫肉腫、および白血病が挙げられる。そのようながんのより詳細な例としては、扁平上皮細胞がん(squamous cell cancer)、小細胞肺がん非小細胞肺がん肺腺癌扁平上皮癌(squamous carcinoma of the lung)、腹膜がん、肝細胞がん胃腸がん、膵がん(pancreatic
cancer)、神経膠芽腫子宮頸がん(cervical cancer)、卵巣がん(ovarian cancer)、肝がん膀胱がんヘパトーマ、乳がん(breast cancer)、結腸がん、結腸直腸がん子宮内膜または子宮癌唾液腺癌、腎がん、肝がん、前立腺がん外陰がん、甲状腺がん肝癌、白血病および他のリンパ球増殖性障害、および種々の型の頭頸部がんが挙げられる。

0103

本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、免疫応答を引き出すことができる任意の物質と定義される。

0104

本明細書で使用される場合、「抗原特異的」という用語は、特定の抗原または抗原の断片の供給により特異的な細胞増殖がもたらされるような細胞集団の性質を指す。

0105

「CD20発現がん」という用語は、本明細書で使用される場合、がん細胞がCD20抗原の発現を示す全てのがんを指す。CD20発現がんとは、本明細書で使用される場合、リンパ腫(好ましくはB細胞非ホジキンリンパ腫(NHL))およびリンパ性白血病を指すことが好ましい。そのようなリンパ腫およびリンパ性白血病としては、例えば、a)濾胞性リンパ腫、b)小型非切れ込み核細胞性リンパ腫(Small Non−Cleaved Cell Lymphoma)/バーキットリンパ腫(地方病性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫および非バーキットリンパ腫を含む)、c)辺縁層リンパ腫(節外周辺帯B細胞リンパ腫(粘膜関連リンパ組織リンパ腫、MALTを含む)、節性辺縁層B細胞リンパ腫(nodal marginal zone B cell lymphoma)および性辺縁層リンパ腫(splenic marginal zone lymphoma))、d)マントル細胞リンパ腫(MCL)、e)大細胞型リンパ腫(びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLCL)、びまん性混合細胞型リンパ腫免疫芽球性リンパ腫縦隔原発B細胞リンパ腫(Primary Mediastinal
B−Cell Lymphoma)、血管中心性リンパ腫−肺B細胞リンパ腫(Angiocentric Lymphoma−Pulmonary B−Cell Lymphoma)を含む)、f)ヘアリー細胞白血病、g)リンパ球性リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、h)急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)/小リンパ球性リンパ腫(SLL)、B細胞前リンパ性白血病、i)形質細胞新生物、形質細胞骨髄腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫、j)ホジキン病が挙げられる。CD20発現がんは、B細胞非ホジキンリンパ腫(NHL)であることがより好ましい。特に、CD20発現がんは、マントル細胞リンパ腫(MCL)、急性リンパ性白血病(ALL)、慢性リンパ性白血病(CLL)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLCL)、バーキットリンパ腫、ヘアリー細胞白血病、濾胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、辺縁層リンパ腫、移植後リンパ増殖性障害(PTLD)、HIV関連リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、またはCNS原発リンパ腫である。

0106

本明細書で使用される場合、「処置(treatment)」とは、処置される個体または細胞の自然経過を変更する試みにおける臨床介入を指し、予防法のためまたは臨床病理過程中のいずれかで実施することができる。望ましい処置の効果としては、疾患の出現または再発の防止、症状の緩和、疾患のあらゆる直接または間接的な病理学的影響の減弱、炎症および/または組織/器官損傷の防止または減少、疾患の進行の速度の低下、病態好転または一時的緩和(palliation)、および寛解または予後の改善が挙げられる。一部の実施形態では、疾患または障害の発生を遅延させるために本発明の抗体を使用する。

0107

「個体」または「被験体」は、脊椎動物である。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物としては、これだけに限定されないが、農場動物(例えば、ウシなど)、競技動物、愛玩動物(例えば、ネコイヌ、およびウマなど)、霊長類、マウスおよびラットが挙げられる。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、ヒトである。

0108

「哺乳動物」とは、処置の目的に関しては、ヒト、家畜動物および農場動物、ならびに動物園の動物、競技動物、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含めた、哺乳動物に分類される任意の動物を指す。ある特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。

0109

「有効量」とは、治療的または予防的結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。

0110

本発明の物質/分子の「治療有効量」は、個体の病態、年齢性別、および体重、ならびに個体における所望の応答を引き出す物質/分子の能力などの因子に応じて変動し得る。治療有効量は、物質/分子のあらゆる毒性の影響または有害な影響よりも治療的に有益な影響が上回る量でもある。「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。必ずではないが、一般に、予防用量は、被験体に疾患の前またはより早い段階で使用されるので、予防有効量は治療有効量よりも少なくなる。

0111

細胞傷害性薬剤」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の機能を阻害するもしくは妨げ、かつ/または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位元素(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212およびLuの放射性同位元素)、化学療法剤(例えば、メトトレキサートアドリアマイシンビンカアルカロイドビンクリスチンビンブラスチンエトポシド)、ドキソルビシンメルファランマイトマイシンCクロラムブシルダウノルビシンまたは他の挿入剤)、核酸分解酵素などの酵素およびその断片、抗生物質、ならびに、断片および/もしくはそのバリアントを含めた、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素もしくは酵素的に活性な毒素などの毒素、ならびに以下に開示されている種々の抗腫瘍剤または抗がん剤を含むものとする。他の細胞傷害性薬剤が下に記載されている。殺腫瘍剤(tumoricidal agent)は腫瘍細胞の破壊を引き起こすものである。

0112

「化学療法剤」はがんの処置において有用な化学化合物である。化学療法剤の例としては、チオテパおよびCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミド(cyclosphosphamide)などのアルキル化剤ブスルファンインプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホネートベンゾドパカルボコン、メツレドパ、およびウレドパなどのアジリジンアルトレタミントリエチレンメラミントリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチルオロメラミンを含めた、エチレンイミンおよびメチルアメラミン(methylamelamine);アセトゲニン(特に、ブラシンおよびブラタシノン);デルタ−9−テトラヒドロカンナビノールドロナビノール、MARINOL(登録商標));ベータ−ラパコン(lapachone);ラパコール(lapachol);コルヒチンベツリン酸カンプトテシン合成類似体トポテカン(HYCAMTIN(登録商標))、CPT−11(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレチン(scopolectin)、および9−アミノカンプトテシンを含む);ブリオスタチンカリスタチン;CC−1065(そのアドレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む);ポドフィロトキシンポドフィリン酸;テニポシド;クリプトフィシン(特に、クリプトフィシン1およびクリプトフィシン8);ドラスタチン;デュオカルマイシン(合成類似体、KW−2189およびCB1−TM1を含む);エリュテロビンパンクラチスタチン(pancratistatin);サルコジクチイン(sarcodictyin);スポンギスタチン(spongistatin);クロラムブシル、クロマファジンクロホスファミド、エストラムスチンイホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン(novembichin)、フェネステリンプレニムスチントロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタードカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン(ranimnustine)などのニトロソ尿素(nitrosurea);エンジイン抗生物質(例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマ1IおよびカリチアマイシンオメガI1など(例えば、Agnew、Chem. Intl. Ed. Engl.、33巻:183〜186頁(1994年)を参照されたい);ジネミシン(dynemicin)Aを含めたジネミシン;エスペラミシン;ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン、アクチノマイシンアントラマイシン(authramycin)、アザセリンブレオマイシンカクチノマイシン、カルビシン(carabicin)、カミノマイシン、カルジノフィリンクロモマイシン(chromomycinis)、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6−ジアゾ−5−オキソ−L−ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、2−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシンマルセロマイシン、マイトマイシンCなどのマイトマイシンミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシンポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリンストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン;メトトレキサートおよび5−フルオロウラシル(5−FU)などの代謝拮抗薬デノプテリン(denopterin)、メトトレキサート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキサートなどの葉酸類似体フルダラビン、6−メルカプトプリンチアプリンチオグアニンなどのプリン類似体;アンシタビンアザシチジン6−アザウリジンカルモフールシタラビンジデオキシウリジンドキシフルリジンエノシタビンフロクスウリジンなどのピリミジン類似体カルステロンプロピオン酸ドロモスタノロンエピチオスタノールメピチオスタンテストラクトンなどのアンドロゲンアミノグルテチミドミトタントリロスタンなどの抗副腎剤(anti−adrenal);フォリン酸(frolinic acid)などの葉酸補充剤アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド(aldophosphamide glycoside);アミノレブリン酸エニルウラシルアムサクリンベストラブシル;ビサントレンエダトラキセート;デフォファミン;デメコルチン;ジアジクオン;エルフロルニチン(elformithine);エリプチニウム(elliptinium)酢酸塩エポチロンエトグルシド;硝酸ガリウムヒドロキシウレアレンチナン;ロニダイニン(lonidainine);マイタンシンおよびアンサマイトシンなどのメイタンシノイドミトグアゾン;ミトキサントロンモピダモール(mopidanmol);ニトクリン(nitraerine);ペントスタチン;フェナメット(phenamet);ピラルビシン;ロソキサントロン(losoxantrone);2−エチルヒドラジドプロカルバジンPSK(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products、Eugene、Oreg);ラゾキサン;リゾキシン(rhizoxin);シゾフラン(sizofuran);スピロゲルマニウムテヌアゾン酸トリアジクオン;2,2’,2’’−トリクロロトリエチルアミントリコテセン(特に、T−2毒素ベラクリン(verracurin)A、ロリジン(roridin)Aおよびアングイジン(anguidine));ウレタンビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILESIN(登録商標));ダカルバジンマンノムスチンミトブロニトール;ミトラクトールピポブロマン;ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(「Ara−C」);チオテパ;タキソイド、例えば、TAXOL(登録商標)パクリタキセル(Bristol−Myers Squibb Oncology、Princeton、N.J.)、パクリタキセルのアルブミンで工学的に操作したナノ粒子製剤であるABRAXANE(商標)Cremophor−free(American Pharmaceutical Partners、Schaumberg、Ill.)、およびTAXOTERE(登録商標)ドセタキセル(doxetaxel)(Rhone−Poulenc Rorer、Antony、France);クロラムブシル(chloranbucil);ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標));6−チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキサート;シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体;ビンブラスチン(VELBAN(登録商標));白金;エトポシド(VP−16);イホスファミド;ミトキサントロン;ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標));オキサリプラチンロイコボリン(leucovovin);ビノレルビン(NAVELBINE(登録商標));ノバントロン(novantrone);エダトレキサート;ダウノマイシンアミノプテリンイバンドロネートトポイソメラーゼ阻害剤FS2000;ジフルオロメチルオルニチンDMFO);レチノイン酸などのレチノイドカペシタビン(XELODA(登録商標));上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体;ならびに、上記の2つまたはそれ超の組合せ、例えば、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の略語であるCHOP、および、オキサリプラチン(ELOXATIN(商標))と5−FUおよびロイコボリン(leucovovin)の組み合わせの処置レジメンの略語であるFOLFOXなどが挙げられる。

0113

本明細書で使用される場合、「処置」とは、処置される個体または細胞の自然経過を変更する試みにおける臨床介入を指し、予防法のためまたは臨床病理の過程中のいずれかで実施することができる。望ましい処置の効果としては、疾患の出現または再発の防止、症状の緩和、疾患のあらゆる直接または間接的な病理学的影響の減弱、炎症および/または組織/器官損傷の防止または減少、疾患の進行の速度の低下、病態の好転または一時的緩和、および寛解または予後の改善が挙げられる。一部の実施形態では、疾患または障害の発生を遅延させるために本発明の抗体を使用する。

0114

「個体」または「被験体」は、脊椎動物である。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物としては、これだけに限定されないが、農場動物(例えば、ウシなど)、競技動物、愛玩動物(例えば、ネコ、イヌ、およびウマなど)、霊長類、マウスおよびラットが挙げられる。ある特定の実施形態では、脊椎動物は、ヒトである。

0115

「哺乳動物」とは、処置の目的に関しては、ヒト、家畜動物および農場動物、ならびに動物園の動物、競技動物、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含めた、哺乳動物に分類される任意の動物を指す。ある特定の実施形態では、哺乳動物はヒトである。

0116

「有効量」とは、所望される治療的または予防的結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。

0117

本発明の物質/分子の「治療有効量」は、個体の病態、年齢、性別、および体重、ならびに個体における所望の応答を引き出す物質/分子の能力などの因子に応じて変動し得る。治療有効量は、物質/分子のあらゆる毒性の影響または有害な影響よりも治療的に有益な影響が上回る量でもある。「予防有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な投与量および期間で有効な量を指す。必ずではないが、一般に、予防用量は、被験体に疾患の前またはより早い段階で使用されるので、予防有効量は治療有効量よりも少なくなる。

0118

「細胞傷害性薬剤」という用語は、本明細書で使用される場合、細胞の機能を阻害するもしくは妨げ、かつ/または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位元素(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212およびLuの放射性同位元素)、化学療法剤(例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤)、核酸分解酵素などの酵素およびその断片、抗生物質、ならびに、その断片および/もしくはバリアントを含めた、細菌、真菌、植物または動物起源の小分子毒素もしくは酵素的に活性な毒素などの毒素、および以下に開示されている種々の抗腫瘍剤または抗がん剤を含むものとする。他の細胞傷害性薬剤が下に記載されている。殺腫瘍剤は腫瘍細胞の破壊を引き起こすものである。

0119

「処置すること(treating)」または「処置(treatment)」または「緩和(alleviation)」とは、治療的処置および予防または防止措置の両方を指し、ここで、目的は、標的とした病的状態または障害を防止するまたは減速させる(減らす)ことである。処置を必要とするものとしては、すでに障害を有するものならびに障害を有しやすいものまたは障害が防止されるべきものが挙げられる。被験体または哺乳動物は、治療量の抗体を本発明の方法に従って受けた後、患者が以下のうちの1つまたは複数の観察可能かつ/または測定可能な低下または不在を示した場合、感染に対して成功裏に「処置」されている:感染細胞の数の低下または感染細胞の不在;感染した総細胞のパーセントの低下;ならびに/または特定の感染に付随する症状のうちの1つまたは複数のいくらかの程度までの軽減;罹患率および死亡率の低下、ならびに生活の質の問題の改善。疾患における成功裏の処置および改善を評価するための上記のパラメータ医師によく知られている常套的な手順によって容易に測定可能である。

0120

「治療有効量」という用語は、被験体または哺乳動物における疾患または障害を「処置する」ために有効な抗体または薬物の量を指す。前述の「処置すること」の定義を参照されたい。

0121

1種または複数種の別の治療剤「と組み合わせた(in combination with)」投与は、同時(並行(concurrent))投与および任意の順序での連続した(consecutive)投与を含む。

0122

「担体」とは、本明細書で使用される場合、使用される投与量および濃度でそれに暴露される細胞または哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。多くの場合、生理的に許容される担体は、水性pH緩衝溶液である。生理的に許容される担体の例としては、リン酸クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液アスコルビン酸を含めた抗酸化剤;低分子量(約10残基未満の)ポリペプチド;血清アルブミンゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマーグリシングルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコールナトリウムなどの塩形成性対イオン;ならびに/またはTWEEN(商標)ポリエチレングリコール(PEG)、およびPLURONICS(商標)などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。

0123

糖操作抗体群
培養物中で哺乳動物細胞から産生された組換えタンパク質のグリコシル化は、治療用抗体の有効な使用を確実にすることにおける重要なプロセスである(Goocheeら、1991年;JenkinsおよびCurling、1994年)。哺乳動物の細胞培養では、全てが同じ性質を有するわけではない、グリコシル化パターンの不均一な混合物が送達される。治療用タンパク質の安全性、有効性および血清中半減期のような性質は、これらのグリコシル化パターンの影響を受ける可能性がある。本発明者らは、「糖操作抗体群(glycoantibodies)」という名称の新規クラスのモノクローナル抗体を開発することにより、グリコフォーム不均一性問題に成功裏に対処した。

0124

糖操作抗体群は、市販されているまたは開発中のモノクローナル抗体(好ましくは、治療用モノクローナル抗体)から生成することができる。治療的使用のためのモノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体またはキメラモノクローナル抗体であってよい。治療的使用のための認可されたモノクローナル抗体の例としては、これだけに限定されないが、ムロモナブ(Muromomab)、アブシキシマブ、リツキシマブ、ダクリズマブバシリキシマブパリビズマブインフリキシマブトラスツズマブエタネルセプトゲムツズマブアレムツズマブイブリツモマブ(Ibritomomab)、アダリムマブ、アレフセプトオマリズマブエファリズマブセツキシマブベバシズマブナタリズマブラニビズマブパニツムマブエクリズマブおよびセルトリズマブが挙げられる。

0125

治療用モノクローナル抗体からFc糖鎖工学によって導出された機能的に活性な糖操作抗体群が本明細書に記載されている。最適化グリコフォームを有する糖操作抗体群は、治療用モノクローナル抗体と比較してより強力な生物活性を示す。最適化グリコフォームを有する糖操作抗体群により、治療的使用のための代替物がもたらされ得ることが意図されている。

0126

抗CD20糖操作抗体群(抗CD20GAb)
「CD20」抗原は、末梢血またはリンパ系器官に由来するB細胞の90%超の表面に見いだされる、分子量およそ35kDの非グリコシル化膜貫通リンタンパク質である。CD20は、初期プレB細胞発生の間に発現し、形質細胞分化まで残る。CD20は、ヒト幹細胞リンパ球前駆細胞または正常な形質細胞においては見いだされない。CD20は、正常なB細胞ならびに悪性B細胞のどちらにも存在する。文献におけるCD20に対する他の名称としては、「Bリンパ球制限分化抗原」および「Bp35」が挙げられる。CD20抗原は、例えば、ClarkおよびLedbetter、Adv. Can Res. 52巻:81〜149頁(1989年)およびValentineら、J. Biol. Chem. 264巻(19号):11282〜11287頁(1989年)に記載されている。

0127

本開示は、「抗CD20糖操作抗体群」(「抗CD20GAb」)と称される新規クラスの抗CD20抗体を特徴とする。抗CD20糖操作抗体群は、抗CD20モノクローナル抗体からFc糖鎖工学によって生成することができる。均一な集団を構成する個々の抗CD20糖操作抗体群は同一であり、明確に定義されたグリカン構造および配列を有する同じFcグリカンを含有する。本発明による抗CD20GAbは、その親抗体が結合するのと同じ、細胞膜上のヒトCD20抗原のエピトープに特異的に結合する。

0128

「親抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、抗CD20糖操作抗体を作製するために使用される抗CD20モノクローナル抗体を指す。

0129

親抗体は、哺乳動物細胞培養物、Pichia pastorisまたは昆虫細胞株などの細胞培養によって得ることができる。親抗体は哺乳動物細胞培養物中で産生されることが好ましい。親抗体はFDAの認可を受けたものであってもよく、開発中のものであってもよい。例示的な親抗体としては、これだけに限定されないが、リツキシマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、オクレリズマブ、11B8または7D8(WO2004/035607に開示されている)、C6などの、WO2005/103081に開示されている抗CD20抗体、IMMU−106(Immunomedics)などの、WO2003/68821に開示されている抗CD抗体、AME−133(Applied Molecular Evolution/Lilly)などの、WO2004/103404に開示されている抗CD20抗体、および、TRU−015(Trubion Pharmaceuticals Inc)などの、US2003/0118592に開示されている抗CD20抗体、「Y2B8」(ZEVALIN(登録商標))(Biogen−Idec,Inc.)と称される90Y標識2B8マウス抗体(例えば、米国特許第5,736,137号、Andersonら;ATCC寄託物HB11388);マウスおよびキメラ2H7抗体(例えば、米国特許第5,677,180号、Robinsonら);rhuMAb2H7および他のバージョン(Genentech,Inc.)などのヒト化2H7抗体(例えば、WO2004/056312、Adamsら、および下に示されている他の参考文献);CD20に対するヒトモノクローナル抗体(GenMab A/S/Medarex,Inc.)(例えば、WO2004/035607およびWO2005/103081、Teelingら);CD20の細胞外エピトープに結合するキメラ化またはヒト化モノクローナル抗体(Biomedics Inc.)(例えば、WO2006/106959、Numazakiら);ヒト化LL2および同様の抗体(Immunomedics,Inc.)(例えば、米国特許第7,151,164号およびUS2005/0106108、Hansen);キメラA20(cA20)またはヒト化A20抗体(hA20、IMMUN−106T、ベルツズマブ)などのA20抗体(Immunomedics,Inc.)(例えば、US2003/0219433、Hansenら);CD20に対する完全ヒト抗体(Amgen/AstraZeneca)(例えば、WO2006/130458、Gazitら);CD20に対する抗体(Avestha Gengraine Technologies Pvt Ltd.)(例えば、WO2006/126069、Morawala);および、GA101などの、CD20に対するキメラまたはヒト化B−Ly1抗体(Roche/GlycArt Biotechnology AG)(例えば、WO2005/044859;US2005/0123546;US2004/0072290;およびUS2003/0175884、Umanaら)が挙げられる。

0130

一部の実施形態では、本明細書に記載の例示的な抗CD20GAbは、配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、および配列番号2に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む。好ましい実施形態では、抗CD20GAbは、リツキシマブの軽鎖配列および重鎖配列を含む。

0131

以下の表1は、リツキシマブの重鎖および軽鎖配列を示す。

0132

一部の実施形態では、N−グリカンはFc領域のAsn−297に付着している。

0133

本発明によるN−グリカンは、「トリマンノースコア」または「五糖コア」とも称されるMan3GlcNAc2という共通の五糖コアを有し、ここで、「Man」はマンノースを指し、「Glc」はグルコースを指し、「NAc」はN−アセチルを指し、GlcNAcはN−アセチルグルコサミンを指す。

0134

一部の実施形態では、N−グリカンは二分岐構造を有する。

0135

本明細書に記載のN−グリカンは、「バイセクティング」GlcNAcを含む鎖内置換を有し得る。グリカンがトリマンノースコア上にバイセクティングGlcNAcを含む場合、構造は、Man3GlcNAc3と表される。グリカンがトリマンノースコアに付着したコアフコースを含む場合、構造は、Man3GlcNAc2(F)と表される。N−グリカンは、1つまたは複数の末端シアル酸(例えば、N−アセチルノイラミン酸)を含んでよい。「Sia」と表される構造は、末端シアル酸を指す。シアリル化は、二分岐構造のα1−3アームまたはα1−6アームのいずれかにおいて起こり得る。

0136

一部の実施形態では、本明細書に記載のN−グリカンは、α2−6末端シアル酸を少なくとも1つ含む。ある特定の実施形態では、N−グリカンは、α2−6末端シアル酸を1つ含む。好ましい実施形態では、N−グリカンは、α2−6末端シアル酸を2つ含む。

0137

一部の実施形態では、本明細書に記載のN−グリカンは、α2−3末端シアル酸を少なくとも1つ含む。ある特定の実施形態では、N−グリカンは、α2−3末端シアル酸を1つ含む。好ましい実施形態では、N−グリカンは、α2−3末端シアル酸を2つ含む。

0138

一部の実施形態では、本明細書に記載のN−グリカンは、ガラクトースを少なくとも1つ含む。ある特定の実施形態では、N−グリカンは、ガラクトースを1つ含む。好ましい実施形態では、N−グリカンは、ガラクトースを2つ含む。

0139

本開示によるN−グリカンは、コアフコースを含まないことが好ましい。

0140

表2は、抗CD20糖操作抗体群における例示的なN−グリカンの一覧である。本開示の複数の実施形態は、本明細書において列挙されているN−グリカンのいずれを含んでもよく排除してもよい。

0141

抗CD20糖操作抗体群の生物学的特性
Fcにおけるグリコシル化は、ADCC、CDCおよび循環半減期を含めた種々の免疫グロブリンエフェクター媒介性機能に影響を及ぼす可能性がある。ADCC増強は、治療用抗体の薬効を改善するための重要な戦略である。ADCC増強には、薬物費用の低減という利益のために、有効薬物投与量を低減させる潜在性がある。本明細書に記載の抗CD20糖操作抗体群は、機能的性質を特徴とし得る。抗CD20GAbには、ヒトCD20発現細胞に対するアポトーシスを含めた細胞増殖阻害活性がある。一部の実施形態では、抗CD20GAbは、その親抗体と比較してより強力な細胞増殖阻害活性を示す。

0142

抗CD20糖操作抗体群のADCC活性
本発明による糖操作抗体のADCC活性の増大は、これだけに限定されないが、親抗体のADCC活性と比較して、少なくとも約6倍、約7倍、約8倍、約9倍 約10倍、約15倍、約20倍、約25倍、約30倍、約35倍、約40倍、約50倍、約60倍、および約80倍を含め、少なくとも約5倍、または、少なくともおよそ、本明細書において列挙されている任意の2つの数字の間の範囲内の値である。

0143

表3は、リツキシマブと比較した抗CD20GAbsのADCC活性の増強の例の一覧である。例示的なアッセイは、実施例に記載されている。

0144

本明細書に記載のいくつかの抗CD20GAbs、特にGAb101およびGAb104は、その親抗体であるリツキシマブと比較してADCC活性の増強を示す。本発明の糖操作抗体群は、B細胞媒介性悪性腫瘍およびB細胞またはB細胞によって産生される抗体が関与する免疫学的疾患に対する治療剤として優れた効果を示し得、治療剤の開発における抗CD20GAbの使用は本発明の目的であることが意図されている。

0145

抗CD20糖操作抗体群のCDC活性
驚いたことに、本明細書に記載の糖操作抗体により、CDCに影響を及ぼすことなく、ADCCの改善をもたらすことができる。例示的なCDCアッセイが実施例に記載されている。例示的な実施形態では、糖操作抗体のADCCは増大するが、補体依存性細胞傷害性(CDC)などの他の免疫グロブリン型エフェクター機能は同様のままである、または有意には影響を受けない。

0146

FcγRIIIと抗CD20糖操作抗体群の間の結合
表5は、抗CD20GAbsおよびリツキシマブの例示的なFcγRIIIA結合の一覧である。FcγRIIIA結合は、当技術分野で公知のアッセイを使用して測定することができる。例示的なアッセイが実施例に記載されている。Fc受容体結合は、抗CD20GAbとリツキシマブの相対比として決定することができる。例示的な実施形態では、Fc受容体結合は、少なくとも1.2倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍または20倍、30倍、40倍、50倍、100倍またはそれを超えて増大する。

0147

結合データから、リツキシマブと比較して、抗CD20GAbs、特にGAb101およびGAb104が標的分子CD20に対してより強力な結合親和性を示すことが示された。

0148

総合すると、抗CD20Gabsは、リツキシマブと比較して、ADCC活性の増強およびより強力なFcγRIIIA結合親和性を示す。本発明の糖操作抗体群により、単独で、またはそのような抗体を2種またはそれ超含む組成物中のいずれかで、および場合によって化学療法などの他の処置と組み合わせて、優れた臨床応答をもたらすことができることが意図されている。ADCCが増強された抗CD20糖操作抗体により、B細胞リンパ腫および他の疾患に対する代替治療薬をもたらすことができることが意図されている。本発明の糖操作抗体群のエフェクター機能の増大は、より低濃度かつ低頻度投薬することが可能になり、それにより、抗体毒性および/または抗体耐性の発生の潜在性が減少することを意味するので、有利なことに、本発明の糖操作抗体群を使用して、現在の投与経路および現在の治療レジメンを変更することができる。さらに、エフェクター機能の改善により、組換え宿主系で産生された対応する抗CD20モノクローナル抗体を用いた処置には以前に抵抗性または不応性であった臨床的適応症を処置するための新しい手法がもたらされる。

0149

抗CD20GAbの調製
本発明の抗CD20糖操作抗体群は、市販されているまたは前臨床または臨床開発中の抗CD20モノクローナル抗体(「親抗体」)からFc糖鎖工学によって作製することができる。モノクローナル抗体は治療用モノクローナル抗体であることが好ましい。Fc糖鎖工学は、酵素的にまたは化学酵素的に行うことができる。好ましい実施形態では、親抗体はリツキシマブである。

0150

本発明の糖操作抗体群におけるN−グリカンは、脱フコシル化されていることが好ましい。

0151

N−グリカンの脱フコシル化は、FcドメインのN−グリカン内のコアフコースを除去するプロセスである。脱フコシル化は酵素的に使用することができる。N−グリカンは2つのFcドメイン間に埋め込まれているので、酵素的脱フコシル化効率は、立体的な障害、すなわち、フコシダーゼのフコース残基への接近がFcドメインの一部によって遮断されることに起因して、はるかに低い。

0152

多くのα−フコシダーゼが当技術分野で公知である。例としては、Turbo cornutus、Charonia lampas、Bacillus fulminans、Aspergillus niger、Clostridium perfringens、ウシ腎臓(Glyko)、ニワトリ肝臓に由来するα−フコシダーゼ(Tyagarajanら、1996年、Glycobiology 6巻:83〜93頁)およびXanthomonas manihotisに由来するα−フコシダーゼII(Glyko、PROzyme)が挙げられる。同様に多種多様なフコシダーゼが市販されている(とりわけ、Glyko、Novato、Calif.;PROzyme、San Leandro、Calif.;Calbiochem−Novabiochem Corp.、San Diego、Calif.)。しかし、コアフコースをN結合グリカンから効率的に除去することが分かっているα−フコシダーゼは存在しない。

0153

WO2013/12066では、ウシ腎臓由来のα−フコシダーゼによる(Fucα1,6)GlcNAc−リツキシマブの脱フコシル化が開示された。WO2013/12066に記載の通り、(Fucα1,6)GlcNAc−リツキシマブの反応混合物をウシ腎臓由来のα−フコシダーゼ(Prozymeから市販されている)と一緒に37℃で20日間インキュベートして、(Fucα1,6)GlcNAc−リツキシマブのフコースが完全に除去された。

0154

免疫グロブリンの熱不安定性が報告されている(Vermeerら、Biophys J. Jan 78巻:394〜404頁(2000年))。Fab断片は加熱処理に対する感受性が最も高く、一方、Fc断片は、pHの低下に対する感受性が最も高い。抗体の熱安定性および機能活性を検査するために、WO2013/12066に記載されているものと同じ実験を実施し、37℃で3日間熱処理した後に抗体がCD20に対する結合親和性を約10%失ったことを見いだした。さらに、本発明者らは、37℃で7日間熱処理した後に抗体がCD20に対する結合親和性を約20%失ったことを見いだした。WO2013/12066に記載の通り、抗体のCD20に対する結合親和性は、37℃で20日間などの持続的な熱処理後に有意に失われることが意図されている。

0155

治療的価値が改善された糖操作抗体群を合成するための本発明者らの試みにおいて、N結合グリカンからフコース残基を効率的に除去することができるBacteroides
fragilis α−フコシダーゼ(GenBank受託番号YP_212855.1)が予想外発見された。効率的な脱フコシル化は、特定の酵素を使用して成功裏に達成されている。重要なことに、本発明の糖操作抗体群の作出効率は、図1において例示されているように、容易なN−グリカンの脱フコシル化をもたらす特定のα−フコシダーゼを使用することによって有益に改善されている。

0156

したがって、本発明は、α−フコシダーゼの組成物、および、α−フコシダーゼを使用してN−グリカンのコアフコースを除去するための、改善された方法を提供する。α−フコシダーゼは、配列番号5またはそのバリアントの配列に対して少なくとも80%、85% 90%、95%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。脱フコシル化の改善された方法は、抗体をα−フコシダーゼと接触させるステップを含み、ここで、α−フコシダーゼは、配列番号5、そのバリアントまたは断片の配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、98%または99%同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

0157

抗CD20糖操作抗体を作出するための、改善された方法であって、(a)抗CD20モノクローナル抗体をα−フコシダーゼおよび少なくとも1種のエンドグリコシダーゼと接触させ、それにより、単一のN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)を有する脱フコシル化抗体を得るステップと、(b)適切な条件下でGlcNAcに炭水化物部分を付加するステップと、を含む方法が本明細書の記載に含まれる。

0158

一部の実施形態では、本発明の方法による抗CD20モノクローナル抗体はリツキシマブである。

0159

N−グリカン内のオリゴ糖の可変性部分を切り取るために、エンドグリコシダーゼを使用する。本明細書で使用されるエンドグリコシダーゼの例としては、これだけに限定されないが、EndoA、EndoF、EndoF1、EndoF2、EndoF3、EndoH、EndoM、EndoS、EndoS2およびそのバリアントが挙げられる。

0160

本発明の方法によるα−フコシダーゼは、配列番号5、その機能的バリアントの配列に対して少なくとも85%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

0161

一部の実施形態では、α−フコシダーゼは、配列番号5、そのバリアントまたは断片の配列に対して少なくとも90%または95%同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。

0162

ある特定の実施形態では、α−フコシダーゼは、組換えBacteroides α−フコシダーゼである。

0163

本発明の方法のステップ(a)により、単一のN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)を有する脱フコシル化抗体が導かれる。その後、トランスグリコシラーゼを使用した酵素媒介性グリコシル化を実施して、指定の炭水化物部分をGlcNAcに付加し、糖鎖を伸長させる。したがって、糖操作抗体群の均一な集団を作製することができる。本明細書に記載のトランスグリコシラーゼの例としては、これだけに限定されないが、EndoA、EndoF、EndoF1、EndoF2、Endo F3、EndoH、EndoM、EndoS、Endo S2およびそのバリアントが挙げられる。

0164

一部の実施形態では、本発明の方法による炭水化物部分は、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAcMan3GlcNAc2およびMan3GlcNAc2からなる群より選択される。

0165

好ましい実施形態では、炭水化物部分は、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia2(α2−3/α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia2(α2−6/α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Sia(α2−6)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Sia(α2−3)GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan3GlcNAc2およびGal2GlcNAc3Man3GlcNAc2からなる群より選択される。

0166

本発明の方法におけるステップ(b)により、糖鎖の伸長が導かれる。糖鎖を伸長させるための1つの方法は、酵素により触媒されるグリコシル化反応を通じたものである。グリコシル化反応は付加反応であり、いかなる酸、水などの付随的な排除も伴わずに進行するので、酵素により触媒されるグリコシル化反応の中でも、糖ドナーとして糖オキサゾリンを使用するグリコシル化がオリゴ糖の合成に関して有用であることが当技術分野で周知である(Fujitaら、Biochim. Biophys. Acta 2001年、1528巻、9〜14頁)。

0167

一部の実施形態では、炭水化物部分は、糖オキサゾリンである。

0168

適切な条件は、反応混合物を少なくとも20分、30分、40分、50分、60分、70分、80分、90分または100分、好ましくは60分未満にわたってインキュベートすることも含む。インキュベーションは室温で行うことが好ましく、およそ20℃、25℃、30℃、35℃、40℃または45℃で行うことがより好ましく、およそ37℃で行うことが最も好ましい。

0169

本発明のα−フコシダーゼのポリペプチドは、それらの単離または精製を補助するために、誘導体化または修飾することができることが理解されよう。したがって、本発明の一実施形態では、本発明において使用するためのポリペプチドを、分離手段に直接かつ特異的に結合することができるリガンドを付加することによって誘導体化または修飾する。あるいは、ポリペプチドを、結合対の一方のメンバーを付加することによって誘導体化または修飾し、分離手段に、結合対の他方のメンバーを付加することによって誘導体化または修飾される試薬を含める。任意の適切な結合対を使用することができる。本発明において使用するためのポリペプチドを、結合対の一方のメンバーを付加することによって誘導体化または修飾する好ましい実施形態では、ポリペプチドにヒスチジン−タグを付けるまたはビオチン−タグを付けることが好ましい。一般には、ヒスチジンまたはビオチンタグのアミノ酸コード配列を遺伝子レベルで含め、E.coliにおいて組換えによりタンパク質を発現させる。ヒスチジンまたはビオチンタグは、一般には、ポリペプチドの一端、N末端またはC末端のいずれかに存在する。ヒスチジンタグは、一般には6つのヒスチジン残基からなるが、これより長くてもよく、一般には、最大7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸または20アミノ酸またはそれ未満、例えば、5アミノ酸、4アミノ酸、3アミノ酸、2アミノ酸または1アミノ酸であってよい。さらに、ヒスチジンタグは、アミノ酸置換、好ましくは上で定義されている保存的置換を1つまたは複数含有してよい。

0170

本明細書に記載のバリアントポリペプチドは、アミノ酸配列が配列番号5のものから変動するものであるが、配列番号5のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む酵素の同じまたは同様の機能を示す。

0171

本明細書で使用される場合、配列に関するパーセント(%)配列同一性は、配列をアラインメントし、必要であれば、最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補ポリペプチド配列内のアミノ酸残基の百分率と定義される。パーセント配列同一性を決定するためのアラインメントは、当技術分野の技術の範囲内である種々のやり方で、例えば、BLAST、ALIGNまたはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含めた、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。

0172

本発明のいくつかの好ましい実施形態が実施例において実証されている。

0173

非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体には、非ヒトである供給源から1つまたは複数のアミノ酸残基が導入されている。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「移入」残基と称され、一般には、「移入」可変ドメインから取得される。ヒト化は、基本的に、Winterおよび共同研究者(Jonesら、Nature、321巻:522〜525頁(1986年);Riechmannら、Nature、332巻:323〜327頁(1988年);Verhoeyenら、Science、239巻:1534〜1536頁(1988年))の方法に従って、齧歯類CDRまたはCDR配列をヒト抗体の対応する配列の代わりに使用することによって実施することができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)であり、非ヒト種に由来する対応する配列で置換されているインタクトなヒト可変ドメインが実質的により少ない。実際には、ヒト化抗体は、一般には、いくつかのCDR残基および場合によっていくつかのFR残基が齧歯類抗体における類似部位由来の残基で置換されたヒト抗体である。

0174

ヒト化抗体の作出に使用する軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「最良適合」法に従って、齧歯類抗体の可変ドメインの配列を公知のヒト可変ドメイン配列ライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、齧歯類の配列に最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク(FR)として許容する(Simsら、J. Immunol.、151巻:2296頁(1993年);Chothiaら、J. Mol. Biol.、196巻:901頁(1987年))。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる(Carterら、Proc. Natl. Acad Sci. USA、89巻:4285頁(1992年);Prestaetal.、J. Immnol.、151巻:2623頁(1993年))。

0175

さらに、抗体を、抗原に対する高親和性および他の好都合な生物学的性質を保持させながらヒト化することが重要である。この目標を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の3次元モデルを使用した、親の配列および種々の概念的なヒト化産物の分析のプロセスによって調製される。3次元免グロブリンモデルが一般に利用可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性のある3次元コンフォメーション構造を例示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンのそれの抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このように、FR残基をレシピエントから選択し、組み合わせ、配列に移入し得、したがって、標的抗原(複数可)に対する親和性の増大などの所望の抗体特性を達成する。一般に、CDR残基は、抗原結合への影響に直接かつほぼ実質的に関与する。

0176

あるいは、現在、免疫化すると内在性免疫グロブリン産生の不在下でヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作製することが可能である。例えば、キメラおよび生殖細胞系変異体マウスにおける抗体重鎖連結領域(JH)遺伝子のホモ接合性欠失により、内在性抗体産生の完全な阻害がもたらされることが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスにおけるヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移行により、抗原による攻撃に際してヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Jakobovitsら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA、90巻:2551頁(1993年);Jakobovitsら、Nature、362巻:255〜258頁(1993年);Bruggermannら、Year in Immuno.、7巻:33頁(1993年)を参照されたい。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーから導出することもできる(Hoogenboomら、J. Mol. Biol.、227巻:381頁(1991年);Marksら、J. Mol. Biol.、222巻:581〜597頁(1991年))。

0177

医薬製剤
本発明の抗体を含む治療用製剤は、保管のために、所望の程度の純度を有する抗体を任意選択の生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって(Remington’s Pharmaceutical Sciences 第16版、Osol, A.編(1980年))、水溶液凍結乾燥製剤または他の乾燥製剤の形態で調製する。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性のものであり、それらとして、リン酸、クエン酸、ヒスチジンおよび他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド塩化ヘキサメトニウム塩化ベンザルコニウム塩化ベンゼトニウムフェノールブチルまたはベンジルアルコールメチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベンカテコールレゾルシノールシクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾールなど);低分子量(約10残基未満の)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸;グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物;EDTAなどのキレート化剤スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成性対イオン;金属錯体(例えば、Zn−タンパク質複合体);および/またはTWEEN(商標)、PLURONICS(商標)またはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性物質が挙げられる。

0178

本明細書の製剤は、これだけに限定されないが、互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有するものを含めた、処置される特定の適応症に関して、必要に応じて1つ超の活性化合物も含有してよい。そのような分子は、意図された目的のために有効な量で組み合わせて適切に存在させる。

0179

活性成分は、例えば、コアセルベーション技法によってまたは界面重合によって調製したマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェアマイクロエマルションナノ粒子およびナノカプセル)に、またはマクロエマルション封入され得る。そのような技法は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 第16版、Osol, A.編(1980年)に開示されている。

0180

in vivo投与に使用する製剤は、無菌であるべきである。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することによって容易に達成される。

0181

持続放出調製物を調製することができる。持続放出調製物の適切な例としては、本発明の免疫グロブリンを含有する固体疎水性ポリマー半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、造形品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例としては、ポリエステルハイドロゲル(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチルメタクリレート)、またはポリ(ビニルアルコール))、ポリ乳酸(米国特許第3,773,919号)、L−グルタミン酸とγエチル−L−グルタメート共重合体非分解性エチレン−酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商標)(乳酸グリコール酸共重合体および酢酸リュープロリドで構成される注射可能なマイクロスフェア)などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−D−(−)−3−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーでは100日超にわたって分子を放出させることが可能であるが、ある特定のハイドロゲルでは、より短い期間にわたってタンパク質が放出される。カプセル封入された免疫グロブリンが長時間にわたって体内に留まる場合、それらは37℃で水分に曝露された結果として変性または凝集し、その結果、生物活性の喪失および起こり得る免疫原性の変化が生じる可能性がある。関与する機構に応じて、安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構が、チオ−ジスルフィド交換による分子間S−−S結合の形成であることが分かった場合、スルフヒドリル残基を修飾すること、酸性溶液から凍結乾燥させること、適切な添加剤を使用して水分含量を制御すること、および特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって安定化を達成することができる。

0182

凍結乾燥前製剤中の抗体の量は、所望の用量体積、投与の様式(複数可)などを考慮に入れて決定する。選択されたタンパク質がインタクトな抗体(全長抗体)である場合、例示的な出発タンパク質濃度は、約2mg/mLから約50mg/mLまで、好ましくは約5mg/mLから約40mg/mLまで、最も好ましくは約20mg/mLから30mg/mLまでである。タンパク質は、一般に、溶液中に存在する。例えば、タンパク質は、pH緩衝溶液中に約4〜8、好ましくは約5〜7のpHで存在し得る。例示的な緩衝液としては、ヒスチジン、リン酸、トリス、クエン酸、コハク酸および他の有機酸が挙げられる。緩衝液の濃度は、例えば、緩衝液および製剤(例えば、再構成製剤)の所望の等張性に応じて、約1mMから約20mMまで、または約3mMから約15mMまでであり得る。以下で実証される通り、凍結保護性を有し得るという点で、ヒスチジンが好ましい緩衝液である。コハク酸が別の有用な緩衝液であることが示された。

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