図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2020年10月8日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (20)

課題

食物アレルゲンを含むアレルゲン現地迅速検出に有用なアレルゲン検出分子及びデバイスを提供する。

解決手段

シグナル発生ポリヌクレオチドは、ピーナッツアレルゲン、カシューナッツアレルゲン、ミルクアレルゲン、アレルゲン、アレルゲン、グルテンアレルゲン、大豆アレルゲン、又は甲殻類アレルゲンに特異的に結合する、所定のヌクレオチド配列を含む。試料中のアレルゲンを検出するためのデバイスは、試料収集チャンバ及びタンパク質抽出膜を含むカートリッジと、検出チャンバ及び核酸に基づく検出分子と、検出器ユニットと、アレルゲンの検出を示すための表示ウィンドウと、試料採取機構とを備える。

概要

背景

アレルギーは、全世界で何百万もの人々、合衆国では約1500万人に影響を及ぼしている重大な医学的状態であり、その中には多くの小児が含まれている。アレルギー反応では、免疫系が、アレルゲンを誤って脅威として標的とし、それを攻撃する。アレルギー反応は、皮膚、消化器系胃腸管呼吸器系、循環系、及び心血管系に影響を及ぼす場合があり、幾つかのアレルギー反応では、複数の臓器系が影響を受ける。アレルギー反応は、軽症から重症又は生死に関わるものまで様々である。重篤な症状には、呼吸困難低血圧胸痛意識消失、及びアナフィラキシーが含まれ得る。アレルギーを有する人々は、現在、特定のアレルゲンを含有する可能性のあるあらゆる食品を回避することにより、自身のアレルギーを管理している。こうした制限は、患者の生活の質に大きな影響を及ぼし、食品のアレルゲン含有を正しく評価する方法は依然として存在しない。合衆国では、3分に1人が、食物アレルギーの症状で緊急処置室に搬送されている。アレルゲンの存在を迅速に決定する方法があれば、有益性は大きいであろう。患者自身が食品を試験して、アレルゲン含有を正確に及び直ちに決定することが可能な携帯デバイスは、詳細な情報を得たうえで食べるか否かを決断するために有益であろう。

McKayの特許文献1には、食物アレルゲンを検出するための食事用マットであって、吸収材料、及び上記マットの別々の領域に塗布されている化学試薬の小さなスポットで形成されている食事用マットが教示されている。食品がアレルギー原因物質を含有していれば、化学試薬の外観が変化し、食品中にアレルギー原因物質が存在することを指し示すことになる。検出限界及び検出特異性は、スポットに使用される化学試薬次第である。欠点としては、固形食品分析する場合、固形食品とスポット試薬との反応時間が長いため、偽陰性を示す可能性が高いということである。

Jungらの特許文献2及び特許文献3には、1つ又は複数のアレルゲン指標を分析するように構成されているマイクロ流体チップ試料を処理し、1つ又は複数の検出ユニットでアレルゲン指標を検出し、1つ又は複数の表示ユニットで結果を表示することより、アレルゲンを検出する方法が教示されている。この検出システムは、マイクロ流体チップ、試薬送達ユニット遠心分離ユニット分析ユニット、検出ユニット、表示ユニット、及び記録ユニットを含む。このデバイスは、携帯できるほど小型ではない。

Scottらの特許文献4には、食物アレルゲンを検出するための携帯デバイスであって、筺体試料入口ポート、試料に含まれている可能性のあるアレルゲンの存在を示すための手段、及び上記試料に含まれている可能性のあるアレルゲンに対する抗体を含み、上記抗体が検出可能なタグで標識されているアレルゲン検出チップを含む携帯デバイスが教示されている。

Roydsの特許文献5には、食品試料中の有害汚染物質の存在を特定するための食品試験デバイスであって、使い捨ての試料容器ブレードアッセンブリを含む機械液化装置;及び有害汚染物質に対する親和性を有し、液化食品試料中の有害汚染物質を検出し、有害汚染物質を認識すると視覚的な合図を生成することが可能な試薬を有する試験供給区画を含むデバイスが教示されている。

アプタマー、並びにアプタマーを使用して食品中のタンパク質を検出するためのデバイス及び方法が、以下のものを含む幾つかの特許及び特許出願(それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる)に開示されている:Kimらの特許文献6には、官能化ポリジアセチレン分子センサーマイクロアレイが教示されている;Brunnerらの特許文献7には、アプタマーに基づく抗CETP抗体誘導抗原を使用して、アテローム性動脈硬化症治療するための方法が教示されている;及びRasoolyらの特許文献8には、「電気浸透」(ランダム抵抗ネットワークによる電気の流れ)と呼ばれる物理原理を使用して、半導体での生体分子結合を電気的に検出するための方法及びシステムが教示されている。1つの実施形態では、標的分子と結合する捕捉分子は、アプタマーであってもよい。Lowery,Jr.らの特許文献9には、分析物収集及び検出するためのNMRシステム及び方法が教示されている。Yokotaらの特許文献10には、内因性カイロミクロンを使用することにより標的遺伝子発現を抑制するために核酸送達するためのシステムであって、上記核酸がアプタマーであってもよいシステムが教示されている。Herzogらの特許文献11には、ペプチドYY(PYY)の発現レベルが低減されているトランスジェニック動物、及び上記トランスジェニック動物を使用して、アプタマーのライブラリースクリーニングし、PYYのアゴニスト及びアンタゴニストを特定するための方法が教示されている。Lieberらの特許文献12には、分析物を検出するための蛍光に基づくナノスケールワイヤバイオセンサーデバイス及び方法であって、アプタマーが、上記ナノスケールワイヤに対して間接的に固定されていてもよいデバイス及び方法が開示されている。Hornbeckらの特許文献13には、カルシノーマ及び/又は白血病で特定された新規チロシンリン酸化部位を検出及び定量化するための側方流動デバイスが教示されている。Mataらの特許文献14には、血清レチノールレチノール結合タンパク質(RBP)、及び/又はトランスサイレチンTTR)の活性又は利用能を調節することができる巨大分子及び他の分析物を検出するためのバイオセンサーが教示されている。Gordonらの特許文献15には、捕捉剤の組み合わせを使用することを含み、捕捉剤がアプタマーであってもよい、試料中にある少量のタンパク質アイソフォーム(例えば、選択的スプライシング、又は異なる疾患タンパク質アイソフォーム、又は分解産物による)を検出するための方法、試薬、及び装置が教示されている。Vukicevicらの特許文献16には、硬骨及び軟組織欠損及び障害診断及び治療するための、骨形態形成タンパク質(BMP)、例えば、BMP−1プロコラーゲンc−プロテイナーゼの核酸バイオセンサーが教示されている。

アナフィラトキシンC5a−(補体因子5a)−結合アプタマーが、Buchnerらの特許文献17、特許文献18、及び特許文献19に記載されている。また、Buchnerらの特許文献20には、CXCケモカインストロマ細胞由来因子−1(SDF−I)に結合するアプタマーが記載されている。

分子ビーコン(MB)は、フルオロフォア部分及びクエンチャー部分両方とも含み、スイッチのように作用するヘアピン型オリゴヌクレオチドである。閉じた状態では、フルオロフォア及びクエンチャーは共に近傍にあり、蛍光は、共鳴エネルギー移動により消光される(「スイッチオフ」)。構造変化によりヘアピン構造が開き、フルオロフォアがクエンチャーと離れると、クエンチャーはもはや消光することができず、蛍光は回復する(「スイッチオン」)。MBは、感度が高く、優れた分子認識特異性を有するプローブを必要とする検出デバイス及び診断アッセイに特に有用である。それらは、非常に標的特異的であり、ヌクレオチドが1でも異なると核酸標的配列は無視される。MBの他の利点は、以下の通りである:(1)高感度であり、リアルタイムモニタリングが可能である;(2)バックグラウンドシグナルが低く、200倍を超える蛍光増強が可能である;(3)MBでは、過剰な未ハイブリダイズプローブからプローブ−標的ハイブリッドを単離することが不可能又は望ましくない場合、「分離せずに検出する」ことが可能である。MBのループステム構造がもたらす特異性は、様々な生物学的環境使用可能であることが実証されている。本明細書で開示されている組成物、方法、及びデバイスは、溶液中(in vitro)でのRNA−DNA相互作用の研究、タンパク質−DNA相互作用の研究、生体系内での測定、及びバイオセンサーの設計に応用可能である。例えば、本明細書に記載の組成物は、PCR中にDNA/RNA増幅リアルタイムモニタリングすること等のin vitro研究;臨床診断用の迅速で信頼性の高い突然変異検出(非特許文献1);スペクトル核型決定(非特許文献2):DNA粘着末端対合SEP)分析;RNAの細胞局在性及び細胞輸送経路可視化(非特許文献3)に使用することができる。

例示的な分子ビーコンは、非特許文献4に概説されており、以下の文献に記載されている:Litmanらの特許文献21、この文献には、癌に関連するマイクロRNA(miRNA)配列、並びにアプタマー及び分子ビーコンを使用したそれらの検出が教示されている;Meyersらの特許文献22、この文献には、新規のプロテインキナーゼセリントレオニンプロテインキナーゼ、セリン/トレオニンホスファターゼプロリルオリゴペプチダーゼトリプシンセリンプロテアーゼ、及びユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼファミリーメンバーが教示されており、明細書では、それらは「53070、15985、26583、21953、m32404、14089、及び23436」と呼ばれており、概して、アプタマー又は分子ビーコンを使用してそれらを検出する方法が開示されている;及びKapeller−Libermannらの特許文献23、この文献には、3つの新規とされているプロテインキナーゼファミリーメンバーが教示されており、明細書では、それらは「2504、15977、及び14760」と呼ばれており、概して、アプタマー又は分子ビーコンを使用したそれらの検出が開示されている。

迅速で正確なアレルゲン検出用の携帯可能な及び再使用可能なデバイスの必要性が依然として存在している。単一のデバイスを用いて複数のアレルゲンを検出する必要性も依然として存在している。

概要

食物アレルゲンを含むアレルゲンの現地迅速検出に有用なアレルゲン検出分子及びデバイスを提供する。シグナル発生ポリヌクレオチドは、ピーナッツアレルゲン、カシューナッツアレルゲン、ミルクアレルゲン、アレルゲン、アレルゲン、グルテンアレルゲン、大豆アレルゲン、又は甲殻類アレルゲンに特異的に結合する、所定のヌクレオチド配列を含む。試料中のアレルゲンを検出するためのデバイスは、試料収集チャンバ及びタンパク質抽出膜を含むカートリッジと、検出チャンバ及び核酸に基づく検出分子と、検出器ユニットと、アレルゲンの検出を示すための表示ウィンドウと、試料採取機構とを備える。

目的

本発明は、種々のタイプの試料中でのアレルゲン検出に使用するためのデバイス、方法、及び検出分子を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

シグナル発生ポリヌクレオチドであって、(i)ピーナッツアレルゲンに特異的に結合する、配列番号16、17、42〜65からなる群から選択されるヌクレオチド配列、(ii)カシューナッツアレルゲンに特異的に結合する、配列番号18〜41からなる群から選択されるヌクレオチド配列、(iii)ミルクアレルゲンに特異的に結合する、配列番号66〜87からなる群から選択されるヌクレオチド配列、(iv)アレルゲンに特異的に結合する、配列番号88〜112からなる群から選択されるヌクレオチド配列、(v)アレルゲンに特異的に結合する、配列番号113〜136からなる群から選択されるヌクレオチド配列、(vi)グルテンアレルゲンに特異的に結合する、配列番号137〜160からなる群から選択されるヌクレオチド配列、(vii)大豆アレルゲンに特異的に結合する、配列番号161〜181からなる群から選択されるヌクレオチド配列、又は(viii)甲殻類アレルゲンに特異的に結合する、配列番号182〜201からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、シグナル発生ポリヌクレオチド。

請求項2

フルオロフォア及びクエンチャーをさらに含み、これらは、前記クエンチャーが前記フルオロフォアの蛍光消光するのに十分な程度に近傍にある、請求項1に記載のシグナル発生ポリヌクレオチド。

請求項3

前記フルオロフォア及び前記クエンチャーが、前記ヌクレオチド配列の反対端に連結されており、前記ヌクレオチド配列の5’末端の5〜20個の核酸塩基残基が、ヘアピン構造を形成可能な前記ヌクレオチド配列の3’末端の5〜20個の核酸塩基残基に少なくとも80%相補性であることにより、前記クエンチャーが、前記フルオロフォアの蛍光を消光するのに十分な程度に前記フルオロフォアの近傍に配置される、請求項2に記載のシグナル発生ポリヌクレオチド。

請求項4

前記ヌクレオチド配列の5’末端にアニーリングされた5〜20核酸塩基長リンカー配列を更に含み、前記リンカー配列は、前記ヌクレオチド配列の5’末端と少なくとも80%の相補性を有し、前記ヌクレオチド配列がフルオロフォアを含み、前記リンカー配列がクエンチャーを含むか、又は前記ヌクレオチド配列がクエンチャーを含み、前記リンカー配列がフルオロフォアを含む、請求項2に記載のシグナル発生ポリヌクレオチド。

請求項5

試料中のアレルゲンを検出するためのデバイスであって、(a)試料を受容し、その試料から1つ以上の緩衝液を用いてアレルゲンを抽出するように構成された試料収集チャンバ及びタンパク質抽出膜を含むカートリッジと、(b)試料から抽出されたアレルゲンと接触するように構成された少なくとも1つの検出チャンバであって、前記試料収集チャンバと関わりを持つ前記検出チャンバ、及び核酸に基づく検出分子と、(c)蛍光励起蛍光発光フィルタリング、及び蛍光発光の検出のための手段を備える検出器ユニットであって、前記検出チャンバと関わりを持ち、蛍光シグナルを検出し、検出されたシグナルをデジタル化するように構成されている検出器ユニットと、(d)前記検出されたシグナルを受信し、前記アレルゲンの検出を示すための少なくとも1つの表示ウィンドウと、(e)針の内部にあるドリルビットを含むドリルプローブを有する試料採取機構とを備えるデバイス。

請求項6

1対の検出チャンバを含み、前記1対の検出チャンバの一方の検出チャンバが、陰性対照を提供し、前記1対の検出チャンバの他方の検出チャンバが、前記アレルゲンを検出し、任意選択で、デバイスは前記アレルゲンの検出を示すための1対の表示ウィンドウを含み、前記1対の表示ウィンドウが、前記1対の検出チャンバに対応する、請求項5に記載のデバイス。

請求項7

前記カートリッジが、前記試料収集チャンバ内への前記試料の進入に先立って、消化緩衝液を試料収集チャンバに送るためのシリンジポンプを含み、任意選択で、前記シリンジポンプは、流体導管を介して前記試料収集チャンバ及び前記検出チャンバと流体連通しており、前記流体導管は、シリンジ出口から前記試料収集チャンバまで伸長する第1の導管と、前記検出チャンバから前記シリンジまで伸長する第2の流体導管とを含み、前記第1の導管は、流体を前記シリンジに引き込む際に、前記試料収集チャンバから前記シリンジへと流体が逆流することを防止するように構成されている第1の一方向バルブを含み、前記第2の流体導管は、流体を前記シリンジから運び出す際に、流体が前記検出チャンバ内へと流れることを防止するように構成されている第2の一方向バルブを含む、請求項5に記載のデバイス。

請求項8

(i)前記カートリッジが使い捨てであるか、又は(ii)前記核酸に基づく検出分子は、アレルゲンに特異的に結合するアプタマーを含むシグナル発生ポリヌクレオチドである、請求項5〜7のいずれか一項に記載のデバイス。

技術分野

0001

本発明は、アレルゲンを検出するための方法、デバイス、及び分子に関する。

背景技術

0002

アレルギーは、全世界で何百万もの人々、合衆国では約1500万人に影響を及ぼしている重大な医学的状態であり、その中には多くの小児が含まれている。アレルギー反応では、免疫系が、アレルゲンを誤って脅威として標的とし、それを攻撃する。アレルギー反応は、皮膚、消化器系胃腸管呼吸器系、循環系、及び心血管系に影響を及ぼす場合があり、幾つかのアレルギー反応では、複数の臓器系が影響を受ける。アレルギー反応は、軽症から重症又は生死に関わるものまで様々である。重篤な症状には、呼吸困難低血圧胸痛意識消失、及びアナフィラキシーが含まれ得る。アレルギーを有する人々は、現在、特定のアレルゲンを含有する可能性のあるあらゆる食品を回避することにより、自身のアレルギーを管理している。こうした制限は、患者の生活の質に大きな影響を及ぼし、食品のアレルゲン含有を正しく評価する方法は依然として存在しない。合衆国では、3分に1人が、食物アレルギーの症状で緊急処置室に搬送されている。アレルゲンの存在を迅速に決定する方法があれば、有益性は大きいであろう。患者自身が食品を試験して、アレルゲン含有を正確に及び直ちに決定することが可能な携帯デバイスは、詳細な情報を得たうえで食べるか否かを決断するために有益であろう。

0003

McKayの特許文献1には、食物アレルゲンを検出するための食事用マットであって、吸収材料、及び上記マットの別々の領域に塗布されている化学試薬の小さなスポットで形成されている食事用マットが教示されている。食品がアレルギー原因物質を含有していれば、化学試薬の外観が変化し、食品中にアレルギー原因物質が存在することを指し示すことになる。検出限界及び検出特異性は、スポットに使用される化学試薬次第である。欠点としては、固形食品分析する場合、固形食品とスポット試薬との反応時間が長いため、偽陰性を示す可能性が高いということである。

0004

Jungらの特許文献2及び特許文献3には、1つ又は複数のアレルゲン指標を分析するように構成されているマイクロ流体チップ試料を処理し、1つ又は複数の検出ユニットでアレルゲン指標を検出し、1つ又は複数の表示ユニットで結果を表示することより、アレルゲンを検出する方法が教示されている。この検出システムは、マイクロ流体チップ、試薬送達ユニット遠心分離ユニット分析ユニット、検出ユニット、表示ユニット、及び記録ユニットを含む。このデバイスは、携帯できるほど小型ではない。

0005

Scottらの特許文献4には、食物アレルゲンを検出するための携帯デバイスであって、筺体試料入口ポート、試料に含まれている可能性のあるアレルゲンの存在を示すための手段、及び上記試料に含まれている可能性のあるアレルゲンに対する抗体を含み、上記抗体が検出可能なタグで標識されているアレルゲン検出チップを含む携帯デバイスが教示されている。

0006

Roydsの特許文献5には、食品試料中の有害汚染物質の存在を特定するための食品試験デバイスであって、使い捨ての試料容器ブレードアッセンブリを含む機械液化装置;及び有害汚染物質に対する親和性を有し、液化食品試料中の有害汚染物質を検出し、有害汚染物質を認識すると視覚的な合図を生成することが可能な試薬を有する試験供給区画を含むデバイスが教示されている。

0007

アプタマー、並びにアプタマーを使用して食品中のタンパク質を検出するためのデバイス及び方法が、以下のものを含む幾つかの特許及び特許出願(それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる)に開示されている:Kimらの特許文献6には、官能化ポリジアセチレン分子センサーマイクロアレイが教示されている;Brunnerらの特許文献7には、アプタマーに基づく抗CETP抗体誘導抗原を使用して、アテローム性動脈硬化症治療するための方法が教示されている;及びRasoolyらの特許文献8には、「電気浸透」(ランダム抵抗ネットワークによる電気の流れ)と呼ばれる物理原理を使用して、半導体での生体分子結合を電気的に検出するための方法及びシステムが教示されている。1つの実施形態では、標的分子と結合する捕捉分子は、アプタマーであってもよい。Lowery,Jr.らの特許文献9には、分析物収集及び検出するためのNMRシステム及び方法が教示されている。Yokotaらの特許文献10には、内因性カイロミクロンを使用することにより標的遺伝子発現を抑制するために核酸送達するためのシステムであって、上記核酸がアプタマーであってもよいシステムが教示されている。Herzogらの特許文献11には、ペプチドYY(PYY)の発現レベルが低減されているトランスジェニック動物、及び上記トランスジェニック動物を使用して、アプタマーのライブラリースクリーニングし、PYYのアゴニスト及びアンタゴニストを特定するための方法が教示されている。Lieberらの特許文献12には、分析物を検出するための蛍光に基づくナノスケールワイヤバイオセンサーデバイス及び方法であって、アプタマーが、上記ナノスケールワイヤに対して間接的に固定されていてもよいデバイス及び方法が開示されている。Hornbeckらの特許文献13には、カルシノーマ及び/又は白血病で特定された新規チロシンリン酸化部位を検出及び定量化するための側方流動デバイスが教示されている。Mataらの特許文献14には、血清レチノールレチノール結合タンパク質(RBP)、及び/又はトランスサイレチンTTR)の活性又は利用能を調節することができる巨大分子及び他の分析物を検出するためのバイオセンサーが教示されている。Gordonらの特許文献15には、捕捉剤の組み合わせを使用することを含み、捕捉剤がアプタマーであってもよい、試料中にある少量のタンパク質アイソフォーム(例えば、選択的スプライシング、又は異なる疾患タンパク質アイソフォーム、又は分解産物による)を検出するための方法、試薬、及び装置が教示されている。Vukicevicらの特許文献16には、硬骨及び軟組織欠損及び障害診断及び治療するための、骨形態形成タンパク質(BMP)、例えば、BMP−1プロコラーゲンc−プロテイナーゼの核酸バイオセンサーが教示されている。

0008

アナフィラトキシンC5a−(補体因子5a)−結合アプタマーが、Buchnerらの特許文献17、特許文献18、及び特許文献19に記載されている。また、Buchnerらの特許文献20には、CXCケモカインストロマ細胞由来因子−1(SDF−I)に結合するアプタマーが記載されている。

0009

分子ビーコン(MB)は、フルオロフォア部分及びクエンチャー部分両方とも含み、スイッチのように作用するヘアピン型オリゴヌクレオチドである。閉じた状態では、フルオロフォア及びクエンチャーは共に近傍にあり、蛍光は、共鳴エネルギー移動により消光される(「スイッチオフ」)。構造変化によりヘアピン構造が開き、フルオロフォアがクエンチャーと離れると、クエンチャーはもはや消光することができず、蛍光は回復する(「スイッチオン」)。MBは、感度が高く、優れた分子認識特異性を有するプローブを必要とする検出デバイス及び診断アッセイに特に有用である。それらは、非常に標的特異的であり、ヌクレオチドが1でも異なると核酸標的配列は無視される。MBの他の利点は、以下の通りである:(1)高感度であり、リアルタイムモニタリングが可能である;(2)バックグラウンドシグナルが低く、200倍を超える蛍光増強が可能である;(3)MBでは、過剰な未ハイブリダイズプローブからプローブ−標的ハイブリッドを単離することが不可能又は望ましくない場合、「分離せずに検出する」ことが可能である。MBのループステム構造がもたらす特異性は、様々な生物学的環境使用可能であることが実証されている。本明細書で開示されている組成物、方法、及びデバイスは、溶液中(in vitro)でのRNA−DNA相互作用の研究、タンパク質−DNA相互作用の研究、生体系内での測定、及びバイオセンサーの設計に応用可能である。例えば、本明細書に記載の組成物は、PCR中にDNA/RNA増幅リアルタイムモニタリングすること等のin vitro研究;臨床診断用の迅速で信頼性の高い突然変異検出(非特許文献1);スペクトル核型決定(非特許文献2):DNA粘着末端対合SEP)分析;RNAの細胞局在性及び細胞輸送経路可視化(非特許文献3)に使用することができる。

0010

例示的な分子ビーコンは、非特許文献4に概説されており、以下の文献に記載されている:Litmanらの特許文献21、この文献には、癌に関連するマイクロRNA(miRNA)配列、並びにアプタマー及び分子ビーコンを使用したそれらの検出が教示されている;Meyersらの特許文献22、この文献には、新規のプロテインキナーゼセリントレオニンプロテインキナーゼ、セリン/トレオニンホスファターゼプロリルオリゴペプチダーゼトリプシンセリンプロテアーゼ、及びユビキチンカルボキシ末端ヒドロラーゼファミリーメンバーが教示されており、明細書では、それらは「53070、15985、26583、21953、m32404、14089、及び23436」と呼ばれており、概して、アプタマー又は分子ビーコンを使用してそれらを検出する方法が開示されている;及びKapeller−Libermannらの特許文献23、この文献には、3つの新規とされているプロテインキナーゼファミリーメンバーが教示されており、明細書では、それらは「2504、15977、及び14760」と呼ばれており、概して、アプタマー又は分子ビーコンを使用したそれらの検出が開示されている。

0011

迅速で正確なアレルゲン検出用の携帯可能な及び再使用可能なデバイスの必要性が依然として存在している。単一のデバイスを用いて複数のアレルゲンを検出する必要性も依然として存在している。

0012

米国特許第5,824,554号明細書
米国特許出願公開第2008/0182339号明細書
米国特許第8,617,903号明細書
米国特許出願公開第2010/0210033号明細書
米国特許第7,527,765号明細書
米国特許第8,633,140号明細書
米国特許第8,618,046号明細書
米国特許第8,614,466号明細書
米国特許第8,563,298号明細書
米国特許第8,507,458号明細書
米国特許第8,236,933号明細書
米国特許第8,232,584号明細書
米国特許第7,977,462号明細書
米国特許第7,973,079号明細書
米国特許第7,855,057号明細書
米国特許第7,850,964号明細書
国際公開第2009/040113号
国際公開第2010/108657号
国際公開第2013/104540号
国際公開第2009/019007号
米国特許第8,188,255号明細書
米国特許第7,282,360号明細書
米国特許第6,730,491号明細書

先行技術

0013

Xiaoら、(2009年)Fluorescence Detection of Single Nucleotide Polymorphisms via a Single,Self−Complementary,Triple−stem DNA Probe.Angew Chem.Int.Ed.Engl.48巻(24号):4354〜4358頁
Kostrikisら、Science、1998年、279巻:1228頁
Tanら、(2005年)Molecular Beacons for Bioanalytical Applications.Analyst 130巻:1002〜1005頁
Leungら、2011年(Nucleic AcidsResearch、2012年、40巻(3号):941〜955頁)

0014

本発明は、種々のタイプの試料中でのアレルゲン検出に使用するためのデバイス、方法、及び検出分子を提供する。
本発明の1つの態様は、試料中の1種又は複数種のアレルゲンを検出するための方法であって、(a)アレルゲンを含有する疑いのある試料を得るステップ、(b)1種又は複数種の緩衝液で(a)の試料を消化するステップ、(c)上記消化試料を検出分子と接触させるステップ、(d)上記接触試料を励起手段で処理するステップ、及び(e)上記検出分子及び上記アレルゲンの相互作用を可視化するステップを含む方法である。

0015

本発明の別の態様は、試料中のアレルゲンを検出するためのデバイスである。上記デバイスは、以下の部品を支持するように構成されている本体を含む:(a)上記試料を収集及び処理するためのカートリッジ;(b)蛍光励起を提供するための手段;(c)蛍光発光フィルタリングするための光フィルタ;(d)上記アレルゲン及び検出分子を混合するための検出チャンバ;(e)検出シグナルデジタル化するための手段を含む、蛍光発光を検出するための検出器;及び(f)上記検出シグナルを受け取り、上記アレルゲンの検出を示すための表示ウィンドウ

図面の簡単な説明

0016

本発明の1つの実施形態による検出デバイス10の概略図である。
本発明の検出デバイスの別の実施形態で使用されるカートリッジ1400の概略図である。この図には、シリンジプランジャー1408をシリンジ1406のバレルに押し込んだ時のカートリッジ内の流体の流れの方向が示されている。流体(消化緩衝液D)は、一方向バルブ1422から混合チャンバ1410に注入される。
図2Aの同じカートリッジ1400の概略図である。この図には、シリンジプランジャー1408をシリンジ1406のバレルから引き出した時のカートリッジ内の流体の流れの方向が示されている。流体は、検出チャンバ1426から第2の一方向バルブ1424を介してシリンジ1406のバレルへと引き出されて戻る。
その前部ローブと後部ローブ(それぞれ、2015及び2025)との間に配置されている把持ハンドル2017を有する砂時計型基本形状をしている検出デバイス2000の別の実施形態を示す図である。
コア配列202、フルオロフォア204、クエンチャー206、及びリンカー配列208を含むシグナル発生ポリヌクレオチドSPN−A*200により表わされる検出分子の第2の配列を示す図である。
ヘアピン型シグナル発生ポリヌクレオチドSPN−E300により表わされる検出分子とその標的分子リゾチームとの反応を示す図である。また、アプタマーコア配列302、フルオロフォア304、およびクエンチャー306が示されている。
二量体シグナル発生ポリヌクレオチドSPN−E*400(アニーリングされたリンカー配列408を含む)により表わされる検出分子とその標的分子リゾチームとの反応を示す図である。また、アプタマーコア配列402、フルオロフォア404、およびクエンチャー406が示されている。
一般的なシグナル発生ポリヌクレオチド500と分子標的としてのリゾチームとの反応を示す図である。シグナル発生ポリヌクレオチド500は、フルオロフォア504が連結されているコア配列502を有する。また、シグナル発生ポリヌクレオチド500は、クエンチャー506が連結されているリンカー配列508を含む。リンカー配列508が、コア配列502にアニーリングされると、それによりクエンチャー506がフルオロフォア504の近傍に配置されるリゾチームがコア配列502に結合すると、ヘアピンを有する二次構造が形成され、それによりリンカー配列508が放出され、クエンチャー506は、もはやフルオロフォア504の蛍光を消光しなくなる。
一般的なヘアピン型シグナル発生ポリヌクレオチド600と分子標的としてのリゾチームとの反応を示す図である。シグナル発生ポリヌクレオチド600は、フルオロフォアが5’末端に連結されており、クエンチャー606が3’末端に連結されているコア配列602を有する。コア配列602は、クエンチャー606をフルオロフォア604に十分に接近させて、その蛍光を消光するヘアピン区画を有する。リゾチームがコア配列602に結合すると、ヘアピン構造が崩れ、クエンチャー606はフルオロフォア504から離れ、クエンチャー606は、もはやフルオロフォア604の蛍光を消光しなくなる。
SPN−Eによるリゾチームの蛍光検出グラフである(519nmの光学濃度リゾチーム濃度)。
様々な濃度のリゾチームを有する3つの試料の、SPN−E*によるリゾチームの蛍光検出の範囲を示す棒グラフである(519nmの光学濃度)。
様々なピコグラム量のリゾチームを含む3つの試料並びに卵白及びBSAを含む試料の、SPN−Eによるリゾチームの蛍光検出の範囲を示す棒グラフである(519nmの光学濃度)。卵白は、むろんリゾチームを含有する。
ミルク又はBSAと混合したリゾチームを有する2つの試料を含む、様々な濃度のリゾチームを有する4つの試料の、SPN−E*によるリゾチームの蛍光検出の範囲を示す棒グラフである(519nmの光学濃度)。
卵白のみ又はタンパク質溶液と混合した卵白を様々に希釈した一連の7つの試料の、SPN−E*によるリゾチームの蛍光検出の範囲を示す棒グラフである(519nmの光学濃度)。卵白は、むろんリゾチームを含有する。
希釈卵白のみ又はタンパク質溶液(BSA)と混合した希釈卵白の、SPN−Eによるリゾチームの蛍光検出の範囲を示す棒グラフである(519nmの光学濃度)。卵白は、むろんリゾチームを含有する。
リゾチームに対するSPN−Eの特異的結合を実証する棒グラフである。卵白は、むろんリゾチームを含有する。
SPN−A*によるピーナッツアレルゲンara h1の蛍光検出のグラフである(519nmの光学濃度対ピーナッツバター濃度)。
1試料当たり様々な濃度のSPN−A*を含有する一連の試料の、SPN−A*によるピーナッツアレルゲンara h1の蛍光検出を示すグラフである(519nmの光学濃度対リゾチーム濃度)。
SPN−A*をピーナッツバターの試料と混合した後の時間の関数としての、SPN−A*によるピーナッツアレルゲンara h1の蛍光検出のグラフである(519nmの光学濃度)。BSAの対照グラフは、比較のために示されている。
SPN−Eをリゾチームの試料と混合した後の時間の関数としての、SPN−Eによるリゾチームの蛍光検出のグラフである(519nmの光学濃度)。BSAの対照グラフは、比較のために示されている。
10%、20%、及び40%エタノール(EtOH)を含有するPBS系緩衝液で抽出された総タンパク量を示すヒストグラムである。GFは、グルテンを含まないことを意味する。
Tris塩基pH8.0、5mMEDTA、及び20%エタノールを含有するTris系緩衝液(DOTS緩衝液)並びにNeogen(登録商標)緩衝液でのグルテン回収を示すヒストグラムである。
改変Tris系緩衝液A、C、及びDでのグルテン回収(ppm)を示す図である。
改変Tris系緩衝液B、E、及びFでのグルテン回収(ppm)を示す図である。
Trsi系緩衝液A+及びNeogen(登録商標)抽出緩衝液でのグルテン回収を示す図である。
Trsi系緩衝液A+及びNeogen(登録商標)抽出緩衝液でのグルテン回収を示す図である。
Trsi系緩衝液A+及びNeogen(登録商標)抽出緩衝液でのミルクアレルゲン回収を示す図である。試料は、試験用に1:10に希釈した。Tris緩衝液A+では、ベーキング前にスパイクした場合のミルクアレルゲンの回収は10%であり、ベーキング後にスパイクした場合の回収は100%であることが示されている。
Trsi系緩衝液A+及びNeogen(登録商標)緩衝液でのベーキング後のアレルゲン回収を示す図である。
Trsi系緩衝液A+及びNeogen(登録商標)緩衝液でのベーキング前のアレルゲン回収を示す図である。
PBS系緩衝液:P+緩衝液及びP−緩衝液でのベーキング前のアレルゲン回収を示す図である。
PBS系緩衝液:P+緩衝液及びP−緩衝液緩衝液でのベーキング後のアレルゲン回収を示す図である。
ElutionELISAキットでの回収率と比較した、PBS系K緩衝液でのアレルゲン回収率を示す図である。K緩衝液でのベーキング前の回収率を示す。
Elution ELISAキットでの回収率と比較した、PBS系K緩衝液でのアレルゲン回収率を示す図である。K緩衝液でのベーキング後の回収率を示す。
Tris系T緩衝液及びPBS系K緩衝液間のカシューアレルゲン回収の比較を示す図である。この実験では、バニラプリン食品マトリックスとして使用した。
PBS系P+緩衝液中での卵白に対するMB6結合親和性を示す図である。P+緩衝液は、卵白に対するSPNの結合親和性を低下させることが示されている。
P+緩衝液及びP−緩衝液中での卵白に対するSPN MB−5結合の蛍光検出のプロットである。ゼラチンの影響は、MB−5の結合にとって重要ではないことが示されている。
K緩衝液中での卵白に対するMB6結合親和性を示す図である。K緩衝液は、SPNの結合親和性を増加させることが示されている。
K緩衝液中での卵白に対するMB4結合親和性を示す図である。K緩衝液は、SPNの結合親和性を増加させることが示されている。
PBS系K緩衝液中での純粋な卵白タンパク質に対するMB5結合親和性を示す図である。
Tris系T緩衝液中での純粋な卵白タンパク質に対するMB5結合親和性を示す図である。
チョコレートケーキにスパイクしたリゾチームのMB6検出を示す棒グラフである。
チョコレートケーキにスパイクしたリゾチームのMB4検出を示す棒グラフである。
を含有する食品中にあるリゾチームのMB6検出を示す棒グラフである。
卵を含有する食物中にあるリゾチームのMB4検出を示す棒グラフである。
純粋なピーナッツ粉末に対するMB7結合の蛍光検出のグラフである。
MB7は、1ppmというより低いレベルでピーナッツ(P)粉末と特異的に結合するが、マグケーキ(MC)マトリックスにスパイクすると、卵白(EW)又はオボムコイド(ovo)とは結合しないことを示す図である。
純粋なピーナッツ粉末に対するMB9結合の蛍光検出のグラフである。
MB9は、1ppmというより低いレベルでピーナッツ(P)粉末と特異的に結合するが、マグケーキ(MC)マトリックスにスパイクすると、卵白(EW)又はオボムコイド(ovo)とは結合しないことを示す図である。
ベーキング前のケーキ及びベーキング後のケーキにスパイクした低ppmレベルのピーナッツのMB7検出を示す図である。
図32AのMB7検出をppmに変換した棒グラフである。
ベーキング前のケーキ及びベーキング後のケーキにスパイクした低ppmレベルのピーナッツのMB9検出を示す図である。
図33AのMB9検出をppmに変換した棒グラフである。
ELISAアッセイでのピーナッツ回収率と比較した、K緩衝液でのMB7及びMB9回収率を示すヒストグラムである。
プレッツェル及びアイスクリーム等の加工食品中の希釈ピーナッツアレルゲンのMB7検出を示すヒストグラムである。
プレッツェル及びアイスクリーム等の加工食品中の希釈ピーナッツアレルゲンのMB9検出を示すヒストグラムである。
PBS系K緩衝液中での純粋なピーナッツタンパク質に対するMB9結合親和性を示す図である。
Tris系T緩衝液中での純粋なピーナッツタンパク質に対するMB9結合親和性を示す図である。
時点0分〜時点30分のMB7検出シグナルの比較を示す図である。
時点0分〜時点30分のMB9検出シグナルの比較を示す図である。
様々な試料サイズトゥインキー(TWINKIE(商標))中のミルクアレルゲン回収を示すヒストグラムである。
様々な試料サイズのプリン中のミルクアレルゲン回収を示すヒストグラムである。
様々な試料サイズの挽肉にスパイクしたミルクアレルゲン回収を示すヒストグラムである。
様々なサイズのトゥインキー(TWINKIE(商標))中でのリゾチームに対するMB5結合親和性を示す図である。試料サイズが増加すると、MB5結合が低下し得ることが示されている。
様々な分離装置GM:gentleMAC;MM:miniMAC;低:Contiuum分離装置低ワット;高:Contiuum分離装置高ワット)を使用した、鶏肉からのミルクアレルゲン回収を示す図である。
様々な分離装置を使用した、トゥインキー(TWINKIE(商標))からのミルクアレルゲン回収を示す図である。
様々な分離装置を使用した、糖衣からのミルクアレルゲン回収を示す図である。
様々な分離装置を使用したMB5結合を示す棒グラフである。

実施例

0017

上述の及び他の目的、特徴、及び利点は、添付の図面に示されているような本発明の特定の実施形態の以下の説明から明白になるであろう。概略図は、必ずしも正しく縮尺されていない。むしろ、ある操作原理を示す際には誇張されている。

0018

別様に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似の又は等価な方法及び物質を、本発明が特徴とする方法の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び物質は、下記の詳細な説明、例、及び請求項に記載されている。種々の特徴が参照番号を使用して説明されている場合、同様の機能を有する特徴を説明するために、類似の参照番号が使用されている。

0019

分析デバイスを使用して食品安全性保証することは、その確実性を満たすという地点にまだ到達していない。特に、多種多様既知アレルゲンを検出するための、単純だが正確で高感度な迅速検出スキームに基づく携帯デバイスは、依然として開発されていない。食品安全性管理の状況における、アプタマーに基づく分析のより最近の概説の1つによると、非常に多様な市販の分析ツールがアレルゲン検出用に開発されているものの、それらのほとんどは、イムノアッセイに依存していることが示されていた。更に、このグループ成分用にアプタマーを選択した研究が現れつつあることが示されていた(Amaya−Gonzalezら、Sensors 2013年、13巻、16292〜16311頁、この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。

0020

本明細書に記載の方法及びデバイスは、アレルゲンを検出するための、核酸に基づく検出分子の使用を企図するものである。幅の広い構想では、本明細書に記載の方法及びデバイスは、食品安全性に加えて、例えば、民間背景及び戦場背景における疾患の医学的診断、環境モニタリング/管理、及び生物兵器を検出するための事利用等の種々様々な場面で、試料中の任意のタンパク質含有量を検出するために使用することができる。更に幅広い応用では、本発明の方法及びデバイスは、核酸に基づく検出分子が結合するあらゆる生体分子を検出するために使用することができる。幾つかの非限定的な例として、この検出方法及びデバイスは、癌マーカーのスポット検出、現場診断(化学薬品との接触、外傷性頭部損傷等)、第三世界での応用(TB、HIV検査等)、急患診療脳卒中マーカー、頭部損傷等)、及びその他多数に使用することができる。

0021

下述のように、そのような核酸に基づく検出分子の1つの特定の種類は、アプタマーである。アプタマーは、SELEXプロセス(以下に記載されている)という反復手法を使用して、本質的にあらゆる分子標的(又はその部分)に対して生成することができるため、本発明者らは、アプタマーが検出分子のコア配列を提供するために特に好適であることを認識している。そのようなアプタマーは、それらの標的に対する親和性及び結合特異性が高い。また、本発明者らは、シグナル発生ポリヌクレオチド(以下に詳しく説明されている)の生成にコア配列としてアプタマーを使用することにより、種々のリポーター分子を便利に結合させることが可能になることを認識している。また、アプタマーコア配列に基づくシグナル発生ポリヌクレオチドの生産コストが比較的低いことは、本明細書に記載のセンサーデバイス等の生体分子センサーの、単純だが効果的である検出アッセイの開発という目的に関して有利である。最後に、本発明者らは、食品安全性を保証するために周囲温度で高感度に再現性よく反復して使用することのできる単純で携帯可能なセンサーでの使用に特に好適である、シグナル発生ポリヌクレオチド等のアプタマーに基づく検出配列を使用して、種々の食品マトリックス中のアレルゲン検出を簡易に実施することができることを認識している。

0022

非限定的な例では、アナフィラキシー毒性アレルゲンであるβ−コングルチン、Lup an 1に特異的な一本鎖DNAアプタマーのin vitro選択プロセス報告されている(Nadalら、(2012年)DNA Aptamers against the Lup an 1 Food Allergen.PLoS ONE 7巻(4号):e35253)。手短に言えば、ルピナスに由来するβ−コングルチンサブユニットが精製され、磁気ビーズ化学的架橋された。ペプチド質量フィンガープリント法を使用して、ビーズ表面のβ−コングルチンの存在が確認された。ホスホロチオエート順方向プライマー及びT7遺伝子6エキソヌクレアーゼを使用して、1014の集団多様性を有するDNAライブラリー貯留が増幅され、一本鎖93量体DNA配列が生成された。ライブラリー貯留は、タンパク質結合磁気ビーズと共にインキュベートされた。PCRを使用してSELEXの各ラウンドモニタされ、タンパク質結合ビーズから開放されたDNAの量が、非結合ビーズから得られたものと比較された。酵素結合オリゴヌクレオチドアッセイ(ELONA)及び表面プラズモン共鳴(SPR)を使用して、進化がモニタされた。15ラウンドのSELEX後、増幅されたDNAがクローニングされ、配列決定され、コンセンサスモチーフが特定され、それらのモチーフに対する親和性及び特異性が評価され、それらの二次構造が予測された。得られたアプタマーは、競合ELONAを使用して、β−コングルチンルピナスアレルゲンの検出及び定量化が評価された。このようにして、3.6×10−7のKDを有する独自の93量体が選択され、1.7×10−9のKDを有する11量体に短縮された(Nadalら、(2013年)Probing high−affinity 11−mer DNA aptamer against Lup an 1 (β−conglutin).Anal.Bioanal.Chem.405巻:9343〜9349頁)。この短縮11量体は、グアニン豊富であり、スタッキングしたグアニン四分子で構成されるG−四本鎖構造へと折り畳むと予測され、この構造は、グアニン間のフーグスティーン型水素結合により、及び四分子間に位置する陽イオンとの相互作用により安定化されている。最近、各単量体アプタマーがドナーアクセプター部分により隣接されている、短縮11量体抗β−コングルチンアプタマーの高親和性二量体形態を使用して、Lup an 1を迅速かつ高感度に検出するための、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を活用した高感度法が報告された。上記二量体形態は、標的が存在しないと、励起フルオロフォアから近位の第2のフルオロフォアへのFRETにより蛍光発光を生じさせる。しかしながら、β−コングルチンを付加すると、特異的相互作用により、二重アプタマー構造に変化が生じて、蛍光発光の増加がもたらされる。この方法は、非常に特異的及び高感度であり、検出限界は150pMであり、食品中の毒性β−コングルチンサブユニットを、室温にてたった1分間で直接検出するための効果的なツールを提供する(Mairalら、FRET−based dimeric aptamer probe for selective and sensitive Lup an 1 allergen detection.Biosensors and Bioelectronics、(2014年)54巻:207〜210頁)。

0023

本明細書に記載のデバイスを使用して検出することができるアレルゲンファミリーには、ピーナッツ、ツリーナッツ(tree nut)等の豆果、卵、ミルク、大豆スパイス、種、甲殻類小麦グルテン、米、果物、及び野菜に由来するアレルゲンが含まれる。アレルゲンは、粉末に存在してもよく、又は食事に存在してもよい。このデバイスは、これらアレルゲンの有無を確認すること、並びにこれらアレルゲンの量を定量化することが可能である。

0024

実施形態の幾つかでは、8種の主要な食物アレルゲン(つまり、小麦、卵、ミルク、ピーナッツ、ツリーナッツ、魚、甲殻類、及び大豆)の検出を目標とするアプタマーを設計及び試験することができる。8種の主な食物アレルゲンは、食物アレルギーの90%を占める。高い選択性、特異性、及び安定性を有するアプタマーを選択し、検出分子として更に標識する。

0025

本発明のデバイス及び方法は、試料中の病原性微生物を検出及び特定することができる。検出することができる病原体には、細菌、酵母真菌ウイルス、及びウイルス様生物が含まれる。病原体は、動物及び植物に疾患を引き起こす場合があり、食物、水、土壌、又は他の供給源汚染する場合があり、又は軍事分野では生物兵器として使用される場合がある。本デバイスは、これら病原体を検出及び特定することが可能である。

0026

別の重要な応用には、医療を施すための、例えば、疾患を診断し、疾患進行病期分類し、ある治療に対する応答をモニタするための、本発明の方法及びデバイスの使用を含む。

0027

食品安全の分野以外への拡張応用には、軍事組織による戦場での使用;抗生物質及び生物学的薬物の試験;殺虫剤及び肥料等の製品の試験;栄養補助食品、種々の食品成分、及びカフェイン及びニコチン等のバルクで調製される添加剤環境試験;並びに個体が、著しいレベルの個々のアレルゲンに暴露されているか否かを決定するための、唾液、皮膚、及び血液等の臨床試料の試験が含まれる。

0028

本発明の組成物
本明細書には、アレルゲンを検出するためのアッセイ、デバイス、及び/又はキットを設計、調製、使用、及び製造するための化合物、組成物、及び方法が記載されている。

0029

本明細書で使用される場合、用語「アレルゲン」は、対象体免疫反応を引き起こすか、誘発するか、又は引き金を引く化合物、物質、又は組成物を意味する。そのため、アレルゲンは、典型的には抗原と呼ばれる。

0030

試料中のそのようなアレルゲンの検出を可能にするように、1種又は複数種のアレルゲンと相互作用可能な若しくは相互作用する、及び/又は結合可能な若しくは結合するあらゆる分子を、本明細書中では、「アレルゲン検出分子」又は「検出分子」と呼ぶ。

0031

検出デバイス及びカートリッジ
本発明の1つの態様は、カートリッジを使用する検出デバイスである。1つの実施形態では、本発明の検出デバイスは、様々な食品試料中の微量濃度のアレルゲンを特異的に検出することができる携帯型の製品である。

0032

幾つかの実施形態では、検出デバイスは、単純で迅速な(5分未満)1段階実施用に設計されている。
幾つかの実施形態では、検出デバイスは、特定のアレルゲン専用の使い捨てカートリッジが、そのカートリッジに特有のアレルゲンを検出するためのデバイスに配置されるように設計されている。

0033

図1を参照すると、検出デバイス10の1つの実施形態が示されている。このデバイスは、プラスチック又は他の好適な支持材料で形成されていてもよい主支持本体12を有する。主支持本体12には、本体12の作用表面適所にカートリッジ14を保持するための手段が提供されている。これから、カートリッジの1つの一般的な実施形態を説明し、その後、カートリッジ1400の別の実施形態を説明することにする。カートリッジ14は、アレルゲンの存在を試験しようとする食品試料S等の試料を保持するための収集チャンバ16を含む。ある実施形態では、カートリッジ14は使い捨てである。ある実施形態では、収集チャンバ16には、試料を消化するためのある容積の緩衝液が提供されている。緩衝液の容積は、約100μLから約500μLまでの範囲であってもよい。また、デバイス10には、マイクロ真空ポンプ(図示せず)、プローブ20、及びプローブホルダ(図示せず)の組み合わせを含んでいてもよい試料収集機構18が含まれている。また、カートリッジ14は、抽出膜22を有するタンパク質抽出チャンバを含む。真空ポンプは、抽出膜22を通して抽出されるタンパク質の流速を増加させるために使用することができる。また、2つの検出チャンバ24a及び24bが使い捨てのカートリッジに含まれている。検出チャンバ24aは、陰性対照を保持し、検出チャンバ24bは、アレルゲン等の目的とする分子標的の存在を示すシグナルを発するためのシグナル発生ポリヌクレオチドを保持する。

0034

発光ダイオード(LED)26a及び26bが、本体12によりカートリッジ14に隣接して支持されている。LED26a及び26bは本質的に同一のものであり、シグナル発生ポリヌクレオチドのフルオロフォアを励起させるのに適切な励起波長の光を提供する。LED26a及び26bの光路は、それらの対応する検出チャンバ24a及び24bに向かっている。

0035

また、検出チャンバ24a及び24bから放射される蛍光を受信し、目的の波長複数可)のみを透過させるフィルタ28、及び光電子増倍管(PMT)シグナルを有用な読出しに変換する(つまり、蛍光出力を測定し、それをデジタル信号に変換する)ためのプロセッサを含む対応する蛍光検出器30a及び30bが、本体12によりカートリッジ14の外部に支持されている。その後、デジタル信号に対応するデータは、ユーザインタフェーススクリーンとして機能する対応する表示ウィンドウ32a及び32bに提供される。図1に示される本例では、表示ウィンドウは両方とも、測定が「陰性」であることを表示している。これは、対照が、その目的機能を果たしており、試料の分析が、試験中のアレルゲンをいかなる有意義なレベルでも含有しないことを示している。

0036

ある実施形態では、デバイス10の長さは、およそ10cmの長さである。プローブ20から得られた試料は、収集チャンバ16へと移される。プローブ20は、多数の試料(最大200mgまでのおよそ5つの試料)を得るために使用される。デバイスが作動していない時は、収集プローブ20は、見えないようにデバイス10内部に隠されており、電子コマンド又は手動のいずれかにより露出することになる。

0037

提供されていてもよい他の特徴には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:例えば、食品のコア試料を得るためのドリル。試料収集プローブには、任意選択カバーが提供されていてもよい。

0038

幾つかの実施形態では、収集チャンバは、100〜500μLの消化緩衝液を含有するのに十分な容積を有する。収集チャンバに移された食品標本は、小型ドリルを使用して均質化されることになる。消化緩衝液は、2%Tween(登録商標)、塩濃度(0mmol/L、200mmol/L、又は1mol/LのNaCl)、及び脱脂粉乳(0〜25%)を有するPBS又はTRISから選択してもよい。消化を促進するために、コラゲナーゼ等のプロテイナーゼを提供することにより、酵素による消化を追加することが望ましい場合がある。

0039

幾つかの実施形態では、1つ又は複数のタンパク質抽出膜を使用してもよく、消化された溶液は、タンパク質抽出膜に移されることになる。溶液は、精製タンパク質を収集する膜を通過して流れるであろう。膜は、0.5nM〜0.5μMの細孔を有し、200KDaよりも小型のタンパク質を分離することができるであろう。タイミングが重要であるため、真空を使用して流速を増加させてもよい。幾つかの好適なタンパク質抽出カラムが知られており、過度な実験を行うことなく、本デバイスのある実施形態に使用するように構成することができる。消化された後、食品標本は、タンパク質抽出膜から2つの検出チャンバ24a及び24bへと流れる。陰性対照チャンバ24aは、クエンチャー分子のみで標識されている検出分子(例えば、アプタマー)を含有し、他方のチャンバ24bは、蛍光マーカー及びクエンチャー分子の両方で標識されているシグナル発生ポリヌクレオチド(SPN)を含有する。精製タンパク質が各検出チャンバに入ったら、対応するLED26a及び26bは、光を放射してフルオロフォアの励起を誘発させることになる。

0040

幾つかの実施形態では、任意の食品試料の分析に十分なアレルゲンタンパク質(例えば、最低でも2mg/mlの総タンパク質)を回収するユニバーサルタンパク質抽出緩衝液。

0041

他の実施形態では、複数の食品マトリックスで効率的であるはずであるアルキメデススクリュー及び真空ポンプ等の食品試料採取機構用の種々の選択肢を試験してもよい。これらの機構は、種々の食品テキスチャーで試験し、迅速で単純な1段階手順用に最適化することになるであろう。1つの実施形態では、図面及び下記に記載のように、アルキメデス型スクリュー機構が、最大の可能性を有する。試料を収集している間、針の内部にあるドリルビットモータにより回転し、スクリューポンプとして機能することになる。ドリルビットの「チップクリーニング」作用は、標的試料小片捕捉し、それらを収集針から混合チャンバの中間部分へと運搬する役目を果たす。25 20の異なる食品マトリックスから0.5gの試料を取得することに成功したら成功と言えるであろう。食品マトリックスの幾つかの例は、表7に列挙されている。

0042

分子から放射された光は、特定のフィルタを通過するであろう。フィルタを通過して伝達された光は捕捉され、デジタル信号に変換され、それがユーザインタフェースを作動させることになる。対照チャンバは、陰性シグナルを生成するはずである試薬を含有することになり、それがバックグラウンドになるであろう。

0043

幾つかの実施形態では、表示ウィンドウ32a及び32bの各々は、試験した試料がアレルゲンを含有するか否かを表示することになるスクリーンを含んでいてもよい。幾つかの実施形態では、検出デバイスは、1つ又は複数のデータベースと、直接的に又は無線で、操作可能に接続されていることが有利な場合がある。ユーザの設定に基づいて、収集したデータを、他と共有することができる。幾つかの場合では、データは、他のユーザ又はヘルスケア分野のユーザと共有することができる。

0044

デバイス10は、最小限の維持しか必要としないように設計されている。LED26a及び26b並びにフィルタ28は、予測では、定期的に、例えば年1回取り替えを必要とするであろう。

0045

上述したように、本発明の検出デバイスに使用されるカートリッジ1400の別の実施形態を、これから図2A及び2Bを参照して説明する。簡潔に示すために、この実施形態のカートリッジには、図1に示されているような1対の検出チャンバが示されていない。しかしながら、当業者であれば、過度な実験を行わずに、図1に示されているような1対の検出チャンバを含むように図2A及び2Bのカートリッジ実施形態を改変することができるであろう。同様に、図2A及び2Bのカートリッジ1400は、図1に示されている他のカートリッジ特徴を含むように構成することができ、当業者であれば、そのような改変及び応用が本発明の範囲内であることを認識するであろう。例えば、検出チャンバ(複数可)がカートリッジの外部に又は別のカートリッジに配置されているデバイスの他の実施形態を設計することができる。カートリッジ1400の機能は、その構成部品の説明と同時に記載されるであろう。

0046

ここで図2A及び2Bを参照すると、本発明の検出デバイスのある実施形態で使用されるカートリッジ1400が示されている。カートリッジ1400の主本体は、キャリアプレート1402により提供される。キャリアプレート1402は、デバイスと共に使用される緩衝液及び他の試薬と適合するように選択されたプラスチックで成型されていてもよい。キャリアプレート1402により支持されている部品は、下記で説明するが、一体的に成型された圧入タン構成等の、公知の取り付け及び接続手段によりキャリアプレート1402に取り付けられている。プロセッサとアクチュエータとの通信用電気部品間の接続は、例えば、従来法により作製することができる。有利には、キャリアプレート1402は、検出デバイスの主支持本体(図示せず)にある対応する部分と接続するように構成されている複数のコネクタ1404を含む。そのようなコネクタ1404は、射出成形等のプロセスによりキャリアプレート1402を製造するプロセス中に形成してもよい。

0047

また、キャリアプレート1402には、プランジャー型シリンジ1406が取り付けられている。プランジャー1408は、シリンジ1406のバレルから引き出されると、キャリアプレート1402の縁部を越えて伸長する。シリンジ1406の目的は、消化緩衝液Dを混合チャンバ1410内に注入するための手段を提供することである。本実施形態では、混合チャンバ1410は、図2A及び2Bに示されている向きでキャリアプレース1402の上半分の実質的に中心に位置している。ある実施形態では、プランジャー1408をシリンジバレル内へと押し込むことにより、シリンジ1406を物理的に作動させる。他の実施形態では、シリンジ1406は、プロセッサ(図示せず)の制御で自動的に作動する。カートリッジのある別の実施形態における、バルブ及びシリンジを制御するためのプロセッサ−アクチュエータシステムの設計は、当業者の能力内にある。

0048

混合チャンバ1410内には、アルキメデス型ミキサ(スクリューポンプとしても知られている)が設けられている。ミキサは、混合チャンバ1410の内容物のらせん混合運動を伝達するためのらせん型コンベヤの形態の、スクリュー1414を有するスピンドル1412を含む。スピンドル1412は、モータコネクタ1416を介して接続されているモータ(図示せず)により回転する。

0049

ある実施形態では、カートリッジ1400は使い捨てであり、混合チャンバに動力を供給するモータ(図示せず)は、カートリッジ1400を廃棄する前にモータコネクタ1416から取り外され、新しいカートリッジに取り付けて、モータを保存することが可能なモジュール型ユニットである。ある実施形態では、検出デバイスには、使用したカートリッジが取り外され、新しいカートリッジと交換される間、モータを検出デバイスの本体の適所に保持するモータブラケットクランプ、又はホルダが設けられている。

0050

スピンドル1412の端部には、末端が針1420である中空ドリルビット1418が接続されている。針1420は、試料Sに突き刺さるのに十分なゲージである。有利には、針を固定するチャック1419は調整可能であり、したがって、種々の材料から試料を得るために種々のゲージの針を受け入れることができる。同様に、チャック1419は、種々の異なるサイズのドリルビットも受け入れることができる。中空ドリルビット1418が作動すると、試料Sの部分は、ドリルビット1418の内部を通って針1420から混合チャンバ1410の内部へと運搬される。試料Sの部分が混合チャンバ1410に移送された後。

0051

消化緩衝液Dは、シリンジ1406のプランジャー1408を押し込むことにより(矢印が示すように)、混合チャンバ1410へと運搬される。シリンジ1406から混合チャンバ1410の右側ポートへと伸長する消化緩衝液導管には、第1の一方向バルブ1422が設けられている。この第1の一方向バルブ1422は、消化緩衝液及び混合チャンバ1410の他の内容物がシリンジ内へ逆流することを防止する。消化緩衝液Dは、試料を分解して、カートリッジ1400の検出アッセイがそのために設計されている標的生体分子を放出させる。混合期間はプロセッサ(図示せず)によりプログラムされていてもよく、その混合期間後、混合チャンバ1410の左側ポートは、プロセッサによりプログラムされており、消化試料が、第2の導管を通って検出チャンバ1426へと運搬されるように開放される(ある実施形態では、プロセッサは、モジュール型モータを使用する実施形態で上述したものと同様の様式で、カートリッジ1400を廃棄する前に取り外すことができるモジュール型ユニットである)。他の実施形態では、プロセッサも使い捨てであり、カートリッジ1400と共に廃棄される。他の実施形態では、プロセッサは含まれておらず、導管内の流体の移動は、もっぱら、第1及び第2の一方向バルブ1422及び1424と連動してプランジャー1408の押し込み及び延伸によりもたされる陽圧及び陰圧により誘導される。例えば、図2Aの矢印で示されているように、シリンジから混合チャンバ1410への消化緩衝液Dの移動は、シリンジ1406のバレル内へとプランジャー1408を押し込むことにより達成され、一方向バルブ1422は、上述のように逆流を防止する。

0052

ここで図2Bを参照すると、矢印は、シリンジ1406のプランジャー1408がシリンジバレルから引き出される際の流体の移動を示す。流体は、検出チャンバ1426から一方向バルブ1424を通ってシリンジ1406のバレルへと引き出されることが分かる。特に、一方向バルブ1422は、流体が、混合チャンバ1410からシリンジ1406へと流れることを防止する。

0053

また、混合チャンバ1410から検出チャンバ1426に至る導管には、消化試料に存在する夾雑物の少なくとも幾つかを除去するための精製フィルタ1428が設けられている。そのような夾雑物には、例えば、核酸又はその消化断片が含まれていてもよい。そのような夾雑物は、アッセイ本来の機能に有害な効果を示す場合がある。別の実施形態では、各々が、種々の異なるタイプの試料中に存在する場合のある特定の種類の夾雑物を除去するため選択される、複数のそのような精製フィルタが設けられていてよい。

0054

検出チャンバ1426から出ていく導管には、検出チャンバからの気体は逃すが、検出チャンバ1426からの流体が流れることを防止する疎水性フィルタ1430が設けられている。

0055

カートリッジ1400は、導管が、戦略的に配置されたフィルタ1428及び1430並びに一方向バルブ1422及び1424と循環ループを形成するという独特な構成であるため、シリンジプランジャー1408を、何回かのサイクル引出し及び押込み、十分な試料材料を検出チャンバ1426に確実に送達することが可能になる。更に、試料の移送には、精密ステッピングモータ制御モータが1つあれば十分である。別の設計では、消化緩衝液を送達するのに1つのモータを必要とし、試料を検出チャンバ内へと引き出すのに別のモータを必要とするであろう。追加のモータがあると、サイズ、重量、コスト、及び検出デバイスに必要な電力が増加するため、図2A及び2Bに示されている設計の有益性は高い。

0056

本発明の1つの実施形態による検出デバイスのカートリッジ1400を作動させると、試料収集針1420が標的試料S内に挿入されることにより分析が開始される。試料を収集している間、針1420の内部にあるドリルビット1418がモータにより回転し、それによりスピンドル1412及びスクリュー1414が回転する。ドリルビット1418の「チップクリーニング」作用は、標的試料Sの小片を捕捉し、それらを収集針から混合チャンバ1410の中間部分へと運搬する役目を果たす。

0057

標的試料Sの小片が収集され、混合チャンバ1410に送達されたら、シリンジプランジャー1408が押し込まれる。これにより、消化緩衝液Dが、一方向バルブ1422から混合チャンバ1410内へと入れられる。第2の一方向バルブ1424が、検出チャンバ内への逆流を防止する向きに配置されていることに留意すべきであり、その機能は下記で再度説明するものとする。消化緩衝液Dが混合チャンバ1410に送達されると、混合モータは、所定の時間及び速度プロファイルに従ってスピンドル1412を回転させて、試料Sを適切に均質化し、目的の構成生体分子を放出させる。混合モータは、モータコネクタ1416に取り付けられており、この同じモータが、ドリルビット1418を回転させる。

0058

試料Sを消化及び均質化した後、それを精製フィルタ1428を介して検出チャンバ1426内へと通過させる。これは、シリンジプランジャー1408を引き出すことにより達成してもよい。しかしながら、この操作を行っている間、一方向バルブ1422は、材料が混合チャンバから出て逆流することを阻止する役目を果たし、一方向バルブ1424は、精製フィルタ1428に陰圧をかけるために開放され、それにより試料Sは検出チャンバ1426内へと引き出される。疎水性フィルタ1430は、上述したように、邪魔な気体を逃しつつ、試料Sの漏出防止を可能にする。試料Sが検出チャンバ1426に存在する場合、分析ユニットは、試料Sの調査を実施し、測定値をユーザに報告することができる。

0059

図2A及び2Bに示されているカートリッジ1400の他の実施形態には、図1に示されているデバイスの実施形態で上述されているような1対の検出チャンバが含まれる。
他の実施形態には、シリンジ1406を引いて、混合チャンバ1410内部を減圧し、それにより針から試料を「吸引する」ことになる吸引機構が含まれていてもよい。

0060

また、他の実施形態には、試料Sが、気体(空気)又は流体によりシリンジ型デバイスからチャンバ内へと押し込まれるポンプ機構が含まれていてもよい。
また、他の実施形態には、収集針からかえし(barb)を自動展開し、その後標的試料片を保持して混合チャンバ内へと収集針を後退させるためのバネフック又はもり型機構が含まれていてもよい。この手法は、「生検」として知られている既存の医療デバイスの機能と同様である。

0061

ここで図3を参照して、検出デバイスの更なる実施形態を説明する。この検出デバイス2000の実施形態には、ユーザが片手を使用して取り扱うために便利なエルノミクス設計が施されており、2015に一般的に示されている前方ローブを有する砂時計型又はバーベル型に構成されている。前方ローブ2015は、カートリッジ2140と接続するための手段を有する。取り付けると、カートリッジ2140が、前向きローブ2015の可視部の大半を占める。前向きローブ2015は、試料コレクター2020が、分析の必要な試料Sに向かうように伸長させることができる。砂時計型の狭小部分は、把持ハンドル2017としての機能を提供する。ユーザがオーバーハンド握り(overhand grip)で握ると、ハンドル2017の前方近傍にある、デバイス2000に位置するコントロールパネル2019を親指で自由に操作することができる。2025に一般的に示されている後方ローブは、デバイス2000内部にあるため視界から隠されている検出チャンバを支持するものである。後方ローブ2025の外側表面は、分析結果を示すディスプレイモニタ2032を含む。

0062

この実施形態のデバイス2000は、連続様式での多試料分析を伴う分析作業に特に好適である。例えば、この実施形態は、多ロット所与の製品が分析される品質管理試験での使用に望ましいであろう。エルゴノミックス設計であるため、長期間の使用でもユーザの不快感は最小限である。デバイス2000は試料Sに向かって伸長し、試料Sの部分は、試料コレクター2020により収集され、カートリッジ2140の混合チャンバで処理される。標的分子が試料マトリックスから放出され、検出チャンバに運搬され、分析結果が、ディスプレイモニタ2032に表示される。ある実施形態では、単純な屈曲の動作で、デバイス2000が、試料収集位置から、分析結果を見るのに好適な位置へと十分に移動することになるように、右利き又は左利きのいずれのユーザでも見やすくディスプレイモニタ2032の向きを調整することができる。

0063

アレルゲン
本発明によると、アレルゲンには、食品に由来するもの、環境に由来するもの、又は家庭内ペット鱗屑等の非ヒトタンパク質に由来するものが含まれる。

0064

食物アレルゲンには、これらに限定されないが、以下のものに含まれるタンパク質が含まれる:ピーナッツ、エンドウヒラマメ、及び豆等の豆果、並びに豆果関連植物ルピナス、アーモンド、カシュー、クルミブラジルナッツ、ハシバミヘーゼルナッツピーカン、ピスチオブナの実、バターナッツ、クリ、チンカピングリ、ココナッツギンナンレイシナッツ、マカダミアナッツナンガイナッツ(nangai nut)、及び松果等のツリーナッツ、卵、魚、カニザリガニロブスター小エビ、及びエビ等の甲殻類、ハマグリカキムール貝、及びホタテ貝等の軟体動物、ミルク、大豆、小麦、グルテン、トウモロコシ牛肉豚肉肉、及び鶏肉等の肉類、ゼラチン、亜硫酸塩、ごま、ヒマワリ、及びケシの実等の種子、並びにコリアンダーニンニク、及びマスタード等の香辛料、果物、セロリ等の野菜、並びに米。例えば、ルピナス、ヒマワリ、又はケシ等の植物に由来する種子は、種付パン等の食品に使用してもよく、又はパン若しくはペストリーを作るために使用される粉末を作るために粉砕してもよい。

0065

最近の総説には、病原体、アレルゲン、不純物毒素、及び他の禁止汚染物質を管理して食品安全性を保証するための、アプタマーを使用して開発された分析戦略が記載されている。(Amaya−Gonzalezら、Aptamer−Based Analysis:A Promising Alternative for Food Safety Control、Sensors、2013年、13巻:16292〜16311頁;Amaya−Gonzalezら、Aptamer binding to coelic disease−triggering hydrophobic proteins:Towardsa sensitive gluten detection system.、Anal.Chem.、2013年提出)。また、グルテンの検出方法は、Amaya−GonzalezらのPCT国際公開第PCT/ES2013/000133号、2013年6月28日に記載されている。

0066

シーフードアレルゲンは、典型的には、タラパルブアルブミン及び甲殻類のトロポミオシンを含む筋肉タンパク質の群に属する。アルギニンキナーゼ及びミオシン軽鎖等の他のアレルゲンも、アレルギー誘発に重要な役割を果たす場合がある。トロポミオシンは、甲殻類及び軟体動物間の分子的及び臨床的交差反応性の原因である主なアレルゲンであり、イエダニ及び昆虫等の他の吸入無脊椎動物の原因アレルゲンであると考えられる。

0067

検出分子:アプタマー
本発明の検出分子には、これらに限定されないが、1種又は複数種のアレルゲンと会合可能又は結合可能な任意の1種又は複数種の分子が含まれる。

0068

幾つかの実施形態では、本発明の検出分子は、1つ又は複数のアプタマーを含む。
本明細書で使用される場合、「アプタマー」は、in vitro選択又は同じことだがSELEX(指数関数的増幅によるリガンド系統的進化)の反復ラウンドにより、低分子、タンパク質、核酸等の種々の分子標的に、並びに細胞、組織、及び生物にさえ結合するように遺伝子操作された核酸種である。核酸アプタマーは、古典的なワトソンクリック塩基対以外の相互作用により、分子に対する特異的結合親和性を有する。核酸アプタマーは、ファージディスプレイにより生成されるペプチド又はモノクローナル抗体(mAb)のように、選択した標的に特異的に結合し、結合することにより、それらの標的が機能する能力を阻止することが可能である。また、幾つかの場合では、アプタマーは、ペプチドアプタマーであってもよい。本明細書で使用される場合、「アプタマー」は、特に核酸アプタマーを指す。

0069

「化学的抗体」と呼ばれることが多いアプタマーは、抗体と同様の特徴を有する。典型的な核酸アプタマーは、サイズがおよそ10〜15kDa(20〜45ヌクレオチド)であり、少なくともナノモルの親和性でその標的と結合し、近縁関係にある標的を区別する。

0070

アプタマーは、一価であってもよく又は多価であってもよい。アプタマーは、単量体、二量体、三量体四量体、又はより高次多量体であってもよい。個々のアプタマーモノマーを連結して、多量体アプタマー融合分子を形成することができる。非限定的な例として、二量体アプタマーを形成するように、ランダムアプタマーの5’側領域及び3’側領域の両方に相補的な配列を含む連結オリゴヌクレオチド(つまり、リンカー)を設計してもよい。三量体又は四量体のアプタマーの場合、ランダムアプタマーの3’側領域に相補的な配列を含み、したがってハイブリダイゼーションにより多量体アプタマー融合体を生成するように、小型の三量体又は四量体(つまり、ホリデイジャンクション様)DNAナノ構造体を遺伝子操作することになるであろう。加えて、3〜5又は5〜10のdT豊富なヌクレオチドを遺伝子操作して、アプタマー結合モチーフ間の一本鎖領域としてのリンカーポリヌクレオチドにすることができる。これにより、複数のアプタマーの可撓性及び自由度が提供され、細胞リガンド又は受容体との多価性相互作用を調整し相乗効果が生みだされる。

0071

或いは、ビオチン化アプタマーをストレプトアビジンと混合することにより、多量体アプタマーを形成することもできる。
本明細書で使用される場合、用語「多量体アプタマー」又は「多価アプタマー」は、複数の単量体ユニットを含むアプタマーを指し、単量体ユニットは、各々がそれ自体アプタマーであってもよい。多価アプタマーは、多価性の結合特徴を有する。多量体アプタマーは、ホモ多量体であってもよく、又はヘテロ多量体であってもよい。用語「ホモ多量体」は、同じ種類の複数の結合ユニットを含む多量体アプタマーを指す。つまり、各ユニットは、同じ標的分子の同じ結合部位に結合する。用語「ヘテロ多量体」は、異なる種類の複数の結合ユニットを含む多量体アプタマーを指す、つまり、各結合ユニットは、同じ標的分子の異なる結合部位に結合するか、又は各結合ユニットは、異なる標的分子の結合部位に結合する。したがって、ヘテロ多量体は、異なる結合部位で1つの標的分子と結合する多量体アプタマーを指していてもよく、又は異なる標的分子と結合する多量体アプタマーを指していてもよい。また、異なる標的分子と結合するヘテロ多量体を、多重特異的多量体と呼ぶこともある。

0072

核酸アプタマーは、一連の連結ヌクレオシド又はヌクレオチドを含む。用語「核酸」は、その最も幅広い意味では、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び/又は物質を含む。これらポリマーは、ポリヌクレオチドと呼ばれることが多い。本発明の例示的な核酸分子又はポリヌクレオチドには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:D型又はL型のいずれでもよい核酸、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、トレオース核酸(TNA)、グリコール核酸(GNA)、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(β−D−リボ立体構造を有するLNA、α−L−リボ立体構造を有するα−LNA(LNAのジアステレオマー)、2’−アミノ官能性を有する2’−アミノ−LNA、及び2’−アミノ官能性を有する2’−アミノ−α−LNAを含むLNA)、又はそれらのハイブリッド

0073

当業者であれば、用語「RNA分子」又は「リボ核酸分子」は、自然界で発現又は見出されるようなRNA分子だけでなく、本明細書に記載のような又は当技術分野で知られているような1つ又は複数のリボヌクレオチドリボヌクレオシド類似体又は誘導体を含むRNAの類似体及び誘導体も包含することを認識するであろう。厳密に言えば、「リボヌクレオシド」は、ヌクレオシド塩基及びリボース糖を含み、「リボヌクレオチド」は、1つ、2つ、又は3つのリン酸部分を有するリボヌクレオシドである。しかしながら、本明細書で使用される場合、用語「リボヌクレオシド」及び「リボヌクレオチド」は等価であると考えることができる。RNAは、核酸塩基構造、リボフラノシル環が修飾されていてもよく、又はリボース−リン酸骨格が修飾されていてもよい。

0074

核酸アプタマーは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、又はリボ核酸及びデオキシリボ核酸の混合物であってもよい。アプタマーは、一本鎖のリボ核酸、デオキシリボ核酸、又はリボ核酸及びデオキシリボ核酸の混合物であってもよい。

0075

幾つかの実施形態では、アプタマーは、少なくとも1つの化学的修飾を含む。幾つかの実施形態では、化学的修飾は、糖位置における核酸の化学的置換、リン酸位置における化学的置換、及び塩基位置における化学的置換から選択される。他の実施形態では、化学的修飾は、修飾ヌクレオチドの組込み;3’キャッピング高分子量非免疫原性化合物との結合;親油性化合物との結合;及びリン酸骨格へのホスホロチオアートの組込みから選択される。好ましい実施形態では、高分子量の非免疫原性化合物は、ポリアルキレングリコールであり、より好ましくはポリエチレングリコール(PEG)である。別の分子、通常は薬物又は治療用タンパク質にPEGを共有結合するプロセスは、PEGylationとして知られている。PEGylationは、PEGの反応性誘導体を標的分子と共にインキュベーションすることにより日常的に達成されている。薬物又は治療用タンパク質にPEGを共有結合で結合することにより、作用剤宿主の免疫系から隠蔽され、それにより免疫原性及び抗原性の低減を提供することができ、作用剤の流体力学的サイズ(溶液中でのサイズ)を増加させ、腎臓クリアランスを低減することにより、その循環時間延長することができる。また、PEGylationは、疎水性の薬物及びタンパク質に水溶解性を提供することができる。

0076

別の好ましい実施形態では、3’キャップは、逆位デオキシチミジンキャッピング(inverted deoxythymidine cap)である。
幾つかの実施形態では、P(O)O基が、P(O)S(「チオアート」)、P(S)S(「ジチオアート」)、P(O)NR2(「アミダート」)、P(O)R、P(O)OR’、CO、又はCH2(「ホルムアセタール」)、又は3’−アミン(−NH−CH2−CH2−)に置換されており、式中各R又はR’が独立してH又は置換若しくは非置換アルキルである核酸アプタマーが提供される。連結基は、−O−、−N−、又は−S−連結により、隣接するヌクレオチドと結合させることができる。核酸アプタマーの連結は、全て同一であることが必要であるとは限らない。

0077

非限定的な例として、核酸アプタマーは、D−リボース核酸残基又はL−リボース核酸残基を含んでいてもよく、また、以下のものを含むがそれらに限定されない少なくとも1つの修飾リボヌクレオシドを含んでいてもよい:2’−O−メチル修飾ヌクレオシド、5’ホスホロチオアート基を含むヌクレオシドコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオシド、ロックドヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、逆位デオキシリボヌクレオシド又は逆位リボヌクレオシド、2’−デオキシ−2’−フルオロ修飾ヌクレオシド、2’−アミノ修飾ヌクレオシド、2’−アルキル修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホルアミダート、又はヌクレオシドを含む非天然塩基、又はそれらの任意の組み合わせ。或いは、核酸アプタマーは、少なくとも2個の修飾リボヌクレオシド、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、又は少なくとも20個以上の、最大で分子の全長にわたる修飾リボヌクレオシドを含んでいてもよい。修飾は、核酸分子中のそのような複数の修飾デオキシリボヌクレオシド又は修飾リボヌクレオシドの各々で同じである必要はない。

0078

核酸に基づく検出分子は、核酸塩基(当技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い)修飾又は置換を含んでいてもよい。本明細書で使用される場合、「未修飾」又は「天然」核酸塩基には、プリン塩基アデニン(A)及びグアニン(G)、並びにピリミジン塩基チミン(T)、シトシン(C)、及びウラシル(U)が含まれる。修飾核酸塩基には、以下のもの等の他の合成及び天然核酸塩基が含まれる:5−メチルシトシン(5−me−C)、5−ヒドロキシメチルシトシンキサンチンヒポキサンチン、2−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2−プロピル及び他のアルキル誘導体、2−チオウラシル、2−チオチミン、及び2−チオシトシン、5−ハロウラシル及びシトシン、5−プロピニルウラシル及びシトシン、6−アゾウシル、シトシン、及びチミン、5−ウラシル(プソイドウラシル)、4−チオウラシル、8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシル、並びに他の8−置換アデニン及びグアニン、5−ハロ、特に5−ブロモ、5−トリフルオロメチル、並びに他の5−置換ウラシル及びシトシン、7−メチルグアニン及び7−メチルアデニン8−アザグアニン及び8−アザアデニン、7−デアザグアニン及び7−ダアザアデニン、並びに3−デアザグアニン及び3−デアザアデニン。更なる核酸塩基には、以下のものが含まれる:米国特許第3,687,808号明細書に開示されているもの、Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine、Herdewijn,P.編 Wiley−VCH、2008年に開示されているもの;The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering、858〜859頁、Kroschwitz、J.L編 John Wiley&Sons(1990年)に開示されているもの、Englischら、Angewandte Chemie,International Edition、1991年、30巻、613頁に開示されているもの、及びSanghvi,YS、第15章、dsRNA Research and Applications、289〜302頁、Crooke、S.T.及びLebleu,B.編、CRCPress、1993年により開示されているもの。

0079

アプタマーに好適なヌクレオチドの長さは、約15から約100ヌクレオチド(nt)までの範囲であり、種々の他の好ましい実施形態では、長さが、15〜30nt、20〜25nt、30〜100nt、30〜60nt、25〜70nt、25〜60nt、40〜60nt、25〜40nt、30〜40nt、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、又は40ntのいずれか、又は40〜70ntである。しかしながら、配列は、アプタマーと本明細書に記載の距離にある2つの標的との相互作用を受け入れることができるように、十分な可撓性を持つように設計することができる。

0080

幾つかの実施形態では、核酸アプタマーは、二本鎖特徴を示す1つ又は複数の領域を含む。そのような二本鎖領域は、内部自己相補性から生じてもよく、又は第2の若しくは更なるアプタマー若しくはオリゴヌクレオチド分子との相補性から生じてもよい。幾つかの実施形態では、二本鎖領域は、長さが4〜12、4〜10、及び4〜8の塩基対の範囲であってもよい。幾つかの実施形態では、二本鎖領域は、5、6、7、8、9、10、11、又は12の塩基対の範囲であってもよい。幾つかの実施形態では、二本鎖領域は、ステム領域を形成してもよい。二本鎖特徴を有するそのような伸長ステム領域は、核酸アプタマーを安定させる役目を果たすことができる。本明細書で使用される場合、用語「二本鎖特徴」は、2つの核酸分子の任意の長さにわたって、それらの配列が、その長さの50パーセントを超える塩基対合標準又は非標準)を形成することを意味する。

0081

アプタマーを更に修飾して、ヌクレアーゼ及び他の酵素活性からの保護をもたらしてもよい。アプタマー配列は、当技術分野で知られている任意の好適な方法により修飾することができる。例えば、ホスホロチオアートを骨格に組み込んでもよく、5’−修飾ピリミジンを、DNAアプタマーのssDNAの5’端部に組み込んでもよい。RNAアプタマーの場合、リボース骨格の2’−OH基を、例えば2’−デオキシ−NTP又は2’−フルオロ−NTPで置換したもの等の修飾ヌクレオチドを、T7RNAポリメラーゼ突然変異体を使用してRNA分子に組み込むことができる。ヌクレアーゼに対するこれら修飾アプタマーの耐性は、それらを、精製ヌクレアーゼ又はマウス血清由来のヌクレアーゼのいずれかと共にインキュベートすることにより試験することができ、アプタマーの完全性は、ゲル電気泳動法により分析することができる。

0082

幾つかの実施形態では、そのような修飾核酸アプタマーは、修飾ヌクレオチドの全体が合成であってもよく、又は修飾ヌクレオチドのサブセットが合成であってもよい。修飾は、同一であってもよく、異なっていてもよい。ヌクレオチドは全てが修飾されていてもよく、全てが同一の修飾を含んでいてもよい。ヌクレオチドは全てが修飾されていてもよいが、異なる修飾を含んでいてもよい。例えば、同じ塩基を含むヌクレオチドは全てが、1つのタイプの修飾を有していてもよく、他の塩基を含むヌクレオチドは、異なるタイプの修飾を有していてもよい。例えば、プリンヌクレオチドは全てが1つのタイプの修飾(又は未修飾)を有していてもよく、ピリミジンヌクレオチドは全てが、別の異なるタイプの修飾(又は未修飾)を有している。このように、オリゴヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチドのライブラリーは、本明細書に開示されている修飾の任意の組み合わせを使用して生成される。

0083

検出方法の幾つかの非限定的な例には、以下のものが含まれる:CCRF−CEM細胞(CCL−119 T細胞、ヒト急性リンパ芽球性白血病)及びRamos細胞(CRL−1596、B細胞、ヒトバーキットリンパ腫)の細胞表面分子に選択的なアプタマー結合金ナノ粒子ACGNP)を使用して癌細胞を直接検出するためのアッセイ(Medleyら、Gold Nanoparticle−Based Colorimetric Assay for the Direct Detection of Cancerous Cells.、Anal.Chem.2008年、80巻:1067〜1072頁);標的分析物と結合すると、赤色分散ナノ粒子へと迅速分解を起こすアプタマー結合金ナノ粒子(AuNP)の使用(Luら、第14章:Nanoparticles/Dip Stick,in Nucleic Acid and Peptide Aptamers:Methodsand Protocols、Gunter Mayer(編)、535巻:223〜239頁);及びヒト血清中でIgE超高感度で検出するための、サンドイッチ増幅要素としてアプタマー−AuNP結合体を使用する微分パルスボルタンメトリーDPV)に基づくバイオセンサー(1〜10,000ng/mLの範囲にわたり、LODが0.52ng/mLと低い)(Wangら、Aptamer−Au NPs conjugates−accumulated methylene blue for the sensitive electrochemical immunoassay of protein、Talanta、2010年4月15日、81巻(1〜2号):63〜67頁)。

0084

しかしながら、多くの電気化学的バイオセンサーに共通する少なくとも1つの欠点は、リアルタイム検出ではなく、分析物溶液との長期間インキュベーションを必要とするオフライン測定という性質を持つことである(Pilloliら、Advances in biosensor development based on integrating nanotechnology and applied to food−allergen management.Trendsin Analytical Chemistry、6月 2013年、47巻:12〜26頁)。

0085

検出分子:抗体
幾つかの実施形態では、本発明の検出分子は、抗体を含む。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、最も幅広い意味で使用されており、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体多特異的抗体(例えば、少なくとも2つの完全抗体で形成される二重特異性抗体)、及び所望の生物活性を示す限りダイアボディ等の抗体断片を含むが、それらに限定されない種々の実施形態を包含する。抗体は、主にアミノ酸に基づく分子であるが、糖部分等の1つ又は複数の修飾を更に含んでいてもよい。

0086

「抗体断片」は、好ましくはその抗原結合領域を含む、完全抗体の一部を含む。抗体断片の例には、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びFv断片;ダイアボディ;直鎖抗体単鎖抗体分子;並びに抗体断片で形成される多特異的抗体が含まれる。抗体をパパイン消化すると、「Fab」断片と呼ばれる、各々が単一の抗原結合部位を有する2つの同一の抗原結合性断片が産生される。また、残りは「Fc」断片を産生する。この名称は、それが容易に結晶化され得ることを反映している。ペプシン処理すると、2つの抗原結合部位を有し、依然として抗原と架橋することが可能なF(ab’)2断片が産出される。検出分子は、これら断片の1つ又は複数を含んでいてもよい。本明細書の目的では、「抗体」は、重鎖及び軽鎖可変ドメイン並びにFc領域を含んでいてもよい。

0087

「天然抗体」は、通常、2つの同一の軽鎖(L)及び2つの同一の重鎖(H)で構成される、約150,000ダルトンヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、1つの共有結合ジスルフィド結合により重鎖と結合しており、免疫グロブリンアイソタイプが異なると重鎖のジスルフィド結合の数は異なる。また、各重鎖及び軽鎖は、規則的に離間した鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン(VH)を有し、その後に幾つかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン(VL)及び他方の末端に定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第1の定常ドメインとアラインしており、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインとアラインしている。

0088

本明細書で使用される場合、用語「可変ドメイン」は、抗体によって配列が非常に異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性に使用される特異的抗体ドメインを指す。本明細書で使用される場合、用語「Fv」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む抗体断片を指す。この領域は、非共有結合で強固に結合されている1つの重鎖及び1つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。

0089

あらゆる脊椎種に由来する抗体「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ及びラムダと呼ばれる明白に異なる2つのタイプの1つに帰属させることができる。抗体は、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに帰属させることができる。5つの主要クラスの完全抗体が存在する:IgAIgD、IgE、IgG、及びIgM。これらの幾つかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、及びIgA2に更に分類されてもよい。

0090

単鎖Fv」又は「scFv」は、本明細書で使用される場合、VH抗体ドメイン及びVL抗体ドメインの融合タンパク質を指し、これらドメインは、共に連結されて単一のポリペプチド鎖になっている。幾つかの実施形態では、Fvポリペプチドリンカーにより、scFvは、抗原と結合するための所望の構造を形成することが可能になる。

0091

用語「ダイアボディ」は、2つの抗原結合部位を有する小型の抗体断片を指し、この断片は、同じポリペプチド鎖中に、軽鎖可変ドメインVLに接続された重鎖可変ドメインVHを含む。同じ鎖中の2つのドメイン間の対合が可能にならない程度に短いリンカーを使用することにより、ドメインを、別の鎖の相補的ドメインと対合させ、2つの抗原結合部位を生成させる。ダイアボディは、例えば、欧州特許第404,097号明細書;国際公開第93/11161号;及びHollingerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、90巻:6444〜6448頁(1993年)により詳細に記載されている。これらの文献の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

0092

用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、実質的に均質な細胞(又はクローン)の集団から得られる抗体を指し、つまり、集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の産生中に生じる可能性のある変異体を除いて、そのような変異体の存在は、一般的に少量であるが、同一であり及び/又は同一のエピトープに結合する。典型的には様々な決定基(エピトープ)に対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体の調製とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対する。

0093

モノクローナル」という修飾語は、抗体が実質的に均質な集団から得られているという特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。本明細書のモノクローナル抗体には、重鎖及び/又は軽鎖の部分が、特定の種に由来するか又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同性であり、鎖(複数可)の残りが、別の種に由来するか又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体並びにそのような抗体の断片の対応する配列と同一又は相同性である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)が含まれる。

0094

非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」型は、含まれている非ヒト免疫グロブリン由来の配列が最小限であるキメラ抗体である。おおむねヒト化抗体は、レシピエントの抗体に由来する超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラットウサギ、又は非ヒト霊長類等の非ヒト種の抗体(ドナー抗体)に由来する超可変領域の残基に置換されているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。

0095

抗体に関して本明細書中で使用される場合、用語「超可変領域」は、抗原結合に関与するアミノ酸残基を含む抗体の抗原結合ドメイン内の領域を指す。超可変領域内に存在するアミノ酸が、相補性決定領域(CDR)の構造を決定する。本明細書で使用される場合、「CDR」は、その標的抗原又はエピトープに相補的な構造を含む抗体の領域を指す。

0096

幾つかの実施形態では、本発明の組成物は、抗体模倣体であってもよい。用語「抗体模倣体」は、抗体の機能又は効果を模倣し、それらの分子標的と特異的に高親和性で結合するあらゆる分子を指す。したがって、抗体模倣体には、ナノボディ等が含まれる。

0097

幾つかの実施形態では、抗体模倣体は、アフィボディ分子、アフィリン、アフィティン(affitin)、アンチカリンアビマー、DARPin、フィノマー(Fynomer)、及びクニッツ(Kunitz)、及びドメインペプチドを含むが、それらに限定されない、当技術分野で知られているものであってもよい。他の実施形態では、抗体模倣体は、1つ又は複数の非ペプチド領域を含んでいてもよい。

0098

本明細書で使用される場合、用語「抗体変異体」は、天然抗体と比較して、それらのアミノ酸配列、組成、又は構造に幾つかの差異を含む、構造及び/又は機能が抗体と類似する生体分子を指す。

0099

モノクローナルであろうと又はポリクローナルであろうと、抗体の調製は、当技術分野で既知である。抗体を産生するための技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Harlow及びLane「Antibodies,A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1988年、並びにHarlow及びLane「Using Antibodies: A Laboratory Manual」Cold Spring Harbor Laboratory Press、1999年に記載されている。

0100

1つの実施形態では、上述のような抗体、抗体断片、それらの変異体又は誘導体を含む検出分子は、アレルゲンに対して特異的な免疫反応性を示す。また、抗体又は抗体の断片を含む検出分子は、アレルゲンの標的部位に結合することができる。

0101

本発明の抗体は、それらの標的分子(複数可)により、それらの生成に使用された抗原により、それらの機能により(アゴニストとしてか又はアンタゴニストとしてか)、及び/又はそれらが機能する細胞ニッチにより特徴付けることができる。

0102

抗体機能の測定は、in vitro又はin vivoにて、正常な生理的状態下において標準物質に対して行ってもよい。また、測定は、抗体の存在又は非存在に対して行ってもよい。そのような測定方法には、ウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、活性アッセイ、リポーターアッセイ、ルシフェラーゼアッセイポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アレイ、遺伝子アレイ、及びリアルタイム逆転写酵素RT)PCR等の、組織又は血清若しくは血液等の流体での標準的測定が含まれる。

0103

検出分子抗体は、アレルゲンタンパク質の又はアレルゲンタンパク質に沿った任意の数の位置で結合又は相互作用してもよい。企図されているアレルゲン抗体標的部位には、上記アレルゲンを検出するためのありとあらゆる考え得る部位が含まれる。

0104

本発明の検出分子化合物は、1つ又は複数のアレルゲン標的部位に結合(可逆的に又は不可逆的に)することにより、それらの効果を発揮する。理論により束縛されることは望まないが、抗体の結合部位である標的部位は、タンパク質又はタンパク質ドメイン若しくは領域により形成されることが最も多い。しかしながら、標的部位には、糖、脂質、核酸分子、又は結合エピトープの任意の他の形態等の生体分子も含まれ得る。

0105

本発明の検出分子抗体、並びにそれらを生成するために使用される抗原は、主にアミノ酸に基づく分子である。これら分子は、「ペプチド」、「ポリペプチド」、又は「タンパク質」であってもよい。

0106

本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」は、2から50までの又はそれを超えるアミノ酸を有するアミノ酸に基づく分子を指す。より小さなペプチドには、2アミノ酸の分子を指す「ジペプチド」、及び3アミノ酸の分子を指す「トリペプチド」という特別な指示名称が適用される。50を超える連続したアミノ酸を有するアミノ酸に基づく分子は、ポリペプチド又はタンパク質とみなされる。

0107

用語「アミノ酸」は、あらゆる天然L−アルファ−アミノ酸並びに非天然アミノ酸を指す。アミノ酸は、以下のような1文字表記又は3文字表記のいずれかにより特定される:アスパラギン酸(Asp:D)、イソロイシン(Ile:I)、トレオニン(Thr:T)、ロイシン(Leu:L)、セリン(Ser:S)、チロシン(Tyr:Y)、グルタミン酸(Glu:E)、フェニルアラニン(Phe:F)、プロリン(Pro:P)、ヒスチジン(His:H)、グリシン(Gly:G)、リジン(Lys:K)、アラニン(Ala:A)、アルギニン(Arg:R)、システイン(Cys:C)、トリプトファン(Trp:W)、バリン(Val:V)、グルタミン(Gln:Q)、メチオニン(Met:M)、及びアスパラギン(Asn:N)。ここでは、アミノ酸がまず列挙され、その後の括弧内にそれぞれ3文字コード又は1文字コードが列挙されている。

0108

抗体:製造
本発明の抗体は、当技術分野で知られているか又は本出願に記載されている方法により産生されるポリクローナル、又はモノクローナル、又は組換えであってもよい。

0109

幾つかの実施形態では、本発明の抗体は、当業者により知られている検出可能な標識で検出するために標識されていてもよい。標識は、放射性同位元素蛍光化合物化学発光化合物、酵素、又は酵素コファクター、又は当技術分野で知られている任意の他の標識であってもよい。幾つかの態様では、所望の抗原に結合する抗体は、標識されていないが、一次抗体に特異的に結合する標識二次抗体との結合により検出することができる。

0110

本発明の抗体には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:ポリクローナル、モノクローナル、多特異性、ヒト、ヒト化、又はキメラ抗体、単鎖抗体、Fab断片、F(ab’)断片、Fab発現ライブラリーにより産生される断片、抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体)、細胞内で産生される抗体(つまり、細胞内抗体)、及び上記のもののいずれかのエピトープ結合性断片。本発明の抗体は、鳥類及び哺乳類を含む任意の動物起源に由来してもよい。好ましくは、そのような抗体は、ヒト、ネズミ科動物(例えば、マウス及びラット)、ロバヒツジ、ウサギ、ヤギモルモットラクダウマ、又はニワトリ起源である。本発明の抗体は単一特異的であってもよく、又は多特異的であってもよい(例えば、二重特異的、三重特異的、又はそれより高次の多重特異的)。多特異性抗体は、本発明のペプチドの異なるエピトープに特異的であってもよく、又は本発明のペプチド、及び異種性ペプチド又は固体支持材料等の異種性エピトープの両方に特異的であってもよい。(例えば、以下の文献を参照されたい:国際公開第93/17715号;国際公開第92/08802号;国際公開第91/00360号;国際公開第92/05793号;Tutt,A.ら、Trispecific F(ab’)3 derivatives that use cooperative signaling via the TCR/CD3 complex and CD2 to activate and redirect resting cytotoxic T cells.J Immunol.1991年7月1日;147巻(1号):60〜9頁;米国特許第4,474,893号明細書;第4,714,681号明細書;第4,925,648号明細書;第5,573,920号明細書;第5,601,819号明細書;及びKostelny,S.A.ら、Formation of a bispecific antibody by the use of leucine zippers.J Immunol.1992年3月1日;148巻(5号):1547〜53頁)。例えば、抗体は、本発明のペプチド配列反復ユニットを含むペプチドに対して産生されてもよく、又は本発明の2つ以上のペプチド配列を含むペプチドに対して産生されてもよく、又はそれらの組み合わせであってもよい。

0111

非限定的な例として、マスト細胞結合IgE抗体に対するアレルゲン結合を競合的に阻害し、それによりマスト細胞脱顆粒を阻害するヘテロ二価リガンド(HBL)系が設計されている(Handlogtenら、Design of a Heterobivalent Ligand to InhibitIgEClustering on Mast Cells、Chemistry&Biology、2011年9月23日、18巻(9号):1179〜1188頁)。

0112

幾つかの実施形態では、抗体は、アレルゲンの任意の領域から調製することができる。本発明では、抗体を生成するためのペプチドは、好ましくは、長さが少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、より好ましくは、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、好ましくは約5〜約50アミノ酸、より好ましくは長さが約10〜約30アミノ酸、更により好ましくは長さが約10〜約20アミノ酸の配列を含む。

0113

より大型のポリペプチド又はタンパク質が抗体の生成に使用される、本発明のある実施形態では、それらは、長さが好ましくは少なくとも50、少なくとも55、少なくとも60、少なくとも70、少なくとも80、少なくとも90、又はそれを超えるアミノ酸である。

0114

本発明のモノクローナル抗体は、当業者に知られている十分に確立された方法を使用して調製することができる。1つの実施形態では、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して調製される(Kohler,G.ら、Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.、Nature、1975年8月7日:256巻(5517号):495〜7頁)。ハイブリドーマ法では、典型的には、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物を、免疫作用剤(例えば、本発明のペプチド)で免疫して、その免疫作用剤に特異的に結合することになる抗体を産生するか又は産生可能なリンパ球を誘発させる。或いは、リンパ球をin vitroで免疫してもよい。その後、ポリエチレングリコール等の好適な融合剤を使用して、リンパ球を不死化細胞株と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding,J.W.ら、Monoclonal Antibodies: Principles and Practice.Academic Press.1986年;59−1031)。不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯動物、ウサギ、ウシ、及びヒト起源ミエローマ細胞である。通常、ラット又はマウスミエローマ細胞株が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の増殖又は生存を阻害する1種又は複数種の物質を含有する好適な培養培地で培養してもよい。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠如している場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含むであろう(「HAT培地」)。これらの物質は、HGPRT欠損細胞の増殖を防止する。

0115

好ましい不死化細胞株は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、HAT培地等の培地感受性であるものである。より好ましい不死化細胞株は、マウスミエローマ系統であり、例えば、Salk Institute Cell Distribution Center、サンディエゴ市、カリフォルニア州、及びアメリカ培養細胞系統保存機関、マナッサス市、バージニア州から取得することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテロミエローマ細胞株も記載されている(Kozbor,D.ら、A human hybrid myeloma for production of human monoclonal antibodies.J Immunol.1984年12月;133巻(6号):3001〜5頁;Brodeur,B.ら、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications.Marcel Dekker,Inc.New York.1987年;33巻:51〜63頁)。

0116

その後、ハイブリドーマ細胞が培養されている培養培地を、モノクローナル抗体の存在についてアッセイしてもよい。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性(つまり、特異的免疫反応性)は、免疫沈降法により、又はラジオイムノアッセイRIA)若しくは酵素結合免疫吸着法(ELISA)等のin vitro結合アッセイにより決定される。そのような技術及びアッセイは、当業者に知られている。モノクローナル抗体の結合特異性は、例えば、スキチャード分析により決定することができる(Munson,P.J.ら、Ligand:a versatile computerized approach for characterization of ligand−binding systems.Anal Biochem.1980年9月1日;107巻(1号):220〜39頁)。

0117

所望のハイブリドーマ細胞を特定した後、クローンを限界希釈手順によりサブクローンし、標準的な方法により増殖させる。この目的に好適な培養培地には、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地又はRPMI−1640培地が含まれる。或いは、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中の腹水としてin vivoで増殖させてもよい。

0118

サブクローンが分泌したモノクローナル抗体を、例えば、プロテインAセファロースヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製手順により培養培地又は腹水から単離又は精製してもよい。

0119

また、別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、米国特許第4,816,567号明細書に記載のもの等の組換えDNA法により作製してもよい。この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定することができる(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより)。本発明のハイブリドーマ細胞は、DNAの好ましい供給源としての役目を果たす。単離したら、DNAを発現ベクターに配置し、その後それを、サルOS細胞チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、又は形質転換しなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しないミエローマ細胞等の宿主細胞形質移入して、組換え宿主細胞中でのモノクローナル抗体の合成を得る。また、DNAを、例えば、相同性マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列代用することにより(米国特許第4,816,567号明細書)、又は免疫グロブリンコード配列、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部若しくは全てに共有結合で連結することにより修飾してもよい。そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、本発明の抗体の定常ドメインの代わりに用いてもよく、又は本発明の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインの代わりに用いて、キメラ二価抗体を作成してもよい。

0120

また、別の実施形態では、本発明の抗体は、当業者に知られている種々の手順により産生してもよい。ポリクローナル抗体をin vivoで産生する場合、遊離ペプチド又はキャリア結合ペプチドのいずれかを、例えば腹腔内注射及び/又は皮内注射して、ウサギ、ラット、マウス、ヒツジ、又はヤギ等の宿主動物を免疫する。注射物質は、典型的には、約100μgのペプチド又はキャリアタンパク質を含有するエマルジョンである。また、宿主種に応じて、種々のアジュバントを使用して、免疫学的応答を増加させてもよい。アジュバントには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:フロインド(完全及び不完全)、水酸化アルミニウム等の鉱物ゲルリソレシチン等の界面活性物質プルロニックポリオールポリアニオン、ペプチド、油乳剤キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール、及びBCGカルメットゲラン菌(Bacillus Calmette−Guerin))及びコリネバクテリウムパルブム(Corynebacterium parvum)等の他の有用なヒトアジュバント。そのようなアジュバントも、当技術分野で周知である。有用な抗体力価をもたらすために、例えば約2週間の間隔で幾つかのブースター注射が必要である場合があり、力価は、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドが使用されるELISAアッセイにより検出することができる。免疫動物に由来する血清中の抗体の力価は、抗体の選択により、例えば、当技術分野で周知の方法により、ペプチドを固体支持体に吸着させ、選択した抗体溶出することにより増加させることができる。

0121

抗体、変異体、及びそれらの断片を含む検出分子は、ハイスループットディスカバリ法を使用して選択及び産生することができる。1つの実施形態では、合成抗体、変異体、及びそれらの断片を含む検出分子は、ディスプレイライブラリーの使用により産生される。用語「ディスプレイ」は、本明細書で使用される場合、タンパク質又はペプチドが所与の宿主の表面に発現又は「提示」されることを指す。用語「ライブラリー」は、本明細書中に使用される場合、固有cDNA配列コレクションを指す。ライブラリーは、少ない場合で2個の固有cDNAから数千億個までの固有cDNAを含んでいてもよい。好ましい実施形態では、合成抗体を含む検出分子は、抗体ディスプレイライブラリー又は抗体断片ディスプレイライブラリーを使用して産生される。用語「抗体断片ディスプレイライブラリー」は、本明細書中に使用される場合、各メンバーが、抗体の少なくとも1つの可変領域を含む抗体断片をコードするディスプレイライブラリーを指す。そのような抗体断片は、好ましくはFab断片であるが、単鎖可変断片(scFv)等の他の抗体断片も同様に企図される。Fab抗体断片ライブラリーでは、コードされた各Fabは、Fab断片の相補性決定領域(CDR)の可変ループ内に含まれるアミノ酸配列を除いて同一であってもよい。別の又は更なる実施形態では、個々のVH及び/又はVL領域内のアミノ酸配列も同様に異なっていてもよい。

0122

ディスプレイライブラリーは、これらに限定されないが、酵母、バクテリオファージ、細菌、及びレトロウイルスを含む、幾つかの考え得る宿主で発現させることができる。使用することができる更なるディスプレイ技術には、リボソームディスプレイマイクロビーズディスプレイ、及びタンパク質−DNA連結技術が含まれていてもよい。好ましい実施形態では、Fabディスプレイライブラリーは、酵母又はバクテリオファージで発現される(本明細書では「ファージ」又は「ファージ粒子」とも呼ばれる。発現されると、Fabは、ファージ又は酵母の表面を修飾し、そこで所与の抗原と相互作用することができる。アレルゲンを含む抗原又は所望の標的部位に由来する抗原を使用して、その抗原に対して最も高い親和性を有する抗体断片を発現するファージ粒子又は酵母細胞を選択してもよい。その後、結合した抗体断片のCDRをコードするDNA塩基配列を、結合した粒子又は細胞を使用して配列決定することにより決定することができる。1つの実施形態では、抗体の発生にはポジティブ選択が使用される。本明細書で使用される場合、用語「ポジティブ選択」は、標的部位を含む抗原に対する親和性に基づいて、抗体及び/又はそれらの断片をディスプレイライブラリーから選択するプロセスを指す。幾つかの実施形態では、抗体の発生にはネガティブ選択が使用される。本明細書で使用される場合、用語「ネガティブ選択」は、抗体を産生するための標的部位を欠如する抗原を使用して、抗体発生中に所与のディスプレイライブラリーから抗体及び/又はその断片を除外するプロセスを指す。幾つかの実施形態では、ディスプレイライブラリーを使用して抗体発生における選択を複数ラウンド行う間に、ポジティブ選択及びネガティブ選択を両方とも使用する。

0123

酵母ディスプレイでは、Chaoら(Chao,G.ら、Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display.Nat Protoc.2006年;1巻(2号):755〜68頁)に記載のように、様々な抗体断片をコードするcDNAを酵母細胞に導入し、そこでそれらを発現させ、抗体断片を細胞表面に「提示」させる。酵母表面提示では、発現された抗体断片は、酵母アグルチニンタンパク質、Aga2pを含む更なるドメインを含有する。このドメインは、表面に発現されたAga1pとジスルフィド結合を形成することにより、抗体断片融合タンパク質を酵母細胞の外側表面に結び付けることを可能にする。結果として、特定の抗体断片に覆われた酵母細胞がもたらされる。抗体断片が各々固有の配列を有する、これら抗体断片をコードするcDNAのディスプレイライブラリーをまず使用する。これら融合タンパク質を、所望の抗原性標的ペプチドと相互作用することができる、何百万個もの酵母細胞の細胞表面に発現させ、細胞と共にインキュベートする。標的ペプチドは、好適な抗体断片との結合がうまくいった後で、効率的な細胞選別を可能にする化学基又は磁気基で共有結合的に又は別様に修飾してもよい。回収は、磁気活性化細胞選別法(MACS)、蛍光活性化細胞選別法(FACS)、又は当技術分野で知られている他の細胞選別法により行うことができる。酵母細胞の部分集団を選択したら、対応するプラスミドを分析して、CDR配列を決定することができる。

0124

バクテリオファージディスプレイ法では、典型的には、fd、F1、及びM13ビリオンを含む糸状ファージが使用される。そのような株は、非細胞溶解性であり、宿主の継続的な増殖及びウイルス力価の増加が可能である。本発明の抗体の作製に使用することができるファージディスプレイ法の例は、以下の文献に記載されているものが含まれる:Mierschら(Miersch,S.ら、Synthetic antibodies:Concepts,potential and practical considerations.Methods.2012年8月;57巻(4号):486〜98頁)、Bradburyら(Bradbury,A.R.ら、Beyondnatural antibodies:the power of in vitro display technologies.Nat Biotechnol.2011年3月;29巻(3号):245〜54頁)、Brinkmanら(Brinkmann,U.ら、Phage display of disulfide−stabilized Fv fragments.J Immunol Methods.1995年5月11日;182巻(1号):41〜50頁);Amesら(Ames,R.S.ら、Conversion of murineFabs isolated from a combinatorial phage display library to full length immunoglobulins.J Immunol Methods.1995年8月18日;184巻(2号):177〜86頁);Kettleboroughら(Kettleborough,C.A.ら、Isolation of tumor cell−specific single−chain Fv from immunized mice using phage−antibody libraries and the re−construction of whole antibodies from these antibody fragments.Eur J Immunol.1994年4月;24巻(4号):952〜8頁);Persicら(Persic,L.ら、An integrated vector system for the eukaryotic expression of antibodies or their fragments after selection from phage display libraries.Gene.1997年3月10日;187巻(1号):9〜18頁);PCT出願PCT/GB91/01134号;PCT出願国際公開第90/02809号;国際公開第91/10737号;国際公開第92/01047号;国際公開第92/18619号;国際公開第93/11236号;国際公開第95/15982号;国際公開第95/20401号;並びに米国特許第5,698,426号明細書;第5,223,409号明細書;第5,403,484号明細書;第5,580,717号明細書;第5,427,908号明細書;第5,750,753号明細書;第5,821,047号明細書;第5,571,698号明細書;第5,427,908号明細書;第5,516,637号明細書;第5,780,225号明細書;第5,658,727号明細書;第5,733,743号明細書、及び第5,969,108号明細書。これらの文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

0125

バクテリオファージでの抗体断片発現は、断片をコードするcDNAを、ウイルスコートタンパク質を発現する遺伝子に挿入することにより実施することができる。糸状バクテリオファージのウイルスコートは、一本鎖ゲノムによりコードされている5つのコートタンパク質で構成されている。コートタンパク質pIIIは、典型的にはN末端での抗体断片発現に好ましいタンパク質である。抗体断片発現がpIIIの機能を妨害する場合、ウイルス機能は、野生型pIIIの共発現により回復する場合がある。そのような発現は、ウイルスコートに発現される抗体断片の数を減らすことになるが、標的抗原による抗体断片への接近を増強することができる。或いは、ウイルスタンパク質並びに抗体断片タンパク質の発現は、複数のプラスミドにコードされていてもよい。この方法を使用すると、感染性プラスミドの全体サイズを低減させ、形質転換効率を増強させることができる。

0126

上述のように、高親和性の抗体又は抗体断片を発現する宿主を選択した後、抗体又は後退断片に由来するコード領域を単離し、ヒト抗体を含む抗体全体又は任意の他の所望の抗原結合性断片を生成するために使用し、例えば、下記に詳述するような、哺乳動物細胞、昆虫細胞植物細胞、酵母、及び細菌を含む、任意の所望の宿主で発現させることができる。

0127

高親和性抗体をコードするDNA配列を、親和性成熟として知られているプロセスの更なる選択ラウンドにかけて、突然変異させてもよい。用語「親和性成熟」は、本明細書で使用される場合、抗体をコードするcDNA配列又は抗体断片をコードするcDNA配列を、突然変異及び選択の連続ラウンドにかけて、所与の抗原に対する親和性が増加した抗体を産生する方法を指す。好ましい実施形態では、このプロセスは、in vitroで実施される。これを達成するために、エラープローンPCRを使用してCDRコード配列の増幅を実施して、これらに限定されないが、点突然変異、領域突然変異、挿入突然変異、及び欠失突然変異を含む突然変異を含有する数百万個のコピーを生成することができる。本明細書で使用される場合、用語「点突然変異」は、ヌクレオチド配列内の1つのヌクレオチドが、異なるヌクレオチドに変更されている核酸突然変異を指す。本明細書で使用される場合、用語「領域突然変異」は、2つ以上の連続ヌクレオチドが、異なるヌクレオチドに変更されている核酸突然変異を指す。本明細書で使用される場合、用語「挿入突然変異」は、1つ又は複数のヌクレオチドが、ヌクレオチド配列に挿入されている核酸突然変異を指す。本明細書で使用される場合、用語「欠失突然変異」は、1つ又は複数のヌクレオチドが、ヌクレオチド配列から除去されている核酸突然変異を指す。挿入突然変異又は欠失突然変異は、コドン全体の完全な置換、又は開始コドンの1つ若しくは2つのヌクレオチドを変更することにより、あるコドンを別のコドンに変更することが含まれていてもよい。

0128

CDRをコードするcDNA配列に対して突然変異誘発を実施して、CDR重鎖及び軽鎖領域に単突然変異を有する数百万個の突然変異を生成することができる。別の手法では、親和性を向上させる可能性が最も高いCDR残基のみにランダム突然変異を導入する。こうした新しく生成された突然変異ライブラリーを使用して、標的ペプチドに対する親和性が更に高い抗体断片をコードするクローンをスクリーニングするプロセスを繰り返すことができる。突然変異及び選択のラウンドを継続することにより、益々より高い親和性を有するクローンの合成が促進される(Chao,G.ら、Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display.Nat.Protoc.2006年;1巻(2号):755〜68頁)。

0129

Fab及びscFv等の抗体及び抗体断片を産生するために使用することができる技術例には、以下の文献に記載のものが含まれる:米国特許第4,946,778号明細書及び第5,258,498号明細書;Mierschら(Miersch,S.ら、Synthetic antibodies:Concepts,potential and practical considerations.Methods.2012年8月;57巻(4号):486〜98頁)、Chaoら(Chao,G.ら、Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display.Nat Protoc.2006年;1巻(2号):755〜68頁)、Hustonら(Huston,J.S.ら、Protein engineering of single−chain Fv analogs and fusion proteins.Methods Enzymol.1991年;203巻:46〜88頁);Shuら(Shu,L.ら、Secretion of a single−gene−encoded immunoglobulin from myeloma cells.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1993年9月1日;90巻(17号):7995〜9頁);及びSkerraら(Skerra,A.ら、Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli.Science.1988年5月20日;240巻(4855号):1038〜41頁)。これらの文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

0130

ヒトにおける抗体のin vivo使用及びin vitro検出アッセイを含む幾つかの用途には、キメラ、ヒト化、又はヒト抗体を使用することが好ましい。キメラ抗体は、マウスモノクローナル免疫グロブリンに由来する可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体等の、抗体の異なる部分が、異なる動物種に由来する分子である。キメラ抗体を産生するための方法は、当技術分野で知られている。(Morrison,S.L.、Transfectomas provide novel chimeric antibodies.Science.1985年9月20日;229巻(4719号):1202〜7頁;Gillies,S.D.ら、High−level expression of chimeric antibodies using adaptedcDNAvariable region cassettes.J Immunol Methods.1989年12月20日;125巻(1〜2号):191〜202頁;及び米国特許第5,807,715号明細書;第4,816,567号明細書;及び第4,816,397号明細書。これらの文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。

0131

ヒト化抗体は、所望の抗原と結合し、非ヒト種に由来する1つ又は複数の相補性決定領域(CDR)及びヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域を有する非ヒト種に由来する抗体分子である。多くの場合、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基を、ドナー抗体のCDR及びフレームワーク領域の対応する残基と置換して、抗原結合を変更、好ましくは向上させる。こうしたフレームワーク置換は、当技術分野で周知の方法により、例えば、CDR及びフレームワーク残基の相互作用をモデリングして、抗原結合に重要なフレームワーク残基を特定することにより、及び配列を比較して、特定位置の非通常フレームワーク残基を特定することにより特定される。(米国特許第5,693,762号明細書及び第5,585,089号明細書;Riechmann,L.ら、Reshapinghuman antibodies for therapy.Nature.1988年3月24日;332巻(6162号):323〜7頁。これらの文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。

0132

抗体は、以下のものを含む、当技術分野で知られている種々の技術を使用してヒト化することができる:例えば、CDR移植(欧州特許第239,400号明細書;PCT出願国際公開第91/09967号;米国特許第5,225,539号明細書;第5,530,101号明細書;及び第5,585,089号明細書);ベニアリング(veneering)又はリサーフェイシング(resurfacing)(欧州特許第592,106号明細書;欧州特許第519,596号明細書;Padlan,E.A.A possible procedure for reducing the immunogenicity of antibody variable domains while preserving their ligand−binding properties.Mol Immunol.1991年4月〜5月;28巻(4〜5号):489〜98頁;Studnicka,G.M.ら、Human−engineered monoclonal antibodies retain full specific binding activity by preserving non−CDR complementarity−modulating residues.Protein Eng.1994年6月;7巻(6号):805〜14頁;Roguska,M.A.ら、Humanization of murine monoclonal antibodies through variable domain resurfacing.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1994年2月1日;91巻(3号):969〜73頁);及び鎖シャッフリング(米国特許第5,565,332号明細書)。これらの文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

0133

完全なヒト抗体は、外来性タンパク質に対する免疫反応を回避又は緩和するため、ヒト患者治療処置に特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用して、上述の抗体ディスプレイ法を含む、当技術分野で知られている様々な方法により作製することができる。米国特許第4,444,887号明細書及び第4,716,111号明細書;並びにPCT出願国際公開第98/46645号、国際公開第98/50433号、国際公開第98/24893号、国際公開第98/16654号、国際公開第96/34096号、国際公開第96/33735号、及び国際公開第91/10741号も参照されたい。これらの文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

0134

また、ヒト抗体は、機能的な内因性免疫グロブリンは発現することはできないが、ヒト免疫グロブリンポリヌクレオチドを発現することができるトランスジェニックマウスを使用して産生することができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリンポリヌクレオチド複合体を、ランダムに、又は相同組換えにより、マウス胚幹細胞に導入してもよい。或いは、ヒト重鎖及び軽鎖ポリヌクレオチドに加えて、ヒト可変領域、定常領域、及び多様性領域をマウス胚幹細胞に導入してもよい。マウス重鎖及び軽鎖免疫グロブリンポリヌクレオチドは、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に又は同時に、機能性を失うように退化させてもよい。特に、JH領域のホモ接合欠失は、内因性抗体産生を妨げる。修飾胚幹細胞を増殖させ、胚盤胞マイクロインジェクションして、キメラマウスを産生する。その後、キメラマウスを飼育して、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を生み出す。トランスジェニックマウスを、通常の方法を用いて、選択した抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全体又は部分で免疫する。

0135

したがって、そのような技術を使用すれば、有用なヒトIgG、IgA、IgM、IgD、及びIgE抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するための技術の概説は、Lonberg及びHuszar(Lonberg,N.ら、Human antibodies from transgenic mice.Int.Rev.Immunol.1995年;13巻(1号):65〜93頁)を参照されたい。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を産生するための技術、並びにそのような抗体を産生するためのプロトコールの詳細な考察は、以下の文献を参照されたい:PCT出願国際公開第98/24893号;国際公開第92/01047号;国際公開第96/34096号;国際公開第96/33735号;米国特許第5,413,923号明細書;第5,625,126号明細書;第5,633,425号明細書;第5,569,825号明細書;第5,661,016号明細書;第5,545,806号明細書;第5,814,318号明細書;第5,885,793号明細書;第5,916,771号明細書;第5,939,598号明細書;第6,075,181号明細書;及び第6,114,598号明細書。これらの文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。加えて、Abgenix,Inc.社(フリーモント、カリフォルニア州)、Protein Design Labs,Inc.社(マウンテンビュー、カリフォルニア州)、及びGenpharm社(サンホゼ、カリフォルニア州)等の企業が、上述の技術に類似した技術を使用して、選択した抗原に対するヒト抗体を提供する業務を行うことができる。

0136

本発明の抗体分子を、動物、細胞株化学合成、又は組換え発現により産生したら、それを、免疫グロブリン又はポリペプチド分子を精製するための、当技術分野で知られている任意の方法、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、特に特異性抗原であるプロテインAに対する親和性による親和性クロマトグラフィー、及びサイズ分類カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度の差異、又はタンパク質を精製するための任意の他の標準的技術により精製(つまり、単離)することができる。加えて、本発明の抗体又はその断片を、本明細書に記載の又はそうでなければ当技術分野で知られている異種性ポリペプチド配列に融合して、精製を容易にしてもよい。

0137

検出分子の変異体
アミノ酸に基づく検出分子は、完全なポリペプチド、複数のポリペプチド、又はポリペプチドの断片として存在していてもよく、それらは、1つ又は複数の核酸、核酸の断片、又は前述のもののいずれかの変異体により、独立してコードされていてもよい。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、ほとんどの場合ペプチド結合で共に連結されていることが多いアミノ酸残基(天然又は非天然)のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用される場合、任意のサイズ、構造、又は機能のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドを指す。幾つかの場合、コードされたポリペプチドは、約50アミノ酸よりも小さく、そのようなポリペプチドは、ペプチドと名付けられる。ポリペプチドがペプチドである場合、その長さは、少なくとも約2、3、4、又は少なくとも5のアミノ酸残基になるであろう。したがって、ポリペプチドには、遺伝子産物天然ポリペプチド合成ポリペプチド相同体オルソログパラログ、断片、及び前述のものの他の等価物、変異体、及び類似体が含まれる。ポリペプチドは、単分子であってもよく、二量体、三量体、又は四量体等の多分子複合体であってもよい。また、ポリペプチドは、単鎖又は複数鎖のポリペプチドを含んでいてもよく、結合又は連結されていてもよい。用語ポリペプチドは、1つ又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸人工化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用される場合がある。

0138

本発明のある実施形態によると、検出分子の変異体が提供される。
用語「ポリペプチド変異体」は、天然配列又は参照配列とアミノ酸配列が異なる分子を指す。アミノ酸配列変異体は、天然配列又は参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある位置に置換、欠失、及び/又は挿入を有していてもよい。通常、変異体は、天然配列又は参照配列に対して少なくとも約50%の同一性(相同性)を有し、好ましくは、天然配列又は参照配列に対して、少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%の同一性(相同性)を有するであろう。

0139

用語「ポリヌクレオチド変異体」は、天然配列又は参照配列と核酸配列が異なる分子を指す。核酸配列変異体は、天然配列又は参照配列と比較して、アミノ酸配列内のある位置に置換、欠失、及び/又は挿入を有していてもよい。通常、変異体は、天然配列又は参照配列に対して少なくとも約50%の同一性(相同性)を有し、好ましくは、天然配列又は参照配列に対して、少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%の同一性(相同性)を有するであろう。

0140

幾つかの実施形態では、「変異模倣体」が提供される。本明細書で使用される場合、用語「模倣変異体」は、活性化配列を模倣することになる1つ又は複数のアミノ酸(又は核酸)を含有するものである。例えば、グルタマートは、リン酸化トレオニン及び/又はリン酸化セリンの模倣体としての役目を果たすことができる。或いは、模倣変異体は、不活化、又は模倣体を含有する不活化産物をもたらす場合があり、例えば、フェニルアラニンは、チロシンの不活化置換としての作用する場合があり、又はアラニンは、セリンの不活化置換として作用する場合がある。本発明の検出分子のアミノ酸配列(又は核酸配列)は、天然アミノ酸(又は核酸)を含んでいてもよい。或いは、検出分子は、天然及び非天然アミノ酸又は非天然核酸)を含んでいてもよい。

0141

用語「アミノ酸配列変異体」は、天然配列又は開始配列と比較して、アミノ酸配列に幾つかの差異がある分子を指す。用語「核酸配列変異体」は、天然配列又は開始配列と比較して、核酸配列に幾つかの差異がある分子を指す。配列変異体は、アミノ酸配列内のある位置に置換、欠失、及び/又は挿入を有していてもよい。「天然」配列又は「開始」配列を、野生型配列混同してはならない。本明細書で使用される場合、天然配列又は開始配列は、比較することができる元の分子を指す相対的な用語である。「天然」又は「開始」配列又は分子は、野生型(自然界に見出されるその配列)であってもよいが、野生型の配列である必要はない。

0142

通常、変異体は、天然配列に対して少なくとも約70%の相同性を有し、好ましくは、天然配列に対して、少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%の相同性を有するであろう。

0143

「相同性」は、アミノ酸配列又は核酸配列に適用される場合、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入して、最大の相同性パーセントを達成した後の、第2の配列の配列中の残基と同一である候補配列中の残基のパーセントとして定義される。アラインメントの方法及びコンピュータプログラムは、当技術分野で周知である。相同性は、同一性パーセントの計算に依存するが、計算に導入されるギャップ及びペナルティのため、値が異なる場合があることが理解される。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

関連する公募課題一覧

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ