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課題

細胞阻害分子プログラム細胞死1(PD−1)タンパク質に結合する抗体、及びその使用方法の提供。

解決手段

特定のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に含まれる3つの重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)、及び特定のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に含まれる、3つの軽鎖(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)を含む、ヒトプログラム細胞死1(PD−1)タンパク質に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント

概要

背景

プログラム細胞死1(PD−1)(CD279とも呼ばれる)は、活性化されたT細胞およびB細胞ナチュラルキラー細胞、ならびに単球上で発現される288個のアミノ酸タンパク質受容体である。PD−1は、T細胞共阻害受容体のCD28/CTLA−4(細胞傷害性Tリンパ球抗原)/ICOS(誘導性共刺激分子ファミリーメンバーである(非特許文献1)。PD−1の主要な機能は、免疫応答減弱させることである(非特許文献2)。PD−1は、2つのリガンド、PD−リガンド1(PD−L1)およびPD−L2を有する。PD−L1(CD274、B7H1)は、CD4およびCD8T細胞、マクロファージ系列細胞抹消組織、ならびに腫瘍細胞ウイルス性に感染した細胞、および自己免疫組織細胞のようなリンパ組織上および非リンパ組織上の両方で広く発現する。PD−L2(CD273、B7−DC)は発現がPD−L1よりも制限されており、活性化された樹状細胞およびマクロファージ上で発現される(非特許文献3)。PD−L1は、メラノーマグリオーマ非小細胞肺がん、頭部および頸部扁平上皮癌白血病膵臓がん腎細胞癌、ならびに肝細胞癌を含む、大抵のヒトがんにおいて発現され、ほぼ全てのがんタイプにおいて誘導性である(非特許文献4)。PD−1がそのリガンドに結合すると、がん、ウイルス感染症、および自己免疫疾患のような疾患において、T細胞増殖およびサイトカイン分泌が低減され、体液性および細胞性免疫応答が損なわれる。免疫抑制逆転させるためのPD−1結合の遮断は、自己免疫、ウイルスおよび腫瘍免疫療法において研究されている(非特許文献5、非特許文献6、非特許文献7)。

T細胞共刺激および共阻害分子(共シグナル伝達分子とまとめて命名される)は、T細胞活性化、サブセット分化エフェクター機能および生存の制御において重大な役割を果たす(非特許文献1)。T細胞受容体による抗原提示細胞上の同族ペプチドMHC複合体の認識後、共シグナル伝達受容体は、免疫シナプスにおいてT細胞受容体と共存し、ここで、TCRシグナル伝達と協力して、T細胞活性化および機能を促進するか、または阻害する(非特許文献8)。最終免疫応答は、共刺激シグナルと共阻害シグナルの間のバランス(「免疫チェックポイント」)により制御される(非特許文献9)。PD−1は、抹消T細胞寛容仲介および自己免疫の回避において1つのかかる「免疫チェックポイント」として機能する。PD−1は、PD−L1またはPD−L2に結合し、T細胞活性化を阻害する。T細胞活性化を阻害するPD1の能力は、免疫応答を逃れるために慢性ウイルス感染症および腫瘍により利用される。慢性ウイルス感染症において、PD−1はウイルス特異的T細胞上で高度に発現され、これらのT細胞は「疲弊」し、エフェクター機能および増殖能喪失する(非特許文献10)。PD−L1は広範囲の腫瘍上で発現され、動物モデルにおける研究は、腫瘍上のPD−L1が、T細胞活性化および腫瘍細胞の溶解を阻害し、腫瘍特異的T細胞の死の増大を導くことを示した。PD−1:PD−L1システムはまた、誘導されたT制御性(Treg)細胞発生において、およびTreg機能の維持において重要な役割を果たす(非特許文献11)。

PD−1は、自己免疫、腫瘍免疫、および感染免疫において重要な役割を果たすので、免疫療法理想的な標的である。モノクローナル抗体を含む、アンタゴニストでのPD−1の遮断は、がんおよび慢性ウイルス感染症の処置において研究されている(非特許文献12)。

PD−1に対するモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知であり、例えば、特許文献1、特許文献2、特許文献3、特許文献4、特許文献5において、ならびに特許文献6、特許文献7、特許文献8、特許文献9、特許文献10、特許文献11および特許文献12において記載されている。

概要

T細胞共阻害分子プログラム細胞死1(PD−1)タンパク質に結合する抗体、及びその使用方法の提供。特定のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域(HCVR)内に含まれる3つの重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2およびHCDR3)、及び特定のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域(LCVR)内に含まれる、3つの軽鎖(LCDR1、LCDR2およびLCDR3)を含む、ヒトプログラム細胞死1(PD−1)タンパク質に特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。なし

目的

本発明は、PD−1に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する

効果

実績

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請求項1

トプログラム細胞死1(PD−1)タンパク質への結合について、表1において挙げられるHCVR配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域(HCVR)の相補性決定領域(CDR);および表1に挙げられるLCVR配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域(LCVR)のCDRを含む参照抗体またはその抗原結合フラグメント競合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって:(a)25℃における競合サンドイッチELISAアッセイにおいて測定される3nM未満のIC50でPD−L1へのヒトPD−1タンパク質結合遮断する特性;(b)37℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定される約50nM未満の結合解離平衡定数(KD)で単量体ヒトPD−1に結合する特性;(c)25℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて約12nM未満のKDで単量体ヒトPD−1に結合する特性;(d)25℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて約8.5nM未満のKDで単量体カニクイザルPD−1に結合する特性;(e)25℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定される約6.3分より長い解離半減期(t1/2)で単量体ヒトPD−1に結合する特性;および(f)37℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて測定される約0.9分より長い解離半減期(t1/2)で単量体ヒトPD−1に結合する特性のうちの1つまたはそれ以上を有する、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項2

参照抗体またはその抗原結合フラグメントは、表1に記載のHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む、請求項1に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項3

参照抗体は、配列番号130/138、162/170、234/202、および314/186からなる群より選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む、請求項2に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項4

ヒトPD−1に特異的に結合する、単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、表1において挙げられるHCVR配列のいずれか1つに含有される3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3);ならびに表1において挙げられるLCVR配列のいずれか1つに含有される3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)を含む、前記単離されたヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項5

表1において挙げられるHCVR配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCVRを含む、請求項4に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項6

表1において挙げられるLCVR配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項4または5に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項7

(a)表1において挙げられるHCVR配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCVR;および(b)表1において挙げられるLCVR配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項4〜6のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項8

(a)配列番号4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、220、228、236、244、252、260、268、276、284、292、300、308、および316からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR1ドメイン;(b)配列番号6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、222、230、238、246、254、262、270、278、286、294、302、310、および318からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR2ドメイン;(c)配列番号8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、および320からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCDR3ドメイン;(d)配列番号12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、および204からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR1ドメイン;(e)配列番号14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、および206からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR2ドメイン;ならびに(f)配列番号16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、および208からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCDR3ドメインを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項9

PD−L1へのPD−1結合を遮断する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、配列番号18、34、50、66、82、114、130、162、178、194、210、218、226、234、242、258、266、274、282、290、298、306、および314からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCVRのCDR;ならびに配列番号26、42、58、74、90、122、138、170、186、および202からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCVRのCDRを含む、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項10

配列番号130/138、162/170、234/202、および314/186からなる群より選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む、請求項9に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項11

ヒトPD−1に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントであって、25℃における競合サンドイッチELISAアッセイにより測定される、PD−L1へのPD−1結合を増強する、前記単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項12

抗体は、配列番号2、98、および250からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCVRのCDR;ならびに配列番号10、106、および202からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCVRのCDRを含む、請求項11に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項13

抗体は、配列番号2/10、98/106、および250/202からなる群より選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む、請求項12に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項14

抗体は多特異性抗原結合分子である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項15

請求項1〜14のいずれか1項に記載の、PD−1に結合する単離された抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学的に許容し得る担体もしくは希釈剤を含む医薬組成物

請求項16

請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗体のHCVRをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子

請求項17

請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗体のLCVRをコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。

請求項18

請求項16または17に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター

請求項19

請求項18に記載のベクターを発現する細胞

請求項20

PD−1に特異的に結合する第1の抗原結合特異性、およびPD−L1もしくはPD−L2の細胞外ドメイン、またはそのフラグメントを含む第2の抗原結合特異性を含む多特異性抗原結合分子またはその抗原結合フラグメント。

請求項21

PD−1に特異的に結合する第1の抗原結合特異性、およびT細胞共阻害分子に特異的に結合する第2の抗原結合特異性を含む多特異性抗原結合分子またはその抗原結合フラグメント。

請求項22

第1の抗原結合特異性は、表1において挙げられるHCVR配列のいずれか1つに含有される3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3);ならびに表1において挙げられるLCVR配列のいずれか1つに含有される3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)を含む、請求項20または21に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。

請求項23

第1の抗原結合特異性は、表1において挙げられるHCVR配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCVR;および表1において挙げられるLCVR配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項20〜22のいずれか1項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。

請求項24

第1の抗原結合特異性は、配列番号130/138、162/170、234/202、および314/186からなる群より選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む、請求項23に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。

請求項25

第2の抗原結合特異性は、LAG3、TIM3、B7−1、CTLA−4、BTLA、CD28、2B4、LY108、TIGIT、ICOS、およびCD160からなる群より選択されるT細胞共阻害分子に特異的に結合する、請求項21に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。

請求項26

腎細胞癌結腸直腸がん卵巣がん前立腺がん乳がん大腸がん非小細胞肺がん、およびメラノーマからなる群より選択されるがん処置において使用するための、請求項20〜25のいずれか1項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。

請求項27

ヒト免疫不全ウイルスHIV)、B型肝炎ウイルスHBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスLCMV)、およびサル免疫不全ウイルス(SIV)からなる群より選択されるウイルスにより引き起こされる慢性ウイルス感染症の処置において使用するための、請求項20〜25のいずれか1項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。

請求項28

PD−1に特異的に結合する第1の抗原結合特異性、ならびに自己免疫組織特異的抗原、T細胞受容体、およびFc受容体からなる群より選択される抗原に特異的に結合する第2の抗原結合特異性を含む多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。

請求項29

第1の抗原結合特異性は、表1において挙げられるHCVR配列のいずれか1つに含有される3つの重鎖CDR(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3);ならびに表1において挙げられるLCVR配列のいずれか1つに含有される3つの軽鎖CDR(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)を含む、請求項28に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。

請求項30

第1の抗原結合特異性は、表1において挙げられるHCVR配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCVR;および表1において挙げられるLCVR配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCVRを含む、請求項28または29に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。

請求項31

第1の抗原結合特異性は、配列番号130/138、162/170、234/202、および314/186からなる群より選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む、請求項30に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。

請求項32

第1の抗原結合特異性は、PD−L1および/もしくはPD−L2の細胞外ドメイン、またはそのフラグメントを含む、請求項28に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。

請求項33

第2の抗原結合特異性は、自己免疫組織特異的抗原に特異的に結合する、請求項28〜32のいずれか1項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。

請求項34

請求項35

第2の抗原結合特異性は、T細胞受容体、Fcα受容体、Fcγ受容体、またはCD19のうちの1つに特異的に結合する、請求項28〜32のいずれか1項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。

請求項36

円形脱毛症、自己免疫性肝炎、セリアック病、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、炎症性腸疾患、炎症性ミオパチー、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、白斑、自己免疫性膵炎、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性血小板減少性紫斑病、クローン病、I型糖尿病、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、乾癬性関節炎、リウマチ熱、潰瘍性大腸炎、脈管炎、およびウェゲナー肉芽腫症からなる群より選択される自己免疫疾患または障害の処置において使用するための、請求項28〜35のいずれか1項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメント。

請求項37

対象において免疫応答を増強する方法であって、請求項1〜13のいずれか1項に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント;または請求項20〜25のいずれか1項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメントを含む医薬組成物を投与することを含む前記方法。

請求項38

対象においてT制御性(Treg)細胞を阻害する方法であって、請求項1〜13のいずれか1項に記載の単離されたヒト抗体またはその抗原結合フラグメント;または請求項20〜25のいずれか1項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメントを含む医薬組成物を投与することを含む前記方法。

請求項39

対象においてT細胞活性化を増強する方法であって、請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント;または請求項20〜25のいずれか1項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメントを含む医薬組成物を投与することを含む前記方法。

請求項40

対象は、脳がん、腎細胞癌、卵巣がん、前立腺がん、大腸がん、非小細胞肺がん、頭部および頸部扁平上皮癌、結腸直腸がん、およびメラノーマからなる群より選択される疾患または障害を有する、請求項37〜39のいずれか1項に記載の方法。

請求項41

対象は、HIV、HCV、HBV、HPV、LCMV、およびSIVからなる群より選択されるウイルスにより引き起こされる慢性ウイルス感染症を有する、請求項37〜39のいずれか1項に記載の方法。

請求項42

腫瘍または腫瘍細胞成長を阻害する方法であって、腫瘍または腫瘍細胞を、治療上有効量の請求項1〜13または20〜25のいずれか1項に記載の抗体と接触させることを含む前記方法。

請求項43

対象においてT細胞活性化を阻害する方法であって、治療上有効量の、請求項1〜13のいずれか1項に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント;または請求項28〜35のいずれか1項に記載の多特異性抗原結合分子またはそのフラグメントを投与することを含む前記方法。

請求項44

対象は、円形脱毛症、自己免疫性肝炎、セリアック病、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本病、溶血性貧血、炎症性腸疾患、炎症性ミオパチー、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、白斑、自己免疫性膵炎、自己免疫性蕁麻疹、自己免疫性血小板減少性紫斑病、クローン病、I型糖尿病、好酸球性筋膜炎、好酸球性胃腸炎、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、乾癬性関節炎、リウマチ熱、潰瘍性大腸炎、脈管炎、およびウェゲナー肉芽腫症からなる群より選択される自己免疫疾患または障害を有する、請求項43に記載の方法。

請求項45

抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または該抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物は、第2の治療剤と併用して対象に投与される、請求項37〜44のいずれか1項に記載の方法。

請求項46

第2の治療剤は、NSAID、コルチコステロイド、異なるT細胞共阻害分子に対する抗体、腫瘍特異的抗原に対する抗体、自己免疫組織抗原に対する抗体、ウイルス性に感染した細胞抗原に対する抗体、PD−L1に対する抗体、酸化防止剤のような栄養補助剤VEGFアンタゴニスト化学療法剤細胞毒性剤抗ウイルス薬放射線、および疾患または障害に関連する少なくとも1つの症状の改善に有用である任意の他の療法からなる群より選択される、請求項45に記載の方法。

請求項47

抗体またはその抗原結合フラグメントは、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋肉内、または頭蓋内投与される、請求項37〜46のいずれか1項に記載の方法。

請求項48

抗体または抗原結合フラグメントは、対象の体重1kg当たり約0.1mg〜体重1kg当たり約60mgの用量で投与される、請求項37〜47のいずれか1項に記載の方法。

請求項49

ヒトPD−1への結合について、重鎖および軽鎖を含む参照抗体またはその抗原結合フラグメントと競合し、ここで、該重鎖は、配列番号330、332、334、および336からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。

請求項50

ヒトPD−1への結合について、重鎖および軽鎖を含む参照抗体またはその抗原結合フラグメントと競合し、ここで、該軽鎖は、配列番号331、333、335、および337からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。

請求項51

ヒトPD−1への結合について、配列番号330/331、332/333、334/335、および336/337からなる群より選択される重鎖/軽鎖アミノ酸配列対を含む参照抗体またはその抗原結合フラグメントと競合する、請求項1に記載の単離された抗体または抗原結合フラグメント。

請求項52

請求項49〜51のいずれか1項に記載のPD−1に結合する単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学的に許容し得る担体または希釈剤を含む医薬組成物。

請求項53

請求項49〜51のいずれか1項に記載の抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。

請求項54

請求項49〜51のいずれか1項に記載の抗体の軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。

請求項55

請求項53または54に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。

請求項56

請求項55に記載のベクターを発現する細胞。

技術分野

0001

本発明は、免疫調節受容体プログラム細胞死1(PD−1)に特異的に結合するヒト抗体およびヒト抗体の抗原結合フラグメントならびにその抗体を用いる治療および診断方法に関する。

背景技術

0002

プログラム細胞死1(PD−1)(CD279とも呼ばれる)は、活性化されたT細胞およびB細胞ナチュラルキラー細胞、ならびに単球上で発現される288個のアミノ酸タンパク質受容体である。PD−1は、T細胞共阻害受容体のCD28/CTLA−4(細胞傷害性Tリンパ球抗原)/ICOS(誘導性共刺激分子ファミリーメンバーである(非特許文献1)。PD−1の主要な機能は、免疫応答減弱させることである(非特許文献2)。PD−1は、2つのリガンド、PD−リガンド1(PD−L1)およびPD−L2を有する。PD−L1(CD274、B7H1)は、CD4およびCD8T細胞、マクロファージ系列細胞抹消組織、ならびに腫瘍細胞ウイルス性に感染した細胞、および自己免疫組織細胞のようなリンパ組織上および非リンパ組織上の両方で広く発現する。PD−L2(CD273、B7−DC)は発現がPD−L1よりも制限されており、活性化された樹状細胞およびマクロファージ上で発現される(非特許文献3)。PD−L1は、メラノーマグリオーマ非小細胞肺がん、頭部および頸部扁平上皮癌白血病膵臓がん腎細胞癌、ならびに肝細胞癌を含む、大抵のヒトがんにおいて発現され、ほぼ全てのがんタイプにおいて誘導性である(非特許文献4)。PD−1がそのリガンドに結合すると、がん、ウイルス感染症、および自己免疫疾患のような疾患において、T細胞増殖およびサイトカイン分泌が低減され、体液性および細胞性免疫応答が損なわれる。免疫抑制逆転させるためのPD−1結合の遮断は、自己免疫、ウイルスおよび腫瘍免疫療法において研究されている(非特許文献5、非特許文献6、非特許文献7)。

0003

T細胞共刺激および共阻害分子(共シグナル伝達分子とまとめて命名される)は、T細胞活性化、サブセット分化エフェクター機能および生存の制御において重大な役割を果たす(非特許文献1)。T細胞受容体による抗原提示細胞上の同族ペプチドMHC複合体の認識後、共シグナル伝達受容体は、免疫シナプスにおいてT細胞受容体と共存し、ここで、TCRシグナル伝達と協力して、T細胞活性化および機能を促進するか、または阻害する(非特許文献8)。最終免疫応答は、共刺激シグナルと共阻害シグナルの間のバランス(「免疫チェックポイント」)により制御される(非特許文献9)。PD−1は、抹消T細胞寛容仲介および自己免疫の回避において1つのかかる「免疫チェックポイント」として機能する。PD−1は、PD−L1またはPD−L2に結合し、T細胞活性化を阻害する。T細胞活性化を阻害するPD1の能力は、免疫応答を逃れるために慢性ウイルス感染症および腫瘍により利用される。慢性ウイルス感染症において、PD−1はウイルス特異的T細胞上で高度に発現され、これらのT細胞は「疲弊」し、エフェクター機能および増殖能喪失する(非特許文献10)。PD−L1は広範囲の腫瘍上で発現され、動物モデルにおける研究は、腫瘍上のPD−L1が、T細胞活性化および腫瘍細胞の溶解を阻害し、腫瘍特異的T細胞の死の増大を導くことを示した。PD−1:PD−L1システムはまた、誘導されたT制御性(Treg)細胞発生において、およびTreg機能の維持において重要な役割を果たす(非特許文献11)。

0004

PD−1は、自己免疫、腫瘍免疫、および感染免疫において重要な役割を果たすので、免疫療法理想的な標的である。モノクローナル抗体を含む、アンタゴニストでのPD−1の遮断は、がんおよび慢性ウイルス感染症の処置において研究されている(非特許文献12)。

0005

PD−1に対するモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知であり、例えば、特許文献1、特許文献2、特許文献3、特許文献4、特許文献5において、ならびに特許文献6、特許文献7、特許文献8、特許文献9、特許文献10、特許文献11および特許文献12において記載されている。

0006

米国特許第8008449号
米国特許第8168757号
米国特許出願公開第20110008369号
米国特許出願公開第20130017199号
米国特許出願公開第20130022595号
WO2006121168
WO20091154335
WO2012145493
WO2013014668
WO2009101611
EP2262837
EP2504028

先行技術

0007

Chenら2013年、Nat.Rev.Immunol.13:227〜242頁
Riley2009年、Immunol.Rev.229:114〜125頁
Dongら1999年、Nature Med.
ZouおよびChen2008年、Nat.Rev.Immunol.8:467〜77頁
Ribas2012年、NEJM366:2517〜2519頁
Watanabeら2012年、Clin.Dev.Immunol.2012巻、論文ID:269756
Wangら2013年、J.Viral Hep.20:27〜39頁
Fliesら2011年、Yale J.Biol.Med.84:409〜421頁
Pardoll2012年、Nature12:252〜264頁
Freeman2008年、PNAS105:10275〜10276頁
Franciscoら2010年、Immunol.Rev.236:219〜242頁
Sheridan2012年、Nature Biotechnology30:729〜730頁

課題を解決するための手段

0008

本発明は、PD−1に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。本発明の抗体は、とりわけ、PD−1を発現するT細胞を標的化するのに、およびPD−1活性を調節するのに有用である。ある種の実施形態において、本発明の抗体は、PD−1活性を阻害もしくは中和するのに、および/または例えば、T細胞により仲介される殺傷が
有益であるか、もしくは望ましい状況下で、T細胞活性化を刺激するのに有用である。代わりの実施形態において、抗体は、PD−1結合および/または活性を増強し、T細胞活性化を阻害するために用いられる。本発明の抗PD−1抗体またはその抗原結合部分は、例えば、免疫応答を調節するため、および/または腫瘍細胞、自己免疫組織細胞、もしくはウイルス性に感染した細胞のような特定の細胞タイプに抗体を標的化するための多特異性抗原結合分子の部分として含まれる。抗体は、がん、ウイルス感染症、および自己免疫疾患のような疾患または障害の処置において有用である。

0009

本発明の抗体は、全長(例えば、IgG1またはIgG4抗体)であるか、または抗原結合部分(例えば、Fab、F(ab’)2、もしくはscFvフラグメント)のみを含み、機能性に影響するように、例えば、残りのエフェクター機能を除去するように修飾される(Reddyら、2000年、J.Immunol.164:1925〜1933頁)。ある種の実施形態において、抗体は二重特異性である。

0010

第1の態様において、本発明は、PD−1に特異的に結合する、単離された組み換えモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある種の実施形態において、抗体は完全にヒトである。本発明の典型的な抗PD−1抗体を、本明細書における表1〜3に挙げる。表1に、典型的な抗PD−1抗体の重鎖可変領域(HCVR)、軽鎖可変領域(LCVR)、重鎖相補性決定領域(HCDR1、HCDR2、およびHCDR3)、ならびに軽鎖相補性決定領域(LCDR1、LCDR2、およびLCDR3)のアミノ酸配列識別名を記載する。表2に、典型的な抗PD−1抗体のHCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3の核酸配列識別名を記載する。表3に、典型的な抗PD−1抗体の重鎖および軽鎖配列のアミノ酸配列識別名を記載する。

0011

本発明は、表1に挙げられるHCVRアミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含むHCVRを含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

0012

本発明はまた、表1に挙げられるLCVRアミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含むLCVRを含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。

0013

本発明はまた、表1に挙げられるLCVRアミノ酸配列のいずれかと対形成される表1に挙げられるHCVRアミノ酸配列のいずれかを含む、HCVRとLCVRアミノ酸配列対(HCVR/LCVR)を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。ある種の実施形態によると、本発明は、表1に挙げられる典型的な抗PD−1抗体のいずれかに含有されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある種の実施形態において、HCVR/LCVRアミノ酸配列対は、配列番号2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/202、218/202、226/202、234/202、242/202、250/202、258/202、266/202、274/202、282/202、290/202、298/186、306/186、および314/186からなる群より選択される。ある種の実施形態において、HCVR/LCVRアミノ酸配列対は、配列番号130/138(例えば、H2M7795N)、162/170(例えば、H2M7798N)、234/202(例えば、H4xH9048P)、または314/186(例えば、H4xH9008P)の1つから選択される。

0014

本発明はまた、表1に挙げられるHCDR1アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1(HCDR1)を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。

0015

本発明はまた、表1に挙げられるHCDR2アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2(HCDR2)を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。

0016

本発明はまた、表1に挙げられるHCDR3アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3(HCDR3)を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。

0017

本発明はまた、表1に挙げられるLCDR1アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1(LCDR1)を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。

0018

本発明はまた、表1に挙げられるLCDR2アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2(LCDR2)を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。

0019

本発明はまた、表1に挙げられるLCDR3アミノ酸配列のいずれか、または少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3(LCDR3)を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。

0020

本発明はまた、表1に挙げられるLCDR3アミノ酸配列のいずれかと対形成される表1に挙げられるHCDR3アミノ酸配列のいずれかを含む、HCDR3とLCDR3アミノ酸配列対(HCDR3/LCDR3)を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。ある種の実施形態によると、本発明は、表1に挙げられる典型的な抗PD−1抗体のいずれかに含有されるHCDR3/LCDR3アミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある種の実施形態において、HCDR3/LCDR3アミノ酸配列対は、配列番号136/144(例えば、H2M7795N)、168/176(例えば、H2M7798N)、240/208(例えば、H4xH9048P)、および320/192(例えば、H4xH9008P)からなる群より選択される。

0021

本発明は、表3に挙げられるHCアミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。

0022

本発明はまた、表3に挙げられるLCアミノ酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。

0023

本発明はまた、表3に挙げられるLCアミノ酸配列のいずれかと対形成される表3に挙げられるHCアミノ酸配列のいずれかを含む、HCとLCアミノ酸配列対(HC/LC)を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。ある種の実施形態によると、本発明は、表3に挙げられる典型的な抗PD−1抗体のいずれかに含有されるHC/LCアミノ酸配列対を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある種の実施形態において、HC/LCアミノ酸配列対は、配列番号330/331、332/333、334/335、および336/337からなる群より選択される。

0024

本発明はまた、表1に挙げられる典型的な抗PD−1抗体のいずれかに含有される6つのCDRのセット(すなわち、HCDR1−HCDR2−HCDR3−LCDR1−LCDR2−LCDR3)を含む抗体またはその抗原結合フラグメントも提供する。ある種の実施形態において、HCDR1−HCDR2−HCDR3−LCDR1−LCDR2−LCDR3アミノ酸配列セットは、配列番号132−134−136−140−142−144(例えば、H2M7795N);164−166−168−172−174−176(例えば、H2M7798N);236−238−240−204−206−208(例えば、H4xH9048P);および316−318−320−188−190−192(例えば、H4xH9008P)からなる群より選択される。

0025

関連する実施形態において、本発明は、表1に挙げられる典型的な抗PD−1抗体のいずれかにより定義される、HCVR/LCVRアミノ酸配列対に含有される6つのCDRのセット(すなわち、HCDR1−HCDR2−HCDR3−LCDR1−LCDR2−LCDR3)を含む抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。例えば、本発明は、配列番号130/138(例えば、H2M7795N);162/170(例えば、H2M7798N);234/202(例えば、H4xH9048P);および314/186(例えば、H4xH9008P)からなる群より選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対に含有されるHCDR1−HCDR2−HCDR3−LCDR1−LCDR2−LCDR3アミノ酸配列セットを含む抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。HCVRおよびLCVRアミノ酸配列内のCDRを同定する方法および技術は、当該技術分野において周知であり、これを用いて、本明細書において開示される特定されたHCVRおよび/またはLCVRアミノ酸配列内のCDRを同定することができる。CDRの境界を同定するために用いられる典型的な慣例は、例えば、Kabat定義、Chothia定義、およびAbM定義を含む。一般的な用語において、Kabat定義は配列可変性に基づき、Chothia定義は、構造上のループ領域の位置に基づき、AbM定義は、KabatとChothiaのアプローチの間で妥協したものである。例えば、Kabat、「Sequences of Proteins of Immunological
Interest」、National Institutes of Health、Bethesda、Md.(1991年);Al−Lazikaniら、J.Mol.Biol.273:927〜948頁(1997年);およびMartinら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268〜9272(1989年)を参照。公的データベースも、抗体内CDR配列を同定するために利用可能である。

0026

本発明は、修飾されたグリコシル化パターンを有する抗PD−1抗体を含む。ある実施形態において、不所望なグリコシル化部位を取り除くための修飾が有用であるか、またはフコース部分を欠く抗体は、オリゴ糖鎖上に提示して、例えば、抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)機能が増大される(Shieldら(2002年)JBC277:26733頁を参照)。他の適用において、ガラクトシル化という修飾は、補体依存性細胞傷害(CDC)を修飾するために成される。

0027

本発明はまた、PD−1への特異的結合について、HCVRのCDRおよびLCVRの
CDRを含む抗体またはその抗原結合フラグメントと競合する抗体ならびにその抗原結合フラグメントも提供し、ここで、HCVRおよびLCVRそれぞれは、表1に挙げられるHCVRおよびLCVR配列から選択されるアミノ酸配列を有する。

0028

本発明はまた、PD−L1またはPD−L2へのPD−1結合を遮断する単離された抗体およびその抗原結合フラグメントも提供する。ある実施形態において、PD−L1へのPD−1結合を遮断する抗体またはその抗原結合フラグメントは、PD−L1と同一のPD−1上のエピトープに結合するか、もしくはPD−L1と異なるPD−1上のエピトープに結合する。

0029

代わりの実施形態において、本発明は、PD−L1へのPD−1結合を刺激する抗体およびその抗原結合フラグメントを提供する。ある種の実施形態において、本発明は、PD−1に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、抗体またはその抗原結合フラグメントは、PD−L1へのPD−1結合を増強する。ある実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号2、98、および250からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するHCVRのCDR、ならびに配列番号10、106、および202からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するLCVRのCDRを含む。ある実施形態において、単離された抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号2/10(例えば、H1M7789N)、98/106(例えば、H2M7791N)、および250/202(例えば、H4H9068P2)からなる群より選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列対を含む。

0030

本発明はまた、ヒトまたは他の種由来のPD−1に特異的に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントも提供する。ある種の実施形態において、抗体は、ヒトPD−1に、および/またはカニクイザルPD−1に結合する。

0031

本発明はまた、PD−1への結合について、HCVRのCDRおよびLCVRのCDRを含む参照抗体またはその抗原結合フラグメントと交差競合する抗体ならびにその抗原結合フラグメントも提供し、ここで、HCVRおよびLCVRそれぞれは、表1に挙げられるHCVRおよびLCVR配列から選択されるアミノ酸配列を有する。

0032

1つの実施形態において、本発明は、次の特徴のうちの1つまたはそれ以上を有する、単離された抗体または抗原結合フラグメントを提供する:(a)PD−L1またはPD−L2へのPD−1の結合を遮断する;(b)ヒトPD−1および/またはカニクイザルPD−1に特異的に結合する;(c)PD−1により誘導されるT細胞下方制御を遮断し、T細胞シグナル伝達レスキューする;(d)腫瘍成長を抑制し、大腸がんを有する対象において生存を増大させる;(e)混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおいてT細胞増殖を阻害する;ならびに(f)MLRアッセイにおいてIL−2および/またはインターフェロンガンマ分泌を増大する。

0033

ある実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、アゴニスト方法においてPD−1に特異的に結合する、すなわち、PD−1結合および/もしくは活性を増強するか、または刺激し;他の実施形態において、抗体は、アンタゴニスト方法においてPD−1に特異的に結合する、すなわち、PD−1をそのリガンドへの結合から遮断する。

0034

ある種の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、PD−1への第1の結合特異性、および第2の標的エピトープについての第2の結合特異性を含む、二重特異性である。第2の標的エピトープは、PD−1上または異なるタンパク質上の別のエピトープである。ある種の実施形態において、標的エピトープは、異なるT細胞、B細胞、腫瘍細胞、自己免疫組織細胞、またはウイルス性に感染した細胞を含む異なる細胞
上にある。

0035

第2の態様において、本発明は、抗PD−1抗体またはその部分をコードする核酸分子を提供する。例えば、本発明は、表1に挙げられるHCVRアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し;ある種の実施形態において、核酸分子は、表2に挙げられるHCVR核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

0036

本発明はまた、表1に挙げられるLCVRアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し;ある種の実施形態において、核酸分子は、表2に挙げられるLCVR核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

0037

本発明はまた、表1に挙げられるHCDR1アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し;ある種の実施形態において、核酸分子は、表2に挙げられるHCDR1核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

0038

本発明はまた、表1に挙げられるHCDR2アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し;ある種の実施形態において、核酸分子は、表2に挙げられるHCDR2核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

0039

本発明はまた、表1に挙げられるHCDR3アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し;ある種の実施形態において、核酸分子は、表2に挙げられるHCDR3核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

0040

本発明はまた、表1に挙げられるLCDR1アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し;ある種の実施形態において、核酸分子は、表2に挙げられるLCDR1核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

0041

本発明はまた、表1に挙げられるLCDR2アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し;ある種の実施形態において、核酸分子は、表2に挙げられるLCDR2核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

0042

本発明はまた、表1に挙げられるLCDR3アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供し;ある種の実施形態において、核酸分子は、表2に挙げられるLCDR3核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。

0043

本発明はまた、HCVRをコードする核酸分子も提供し、ここで、HCVRは、3つのCDRのセット(すなわち、HCDR1−HCDR2−HCDR3)を含み、ここで、HCDR1−HCDR2−HCDR3アミノ酸配列セットは、表1に挙げられる典型的な抗PD−1抗体のいずれかにより定義される通りである。

0044

本発明はまた、LCVRをコードする核酸分子も提供し、ここで、LCVRは、3つのCDRのセット(すなわち、LCDR1−LCDR2−LCDR3)を含み、ここで、LCDR1−LCDR2−LCDR3アミノ酸配列セットは、表1に挙げられる典型的な抗PD−1抗体のいずれかにより定義される通りである。

0045

本発明はまた、HCVRおよびLCVR両方をコードする核酸分子も提供し、ここで、HCVRは、表1に挙げられるHCVRアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、ここで、LCVRは、表1に挙げられるLCVRアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。ある種の実施形態において、核酸分子は、表2に挙げられるHCVR核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列、および表2に挙げられるLCVR核酸配列のいずれか、またはそれに対して少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含む。本発明のこの態様によるある種の実施形態において、核酸分子は、HCVRおよびLCVRをコードし、ここで、HCVRおよびLCVRはいずれも、表1に挙げられる同一の抗PD−1抗体に由来する。

0046

本発明は、表3に挙げられる重鎖アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、表3に挙げられる軽鎖アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子も提供する。

0047

本発明はまた、重鎖(HC)および軽鎖(LC)両方をコードする核酸分子も提供し、ここで、HCは、表3に挙げられるHCアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、ここで、LCは、表3に挙げられるLCアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。

0048

関連する態様において、本発明は、抗PD−1抗体の重鎖または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現する能力を有する組み換え発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子、すなわち、表1に記載のHCVR、LCVR、および/またはCDR配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組み換え発現ベクターを含む。本発明はまた、抗PD−1抗体の重鎖または軽鎖を含むポリペプチドを発現する能力がある組み換え発現ベクターも提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子、すなわち、表3に記載の重鎖または軽鎖配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む組み換え発現ベクターを含む。かかるベクターが導入される宿主細胞、ならびに抗体もしくは抗体フラグメントの産生が可能となる条件下で宿主細胞を培養すること、ならびに産生される抗体および抗体フラグメントを回収することにより、抗体またはその部分を産生する方法もまた、本発明の範囲に含まれる。

0049

第3の態様において、本発明は、PD−1に特異的に結合する第1の抗原結合特異性、ならびに腫瘍細胞特異的細胞、自己免疫組織特異的抗原、感染した細胞特異的抗原、T細胞共阻害分子、T細胞受容体、Fc受容体、PD−L1、およびPD−1からなる群より選択される抗原に特異的に結合する第2の抗原結合特異性を含む多特異性抗原結合分子、およびその抗原結合フラグメントを提供する。ある種の実施形態において、第1の抗原結合特異性は、表1におけるHCVR配列から選択されるアミノ酸配列を有するHCVRに
由来する3つのCDR、および表1におけるLCVR配列から選択されるアミノ酸配列を有するLCVRに由来する3つのCDRを含む。1つの実施形態において、第1の抗原結合特異性は、PD−L1の細胞外ドメインを含む。第2の抗原結合特異性は、PD−1と同一の細胞上、または同一の組織タイプもしくは異なる組織タイプの異なる細胞上の抗原を標的とする。例えば、多特異性抗原結合分子はT細胞に結合し、ここで、第1の抗原結合特異性は、PD−1に特異的に結合し、第2の抗原結合特異性は、T細胞上のT細胞受容体に結合する。あるいは、別の実施形態において、第1の抗原結合特異性は、T細胞上のPD−1に特異的に結合し、第2の抗原結合特異性は、B細胞、またはマクロファージ、または抗原提示細胞上の抗原/受容体に標的化される。ある種の実施形態において、第2の抗原結合特異性は、自己免疫組織に関連する(associated with)抗原に対するもの
である。1つの実施形態において、第1の抗原結合特異性は、PD−L1の細胞外ドメインを含み、第2の抗原結合特異性は、PD−1上の別のエピトープに結合する。ある種の実施形態において、第1の抗原結合特異性は、より低い親和性で、例えば、10−7Mより大きい、10−6Mより大きい、10−5Mより大きい、または10−4Mより大きいKDでPD−1に結合する。

0050

第4の態様において、本発明は、PD−1に特異的に結合する組み換えヒト抗体またはそのフラグメント、および薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。関連する態様において、本発明は、抗PD−1抗体および第2の治療剤の併用である、組成物特徴付ける。1つの実施形態において、第2の治療剤は、抗PD−1抗体と有利に併用される任意の剤である。抗PD−1抗体と有利に併用される典型的な剤は、PD−1に結合し、および/もしくはPD−1シグナル伝達を調節する他の剤(他の抗体またはその抗原結合フラグメントなどを含む)、ならびに/またはPD−1を直接的に結合しないが、それにもかかわらず、免疫細胞活性化を調節する剤を含むが、これらに限定されない。本発明の抗PD−1抗体を含む、さらなる併用療法および同時製剤は、本明細書において他の場所で開示される。

0051

第5の態様において、本発明は、治療上有効量の本発明の抗PD−1抗体またはその抗原結合フラグメントを、それを必要とする対象に投与することを含む、対象において免疫応答を調節する方法を提供する。ある種の実施形態において、本発明は、対象に、有効量の、PD−1に結合し、PD−L1へのPD−1結合を遮断する本発明の抗体またはそのフラグメントを投与することを含む、対象において免疫応答を増強する方法を提供する。1つの実施形態において、本発明は、対象においてT細胞刺激を刺激するか、または増強する方法を提供する。1つの実施形態において、本発明は、治療上有効量の本発明の遮断抗体またはその抗原結合フラグメントを、それを必要とする対象に投与することを含む、対象においてT制御性(Treg)細胞を阻害する方法を提供する。ある種の実施形態において、それを必要とする対象は、がんもしくはウイルス感染症のような疾患または障害に罹患する。代わりの実施形態において、本発明は、治療上有効量の本発明の活性化抗体もしくはそのフラグメントを、それを必要とする対象に投与することを含む、対象においてT細胞活性化を阻害するか、または抑制する方法を提供する。1つの実施形態において、対象は、自己免疫疾患または障害に罹患する。

0052

第6の態様において、本発明は、本発明の抗PD−1抗体もしくは抗体の抗原結合部分を用いた、対象においてがん、自己免疫疾患、もしくはウイルス感染症のような疾患または障害を処置する治療方法を提供し、ここで、治療方法は、治療上有効量の本発明の抗体もしくは抗体のフラグメントを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。処置される障害は、PD−1活性もしくはシグナル伝達の刺激もしくは阻害により、好転されるか、改善されるか、阻害されるか、もしくは予防される任意の疾患または状態である。ある種の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、第2の治療剤との併用でそれを必要とする対象に投与される。第2の治療剤は、別の
T細胞共阻害分子に対する抗体、腫瘍細胞抗原に対する抗体、T細胞受容体に対する抗体、Fc受容体に対する抗体、ウイルス性に感染した細胞上のエピトープに対する抗体、自己免疫組織抗原に対する抗体、PD−L1に対する抗体、細胞毒性剤抗がん薬抗ウイルス薬抗炎症薬(例えば、コルチコステロイド)、化学療法剤放射線療法免疫抑制剤、および当該技術分野において公知の任意の他の薬物または療法からなる群より選択される。ある種の実施形態において、第2の治療剤は、本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメントに関連する何らかの副作用が生じるようなら、かかる潜在的副作用に対抗するか、または低減するのを助ける剤である。

0053

ある種の実施形態において、本発明は、腫瘍成長を抑制する方法を提供する。ある種の実施形態において、本発明は、がん患者の生存を増強する方法を提供する。がんの例は、脳がん(例えば、多形神経膠芽腫)、肺がん(例えば、非小細胞肺がん)、頭部および頸部の扁平上皮癌、腎細胞癌、メラノーマ、多発性骨髄腫前立腺がん、ならびに大腸がんを含む原発性ならびに/または再発性がんを含むが、これらに限定されない。方法は、治療上有効量の本発明の抗PD−1抗体を含む医薬組成物を、血管内皮増殖因子VEGF)アンタゴニスト(例えば、アフリベルセプトベバシズマブ)、アンジオポエチン2(Ang2)阻害剤(例えば、ネスバクマブのような抗Ang2抗体)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG−3)阻害剤、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA−4)阻害剤(例えば、イピリムマブ)、化学療法剤、および放射線療法からなる群より選択される第2の治療剤との併用で投与することを含む。がんの処置において用いるための本発明の抗PD−1抗体との併用で用いられるさらなる療法/治療剤のさらなる例は、本明細書において他の場所で記載される。

0054

抗体またはそのフラグメントは、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、経口、筋肉内、または頭蓋内投与される。抗体またはそのフラグメントは、対象の体重1kg当たり約0.1mg〜体重1kg当たり約100mgの用量で投与される。

0055

本発明はまた、PD−1結合および/もしくはシグナル伝達の遮断もしくは増強から恩恵を受ける疾患もしくは障害を処置するための医薬の製造における本発明の抗PD−1抗体またはその抗原結合フラグメントの使用も含む。

0056

他の実施形態は、次の詳細な説明の記載から明らかになるだろう。

図面の簡単な説明

0057

本明細書における実施例8において記載されるルシフェラーゼベースのPD−1バイオアッセイの模式図である。パネルA:不活性なジャーカット細胞;パネルB:ジャーカット細胞は、CD3×CD20二重特異性抗体を通じたT細胞受容体(TCR)クラスター形成により活性化される;パネルC:PD−1活性化は、活性化ジャーカット細胞において応答を減弱する;パネルD:遮断PD−1は、活性化ジャーカット細胞において応答をレスキューする。
図1−1の続き
0日において結腸−26腫瘍細胞を移植され、3、6、10、13、および19日における注射により、示した分子の組み合わせで処置されたマウスについての腫瘍成長および生存結果を説明する図である(「早期処置腫瘍モデル」)。グラフは、移植後種々の時間点において、異なる実験群についての腫瘍体積(mm3)を示す。X軸に沿った上向きの矢印は、処置注射のタイミングを示す。本明細書において他の場所で記載される通り、「mIgG2a」はIgG2アイソタイプ対照であり;「Fc」はヒトFc対照であり;「VEGF Trap」はアフリベルセプトであり;「抗PD−1」は、抗マウスPD−1クローンPMI−14であり;「抗PD−L1」は抗PD−L1モノクローナル抗体である。
0日において結腸−26腫瘍細胞を移植され、3、6、10、13、および19日における注射により、示した分子の組み合わせで処置されたマウスについての腫瘍成長および生存結果を説明する図である(「早期処置腫瘍モデル」)。グラフは、移植の28日後において、それぞれの実験群における個々のマウス腫瘍体積(mm3)を示す。本明細書において他の場所で記載される通り、「mIgG2a」はIgG2アイソタイプ対照であり;「Fc」はヒトFc対照であり;「VEGF Trap」はアフリベルセプトであり;「抗PD−1」は抗マウスPD−1クローンRPMI−14であり;「抗PD−L1」は抗PD−L1モノクローナル抗体である。

0058

本方法が記載される前に、本発明は、記載される特定の方法および実験条件に制限されず、方法および条件自体が変動することは理解されるべきである。本明細書において用いられる専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのみであることも理解されるべきであり、本発明の範囲は、添付の請求項によってのみ制限されるので、制限であることは意図されない。

0059

別段定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書において記載されるものと類似または均等な任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において用いられるが、好ましい方法および材料がここで記載される。本明細書において述べられる全ての刊行物は、全体として参照によって本明細書に組み入れられる。

0060

用語「PD−1」は、CD279としても公知の、プログラム細胞死1タンパク質、T細胞共阻害分子を指す。全長PD−1のアミノ酸配列は、GenBankにおいて受託番号NP_005009.2として提供され、本明細書において配列番号327としても言及される。用語「PD−1」はまた、配列番号321、322、323、または324のアミノ酸配列を有するPD−1のタンパク質変異体も含む。用語「PD−1」は、組み換えPD−1またはそのフラグメントを含む。用語はまた、例えば、ヒスチジンタグ、マウスもしくはヒトFc、もしくはROR1のようなシグナル配列に結合したPD−1またはそのフラグメントも包含する。例えば、用語は、C93S変更を有する全長PD−1のアミノ酸残基25〜170に結合した、C末端におけるマウスFc(mIgG2a)もしくはヒトFc(hIgG1)を含む、配列番号323または324により例示される配列を含む。配列番号321により例示されるタンパク質変異体は、全長PD−1のアミノ酸残基25〜170に結合した、C末端におけるヒスチジンタグを含む。非ヒト種由来であると特定されない限り、用語「PD−1」はヒトPD−1を意味する。

0061

PD−1は、T細胞共阻害分子のCD28/CTLA−4/ICOSファミリーのメンバーである。PD−1は、IgV様の細胞外N末端ドメイン膜貫通型ドメイン、ならびに免疫受容体チロシンベースの阻害性(ITIMモチーフ、および免疫受容体チロシンベースのスイッチ(ITSM)モチーフを含有する細胞内ドメインを有する288個のアミノ酸のタンパク質である(Chattopadhyayら2009年、Immunol.Rev.)。PD−1受容体は、2つのリガンド、PD−リガンド−1(PD−L1)およびPD−L2を有する。

0062

用語「PD−L1」は、CD274およびB7H1としても公知の、PD−1受容体のリガンドを指す。全長PD−L1のアミノ酸配列は、GenBankにおいて受託番号NP_054862.1として提供され、本明細書において配列番号328としても言及される。用語はまた、例えば、ヒスチジンタグ、マウスもしくはヒトFc、もしくはROR1のようなシグナル配列に結合したPD−L1またはそのフラグメントも包含する。例えば、用語は、全長PD−L1のアミノ酸残基19〜239に結合した、C末端におけるマ
ウスFc(mIgG2a)もしくはヒトFc(hIgG1)を含む、配列番号325または326により例示される配列を含む。PD−L1は、細胞外IgV様ドメイン、膜貫通型ドメイン、およびおよそ30個のアミノ酸の高度に保存された細胞内ドメインを有する290個のアミノ酸のタンパク質である。PD−L1は、抗原提示細胞(例えば、樹状細胞、マクロファージ、およびB細胞)のような多くの細胞上、ならびに造血細胞および非造血細胞(例えば、血管内皮細胞膵島、および免疫特権の部位)上で構成的に発現される。PD−L1はまた、広範囲の腫瘍、ウイルス性に感染した細胞、および自己免疫組織上でも発現され、免疫抑制環境の成分である(Ribas2012年、NEJM366:2517〜2519頁)。

0063

本明細書において用いられる用語「T細胞共阻害分子」は、T細胞活性化もしくは抑制を介して免疫応答を調節するリガンドおよび/または受容体を指す。T細胞共シグナル伝達分子としても公知の、用語「T細胞共阻害分子」は、リンパ球活性化遺伝子3タンパク質(LAG−3、CD223としても公知)、細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA−4)、BおよびTリンパ球アテニュエーターBTLA)、CD−28、2B4、LY108、T細胞免疫グロブリンおよびムチン3(TIM3)、免疫グロブリンおよびITIM(TIGIT;VSIG9としても公知)を有するT細胞免疫受容体、白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1;CD305としても公知)、誘導性T細胞共刺激分子(ICOS;CD278としても公知)、T細胞活性化のVドメインIg抑制分子(VISTA)、ならびにCD160を含むが、これらに限定されない。

0064

本明細書において用いられる用語「Fc受容体」は、Bリンパ球、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好塩基球好中球、および肥満細胞を含む免疫細胞上で見られる表面受容体タンパク質を指し、抗体のFc領域に対する結合特異性を有する。用語「Fc受容体」は、Fcγ受容体[例えば、FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32)、FcγRIIB(CD32)、FcγRIIIA(CD16a)、およびFcγRIIIB(CD16b)]、Fcα受容体(例えば、FcαRIまたはCD89)、ならびにFcε受容体[例えば、FcεRI、およびFcεRII(CD23)]を含むが、これらに限定されない。

0065

本明細書において用いられる用語「抗体」は、4つのポリペプチド鎖ジスルフィド結合により相互結合された2つの重(H)鎖および2つの軽(L)鎖を含む免疫グロブリン分子(すなわち、「完全抗体分子」)、ならびにその多量体(例えば、IgM)またはその抗原結合フラグメントを指すことが意図される。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域(「HCVR」または「VH」)、ならびに重鎖定常領域(ドメインCH1、CH2、およびCH3を含む)を含む。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域(「LCVR」または「VL」)、および軽鎖定常領域(CL)を含む。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存される領域が散在した相補性決定領域(CDR)と呼ばれる、高頻度可変性の領域にさらに細分される。それぞれのVHならびにVLは、次の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4でアミノ末端からカルボキシ末端まで配置された、3つのCDRおよび4つのFRを含む。本発明のある種の実施形態において、抗体(もしくはその抗原結合フラグメント)のFRは、ヒト生殖系列配列と同一であるか、または天然または人工的に修飾される。アミノ酸連続配列は、2つまたはそれ以上のCDRの隣り合った解析に基づき定義される。

0066

1つもしくはそれ以上のCDR残基の置換、または1つもしくはそれ以上のCDRの除外も可能である。1つまたは2つのCDRを省いても結合する抗体が、科学文献において記載されている。Padlanら(1995年FASEB J.9:133〜139頁)は、公開された結晶構造に基づき、抗体とその抗原の間の接触領域を解析し、CDR残基の約5分の1〜3分の1のみが抗原と実際に接触すると結論付けた。Padlanはまた
、1つまたは2つのCDRが、抗原と接触したアミノ酸を有していない、多くの抗体を見出した(Vajdosら2002年J Mol Biol320:415〜428頁も参照)。

0067

抗原と接触しないCDR残基は、従前の研究(例えば、CDRH2における残基H60〜H65はしばしば必要とされない)において、ChothiaCDRの外側にあるKabatCDRの領域から、分子モデリングにより、および/または実験的に同定される。CDRまたはその残基が除外されるなら、それは、別のヒト抗体配列または共通のかかる配列における対応する位置を占めるアミノ酸で通常置換される。置換するためのCDRおよびアミノ酸内の置換のための位置はまた、実験的に選択される。実験的置換は、保存的または非保存的置換である。

0068

本明細書において開示される完全ヒト抗PD−1モノクローナル抗体は、対応する生殖系列配列と比較して、重鎖および軽鎖可変ドメインのフレームワークおよび/またはCDR領域における1つまたはそれ以上のアミノ酸置換、挿入および/または欠損を含む。かかる変異は、本明細書において開示されるアミノ酸配列を、例えば、公開抗体配列データベースから入手可能な生殖系列配列と比較することにより、容易に確かめられる。本発明は、本明細書において開示されるアミノ酸配列のいずれかに由来する抗体およびその抗原結合フラグメントを含み、ここで、1つもしくはそれ以上のフレームワークおよび/またはCDR領域内の1個またはそれ以上のアミノ酸は、抗体が由来する生殖系列配列の対応する残基に、または別のヒト生殖系列配列の対応する残基に、または対応する生殖系列残基の保存的アミノ酸置換に変異される(かかる配列変更は、本明細書において「生殖系列変異」としてまとめて言及される)。当業者は、本明細書において開示される重鎖および軽鎖可変領域配列から出発して、1つもしくはそれ以上の個々の生殖系列変異またはその組み合わせを含む、多数の抗体および抗原結合フラグメントを容易に作り出す。ある種の実施形態において、VHおよび/またはVLドメイン内のフレームワークならびに/またはCDR残基の全てを変異させて、抗体が由来する元の生殖系列配列において見出される残基に戻す。他の実施形態において、ある種の残基のみ、例えば、FR1の最初の8個のアミノ酸内、もしくはFR4の最後の8個のアミノ酸内で見出される変異した残基、またはCDR1、CDR2、もしくはCDR3内で見出される変異した残基のみを変異させて、元の本来の生殖系列配列に戻す。他の実施形態において、フレームワークおよび/またはCDR残基の1つまたはそれ以上は、異なる生殖系列配列(すなわち、抗体が元々由来する生殖系列配列と異なる、生殖系列配列)の対応する残基に変異される。さらに、本発明の抗体は、フレームワークおよび/またはCDR領域内の2つもしくはそれ以上の生殖系列変異の任意の組み合わせを含有し、例えば、ここで、ある種の個々の残基は、特定の生殖系列配列の対応する残基に変異され、一方、元の生殖系列配列と異なるある種の他の残基は、維持されるか、もしくは異なる生殖系列配列の対応する残基に変異される。一旦得られると、1つまたはそれ以上の生殖系列変異を含有する抗体および抗原結合フラグメントは、結合特異性の好転、結合親和性の増大、アンタゴニストもしくはアゴニスト生物学的特性の好転または増強(場合によっては)、免疫原性の低減などのような1つまたはそれ以上の所望の特性について容易に試験される。この一般的な方法において得られる抗体および抗原結合フラグメントは、本発明に包含される。

0069

本発明はまた、1つもしくはそれ以上の保存的置換を有する、本明細書において開示されるHCVR、LCVR、および/またはCDRアミノ酸配列のいずれかの変異体を含む完全ヒト抗PD−1モノクローナル抗体も含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書において開示されるHCVR、LCVR、および/もしくはCDRアミノ酸配列のいずれかに関連する10もしくはそれ以下、8つもしくはそれ以下、6つもしくはそれ以下、4つもしくはそれ以下などの保存的アミノ酸置換を有する、HCVR、LCVR、ならびに/またはCDRアミノ酸配列を有する抗PD−1抗体を含む。

0070

本明細書において用いられる用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域を有する抗体を含むことが意図される。本発明のヒトmAbは、例えば、CDR、特に、CDR3において、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的変異誘発、またはインビボでの体細胞変異により導入される変異)を含む。しかしながら、本明細書において用いられる用語「ヒト抗体」は、別の哺乳類種(例えば、マウス)の生殖系列に由来するCDR配列が、ヒトFR配列に移植されている、mAbを含むことは意図されない。用語は、非ヒト哺乳類において、または非ヒト哺乳類の細胞において組み換え的に産生される抗体を含む。用語は、ヒト対象から単離された、またはヒト対象において生じた抗体を含むことは意図されない。

0071

本明細書において用いられる用語「組換え体」は、例えば、DNAスプライシングおよび遺伝子導入発現を含む、組み換えDNA技術として当該技術分野において公知の技術もしくは方法により、作製されるか、発現されるか、単離されるか、もしくは得られる、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントを指す。用語は、非ヒト哺乳類(遺伝子導入非ヒト哺乳類、例えば、遺伝子導入マウスを含む)、もしくは細胞(例えば、CHO細胞)発現系において発現されるか、または組み換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離される抗体を指す。

0072

本明細書において用いられる用語「多特異性抗原結合分子」は、二重特異性、三重特異性、または多特異性抗原結合分子、およびその抗原結合フラグメントを指す。多特異性抗原結合分子は、1つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であるか、または1つより多くの標的ポリペプチドのエピトープに特異的な抗原結合ドメインを含有する。多特異性抗原結合分子は、単一の多機能ポリペプチドであるか、または互いに共有結合または非共有結合する、2つもしくはそれ以上のポリペプチドの多量体複合体である。用語「多特異性抗原結合分子」は、別の機能分子、例えば、別のペプチドもしくはタンパク質に結合されるか、または共発現される、本発明の抗体を含む。例えば、抗体またはそのフラグメントは、第2の結合特異性を有する二重特異性もしくは多特異性抗原結合分子を作り出すためのタンパク質もしくはそのフラグメントのような、1つまたはそれ以上の他の分子実体に、(例えば、化学的架橋結合、遺伝子融合非共有結合的会合、もしくはその他により)機能的に結合される。本発明によると、用語「多特異性抗原結合分子」はまた、二重特異性、三重特異性、または多特異性抗体またはその抗原結合フラグメントも含む。ある種の実施形態において、本発明の抗体は、別の抗体またはその抗原結合フラグメントに機能的に結合されて、第2の結合特異性を有する二重特異性抗体が作り出される。本発明の二重特異性および多特異性抗体は、本明細書において他の場所で記載される。

0073

用語「特異的に結合する」、または「に特異的に結合する」などは、抗体もしくはその抗原結合フラグメントが、生理的条件下で比較的安定である抗原との複合体を形成することを意味する。特異的結合は、少なくとも約1×10−8Mまたはそれ以下の平衡解離定数により特徴付けられる(例えば、KDが小さいほど、より強固な結合を示す)。2つの分子が特異的に結合するかどうかを決定する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、平衡透析表面プラズモン共鳴などを含む。本明細書において記載される通り、抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、BIACORE(商標)により同定され、PD−1に特異的に結合する。さらに、PD−1における1つのドメイン、および1つもしくはそれ以上のさらなる抗原に結合する多特異性抗体、またはPD−1の2つの異なる領域に結合する二重特異性抗体は、それにもかかわらず、本明細書において用いられる「特異的に結合する」抗体とみなされる。

0074

用語「高い親和性」抗体は、表面プラズモン共鳴、例えば、BIACORE(商標)ま
たは溶液親和性ELISAにより測定される、少なくとも10−7M;好ましくは、10−8M;より好ましくは、10−9M、なおより好ましくは、10−10M、なおより好ましくは、10−11MのKDとして表される、PD−1に対する結合親和性を有するそのmAbを指す。

0075

用語「スローオフレート」、「Koff」、または「kd」は、表面プラズモン共鳴、例えば、BIACORE(商標)により決定される、1×10−3s−1もしくはそれ以下、好ましくは、1×10−4s−1もしくはそれ以下の速度定数でPD−1から解離する抗体を意味する。

0076

本明細書において用いられる用語、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などは、任意の天然に生じる、酵素的に得られる、合成された、または遺伝子操作された、抗原に特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。本明細書において用いられる用語、抗体の「抗原結合フラグメント」、または「抗体フラグメント」は、PD−1に結合する能力を保持する抗体の1つまたはそれ以上のフラグメントを指す。

0077

特定の実施形態において、本発明の抗体または抗体フラグメントは、リガンド、もしくは抗生物質、第2の抗PD−1抗体、もしくは腫瘍特異的抗原、自己免疫組織抗原、ウイルス性に感染した細胞抗原、Fc受容体、T細胞受容体、もしくはT細胞共阻害分子、もしくは免疫毒素のような別の抗原に対する抗体のような治療部分(「免疫複合体」)、もしくはがん、自己免疫疾患、もしくは慢性ウイルス感染症を含む疾患もしくは状態を処置するのに有用な任意の他の治療部分のような部分に結合される。

0078

本明細書において用いられる「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体(Ab)が実質的にない抗体(例えば、PD−1に特異的に結合する、単離された抗体またはそのフラグメントは、PD−1以外の抗原に特異的に結合するAbが実質的にない)を指すことが意図される。

0079

本明細書において用いられる「遮断抗体」もしくは「中和抗体」(または「PD−1活性を中和する抗体」もしくは「アンタゴニスト抗体」)は、PD−1への結合が、PD−1の少なくとも1つの生物学的活性の阻害をもたらす抗体を指すことが意図される。例えば、本発明の抗体は、PD−L1へのPD−1結合を防ぐか、または遮断する。

0080

本明細書において用いられる「活性化抗体」もしくは「増強抗体」(または「アゴニスト抗体」)は、PD−1への結合が、PD−1の少なくとも1つの生物学的活性の増大または刺激をもたらす抗体を指すことが意図される。例えば、本発明の抗体は、PD−L1へのPD−1結合を増大する。

0081

本明細書において用いられる用語「表面プラズモン共鳴」は、例えば、BIACORE(商標)システム(Pharmacia Biosensor AB、Uppsala、Sweden and Piscataway、N.J.)を用いた、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出による、リアルタイム生体分子相互作用の解析を可能にする光学現象を指す。

0082

本明細書において用いられる用語「KD」は、特定の抗体と抗原の相互作用の平衡解離定数を指すことが意図される。

0083

用語「エピトープ」は、パラトープとしても公知の抗体分子の可変領域における特異的抗原結合部位と相互作用する、抗原決定因子を指す。単一の抗原は、1つより多くのエピ
トープを有する。従って、異なる抗体は、抗原上の異なる範囲に結合し、異なる生物学的作用を有する。用語「エピトープ」はまた、Bおよび/またはT細胞が応答する抗原上の部位も指す。それはまた、抗体により結合される抗原の領域も指す。エピトープは、構造的または機能的として定義される。機能的エピトープは、一般に構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接的に関与するその残基を有する。エピトープはまた立体構造でもあり、すなわち、非直線状のアミノ酸を含む。ある種の実施形態において、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、リン酸基、またはスルホニル基のような分子の化学的に活性な表面基である決定因子を含み、ある種の実施形態において、特異的な3次元構造的特徴、および/または特異的な変更特徴を有する。

0084

核酸もしくはそのフラグメントに言及している場合、用語「実質的な同一性」または「実質的に同一の」は、適切なヌクレオチド挿入または欠損を伴うかたちで別の核酸(もしくはその相補鎖)と最適に整列されると、以下で考察される通り、FASTA、BLAST、またはGAPのような、配列同一性の任意の周知のアルゴリズムにより測定される、少なくとも約90%、より好ましくは、少なくとも約95%、96%、97%、98%、または99%のヌクレオチド塩基ヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。参照核酸分子に対する実質的な同一性を有する核酸分子は、ある種の例において、参照核酸分子によりコードされるポリペプチドと同一または実質的に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。

0085

ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的な類似性」または「実質的に類似の」は、2つのペプチド配列が、例えば、デフォルトギャップウェイトを用いたプログラムGAPまたはBESTFITにより、最適に整列されると、少なくとも90%の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも95%、98%、または99%の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、残基位置は、同一でなく、保存的アミノ酸置換により異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性(例えば、電荷または疎水性)を有する側鎖(R基)を有する別のアミノ酸残基により置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。2つまたはそれ以上のアミノ酸配列が、保存的置換により互いに異なる場合において、類似性の割合または程度は、置換の保存的性質を補正するよう上方調節される。この調節を成す手段は、当業者に周知である。例えば、Pearson(1994年)MethodsMol.Biol.24:307〜331頁を参照(参照によって本明細書に組み入れられる)。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例は、1)脂肪族側鎖:グリシンアラニンバリンロイシン、およびイソロイシン;2)脂肪族−ヒドロキシル側鎖:セリン、およびスレオニン;3)アミド含有側鎖:アスパラギン、およびグルタミン;4)芳香族側鎖フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン;5)塩基性側鎖リジンアルギニン、およびヒスチジン;6)酸性側鎖:アスパラギン酸塩、およびグルタミン酸塩、ならびに7)硫黄含有側鎖:システイン、およびメチオニンを含む。好ましい保存的アミノ酸置換基は:バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸塩−アスパラギン酸塩、およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、Gonnetら(1992年)Science256:1443〜45頁(参照によって本明細書に組み入れられる)において開示されるPAM250対数尤度行列において正の値を有する任意の変化である。「中程度の保存的」置換は、PAM250対数尤度行列において負でない値を有する任意の変化である。

0086

ポリペプチドについての配列類似性は、配列解析ソフトウェアを用いて典型的に測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠損、および他の修飾に割り当てられる類似性の測定を用いて、類似の配列を一致させる。例えば、GCGソフトウェアは、生物の異なる種由来の相同な諸ポリペプチドの間、または野
生型タンパク質とその変異タンパク質の間のような、密接に関連するポリペプチド間の配列相同性または配列同一性を決定するためのデフォルトパラメーターで用いられるGAPおよびBESTFITのようなプログラムを含む。例えば、GCG Version 6.1を参照。ポリペプチド配列はまた、デフォルトまたは推奨パラメーターを用いたFASTA;GCG Version 6.1におけるプログラムを用いても比較される。FASTA(例えば、FASTA2、およびFASTA3)は、クエリー検索配列の間の最適オーバーラップの領域の整列化およびパーセント配列同一性をもたらす(上記、Pearson(2000年))。本発明の配列を、異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較する上での別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを用いた、コンピュータープログラムBLAST、特に、BLASTPまたはTBLASTNである。例えば、Altschulら(1990年)J.Mol.Biol.215:403〜410頁、および(1997年)Nucleic AcidsRes.25:3389〜3402頁を参照(それぞれが、参照によって本明細書に組み入れられる)。

0087

語句「治療上有効量」によって、投与されるものに所望の作用を作り出す量が意味される。抽出量は、処置の目的に依存し、公知の技術(例えば、Lloyd(1999年)The Art、Science and Technology of Pharmaceutical Compoundingを参照)を用いて当業者により解明可能だろう。

0088

本明細書において用いられる用語「対象」は、慢性ウイルス感染症、がん、または自己免疫疾患のような疾患または障害の改善、予防、および/または処置の必要な動物、好ましくは、哺乳類を指す。

0089

本明細書において用いられる「抗がん薬」は、細胞毒素、ならびに代謝拮抗物質アルキル化剤アントラサイクリン、抗生物質、有糸分裂阻害剤プロカルバジンヒドロキシウレアアスパラギナーゼ、コルチコステロイド、ミトタン(O,P’−(DDD))、バイオ医薬品(biologic)(例えば、抗体、およびインターフェロン)、ならびに放射性剤を含むが、これらに限定されない、がんを処置するのに有用な任意の剤を意味する。本明細書において用いられる「細胞毒素または細胞毒性剤」はまた、化学療法剤も指し、細胞に有害である任意の剤も意味する。例は、Taxol(登録商標)(パクリタキセル)、テモゾラミド、サイトカラシンBグラミシジンD、エチジウムブロマイドエメチンシスプラチンマイトマイシンエトポシド、テノポシド、ビンクリスチンビンビラスチンコイシンドキソルビシンダウノルビシンジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロンミスラマイシン、アクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロングルココルチコイドプロカインテトラカインリドカインプロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにその類似体または相同体を含む。

0090

本明細書において用いられる用語「抗ウイルス薬」は、宿主対象においてウイルス感染症を処置、予防、もしくは改善するために用いられる任意の薬物または療法を指す。用語「抗ウイルス薬」は、ジドブジンラミブジンアバカビルリバビリンロピナビルエファビレンツ、コビシスタットテノホビルリルピビリン鎮痛剤、およびコルチコステロイドを含むが、これらに限定されない。本発明の文脈において、ウイルス感染症は、ヒト免疫不全ウイルスHIV)、B型肝炎ウイルスHBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスLCMV)、およびサル免疫不全ウイルス(SIV)を含むが、これらに限定されないウイルスにより引き起こされる長期または慢性感染症を含む。

0091

本発明の抗体および抗原結合フラグメントは、PD−1に特異的に結合し、PD−1のPD−L1との相互作用を調節する。抗PD−1抗体は、PD−1に高い親和性または低
い親和性で結合してもよい。ある種の実施形態において、本発明の抗体は遮断抗体であり、ここで、抗体は、PD−1に結合し、PD−1のPD−L1との相互作用を遮断する。ある実施形態において、本発明の遮断抗体は、PD−1のPD−L1への結合を遮断し、および/またはT細胞活性化を刺激するか、もしくは増強する。ある実施形態において、遮断抗体は、免疫応答を刺激もしくは増強するのに、および/またはがん、もしくは慢性ウイルス感染症に罹患している対象を処置するのに有用である。抗体は、それを必要とする対象に投与されると、対象において、HIV、LCMV、またはHBVのようなウイルスによる慢性感染症を低減する。それらを用いて、対象において腫瘍細胞の成長が阻害される。それらは、単独で、またはがん、もしくはウイルス感染症を処置するための当該技術分野において公知の他の治療部分もしくは様式を用いた補助療法として用いられる。

0092

他の実施形態において、本発明の抗体は活性化抗体であり、ここで、抗体は、PD−1に結合し、PD−1とPD−L1の相互作用を増強する。ある実施形態において、活性化抗体は、PD−1のPD−L1への結合を増強し、および/またはT細胞活性化を阻害するか、もしくは抑制する。本発明の活性化抗体は、対象における免疫応答を阻害するのに、および/または自己免疫疾患を処置するのに有用である。

0093

ある種の実施形態において、抗PD−1抗体は多特異性抗原結合分子であり、ここで、それらは、PD−1に対する第1の結合特異性、ならびに別のT細胞共阻害分子、自己免疫組織抗原、T細胞受容体、Fc受容体、T細胞受容体、PD−L1、およびPD−1の異なるエピトープからなる群より選択される抗原に対する第2の結合特異性を含む。

0094

ある種の実施形態において、本発明の抗体は、全長PD−1[GenBank受託番号NP_005009.2(配列番号327)を参照]のような一次免疫原、またはPD−1の組み換え形態もしくは修飾されたヒトPD−1フラグメント(配列番号321、323、もしくは324)、または修飾されたカニクイザルPD−1フラグメント(配列番号322)で免疫され、続いて、二次免疫原、またはPD−1の免疫原として活性なフラグメントで免疫されたマウスから得られる。

0095

免疫原は、PD−1の生物学的に活性および/もしくは免疫原性フラグメント、またはその活性フラグメントをコードするDNAである。フラグメントは、PD−1のN末端またはC末端のドメインに由来する。本発明のある種の実施形態において、免疫原は、C93S変更を有する配列番号327のアミノ酸残基25〜170の範囲にあるPD−1のフラグメントである。

0096

ペプチドは、タグ付けのため、もしくはKLHのような担体分子への結合の目的のためのある種の残基の付加または置換を含むよう修飾される。例えば、免疫のためのKLHへの結合のためのペプチドを調製するために、例えば、ペプチドのN末端もしくはC末端いずれかにシステインが付加されるか、またはリンカー配列が付加される。

0097

全長ヒトPD−1の全長アミノ酸配列は、配列番号327として示される。

0098

ある種の実施形態において、PD−1に特異的に結合する抗体は、上で示された領域のフラグメント、または本明細書において記載される領域のNもしくはC末端いずれか、もしくは両方から約5〜約20個のアミノ酸残基だけ、指定された領域を越えて伸びているペプチドを用いて調製される。ある種の実施形態において、上で示された領域またはそのフラグメントの任意の組み合わせは、PD−1特異的抗体の調製において用いられる。ある種の実施形態において、PD−1の上で示された領域、またはそのフラグメントの任意の1つまたはそれ以上は、単一特異性、二重特異性、または多特異性抗体を調製するため用いられる。

0099

本発明のある種の抗PD−1抗体は、PD−1に結合し、インビトロまたはインビボアッセイにより決定される、PD−1の活性を中和する。PD−1に結合し、PD−1の活性を中和する本発明の抗体の能力は、本明細書において記載される、結合アッセイ、もしくは活性アッセイを含む、当業者に公知の任意の標準的方法を用いて測定される。

0100

結合活性を測定するための非限定的な典型的インビトロアッセイは、本明細書における実施例において説明される。実施例3において、ヒトPD−1およびカニクイザルPD−1についてのヒト抗PD−1抗体の結合親和性ならびに運動定数は、表面プラズモン共鳴において決定され、測定は、Biacore4000またはT200装置にて行われた。実施例4および5において、遮断アッセイを用いて、インビトロでPD−1のPD−L1−結合能を遮断する抗PD−1抗体の能力が決定された。実施例6において、遮断アッセイを用いて、抗PD−1抗体間の交差競合が決定された。実施例7は、抗体のPD−1を過剰発現する細胞への結合を記載する。実施例8において、ルシフェラーゼアッセイを用いて、T細胞におけるPD−1/PD−L1シグナル伝達と拮抗する抗PD−1抗体の能力が決定された。

0101

ある種の実施形態において、本発明の抗体は、インビトロで、およびがんを有する対象、もしくはLCMVのようなウイルスに感染した対象においてT細胞活性化を増強するか、または刺激することができる。ある種の実施形態において、本発明の抗体は、対象において免疫応答を増強し、腫瘍成長を阻害するために、第2のT細胞共阻害分子に対する抗体のような第2の治療剤と併用して用いられる。

0102

PD−1に特異的な抗体は、さらなる標識もしくは部分を含有しないか、またはそれらは、N末端またはC末端標識もしくは部分を含有する。1つの実施形態において、標識または部分はビオチンである。結合アッセイにおいて、(もしあれば)標識の位置は、ペプチドが結合される表面に関連してペプチドの方向が決定される。例えば、表面がアビジンでコートされるなら、N末端のビオチンを含有するペプチドは、ペプチドのC末端部分が表面の遠位であるように、方向付けられる。1つの実施形態において、標識は、放射性核種蛍光色素、またはMRIで検出可能な標識である。ある種の実施形態において、かかる標識された抗体は、画像化アッセイを含む診断アッセイにおいて用いられる。

0103

抗体の抗原結合フラグメント
別段具体的に示されない限り、本明細書において用いられる用語「抗体」は、2つの免疫グロブリン重鎖、および2つの免疫グロブリン軽鎖を含む抗体分子(すなわち、「完全抗体分子」)、ならびにその抗原結合フラグメントを包含することは理解されるだろう。本明細書において用いられる用語、抗体の「抗原結合部分」、抗体の「抗原結合フラグメント」などは、任意の天然に生じる、酵素的に得られる、合成された、または遺伝子操作された、抗原に特異的に結合して複合体を形成するポリペプチドもしくは糖タンパク質を含む。本明細書において用いられる用語、抗体の「抗原結合フラグメント」、または「抗体フラグメント」は、PD−1に特異的に結合する能力を保持する抗体の1つまたはそれ以上のフラグメントを指す。抗体フラグメントは、Fabフラグメント、F(ab’)2フラグメント、Fvフラグメント、dAbフラグメント、CDRを含有するフラグメント、または単離されたCDRを含む。ある種の実施形態において、用語「抗原結合フラグメント」は、多特異性抗原結合分子のポリペプチドフラグメントを指す。かかる実施形態において、用語「抗原結合フラグメント」は、例えば、PD−1に特異的に結合するPD−L1の細胞外ドメインを含む。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、タンパク質消化、または抗体可変および(場合により)定常ドメインをコードするDNAの操作および発現を伴う組み換え遺伝子操作技術のような任意の適切な標準的技術を用いて、完全抗体分子から得ることができる。かかるDNAは公知であり、および/または例えば、市販の供
給源DNAライブラリー(例えば、ファージ抗体ライブラリーを含む)から容易に入手可能であるか、もしくは合成される。DNAは、配列決定され、化学的に、または分子生物学技術を用いることにより操作されて、例えば、1つもしくはそれ以上の可変および/もしくは定常ドメインが適切な配置に配置されるか、またはコドンが導入されるか、システイン残基が作製されるか、アミノ酸が修飾されるか、付加されるか、もしくは欠損される。

0104

抗原結合フラグメントの非限定的な例は:(i)Fabフラグメント;(ii)F(ab’)2フラグメント;(iii)Fdフラグメント;(iv)Fvフラグメント;(v)1本鎖Fv(scFv)分子;(vi)dAbフラグメント;および(vii)抗体の超可変領域模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位(例えば、CDR3ペプチドのような単離された相補決定領域(CDR))、または限定されたFR3−CDR3−FR4ペプチドを含む。ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメインが欠損した抗体、キメラ抗体、CDRが移植された抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体四重特異性抗体ミニボディナノボディ(例えば、1価のナノボディ、2価のナノボディなど)、小モジュラー免疫薬(SMIP)、およびサメ可変IgNARドメインのような他の操作された分子もまた、本明細書において用いられる、表現「抗原結合フラグメント」に包含される。

0105

抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも1つの可変ドメインを典型的に含む。可変ドメインは、任意のサイズまたはアミノ酸組成であり、少なくとも1つのCDRを一般的に含み、1つもしくはそれ以上のフレームワーク配列に隣接されるか、もしくはインフレームである。VLドメインと繋がったVHドメインを有する抗原結合フラグメントにおいて、VHおよびVLドメインは、任意の適切な配置で相対的に位置する。例えば、可変領域は、二量体であり、VH−VH、VH−VL、またはVL−VL二量体を含有する。あるいは、抗体の抗原結合フラグメントは、単量体VHまたはVLドメインを含有する。

0106

ある種の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントは、少なくとも1つの定常ドメインに共有結合した少なくとも1つの可変ドメインを含有する。本発明の抗体の抗原結合フラグメント内で見出される可変および定常ドメインの非限定的な典型的配置は:(i)VH−CH1;(ii)VH−CH2;(iii)VH−CH3;(iv)VH−CH1−CH2;(v)VH−CH1−CH2−CH3;(vi)VH−CH2−CH3;(vii)VH−CL;(viii)VL−CH1;(ix)VL−CH2;(x)VL−CH3;(xi)VL−CH1−CH2;(xii)VL−CH1−CH2−CH3;(xiii)VL−CH2−CH3;および(xiv)VL−CLを含む。上で挙げられる典型的な配置のいずれかを含む、可変および定常ドメインの任意の配置において、可変ならびに定常ドメインは、互いに直接的に結合されるか、または完全もしくは部分的ヒンジもしくはリンカー領域により結合されるか、のいずれかである。ヒンジ領域は、少なくとも2個(例えば、5個、10個、15個、20個、40個、60個もしくはそれ以上)のアミノ酸からなり、単一のポリペプチド分子における隣接する可変および/または定常ドメイン間の可動性または半可動性の結合をもたらす。さらに、本発明の抗体の抗原結合フラグメントは、(例えば、ジスルフィド結合による)互いにおよび/もしくは1つもしくはそれ以上の単量体VHもしくはVLドメインと非共有結合的に会合した、上で挙げられた可変ならびに定常ドメイン配置のいずれかのホモ−二量体またはヘテロ−二量体(もしくは他の多量体)を含む。

0107

全抗体分子と同様に、抗原結合フラグメントは、単特異性または多特異性(例えば、二重特異性)である。抗体の多特異性抗原結合フラグメントは、少なくとも2つの異なる可変ドメインを典型的には含み、ここで、それぞれの可変ドメインは、別々の抗原、または同一抗原上の異なるエピトープに特異的に結合する能力がある。本明細書において開示さ
れる典型的な二重特異性抗体フォーマットを含む、任意の多特異性抗体フォーマットは、当該技術分野において利用可能な慣例的技術を用いて、本発明の抗体の抗原結合フラグメントの文脈において使用するために適合される。

0108

ヒト抗体の調製
遺伝子導入マウスにおいてヒト抗体を作製する方法は、当該分野で公知である。任意のかかる公知の方法を、本発明の文脈において用いて、PD−1に特異的に結合するヒト抗体が作られる。

0109

次のいずれか1つを含む免疫原を用いて、PD−1に対する抗体を作製する。ある種の実施形態において、本発明の抗体は、全長の天然PD−1(GenBank受託番号NP_005009.2を参照)(配列番号327)、または組み換えPD−1ペプチドで免疫されたマウスから得られる。あるいは、PD−1またはそのフラグメントは、標準的生化学技術を用いて作り出され、修飾され(配列番号321〜324)、免疫原として用いられる。

0110

ある種の実施形態において、免疫原は、PD−1のN末端またはC末端由来のペプチドである。1つの実施形態において、免疫原は、PD−1の細胞外ドメインまたはIgV様ドメインである。本発明のある種の実施形態において、免疫原は、C93S変更を有する配列番号327のおよそアミノ酸残基25〜170の範囲にあるPD−1のフラグメントである。

0111

ある実施形態において、免疫原は、エシェリキアコリ(E.coli)において、またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞のような任意の他の真核生物もしくは哺乳類細胞において発現された組み換えPD−1ペプチドである。

0112

ある種の実施形態において、PD−1に特異的に結合する抗体は、上で示された領域のフラグメント、または本明細書において記載される領域のNもしくはC末端いずれか、もしくは両方から約5〜約20個のアミノ酸残基だけ、指定された領域を越えて伸びているペプチドを用いて、調製される。ある種の実施形態において、上で示された領域、またはそのフラグメントの任意の組み合わせは、PD−1特異的抗体の調製において用いられる。

0113

VELOCIMMUNE(登録商標)技術(例えば、US6,596,541、Regeneron Pharmaceuticals、VELOCIMMUNE(登録商標))、またはモノクローナル抗体を作製する任意の他の公知の方法を用いて、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する、PD−1に対する高親和性キメラ抗体が、まず単離される。VELOCIMMUNE(登録商標)技術は、マウスが、抗原刺激に応答して、ヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を産生するように、内在性マウス定常領域部位作動可能に結合したヒト重鎖および軽鎖可変領域を含むゲノムを有する遺伝子導入マウスの作製に関与する。抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするDNAが単離され、ヒト重鎖および軽鎖定常領域をコードするDNAに作動可能に結合される。次に、DNAは、完全ヒト抗体を発現する能力がある細胞において発現される。

0114

生物学的等価物
本発明の抗PD−1抗体および抗体フラグメントは、記載される抗体のものと異なるが、PD−1に結合する能力を保持する、アミノ酸配列を有するタンパク質を包含する。かかる変異体抗体および抗体フラグメントは、親配列と比較された場合、アミノ酸の1つまたはそれ以上の付加、欠失、または置換を含むが、記載される抗体のものと実質的に等価物である生物学的活性を示す。同様に、本発明のDNA配列をコードする抗体は、開示さ
れる配列と比較された場合、ヌクレオチドの1つまたはそれ以上の付加、欠失、または置換を含むが、本発明の抗体または抗体フラグメントに実質的な生物学的等価物である抗体または抗体フラグメントをコードする配列を含む。

0115

2つの抗原結合タンパク質、または抗体は、例えば、吸収の速度および程度が、類似の実験条件下で同一のモル用量、単回用量もしくは複数回用量いずれかで投与される場合、有意な相違を示さない医薬等価物もしくは医薬代替物であるなら、生物学的等価物とみなされる。ある抗体は、その吸収の程度において等価物であるが、その吸収の速度において等価物でないなら、等価物または医薬代替物とみなされ、かかる吸収の速度における相違が意図的であり、標識において反映され、例えば、慢性的使用の際の有効な身体薬物濃度の到達に必須ではなく、研究される特定の薬物製品にとって医薬的に有意でないとみなされるので、生物学的等価物であると依然みなされる。

0116

1つの実施形態において、2つの抗原結合タンパク質の安全性、純度、または有効性において臨床上有意義な相違はないなら、2つの抗原結合タンパク質は生物学的等価物である。

0117

1つの実施形態において、2つの抗原結合タンパク質は、患者が、切り替えることなく継続される療法と比較して、免疫原性における臨床上有意な変化、もしくは損なわれた効能を含む副作用のリスクの増大を予期せずに、参照産物と生物学的産物の間で1回またはそれ以上切り替えられるなら、生物学的等価物である。

0118

1つの実施形態において、2つの抗原結合タンパク質は、それら両方が、使用の条件もしくは複数の条件についての作用の通常のメカニズムまたは複数のメカニズムにより、かかるメカニズムが公知である限り、作用するなら、生物学的等価物である。

0119

生物学的等価物は、インビボおよび/またはインビトロの方法により実証される。生物学的等価物の測定は、例えば、(a)抗体もしくはその代謝産物の濃度が、血液、血漿血清、もしくは他の生物学的体液において時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験;(b)ヒトイビボバイオアベイラビリティデータと相関し、それを十分に予測するインビトロ試験;(c)抗体(もしくはその標的)の適切な急性薬理作用が、時間の関数として測定される、ヒトまたは他の哺乳類におけるインビボ試験;および(d)抗体の安全性、効能(efficacy)、もしくはバイオアベイラビリティもしくは生物学的均等性確立する、十分に制御された臨床試験、を含む。

0120

本発明の抗体の生物学的等価物は、例えば、残基もしくは配列の種々の置換を成すこと、または生物学的活性のため必要とされない末端もしくは内部残基もしくは配列を欠損させることにより、構築される。例えば、生物学的活性に必須でないシステイン残基は、欠損されるか、または他のアミノ酸で置換されて、再生の際に不必要または不正確な分子内ジスルフィド架橋の形成が防止される。他の文脈において、生物学的等価物抗体は、アミノ酸変更を含む抗体変異体を含み、抗体のグリコシル化特徴、例えば、グリコシル化を除去するか、または取り除く変異を修飾する。

0121

Fc変異体を含む抗PD−1抗体
本発明のある種の実施形態によると、例えば、中性pHと比較して酸性pHにおいて、FcRn受容体への抗体結合を増強するか、もしくは損なう1つまたはそれ以上の変異を含むFcドメインを含む抗PD−1抗体が提供される。例えば、本発明は、FcドメインのCH2またはCH3領域における変異を含む抗PD−1抗体を含み、ここで、変異は、酸性環境において(例えば、pHが約5.5〜約6.0の範囲にあるエンドソームにおいて)、FcRnに対するFcドメインの親和性を増大させる。かかる変異は、動物に投与
される場合、抗体の血清半減期の増大をもたらす。かかるFc修飾の非限定的な例は、例えば、250位(例えば、EもしくはQ);250位および428位(例えば、LもしくはF);252位(例えば、L/Y/F/W、もしくはT)、254位(例えば、S、もしくはT)、ならびに256位(例えば、S/R/Q/E/D、もしくはT)における修飾;または428位および/もしくは433位(例えば、H/L/R/S/P/Q、もしくはK)および/もしくは434位(例えば、A、W、H、F、もしくはY[N434A、N434W、N434H、N434F、もしくはN434Y])における修飾;または250位および/もしくは428位における修飾;または307位もしくは308位(例えば、308F、V308F)、および434位における修飾を含む。1つの実施形態において、修飾は、428L(例えば、M428L)、ならびに434S(例えば、N434S)修飾;428L、259I(例えば、V259I)、ならびに308F(例えば、V308F)修飾;433K(例えば、H433K)、ならびに434(例えば、434Y)修飾;252、254、ならびに256(例えば、252Y、254T、および256E)修飾;250Q、ならびに428L修飾(例えば、T250Q、およびM428L);ならびに307、ならびに/または308修飾(例えば、308F、もしくは308P)を含む。なお別の実施形態において、修飾は、265A(例えば、D265A)、および/または297A(例えば、N297A)修飾を含む。

0122

例えば、本発明は、250Q、ならびに248L(例えば、T250Q、およびM248L);252Y、254T、ならびに256E(例えば、M252Y、S254T、およびT256E);428L、ならびに434S(例えば、M428L、およびN434S);257I、ならびに311I(例えば、P257I、およびQ311I);257I、ならびに434H(例えば、P257I、およびN434H);376V、ならびに434H(例えば、D376V、およびN434H);307A、380A、ならびに434A(例えば、T307A、E380A、およびN434A);ならびに433K、ならびに434F(例えば、H433K、およびN434F):からなる群より選択される変異の1つまたはそれ以上の対または群を含むFcドメインを含む抗PD−1抗体を含む。1つの実施形態において、本発明は、二量体安定化を促進するためのIgG4のヒンジ領域におけるS108P変異を含むFcドメインを含む抗PD−1抗体を含む。前述のFcドメイン変異と、本明細書において開示される抗体可変ドメイン内の他の変異の全ての可能な組み合わせは、本発明の範囲内と考えられる。

0123

本発明はまた、キメラ重鎖定常(CH)領域を含む抗PD−1抗体も含み、ここで、キメラCH領域は、1つより多い免疫グロブリンアイソタイプのCH領域に由来するセグメントを含む。例えば、本発明の抗体は、ヒトIgG1、ヒトIgG2、もしくはヒトIgG4分子に由来するCH3ドメインの一部または全てと組み合わされた、ヒトIgG1、ヒトIgG2、もしくはヒトIgG4分子に由来するCH2ドメインの一部または全てを含むキメラCH領域を含む。ある種の実施形態によると、本発明の抗体は、キメラヒンジ領域を有するキメラCH領域を含む。例えば、キメラヒンジは、ヒトIgG1、ヒトIgG2、またはヒトIgG4ヒンジ領域に由来する「下部のヒンジ」配列(EUナンバリングによる228位〜236位のアミノ酸残基)と組み合わされた、ヒトIgG1、ヒトIgG2、またはヒトIgG4ヒンジ領域に由来する「上部のヒンジ」アミノ酸配列(EUナンバリングによる216位〜227位のアミノ酸残基)を含む。ある種の実施形態によると、キメラヒンジ領域は、ヒトIgG1、またはヒトIgG4上部のヒンジに由来するアミノ酸残基、およびヒトIgG2下部のヒンジに由来するアミノ酸残基を含む。本明細書において記載されるキメラCH領域を含む抗体は、ある種の実施形態において、抗体の治療または薬物動態特性に有害に作用することなく、修飾されたFcエフェクター機能を提示する。(例えば、2014年1月31日付けで出願されたUSSN.14/170,166(全体として参照によって本明細書に組み入れられる)を参照。)

0124

抗体の生物学的特徴
一般に、本発明の抗体は、PD−1に結合することにより機能する。本発明は、可溶性単量体または二量体PD−1分子を高親和性で結合する抗PD−1抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。例えば、本発明は、例えば、本明細書における実施例3において定義されるアッセイフォーマットを用いて、表面プラズモン共鳴により測定される、(例えば、25℃において、または37℃において)約50nM未満のKDで単量体PD−1に結合する抗体および抗体の抗原結合フラグメントを含む。ある種の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書における実施例3において定義されるアッセイフォーマット、もしくは実質的に類似のアッセイを用いて、表面プラズモン共鳴により測定される、約40nM未満、約30nM未満、約20nM未満、約10nM未満、約5nM未満、約2nM未満、もしくは約1nM未満のKDで単量体PD−1に結合する。

0125

本発明はまた、例えば、本明細書における実施例3において定義されるアッセイフォーマットを用いて、表面プラズモン共鳴により測定される、(例えば、25℃において、または37℃において)約400pM未満のKDで二量体PD−1に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。ある種の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書における実施例3において定義されるアッセイフォーマット、もしくは実質的に類似のアッセイを用いて、表面プラズモン共鳴により測定される、約300pM未満、約250pM未満、約200pM未満、約100pM未満、もしくは約50pM未満のKDで二量体PD−1に結合する。

0126

本発明はまた、例えば、本明細書における実施例3において定義されるアッセイフォーマットを用いて、表面プラズモン共鳴により測定される、(例えば、25℃において、または37℃において)約35nM未満のKDでカニクイザル(マカクファクラリス(Macaca fascicularis))PD−1に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを含
む。ある種の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書における実施例3において定義されるアッセイフォーマット、もしくは実質的に類似のアッセイを用いて、表面プラズモン共鳴により測定される、約30nM未満、約20nM未満、約15nM未満、約10nM未満、もしくは約5nM未満のKDでカニクイザルPD−1に結合する。

0127

本発明はまた、例えば、本明細書における実施例3において定義されるアッセイフォーマット、または実質的に類似のアッセイを用いて、25℃もしくは37℃における表面プラズモン共鳴により測定される、約1.1分より長い解離半減期(t1/2)でPD−1に結合する抗体およびその抗原結合フラグメントを含む。ある種の実施形態において、本発明の抗体または抗原結合フラグメントは、例えば、本明細書における実施例3において定義されるアッセイフォーマット(例えば、mAb捕捉または抗原捕捉フォーマット)、または実質的に類似のアッセイを用いて、25℃または37℃における表面プラズモン共鳴により測定される、約5分より長い、約10分より長い、約30分より長い、約50分より長い、約60分より長い、約70分より長い、約80分より長い、約90分より長い、約100分より長い、約200分より長い、約300分より長い、約400分より長い、約500分より長い、約600分より長い、約700分より長い、約800分より長い、約900分より長い、約1000分より長い、または約1200分より長いt1/2でPD−1に結合する。

0128

本発明はまた、例えば、実施例4において示されるELISAベースのイムノアッセイアッセイ、または実質的に類似のアッセイを用いて決定される約3nM未満のIC50でPD−L1へのPD−1結合を遮断する抗体またはその抗原結合フラグメントも含む。本発明はまた、PD−1に結合し、PD−1のPD−L1への結合を増強する抗体およびそ
の抗原結合フラグメントも含む。

0129

ある実施形態において、本発明の抗体は、PD−1の細胞外ドメイン、またはドメインのフラグメントに結合する。ある実施形態において、本発明の抗体は、1つより多くのドメインに結合する(交差反応性抗体)。ある種の実施形態において、本発明の抗体は、PD−1のアミノ酸残基21〜171(配列番号327)を含む細胞外ドメインに位置するエピトープに結合する。1つの実施形態において、抗体は、配列番号321〜324のアミノ酸残基1〜146からなる群より選択される1個またはそれ以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する。

0130

ある種の実施形態において、本発明の抗体は、アミノ酸配列が配列番号327において示される、全長タンパク質の任意の他の領域もしくはフラグメントに結合することにより、PD−1に関連するPD−L1−結合活性を遮断または阻害することにより機能する。ある種の実施形態において、抗体は、PD−1とPD−L1の間の相互作用を減弱させるか、または調節する。

0131

ある種の実施形態において、本発明の抗体は二重特異性抗体である。本発明の二重特異性抗体は、あるドメインにおけるあるエピトープに結合し、PD−1の異なるドメインにおける第2のエピトープにも結合する。ある種の実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、同一ドメインにおける2つの異なるエピトープに結合する。1つの実施形態において、多特異性抗原結合分子は、PD−L1の細胞外ドメインまたはそのフラグメントを含む第1の結合特異性、およびPD−1の別のエピトープに対する第2の結合特異性を含む。

0132

1つの実施形態において、本発明は、PD−1に結合する、単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、抗体またはそのフラグメントは、次の特徴のうちの1つもしくはそれ以上を示す:(i)配列番号2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、218、226、234、242、250、258、266、274、282、290、298、306、および314からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するHCVRを含む;(ii)配列番号10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、および202からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するLCVRを含む;(iii)配列番号8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、224、232、240、248、256、264、272、280、288、296、304、312、および320からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するHCDR3ドメイン;ならびに配列番号16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、および208からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するLCDR3ドメインを含む;(iv)配列番号4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、220、228、236、244、252、260、268、276、284、292、300、308、および316からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するHCDR1ドメイン;配列番号6
、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、222、230、238、246、254、262、270、278、286、294、302、310、および318からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するHCDR2ドメイン;配列番号12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、および204からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するLCDR1ドメイン;ならびに配列番号14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、および206からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するLCDR2ドメインを含む;(v)PD−1に対する第1の結合特異性、ならびにPD−1、腫瘍特異的抗原、自己免疫組織特異的抗原、ウイルス性に感染した細胞抗原、異なるT細胞共阻害分子、T細胞受容体、およびFc受容体からなる群より選択される抗原に対する第2の結合特異性を含む多特異性抗原結合分子である;(vi)ヒトPD−1に約28pM〜約1.5μMのKDで結合する;(vii)カニクイザルPD−1に約3nM〜約7.5μMのKDで結合する;(viii)PD−1のPD−L1への結合を、約3.3nM以下のIC50で遮断するか、もしくは増強する;(ix)PD−1により誘導されるT細胞下方制御を遮断し、および/もしくはT細胞/APCルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、T細胞シグナル伝達をレスキューする;(x)混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおいてT細胞増殖および活性を刺激する;(xi)MLRアッセイにおいてIL−2および/もしくはIFNγ産生を誘導する;ならびに(xii)がんを有する対象において、腫瘍成長を抑制し、生存を増大させる。

0133

1つの実施形態において、本発明は、PD−L1へのPD−1結合を遮断する、単離された完全ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、抗体またはそのフラグメントは、次の特徴のうちの1つもしくはそれ以上を示す:(i)配列番号130、162、234、および314からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するHCVRを含む;(ii)配列番号138、170、186、および202からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するLCVRを含む;(iii)配列番号136、168、240、および320からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するHCDR3ドメイン;ならびに配列番号144、176、192、および208からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するLCDR3ドメインを含む;(iv)配列番号132、164、236、および316からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するHCDR1ドメイン;配列番号134、166、238、および318からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するHCDR2ドメイン;配列番号140、172、188、および204からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するLCDR1ドメイン;ならびに配列番号142、174、190、および206からなる群よ
り選択されるアミノ酸配列、もしくは少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有するその実質的に類似の配列を有するLCDR2ドメインを含む;(v)PD−1に対する第1の結合特異性、ならびにPD−1の異なるエピトープ、腫瘍特異的抗原、自己免疫組織特異的抗原、ウイルス性に感染した細胞抗原、異なるT細胞共阻害分子、T細胞受容体、およびFc受容体からなる群より選択される抗原に対する第2の結合特異性を含む多特異性抗原結合分子である;(vi)ヒトPD−1に10−9M以下のKDで結合する;(vii)カニクイザルPD−1に10−8M以下のKDで結合する;(viii)PD−1のPD−L1への結合を10−10M以下のIC50で遮断する;(ix)PD−1により誘導されるT細胞下方制御を遮断し、および/もしくはT細胞/APCルシフェラーゼレポーターアッセイにおいてT細胞シグナル伝達をレスキューする;(x)混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおいてT細胞増殖および活性を刺激する;(xi)MLRアッセイにおいてIL−2および/もしくはIFNγ産生を誘導する;ならびに(xii)がんを有する対象において、腫瘍成長を抑制し、生存を増大させる。

0134

本発明の抗体は、前述の生物学的特徴の1つもしくはそれ以上、または任意のその組み合わせを有する。本発明の抗体の他の生物学的特徴は、本明細書における実施例を含む本開示の説明から当業者に明白であろう。

0135

選択性および種交差反応性
本発明のある種の実施形態によると、抗PD−1抗体は、ヒトPD−1に結合するが、他の種由来のPD−1に結合しない。あるいは、本発明の抗PD−1抗体は、ある種の実施形態において、ヒトPD−1、および1つまたはそれ以上の非ヒト種由来のPD−1に結合する。例えば、本発明の抗PD−1抗体は、ヒトPD−1に結合し、マウス、ラットモルモットハムスタースナネズミブタネコイヌウサギヤギヒツジウシウマラクダ、カニクイザル、マーモセットアカゲザル、もしくはチンパンジーPD−1のうちの1つもしくはそれ以上に結合するか、または結合しない。ある種の実施形態において、本発明の抗PD−1抗体は、ヒトおよびカニクイザルPD−1に、同一の親和性で、または異なる親和性で結合するが、ラットおよびマウスPD−1に結合しない。

0136

エピトープマッピングおよび関連技術
本発明は、例えば、細胞外(IgV様)ドメイン、膜貫通型ドメイン、ならびに免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ(ITIM)および免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ(ITSM)を含有する細胞内ドメインを含むPD−1分子の1つまたはそれ以上のドメイン内で見出される1個またはそれ以上のアミノ酸と相互作用する、抗PD−1抗体を含む。抗体が結合するエピトープは、PD−1分子の前述のドメインのいずれかに位置する、3個またはそれ以上(例えば、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個もしくはそれ以上)のアミノ酸の単一の連続配列からなる(例えば、ドメインにおける直線エピトープ)。あるいは、エピトープは、PD−1分子の前述のドメインのいずれかまたは両方に位置する、多数の非連続アミノ酸(もしくはアミノ酸配列)からなる(例えば、立体構造エピトープ)。

0137

当業者に公知の種々の技術を用いて、抗体が、ポリペプチドもしくはタンパク質内の「1個またはそれ以上のアミノ酸と相互作用するかどうかが決定される。典型的な技術は、例えば、Antibodies、Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、NY)において記載されるもののような、慣例的交差−遮断アッセイを含む。他の方法は、アラニンスキャンニング変異解析、ペプチドブロット解析(Reineke(2004年)MethodsMol. Biol.248:443〜63頁)、ペプチド切断解結晶研究
、およびNMR解析を含む。加えて、抗原のエピトープ切除、エピトープ抽出、および化学修飾のような方法が利用される(Tomer(2000年)Prot.Sci.9:487〜496頁)。抗体が相互作用するポリペプチド内のアミノ酸を同定するために用いられる別の方法は、質量分析により検出される水素ジュウテリウム交換である。一般的な用語において、水素/ジュウテリウム交換方法は、目的のタンパク質をジュウテリウム標識すること、続いて、抗体をジュウテリウムで標識されたタンパク質に結合させることを含む。次に、タンパク質/抗体複合体は水に移され、抗体複合体により保護されるアミノ酸内の交換可能なプロトンは、接触面の一部でないアミノ酸内の交換可能なプロトンより遅い速度でジュウテリウムから水素への逆交換を受ける。結果として、タンパク質/抗体接触面の部分を形成するアミノ酸は、ジュウテリウムを保持し、それ故、接触面に含まれないアミノ酸と比較して、比較的大きな質量を提示する。抗体の解離後、標的タンパク質は、タンパク質分解酵素切断および質量分析の対象とされ、それにより、抗体が相互作用する特異的アミノ酸に対応するジュウテリウムで標識された残基が明らかにされる。例えば、Ehring(1999年)Analytical Biochemistry267:252〜259頁;EngenおよびSmith(2001年)Anal.Chem.73:256A〜265A頁を参照。

0138

用語「エピトープ」は、Bおよび/またはT細胞が応答する抗原上の部位を指す。B細胞エピトープは、タンパク質の3次フォールディングにより並べて置かれた連続アミノ酸または不連続アミノ酸両方から形成される。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、変性溶媒への曝露の際に典型的に保持され、他方、3次フォールディングにより形成されるエピトープは、変性溶媒での処理の際に典型的に失われる。エピトープは、固有空間立体構造において少なくとも3個、より通常には、少なくとも5個または8〜10個のアミノ酸を典型的に含む。

0139

抗原構造ベースの抗体プロファイリング(ASAP)としても公知の修飾補助プロファイリング(MAP)は、化学的または酵素的に修飾された抗原表面へのそれぞれの抗体の結合プロファイルの類似性により、同一の抗原に対して向けられた多数のモノクローナル抗体(mAb)を分類する方法である(US2004/0101920、参照によって全体として本明細書に組み入れられる)。それぞれのカテゴリーは、別のカテゴリーにより表されるエピトープと明らかに異なるか、または部分的に重複するいずれかの固有のエピトープを反映する。この技術は、特徴が、遺伝子学的に明確な抗体に焦点を当てられるように、遺伝子学的に一致する抗体の迅速な選別を可能にする。ハイブリドーマスクリーニングに適用される場合、MAPは、所望の特徴を有するmAbを産生する稀なハイブリドーマクローンの同定を促進する。MAPを用いて、本発明の抗体は異なるエピトープに結合する抗体の群に分類される。

0140

ある種の実施形態において、抗PD−1抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号327において例示される天然の形態か、もしくは配列番号321〜324において例示される組換え産生されているかのいずれかのPD−1において例示される領域の任意の1つまたはそれ以上の内のエピトープ、またはそのフラグメントに結合する。ある実施形態において、本発明の抗体は、PD−1のアミノ酸残基21〜171からなる群より選択される1個またはそれ以上のアミノ酸を含む細胞外領域に結合する。ある実施形態において、本発明の抗体は、配列番号322により例示される、カニクイザルPD−1のアミノ酸残基1〜146からなる群より選択される1個またはそれ以上のアミノ酸を含む細胞外領域に結合する。

0141

ある種の実施形態において、表1に示される、本発明の抗体は、配列番号327のおよそ21位〜およそ136の範囲にあるアミノ酸残基;または配列番号327のおよそ136位〜およそ171位の範囲にあるアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも1
個のアミノ酸配列と相互作用する。これらの領域は、配列番号321〜324において部分的に例示される。

0142

本発明は、本明細書における表1において記載される特異的な典型的な抗体、もしくは表1において記載される典型的な抗体のいずれかのCDR配列を有する抗体のいずれかと、同一のエピトープ、またはエプトープの部分に結合する、抗PD−1抗体を含む。同様に、本発明はまた、PD−1もしくはPD−1フラグメントへの結合について、本明細書における表1において記載される特異的な典型的な抗体、または表1において記載される典型的な抗体のいずれかのCDR配列を有する抗体のいずれかと競合する、抗PD−1抗体も含む。例えば、本発明は、PD−1への結合について、本明細書における実施例6において定義される1つまたはそれ以上の抗体と交差競合する抗PD−1抗体(例えば、H2aM7788N、H4xH8992P、H4xH8999P、H1M7799N、H2aM7780N、H1M7800N、H2aM7794N、H2aM7798N、H4xH9145P2、H4H9057P2、H4xH9120P2、H4xH9128P2、H4H9019P、H4xH9119P2、H4xH9135P2、H4xH9034P、H2aM7790N、H4xH9035P、H4xH9037P、H4xH9045P、およびH2aM7795N)を含む。

0143

当該技術分野において公知の慣例的方法を用いることにより、抗体が、参照抗PD−1抗体と同一のエピトープに結合するか、または結合について参照抗PD−1抗体と競合するかどうかを容易に決定することができる。例えば、試験抗体が、本発明の参照抗PD−1抗体と同一のエピトープに結合するかを決定するために、参照抗体を飽和条件下でPD−1タンパク質またはペプチドに結合させることを可能にする。次に、PD−1分子に結合する試験抗体の能力が評価される。試験抗体は、参照抗PD−1抗体との飽和結合後にPD−1に結合することができるなら、試験抗体は、参照抗PD−1抗体より異なるエピトープに結合すると結論付けられる。他方、試験抗体は、参照抗PD−1抗体との飽和結合後にPD−1タンパク質に結合することができないなら、次に、試験抗体は、本発明の参照抗PD−1抗体により結合されるエピトープと同一のエピトープに結合する。

0144

抗体が、結合について参照抗PD−1抗体と競合するかを決定するために、上で記載された結合方法論は、2つの方針で行われる。第1の方針において、参照抗体を、飽和条件下でPD−1タンパク質に結合させることを可能にし、続いて、試験抗体のPD−1分子への結合が評価される。第2の方針において、試験抗体を、飽和条件下でPD−1分子に結合させることを可能にし、続いて、参照抗体のPD−1分子への結合が評価される。両方の方針において、第1の(飽和)抗体のみが、PD−1分子に結合する能力があるなら、次に、試験抗体と参照抗体は、PD−1への結合について競合すると結論付けられる。当業者により理解される通り、結合について参照抗体と競合する抗体は、参照抗体と一致するエピトープに必ずしも結合しないが、重複または隣接するエピトープに結合することにより、参照抗体の結合を立体的に遮断する。

0145

2つの抗体は、それぞれが、他方の抗原への結合を競合的に阻害(遮断)するなら、同一または重複するエピトープに結合する。すなわち、1倍、5倍、10倍、20倍、または100倍過剰の一方の抗体が、他方の結合を、競合的結合アッセイにおいて測定される、少なくとも50%だが、好ましくは、75%、90%、もしくは99%でさえ阻害する(例えば、Junghansら、Cancer Res.1990年50:1495〜1502頁を参照)。あるいは、一方の抗体の結合を低減するか、もしくは除去する抗原における本質的に全てのアミノ酸変異が、他方の結合を低減するか、または除去するなら、2つの抗体は同一のエピトープを有する。一方の抗体の結合を低減するか、もしくは除去する、いくつかのアミノ酸変異が、他方の結合を低減するか、または除去するなら、2つの抗体は重複するエピトープを有する。

0146

次に、さらなる慣習的実験(例えば、ペプチド変異、および結合解析)を行い、試験抗体の結合の観察された欠如が、事実上、参照抗体と同一のエピトープへの結合に起因するかどうか、または立体的遮断(もしくは別の現象)が、観察された結合の欠如に関与するかが確認される。この選別の実験は、ELISA、RIA、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または当該技術分野において利用可能な任意の他の定量的もしくは定性的抗体結合アッセイを用いて行われる。

0147

免疫複合体
本発明は、細胞毒素、またはがんを処置するための化学療法剤のような、治療部分に結合したヒト抗PD−1モノクローナル抗体(「免疫複合体」)を包含する。本明細書において用いられる用語「免疫複合体」は、細胞毒素、放射性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分酵素毒素、ペプチドもしくはタンパク質、もしくは治療剤に化学的または生物学的に結合される抗体を指す。抗体は、その標的に結合することができる限り、分子に沿った任意の位置において、細胞毒素、放射性剤、サイトカイン、インターフェロン、標的もしくはレポーター部分、酵素、毒素、ペプチド、または治療剤に結合される。免疫複合体の例は、抗体薬物複合体、および抗体と毒素の融合タンパク質を含む。1つの実施形態において、剤は、PD−1に対する第2の異なる抗体である。ある種の実施形態において、抗体は、腫瘍細胞、またはウイルス性に感染した細胞に特異的な剤に結合される。抗PD−1抗体に結合される治療部分のタイプは、処置されるべき条件、および達成されるべき所望の治療効果を考慮する。免疫複合体を形成させるのに適切な剤の例は、当該分野で公知であり、例えば、WO05/103081を参照。

0148

多特異性抗体
本発明の抗体は、単特異性、二重特異性、または多特異性である。多特異性抗体は、1つの標的ポリペプチドの異なるエピトープに特異的であるか、または1つより多くの標的ポリペプチドに特異的な抗原結合ドメインを含有する。例えば、Tuttら、1991年、J.Immunol.147:60〜69頁;Kuferら、2004年、TrendsBiotechnol.22:238〜244頁を参照。

0149

1つの態様において、本発明は、多特異性抗原結合分子、またはその抗原結合フラグメントを含み、ここで、免疫グロブリンの1つの特異性は、PD−1の細胞外ドメイン、またはそのフラグメントに特異的であり、免疫グロブリンの他の特異性は、PD−1の細胞外ドメイン、もしくは第2の治療標的の外側の結合に特異的であるか、または治療部分に結合される。ある種の実施形態において、第1の抗原結合特異性は、PD−L1もしくはPD−L2、またはそのフラグメントを含む。本発明のある種の実施形態において、免疫グロブリンの一方の特異性は、PD−1のアミノ酸残基21〜171(配列番号327)、またはそのフラグメントを含むエピトープに特異的であり、免疫グロブリンの他の特異性は、第2の標的抗原に特異的である。第2の標的抗原は、PD−1と同一の細胞上、または異なる細胞上にある。1つの実施形態において、第2の標的細胞は、B細胞、抗原提示細胞、単球、マクロファージ、または樹状細胞のようなT細胞以外の免疫細胞上にある。ある実施形態において、第2の標的抗原は、腫瘍細胞上、または自己免疫組織細胞上、またはウイルス性に感染した細胞上に存在する。

0150

別の態様において、本発明は、PD−1に結合する第1の抗原結合特異性、およびT細胞受容体、B細胞受容体、またはFc受容体に結合する第2の抗原結合特異性を含む多特異性抗原結合分子またはその抗原結合フラグメントを提供する。関連する態様において、本発明は、PD−1に結合する第1の抗原結合特異性、ならびにLAG−3、CTLA−4、BTLA、CD−28、2B4、LY108、TIGIT、TIM3、LAIR1、ICOS、およびCD160のような異なるT細胞共阻害分子に結合する第2の抗原結合
特異性を含む多特異性抗原結合分子またはその抗原結合フラグメントを提供する。

0151

別の態様において、本発明は、PD−1に結合する第1の抗原結合特異性、および自己免疫組織特異的抗原に結合する第2の抗原結合特異性を含む多特異性抗原結合分子またはその抗原結合フラグメントを提供する。ある種の実施形態において、抗体は、活性化またはアゴニスト抗体である。

0152

本発明の多特異性抗原結合分子のいずれか、またはその変異体は、当業者に公知であろう、標準的分子生物学的技術(例えば、組み換えDNA、およびタンパク質発現技術)を用いて構築される。

0153

ある実施形態において、PD−1特異的抗体は、PD−1の別個のドメインに結合する可変領域が、単一の結合分子内に二重−ドメイン特異性を付与するよう一緒に結合される、二重特異性フォーマット(「二重特異性」)で作製する。適切には、設計された二重特異性は、特異性および結合活性両方の増大を通じて、全体的なPD−1阻害性効能を増強する。個々のドメイン(例えば、N末端のドメインのセグメント)についての特異性を有する、または1つのドメイン内の異なる領域に結合する可変領域は、それぞれの領域が、別個のエピトープ、または1つのドメイン内の異なる領域に同時に結合することを可能にする、構造スキャフォールド上で対形成される。二重特異性についての1つの例において、1つのドメインについての特異性を有する結合剤由来の重鎖可変領域(VH)を、第2のドメインについての特異性を有する、一連の結合剤由来の軽鎖可変領域(VL)と再度組み合わせて、そのVHについての元の特異性を壊すことなく、元のVHと対形成させる、非同族VLパートナーが同定される。この方法において、単一のVLセグメント(例えば、VL1)は、2つの異なるVHドメイン(例えば、VH1、およびVH2)と組み合わされて、2つの結合「アーム」(VH1−VL1、およびVH2−VL1)を含む二重特異性を生じる。単一のVLセグメントの使用は、システムの複雑さを低減し、これにより、単純化し、二重特異性を生じるために用いられるクローニング、発現、および精製方法における効率を増大させる(例えば、USSN13/022759、およびUS2010/0331527を参照)。

0154

あるいは、1つより多くのドメイン、および非限定的に、例えば、第2の異なる抗PD−1抗体のような第2の標的に結合する抗体は、本明細書において記載される技術、または当業者に公知の他の技術を用いて、二重特異性フォーマットで調製される。別個の領域に結合する抗体可変領域を、例えば、PD−1の細胞外ドメイン上の関連部位に結合する可変領域と一緒に結合させて、単一の結合分子内の二重−抗原特異性が確かにされる。適切には、この性質の設計された二重特異性は、二重機能を果たす。細胞外ドメインについての特異性を有する可変領域は、細胞外ドメインの外側についての特異性を有する可変領域と組み合わされ、それぞれの可変領域が、別の抗原に結合することを可能にする、構造スキャフォールド上で対形成される。

0155

本発明の文脈において用いられる典型的な二重特異性抗体フォーマットは、第1の免疫グロブリン(Ig)CH3ドメイン、および第2のIg CH3ドメインの使用を含み、ここで、第1および第2のIg CH3ドメインは、少なくとも1個のアミノ酸により互いに異なり、ここで、少なくとも1個のアミノ酸相違が、アミノ酸相違を欠く二重特異性抗体と比較して、タンパク質Aへの二重特異性抗体の結合を低減する。1つの実施形態において、第1のIg CH3ドメインは、タンパク質Aに結合し、第2のIg CH3ドメインは、H95R修飾(IMGTエキソンナンバリングによる;EUナンバリングによりH435R)のようなタンパク質A結合を低減するか、または消失させる、変異を含有する。第2のCH3は、Y96F修飾(IMGTによる;EUによりY436F)をさらに含む。第2のCH3内で見出されるさらなる修飾は:IgG1抗体の場合において、D
16E、L18M、N44S、K52N、V57M、ならびにV82I(IMGTによる;EUにより、D356E、L358M、N384S、K392N、V397M、およびV422I);IgG2抗体の場合において、N44S、K52N、ならびにV82I(IMGT;EUにより、N384S、K392N、およびV422I);ならびにIgG4抗体の場合において、Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q、ならびにV82I(IMGTによる;EUにより、Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q、およびV422I)を含む。上で記載された二重特異性抗体フォーマットにおけるバリエーションは、本発明の範囲内であると考えられる。

0156

本発明の文脈において用いられる他の典型的な二重特異性フォーマットは、限定されることなく、例えば、scFv−ベースもしくは二重特異性抗体二重特異性フォーマット、IgG−scFv融合体、二重可変ドメイン(DVD)−Ig、クアドローマ、knobs−into−holes、共通軽鎖(例えば、knobs−into−holesを有する共通軽鎖など)、CrossMab、CrossFab、(SEED)body、ロイシンジッパー、Duobody、IgG1/IgG2、二重作用Fab(DAF)−IgG、ならびにMab2二重特異性フォーマットを含む(例えば、前述のフォーマットの説明のため、Kleinら、2012年、mAbs4:6、1〜11頁、およびそこで引用される参考文献を参照)。二重特異性抗体はまた、ペプチド/核酸結合を用いても構築され、例えば、ここで、直交性化学反応性(orthogonal chemical reactivity)を有する非天然のアミノ酸を用いて、部位特異的抗体−オリゴヌクレオチド結合を生じ、次に、規定された組成原子価、および幾何学を有する多量体複合体に自己アセンブルする(例えば、Kazaneら、J.Am.Chem.Soc.[Epub:2012年12月4日]を参照)。

0157

治療投与および製剤
本発明は、本発明の抗PD−1抗体またはその抗原結合フラグメントを含む治療組成物を提供する。治療組成物は、本発明に従い、輸送デリバリー、寛容の好転などをもたらすよう製剤に取り込まれる、適切な担体、賦形剤、および他の剤と共に投与される。多数の適切な製剤は、全ての医薬化学者に公知の処方書:Remington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、PAにおいて見出される。これらの製剤は、例えば、粉末ペースト軟膏ジェルワックス、油、脂質、脂質(陽イオンまたは陰イオン)含有ベシクル(例えば、LIPOFECTIN(商標))、DNA結合体無水吸収ペースト、水中油型および油中水型エマルジョンエマルジョンカルボワックス(種々の分子量のポリエチレングリコール)、半固体ジェル、ならびにカルボワックスを含有する半固体混合物を含む。Powellら、「Compendium of excipients for
parenteral formulations」PDA(1998年)J Pharm Sci Technol52:238〜311頁も参照。

0158

抗体の用量は、投与されるべき対象の年齢およびサイズ、標的疾患、状態、投与経路などに依存して変動する。本発明の抗体が、成人患者において疾患もしくは障害を処置するために、またはかかる疾患の予防のため用いられる場合、本発明の抗体を、通常、体重1kg当たり約0.1〜約60mg、より好ましくは、体重1kg当たり約5〜約60、約10〜約50、または約20〜約50mgの単回用量で投与することが有利である。状態の重症度に依存して、処置の頻度および持続時間は調節される。ある種の実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも約0.1mg〜約800mg、約1〜約500mg、約5〜約300mg、または約10〜約200mg、〜約100mg、もしくは〜約50mgの開始用量として投与される。ある種の実施形態において、開始用量に続き、開始用量のものとおよそ同一であるか、またはそれ未満である量
における第2または多数の続く用量の抗体またはその抗原結合フラグメントが投与され、ここで、続く用量は、少なくとも1日〜3日;少なくとも1週;少なくとも2週;少なくとも3週;少なくとも4週;少なくとも5週;少なくとも6週;少なくとも7週;少なくとも8週;少なくとも9週;少なくとも10週;少なくとも12週;または少なくとも14週により隔てられる。

0159

種々のデリバリーシステムが公知であり、これを用いて、本発明の医薬組成物、例えば、リポソームにおけるカプセル封入微粒子マイクロカプセル変異ウイルスを発現する能力がある組み換え細胞、受容体により仲介されるエンドサイトーシスが投与される(例えば、Wuら(1987年)J.Biol.Chem.262:4429〜4432頁を参照)。導入の方法は、皮内、経皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、および経口経路を含むが、これらに限定されない。組成物は、任意の好都合経路により、例えば、注入もしくはボーラス注射により、上皮もしくは皮膚粘膜裏層(例えば、経口粘膜直腸、および腸粘膜など)を通じた吸収により、投与され、他の生物学的に活性な剤と一緒に投与される。投与は全身または局所である。医薬組成物はまた、ベシクル、特に、リポソームにおいてもデリバリーされる(例えば、Langer(1990年)Science249:1527〜1533頁を参照)。

0160

本発明の抗体をデリバリーするためのナノ粒子の使用も本明細書において考えられる。抗体結合ナノ粒子は、治療上および診断上の適用両方のため用いられる。抗体結合ナノ粒子、ならびに調製および使用方法は、Arruebo,M.ら、2009年(J. Nanomat.における「Antibody−conjugated nanoparticles for biomedical applications」2009巻、論文番号439389、24頁、doi:10.1155/2009/439389)(参照によって本明細書において組み入れられる)により詳細に記載される。ナノ粒子が開発され、腫瘍細胞、または自己免疫組織細胞、またはウイルス性に感染した細胞を標的化するための医薬組成物において含有される抗体に結合される。薬物デリバリー用ナノ粒子はまた、例えば、US8257740、またはUS8246995(それぞれ、参照によって、全体として本明細書に組み入れられる)においても記載される。

0161

ある種の状況において、医薬組成物は、制御放出システムにおいてデリバリーされる。1つの実施形態において、ポンプが用いられる。別の実施形態において、ポリマー材料が用いられる。なお別の実施形態において、制御放出システムは、組成物の標的の近くに置かれ、従って、少量の全身性用量のみが必要とされる。

0162

注射可能な調製物は、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、腹腔内および筋内注射用形態、点滴注入用形態などを含む。これらの注射可能な調製物は、公的に公知の方法により調製される。例えば、注射可能な調製物は、例えば、注射のため通常用いられる無菌水性媒体もしくは油性媒体において、上で記載された抗体またはその塩を溶解、懸濁、または乳化することにより、調製される。注射用水性媒体として、例えば、生理的食塩水グルコースを含有する等調溶液、および他の補助剤などが存在し、アルコール(例えば、エタノール)、多価アルコール(例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール)、非イオン性界面活性剤[例えば、ポリソルベート80、HCO−50(硬化ヒマシ油ポリオキシエチレン(50mol)付加物)]などのような適切な溶解剤と併用で用いられる。油性媒体として、例えば、ゴマ油大豆油などが利用され、安息香酸ベンジルベンジルアルコールなどのような溶解剤と併用して用いられる。従って、調製される注射は、適切なアンプルに好ましく充填される。

0163

本発明の医薬組成物は、標準的な針およびシリンジで皮下または静脈内にデリバリーされる。加えて、皮下デリバリーに関して、ペンデリバリー装置は、本発明の医薬組成物の
デリバリーにおいて容易に適用される。かかるペンデリバリー装置は、再利用可能であるか、または使い捨てである。再利用可能なペンデリバリー装置は、医薬組成物を含有する置換可能なカートリッジを一般に利用する。カートリッジ内の医薬組成物の全てが投与されると、カートリッジは空になり、空のカートリッジは容易に廃棄され、医薬組成物を含有する新しいカートリッジで置き換えられる。次に、ペンデリバリー装置は再利用される。使い捨てのペンデリバリー装置において、置き換え可能なカートリッジは存在しない。むしろ、使い捨てのペンデリバリー装置は、装置内のリザーバーにおいて保持される医薬組成物で予め充填される。リザーバーは、医薬組成物が空になると、全体の装置は廃棄される。

0164

多数の再利用可能なペン、および自動注射デリバリー装置は、本発明の医薬組成物の皮下デリバリーにおいて適用される。例は、AUTOPEN(商標)(Owen Mumford、Inc.、Woodstock、UK)、DISETRONIC(商標)ペン(Disetronic Medical Systems、Burghdorf、Switzerland)、HUMALOGMIX75/25(商標)ペン、HUMALOG(商標)ペン、HUMALIN70/30(商標)ペン(Eli Lilly and Co.、Indianapolis、IN)、NOVOPEN(商標)I、II、およびIII(Novo Nordisk、Copenhagen、Denmark)、NOVOPEN JUNIOR(商標)(Novo Nordisk、Copenhagen、Denmark)、BD(商標)ペン(Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ)、OPTIPEN(商標)、OPTIPEN PRO(商標)、OPTIPEN STARLET(商標)、ならびにOPTICLIK(商標)(Sanofi−Aventis、Frankfurt、Germany)(2、3例のみを挙げる)を含むが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物の皮下デリバリーにおいて適用される、使い捨てのペンデリバリー装置の例は、SOLOSTAR(商標)ペン(Sanofi−Aventis)、FLEXPEN(商標)(Novo Nordisk)、およびKWIKPEN(商標)(Eli Lilly)、SURECLCK(商標)Autoinjector(Amgen、Thousand Oaks、CA)、PENLET(商標)(Haselmeier、Stuttgart、Germany)、EPIPEN(Dey、L.P.)、ならびにHUMIRA(商標)ペン(Abbott Labs、Abbott Park、IL)(2、3例のみを挙げる)を含むが、確かにこれらに限定されない。

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