技術 形質転換体及び当該形質転換体を用いたシキミ酸の生産方法

0001

本発明は、微生物を用いたシキミ酸の生産方法に関する。

0002

シキミ酸は、植物が芳香族化合物を生合成するための反応経路における重要な中間体であり、多くの植物に含まれる。また、シキミ酸は、インフルエンザ治療薬タミフル（登録商標）の出発原料としても用いられる。インフルエンザ治療薬タミフルの製造には、スターアニス（「八角」とも称される）から単離されたシキミ酸が用いられている。シキミ酸はまた、p−ヒドロキシ安息香酸やフェノール等の有用化学物質に化学的に変換可能であり、それらの合成原料としても有望である。

0003

シキミ酸の生産方法としては、植物バイオマス原料からの抽出、分離精製によるシキミ酸の製造方法が知られている（特許文献１）。しかし、植物からの抽出、精製方法は、煩雑であり、収率が低く、また原料が天然物であるため、安定供給や大量供給が困難といった問題がある。また、特許文献２には、発現可能な制御配列下に、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡにより形質転換されたコリネバクテリウム・グルタミカム形質転換体、及び当該形質転換体を用いて、還元条件下の反応液中に糖類の代謝速度を向上させて有機化合物を蓄積し、該反応液より有機化合物を回収することを特徴とする有機化合物の製造方法が記載されている。特許文献２には、当該方法により製造され得る有機化合物が多数列挙されており、そのなかの一つとしてシキミ酸も挙げられている。しかし、特許文献２の実施例等には、シキミ酸を製造する方法について具体的な開示はされていない。また、当該方法では、シキミ酸は宿主体内に蓄積することになり、そのため、シキミ酸を回収するためには当該宿主を破砕した上で分離精製という工程を経て得ることが必要なため煩雑であり、この点は特許文献１に記載の植物バイオマス原料からの抽出、分離精製と同様となる。また宿主の破砕を要するため、製造の都度に宿主の培養を最初からやり直す必要があり、非効率である。

0004

また、特許文献３には、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−６７２２で特定されるシトロバクター・フロインディの特殊な変異株がシキミ酸を分泌する能力を有すること、及び当該変異株を用いたシキミ酸の製造方法が記載されている。しかし、当該方法は非常に特殊な変異株を使用する必要がある。また、特許文献３には、シキミ酸を分泌する能力をもたらする遺伝因子（表現型）が具体的に特定されていない。かかる状況の下、シキミ酸を生物学的に生産する新たな方法の開発が熱望されている。

0005

特開２０１２−１８８３７４
特開２０１１−２２９５４４
特開２０００−７８９６７

0006

J Mol Biol. 2015 Feb 27;427(4):943-54

0007

本発明は、微生物を用いて簡便にシキミ酸を生産することができる新たな方法を提供することを課題とする。

0008

本発明者らは、鋭意検討を行った結果、多種多様な遺伝子のうちシキミ酸を効率的に排出する輸送体をコードしているものを特定し、かかる遺伝子を用いることにより上記課題を解決し得ることを見出した。本発明は、上記新たな知見に基づくものである。

0009

従って、本発明は以下の項を提供する：
項１．下記（Ａ）及び（Ｂ）の一方又は両方の要件を満たす遺伝子が、当該遺伝子が発現するように組み込まれた微生物を培養して、当該微生物にシキミ酸を生成させる工程を含む、シキミ酸の生産方法：
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子
（Ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれと７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子。

0010

項２．前記微生物が、前記遺伝子と、フュージョンパートナーをコードする遺伝子とを発現するように組み込んだ微生物であり、フュージョンパートナーをコードする遺伝子の終止コドンを構成するヌクレオチドの一部が前記遺伝子の開始コドンの一部となるように連結されて微生物に導入されている、項１に記載の方法。

0011

項３．前記培養工程で得られたシキミ酸を回収する工程をさらに含む、項１又は２に記載の方法。

0012

項４．前記微生物がバクテリアである項１〜３のいずれか１項に記載の方法。

0013

項５．下記（Ａ）及び（Ｂ）の一方又は両方の条件を満たす遺伝子を発現するように組み込んだ形質転換体：
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子
（Ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれと７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子。

0014

項６．項５に記載の形質転換体であって、シキミ酸の分泌能を有する、形質転換体。

0015

項７．項５又は６に記載の形質転換体であって、前記遺伝子と、フュージョンパートナーをコードする遺伝子とを発現するように組み込まれた形質転換体であり、フュージョンパートナーをコードする遺伝子の終止コドンを構成するヌクレオチドの一部が前記遺伝子の開始コドンの一部となるように連結されている、形質転換体。

0016

項８．バクテリアである項５〜７のいずれか１項に記載の形質転換体。

0017

本発明は、微生物を用いて簡便にシキミ酸を生産することができる新たな方法を提供する。

0018

図１［Ａ］：配列番号１の具体的な塩基配列を示す。図１［Ｂ］：配列番号２の具体的なアミノ酸配列を示す。
図１［Ａ］：配列番号８の具体的な塩基配列を示す。図１［Ｂ］：配列番号９の具体的なアミノ酸を示す。
図１［Ａ］：配列番号１２の具体的な塩基配列を示す。図１［Ｂ］：配列番号１３の具体的なアミノ酸を示す。
実施例の結果を示す。
実施例の結果を示す。

0019

本発明において、用語「遺伝子」には、特に言及しない限り、タンパク質、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等の一次構造を規定している構造遺伝子だけでなく、プロモーター、オペレーター等の特定の制御機能を有する核酸上の領域も包含される。従って、本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。また、「構造遺伝子」には、元のＤＮＡ配列にサイレント変異が施されたサイレントＤＮＡも包含される。また、本発明においては、遺伝子発現に干渉するｓｉＲＮＡ等の核酸分子も「遺伝子」に包含される。本発明においては、そうでないことを明示しない限り、用語「遺伝子」は、上記説明と矛盾しない範囲で、用語「核酸」と置き換えることができる。

0020

本明細書中において、「核酸」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドと同義であって、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドのいずれであってもよい。また、これらは２本鎖であっても１本鎖であってもよく、ある配列を有する核酸分子といった場合、特に言及しない限り、これに相補的な配列を有する核酸分子（またはヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド）も包括的に意味するものとする。また、これらの核酸分子は環状でも直鎖状であってもよく、また合成及び生物由来のいずれであってもよい。

0021

本発明において、用語「タンパク質（タンパク）」及び「ペプチド」は、特に言及しない限り、オリゴペプチド及びポリペプチドを含む意味で用いられる。また、本明細書において、「タンパク質」及び「ペプチド」は、特に言及しない限り、糖鎖などによって修飾されているタンパク質及び非修飾のタンパク質の両方を包含するものとする。このことは、タンパク質であることが明記されていないタンパク質についても同様である。

0022

本明細書中において、「膜タンパク質」は、特に言及しない限り、細胞膜に局在する形で発現し、所定の化合物の細胞内外の輸送能を有するタンパク質を含む意味で用いられる。また、「膜タンパク質」は、所定の化合物の細胞内外の輸送に関わる膜輸送体タンパク質、細胞膜に局在し、所定の化合物への触媒と細胞内外の輸送に関わる合成酵素タンパク質、または細胞膜において機能するタンパク質分泌装置と呼ばれる、細胞内外のタンパク質の輸送に関わる複数のタンパク質による構成される複合体を含むものとする。膜輸送体タンパク質はさらにエクスポータータンパク質、インポータータンパク質を含むものとする。

0023

形質転換体
本発明は、下記（Ａ）及び（Ｂ）の一方又は両方の条件を満たす遺伝子を発現するように組み込んだ形質転換体を提供する：
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子
（Ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれと７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子。

0024

本発明における上記要件（Ａ）に規定されている配列番号１は、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のある膜タンパク質をコードする核酸の塩基配列を示す。配列番号１の具体的な塩基配列を図１［Ａ］に示す。上記要件（Ａ）において、配列番号１で表される塩基配列又はこれと９５％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子が好ましく；配列番号１で表される塩基配列又はこれと９７％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子がより好ましく；配列番号１で表される塩基配列又はこれと９９％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子がより好ましい。要件（Ａ）を満たす遺伝子としては、下記要件（Ｂ）で示される配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又はこれと機能的等価物をコードするものが好ましい。また、「配列番号１で表される塩基配列を有する遺伝子」には、いわゆるサイレント変異のように、配列番号１とは塩基配列が異なるものの、コードするアミノ酸配列が同一であるような塩基配列を有する遺伝子も包含される。

0025

本発明における上記要件（Ｂ）に規定されている配列番号２は、コリネバクテリウムグルタミカムのある膜タンパク質のアミン酸配列を示す。配列番号２の具体的なアミノ酸配列を図１［Ｂ］に示す。上記要件（Ｂ）において、配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子が好ましく；配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれと８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するｐポリペプチドをコードする遺伝子がより好ましく；配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子がより好ましく；配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれと９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子がより好ましく；配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれと９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子がより好ましく；配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれと９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子がより好ましい。要件（Ａ）を満たす遺伝子としては、下記要件（Ｂ）で示される配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又はこれと機能的等価物をコードするものが好ましい。上記要件（Ｂ）において、配列番号２で表されるアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと機能的等価物が好ましい。

0026

本発明においては、前記「（Ａ）及び（Ｂ）の一方又は両方の条件を満たす遺伝子」を、遺伝子Ｘと示すこともある。本発明者らは、エクスポータータンパク質の機能が示唆されている多種多様に存在する遺伝子のうち、上記遺伝子Ｘを微生物に導入した場合に、シキミ酸の細胞外への分泌が非常に高くなることを見出した。

0027

上記遺伝子Ｘを得る方法は特に限定されないが、例えば、後述の実施例のように、所定の微生物のゲノムＤＮＡを鋳型にし、適当なプライマーを用いたＰＣＲにより、膜輸送体候補タンパク質をコードする遺伝子を増幅することにより得ることができる。膜タンパク質としてどの微生物に由来するものを用いるかは特に限定されないが、例えば、「遺伝子を導入する微生物」として後述する微生物等が挙げられる。当該膜タンパク質を元々有する微生物と当該膜タンパク質の遺伝子を導入する微生物とは異なる種類のものでも同一種でもよい。

0028

これらの遺伝子Ｘを導入する微生物としては、特に限定されないが、本発明においては、真核生物、原核生物のうち、原核生物が好ましい。原核生物としては、例えば、大腸菌、放線菌（Corynebacterium属、Streptomyces属、Propionibacterium属等）、乳酸菌（Lactobacillus、Streptococcus属等）、枯草菌（Bacillus属等）等のバクテリア（真正細菌）が挙げられ、大腸菌、放線菌等が好ましい。Corynebacterium属としては、Corynebacterium glutamicum、Corymebacterium ammoniagenes、Corynebacterium lactofermentum、Corynebacterium efficiens等が挙げられる。

0029

上記微生物に、遺伝子Ｘを導入する方法としては、導入する遺伝子Ｘとして前述のものを用いる以外、自体公知の方法に従い行うことができる。例えば、遺伝子Ｘを組み込んだベクターを構築し、当該ベクターの存在下で上記微生物をインキュベートすることにより行うことができる。

0030

本発明の実施形態において、形質転換体には、上記遺伝子Ｘに加え、フュージョンパートナーをコードする遺伝子が組み込まれていることが好ましい。

0031

本発明において、フュージョンパートナーとは、発現させるタンパク質のN末端側に結合させるタンパク質で、膜タンパク質のmRNAの安定化や膜タンパク質の細胞膜上での発現量の向上といった効果を発揮するもので（非特許文献１）、発現させるタンパク質を精製する際にも利用される。代表的なものにはmstX、ybeLなどがある。尚、非特許文献１には、フュージョンパートナーであるmstX、ybeLをProW、MscL、LacY、GltPといった膜タンパク質に連結してin vivoで発現させたことが記載されている。しかし、非特許文献１には、発現させた膜タンパク質が有用物質生産代謝系と共同して機能し、物質生産の効率化に寄与するかどうかの検討結果に関する開示はない。本発明において、mstXとは、Genbank accession No.YP_003097778.1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は当該アミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド（典型的には上記ポリペプチドとの機能的等価物）を示す。また、本発明において、ybeLとは、Genbank accession No.NP_415176.1に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は当該アミノ酸配列と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９９％以上）の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド（典型的には上記ポリペプチドとの機能的等価物）を示す。

0032

本実施形態において、上記微生物に、フュージョンパートナーをコードする遺伝子と、遺伝子Ｘとを導入する方法としては、導入する遺伝子としてフュージョンパートナーをコードする遺伝子及び遺伝子Ｘを用いる以外、自体公知の方法に従い行うことができる。例えば、フュージョンパートナーをコードする遺伝性及び遺伝子Ｘを組み込んだベクターを構築し、当該ベクターの存在下で上記微生物をインキュベートすることにより行うことができる。本発明においては、フュージョンパートナーをコードする遺伝子と、前記遺伝子ＸとがポリシストロニックｍRNAの翻訳により発現するように連結された遺伝子として前記微生物に組み込まれていることが好ましい。また、フュージョンパートナーをコードする遺伝子と、前記遺伝子Ｘとが融合タンパク質として発現するように連結された遺伝子として前記微生物に組み込まれていることも好ましい。これらの好ましい実施形態において、前記連結された遺伝子において、前記フュージョンパートナーをコードする遺伝子の終止コドンを構成するヌクレオチドの一部が前記遺伝子Ｘの開始コドンの一部となるように連結されていることがさらに好ましい。上記微生物には、シキミ酸を発現するか又はシキミ酸の発現を促進する遺伝子をさらに導入してもよい。また、前記微生物（好ましくは大腸菌）には、当該微生物のレアコドンに対応するｔRNAをコードする遺伝子がさらに組み込まれていることが、tRNAレパートリーの拡充の観点から好ましい。本発明の形質転換体はシキミ酸を細胞外に分泌することができる。従って、本発明の形質転換体はシキミ酸の生産に非常に有用である。

0033

シキミ酸の生産方法
別の実施形態において、本発明は、下記（Ａ）及び（Ｂ）の一方又は両方の要件を満たす遺伝子が、当該遺伝子が発現するように組み込まれた微生物を培養して、当該微生物にシキミ酸を生成させる工程を含む、シキミ酸の生産方法を提供する：
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列又はこれと９０％以上の同一性を有する塩基配列を有する遺伝子
（Ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列又はこれと７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子。

0034

本発明は、前記遺伝子Ｘが組み込まれた微生物を培養して、当該微生物にシキミ酸を生成させる工程を含む。

0035

当該工程で用いる培地としては、特に限定されず、上記微生物の培養に用いることができるものを広く使用することができる。例えば、ＬＢ培地、Ｍ９培地、ＭＲＳ培地、マルツ培地、ブイヨン培地等が挙げられる。上記培地には、炭素源として、グルコース、でんぷん、可溶性でんぷん、廃糖蜜、コーンスティープリカー等を添加してもよい。膜輸送体候補タンパク質が、インポーター候補タンパク質の場合、所定の化合物を予め培地に添加しておいてもよい。培養温度は特に限定されず、２０〜４５℃、より好ましくは２５〜３７℃の範囲で適宜設定できる。培養時間も特に限定されないが、例えば、１２〜７２時間、より好ましくは２４〜４８時間の範囲で適宜設定できる。培養は、静置培養でも振盪培養でもよいが、振盪培養が好ましい。

0036

本実施形態で用いる遺伝子Ｘが組み込まれた微生物についての詳細、具体的には、遺伝子Ｘの説明（遺伝子Ｘを得る方法、当該遺伝子Ｘを導入する方法等）、フュージョンパートナーの定義、微生物等の例示等は、前記「形質転換体」で説明した通りである。

0037

本発明の方法は、上記培養工程で得られた培養液から所定の化合物を回収する工程をさらに含んでいてもよい。培養培地からの所定の化合物の回収方法としては、特に限定されず、自体公知の方法（遠心分離、再結晶、蒸留法、溶媒抽出法、クロマトグラフィー等）を適宜用いることができる。

0038

以下に、本願実施例を用いて本発明の具体的な実施形態を説明するが、本発明は当該実施例に示される実施形態に限定されない。

0039

＜実験方法の詳細＞
（１）膜蛋白質高発現用ベクタープラスミドの構築（全実施例共通）
（１）−１．ｐＴｒｃ９９Ａ＿ｍｓｔＸ＿Ｃ８＿Ｈｉｓの作成
プラスミドベクターｐＴｒｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を制限酵素ＸｂａＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断処理し、リンカーとＴＥＶプロテアーゼ認識配列、Ｈｉｓ−ｔａｇを有するオリゴＤＮＡにＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの認識配列を５´端及び３´端にそれぞれ付加した配列（CTAGAGGTGGCGGTGGCGGTGGCGGTGGCGAAAACCTGTACTTCCAGG
GTCACCACCACCACCACCATCATCATtaaTAGCT）（配列番号３）をライゲーションにより挿入した（ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｃ８＿Ｈｉｓ）。本配列は、北海道システム・サイエンス株式会社に合成を委託して取得した。

0040

次に、ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｃ８＿Ｈｉｓを制限酵素ＮｃｏＩとＫｐｎＩで切断処理し、クローニングしたｍｓｔＸ遺伝子をライゲーションにより挿入した。ｍｓｔＸ遺伝子断片は、ＬＢ培地を用いて枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を培養後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ （Ｔａｋａｒａ）を付属のプロトコル通りに用いて、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からゲノムＤＮＡを抽出し、抽出したＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムＤＮＡを鋳型とし、
forward primer: AGGAAACAGACcatgttttgtacattttttgaaaaacatcaccgg（配列番号４）、および
reverse primer: TAGAGGATCCCCGGGTACCACTCATtctttttctccttcttcagatactg（配列番号５）
をプライマーとして用いて、ＰＣＲにより増幅することで得た。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ）を付属のプロトコル通りに用いて、前記ｍｓｔＸ遺伝子断片をＮｃｏＩ及びＫｐｎＩで処理後、ｐＴｒｃ９９Ａ＿Ｃ８＿Ｈｉｓにライゲーションした（ｐＴｒｃ９９Ａ＿ｍｓｔＸ＿Ｃ８＿Ｈｉｓ）。

0041

（２）−１．シキミ酸輸送体DNAの単離
培地（ポリペプトン２ ｇ， Ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ ０．４ ｇ， ＭｇＳＯ４ ７Ｈ２Ｏ ０．２ ｇ／ ２００ ｍｌ）を用いてコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）を培養し、菌体よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｔｉｓｓｕｅ （Ｔａｋａｒａ）を付属のプロトコル通りに用いてゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したゲノムＤＮＡを鋳型にして、コリネバクテリウム・グルタミカムのゲノムデータベース（https://www.ncbi.nim.nih.gov）から得た「NCgl2828」全長を増幅できるように設計した
forward primer: GAAAAGAATGAGTGGTACCATGAACTCCATGAGCCAAGC（配列番号６）、および
reverse primer: CACCGCCACCTCTAGAATTGGCGTTGCGGGCAAG（配列番号７）
をプライマーとして用いて、ＰＣＲにより増幅することでNGgl 2828のDNAを得た（＝配列番号１）。ｐＴｒｃ９９Ａ＿ｍｓｔＸ＿Ｃ８＿Ｈｉｓを制限酵素ＫｐｎＩとＸｂａＩで処理し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ （Ｔａｋａｒａ）を付属のプロトコル通りに用いて配列番号１を融合し、シキミ酸輸送体発現用プラスミドベクターを構築した。このとき、図Xに示すようにｍｓｔＸ遺伝子の終止コドンと各輸送体遺伝子の開始コドンが互いにその一部を共有する状態となっている。

0042

（２）−２．輸送体発現用大腸菌の形質転換
毒性タンパク質の発現に適した大腸菌Ｃ４３ （ＤＥ３）株（Ｌｕｃｉｇｅｎ社）に大腸菌のレアコドンに対応するｔＲＮＡを補充するプラスミドｐＲＡＲＥ（メルク社）を形質転換した株（Ｃ４３ （ＤＥ３） Ｒｏｓｅｔｔａ株）を（２）−１で得たシキミ酸輸送体発現用プラスミドベクターの発現宿主とし、実施例株を得た。またコントロールとして、膜輸送体遺伝子をライゲーションしていないｐＴｒｃ９９Ａ＿ｍｓｔＸ＿Ｃ８＿Ｈｉｓを前記発現宿主に導入しコントロール株を取得した。

0043

実施例株およびコントロール株を、ＬＢ培地を用いて３０℃、２４ ｈ前培養し、前培養液を得た。５０ ｍｌ Ｍ９最小培地に抗生物質アンピシリン（１００ μｇ／ｍｌ）とクロラムフェニコール（３０ μｇ／ｍｌ）を添加し、前培養液５００ μｌを添加し、３７℃で振盪培養した。ＯＤ６６０が、おおよそ０．５になった時に、終濃度が１ ｍＭ となるようにＩＰＴＧを添加し、ひきつづき３７℃で、２４時間振盪培養した。２４時間培養後、９，０００ ｒｐｍ， １５ ｍｉｎ遠心し、実施例株培養上清およびコントロール株培養上清を得た。

0044

（２）−３．培養液のLC-MS/MS分析
（２）−２における前培養液、実施例株培養上清およびコントロール株培養上清を０．２２ μｍのフィルターを用いてろ過した。各ろ液をHPLC-ESI-MS/MS（表１）に供し，シキミ酸の定量を行った。

0045

0046

さらに、下記に記載の方法により、ＴＯＦ−ＭＳでも形質転換体により生産されたシキミ酸の定量を行った。２）−２における前培養液、実施例株培養上清およびコントロール株培養上清を０．２２ μｍのフィルターを用いてろ過した。各ろ液をイオン化のために等量のマトリックス(5mg/mL CHCA(溶媒は70%アセトニトリル、0.1%TFA) ) と混合し、TOF/TOFTM 5800（SCIEX社製）に供した。シキミ酸のピークは、標品を用いて確認（図５上段、Shikimic acid (Std.)）し、各ろ液のシキミ酸のピーク強度を比較した（図５）。

0047

また、プライマーとして上記配列番号６及び７で示されるものに代えて下記配列で示されるもの用いてＰＣＲ行う以外、上記（２）−１〜（２）−３と同様にして、NCgl2961のＤＮＡ（具体的な配列情報は図２に示す）を導入した形質転換体を製造し、そのシキミ酸産生能を評価した：
FW:GAAAAGAATGAGTGGTACCAGCCCGATTCGCTCAAAAAAG（配列番号１０）
RV:CACCGCCACCTCTAGATGCGTTTTGCTTTTCAGCACC（配列番号１１）。
同様に、プライマーとして上記配列番号６及び７で示されるものに代えて下記配列で示されるもの用いてＰＣＲ行う以外、上記（２）−１〜（２）−３と同様にして、NCgl2548のＤＮＡ（具体的な配列情報は図３に示す）を導入した形質転換体を製造し、そのシキミ酸産生能を評価した：
FW:GAAAAGAATGAGTGGTACCGAACATTCTCCTGAAGGCAAG（配列番号１４）
RV:CACCGCCACCTCTAGATTTCTTCCCTAGATCTTCAAGCTTG（配列番号１５）。

0048

（２）−４．結果
図４及び５に示す。LC-MS/MSでの分析の結果、NCgl 2828の遺伝子を導入した形質転換体の培養上清ではシキミ酸が前培養液、コントロール培養上清ならびにNCgl 2961の遺伝子を導入した形質転換体及びNCgl 2548の遺伝子を導入した形質転換体の培養上清に比べ格段に含まれていることが分かった（図４）。また、またTOF-MSでも同様に、の培養上清ではシキミ酸が前培養液、コントロール培養上清ならびにNCgl 2961の遺伝子を導入した形質転換体及びNCgl 2548の遺伝子を導入した形質転換体の培養上清に比べ格段に含まれていることが分かった（図５）。以上から、配列番号１はシキミ酸輸送体をコードする遺伝子であることが特定され、前記遺伝子を発現させることによりシキミ酸を効率的に産生できることが示された。また、前述のゲノムデータベースでは、NCgl 2961及びNCgl 2548は膜輸送体機能を有しうることが示唆されており、NCgl 2548についてはシキミ酸輸送体であることが示唆されている。従って、NCgl 2828のほうがシキミ酸の産生、分泌を格段に向上させることは、予想外の効果といえる。