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技術 終末糖化産物(AGE)に対する抗体を使用して、がんを治療、転移性がん細胞を殺傷、及びがん転移を予防するための方法及び組成物

出願人 シワコーポレーション
発明者 グルバールイスエス.
出願日 2020年6月19日 (8ヶ月経過) 出願番号 2020-106264
公開日 2020年10月1日 (4ヶ月経過) 公開番号 2020-158531
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 化合物または医薬の治療活性 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 初期要素 デジタルカード 治療構成要素 界面位置 応答対 診断材料 ユーザ文書 pH緩衝液
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重要な関連分野

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図面 (5)

課題

がん治療する、転移性がん細胞を殺傷する、潜在的悪性新生物細胞を殺傷する、及び/またはがん転移を予防する方法の提供。

解決手段

対象における乳癌の治療及び/又は乳癌の予防において使用するための、抗AGE抗体を含む組成物であって、抗AGE抗体が、カルボキシメチルリジン修飾タンパク質に結合する組成物。

概要

背景

老化細胞は、部分的に機能性または非機能性であり、増殖停止の状態にある細胞である。老化は、細胞の特徴的な状態であり、バイオマーカーp16Ink4a(「p16」)の活性化及びβ−ガラクトシダーゼ発現などのバイオマーカーに関連付けられる。老化は、細胞の損傷またはストレス成長因子による過剰刺激など)とともに開始する。損傷またはストレスは、細胞内のミトコンドリアDNAに負の影響を与えて、それらに、細胞内の糖と反応してメチルグリオキサール(MG)を形成するフリーラジカルを産生させる。転じて、MGは、タンパク質または脂質と反応して、終末糖化産物(AGE)を生成する。タンパク質構成要素のリジンの場合、MGは反応して、AGEであるカルボキシメチルリジンを形成する。AGEはまた、血液内の糖と外部細胞タンパク質との非酵素反応からも形成される。

ミトコンドリアDNAに対する損傷またはストレスはまた、細胞に、細胞周期遮断タンパク質を産生するように誘発するDNA損傷応答も引き起こす。これらの遮断タンパク質は、細胞分裂を予防する。損傷またはストレスの継続は、mTOR産生を引き起こし、これが転じて、タンパク質合成を活性化し、タンパク質分解不活性化する。細胞の更なる刺激は、プログラム細胞死アポトーシス)をもたらす。

p16は、S相阻害することによって細胞周期の制御に関与するタンパク質である。それは、老化中または様々なストレス(DNA損傷、酸化ストレス、もしくは薬物に対する曝露など)に応答して活性化され得る。p16は典型的には、DNA損傷に応答して細胞を老化させ、細胞が過剰増殖状態に入るのを不可逆的に予防する腫瘍抑制タンパク質とみなされる。しかしながら、いくつかの腫瘍はp16の過剰発現を示す一方で、他の腫瘍は下方制御された発現を示すため、この点についてはいくらかの曖昧さが存在している。証拠は、いくつかの腫瘍におけるp16の過剰発現が、欠陥網膜芽細胞腫タンパク質(「Rb」)から生じることを示唆している。p16は、Rbに対して作用してS相を阻害させ、Rbは、p16を下方制御し、負のフィードバックを作り出す。欠損Rbは、S相の阻害及びp16の下方制御のいずれもすることができず、故に過剰増殖細胞内でのp16の過剰発現をもたらす。Romagosa,C.et al.,p16Ink4a overexpression in cancer:a tumor suppressor gene associated with senescence and high−grade tumors,Oncogene,Vol.30,2087−2097(2011)。

老化細胞は、がん細胞の成長を煽ることが知られている。老化細胞は、炎症促進性因子を含む細胞内シグナリングに関与する多くの因子の分泌に関連付けられ、これらの因子の分泌は、老化関連分泌表現型またはSASPと称されている。1つの研究は、老化間葉系幹細胞が、IL−6の分泌によって乳癌細胞の増殖及び遊走を促進することを示した(Di,G−h.et al.IL−6Secreted from Senescent Mesenchymal Stem Cells Promotes Proliferation and migration of Breast Cancer Cells,PLOS One,Vol.9,11,e113572(2014))。別の研究は、老化ヒト線維芽細胞が、マトリックスメタロプロテイナーゼの分泌によって腫瘍の成長を増加させることを示した(Liu,D.et al.Senescent Human Fibroblasts Increase the Early Growth of Xenograft Tumors via Matrix Metallopr
oteinase Secretion,Cancer Res,Vol.67,3117−3126(2007))。

老化細胞は、SASPの一部として活性酸素種(「ROS」)を分泌する。ROSは、細胞の老化を維持する上で重要な役割を果たすと考えられている。ROSの分泌は、老化細胞が隣接細胞の老化を誘発する傍観者効果を作り出し、つまりROSは、p16発現を活性化することが知られる正にその細胞損傷を作り出し、老化をもたらす(Nelson,G.,A senescent cell bystander effect:senescence−induced senescence,Aging Cell,Vo.11,345−349(2012))。p16/Rbパスウェイは、ROSの誘発をもたらし、これが転じて、ROSを更に増強する正のフィードバックループを作り出すタンパク質キナーゼデルタを活性化し、不可逆的な細胞周期停止の維持を助ける。がん細胞をROSに曝露することが、過剰増殖細胞内での細胞相停止を誘発することによって、がんを治療するのに有効であり得ることさえ示唆されている(Rayess,H.et al.,Cellular senescence and tumor suppressor gene p16,Int J Cancer,Vol.130,1715−1725(2012))。

終末糖化産物(AGE、AGE修飾タンパク質または最終糖化産物とも称される)は、糖とタンパク質側鎖との非酵素反応から生じる(Ando,K.et al.,Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in theCirculation,Biochem Biophys Res Commun.,Vol.258,123,125(1999))。このプロセスは、シッフ塩基を形成するための還元糖アミノ基との可逆的な反応とともに開始し、これが進行して、共有結合したアマドリ転位産物を形成する。一旦形成されると、アマドリ産物は更なる転位を受けて、AGEを産生する。真性糖尿病DM)によって引き起こされる高血糖、及び酸化ストレスは、膜タンパク質のこの翻訳後修飾を促進する(LindseyJB,et al.,“Receptor For
Glycation End−Products(RAGE)and soluble
RAGE(sRAGE):Cardiovascular Implications,”Diabetes Vascular Disease Research,Vol.6(1),7−14,(2009))。AGEは、糖尿病合併症、炎症、網膜症腎症アテローム性動脈硬化症、卒中、内皮細胞機能障害、及び神経変性障害を含むいくつかの病態に関連付けられている(Bierhaus A,“AGEs and their
interaction with AGE−receptors in vascular disease and diabetes mellitus.I.The AGE concept,”Cardiovasc Res,Vol.37(3),586−600(1998))。

AGE修飾タンパク質はまた、老化細胞のマーカーでもある。最終糖化産物と老化とのこの関連は、当該技術分野において周知である。例えば、Gruber,L.(WO2009/143411、2009年11月26日)、Ando,K.ら(Membrane
Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in theCirculation,Biochem Biophys Res Commun.,Vol.258,123,125(1999))、Ahmed,E.K.ら(“Protein Modification and
Replicative Senescence of WI−38Human Embryonic Fibroblasts”Aging Cells,vol.9,25
2,260(2010))、Vlassara,H.ら(Advanced Glycosylation Endproducts on Erythrocyte Cell
Surface Induce Receptor−Mediated Phagocytosis by Macrophages,J.Exp.Med.,Vol.166,539,545(1987))、及びVlassaraら(“High−affinity−receptor−mediated Uptake and Degradation of Glucose−modified Proteins:A Potential Mechanism for the Removal of Senescent Macromolecules”Proc.Natl.Acad.Sci.USAI,Vol.82,5588,5591(1985))を参照されたい。更に、Ahmed,E.K.らは、最終糖化産物が「細胞タンパク質及び細胞外タンパク質に対する自然損傷の主要な原因のうちの1つ」であることを示している(Ahmed,E.K.ら、上記参照、353頁)。したがって、最終糖化産物の蓄積は、老化に関連付けられる。最終糖化産物の形成は、酸化に関連付けられるため、最終糖化産物の蓄積は、老化細胞内でのROSの形成の結果であり得る(Fu,M.−X.,et al.,The Advanced Glycation End Product,NΕ−(Carboxymehtyl)lysine,Is a Product of both Lipid Peroxidation and Glycoxidation Reactions,J.Biol.Chem.,Vol.271,9982−9986(1996))。

概要

がんを治療する、転移性がん細胞を殺傷する、潜在的悪性新生物細胞を殺傷する、及び/またはがん転移を予防する方法の提供。対象における乳癌の治療及び/又は乳癌の予防において使用するための、抗AGE抗体を含む組成物であって、抗AGE抗体が、カルボキシメチルリジン修飾タンパク質に結合する組成物。

目的

したがって、AGE修飾タンパク質は、転移性がん細胞を探索し、破壊するために、抗体を使用して標的とすることができる抗原を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
0件

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請求項1

対象における乳癌治療及び/又は乳癌の予防において使用するための、抗AGE抗体を含む組成物であって、前記抗AGE抗体が、カルボキシメチルリジン修飾タンパク質に結合する、前記組成物。

請求項2

薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項1に記載の、使用のための組成物。

請求項3

対象が、ヒト、ヤギヒツジウシウマイヌ、及びネコからなる群から選択される、請求項1又は2に記載の、使用のための組成物。

請求項4

対象が、ヒトである、請求項1〜3のいずれかに記載の、使用のための組成物。

請求項5

抗AGE抗体が、ヒト、ネコ、イヌ、ウマ、ラクダアルパカ、ウシ、ヒツジ、及びヤギからなる群から選択される種に対して非免疫原性である、請求項1〜4のいずれかに記載の、使用のための組成物。

請求項6

対象が、乳癌を有する、請求項1〜5のいずれかに記載の、使用のための組成物。

請求項7

対象が、乳癌を有さない、請求項1〜6のいずれかに記載の、使用のための組成物。

請求項8

単位投与量形態である、請求項1〜7のいずれかに記載の、使用のための組成物。

請求項9

複数回投与形態である、請求項1〜8のいずれかに記載の、使用のための組成物。

請求項10

無菌である、請求項1〜9のいずれかに記載の、使用のための組成物。

請求項11

抗AGE抗体が、AGE修飾を発現する乳癌細胞に結合する、請求項1〜10のいずれかに記載の、使用のための組成物。

請求項12

対象が、妊娠している、請求項1〜11のいずれかに記載の、使用のための組成物。

請求項13

対象が、以前に癌性悪液質診断されている、請求項1〜12のいずれかに記載の、使用のための組成物。

請求項14

対象が、免疫不全である、請求項1〜13のいずれかに記載の、使用のための組成物。

請求項15

(a)対象が、ヒトである;(b)抗AGE抗体が、ヒトに非免疫原性である;(c)前記対象が、乳癌を有する;及び(d)組成物が、単位投与量形態である、請求項1〜14のいずれかに記載の、使用のための組成物。

背景技術

0001

老化細胞は、部分的に機能性または非機能性であり、増殖停止の状態にある細胞である。老化は、細胞の特徴的な状態であり、バイオマーカーp16Ink4a(「p16」)の活性化及びβ−ガラクトシダーゼ発現などのバイオマーカーに関連付けられる。老化は、細胞の損傷またはストレス成長因子による過剰刺激など)とともに開始する。損傷またはストレスは、細胞内のミトコンドリアDNAに負の影響を与えて、それらに、細胞内の糖と反応してメチルグリオキサール(MG)を形成するフリーラジカルを産生させる。転じて、MGは、タンパク質または脂質と反応して、終末糖化産物(AGE)を生成する。タンパク質構成要素のリジンの場合、MGは反応して、AGEであるカルボキシメチルリジンを形成する。AGEはまた、血液内の糖と外部細胞タンパク質との非酵素反応からも形成される。

0002

ミトコンドリアDNAに対する損傷またはストレスはまた、細胞に、細胞周期遮断タンパク質を産生するように誘発するDNA損傷応答も引き起こす。これらの遮断タンパク質は、細胞分裂を予防する。損傷またはストレスの継続は、mTOR産生を引き起こし、これが転じて、タンパク質合成を活性化し、タンパク質分解不活性化する。細胞の更なる刺激は、プログラム細胞死アポトーシス)をもたらす。

0003

p16は、S相阻害することによって細胞周期の制御に関与するタンパク質である。それは、老化中または様々なストレス(DNA損傷、酸化ストレス、もしくは薬物に対する曝露など)に応答して活性化され得る。p16は典型的には、DNA損傷に応答して細胞を老化させ、細胞が過剰増殖状態に入るのを不可逆的に予防する腫瘍抑制タンパク質とみなされる。しかしながら、いくつかの腫瘍はp16の過剰発現を示す一方で、他の腫瘍は下方制御された発現を示すため、この点についてはいくらかの曖昧さが存在している。証拠は、いくつかの腫瘍におけるp16の過剰発現が、欠陥網膜芽細胞腫タンパク質(「Rb」)から生じることを示唆している。p16は、Rbに対して作用してS相を阻害させ、Rbは、p16を下方制御し、負のフィードバックを作り出す。欠損Rbは、S相の阻害及びp16の下方制御のいずれもすることができず、故に過剰増殖細胞内でのp16の過剰発現をもたらす。Romagosa,C.et al.,p16Ink4a overexpression in cancer:a tumor suppressor gene associated with senescence and high−grade tumors,Oncogene,Vol.30,2087−2097(2011)。

0004

老化細胞は、がん細胞の成長を煽ることが知られている。老化細胞は、炎症促進性因子を含む細胞内シグナリングに関与する多くの因子の分泌に関連付けられ、これらの因子の分泌は、老化関連分泌表現型またはSASPと称されている。1つの研究は、老化間葉系幹細胞が、IL−6の分泌によって乳癌細胞の増殖及び遊走を促進することを示した(Di,G−h.et al.IL−6Secreted from Senescent Mesenchymal Stem Cells Promotes Proliferation and migration of Breast Cancer Cells,PLOS One,Vol.9,11,e113572(2014))。別の研究は、老化ヒト線維芽細胞が、マトリックスメタロプロテイナーゼの分泌によって腫瘍の成長を増加させることを示した(Liu,D.et al.Senescent Human Fibroblasts Increase the Early Growth of Xenograft Tumors via Matrix Metallopr
oteinase Secretion,Cancer Res,Vol.67,3117−3126(2007))。

0005

老化細胞は、SASPの一部として活性酸素種(「ROS」)を分泌する。ROSは、細胞の老化を維持する上で重要な役割を果たすと考えられている。ROSの分泌は、老化細胞が隣接細胞の老化を誘発する傍観者効果を作り出し、つまりROSは、p16発現を活性化することが知られる正にその細胞損傷を作り出し、老化をもたらす(Nelson,G.,A senescent cell bystander effect:senescence−induced senescence,Aging Cell,Vo.11,345−349(2012))。p16/Rbパスウェイは、ROSの誘発をもたらし、これが転じて、ROSを更に増強する正のフィードバックループを作り出すタンパク質キナーゼデルタを活性化し、不可逆的な細胞周期停止の維持を助ける。がん細胞をROSに曝露することが、過剰増殖細胞内での細胞相停止を誘発することによって、がんを治療するのに有効であり得ることさえ示唆されている(Rayess,H.et al.,Cellular senescence and tumor suppressor gene p16,Int J Cancer,Vol.130,1715−1725(2012))。

0006

終末糖化産物(AGE、AGE修飾タンパク質または最終糖化産物とも称される)は、糖とタンパク質側鎖との非酵素反応から生じる(Ando,K.et al.,Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in theCirculation,Biochem Biophys Res Commun.,Vol.258,123,125(1999))。このプロセスは、シッフ塩基を形成するための還元糖アミノ基との可逆的な反応とともに開始し、これが進行して、共有結合したアマドリ転位産物を形成する。一旦形成されると、アマドリ産物は更なる転位を受けて、AGEを産生する。真性糖尿病DM)によって引き起こされる高血糖、及び酸化ストレスは、膜タンパク質のこの翻訳後修飾を促進する(LindseyJB,et al.,“Receptor For
Glycation End−Products(RAGE)and soluble
RAGE(sRAGE):Cardiovascular Implications,”Diabetes Vascular Disease Research,Vol.6(1),7−14,(2009))。AGEは、糖尿病合併症、炎症、網膜症腎症アテローム性動脈硬化症、卒中、内皮細胞機能障害、及び神経変性障害を含むいくつかの病態に関連付けられている(Bierhaus A,“AGEs and their
interaction with AGE−receptors in vascular disease and diabetes mellitus.I.The AGE concept,”Cardiovasc Res,Vol.37(3),586−600(1998))。

0007

AGE修飾タンパク質はまた、老化細胞のマーカーでもある。最終糖化産物と老化とのこの関連は、当該技術分野において周知である。例えば、Gruber,L.(WO2009/143411、2009年11月26日)、Ando,K.ら(Membrane
Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products during Aging in theCirculation,Biochem Biophys Res Commun.,Vol.258,123,125(1999))、Ahmed,E.K.ら(“Protein Modification and
Replicative Senescence of WI−38Human Embryonic Fibroblasts”Aging Cells,vol.9,25
2,260(2010))、Vlassara,H.ら(Advanced Glycosylation Endproducts on Erythrocyte Cell
Surface Induce Receptor−Mediated Phagocytosis by Macrophages,J.Exp.Med.,Vol.166,539,545(1987))、及びVlassaraら(“High−affinity−receptor−mediated Uptake and Degradation of Glucose−modified Proteins:A Potential Mechanism for the Removal of Senescent Macromolecules”Proc.Natl.Acad.Sci.USAI,Vol.82,5588,5591(1985))を参照されたい。更に、Ahmed,E.K.らは、最終糖化産物が「細胞タンパク質及び細胞外タンパク質に対する自然損傷の主要な原因のうちの1つ」であることを示している(Ahmed,E.K.ら、上記参照、353頁)。したがって、最終糖化産物の蓄積は、老化に関連付けられる。最終糖化産物の形成は、酸化に関連付けられるため、最終糖化産物の蓄積は、老化細胞内でのROSの形成の結果であり得る(Fu,M.−X.,et al.,The Advanced Glycation End Product,NΕ−(Carboxymehtyl)lysine,Is a Product of both Lipid Peroxidation and Glycoxidation Reactions,J.Biol.Chem.,Vol.271,9982−9986(1996))。

0008

国際公開第2009/143411号パンフレット

先行技術

0009

Romagosa, C. et al., Oncogene 30: 2087-97 (2011)
Di,G-h. et al.,PLOS One 9,11: e113572 (2014)
Liu,D. et al., Cancer Res 67: 3117-26(2007)
Nelson, G., Aging Cell 11: 345-49 (2012)
Rayess, H. et al., Int J Cancer 130: 1715-25 (2012)
Ando, K. et al., BiochemBiophys Res Commun. 258:123-27 (1999)
LindseyJB, et al., Diabetes Vascular DiseaseResearch 6(1):7-14 (2009)
Bierhaus A, Cardiovasc Res 37(3): 586-600 (1998)
Ahmed, E. K. et al., Aging Cells 9: 252-72(2010)
Vlassara, H. et al., J.Exp.Med. 166: 539-49 (1987)
Vlassara, H. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:5588-92 (1985)
Fu,M.-X., et al., J.Biol.Chem. 271: 9982-86(1996)

0010

第1の態様において、本発明は、がんを治療、転移性がん細胞を殺傷、潜在的悪性新生物細胞を殺傷、及び/またはがん転移を予防する方法であって、対象に抗AGE抗体を含む組成物投与することを含む、方法である。

0011

第2の態様において、本発明は、がんを治療、転移性がん細胞を殺傷、潜在的悪性新生物細胞を殺傷、及び/またはがん転移を予防する方法であって、第1の抗AGE抗体及び第2の抗AGE抗体を含む組成物を投与することを含む、方法である。第2の抗AGE抗体は、第1の抗AGE抗体とは異なる。

0012

第3の態様において、本発明は、がんを有する対象を治療、転移性がん細胞を殺傷、潜在的悪性新生物細胞を殺傷、及び/またはがん転移を予防する方法であって、抗AGE抗体の第1の投与と、その後、第1の投与ががんを治療、転移性がん細胞を殺傷、潜在的悪性新生物細胞を殺傷、及び/またはがん転移を予防する有効性について、対象を検査することと、その後、抗AGE抗体の第2の投与とを含む、方法である。

0013

第4の態様において、本発明は、がんを治療、転移性がん細胞を殺傷、潜在的悪性新生物細胞を殺傷、及び/またはがん転移を予防するための医薬の製造のための、抗AGE抗体の使用である。

0014

第5の態様において、本発明は、がんを治療、転移性がん細胞を殺傷、潜在的悪性新生物細胞を殺傷、及び/またはがん転移を予防する上での使用のための、抗AGE抗体を含む組成物である。

0015

第6の態様において、本発明は、がんを治療、転移性がん細胞を殺傷、潜在的悪性新生物細胞を殺傷、及び/またはがん転移を予防するための組成物であって、第1の抗AGE抗体と、第2の抗AGE抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物である。第1の抗AGE抗体は、第2の抗AGE抗体とは異なる。

0016

第7の態様において、本発明は、転移性がんを診断する方法であって、AGE修飾を発現する細胞に結合した抗AGE抗体を含む免疫複合体を検出することを含む、方法である。

0017

第8の態様において、本発明は、転移性がん細胞に結合した抗AGE抗体を含む免疫複合体である。転移性がん細胞は、AGE修飾を発現する。

0018

第9の態様において、本発明は、転移性がんを診断するためのキットであって、抗AGE抗体と、対照試料と、任意で、抗AGE抗体に結合する試薬とを含む、キットである。

0019

定義

0020

ペプチド」という用語は、2〜50個のアミノ酸で構成される分子を意味する。

0021

「タンパク質」という用語は、50個を超えるアミノ酸で構成される分子を意味する。

0022

「終末糖化産物」、「AGE」、「AGE修飾タンパク質またはペプチド」、「最終糖化産物」、及び「AGE抗原」は、糖とタンパク質側鎖との反応の結果として形成され、更に転位し、不可逆的な架橋を形成する、修飾タンパク質またはペプチドを指す。このプロセスは、シッフ塩基を形成するための還元糖とアミノ基との可逆的な反応とともに開始し、これが進行して、共有結合したアマドリ転位産物を形成する。一旦形成されると、アマドリ産物は更なる転位を受けて、AGEを産生する。AGE修飾タンパク質及びAGE修飾タンパク質に対する抗体は、BucalaのUS5,702,704(「Bucala」)及びAl−AbedらのUS6,380,165(「Al−Abed」)に記載されている。糖化アルブミンに見出されるN−デオキシフルクトシルリジンなどの、AGEを形成するのに必要な転位を受けていない糖化タンパク質またはペプチドは、AGEではない。AGEは、2−(2−フロイル)−4(5)−(2−フラニル)−1H−イミダゾール(「FFI」)、5−ヒドロキシメチル−1−アルキルピロール−2−カルボアルデヒド(「ピラリン」)、1−アルキル−2−ホルミル−3,4−ジグリコシルピロール(「AFGP」)、非蛍光モデルAGE、カルボキシメチルリジン、及びペントシジンなど
のAGE修飾の存在(AGEエピトープまたはAGE部分とも称される)によって特定され得る。別のAGEであるALIは、Al−Abedに記載されている。

0023

「細胞上のAGE修飾タンパク質に結合する抗体」、「抗AGE抗体」、または「AGE抗体」は、AGE修飾タンパク質またはペプチドに結合し、抗体の定常領域を含む抗体又は他のタンパク質を意味し、上記AGE修飾されているタンパク質またはペプチドは通常、細胞、好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト、ネコイヌウマラクダ科(例えば、ラクダもしくはアルパカ)、ウシヒツジ、またはヤギ細胞の表面上に結合した状態で見出されるタンパク質またはペプチドである。「細胞上のAGE修飾タンパク質に結合する抗体」、「抗AGE抗体」、または「AGE抗体」は、同じ特異性及び選択性で、AGE修飾タンパク質またはペプチドと、同じ非AGE修飾タンパク質またはペプチドとの両方に結合する抗体または他のタンパク質は含まない(つまりAGE修飾の存在は、結合を増加させない)。アルブミンは、通常細胞の表面上に結合した状態で見出されるタンパク質ではないため、AGE修飾アルブミンは、細胞上のAGE修飾タンパク質ではない。「細胞上のAGE修飾タンパク質に結合する抗体」、「抗AGE抗体」、または「AGE抗体」は、細胞の除去、破壊、または死をもたらす抗体のみを含む。例えば、毒素、薬物、または他の化学物質もしくは粒子接合されている抗体もまた、含まれる。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗体もまた許容可能である。

0024

「老化細胞」という用語は、増殖停止の状態にあり、1つ以上の老化のバイオマーカー(p16Ink4aの活性化または老化関連β−ガラクトシダーゼの発現など)を発現する細胞を意味する。

0025

バリアント」という用語は、具体的に特定された配列とは異なり、1つ以上のヌクレオチド、タンパク質、またはアミノ酸残基欠失置換、または付加されているヌクレオチド、タンパク質、またはアミノ酸配列を意味する。バリアントは、天然に存在する対立遺伝子バリアントであっても、天然に存在しないバリアントであってもよい。特定された配列のバリアントは、特定された配列の機能的特徴のうちのいくつかまたは全てを保持し得る。

0026

配列同一性パーセント(%)」は、配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入して、最大配列同一性パーセントを達成した後、かついかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮しない、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することが目的の整列は、BLAST、BLAST−2、ALIGN、またはMegalign(DNASTAR)ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、様々な方法で達成することができる。好ましくは、配列同一性%値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN−2を使用して生成される。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムは、Genentech,Inc.(South San Francisco,CA)から公的に入手可能であるか、または米国著作権局にユーザ文書とともに提出されており、米国著作権登録第TXU510087号の下に登録されているソースコードからコンパイルすることができる。ALIGN−2プログラムは、デジタルUNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステムでの使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメータは、ALIGN−2プログラムによって設定されており、変動しない。

0027

アミノ酸配列比較のためにALIGN−2が用いられる状況において、所与のアミノ酸配列Bへの、それとの、またはそれに対する所与のアミノ酸配列Aの配列同一性%(あるいは、所与のアミノ酸配列Bへの、それとの、またはそれに対する特定のアミノ酸配列同
一性%を有するか、または含む所与のアミノ酸配列Aとも表現することができる)は、以下、分数X/Yの100倍(式中、Xは、配列整列プログラムALIGN−2によって、そのプログラムのA及びBの整列において同一のマッチとしてスコア化されるアミノ酸残基の数であり、Yは、Bにおけるアミノ酸残基の総数である)のように計算される。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、BへのAのアミノ酸配列同一性%は、AへのBのアミノ酸配列同一性%とは等しくないだろう。別段具体的に述べられない限り、本明細書で使用される全てのアミノ酸配列同一性%値は、ALIGN−2コンピュータプログラムを使用して得られる。

0028

「免疫複合体」という用語は、抗原に結合した抗体の組み合わせを意味する。免疫複合体はまた、「抗体−抗原複合体」とも称され得る。

図面の簡単な説明

0029

抗体結合実験における応答対時間のグラフである。
がん転移を診断するためのキットを示す。
腫瘍成長転移能、及び悪液質に対する抗AGE抗体の効果を調査するインビボ研究の過程を通した、正規化した腫瘍体積のグラフを示す。
腫瘍成長、転移能、及び悪液質に対する抗AGE抗体の効果を調査するインビボ研究の過程を通した、正規化したマウスの体重のグラフを示す。

0030

C.elegansにおける近年の研究は、活発に増殖している細胞が侵襲性ではないこと、及び転移性がん細胞などの侵襲性細胞が増殖しておらず、細胞周期停止にあるはずであることを示唆している(Matus et al.,Invasive Cell Fate Requires G1Cell−Cycle arrest and Histone Deacetylase−Mediated Changes in Gene Expression,Developmental Cell,Vol.35,162−174(2015))。他の研究者らは、ROSの形成ががん細胞の転移を誘発し得ることを見出している(Porporato,P.E.,et al.A Mitochondrial Switch Promotes Tumor Metastasis,Cell Reports,Vol.8,754−766(2014))。

0031

細胞相停止及びROSの産生は、転移性がん細胞に、細胞表面上のAGE修飾タンパク質の存在を含むことが予想される老化細胞の多くの特徴を与える。したがって、AGE修飾タンパク質は、転移性がん細胞を探索し、破壊するために、抗体を使用して標的とすることができる抗原を提供する。抗AGE抗体の投与は、転移性がん細胞を殺傷することにより、がんを治療する。抗AGE抗体の投与は、がん患者において転移を予防し、予防的な様式でがんの拡散を予防するために使用することができる。

0032

脂漏性角化症光線角化症、及び上皮内癌などの潜在的悪性新生物は、細胞表面上のAGE修飾タンパク質の存在を含むことが予想される老化細胞の多くの特徴(p16の発現など)を有する。したがって、AGE修飾タンパク質は、潜在的悪性新生物細胞を探索し、破壊するために、抗体を使用して標的とすることができる抗原を提供する。抗AGE抗体の投与は、潜在的悪性新生物細胞を殺傷することにより、がんを予防する。抗AGE抗体の投与は、予防的な様式で患者においてがんを予防する。

0033

細胞上のAGE修飾タンパク質に結合する抗体(「抗AGE抗体」または「AGE抗体」)は、当該技術分野において既知である。例としては、US5,702,704(Bucala)及びUS6,380,165(Al−Abedら)に記載されるものが挙げられる。例としては、FFI、ピラリン、AFGP、ALI、カルボキシメチルリジン、カ
ルボキシエチルリジン、及びペントシジンなどのAGE修飾を有する1つ以上のAGE修飾タンパク質に結合する抗体、ならびにそのような抗体の混合物が挙げられる。好ましくは、抗体は、カルボキシメチルリジン修飾タンパク質に結合する。好ましくは、抗体は、それが使用される動物に対して非免疫原性であり、例えば、ヒト、伴侶動物(ネコ、イヌ、及びウマを含む)、ならびに商業的に重要な動物(ラクダ(またはアルパカ)、ウシ(ウシ亜科)、ヒツジ、及びヤギなど)に対して非免疫原性である。より好ましくは、抗体は、抗体に対する免疫応答を減少させるために動物の抗体と同じ種の定常領域を有し、例えば、(ヒトでは)ヒト化、(ネコでは)ネコ化、(イヌでは)イヌ化、(ウマでは)ウマ化、(ラクダもしくはアルパカでは)ラクダ化、(ウシでは)ウシ化、(ヒツジでは)ヒツジ化、または(ヤギでは)ヤギ化される。最も好ましくは、抗体は、(可変領域を除いて)それが使用される動物の抗体と同一であり、例えば、ヒト抗体、ネコ抗体、イヌ抗体、ウマ抗体、ラクダ抗体ウシ抗体ヒツジ抗体、またはヤギ抗体である。これらの動物の抗体の定常領域及び他の部分の詳細は、以下に記載される。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗体もまた許容可能である。

0034

特に好ましい抗AGE抗体としては、カルボキシメチルリジンまたはカルボキシエチルリジンAGE修飾を呈するタンパク質またはペプチドに結合するものが挙げられる。カルボキシメチルリジン(N(イプシロン)−(カルボキシメチル)リジン、N(6)−カルボキシメチルリジン、または2−アミノ−6−(カルボキシメチルアミノヘキサン酸としても知られる)及びカルボキシエチルリジン(N−イプシロン−(カルボキシエチル)リジンとしても知られる)は、酸化ストレス及び化学糖化の結果としてタンパク質またはペプチド及び脂質上に見出される。CML及びCEL修飾タンパク質またはペプチドは、様々な細胞上で発現される受容体RAGEによって認識される。CML及びCELはよく研究されており、CML及びCEL関連産物は市販されている。例えば、Cell Biolabs,Inc.は、CML−BSA抗原、CMLポリクローナル抗体、CML免疫ブロットキット、及びCML競合ELISAキット(www.cellbiolabs.com/cml−assays)、ならびにCEL−BSA抗原及びCEL競合ELISAキット(www.cellbiolabs.com/cel−n−epsilon−carboxyethyl−lysine−assays−and−reagents)を販売している。特に好ましい抗体としては、キーホールリンペットヘモシアニンに接合したカルボキシメチルリジンに対して産生された市販のマウス抗最終糖化産物抗体の可変領域、つまりヒト定常領域(またはそれが投与される動物の定常領域)を有するように修飾されたR&D Systems,Inc.(Minneapolis,MN、カタログ番号MAB3247)から入手可能なカルボキシメチルリジンMAb(クローン318003)が挙げられる。R&D Systems,Inc.のカタログ番号MAB3247に対応するカルボキシメチルリジン抗体などの市販の抗体は、診断目的向けのものであり得、動物またはヒトにおける使用には適さない材料を含有し得る。好ましくは、市販の抗体は、毒素または他の潜在的に有害な材料を除去するために、動物またはヒトにおける使用前に精製及び/または単離される。

0035

抗AGE抗体は、好ましくは最大で9×10−3、8×10−3、7×10−3、または6×10−3(秒−1)の抗体−抗原複合体からの低い解離速度、つまりkd(kbackまたはオフ速度とも称される)を有する。抗AGE抗体は、細胞のAGE修飾タンパク質に対する高い親和性を有し、これは、最大で9×10−6、8×10−6、7×10−6、6×10−6、5×10−6、4×10−6、または3×10−6(M)の低い解離定数KDとして表され得る。好ましくは、抗AGE抗体の結合特性は、図1に示される、R&D Systems,Inc.(Minneapolis,MN、カタログ番号MAB3247)から入手可能なカルボキシメチルリジンMAb(クローン318003)に類似しているか、それと同じであるか、またはそれよりも優れている。

0036

抗AGE抗体は、抗体依存性細胞傷害ADCC)を通してAGE修飾細胞を破壊し得る。ADCCは、細胞媒介免疫防御機構であり、そこでは、免疫系のエフェクター細胞が、膜表面抗原特異的抗体が結合している標的細胞を活発に溶解させる。ADCCは、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ好中球、または好酸球によって媒介され得る。エフェクター細胞は、結合した抗体のFc部分に結合する。NK92細胞(NantKwest,CulverCity,CAから入手可能な細胞株)などのNK細胞を、抗AGE抗体の投与とともに、またはそれに後続して投与することで、補体価、及びそれ故に抗AGE抗体が転移性がん細胞を殺傷する有効性を増強することができる。抗AGE抗体は、補体依存性細胞傷害(CDC)を通してAGE修飾細胞を破壊し得る。CDCにおいて、免疫系の補体カスケードは、抗体が標的抗原に結合することによって引き起こされる。

0037

抗AGE抗体は、AGE修飾細胞の破壊を引き起こす薬剤に接合され得る。そのような薬剤は、毒素、細胞傷害性剤磁性ナノ粒子、及び磁性スピンボルテックスディスクであり得る。

0038

抗AGE抗体に接合したポア形成毒素(PFT)(Aroian R.et al.,“Pore−Forming Toxins and Cellular Non−Immune Defenses(CNIDs),”Current Opinion in
Microbiology,10:57−61(2007))などの毒素は、AGE修飾細胞を選択的に標的とし、それを除去するために、患者に注射され得る。抗AGE抗体は、AGE修飾細胞を認識し、それに結合する。その後、毒素は、細胞表面でのポア形成、及び浸透圧溶解を通した後続する細胞除去を引き起こす。

0039

抗AGE抗体に接合した磁性ナノ粒子は、AGE修飾細胞を標的とし、それを除去するために、患者に注射され得る。磁性ナノ粒子は、AGE修飾細胞を選択的に除去するために、磁場を適用することによって加熱され得る。

0040

代替手段として、血管を遮断し得る自己凝集を回避するために、磁場が適用されるときにのみ磁化される磁性スピンボルテックスディスクは、磁場が適用されるときにスピンを開始し、標的細胞の膜破壊を引き起こす。抗AGE抗体に接合した磁性スピンボルテックスディスクは、他の細胞を除去することなく、AGE修飾細胞型を特異的に標的とする。

0041

抗体は典型的には、連結して「Y」形分子を形成する、ポリペプチドの2つの重鎖及び2つの軽鎖を含む。定常領域は、抗原を標的とするために使用される機構を決定する。「Y」(可変領域)の先端のアミノ酸配列は、異なる抗体間で変動する。この変動が、抗体に、抗原に結合するその特異性を与える。軽鎖及び重鎖の末端を含む可変領域は、超可変(HV相補性決定領域またはCDRとも称されることがある)領域及びフレームワーク(FR)領域に更に細分される。抗体が組み換えで調製されるとき、「Y」の各先端が抗原のうちの1つに対して特異的になって、2つの異なる抗原に結合する可変領域(または相補性決定領域)を有する単一の抗体を有することもまた可能であり、これらは、二重特異性抗体と称される。

0042

本発明のヒト化抗AGE抗体は、配列番号22に示されるアミノ酸のヒト定常領域配列を有し得る。ヒト化抗AGE抗体の重鎖相補性決定領域は、配列番号23(CDR1H)、配列番号24(CDR2H)、及び配列番号25(CDR3H)に示されるタンパク質配列のうちの1つ以上を有し得る。ヒト化抗AGE抗体の軽鎖相補性決定領域は、配列番号26(CDR1L)、配列番号27(CDR2L)、及び配列番号28(CDR3L)に示されるタンパク質配列のうちの1つ以上を有し得る。

0043

ヒト(ホモサピエンス)抗体免疫グロブリンG1の重鎖は、配列番号1のタンパク質配列を有し得るか、またはそれを含み得る。重鎖の可変ドメインは、配列番号2のタンパク質配列を有し得るか、またはそれを含み得る。重鎖(配列番号2)の可変ドメインの相補性決定領域は、配列番号41、配列番号42、及び配列番号43に示される。ヒト(ホモサピエンス)抗体免疫グロブリンG1のカッパ軽鎖は、配列番号3のタンパク質配列を有し得るか、またはそれを含み得る。カッパ軽鎖の可変ドメインは、配列番号4のタンパク質配列を有し得るか、またはそれを含み得る。任意で、配列番号4の128位のアルギニン(ArgまたはR)残基は、省略され得る。軽鎖(配列番号4)の可変ドメインの相補性決定領域は、配列番号44、配列番号45、及び配列番号46に示される。可変領域は、コドン最適化され、合成され、ヒト免疫グロブリンG1定常領域を含有する発現ベクター内にクローニングされ得る。加えて、可変領域は、非ヒト抗体のヒト化において使用されてもよい。

0044

抗体重鎖は、配列番号12のDNA配列、つまりマウス抗AGE免疫グロブリンG2b重鎖によってコードされ得る。配列番号12によってコードされるマウス抗AGE免疫グロブリンG2b重鎖のタンパク質配列は、配列番号16に示される。マウス抗体の可変領域は、配列番号20に示され、これは、配列番号16の25〜142位に対応する。あるいは、抗体重鎖は、配列番号13のDNA配列、つまりキメラ抗AGEヒト免疫グロブリンG1重鎖によってコードされ得る。配列番号13によってコードされるキメラ抗AGEヒト免疫グロブリンG1重鎖のタンパク質配列は、配列番号17に示される。キメラ抗AGEヒト免疫グロブリンは、25〜142位の配列番号20のマウス可変領域を含む。抗体軽鎖は、配列番号14のDNA配列、つまりマウス抗AGEカッパ軽鎖によってコードされ得る。配列番号14によってコードされるマウス抗AGEカッパ軽鎖のタンパク質配列は、配列番号18に示される。マウス抗体の可変領域は、配列番号21に示され、これは、配列番号18の21〜132位に対応する。あるいは、抗体軽鎖は、配列番号15のDNA配列、つまりキメラ抗AGEヒトカッパ軽鎖によってコードされ得る。配列番号15によってコードされるキメラ抗AGEヒトカッパ軽鎖のタンパク質配列は、配列番号19に示される。キメラ抗AGEヒト免疫グロブリンは、21〜132位の配列番号21のマウス可変領域を含む。

0045

本発明のヒト化抗AGE抗体は、1つ以上のヒト化重鎖またはヒト化軽鎖を有し得るか、またはそれを含み得る。ヒト化重鎖は、配列番号30、32、または34のDNA配列によってコードされ得る。配列番号30、32、及び34によってコードされるヒト化重鎖のタンパク質配列はそれぞれ、配列番号29、31、及び33に示される。ヒト化軽鎖は、配列番号36、38、または40のDNA配列によってコードされ得る。配列番号36、38、及び40によってコードされるヒト化軽鎖のタンパク質配列はそれぞれ、配列番号35、37、及び39に示される。好ましくは、ヒト化抗AGE抗体は、元の抗体特異性を保持しながら、ヒト配列の量を最大化する。配列番号29、31、及び33から選択されるタンパク質配列を有する重鎖と、配列番号35、37、及び39から選択されるタンパク質配列を有する軽鎖とを含有する完全ヒト化抗体が、構築され得る。

0046

特に好ましい抗AGE抗体は、マウスモノクローナル抗AGE抗体をヒト化することによって得ることができる。マウスモノクローナル抗AGE抗体は、配列番号47に示される重鎖タンパク質配列(可変ドメインのタンパク質配列は配列番号52に示される)と、配列番号57に示される軽鎖タンパク質配列(可変ドメインのタンパク質配列は配列番号62に示される)とを有する。好ましいヒト化重鎖は、配列番号48、配列番号49、配列番号50、または配列番号51に示されるタンパク質配列を有する(ヒト化重鎖の可変ドメインのタンパク質配列はそれぞれ、配列番号53、配列番号54、配列番号55、及び配列番号56に示される)。好ましいヒト化軽鎖は、配列番号58、配列番号59、配列番号60、または配列番号61に示されるタンパク質配列を有する(ヒト化軽鎖の可変
ドメインのタンパク質配列はそれぞれ、配列番号63、配列番号64、配列番号65、及び配列番号66に示される)。好ましくは、ヒト化抗AGEモノクローナル抗体は、配列番号48、配列番号49、配列番号50、及び配列番号51からなる群から選択されるタンパク質配列を有する重鎖と、配列番号58、配列番号59、配列番号60、及び配列番号61からなる群から選択されるタンパク質配列を有する軽鎖とで構成される。これらのタンパク質配列で構成されるヒト化モノクローナル抗AGE抗体は、より良好な結合及び/または改善された免疫系の活性化を有し得、これは、より大きな有効性をもたらす。

0047

非ヒト種に由来する抗体のタンパク質配列は、配列番号2に示される配列を有する重鎖または配列番号4に示される配列を有するカッパ軽鎖の可変ドメインを含むように修飾され得る。非ヒト種は、イエネコもしくはイエイヌなどの伴侶動物、またはウシ、ウマ、もしくはラクダなどの家畜であり得る。好ましくは、非ヒト種は、マウスではない。ウマ(Equus caballus)抗体免疫グロブリンガンマ4の重鎖は、配列番号5のタンパク質配列(EMBLGenBank受入番号AY445518)を有し得るか、またはそれを含み得る。ウマ(Equus caballus)抗体免疫グロブリンデルタの重鎖は、配列番号6のタンパク質配列(EMBL/GenBank受入番号AY631942)を有し得るか、またはそれを含み得る。イヌ(Canis familiaris)抗体免疫グロブリンAの重鎖は、配列番号7のタンパク質配列(GenBank受入番号L36871)を有し得るか、またはそれを含み得る。イヌ(Canis familiaris)抗体免疫グロブリンEの重鎖は、配列番号8のタンパク質配列(GenBank受入番号L36872)を有し得るか、またはそれを含み得る。ネコ(Felis
catus)抗体免疫グロブリンG2の重鎖は、配列番号9のタンパク質配列(DDBJ/EMBL/GenBank受入番号KF811175)を有し得るか、またはそれを含み得る。

0048

ラクダ(Camelus dromedarius及びCamelus bactrianus)、ラマ(Lama glama、Lama pacos、及びLama vicugna)、アルパカ(Vicugna pacos)、ならびにグアナコ(Lama
guanicoe)などのラクダ科の動物は、他の哺乳動物には見出されない特有の抗体を有する。重鎖及び軽鎖四量体で構成される従来の免疫グロブリンG抗体に加えて、ラクダ科はまた、軽鎖を含有せず重鎖二量体として存在する重鎖免疫グロブリンG抗体も有する。これらの抗体は、重鎖抗体、HCAb、単一ドメイン抗体、またはsdAbとして知られ、ラクダ科重鎖抗体の可変ドメインは、VHHとして知られる。ラクダ科重鎖抗体は、重鎖CH1ドメインを欠き、他の種には見出されないヒンジ領域を有する。ヒトコブラクダ(Camelus dromedarius)単一ドメイン抗体の可変領域は、配列番号10のタンパク質配列(GenBank受入番号AJ245148)を有し得るか、またはそれを含み得る。ヒトコブラクダ(Camelus dromedarius)四量体免疫グロブリンの重鎖の可変領域は、配列番号11のタンパク質配列(GenBank受入番号AJ245184)を有し得るか、またはそれを含み得る。

0049

ラクダ科に加えて、重鎖抗体はまた、サメガンギエイ、及びエイなどの軟骨魚類にも見出される。この種類の抗体は、免疫グロブリン新抗原受容体またはIgNARとして知られ、IgNARの可変ドメインは、VNARとして知られる。IgNARは、各々が1つの可変ドメインと5つの定常ドメインとで構成される2つの同一の重鎖二量体として存在する。ラクダ科と同様に、軽鎖は存在しない。

0050

追加の非ヒト種のタンパク質配列は、International ImMunoGeneTics Information System(www.imgt.org)、European Bioinformatics Institute(www.ebi.ac.uk)、DNA Databank of Japan(ddbj.nig.
ac.jp/arsa)、またはNational Center for Biotechnology Information(www.ncbi.nlm.nih.gov)などのオンラインデータベースに容易に見出すことができる。

0051

抗AGE抗体またはそのバリアントは、配列番号2または配列番号20(その翻訳後修飾を含む)のアミノ酸配列と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する重鎖可変領域を含み得る。少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有する可変領域は、参照配列と比較して置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含有し得るが、その配列を含む抗AGE抗体は、AGEに結合する能力を保持する。置換、挿入、または欠失は、可変領域外の領域において生じ得る。

0052

抗AGE抗体またはそのバリアントは、配列番号4または配列番号21のアミノ酸配列(その翻訳後修飾を含む)と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含み得る。少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有する可変領域は、参照配列と比較して置換(例えば、保存的置換)、挿入、または欠失を含有し得るが、その配列を含む抗AGE抗体は、AGEに結合する能力を保持する。置換、挿入、または欠失は、可変領域外の領域において生じ得る。

0053

あるいは、抗体は、キーホールリンペットヘモシアニンに接合したカルボキシメチルリジン(CML−KLH)に対して産生された市販のマウス抗最終糖化産物抗体の相補性決定領域、つまりR&D Systems,Inc.(Minneapolis,MN、カタログ番号MAB3247)から入手可能なカルボキシメチルリジンMAb(クローン318003)を有し得る。

0054

抗体は、対象の免疫系による標的細胞の破壊を可能にする定常領域を有し得るか、またはそれを含み得る。

0055

AGE修飾タンパク質の2種類以上のAGEに結合する抗体の混合物もまた、使用されてもよい。

0056

2つの異なるエピトープに指向された抗AGE抗体である二重特異性抗体もまた、使用されてもよい。そのような抗体は、1つの抗AGE抗体のものに由来する可変領域(または相補性決定領域)と、異なる抗体に由来する可変領域(または相補性決定領域)とを有するだろう。

0057

抗体断片が、全抗体の代わりに使用されてもよい。例えば、免疫グロブリンGは、酵素での消化によってより小さな断片へと分解され得る。パパイン消化は、重鎖内ジスルフィド架橋N末端側を切断して、Fab断片を産生する。Fab断片は、軽鎖と、重鎖の2つのN末端ドメインのうちの1つ(Fd断片としても知られる)とを含む。ペプシン消化は、重鎖内ジスルフィド架橋のC末端側を切断して、F(ab’)2断片を産生する。F(ab’)2断片は、軽鎖と、ジスルフィド架橋によって結合された2つのN末端ドメインとの両方を含む。ペプシン消化はまた、Fv(可変断片)断片及びFc(結晶化可能断片)断片も形成し得る。Fv断片は、2つのN末端可変ドメインを含有する。Fc断片は、細胞上の免疫グロブリン受容体と及び補体カスケードの初期要素相互作用するドメインを含有する。ペプシンはまた、重鎖の第3の定常ドメイン(CH3)前の免疫グロブリンGも切断して、大断片F(abc)及び小断片pFc’を産生し得る。あるいは、抗体
断片は、組み換えで産生され得る。

0058

追加の抗体が所望される場合、それらは、周知の方法を使用して産生され得る。例えば、ポリクローナル抗体(pAb)は、免疫原、及び所望される場合アジュバントの1回以上の注射によって哺乳動物宿主内で産生され得る。典型的には、免疫原(及びアジュバント)は、皮下または腹腔内注射によって哺乳動物内に注射される。免疫原は、AGE−アンチトロンビンIII、AGE−カルモジュリン、AGE−インスリン、AGE−セルロプラスミン、AGE−コラーゲン、AGE−カテプシンB、AGE−アルブミン(AGE−ウシ血清アルブミン(AGE−BSA)、AGE−ヒト血清アルブミン、及び卵白アルブミンなど)、AGE−クリスタリン、AGE−プラスミノーゲン活性化因子、AGE−内皮血漿膜タンパク質、AGE−アルデヒド還元酵素、AGE−トランスフェリン、AGE−フィブリン、AGE−銅/亜鉛OD、AGE−アポリポタンパク質B、AGE−フィブロネクチン、AGE−膵臓リボース、AGE−アポリポタンパク質A−I及びII、AGE−ヘモグロビン、AGE−Na+/K+−ATPアーゼ、AGE−プラスミノーゲン、AGE−ミエリン、AGE−リゾチーム、AGE−免疫グロブリン、AGE−赤血球グルタミン酸輸送タンパク質、AGE−β−N−アセチルヘキソミナーゼ(ヘキソキナーゼ)、AGE−アポリポタンパク質E、AGE−赤血球膜タンパク質、AGE−アルドース還元酵素、AGE−フェリチン、AGE−赤血球スペクトリン、AGE−アルコール脱水素酵素、AGE−ハプトグロビン、AGE−チューブリン、AGE−甲状腺ホルモン、AGE−フィブリノーゲン、AGE−β2ミクログロブリン、AGE−ソルビトール脱水素酵素、AGE−α1−アンチトリプシン、AGE−炭酸脱水素酵素、AGE−リボヌクレアーゼ、AGE−低密度リポタンパク質、AGE−ヘキソキナーゼ、AGE−アポリポタンパク質C−I、AGE−リボヌクレアーゼ、AGE−ヘモグロビン(AGE−ヒトヘモグロビンなど)、AGE−アルブミン(AGE−ウシ血清アルブミン(AGE−BSA)及びAGE−ヒト血清アルブミンなど)、AGE−低密度リポタンパク質(AGE−LDL)、ならびにAGE−コラーゲンIVなどの細胞のAGE修飾タンパク質であり得る。完全な、溶解された、または部分的に消化されたAGE修飾赤血球などのAGE修飾細胞もまた、AGE抗原として使用することができる。アジュバントの例としては、フロイント完全アジュバントモノホスホリルリピドA合成−トレハロースコリノミコレート水酸化アルミニウムミョウバン)、熱ショックタンパク質HSP70またはHSP96、モノホスホリルリピドAを含有するスクアレン乳濁液、α2−マクログロブリン、ならびに界面活性物質油乳濁液、プロイロニックポリオールポリアニオン、及びジニトロフェノールを含む)が挙げられる。免疫応答を改善するために、免疫原は、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、血清アルブミン、ウシサイログロブリンコレラ毒素不安定性エンテロトキシンシリカ粒子、または大豆トリプシン阻害剤などの宿主内で免疫原性であるポリペプチドに接合されてもよい。好ましい免疫原接合体は、AGE−KLHである。あるいは、pAbはニワトリ内で作製され得、これはIgY分子を産生する。

0059

モノクローナル抗体(mAb)はまた、宿主または宿主に由来するリンパ球免疫化し、mAbを分泌する(または潜在的に分泌する)リンパ球を収集し、それらのリンパ球を不死化細胞(例えば、骨髄腫細胞)に融合し、所望されるmAbを分泌する細胞を選択することによっても作製され得る。EBVハイブリドーマ技術などの他の技術が使用されてもよい。抗体の可変ドメインをコードする遺伝子を、ヒト(または他の動物)免疫グロブリンの定常ドメインの遺伝子にスプライスすることによる、キメラ抗体の生成のための技術は、アミノ酸レベルで実質的にヒトである(ヒト化されている)か、または別の動物(ネコ、イヌ、ウマ、ラクダ、ウシ、ヒツジ、もしくはヤギなど)に実質的に「〜化」された「キメラ抗体」をもたらす。所望される場合、mAbは、タンパク質A−セファロースヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーゲル電気泳動法透析法硫酸アンモニウム沈殿法、または親和性クロマトグラフィーなどの従来の手順によって、培養培地
たは腹水から精製されてもよい。加えて、ヒトモノクローナル抗体は、第3のコピーIgGヒトトランス遺伝子座及び発現停止された内在性マウスIg遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスの免疫化によって、またはヒト−トランスジェニックマウスを使用して生成され得る。ヒト化モノクローナル抗体及びその断片の産生はまた、ファージディスプレイ技術を通して生成することもできる。

0060

「薬学的に許容される担体」は、薬学的投与に適合するあらゆる全ての溶剤、分散培地コーティング抗菌剤及び抗真菌剤、ならびに等張剤及び吸収遅延剤などを含む。そのような担体または希釈剤の好ましい例としては、水、食塩水リンゲル溶液、及びデキストロース溶液が挙げられる。補助活性化合物もまた、組成物中に組み込まれてもよい。非経口投与に使用される溶液及び懸濁液としては、無菌希釈剤(注射用水生理食塩水ポリエチレングリコールグリセリンプロピレングリコール、または他の合成溶剤など)、抗菌剤(ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど)、酸化防止剤アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど)、緩衝液酢酸クエン酸、またはリン酸など)、及び浸透圧調節用の薬剤(塩化ナトリウムまたはデキストロースなど)を挙げることができる。pHは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調節することができる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル使い捨てシリンジ、または複数回用量バイアル内に封入され得る。

0061

注射に好適な薬学的組成物としては、無菌注射可能溶液または分散液の即時調製用無菌水溶液または分散液が挙げられる。注射に好適な抗体の薬学的組成物中には、様々な賦形剤が含まれ得る。静脈内投与について、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、CREMOPHOR EL(登録商標)(BASF、Parsippany,NJ)、またはリン酸緩衝食塩水PBS)が挙げられる。あらゆる場合において、組成物は無菌でなくてはならず、シリンジを使用して投与するために流体であるべきである。そのような組成物は、製造及び保管中安定しているべきであり、細菌及び真菌などの微生物による汚染に対して保存されなくてはならない。様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベンクロロブタノールフェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールは、微生物汚染を含有し得る。組成物中には、糖、アルコールマニトール(manitol)、ソルビトール、及び塩化ナトリウムなど)などの等張剤が含まれてもよい。吸収を遅延することができる組成物としては、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤が挙げられる。無菌注射可能溶液は、必要に応じて成分のうちの1つまたはその組み合わせとともに、必要な量の抗体、及び任意で他の治療構成要素を適切な溶剤中に組み込み、その後、無菌化することによって調製され得る。無菌注射可能溶液の調製のための無菌固体調製方法としては、固体を得るための真空乾燥及び凍結乾燥が挙げられる。

0062

吸入による投与について、抗体は、好適な噴霧剤、例えば、二酸化炭素などの気体を含有する噴霧器または加圧容器からエアロゾルスプレーとして送達され得る。抗体はまた、例えば、iSPERSE(商標)吸入薬送達プラットフォーム(PULMATRIX,Lexington,Mass.)を使用して、乾燥粉末としての吸入を介して送達することもできる。ニワトリ抗体(IgY)である抗AGE抗体の使用は、吸入によって投与される場合、ヒトを含む様々な動物において非免疫原性であり得る。

0063

局所適用は、皮膚に存在するがんならびに潜在的悪性新生物、例えば、黒色腫、脂漏性角化症、及び光線角化症にとって有効であり得る。局所投与用の組成物は、クリームまたはローションの形態であり得る。

0064

各種の抗体の適切な投薬量ベルは一般に、1kgの患者体重当たり約0.01〜500mgであるだろう。好ましくは、投薬量レベルは、約0.1〜約250mg/kg、より好ましくは約0.5〜約100mg/kgであるだろう。好適な投薬量レベルは、約0
.01〜250mg/kg、約0.05〜100mg/kg、または約0.1〜50mg/kgであり得る。この範囲内で、投薬量は、0.05〜0.5、0.5〜5、または5〜50mg/kgであり得る。各種の抗体は、1日当たり1〜4回(1日当たり1回または2回など)のレジメンで投与され得るものの、抗体は典型的には、インビボで長期の半減期を有する。したがって、各種の抗体は、1日1回、1週間に1回、2もしくは3週間に1回、1ヶ月に1回、または60〜90日に1回投与され得る。

0065

異なる身体の部分、特にリンパ節内へのがんの拡散について患者を試験することによって、抗AGE抗体の投与を受ける対象を検査して、がんの治療が有効であるかどうかを決定し得る。生検内視鏡検査法血液検査、または画像診断検査(X線もしくはCTスキャンなど)などの、任意の好適な診断試験を使用することができる。診断検査はまた、検出のための抗AGE抗体も含み得る。抗体の投与及び後続する検査は、所望される治療結果が達成されるまで反復されてもよい。同様に、対象を検査して、新生物の大きさの減少または消失によって潜在的悪性新生物の治療が有効であるかどうかを決定し得る。

0066

単位投与量形態(unit dosage form)を作製して、投与及び投薬量均一性を促進することができる。単位投与量形態は、治療される対象への単回投薬量として適した物理的に別々の単位を指し、これは、必要な薬学的担体に関連して治療有効量の1つ以上の種類の抗体を含有する。好ましくは、単位投与量形態は密閉容器内にあり、かつ無菌である。

0067

転移性がんを発症し得る任意の哺乳動物が、本明細書に記載される方法によって治療され得る。ヒトは、治療に好ましい哺乳動物である。治療され得る他の哺乳動物としては、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、及び伴侶動物(イヌまたはネコなど)が挙げられる。治療を必要とする対象は、がんの診断によって特定され得る。転移を特に受けやすいがんとしては、肺癌、黒色腫、結腸癌腎細胞癌前立腺癌子宮頚癌膀胱癌直腸癌食道癌肝臓癌口腔癌及び咽喉癌、多発性骨髄腫卵巣癌、ならびに胃癌が挙げられる。治療は、転移性がんを経験する患者のものであり得る。がんを有するが、いかなる転移も特定される前である患者に治療を与えて、転移を予防することもできる。同様に、潜在的悪性新生物を発症し得る任意の哺乳動物が、本明細書に記載される方法によって治療され得る。ヒトは、治療に好ましい哺乳動物である。治療され得る他の哺乳動物としては、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、及び伴侶動物(イヌまたはネコなど)が挙げられる。治療を必要とする対象は、潜在的悪性新生物の診断によって特定され得る。

0068

特に好ましい治療群としては、手術放射線療法、または化学療法などの従来のがん治療を受けることができない対象が挙げられる。転移性がんを有するか、またはがん転移のリスクにある患者は、他の診断、健康状態、または合併症のために特定のがん治療を受けることができない可能性がある。例えば、妊娠している女性は、胎児を害するリスクのために放射線療法を受けることができない。老齢または衰弱した患者(癌性悪液質を経験する患者など)は、侵襲的手順を生き延びないリスクのために手術には良好な候補ではない可能性がある。多くの化学療法薬物は免疫系を害するため、免疫不全または慢性感染症を既に有する患者は、化学療法を受けることができない可能性がある。

0069

抗AGE抗体は、免疫パニング及び免疫吸着などの細胞精製プロセスにおいて使用されてもよい。精製プロセスは、望ましい細胞または望まれない細胞を、組織培養細胞培養、または血液から単離する上で有用である。細胞精製は、骨髄移植などの移植または輸血などの輸注において有用であり得る。細胞精製は、転移性悪性細胞を除去し、有益な幹細胞濃縮するための化学療法中の自家幹細胞移植において特に有用である。抗AGE抗体を使用する免疫パニング及び免疫吸着は、転移性がんを、組織培養、細胞培養、または血
試料から単離し得る。

0070

抗AGE抗体はまた、がん転移を診断するために使用することもできる。AGE修飾タンパク質を発現する転移性がん細胞に結合した抗AGE抗体を含む免疫複合体(抗体−抗原複合体としても知られる)は、転移性がんを予想するか、または示すことができる特有の分析物である。抗AGE抗体の転移性がん細胞への特異的結合は、無症候レベルでのがん転移の検出を可能にし得る。診断用抗AGE抗体を使用して、新たな場所での転移のリスクを提起する、循環転移性がん細胞を検出することができる。あるいは、診断用抗AGE抗体を使用して、特定の場所から得た細胞を転移性がん細胞の存在について検査することができる。生検は、リンパ節、肝臓、脳、もしくは骨などの転移性がん細胞の蓄積のリスクが知られている特定の身体の部分から、または疑わしいしこりなどの他の症状のために転移が疑われる身体の部分から細胞を採取することを伴い得る。抗AGE抗体は、対象となる分析物を検出するために抗体を用いる任意の診断方法において使用されてもよい。例えば、免疫複合体は、蛍光標識もしくは放射標識などの標識を抗体に付着させた後、好適な画像技術を使用して、免疫蛍光法フローサイトメトリー、もしくは標識細胞分取FACS)などの細胞学的技術を使用して、免疫測定法、特に酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)、ウェスタンブロット法、もしくは免疫沈殿法などの生化学的技術を使用して、または免疫パニングなどの細胞精製技術を使用して検出され得る。

0071

図2は、がん転移を診断するためのキット200を示す。キットは、抗AGE抗体210と、対照220と、任意で、抗AGE抗体を検出するための試薬230とを含み得る。抗AGE抗体、対照、及び任意の試薬は、ビン、アンプル、エンベロープ試験管、バイアル、フラスコ、またはシリンジなどの任意の好適な容器内に提供され得る。抗AGE抗体及び/または試薬は任意で、蛍光標識、放射標識、または金粒子などで標識され得る。対照は、二次抗体が作製された動物に由来する正常な血清、既知の量のAGE修飾タンパク質もしくはペプチドを含有する溶液、またはAGE修飾を呈する固定もしくは保存細胞であり得る。抗AGE抗体を検出するための試薬の例としては、ロバにおいて作製され、ローダミンで標識された抗ヒトポリクローナル抗体などの二次抗体が挙げられる。キットは任意で、容器240内に収容され得る。キットは任意で、印刷された説明書250を含み得る。好ましくは、キットの内容物は無菌であり、使用準備ができている。

0072

キットは任意で、キット成分を収容するための容器を含み得る。容器は、プラスチックなどの強固で耐久性のある材料から形成されても、袋または側面が柔らかい箱などのように柔軟であってもよい。

0073

キットは任意で、使用説明書を含み得る。説明書は、印刷された説明書として、または電子形式ユニバーサルシリアルバス(USB)ドライブ上、セキュアデジタルカード(SD)カード上など)で提供されても、インターネット上にホストされ、クイックレスポンス(QR)コードを通してアクセス可能であってもよい。

0074

キットは任意で、緩衝液、固定液、遮断溶液、プロテアーゼ阻害剤分析用基質顕微鏡スライドガラス及び/またはカバーガラスなど)、マイクロタイタープレート、ならびに細胞抽出試薬洗剤及び洗剤溶液など)などの追加の診断材料または機器を含有し得る。

0075

配列番号1に対応する1文字表記のアミノ酸配列を、以下に示す。

0076

上記のアミノ酸配列の16〜133位は、配列番号2に対応する。上記のアミノ酸配列の46〜50位は、配列番号41に対応する。上記のアミノ酸配列の65〜81位は、配列番号42に対応する。上記のアミノ酸配列の114〜122位は、配列番号43に対応する。

0077

配列番号3に対応する1文字表記のアミノ酸配列を、以下に示す。

0078

上記のアミノ酸配列の16〜128位は、配列番号4に対応する。任意で、配列番号4の128位のアルギニン(ArgまたはR)残基は、省略され得る。上記のアミノ酸配列の39〜54位は、配列番号44に対応する。上記のアミノ酸配列の70〜76位は、配列番号45に対応する。上記のアミノ酸配列の109〜117位は、配列番号46に対応する。

0079

配列番号12に対応するDNA配列を、以下に示す。

0080

配列番号13に対応するDNA配列を、以下に示す。

0081

配列番号14に対応するDNA配列を、以下に示す。

0082

配列番号15に対応するDNA配列を、以下に示す。

0083

配列番号16に対応する1文字表記のアミノ酸配列を、以下に示す。

0084

上記のアミノ酸配列の123位のアラニン残基は任意で、セリン残基で置換され得る。上記のアミノ酸配列の124位のチロシン残基は任意で、フェニルアラニン残基で置換され得る。上記のアミノ酸配列の25〜142位は、配列番号20に対応する。配列番号20は任意で、123及び124位に置換を含み得る。配列番号20は任意で、末端バリン残基の後に1つの追加のリジン残基を含有し得る。

0085

配列番号17に対応する1文字表記のアミノ酸配列を、以下に示す。

0086

配列番号18に対応する1文字表記のアミノ酸配列を、以下に示す。

0087

上記のアミノ酸配列の21〜132位は、配列番号21に対応する。

0088

配列番号19に対応する1文字表記のアミノ酸配列を、以下に示す。

0089

配列番号22に対応する1文字表記のアミノ酸配列を、以下に示す。

0090

配列番号23に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、SYTMGVSである。

0091

配列番号24に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、TISSGGGSTYYPDSVKGである。

0092

配列番号25に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、QGGWLPFAXであり、Xは、任意の天然に存在するアミノ酸であり得る。

0093

配列番号26に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、RASSVSTSSRGYSYMHである。

0094

配列番号27に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、LVSNLESである。

0095

配列番号28に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、QHIRELTRSである。

0096

配列番号29に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0097

配列番号30に対応するDNA配列は、


である。

0098

配列番号31に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0099

配列番号32に対応するDNA配列は、


である。

0100

配列番号33に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0101

配列番号34に対応するDNA配列は、


である。

0102

配列番号35に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0103

配列番号36に対応するDNA配列は、


である。

0104

配列番号37に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0105

配列番号38に対応するDNA配列は、


である。

0106

配列番号39に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0107

配列番号40に対応するDNA配列は、


である。

0108

配列番号47に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0109

配列番号48に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0110

配列番号49に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0111

配列番号50に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0112

配列番号51に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0113

配列番号52に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0114

配列番号53に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0115

配列番号54に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0116

配列番号55に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0117

配列番号56に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0118

配列番号57に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0119

配列番号58に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0120

配列番号59に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0121

配列番号60に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0122

配列番号61に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0123

配列番号62に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0124

配列番号63に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0125

配列番号64に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0126

配列番号65に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0127

配列番号66に対応する1文字表記のアミノ酸配列は、


である。

0128

実施例1:抗最終糖化産物抗体の投与のインビボ研究。この実施例は、抗AGE抗体が細胞表面上にAGE修飾タンパク質を有する細胞を標的とし得ることを示す。この研究において考慮される細胞は老化細胞であるものの、それらは、転移性がん細胞のモデルと見なされ得る。

0129

抗最終糖化産物抗体の効果を試験するために、老齢のCD1(ICR)マウス(Charles River Laboratories)に抗体を3週間にわたって1週間に1回(1、8、及び15日目)、1日2回、静脈内注射によって投与し、その後、10週間の無治療期間を続けた。検査抗体は、キーホールリンペットヘモシアニンに接合したカルボキシメチルリジンに対して産生された市販のマウス抗最終糖化産物抗体、つまりR&D Systems,Inc.(Minneapolis,MN、カタログ番号MAB3247)から入手可能なカルボキシメチルリジンMAb(クローン318003)であった。生理食塩水の対照参照を、対照動物において使用した。

0130

若年」と称されるマウスは、生後8週間である一方で、「老齢」と称されるマウスは、生後88週間(±2日)であった。抗体の投与によるいかなる有害事象も認められなかった。研究において使用される異なる動物群を、表1に示す。

0131

0132

老化細胞のマーカーであるP16INK4amRNAを、群の脂肪組織中で実時間qPCRによって定量化した。結果を、表2に示す。表において、ΔΔCt=ΔCt平均対照群(2)−ΔCt平均実験群(1または3または5)であり、倍発現=2−ΔΔCtである。

0133

0134

上記の表は、予想通り、未治療老齢マウス(対照群2)が未治療の若年マウス(対照群1)よりも2.55倍多いp16Ink4amRNAを発現することを示す。これは、回復85日目の終了時に安楽死させた群2の未治療の老齢マウスを、治療22日目の終了時に安楽死させた群1の未治療の若年マウスと比較したときに観察された。群2の未治療の老齢マウスの結果を、85日目に安楽死させた群3の治療した老齢マウスの結果と比較したとき、p16Ink4a mRNAは群3におけるよりも群2において1.23倍高いことが観察された。したがって、p16Ink4amRNA発現のレベルは、老齢マウスを2.5μg/グラム/1日2回/週の抗体で治療したときにより低かった。

0135

群2(対照)の未治療の老齢マウスの結果を、22日目に安楽死させた群5(5μg/グラム)の治療した老齢マウスの結果と比較したとき、p16Ink4amRNAは群5(5μg/グラム)におけるよりも群2(対照)において3.03倍高いことが観察された。この比較は、群5の動物を5.0μg/グラム/1日2回/週で治療したとき、未治療の若年マウス(すなわち、群1)と同等のp16Ink4amRNA発現レベルを示し、群5の動物がより低いレベルのp16Ink4a mRNA発現を有することを示した。回復85日目の終了時に安楽死させた群3(2.5μg/グラム)のマウスとは異なり、群5のマウスは、治療22日目の終了時に安楽死させた。

0136

これらの結果は、抗体投与が老化細胞の殺傷をもたらしたことを示す。

0137

腓腹筋の質量もまた測定して、筋肉減少症に対する抗体投与の効果を決定した。結果を、表3に示す。結果は、抗体の投与が対照と比較して筋肉質量を増加させたが、これは5.0μg/グラム/1日2回/週でのより高い投薬量でのみそのようであったことを示す。

0138

0139

これらの結果は、細胞のAGEに結合する抗体の投与が、老化のバイオマーカーであるp16Ink4aを発現する細胞の減少をもたらしたことを実証する。データは、老化細胞の減少が、老齢マウスにおいて筋肉質量の増加を直接もたらすことを示す。これらの結果は、筋肉減少症の典型的な徴候である筋肉質量の減少を、細胞のAGEに結合する抗体の投与によって治療することができることを示す。結果は、抗体の投与が、老化細胞を除去することによって、がん転移を治療する上で有効であることを示唆する。

0140

実施例2:検査抗体の親和性及び動態

0141

実施例1において使用した検査抗体の親和性及び動態を、細胞のAGE修飾タンパク質のモデル基質としてNα,Nα−ビス(カルボキシメチル)−L−リジントリフルオロ酢酸塩(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO)を使用して分析した。ブランクとしてFc1セットを有する、及び検査抗体で固定化したFc2(150,000Daの分子量)を有するSeries SセンサーチップCM5(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)を使用して、BIACORE(商標)T200(GE Healthcare,Pittsburgh,PA)で無標識相互作用分析を実行した。泳動緩衝液は、25℃の温度のHBS−EP緩衝液(10mMのHEPES、150mMのNaCl、3mMのEDTA、及び0.05%のP−20、7.4のpH)であった。ソフトウェアは、BIACORE(商標)T200評価ソフトウェアバージョン2.0であった。二重参照(Fc2−1及び緩衝液注射のみ)を分析において使用し、データをラングミュア1:1結合モデルフィットさせた。

0142

0143

応答対時間のグラフを、図1に示す。分析から以下の値を決定した。ka(1/Ms)=1.857×103、kd(1/s)=6.781×10−3、KD(M)=3.651×10−6、Rmax(RU)=19.52、及びChi2=0.114。フィッティングのChi2値はRmaxの10%未満であるため、フィットは信頼できるものである。

0144

実施例3:マウス抗AGEIgG2b抗体及びキメラ抗AGE IgG1抗体の構築及び産生

0145

マウス及びキメラヒト抗AGE抗体を調製した。マウス抗AGE抗体IgG2b重鎖のDNA配列を、配列番号12に示す。キメラヒト抗AGE抗体IgG1重鎖のDNA配列を、配列番号13に示す。マウス抗AGE抗体カッパ軽鎖のDNA配列を、配列番号14に示す。キメラヒト抗AGE抗体カッパ軽鎖のDNA配列を、配列番号15に示す。遺伝子配列を合成し、高発現哺乳動物ベクター内にクローニングした。配列をコドン最適化した。完成した構築物を配列確認してから、トランスフェクションへと進行した。

0146

トランスフェクションの1日前に、HEK293細胞を振盪フラスコ内に播種し、無血清合成培地を使用して成長させた。DNA発現構築物を、0.03リットルの懸濁液HEK293細胞内に一過的にトランスフェクトした。20時間後、細胞を試料採取して、生存率及び生存細胞数を得、力価を測定した(Octet QKe,ForteBio)。一過的トランスフェクション産生実行を通して、追加の読み取りを取得した。5日目に培養物を収集し、細胞密度、生存率、及び力価について各々の追加の試料を測定した。

0147

マウス及びキメラ抗AGE抗体の馴化培地を収集し、遠心分離及び濾過によって一過的トランスフェクション産生実行から浄化した。上清をタンパク質Aカラムに流し、低pH緩衝液溶出させた。0.2μmの膜フィルターを使用して濾過を実行してから、アリコートした。精製及び濾過の後、OD280からタンパク質濃度及び消衰係数を計算した。収率及びアリコートの要約を、表5に示す。

0148

0149

LabChip(登録商標)GXII(PerkinElmer)を使用して、キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム(CE−SDS)分析によって、抗体純度を評価した。

0150

実施例4:マウス(親)及びキメラ抗AGE抗体の結合

0151

実施例3に記載されるマウス(親)及びキメラ抗AGE抗体の結合を、直接結合ELISAによって調査した。抗カルボキシメチルリジン(CML)抗体(R&D Systems、MAB3247)を、対照として使用した。CMLをKLH(CML−KLH)に接合させ、CML及びCML−KLHの両方をELISAプレート上に一晩コーティングした。HRPヤギ抗マウスFcを使用して、対照及びマウス(親)抗AGE抗体を検出した。HRPヤギ抗ヒトFcを使用して、キメラ抗AGE抗体を検出した。

0152

抗原を、1×リン酸緩衝液(pH6.5)中、1μg/mLに希釈した。96ウェルマイクロタイターELISAプレートを、100μL/ウェルの希釈した抗原でコーティングし、4℃で一晩放置した。プレートを1×PBS、2.5%のBSAで遮断し、翌室温で1〜2時間放置した。50μg/mLの開始濃度で、1×PBS、1%のBSAでの段階希釈抗体試料を調製した。二次抗体を1:5,000に希釈した。100μLの抗体希釈物を各ウェルに適用した。マイクロプレート振盪機で、プレートを室温で0.5〜1時間インキュベートした。プレートを1×PBSで3回洗浄した。100μL/ウェルの希釈したHRP接合ヤギ抗ヒトFc二次抗体を、各ウェルに適用した。マイクロプレート振盪機で、プレートを1時間インキュベートした。その後、プレートを1×PBSで3回洗浄した。100μLのHRP基質TMBを各ウェルに添加して、プレートを展開した。3〜5分間が経過した後、100μLの1NのHClを添加することによって反応を終了させた。第2の直接結合ELISAを、CMLコーティングのみで実行した。マイクロプレートリーダーを使用して、OD450での吸光度を読み取った。

0153

CML及びCML−KLHELISAのOD450吸光度の生データを、以下のプレートマップに示す。ウェルプレート中、96個のウェルのうち48個を使用した。プレートマップ中のブランクウェルは、未使用のウェルを示す。

0154

CML及びCML−KLHELISAのプレートマップ:

0155

CMLのみのELISAのOD450吸光度の生データを、以下のプレートマップに示す。ウェルプレート中、96個のウェルのうち24個を使用した。プレートマップ中のブランクウェルは、未使用のウェルを示す。

0156

CMLのみのELISAのプレートマップ:

0157

対照及びキメラ抗AGE抗体は、CML及びCML−KLHの両方への結合を示した。マウス(親)抗AGE抗体は、CMLまたはCML−KLHのいずれかへの非常に弱い結合〜無結合を示した。反復したELISAのデータは、対照及びキメラ抗AGEのCMLへの結合を確認する。全ての緩衝液対照は、負のシグナルを示した。

0158

実施例5:ヒト化抗体

0159

親(マウス)抗体配列の選択部分をヒトフレームワーク配列と融合する複数のハイブリッド配列を作り出すことによって、ヒト化抗体を設計した。そのフレームワークにわたる全体的配列同一性、マッチする界面位置、同様に分類されるCDR正準位置、及び除去されなくてはならないN−グリコシル化部位の存在に基づいて、アクセプターフレームワークを特定した。2つの異なる重鎖及び軽鎖ヒトアクセプターフレームワークに基づいて、3つのヒト化軽鎖及び3つのヒト化重鎖を設計した。重鎖のアミノ酸配列を配列番号29、31、及び33に示し、これらはそれぞれ配列番号30、32、及び34に示されるDNA配列によってコードされる。軽鎖のアミノ酸配列を配列番号35、37、及び39に示し、これらはそれぞれ配列番号36、38、及び40に示されるDNA配列によってコードされる。ヒト化配列を目測及びコンピュータモデル化によって系統的に分析して、抗原結合を保持する可能性が最も高い配列を単離した。この目的は、元の抗体特異性を保持しながら、最終ヒト化抗体におけるヒト配列の量を最大化することであった。ヒト化軽鎖及び重鎖を組み合わせて、9つのバリアントの完全ヒト化抗体を作り出すことができた。

0160

3つの重鎖及び3つの軽鎖を分析して、それらのヒト化度(humanness)を決定した。抗体ヒト化度スコアは、Gao,S.H.,et al.,“Monoclonal antibody humanness score and its appl
ications”,BMCBiotechnology,13:55(2013年7月5日)に記載される方法に従って計算した。ヒト化度スコアは、抗体可変領域配列がいかにヒトらしく見えるかを表す。重鎖では、79以上のスコアがヒトらしく見えることを示し、軽鎖では、86以上のスコアがヒトらしく見えることを示す。3つの重鎖、3つの重鎖、親(マウス)重鎖、及び親(マウス)軽鎖のヒト化度を、以下の表6に示す。

0161

0162

まず可変領域配列を合成することによって、完全長抗体遺伝子を構築した。配列を、哺乳動物細胞内での発現に最適化した。その後、これらの可変領域配列を、既にヒトFcドメインを含有する発現ベクター内にクローニングした(重鎖には、IgG1を使用した)。

0163

血清の不在下で合成培地を使用して、重鎖及び軽鎖のプラスミドを懸濁液HEK293細胞にトランスフェクトすることによって、ヒト化抗体の小規模の産生を実行した。MabSelect SuReタンパク質A培地(GE Healthcare)を使用して、馴化培地内の全抗体を精製した。

0164

配列番号29、31、及び33に示されるアミノ酸配列を有する3つの重鎖と、配列番号35、37、及び39に示されるアミノ酸配列を有する3つの軽鎖との各組み合わせから、9つのヒト化抗体を産生した。比較キメラ親抗体もまた調製した。抗体及びそれらのそれぞれの力価を、以下の表7に示す。

0165

0166

ヒト化抗体の結合は、例えば、用量依存的結合ELISAまたは細胞ベース結合アッセイによって評価することができる。

0167

実施例6(予言):転移性がん細胞の殺傷、及び転移性がんの治療

0168

ヒト卵巣癌細胞(Creative BioArray,Shirley,NY)の凝集体を、2つの群(A及びB)のT及びB細胞欠乏prkdcscid(SCID)マウス、具体的にはJackson Laboratories(Farmington,CT)から入手可能なNSGマウスの腹腔内に植え付ける。群Aは、生理食塩水が静脈内注射される対照群であり、群Bは、1匹のマウス当たり1グラム当たり5μgの記載される抗AGEモノクローナル抗体のうちのいずれかが静脈内注射される。

0169

がん細胞の植え付けの80日後、群A及びBの両方のマウスは、肉眼及び組織学的試験を受ける。抗体で治療した群Bのマウスは、群Aの対照マウスよりも有意に少ない転移性病巣を有する。

0170

実施例6:カルボキシメチルリジンモノクローナル抗体の投与のインビボ研究

0171

腫瘍成長、転移能、及び悪液質に対するカルボキシメチルリジン抗体の効果を調査した。マウス乳癌腫瘍モデルを使用して、マウスにおいてインビボ研究を実行した。雌のBALB/cマウス(BALB/cAnNCrl、Charles River)は、研究の1日目の時点で生後11週間であった。

0172

4T1マウス乳腺腫瘍細胞(ATCCCRL−2539)を、10%のウシ胎仔血清、2mMのグルタミン、25μg/mLのゲンタマイシン、100単位/mLのペニシリンGNa、及び100μg/mLの硫酸ストレプトマイシンを含有するRPMI1640培地中で培養した。腫瘍細胞を、5%のCO2及び95%の空気の雰囲気中、37℃の加湿インキュベーター内の組織培養フラスコ内に維持した。

0173

その後、培養した乳癌細胞をマウス内に移植した。対数期成長中に4T1細胞を収集し、移植日に1×106個の細胞/mLの濃度でリン酸緩衝食塩水(PBS)中に再懸濁した。1×105個の4T1細胞(0.1mLの懸濁液)を各検査動物の右側腹部に皮下移
植することによって、腫瘍を引き起こした。腫瘍の体積が80〜120mm3の標的範囲に接近するにつれて、それらをモニターした。式、腫瘍体積=(腫瘍幅)2(腫瘍長さ)/2を使用して、腫瘍体積を決定した。1mm3の腫瘍体積が1mgの重量を有するという想定を使用して、腫瘍重量概算した。移植の13日後(研究1日目と指定)、個々の腫瘍体積が108〜126mm3の範囲、及び群平均腫瘍体積が112mm3で、マウスを4つの群(n=15/群)に選別した。4つの治療群を、以下の表8に示す。

0174

0175

抗カルボキシメチルリジンモノクローナル抗体を、治療剤として使用した。250mgのカルボキシメチルリジンモノクローナル抗体を、R&D Systems(Minneapolis,MN)から得た。カルボキシメチルリジンモノクローナル抗体の投薬溶液を、ビヒクル(PBS)中1及び0.5mg/mLで調製して、10mL/kgの投薬体積中それぞれ10及び5μg/gの活性投薬量を用意した。投薬溶液を光から保護して4℃で保管した。

0176

全ての治療は、マウスに1回用量を投与した研究1日目を除いて、21日間にわたって1日2回静脈内(i.v.)投与した。研究19日目に、尾静脈劣化のために静脈内投薬できない動物について、静脈内投薬を腹腔内(i.p.)投薬に変更した。投薬体積は、20グラムの体重当たり0.200mL(10mL/kg)であり、個々の各動物の体重に調整した。

0177

この研究を23日間継続した。ノギスを使用して、腫瘍を1週間に2回測定した。1〜5日目は動物を毎日、その後、研究完了まで1週間に2回量した。あらゆる副作用についても、マウスを観察した。許容される毒性は、研究中の20%未満の群平均の体重減少かつ10%以下の治療関連死と定義された。研究最終日(23日目)のデータを使用して、治療有効性を決定した。

0178

群1〜3の腫瘍体積中央値MTV)を比較することによって、抗カルボキシメチルリジン抗体が腫瘍成長を阻害する能力を決定した。腫瘍体積は、上述のように測定した。腫瘍成長阻害パーセント(TGI%)は、対照群のMTVのパーセンテージとして表される、対照群(群1)のMTVと薬物治療した群のMTVとの差と定義された。%TGIは、式、%TGI=(1−MTV治療/MTV対照)×100に従って計算することができる。図3は、腫瘍成長、転移能、及び悪液質に対する抗AGE抗体の効果を調査するインビボ研究の過程を通した、正規化した腫瘍体積のグラフを示す。

0179

群1〜3の肺癌病巣を比較することによって、抗カルボキシメチルリジン抗体ががん転移を阻害する能力を決定した。阻害パーセント(阻害%)は、対照群の転移性病巣の平均数のパーセンテージとして表される、対照群の転移性病巣の平均数と、薬物治療した群の転移性病巣の平均数との差と定義された。阻害%は、以下の式、阻害%=(1−病巣の平
均数治療/病巣の平均数対照)×100に従って計算することができる。

0180

群1〜3の肺及び腓腹筋の重量を比較することによって、抗カルボキシメチルリジン抗体が悪液質を阻害する能力を決定した。組織重量もまた、100gの体重に正規化した。図4は、腫瘍成長、転移能、及び悪液質に対する抗AGE抗体の効果を調査するインビボ研究の過程を通した、正規化したマウスの体重のグラフを示す。

0181

治療有効性を、研究中に観察された退縮応答の発生率及び規模によってもまた評価した。治療は、動物において腫瘍の部分的な退縮(PR)または完全な退縮(CR)を引き起こし得る。PR応答において、腫瘍体積は、研究の過程中、3回の連続する測定にわたってその1日目の体積の50%以下、かつこれら3回の測定のうちの1つ以上について13.5mm3以上であった。CR応答において、腫瘍体積は、研究の過程中、3回の連続する測定にわたって13.5mm3未満であった。

0182

Windows6.07用Prism(GraphPad)を使用して、統計学的分析を実行した。マンホイットニーU検定を使用して、2つの群の23日目の平均腫瘍体積(MTV)の差の統計学的分析を達成した。転移性病巣の比較を、ダネット分散分析によって評価した。正規化した組織重量を、分散分析によって比較した。有意水準P=0.05で、両側の統計学的分析を実行した。統計学的に有意であるもの、または統計学的に有意ではないものとして、結果を分類した。

0183

研究の結果を、以下の表9に示す。

0184

0185

全ての治療レジメンは、いかなる治療関連死もなく、許容された。唯一の動物死は、転移による非治療関連死であった。TGI%は、5μg/g(群2)及び10μg/gの治療群(群3)について有意性への傾向(P>0.05、マンホイットニー)を示した。阻害%は、5μg/gの治療群について有意性への傾向(P>0.05、ダネット分散分析)を示した。阻害%は、10μg/gの治療群について統計学的に有意(P≦0.01、ダネット分散分析)であった。カルボキシメチルリジン抗体が悪液質を治療する能力は、治療群と対照群との間の肺及び腓腹筋の器官重量の比較に基づいて、有意性への傾向(P>0.05、分散分析)を示した。結果は、抗カルボキシメチルリジンモノクローナル抗
体の投与が、がん転移を減少させることができることを示す。

0186

実施例7:転移性がんの診断(仮想

0187

乳癌を有する患者は、腫大したリンパ節を呈する。腫瘍学者は、乳癌が彼のリンパ節に転移していることを疑う。腫瘍学者は、彼女の腫大したリンパ節のうちの1つから血液試料及び生検を得る。蛍光標識抗AGE抗体及び対照を含有するキットを使用して、血液試料及び生検からの細胞を、AGE修飾がん細胞の存在について検査する。診断検査は、患者の血液中に循環AGE修飾がん細胞の存在を、及びリンパ節内に転移性乳癌細胞の存在を示す。MillerらのUS7,541,150に記載されるように、周知のがんマーカーである細胞表面ヌクレオリンについての第2の細胞染色は、癌性細胞の存在を確認する。

実施例

0188

参考文献
1.Gruberらの国際出願公開第WO2009/143411号(2009年11月26日)。
2.Bucalaらの米国特許第5,702,704号(1997年12月30日発行)。
3.Al−Abedらの米国特許第6,380,165号(2002年4月30日発行)。
4.Wrightらの米国特許第6,387,373号(2002年5月14日発行)。
5.Vanlerbergheらの米国特許第4,217,344号(1980年8月12日発行)。
6.Wallachの米国特許第4,917,951号(1990年4月17日発行)。
7.Wallachの米国特許第4,911,928号(1990年3月27日発行)。
8.Smithらの米国特許出願公開第US2010/226932号(2010年9月9日)。
9.Ando K,et al.,“Membrane Proteins of Human Erythrocytes Are Modified by Advanced Glycation End Products During Aging in theCirculation,”Biochemical and Biophysical Research Communications,Vol.258,123−27(1999)。
10.LindseyJB,et al.,“Receptor For Advanced Glycation End−Products(RAGE)and soluble RAGE(sRAGE):Cardiovascular Implications,”Diabetes Vascular Disease Research,Vol.6(1),7−14,(2009)。
11.Bierhaus A,“AGEs and their interaction with AGE−receptors in vascular disease and diabetes mellitus. I.The AGE concept,”Cardiovasc Res,Vol.37(3),586−600 (1998)。
12.Meuter A.,et al.“Markers of cellular
senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro:molecular consequences of culture in atmospheric oxygen
”J Assist Reprod Genet.2014Aug10.[印刷前オンライン先行公開]。
13.Baker,D.J.et al.,“Clearance of p16Ink4a−positive senescent cells delays ageing−associated disorders”,Nature,vol.479,pp.232−236,(2011)。
14.Jana Hadrabova,et al.“Chicken immunoglobulins for prophylaxis:Effect of inhaled antibodies on inflammatory parameters in rat airways”Journal of Applied Biomedicine(印刷中、2014年5月5日オンライン入手可能)。
15.Vlassara,H.et al.,“High−affinity−receptor−mediated Uptake and Degradation of
Glucose−modified Proteins:A Potential Mechanism for the Removal of Senescent Macromolecules”,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.82,5588,5591(1985)。
16.Roll,P.et al.,“Anti−CD20Therapy in Patients with Rheumatoid Arthritis”,Arthritis&Rheumatism,Vol.58,No.6,1566−1575(2008)。
17.Kajstura,J.et al.,“Myocite Turnover in the Aging Human Heart”,Circ. Res.,Vol.107(11),1374−86,(2010)。
18.de Groot,K.et al.,“Vascular Endothelial Damage and Repair in Antineutrophil Cytoplasmic Antibody−Associated Vasculitis”,Arthritis and Rheumatism,Vol.56(11),3847,3847(2007)。
19.Manesso,E.et al.,“Dynamics of β−Cell
Turnover:Evidence for β−Cell Turnover and Regeneration from Sources of β−Cellsotherthan β−cell Replication in theHIP
Rat”,Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.,Vol.297,E323,E324(2009)。
20.Kirstein,M.et al.,“Receptor−specific
Induction of Insulin−like Growth Factor
I in Human Monocytes by Advanced Glycosylation End Product−modified Proteins”,J.Clin.Invest.,Vol.90,439,439−440(1992)。
21.Murphy,J.F.,“Trends in cancer immunotherapy”,Clinical Medical Insights:Oncology,Vol.14(4),67−80(2010)。
22.Virella,G.et al.,“Autoimmune Response to Advanced Glycosylation End−Products
of Human LDL”,Journal of Lipid Research,Vol.44,487−493(2003)。
23.Ameli,S.et al.,“Effect of Immunization With Homologous LDL and Oxidized LDL on Early Atherosclerosis in Hypercholest
erolemic Rabbits”,Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology,Vol.16,1074(1996)。
24.“Sarcopenia”、en.wikipedia.org/wiki/Sarcopeniaでオンライン入手可能(2014年11月14日)。
25.“What is sarcopenia?”、www.iofbonehealth.org/what−sarcopeniaでオンライン入手可能(2014年)。
26.Blahd,W.,“Sarcopenia with aging”、www.webmd.com/healthy−aging/sarcopenia−with−agingでオンライン入手可能(2014年8月3日)。
27.“Keyhole limpet hemocyanin”、en.wikipedia.org/wiki/Keyhole_limpet_hemocyaninでオンライン入手可能(2014年4月18日)。
28.“CML−BSA Product Data Sheet”、www.cellbiolabs.com/sites/default/files/STA−314−cml−bsa.pdfでオンライン入手可能(2010年)。
29.“CML(N−epsilon−(Carboxymethyl)Lysine)Assays and Reagents、www.cellbiolabs.com/cml−assaysでオンライン入手可能(2014年12月15日アクセス)。
30.Cruz−Jentoft,A.J.et al.,“Sarcopenia:European consensus on definition and diagnosis”,Age and Ageing,Vol.39,pp.412−423(April13,2010)。
31.Rolland,Y.et al.,“Sarcopenia:its assessment,etiology,pathogenesis,consequences and future perspectives”,J.Nutr.Health Aging,Vol.12(7),pp.433−450(2008)。
32.Mera,K.et al.,“An autoantibody against Nε−(carboxyethyl)lysine(CEL):Possible
involvement in the removal of CEL−modified proteins by macrophages”,Biochemical
and Biophysical Research Communications,Vol.407,pp.420−425(March12,2011)。
33.Reddy,S.et al.,“Nε−(carboxymethyl)lysine is a dominant advanced glycation end product(AGE)antigen in tissue proteins”,Biochemistry,Vol.34,pp.10872−10878(August1,1995)。
34.Naylor,R.M.et al.,“Senescent cells:a
novel therapeutic target for aging and age−related diseases”,Clinical Pharmacology&Therapeutics,Vol.93(1),pp.105−116(December5,2012)。
35.Katcher,H.L.,“Studies that shed new light on aging”,Biochemistry(Moscow),Vol.78(9),pp.1061−1070(2013)。
36.Ahmed,E.K.et al.,“Protein Modification and Replicative Senescence of WI−38Human Embryonic Fibroblasts”,Aging Cells,V
ol.9,252,260(2010)。
37.Vlassara,H.et al.,“Advanced Glycosylation Endproducts on Erythrocyte Cell Surface Induce Receptor−Mediated Phagocytosis by Macrophages”,J.Exp.Med.,Vol.166,539,545(1987)。
38.Fielding,R.A.,et al.,“Sarcopenia:an undiagnosed condition in older adults.Current consensus definition:prevalence,etiology,and consequences”,Journal of the American Medical Directors Association,Vol.12(4),pp.249−256(May2011)。
39.Maass,D.R.et al.,“Alpaca(Lama pacos)as a convenient source of recombinant camelid heavy chain antibodies(VHHs)”,Journal of Immunological Methods,Vol.324,No.1−2,pp.13−25(July31,2007)。
40.Strietzel,C.J.et al.,“In vitro functional characterization of felineIgGs”,Veterinary Immunology and Immunopathology,Vol.158,pp.214−223(2014)。
41.Patel,M.et al.,“Sequence of the dog immunoglobulin alpha and epsilon constant region genes”,Immunogenetics,Vol.41,pp.282−286(1995)。
42.Wagner,B.et al.,“The complete map of
theIgheavy chain constant gene region
reveals evidence for seven IgG isotypes
and forIgDin the horse”,The Journal of Immunology,Vol.173,pp.3230−3242(2004)。
43.Hamers−Casterman,C.et al.,“Naturally
occurring antibodies devoid of light chains”,Nature,Vol.363,pp. 446−448(June3,1993)。
44.De Genst,E.et al.,“Antibody repertoire development in camelids”,Developmental&Comparative Immunology,Vol.30,pp.187−198(2005年7月11日オンライン入手可能)。
45.Griffin,L.M.et al.,“Analysis of heavy and light chain sequences of conventional camelid antibodies from Camelus dromedarius and Camelus bactrianus species”,Journal of Immunological Methods,Vol.405,pp.35−46(2014年1月18日オンライン入手可能)。
46.Nguyen,V.K.et al.,“Camel heavy−chain
antibodies:diverse germline VHH and specific mechanisms enlarge the antigen−binding repertoire”,The European Molecular Biology Organization Journal,Vol.19,No,5,pp.921−930(2000)。
47.Muyldermans,S.et al.,“Sequence and structure of VH domain fromnaturally occurring camel heavy chain immunoglobulins
lacking light chains”,Protein Engineering,Vol.7,No.9,pp.1129−1135(1994)。

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