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技術 腫瘍学関連タンパク質およびペプチドの産生のための修飾ポリヌクレオチド

出願人 モデルナティエックスインコーポレイテッド
発明者 バンセル、ステファヌチャクラボルティ、ティルタドゥフジェローレ、アントニンエルバシール、セイダエム.ジョン、マティアスロイ、アタヌホリスキー、スーザンウッド、クリスティエム.ハタラ、ポールシュラム、ジェイソンピー.エジェベ、ケネチエルスワース、ジェフリンギルド、ジャスティン
出願日 2020年5月20日 (9ヶ月経過) 出願番号 2020-088048
公開日 2020年10月1日 (4ヶ月経過) 公開番号 2020-158508
状態 未査定
技術分野 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 化合物または医薬の治療活性 突然変異または遺伝子工学 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬
主要キーワード 構造質量 均質薄膜 えくぼ 研磨デバイス 係留物 負電荷イオン 大気組成 ペルフルオロ炭素
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2020年10月1日)のものです。
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図面 (4)

課題

腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次転写物、及び腫瘍学関連mmRNA分子組成物、並びに、これらの調製、製造、及び治療的使用の方法の提供。

解決手段

目的の腫瘍学関連ポリペプチドのレベルを高めることにより、疾患、障害、及び/又は状態の治療を必要とする対象の前記疾患、障害、及び/又は状態を治療する方法であって、前記腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを前記対象に投与することを含む方法。

概要

背景

癌は、身体内コントロール不良の細胞分裂および増殖で特徴づけられる疾患である。
アメリカでは、全ての女性のおおよそ3分の1及び全ての男性のおおよそ2分の1が、生
涯において癌を経験するであろう。ポリペプチド癌細胞生物学(発癌細胞周期抑制、
DNA修復および血管新生)、治療(免疫療法ホルモン操作、酵素阻害)、癌の種類の診
断および判定(例えば乳癌前立腺癌結腸癌および子宮頸癌のための分子マーカー)を含
む疾患の各諸点に関与する。今日使用される化学療法および放射線療法等の標準治療によ
って引き起こされた望ましくない結果の宿主に対し、疾患関連ペプチドの操作のための遺
伝子治療は、疾患の診断、治療および管理へのより的を絞ったアプローチを提供する。

この目的を達成するために、本発明者らは、ある特定の修飾mRNA配列が、単に免疫
応答を逃れるか、回避するか、または低減させるだけではない利点を有する治療薬として
の可能性を有することを示した。そのような研究は、公開された同時係属出願である、2
011年8月5日出願の国際出願第PCT/US2011/046861号および201
1年10月3日出願の同第PCT/US2011/054636号、2011年10月3
日出願の国際出願第PCT/US2011/054617号に詳述されており、これらの
内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードし、当技術分野における課題の
うちの1つ以上を回避する構造的および/または化学的特徴を有する核酸化合物または
ポリヌクレオチドをコードする核酸系化合物(例えば、修飾mRNAまたはmmRNA)
を提供することによって、この必要性に対処する。

発明の概要
少なくとも1つの目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする修飾mRNA(mm
RNA)分子組成、少なくとも1つの目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする
修飾mRNA(mmRNA)分子の設計、調製、製造、および/または製剤化方法、プロ
セス、キット、ならびにデバイスが本明細書に記載される。

本発明は、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドのレベルを高めることにより、疾患、障
害、および/または状態の治療を必要とする対象の疾患、障害、および/または状態を治
療する方法であって、腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを対象
投与することを含む方法を提供する。疾患、障害、および/または状態は、副腎皮質
進行癌肛門癌、再生不良性貧血胆管癌膀胱癌骨癌骨転移脳腫瘍、脳癌、乳
癌、小児癌原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸直腸癌子宮内膜癌、食
道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌消化管カルチノイド消化管間質腫瘍妊娠性
毛疾患ホジキン病カポジ肉腫腎細胞癌喉頭癌と下咽頭癌急性リンパ性白血病
急性骨髄性白血病慢性リンパ性白血病慢性骨髄性白血病慢性骨髄単球性白血病、肝
癌、非小細胞肺癌小細胞肺癌カルチノイド腫瘍、皮膚リンパ腫悪性中皮腫、多発
骨髄腫骨髄異形成症候群鼻腔癌と副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキン
リンパ腫、口腔癌中咽頭癌骨肉腫卵巣癌膵癌陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、
網膜芽細胞腫横紋筋肉腫唾液腺癌、成人軟部組織肉腫基底細胞癌扁平上皮癌、メ
ラノーマ、小腸癌、胃癌睾丸癌、咽頭癌胸腺癌甲状腺癌子宮肉腫癌、外陰
、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症ウィルムス腫瘍、および癌治療に起因
する二次癌を含み得るが、これに限定されない。

本発明は、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドのレベルを高めることにより、腫瘍の増
殖の減少、排除または予防を必要とする対象の腫瘍の増殖を減少、排除または予防する方
法であって、腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを対象に投与す
ることを含む方法を提供する。腫瘍の増殖は、副腎皮質癌、進行癌、肛門癌、再生不良性
貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、脳腫瘍、脳癌、乳癌、小児癌、原発不明癌、キャ
スルマン病、子宮頸癌、結腸/直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、
胆嚢癌、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛疾患、ホジキン病、カポジ
腫、腎細胞癌、喉頭癌と下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ
白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌
、肺カルチノイド腫瘍、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、
鼻腔癌と副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌と中咽頭癌、
骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾
腺腫、成人軟部組織肉腫、基底細胞癌と扁平上皮癌、メラノーマ、小腸癌、胃癌、睾丸
癌、咽頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレーム型マク
ログロブリン血症、ウィルムス腫瘍および癌治療に起因する二次癌等の疾患、障害、およ
び/または状態と関連するかあるいはこれらに起因するが、これに限定されない。

本発明は、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドのレベルを高めることにより、少なくと
も1つの癌症状の軽減および/または寛解を必要とする対象の少なくとも1つの癌症状を
軽減および/または寛解させる方法であって、腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離
ポリヌクレオチドを対象に投与することを含む方法を提供する。

本発明は、結合ヌクレオシドの第1の領域を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。第
1の領域は、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする。第1の領域の5’末端
位置する第1の隣接領域は、配列番号4704〜9203、配列番号1〜4、およびその
機能的変異形のうちのいずれかの天然5’非翻訳領域からなる群から選択される結合ヌク
レオシドの配列を含む。第1の領域の3’末端に位置する第2の隣接領域は、配列番号4
704〜9203、配列番号5〜21、およびその機能的変異形のうちのいずれかの天然
3’UTRからなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列と、結合ヌクレオシドの3
尾部配列とを含む。さらに、単離ポリヌクレオチドは実質的に精製されうる。

さらに、本発明の単離ポリヌクレオチドの第1の領域は、2つの停止コドンを含み得る
。一実施形態では、第1の領域はさらに、第1の停止コドン「TGA」と、「TAA」、
「TGA」および「TAG」からなる群から選択される第2の停止コドンとを含む。

本発明の単離ポリヌクレオチドの3’尾部配列は、約130個のヌクレオチドポリ
A尾部と、ポリA〜G四重項等の結合ヌクレオシドとをさらに含み得るが、これに限定さ
れない。

単離ポリヌクレオチドの第1の隣接領域は、Cap0、Cap1、ARCAイノシン
、N1−メチルグアノシン、2’フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8
オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、および2−アジ
ド−グアノシン等の少なくとも1つの5’末端キャップをさらに含み得るが、これに限定
されない。

本発明の単離ポリヌクレオチドのヌクレオチドは、少なくとも2つの修飾と、翻訳可能
な領域とを含み得る。修飾は、少なくとも1つのヌクレオシドおよび/または当該ヌクレ
オチドの骨格上、あるいはヌクレオシドおよび骨格結合の両方、あるいはヌクレオシドの
糖に存在し得る。修飾は、少なくとも1つのホスホジエステル結合ホスホロチオエート
結合に置換することを含み得る。修飾は、ピリジン−4−オンリボヌクレオシド、5−ア
ザ−ウリジン、2−チオ−5−アザ−ウリジン、2−チオウリジン、4−チオ−シュー
ウリジン、2−チオ−シュードウリジン、5−ヒドロキシウリジン、3−メチルウリジン
、5−カルボキシメチル−ウリジン、1−カルボキシメチル−シュードリジン、5−プロ
ニル−ウリジン、1−プロピニル−シュードウリジン、5−タウリノメチルウリジン、
1−タウリノメチル−シュードウリジン、5−タウリノメチル−2−チオウリジン、1−
タウリノメチル−4−チオ−ウリジン、5−メチル−ウリジン、1−メチルシュードウ
ジン、4−チオ−1−メチルシュードウリジン、2−チオ−1−メチルシュードウリジン
、1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−シ
ュードウリジンジヒドロウリジンジヒドロシュードウリジン、2−チオ−ジヒドロウ
リジン、2−チオ−ジヒドロシュードウリジン、2−メトキシウリジン、2−メトキシ−
4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−シュードウリジン、4−メトキシ−2−チオ−シュ
ードウリジン、5−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、3−メチルシチジン、N4
アセチルシチジン、5−ホルミルシチジン、N4−メチルシチジン、5−ヒドロキシメ
ルシチジン、1−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュー
ドイソシチジン、2−チオ−シチジン、2−チオ−5−メチルシチジン、4−チオ−シュ
ードイソシチジン、4−チオ−1−メチル−シュードイソシチジン、4−チオ−1−メチ
ル−1−デアザ−シュードイソシチジン、1−メチル−1−デアザ−シュードイソシチジ
ン、ゼブラリン、5−アザ−ゼブラリン、5−メチル−ゼブラリン、5−アザ−2−チオ
−ゼブラリン、2−チオ−ゼブラリン、2−メトキシ−シチジン、2−メトキシ−5−メ
チルシチジン、4−メトキシ−シュードイソシチジン、4−メトキシ−1−メチル−シュ
ードイソシチジン、2−アミノプリン、2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−アデニン
、7−デアザ−8−アザ−アデニン、7−デアザ−2−アミノプリン、7−デアザ−8−
アザ−2−アミノプリン、7−デアザ−2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−8−アザ
−2,6−ジアミノプリン、1−メチルアデノシン、N6−メチルアデノシン、N6−イ
ペンテニルアデノシン、N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2
メチルチオ−N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6−グリ
ニルカルバモイルアデノシン、N6−スレオニルカルバモイルアデノシン、2−メチルチ
オ−N6−スレオニルカルバモイルアデノシン、N6,N6−ジメチルアデノシン、7−
メチルアデニン、2−メチルチオ−アデニン、2−メトキシ−アデニン、イノシン、1−
メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、7−デアザ−グアノシン、7−デアザ−
8−アザ−グアノシン、6−チオ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−グアノシン、6
−チオ−7−デアザ−8−アザ−グアノシン、7−メチル−グアノシン、6−チオ−7−
メチル−グアノシン、7−メチルイノシン、6−メトキシ−グアノシン、1−メチルグア
ノシン、N2−メチルグアノシン、N2,N2−ジメチルグアノシン、8−オキソ−グア
ノシン、7−メチル−8−オキソ−グアノシン、1−メチル−6−チオ−グアノシン、N
2−メチル−6−チオ−グアノシン、およびN2,N2−ジメチル−6−チオ−グアノ
ンを含み得るが、これに限定されない。骨格結合は、1つ以上の酸素原子の置換により修
飾され得る。修飾される核酸塩基は、シトシングアニン、アデニン、チミンおよびウラ
シルから選択され得るが、これに限定されない。

本発明の単離ポリヌクレオチドは製剤化され得る。製剤は、DLin−DMA、DLi
n−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、DLi
n−MC3−DMA、PLGA、PEG、PEG−DMG、ペグ化脂質、およびそれらの
合物を含む脂質を含み得るが、これに限定されない。

本発明の単離ポリヌクレオチドは、1日合計0.001ugないし150ugの用量で
投与され得る。投与は注射、局所投与、眼投与および鼻腔内投与により行われ得る。注射
は皮内、皮下、および筋肉内を含み得るが、これに限定されない。局所投与は、クリーム
ローション軟膏ゲルスプレー溶液等であり得るが、これに限定されない。局所
投与は、界面活性物質脂肪酸胆汁酸塩キレート化剤非キレート非界面活性剤
ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−20−セチルエーテ
ル、胆汁酸および/または塩類を含有する脂肪酸および/または塩類、ラウリン酸、カプ
リン酸およびUDCAを含有するナトリウム塩等の浸透促進剤をさらに含み得るが、これ
に限定されない。

単離ポリヌクレオチド製剤は、溶媒水性溶媒非水溶媒分散媒希釈剤分散剤
懸濁助剤表面活性剤等張剤、増粘剤または乳化剤防腐剤、脂質、リピドイドリポ
ーム、脂質ナノ粒子コアシェルナノ粒子ポリマーリポプレックス、ペプチド、タン
パク質、細胞ヒアルロニダーゼ、およびこれらの混合物等の薬学的に許容される賦形剤
をさらに含み得るが、これに限定されない。

本発明の様々な実施形態の詳細が、以下の発明を実施するための形態において説明され
る。本発明の他の特徴、目的、および利点は、発明を実施するための形態および図面、な
らびに特許請求の範囲から明らかになる。

前述および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面に図示されるように、本発明の
特定の実施形態の以下の記述から明らかになり、その図面において、同様の参照文字は、
異なる図面を通して同一の部分を指す。図面は、必ずしも原寸に比例しておらず、むしろ
、本発明の様々な実施形態の原理を例示説明することに重点が置かれている。

概要

腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次転写物、及び腫瘍学関連mmRNA分子の組成物、並びに、これらの調製、製造、及び治療的使用の方法の提供。目的の腫瘍学関連ポリペプチドのレベルを高めることにより、疾患、障害、及び/又は状態の治療を必要とする対象の前記疾患、障害、及び/又は状態を治療する方法であって、前記腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを前記対象に投与することを含む方法。なし

目的

今日使用される化学療法および放射線療法等の標準治療によ
って引き起こされた望ましくない結果の宿主に対し、疾患関連ペプチドの操作のための遺
伝子治療は、疾患の診断、治療および管理へのより的を絞ったアプローチを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

目的の腫瘍学関連ポリペプチドのレベルを高めることにより、疾患、障害、および/または状態の治療を必要とする対象の前記疾患、障害、および/または状態を治療する方法であって、前記腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを前記対象に投与することを含む方法。

請求項2

目的の腫瘍学関連ポリペプチドのレベルを高めることにより、少なくとも1つの癌症状の軽減および/または寛解を必要とする対象の前記少なくとも1つの癌症状を軽減および/または寛解させる方法であって、前記腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを前記対象に投与することを含む方法。

請求項3

前記少なくとも1つの癌症状は腫瘍の増殖である、請求項2に記載の方法。

請求項4

請求項5

前記腫瘍の増殖は、副腎皮質癌、進行癌、肛門癌、再生不良性貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、脳腫瘍、脳癌、乳癌、小児癌、原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸/直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛疾患、ホジキン病、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭癌と下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺カルチノイド腫瘍、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、鼻腔癌と副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌と中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、成人軟部組織肉腫、基底細胞癌と扁平上皮癌、メラノーマ、小腸癌、胃癌、睾丸癌、咽頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、ウィルムス腫瘍、および癌治療に起因する二次癌からなる群から選択される疾患、障害、および/または状態に起因する、請求項3に記載の方法。

請求項6

前記単離ポリヌクレオチドの投与は、対象の癌細胞を減少させ、癌細胞を排除し、癌細胞の増加を予防し、および/または癌の症状を緩和する、請求項1または2のいずれかに記載の方法。

請求項7

前記少なくとも1つの癌症状は、衰弱うずきと痛み、発熱、疲労、体重減少血餅、血中カルシウム濃度の上昇、白血球数の低下、息切れ眩暈頭痛色素沈着過剰黄疸紅斑掻痒症多毛症排便習慣の変化、膀胱機能の変化、長続きするただれ口腔内白斑白点、異常な出血または排出、身体部位肥厚またはしこり消化不良嚥下困難いぼまたはほくろの変化、新しい皮膚の変化およびしつこい、または嗄声からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。

請求項8

前記単離ポリヌクレオチドは製剤化される、請求項1または2に記載の方法。

請求項9

前記製剤は、DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、DLin−MC3−DMA、PLGA、PEG、PEG−DMG、ペグ化脂質、およびそれらの混合物のうちの1つから選択される脂質を含む、請求項8に記載の方法。

請求項10

前記単離ポリヌクレオチドは、1日合計0.001ugないし150ugの用量で投与される、請求項9に記載の方法。

請求項11

注射、局所投与、眼投与および鼻腔内投与によって投与が行われる、請求項10に記載の方法。

請求項12

注射によって投与が行われ、前記注射は、皮内、皮下、および筋肉内からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。

請求項13

投与が局所投与であり、前記局所投与は、クリームローション軟膏ゲルスプレー溶液等からなる群から選択される、請求項12に記載の方法。

請求項14

前記局所投与は浸透促進剤をさらに含む、請求項13に記載の方法。

請求項15

前記浸透促進剤は、界面活性物質脂肪酸胆汁酸塩キレート化剤非キレート非界面活性剤ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−20−セチルエーテル胆汁酸および/または塩類を含有する脂肪酸および/または塩類、ラウリン酸カプリン酸およびUDCAを含有するナトリウム塩等からなる群から選択される、請求項14に記載の方法。

請求項16

(a)結合ヌクレオシドの第1の領域であって、前記第1の領域は、配列番号4704〜9203からなる群から選択される目的の腫瘍学関連ポリペプチドをコードする、結合ヌクレオシドの第1の領域と、(b)前記第1の領域の5’末端に位置する第1の隣接領域であって、(i)配列番号4704〜9203、配列番号1〜4、およびそれらの機能的変異形のうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかの天然5’非翻訳領域(UTR)からなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列を含む、第1の隣接領域と、(c)前記第1の領域の3’末端に位置する第2の隣接領域であって、(i’)配列番号4704〜9203、配列番号5〜21、およびそれらの機能的変異形のうちのいずれかをコードする核酸のうちのいずれかの天然3’UTRからなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列と、(ii’)結合ヌクレオシドの3’尾部配列とを含む、第2の隣接領域とを含む単離ポリヌクレオチド。

請求項17

前記結合ヌクレオシドの前記第1の領域は、核酸配列の少なくとも1つのオープンリーディングフレームを含み、前記核酸配列は、配列番号4667〜4703および9204〜33882からなる群から選択される、請求項16に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項18

前記第1の領域は2つの停止コドンをさらに含む、請求項16に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項19

前記第1の領域は、第1の停止コドン「TGA」と、「TAA」、「TGA」および「TAG」からなる群から選択される第2の停止コドンとをさらに含む、請求項16に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項20

前記結合ヌクレオシドの3’尾部配列は、約160個のヌクレオチドポリA尾部と、ポリA〜G四重項とからなる群から選択される、請求項16に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項21

第1の隣接領域は少なくとも1つの5’末端キャップをさらに含む、請求項16に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項22

前記少なくとも1つの5’末端キャップは、キャップ0、キャップ1、ARCAイノシン、N1−メチルグアノシン、2’フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、および2−アジド−グアノシンからなる群から選択される、請求項21に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項23

前記単離ポリヌクレオチドは実質的に精製される、請求項16〜22のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項24

前記ヌクレオチドは、少なくとも2つの修飾と、翻訳可能な領域とを含む、請求項16〜22のいずれか一項に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項25

前記修飾は、1つ以上のヌクレオシドおよび/または前記ヌクレオチドの骨格上に位置する、請求項24に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項26

前記修飾は、ヌクレオシドおよび骨格結合の両方の上に位置する、請求項25に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項27

前記修飾は骨格結合上に位置する、請求項25に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項28

前記骨格結合は、1つ以上の酸素原子置換により修飾される、請求項27に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項29

前記修飾は、少なくとも1つのホスホジエステル結合ホスホロチオエート結合に置換することを含む、請求項27に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項30

前記修飾はヌクレオシド上に位置する、請求項25に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項31

前記修飾は前記ヌクレオシドの糖に存在する、請求項27に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項32

前記修飾は、ピリジン−4−オンリボヌクレオシド、5−アザウリジン、2−チオ−5−アザ−ウリジン、2−チオウリジン、4−チオ−シュードウリジン、2−チオ−シュードウリジン、5−ヒドロキシウリジン、3−メチルウリジン、5−カルボキシメチル−ウリジン、1−カルボキシメチル−シュードウリジン、5−プロピニル−ウリジン、1−プロピニル−シュードウリジン、5−タウリノメチルウリジン、1−タウリノメチル−シュードウリジン、5−タウリノメチル−2−チオウリジン、1−タウリノメチル−4−チオ−ウリジン、5−メチル−ウリジン、1−メチルシュードウリジン、4−チオ−1−メチルシュードウリジン、2−チオ−1−メチルシュードウリジン、1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、ジヒドロウリジンジヒドロシュードウリジン、2−チオ−ジヒドロウリジン、2−チオ−ジヒドロシュードウリジン、2−メトキシウリジン、2−メトキシ−4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−シュードウリジン、4−メトキシ−2−チオ−シュードウリジン、5−アザ−シチジンシューイソシチジン、3−メチル−シチジン、N4−アセチルシチジン、5−ホルミルシチジン、N4−メチルシチジン、5−ヒドロキシメチルシチジン、1−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュードイソシチジン、2−チオ−シチジン、2−チオ−5−メチル−シチジン、4−チオ−シュードイソシチジン、4−チオ−1−メチル−シュードイソシチジン、4−チオ−1−メチル−1−デアザ−シュードイソシチジン、1−メチル−1−デアザ−シュードイソシチジン、ゼブラリン、5−アザ−ゼブラリン、5−メチル−ゼブラリン、5−アザ−2−チオ−ゼブラリン、2−チオ−ゼブラリン、2−メトキシ−シチジン、2−メトキシ−5−メチル−シチジン、4−メトキシ−シュードイソシチジン、4−メトキシ−1−メチル−シュードイソシチジン、2−アミノプリン、2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−アデニン、7−デアザ−8−アザ−アデニン、7−デアザ−2−アミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2−アミノプリン、7−デアザ−2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−8−アザ−2,6−ジアミノプリン、1−メチルアデノシン、N6−メチルアデノシン、N6−イソペンテニルアデノシン、N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2−メチルチオ−N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6−グリニルカルバモイルアデノシン、N6−スレオニルカルバモイルアデノシン、2−メチルチオ−N6−スレオニルカルバモイルアデノシン、N6,N6−ジメチルアデノシン、7−メチルアデニン、2−メチルチオ−アデニン、2−メトキシ−アデニン、イノシン、1−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、7−デアザ−グアノシン、7−デアザ−8−アザ−グアノシン、6−チオ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−8−アザ−グアノシン、7−メチル−グアノシン、6−チオ−7−メチル−グアノシン、7−メチルイノシン、6−メトキシ−グアノシン、1−メチルグアノシン、N2−メチルグアノシン、N2,N2−ジメチルグアノシン、8−オキソ−グアノシン、7−メチル−8−オキソ−グアノシン、1−メチル−6−チオ−グアノシン、N2−メチル−6−チオ−グアノシン、およびN2,N2−ジメチル−6−チオ−グアノシンからなる群から選択される、請求項30に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項33

前記修飾は核酸塩基上に位置する、請求項25に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項34

前記核酸塩基上の前記修飾は、シトシングアニン、アデニン、チミンおよびウラシルからなる群から選択される、請求項33に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項35

前記単離ポリヌクレオチドは製剤化される、請求項16に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項36

前記製剤は、DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、DLin−MC3−DMA、PLGA、PEG、PEG−DMG、ペグ化脂質、およびそれらの混合物のうちの1つから選択される脂質を含む、請求項35に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項37

前記単離ポリヌクレオチドは、1日合計0.001ugないし150ugの用量で投与される、請求項36に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項38

注射、局所投与、眼投与および鼻腔内投与によって投与が行われる、請求項37に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項39

注射によって投与が行われ、前記注射は、皮内、皮下、および筋肉内からなる群から選択される、請求項38に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項40

投与が局所投与であり、前記局所投与は、クリーム、ローション、軟膏、ゲル、スプレー、溶液等からなる群から選択される、請求項39に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項41

前記局所投与は浸透促進剤をさらに含む、請求項40に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項42

前記浸透促進剤は、界面活性物質、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、非キレート性非界面活性剤、ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−20−セチルエーテル、胆汁酸および/または塩類を含有する脂肪酸および/または塩類、ラウリン酸、カプリン酸およびUDCAを含有するナトリウム塩等からなる群から選択される、請求項41に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項43

薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項16に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項44

前記薬学的に許容される賦形剤は、溶媒水性溶媒非水溶媒分散媒希釈剤分散剤、懸濁助剤表面活性剤等張剤、増粘剤または乳化剤防腐剤、脂質、リピドイドリポソーム脂質ナノ粒子コアシェルナノ粒子ポリマーリポプレックスペプチドタンパク質細胞ヒアルロニダーゼ、およびこれらの混合物からなる群から選択される、請求項43に記載の単離ポリヌクレオチド。

請求項45

腫瘍学関連組成物は脂質をさらに含み、前記脂質は、DLin−DMA、DLin−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、DLin−MC3−DMA、PLGA、PEG、PEG−DMG、ペグ化脂質、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項44に記載の単離ポリヌクレオチド。

技術分野

0001

配列表の参照
本出願は、配列表とともに電子書式で出願されている。MNC2_20SQLST.t
xtと題される配列表ファイルは、2013年3月9日に作成され、91,363,88
バイトの大きさである。この配列表の電子書式での情報は、参照によりその全体が組み
込まれる。

0002

関連出願の相互参照
本出願は、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,742号、表
題「Modified Polynucleotides for the Produ
ction of Oncology−Related Proteins and P
eptides」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,22
4号、表題「Terminally Optimized Modified RNAs
」、2012年12月14日出願の国際出願第PCT/US2012/069610号、
表題「Modified Nucleoside,Nucleotide,and Nu
cleic Acid Compositions」、2012年4月2日出願の米国仮
特許出願第61/618,862号、表題「Modified Polynucleot
ides for the Production of Biologics」、20
12年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,645号、表題「Modifi
ed Polynucleotides for the Production of
Biologics」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737
,130号、表題「Modified Polynucleotides for th
e Production of Biologics」、2012年4月2日出願の米
国仮特許出願第61/618,866号、表題「Modified Polynucle
otides for the Production of Antibodies」
、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,647号、表題「Mod
ified Polynucleotides for the Production
of Antibodies」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第61
/737,134号、表題「Modified Polynucleotides fo
r the Production of Antibodies」、2012年4月2
日出願の米国仮特許出願第61/618,868号、表題「Modified Poly
nucleotides for the Production of Vaccin
es」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,648号、表題「
Modified Polynucleotides for the Product
ion of Vaccines」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第6
1/737,135号、表題「Modified Polynucleotides f
or the Production of Vaccines」、2012年4月2日
出願の米国仮特許出願第61/618,870号、表題「Modified Polyn
ucleotides for the Production of Therape
utic Proteins and Peptides」、2012年8月10日出願
の米国仮特許出願第61/681,649号、表題「Modified Polynuc
leotides for the Production of Therapeut
ic Proteins and Peptides」、2012年12月14日出願の
米国仮特許出願第61/737,139号、表題「Modified Polynucl
eotides for the Production of Therapeuti
c Proteins and Peptides」、2012年4月2日出願の米国仮
特許出願第61/618,873号、表題「Modified Polynucleot
ides for the Production of Secreted Prot
eins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,650号、表
題「Modified Polynucleotides for the Produ
ction of Secreted Proteins」、2012年12月14日出
願の米国仮特許出願第61/737,147号、表題「Modified Polynu
cleotides for the Production of Secreted
Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,87
8号、表題「Modified Polynucleotides for the P
roduction of Plasma Membrane Proteins」、2
012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,654号、表題「Modif
ied Polynucleotides for the Production o
f Plasma Membrane Proteins」、2012年12月14日出
願の米国仮特許出願第61/737,152号、表題「Modified Polynu
cleotides for the Production of Plasma M
embrane Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61
/618,885号、表題「Modified Polynucleotides fo
r the Production of Cytoplasmic and Cyto
skeletal Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第
61/681,658号、表題「Modified Polynucleotides
for the Production of Cytoplasmic and Cy
toskeletal Proteins」、2012年12月14日出願の米国仮特許
出願第61/737,155号、表題「Modified Polynucleotid
es for the Production of Cytoplasmic and
Cytoskeletal Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特
許出願第61/618,896号、表題「Modified Polynucleoti
des for the Production of Intracellular
Membrane Bound Proteins」、2012年7月5日出願の米国仮
特許出願第61/668,157号、表題「Modified Polynucleot
ides for the Production of Intracellular
Membrane Bound Proteins」、2012年8月10日出願の米
国仮特許出願第61/681,661号、表題「Modified Polynucle
otides for the Production of Intracellul
ar Membrane Bound Proteins」、2012年12月14日出
願の米国仮特許出願第61/737,160号、表題「Modified Polynu
cleotides for the Production of Intracel
lular Membrane Bound Proteins」、2012年4月2日
出願の米国仮特許出願第61/618,911号、表題「Modified Polyn
ucleotides for the Production of Nuclear
Proteins」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/681,6
67号、表題「Modified Polynucleotides for the
Production of Nuclear Proteins」、2012年12月
14日出願の米国仮特許出願第61/737,168号、表題「Modified Po
lynucleotides for the Production of Nucl
ear Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618
,922号、表題「Modified Polynucleotides for th
e Production of Proteins」、2012年8月10日出願の米
国仮特許出願第61/681,675号、表題「Modified Polynucle
otides for the Production of Proteins」、2
012年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,174号、表題「Modi
fied Polynucleotides for the Production
of Proteins」、2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,
935号、表題「Modified Polynucleotides for the
Production of Proteins Associated with
Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮特許出願第61/6
81,687号、表題「Modified Polynucleotides for
the Production of Proteins Associated wi
th Human Disease」、2012年12月14日出願の米国仮特許出願第
61/737,184号、表題「Modified Polynucleotides
for the Production of Proteins Associate
d with Human Disease」、2012年4月2日出願の米国仮特許出
願第61/618,945号、表題「Modified Polynucleotide
s for the Production of Proteins Associa
ted with Human Disease」、2012年8月10日出願の米国仮
特許出願第61/681,696号、表題「Modified Polynucleot
ides for the Production of Proteins Asso
ciated with Human Disease」、2012年12月14日出願
の米国仮特許出願第61/737,191号、表題「Modified Polynuc
leotides for the Production of Proteins
Associated with Human Disease」、2012年4月2日
出願の米国仮特許出願第61/618,953号、表題「Modified Polyn
ucleotides for the Production of Protein
s Associated with Human Disease」、2012年8月
10日出願の米国仮特許出願第61/681,704号、表題「Modified Po
lynucleotides for the Production of Prot
eins Associated with Human Disease」、2012
年12月14日出願の米国仮特許出願第61/737,203号、表題「Modifie
d Polynucleotides for the Production of
Proteins Associated with Human Disease」、
2012年4月2日出願の米国仮特許出願第61/618,961号、表題「Dosin
g Methodsfor ModifiedmRNA」、2012年5月17日出
願の米国仮特許出願第61/648,286号、表題「Dosing Methods
for Modified mRNA」に対する優先権を主張するものであり、これら各
々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

0003

本出願は、2012年10月3日出願の国際公開第PCT/US2012/58519
号、表題「Modified Nucleosides,Nucleotides,an
d Nucleic Acids,and Uses Thereof」、および201
2年12月14日出願の国際公開第PCT/US2012/69610号、表題「Mod
ified Nucleoside,Nucleotide,and Nucleic
Acid Compositions」にも関連する。

0004

本出願は、同時係属出願にも関連し、それぞれ、2013年3月9日に本出願と共に同
時に出願され、表題「Modified Polynucleotides for t
he Production of Biologics and Proteins
Associated with Human Disease」の代理人整理番号M3
00.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynu
cleotides」の代理人整理番号M301.20(PCT/US13/XXXXX
)、表題「Modified Polynucleotides for the Pr
oduction of Secreted Proteins」の代理人整理番号M3
04.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynu
cleotides for the Production of Secreted
Proteins」の代理人整理番号304.20(PCT/US13/XXXXX)
、表題「Modified Polynucleotides for the Pro
duction of Membrane Proteins」の代理人整理番号M30
5.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynuc
leotides for the Production of Cytoplasm
ic and Cytoskeletal Proteins」の代理人整理番号M30
6.20(PCT/US13/XXXXX)、表題「Modified Polynuc
leotides for the Production of Nuclear P
roteins」の代理人整理番号M308.20(PCT/US13/XXXXX)、
表題「Modified Polynucleotides for the Prod
uction of Proteins」の代理人整理番号M309.20(PCT/U
S13/XXXXX)、表題「Modified Polynucleotides f
or the Production of Proteins Associated
with Human Disease」の代理人整理番号M310.20(PCT/
US13/XXXXX)、および表題「Modified Polynucleotid
es for the Production of Cosmetic Protei
ns and Peptides」の代理人整理番号MNC1.20(PCT/US13
/XXXXX)を有し、これら各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込ま
れる。

0005

発明の分野
本発明は、腫瘍学関連ポリヌクレオチド、一次構築物、および修飾mRNA分子(mm
RNA)の組成、これらの設計、調製、製造、および/または製剤化の方法、プロセス、
キット、ならびにデバイスに関する。

背景技術

0006

癌は、身体内コントロール不良の細胞分裂および増殖で特徴づけられる疾患である。
アメリカでは、全ての女性のおおよそ3分の1及び全ての男性のおおよそ2分の1が、生
涯において癌を経験するであろう。ポリペプチド癌細胞生物学(発癌細胞周期抑制、
DNA修復および血管新生)、治療(免疫療法ホルモン操作、酵素阻害)、癌の種類の診
断および判定(例えば乳癌前立腺癌結腸癌および子宮頸癌のための分子マーカー)を含
む疾患の各諸点に関与する。今日使用される化学療法および放射線療法等の標準治療によ
って引き起こされた望ましくない結果の宿主に対し、疾患関連ペプチドの操作のための遺
伝子治療は、疾患の診断、治療および管理へのより的を絞ったアプローチを提供する。

0007

この目的を達成するために、本発明者らは、ある特定の修飾mRNA配列が、単に免疫
応答を逃れるか、回避するか、または低減させるだけではない利点を有する治療薬として
の可能性を有することを示した。そのような研究は、公開された同時係属出願である、2
011年8月5日出願の国際出願第PCT/US2011/046861号および201
1年10月3日出願の同第PCT/US2011/054636号、2011年10月3
日出願の国際出願第PCT/US2011/054617号に詳述されており、これらの
内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。

0008

本発明は、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードし、当技術分野における課題の
うちの1つ以上を回避する構造的および/または化学的特徴を有する核酸化合物または
ポリヌクレオチドをコードする核酸系化合物(例えば、修飾mRNAまたはmmRNA)
を提供することによって、この必要性に対処する。

0009

発明の概要
少なくとも1つの目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする修飾mRNA(mm
RNA)分子の組成、少なくとも1つの目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする
修飾mRNA(mmRNA)分子の設計、調製、製造、および/または製剤化方法、プロ
セス、キット、ならびにデバイスが本明細書に記載される。

0010

本発明は、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドのレベルを高めることにより、疾患、障
害、および/または状態の治療を必要とする対象の疾患、障害、および/または状態を治
療する方法であって、腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを対象
投与することを含む方法を提供する。疾患、障害、および/または状態は、副腎皮質
進行癌肛門癌、再生不良性貧血胆管癌膀胱癌骨癌骨転移脳腫瘍、脳癌、乳
癌、小児癌原発不明癌、キャッスルマン病、子宮頸癌、結腸直腸癌子宮内膜癌、食
道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、胆嚢癌消化管カルチノイド消化管間質腫瘍妊娠性
毛疾患ホジキン病カポジ肉腫腎細胞癌喉頭癌と下咽頭癌急性リンパ性白血病
急性骨髄性白血病慢性リンパ性白血病慢性骨髄性白血病慢性骨髄単球性白血病、肝
癌、非小細胞肺癌小細胞肺癌カルチノイド腫瘍、皮膚リンパ腫悪性中皮腫、多発
骨髄腫骨髄異形成症候群鼻腔癌と副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキン
リンパ腫、口腔癌中咽頭癌骨肉腫卵巣癌膵癌陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、
網膜芽細胞腫横紋筋肉腫唾液腺癌、成人軟部組織肉腫基底細胞癌扁平上皮癌、メ
ラノーマ、小腸癌、胃癌睾丸癌、咽頭癌胸腺癌甲状腺癌子宮肉腫癌、外陰
、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症ウィルムス腫瘍、および癌治療に起因
する二次癌を含み得るが、これに限定されない。

0011

本発明は、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドのレベルを高めることにより、腫瘍の増
殖の減少、排除または予防を必要とする対象の腫瘍の増殖を減少、排除または予防する方
法であって、腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを対象に投与す
ることを含む方法を提供する。腫瘍の増殖は、副腎皮質癌、進行癌、肛門癌、再生不良性
貧血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨転移、脳腫瘍、脳癌、乳癌、小児癌、原発不明癌、キャ
スルマン病、子宮頸癌、結腸/直腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、眼癌、
胆嚢癌、消化管カルチノイド、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛疾患、ホジキン病、カポジ
腫、腎細胞癌、喉頭癌と下咽頭癌、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ
白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、肝癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌
、肺カルチノイド腫瘍、皮膚リンパ腫、悪性中皮腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、
鼻腔癌と副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、口腔癌と中咽頭癌、
骨肉腫、卵巣癌、膵癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾
腺腫、成人軟部組織肉腫、基底細胞癌と扁平上皮癌、メラノーマ、小腸癌、胃癌、睾丸
癌、咽頭癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレーム型マク
ログロブリン血症、ウィルムス腫瘍および癌治療に起因する二次癌等の疾患、障害、およ
び/または状態と関連するかあるいはこれらに起因するが、これに限定されない。

0012

本発明は、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドのレベルを高めることにより、少なくと
も1つの癌症状の軽減および/または寛解を必要とする対象の少なくとも1つの癌症状を
軽減および/または寛解させる方法であって、腫瘍学関連ポリペプチドをコードする単離
ポリヌクレオチドを対象に投与することを含む方法を提供する。

0013

本発明は、結合ヌクレオシドの第1の領域を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。第
1の領域は、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする。第1の領域の5’末端
位置する第1の隣接領域は、配列番号4704〜9203、配列番号1〜4、およびその
機能的変異形のうちのいずれかの天然5’非翻訳領域からなる群から選択される結合ヌク
レオシドの配列を含む。第1の領域の3’末端に位置する第2の隣接領域は、配列番号4
704〜9203、配列番号5〜21、およびその機能的変異形のうちのいずれかの天然
3’UTRからなる群から選択される結合ヌクレオシドの配列と、結合ヌクレオシドの3
尾部配列とを含む。さらに、単離ポリヌクレオチドは実質的に精製されうる。

0014

さらに、本発明の単離ポリヌクレオチドの第1の領域は、2つの停止コドンを含み得る
。一実施形態では、第1の領域はさらに、第1の停止コドン「TGA」と、「TAA」、
「TGA」および「TAG」からなる群から選択される第2の停止コドンとを含む。

0015

本発明の単離ポリヌクレオチドの3’尾部配列は、約130個のヌクレオチドポリ
A尾部と、ポリA〜G四重項等の結合ヌクレオシドとをさらに含み得るが、これに限定さ
れない。

0016

単離ポリヌクレオチドの第1の隣接領域は、Cap0、Cap1、ARCAイノシン
、N1−メチルグアノシン、2’フルオロ−グアノシン、7−デアザ−グアノシン、8
オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノシン、および2−アジ
ド−グアノシン等の少なくとも1つの5’末端キャップをさらに含み得るが、これに限定
されない。

0017

本発明の単離ポリヌクレオチドのヌクレオチドは、少なくとも2つの修飾と、翻訳可能
な領域とを含み得る。修飾は、少なくとも1つのヌクレオシドおよび/または当該ヌクレ
オチドの骨格上、あるいはヌクレオシドおよび骨格結合の両方、あるいはヌクレオシドの
糖に存在し得る。修飾は、少なくとも1つのホスホジエステル結合ホスホロチオエート
結合に置換することを含み得る。修飾は、ピリジン−4−オンリボヌクレオシド、5−ア
ザ−ウリジン、2−チオ−5−アザ−ウリジン、2−チオウリジン、4−チオ−シュー
ウリジン、2−チオ−シュードウリジン、5−ヒドロキシウリジン、3−メチルウリジン
、5−カルボキシメチル−ウリジン、1−カルボキシメチル−シュードリジン、5−プロ
ニル−ウリジン、1−プロピニル−シュードウリジン、5−タウリノメチルウリジン、
1−タウリノメチル−シュードウリジン、5−タウリノメチル−2−チオウリジン、1−
タウリノメチル−4−チオ−ウリジン、5−メチル−ウリジン、1−メチルシュードウ
ジン、4−チオ−1−メチルシュードウリジン、2−チオ−1−メチルシュードウリジン
、1−メチル−1−デアザ−シュードウリジン、2−チオ−1−メチル−1−デアザ−シ
ュードウリジンジヒドロウリジンジヒドロシュードウリジン、2−チオ−ジヒドロウ
リジン、2−チオ−ジヒドロシュードウリジン、2−メトキシウリジン、2−メトキシ−
4−チオ−ウリジン、4−メトキシ−シュードウリジン、4−メトキシ−2−チオ−シュ
ードウリジン、5−アザ−シチジン、シュードイソシチジン、3−メチルシチジン、N4
アセチルシチジン、5−ホルミルシチジン、N4−メチルシチジン、5−ヒドロキシメ
ルシチジン、1−メチル−シュードイソシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−シュー
ドイソシチジン、2−チオ−シチジン、2−チオ−5−メチルシチジン、4−チオ−シュ
ードイソシチジン、4−チオ−1−メチル−シュードイソシチジン、4−チオ−1−メチ
ル−1−デアザ−シュードイソシチジン、1−メチル−1−デアザ−シュードイソシチジ
ン、ゼブラリン、5−アザ−ゼブラリン、5−メチル−ゼブラリン、5−アザ−2−チオ
−ゼブラリン、2−チオ−ゼブラリン、2−メトキシ−シチジン、2−メトキシ−5−メ
チルシチジン、4−メトキシ−シュードイソシチジン、4−メトキシ−1−メチル−シュ
ードイソシチジン、2−アミノプリン、2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−アデニン
、7−デアザ−8−アザ−アデニン、7−デアザ−2−アミノプリン、7−デアザ−8−
アザ−2−アミノプリン、7−デアザ−2,6−ジアミノプリン、7−デアザ−8−アザ
−2,6−ジアミノプリン、1−メチルアデノシン、N6−メチルアデノシン、N6−イ
ペンテニルアデノシン、N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、2
メチルチオ−N6−(cis−ヒドロキシイソペンテニル)アデノシン、N6−グリ
ニルカルバモイルアデノシン、N6−スレオニルカルバモイルアデノシン、2−メチルチ
オ−N6−スレオニルカルバモイルアデノシン、N6,N6−ジメチルアデノシン、7−
メチルアデニン、2−メチルチオ−アデニン、2−メトキシ−アデニン、イノシン、1−
メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、7−デアザ−グアノシン、7−デアザ−
8−アザ−グアノシン、6−チオ−グアノシン、6−チオ−7−デアザ−グアノシン、6
−チオ−7−デアザ−8−アザ−グアノシン、7−メチル−グアノシン、6−チオ−7−
メチル−グアノシン、7−メチルイノシン、6−メトキシ−グアノシン、1−メチルグア
ノシン、N2−メチルグアノシン、N2,N2−ジメチルグアノシン、8−オキソ−グア
ノシン、7−メチル−8−オキソ−グアノシン、1−メチル−6−チオ−グアノシン、N
2−メチル−6−チオ−グアノシン、およびN2,N2−ジメチル−6−チオ−グアノ
ンを含み得るが、これに限定されない。骨格結合は、1つ以上の酸素原子の置換により修
飾され得る。修飾される核酸塩基は、シトシングアニン、アデニン、チミンおよびウラ
シルから選択され得るが、これに限定されない。

0018

本発明の単離ポリヌクレオチドは製剤化され得る。製剤は、DLin−DMA、DLi
n−K−DMA、DLin−KC2−DMA、98N12−5、C12−200、DLi
n−MC3−DMA、PLGA、PEG、PEG−DMG、ペグ化脂質、およびそれらの
合物を含む脂質を含み得るが、これに限定されない。

0019

本発明の単離ポリヌクレオチドは、1日合計0.001ugないし150ugの用量で
投与され得る。投与は注射、局所投与、眼投与および鼻腔内投与により行われ得る。注射
は皮内、皮下、および筋肉内を含み得るが、これに限定されない。局所投与は、クリーム
ローション軟膏ゲルスプレー溶液等であり得るが、これに限定されない。局所
投与は、界面活性物質脂肪酸胆汁酸塩キレート化剤非キレート非界面活性剤
ポリオキシエチレン−9−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−20−セチルエーテ
ル、胆汁酸および/または塩類を含有する脂肪酸および/または塩類、ラウリン酸、カプ
リン酸およびUDCAを含有するナトリウム塩等の浸透促進剤をさらに含み得るが、これ
に限定されない。

0020

単離ポリヌクレオチド製剤は、溶媒水性溶媒非水溶媒分散媒希釈剤分散剤
懸濁助剤表面活性剤等張剤、増粘剤または乳化剤防腐剤、脂質、リピドイドリポ
ーム、脂質ナノ粒子コアシェルナノ粒子ポリマーリポプレックス、ペプチド、タン
パク質、細胞ヒアルロニダーゼ、およびこれらの混合物等の薬学的に許容される賦形剤
をさらに含み得るが、これに限定されない。

0021

本発明の様々な実施形態の詳細が、以下の発明を実施するための形態において説明され
る。本発明の他の特徴、目的、および利点は、発明を実施するための形態および図面、な
らびに特許請求の範囲から明らかになる。

0022

前述および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面に図示されるように、本発明の
特定の実施形態の以下の記述から明らかになり、その図面において、同様の参照文字は、
異なる図面を通して同一の部分を指す。図面は、必ずしも原寸に比例しておらず、むしろ
、本発明の様々な実施形態の原理を例示説明することに重点が置かれている。

図面の簡単な説明

0023

本発明の腫瘍学関連一次構築物の概略図である。
本発明において有用な先行技術における脂質構造を図示する。98N12−5(TETA5−LAP)、DLin−DMA、DLin−K−DMA(2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキソラン)、DLin−KC2−DMA、DLin−MC3−DMA、およびC12−200の構造を示す。
本明細書に教示されるIVT反応において有用な代表的なプラスミドである。このプラスミドは、本発明者らによって設計された挿入物64818を含有する。
PLGAマイクロスフェアカプセル封入された修飾mRNAのゲルプロファイルである。

0024

治療薬、診断、試薬の分野、および生物学的アッセイにおいて、例えば、核酸の細胞内
翻訳およびコードされた目的とするポリペプチドの産生を引き起こすために、インビトロ
インビボインサイツ、またはエクスビボにかかわらず、細胞内に核酸、例えば、リボ
核酸(RNA)を送達することができることは大変興味深いことである。非組み込みポリ
ヌクレオチドの送達および機能が特に重要である。

0025

1個以上の目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの組成物
薬学的組成物を含む)、ならびにその設計、調製、製造、および/または製剤化方法が
本明細書に記載される。本明細書に記載の目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードす
るポリヌクレオチドを選択、設計、および/または利用するためのシステム、プロセス、
デバイス、およびキットも提供される。

0026

本発明に従って、これらの腫瘍学関連ポリヌクレオチドは、好ましくは、当技術分野の
他のポリペプチドをコードする分子の欠陥を回避するように修飾される。したがって、こ
れらのポリヌクレオチドは、修飾mRNAまたはmmRNAと称される。

0027

抗体、ウイルス獣医学における適用の分野、および様々なインビボ環境における修飾
ポリヌクレオチドの使用が本発明者らによって研究されており、これらの研究は、例えば
、同時係属および共同所有の、mmRNAのインビボ適用を教示する2011年3月31
日出願の米国仮特許出願第61/470,451号;抗体ポリペプチドの産生のために操
作された核酸を教示する2011年4月26日出願の同第61/517,784号;mm
RNA技術の獣医学における適用を教示する2011年5月17日出願の同第61/51
9,158号;mmRNA技術の抗菌剤における適用を教示する2011年9月12日出
願の同第61/533,537号;mmRNA技術のウイルス適用を教示する2011年
9月12日出願の同第61/533,554号;mmRNA技術で用いる様々な化学修飾
を教示する2011年10月3日出願の同第61/542,533号;mmRNA技術の
作製および使用で用いるモバイルデバイスを教示する2011年12月14日出願の同第
61/570,690号;救急治療状況下でのmmRNAの使用を教示する2011年1
2月14日出願の同第61/570,708号;mmRNAの末端修飾構造を教示する2
011年12月16日出願の同第61/576,651号;リピドイドを用いたmmRN
Aの送達方法を教示する2011年12月16日出願の同第61/576,705号;m
mRNAを用いて器官または組織生存率を増加させるための方法を教示する2011年
12月21日出願の同第61/578,271号;細胞透過性ペプチドをコードするmm
RNAを教示する2011年12月29日出願の同第61/581,322号;mmRN
Aへの細胞傷害性ヌクレオシドの組み込みを教示する2011年12月29日出願の同第
61/581,352号;および血液脳関門横断するためにmmRNAを用いる方法を
教示する2012年1月10日出願の同61/631,729号に開示されており、これ
らはすべて、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

0028

組織における安定性および/もしくは排除、受容体の取り込みおよび/もしくは動態
組成物による細胞到達、翻訳機構との関わり、mRNA半減期、翻訳の効率、免疫回避、
タンパク質産生能力分泌の効率(適用される場合)、血液循環への到達可能性タンパ
ク質半減期、ならびに/または細胞の状態、機能、および/もしくは活性の調節のうちの
1つ以上を改善するように設計された、目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする
腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、および/または腫瘍学関連mmR
NAが本明細書の一部分に提供される。

0029

I. 本発明の組成物(mmRNA)
本発明は、1個以上の目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする核酸分子、具体
的には、腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、および/または腫瘍学関
連mmRNAを提供する。「核酸」という用語は、その最も広い意味において、ヌクレオ
チドのポリマーを含む任意の化合物および/または物質を含む。これらのポリマーは、多
くの場合、ポリヌクレオチドと称される。本発明の例示の核酸またはポリヌクレオチドに
は、リボ核酸(RNA)、デオキシリボ核酸(DNA)、トレオース核酸(TNA)、グ
リコール核酸(GNA)、ペプチド核酸(PNA)、ロックド核酸(LNA、β−D−リ
ボ配置を有するLNA、α−L−リボ配置を有するα−LNA(LNAのジアステレオ
ー)、2’−アミノ官能化を有する2’−アミノ−LNA、および2’−アミノ官能化を
有する2’−アミノ−α−LNAを含む)、またはこれらのハイブリッドが含まれるが、
これらに限定されない。

0030

好ましい実施形態において、核酸分子は、メッセンジャーRNA(mRNA)である。
本明細書で使用するとき、「メッセンジャーRNA(mRNA)」という用語は、目的と
する腫瘍学関連ポリペプチドをコードし、かつ翻訳されてインビトロ、インビボ、インサ
イツ、またはエクスビボで、コードされた目的とする腫瘍学関連ポリペプチドを産生する
ことができる任意の腫瘍学関連ポリヌクレオチドを指す。

0031

従来、mRNA分子の主要成分には、少なくともコーディング領域、5’UTR、3’
UTR、5’キャップ、およびポリA尾部が含まれる。この野生型モジュール構造を基に
、本発明は、モジュール組織を維持するが、いくつかの実施形態において、腫瘍学関連ポ
リヌクレオチドが導入される部分への細胞の自然免疫応答の実質的な誘導欠如を含む、
有用な特性をポリヌクレオチドに付与する1つ以上の構造および/もしくは化学修飾また
改変を含む腫瘍学関連ポリヌクレオチドまたは腫瘍学関連一次RNA構築物を提供する
ことによって従来のmRNA分子の機能の範囲を拡大する。したがって、本発明の修飾m
RNA分子は、「mmRNA」と称される。本明細書で使用するとき、「構造的」特徴ま
たは修飾は、2個以上の結合ヌクレオチドが、ヌクレオチド自体への著しい化学修飾なく
、腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学関連mmRNAに
おいて挿入、欠失、複製、反転、またはランダム化される特徴または修飾である。化学
合が必然的に破壊および再形成されて構造修飾をもたらすため、構造修飾は、化学的性質
のものであり、したがって、化学修飾である。しかしながら、構造修飾は、異なるヌクレ
オチド配列をもたらす。例えば、ポリヌクレオチド「ATCG」は、「AT−5meC−
G」に化学修飾され得る。同一のポリヌクレオチドは、「ATCG」から「ATCCCG
」に構造修飾され得る。ここで、ジヌクレオチド「CC」が挿入されており、腫瘍学関連
ポリヌクレオチドへの構造修飾をもたらす。

0032

mmRNA構造
本発明のmmRNAは、本明細書で証明されるように核酸系治療薬を用いた効果的なポ
リペプチド産生の既存の問題の打開に役立つそれらの機能的および/または構造的設計特
徴において野生型mRNAと区別される。

0033

図1は、本発明の代表的なポリヌクレオチド一次構築物100を示す。本明細書で使用
するとき、「一次構築物」または「一次mRNA構築物」という用語は、1個以上の目的
とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードし、その中でコードされる目的とするポリペプチ
ドが翻訳されることを可能とするのに十分な構造的および/または化学的特徴を保持する
、腫瘍学関連ポリヌクレオチド転写物を指す。腫瘍学関連一次構築物は、本発明の腫瘍学
関連ポリヌクレオチドであり得る。構造または化学修飾された場合、腫瘍学関連一次構築
物は、腫瘍学関連mmRNAと称され得る。

0034

図1を参照して、ここで、腫瘍学関連一次構築物100は、第1の隣接領域104およ
び第2の隣接領域106に隣接する結合ヌクレオチド102の第1の領域を含有する。本
明細書で使用するとき、「第1の領域」は、「コーディング領域」もしくは「コード領域
」、または単に「第1の領域」と称され得る。この第1の領域は、コードされた目的とす
る腫瘍学関連ポリペプチドを含み得るが、これに限定されない。目的とする腫瘍学関連ポ
リペプチドは、その5’末端に、シグナル配列領域103によってコードされた1つ以上
のシグナル配列を含み得る。隣接領域104は、1つ以上の完全または不完全な5’UT
R配列を含む結合ヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域104は、5’末端キャップ
108も含み得る。第2の隣接領域106は、1つ以上の完全または不完全な3’UTR
を含む結合ヌクレオチドの領域を含み得る。隣接領域106は、3’尾部配列110も含
み得る。

0035

第1の領域102と第1の隣接領域104の5’末端の架橋は、第1の操作領域105
である。従来、この操作領域は、開始コドンを含む。あるいは、この操作領域は、開始コ
ドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含み得る。

0036

第1の領域102と第2の隣接領域106の3’末端の架橋は、第2の操作領域107
である。従来、この操作領域は、終止コドンを含む。あるいは、この操作領域は、終止
ドンを含む任意の翻訳開始配列またはシグナルを含み得る。本発明に従って、複数の連続
終止コドンも使用され得る。一実施形態では、本発明の動作領域は2つの停止コドンを含
み得る。第1の停止コドンは「TGA」であり得、第2の停止コドンは「TAA」、「T
GA」、および「TAG」からなる群から選択され得る。

0037

概して、本発明の一次構築物の第1の領域の最短の長さは、ジペプチドトリペプチド
テトラペプチドペンタペプチドヘキサペプチドヘプタペプチドオクタペプチド
ノナペプチド、またはデカペプチドをコードするのに十分な核酸配列の長さであり得る
。別の実施形態において、この長さは、2〜30個のアミノ酸、例えば、5〜30、10
〜30、2〜25、5〜25、10〜25、または10〜20個のアミノ酸のペプチドを
コードするのに十分であり得る。この長さは、少なくとも11、12、13、14、15
、17、20、25、もしくは30個のアミノ酸のペプチド、または40個のアミノ酸よ
り長くないペプチド、例えば、35、30、25、20、17、15、14、13、12
、11、もしくは10個のアミノ酸より長くないペプチドをコードするのに十分であり得
る。ポリヌクレオチド配列がコードし得るジペプチドの例には、カルノシンおよびアン
リンが挙げられるが、それらに限定されない。

0038

概して、本発明の目的とする腫瘍学関連ポリペプチドをコードする第1の領域の長さは
、約30ヌクレオチド長を超える(例えば、少なくとも、約35、40、45、50、5
5、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、25
0、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1,
000、1,100、1,200、1,300、1,400、1,500、1,600、
1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、および3,000、4
,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,00
0、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,
000、80,000、90,000、もしくは100,000ヌクレオチド長(100
,000を含む)まで、またはそれらを超える)。本明細書で使用するとき、「第1の領
域」は、「コーディング領域」もしくは「コード領域」、または単に「第1の領域」と称
され得る。

0039

いくつかの実施形態において、腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、
または腫瘍学関連mmRNAは、約30〜約100,000個のヌクレオチド(例えば、
30〜50、30〜100、30〜250、30〜500、30〜1,000、30〜1
,500、30〜3,000、30〜5,000、30〜7,000、30〜10,00
0、30〜25,000、30〜50,000、30〜70,000、100〜250、
100〜500、100〜1,000、100〜1,500、100〜3,000、10
0〜5,000、100〜7,000、100〜10,000、100〜25,000、
100〜50,000、100〜70,000、100〜100,000、500〜1,
000、500〜1,500、500〜2,000、500〜3,000、500〜5,
000、500〜7,000、500〜10,000、500〜25,000、500〜
50,000、500〜70,000、500〜100,000、1,000〜1,50
0、1,000〜2,000、1,000〜3,000、1,000〜5,000、1,
000〜7,000、1,000〜10,000、1,000〜25,000、1,00
0〜50,000、1,000〜70,000、1,000〜100,000、1,50
0〜3,000、1,500〜5,000、1,500〜7,000、1,500〜10
,000、1,500〜25,000、1,500〜50,000、1,500〜70,
000、1,500〜100,000、2,000〜3,000、2,000〜5,00
0、2,000〜7,000、2,000〜10,000、2,000〜25,000、
2,000〜50,000、2,000〜70,000、および2,000〜100,0
00個)を含む。

0040

本発明に従って、第1および第2の隣接領域は、独立して、15〜1,000ヌクレオ
チド長の範囲(例えば、30、40、45、50、55、60、70、80、90、10
0、120、140、160、180、200、250、300、350、400、45
0、500、600、700、800、および900を超えるヌクレオチド長、または少
なくとも30、40、45、50、55、60、70、80、90、100、120、1
40、160、180、200、250、300、350、400、450、500、6
00、700、800、900、および1,000ヌクレオチド長)であり得る。

0041

本発明に従って、尾部配列は、0〜500ヌクレオチド長の範囲(例えば、少なくとも
60、70、80、90、120、140、160、180、200、250、300、
350、400、450、または500ヌクレオチド長)であり得る。尾部領域がポリA
尾部である場合、長さは、ポリA結合タンパク質結合の単位で、またはその関数として決
定され得る。この実施形態において、ポリA尾部は、ポリA結合タンパク質の少なくとも
4個の単量体に結合するのに十分な長さである。ポリA結合タンパク質の単量体は、一続
きの約38個のヌクレオチドに結合する。したがって、約80個のヌクレオチドおよび1
60個のヌクレオチドのポリA尾部が機能的であることが観察されている。

0042

本発明に従って、キャッピング領域は、単一のキャップまたはキャップを形成する一連
のヌクレオチドを含み得る。この実施形態において、キャッピング領域は、1〜10、例
えば、2〜9、3〜8、4〜7、1〜5、5〜10、または少なくとも2、もしくは10
以下のヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態において、キャップは不在である

0043

本発明に従って、第1および第2の操作領域は、3〜40、例えば、5〜30、10〜
20の範囲、15、または少なくとも4、もしくは30以下のヌクレオチド長であり得、
開始コドンおよび/または終止コドンに加えて、1つ以上のシグナルおよび/または制限
配列を含み得る。

0044

環状mmRNA
本発明に従って、腫瘍学関連一次構築物または腫瘍学関連mmRNAは、環化またはコ
カテマー化されて翻訳コンピテント分子を生成し、ポリA結合タンパク質と5’末端結
タンパク質との間の相互作用補助し得る。環化またはコンカテマー化機構は、少な
くとも3つの異なる経路、すなわち1)化学的経路、2)酵素的経路、および3)リボザ
イム触媒経路を通って生じ得る。新たに形成された5’/3’連結は、分子内または分子
間であり得る。

0045

第1の経路において、核酸の5’末端および3’末端は、接近しているときに分子の5
’末端と3’末端との間に新たな共有結合を形成する化学反応基を含有し得る。有機溶媒
中で、合成mRNA分子の3’末端上の3’−アミノ末端ヌクレオチドが5’−NHS−
エステル部分上で求核攻撃を経て新たな5’/3’アミド結合を形成するように、5’末
端は、NHS−エステル反応基を含有し得、3’末端は、3’−アミノ末端ヌクレオチド
を含有し得る。

0046

第2の経路において、T4RNAリガーゼを用いて、5’−リン酸化核酸分子を核酸
の3’−ヒドロキシル基酵素結合させて、新たなホスホジエステル結合を形成するこ
とができる。反応の例において、1μgの核酸分子が、製造業者プロトコルに従って、
1〜10単位のT4 RNAリガーゼ(New England Biolabs、Ip
swich,MA)と37℃で1時間インキュベートされる。連結反応が、5’領域およ
び3’領域の両方と並んで塩基対合して、酵素的連結反応を補助することができる分裂
オリゴヌクレオチドの存在下で生じ得る。

0047

第3の経路において、cDNA鋳型の5’末端または3’末端のいずれかは、インビト
転写中に、結果として生じる核酸分子が核酸分子の5’末端を核酸分子の3’末端に連
結することができる活性リボザイム配列を含有し得るように、リガーゼリボザイム配列を
コードする。リガーゼリボザイムは、I群イントロン、I群イントロン、デルタ肝炎ウイ
ルス、ヘアピンリボザイム由来し得るか、またはSELEX(試験管進化法、sys
tematic evolution of ligandsby exponent
ial enrichment)によって選択され得る。リボザイムリガーゼ反応は、0
〜37℃の温度で1〜24時間かかり得る。

0048

mmRNA多量体
本発明に従って、複数のはっきりと異なる腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一
次構築物、または腫瘍学関連mmRNAは、3’末端で修飾されたヌクレオチドを用いて
3’末端を介して結合され得る。化学的複合体形成を用いて、細胞への送達の化学量論
制御することができる。例えば、グリオキシル酸回路酵素イソクエン酸リアーゼ、およ
リンゴ酸シンターゼは、HepG2細胞に1:1の比率で供給されて細胞脂肪酸の代謝
を変化させ得る。この比率は、一方の腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築
物、または腫瘍学関連mmRNA種に3’−アジド末端ヌクレオチドを用い、かつ反対側
の腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学関連mmRNA種
にC5−エチニルまたはアルキニル含有ヌクレオチドを用いて化学結合腫瘍学関連ポリヌ
クレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学関連mmRNAを化学結合させること
によって制御され得る。この修飾されたヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従って
末端トランスフェラーゼ(New England Biolabs、Ipswich,
MA)を用いて転写後に添加される。3’末端修飾ヌクレオチドの添加後、これら2個の
腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学関連mmRNA種は
、銅の存在下または不在下において水溶液中で合わせられて、文献内に記載のクリック
学機構を介して新たな共有結合を形成し得る。

0049

別の例において、3個以上の腫瘍学関連ポリヌクレオチドが官能化リンカー分子を用い
て結合され得る。例えば、官能化サッカリド分子は、複数の化学反応基(SH−、NH2
−、N3等)を含有して3’−官能化腫瘍学関連mRNA分子上の同族部分(すなわち、
3’−マレイミドエステル、3’−NHS−エステル、アルキニル)と反応するように化
学修飾され得る。この修飾されたサッカリド上の反応基の数は、化学量論的様式で制御さ
れて、複合体化された腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍
学関連mmRNAの化学量論比直接制御し得る。

0050

mmRNA複合体および組み合わせ
腫瘍学関連タンパク質産生をさらに亢進するために、本発明の腫瘍学関連一次構築物ま
たは腫瘍学関連mmRNAは、他のポリヌクレオチド、腫瘍学関連ポリペプチド、染料
挿入剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、プソラレンマイトマイシンC)、ポ
フィリン(TPPC4、テキサフィリンサフィリン)、多環芳香族炭化水素(例えば
フェナジンジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、
アルキル化剤リン酸塩、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG−40K)、M
PEG、[MPEG]2、ポリアミノアルキル置換アルキル放射標識マーカー、酵
素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送吸収促進剤(例えば、アスピリンビタミン
E、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ、タンパク質、例えば、糖タンパク質、またはペプチ
ド、例えば、コリガンド特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば、癌細胞、内
皮細胞、または骨細胞等の特定の細胞型に結合する抗体、ホルモンおよびホルモン受容体
非ペプチド種、例えば、脂質、レクチン炭水化物、ビタミン、共同因子、または薬物
と複合体化されるように設計され得る。

0051

複合体化は、安定性および/または半減期の増加をもたらし得、腫瘍学関連ポリヌクレ
オチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学関連mmRNAを、細胞、組織、または生
物体の特定の部位に標的化するときに特に有用であり得る。

0052

本発明に従って、腫瘍学関連mmRNAまたは腫瘍学関連一次構築物は、RNAi剤
siRNA、shRNA、miRNA、miRNA結合部位アンチセンスRNA、リボ
ザイム、触媒DNA、tRNA三重らせん形成を誘導するRNA、アプタマー、もしく
ベクター等のうちの1つ以上とともに投与され得るか、またはこれらをさらにコードし
得る。

0053

二機能性mmRNA
本発明の一実施形態は、二機能性腫瘍学関連ポリヌクレオチド(例えば、二機能性腫瘍
学関連一次構築物または二機能性腫瘍学関連mmRNA)である。その名称が示すように
、二機能性腫瘍学関連ポリヌクレオチドは、少なくとも2つの機能を有するか、または少
なくとも2つの機能の能力があるポリヌクレオチドである。これらの分子は、慣例により
多機能性とも称され得る。

0054

二機能性腫瘍学関連ポリヌクレオチドの複数の機能は、RNAによってコードされ得る
(この機能は、コードされた産物が翻訳されるまで現れ得ない)か、またはポリヌクレオ
チド自体の特性であり得る。これは、構造的または化学的であり得る。二機能性腫瘍学関
修飾ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドと共有結合的または静電的に関連した機能
を含み得る。さらに、これら2つの機能は、mmRNAおよび別の分子の複合体との関連
において提供され得る。

0055

二機能性腫瘍学関連ポリヌクレオチドは、抗増殖性腫瘍学関連ペプチドをコードし得る
。これらのペプチドは、線状、環状、拘束、またはランダムコイルであり得る。これらは
、アプタマー、シグナル伝達分子リガンド、またはこれらの模倣物もしくはミメティ
クとして機能し得る。抗増殖性ペプチドは、翻訳されると、3〜50アミノ酸長であり得
る。それらは、5〜40、10〜30、または約15アミノ酸長であり得る。それらは、
一本鎖、多本鎖、または分岐鎖であり得、翻訳されると、複合体、凝集体、または任意の
多ユニット構造を形成し得る。

0056

非コード腫瘍学関連ポリヌクレオチドおよび一次構築物
本明細書に記載されるように、部分的または実質的に翻訳可能ではない配列、例えば、
非コード領域を有する腫瘍学関連ポリヌクレオチドおよび腫瘍学関連一次構築物が提供さ
れる。そのような非コード領域は、腫瘍学関連一次構築物の「第1の領域」であり得る。
あるいは、非コード領域は、第1の領域以外の領域であり得る。そのような分子は、通常
翻訳されないが、リボソームタンパク質または転移RNA(tRNA)等の1つ以上の翻
訳機構成分への結合および隔離のうちの1つ以上によってタンパク質産生に影響を及ぼし
、それによって、細胞におけるタンパク質発現を効果的に低下させるか、細胞における1
つ以上の経路またはカスケードを調節し得、それが次いでタンパク質レベルを変化させる
。腫瘍学関連ポリヌクレオチドおよび/または腫瘍学関連一次構築物は、1個以上の長い
非コードRNA(lncRNAもしくはlincRNA)もしくはその部分、低分子核R
NA(sno−RNA)、マイクロRNA(miRNA)、低分子干渉RNA(siRN
A)、またはPiwi干渉RNA(piRNA)を含有し得るか、あるいはこれらをコー
ドし得る。

0057

目的とするポリペプチド
本発明に従って、腫瘍学関連一次構築物は、1個以上の目的とする腫瘍学関連ポリペプ
チドまたはその断片をコードするように設計される。目的とする腫瘍学関連ポリペプチド
は、全ポリペプチド、複数のポリペプチド、またはポリペプチドの断片を含み得るが、こ
れらに限定されず、これらは、独立して、1個以上の核酸、複数の核酸、核酸の断片、ま
たは前述のうちのいずれかの変異形によってコードされ得る。本明細書で使用するとき、
「目的とする腫瘍学関連ポリペプチド」という用語は、選択されて本発明の腫瘍学関連一
次構築物においてコードされる任意のポリペプチドを指す。本明細書で使用するとき、「
ポリペプチド」とは、ほとんどの場合ペプチド結合によって結合されるアミノ酸残基(天
然または非天然)のポリマーを意味する。この用語は、本明細書で使用するとき、任意の
大きさ、構造、または機能を有するタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを指す。
いくつかの例において、コードされたポリペプチドが約50個のアミノ酸よりも小さい場
合、このポリペプチドは、ペプチドと称される。ポリペプチドがペプチドである場合、こ
れは、少なくとも約2、3、4、または少なくとも5アミノ酸残基長である。したがって
、ポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するポリペプチド、合成ポリペプチド相同
体、オルソログパラログ、前述の断片および他の等価物、変異形、ならびに類似体を含
む。ポリペプチドは、単一の分子であり得るか、または二量体三量体、もしくは四量体
等の多分子複合体であり得る。それらは、抗体またはインスリン等の一本鎖または多本鎖
ポリペプチドも含み得、会合または結合され得る。ほとんどの場合、ジスルフィド結合
本鎖ポリペプチドに見られる。「ポリペプチド」という用語は、1個以上のアミノ酸残
基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適
用され得る。

0058

「ポリペプチド変異形」という用語は、それらのアミノ酸配列天然配列または参照配
列とは異なる分子を指す。アミノ酸配列変異形は、天然配列または参照配列と比較して、
アミノ酸配列内のある特定の位置に置換、欠失、および/または挿入を有し得る。通常、
変異形は、天然配列または参照配列と少なくとも約50%の同一性相同性)を有し、好
ましくは、それらは、天然配列または参照配列と少なくとも約80%、より好ましくは、
少なくとも約90%同一(相同)である。

0059

いくつかの実施形態において、「変異形模倣物」が提供される。本明細書で使用すると
き、「変異形模倣物」という用語は、活性化配列模倣する1個以上のアミノ酸を含有す
るものである。例えば、グルタミン酸塩は、ホスホロ−トレオニンおよび/またはホスホ
ロ−セリンの模倣物の役割を果たし得る。あるいは、変異形模倣物は、その模倣物を含有
する産物の失活または不活性化をもたらし得、例えば、フェニルアラニンは、チロシン
不活性化置換としての機能を果たし得るか、またはアラニンは、セリンの不活性化置換と
しての機能を果たし得る。

0060

「相同性」は、アミノ酸配列に適用されるとき、最大の相同パーセントを得るために、
配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入した後の第2の配列のアミノ酸配列内の残
基と同一の候補アミノ酸配列内の残基の割合(%)と定義される。整列させるための方法
およびコンピュータプログラムは、当技術分野で周知である。相同性が同一性パーセント
の計算に依存するが、計算に導入されるギャップおよびペナルティのため値が異なり得る
ことが理解される。

0061

相同体」とは、ポリペプチド配列に適用されるとき、第2の種の第2の配列に対して
かなりの割合の同一性を有する他の種の対応する配列を意味する。
「類似体」は、親または出発ポリペプチドの特性のうちの1つ以上を依然として維持す
る、1つ以上のアミノ酸改変、例えば、アミノ酸残基の置換、付加、または欠失によって
異なるポリペプチド変異形を含むよう意図される。

0062

本発明は、変異形および誘導体を含むポリペプチド系のいくつかの種類の組成物を企図
する。これらは、置換、挿入、欠失、および共有結合変異形および誘導体を含む。「誘導
体」という用語は、「変異形」という用語と同義に使用されるが、概して、任意の方法で
参照分子または出発分子に対して修飾され、かつ/または変化した分子を指す。

0063

したがって、参照配列、具体的には、本明細書に開示の腫瘍学関連ポリペプチド配列に
対して置換、挿入および/または付加、欠失、ならびに共有結合修飾を含有する腫瘍学関
連ポリペプチドをコードするmmRNAが、本発明の範囲内に包含される。例えば、配列
タグまたはアミノ酸、例えば、1個以上のリジンが、本発明のペプチド配列に付加され得
る(例えば、N末端またはC末端で)。配列タグは、ペプチド精製または局在化に使用さ
れ得る。リジンを用いて、ペプチド溶解度を増加させるか、またはビオチン化を可能にす
る。あるいは、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸配列のカルボキシおよびアミノ末端
領域に位置するアミノ酸残基が任意に欠失されて、切断配列を提供し得る。あるいは、あ
る特定のアミノ酸(例えば、C末端またはN末端残基)は、配列の使用に応じて、例えば
、可溶性のより大きい配列の一部として配列の発現時に欠失され得るか、または固体支持
体に結合され得る。

0064

置換変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、天然配列または出発配列内
の少なくとも1個のアミノ酸残基が除去され、その場所の同一の位置に異なるアミノ酸が
挿入されたものである。これらの置換は、単一置換であり、分子中の1個のアミノ酸のみ
が置換されたものであり得、またはこれらの置換は、多置換であり、同一の分子中の2個
以上のアミノ酸が置換されたものであり得る。

0065

本明細書で使用するとき、「保存アミノ酸置換」という用語は、配列に通常存在するア
ミノ酸を、同様の大きさ、電荷、または極性を有する異なるアミノ酸で置換することを指
す。保存置換の例には、イソロイシンバリン、およびロイシン等の非極性疎水性)残
基の別の非極性残基との置換が挙げられる。同様に、保存置換の例には、アルギニンとリ
ジン、グルタミンアスパラギン、およびグリシンのセリン等の極性(親水性)残基の別
の残基との置換が挙げられる。さらに、リジン、アルギニン、もしくはヒスチジン等の塩
基性残基の別の塩基性残基との置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸等のあ
酸性残基の別の酸性残基との置換が、保存置換のさらなる例である。非保存置換の例に
は、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、メチオニン等の非極性(疎水性)アミ
酸残基の、システイン、グルタミン、グルタミン酸、もしくはリジン等の極性(親水性
)残基との置換、および/または極性残基の非極性残基との置換が挙げられる。

0066

挿入変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、1個以上のアミノ酸が天然
配列または出発配列内の特定の位置のアミノ酸にすぐ隣接して挿入されたものである。ア
ミノ酸に「すぐ隣接した」とは、アミノ酸のα−カルボキシ官能基またはα−アミノ官能
基のいずれかに連結されていることを意味する。

0067

欠失変異形」とは、ポリペプチドについて言及するとき、天然アミノ酸配列または出
発アミノ酸配列内の1個以上のアミノ酸が除去されたものである。通常、欠失変異形は、
1個以上のアミノ酸を分子の特定の領域で欠失させる。

0068

「共有結合誘導体」は、ポリペプチドについて言及するとき、有機タンパク質性もしく
非タンパク質誘導体化剤での天然タンパク質もしくは出発タンパク質の修飾、および
/または翻訳後修飾を含む。共有結合修飾は、従来、タンパク質の標的アミノ酸残基を、
選択された側鎖または末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させること
によって、または選択された組換え宿主細胞において機能する翻訳後修飾の機構を利用す
ることによって導入される。結果として生じる共有結合誘導体は、組換え糖タンパク質
免疫親和性精製のための抗タンパク質抗体生物学的活性免疫学的アッセイ、または調
製に重要な残基の特定を目的としたプログラムにおいて有用である。そのような修飾は、
当技術分野の技術の範囲内であり、過度実験なく行われる。

0069

ある特定の翻訳後修飾は、発現腫瘍学関連ポリペプチドにおける組換え宿主細胞の作用
の結果である。グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、高い頻度で、翻訳後に対応す
グルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。あるいは、これらの残基は、
弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれかの形態も、本発明に従って産
生された腫瘍学関連ポリペプチドに存在し得る。

0070

他の翻訳後修飾は、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化セリルまたはトレオニル
残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−ア
ミノ基のメチル化を含む(T.E.Creighton,Proteins:Struc
ture and Molecular Properties,W.H.Freema
n&Co.,San Francisco,pp.79−86(1983))。

0071

「特徴」は、ポリペプチドについて言及するとき、分子のはっきりと異なるアミノ酸配
列に基づく成分と定義される。本発明のmmRNAによってコードされるポリペプチドの
特徴には、表面出現、局所立体配座形状、折り畳み、ループ半ループドメイン、半ド
メイン、部位、末端、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。

0072

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「表面出現」という用語は
、タンパク質のポリペプチド系成分が最も外側の表面に現れることを指す。
本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「局所立体配座形状」とい
う用語は、タンパク質の定義可能な空間内に位置するタンパク質のポリペプチド系構造の
出現を意味する。

0073

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「折り畳み」という用語は
エネルギー最小化時のアミノ酸配列の結果として生じる立体構造を指す。折り畳みは、
折り畳みプロセスの二次または三次レベルで生じ得る。二次レベルの折り畳みの例には、
βシートおよびαヘリックスが挙げられる。三次レベルの折り畳みの例には、エネルギー
力の凝集または分離が原因で形成されるドメインおよび領域を含む。このようにして形成
された領域は、疎水性および親水性ポケット等を含む。

0074

本明細書で使用する「回転」という用語は、タンパク質構造に関するとき、ペプチドま
たはポリペプチドの骨格の方向を変化させる屈曲を意味し、1、2、または3個以上のア
ミノ酸残基が関与し得る。

0075

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「ループ」という用語は、
ペプチドまたはポリペプチドの骨格の方向を逆転させる役目を果たし得るポリペプチドの
構造的特徴を指す。ループがポリペプチドで見つけられ、かつ骨格の方向のみを変化させ
る場合、これは、4個以上のアミノ酸残基を含み得る。Olivaらは、少なくとも5つ
クラスのタンパク質ループを特定している(J.Mol Biol 266(4):8
14−830;1997)。ループは、開ループまたは閉ループであり得る。閉ループま
たは「環状」ループは、架橋部分の間に2、3、4、5、6、7、8、9、または10個
以上のアミノ酸を含み得る。そのような架橋部分は、ジスルフィド架橋を有するポリペプ
チドにおいて典型的なシステイン−システイン架橋(Cys−Cys)を含み得るか、ま
たはあるいは架橋部分は、本明細書で用いられるジブロモジルイル剤(dibromoz
ylyl agent)等の非タンパク質系のものであり得る。

0076

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「半ループ」という用語は
、それが由来するループとして特定されたアミノ酸残基の少なくとも半数を有するループ
の部分を指す。ループが必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有するわけではないことが理解
される。したがって、ループが奇数のアミノ酸を含有するか、または奇数のアミノ酸を含
むと特定された場合において、奇数のループの半ループは、ループの整数部分または次の
整数部分(ループのアミノ酸の数/2+/−0.5個のアミノ酸)を含む。例えば、7ア
ミノ酸ループと特定されたループは、3個のアミノ酸または4個のアミノ酸(7/2=3
.5+/−0.5で3または4になる)の半ループをもたらし得る。

0077

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「ドメイン」という用語は
、1つ以上の特定可能な構造または機能特徴または特性(例えば、結合能力、タンパク質
間の相互作用の部位としての役割を果たす)を有するポリペプチドのモチーフを指す。

0078

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「半ドメイン」という用語
は、それが由来するドメインとして特定されたアミノ酸残基の少なくとも半数を有するド
メインの部分を意味する。ドメインが必ずしも偶数のアミノ酸残基を含有するわけではな
いことが理解される。したがって、ドメインが奇数のアミノ酸を含有するか、または奇数
のアミノ酸を含むと特定された場合において、奇数のドメインの半ドメインは、ドメイン
の整数部分または次の整数部分(ドメインのアミノ酸の数/2+/−0.5個のアミノ酸
)を含む。例えば、7アミノ酸ドメインと特定されたドメインは、3個のアミノ酸または
4個のアミノ酸(7/2=3.5+/−0.5で3または4になる)の半ドメインをもた
らし得る。サブドメインがドメインまたは半ドメイン内で特定され得、これらのサブドメ
インが、それらが由来するドメインまたは半ドメインで特定された構造特性または機能特
性のすべてに満たない構造特性または機能特性を有することも理解される。本明細書のド
メイン型のうちのいずれを含むアミノ酸もポリペプチドの骨格に沿って隣接している必要
はない(すなわち、非隣接アミノ酸が構造的に折り畳まれて、ドメイン、半ドメイン、ま
たはサブドメインをもたらし得る)ことも理解される。

0079

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「部位」という用語は、ア
ミノ酸系の実施形態に関するとき、「アミノ酸残基」および「アミノ酸側鎖」と同義に使
用される。部位は、本発明のポリペプチド系分子内で修飾、操作、改変、誘導体化、また
は変更され得るペプチドまたはポリペプチド内の位置を表す。

0080

本明細書で使用され、ポリペプチドについて言及するとき、「末端(termini)
」または「末端(terminus)」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドの端
を指す。そのような端は、ペプチドまたはポリペプチドの第1または最終部位に限定され
るだけでなく、末端領域にさらなるアミノ酸も含み得る。本発明のポリペプチド系分子は
、N末端(アミノ酸によって遊離アミノ基(NH2)で終端する)もC末端(アミノ酸に
よって遊離カルボキシル基(COOH)で終端する)もいずれも有することを特徴とし得
る。本発明のタンパク質は、ある場合には、ジスルフィド結合または非共有結合力(多量
体、オリゴマー)によって結び付けられた複数のポリペプチド鎖からなりうる。これらの
種類のタンパク質は、複数のN末端およびC末端を有する。あるいは、ポリペプチドの末
端は、それらが場合によって有機複合体等の非ポリペプチド系部分で始まるか、または終
了するように修飾され得る。

0081

これらの特徴のうちのいずれかが本発明の腫瘍学関連一次構築物または腫瘍学関連mm
RNAによってコードされるポリペプチドの所望の成分であると特定または定義されると
、これらの特徴のいくつかの操作および/または修飾のうちのいずれも、移動、交換、反
転、欠失、ランダム化、または複製によって行われ得る。さらに、特徴の操作が本発明の
分子に対する修飾と同一の結果をもたらすことが理解される。例えば、ドメインの欠失を
伴う操作は、全長分子未満をコードする核酸の修飾のような分子の長さの改変をもたらす

0082

修飾および操作は、部位特異的変異誘発等であるが、これに限定されない当技術分野で
既知の方法によって達成され得る。その後、結果として生じる修飾された分子は、本明細
書に記載のアッセイ等のインビトロまたはインビボアッセイ、または当技術分野で既知の
任意の他の好適なスクリーニングアッセイを用いて活性について試験され得る。

0083

本発明に従って、腫瘍学関連ポリペプチドは、一連の実験によって発見されるコンセン
サス配列を含み得る。本明細書で使用するとき、「コンセンサス」配列とは、1つ以上の
部位で可変性を可能にする配列の集合集団を表す単一配列である。

0084

業者によって認識されるように、タンパク質断片、機能的タンパク質ドメイン、およ
相同タンパク質も、本発明の目的とする腫瘍学関連ポリペプチドの範囲内であると見な
される。例えば、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、ま
たは100を超えるアミノ酸長の参照タンパク質の任意のタンパク質断片(少なくとも1
個のアミノ酸残基が参照腫瘍学関連ポリペプチド配列よりも短いが、他の点では同一であ
る腫瘍学関連ポリペプチド配列を意味する)が本明細書に提供される。別の例において、
本明細書に記載の配列のうちのいずれかと約40%、約50%、約60%、約70%、約
80%、約90%、約95%、または約100%同一の一続きの約20、約30、約40
、約50、または約100個のアミノ酸を含む任意の腫瘍学関連タンパク質が本発明に従
って利用され得る。ある特定の実施形態において、本発明に従って利用されるポリペプチ
ドは、本明細書に提供または参照される配列のうちのいずれかに示される2、3、4、5
、6、7、8、9、10以上の変異を含む。

0085

コードされた腫瘍学関連ポリペプチド
本発明の腫瘍学関連一次構築物または腫瘍学関連mmRNAは、腫瘍学関連ペプチドお
よびタンパク質のような目的とするポリペプチドをコードするように設計され得る。

0086

一実施形態において、腫瘍学関連一次構築物または腫瘍学関連mmRNAは、参照腫瘍
学関連ポリペプチド配列とある特定の同一性を有する変異形ポリペプチドをコードし得る
。本明細書で使用するとき、「参照腫瘍学関連ポリペプチド配列」は、出発腫瘍学関連ポ
リペプチド配列を指す。参照配列は、別の配列の設計において参照される野生型配列また
は任意の配列であり得る。「参照ポリペプチド配列」は、例えば、本明細書に開示の配列
番号4704〜9203のうちのいずれか1つ、例えば、配列番号4704、4705、
4706、4707、4708、4709、4710、4711、4712、4713、
4714、4715、4716、4717、4718、4719、4720、4721、
4722、4723、4724、4725、4726、4727、4728、4729、
4730、4731、4732、4733、4734、4735、4736、4737、
4738、4739、4740、4741、4742、4743、4744、4745、
4746、4747、4748、4749、4750、4751、4752、4753、
4754、4755、4756、4757、4758、4759、4760、4761、
4762、4763、4764、4765、4766、4767、4768、4769、
4770、4771、4772、4773、4774、4775、4776、4777、
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6、7787、7788、7789、7790、7791、7792、7793、779
4、7795、7796、7797、7798、7799、7800、7801、780
2、7803、7804、7805、7806、7807、7808、7809、781
0、7811、7812、7813、7814、7815、7816、7817、781
8、7819、7820、7821、7822、7823、7824、7825、782
6、7827、7828、7829、7830、7831、7832、7833、783
4、7835、7836、7837、7838、7839、7840、7841、784
2、7843、7844、7845、7846、7847、7848、7849、785
0、7851、7852、7853、7854、7855、7856、7857、785
8、7859、7860、7861、7862、7863、7864、7865、786
6、7867、7868、7869、7870、7871、7872、7873、787
4、7875、7876、7877、7878、7879、7880、7881、788
2、7883、7884、7885、7886、7887、7888、7889、789
0、7891、7892、7893、7894、7895、7896、7897、789
8、7899、7900、7901、7902、7903、7904、7905、790
6、7907、7908、7909、7910、7911、7912、7913、791
4、7915、7916、7917、7918、7919、7920、7921、792
2、7923、7924、7925、7926、7927、7928、7929、793
0、7931、7932、7933、7934、7935、7936、7937、793
8、7939、7940、7941、7942、7943、7944、7945、794
6、7947、7948、7949、7950、7951、7952、7953、795
4、7955、7956、7957、7958、7959、7960、7961、796
2、7963、7964、7965、7966、7967、7968、7969、797
0、7971、7972、7973、7974、7975、7976、7977、797
8、7979、7980、7981、7982、7983、7984、7985、798
6、7987、7988、7989、7990、7991、7992、7993、799
4、7995、7996、7997、7998、7999、8000、8001、800
2、8003、8004、8005、8006、8007、8008、8009、801
0、8011、8012、8013、8014、8015、8016、8017、801
8、8019、8020、8021、8022、8023、8024、8025、802
6、8027、8028、8029、8030、8031、8032、8033、803
4、8035、8036、8037、8038、8039、8040、8041、804
2、8043、8044、8045、8046、8047、8048、8049、805
0、8051、8052、8053、8054、8055、8056、8057、805
8、8059、8060、8061、8062、8063、8064、8065、806
6、8067、8068、8069、8070、8071、8072、8073、807
4、8075、8076、8077、8078、8079、8080、8081、808
2、8083、8084、8085、8086、8087、8088、8089、809
0、8091、8092、8093、8094、8095、8096、8097、809
8、8099、8100、8101、8102、8103、8104、8105、810
6、8107、8108、8109、8110、8111、8112、8113、811
4、8115、8116、8117、8118、8119、8120、8121、812
2、8123、8124、8125、8126、8127、8128、8129、813
0、8131、8132、8133、8134、8135、8136、8137、813
8、8139、8140、8141、8142、8143、8144、8145、814
6、8147、8148、8149、8150、8151、8152、8153、815
4、8155、8156、8157、8158、8159、8160、8161、816
2、8163、8164、8165、8166、8167、8168、8169、817
0、8171、8172、8173、8174、8175、8176、8177、817
8、8179、8180、8181、8182、8183、8184、8185、818
6、8187、8188、8189、8190、8191、8192、8193、819
4、8195、8196、8197、8198、8199、8200、8201、820
2、8203、8204、8205、8206、8207、8208、8209、821
0、8211、8212、8213、8214、8215、8216、8217、821
8、8219、8220、8221、8222、8223、8224、8225、822
6、8227、8228、8229、8230、8231、8232、8233、823
4、8235、8236、8237、8238、8239、8240、8241、824
2、8243、8244、8245、8246、8247、8248、8249、825
0、8251、8252、8253、8254、8255、8256、8257、825
8、8259、8260、8261、8262、8263、8264、8265、826
6、8267、8268、8269、8270、8271、8272、8273、827
4、8275、8276、8277、8278、8279、8280、8281、828
2、8283、8284、8285、8286、8287、8288、8289、829
0、8291、8292、8293、8294、8295、8296、8297、829
8、8299、8300、8301、8302、8303、8304、8305、830
6、8307、8308、8309、8310、8311、8312、8313、831
4、8315、8316、8317、8318、8319、8320、8321、832
2、8323、8324、8325、8326、8327、8328、8329、833
0、8331、8332、8333、8334、8335、8336、8337、833
8、8339、8340、8341、8342、8343、8344、8345、834
6、8347、8348、8349、8350、8351、8352、8353、835
4、8355、8356、8357、8358、8359、8360、8361、836
2、8363、8364、8365、8366、8367、8368、8369、837
0、8371、8372、8373、8374、8375、8376、8377、837
8、8379、8380、8381、8382、8383、8384、8385、838
6、8387、8388、8389、8390、8391、8392、8393、839
4、8395、8396、8397、8398、8399、8400、8401、840
2、8403、8404、8405、8406、8407、8408、8409、841
0、8411、8412、8413、8414、8415、8416、8417、841
8、8419、8420、8421、8422、8423、8424、8425、842
6、8427、8428、8429、8430、8431、8432、8433、843
4、8435、8436、8437、8438、8439、8440、8441、844
2、8443、8444、8445、8446、8447、8448、8449、845
0、8451、8452、8453、8454、8455、8456、8457、845
8、8459、8460、8461、8462、8463、8464、8465、846
6、8467、8468、8469、8470、8471、8472、8473、847
4、8475、8476、8477、8478、8479、8480、8481、848
2、8483、8484、8485、8486、8487、8488、8489、849
0、8491、8492、8493、8494、8495、8496、8497、849
8、8499、8500、8501、8502、8503、8504、8505、850
6、8507、8508、8509、8510、8511、8512、8513、851
4、8515、8516、8517、8518、8519、8520、8521、852
2、8523、8524、8525、8526、8527、8528、8529、853
0、8531、8532、8533、8534、8535、8536、8537、853
8、8539、8540、8541、8542、8543、8544、8545、854
6、8547、8548、8549、8550、8551、8552、8553、855
4、8555、8556、8557、8558、8559、8560、8561、856
2、8563、8564、8565、8566、8567、8568、8569、857
0、8571、8572、8573、8574、8575、8576、8577、857
8、8579、8580、8581、8582、8583、8584、8585、858
6、8587、8588、8589、8590、8591、8592、8593、859
4、8595、8596、8597、8598、8599、8600、8601、860
2、8603、8604、8605、8606、8607、8608、8609、861
0、8611、8612、8613、8614、8615、8616、8617、861
8、8619、8620、8621、8622、8623、8624、8625、862
6、8627、8628、8629、8630、8631、8632、8633、863
4、8635、8636、8637、8638、8639、8640、8641、864
2、8643、8644、8645、8646、8647、8648、8649、865
0、8651、8652、8653、8654、8655、8656、8657、865
8、8659、8660、8661、8662、8663、8664、8665、866
6、8667、8668、8669、8670、8671、8672、8673、867
4、8675、8676、8677、8678、8679、8680、8681、868
2、8683、8684、8685、8686、8687、8688、8689、869
0、8691、8692、8693、8694、8695、8696、8697、869
8、8699、8700、8701、8702、8703、8704、8705、870
6、8707、8708、8709、8710、8711、8712、8713、871
4、8715、8716、8717、8718、8719、8720、8721、872
2、8723、8724、8725、8726、8727、8728、8729、873
0、8731、8732、8733、8734、8735、8736、8737、873
8、8739、8740、8741、8742、8743、8744、8745、874
6、8747、8748、8749、8750、8751、8752、8753、875

、8755、8756、8757、8758、8759、8760、8761、8762
、8763、8764、8765、8766、8767、8768、8769、8770
、8771、8772、8773、8774、8775、8776、8777、8778
、8779、8780、8781、8782、8783、8784、8785、8786
、8787、8788、8789、8790、8791、8792、8793、8794
、8795、8796、8797、8798、8799、8800、8801、8802
、8803、8804、8805、8806、8807、8808、8809、8810
、8811、8812、8813、8814、8815、8816、8817、8818
、8819、8820、8821、8822、8823、8824、8825、8826
、8827、8828、8829、8830、8831、8832、8833、8834
、8835、8836、8837、8838、8839、8840、8841、8842
、8843、8844、8845、8846、8847、8848、8849、8850
、8851、8852、8853、8854、8855、8856、8857、8858
、8859、8860、8861、8862、8863、8864、8865、8866
、8867、8868、8869、8870、8871、8872、8873、8874
、8875、8876、8877、8878、8879、8880、8881、8882
、8883、8884、8885、8886、8887、8888、8889、8890
、8891、8892、8893、8894、8895、8896、8897、8898
、8899、8900、8901、8902、8903、8904、8905、8906
、8907、8908、8909、8910、8911、8912、8913、8914
、8915、8916、8917、8918、8919、8920、8921、8922
、8923、8924、8925、8926、8927、8928、8929、8930
、8931、8932、8933、8934、8935、8936、8937、8938
、8939、8940、8941、8942、8943、8944、8945、8946
、8947、8948、8949、8950、8951、8952、8953、8954
、8955、8956、8957、8958、8959、8960、8961、8962
、8963、8964、8965、8966、8967、8968、8969、8970
、8971、8972、8973、8974、8975、8976、8977、8978
、8979、8980、8981、8982、8983、8984、8985、8986
、8987、8988、8989、8990、8991、8992、8993、8994
、8995、8996、8997、8998、8999、9000、9001、9002
、9003、9004、9005、9006、9007、9008、9009、9010
、9011、9012、9013、9014、9015、9016、9017、9018
、9019、9020、9021、9022、9023、9024、9025、9026
、9027、9028、9029、9030、9031、9032、9033、9034
、9035、9036、9037、9038、9039、9040、9041、9042
、9043、9044、9045、9046、9047、9048、9049、9050
、9051、9052、9053、9054、9055、9056、9057、9058
、9059、9060、9061、9062、9063、9064、9065、9066
、9067、9068、9069、9070、9071、9072、9073、9074
、9075、9076、9077、9078、9079、9080、9081、9082
、9083、9084、9085、9086、9087、9088、9089、9090
、9091、9092、9093、9094、9095、9096、9097、9098
、9099、9100、9101、9102、9103、9104、9105、9106
、9107、9108、9109、9110、9111、9112、9113、9114
、9115、9116、9117、9118、9119、9120、9121、9122
、9123、9124、9125、9126、9127、9128、9129、9130
、9131、9132、9133、9134、9135、9136、9137、9138
、9139、9140、9141、9142、9143、9144、9145、9146
、9147、9148、9149、9150、9151、9152、9153、9154
、9155、9156、9157、9158、9159、9160、9161、9162
、9163、9164、9165、9166、9167、9168、9169、9170
、9171、9172、9173、9174、9175、9176、9177、9178
、9179、9180、9181、9182、9183、9184、9185、9186
、9187、9188、9189、9190、9191、9192、9193、9194
、9195、9196、9197、9198、9199、9200、9201、9202
、9203のうちのいずれかであり得る。

0087

当技術分野で既知の「同一性」という用語は、配列を比較することによって決定される
2個以上のペプチドの配列間の関係を指す。当技術分野において、同一性は、2個以上の
アミノ酸残基のストリング間のマッチ数によって決定されるペプチド間の配列関連性の程
度も意味する。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム(すなわち、
アルゴリズム」)によって処理されるギャップアライメント(存在する場合)を有する
2つ以上の配列のうちのより小さい配列間の同一のマッチの割合(%)を測定する。関連
ペプチドの同一性は、既知の方法によって容易に計算され得る。そのような方法には、C
omputational Molecular Biology,Lesk,A.M.
,ed.,Oxford University Press,New York,19
88、Biocomputing:Informatics and Genome P
rojects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,Ne
w York,1993、Computer Analysis of Sequenc
e Data,Part 1,Griffin,A.M.,and Griffin,H
.G.,eds.,Humana Press,New Jersey,1994、Se
quence Analysis in Molecular Biology,von
Heinje,G.,Academic Press,1987、Sequence
Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,
J.,eds.,M.Stockton Press,New York,1991、お
よびCarillo et al.,SIAM J.Applied Math.48,
1073(1988)に記載の方法が含まれるが、これらに限定されない。

0088

いくつかの実施形態において、ポリペプチド変異形は、参照腫瘍学関連ポリペプチドと
同一または同様の活性を有し得る。あるいは、変異形は、参照腫瘍学関連ポリペプチドと
比較して変化(例えば、増加または減少)した活性を有し得る。概して、本発明の特定の
腫瘍学関連ポリヌクレオチドまたは腫瘍学関連ポリペプチドの変異形は、本明細書に記載
され、かつ当業者に既知の配列アライメントプログラムおよびパラメータによって決定さ
れるように、特定の参照腫瘍学関連ポリヌクレオチドまたは腫瘍学関連ポリペプチドの変
異形と少なくとも約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%
、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%
、98%、99%であるが、100%未満の配列同一性を有する。そのようなアライメ
トのツールは、BLASTプログラム一式を含む(Stephen F.Altschu
l,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,J
inghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and
David J.Lipman(1997),“Gapped BLAST and
PSI−BLAST:a new generation of protein da
tabese search programs”,Nucleic AcidsRe
s.25:3389−3402)。他のツールは、本明細書、具体的には、「同一性」の
定義に記載される。

0089

BLASTアルゴリズムの初期設定パラメータは、例えば、予測閾値10、ワードサイ
ズ28、マッチ/ミスマッチスコア1、−2、線形ギャップコストを含む。任意のフィル
ター、ならびに種特異的繰り返し配列、例えば、ヒト特異的繰り返し配列の選択が適用さ
れ得る。

0090

一実施形態では、腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物および/または
腫瘍学関連mmRNAは、対象の疾患、障害、および/または状態を治療するために使用
され得る。

0091

一実施形態では、腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物および/または
腫瘍学関連mmRNAは、対象の腫瘍増殖を減少、排除または予防するために使用され得
る。

0092

一実施形態では、腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物および/または
腫瘍学関連mmRNAは、対象の少なくとも1つの癌症状を軽減および/または寛解させ
るために使用され得る。癌の症状は衰弱うずきと痛み、発熱、疲労、体重減少血餅
血中カルシウム濃度の上昇、白血球数の低下、息切れ眩暈頭痛色素沈着過剰黄疸
紅斑掻痒症多毛症排便習慣の変化、膀胱機能の変化、長続きするただれ口腔内
白斑白点、異常な出欠または排出、身体部位肥厚またはしこり消化不良、嚥
下困難、いぼまたはほくろの変化、新しい皮膚およびしつこい席の変化または嗄声を含み
得るが、これらに限定されない。さらに、腫瘍学連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構
築物および/または腫瘍学関連mmRNAはケモブレイン末梢神経障害、疲労、うつ病
吐き気嘔吐、痛み、貧血、リンパ浮腫感染症、性的副作用、減少した不妊症または
妊孕性オストミー、不妊症および脱毛のような癌に関する副作用を減少し得るが、これ
らに限定されない。

0093

腫瘍学関連タンパク質または腫瘍学関連ペプチド
本明細書に開示の腫瘍学関連一次構築物または腫瘍学関連mmRNAは、1個以上の有
効なまたは「試験中の」腫瘍学関連タンパク質または腫瘍学関連ペプチドをコードし得る

0094

本発明に従って、現在販売されているか、または開発中の1個以上の腫瘍学関連タンパ
ク質または腫瘍学関連ペプチドは、本発明の腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一
次構築物または腫瘍学関連mmRNAによってコードされ得る。理論によって束縛される
ことを望まないが、少なくとも部分的に、特異性純度、および構築物設計の選択性によ
り、本発明の腫瘍学関連一次構築物または腫瘍学関連mmRNAへの組み込みが治療効果
の改善をもたらすと考えられる。

0095

腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物および/または腫瘍学関連mmR
NAは細胞周期、DNA損傷応答(例えば、DNA損傷修復)、アポトーシス、血管新生
細胞運動性上皮細胞上皮間葉転換ホスファチジルイノシトール3(PI3)キナ
ーゼ/Akt細胞のシグナル伝達経路テロメラーゼ活性および/または発現、腫瘍転移
腫瘍形成カテプシン細胞老化受容体チロシンキナーゼシグナル伝達、代謝および
薬物代謝Gタンパク質シグナル伝達、成長因子および受容体、熱ショックタンパク質
ヒストンデアセチラーゼ、ホルモン受容体、低酸素症ポリADPリボースポリメラーゼ
タンパク質キナーゼRASシグナル伝達、トポイソメラーゼ癌性前癌性、および/
または他の細胞の転写因子および抗腫瘍活性等の生物学的および/または生理学過程
よび/または化合物を変更し得るが、これらに限定されない。

0096

一実施形態では、ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物および/または腫瘍学関連
mmRNAは、欠失または変異遺伝子から産出されるタンパク質を置換する目的で、細胞
または組織のポリペプチドを発現するために使用され得る。

0097

さらに、本発明の腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物または腫瘍学関
連mmRNAは天然および/または合成起源発癌物質が原因で発生した癌を治療するた
めに使用され得る。別の実施形態では、腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構
築物および/または腫瘍学関連mmRNAの使用は、他の有機体が原因で発生した癌およ
び/またはウイルス感染が原因で発生した癌を治療するために使用され得る。

0098

隣接領域:非翻訳領域(UTR)
遺伝子の非翻訳領域(UTR)は、転写されるが、翻訳されない。5’UTRが転写開
始部位で始まり開始コドンに続くが、開始コドンを含まない一方で、3’UTRは、終止
コドンの直後に始まり、転写終結シグナルまで続く。核酸分子および翻訳の安定性におい
てUTRが果たす制御的役割についての報告が相次いでいる。UTRの制御特徴は、本発
明の腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、および/または腫瘍学関連m
mRNAに組み込まれて、分子の安定性を高め得る。特定の特徴も組み込まれて、万が一
それらが望ましくない器官部位に誤指向される場合には転写物の制御された下方制御を確
保することができる。

0099

5’UTRおよび翻訳開始
天然5’UTRは、翻訳開始に関与する特徴を有する。それらは、リボソームが多くの
遺伝子の翻訳を開始するプロセスに関与することで一般に知られているコザック配列のよ
うな特徴を有する。コザック配列は、コンセンサスCCR(A/G)CCAUGGを有し
、式中、Rは、開始コドン(AUG)の3塩基上流プリン(アデニンまたはグアニン)
であり、この後に別の「G」が続く。5’UTRは、伸長因子結合に関与する二次構造
形成することも知られている。

0100

特定の標的器官の多量に発現した遺伝子において典型的に見られる特徴を操作すること
によって、本発明の腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学
関連mmRNAの安定性および腫瘍学関連タンパク質産生を高めることができる。例えば
アルブミン血清アミロイドAアポリポタンパク質A/B/E、トランスフェリン
αフェトタンパク質、エリスロポエチン、または第VIII因子等の肝臓で発現したmR
NAの5’UTR導入を用いて、肝細胞株または肝臓でのmmRNA等の核酸分子の発現
を高めることができる。同様に、他の組織特異的mRNAからの5’UTRを用いてその
組織での発現を高めることは、筋肉(MyoD、ミオシンミオグロビンミオゲニン
ヘルクリン(Herculin))、内皮細胞(Tie−1、CD36)、骨髄細胞(C
/EBP、AML1、G−CSFGM−CSF、CD11b、MSR、Fr−1、i−
NOS)、白血球(CD45、CD18)、脂肪組織(CD36、GLUT4、ACR
30、アディポネクチン)、および肺上皮細胞(SP−A/B/C/D)において可能で
ある。

0101

他の非UTR配列が、5’UTR(または3’UTR)に組み込まれ得る。例えば、イ
トロンまたはイントロン配列の一部は、本発明の腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学
関連一次構築物、または腫瘍学関連mmRNAの隣接領域に組み込まれ得る。イントロン
配列の組み込みは、タンパク質産生、ならびにmRNAレベルを増加させ得る。

0102

3’UTRおよびAU豊富な要素
3’UTRは、それらに包理される一続きのアデノシン(Adenosine)および
ウリジン(Uridine)を有することで知られている。これらのAU豊富な特徴は、
特に高代謝回転率を有する遺伝子においてよく見られる。それらの配列特徴および機能特
性に基づいて、AU豊富な要素(ARE)は、3つのクラスに分類され得る(Chen
et al,1995):クラスIのAREは、U豊富な領域内にAUUUAモチーフの
いくつかの分散したコピーを含有する。C−MycおよびMyoDは、クラスIのARE
を含有する。クラスIIのAREは、2個以上の重複したUUAUUUA(U/A)(U
/A)九量体を有する。この種のAREを含有する分子は、GM−CSFおよびTNF−
aを含む。クラスIIIのAREは、あまり明確にされていない。これらのU豊富な領域
は、AUUUAモチーフを含有しない。C−Junおよびミオゲニンが、十分に研究され
たこのクラスの例の2つである。AREに結合する大半のタンパク質がメッセンジャー
不安定にすることで知られているが、ELAVファミリーメンバー、中でも注目すべき
HuRがmRNAの安定性を向上させることが実証されている。HuRは、これら3つの
クラスのAREに結合する。HuR特異的結合部位を操作して核酸分子の3’UTRに入
れることで、HuR結合、ひいてはインビボでのメッセージの安定化につながる。

0103

3’UTRのAU豊富な要素(ARE)の導入、除去、または修飾を用いて、本発明の
腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学関連mmRNAの安
定性を調節することができる。特定の腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築
物、または腫瘍学関連mmRNAを操作するとき、AREの1つ以上のコピーが導入され
て、本発明の腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学関連m
mRNAの安定性を低下させ、それによって、結果として生じるタンパク質の翻訳を抑制
し、その産生を低減させ得る。同様に、AREは、特定および除去されるか、または変異
されて、細胞内安定性を向上させ、ひいては結果として生じるタンパク質の翻訳および産
生を増加させることができる。本発明の腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構
築物、または腫瘍学関連mmRNAを用いたトランスフェクション実験を関連細胞株にお
いて行うことができ、タンパク質産生をトランスフェクション後の様々な時点でアッセイ
することができる。例えば、細胞を、異なるARE操作分子でトランスフェクトすること
ができ、関連タンパク質に対してELISAキットを用いてトランスフェクション後6時
間、12時間、24時間、48時間、および7日時点で産生されたタンパク質をアッセイ
することができる。

0104

マイクロRNA結合部位の組み込み
マイクロRNA(またはmiRNA)は、核酸分子の3’UTRに結合し、かつ核酸分
子安定性を低下させるか、または翻訳を阻害するかのいずれかによって遺伝子発現を下方
制御する19〜25ヌクレオチド長の非コードRNAである。本発明の腫瘍学関連ポリヌ
クレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学関連mmRNAは、1つ以上のマイ
RNA標的配列、マイクロRNA配列、またはマイクロRNA種を含み得る。そのよう
な配列は、米国特許公開第US2005/0261218号および米国特許公開第US2
005/0059005号に教示されるもの等の任意の既知のマイクロRNAに対応し得
、これらの内容は、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。

0105

マイクロRNA配列は、「種」領域、すなわち、成熟マイクロRNAの2〜8位の領域
における配列を含み、この配列は、miRNA標的配列に対して完全なワトソン・クリッ
相補性を有する。マイクロRNA種は、成熟マイクロRNAの2〜8位または2〜7位
を含み得る。いくつかの実施形態において、マイクロRNA種は、7個のヌクレオチド(
例えば、成熟マイクロRNAのヌクレオチド2〜8位)を含み得、対応するmiRNA標
的におけるこの種相補的部位は、マイクロRNA1位と反対のアデニン(A)に隣接する
。いくつかの実施形態において、マイクロRNA種は、6個のヌクレオチド(例えば、成
熟マイクロRNAのヌクレオチド2〜7位)を含み得、対応するmiRNA標的における
種相補的部位は、マイクロRNA1位と反対のアデニン(A)に隣接する。例えば、Gr
imson A,Farh KK,Johnston WK,Garrett−Enge
le P,LimLP,BartelDP;Mol Cell.2007 Jul
6;27(1):91−105を参照されたく、それぞれ、参照によりそれらの全体が本
明細書に組み込まれる。マイクロRNA種の塩基は、標的配列と完全な相補性を有する。
マイクロRNA標的配列を操作して、本発明の腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連
一次構築物、または腫瘍学関連mmRNAの3’UTRに入れることによって、分解また
は翻訳減少のためにこの分子を標的化することができるが、但し、問題のマイクロRNA
利用可能であることを条件とする。このプロセスは、核酸分子送達時のオフターゲット
効果の危険を低下させる。マイクロRNA、マイクロRNA標的領域、およびそれらの発
現パターンの特定、ならびに生物学におけるそれらの役割が報告されている(それぞれ、
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Bonauer et al.,Cur
r Drug Targets 2010 11:943−949、Anand and
Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18:171−1
76、Contreras and Rao Leukemia 2012 26:40
4−413(2011 Dec 20.doi:10.1038/leu.2011.3
56)、Bartel Cell 2009 136:215−233、Landgra
f et al,Cell,2007 129:1401−1414)。

0106

例えば、核酸分子がmRNAであり、肝臓に送達されることが意図されないが、そこで
落ち着く場合、肝臓中に豊富なマイクロRNAであるmiR−122が、miR−122
の1つまたは複数の標的部位が操作されて、腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一
次構築物、または腫瘍学関連mmRNAの3’UTRに入れられると、目的とする遺伝子
の発現を阻害することができる。異なるマイクロRNAの1つまたは複数の結合部位の導
入を操作して、腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学関連
mmRNAの長寿命、安定性、およびタンパク質翻訳をさらに減少させることができる。
本明細書で使用するとき、「マイクロRNA部位」という用語は、マイクロRNA標的部
位もしくはマイクロRNA認識部位、またはマイクロRNAが結合もしくは会合する任意
ヌクレオチド配列を指す。「結合」は、従来のワトソン・クリックハイブリダイゼーシ
ョン規則に従い得るか、あるいはマイクロRNA部位に、またはマイクロRNA部位に隣
接して標的配列を有するマイクロRNAの任意の安定した会合を示し得ることを理解され
たい。

0107

逆に、本発明の腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学関
連mmRNAの目的のために、特定の組織でのタンパク質発現を増加させるために自然に
生じるマイクロRNA結合部位を操作して配列から出す(すなわち、配列から除去する)
ことができる。例えば、miR−122結合部位が除去されて、肝臓でのタンパク質発現
を改善することができる。複数の組織での発現の制御は、1つまたはいくつかのマイクロ
RNA結合部位の導入または除去によって達成され得る。

0108

マイクロRNAがmRNAを制御し、その結果タンパク質発現を制御することで知られ
ている組織の例には、肝臓(miR−122)、筋肉(miR−133、miR−206
、miR−208)、内皮細胞(miR−17−92、miR−126)、骨髄細胞(m
iR−142−3p、miR−142−5p、miR−16、miR−21、miR−2
23、miR−24、miR−27)、脂肪組織(let−7、miR−30c)、心臓
(miR−1d、miR−149)、腎臓(miR−192、miR−194、miR−
204)、および肺上皮細胞(let−7、miR−133、miR−126)が挙げら
れるが、これらに限定されない。マイクロRNAは、血管新生(miR−132)等の複
雑な生物学的プロセスも制御し得る(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Ana
nd and Cheresh Curr Opin Hematol 2011 18
:171−176)。本発明の腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、ま
たは腫瘍学関連mmRNAにおいて、そのようなプロセスに関与するマイクロRNAの結
合部位は、生物学的に関連した細胞型に対して、または関連生物学的プロセスに関連して
腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学関連mmRNAの発
現を調整するために除去または導入され得る。マイクロRNA、miR配列、およびmi
R結合部位の一覧が、2013年1月17日出願の米国特許仮出願第61/753,66
1号の表9、2013年1月18日出願の米国特許仮出願第61/754,159号の表
9、および2013年1月31日出願の米国特許仮出願第61/758,921号の表7
列記されており、それぞれ、参照によりこれらの全体が本明細書に組み込まれる。

0109

最後に、異なる腫瘍学関連細胞型におけるマイクロRNAの発現パターンの理解を通じ
て、腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構構築物、または腫瘍学関連mmRN
Aは、特定の細胞型におけるより標的化された発現または特定の生物学的条件下のみでの
より標的化された発現のために操作され得る。組織特異的マイクロRNA結合部位の導入
によって、組織での腫瘍学関連タンパク質発現または生物学的条件に関連した腫瘍学関連
タンパク質発現に最適な腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫
瘍学関連mmRNAが設計され得る。組織または疾患特異的遺伝子発現を駆動するための
マイクロRNAの使用例が列記されている(参照により全体が本明細書に組み込まれる、
Getner and Naldini,Tissue Antigens.2012,
80:393−403)。加えて、マイクロRNA種部位は、mRNAに組み込まれてあ
る特定の細胞における発現を低下させ得、これは、生物学的改善をもたらす。これについ
ての例は、miR−142部位のUGT1A1発現レンチウイルスベクターへの組み込み
である。miR−142種部位の存在が造血細胞での発現を低下させ、結果として抗原
示細胞での発現を低下させ、ウイルスによって発現したUGT1A1に対する免疫応答
不在をもたらした(それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Schmi
tt et al.,Gastroenterology 2010;139:999−
1007、Gonzalez−Asequinolaza et al.Gastroe
nterology 2010,139:726−729)。miR−142部位の修飾
mRNAへの組み込みが、造血細胞でのコードされたタンパク質の発現を低下させること
ができただけでなく、mRNAでコードされたタンパク質に対する免疫応答を低下または
無効にすることもできた。miR−142種部位(1つまたは複数)のmRNAへの組み
込みは、I型UGT1A1、LDLR欠損患者、およびCRI陰性Pompe患者のよ
うな完全なタンパク質欠乏症が挙げられるがこれらに限定されない完全なタンパク質欠乏
症を有する患者の治療時に重要である。

0110

操作された腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学関連m
mRNAを用いたトランスフェクション実験を関連細胞株において行うことができ、タン
パク質産生をトランスフェクション後の様々な時点でアッセイすることができる。例えば
、細胞を、異なるマイクロRNA結合部位操作腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連
一次構築物、または腫瘍学関連mmRNAでトランスフェクトすることができ、関連タン
パク質に対してELISAキットを用いてトランスフェクション後6時間、12時間、2
4時間、48時間、72時間、および7日時点で産生されたタンパク質をアッセイするこ
とができる。マイクロRNA結合部位操作分子を用いたインビボ実験を行って、製剤化さ
れた腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学関連mmRNA
組織特異的発現の変化を試験することもできる。

0111

5’キャッピング
mRNAの5’キャップ構造は、核外輸送に関与し、mRNAの安定性を向上させ、m
RNAキャップ結合タンパク質(CBP)に結合し、これは、CBPのポリ(A)結合タ
ンパク質との会合を介して細胞におけるmRNA安定性および翻訳適格性に関与し、成熟
環状mRNA種を形成する。このキャップはさらに、mRNAスプライシング中に5’近
位のイントロンの除去を支援する。

0112

内因性mRNA分子は、5’末端キャップされて、末端グアノシンキャップ残基とmR
NA分子の5’末端転写センスヌクレオチドとの間に5’−ppp−5’−トリホスフェ
ート結合をもたらし得る。その後、この5’−グアニル酸キャップがメチル化されて、N
7−メチル−グアニル酸残基を生成し得る。mRNAの5’末端の末端および/または前
末端転写ヌクレオチドのリボース糖も、任意に2’−O−メチル化され得る。グアニル酸
キャップ構造の加水分解および切断を介する5’デキャッピングは、分解するためにmR
NA分子等の核酸分子を標的とし得る。

0113

本発明の腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、および腫瘍学関連mm
RNAの修飾は、デキャッピングを阻止する非加水分解性のキャップ構造を生成し、その
結果mRNAの半減期を増加させ得る。キャップ構造の加水分解が5’−ppp−5’ホ
ホロジエステル結合の切断を必要とするため、修飾ヌクレオチドが、キャッピング反応
中に用いられ得る。例えば、New England Biolabs(Ipswich
,MA)のワクシニアキャッピング酵素を製造業者の指示に従ってα−チオ−グアノシン
ヌクレオチドとともに用いて、5’−ppp−5’キャップにおけるホスホロチオエート
結合を引き起こすことができる。α−メチル−ホスホネートおよびセレノホスフェート
ヌクレオチド等のさらなる修飾グアノシンヌクレオチドを用いることができる。

0114

さらなる修飾には、糖環の2’−ヒドロキシル基におけるmRNAの5’末端および/
または5’前末端ヌクレオチドのリボース糖の2’−O−メチル化(上述のもの)が含ま
れるが、これに限定されない。複数のはっきりと異なる5’−キャップ構造を用いて、m
RNA分子等の核酸分子の5’キャップを生成することができる。

0115

本明細書において合成キャップ類似体、化学キャップ、化学キャップ類似体、または構
造もしくは機能キャップ類似体とも称されるキャップ類似体は、それらの化学構造の点で
天然の(すなわち、内因性、野生型、または生理学的)5’キャップとは異なるが、キャ
ップ機能は保持する。キャップ類似体は、化学的(すなわち、非酵素的)もしくは酵素的
に合成され、かつ/または核酸分子に結合され得る。

0116

例えば、反逆方向キャップ類似体(ARCA)キャップは、5’−5’−トリホスフェ
ート基によって結合される2個のグアニンを含有し、一方のグアニンは、N7メチル基
ならびに3’−O−メチル基(すなわち、N7,3’−O−ジメチル−グアノシン−5’
トリホスフェート−5’−グアノシン(m7G−3’mppp−G、これは同等に3’
O−Me−m7G(5’)ppp(5’)Gと指定され得る)を含有する。他方の未修飾
グアニンの3’−O原子は、キャップされた核酸分子(例えば、mRNAまたはmmRN
A)の5’末端ヌクレオチドに結合される。N7−および3’−O−メチル化グアニンは
、キャップされた核酸分子(例えば、mRNAまたはmmRNA)の末端部分を提供する

0117

別の例示のキャップには、mCAPがあり、これは、ARCAと同様であるが、グアノ
シン上に2’−O−メチル基(すなわち、N7,2’−O−ジメチル−グアノシン−5’
−トリホスフェート−5’−グアノシン、m7Gm−ppp−G)を有する。

0118

キャップ類似体がインビトロ転写反応において同時に起こる核酸分子のキャッピングを
可能にする一方で、転写物の最大20%がキャップされないままであり得る。これ、なら
びに内因性細胞転写機構によって産生される核酸の内因性5’−キャップ構造とのキャッ
プ類似体の構造差は、翻訳適格性の低下および細胞安定性の低下をもたらし得る。

0119

本発明の腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、および腫瘍学関連mm
RNAは、より真正の5’−キャップ構造を生成するために、酵素を用いて転写後にもキ
ャップされ得る。本明細書で使用するとき、「より真正の」という表現は、構造的または
機能的のいずれかで内因性または野生型特徴を酷似させるか、または模倣する特徴を指す
。すなわち、「より真正の」特徴は、先行技術の合成特徴もしくは類似体等と比較して、
より良好に内因性、野生型、天然、もしくは生理学的細胞機能および/もしくは構造を表
しているか、またはこれは、対応する内因性、野生型、天然または生理学的特徴を1つ以
上の点においてしのぐ。本発明のより真正の5’キャップ構造の非限定的な例には、当技
術分野で既知の合成5’キャップ構造(または野生型、天然、または生理学的5’キャッ
プ構造)と比較して、とりわけ、強化されたキャップ結合タンパク質の結合、増加した半
減期、低下した5’エンドヌクレアーゼに対する感受性、および/または低下した5’デ
キャッピングを有するものがある。例えば、組換えワクシニアウイルスキャッピング酵素
および組換え2’−O−メチルトランスフェラーゼ酵素は、mRNAの5’末端ヌクレオ
チドとグアニンキャップヌクレオチドとの間に基準の5’−5’−トリホスフェート結合
を生成し得、キャップグアニンは、N7メチル化を含有、mRNAの5’末端ヌクレオチ
ドは、2’−O−メチルを含有する。そのような構造は、キャップ1構造と称される。こ
のキャップは、例えば、当技術分野で既知の他の5’キャップ類似体構造と比較して、よ
り高い翻訳適格性および細胞安定性、ならびに細胞炎症誘発性サイトカインの活性化の低
下をもたらす。キャップ構造には、7mG(5’)ppp(5’)N,pN2p(キャッ
プ0)、7mG(5’)ppp(5’)NlmpNp(キャップ1)、および7mG(5
’)−ppp(5’)NlmpN2mp(キャップ2)が含まれるが、これらに限定され
ない。

0120

腫瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学関連mmRNAが
転写後にキャップされ得、かつこのプロセスがより効率的であるため、ほぼ100%の腫
瘍学関連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学関連mmRNAがキャ
ップされ得る。これは、キャップ類似体がインビトロ転写反応の過程でmRNAに結合さ
れるときの約80%とは大いに異なる。

0121

本発明に従って、5’末端キャップは、内因性キャップまたはキャップ類似体を含み得
る。本発明に従って、5’末端キャップは、グアニン類似体を含み得る。有用なグアニン
類似体には、イノシン、N1−メチル−グアノシン、2’フルオロ−グアノシン、7−デ
アザ−グアノシン、8−オキソ−グアノシン、2−アミノ−グアノシン、LNA−グアノ
シン、および2−アジド−グアノシンが含まれるが、これらに限定されない。

0122

ウイルス配列
大麦萎縮ウイルス(BYDV−PAV)の翻訳エンハンサー配列、ヤーグジークテ
ジレトロウイルス(JSRV)、および/または地方病腫瘍ウイルス(例えば、参
照により全体が本明細書に組み込まれる、国際公開第WO2012129648号を参照
のこと)等であるが、これらに限定されないさらなるウイルス配列は、本発明の腫瘍学関
連ポリヌクレオチド、腫瘍学関連一次構築物、または腫瘍学関連mmRNAの3’UTR
に操作および挿入され得、インビトロおよびインビボで構築物の翻訳を刺激し得る。トラ
スフクション実験を関連細胞株において行うことができ、ELISAによってタンパ
ク質産生をトランスフェクション後12時間、24時間、48時間、72時間、および7
日時点でアッセイすることができる。

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