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技術 アミロイドベータタンパク質に対するモノクローナル抗体及びその使用

出願人 アッヴィ・インコーポレイテッドアッヴィ・ドイチュラント・ゲー・エム・ベー・ハー・ウント・コー・カー・ゲー
発明者 ボリス・ラブコフスキーシユテフアン・バルクホルンハインツ・ヒレンウルリヒ・エーベルトアンドレーアス・アール・シユトリービンガーパトリツク・ケラー
出願日 2020年4月3日 (10ヶ月経過) 出願番号 2020-067220
公開日 2020年9月10日 (5ヶ月経過) 公開番号 2020-143058
状態 未査定
技術分野 微生物、その培養処理 生物学的材料の調査,分析 ペプチド又は蛋白質 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 化合物または医薬の治療活性 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤
主要キーワード 使用利用 選択性係数 平均グレー 水素陽イオン 集合形態 球状凝集体 イメージングパラメータ 多孔材料
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図面 (20)

課題

アルツハイマー病又はその他の神経変性疾患の予防、治療及び診断において使用され得る、モノクローナル抗体の提供。

解決手段

アミロイドベータタンパク質単量体に対してよりもアミロイドベータ(Aβ)タンパク質球状凝集体に対して高い特異性で結合する単離抗体、及びアルツハイマー病を有する疑いのある患者から生体試料を単離し、抗原抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下で抗体と接触させた後、抗原/抗体複合体を検出することにより、アルツハイマー病を診断する方法。

概要

背景

アルツハイマー病(AD)は、進行性認知能力喪失及び脳のいくつかの領域での、ア
ミロイド沈着神経原線維もつれ及びニューロン欠損を含む特徴的な神経病理学的特性
を特徴とする神経変性疾患である(Hardy及びSelkoe(Science 29
7、353(2002);Mattson(Nature 431、7004(2004
)参照)。アミロイド沈着の主要な構成因子アミロイドベータペプチド(Aβ)であり
、42アミノ酸長型(Aβ1−42)が最も顕著である。

特に、アミロイドβ(1−42)タンパク質は、タンパク質分解プロセシングによる
アミロイド前駆体タンパク質APP)由来の42アミノ酸を有するポリペプチドである
。これにはまた、ヒト変異型に加え、ヒト以外の生物(特にその他の哺乳動物、とりわけ
ラット)に存在するアミロイドβ(1−42)タンパク質のアイソフォームも含まれる。
このタンパク質は、水性の環境で重合する傾向があり、非常に様々な分子形態で存在し得
る。

例えばアルツハイマー病などの認知症発症又は進行と不溶性タンパク質の沈着との単
純な相互関係は疑わしいことが分かっている(Terryら、Ann.Neurol.3
0.572−580(1991);Dicksonら、Neurobiol.Aging
16、285−298(1995))。一方、シナプス欠損及び知的知覚は、Aβ(1
−42)の可溶型とより相関すると思われる(Lueら、Am.J.Pathol.15
5、853−862(1999);McLeanら、Ann.Neurol.46、86
0−866(1999))。

過去にポリクローナル及びモノクローナル抗体がAβ(1−42)に対して作製されて
きたが、動物及び/又はヒトにおいて重篤副作用も起こさずに所望の治療効果をもたら
すことが証明されているものはない。例えば、5ヵ月間、週に1回、N−末端特異的抗−
Aβ(1−42)抗体の投与を受けた老齢APP23マウスでの前臨床研究からの受動
疫付与の結果から、治療的に関連のある副作用が示されている。特に、これらのマウスは
食塩水処置マウスと比較して、微小出血の数及び重症度が上昇していた(Pfeife
rら、Science 2002 298:1379)。同様の出血の増加は、最近、老
齢(>24ヵ月)Tg2576及びPDAPPマウスに対しても報告された(Wilco
ckら、J Neuroscience 2003、23:3745−51;Racke
ら、J Neuroscience 2005、25:629−636)。両系統におい
て、抗−Aβ(1−42)の注射の結果、微小出血が顕著に増加した。このように、ヒト
の身体においてネガティブで潜在的な致死的影響を誘発することなく疾患の進行を予防又
は遅らせる生物製剤の開発に対して非常に大きい治療ニーズがある。一般集団寿命が長
くなっており、この長寿化とともに、アルツハイマー病と診断される年間患者数が上昇し
ているという観点で、このようなニーズは特に明白である。さらに、このような抗体によ
り、アルツハイマー病の症状があった患者においてアルツハイマー病の適切な診断が可能
となろう(この診断は、現在、剖検でのみ確認することができる。)。さらに、このよう
な抗体により、本タンパク質生物学的特性及びこの衰弱性疾患に関与するその他の生物
学的因子解明することが可能となろう。本明細書中で言及する全ての特許及び刊行物
、参照によりその全体を本明細書中に組み込む。

概要

アルツハイマー病又はその他の神経変性疾患の予防、治療及び診断において使用され得る、モノクローナル抗体の提供。アミロイドベータタンパク質単量体に対してよりもアミロイドベータ(Aβ)タンパク質球状凝集体に対して高い特異性で結合する単離抗体、及びアルツハイマー病を有する疑いのある患者から生体試料を単離し、抗原抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下で抗体と接触させた後、抗原/抗体複合体を検出することにより、アルツハイマー病を診断する方法。

目的

本発明はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物に免
疫付与することにより、非ヒト、非マウス動物から、本発明のモノクローナル抗体を作製
するための方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

請求項2

モノクローナルである、請求項1に記載の単離抗体。

請求項3

前記球状凝集体及び前記単量体に対する結合特異性の比が少なくとも1.4である、請求項2に記載の単離抗体。

請求項4

前記比が1.4から16.9である、請求項3に記載の単離抗体。

請求項5

前記アミロイドベータタンパク質単量体が、Aβ(1−42)単量体及びAβ(1−40)単量体からなる群から選択される、請求項4に記載の単離抗体。

請求項6

前記モノクローナル抗体が、AmericanTypeCultureCollection指定番号PTA−7238又はPTA−7407を有するハイブリドーマにより産生される、請求項5に記載の単離抗体。

請求項7

AmericanTypeCultureCollection指定番号PTA−7238を有するハイブリドーマ。

請求項8

請求項7に記載のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体(8F5)。

請求項9

列番号1によりコードされる可変重鎖を含むモノクローナル抗体。

請求項10

ヒト又はヒト化である、請求項9に記載のモノクローナル抗体。

請求項11

配列番号2によりコードされる可変軽鎖を含むモノクローナル抗体。

請求項12

ヒト又はヒト化である、請求項11に記載のモノクローナル抗体。

請求項13

配列番号1によりコードされる可変軽重鎖をさらに含む、請求項11に記載のモノクローナル抗体。

請求項14

ヒト又はヒト化である、請求項13に記載のモノクローナル抗体。

請求項15

配列番号3を含むモノクローナル抗体。

請求項16

ヒト又はヒト化である、請求項15に記載のモノクローナル抗体。

請求項17

配列番号4を含むモノクローナル抗体。

請求項18

ヒト又はヒト化である、請求項17に記載のモノクローナル抗体。

請求項19

配列番号3をさらに含む、請求項17に記載のモノクローナル抗体。

請求項20

ヒト又はヒト化である、請求項19に記載のモノクローナル抗体。

請求項21

アミロイドベータタンパク質原線維に対してよりもアミロイドベータタンパク質球状凝集体に対して高い特異性で結合する単離抗体。

請求項22

モノクローナルである、請求項22に記載の単離抗体。

請求項23

前記モノクローナル抗体がAmericanTypeCultureCollection指定番号PTA−7238又はPTA−7407を有するハイブリドーマにより産生される、請求項23に記載の単離抗体。

請求項24

AmericanTypeCultureCollection指定番号PTA−7407を有するハイブリドーマ。

請求項25

請求項24に記載のハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体(8C5)。

請求項26

配列番号11によりコードされる可変重鎖を含むモノクローナル抗体。

請求項27

ヒト又はヒト化である、請求項26に記載のモノクローナル抗体。

請求項28

配列番号12によりコードされる可変軽鎖を含む、モノクローナル抗体。

請求項29

ヒト又はヒト化である、請求項28に記載のモノクローナル抗体。

請求項30

配列番号11によりコードされる可変軽鎖をさらに含む、請求項28に記載のモノクローナル抗体。

請求項31

ヒト又はヒト化である、請求項30に記載のモノクローナル抗体。

請求項32

配列番号19を含む、モノクローナル抗体。

請求項33

ヒト又はヒト化である、請求項32に記載のモノクローナル抗体。

請求項34

配列番号20を含む、モノクローナル抗体。

請求項35

ヒト又はヒト化である、請求項34に記載のモノクローナル抗体。

請求項36

可変重鎖を含むモノクローナル抗体(該可変重鎖は、配列番号13、配列番号14及び配列番号15からなる群から選択される少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含む。)。

請求項37

可変軽鎖を含むモノクローナル抗体(該可変軽鎖は、配列番号16、配列番号17及び配列番号18からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む。)。

請求項38

可変重鎖をさらに含む、請求項37に記載のモノクローナル抗体(該可変重鎖は、配列番号13、配列番号14及び配列番号15からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む。)。

請求項39

可変重鎖を含むモノクローナル抗体(該可変重鎖は、配列番号5、配列番号6及び配列番号7からなる群から選択される少なくとも1つの相補性決定領域(CDR)を含む。)。

請求項40

可変軽鎖を含むモノクローナル抗体(該可変軽鎖は、配列番号8、配列番号9及び配列番号10からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む。)。

請求項41

可変重鎖をさらに含む、請求項40に記載のモノクローナル抗体(該可変重鎖は、配列番号5、配列番号6及び配列番号7からなる群から選択される少なくとも1つのCDRを含む。)。

請求項42

アルツハイマー病治療又は予防を達成するのに十分な量でアルツハイマー病の治療又は予防を必要とする患者に請求項1又は請求項6に記載の単離抗体を投与することを含む、アルツハイマー病の治療又は予防を必要とする患者においてアルツハイマー病を治療又は予防する方法。

請求項43

前記単離抗体が、筋肉内投与静脈内投与及び皮下投与からなる群から選択される経路を介して投与される、請求項42に記載の方法。

請求項44

a.アルツハイマー病を有する疑いのある患者から生体試料を単離する段階;b.抗原抗体複合体の形成に十分な時間及び条件下で、請求項1又は請求項6に記載の単離抗体と該生体試料を接触させる段階;c.該試料中の該抗原/抗体複合体の存在(該複合体の存在は、該患者におけるアルツハイマー病の診断を示す。)を検出する段階を含む、アルツハイマー病を有する疑いのある患者においてアルツハイマー病を診断する方法。

請求項45

前記抗原が球状凝集体である、請求項44に記載の方法。

請求項46

a.アルツハイマー病を有する疑いのある患者から生体試料を単離する段階;b.抗体/抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で、抗原と該生体試料を接触させる段階;c.共役物結合抗体に結合させるのに十分な時間及び条件下で、得られた抗体/抗原複合体に共役物を添加する段階(該共役物は、請求項1又は請求項6に記載の単離抗体を含み、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合されている。);d.該シグナル生成化合物により生成されたシグナルを検出することにより、該生体試料中に存在し得る抗体の存在を検出する(該シグナルは、該患者においてアルツハイマー病の診断を示す。)段階を含む、アルツハイマー病を有する疑いのある患者においてアルツハイマー病を診断する方法。

請求項47

前記抗原が球状凝集体である、請求項46に記載の方法。

請求項48

a.アルツハイマー病を有する疑いのある患者から生体試料を単離する段階;b.抗−抗体/抗体複合体(該複合体は該生体試料中に存在する抗体を含有する。)の形成を可能にするのに十分な時間及び条件下で、抗−抗体と該生体試料を接触させる段階(該抗−抗体は、請求項1又は請求項6に記載の抗体に特異的である。);c.共役物を結合抗体に結合させるのに十分な時間及び条件下で、得られた抗−抗体/抗体複合体に共役物を添加する段階(該共役物は、抗原を含み、これは検出可能なシグナルを生成することができるシグナル生成化合物に結合されている。);d.該シグナル生成化合物により生成されるシグナルを検出する(該シグナルは、該患者においてアルツハイマー病の診断を示す。)段階を含む、アルツハイマー病を有する疑いのある患者においてアルツハイマー病を診断する方法。

請求項49

請求項1又は請求項6に記載の単離抗体を含有する組成物

請求項50

アルツハイマー病の予防又は治療を達成するのに十分な量でアルツハイマー病の予防又は治療を必要とする患者に請求項49に記載の組成物を投与する段階を含む、アルツハイマー病の予防又は治療を必要とする患者においてアルツハイマー病を予防又は治療する方法。

請求項51

請求項1又は請求項6に記載の単離抗体と、医薬的に許容可能なアジュバントと、を含有するワクチン

請求項52

アルツハイマー病の予防又は治療を達成するのに十分な量でアルツハイマー病の予防又は治療を必要とする患者に請求項51に記載のワクチンを投与する段階を含む、アルツハイマー病の予防又は治療を必要とする患者においてアルツハイマー病を予防又は治療する方法。

請求項53

a)関心のある1以上の化合物が請求項1又は請求項6に記載の単離抗体に結合するのに十分な時間及び条件下で、関心のある1以上の化合物を請求項1又は請求項6に記載の単離抗体に曝露する段階;b)請求項1又は請求項6に記載の単離抗体に結合する化合物を同定する(同定された化合物は、アルツハイマー病を発現すると予測される患者での能動免疫化において使用される。)段階を含む、アルツハイマー病が発現することが予測される患者の能動免疫化に適切な化合物を同定する方法。

請求項54

a)請求項1又は請求項6に記載の単離抗体と、b)シグナル生成化合物に結合された抗体を含む共役物(該共役物の該抗体は前記単離抗体とは異なる。)と、を含む、キット

請求項55

a)請求項1又は請求項6に記載の単離抗体に対する抗−抗体と、b)シグナル生成化合物に結合された抗原を含む共役物と、を含む、キット。

請求項56

前記抗原が球状凝集体である、請求項55に記載のキット。

技術分野

0001

本発明は、例えば、アルツハイマー病又はその他の神経変性疾患の、予防、治療及び診
断において使用され得るモノクローナル抗体(例えば、8F5及び8C5)に関する。

背景技術

0002

アルツハイマー病(AD)は、進行性認知能力喪失及び脳のいくつかの領域での、ア
ミロイド沈着神経原線維もつれ及びニューロン欠損を含む特徴的な神経病理学的特性
を特徴とする神経変性疾患である(Hardy及びSelkoe(Science 29
7、353(2002);Mattson(Nature 431、7004(2004
)参照)。アミロイド沈着の主要な構成因子アミロイドベータペプチド(Aβ)であり
、42アミノ酸長型(Aβ1−42)が最も顕著である。

0003

特に、アミロイドβ(1−42)タンパク質は、タンパク質分解プロセシングによる
アミロイド前駆体タンパク質APP)由来の42アミノ酸を有するポリペプチドである
。これにはまた、ヒト変異型に加え、ヒト以外の生物(特にその他の哺乳動物、とりわけ
ラット)に存在するアミロイドβ(1−42)タンパク質のアイソフォームも含まれる。
このタンパク質は、水性の環境で重合する傾向があり、非常に様々な分子形態で存在し得
る。

0004

例えばアルツハイマー病などの認知症発症又は進行と不溶性タンパク質の沈着との単
純な相互関係は疑わしいことが分かっている(Terryら、Ann.Neurol.3
0.572−580(1991);Dicksonら、Neurobiol.Aging
16、285−298(1995))。一方、シナプス欠損及び知的知覚は、Aβ(1
−42)の可溶型とより相関すると思われる(Lueら、Am.J.Pathol.15
5、853−862(1999);McLeanら、Ann.Neurol.46、86
0−866(1999))。

0005

過去にポリクローナル及びモノクローナル抗体がAβ(1−42)に対して作製されて
きたが、動物及び/又はヒトにおいて重篤副作用も起こさずに所望の治療効果をもたら
すことが証明されているものはない。例えば、5ヵ月間、週に1回、N−末端特異的抗−
Aβ(1−42)抗体の投与を受けた老齢APP23マウスでの前臨床研究からの受動
疫付与の結果から、治療的に関連のある副作用が示されている。特に、これらのマウスは
食塩水処置マウスと比較して、微小出血の数及び重症度が上昇していた(Pfeife
rら、Science 2002 298:1379)。同様の出血の増加は、最近、老
齢(>24ヵ月)Tg2576及びPDAPPマウスに対しても報告された(Wilco
ckら、J Neuroscience 2003、23:3745−51;Racke
ら、J Neuroscience 2005、25:629−636)。両系統におい
て、抗−Aβ(1−42)の注射の結果、微小出血が顕著に増加した。このように、ヒト
の身体においてネガティブで潜在的な致死的影響を誘発することなく疾患の進行を予防又
は遅らせる生物製剤の開発に対して非常に大きい治療ニーズがある。一般集団寿命が長
くなっており、この長寿化とともに、アルツハイマー病と診断される年間患者数が上昇し
ているという観点で、このようなニーズは特に明白である。さらに、このような抗体によ
り、アルツハイマー病の症状があった患者においてアルツハイマー病の適切な診断が可能
となろう(この診断は、現在、剖検でのみ確認することができる。)。さらに、このよう
な抗体により、本タンパク質生物学的特性及びこの衰弱性疾患に関与するその他の生物
学的因子解明することが可能となろう。本明細書中で言及する全ての特許及び刊行物
、参照によりその全体を本明細書中に組み込む。

先行技術

0006

Hardy及びSelkoe、Science 297、353(2002)
Mattson、Nature 431、7004(2004)
Terryら、Ann.Neurol.30.572−580(1991)
Dicksonら、Neurobiol.Aging 16、285−298(1995)
Lueら、Am.J.Pathol.155、853−862(1999)
McLeanら、Ann.Neurol.46、860−866(1999)
Pfeiferら、Science 2002 298:1379
Wilcockら、J Neuroscience 2003、23:3745−51
Rackeら、J Neuroscience 2005、25:629−636

0007

本発明は、アミロイドベータタンパク質単量体に対してよりもアミロイドベータ(Aβ
)タンパク質球状凝集体に対して高い特異性で結合する単離抗体を含む。従って、選択的
結合が観察される。本抗体は、例えば、8F5又は8C5などのモノクローナル抗体であ
り得る。単量体と対比した球状凝集体の結合特異性の比は少なくとも1.4である。特に
、この比は、好ましくは、少なくとも約1.4から少なくとも約16.9である。(1.
0−17.5(両端を含む。)の比もまた、本発明の範囲内であるとみなされる(同時に
その小数%範囲内)。例えば、1.1、1.2、1.3、...、2.0、2.1、2.
2...、17.1、17.2、17.3、17.4、17.5ならびにそれらの間及び
%の全ての整数は、本発明の範囲内に入るとみなされる。)。アミロイドベータタンパク
質単量体は、例えば、Aβ(1−42)単量体又はAβ(1−40)単量体であり得る。

0008

さらに、本発明はまた、American Type Culture Collec
tion指定番号PTA−7238を有するハイブリドーマにより産生されるモノクロ
ナル抗体(本明細書中で「8F5」と呼ぶ。)ならびにこのモノクローナル抗体(即ち8
F5)を産生するハイブリドーマを包含する。また、本発明は、American Ty
pe Culture Collection指定番号PTA−7407を有するハイブ
ドーマにより産生されるモノクローナル抗体(本明細書中で「8C5」と呼ぶ。)なら
びにこのモノクローナル抗体(即ち8C5)を産生するハイブリドーマも含む。

0009

さらに、本発明は、配列番号1によりコードされる可変重鎖を含むモノクローナル抗体
を含む。この抗体は、マウス、ヒト又はヒト化であり得る。さらに、本発明は、配列番号
2によりコードされる可変軽鎖を含むモノクローナル抗体を含む。この抗体もまた、マウ
ス、ヒト又はヒト化であり得る。この抗体は、配列番号1によりコードされる可変軽重
をさらに含み得、ヒト又はヒト化であり得る。

0010

さらに、本発明は、配列番号3を含むモノクローナル抗体を含む。この抗体は、マウス
、ヒト又はヒト化であり得る。

0011

さらに、本発明は配列番号4を含むモノクローナル抗体を包含する。この抗体は、マウ
ス、ヒト又はヒト化であり得る。この抗体は配列番号3をさらに含み得、マウス、ヒト又
はヒト化であり得る。

0012

さらに、本発明は、配列番号11によりコードされる可変重鎖を含むモノクローナル
体を含む。この抗体は、マウス、ヒト又はヒト化であり得る。

0013

さらに、本発明は、配列番号12によりコードされる可変軽鎖を含むモノクローナル抗
体を含む。この抗体もまた、マウス、ヒト又はヒト化であり得る。この抗体は、配列番号
11によりコードされる可変重鎖をさらに含み得、ヒト又はヒト化であり得る。

0014

さらに、本発明は配列番号19を含むモノクローナル抗体を含む。この抗体は、マウス
、ヒト又はヒト化であり得る。

0015

さらに、本発明は、配列番号20を含むモノクローナル抗体を包含する。この抗体は、
マウス、ヒト又はヒト化であり得る。この抗体は配列番号19をさらに含み得、マウス、
ヒト又はヒト化であり得る。

0016

本発明はまた、アミロイドベータタンパク質原線維に対してよりもアミロイドベータタ
ンパク質球状凝集体に対して高い特異性で結合する単離抗体も含む。この抗体は、例えば
モノクローナルであり得、American Type Culture Collec
tion指定番号PTA−7243を有するハイブリドーマ又はAmerican Ty
pe Culture CollectionPTA−7407を有するハイブリドーマ
により産生されるモノクローナル抗体であり得る。これらのモノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマもまた本発明の範囲内に入る。

0017

さらに、本発明は、可変重鎖の相補性決定領域(CDR)の少なくとも1つが、配列番
号5、配列番号6及び配列番号7からなる群から選択される抗体を含む。

0018

さらに、本発明はまた、可変軽鎖のCDRの少なくとも1つが配列番号8、配列番号9
及び配列番号10からなる群から選択される抗体も含む。この抗体は、配列番号5、配列
番号6及び配列番号7からなる群から選択される可変重鎖の少なくとも1つのCDRをさ
らに含み得る。

0019

本発明はまた、可変重鎖のCDRの少なくとも1つが配列番号13、配列番号14及び
配列番号15からなる群から選択される抗体も含む。

0020

さらに、本発明はまた、可変軽鎖のCDRの少なくとも1つが配列番号16、配列番号
17及び配列番号18からなる群から選択される抗体も包含する。この抗体は配列番号1
3、配列番号14及び配列番号15からなる群から選択される可変重鎖の少なくとも1つ
のCDRをさらに含み得る。

0021

さらに、本発明は、アルツハイマー病の治療又は予防を必要とする患者においてアル
ハイマー病を治療又は予防する方法を包含する。この方法は、治療又は予防を達成するの
に十分な量で患者に上述の単離抗体の何れか1以上を投与することを含む。

0022

例えば筋肉内投与静脈内投与及び皮下投与からなる群から選択される経路を介して本
単離抗体を投与し得る。

0023

本発明はまた、アルツハイマー病の疑いがある患者においてアルツハイマー病を診断す
る方法も含む。この方法は、1)患者から生体試料を単離する段階;2)抗原/抗体複合
体の形成に十分な時間及び条件下で、上述の抗体の少なくとも1つと該生体試料を接触さ
せる段階;3)該試料中の抗原/抗体複合体の存在(該複合体の存在は患者におけるアル
ツハイマー病の診断を示す。)を検出する段階を含む。この抗原は、例えば、球状凝集体
又は、完全な球状凝集体と同じ機能特性(例えば結合活性)を有する、その一部もしくは
断片であり得る。

0024

さらに、本発明は、アルツハイマー病の疑いがある患者においてアルツハイマー病を診
断する別の方法を含む。この方法は、1)患者から生体試料を単離する段階;2)抗体/
抗原複合体の形成に十分な時間及び条件下で、抗原と該生体試料を接触させる段階;3)
共役物結合抗体に結合させるのに十分な時間及び条件下で、得られた抗体/抗原複合体
に共役物を添加する段階(この共役物は、上述の抗体の1つを含み、検出可能なシグナル
を生成することができるシグナル生成化合物に結合されている。);4)シグナル生成
合物により生成されたシグナルを検出することにより、該生体試料に存在し得る抗体の存
在を検出する(このシグナルは、該患者においてアルツハイマー病の診断を示す。)段階
を含む。この抗原は、球状凝集体又は、完全な球状凝集体と同じ機能特性(例えば結合活
性)を有するその一部もしくは断片であり得る。

0025

本発明は、アルツハイマー病の疑いがある患者においてアルツハイマー病を診断するさ
らなる方法を含む。この方法は、1)患者から生体試料を単離する段階;2)抗−抗体/
抗体複合体(該複合体は該生体試料中に存在する抗体を含有する。)を形成させるのに十
分な時間及び条件下で、抗−抗体と生体試料を接触させる段階(該抗−抗体は、上述の抗
体の1つに特異的である。);2)共役物(conjugate)を結合抗体に結合させ
るのに十分な時間及び条件下で、得られた抗−抗体/抗体複合体に共役物を添加する段階
(該共役物は抗原を含み、これは、検出可能なシグナルを生成することができるシグナル
生成化合物に結合されている。);3)シグナル生成化合物により生成されたシグナルを
検出する(このシグナルは、該患者においてアルツハイマー病の診断を示す。)段階を含
む。

0026

さらに、本発明は、上述の抗体の何れか1以上を含有する組成物を含む(例えば、8F
5及び8C5)。

0027

本発明は、アルツハイマー病の予防又は治療を必要とする患者においてアルツハイマー
病を予防又は治療する別の方法を含む。この方法は、予防又は治療を達成するのに十分な
量で患者に直上の組成物を投与する段階を含む。

0028

さらに、本発明は、上述の抗体の少なくとも1つと、医薬的に許容可能なアジュバント
と、を含むワクチンを包含する。

0029

さらに、本発明は、アルツハイマー病の予防又は治療を必要とする患者においてアルツ
ハイマー病を予防又は治療するさらなる方法を含む。この方法は、予防又は治療を達成す
るのに十分な量で患者に上述のワクチンを投与する段階を含む。さらに、本発明は、アル
ツハイマー病が発現することが予測される患者の能動免疫化に適切な化合物を同定する方
法を包含する。この方法は、1)1以上の化合物が上述の抗体の1以上に結合するのに十
分な時間及び条件下で、関心のある1以上の化合物を上述の抗体の1以上に曝露する段階
;2)該抗体に結合する化合物を同定する(同定された化合物は、アルツハイマー病を発
現すると予測される患者での能動免疫化において使用される。)段階を含む。

0030

また、本発明は、a)上述の単離抗体の少なくとも1つと、b)シグナル生成化合物に
結合された抗体を含む共役物(この共役物の抗体はa)の単離抗体とは異なる。)と、を
含む、キットを含む。このキットは、このキットの成分の利用方法に関する説明付きの添
文書も含み得る。

0031

本発明はまた、a)上述の抗体の1つに対する抗−抗体と、b)シグナル生成化合物に
結合された抗原を含む共役物と、を含むキットも包含する。この抗原は、球状凝集体又は
、球状凝集体と同じ機能特性(例えば結合活性)を有するその一部もしくは断片であり得
る。また、このキットは、このキットの成分の利用方法に関する説明付きの添付文書も含
み得る。

0032

図面の簡単な説明
図1は、Aβ(1−42)単量体、Aβ(1−40)及びsAPPと対比した、球状凝
集体への、8F5の選択性を示す。EC50値間の比として、8F5に対する選択性係数
を計算することができる(HFIP中でAβ(1−42)単量体に対して:555.8/
90.74=6.1;NH4OH中でAβ(1−42)単量体に対して:1007/90
.74=11.1;Aβ(1−40)単量体に対して:667.8/90.74=7.4
;sAPPに対して:>100)。

0033

図2は、上清中の、原線維結合重及び軽鎖抗体(レーン4、6、8)及び対応する非結
遊離断片(レーン3、5、7)のSDS−PAGE分析を示す。

0034

図3は、軽度認知障害(MCI、左)又はアルツハイマー病(AD、右)の患者由来
CSF試料中のAβ42及びAβ40含量を示す。標準抗体6E10と比較した場合、又
は同じELISAを用いた直接試料分析と比較した場合、両群とも、8F5はAβ(1−
42)の割合がより高く、Aβ(1−40)の量が少ないか又は同等であることが観察さ
れ得る。

0035

図4は、APPトランスジェニックマウスの3群(即ち、6G1、8F5、PBS)及
び非トランスジェニック同腹仔野生型)の1群における、既知物体と対比した未知
の物体と過ごす時間としての、新規物体認識指数を示す。3週間にわたる、1週間に1回
腹腔内注射により、動物(数は下記カラムで与える。)に対して、モノクローナル抗体
6G1もしくは8F5で免疫付与を行うか又はビヒクル(即ち、リン酸緩衝食塩水;PB
S、及び野生型)での処置を行った。注射の最終日に、新規物体認識テストを行った。P
BS群と野生型群との間の相違から、この範例において、APPトランスジェニックマウ
スの認知障害が示された。PBSを注射したマウスはチャンスベルであったが(即ち、
50と有意差はなかった。)、一方、他の全てのマウスは物体認識を示した(t検定;星
印)。抗体処置APPトランスジェニックマウスのパフォーマンス対照群と比較したと
ころ、PBS処置マウスと対比して有意差が見られたが、野生型マウスと対比した場合有
意差は見られず(事後t検定を用いたANOVA;丸印)、このことから、これらのAP
Pトランスジェニックマウスにおいて、抗体処置により認知障害が軽減したことが示唆
れる。

0036

図5(A)は本明細書中で「8F5」と呼ぶモノクローナル抗体をコードする可変重鎖
DNA配列(配列番号1)を示し、図5(B)は、モノクローナル抗体8F5をコード
する可変軽鎖のDNA配列(配列番号2)を示す。(各配列において相補性決定領域(C
DR)に下線を付す。図6も参照のこと。)。

0037

図6(A)はモノクローナル抗体8F5の可変重鎖のアミノ酸配列(配列番号3)を示
し、図6(B)はモノクローナル抗体8F5の可変軽鎖のアミノ酸配列(配列番号4)を
示す。可変重鎖の1つのCDRは、アミノ酸配列SYGMS(配列番号5)により表され
る。可変重鎖の別のCDRは、アミノ酸配列ASINSNGGSTYYPDSVKG(配
列番号6)により表され、可変重鎖の別のCDRは、アミノ酸配列SGDY(配列番号7
)により表される。可変軽鎖のあるCDRは、アミノ酸配列RSSQSLVYSNGDT
LH(配列番号8)により表される。可変軽鎖の別のCDRは、アミノ酸配列KVS
FS(配列番号9)により表され、可変軽鎖の別のCDRは、アミノ酸配列SQSTH
VPWT(配列番号10)により表される。上述のCDRの全てに図6(A)及び6(B
)で下線を付す。

0038

図7は、アルツハイマー病(AD)患者又は老齢APPトランスジェニックマウスの新
皮質横断面に対する、様々な濃度での抗体の結合を示す。特に、図7(A)は、APP
トランスジェニックマウス系統Tg2576及びAD患者RZ55)での、脳組織
としての、及び脳血管での大脳アミロイド血管障害(CAA)としての、コンゴレッド
色による、アミロイド沈着の検証を示す。図7(B)は、AD患者(RZ16)における
Aβ(アミロイド斑)の実質性沈着の染色が6G1及び市販の抗体6E10によってのみ
起こり、一方、8F5及び8C5では染色が非常に弱いことを示す。図7(C)は、TG
2576マウスにおけるAβ(アミロイド斑)の実質性沈着の強い染色が6G1及び市販
の抗体6E10によってのみ起こり、一方、8F5及び8C5では染色が非常に弱いこと
を示す。図7(D)−(G)は、画像解析を用いた組織学的画像におけるAβ斑染色の分
析の定量を示す。斑のグレースケール値からバックグラウンド組織のグレースケール値を
差し引くことにより、光学密度値(0%=染色なし)を計算した。(図(D)=Tg25
76マウスにおける0.7μg/mL抗体の結合;図(E)=APP/Lマウスにおける
0.07−0.7μg/mL抗体の結合;図(F)=AD患者(RZ55)における0.
7μg/mL抗体の結合;及び図(G)=AD患者(RZ16)における0.07−0.
7μg/mL抗体の結合)。市販の抗体6E10(星印)及び4G8(丸)及び抗体6G
1、8C5及び8F5の染色間の差異を統計的に評価した(対照と対比して、星印1個/
丸印:p<0.05、星印2個/丸印:p<0.01及び星印3個/丸印:p<0.00
1;p<0.001でのANOVA後の、事後ボンフェローニt検定)(図(D)及び図
(E))。図(E)及び(G)において、抗体8C5及び8F5は常に、市販の抗体6E
10及び4G8よりも有意に弱い染色を示した(ANOVAでのp<0.001後、事後
t検定において、p<0.05)。図(H)は、Aβの血管沈着(矢印)の強い染色が6
G1及び市販の抗体6E10でのみ起こり、一方、8F5又は8C5での染色は非常に弱
かったことを示す。Tg2576マウスにおいて、量的に同様の状況が見られた(ここで
は示さない。)。

0039

図8は、Aβ(1−42)単量体、Aβ(1−40)及びsAPPと対比した、球状凝
集体に対する8C5の選択性を示す。EC50値間の比として、8C5に対する選択性係
数を計算することができる(HFIP中でAβ(1−42)単量体に対して:2346/
568.2=4.1;NH4OH中でAβ(1−42)単量体に対して:>100;Aβ
(1−40)単量体に対して:>100;sAPPに対して:>100)。

0040

図9(A)は、8C5の重鎖をコードするヌクレオチド配列(配列番号11)を示し、
図9(B)は、8C5の軽鎖をコードするヌクレオチド配列(配列番号12)を示す。図
10(A)及び10(B)で述べる対応するCDRをコードするヌクレオチド配列に下線
を付す。

0041

図10(B)は、モノクローナル抗体8C5の可変重鎖のアミノ酸配列(配列番号19
)を示し、図10(B)は、モノクローナル抗体8F5の可変軽鎖のアミノ酸配列(配列
番号20)を示す。可変重鎖の1つのCDRは、アミノ酸配列SYGMS(配列番号13
)で表される。可変重鎖の別のCDRはアミノ酸配列SIKNNGGSTYYPDSLK
G(配列番号14)で表され、可変重鎖の別のCDRはアミノ酸配列SGDY(配列番号
15)で表される。可変軽鎖の1つのCDRはアミノ酸配列RSSQSLVHSNGDT
FLH(配列番号16)で表される。可変軽鎖の別のCDRはアミノ酸配列KVSNRF
S(配列番号17)で表され、可変軽鎖の別のCDRはアミノ酸配列SQSIHVPWT
(配列番号18)で表される。上述のCDRの全てに図10(A)及び10(B)で下線
を付す。

0042

発明の詳細な説明
本発明は、本明細書中で「8F5」と呼ぶモノクローナル抗体ならびにその他の関連抗
体(例えば8C5)に関する。例えば、アルツハイマー病及びその他の神経変性疾患の、
診断、予防及び治療において、これらの抗体を使用し得る。

0043

モノクローナル抗体8F5ならびにモノクローナル抗体8C5は、多くの興味深い特性
を有し、このため、これらは非常に興味深い治療薬候補であり、同時に非常に有用な診断
薬候補である。例えば、モノクローナル抗体8F5及び8C5は、単量体又は原線維と比
較して、Aβ(1−42)球状凝集体に対して選択的な結合を有する。

0044

「Aβ(X−Y)」という用語は、本明細書中で、ヒトアミロイドβタンパク質のアミ
ノ酸位置Xからアミノ酸位置Y(X及びYの両方を含む。)のアミノ酸配列を指し、特に
、アミノ酸配列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGA
IIGLMVGGVV IA又はその天然変異体の何れかの、アミノ酸位置Xからアミ
ノ酸位置Yのアミノ酸配列を指し、特に、A2T、H6R、D7N、A21G(「Fle
mish」)、E22G(「Arctic」)、E22Q(「Dutch」)、E22K
(「Italian」)、D23N(「Iowa」)、A42T及びA42Vからなる群
から選択される少なくとも1つの突然変異があるもの(ここで、数字は、Aβペプチド
開始位置に対応し、位置X及び位置Yの両方を含む。)又は3個以下のさらなるアミノ酸
置換(これらの中に球状凝集体形成を妨害し得るものはない。)を有する配列を指す。「
さらなる」アミノ酸置換とは、本明細書中で、自然には見られない規範的な配列からの何
らかの逸脱として定義する。

0045

より具体的には、本明細書中で「Aβ(1−42)」という用語は、ヒトアミロイドβ
タンパク質の、アミノ酸位置1からアミノ酸位置42(1及び42の両方を含む。)のア
ミノ酸配列を指し、特に、アミノ酸配列DAEFRHDSGYEVHHQKLVFF
AEDVGSNKGA IIGLMVGGVV IA(アミノ酸位置1から42に対応す
る。)又はその天然の変異体の何れかの、アミノ酸位置1からアミノ酸位置42のアミノ
酸配列を指す。このような変異体は、例えば、A2T、H6R、D7N、A21G(「F
lemish」)、E22G(「Arctic」)、E22Q(「Dutch」)、E2
2K(「Italian」)、D23N(「Iowa」)、A42T及びA42Vからな
る群から選択される少なくとも1つの突然変異を有するもの(ここで、数字は、Aβペプ
チドの開始位置に対応し、位置1及び位置42の両方を含む。)又は3個以下のさらなる
アミノ酸置換(これらの中に球状凝集体形成を妨害し得るものはない。)を有する配列で
あり得る。同様に、「Aβ(1−40)」という用語は、ここで、ヒトアミロイドβタン
パク質の、アミノ酸位置1からアミノ酸位置40(1及び40の両方を含む。)のアミノ
酸配列を指し、特に、アミノ酸配列DAEFRHDSGY EVHHQKLVFF AE
DVGSNKGA IIGLMVGGVV又はその天然の変異体の何れかの、アミノ酸位
置1からアミノ酸位置40のアミノ酸配列を指す。このような変異体は、例えば、A2T
、H6R、D7N、A21G(「Flemish」)、E22G(「Arctic」)、
E22Q(「Dutch」)、E22K(「Italian」)及びD23N(「Iow
a」)からなる群から選択される少なくとも1つの突然変異を有するもの(ここで、数字
は、Aβペプチドの開始位置に対応し、位置1及び位置40の両方を含む。)又は3個以
下のさらなるアミノ酸置換(これらの中に球状凝集体形成を妨害し得るものはない。)を
有する配列を含む。「Aβ(X−Y)球状凝集体」(「Aβ(X−Y)球状オリゴマー
としても知られる。)という用語は、本明細書中で、上記で定義されるように、均一性
び個別の物理的特性を有する、Aβ(X−Y)ペプチドの可溶性の球状の非共有結合を指
す。Aβ(X−Y)球状凝集体は、陰イオン性界面活性剤インキュベートすることによ
り得られるAβ(X−Y)ペプチドの安定な非原線維性オリゴマー集合体である。単量
体及び原線維とは異なり、これらの球状凝集体は、サブユニットの定められた集合体数を
特徴とする(例えば、PCT国際出願公開WO04/067561に記載のように、初期
集合形態、n=3−6、「オリゴマーA」及び後期集合形態、n=12−14、「オリゴ
マーB」。)。球状凝集体は、3次元球状型構造を有する(「モルテングロビュール」、
Barghornら、2005、J Neurochem、95、834−847参照)
。これらはさらに、次の特性の1以上をさらに特徴とする:
−短縮型Aβ(X−Y)球状凝集体を生じる広域プロテアーゼサーモリシン又はエン
プロテイナーゼGluCなど)でのN−末端アミノ酸X−23の切断可能性;
−広域プロテアーゼ及び抗体とのC末端アミノ酸24−Yの非近接性;及び
−これらのAβ(X−Y)球状凝集体の短縮型が、球状凝集体の3次元コア構造(その
球状凝集体配座におけるコアエピトープAβ(20−Y)の近接性がより優れている。)
を維持する。

0046

本発明によると、及び、特に本発明の抗体の結合親和性を評価する目的のために、「A
β(X−Y)球状凝集体」という用語は、本明細書中で、国際出願公開WO04/067
561(参照により、その全体を本明細書中に組み込む。)に記載のようなプロセスによ
り得ることができる産物を指す。このプロセスは、天然、組み換え又は合成Aβ(X−Y
)ペプチドもしくはその誘導体アンフォールディングすること;アンフォールディング
したAβ(X−Y)ペプチド又はその誘導体を界面活性剤に少なくとも部分的に曝露し、
その界面活性剤作用を低下させ、インキュベートを続けることを含む。

0047

ペプチドのアンフォールディングのために、例えばヘキサフルオロイソプロパノール
HFIP)などの水素結合破壊剤をタンパク質に対して作用させ得る。作用温度が約20
から50℃、特に約35から40℃である場合、数分、例えば10から60分の作用時間
で十分である。蒸発乾固した残渣を、好ましくは濃縮形態で、例えばジメチルスルホキシ
ド(DMSO)などの水性緩衝剤と混ざり合う適切な有機溶媒中で続いて溶解することに
より、結果として、その後に使用できる、少なくとも部分的にアンフォールディングされ
たペプチド又はその誘導体の懸濁液が得られる。必要ならば保存用懸濁液を低温、例え
ば約−20℃でしばらくの間保存し得る。

0048

あるいは、ペプチド又はその誘導体を僅かに酸性の、好ましくは水性の、溶液、例えば
約10mMHCl水溶液中で溶解させ得る。およそ数分間インキュベートした後、不溶
性成分を遠心により除去する。10,000gで数分が好都合である。これらの方法の段
階を好ましくは室温、即ち20から30℃の範囲の温度で行う。遠心後に得られる上清は
、Aβ(X−Y)ペプチド又はその誘導体を含有し、低温、例えば約−20℃でしばらく
の間保存し得る。

0049

オリゴマー(国際出願公開WO04/067561、オリゴマーAと呼ばれる。)の中
間型を与えるための、界面活性剤への続く曝露は、ペプチド又はその誘導体のオリゴマー
化に関連する。このために、十分な中間体オリゴマーが生じるまで、場合によっては少な
くとも部分的にアンフォールディングされたペプチド又はその誘導体に対して界面活性剤
を作用させる。イオン性界面活性剤、特に陰イオン性界面活性剤を用いるのが好ましい。

0050

特定の実施形態によると、式(I):
R−X
の界面活性剤が使用される(式中、基「R」は、6から20、好ましくは10から14
個の炭素原子を有する非分枝もしくは分枝アルキル又は6から20、好ましくは10から
14個の炭素原子を有する非分枝もしくは分枝アルケニルであり、基「X」は酸性基又は
その塩であり、Xは好ましくは−COC−M+、−SO3−M+の中から選択され、最も
好ましくは−OSO3−M+であり、M+は、水素陽イオン又は無機もしくは有機陽イオ
ンであり、好ましくは、アルカリ金属陽イオンアルカリ土類金属陽イオン及びアンモ
ウム陽イオンから選択される。)。最も有利であるのは、特にRが非分枝アルキルである
(そのalk−l−yl基を言及しなければならない。)、式(I)の界面活性剤である
。特に好ましいのは、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)である。ラウリン酸及びオレイ
ン酸も有利に使用できる。界面活性剤ラウロイルサルコシンナトリウム塩サルコシル
NL−30又はGardol(R)としても知られている。)もまた特に有利である。

0051

界面活性剤作用時間は、特に、アンフォールディングされているならば、オリゴマー化
に供されるペプチド又はその誘導体がどの程度までアンフォールディングされているかに
依存する。アンフォールディング段階に従い、ペプチド又はその誘導体が水素結合破壊剤
で(即ち、特にヘキサフルオロイソプロパノールで)既に処理されているならば、作用温
度が約20から50℃、特に約35から40℃である場合、数時間の範囲の作用時間、有
利には約1から20、特に約2から10時間で十分である。アンフォールディングの程度
が小さいか又は基本的にアンフォールディングされていないペプチド又はその誘導体が出
発点である場合、同様に、作用時間が長い方が好都合である。例えばHFIP処理に代わ
る手段として上記手順に従いペプチドもしくはその誘導体が前処理されているか、又は該
ペプチドもしくはその誘導体がオリゴマー化に直接供されるならば、作用温度が約20か
ら50℃、特に約35から40℃である場合、約5から30時間、特に約10から20時
間の作用時間で十分である。インキュベート後、不溶性成分を遠心により有利に除去する
。10,000gで数分が好都合である。

0052

選択すべき界面活性剤濃度は使用する界面活性剤に依存する。SDSを使用する場合、
0.01から1重量%、好ましくは、0.05から0.5重量%の範囲、例えば、約0.
2重量%の濃度が好都合である。ラウリン酸又はオレイン酸を使用する場合、例えば、0
.05から2重量%、好ましくは0.1から0.5重量%の範囲、例えば約0.5重量%
の、幾分高い濃度が好都合である。界面活性剤作用は、生理的範囲前後の塩濃度で起こる
はずである。従って、特に50から500mM、好ましくは100から200mMの範囲
、より具体的には約140mMのNaCl濃度が好都合である。

0053

続く界面活性剤作用の低下及びインキュベートの継続は、本発明のAβ(X−Y)球状
凝集体(国際出願公開WO04/067561において、オリゴマーBと呼ばれる。)を
与えるためのオリゴマー化にさらに関連する。前段階から得られる組成物は通常界面活性
剤及び生理的範囲の塩濃度を含有するので、界面活性剤作用を低下させ、好ましくは塩濃
度も低下させることが好都合である。例えば、水又は低塩濃度の緩衝液(例えばTris
−HCl、pH7.3)で好都合に希釈することにより界面活性剤及び塩の濃度を低下さ
せることによって、これを行い得る。約2から10の範囲、有利には、約3から8の範囲
、特に約4の、希釈係数が適切であることが分かっている。この界面活性剤作用を中和
ることができる物質を添加することによっても、界面活性剤作用の低下を達成し得る。こ
れらの例には、一連の精製及び抽出手段において細胞を安定化させることができる物質の
ような界面活性剤を錯化することができる物質(例えば、特定のEO/POブロクコ
リマー、特に、Pluronic(R)F68の商標名のブロックコポリマー)が含まれ
る。特定の臨界ミセル濃度後又はそれ以上の濃度の、アルコキシル化及び、特に、エト
キシルアルキルフェノール(Triton(R)Xシリーズエトキシル化t−オクチ
フェノール、特にTriton(R)X100、3−(3−コラミドプロピルジメチル
アンモニオ)−1−プロパンスルホネートCHAPS(R))など)又はアルコキシル
化及び、特に、エトキシル化ソルビタン脂肪エステル(Triton(R)シリーズのも
の、特にTween(R)20など)も同様に使用し得る。

0054

続いて、十分なAβ(X−Y)球状凝集体が産生されるまでこの溶液をインキュベート
する。作用温度が約20から50℃、特に約35から40℃である場合、数時間の範囲、
好ましくは約10から30時間、特に約15から25時間の範囲の作用時間で十分である
。次にこの溶液を濃縮し得、得られるであろう残渣を遠心により除去し得る。繰り返すが
、10,000gで数分間が好都合であることが分かっている。遠心後に得られた上清は
、本明細書中に記載のようなAβ(X−Y)球状凝集体を含有する。

0055

例えば超遠心透析沈殿又は遠心により、Aβ(X−Y)球状凝集体を最終的に回収
することができる。変性条件下でのAβ(X−Y)球状凝集体の電気泳動による(例えば
SDS−PAGEによる)分離によって2重のバンドが得られれば(例えば、Aβ(1−
42)に対して38/48kDaの見かけ分子量を有する。)さらに好ましく、分離前
にオリゴマーのグルタールアルデヒド処理においてこれらの2本のバンドが1本にまとま
れば特に好ましい。球状凝集体のサイズ排除クロマトグラフィーの結果、1本のピーク
なる場合も好ましい(例えば、Aβ(1−42)に対するおよそ60kDaの分子量に対
応する。)。Aβ(1−42)ペプチドから開始する場合、本プロセスは、特にAβ(1
−42)球状凝集体を得るために適切である。好ましくは、この球状凝集体は、神経細胞
に対して親和性を示し、また、神経調節作用も示す。「神経調節作用」は、神経可塑性
関してニューロンの機能不全を導く、ニューロンの長期にわたる阻害作用として定義され
る。

0056

本発明の別の態様によると、「Aβ(X−Y)球状凝集体」という用語は、本明細書中
で、基本的にAβ(X−Y)サブユニットからなる球状凝集体を指し、これは、平均で1
2サブユニットのうち少なくとも11がAβ(X−Y)タイプであれば好ましく、より好
ましくはこの球状凝集体の10%未満が何らかの非Aβ(X−Y)ペプチドであり、最も
好ましくは、この調製物の非Aβ(X−Y)ペプチドの含量が検出閾値以下である。より
具体的には、「Aβ(1−42)球状凝集体」という用語は、本明細書中で、上記で定義
されるような、Aβ(1−42)ユニットを含有する球状凝集体を指し;「Aβ(12−
42)球状凝集体」という用語は、本明細書中で、上記で定義されるような、Aβ(12
−42)ユニットを含有する球状凝集体を指し;「Aβ(20−42)球状凝集体」とい
う用語は、本明細書中で、上記で定義されるような、Aβ(20−42)ユニットを含有
する球状凝集体を指す。

0057

架橋Aβ(X−Y)球状凝集体」という用語は、本明細書中で、球状凝集体の構成単
位の、架橋により、好ましくは化学的架橋により、より好ましくはアルデヒド架橋により
、最も好ましくはグルタールアルデヒド架橋により、上述のようなAβ(X−Y)球状凝
集体から得られる分子を指す。本発明の別の態様において、架橋球状凝集体は基本的に、
その単位が、非共有結合相互作用のみによって一緒になっているのではなく、少なくとも
一部が共有結合により連結されている球状凝集体である。

0058

「Aβ(X−Y)球状凝集体誘導体」という用語は、本明細書中で、特に、検出を容易
にする基に共有結合されることにより標識されている球状凝集体(好ましくは、フルオロ
フォア、例えば、フルオレセインイソチオシアネートフィコエリスリンオワンクラゲ
Aequorea victoria)蛍光タンパク質、Dictyosoma蛍光
ンパク質もしくは何らかの組み合わせ又はその蛍光活性誘導体;発色団化学発光団、例
えば、ルシフェラーゼ、好ましくはPhotinus pyralis(ホタルルシ
ェラーゼ、Vibrio fischeri(発光細菌)ルシフェラーゼもしくは何らか
の組み合わせ又はその化学発光活性誘導体;酵素活性基、例えば、ホースラディッシュ
ルオキシダーゼなどのペルオキシダーゼ又はその酵素活性誘導体;高電子密度基、例えば
、金含有基などの重金属含有基;ハプテン、例えば、フェノール誘導化ハプテン;強い抗
原性のある構造、例えば、Kolaskar及びTongaonkarのアルゴリズム
どにより抗原性があると予想されるペプチド配列;別の分子に対するアプタマーキレ
ト基、例えば、ヘキサヒスチジニル;さらに特異的なタンパク質−タンパク質相互作用
介在する天然もしくは天然由来タンパク質構造、例えば、fos/junペアメンバー
磁気群、例えば、強磁性体群;又は1H、14C、32P、35Sもしくは125I又
はそれらの何らかの組み合わせを含む基などの放射活性基);又は共有結合により、もし
くは高親和性相互作用による非共有結合によりフラッグ化されている、好ましくは、不活
性化、金属イオン封鎖、分解及び/又は沈降を促進する基に共有結合されている、好まし
くは、インビボでの分解を促進する基(より好ましくは、ユビキチン)でフラッグ化され
ている球状凝集体(このフラッグ化オリゴマーがインビボでアセンブルされている場合、
特に好ましい。);又は何らかの上記の組み合わせにより修飾されている球状凝集体を指
す。このような標識及びフラッグ化基及びこれらをタンパク質に結合するための方法は当
技術分野で公知である。球状化の前、最中又は後に、標識及び/又はフラッグ化を行い得
る。本発明の別の態様において、球状凝集体誘導体は、標識及び/又はフラッグ化反応に
より球状凝集体から得ることができる分子である。従って、「Aβ(X−Y)単量体誘導
体」という用語は、本明細書中で、特に、球状凝集体に対して述べたように標識又はフラ
ッグ化されたAβ単量体を指す。

0059

「より高い親和性」という用語は、本明細書中で、一方の未結合抗体及び未結合球状凝
集体と、他方の抗体−球状凝集体複合体との間の平衡が、抗体−球状凝集体複合体にさら
に偏っている、相互作用の程度を指す。同様に、「より小さい親和性」という用語は、本
明細書中で、一方の未結合抗体及び未結合球状凝集体と、他方の抗体−球状凝集体複合体
との間の平衡が、未結合抗体及び未結合球状凝集体にさらに偏っている相互作用の程度を
指す。

0060

「Aβ(X−Y)単量体」という用語は、本明細書中で、Aβ(X−Y)ペプチドの単
離形態、好ましくは、その他のAβペプチドとの基本的に非共有相互作用に関与していな
いAβ(X−Y)ペプチドの形態を指す。実際に、Aβ(X−Y)単量体は通常、水溶液
の形態で与えられる。好ましくは、水性単量体溶液は、例えば本発明の抗体の結合親和性
を調べるために使用する場合、0.05%から0.2%、より好ましくは、約0.1%
NaOHを含有する。別の好ましい状況において、水性単量体溶液は、0.05%から0
.2%、より好ましくは、約0.1% NaOHを含有する。使用する場合、適切な形式
で溶液を希釈することが好都合であり得る。さらに、通常、溶液調製後、2時間以内、特
に1時間以内、とりわけ30分以内に溶液を使用することが好都合である。

0061

「原線維」という用語は、本明細書中で、電子顕微鏡下で原線維性構造を示す非共有結
合した個々のAβ(X−Y)ペプチドの集合体を含む分子構造を指し、これはコンゴレッ
ドに結合し、偏光下で複屈性を示し、そのX−線回折パターンクロス−β構造である。
原線維はまた、24単位を超える、好ましくは、100単位を超える凝集体の形成を導く
変性剤非存在下での、例えば0.1M HCl中での、適切なAβペプチドの自己誘導
重合体凝集を含むプロセスにより得られる分子構造とも定義され得る。このプロセスは当
技術分野で周知である。好都合に、Aβ(X−Y)原線維は、水溶液の形態で使用される
。本発明の特に好ましい実施形態において、0.1%NH4OH中でAβペプチドを溶解
し、20mM NaH2PO4、140mM NaCl、pH7.4で1:4に希釈し、
次いでpH7.4に再調整し、37℃にて20時間インキュベートし、次いで10000
gで10分間遠心し、20mM NaH2PO4、140mM NaCl、pH7.4で
再懸濁することにより、水性原線維溶液を調製する。

0062

「Aβ(X−Y)原線維」という用語は、本明細書中で、Aβ(X−Y)サブユニット
を含む原線維を指し、この場合、平均でサブユニットの少なくとも90%がAβ(X−Y
)型のものであれば好ましく、サブユニットの少なくとも98%がAβ(X−Y)型のも
のであればより好ましく、非Aβ(X−Y)ペプチドの含量が検出閾値以下であれば最も
好ましい。

0063

8F5に戻って、図1ならびに8C5(図8)により明らかなように、Aβ(1−42
)球状凝集体特異的抗体モノクローナル抗体8F5及び8C5は、非特異的抗体6G1及
び6E10とは異なり、主にAβ(1−42)球状凝集体型を認識し、凝集したAβ(1
−42)を含むAβ(1−40)又はAβ(1−42)単量体の標準的調製物を認識しな
い。特に、8F5は、ネイティブPAGE−ウェスタンブロットによりAβ(1−42)
球状凝集体のみを検出し、SDS−PAGEウェスタンブロット分析では検出しないので
、このことから、コアAβ(1−42)球状凝集体構造における、より複雑な界面活性剤
解離可能なサブユニット間エピトープへの結合が示唆される。サブユニット間エピトー
プは、少なくとも2個のサブユニットに位置する、複雑な非線形性スルースペース(th
rough space)エピトープとして定義される。より具体的に、様々なAβ(1
−42)及びAβ(1−40)標準的調製物に対するドットブロット分析から、特異的8
F5及び8C5の場合、非球状Aβ型(標準的Aβ(1−40)/(1−42)単量体調
製物)、凝集Aβ(1−42)と対比してAβ(1−42)球状凝集体の認識に顕著な差
があるが、アイソフォーム非特異的抗体6G1及び6E10の場合は顕著な差がないこと
が示される。8F5及び8C5は球状凝集体特異性があるが6G1及び6E10は球状凝
集体特異性がないことは、サンドイッチELISAにおいて、Aβ(1−42)球状凝集
体、Aβ(1−42)単量体、Aβ(1−40)単量体及び可溶性アミロイド前駆体タン
パク質α結合を定量することにより確認された。さらに、これらの抗体は、ネイティブウ
スタブロッティング後には球状凝集体に接近するが、SDSウェスタンブロッティ
グ後には接近しないので、各抗体が、Aβ(1−42)のアミノ酸20から30の領域で
、サブユニットの間の構造的非線形性エピトープを認識すると思われる。例えば8F5又
は8C5などの球状凝集体選択的抗体によってAβの球状凝集体型を特異的に標的とする
ことにより、1)不溶性アミロイド沈着を標的とすることが避けられ(これに結合するこ
とは、不溶性Aβで免疫付与する際中に観察される炎症性の副作用の原因となり得る。)
;2)予知的な生理的機能を有することが報告されているAβ単量体及びAPPを使用せ
ず(Planら、J.of Neuroscience 23:5531−5535(2
003);3)不溶性沈着への大量の結合により隠されないか又は接近不可能でないため
、抗体のバイオアベイラビリティーが向上するので、球状凝集体に対するこのような特異
性は重要である。

0064

本発明はまた、モノクローナル抗体8F5及び8CDの可変軽鎖及び重鎖をコードする
単離ヌクレオチド配列(又はその断片)ならびに、これらのコードヌクレオチド配列と少
なくとも約70%(例えば、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%
、77%、78%又は79%)、好ましくは少なくとも約80%(例えば、80%、81
%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%又は89%)、より好ま
しくは少なくとも約90%(例えば、91%、92%、93%、94%、95%、96%
、97%、98%又は99%)同一であるものを含むか、これらに相当するか、これらと
、同一であるか、ハイブリダイズ可能であるか又は相補的である、配列を有するヌクレオ
チド配列(又はその断片)も含む。(70%と100%との間及びこれらを含む全ての整
数(及びその一部)は、%同一性に関して本発明の範囲内であるとみなされる。)。この
ような配列は、あらゆる源由来であり得る(例えば、天然源から単離されるか、半合成
路介して産生されるか、又は合成デノボをの何れか。)。特に、実施例に記載のもの以外
の源からこのような配列を単離し得るか又はこのような配列は実施例に記載のもの以外の
源由来であり得る(例えば、細菌、真菌藻類、マウス又はヒト)。

0065

上述のヌクレオチド配列に加えて、本発明はまた、モノクローナル抗体8F5及びモノ
クローナル抗体8C5の可変軽及び重鎖のアミノ酸配列(又はこれらのアミノ酸配列の断
片)も含む。さらに、本発明はまた、本発明のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約
70%、好ましくは少なくとも約80%及びより好ましくは少なくとも約90%同一であ
るものを含むか、これらに相当するか、これらと、同一であるか又は相補的である、アミ
ノ酸配列(又はその断片)も含む(繰り返すが、70%と100%との間及びこれらを含
む全ての整数(及びその一部)も(上記のヌクレオチド配列同一性に関連して引用される
場合)、%同一性に関して本発明の範囲内であるとみなされる。)。

0066

本発明の目的に対して、ヌクレオチド配列の「断片」は、特定のヌクレオチド配列の領
域に相当する、およそ、少なくとも6、好ましくは少なくとも約8、より好ましくは少な
くとも約10ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約15ヌクレオチドの連続
する配列として定義される。

0067

「同一性」という用語は、特定の比較枠又はセグメントにわたる、ヌクレオチドごとの
2つの配列の関連性を指す。従って、同一性は、2つのDNAセグメント(又は2つのア
ミノ酸配列)の同じ鎖(センス又はアンチセンスの何れか)間の、同一性、対応性又は同
等性の程度として定義される。「配列同一性の%」は、特定の領域にわたり2つの最適に
アラインされた配列を比較し、一致している位置の数を得るために両配列において同一の
塩基又はアミノ酸がある位置の数を調べ、このような位置の数を比較しているセグメント
中の位置の総数割り、その結果に100を掛けることにより計算される。Smith&
Waterman、Appl.Math.2:482(1981)のアルゴリズムにより
、Needleman&Wunsch、J.Mol.Biol.48:443(1970
)のアルゴリズムにより、Pearson&Lipman、Proc.Natl.Aca
d.Sci.(USA)85:2444(1988)の方法により、及び、関連するアル
リズムを実行するコンピュータプログラムにより(例えば、Clustal Maca
w Pileup(http://cmgm.stanford.edu/bioche
m218/11Multiple.pdf;Higginsら、CABIOS.5L15
1−153(1989))、FASTDB(Intelligentics)、BLAS
T(National Center for Biomedical Informa
tion;Altschulら、Nucleic AcidsResearch 25
:3389−3402(1997))、PILEUP(Genetics Comput
er Group、Madison、WI)又はGAP、BESTFIT、FASTA及
びTFASTA(Wisconsin Genetics Software Pack
age Release 7.0、Genetics Computer Group、
Madison、WI)、配列の最適アラインメントを行い得る。(米国特許第5,91
2,120号参照)。

0068

本発明の目的に対して、「相補性」は、2つのDNAセグメント間の関連性の程度とし
て定義される。これは、二重らせんを形成するために、適切な条件下で、一方のDNAセ
グメントのセンス鎖が他方のDNAセグメントのアンチセンス鎖とハイブリダイズする能
力を測定することにより決定される。「相補的である」とは、規範的な塩基対形成規則
基づきある一定の配列に対して対を形成する配列として定義される。例えば、あるヌクレ
オチド鎖中の配列A−G−Tは、他方の鎖のT−C−Aに対して「相補的」である。

0069

二重らせんにおいて、アデニンが一方の鎖に現れ、チミンが他方の鎖に現れる。同様に
グアニンが一方の鎖で見られる場合は常に、他方でシトシンが見られる。2つのDNA
セグメントのヌクレオチド配列間の関連性が大きいほど、2つのDNAセグメントの鎖間
でのハイブリッド二本鎖形成能が大きくなる。

0070

2つのアミノ酸配列間の「類似性」は、一連の同一ならびに保存的アミノ酸残基が両配
列において存在することとして定義される。2つのアミノ酸配列間の類似性の程度が高い
ほど、2つの配列の、対応性、同一性又は同等性が高くなる。(2つのアミノ酸配列の間
の「同一性(identity)」は、一連の正確に等しい又は不変のアミノ酸残基が両
配列において存在することとして意義される。)。「相補性」、「同一性」及び「類似性
」の定義は、当業者にとって周知である。

0071

「によりコードされる」とは、ポリペプチド配列をコードする核酸配列を指し、このポ
リペプチド配列又はその一部は、その核酸配列によりコードされるポリペプチド由来の、
少なくとも3アミノ酸、より好ましくは少なくとも8アミノ酸及びさらにより好ましくは
少なくとも15アミノ酸のアミノ酸配列を含有する。

0072

さらに、核酸分子は、核酸分子の1本鎖形態が温度及びイオン強度の適切な条件下でそ
の他の核酸分子とアニールすることができる場合、別の核酸分子にハイブリダイズ可能で
ある(Sambrookら、「Molecular Cloning:A Labora
tory Manual、第2版(1989)、Cold Spring Harbor
Laboratory Press、Cold Spring Harbor、New
York)を参照)。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「スト
リンジェンシー」を定める。

0073

「ハイブリダイゼーション」という用語は、本明細書で使用する場合、当業者にとって
容易に明らかになるであろうように、プローブ配列及び標的配列性質に依存して、スト
リンジェンシーの適切な条件での核酸のハイブリダイゼーションを意味するために通常使
用される。ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件は当技術分野で周知であり、インキュ
ベート時間、温度及び/又は溶液のイオン強度を変化させることによる、所望のストリ
ジェンシーに依存した条件の調整は容易に行われる。例えば、上述のような、Sambr
ook、J.ら、Molecular Cloning:A Laboratory M
anual、第2版、Cold Spring Harbor Press、Cold
Spring Harbor、N.Y.、1989を参照のこと(これを参照により本明
細書中に組み込む。)。(Short Protocols in Molecular
Biology、Ausbelら編及びTijssen、Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology−Hybr
idization with Nucleic Acid Probes、「Over
view of principles of Hybridization and
the strategy of nucleic acid assays」(198
3)も参照のこと。両者とも参照により本明細書中に組み込む。)。具体的に、条件の選
択は、ハイブリダイズさせる配列の長さ、特にプローブ配列の長さ、核酸の相対的G−C
含量及び許容されるミスマッチの量による。低ストリンジェンシー条件は、相補性の程度
がより低い鎖間の部分的ハイブリダイゼーションが望ましい場合に好ましい。完全又はほ
ぼ完全な相補性が望ましい場合、高ストリンジェンシー条件が好ましい。典型的な高スト
リンジェンシー条件の場合、ハイブリダイゼーション溶液は、6xS.S.C.、0.0
1MEDTA、1xDenhardt溶液及び0.5%SDSを含有する。クローン化
DNAの断片の場合、約68℃で約3から4時間、トータル真核DNAの場合、約12か
ら約16時間、ハイブリダイゼーションを行う。中程度のストリンジェンシーの場合、3
塩化ナトリウムクエン酸ナトリウムSSC)、50%ホルムアミド(pH7.5で
、この緩衝液の0.1M)の溶液及び5xDenhardt溶液でのフィルタープレハイ
ブリダイズ及びハイブリダイズを利用し得る。37℃で4時間プレハイブリダイズし、続
いて3,000,000cpmトータルに等しい標識プローブ量と37℃で16時間ハイ
ブリダイズし、次いで、2xSSC及び0.1%SDS溶液中で洗浄(室温で各1分間を
4回及び60℃にて各30分間を4回)し得る。乾燥後、フィルムに曝露する。より低い
ストリンジェンシーの場合、ハイブリダイゼーション温度を2本鎖の融解温度(Tm)よ
りも約12℃低くする。Tmは、G−C含量及び2本鎖の長さならびに溶液のイオン強度
関数として知られている。

0074

「ハイブリダイゼーション」には、2つの核酸が相補的配列を含有することが必要であ
る。しかし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによって、塩基間のミスマッ
チが起こり得る。上述のように、核酸をハイブリダイズさせるのに適切なストリンジェン
シーは、核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。このような可変性は当技術分野で周知
である。より具体的には、2つのヌクレオチド配列間の類似性又はホモロジーの程度が大
きいほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドに対するTm値が大きくなる。10
ヌクレオチド長を超えるハイブリッドの場合、Tmを計算するための式がある(Sam
brookら、前出参照)。短い核酸のハイブリダイゼーションの場合、ミスマッチの位
置がより重要となり、オリゴヌクレオチドの長さによりその特異性が決まる(Sambr
ookら、前出参照)。

0075

本明細書で使用する場合、「単離核酸断片又は配列」は、1本鎖又は2本鎖であり、場
合によっては合成、非天然又は改変ヌクレオチド塩基を含有する、RNA又はDNAのポ
リマーである。DNAのポリマーの形態の単離核酸断片は、cDNAゲノムDNA又は
合成DNAの1以上のセグメントから構成され得る。(特定のポリヌクレオチドの「断片
」とは、およそ少なくとも約6ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約8ヌクレオチド、
より好ましくは少なくとも約10ヌクレオチド及びさらにより好ましくは少なくとも約1
5ヌクレオチド、及び最も好ましくは少なくとも約25ヌクレオチドの、特定のヌクレオ
チド配列の領域と同一又は相補的な連続配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。)。ヌ
クレオチド(通常、その5’−モノリン酸形態で見出される。)は、次のように1文字表
記で表される:アデニル酸又はデオキシアデニル酸に対して「A」(それぞれRNA又は
DNAに対して)、シチジル酸又はデオキシシチジル酸に対して「C」、グアニル酸又は
デオキシグアニル酸に対して「G」、ウリジル酸に対して「U」、デオキシチミジル酸
対して「T」、プリン(A又はG)に対して「R」、ピリミジン(C又はT)に対して「
Y」、G又はTに対して「K」、A又はC又はTに対して「H」、イノシンに対して「I
」及び何れかのヌクレオチドに対して「N」。

0076

「機能的に同等の断片又はサブフラグメント」及び「機能的に同等の断片又はサブフラ
グメント」という用語は、本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、その断
片又はサブフラグメントが活性酵素をコードするか否かに関わらず、遺伝子発現を変化さ
せるか又はある種の表現型を生じさせる能力が保持されている、単離核酸断片の一部又は
部分配列を指す。例えば、形質転換された植物において所望の表現型を生じさせるための
キメラコンストラクトの設計において、断片又はサブフラグメントを使用することができ
る。活性酵素をコードするか否かに関わらず、植物プロモーター配列に対して適切な方向
で、核酸断片又はそのサブフラグメントを連結することによるコサプレッション又はアン
チセンスにおける使用のために、キメラコンストラクトを設計することができる。

0077

「ホモロジー」、「相同の」、「実質的に同様の」及び「実質的に一致する」という用
語は、本明細書中で交換可能に使用される。これらは、1以上のヌクレオチド塩基の変化
が、その核酸断片の、遺伝子発現介在能力又はある種の表現型生成能に影響を与えない核
酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の、非修飾断片に対して、得られる核酸断片の
機能特性を実質的に変化させない1以上のヌクレオチドの欠失又は挿入などの、本発明の
核酸断片の修飾も指す。従って、当業者にとって当然のことながら、本発明は、具体的な
代表的配列だけにとどまらないものを包含する。

0078

「遺伝子」とは、コード配列の前にある(5’非コード配列)及び後にある(3’非コ
ード配列)制御配列を含む、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。

0079

「ネイティブ遺伝子」とは、それ自身の制御配列とともに天然に見出されるような遺伝
子を指す。一方、「キメラコンストラクト」とは、天然において通常は一緒に見出されな
い核酸断片の組み合わせを指す。従って、キメラコンストラクトは、異なる源由来の制御
配列及びコード配列又は、同じ源由来であるが、天然で通常見られるものとは異なる方式
編成される制御配列及びコード配列を含み得る。(「単離された」という用語は、配列
がその天然の環境から離されることを意味する。)。

0080

外来」遺伝子とは、宿主生物において通常は見られない遺伝子を指すが、これは、遺
伝子移入により宿主生物に導入される。外来遺伝子は、非ネイティブ生物又はキメラコン
ストラクトに挿入されたネイティブ遺伝子を含み得る。「トランス遺伝子」は、形質転換
手順によりゲノムに導入されている遺伝子である。

0081

「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするDNA配列を指す。「制御配列
」とは、コード配列の上流(5’非コード配列)、コード配列内、又はその下流(3’非
コード配列)に位置するヌクレオチド配列を指し、この配列は、転写、RNAプロセシン
グ又は安定性又は関連するコード配列の翻訳に影響を及ぼす。制御配列には、以下に限定
されないが、プロモーター、翻訳リーダー配列及びポリアデニル化認識配列が含まれ得る

0082

「プロモーター」又は「制御遺伝子配列」とは、コード配列又は機能的RNAの発現を
調節することができるDNA配列を指す。この配列は、隣接及びより遠位の上流エレメン
トからなり、後者のエレメントエンハンサーと呼ばれることが多い。従って、「エンハ
ンサー」は、プロモーター又は制御遺伝子配列活性を刺激することができ、プロモーター
生来のエレメント又はプロモーターのレベル又は組織特異性を促進するために挿入され
た異種エレメントであり得るDNA配列である。プロモーター配列はまた、遺伝子の転写
部分内、及び/又は転写配列の下流にも位置し得る。プロモーターは、それらの全体にお
いて、ネイティブ遺伝子由来であるか、又は、天然で見られる様々なプロモーター由来の
様々なエレメントからなるか、又は合成DNAセグメントを含み得る。当業者にとって当
然のことながら、異なるプロモーターは、異なる組織又は細胞型において、又は発生の異
なるステージにおいて、又は異なる環境条件に反応して、遺伝子の発現を支配し得る。殆
どの場合に、殆どの宿主細胞型において遺伝子発現を引き起こすプロモーターは、一般に
構成的プロモーター」と呼ばれる。植物細胞で有用な様々なタイプの新しいプロモータ
ーが常に発見されている;Okamuro及びGoldberg、Biochemist
ry of Plants 15:1−82(1989)による編集物において、多くの
例を見出すことができる。殆どの場合において、制御配列の正確な境界は完全に定められ
ていないので、いくつかのバリエーションDNA断片が同一のプロモーター活性を有し
得ることがさらに認められる。

0083

イントロン」は、タンパク質配列の一部をコードしない遺伝子中の介在配列である。
従って、このような配列は、RNAに転写されるが、その後切り出され、翻訳されない。
この用語はまた、切り出されたRNA配列に対しても使用される。「エクソン」は、転写
され、その遺伝子由来の成熟メッセンジャーRNAで見出される遺伝子配列の一部である
が、必ずしも最終遺伝子産物をコードする配列の一部である必要はない。

0084

「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置する
DNA配列を指す。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシングされたmRNAの、翻訳開
始配列の上流に存在する。翻訳リーダー配列は、mRNAに対する主要な転写産物のプロ
シング、mRNA安定性又は翻訳効率に影響し得る。翻訳リーダー配列の例は、(Tu
rner、R.及びFoster、G.D.(1995)Molecular Biot
echnology 3:225)に記載されている。

0085

「3’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置するDNA配列を指し、ポリアデ
ニル化認識配列及びmRNAプロセシング又は遺伝子発現に影響を与え得る制御シグナル
をコードするその他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは、通常、mRNA前駆体
3’末端へのポリアデニル酸領域の付加に影響を与えることを特徴とする。様々な3’非
コード配列の使用については、Ingelbrechtら、Plant Cell 1:
671−680(1989)により例示されている。

0086

RNA転写産物」とは、RNAポリメラーゼにより触媒されるDNA配列の転写によ
り得られる産物を指す。RNA転写産物がDNA配列の完全な相補的コピーである場合、
これは、一次転写産物と呼ばれるか、又は一次転写産物の転写後プロセシング由来のRN
A配列であり得、成熟RNAと呼ばれる。「メッセンジャーRNA(mRNA)」とは、
イントロンがなく、細胞によりタンパク質へと翻訳され得るRNAを指す。「cDNA」
とは、mRNA鋳型に相補的であり、これから酵素逆転写酵素を用いて合成されるDNA
を指す。cDNAは、1本鎖であるか、又はDNAポリメラーゼIのKlenow断片を
用いて2本鎖形態に変換され得る。「センス」RNAとは、mRNAを含み、細胞内又は
インビトロでタンパク質に翻訳され得るRNA転写産物を指す。「アンチセンスRNA
とは、標的の一次転写産物又はmRNAの全てもしくは一部に相補的であり、標的遺伝子
の発現をブロックするRNA転写産物を指す(米国特許第5,107,065号)。アン
チセンスRNAの相補性とは、具体的な遺伝子転写産物の何れかの部分との(即ち、5’
非コード配列、3’非コード配列、イントロン又はコード配列での)ものであり得る。「
機能的RNA」とは、アンチセンスRNA、リボザイムRNA又は、翻訳され得ないが、
細胞性プロセスにおいて影響を有するその他のRNAを指す。「相補」及び「逆相補(r
everse complement)」という用語は、mRNA転写産物に関して本明
細書中で交換可能に使用され、メッセージのアンチセンスRNAを定義するものである。

0087

内在性RNA」という用語は、天然であれ非天然であれ、本発明の組み換えコンスト
ラクトにより形質転換される前に(即ち、組み換え手段、突然変異誘発などにより導入さ
れる。)、宿主のゲノムに存在する何らかの核酸配列によりコードされる何らかのRNA
を指す。

0088

「非天然」という用語は、人工のものであり、天然で通常見られるものと一致しないこ
とを意味する。

0089

「操作可能に連結」という用語は、一方の機能が他方により制御されるような1つの核
酸断片における核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターがそのコード配列の発現を
制御可能である場合、そのプロモーターはコード配列に操作可能に連結されている(即ち
、コード配列がプロモーターの転写調節下にある。)。センス又はアンチセンス方向で、
コード配列を制御配列に操作可能に連結することができる。別の例において、直接又は間
接的に、標的mRNAに対して5’又は標的mRNAに対して3’に、又は標的mRNA
内で、本発明の相補的RNA領域を操作可能に連結することができるか、又は標的mRN
Aに対して、第一の相補的領域が5’であり、その相補が3’である。

0090

「発現」という用語は、本明細書で使用する場合、機能的最終産物の産生を指す。遺伝
子の発現は、遺伝子の転写及びmRNAの前駆体又は成熟タンパク質への翻訳を含む。「
アンチセンス阻害」とは、標的タンパク質の発現を抑制することができるアンチセンスR
NA転写産物の産生を指す。「コサプレッション」とは、同一又は実質的に同様の外来又
内在性遺伝子の発現を抑制することができるセンスRNA転写産物の産生を指す(米国
特許第5,231,020号)。

0091

「成熟」タンパク質とは、翻訳後にプロセシングされたポリペプチド、即ち、一次転写
産物において存在する何らかのプレ又はプロペプチドが除去されているものを指す。「前
駆体」タンパク質とは、mRNAの転写の一次産物を指し、即ち、プレ及びプロペプチド
がまだ存在するものである。プレ及びプロペプチドは、限定されないが、細胞内局在シグ
ナルであり得る。

0092

「安定な形質転換」とは、結果として遺伝的に安定な遺伝形質が得られる、宿主生物の
ゲノムへの核酸断片の移入を指す。一方、「一時的形質転換」とは、結果として統合又は
安定な遺伝なく遺伝子発現が起こる、宿主生物の核又はDNA含有細胞小器官への核酸断
片の移入を指す。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「トランスジェニック
」生物と呼ばれる。「形質転換」という用語は、本明細書で使用する場合、安定的形質
換及び一時的形質転換の両方を指す。

0093

本明細書中で使用される標準的組み換えDNA及び分子クローニング技術は当技術分野
で周知であり、Sambrook、J.、Fritsch、E.F.及びManiati
s、T.、Molecular Cloning:A Laboratory Manu
al;Cold Spring Harbor Laboratory Press:C
old Spring Harbor、1989(本明細書中で以後「Sambrook
」と呼ぶ。)においてより詳細に記載されている。

0094

「組み換え」という用語は、例えば、化学合成による、又は遺伝子操作技術による核酸
の単離セグメントの操作による、2つの異なった個別の配列のセグメントの人工的組み合
わせを指す。

0095

PCR」又は「ポリメラーゼ連鎖反応」は、一連の繰り返しサイクルからなる、大量
の特定DNAセグメントの合成のための技術である(Perkin Elmer Cet
us Instruments、Norwalk、CT)。通常、2本鎖DNAを加熱変
性させ、標的セグメントの3’境界に相補的な2つのプライマーを低温でアニーリング
せ、次いで中間温度伸長させる。これらの連続的な3段階の1セットをサイクルと呼ぶ

0096

ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)は、短時間で鋳型の複製を繰り返すことによって
DNAを数百倍に増幅するために使用される強力な技術である。(Mullisら、Co
ld Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:263−
273(1986);Erlichら、欧州特許出願第50,424号;欧州特許出願第
84,796号;欧州特許出願第258,017号;欧州特許出願第237,362号;
Mullis、欧州特許出願第201,184号;Mullisら、米国特許第4,68
3,202号;Erlich、米国特許第4,582,788号;及びSaikiら、米
国特許第4,683,194号)。このプロセスは、DNA合成を開始させるために、特
異的なインビトロ合成オリゴヌクレオチドのセットを利用する。これらのプライマーの設
計は、分析するDNA配列に依存する。高温で鋳型を融解させ、プライマーを鋳型内の相
補的配列にアニーリングさせ、次いでDNAポリメラーゼにより鋳型を複製する、多くの
サイクル(通常20−50)により、この技術を行う。

0097

アガロースゲルにおいて分離し、次いで臭化エチジウム染色し、UV透光可視化する
ことにより、PCR反応の産物を分析する。あるいは、産物に標識を組み込むために、放
射性dNTPをPCRに添加することができる。この場合、X線フィルムゲルを曝露す
ることにより、PCRの産物を可視化する。放射性標識PCR産物のさらなる長所は、個
々の増幅産物のレベルを定量できることである。

0098

「組み換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」及び「組み換え発現コンストラ
クトという用語は、本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、当業者にとっ
て周知の標準的方法を用いて細胞のゲノムに挿入することができる遺伝物質の機能的単位
を指す。このようなコンストラクトは、それ自身か、又はベクターと組み合わせて使用さ
れ得る。ベクターを使用する場合、ベクターの選択は、当業者にとって周知のように、宿
主植物を形質転換するために使用するであろう方法に依存する。例えば、プラスミドを使
用することができる。当業者は、首尾よく形質転換し、選択し、本発明の単離核酸断片の
何れかを含有する宿主細胞を増殖させるために、ベクターに存在しなければならない遺伝
的エレメントを十分認識している。当業者はまた、異なる独立の形質転換事象の結果、異
なるレベル及びパターンの発現が得られること(Jonesら、(1985)EMBO
J.4:2411−2418;De Almeidaら、(1989)Mol.Gen.
Genetics 218:78−86)及び、従って、所望の発現レベル及びパターン
を示す株を得るために複数の事象をスクリーニングしなければならないことも認識するで
あろう。DNAのサザン分析mRNA発現のノザン分析、タンパク質発現ウエスタン
分析又は表現型分析により、このようなスクリーニングを行い得る。

0099

「モノクローナル抗体」とは、本明細書で使用する場合、様々な抗体の混合物を含有す
る「ポリクローナル」抗体調製物とは異なり、共通の重鎖及び共通の軽鎖アミノ酸配列
共有する抗体を含有する抗体分子の調製物の1つを指すものとする。ファージ、細菌、酵
母又はリボソームディスプレイなどのいくつかの新規技術ならびにハイブリドーマ由来抗
体(例えば、標準的Kohler及びMilsteinハイブリドーマ法((1975)
Nature 256:495−497)などのハイブリドーマ技術により調製されたハ
イブリドーマによって分泌される抗体)に代表される古典的方法により、モノクローナル
抗体を生成させ得る。このように、非古典的方法により生じたものであり得るが、本発明
の非ハイブリドーマ由来アゴニスト性抗体もモノクローナル抗体と呼ばれる。

0100

本明細書で使用する場合、「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有するその他の抗体
を実質的に含まない抗体を指すものとする(例えば、球状凝集体に特異的に結合する単離
抗体は、球状凝集体以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない。)。しかし
、球状凝集体に特異的に結合する単離抗体は、他の抗原に対して交差反応性を有し得る。
さらに、単離抗体は、他の細胞物質及び/又は化学物質を実質的に含まないものであり得
る。

0101

本明細書で使用する場合、抗体の「抗原結合部分」(又は単に「抗体部分」)という用
語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の1以上の断片を指す。抗体の抗原結
合機能は、全長抗体の断片によって発揮され得ることが示されている。このような抗体実
施形態はまた、二特異性、二重特異性又は多特異性形態でもあり得、2以上の様々な抗原
に特異的に結合する。抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含される結合断片
の例には、(i)Fab断片、VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる1価の断片
;(ii)F(ab’)2断片、ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結され
た2つのFab断片を含む2価の断片;(iii)VH及びCH1ドメインからなるFd
断片;(iv)抗体の1本のアームのVL及びVHドメインからなるFv断片;(v)d
Ab断片(Wardら(1989)Nature 341:544−546)(これは1
つの可変ドメインを含有する。);及び(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が
含まれる。さらに、Fv断片の2つのドメインVL及びVHは、別個の遺伝子によりコー
ドされるが、これらは、組み換え法を使用して、VL及びVH領域が対になって1価の分
子を形成する単一のタンパク質鎖にすることができる合成リンカーにより連結することが
できる(単一鎖Fv(scFv)として知られている;例えば、Birdら(1988)
Science 242:423−426;及びHustonら(1988)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883参照。)。このような
1本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲内に包含されるものとする。1
本鎖抗体の他の形態、例えばダイアボディーもこの範囲内に包含される。ダイアボディー
は、2価で、二特異性の抗体であり、VH及びVLのドメインが単一のポリペプチド鎖
で発現されるが、使用しているリンカーが短すぎるため、同じ鎖上の2つのドメイン間で
対形成できず、それによりドメインは別の鎖の相補的ドメインと対形成せざるを得ず、2
つの抗原結合性部位が生じる(例えば、Holliger、P.ら(1993)Proc
.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−6448;Poljak、R
.J.ら(1994)Structure 2:1121−1123参照)。このような
抗体結合特性は当技術分野で公知である(Kontermann及びDubel編、An
tibody Engineering(2001)Springer−Verlag.
New York.790pp.(ISBN3−540−41354−5)。

0102

またさらに、抗体又はその抗原結合部分は、1以上のその他のタンパク質又はペプチド
と抗体又は抗体部分の共有又は非共有結合により形成されているより大きな免疫接着分子
の一部であり得る。このような免疫接着分子の例には、四量体scFv分子を作るための
ストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov、S.M.ら(1995)H
uman Antibodies and Hybridomas 6:93−101)
及び二価及びビオチン化scFv分子を作るための、システイン残基マーカーペプチド
及びC末端ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanov、S.M.ら(1994)
Mol.Immunol.31:1047−1058)が含まれる。全抗体の、それぞれ
パパイン又はペプシン消化などの従来技術を用いて、全抗体から、Fab及びF(ab’
)2断片などの抗体の一部を調製することができる。さらに本明細書中に記載のように、
標準的組み換えDNA技術を用いて、抗体、抗体部分及び免疫接着分子を得ることができ
る。

0103

本明細書で使用する場合、「組み換えヒト抗体」という用語は、組み換え手段によって
調製、発現、作製又は単離された全てのヒト抗体、例えば、宿主細胞中にトランスフェク
トされた組み換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組み換え体から単離された抗
体、コンビナトリアルヒト抗体ライブラリ(Hoogenboom H.R.、(199
7)TIB Tech.15:62−70;Azzazy H.及びHighsmith
W.E.、(2002)Clin.Biochem.35:425−445;Gavi
londo J.V.及びLarrick J.W.(2002)BioTechniq
ues 29:128−145;Hoogenboom H.及びChames P.(
2000)Immunology Today 21:371−378)、ヒト免疫グロ
ブリン遺伝子に対するトランスジェニックである動物(例えば、マウス)から単離された
抗体(例えば、Taylor,L.D.ら(1992)Nucl.AcidsRes.
20、6287−6295;Kellermann S−A.及びGreen L.L.
(2002)Current Opinion in Biotechnology 1
3:593−597;Little M.ら(2000)Immunology Tod
ay 21:364−370参照)又はヒト免疫グロブリン遺伝子の他のDNA配列への
スプライシングを含む何らかの他の手段によって調製、発現、作製又は単離された抗体を
含むものとする。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン
列由来の可変及び定常領域を有する。しかし、ある実施形態において、このような組み換
えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発(又は、ヒトIg配列に対してトランスジェニック
である動物を使用する場合は、インビボ体細胞変異)が起こりやすく、従って組み換え抗
体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のVH及びVL配列由来であ
り、これらと関連している一方で、天然ではインビボのヒト抗体生殖細胞系列レパートリ
ー内に存在し得ない配列である。(Kabatら、Sequences of Prot
eins of Immunological Interest、第5版、U.S.D
epartment of Health and Human Services、N
IH Publication No.91−3242、1991も参照)。しかし、本
発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸
残基を含み得る(例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的突然変異誘発又はイ
ビボでの体細胞突然変異により導入された突然変異)。(Harlow及びLane、
Antibodies:A Laboratory Manual、New York:
Cold Spring Harbor Press、1990も参照)。

0104

キメラ抗体」という用語は、ある種からの重鎖及び軽鎖可変領域配列及び別の種から
の定常領域配列を含む抗体、例えば、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖及び軽鎖可変
領域を有する抗体など、を指す。

0105

「CDRグラフト抗体」という用語は、ある種からの重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む
が、この中でVH及び/又はVLのCDR領域の1以上の配列が、別の種のCDR配列
置換された抗体、例えば、マウスCDRの1以上(例えば、CDR3)がヒトCDR配列
で置換されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体など、を指す。

0106

本発明の組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変領域を
有し、定常領域も含み得る(Kabatら(1991)前出参照)。しかし、ある実施形
態において、このような組み換えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発(又は、ヒトIg配
列に対してトランスジェニックである動物を使用する場合、インビボ体細胞突然変異誘発
)が起こりやすく、従って、組み換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生
細胞系列VH及びVL領域由来であり、これらと関連する一方、ヒト抗体生殖細胞系列
レパートリー内にインビボでは天然に存在し得ない。しかし、ある実施形態において、こ
のような組み換え抗体は、選択的突然変異誘発又は復帰突然変異又は両方の結果である。

0107

「復帰突然変異」という用語は、ヒト抗体の体細胞突然変異アミノ酸のいくつか又は全
部を、相同生殖細胞系列抗体配列からの対応する生殖細胞系列残基で置換するプロセスを
指す。最大のホモロジーを有する配列を同定するために、本発明のヒト抗体の重鎖及び軽
鎖の配列を、個別に、VBASEデータバンク中の生殖細胞系列配列とアラインする。V
BASEは、GenBank及びEMBLデータライブラリ最新情報を含む、公開され
ている配列から作成される全てのヒト生殖細胞系列可変領域配列の包括ディレクトリ
ある。このデータベースは、配列決定されたヒト抗体遺伝子の寄託先としてMRC Ce
nter for Protein Engineering(Cambridge、U
K)で開発された(ウェブサイト、http://www.mrc−cpe.cam.a
c.uk/vbase−intro.php?menu=901)。本発明のヒト抗体に
おける差異は、このような異なるアミノ酸をコードする定められたヌクレオチド位置にお
いて突然変異誘発することにより生殖細胞系列配列に戻される。従って、最終的ヒト抗体
において含まれるべきでないヒト抗体の何らかの所望の特性に影響を与えるために、抗原
結合及び突然変異後に見いだされる何らかのアミノ酸における直接的又は間接役割につ
いて、復帰突然変異に対する候補として同定された各アミノ酸の役割を調べるべきである
。復帰突然変異を行うアミノ酸の数をできるだけ少なくするために、最も近い生殖細胞系
列配列とは異なるが第二の生殖細胞系列配列の対応するアミノ酸配列と同一であるアミノ
酸位置は不変のままであり得る(ただし、第二の生殖系列配列は、本発明のヒト抗体配列
と、当該アミノ酸の両側において少なくとも10個、好ましくは12個のアミノ酸が同一
であり同一線上であることが前提である。)。復帰突然変異は、抗体最適化の何れかの段
階で行い得る。

0108

「標識結合タンパク質」は、本発明の抗体又は抗体部分が誘導化されるか又は別の機能
的分子(例えば別のペプチド又はタンパク質)に連結される、タンパク質である。例えば
、本発明の標識結合タンパク質は、本発明の抗体又は抗体部分を別の抗体などの1以上の
その他の分子(例えば二特異的抗体又はダイアボディー)、検出可能な試薬細胞毒性剤
医薬物質及び/又は、別の分子(例えばストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジ
ンタグ)と抗体又は抗体部分の会合を媒介するタンパク質もしくはペプチドに機能的に連
結することにより(化学カップリング遺伝子融合、非共有結合などにより)得られ得る

0109

本発明の目的に対して、「グリコシル化結合タンパク質」は、抗体又はその抗原結合部
分が1以上の炭水化物残基を含有するタンパク質を含む。発生期のインビボタンパク質産
生は、翻訳後修飾として知られるさらなるプロセシングを受け得る。特に、糖(グリコ
ル)残基が酵素により付加され得る(グリコシル化として知られるプロセス)。得られた
タンパク質は、共有結合されたオリゴ糖側鎖を有し、グリコシル化タンパク質又は糖タン
パク質として知られている。抗体は、Fcドメインならびに可変ドメインにおいて1以上
の炭水化物残基を伴う糖タンパク質である。Fcドメインの炭水化物残基は、Fcドメ
ンのエフェクター機能において重要な影響を有し、抗体結合又は抗体の半減期に対しては
あまり影響がない(R.Jefferis、Biotechnol.Prog.21(2
005)、pp.11−16)。一方、可変ドメインのグリコシル化は、抗体の抗原結合
活性に対して影響を有し得る。可変ドメインにおけるグリコシル化は、抗体結合親和性に
ネガティブな影響を有し得る(これは立体障害によると思われる。)(Co、M.S.ら
、Mol.Immunol.(1993)30:1361−1367)か又はこの結果、
抗原に対する親和性が向上し得る(Wallick、S.C.ら、Exp.Med.(1
988)168:1099−1109;Wright、A.ら、EMBO J.(199
1)10:2717 2723)。さらに、結合タンパク質のO−又はN−結合グリコシ
ル化部位が突然変異誘発されている、グリコシル化部位特異的突然変異誘発を行うことが
できる。当業者は、標準的な周知の技術を用いて、このような突然変異体を作製すること
ができる。生物学的活性を保持するが結合活性が増減しているグリコシル化部位特異的突
変異誘発ももくろまれる。

0110

さらに、本発明の抗体又は抗原結合部分のグリコシル化を修飾することができる。例え
ば、アグリコシル化(aglycoslated)抗体を作製し得る(即ち、この抗体は
グリコシル化されていない。)。例えば、抗原に対する抗体の親和性を向上させるために
、グリコシル化を変化させることができる。例えば、抗体配列内で1以上のグリコシル化
部位を変化させることにより、このような炭水化物修飾を行うことができる。例えば、結
果として1以上の可変領域グリコシル化部位が除去され、それによりその部位のグリコシ
ル化がなくなる、1以上のアミノ酸置換を行うことができる。このようなグリコシル化に
より、抗原に対する抗体の親和性が向上し得る。このようなアプローチについては、国際
出願公開WO03/016466A2及び米国特許第5,714,350号及び同第6,
350,861号(それぞれ、その全体を参照により本明細書中に組み込む。)において
詳細に記載されている。

0111

さらに又はあるいは、フコシル残基の量が低下した低フコシル化抗体又は分岐GlcN
Ac構造が増加している抗体など、グリコシル化の改変型を有する修飾抗体を作製するこ
とができる。このような改変グリコシル化パターンにより、抗体のADCC能が向上する
ことが示されている。例えば、グリコシル化機構が変化した宿主細胞において抗体を発現
させることにより、このような炭水化物修飾を行うことができる。グリコシル化機構が変
化した細胞は当技術分野で記載されており、本発明の組み換え抗体を発現させ、それによ
りグリコシル化が変化した抗体を産生させるために宿主細胞として使用することができる
(例えば、Shields、R.L.ら(2002)J.Biol.Chem.277:
26733−26740;Umanaら(1999)Nat.Biotech.17:1
76−1、ならびに、欧州特許EP1,176,195;国際出願公開WO03/035
835及びWO99/5434280参照(それぞれ、その全体を参照により本明細書中
に組み込む。))。

0112

タンパク質グリコシル化は、関心のあるタンパク質のアミノ酸配列ならびにタンパク質
が発現される宿主細胞に依存する。異なる生物は、異なるグリコシル化酵素(例えば、グ
リコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼ)を産生し得、利用可能な基質(ヌクレ
オチド糖)が異なり得る。このような要素のために、特定のタンパク質を発現させる宿主
の系に依存して、タンパク質グリコシル化パターン及びグリコシル残基の構成が異なり得
る。本発明で有用なグリコシル残基には、以下に限定されないが、グルコースガラクト
ース、マンノースフコース、n−アセチルグルコサミン及びシアル酸が含まれ得る。好
ましくはグリコシル化結合タンパク質は、グリコシル化パターンがヒトであるようなグリ
コシル残基を含む。

0113

異なるタンパク質グリコシル化の結果、タンパク質の特徴が異なり得ることは、当業者
にとって公知である。例えば、酵母などの微生物宿主において産生され、酵母内在性の経
路を利用してグリコシル化される治療用タンパク質効力は、CHO細胞株などの哺乳動
物細胞で発現される同じタンパク質の効力と比較して低くなり得る。このような糖タンパ
ク質はまたヒトにおいて免疫原性であり得、投与後のインビボ半減期が低下し得る。ヒト
及びその他の動物の特異的受容体は、特異的なグリコシル残基を認識し、血流からのその
タンパク質の急速な排出を促進し得る。その他の悪影響には、タンパク質折りたたみ、溶
解性、プロテアーゼに対する影響の受けやすさ、トラフィッキング輸送コンパート
ント化、分泌、その他のタンパク質又は因子による認識、抗原性又はアレルギー原性の変
化が含まれる。従って、熟練者は、グリコシル化の特異的組成及びパターン、例えば、ヒ
ト細胞又は意図する対象動物種特異的細胞で産生されるグリコシル化組成及びパターン
と同一であるか、少なくとも似ているグリコシル化組成及びパターンを有する治療タンパ
ク質を好み得る。

0114

異種グリコシル化酵素を発現するように宿主細胞を遺伝子改変することにより、宿主細
胞のものとは異なるグリコシル化タンパク質の発現を行い得る。当技術分野で公知である
技術を用いて、熟練者は、ヒトタンパク質グリコシル化を示す、抗体又はその抗原結合部
分を作製し得る。例えば、これらの酵母株で産生されるグリコシル化タンパク質(糖タン
パク質)が動物細胞、特にヒト細胞と同一であるタンパク質グリコシル化を示すよう、非
天然のグリコシル化酵素を発現するように、酵母株が遺伝子改変される(米国特許出願公
開第20040018590号及び同第20020137134号及び国際出願公開WO
05/100584A2)。

0115

さらに、当業者にとって当然のことながら、ライブラリのメンバー宿主細胞が様々なグ
リコシル化パターンの関心のあるタンパク質を産生するよう、様々なグリコシル化酵素を
発現するように遺伝子操作された宿主細胞のライブラリを用いて、関心のあるタンパク質
を発現させ得る。次いで、熟練者は、特定の新規グリコシル化パターンを有する関心のあ
るタンパク質を選択し単離し得る。好ましくは、特に選択された新規グリコシル化パター
ンを有するタンパク質は、生物学的特性が改善又は変化している。

0116

本発明はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物に免
疫付与することにより、非ヒト、非マウス動物から、本発明のモノクローナル抗体を作製
するための方法を提供する。当技術分野で公知である方法を用いて、このような動物を作
製し得る。好ましい実施形態において、非ヒト動物は、ラット、ヒツジブタヤギ、ウ
シ又はウマであり得る。免疫付与動物から抗体産生不死化ハイブリドーマを調製し得る。
免疫付与後、動物を屠殺し、当技術分野で周知であるように、脾臓B細胞を不死化骨髄腫
細胞と融合させる。例えば、Harlow及びLane、前出を参照のこと。好ましい実
施形態において、骨髄腫細胞免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない(非分泌性細胞
株)。融合及び抗生物質選択後、抗原(例えば球状凝集体)もしくはその一部又は関心の
ある抗原を発現する細胞を用いて、ハイブリドーマをスクリーニングする。好ましい実施
形態において、酵素結合免疫アッセイ(ELISA)又は放射性免疫アッセイ(RIA
、好ましくはELISAを用いて最初のスクリーニングを行う。ELISAスクリーニン
グの例は、国際出願公開WO00/37504(参照により本明細書中に組み込む。)で
与えられる。

0117

抗体産生ハイブリドーマを選択し、クローニングし、下記で考察するように、強力なハ
イブリドーマ増殖、高抗体産生及び所望の抗体特性を含む所望の特性についてさらにスク
リーニングする。ハイブリドーマを培養し、同系動物、免疫系を欠く動物(例えばヌード
マウス)においてインビボで、又はインビトロで細胞培養により、増殖させ得る。ハイブ
リドーマを選択し、クローニングし、増殖させる方法は当業者にとって周知である。好ま
しくは、免疫付与される動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する非ヒト動物であり
、脾臓B細胞をその非ヒト動物と同じ種由来の骨髄腫と融合させる。

0118

ある態様において、本発明は、アルツハイマー病の、治療、診断及び予防において使用
されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。好ましい実施形態にお
いて、このハイブリドーマはマウスハイブリドーマである。別の好ましい実施形態におい
て、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ又はウマなどの、非ヒト、非マウス種においてハ
イブリドーマを作製する。別の実施形態において、本ハイブリドーマはヒトハイブリド
マであり、球状凝集体に対する抗体を発現するヒト細胞とヒト非分泌性骨髄腫を融合させ
る。

0119

米国特許第5,627,052号、国際出願公開WO92/02551及びBabco
ck、J.S.ら(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:
7843−7848に記載のような、当技術分野で選択リンパ球抗体法(SLAM)と呼
ばれる手順を用いて、単一の単離リンパ球から、組み換え抗体を生成させ得る。この方法
において、抗原特異的溶血プラークアッセイを用いて、関心のある抗体を分泌する1個の
細胞(例えば、免疫付与動物由来のリンパ球)をスクリーニンするが、ここで、抗原(例
えば球状凝集体)又はその断片は、ビオチンなどのリンカーを用いてヒツジ赤血球細胞に
カップリングされており、抗原に対する特異性を有する抗体を分泌する1個の細胞を同定
するために使用される。関心のある抗体分泌細胞の同定後、逆転写酵素−PCRにより重
及び軽鎖可変領域cDNAを細胞からレスキューし、次いで、COS又はCHO細胞など
哺乳動物宿主細胞において、適切な免疫グロブリン定常領域(例えばヒト定常領域)に
関連して、これらの可変領域を発現させることができる。次に、例えばIL−18に対す
る抗体を発現する細胞を単離するためにトランスフェクト細胞を掬いだすことにより、イ
ンビボ選択リンパ球由来の増幅免疫グロブリン配列でトランスフェクトした宿主細胞をイ
ビトロでさらに分析及び選択することができる。国際出願公開WO97/29131及
び国際出願公開WO00/56772に記載のものなどのインビトロ親和性成熟法などに
よって、増幅免疫グロブリン配列をインビトロでさらに操作することができる。

0120

「キメラ抗体」という用語は、ある種からの重及び軽鎖の可変領域配列及び別の種から
の定常領域配列を含む抗体、例えばヒトの定常領域に連結されたマウス重及び軽鎖可変領
域を有する抗体を指す。

0121

「CDRグラフト抗体」という用語は、ある種からの重及び軽鎖の可変領域を含むが、
VH及び/又はVLのCDR領域の1以上の配列が、別の種のCDR配列で置換された抗
体、例えば、マウスCDRの1以上(例えば、CDR3)がヒトCDR配列で置換されて
いるマウス重及び軽鎖可変領域を有する抗体を指す。

0122

ヒト化抗体」という用語は、ヒト以外の種(例えばマウス)からの重及び軽鎖可変領
域配列を含むが、VH及び/又はVL配列の少なくとも一部分が、より「ヒトに近い」、
即ちよりヒト生殖細胞系列の可変配列に似ているように改変されている抗体を指す。ヒト
化抗体のあるタイプは、ヒトCDR配列が非ヒトVH及びVLの配列中に導入されて対応
する非ヒトCDR配列に置換されている、CDRグラフト抗体である。特に、「ヒト化抗
体」という用語は、関心のある抗原に免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸
配列を有するフレームワーク(PR)領域及び実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有す
る相補性決定領域(CDR)を含む、抗体又はその変異体、誘導体、類似体もしくは断片
である。本明細書で使用する場合、「実質的に」という用語は、CDRに関して、非ヒト
抗体CDRのアミノ酸配列と、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、少なく
とも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一のアミノ酸
配列を有するCDRを指す。ヒト化抗体は、少なくとも1つ、通常は2つの可変ドメイン
(Fab、Fab’、F(ab’)2、FabC、Fv)の実質的に全てを含み、ここで
CDR領域の全て又は実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリン(即ちドナー抗体)のもの
に相当し、フレームワーク領域の全て又は実質的に全ては、ヒト免疫グロブリンコンセン
サス配列のものである。好ましくは、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン(通常はヒト免
グロブリン)定常領域(Fc)の少なくとも一部も含む。ある実施形態において、ヒト
化抗体は、軽鎖ならびに、少なくとも重鎖の可変ドメインの両方を含有する。本抗体はま
た、重鎖の、CH1、ヒンジ、CH2、CH3及びCH4領域も含み得る。ある実施形態
において、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみを含有する。その他の実施形態において、ヒト化
抗体はヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト
化可変ドメイン及び/又はヒト化重鎖のみを含有する。

0123

このヒト化抗体は、IgMIgGIgDIgA及びIgE及び何らかのアイソタ
イプ(以下に限定されないが、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を含む。)を
含む、免疫グロブリンの何らかのクラスから選択することができる。ヒト化抗体は、複数
のクラス又はアイソタイプからの配列を含み得、当技術分野で周知である技術を用いて、
所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択し得る。

0124

ヒト化抗体の、フレームワーク及びCDR領域は、親配列に正確に対応する必要はなく
、例えば、その部位でCDR又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレ
ームワークの何れかに相当しないように、少なくとも1つのアミノ酸残基の、置換、挿入
及び/又は欠失により、ドナー抗体CDR又はコンセンサスフレームワークに対して突然
変異誘発を行い得る。しかし、好ましい実施形態において、このような突然変異誘発は大
規模ではない。通常、ヒト化抗体残基の、少なくとも80%、好ましくは少なくとも85
%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%が親FR及びC
DR配列のものに相当する。本明細書で使用する場合、「コンセンサスフレームワーク」
という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列のフレームワーク領域を指す。さらに、
本明細書で使用する場合、「コンセンサス免疫グロブリン配列」という用語は、関連免疫
グロブリン配列のファミリーにおいて最も高頻度に起こるアミノ酸(又はヌクレオチド)
から形成される配列を指す(例えば、Winnaker、From Gene to C
lones(Verlagsgesellschaft、Weinheim、Germa
ny 1987参照)。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列の各位
置には、そのファミリーのその位置で最も高頻度に起こるアミノ酸がある。2種類のアミ
ノ酸が同等の頻度で起こる場合、何れかをコンセンサス配列に含めることができる。

0125

「活性」という用語は、抗原に対する抗体の結合特異性/親和性などの活性を含む。

0126

「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン又はT細胞受容体と特異的に結合する能
力があるあらゆるポリペプチド決定基を含む。ある実施形態においては、エピトープ決定
基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面配
置を含み、ある実施形態においては、特定の3次元構造的特徴及び/又は特定の電荷的特
徴を有し得る。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。ある実施形態において
、抗体は、タンパク質及び/又は巨大分子の複雑な混合物中でその標的抗原を選択的に認
識した際に抗原に特異的に結合すると言われる。

0127

本明細書で使用する場合、「表面プラズモン共鳴」という用語は、(例えば、BIAc
oreシステム(Pharmacia Biosensor AB、Uppsala、S
weden及びPiscataway、NJ)を使用した、バイオセンサーマトリクス
タンパク質濃度の変化の検出による)リアルタイム生体特異性相互作用の分析を可能
にする光学現象を指す。さらなる説明については、Jonsson、U.ら(1993)
Ann.Biol Clin.51:19−26;Jonsson、U.ら(1991)
Biotechniques 11:620−627;Johnsson,B.ら(19
95)J.Mol.Recognit.8:125−131;及びJohnnson、B
.ら(1991)Anal.Biochem.198、268−277を参照のこと。

0128

本明細書で使用する場合、「Kon」という用語は、当技術分野で公知のように、抗体
/抗原複合体を形成するための抗体の抗原への会合に対する「会合速度定数を指すもの
とする。

0129

本明細書で使用する場合、「Koff」という用語は、当技術分野で公知のように、抗
体/抗原複合体からの抗体の解離に対する「解離速度」定数を指すものとする。

0130

本明細書で使用する場合、「Kd」という用語は、当技術分野で公知のように、特定の
抗体−抗原相互作用の「解離定数」を指すものとする。

0131

「標識結合タンパク質」という用語は、本明細書で使用する場合、結合タンパク質の同
定を可能にする標識が組み込まれたタンパク質を指す。好ましくは、この標識は、例えば
、放射性標識アミノ酸の組み込み又はマークされたアビジンにより検出することができる
ビオチニル部分のポリペプチドへの結合など、検出可能マーカーである(例えば、光学
方法又は比色法により検出することができる、蛍光マーカー又は酵素活性を含有するスト
レプトアビジン)。ポリペプチドに対する標識の例には、以下に限定されないが、次のも
のが含まれる:放射性同位元素又は放射性核種(例えば、3H、14C、35S、90Y
、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho又は153Sm
);蛍光標識(例えば、FITCローダミン又はランタニド蛍光体)、酵素標識(例え
ば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ又はアルカリホスファターゼ
);化学発光マーカー;ビオチニル基;第二のレポーターにより認識される予め定められ
たポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部
位、金属結合ドメイン又はエピトープタグ);及びガドリニウムキレートなどの磁性物質

0132

「抗体共役物」という用語は、治療剤又は細胞毒性薬剤などの第二の化学部分に化学的
に連結された抗体などの、結合タンパク質を指す。「薬剤」という用語は、本明細書中で
化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的巨大分子又は生体物質から調製された
抽出物を指すために使用される。好ましくは、治療用薬剤又は細胞毒性薬剤には、以下に
限定されないが、百日咳毒素タキソールサイトカラシンBグラミシジンD、臭化エ
チジウム、エメチンマイトマイシンエトポシド、テノポシド、ビンクリスチンビン
ブラスチン、コルヒチンドキソルビシンダウノルビシンジヒドロキシアントラシン
ジオンミトキサントロンミトラマイシンアクチノマイシンD、1−デヒドロテスト
ステロングルココルチコイドプロカインテトラカインリドカインプロプラノ
ール及びプロマイシン、ならびにこれらの薬剤の類似物及びホモローグが含まれる。

0133

結晶」及び「結晶化」という用語は、本明細書で使用する場合、結晶の形態で存在す
る、抗体又はその抗原結合部分を指す。結晶は、物質の固体状態の一形態である。

0134

「免疫付与する」という用語は、本明細書中で、その免疫レパートリーが天然の遺伝子
改変されていない生物であれ、又は人工的なヒト免疫レパートリー提示するように改変
されたトランスジェニック生物であれ、免疫レパートリーに抗原を提示するプロセスを指
す。同様に、「免疫原製剤」は、アジュバント又は抗原の免疫原性を促進するその他の添
加物を含有する、抗原の処方物である。これの例は、GLP−1受容体の精製形態のフロ
イン完全アジュバントとのマウスへの同時注射である。本明細書中で定義する場合、「
超免疫付与」は、強い免疫反応を発現させる意図での、宿主動物への、免疫原製剤におけ
る、連続的かつ複数回の抗原の提示の行為である。

0135

抗体の結合速度を測定するある方法は表面プラズモン共鳴による。「表面プラズモン
鳴」という用語は、本明細書で使用する場合、例えば、Biacoreシステム(Bia
core International、Upsala Sweden及びPiscat
away、NJ)を使用した、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化の検
出によるリアルタイムの生体特異的相互作用の分析を可能にする光学現象を指す。さらな
る説明については、Jonssonら(1993)Annales de Biolog
ie Clinique(Paris)51:19−26;Jonssonら(1991
)Biotechniques 11:620−627;Johnssonら(1995
)Journal of Molecular Recognition 8:125−
131及びJohnnsonら(1991)Analytical Biochemis
try 198:268−277を参照のこと。

0136

「医薬的に許容可能な担体」には、生理学的に適合性である、あらゆる溶媒分散媒体
コーティング剤抗菌及び抗真菌剤等張剤及び吸収遅延剤などが含まれる。医薬的に
許容可能な担体の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、デキストロース、グリセ
ロールエタノールなど、ならびにこれらの組合せの1以上が含まれる。多くの場合、等
張剤、例えば、糖、マンニトールなどのポリアルコールソルビトール、又は塩化ナトリ
ウムを組成物中に含むことが好ましい。医薬的に許容可能な担体には、抗体又は抗体部分
貯蔵期間又は有効性を高める、湿潤剤又は乳化剤保存料又は緩衝剤などの、湿潤化物
質又は少量の補助物質などもさらに含まれ得る。

0137

本発明の医薬組成物は、本発明の抗体又は抗体部分の「治療的有効量」又は「予防的有
効量」を含み得る。「治療的有効量」とは、必要な投与量及び期間で、所望の治療結果を
達成するのに有効な量を指す。抗体又は抗体部分の治療的有効量は、当業者により決定さ
れ得、個体の、疾病のステ—ジ、年齢性別及び体重、個体において所望の反応を誘発す
るための抗体又は抗体部分の活性などの因子に従い変化し得る。治療的有効量はまた、治
療上の有益な効果が抗体又は抗体部分の何らかの毒性又は有害な影響を上回るものでもあ
る。「予防的有効量」とは、必要な投与量及び期間で、所望の予防結果を達成するのに有
効な量を指す。通常、疾患の前又初期段階では、対象において予防的用量を使用するの
で、予防的有効量は治療的有効量より少量となろう。

0138

本発明の抗体及び抗体部分を例えば非経口投与に適切な医薬組成物に組み込むことがで
きる。好ましくは、本抗体又は抗体部分を0.1−250mg/mL抗体を含有する注射
用溶液として調製する。注射用溶液は、フリントガラス又はアンバーバイアルアンプル
又はプレフィルドシリンジ中で、液体又は凍結乾燥製剤の何れかにより構成され得る。緩
衝液は、pH5.0から7.0(最適にはpH6.0)のL−ヒスチジン(1−50mM
、最適には5−10mM)であり得る。その他の適切な緩衝液には、以下に限定されない
が、コハク酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウム
含まれる。0−300mMの濃度(液状製剤の場合、最適には150mM)で溶液の毒性
を変化させるために、塩化ナトリウムを使用することができる。凍結乾燥製剤の場合、凍
結保護剤、基本的には0−10%スクロース(最適には0.5−1.0%)を含有するこ
とができる。その他の適切な凍結保護剤には、トレハロース及びラクトースが含まれる。
凍結乾燥製剤の場合、充填剤、基本的には1−10%マンニトール(最適には2−4%)
を含有することができる。安定化剤、基本的には1−50mM L−メチオニン(最適に
は5−10mM)を液状及び凍結乾燥製剤の両方で使用することができる。その他の適切
な充填剤には、グリシン及びアルギニンが含まれ、0−0.05%ポリソルベート−80
(最適には0.005−0.01%)として含まれ得る。さらなる界面活性剤には、以下
に限定されないが、ポリソルベート20及びBRIJ界面活性剤が含まれる。

0139

本発明の組成物は様々な形態であり得る。これらには、例えば、液体、半固体及び固体
製剤、例えば溶液(例えば、注射用及び点滴用溶液)、分散液又は懸濁液、錠剤丸剤
粉末リポソーム及び座薬などが含まれる。好ましい剤形は、意図する投与方法及び治療
用途に依存する。通常の好ましい組成物は、注射用又は点滴用溶液、例えば他の抗体によ
るヒトの受動免疫法のために使用されるものと類似の組成物などである。好ましい投与方
法は、非経口(例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内)である。好ましい実施形態にお
いて、本抗体は静脈内点滴又は注射によって投与される。別の好ましい実施形態において
、本抗体は、筋肉内又は皮下注射によって投与される。

0140

治療用組成物は、通常、製造及び貯蔵の条件下で無菌かつ安定でなければならない。本
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム又はその他の高い薬剤濃度
に適した秩序構造として処方することができる。滅菌注射用溶液は、活性化合物(即ち抗
体又は抗体部分)を、必要な量で、適切な溶媒中に、必要に応じて上記で列挙した成分の
1つ又は組合せと共に配合し、続いてろ過滅菌することにより調製することができる。一
般に、分散液は、基本的な分散媒及び上記で列挙したものからの必要なその他の成分を含
有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を配合することにより調製される。滅菌注射用溶液を
調製するための滅菌凍結乾燥粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分に何らかのさら
なる所望の成分を加えた粉末を、予めろ過滅菌したこれらの溶液から得る、真空乾燥及び
噴霧乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用す
ることにより、分散液の場合は必要な粒子サイズを維持することにより、及び、界面活性
剤を使用することにより、維持することができる。組成物中に吸収を遅らせる物質、例え
ば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含むことにより、注射用組成物持続的に吸収さ
せるようにすることができる。

0141

本発明の抗体及び抗体部分は、当技術分野で公知の様々な方法により投与することがで
きるが、多くの治療用途に対して、好ましい投与の経路/方法は、皮下注射、静脈内注射
又は点滴である。当業者にとって当然のことながら、投与の経路及び/又は方法は、所望
の結果に依存して変化する。ある実施形態において、インプラント経皮パッチ及びマイ
クロカプセル型送達系を含む制御放出製剤など、化合物を急速な放出から保護する担体を
用いて活性化合物を調製し得る。エチレン酢酸ビニルポリ無水物ポリグリコール酸
コラーゲンポリオルトエステルポリ乳酸などの生分解性生体適合性ポリマーを使用
することができる。このような処方物の調製のための多くの方法が特許取得されているか
、又は当業者に一般に知られている。例えば、Sustained and Contr
olled Release Drug Delivery Systems、J.R.
Robinson編、Marcel Dekker、Inc.、New York、19
78参照。

0142

ある実施形態において、例えば不活性希釈剤又は同化可能な可食担体と共に、本発明の
抗体又は抗体部分を経口投与し得る。硬殻又は軟殻のゼラチンカプセル圧縮錠剤にこの
化合物(及び必要に応じてその他の成分)を封入するか、又は対象の食餌に直接混合し得
る。治療剤の経口投与の場合、賦形剤とともにこの化合物を配合し、経口摂取錠剤、口腔
錠、トローチカプセルエリキシル、懸濁液、シロップウエハースなどの形態で使用
し得る。本発明の化合物を非経口投与以外によって投与するために、この化合物をその不
活性化を防止する物質で被覆するか、又はこれらと一緒に投与することが必要であり得る

0143

補助的な活性物質を組成物中に配合することもできる。ある実施形態において、アルツ
ハイマー病又は関連疾患もしくは状態を治療するのに有用な1以上のさらなる治療剤と一
緒に、本発明の抗体又は抗体部分を処方、及び/又は一緒に投与する。例えば、本発明の
抗体の1つ又はその抗体部分を、その他の標的に結合する1以上のさらなる抗体とともに
同時処方及び/又は同時投与し得る。

0144

ある実施形態において、本発明のモノクローナル抗体又はその断片を当技術分野で公知
の半減期延長ビヒクルに連結し得る。このようなビヒクルには、以下に限定されないが、
Fcドメイン、ポリエチレングリコール及びデキストランが含まれる。このようなビヒク
ルは、例えば、米国出願09/428,082及び公開PCR出願WO99/25044
(これらをあらゆる目的のために参照により本明細書中に組み込む。)に記載されている

0145

上述の手順に加えて、熟練者は、巨大分子(例えばDNA分子、プラスミドなど)の構
築、操作及び単離、組み換え生物の作製及びクローンのスクリーニング及び単離に対する
具体的な条件及び手順を述べる標準的リソース精通している(例えば、Sambroo
kら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual
、Cold Spring Harbor Press(1989);Maligaら、
Methodsin Plant Molecular Biology、Cold
Spring Harbor Press(1995);Birrenら、Genome
Analysis:Detecting Genes、1、Cold Spring
Harbor、New York(1998);Birrenら、Genome Ana
lysis:Analyzing DNA、2、Cold Spring Harbor
、New York(1998);Plant Molecular Biology:
A Laboratory Manual、Clark編、Springer、New
York(1997)を参照)。

0146

モノクローナル抗体の使用
本発明のモノクローナル抗体(例えば8F5及び8CF)は、多くの興味深い有用性
ある。例えば、上述のように、アルツハイマー病の、予防、治療及び診断において、本モ
ノクローナル抗体を使用し得る。さらに、抗−抗体の開発において、本抗体を使用し得る
。さらに、個々の抗体を産生するハイブリドーマにより、同一のモノクローナル抗体(即
ち試薬)の継続的な源を安定して産生することができ、よって、様々な実験ならびに治療
用途における抗体間の同一性が保証される。

0147

また、本発明の方法により、さらなる物質の調製での使用のための出発物質の適切な量
を調製できるようになり、言い換えれば、これは、アルツハイマー病の治療のためのモノ
クローナル抗体(又はその他の抗体)の産生において利用され得る。上記のように、本抗
体は、アルツハイマー病又は認知機能障害などのアルツハイマー病と同じ症状を特徴とす
るその他の関連する神経学的状態を予防するための受動免疫付与のためにも使用し得る。

0148

本発明のある診断実施形態において、本発明の抗体(例えば8F5)又はその一部で固
相を被覆する(又は、液相に存在する。)。次に、試験又は生体試料(例えば、全血、脳
脊髄液血清など)を固相と接触させる。抗原(例えば球状凝集体)が試料中に存在する
場合、このような抗原が固相上の抗体に結合し、次いで、直接的又は間接的方法の何れか
により検出される。直接法は、複合体そのものの存在、従って抗原の存在を単純に検出す
ることを含む。間接的方法では、共役物を結合抗原に添加する。この共役物は、第二抗体
を含み、これは、シグナル生成化合物又は標識に結合された結合抗原に結合する。第二抗
体が結合抗原に結合すると、シグナル生成化合物が測定可能なシグナルを生成する。この
ようなシグナルは、試験試料中に抗原が存在することを示す。

0149

診断用免疫アッセイで使用される固相の例は、多孔及び非多孔材料ラテックス粒子
磁性粒子微小粒子(例えば米国特許第5,705,330号参照)、ビーズ、膜、マイ
クロタイターウェル及びプラスチックチューブである。固相材料の選択及び共役物中に存
在する抗原又は抗体を標識する方法は、必要に応じて、所望のアッセイ方式の性能特性
基づき決定される。

0150

上述のように、共役物(又は指標試薬)は、シグナル生成化合物又は標識に連結された
抗体(又はおそらく、アッセイによっては抗−抗体)を含む。このシグナル生成化合物又
は「標識」は、そのものが検出可能であるか、又は検出可能な産物を生成するための1以
上のさらなる化合物と反応し得る。シグナル生成化合物の例には、色原体、放射性同位
素(例えば、125I、131I、32P、3H、35S及び14C)、化学発光化合物
(例えばアクリジニウム)、粒子(可視性又は蛍光性)、核酸、錯化剤又は酵素などの触
媒(例えば、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、ホースラディッシュペル
シダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びリボヌクレアーゼ)が含まれる。酵素を使用する
場合(例えば、アルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼ)、色
原、蛍光又は化学発光生成基質を添加することにより、検出可能なシグナルが生じる。時
間分解蛍光、内部反射蛍光、増幅(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応)及びラマン分光法
どのその他の検出系も有用である。

0151

上記免疫アッセイにより試験され得る体液の例には、血漿、全血、乾燥全血、脳脊髄液
又は組織及び細胞の水性もしくは有機−水性抽出物が含まれる。

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