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課題

幅広年齢層で有益に利用可能なプロバイオティクス及びこれを含む組成物を提供すること。

解決手段

2’−フコシルラクトース及びセロビオースの資化能を有するビフィドバクテリウムブレーベ分類される細菌。ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITEBP−02871(受託番号:NITE BP−02871);前記細菌を含む組成物。好適には、さらに、2’−フコシルラクトース及び/又はセロビオースを含む組成物である。好適には、前記組成物が、さらに、2’−フコシルラクトース、セロビオース、セロビオースを構成糖とする多糖体、及びセロビオースを構成糖とするオリゴ糖からなる群より選択される1種又は2種以上を含む、組成物である。

概要

背景

近年、動物に良い影響を与える細菌(善玉菌)を積極的に摂取して腸内環境を整えることで、病気の発生抑制、健康増進等を目的とするプロバイオティクス及び善玉菌の増殖を助ける成分等のプレバイオティクスの研究が盛んに行われるようになってきている。プロバイオティクスは、腸内で有益な働きをする細菌をいうのに対して、プレバイオティクスは、これらのプロバイオティクスの選択的な栄養源となり、それらの増殖を促進する物質をいう。プレバイオティクスにより、乳酸菌ビフィドバクテリウム属細菌増殖促進作用整腸作用炎症性腸疾患への予防・改善作用等のヒトの健康に有益な効果があることが知られている。

例えば、特許文献1では、キムチ又はヒトの糞便から単離された、特定のラクトバチルス属細菌株、特定のビフィドバクテリウム属細菌株又はこれらの混合乳酸菌が、腸損傷、肝損傷、アレルギー疾患炎症性疾患肥満などの予防、改善または治療に有用な機能性食品及び医薬品素材として使用することができることが開示されている。

斯様に、プロバイオティクスやプレバイオティクスについて鋭意研究が進められている。

概要

幅広年齢層で有益に利用可能なプロバイオティクス及びこれを含む組成物を提供すること。 2’−フコシルラクトース及びセロビオースの資化能を有するビフィドバクテリウムブレーベ分類される細菌。ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITEBP−02871(受託番号:NITE BP−02871);前記細菌を含む組成物。好適には、さらに、2’−フコシルラクトース及び/又はセロビオースを含む組成物である。好適には、前記組成物が、さらに、2’−フコシルラクトース、セロビオース、セロビオースを構成糖とする多糖体、及びセロビオースを構成糖とするオリゴ糖からなる群より選択される1種又は2種以上を含む、組成物である。なし

目的

近年、動物に良い影響を与える細菌(善玉菌)を積極的に摂取して腸内環境を整えることで、病気の発生抑制、健康増進等を目的とする

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

2’−フコシルラクトース及びセロビオースの資化能を有するビフィドバクテリウムブレーベ分類される細菌。

請求項2

前記ビフィドバクテリウム・ブレーベが、配列番号1に示す16SrRNA遺伝子塩基配列と99.9%以上の相同性を有する細菌である、請求項1記載の細菌。

請求項3

ビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871(受託番号:NITEBP−02871)。

請求項4

請求項1〜3のいずれかに記載の細菌を含む、組成物

請求項5

前記組成物が、プロバイオティクス組成物である、請求項4に記載の組成物。

請求項6

前記組成物が、少なくとも、乳幼児用大人用高齢者用のいずれかに用いられる、請求項4又は5に記載の組成物。

請求項7

前記組成物が、整腸用組成物飲食品組成物、及び育児用調製粉乳からなる群より選択される1種又は2種以上の組成物である、請求項4〜6のいずれかの項に記載の組成物。

請求項8

前記組成物が、さらに、2’−フコシルラクトース、セロビオース、セロビオースを構成糖とする多糖体、及びセロビオースを構成糖とするオリゴ糖からなる群より選択される1種又は2種以上を含む組成物である、請求項4〜7のいずれかの項に記載の組成物。

請求項9

ビフィドバクテリウム・ブレーベに分類される細菌の増殖を促進するのに使用するためのプレバイオティクス組成物であり、前記組成物が、2’−フコシルラクトース、セロビオース、セロビオースを構成糖とする多糖体、及びセロビオースを構成糖とするオリゴ糖からなる群より選択される1種又は2種以上を含む組成物である、プレバイオティクス組成物。

請求項10

2’−フコシルラクトース及び/又はセロビオースの資化能を有するビフィドバクテリウム・ブレーベに分類される細菌を含む組成物の製造方法。

請求項11

前記細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871(受託番号:NITEBP−02871)である、請求項10に記載の製造方法。

技術分野

0001

本発明は、新規ビフィドバクテリウム属細菌及び当該細菌を含む組成物に関する。

背景技術

0002

近年、動物に良い影響を与える細菌(善玉菌)を積極的に摂取して腸内環境を整えることで、病気の発生抑制、健康増進等を目的とするプロバイオティクス及び善玉菌の増殖を助ける成分等のプレバイオティクスの研究が盛んに行われるようになってきている。プロバイオティクスは、腸内で有益な働きをする細菌をいうのに対して、プレバイオティクスは、これらのプロバイオティクスの選択的な栄養源となり、それらの増殖を促進する物質をいう。プレバイオティクスにより、乳酸菌・ビフィドバクテリウム属細菌増殖促進作用整腸作用炎症性腸疾患への予防・改善作用等のヒトの健康に有益な効果があることが知られている。

0003

例えば、特許文献1では、キムチ又はヒトの糞便から単離された、特定のラクトバチルス属細菌株、特定のビフィドバクテリウム属細菌株又はこれらの混合乳酸菌が、腸損傷、肝損傷、アレルギー疾患炎症性疾患肥満などの予防、改善または治療に有用な機能性食品及び医薬品素材として使用することができることが開示されている。

0004

斯様に、プロバイオティクスやプレバイオティクスについて鋭意研究が進められている。

先行技術

0005

特表2018−536385号公報

発明が解決しようとする課題

0006

ここで、乳幼児腸内細菌叢大人の腸内細菌叢は異なり、これらの善玉菌の種類及び割合も異なることは一般的に知られている。このため、腸内の善玉菌を投与すること又は腸内の善玉菌の増殖を助ける成分を投与することで、乳幼児であっても大人であっても良好なプロバイオティクス効果が得られることが望ましい。

0007

しかしながら、乳幼児の腸内に多く存在する種類の善玉菌は、母乳栄養素適応しているケースが多く、大人の食事由来成分(食物繊維等)を利用できない。従って減少する善玉菌を積極的に大人になって摂取しても腸内で増殖させることは難しい。また、大人の食環境で良好に増殖する善玉菌を乳幼児に積極的に摂取させても、乳幼児に対して期待する効果(腸内細菌叢の形成、母乳の消化吸収感染防御等)があまり得られないことが多い。

0008

そこで、本技術は、幅広年齢層で有益に利用可能なプロバイオティクス、プレバイオティクス及び/又はこれを含む組成物を提供することを主な目的とする。

課題を解決するための手段

0009

本発明者は、乳幼児でも大人でも幅広い年齢層で有益に利用可能なプロバイオティクスを得ようとしたときに、まずは両者の食生活の違いに着目し検討を行った。
そして、本発明者らは、鋭意検討を行った結果、ヒト腸内細菌から採取されたビフィドバクテリウムブレーベにおいて、従来知られているブレーベの性質とは異なる性質を有する新たなグループが存在することを発見した。
具体的には、本発明者らは、全く偶然にも、「2’−フコシルラクトース」及び「セロビオース」の両方の資化能を有するビフィドバクテリウム・ブレーベが存在することを見出した。

0010

参考文献1(Wong et al., Benef Microbes. 29, 9, 1, 111-122(2018))では、ヒトに対して有益な保健効果を持つビフィドバクテリウム属細菌には、乳児常在する乳児型ビフィドバクテリウム属細菌と大人に常在する大人型ビフィドバクテリウム属細菌とが存在しており、ビフィドバクテリウムブレーベは、乳児型ビフィドバクテリウム属細菌に属することが記載されている。乳児型ビフィドバクテリウム属細菌はヒトミルクオリゴ糖(HMO)を資化する能力を有すること、一方で大人型ビフィドバクテリウム属細菌はセロビオースや食物繊維を資化する能力を有することが一般的に知られている。
乳児型ビフィドバクテリウム属細菌に属するブレーベは、通常、セロビオースやセルロースに対して資化能を有さないとされている。

0011

しかしながら、本発明者が見出した本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、ビフィドバクテリウム・ブレーベに属しながら、日々の食生活によって摂取可能な食物繊維(好適には、少なくともセルロースを含む食物繊維)及び/又はセロビオースを資化することができ、ヒトの腸内でも増殖が容易である。しかも、当該本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、2’−フコシルラクトースを資化することが可能であり、この2’−フコシルラクトースはヒトミルクオリゴ糖に多く含まれ、代表的なオリゴ糖の一つとして知られている。本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、乳幼児が摂取するヒトミルクオリゴ糖を利用できることから乳幼児の腸内で増殖が容易である。

0012

従って、本発明者らは、2’−フコシルラクトース及びセロビオースの両方の資化能を有する新規なビフィドバクテリウム・ブレーベを見出した。本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、幼児でも大人でも幅広い年齢層で有益に利用可能なプロバイオティクスであり、当該プロバイオティクスを含む組成物、及び当該プロバイオティクスの増殖促進用組成物を新たに提供できることを見出した。

0013

このように、本発明者らが発見した新たなビフィドバクテリウム・ブレーベであれば、大人の腸内で増殖が容易であり、さらに乳幼児の腸内で増殖が容易であるため、幅広い年齢層で利用することができる。この本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベであれば、幼児又は大人を問わずに幅広い年齢層で良好な腸内フローラ形成にも寄与することができる。
すなわち、本発明は、以下の(1)〜(11)のとおりである。

0014

(1)
2’−フコシルラクトース及びセロビオースの資化能を有するビフィドバクテリウム・ブレーベに分類される細菌。
(2)
前記ビフィドバクテリウム・ブレーベが、配列番号1に示す16SrRNA遺伝子塩基配列と99.9%以上の相同性を有する細菌である、前記(1)記載の細菌。
(3)
ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITEBP−02871(受託番号:NITE BP−02871)。
(4)
前記(1)〜(3)のいずれかに記載の細菌を含む、組成物。
(5)
前記組成物が、プロバイオティクス組成物である、前記(4)に記載の組成物。
(6)
前記組成物が、少なくとも、乳幼児用大人用高齢者用のいずれかに用いられる、前記(4)又は(5)に記載の組成物。
(7)
前記組成物が、整腸用組成物飲食品組成物、及び育児用調製粉乳からなる群から選択される1種又は2種以上の組成物である、前記(4)〜(6)のいずれかに記載の組成物。
(8)
前記組成物が、さらに、2’−フコシルラクトース、セロビオース、セロビオースを構成糖とする多糖体、及びセロビオースを構成糖とするオリゴ糖からなる群より選択される1種又は2種以上を含む組成物である、前記(4)〜(7)のいずれかに記載の組成物。
(9)
ビフィドバクテリウム・ブレーベに分類される細菌の増殖を促進するのに使用するためのプレバイオティクス組成物であり、前記組成物が、2’−フコシルラクトース、セロビオース、セロビオースを構成糖とする多糖体、及びセロビオースを構成糖とするオリゴ糖からなる群より選択される1種又は2種以上を含む組成物である、プレバイオティクス組成物。
(10)
2’−フコシルラクトース及び/又はセロビオースの資化能を有するビフィドバクテリウム・ブレーベに分類される細菌を含む組成物の製造方法。
(11)
前記細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP−02871株(受託番号:NITE BP−02871)である、前記(10)に記載の製造方法。

発明の効果

0015

本技術によれば、幅広い年齢層で有益に利用可能なプロバイオティクス及びこれを含む組成物を提供することができる。
なお、ここに記載された効果は必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。

0016

次に、本発明の好ましい実施形態について説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。

0017

<新規なビフィドバクテリウム属細菌>
本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、新規なビフィドバクテリウム属細菌であり、当該細菌はビフィドバクテリウムブレーベに分類される細菌であり、上述のように従来にはない「2’−フコシルラクトース」及び/又は「セロビオース」の資化能(特にこの両方の資化能)を有するという極めてユニークな特徴を有する。
本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、当該「2’−フコシルラクトース」及び/又は「セロビオース」の資化能を有するので、「2’−フコシルラクトース」及び/又は「セロビオース」を含有する組成物にて、容易に増殖することができる。そして、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、「2’−フコシルラクトース」及び「セロビオース」の両方の資化能を有することが好適であり、これにより、より幅広い年齢層で有益に利用することができる。

0018

本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベが、「2’−フコシルラクトース」の資化能を有することにより、2’−フコシルラクトースを含む組成物(例えば、ヒト母乳、ヒトミルクオリゴ糖、粉ミルク等)にて、容易に増殖することができる。本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、2’−フコシルラクトースを使用することで、腸内において増殖も容易となる。
なお、前記「2’−フコシルラクトース」の成分の詳細は、後述の「成分(a)2’−フコシルラクトース」にて説明する。

0019

本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、「セロビオース」の資化能を有することにより、セロビオース又はセロビオースを構成糖とする多糖体若しくはオリゴ糖を少なくとも含む組成物(例えば、野菜類キノコ類果実類等の加工品等)にて増殖することが容易にできるので、腸内において増殖が容易となる。
本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを増殖させる場合、前記「セロビオース」は植物細胞細胞壁成分であるセルロースの構成糖と知られているので、食物繊維(例えば、セルロースを少なくとも含む食物繊維)でも同様の効果が期待される。

0020

なお、前記「セロビオース」の成分の詳細は、後述の「成分(b)」にて説明する。
本明細書において、「セロビオース」とは、特に言及しない場合、本技術の菌群が資化可能なセロビオースを構成糖とする多糖体も含む意味である。
本明細書において、「糖質」とは、特に言及しない場合、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベが資化可能な「多糖体」及び「オリゴ糖」も含む意味である。オリゴ糖は、糖残基2〜10程度から構成される糖質を云う。なお、当該多糖体やオリゴ糖に、糖質以外の物質(例えば、タンパクペプチドアミノ酸、脂質、核酸等)が結合していてもよく、このような多糖体やオリゴ糖は、例えば、ペプチドグリカン糖タンパク質糖脂質等であってもよい。

0021

また、食物繊維を豊富に含む食材(例えば、野菜類、キノコ類、果実類等)又は、それら加工品を食し、一部消化したものには、セロビオースが含まれる。このため、前記「2’−フコシルラクトース」に加えて、さらに前記「セロビオース」を資化できる本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、食物繊維を豊富に含む食材(例えば、野菜類、キノコ類、果実類等)又は、それら加工品を使用するような食事をすることで、腸内において増殖が容易であるので、さらにユニークなビフィドバクテリウム・ブレーベと云える。

0022

ビフィドバクテリウム属細菌は、様々な生理機能報告されており、その機能は腸内での増殖や産生する物質(例えば、酢酸等)によるものであると報告されている。
従って、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベも、安全性が高く、かつ幅広い年齢層において、一般的に云われているビフィドバクテリウム属細菌による効能を期待することができる。このため、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、幅広い組成物(飲食品用、機能性食品用、医薬品用飼料用等)に用いることが可能である。
また、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、プロバイオティクス効果を期待することができるので、健康増進、食生活改善、腸内環境改善、腸内感染予防・治療等の目的に使用することも可能である。

0023

本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、例えば、[1]ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITEBP−02871(受託番号:NITE BP−02871)等が挙げられる。これら群から1種又は2種以上を選択することができる。
なお、以降、前記ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP−02871(受託番号:NITE BP−02871)を、「ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP−02871株」ともいう。
本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP−02871株は、2’−フコシルラクトース及びセロビオースに高い資化能を有する細菌であるので、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベのなかで、特に好ましい。本菌株は、2’−フコシルラクトース及びセロビオースの資化能が、後述の<糖源の資化性の判定方法>において、それぞれOD0.3以上であり優れている。

0024

前記ビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871は、配列番号1を有する細菌である。当該菌株は、新規なビフィドバクテリウム・ブレーベであり、Bifidobacterium breve(受託番号:NITE BP-02871)として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD)に国際寄託されている。

0025

本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871株は、以下の菌学的性質及び特性から新規菌株として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD)(住所:〒292−0818 日本国千葉県木更津市かずさ足2−5−8)に、2019年1月30日に、Bifidobacterium breve(受託番号:NITE BP-02871)株として国際寄託した。この菌株は、上記保存機関より一般に入手可能である。

0026

本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871株と実質的に同質の菌株とは、例えば、同属の細菌であって、16SrRNA遺伝子の塩基配列が、これら各細菌の16SrRNA遺伝子の塩基配列と好ましくは99.9%以上、より好ましくは100%の相同性を有し、且つ、好ましくはこれら各細菌と同一の菌学的性質を有する。

0027

本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、本技術の目的を達成できる特性(例えば、2’−フコシルラクトース及びセロビオースの資化能を持つ菌)を有する限り、上記ビフィドバクテリウム属細菌の変異株であってもよい。また、当該変異株は、上記ビフィドバクテリウム属細菌と同一の菌学的性質を有し、かつ、上記ビフィドバクテリウム属細菌と同等以上の2’−フコシルラクトース及びセロビオースの資化能を有する細菌が好ましい。ある変異株が上記ビフィドバクテリウム属細菌と「同等以上の2’−フコシルラクトース及び/又はセロビオースの資化能」を有するか否かは、例えば、後述する試験例の方法により確認することができる。
このような変異株は、上記ビフィドバクテリウム属細菌に非人為的に変異が導入されることで構築されてもよい。また、UV等の変異原を用いた処理により上記細菌に変異を導入して構築してもよく、種々の遺伝子操作法により上記株に変異を導入して構築してもよい。

0028

なお、上記例示した菌株名で特定される菌株には、当該菌株名で所定の機関に寄託や登録がなされている株そのもの(以下、説明の便宜上、「寄託菌株」ともいう)に限られず、それと実質的に同等な株(「派生株」または「誘導株」ともいう)も包含される。すなわち、例えば、上記[1]本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871には、NITE BP−02871株の受託番号で上記寄託機関に寄託されている株そのものに限られず、それと実質的に同等な株も包含される。
菌株について、「上記寄託菌株と実質的に同等の株」とは、上記寄託菌株と同一の種に属し、本件寄託菌株と同等以上の本技術の特性である2’−フコシルラクトース及び/又はセロビオースの資化能(好適にはこれら両方の資化能)等が得られる株を意味する。上記寄託菌株と実質的に同等の株は、例えば、当該寄託菌株を親株とする派生株であってよい。派生株としては、寄託菌株から育種された株や寄託菌株から自然に生じた株が挙げられる。

0029

実質的に同一の菌株、派生株は下記のような株が挙げられる。
(1)RAPD法(Randomly Amplified Polymorphic DNA)、PFGE法(Pulsed−field gel electrophoresis)により同一の菌株と判定される菌株(Probiotics in food/Health and nutritional properties and guidelines for evaluation 85 Page43に記載)
(2)当該寄託菌株由来の遺伝子のみ保有し、外来由来の遺伝子を持たず、DNAの同一性が95%以上(好適には98%以上)である菌株
(3)当該菌株から育種された株(遺伝子工学的改変突然変異自然突然変異を含む)、同一の形質を有する株

0030

<糖源の資化性の判定方法>
糖源を含むMRS(de Man-Rogosa-Sharpe)液体培地1mLに、菌株3v/v%ずつ接種し、嫌気条件下で37℃にて培養する。培養48時間後に濁度(OD600)を測定し、菌株を接種しなかった培地を同様に培養したコントロールの濁度を差し引いた値を以下の基準に照らし、資化性の有無及び資化能の程度を判定する。コントロールとの差でOD 600が、0.3以上を「良好な資化性あり」、0.4以上を「より良好な資化性あり」、0.5以上を「よりさらに良好な資化性あり」、0.6以上を「非常に良好な資化性あり」とする。

0031

本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、例えば、同菌株を培養することにより増殖させることができる。
培養する方法は、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベが増殖できる限り特に限定されず、ビフィドバクテリウム属細菌の培養に通常用いられる方法を必要により適宜修正して用いることができる。例えば、培養温度は30〜50℃でよく、35〜45℃であることが好ましい。また培養は嫌気条件下で行うことが好ましく、例えば、炭酸ガス等の嫌気ガス通気しながら培養することができる。また、液体静置培養等の微好気条件下で培養してもよい。

0032

本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを増殖させるために培養する培地としては、特に限定されず、ビフィドバクテリウム属細菌の培養に通常用いられる培地を必要により適宜修正して用いることができる。すなわち、炭素源としては、後述する成分(a)及び(b)以外で、例えば、ガラクトースグルコースフルクトースマンノース、セロビオース、マルトースラクトーススクローストレハロースデンプン加水分解物廃糖蜜等の糖類を資化性に応じて使用できる。窒素源としては、例えば、アンモニア硫酸アンモニウム塩化アンモニウム硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩類や硝酸塩類を使用できる。また、無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム塩化カリウム硫酸カリウム硫酸マグネシウム塩化カルシウム硝酸カルシウム塩化マンガン硫酸第一鉄等を用いることができる。また、ペプトン大豆粉脱脂大豆粕肉エキス酵母エキス等の有機成分を用いてもよい。また、調製済みの培地としては、例えばMRS培地を好適に用いることができる。

0033

本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベの好ましい資化成分として、以下の成分(a)及び/又は成分(b)が挙げられ、これら成分(a)及び成分(b)のいずれかを少なくとも含有することが好ましい。
本技術に用いる「成分(a)2’−フコシルラクトース」は、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベの増殖促進作用を有する。さらに、当該「成分(a)」と、後述する「成分(b)」とを組み合わせることで、より安定的に本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベの増殖促進作用を発揮させることができる。これにより、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベが幅広い年齢層の腸内でも増殖し易くなる。さらに、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベの増殖促進作用の点から、ラクト−N−テトラオース(LNT)も資化成分とすることが好ましい。

0034

本技術の資化成分として使用する「成分(a)2’−フコシルラクトース」は、ヒトミルクオリゴ糖(HMO)の代表的な成分として知られている。このため、市販品の2’−フコシルラクトース(Fucα(1−2)Galβ(1−4)Glc)を使用してもよいし、乳から調製してもよいし、公知の有機合成酵素処理等にて得ても良い。また、2’−フコシルラクトースを含む乳(例えば、母乳、粉ミルク、牛乳乳製品)を使用してもよい。また、2’−フコシルラクトースを少なくとも含むヒトミルクオリゴ糖を使用してもよく、当該ヒトミルクオリゴ糖を乳(牛乳や粉ミルク、育乳用ミルク等)に配合した組成物(すなわち、ヒトミルクオリゴ糖を含む乳)を使用してもよい。

0035

本技術の資化成分として使用できる「ヒトミルクオリゴ糖(以下、「HMO」ともいう)」には、少なくとも2’−フコシルラクトース及び/又はラクト−N−テトラオース(LNT)が含まれることが好適である。一般的にHMOとして、例えば、2’−フコシルラクトース、3−フコシルラクトース、2’,3−ジフコシルラクトース、3’−シアリルラクトース、6’−シアリルラクトース、3−フコシル−3’−シアリルラクトース、ラクト−N−テトラオース、ラクト−N−ネオテトラオース、ラクト−N−フコペンタオースI、ラクト−N−フコペンタオースII、ラクト−N−フコペンタオースIII、ラクト−N−フコペンタオースV、ラクト−N−ジフコシルヘキサオースI、ラクト−N−ジフコシルヘキサオースII、並びに、ラクト−N−シアリルペンタオース、LSTa、LSTb及びLSTc等が挙げられる。当該HMOの各オリゴ糖は公知の製造方法で得ることができる。本技術では、これらからなる群から選択される1種又は2種以上のヒトミルクオリゴ糖を使用することができる。

0036

本技術の資化成分として、「成分(b)セロビオース、セロビオースを構成糖とする多糖体、及びセロビオースを構成糖とするオリゴ糖の少なくともいずれか」を増殖促進のために使用することが、これを資化可能なビフィドバクテリウム・ブレーベが増殖促進できるため、好ましい。これら成分(b)からなる群より選択される1種又は2種以上の成分を使用してもよい。

0037

前記「成分(b)」の「セロビオース」は、植物細胞の細胞壁成分であるセルロースの構成糖としてよく知られている。
前記「成分(b)」の「セロビオース」、「セロビオースを構成糖とする多糖体」や「セロビオースを構成糖とするオリゴ糖」は、植物由来食品(例:野菜キノコ果実等)を加工処理した市販品を使用することができ、また、当該食品から抽出加工することで得ることができる。
セロビオースは、上記「植物細胞の細胞壁成分であるセルロースの構成糖」として知られるため、食物繊維の多い食品を摂取することで、ビフィドバクテリウム・ブレーベの増殖促進が期待される。食物繊維の多い食品として、例えば、日本食品標準成分表2015(文部科学省科学技術・学術政策局政策課資源室)には、各食品における食物繊維含量が報告されており、野菜類(ごぼうグリーンピース等)、果実類(アボガドりんご等)、キノコ類(干シイタケキクラゲ等)、豆類(きなこ等)、海藻類ひじき、わかめ等)等に多く含まれることが公開されている。
本技術では、個々の通常の食生活に対応して、これらから適宜選択することが可能である。

0038

<本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベの増殖促進用のプレバイオティクス>
本技術の前記「成分(a)2’−フコシルラクトース」及び/又は「成分(b)セロビオース、セロビオースを構成糖とする多糖体、及びセロビオースを構成糖とするオリゴ糖の少なくともいずれか」は、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベに対して増殖促進作用を有し、プレバイオティクスとして使用できる。前記「成分(a)」及び前記「成分(b)」は、組み合わせることで、より好適に本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベに対して増殖促進作用を有する。
なお、さらに、成分(c)として、適宜、前記ヒトミルクオリゴ糖からなる群より選択される1種又は2種以上の糖質を単独で又は組み合わせて使用してもよいし、成分(b)を含むヒトミルクオリゴ糖を使用してもよい。

0039

前記「成分(a)」及び/又は前記「成分(b)」は、有効成分として、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベの増殖を促進するのに使用するためのプレバイオティクスとして使用することが出来る。これらの製品は各種用途に適合した任意成分を適宜用い、各用途に適合した公知の製造方法によって、製造することができる。

0040

また、本技術の増殖促進用組成物における、前記「成分(a)2’−フコシルラクトース」の使用量又は含有量は、細菌100質量部に対して、1〜1,000,000質量部が好ましく、10〜10,000質量部がより好ましい。
また、本技術の増殖促進用組成物における、前記「成分(b)セロビオース、セロビオースを構成糖とする多糖体、及びセロビオースを構成糖とするオリゴ糖の少なくともいずれか又はこれら」の使用量又は含有量は、細菌100質量部に対して、1〜1,000,000質量部が好ましく、10〜10,000質量部がより好ましい。

0041

当該プレバイオティクスの使用により、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベによる、整腸作用、ミネラル吸収促進作用、炎症性腸疾患への予防・改善作用等といったヒトの健康に有益なプロバイオティクス効果も期待できる。

0042

<本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを含む組成物>
本技術はまた、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを含む組成物を提供することができる。本技術の組成物は、プロバイオティクス組成物、飲食品組成物、医薬組成物等を含む意味である。また、本技術の組成物は、プロバイオティクス組成物が好適である。

0043

本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、適用対象であるヒト又は非ヒト動物(好適には哺乳類)に使用してもよく、ヒト及びペットが好ましく、より好ましくはヒトである。
さらに、本技術の適用対象者は、プロバイオティクス効果を望む者であれば特に限定されず、例えば、乳幼児、小児、大人、健常者中高年、高齢者、及び腸内環境の優れない者等が挙げられる。このうち、本技術は、乳幼児用、大人用、高齢者用に使用することが好ましい。
また、本技術に用いられるビフィドバクテリウム・ブレーベは、ヒト由来であるため副作用が少なく安全性が高いので、継続して長期間摂取することも可能である。
そして、本技術は、プロバイオティクスによって予防、改善又は治療可能な症状又は疾患に有効に使用することもできる。

0044

本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、そのまま用いることが可能であり、又は生理的、医薬品的若しくは飲食品的に許容される通常の担体若しくは希釈剤等と共に混合して用いることもできる。
従って、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、有効成分としてプロバイオティクス組成物に含有させることもでき、また、安全性が高いので、医薬品、飲食品等の幅広い用途の製品に使用できる。これらの製品は、各用途に適合した任意成分を適宜用い、各用途に適合した公知の製造方法によって、製造することができる。
また、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベは、これら各種製剤又は各種組成物等の製造のために使用することができる。また、本技術は、プロバイオティクス用のビフィドバクテリウム・ブレーベとして使用することも可能である。

0045

本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベの投与又は摂取は、少なくとも1週間摂取することが好ましく、少なくとも4週間継続して摂取ことがより好ましく、毎日摂取することが望ましい。
本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベの使用量は、安全性が高いので特に制限されないが、例えば、1×106〜1×1012CFU/kg体重/日が好ましく、1×107〜1×1011CFU/kg体重/日がより好ましく、1×108〜1×1010CFU/kg体重/日がさらに好ましい。又は、1個体(Body weight)あたりの使用量(投与量)としては、107〜1014CFU/日が好ましく、108〜1013CFU/日がより好ましく、109〜1012CFU/日がさらに好ましい。
また、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベの使用量は、0.01〜100mL/体重kg/日であることが好ましく、0.1〜10mL/体重kg/日であることがより好ましい。
なお、本技術において、CFUとは、Colony forming unitの意味であり、コロニー形成単位を表す。前記細菌が死菌の場合、CFUは、個細胞(cells)と置き換えることができる。

0046

<医薬組成物>
さらに、本技術の組成物は、医薬組成物として用いることができる。これにより、プロバイオティクス効果を期待できる。
本技術の医薬組成物は、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを含有する限り特に制限されない。当該医薬組成物は、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを含有する、整腸用組成物等としても使用できる。
本技術の医薬組成物としては、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベをそのまま使用してもよく、生理的に許容される液体又は固体製剤担体を配合し製剤化して使用してもよい。

0047

また、本技術の医薬組成物は、経口組成物成分としてヒト腸内より得ることができる本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを有効成分とするため、種々の疾患を罹患した患者に対しても安心して投与できる。また、ビフィドバクテリウム属細菌は、動物の腸内にも存在するため、本技術は、長期間、連続的に投与しても副作用が生じにくいことが期待される。また、ビフィドバクテリウム属細菌は、乳幼児や小児にも安全に投与することができる。したがって、本技術は、乳幼児や小児に対する疾患又はその症状の予防、改善及び/又は治療にも好適である。

0048

本技術は、治療目的使用であっても、非治療目的使用であってもよい。
「非治療目的」とは、医療行為、すなわち、治療による人体への処置行為を含まない概念である。例えば、健康増進、美容行為等が挙げられる。
「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転;疾患、症状又は状態の悪化防止遅延;疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいう。
「予防」とは、適用対象における疾患若しくは症状の発症の防止や遅延、又は適用対象の疾患若しくは症状の危険性の低下をいう。

0049

本技術の医薬組成物の剤形は特に制限されず、具体的には、錠剤丸剤散剤液剤懸濁剤乳剤顆粒剤カプセル剤シロップ剤坐剤注射剤軟膏剤貼付剤点眼剤、及び点鼻剤等を例示できる。また、製剤化にあたっては、製剤担体として通常使用される賦形剤結合剤崩壊剤滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、又は注射剤用溶剤等の添加剤を使用することができる。

0050

また、製剤化に際しては、本技術に係る医薬組成物には、通常製剤化に用いられている賦形剤、pH調整剤着色剤矯味剤等の成分を用いることができる。また、本発明の効果を損なわない限り、本技術に係る医薬組成物には、公知の又は将来的に見出される本技術に関連する疾患又は症状に対する予防、改善及び/又は治療の効果を有する成分を使用することもできる。
加えて、製剤化は剤形に応じて適宜公知の方法により実施できる。製剤化に際しては、適宜、製剤担体を配合して製剤化してもよい。

0051

本技術の医薬組成物における本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベの含有量は、剤形、用法、患者の年齢性別、疾患の種類、疾患の程度、及びその他の条件等により適宜設定されるが、通常、1×106〜1×1012cfu/g又は1×106〜1×1012cfu/mLの範囲内であることが好ましく、1×107〜1×1011cfu/g又は1×107〜1×1011cfu/mLの範囲内であることがより好ましい。本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベが死菌の場合、cfu/g又はcfu/mLは、個細胞/g又は個細胞/mLと置き換えることができる。

0052

本技術の医薬組成物の投与時期は特に限定されず、対象となる症状又は疾患の治療方法に従って、適宜投与時期を選択することが可能である。また、予防的に投与してもよく、維持療法に用いてもよい。また、投与形態製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて決定されることが好ましい。なお、本技術の医薬組成物は、いずれの場合も1日1回又は複数回に分けて投与することができ、また、数日又は数週間に1回の投与としてもよい。

0053

<飲食品組成物>
さらに、本技術の組成物は、飲食品組成物として用いることができる。これにより、プロバイオティクス効果を期待できる。
本技術の飲食品組成物は、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを公知の飲食品に添加することによって製造してもよいし、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを飲食品の原料中に混合して新たな飲食品組成物として製造することもできる。

0054

本技術の飲食品組成物は、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを含有する限り特に制限されず、飲食品組成物としては、清涼飲料炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、及び乳酸菌飲料等の飲料(これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む);アイスクリームシャーベット、かき等の氷菓;飴、チューインガムキャンディーガムチョコレート錠菓スナック菓子ビスケットゼリージャムクリーム、及び焼き菓子等の菓子類加工乳乳飲料発酵乳ドリンクヨーグルト、及びバター等の乳製品;パン経腸栄養食、おかゆ等の流動食離乳食育児用ミルクスポーツ飲料;その他機能性食品等が例示される。また、飲食品は、サプリメントであってもよく、例えばタブレット状のサプリメントであってもよい。サプリメントである場合には、一日当り食事量及び摂取カロリーについて他の食品に影響されることなく、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを摂取できる。

0055

また、本技術における飲食品組成物には、本発明の効果を損なわない限り、前述のプロバイオティクス効果を有する成分又はプロバイオティクス効果を補助する成分を使用することができる。例えば、本技術における飲食品組成物は、ホエイタンパク質、カゼインタンパク質大豆タンパク質、若しくはエンドウ豆タンパク質(ピープロテイン)等の各種タンパク質若しくはその混合物分解物ロイシンバリンイソロイシン若しくはグルタミン等のアミノ酸;ビタミンB6若しくはビタミンC等のビタミン類クレアチンクエン酸;又はフィッシュオイル等の成分と、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベとを組合せて調製することができる。

0056

また、本技術で定義される飲食品組成物は、プロバイオティクス等の用途(保健用途を含む)が表示された飲食品として提供・販売されることが可能である。また、飲食品の摂取対象として、「ビフィドバクテリウム属細菌と暮らす生活を望む方」、「腸内環境を改善したい方」、「お腹の調子を整えたい方」、「良好な腸内環境を形成したい方」等と表示して提供・販売されることが可能である。
「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物媒体等の如何に拘わらず、全て本発明の「表示」行為に該当する。

0057

また、「表示」は、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的(インターネット等)方法により提供する行為等が挙げられる。

0058

一方、表示内容としては、行政等によって認可された表示(例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示等)であることが好ましい。また、そのような表示内容を、包装、容器カタログパンフレットPOP等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。

0059

また、「表示」には、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品特定保健用食品栄養機能食品、機能性表示食品、医薬用部外品等としての表示も挙げられる。この中でも特に、消費者によって認可される表示、例えば、特定保健用食品、栄養機能食品、若しくは機能性表示食品に係る制度、又はこれらに類似する制度にて認可される表示等が挙げられる。具体的には、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク減少表示、科学的根拠に基づいた機能性の表示等を挙げることができ、より具体的には、健康増進法に規定する特別用途表示の許可等に関する内府令(平成二十一年八月三十一日内閣府令第五十七号)に定められた特定保健用食品としての表示(特に保健の用途の表示)及びこれに類する表示が典型的な例である。

0060

本技術の飲食品組成物における本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベの含有量は、飲食品組成物の態様によって適宜設定されるが、通常、飲食品中に、1×106〜1×1012cfu/g又は1×106〜1×1012cfu/mLの範囲内であることが好ましく、1×107〜1×1011cfu/g又は1×107〜1×1011cfu/mLの範囲内であることがより好ましい。

0061

本技術に係る飲食品として、乳幼児用調製粉乳(育児用調製粉乳ともいう)を挙げることができる。育児用調製粉乳とは、0〜12か月の乳児を対象とする乳幼児用調製粉乳、6〜9か月以降の乳児および年少幼児(3まで)を対象とするフォローアップミルク、出生時の体重が2500g未満の新生児低出生体重児)を対象とする低出生体重児用調製粉乳、牛乳アレルギー乳糖不耐症等の病的状態を有する乳幼児の治療に用いられる各種治療用ミルクなどを指す。さらに、該組成物を保健機能食品や病者用食品に適用することができる。保健機能食品制度は、内外動向、従来からの特定保健用食品制度との整合性踏まえて、通常の食品のみならず錠剤、カプセル等の形状をした食品を対象として設けられたもので、特定保健用食品(個別許可型)と栄養機能食品(規格基準型)の2種類の類型からなる。
なお、本技術において、乳幼児用ミルクの形態として、粉ミルクの他、液体ミルクの形態をとることも可能である。

0062

本技術の飲食品組成物の製造方法について、以下に説明する。本技術の飲食品組成物の製造方法において、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベの添加工程は、飲食品組成物の製造工程におけるいずれの段階で行ってもよい。例えば、一例として、一般的にビフィドバクテリウム属細菌を発酵のために添加する工程において添加してもよい。

0063

本技術の組成物の製造方法について、下記に例示するが、これに限定されるものではない。

0064

製造方法の一例として、下記(a)工程又は下記(b)工程の少なくともいずれかを含む、組成物の製造方法:
(a)本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベ、及びプレバイオティクスを混合する工程;、又は、(b)本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベ、及び乳成分を混合する工程;
が挙げられる。このとき本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベとして、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを含む組成物を使用してもよい。さらに、当該組成物に、これ以外のビフィドバクテリウム属細菌や乳酸菌等のプロバイオティクスをさらに含んでもよい。

0065

当該プレバイオティクス及び/又は乳成分を混合する場合、当該製造工程のいずれの工程であってもよい。例えば、前記乳成分を混合する場合、前記(a)工程と同時期に、又はこの前工程若しくはこの後工程の何れでもよい。
また、乳成分は粉体が好適であり、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベの菌末と混合することがより好適である。

0066

また、本組成物の製造方法として、下記工程(A)及び(B)を含む、組成物の製造方法も例示出来る。
(A)培地で本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを培養し、ビフィドバクテリウム・ブレーベを含む培養物又は生産物を得る工程;
(B)前記培養物又は生産物を乾燥に供し、菌末又は乾燥物を得る工程;
を提供することができる。当該乾燥は、凍結乾燥または噴霧乾燥が好適である。

0067

前記乳成分として、特に限定されないが、例えば、牛乳、水牛乳、乳、山羊乳馬乳脱脂乳脱脂濃縮乳脱脂粉乳濃縮乳全脂粉乳、クリーム、バター、バターミルク練乳及び乳タンパク質等を挙げることができ、これらからなる群から選ばれる1種又は2種以上を使用することができる。また、乳タンパク質として、特に限定されないが、例えば、ホエイカゼイン、及びこれらの加水分解物等が挙げられ、これらからなる群から選ばれる1種又は2種以上を用いることができる。乳成分のうち、牛乳由来の成分が好適である。

0068

前記加水分解物は、前記乳成分(好適には乳タンパク質)を加水分解することで、ホエイ加水分解物カゼイン加水分解物等を製造することができる。当該加水分解として、例えば、酸・アルカリ加水分解、及び酵素加水分解等が挙げられる。このうち、酵素加水分解が好適であり、当該酵素として、タンパク質分解酵素が好適である。前記タンパク質分解酵素として、例えば、プロテアーゼトリペプシンキモトリプシンプラスミン、ペプシン、パパインペプチダーゼ及びアミノペプチダーゼ等が挙げられる。加水分解反応の際のpHは、使用する酵素の至適pHに適宜調整して、例えばpH2〜6等で行うことができる。加水分解反応の際の温度は、特に限定されず、通常30〜60℃の範囲で行うことが好適であり、また、反応時間は、2〜10時間が好ましい。

0069

本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベ又はこれを含む培養物の形態は、特に限定されず、液体又は固体の何れでもよいが、当該形態は、乾燥形態(例えば、菌末状や培養乾燥物等)が、製造時や保管時の取扱が容易な観点から、好適である。また、当該培養物として、上述のように、培養液が分離された菌体自体、菌体を含む培養物、及び、菌体が除去された培養物などが挙げられる。

0071

また、菌体は破砕されていてもよく、当該破砕物は、生菌を破砕した菌体でも死菌を破砕した菌体でもよく、破砕後に加熱や凍結乾燥等を施した菌体でもよい。
このうち、生菌率を高くする観点から、前記培養物を凍結乾燥に供するのが好適であり、また、生産効率を高くする観点から、前記培養物を噴霧乾燥に供するのが好適である。

0072

また、本発明の組成物として、サプリメントやタブレットを製造する場合、ビフィドバクテリウム・ブレーベを含む培養物と賦形剤等を混合して混合物を得る工程、当該所定の形状に成形する工程を含むことができる。成形工程として、例えば、打錠等が挙げられ、打錠の一例としては、例えば、粉末や顆粒の混合物を圧縮成形してタブレットを得ること等が挙げられる。

0073

本技術の製造方法のの一例として、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを含む発酵飲食品(好適には発酵乳)の製造方法が挙げられる。
前述の製造法で得られた前記菌末を、発酵乳原料に添加し、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを用いてこのビフィドバクテリウム属細菌を含む発酵乳を得る工程を行う。又は、前記菌末と、発酵乳とを混合して、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを含む発酵乳を得る工程を行う。当該組成物中の本技術の細菌の菌体量は、所定の菌体量になるように発酵条件や配合量を調整する。これにより、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを含む発酵飲食品(好適には発酵乳又は発酵製品)を提供することができる。

0074

以下に、実施例及び比較例等を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。

0075

<試験例1:ビフィドバクテリウム属細菌株群の取得>
健常な日本人女性より出生した健康な赤ちゃんの口腔液及び糞便から採集したサンプルを滅菌した下記組成の光岡バッファー希釈し、糖源をガラクトオリゴ糖からセロビオース又は2′−フコシルラクトースとした下記組成のTOS糖源改変寒天培地に塗布し、37℃で嫌気培養した。
〔光岡バッファー〕リン酸二水素カリウム45.0g;リン酸水素二ナトリウム60.0g;L−システイン塩酸塩5.0g;ポリソルベート80 5.0g;寒天10.0g;精製水1000mLを121℃で15分滅菌した。
〔TOS糖源改変寒天培地〕トリプチケースペプトン10.0g;酵母エキス1.0g;リン酸二水素カリウム 3.0g;リン酸水素二カリウム4.8g;硫酸アンモニウム3.0g;硫酸マグネシウム七水和物0.2g;L−システイン塩酸塩 0.5g;プロピオン酸ナトリウム15.0g;寒天 15.0g;ガラクトオリゴ糖又はセロビオース、2′−フコシルラクトース 10.0g;精製水 1000mLを121℃で15分滅菌後、50℃に冷却し、ムピロシンリチウム塩50mgを加えシャーレ分注して平板とした。

0076

そして得られたコロニー釣菌し、BL寒天培地(栄研化学社)に画線塗布し、前記と同様の方法で嫌気培養を反復し、純粋単離された菌株を得た。
〔BL寒天培地〕肉エキス3.0g;肝臓エキス5.0g;酵母エキス5.0 g;ペプトン15.0g;ソイペプトン 3.0g;可溶性デンプン0.5g;ブドウ糖10.0g;リン酸二カリウム1.0g;リン酸一カリウム1.0g;硫酸マグネシウム0.2g;塩化ナトリウム0.01g;硫酸マンガン0.00674g;L−システイン塩酸塩0.5g;硫化第一鉄0.01g;ポリソルベート801.0g;寒天15.0g;精製水1000mL;pH 7.2±0.2を、121℃で15分滅菌後、50℃に冷却し、5%(V/V)無菌脱繊血を加え、シャーレに分注して平板とした。

0077

さらに、純粋単離された菌株群から、ゲノムDNAを抽出し、Nextera XT DNA Library Prep Kit(イルミナ社)によりライブラリー調整を実施し、MiSeq v3 Reagent Kit(イルミナ社)とCLC Genomics Workbench (v 8.0) software package (キアゲン社)を用いてドラフトゲノム配列情報を得た。
この塩基配列情報に基づき、NCBI(National Center for Biotechnology Information、国立バイオテクノロジー情報センター)の国際塩基配列データベース(Genbank)上で、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool、http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)による相同性検索を行い、菌種を決定した。

0078

<試験例2:2’−フコシルラクトース及びセロビオースの資化能を有するビフィドバクテリウム・ブレーベの取得>
得られた複数のビフィドバクテリウム属細菌株(以下、候補菌株)について、糖源を表1に記載の糖源のみに変更したMRS(de Man-Rogosa-Sharpe)液体培地1mLに、3v/v%ずつ接種し、嫌気条件下で37℃にて培養した。培養48時間後に濁度(OD600)を測定し、菌株を接種しなかった培地を同様に培養したコントロールの濁度を差し引いた値を以下の基準に照らし、資化性の有無及び資化能の程度を判定した。コントロールとの差でOD 600が、0.3以上を「良好な資化性あり」、0.5以上を「より良好な資化性あり」、0.8以上を「非常に良好な資化性あり」、と判断した。
参考文献(Asakuma et al., J Biol Chem. 286, 40, 34583-34592 (2011))に基づき、2′−フコシルラクトースを資化できる菌株;Bifidobacterium longum spp. infantisATCC15697を、2′−フコシルラクトースを資化できない菌株;Bifidobacterium longum spp. longum ATCC15707を比較対象として用いた。

0079

〔糖源(資化源)〕
(1)2’−FL(2’−フコシルラクトース):Fuc α(1-2)Gal β(1-4) Glc):フナコシ株式会社。
(2)D—(+)—セロビオース:Glc β(1-4) Glc: 富士フイルム和光純薬社。
なお、Fucはフコース(6−デオキシガラクトースとも云う)、Galはガラクトース、Glcはグルコースの略である。

0080

上記資化能の結果、上記2’−フコシルラクトースの資化能を有する菌株を3菌株、上記セロビオースの資化能を有する菌株を3菌株見出した。さらに、2’−フコシルラクトース及びセロビオースの両方の資化能を有する菌株を1菌株見出した。
具体的には、本菌株であるビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871株(受託番号:NITE BP−02871)に、2’−フコシルラクトース及びセロビオースに対して高い資化能を有することが認められた。
本菌株は、上述の方法にてBifidobacterium breveと同定された。前記ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP−02871株(受託番号:NITE BP−02871)について、16SリボソーマルRNA(SrRNA遺伝子配列全長についての相同性検索を実施した結果、最も相同性の高いBifidobacterium breve strain NRBB09と99.9%の相同性であった。
このことから、上記本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベが新規の菌株であることが示唆された。

0081

ビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871株(受託番号:NITE BP-02871)は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD)(住所:〒292−0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2−5−8)に、2019年1月30日に、Bifidobacterium breve(受託番号:NITE BP-02871)株として寄託した。この菌株は、上記保存機関より一般に入手可能である。

0082

本菌株のODは2’—フコシルラクトース及びセロビオースでは共に0.5〜0.8の範囲であったので、より良好な資化能を有していると云える。上述の通り、この結果から、本菌株は、ヒトミルクオリゴ糖でも、食物繊維でも、増殖可能であることが考えられる。そして、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベであれば、乳幼児や高齢者といった幅広い年齢層に対して、有益に利用可能であり、特にプロバイオティクス効果が期待できると考えられる。さらに、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベを利用した組成物及び、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベの増殖促進用組成物も提供できると考えられる。

0083

0084

なお、ビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871株(受託番号:NITE BP-02871)の16SrDNA遺伝子配列は、配列番号1として示す。

0085

[製造例]
下記に本技術の医薬組成物、及び飲食品組成物の製造例を示すが、本技術の組成物は、これに限定されない。

0086

〔製造例1〕
ビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871株を、MRS液体培地3mLに添加し、37℃で16時間嫌気培養後、培養液を濃縮し、凍結乾燥を行い、細菌の凍結乾燥粉末(菌末)を得る。菌末と、ホエイタンパク質濃縮物(Whey protein concentrate;WPC)と、プレバイオティクス(2’−フコシルラクトース、セロビオース)を均一に混合して組成物を得る。当該組成物20gを200gの水に溶かし、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP−02871株を含む組成物を得る。

0087

〔製造例2〕
ビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871株を、MRS液体培地3mLに添加し、37℃で16時間嫌気培養後、培養液を濃縮し、凍結乾燥を行い、細菌の凍結乾燥粉末(菌末)を得る。菌末と、乳タンパク質濃縮物乾燥粉末MPC480、フォンテラ社製、タンパク質含量80質量%、カゼインタンパク質:ホエイタンパク質=約8:2)と、プレバイオティクス(2’−フコシルラクトース、セロビオース)を均一に混合して、組成物を得る。当該組成物20gを200gの水に溶かし、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP−02871株を含む組成物を得る。

0088

〔製造例3〕
ビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871株を、MRS液体培地3mLに添加し、37℃で16時間嫌気培養後、培養液を濃縮し、凍結乾燥を行い、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP−02871株を含む細菌の凍結乾燥粉末(菌末)を得る。次に、プレバイオティクス(2’−フコシルラクトース、セロビオース)、結晶セルロース撹拌造粒機投入し混合する。その後、精製水を加え造粒造粒物を乾燥し、細菌の発酵成分及びプレバイオティクスを含有し、賦形剤を含有してなる造粒物(医薬組成物)を得る。このようにして、本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP−02871株を含む造粒物を得ることができる。

0089

〔製造例4〕
ビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871株を添加した発酵乳の製造法を下記に示す。
まず、乳原料、および必要に応じた水、その他の成分等を混合し、好ましくは均質化処理を行い、加熱殺菌処理する。均質化処理および加熱殺菌処理は常法により行うことができる。加熱殺菌された殺菌調乳液乳酸菌スターターを添加(接種)し、所定の発酵温度に保持して発酵させ、発酵物を得る。発酵によりカードが形成される。
乳酸菌スターターとしては、例えば、ラクトバチルスブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)、ラクトコッカスラクチス(Lactococcus lactis)、ストレプトコッカスサーモフィラス(Streptococcus thermophilus)等のヨーグルト製造に通常用いられている乳酸菌を用いることができる。pHが目標の値に達したら、形成されたカードを撹拌により破砕し、10℃以下に冷却して発酵物を得る。10℃以下に冷却することにより、乳酸菌の活性を低下させて酸の生成を抑制することができる。

0090

次いで、発酵工程で得られた発酵物を加熱処理して加熱後発酵物(加熱処理後の発酵物)を得る。発酵物を適度に加熱することにより、加熱後発酵物中の乳酸菌による酸の生成を抑えることができる。これによって、その後の製造工程中および/またはビフィズス菌入り濃縮発酵乳の保存中のpHの低下を抑えることができ、その結果、ビフィズス菌の生残性を向上させることができる。
次いで、加熱処理工程で得られた加熱後発酵物に、ビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871株及びプレバイオティクス(2’−フコシルラクトース、セロビオース)を添加する。ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP−02871株の添加量は、加熱後発酵物に対して1×107〜1×1011CFU/mLが好ましく、1×108〜1×1010CFU/mLがより好ましい。ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP−02871株が死菌の場合、CFU/mLは、個細胞/mLと置き換えることができる。

0091

加熱後発酵物に、ビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871株、プレバイオティクスを添加した後、濃縮を行う。濃縮工程は公知の濃縮方法を適宜用いて行うことができる。例えば遠心分離法または膜分離法を用いることができる。
遠心分離法では、被濃縮物(ビフィズス菌及びプレバイオティクスが添加された加熱後発酵物)中のホエイが除去されて、固形分濃度が高められたビフィズス菌及びプレバイオティクス入り濃縮発酵乳が得られる。
上述のようにして得られた本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP−02871株及びを含む発酵乳を製造することができる。

0092

〔製造例5〕
ビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871株を添加した調製粉乳の製造法を下記に示す。
脱塩牛乳乳清蛋白質粉末(ミライ社製)10kg、牛乳カゼイン粉末(フォンテラ社製)6kg、乳糖(ミライ社製)48kg、ミネラル混合物(富田製薬社製)920g、及びビタミン混合物(田辺製薬社製)32g、ラクチュロース森永乳業社製)500g、ラフィノース(日本甜菜製糖社製)500g、ガラクトオリゴ糖液糖ヤクルト薬品工業社製)900gを温水300kgに溶解し、さらに90℃で10分間加熱溶解し、調製脂肪(太陽油脂社製)28kgを添加して均質化した。その後、殺菌、濃縮の工程を行って噴霧乾燥し、調製粉乳約95kgを調製した。これに、澱粉倍散したビフィドバクテリウム・ブレーベNITE BP−02871株の菌体粉末(1.8×1011cfu/g、森永乳業社製)100gを加えてビフィズス菌・オリゴ糖配合調製粉乳約95kgを調製する。得られた調製粉乳を水に溶解して、標準調乳濃度である総固形分濃度14%(w/V)の調乳液としたとき、調乳液中のビフィズス菌数は2.7×109cfu/100mLを得ることができる。

0093

上述のようにして得られた本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871株を含む調製粉乳を摂取又は投与することにより、ヒトの腸内環境を改善することができる。
本技術のビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP−02871株は、2’−フコシルラクトースの資化能を有するため、乳幼児の場合でも良好に腸内での増殖が可能であり、乳幼児の腸内環境を改善することができる。
また、前記ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP−02871株は、2’−フコシルラクトースの資化能及び食物繊維の一種であるセルロースの主要構成糖であるセロビオースの資化能を有するため、大人又は高齢者の場合でも良好に腸内での増殖が可能であり、大人又は高齢者の腸内環境を改善することができる。

0094

〔製造例6〕
ビフィドバクテリウム・ブレーベNITEBP−02871株を添加した腸内環境改善食の製造法を下記に示す。
ビフィドバクテリウム・ブレーベ NITE BP−02871株を、MRS液体培地3mLに添加し、37℃で16時間嫌気培養後、培養液を濃縮し、凍結乾燥を行い、細菌の凍結乾燥粉末(菌末)を得、本技術の組成物を得る。セルロースが多く含有する食品(野菜、サラダ等)に本技術の菌末を加えて調理することもでき、これにより本技術の組成物を得ることもできる。
もしくは、菌末を、食事をする際に、食前食中又は食後に摂取する。規則正しい食事(主食、副菜、主菜のある食事)を行えば必然的に食物繊維を摂取するため、本技術の乾燥菌末製品を、食事の際に一緒に摂取することで、大人の腸内環境の改善効果が期待できる。
本技術の腸内環境改善食を、便秘下痢等の腸に問題を感じる方が継続摂取することで、より腸内環境の改善効果が期待できる。

実施例

0095

以上のことから、2’−フコシルラクトース及びセロビオースの資化能を有するビフィドバクテリウム・ブレーベ、及び当該ビフィドバクテリウム・ブレーベを含む組成物、当該ビフィドバクテリウム・ブレーベ増殖促進用組成物は、腸内でのビフィドバクテリウム属細菌の増殖を手助けすることができ、また、良好な腸内フローラ形成、腸内環境の改善等に有効に使用することができる。

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