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技術 アポリポタンパク質C3(APOC3)iRNA組成物およびその使用方法

出願人 アルナイラムファーマシューティカルズ,インコーポレイテッド
発明者 ケビン・フィッツジェラルドウィリアム・クアーベスジェイムズ・バトラーステファニー・ウィリアムズアビゲイル・リーボウグレゴリー・ヒンクルマルティン・マイアースチュアート・ミルスタインサティアナラヤーナ・クチマンチムティア・マノハラン
出願日 2020年5月11日 (9ヶ月経過) 出願番号 2020-083294
公開日 2020年9月10日 (5ヶ月経過) 公開番号 2020-141685
状態 未査定
技術分野 化合物または医薬の治療活性 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 突然変異または遺伝子工学 動物,微生物物質含有医薬 微生物、その培養処理 医薬品製剤 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬
主要キーワード 追加的材料 合成プレー 中断部分 構造的構成要素 フォローオン 切断環 複合体前駆体 計量分配装置
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図面 (20)

課題

アポリポタンパク質C3(APOC3)遺伝子を標的化するRNAi剤、例えば二本鎖RNAi剤、およびAPOC3の発現阻害するための、かかるRNAi剤の提供。

解決手段

二本鎖RNAi剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、少なくとも一方の鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、および前記センス鎖が、3’末端に付加されたリガンドと共役している、二本鎖RNAi剤。

概要

背景

アポリポタンパク質C3(APOC3)は超低密度リポタンパク質VLDL)であり、リポタンパク質代謝の重要な調節因子である。ヒトでは、APOC2は、11番染色体長腕上にAPOA1およびAPOA4遺伝子と共に遺伝子クラスターとして位置するAPOC3遺伝子によってコードされる。APOC3は、肝臓、およびそれより程度は少ないが腸において、小さい99アミノ酸タンパク質として発現する。小胞体で20アミノ酸のシグナルペプチドが除去されると、79アミノ酸の成熟ApoC3タンパク質が形成され、これは非グリコシル化型またはグリコシル化アイソフォームとして存在し得る。

APOC3の主な役割は、内皮結合型リポタンパク質リパーゼLPL)の非競合的阻害による脂肪分解の調節因子としての役割である。LPLは、トリアシルグリセロールトリグリセリドリッチリポタンパク質(TRL)中のトリアシルグリセロール類を加水分解して血漿中に脂肪酸遊離させ、大きいトリアシルグリセロールリッチ粒子を小さいトリアシルグリセロール枯渇レムナントリポタンパク質に変える。APOC3欠損者は低いTRLレベルを有し、トリアシルグリセロール類の極めて効率的な脂肪分解を伴う。さらに、APOC3遺伝子を遺伝的に欠失させたマウスもまた、低い血漿トリアシルグリセロールレベルおよび効率的なTRL異化を有することが示された。APOC3はまた、肝臓で合成されるトリアシルグリセロールリパーゼおよびホスホリパーゼA1活性を有する脂肪分解酵素肝性リパーゼ(HL)も阻害する。APOC3のHL阻害効果は、肝臓による脂肪分解およびTRLレムナントの取込みをさらに低減する。APOC3はまた、超低密度リポタンパク質(VLDL)の合成を刺激することも示されている。このAPOC3効果に関連する根本的な機構は、プロテアソーム媒介性のAPOB分解の阻害に関係している可能性があり、APOB合成および分泌の増加、ならびにVLDLトリアシルグリセロールの合成の増加につながり得ると考えられる。したがってAPOC3は、肝臓によるVLDL産生量の調節において重要な役割を果たし得る。

細胞研究は、APOC3が肝臓のリポタンパク質受容体に対するTRLおよびレムナント結合を妨げ得ることを報告している。APOC3は、APOBおよびAPOEを遮蔽するか、またはそれらのコンホメーションを変化させるかのいずれかにより、低密度リポタンパク質受容体(LDLR)に対するAPOB媒介性およびApoE媒介性のリポタンパク質結合を消失させることができる。脂肪分解刺激受容体(LSR)に対するカイロミクロンおよびVLDL粒子の結合もまた、APOC3によって有意に阻害される。

APOC3レベルの増加は、高トリグリセリド血症(hypertriglyceridemia)、すなわち高い(高(hyper−))トリグリセリド血中濃度血症(−emia))の発症を引き起こす。トリグリセリドレベルの上昇は、心血管疾患アテローム性動脈硬化症非アルコール性脂肪性肝疾患非アルコール性脂肪性肝炎多嚢胞性卵巣症候群腎疾患肥満症2型真性糖尿病インスリン抵抗性)、高血圧症および皮膚病変黄色腫)を含めた種々の疾患と関連付けられる。極めて高いトリグリセリドレベルはまた、急性膵炎リスクも増加させる。したがって、APOC3代謝を調節することが、高トリグリセリド血症および関連疾患を管理するための重要な新規治療手法であり得る。

概要

アポリポタンパク質C3(APOC3)遺伝子を標的化するRNAi剤、例えば二本鎖RNAi剤、およびAPOC3の発現を阻害するための、かかるRNAi剤の提供。二本鎖RNAi剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、少なくとも一方の鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、および前記センス鎖が、3’末端に付加されたリガンドと共役している、二本鎖RNAi剤。

目的

本発明は、APOC3遺伝子の発現を阻害または低減するiRNA組成物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

細胞におけるアポリポタンパク質C3(APOC3)の発現阻害するための二本鎖RNAi剤であって、前記二本鎖RNAi剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖は、配列番号1のヌクレオチド配列と3ヌクレオチド以下異なる、少なくとも15連続ヌクレオチドを含み、かつ前記アンチセンス鎖は、配列番号2のヌクレオチド配列と3ヌクレオチド以下異なる、少なくとも15連続ヌクレオチドを含み、少なくとも一方の鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、および前記センス鎖が、3’末端に付加されたリガンドと共役している、二本鎖RNAi剤。

請求項2

前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、および12、13に列挙される配列のいずれか1つと3ヌクレオチド以下異なる、少なくとも15連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項3

前記修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも1つが、3’末端デオキシチミン(dT)ヌクレオチド、2’−O−メチル修飾ヌクレオチド、2’−フルオロ修飾ヌクレオチド、2’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、配座固定ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’−アミノ修飾ヌクレオチド、2’−O−アリル修飾ヌクレオチド、2’−C−アルキル修飾ヌクレオチド、2’−ヒドロキシル(hydroxly)修飾ヌクレオチド、2’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸塩、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、1,5−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、5’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、5’−メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、5’リン酸または5’リン酸模倣体を含むヌクレオチド、ビニルリン酸を含むヌクレオチド、アデノシングリコール核酸(GNA)を含むヌクレオチド、チミジン−グリコール核酸(GNA)S−異性体を含むヌクレオチド、2−ヒドロキシメチルテトラヒドロフラン−5−リン酸を含むヌクレオチド、2’−デオキシチミジン−3’リン酸を含むヌクレオチド、2’−デオキシグアノシン−3’−リン酸を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項1または2に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項4

前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項5

前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項6

前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドである、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項7

前記センス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項8

前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項9

前記センス鎖のヌクレオチドの全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項10

少なくとも一方の鎖が少なくとも1ヌクレオチドの3’オーバーハングを含む、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項11

少なくとも一方の鎖が少なくとも2ヌクレオチドの3’オーバーハングを含む、請求項1に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項12

細胞におけるアポリポタンパク質C3(APOC3)の発現の阻害能を有する二本鎖RNAi剤であって、前記二本鎖RNAi剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、APOC3をコードするmRNAの一部と相補的な領域を含み、各鎖は約14〜約30ヌクレオチド長であり、前記二本鎖RNAi剤は、式(III):センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)[式中:i、j、k、およびlは、各々独立して0または1であり;p、p’、q、およびq’は、各々独立して0〜6であり;各NaおよびNa’は、独立して、修飾または非修飾のいずれかである0〜25ヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;各NbおよびNb’は、独立して、修飾または非修飾のいずれかである0〜10ヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;各np、np’、nq、およびnq’(この各々は存在することもまたは存在しないこともある)は、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し;XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、およびZ’Z’Z’は、各々独立して、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを表し;Nb上の修飾はY上の修飾と異なり、かつNb’上の修飾はY’上の修飾と異なる]によって表され;および前記センス鎖は少なくとも1つのリガンドと共役している、二本鎖RNAi剤。

請求項13

iが0であり;jが0であり;iが1であり;jが1であり;iおよびjが両方ともに0であり;またはiおよびjが両方ともに1である、請求項12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項14

kが0であり;lが0であり;kが1であり;lが1であり;kおよびlが両方ともに0であり;またはkおよびlが両方ともに1である、請求項12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項15

前記YYYモチーフが前記センス鎖の切断部位またはその近傍に存在する、請求項12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項16

前記Y’Y’Y’モチーフが、前記アンチセンス鎖の5’末端から11、12および13位に存在する、請求項12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項17

前記Y’が2’−O−メチルまたは2’−フルオロである、請求項16に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項18

式(III)が式(IIIa):センス:5’np−Na−YYY−Na−nq3’アンチセンス:3’np’−Na’−Y’Y’Y’−Na’−nq’5’(IIIa)によって表される、請求項12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項19

前記二本鎖領域が15〜30ヌクレオチド対長である、請求項1または12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項20

前記二本鎖領域が17〜23ヌクレオチド対長である、請求項19に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項21

前記二本鎖領域が17〜25ヌクレオチド対長である、請求項19に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項22

前記二本鎖領域が23〜27ヌクレオチド対長である、請求項19に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項23

前記二本鎖領域が19〜21ヌクレオチド対長である、請求項19に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項24

前記二本鎖領域が21〜23ヌクレオチド対長である、請求項19に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項25

各鎖が15〜30ヌクレオチドを有する、請求項1または12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項26

各鎖が19〜30ヌクレオチドを有する、請求項1または12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項27

前記ヌクレオチド上の修飾が、表5、9、10、11B、12、および13に列挙するとおりの修飾、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項28

前記ヌクレオチド上の前記修飾が2’−O−メチルおよび2’−フルオロ修飾である、請求項12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項29

前記リガンドが、二価または三価分枝リンカーを介して付加された1つ以上のGalNAc誘導体である、請求項1または12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項30

前記リガンドが、である、請求項1または12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項31

前記リガンドが前記センス鎖の3’末端に付加されている、請求項1または12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項32

以下の概略図[式中、XはOまたはSである]に示されるとおりのリガンドと共役している、請求項31に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項33

少なくとも1つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含む、請求項1または12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項34

前記ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が一方の鎖の3’末端にある、請求項33に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項35

前記鎖が前記アンチセンス鎖である、請求項34に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項36

前記鎖が前記センス鎖である、請求項34に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項37

前記ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が一方の鎖の5’末端にある、請求項33に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項38

前記鎖が前記アンチセンス鎖である、請求項37に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項39

前記鎖が前記センス鎖である、請求項37に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項40

前記ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が一方の鎖の5’末端および3’末端の両方にある、請求項33に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項41

前記鎖が前記アンチセンス鎖である、請求項40に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項42

6〜8つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項33に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項43

前記アンチセンス鎖が5’末端に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および3’末端に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、前記センス鎖が5’末端または3’末端のいずれかに少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項42に記載の二本鎖RNAi。

請求項44

前記二重鎖のアンチセンス鎖の5’末端の1位にある塩基対がAU塩基対である、請求項1または12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項45

前記Yヌクレオチドが2’−フルオロ修飾を含有する、請求項9に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項46

前記Y’ヌクレオチドが2’−O−メチル修飾を含有する、請求項12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項47

前記センス鎖が合計21ヌクレオチドを有し、前記アンチセンス鎖が合計23ヌクレオチドを有する、請求項1または12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項48

表4A、4B、5、8、9、11A、11B、12、および13のいずれか1つに列挙されるRNAi剤の群から選択される、請求項1または12に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項49

細胞におけるアポリポタンパク質C3(APOC3)の発現の阻害能を有する二本鎖RNAi剤であって、前記二本鎖RNAi剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖は5’−GCUAAAAGGGACAGUAUUCU−3’(配列番号13)を含み、かつ前記アンチセンス鎖は5’−AGAAUACUGUCCCUUUUAAGCAA−3’(配列番号14)を含み、前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖は、3’末端に付加されたリガンドと共役し、および前記リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された1つ以上のGalNAc誘導体である、二本鎖RNAi剤。

請求項50

細胞におけるアポリポタンパク質C3(APOC3)の発現の阻害能を有する二本鎖RNAi剤であって、前記二本鎖RNAi剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖は5’−GCUUAAAAGGGACAGUAUUCU−3’(配列番号13)を含み、かつ前記アンチセンス鎖は5’−UGAAUACUGUCCCUUUUAAGCAA−3’(配列番号15)を含み、前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖は、3’末端に付加されたリガンドと共役し、および前記リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された1つ以上のGalNAc誘導体である、二本鎖RNAi剤。

請求項51

細胞におけるアポリポタンパク質C3(APOC3)の発現の阻害能を有する二本鎖RNAi剤であって、前記二本鎖RNAi剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖は5’−GCUUAAAAGGGACAGUAUUCA−3’(配列番号659)を含み、かつ前記アンチセンス鎖は5’−UGAAUACUGUCCCUUUUAAGCAA−3’(配列番号670)を含み、前記センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖は、3’末端に付加されたリガンドと共役し、および前記リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された1つ以上のGalNAc誘導体である、二本鎖RNAi剤。

請求項52

前記センス鎖のヌクレオチドの全ておよび前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾を含む、請求項49〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項53

前記修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも1つが、3’末端デオキシチミン(dT)ヌクレオチド、2’−O−メチル修飾ヌクレオチド、2’−フルオロ修飾ヌクレオチド、2’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、配座固定ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’−アミノ修飾ヌクレオチド、2’−O−アリル修飾ヌクレオチド、2’−C−アルキル修飾ヌクレオチド、2’−ヒドロキシル(hydroxly)修飾ヌクレオチド、2’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸塩、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、1,5−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、5’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、5’−メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、5’リン酸または5’リン酸模倣体を含むヌクレオチド、ビニルリン酸を含むヌクレオチド、アデノシン−グリコール核酸(GNA)を含むヌクレオチド、チミジン−グリコール核酸(GNA)S−異性体を含むヌクレオチド、2−ヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン−5−リン酸を含むヌクレオチド、2’−デオキシチミジン−3’リン酸を含むヌクレオチド、2’−デオキシグアノシン−3’−リン酸を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項49〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項54

2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを10個以下含む、請求項49〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項55

2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを6個以下含む、請求項49〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項56

前記センス鎖が、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを4個以下含む、請求項49〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項57

前記アンチセンス鎖が、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを6個以下含む、請求項49〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項58

前記アンチセンス鎖が、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを2個以下含む、請求項49〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項59

前記アンチセンス鎖の5’ヌクレオチドに5’−リン酸または5’−リン酸模倣体をさらに含む、請求項49〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項60

前記アンチセンス鎖の5’ヌクレオチドに5’−リン酸模倣体をさらに含む、請求項49〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項61

前記5’−リン酸模倣体が5’−ビニルリン酸(5’−VP)である、請求項60に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項62

前記リガンドが、である、請求項49〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項63

以下の概略図[式中、XはOまたはSである]に示されるとおりのリガンドと共役する、請求項62に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項64

表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12、および13のいずれか1つに列挙されるRNAi配列を含む二本鎖RNAi剤。

請求項65

以下の配列:センス:5’GfscsUfuAfaAfaGfGfGfaCfaGfuAfuUfcUfL963’(配列番号16)アンチセンス:5’asGfsaAfuAfcUfgUfcccUfuUfuAfaGfcsAfsa3’(配列番号17)を含むAD−57553である、請求項64に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項66

以下の配列:センス:5’GfscsUfuAfaAfaGfGfGfaCfaGfuAfuUfcUfL963’(配列番号18)アンチセンス:5’VPusGfsaAfuAfcUfgUfcccUfuUfuAfaGfcsasa3’(配列番号19)を含むAD−65696である、請求項64に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項67

以下の配列:センス:5’gscsuuaaAfaGfGfGfacaguauucaL963’(配列番号20)アンチセンス:5’usGfsaauAfcUfGfucccUfuUfuaagcsasa3’(配列番号21)を含むAD−65703である、請求項64に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項68

以下の配列:センス:5’gscsuuaaAfaGfGfGfacaguauucaL963’(配列番号22)アンチセンス:5’usGfsaauacugucccUfuuuaagcsasa3’(配列番号23)を含むAD−65704である、請求項64に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項69

以下の配列:センス:5’cscscaauAfaAfGfCfuggacaagaaL963’(配列番号714)アンチセンス:5’usUfscuuGfuCfCfagcuUfuAfuugggsasg3’(配列番号718)を含むAD−67221である、請求項64に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項70

以下の配列:センス:5’gscsuuaaaaGfgGfacaguauuca3’(配列番号738)アンチセンス:5’sGfsaauacugucCfcUfuuuaagcsasa3’(配列番号749)を含むAD−69535である、請求項64に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項71

以下の配列:センス:5’gscsuuaaaaGfgGfacagu(Agn)uuca3’(配列番号744)アンチセンス:5’usGfsaauacugucCfcUfuuuaagcsasa3’(配列番号755)を含むAD−69541である、請求項64に記載の二本鎖RNAi剤。

請求項72

修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物であり、前記薬剤が、細胞におけるAPOC3の発現の阻害能を有し、かつ表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12、および13のいずれか1つに列挙される配列の群から選択されるセンス配列と相補的な配列を含み、前記ポリヌクレオチドが約14〜約30ヌクレオチド長である、組成物。

請求項73

請求項1、12、および49〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤を含有するベクター

請求項74

請求項1、12、および49〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤を含有する細胞。

請求項75

請求項1、12、および49〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤、または請求項72に記載の修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物、または請求項73に記載のベクターを含む医薬組成物

請求項76

二本鎖RNAi剤が非緩衝液中に存在する、請求項75に記載の医薬組成物。

請求項77

前記非緩衝液が生理食塩水または水である、請求項76に記載の医薬組成物。

請求項78

前記二本鎖RNAi剤が緩衝液中に存在する、請求項76に記載の医薬組成物。

請求項79

前記緩衝液が、酢酸塩クエン酸塩プロラミン炭酸塩、またはリン酸塩またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項78に記載の医薬組成物。

請求項80

前記緩衝液がリン酸緩衝生理食塩水(PBS)である、請求項79に記載の医薬組成物。

請求項81

細胞におけるアポリポタンパク質C3(APOC3)発現を阻害する方法であって、(a)前記細胞を、請求項1、12、および49〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤、または請求項72に記載の修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物、請求項73に記載のベクター、または請求項75〜80のいずれか一項に記載の医薬組成物と接触させるステップ;および(b)ステップ(a)で生じた前記細胞を、APOC3遺伝子のmRNA転写物の分解を達成するのに十分な時間にわたって維持し、それによって前記細胞における前記APOC3遺伝子の発現を阻害するステップを含む方法。

請求項82

前記細胞が対象の体内にある、請求項81に記載の方法。

請求項83

前記対象がヒトまたはウサギである、請求項72に記載の方法。

請求項84

前記対象がAPOC3関連疾患に罹患している、請求項83に記載の方法。

請求項85

前記APOC3発現が、少なくとも約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%または約100%阻害される、請求項81〜84のいずれか一項に記載の方法。

請求項86

アポリポタンパク質C3(APOC3)関連疾患を有する対象を治療する方法であって、請求項1、12、および49〜51のいずれか一項に記載の二本鎖RNAi剤、または請求項72に記載の修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物、または請求項73に記載のベクター、または請求項75〜80のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与し、それによって前記対象を治療するステップを含む、方法。

請求項87

前記APOC3関連疾患が高トリグリセリド血症である、請求項86に記載の方法。

請求項88

前記APOC3関連疾患が、非アルコール性脂肪性肝疾患非アルコール性脂肪性肝炎多嚢胞性卵巣症候群腎疾患肥満症2型真性糖尿病インスリン抵抗性)、高血圧症アテローム性動脈硬化症(artherosclerosis)および膵炎からなる群から選択される、請求項86に記載の方法。

請求項89

前記二本鎖RNAi剤が約0.01mg/kg〜約10mg/kgまたは約0.5mg/kg〜約50mg/kgの用量で投与される、請求項82に記載の方法。

請求項90

前記二本鎖RNAi剤が約10mg/kg〜約30mg/kgの用量で投与される、請求項89に記載の方法。

請求項91

前記二本鎖RNAi剤が約3mg/kgの用量で投与される、請求項89に記載の方法。

請求項92

前記二本鎖RNAi剤が約10mg/kgの用量で投与される、請求項89に記載の方法。

請求項93

前記二本鎖RNAi剤が皮下投与される、請求項82に記載の方法。

請求項94

前記二本鎖RNAi剤が静脈内投与される、請求項82に記載の方法。

請求項95

前記二本鎖RNAi剤が筋肉内投与される、請求項82に記載の方法。

請求項96

前記RNAi剤が2用量以上で投与される、請求項82に記載の方法。

請求項97

前記RNAi剤が、約12時間に1回、約24時間に1回、約48時間に1回、約72時間に1回、および約96時間に1回からなる群から選択される間隔で投与される、請求項95に記載の方法。

請求項98

前記対象に追加的な療法剤を投与するステップをさらに含む、請求項82に記載の方法。

請求項99

前記追加的な療法剤が、HMG−CoAレダクターゼ阻害薬フィブラート胆汁酸捕捉剤ナイアシン抗血小板剤アンジオテンシン変換酵素阻害薬、アンジオテンシンII受容体拮抗薬アシルCoAコレステロールアセチルトランスフェラーゼACAT)阻害薬、コレステロール吸収阻害薬コレステロールエステル転移タンパク質(CETP)阻害薬、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質(MTTP)阻害薬、コレステロールモジュレーター胆汁酸モジュレーター、ペルオキシソーム増殖活性化受容体(PPAR)作動薬、遺伝子ベース療法、複合血管保護剤糖タンパク質Ilb/IIIa阻害薬、アスピリンまたはアスピリン様化合物、IBAT阻害薬、スクアレンシンターゼ阻害薬、単球走化性タンパク質(MCP)−I阻害薬、または魚油からなる群から選択される、請求項98に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2014年11月17日に出願された米国仮特許出願第62/080,941号明細書、および2015年3月20日に出願された米国仮特許出願第62/136,159号明細書の優先権の利益を主張する。前述の出願の各々の内容は全て、本明細書によって参照により本明細書に援用される。

0002

配列表
本出願は、ASCII形式電子的に提出された配列表を含み、この配列表は本明細書によって全体として参照により援用される。2015年11月17日に作成された前記ASCII複製物は、名称121301−02520_SL.txt、およびサイズ212,085バイトである。

背景技術

0003

アポリポタンパク質C3(APOC3)は超低密度リポタンパク質VLDL)であり、リポタンパク質代謝の重要な調節因子である。ヒトでは、APOC2は、11番染色体長腕上にAPOA1およびAPOA4遺伝子と共に遺伝子クラスターとして位置するAPOC3遺伝子によってコードされる。APOC3は、肝臓、およびそれより程度は少ないが腸において、小さい99アミノ酸タンパク質として発現する。小胞体で20アミノ酸のシグナルペプチドが除去されると、79アミノ酸の成熟ApoC3タンパク質が形成され、これは非グリコシル化型またはグリコシル化アイソフォームとして存在し得る。

0004

APOC3の主な役割は、内皮結合型リポタンパク質リパーゼLPL)の非競合的阻害による脂肪分解の調節因子としての役割である。LPLは、トリアシルグリセロールトリグリセリドリッチリポタンパク質(TRL)中のトリアシルグリセロール類を加水分解して血漿中に脂肪酸遊離させ、大きいトリアシルグリセロールリッチ粒子を小さいトリアシルグリセロール枯渇レムナントリポタンパク質に変える。APOC3欠損者は低いTRLレベルを有し、トリアシルグリセロール類の極めて効率的な脂肪分解を伴う。さらに、APOC3遺伝子を遺伝的に欠失させたマウスもまた、低い血漿トリアシルグリセロールレベルおよび効率的なTRL異化を有することが示された。APOC3はまた、肝臓で合成されるトリアシルグリセロールリパーゼおよびホスホリパーゼA1活性を有する脂肪分解酵素肝性リパーゼ(HL)も阻害する。APOC3のHL阻害効果は、肝臓による脂肪分解およびTRLレムナントの取込みをさらに低減する。APOC3はまた、超低密度リポタンパク質(VLDL)の合成を刺激することも示されている。このAPOC3効果に関連する根本的な機構は、プロテアソーム媒介性のAPOB分解の阻害に関係している可能性があり、APOB合成および分泌の増加、ならびにVLDLトリアシルグリセロールの合成の増加につながり得ると考えられる。したがってAPOC3は、肝臓によるVLDL産生量の調節において重要な役割を果たし得る。

0005

細胞研究は、APOC3が肝臓のリポタンパク質受容体に対するTRLおよびレムナント結合を妨げ得ることを報告している。APOC3は、APOBおよびAPOEを遮蔽するか、またはそれらのコンホメーションを変化させるかのいずれかにより、低密度リポタンパク質受容体(LDLR)に対するAPOB媒介性およびApoE媒介性のリポタンパク質結合を消失させることができる。脂肪分解刺激受容体(LSR)に対するカイロミクロンおよびVLDL粒子の結合もまた、APOC3によって有意に阻害される。

0006

APOC3レベルの増加は、高トリグリセリド血症(hypertriglyceridemia)、すなわち高い(高(hyper−))トリグリセリド血中濃度血症(−emia))の発症を引き起こす。トリグリセリドレベルの上昇は、心血管疾患アテローム性動脈硬化症非アルコール性脂肪性肝疾患非アルコール性脂肪性肝炎多嚢胞性卵巣症候群腎疾患肥満症2型真性糖尿病インスリン抵抗性)、高血圧症および皮膚病変黄色腫)を含めた種々の疾患と関連付けられる。極めて高いトリグリセリドレベルはまた、急性膵炎リスクも増加させる。したがって、APOC3代謝を調節することが、高トリグリセリド血症および関連疾患を管理するための重要な新規治療手法であり得る。

発明が解決しようとする課題

0007

したがって、当該技術分野においては、高トリグリセリド血症などのアポリポタンパク質C3関連障害を治療するためのAPOC3発現の調節因子が必要とされている。

課題を解決するための手段

0008

本発明は、APOC3遺伝子の発現を阻害または低減するiRNA組成物を提供する。この遺伝子は、細胞内、例えばヒトなどの対象の体内にある細胞内にあり得る。

0009

本発明はまた、APOC3遺伝子の発現を阻害または低減するiRNA組成物を使用して、APOC3遺伝子の発現の阻害または低減から利益を受け得る障害、例えば高トリグリセリド血症などのアポリポタンパク質C3関連疾患を有する対象を治療するための方法および療法も提供する。

0010

一部の実施形態において、本発明は、細胞におけるアポリポタンパク質C3(APOC3)の発現を阻害するための二本鎖RNAi剤を提供し、この二本鎖RNAi剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、配列番号1のヌクレオチド配列と3ヌクレオチド以下異なる、少なくとも15連続ヌクレオチドを含み、かつアンチセンス鎖は、配列番号2のヌクレオチド配列と3ヌクレオチド以下異なる、少なくとも15連続ヌクレオチドを含み、
少なくとも一方の鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、および前記センス鎖は、3’末端に付加されたリガンドと共役している。

0011

特定の態様において、センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。一態様において、センス鎖およびアンチセンス鎖は、表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12、および13に列挙される配列のいずれか1つと3ヌクレオチド以下異なる、少なくとも15連続ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。

0012

一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドの少なくとも1つは、3’末端デオキシチミン(dT)ヌクレオチド、2’−O−メチル修飾ヌクレオチド、2’−フルオロ修飾ヌクレオチド、2’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、配座固定ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’−アミノ修飾ヌクレオチド、2’−O−アリル修飾ヌクレオチド、2’−C−アルキル修飾ヌクレオチド、2’−ヒドロキシル(hydroxly)修飾ヌクレオチド、2’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸塩、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、1,5−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、5’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、5’−メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、5’リン酸または5’リン酸模倣体を含むヌクレオチド、ビニルリン酸を含むヌクレオチド、アデノシングリコール核酸(GNA)を含むヌクレオチド、チミジン−グリコール核酸(GNA)S−異性体を含むヌクレオチド、2−ヒドロキシメチルテトラヒドロフラン−5−リン酸を含むヌクレオチド、2’−デオキシチミジン−3’リン酸を含むヌクレオチド、2’−デオキシグアノシン−3’−リン酸を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチドからなる群から選択される。

0013

一実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている。別の態様において、アンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている。さらに別の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドである。一実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。別の実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。さらに別の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。

0014

一態様において、少なくとも一方の鎖が少なくとも1ヌクレオチドの3’オーバーハングを含む。別の態様において、少なくとも一方の鎖が少なくとも2ヌクレオチドの3’オーバーハングを含む。

0015

一部の実施形態では、本発明は、細胞におけるアポリポタンパク質C3(APOC3)の発現の阻害能を有する二本鎖RNAi剤を提供し、この二本鎖RNAi剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、APOC3をコードするmRNAの一部と相補的な領域を含み、各鎖は約14〜約30ヌクレオチド長であり、二本鎖RNAi剤は、式(III):
センス:5’np−Na−(XXX)i−Nb−YYY−Nb−(ZZZ)j−Na−nq3’
アンチセンス:3’np’−Na’−(X’X’X’)k−Nb’−Y’Y’Y’−Nb’−(Z’Z’Z’)l−Na’−nq’5’(III)
[式中:
i、j、k、およびlは、各々独立して0または1であり;
p、p’、q、およびq’は、各々独立して0〜6であり;
各NaおよびNa’は、独立して、修飾もしくは非修飾のいずれかまたはこれらの組み合わせである0〜25ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は少なくとも2つの異なる修飾のヌクレオチドを含み;
各NbおよびNb’は、独立して、修飾または非修飾のいずれかまたはこれらの組み合わせである0〜10ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し;
各np、np’、nq、およびnq’(この各々は存在することもまたは存在しないこともある)は、独立してオーバーハングヌクレオチドを表し;
XXX、YYY、ZZZ、X’X’X’、Y’Y’Y’、およびZ’Z’Z’は、各々独立して、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾の1つのモチーフを表し;
Nb上の修飾はY上の修飾と異なり、かつNb’上の修飾はY’上の修飾と異なる]によって表され;および
センス鎖は少なくとも1つのリガンドと共役している。

0016

さらなる実施形態において、iは0であり;jは0であり;iは1であり;jは1であり;iおよびjは両方ともに0であり;またはiおよびjは両方ともに1である。別のさらなる実施形態において、kは0であり;lは0であり;kは1であり;lは1であり;kおよびlは両方ともに0であり;またはkおよびlは両方ともに1である。別の態様において、YYYモチーフはセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。さらに別の態様において、Y’Y’Y’モチーフは、アンチセンス鎖の5’末端から11、12および13位に存在する。

0017

一実施形態において、Y’は2’−O−メチルまたは2’−フルオロである。

0018

一部の態様において、式(III)は、式(IIIa):
センス:5’np−Na−YYY−Na−nq3’
アンチセンス:3’np’−Na’−Y’Y’Y’−Na’−nq’5’(IIIa)
によって表される。

0019

さらなる態様において、二本鎖領域は15〜30ヌクレオチド対長である。別の態様において、二本鎖領域は17〜23ヌクレオチド対長である。別の実施形態において、二本鎖領域は17〜25ヌクレオチド対長である。さらに別の実施形態において、二本鎖領域は23〜27ヌクレオチド対長である。さらなる態様において、二本鎖領域は19〜21ヌクレオチド対長である。さらに別の態様において、二本鎖領域は21〜23ヌクレオチド対長である。

0020

一実施形態において、各鎖は15〜30ヌクレオチドを有する。さらなる実施形態において、各鎖は19〜30ヌクレオチドを有する。

0021

一態様において、ヌクレオチド上の修飾は、表5、9、10、11B、12、13に列挙されるとおりの修飾、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される。

0022

一部の実施形態において、ヌクレオチド上の修飾は2’−O−メチルおよび2’−フルオロ修飾である。

0023

一部の実施形態において、リガンドは、二価または三価分枝リンカーを介して付加された1つ以上のGalNAc誘導体である。さらなる実施形態において、リガンドは、



である。

0024

一部の態様において、リガンドはセンス鎖の3’末端に付加されている。

0025

特定の実施形態において、RNAi剤は、以下の概略図



[式中、XはOまたはSである]に示されるとおりのリガンドと共役している。

0026

一部の態様において、RNAi剤は、少なくとも1つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含む。さらなる態様において、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は一方の鎖の3’末端にある。別のさらなる態様において、この鎖はアンチセンス鎖である。さらに別の態様において、この鎖はセンス鎖である。

0027

一部の実施形態において、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は一方の鎖の5’末端にある。さらなる態様において、この鎖はアンチセンス鎖である。別のさらなる態様において、この鎖はセンス鎖である。

0028

特定の実施形態において、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合は一方の鎖の5’末端および3’末端の両方にある。一実施形態において、この鎖はアンチセンス鎖である。

0029

一部の態様において、RNAi剤は6〜8つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらなる実施形態において、アンチセンス鎖は5’末端に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および3’末端に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は5’末端または3’末端のいずれかに少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。

0030

一部の実施形態において、二重鎖のアンチセンス鎖の5’末端の1位にある塩基対はAU塩基対である。

0031

一部の態様において、Yヌクレオチドは2’−フルオロ修飾を含有する。さらなる態様において、Y’ヌクレオチドは2’−O−メチル修飾を含有する。

0032

一部の実施形態において、センス鎖は合計21ヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は合計23ヌクレオチドを有する。

0033

一部の態様において、RNAi剤は、表4A、4B、5、8、9、10、11A、11Bおよび12のいずれか1つに列挙されるRNAi剤の群から選択される。

0034

特定の実施形態において、本発明はまた、細胞におけるアポリポタンパク質C3(APOC3)の発現の阻害能を有する二本鎖RNAi剤も提供し、この二本鎖RNAi剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
センス鎖は5’−GCUAAAAGGGACAGUAUUCU−3’(配列番号13)を含み、かつアンチセンス鎖は5’−AGAAUACUGUCCCUUUUAAGCAA−3’(配列番号14)を含み、
センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、
センス鎖は、3’末端に付加されたリガンドと共役し、および
リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された1つ以上のGalNAc誘導体である。

0035

他の実施形態において、本発明はまた、細胞におけるアポリポタンパク質C3(APOC3)の発現の阻害能を有する二本鎖RNAi剤も提供し、この二本鎖RNAi剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
センス鎖は5’−GCUUAAAAGGGACAGUAUUCU−3’(配列番号13)を含み、かつアンチセンス鎖は5’−UGAAUACUGUCCCUUUUAAGCAA−3’(配列番号を含み15)を含み、
センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、
センス鎖は、3’末端に付加されたリガンドと共役し、および
リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された1つ以上のGalNAc誘導体である。

0036

特定の実施形態において、本発明はまた、細胞におけるアポリポタンパク質C3(APOC3)の発現の阻害能を有する二本鎖RNAi剤も提供し、この二本鎖RNAi剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、
センス鎖は5’−GCUUAAAAGGGACAGUAUUCA−3’(配列番号659)を含み、かつアンチセンス鎖は5’−UGAAUACUGUCCCUUUUAAGCAA−3’(配列番号670)を含み、
センス鎖のヌクレオチドの実質的に全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの実質的に全てが修飾ヌクレオチドであり、
センス鎖は、3’末端に付加されたリガンドと共役し、および
リガンドは、二価または三価の分枝リンカーを介して付加された1つ以上のGalNAc誘導体である。

0037

実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。一実施形態において、アンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。別の実施形態において、センス鎖のヌクレオチドの全ておよびアンチセンス鎖のヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。

0038

さらなる態様において、修飾ヌクレオチドの少なくとも1つは、3’末端デオキシチミン(dT)ヌクレオチド、2’−O−メチル修飾ヌクレオチド、2’−フルオロ修飾ヌクレオチド、2’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、アンロックドヌクレオチド、配座固定ヌクレオチド、拘束エチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、2’−アミノ修飾ヌクレオチド、2’−O−アリル修飾ヌクレオチド、2’−C−アルキル修飾ヌクレオチド、2’−ヒドロキシル(hydroxly)修飾ヌクレオチド、2’−メトキシエチル修飾ヌクレオチド、2’−O−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホロアミド酸塩、非天然塩基を含むヌクレオチド、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、1,5−アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、5’−ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、5’−メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、5’リン酸または5’リン酸模倣体を含むヌクレオチド、ビニルリン酸を含むヌクレオチド、アデノシン−グリコール核酸(GNA)を含むヌクレオチド、チミジン−グリコール核酸(GNA)S−異性体を含むヌクレオチド、2−ヒドロキシメチル−テトラヒドロフラン−5−リン酸を含むヌクレオチド、2’−デオキシチミジン−3’リン酸を含むヌクレオチド、2’−デオキシグアノシン−3’−リン酸を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結した末端ヌクレオチドからなる群から選択される。

0039

一実施形態において、RNAi剤は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを10個以下含む。別の実施形態において、RNAi剤は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを9個以下含む。別の実施形態において、RNAi剤は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを8個以下含む。別の実施形態において、RNAi剤は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを7個以下含む。別の実施形態において、RNAi剤は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを6個以下含む。別の実施形態において、RNAi剤は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを5個以下含む。さらに別の実施形態において、センス鎖は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを4個以下含む。別の実施形態において、センス鎖は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを4個以下含む。別の実施形態において、センス鎖は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを3個以下含む。別の実施形態において、センス鎖は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを2個以下含む。別の態様において、アンチセンス鎖は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを6個以下含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを5個以下含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを4個以下含む。別の実施形態において、アンチセンス鎖は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを3個以下含む。さらに別の態様において、アンチセンス鎖は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを2個以下含む。

0040

一実施形態において、本発明の二本鎖RNAi剤は、アンチセンス鎖の5’ヌクレオチドに5’−リン酸または5’−リン酸模倣体をさらに含む。別の実施形態において、二本鎖RNAi剤は、アンチセンス鎖の5’ヌクレオチドに5’−リン酸模倣体をさらに含む。具体的な実施形態において、5’−リン酸模倣体は5’−ビニルリン酸(5’−VP)である。

0041

特定の態様において、リガンドは、



である。

0042

一部の実施形態において、RNAi剤は、以下の概略図



[式中、XはOまたはSである]に示されるとおりのリガンドと共役している。

0043

一部の態様において、本発明は、表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12、および13のいずれか1つに列挙されるRNAi配列を含む二本鎖RNAi剤を提供する。

0044

一実施形態において、RNAi剤は、以下の配列:
センス:5’GfscsUfuAfaAfaGfGfGfaCfaGfuAfuUfcUfL96 3’(配列番号16)
アンチセンス:5’asGfsaAfuAfcUfgUfcccUfuUfuAfaGfcsAfsa 3’(配列番号17)を含むAD−57553である。

0045

別の実施形態において、RNAi剤は、以下の配列:
センス:5’GfscsUfuAfaAfaGfGfGfaCfaGfuAfuUfcUfL96 3’(配列番号18)
アンチセンス:5’VPusGfsaAfuAfcUfgUfcccUfuUfuAfaGfcsasa 3’(配列番号19)を含むAD−65696である。

0046

さらに別の態様において、RNAi剤は、以下の配列:
センス:5’gscsuuaaAfaGfGfGfacaguauucaL96 3’(配列番号20)
アンチセンス:5’usGfsaauAfcUfGfucccUfuUfuaagcsasa 3’(配列番号21)を含むAD−65703である。

0047

さらに別の態様において、RNAi剤は、以下の配列:
センス:5’gscsuuaaAfaGfGfGfacaguauucaL96 3’(配列番号22)
アンチセンス:5’usGfsaauacugucccUfuuuaagcsasa 3’(配列番号23)を含むAD−65704である。

0048

さらに別の態様において、RNAi剤は、以下の配列:
センス:5’cscscaauAfaAfGfCfuggacaagaaL96 3’(配列番号714)
アンチセンス:5’usUfscuuGfuCfCfagcuUfuAfuugggsasg 3’(配列番号718)を含むAD−67221である。

0049

一実施形態において、RNAi剤は、以下の配列:
センス:5’gscsuuaaaaGfgGfacaguauuca 3’(配列番号738)
アンチセンス:5’sGfsaauacugucCfcUfuuuaagcsasa 3’(配列番号749)を含むAD−69535である。

0050

別の実施形態において、RNAi剤は、以下の配列:
センス:5’gscsuuaaaaGfgGfacagu(Agn)uuca 3’(配列番号744)
アンチセンス:5’usGfsaauacugucCfcUfuuuaagcsasa 3’(配列番号755)を含むAD−69541である。

0051

特定の実施形態において、本発明はまた、修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物も提供し、この薬剤は、細胞におけるAPOC3の発現の阻害能を有し、かつ表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12、および13のいずれか1つに列挙される配列の群から選択されるセンス配列と相補的な配列を含み、このポリヌクレオチドは約14〜約30ヌクレオチド長である。

0052

一部の態様において、本発明はまた、本明細書に記載されるとおりの二本鎖RNAi剤を含有するベクターも提供する。他の態様において、本発明はまた、本明細書に記載されるとおりの二本鎖RNAi剤を含有する細胞も提供する。

0053

一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるとおりの二本鎖RNAi剤、または修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物、またはベクターを含む医薬組成物に関する。

0054

特定の態様において、二本鎖RNAi剤は非緩衝液中に存在する。さらなる態様において、非緩衝液は生理食塩水または水である。他の態様において、二本鎖RNAi剤は緩衝液中に存在する。さらなる実施形態において、緩衝液は、酢酸塩クエン酸塩プロラミン炭酸塩、またはリン酸塩またはそれらの任意の組み合わせを含む。具体的な実施形態において、緩衝液はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)である。

0055

一実施形態において、本発明はまた、細胞におけるアポリポタンパク質C3(APOC3)発現を阻害する方法も提供し、この方法は、
(a)細胞を、本明細書に記載されるとおりの二本鎖RNAi剤、または修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物、ベクター、または医薬組成物と接触させるステップと、
(b)ステップ(a)で生じた細胞を、APOC3遺伝子のmRNA転写物の分解を達成するのに十分な時間にわたって維持し、それによって細胞におけるAPOC3遺伝子の発現を阻害するステップとを含む。

0056

一態様において、細胞は対象の体内にある。さらなる態様において、対象はヒトまたはウサギである。一実施形態において、対象はAPOC3関連疾患に罹患している。

0057

一部の実施形態において、APOC3発現は、少なくとも約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約98%または約100%阻害される。

0058

一部の態様において、本発明は、アポリポタンパク質C3(APOC3)関連疾患を有する対象を治療する方法を提供し、この方法は、本明細書に記載されるとおりの二本鎖RNAi剤、または修飾アンチセンスポリヌクレオチド剤を含む組成物、またはベクター、または医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それによって前記対象を治療するステップを含む。

0059

一実施形態において、APOC3関連疾患は高トリグリセリド血症である。別の実施形態において、APOC3関連疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、腎疾患、肥満症、2型真性糖尿病(インスリン抵抗性)、高血圧症、アテローム性動脈硬化症(artherosclerosis)および膵炎からなる群から選択される。

0060

一部の態様において、二本鎖RNAi剤は約0.01mg/kg〜約10mg/kgまたは約0.5mg/kg〜約50mg/kgの用量で投与される。さらなる態様において、二本鎖RNAi剤は約10mg/kg〜約30mg/kgの用量で投与される。別の態様において、二本鎖RNAi剤は約3mg/kgの用量で投与される。さらに別の態様において、二本鎖RNAi剤は約10mg/kgの用量で投与される。

0061

一実施形態において、二本鎖RNAi剤は皮下投与される。別の実施形態において、二本鎖RNAi剤は静脈内投与される。別の実施形態において、二本鎖RNAi剤は筋肉内投与される。

0062

一部の態様において、RNAi剤は2用量以上で投与される。さらなる態様において、RNAi剤は、約12時間に1回、約24時間に1回、約48時間に1回、約72時間に1回、および約96時間に1回からなる群から選択される間隔で投与される。

0063

特定の実施形態において、本発明の方法は、対象に追加的な療法剤を投与するステップをさらに含む。さらなる実施形態において、追加的な療法剤は、HMG−CoAレダクターゼ阻害薬フィブラート胆汁酸捕捉剤ナイアシン抗血小板剤アンジオテンシン変換酵素阻害薬、アンジオテンシンII受容体拮抗薬アシルCoAコレステロールアセチルトランスフェラーゼACAT)阻害薬、コレステロール吸収阻害薬コレステロールエステル転移タンパク質(CETP)阻害薬、ミクロソームトリグリセリド転移タンパク質(MTTP)阻害薬、コレステロールモジュレーター胆汁酸モジュレーター、ペルオキシソーム増殖活性化受容体(PPAR)作動薬、遺伝子ベース療法、複合血管保護剤糖タンパク質Ilb/IIIa阻害薬、アスピリンまたはアスピリン様化合物、IBAT阻害薬、スクアレンシンターゼ阻害薬、単球走化性タンパク質(MCP)−I阻害薬、または魚油からなる群から選択される。

図面の簡単な説明

0064

指示される本発明のiRNAの0.1nMまたは10mMの単回用量処置した後のHep3B細胞におけるAPOC3mRNAの相対量を示す棒グラフである。
3、10および30mg/kg用量のGalNac共役AD−57558で治療した野生型マウスにおいて5日目に計測されたAPOC3 mRNAの相対量を示す棒グラフである。
AD−57553、AD−57547およびAD−58924を注射した個々のAPOC3−AAVマウスにおいて計測されたAPOC3 mRNAレベルの計測値を示す棒グラフである。
AD−57553、AD−57547およびAD−58924を注射したAPOC3−AAVマウスにおいて計測されたAPOC3 mRNAレベルの群平均を示す棒グラフである。
1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを予め注射し、続いて1.25mg/kg、2.5mg/kgおよび5mg/kg用量のAD−57553を注射したAPOC3−AAVマウスにおいて計測されたAPOC3 mRNAの相対量を示す棒グラフである。
1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを予め注射し、続いて1.25mg/kg、2.5mg/kgおよび5mg/kg用量のAD−57553を注射したAPOC3−AAVマウスにおいて計測されたAPOC3 mRNAの相対量の群平均を示す棒グラフである。
1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを注射し、続いて3mg/kg用量の指示される本発明のiRNAを注射したAPOC3−AAVマウスにおいて計測された血清APOC3タンパク質の20日間の経時変化を示すグラフである。
1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを注射し、続いて3mg/kg用量の指示される本発明のiRNAを注射したAPOC3−AAVマウスにおいて計測された血清APOC3タンパク質の30日間の経時変化を示すグラフである。
1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを注射し、続いて3mg/kg用量の指示される本発明のiRNAを注射したAPOC3−AAVマウスにおいて10日目に計測された血清APOC3タンパク質の量を示す棒グラフである。
1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを注射し、続いて3mg/kg用量の指示される本発明のiRNAを注射したAPOC3−AAVマウスにおいて20日目に計測された血清APOC3タンパク質の量を示す棒グラフである。
1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを注射し、続いて3mg/kg用量の指示される本発明のiRNAを注射したAPOC3−AAVマウスにおいて計測されたAPOC3タンパク質の量を示す経時変化である。
AD−57553、AD−65696、AD−65699、AD−65703およびAD−65704による複数用量試験に使用した投薬スケジュールQ2W×4を示す概略図である。
図12Aは、1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを注射し、続いて図11に示す投薬スケジュールに従い投与した4回の0.3mg/kg用量の指示される本発明のiRNAを注射したAPOC3−AAVマウスにおいて計測されたAPOC3タンパク質の量を示す経時変化である。図12Bは、1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを注射し、続いて図11に示す投薬スケジュールに従い投与した4回の1mg/kg用量の指示される本発明のiRNAを注射したAPOC3−AAVマウスにおいて計測されたAPOC3タンパク質の量を示す経時変化である。図12Cは、1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを注射し、続いて図11に示す投薬スケジュールに従い投与した4回の3mg/kg用量の指示される本発明のiRNAを注射したAPOC3−AAVマウスにおいて計測されたAPOC3タンパク質の量を示す経時変化である。
1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを注射し、続いて単回用量の0.3mg/kg、1mg/kgおよび3mg/kgのAD−65704を注射したAPOC3−AAVマウスにおいて14日目に計測されたAPOC3タンパク質の相対量を示す棒グラフである。
1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを注射し、続いて図11に示す投薬スケジュールに従い投与した、複数用量の0.3mg/kg、1mg/kgおよび3mg/kgのAD−65704を注射したAPOC3−AAVマウスにおいて最終用量後20日に計測されたAPOC3タンパク質の相対量を示す棒グラフである。
1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを注射し、続いて1mg/kg用量の指示される本発明のiRNAを注射したAPOC3−AAVマウスにおいて計測されたAPOC3タンパク質の量を示す経時変化である。
図16Aは、1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを注射し、続いて1mg/kg単回用量の指示される本発明のiRNAを注射したAPOC3−AAVマウスにおいて10日目に計測されたAPOC3タンパク質の相対量を示す棒グラフである。図16Bは、1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを注射し、続いて1mg/kg単回用量の指示される本発明のiRNAを注射したAPOC3−AAVマウスにおいて24日目に計測されたAPOC3タンパク質の相対量を示す棒グラフである。
図17Aは、1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを注射し、続いて単回1mg/kg用量の指示されるiRNAを注射したAPOC3−AAVマウスにおいて14日目に計測された血清APOC3タンパク質の相対量を示す棒グラフである。図17Bは、1011個のhAPOC3 AAVゲノムコピーを注射し、続いて単回1mg/kg用量の指示されるiRNAを注射したAPOC3−AAVマウスにおいて計測された投与前レベルに対する0、14、28、および42日目の血清APOC3タンパク質の量を示すグラフである。
図18Aは、8週間にわたるAD−65704の単回1mg/kg週用量(QW×8)後のカニクイザルにおいて1、8、11、15、22、29、36、43、57、64、および71日目に計測された血清APOC3タンパク質を−7日目における投与前と比べた量を示すグラフである。図18Bは、AD−65704の単回1mg/kg用量後のカニクイザルにおいて1、8、11、15、22、29、および36日目に計測された血清APOC3タンパク質を−7日目における投与前と比べた量を示すグラフである。図18Cは、5週間にわたるAD−65704の単回1mg/kg週用量(q1w×5)後のカニクイザルにおける64日目の肝臓APOC3 mRNAを−7日目における投与前と比べた量、およびAD−65704の単回1mg/kg用量後のカニクイザルにおける12日目の肝臓APOC3 mRNAを−7日目における投与前と比べた量を示すグラフである。
図19Aは、指示されるiRNAの単回1mg/kg用量後のカニクイザルにおいて1、8、11、15、22、29、および36日目に計測された血清APOC3タンパク質を−7日目における投与前と比べた量を示すグラフである。図19Bは、指示されるiRNAの単回1mg/kg用量後のカニクイザルにおいて12日目に計測された肝臓APOC3 mRNAを−7日目における投与前と比べた量を示す棒グラフである。
図20Aは、指示されるiRNAの単回1mg/kg用量および続く36日目における同じ薬剤の単回皮下3mg/kg用量の投与後のカニクイザルにおいて1、8、11、15、22、29、36、43、50、57、64、および71日目に計測された血清APOC3 mRNAを−7日目における投与前と比べた量を示すグラフである。図20Bは、1日目の指示されるiRNAの単回1mg/kg用量と、続く36日目の同じiRNA剤の単回3mg/kg用量後のカニクイザルにおいて12日目に計測された肝臓APOC3 mRNAを−7日目における投与前と比べた量を示す棒グラフである。

0065

本発明は、APOC3遺伝子の発現を低減または阻害するiRNA剤、例えば二本鎖iRNA剤、および組成物を提供する。この遺伝子は、細胞内、例えばヒトなどの対象の体内にある細胞内にあり得る。

0066

本発明はまた、APOC3の発現の阻害または低減から利益を受け得る障害、例えば高トリグリセリド血症などのアポリポタンパク質C3関連疾患または障害を有する対象を、APOC3遺伝子の発現を阻害または低減するiRNA組成物を使用して治療する方法も提供する。

0067

本発明のiRNAは、約30ヌクレオチド長以下、例えば、15〜30、15〜29、15〜28、15〜27、15〜26、15〜25、15〜24、15〜23、15〜22、15〜21、15〜20、15〜19、15〜18、15〜17、18〜30、18〜29、18〜28、18〜27、18〜26、18〜25、18〜24、18〜23、18〜22、18〜21、18〜20、19〜30、19〜29、19〜28、19〜27、19〜26、19〜25、19〜24、19〜23、19〜22、19〜21、19〜20、20〜30、20〜29、20〜28、20〜27、20〜26、20〜25、20〜24、20〜23、20〜22、20〜21、21〜30、21〜29、21〜28、21〜27、21〜26、21〜25、21〜24、21〜23、または21〜22ヌクレオチド長の領域を有するRNA鎖(アンチセンス鎖)を含み、この領域は、APOC3遺伝子のmRNA転写物の少なくとも一部と実質的に相補的である。これらのiRNAを使用すると、細胞におけるAPOC3遺伝子のmRNAを標的化して分解することが可能になる。詳細には、極めて低い投薬量の本発明のiRNAがRNA干渉(RNAi)を特異的かつ効率的に媒介することができ、APOC3遺伝子の発現の有意な阻害をもたらし得る。本発明者らは、インビトロおよびインビボアッセイを使用して、APOC3遺伝子を標的化するiRNAがRNAiを媒介し、APOC3遺伝子の発現の有意な阻害およびAPOC3タンパク質レベルの低下をもたらし得ることを実証している。本発明者らはまた、APOC3遺伝子を標的化するiRNAが、アポリポタンパク質C3関連障害に伴う症状を低減し得る、例えばトリグリセリドレベルを低下させ得ることも実証している。したがって、これらのiRNAを含む方法および組成物は、高トリグリセリド血症などのアポリポタンパク質C3関連障害(disoerder)を有する対象の治療に有用である。

0068

以下の詳細な説明は、iRNAを含有する組成物をどのように作製および使用してAPOC3遺伝子の発現を阻害するか、ならびにAPOC3の発現の阻害および/または低減から利益を受け得る疾患および障害を有する対象を治療するための組成物、使用、および方法を開示する。

0069

I.定義
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に定義する。これに加えて、パラメータの値または値範囲が列挙される場合は常に、列挙された値の中間の値および範囲もまた、本発明の一部であることが意図されることに留意すべきである。

0070

詞「a」および「an」は、冠詞の1つまたは2つ以上(すなわち少なくとも1つ)の文法的目的に言及するために、本明細書で使用される。一例として「因子(an element)」は、1つの因子、または例えば複数の因子などの2つ以上の因子を意味する。

0071

「含む」という用語は、本明細書では、「をはじめとするが、これに限定されるものではない」という用語を意味するために使用され、またそれと区別なく使用される。

0072

「または」という用語は、本明細書では、文脈上、明確に別の意味でない限り、「および/または」という用語を意味するために使用され、またそれと区別なく使用される。

0073

本明細書で使用されるとき、用語「APOC3」は、アポリポタンパク質C3をコードする周知の遺伝子、ならびに当該技術分野においてHALP2またはAPOCIIIとしても知られるそのタンパク質産物を指す。

0074

用語「APOC3」には、ヒトAPOC3(そのアミノ酸および完全コード配列については、例えば、GenBank受託番号GI:4557322(NM_000040.1;配列番号1)を参照し得る);マカカ・ファシキュラリス(Macaca fascicularis)APOC3(そのアミノ酸および完全コード配列については、例えば、GenBank受託番号GI:544489959(XM_05579730.1、配列番号3)を参照し得る);マカカ・ムラタ(Macaca mulatta)APOC3(そのアミノ酸および完全コード配列については、例えば、GenBank受託番号GI:297269260(XM_001090312.2;配列番号5)を参照し得る);マウス(ムス・ムスクルス(Mus musculus))APOC3(そのアミノ酸および完全コード配列については、例えば、GenBank受託番号GI:577019555(NM_023114.4、配列番号7)を参照し得る);ラットラッツス・ノルベギクス(Rattus norvegicus))APOC3(そのアミノ酸および完全コード配列については、例えば、GenBank受託番号GI:402534545(NM_012501.2、配列番号9)を参照し得る);およびウサギ(オリクトラグス・クニクルス(Oryctolagus cuniculus))、GenBank受託番号GI:655601498(XM_002708371.2、配列番号11)が含まれる。

0075

APOC3mRNA配列のさらなる例は、公的に利用可能なデータベース、例えば、GenBank、UniProt、OMIM、およびマカク属(Macaca)ゲノムプロジェクトウェブサイトなどで容易に利用可能である。

0076

用語「APOC3」は、本明細書で使用されるとき、APOC3遺伝子の一塩基変異多型(SNP)など、APOC3遺伝子の天然に存在するDNA配列変異もまた指す。APOC3 DNA配列の例示的なSNPは、www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/において利用可能なdbSNPデータベースで参照し得る。APOC3遺伝子内配列変異の非限定的な例として、例えば、Petersen,K.F.et al.,(2010),N.Engl.J.Med.362(12):1082−1089(この内容は全て、参照により本明細書に援用される)に記載される2つの変異rs2854116およびrs2854117が挙げられる。

0077

本明細書の用法では、「標的配列」は、一次転写産物のRNAプロセシング産物であるmRNAをはじめとする、APOC3遺伝子の転写中に形成されるmRNA分子のヌクレオチド配列の連続部分を指す。一実施形態では、配列の標的部分は、APOC3遺伝子の転写中に形成されるmRNA分子のヌクレオチド配列の部分またはその近辺における、iRNA指向切断のための基質としての役割を果たすのに、少なくとも十分長い。

0078

標的配列は、例えば約15〜30ヌクレオチド長などの約9〜36ヌクレオチド長であってもよい。例えば、標的配列は、15〜29、15〜28、15〜27、15〜26、15〜25、15〜24、15〜23、15〜22、15〜21、15〜20、15〜19、15〜18、15〜17、18〜30、18〜29、18〜28、18〜27、18〜26、18〜25、18〜24、18〜23、18〜22、18〜21、18〜20、19〜30、19〜29、19〜28、19〜27、19〜26、19〜25、19〜24、19〜23、19〜22、19〜21、19〜20、20〜30、20〜29、20〜28、20〜27、20〜26、20〜25、20〜24,20〜23、20〜22、20〜21、21〜30、21〜29、21〜28、21〜27、21〜26、21〜25、21〜24、21〜23、または21〜22ヌクレオチドなど、約15〜30ヌクレオチド長であり得る。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。

0079

本明細書の用法では、「配列を含む鎖」という用語は、標準ヌクレオチド命名法を使用して、言及される配列によって記載されるヌクレオチド鎖を含む、オリゴヌクレオチドを指す。

0080

「G」、「C」、「A」、「T」、および「U」は、通常、塩基としてそれぞれグアニンシトシンアデニン、チミジン、およびウラシルを含有するヌクレオチドをそれぞれ表す。しかし「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語はまた、以下でさらに詳述されるような修飾ヌクレオチドにも、または代替置換部分にも言及し得るものと理解される(例えば表3を参照されたい)。当業者は、このような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対形成特性を実質的に変更することなく、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルをその他の部分で置き換え得ることを十分承知している。制限を意図しない例として、塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシン、またはウラシルを含有するヌクレオチドと塩基対形成し得る。したがってウラシル、グアニン、またはアデニンを含有するヌクレオチドは、本発明で取り上げdsRNAのヌクレオチド配列中で、例えばイノシンを含有するヌクレオチドで置き換え得る。別の実施例では、アデニンおよびシトシンは、オリゴヌクレオチドのどこでも、それぞれグアニンおよびウラシルで置換され得て、標的mRNAとG−Uゆらぎ塩基対を形成する。このような置換部分を含有する配列は、本発明で取り上げる組成物および方法に適する。

0081

「iRNA」、「RNAi剤」、「iRNA剤」、「RNA干渉剤」という用語は、本明細書で同義的に使用され、本明細書定義で定義されるRNAを含有して、RNA誘導サイレンシング複合体RISC経路を通じたRNA転写物の標的切断を媒介する薬剤を指す。iRNAは、RNA干渉(RNAi)として知られている過程を通じて、mRNAの配列特異的分解を誘発する。iRNAは、例えば哺乳類対象などの対象内の細胞などの細胞内で、APOC3発現を調節し、例えば阻害する。

0082

一実施形態において、本発明のRNAi剤は、標的RNA配列、例えばAPOC3標的mRNA配列と相互作用する一本鎖RNAを含み、標的RNAの切断を誘導する。理論によって拘束されることを望むものではないが、細胞に導入された長い二本鎖RNAは、ダイサーとして知られるIII型エンドヌクレアーゼによってセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む二本鎖低分子干渉RNA(siRNA)に分解されると考えられる(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15:485)。リボヌクレアーゼII様酵素であるダイサーがこれらのdsRNAをプロセシングすると、特有の2塩基3’オーバーハングを有する19〜23塩基対の低分子干渉RNAになる(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409:363)。これらのsiRNAは、次にRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれ、そこで1つ以上のヘリカーゼがsiRNA二重鎖をほどき、相補的なアンチセンス鎖が標的認識をガイドすることが可能になる(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107:309)。適切な標的mRNAに結合すると、RISC内の1つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15:188)。したがって、一態様において本発明は、細胞内で生成される、かつRISC複合体の形成を促進して標的遺伝子、すなわちAPOC3遺伝子のサイレンシングを生じさせる一本鎖RNA(ssRNA)(siRNA二重鎖のアンチセンス鎖)に関する。したがって、用語「siRNA」はまた、本明細書では、上記に記載したとおりのRNAiも指して使用される。

0083

別の実施形態において、RNAi剤は、細胞または生物体内に導入されて標的mRNAを阻害する一本鎖RNAであってもよい。一本鎖RNAi剤はRISCエンドヌクレアーゼ、アルノート2に結合し、次にこれが標的mRNAを切断する。一本鎖siRNAは概して15〜30ヌクレオチドであり、化学修飾されている。一本鎖RNAの設計および試験については、米国特許第8,101,348号明細書およびLima et al.,(2012)Cell 150:883−894(その各々の内容全体が、本明細書によって参照により本明細書に援用される)に記載されている。本明細書に記載されるアンチセンスヌクレオチド配列のいずれも、本明細書に記載されるとおりの一本鎖siRNAとして、またはLima et al.,(2012)Cell 150:883−894に記載される方法によって化学修飾されたものとして使用し得る。

0084

別の実施形態において、本発明の組成物、使用、および方法において用いられる「iRNA」は二本鎖RNAであり、本明細書では、「二本鎖RNAi剤」、「二本鎖RNA(dsRNA)分子」、「dsRNA剤」、「RNAi剤」、「RNAi」、または「dsRNA」と称される。用語「dsRNA」は、標的RNA、すなわちAPOC3遺伝子に対して「センス」および「アンチセンス」方向を有すると称される、2つの逆平行の、かつ実質的に相補的な核酸鎖を含む二重鎖構造を有するリボ核酸分子の複合体を指す。本発明の一部の実施形態において、二本鎖RNA(dsRNA)は、本明細書においてRNA干渉またはRNAiと称される転写遺伝子サイレンシング機構を介した標的RNA、例えばmRNAの分解を引き起こす。

0085

一般に、dsRNA分子の各鎖のヌクレオチドの大多数はリボヌクレオチドであるが、本明細書に詳細に記載されるとおり、各々または両方の鎖がまた、1つ以上の非リボヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドおよび/または修飾ヌクレオチドも含み得る。加えて、本明細書で使用されるとき、「RNAi剤」は、化学修飾を有するリボヌクレオチドを含み得る;RNAi剤は、複数のヌクレオチドに実質的な修飾を含み得る。本明細書で使用されるとき、用語「修飾ヌクレオチド」は、修飾糖部分、修飾ヌクレオチド間結合、および/または修飾核酸塩基を独立に有するヌクレオチドを指す。したがって、用語の修飾ヌクレオチドには、ヌクレオシド間結合、糖部分、または核酸塩基に対する例えば官能基または原子の置換、付加または除去が包含される。本発明の薬剤中での使用に好適な修飾には、本明細書に開示される、または当該技術分野において公知のあらゆる種類の修飾が含まれる。いずれのかかる修飾も、siRNA型分子において用いられるとき、本明細書および特許請求の範囲の目的上「RNAi剤」に包含される。

0086

二本鎖領域は、RISC経路を通じた所望の標的RNA特異的分解を可能にするあらゆる長さであってもよく、約9〜36塩基対長さなどの範囲であってもよく、例えば約9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または36塩基対長さなどの約15〜30塩基対長さ、例えば約15〜30、15〜29、15〜28、15〜27、15〜26、15〜25、15〜24、15〜23、15〜22、15〜21、15〜20、15〜19、15〜18、15〜17、18〜30、18〜29、18〜28、18〜27、18〜26、18〜25、18〜24、18〜23、18〜22、18〜21、18〜20、19〜30、19〜29、19〜28、19〜27、19〜26、19〜25、19〜24、19〜23、19〜22、19〜21、19〜20、20〜30、20〜29、20〜28、20〜27、20〜26、20〜25、20〜24,20〜23、20〜22、20〜21、21〜30、21〜29、21〜28、21〜27、21〜26、21〜25、21〜24、21〜23、または21〜22塩基対長さなどである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。

0087

二本鎖構造を形成する2本の鎖は、より大型のRNA分子の異なる部分であってもよく、またはそれらは別のRNA分子であってもよい。2本の鎖が1つのより大型の分子の部分であり、したがって二本鎖構造を形成する1本の鎖の3’末端と、それぞれの他方の鎖の5’末端との間が中断されていないヌクレオチド鎖によって結合される場合、結合RNA鎖は「ヘアピンループ」と称される。ヘアピンループは、少なくとも1つの不対ヌクレオチドを含み得て;いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも20、少なくとも23以上の不対ヌクレオチドを含み得る。

0088

dsRNAの2本の実質的に相補的な鎖が、別のRNA分子によって構成されている場合、これらの分子は共有結合的に連結され得るが、必ずしもそうである必要はない。2本の鎖が、二本鎖構造を形成する1本の鎖の3’末端と、それぞれの他方の鎖の5’末端との間で、中断されていないヌクレオチド鎖以外の手段によって共有結合される場合、結合構造は「リンカー」と称される。RNA鎖は、同じまたは異なるヌクレオチド数を有してもよい。最大塩基対数は、dsRNAの最短鎖中のヌクレオチド数から、二本鎖中に存在するあらゆるオーバーハングを差し引いた数である。二本鎖構造に加えて、RNAiは、1つまたは複数のヌクレオチドオーバーハングを含んでもよい。

0089

一実施形態において、本発明のRNAi剤はdsRNAであり、その各鎖が、標的RNA配列、例えばAPOC3標的mRNA配列と相互作用する20〜30ヌクレオチドを含み、標的RNAの切断を誘導する。理論によって拘束されることを望むものではないが、細胞に導入された長い二本鎖RNAは、ダイサーとして知られるIII型エンドヌクレアーゼによってsiRNAに分解される(Sharp et al.(2001)Genes Dev.15:485)。リボヌクレアーゼIII様酵素であるダイサーがdsRNAをプロセシングすると、特有の2塩基3’オーバーハングを有する19〜23塩基対の低分子干渉RNAになる(Bernstein,et al.,(2001)Nature 409:363)。これらのsiRNAは、次にRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれ、そこで1つ以上のヘリカーゼがsiRNA二重鎖をほどき、相補的なアンチセンス鎖が標的認識をガイドすることが可能になる(Nykanen,et al.,(2001)Cell 107:309)。適切な標的mRNAに結合すると、RISC内の1つ以上のエンドヌクレアーゼが標的を切断してサイレンシングを誘導する(Elbashir,et al.,(2001)Genes Dev.15:188)。

0090

本明細書の用法では、「ヌクレオチドオーバーハング」という用語は、例えばdsRNAなどのiRNAの二本鎖構造から突出する、少なくとも1つの不対ヌクレオチドを指す。例えばdsRNAの1本の鎖の3’末端が他方の鎖の5’末端を越えて伸びる、またはその逆の場合、ヌクレオチドオーバーハングがある。dsRNAは、少なくとも1つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得て;代案としては、オーバーハングは、少なくとも2つのヌクレオチド、少なくとも3つのヌクレオチド、少なくとも4つのヌクレオチド、少なくとも5つ以上のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド/ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド/ヌクレオシド類似体を含み得て、またはそれからなる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組み合わせの上にあり得る。さらにオーバーハングのヌクレオチドは、dsRNAのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの5’末端、3’末端、または双方の末端上に存在し得る。

0091

一実施形態では、dsRNAのアンチセンス鎖は、例えば3’末端および/または5’末端でオーバーハングする、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドなどの1〜10ヌクレオチドを有する。一実施形態では、dsRNAのセンス鎖は、例えば3’末端および/または5’末端でオーバーハングする、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドなどの1〜10ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、オーバーハング中の1つまたは複数のヌクレオチドは、チオリン酸ヌクレオシドで置換されている。

0092

平滑末端化する」または「平滑末端」は、二本鎖RNAi剤の当該の末端に、対になっていないヌクレオチドがない、すなわちヌクレオチドオーバーハングがないことを意味する。「平滑末端の」RNAi剤は、その全長にわたって二本鎖である、すなわち分子のいずれの末端にもヌクレオチドオーバーハングがないdsRNAである。本発明のRNAi剤は、一端にヌクレオチドオーバーハングを有するか(すなわち、1つのオーバーハングと1つの平滑末端とを有する薬剤)、または両端にヌクレオチドオーバーハングを有するRNAi剤を含む。

0093

「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」という用語は、例えばAPOC3mRNAなどの標的配列と実質的に相補的な領域を含む、dsRNAなどのiRNA鎖を指す。本明細書の用法では、「領域相補性」という用語は、例えば本明細書で定義されるようなAPOC3ヌクレオチド配列のような標的配列などの配列と実質的に相補的な、アンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が標的配列と完全に相補的でない場合、分子の内部または末端領域にミスマッチがあり得る。一般に、最も耐容されるミスマッチは、例えばiRNAの5’および/または3’末端の5、4、3、または2ヌクレオチド内などの末端領域にある。

0094

「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、本明細書の用法では、本明細書で定義されるアンチセンス鎖の領域と実質的に相補的な領域を含む、iRNA鎖を指す。

0095

本明細書で使用されるとき、用語「切断領域」は、切断部位に直ちに隣接して位置する領域を指す。切断部位は、標的上で切断が起こる部位である。一部の実施形態において、切断領域は、切断部位の両側の、かつそれに直ちに隣接した3塩基を含む。一部の実施形態において、切断領域は、切断部位の両側の、かつそれに直ちに隣接した2塩基を含む。一部の実施形態において、切断部位はアンチセンス鎖のヌクレオチド10および11が結合する部位に特異的に存在し、切断領域はヌクレオチド11、12および13を含む。

0096

本明細書の用法では、特に断りのない限り、「相補的」という用語は、第2のヌクレオチド配列との関連で第1のヌクレオチド配列を記述するのに使用される場合、当業者に理解されるであろうように、第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、特定条件下で、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとハイブリダイズして、二本鎖構造を生成する能力を指す。このような条件は、例えばストリンジェントな条件であり得て、ストリンジェントな条件としては、400mMのNaCl、pH6.4の40mMのPIPES、1mMのEDTA、50℃または70℃で12〜16時間と、それに続く洗浄が挙げられる(例えば“Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Sambrook,et al.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい)。生物中で遭遇し得る生理学的に妥当な条件などのその他の条件が、適用され得る。当業者は、ハイブリダイズしたヌクレオチドの最終用途に従って、2つの配列の相補性試験に最適な条件の組を判定することができる。

0097

例えば本明細書に記載されるdsRNA内などのiRNA内の相補配列は、片方または双方のヌクレオチド配列全長にわたる、第1のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、第2のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの塩基対合を含む。このような配列は、本明細書で互いに「完全に相補的」と称し得る。しかし本明細書で第1の配列が第2の配列に関して「実質的に相補的」と称される場合、2つの配列は完全に相補的であり得て、またはそれらは最大で30塩基対の二本鎖のハイブリダイゼーションに際して、例えばRISC経路を通じた遺伝子発現の阻害などのそれらの最終用途に最も妥当な条件下でハイブリダイズする能力を保ちながら、1つまたは複数であるが概して5、4、3または2以下のミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしハイブリダイゼーションに際して、1つまたは複数の一本鎖オーバーハングを形成するように、2つのオリゴヌクレオチドがデザインされる場合、このようなオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチと見なされないものとする。例えば21ヌクレオチド長の1つのオリゴヌクレオチドと、23ヌクレオチド長の別のオリゴヌクレオチドとを含み、より長いオリゴヌクレオチドがより短いオリゴヌクレオチドと完全に相補的な21ヌクレオチドの配列を含むdsRNAは、本明細書に記載される目的では、なおも「完全に相補的」と称される。

0098

「相補的」配列は、本明細書の用法ではまた、それらのハイブリダイズ能力に関する上の要件が満たされる限りにおいて、非ワトソンクリック塩基対および/または非天然および修飾ヌクレオチドから形成される塩基対も含み、またはそれから完全に形成され得る。このような非ワトソン・クリック塩基対としては、G:Uゆらぎ塩基対またはフーグスティーン型塩基対が挙げられるが、これに限定されるものではない。

0099

本明細書では、「相補的」、「完全に相補的」、および「実質的に相補的」という用語は、それらが使用される文脈から理解されるであろうように、dsRNAのセンス鎖とアンチセンス鎖間の、またはiRNA剤のアンチセンス鎖と標的配列間の塩基整合に関して使用し得る。

0100

本明細書の用法では、メッセンジャーRNA(mRNA)の「少なくとも一部と実質的に相補的」なポリヌクレオチドは、対象mRNA(例えばAPOC3をコードするmRNA)の連続部分と、実質的に相補的なポリヌクレオチドを指す。例えばポリヌクレオチドは、配列が、APOC3をコードするmRNAの非中断部分と実質的に相補的であれば、APOC3 mRNAの少なくとも一部と相補的である。

0101

したがって、一部の実施形態において、本明細書に開示されるアンチセンスポリヌクレオチドは、標的APOC3配列に完全に相補的である。他の実施形態において、本明細書に開示されるセンス鎖ポリヌクレオチドおよび/またはアンチセンスポリヌクレオチドは標的APOC3配列と実質的に相補的であり、配列番号1〜12のいずれか1つのヌクレオチド配列の等価な領域とその全長にわたって少なくとも約80%相補的、例えば約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約%91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%相補的な連続ヌクレオチド配列、または配列番号1〜12のいずれか1つの断片を含む。

0102

一実施形態において、本発明のRNAi剤は、標的APOC3配列と相補的なアンチセンスポリヌクレオチドと実質的に相補的なセンス鎖を含み、ここでこのセンス鎖ポリヌクレオチドは、配列番号1〜12のいずれか1つのヌクレオチド配列の等価な領域とその全長にわたって少なくとも約80%相補的、例えば、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約%91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%相補的な連続ヌクレオチド配列、または配列番号1〜12のいずれか1つの断片を含む。別の実施形態において、本発明のRNAi剤は、標的APOC3配列と実質的に相補的なアンチセンス鎖を含み、配列番号1〜12のいずれか1つのヌクレオチド配列の等価な領域とその全長にわたって少なくとも約80%相補的、例えば、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約%91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、または約99%相補的な連続ヌクレオチド配列、または配列番号1〜12のいずれか1つの断片を含む。

0103

一般に、各鎖のヌクレオチドの大部分はリボヌクレオチドであるが、本明細書で詳細に記載されるように、片方または双方の鎖はまた、例えばデオキシリボヌクレオチドおよび/または修飾ヌクレオチドなどの1つまたは複数の非リボヌクレオチドも含み得る。さらに「iRNA」としては、化学修飾のあるリボヌクレオチドが挙げられる。このような修飾としては、本明細書で開示され、または当該技術分野で公知の全てのタイプの修飾が挙げられる。本明細書および特許請求の目的で、あらゆるこのような修飾は、iRNA分子における用法では「iRNA」に包含される。

0104

本発明の一態様において、本発明の方法および組成物に使用される薬剤は、アンチセンス阻害機構によって標的mRNAを阻害する一本鎖アンチセンス核酸分子である。一本鎖アンチセンス核酸分子は標的mRNA内の配列と相補的である。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、mRNAとの塩基対合および翻訳機構物理的な妨害によって化学量論的に翻訳を阻害し得る(Dias,N.et al.,(2002)Mol Cancer Ther 1:347−355を参照)。一本鎖アンチセンス核酸分子は約15〜約30ヌクレオチド長であってもよく、標的配列と相補的な配列を有し得る。例えば、一本鎖アンチセンス核酸分子は、本明細書に記載されるアンチセンス配列のいずれか1つからの少なくとも約15、16、17、18、19、20、またはそれ以上の連続ヌクレオチドである配列を含み得る。

0105

本明細書の用法では、「対象」は、霊長類(ヒト、例えばサルおよびチンパンジーなどの非ヒト霊長類など)、非霊長類ウシブタラクダラマウマヤギ、ウサギ、ヒツジハムスターモルモットネコイヌ、ラット、マウス、ウマ、およびクジラなど)をはじめとする哺乳類、または鳥類(例えばアヒルまたはガチョウ)などの動物である。一実施形態では、対象は、APOC3発現低下から利益を受ける、疾患、障害または病状を治療されまたは評価されるヒト;APOC3発現低下から利益を受ける、疾患、障害または病状のリスクがあるヒト;APOC3発現低下から利益を受ける、疾患、障害または病状を有するヒト;および/または本明細書に記載されるようにAPOC3発現低下から利益を受ける、疾患、障害または病状を治療されるヒトなどのヒトである。

0106

本明細書で使用されるとき、用語「治療する」または「治療」は、望ましくないまたは過剰なAPOC3発現に関連する1つ以上の症状、例えば高トリグリセリド血症(または高トリグリセリドレベル)の、限定はされないが軽減または改善を含めた、有益なまたは所望の結果を指す。かかる症状には、例えば、皮膚症状(例えば、発疹性黄色腫);眼異常(例えば、網膜脂血症);肝脾腫(肝臓および脾臓肥大);神経症状;または膵炎の軽度のエピソードであり得る腹痛発作が含まれ得る。望ましくないまたは過剰なAPOC3発現に関連する他の症状にはまた、高トリグリセリド血症によって引き起こされ得るか、それに関連し得るか、またはそれの結果であり得る疾患、障害または病態、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、腎疾患、肥満症、2型真性糖尿病(インスリン抵抗性)、アテローム性動脈硬化症(artherosclerosis)、心血管疾患または膵炎の任意の症状も含まれ得る。「治療」はまた、治療がない場合に予想される生存と比較したときの生存の延長も意味し得る。

0107

対象のAPOC3レベルまたは疾患マーカもしくは症状の文脈で、用語「より低い」は、かかるレベルの統計学的に有意な低下を指す。この低下は、例えば、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、またはそれ以上であってもよく、好ましくはかかる障害を有しない個体の正常範囲内として認められているレベルまで下がる。

0108

本明細書で使用されるとき、「予防」または「予防する」は、APOC3遺伝子の発現の低減によって治療または改善し得る疾患、障害またはその病態に関連して使用されるとき、対象がかかる疾患、障害、または病態に関連する症状、例えば高トリグリセリド血症などの望ましくないまたは過剰なAPOC3発現の症状を発症する可能性の低減を指す。例えば高トリグリセリド血症を発症する可能性は、例えば、高トリグリセリド血症の1つ以上のリスク要因を有する個体が高トリグリセリド血症を発症しないか、あるいは同じリスク要因を有しかつ本明細書に記載されるとおりの治療を受けていない集団と比べて低い重症度で高トリグリセリド血症を発症するとき、低減される。疾患、障害または病態を発症しないこと、またはかかる疾患、障害または病態に関連する症状の発症が(例えば、当該の疾患または障害について臨床的に認められている尺度で少なくとも約10%)低減されること、または症状の(例えば、数日、数週間、数ヵ月または数年の)遅延を呈することは、有効な予防と見なされる。

0109

本明細書で使用されるとき、用語「アポリポタンパク質C3関連疾患」または「APOC3関連疾患」は、望ましくないまたは過剰なAPOC3発現によって引き起こされるか、またはそれに関連する疾患、障害または病態である。用語「APOC3関連疾患」には、APOC3発現の低減によって治療または改善し得る疾患、障害または病態が含まれる。用語「APOC3関連疾患」には、高トリグリセリド血症、または高トリグリセリドレベルが含まれる。

0110

高トリグリセリド血症の徴候があり得る対象、例えばヒト対象血清中のトリグリセリドレベルについては、Oh,R.C.et al.,(2007)American Family Physician,75(9):1366−1371に記載されている。具体的には、高トリグリセリド血症は、「境界域高血清トリグリセリドレベル」(すなわち、150〜199mg/dLまたは1.70〜2.25mmol/L);「高血清トリグリセリドレベル」(すなわち、200〜499mg/dLまたは2.26〜5.64mmol/L);または「超高トリグリセリドレベル」(すなわち、500mg/dLまたはそれ以上(または5.65mmol/Lまたはそれ以上)に関連し得る。

0111

一実施形態において、APOC3関連疾患は原発性高トリグリセリド血症である。「原発性トリグリセリド血症(primary triglyceridemia)」は、環境的または遺伝的原因によって生じる(例えば、明らかな基礎疾患の結果)。原発性高トリグリセリド血症として特徴付けられる例示的疾患としては、限定はされないが、家族性乳び血症高リポタンパク血症I型)、原発性混合型高脂血症5型)、家族性高トリグリセリド血症(高リポタンパク血症4型)、家族性複合型高リポタンパク血症(2B型)および家族性異常βリポタンパク血症(高リポタンパク血症3型)が挙げられる。

0112

別の実施形態において、APOC3関連疾患は続発性高トリグリセリド血症である。「続発性トリグリセリド血症」は、他の基礎的障害および病態によって引き起こされるか、またはそれに関連する。かかる障害および/または病態としては、例えば、肥満症、メタボリックシンドローム糖尿病脂肪肝アルコール摂取、腎疾患、妊娠非アルコール性脂肪肝障害、甲状腺機能低下症パラプロテイン血症マクログロブリン血症における高ガンマグロブリン血症骨髄腫リンパ腫およびリンパ性白血病など)、自己免疫障害全身性エリテマトーデスなど)、薬剤の服用リトナビルおよびロピナビルを含む抗レトロウイルス薬、およびクロザピンおよびオランザピンを含む抗精神病薬療法など)が挙げられる(G.Yuan et al.,(2007)Canadian Medical Association Journal,176(8):1113−1120を参照のこと)。

0113

高トリグリセリド血症の原因となり得る任意の障害(例えば、続発性高トリグリセリド血症)または高トリグリセリド血症の結果であり得る任意の障害(例えば、原発性または続発性高トリグリセリド血症)が、用語「APOC3関連疾患」に包含される。APOC3関連疾患の非限定的な例としては、代謝障害、例えば、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、多嚢胞性卵巣症候群、腎疾患、肥満症、2型真性糖尿病(インスリン抵抗性);高血圧症;心血管障害、例えばアテローム性動脈硬化症(artherosclerosis);および膵炎、例えば急性膵炎が挙げられる。

0114

II.本発明のiRNA
本発明は、APOC3遺伝子の発現を阻害するiRNAを提供する。一実施形態において、このiRNA剤は、APOC3関連疾患、例えば高トリグリセリド血症を有する対象、例えばヒトなどの哺乳動物の体内にある細胞など、細胞におけるAPOC3遺伝子の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸(dsRNA)分子を含む。dsRNAは、APOC3遺伝子の発現で形成されるmRNAの少なくとも一部と相補的な相補性領域を有するアンチセンス鎖を含む。相補性領域は約30ヌクレオチド長以下(例えば、約30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、または18ヌクレオチド長以下)である。APOC3遺伝子を発現する細胞と接触すると、このiRNAはAPOC3遺伝子(例えば、ヒト、霊長類、非霊長類、またはトリAPOC3遺伝子)の発現を、例えばPCRまたは分岐DNA(bDNA)ベースの方法によるか、または例えばウエスタンブロッティング法またはフローサイトメトリー法を用いた、免疫蛍光分析によるなどのタンパク質ベースの方法によってアッセイしたとき、少なくとも約10%阻害する。

0115

dsRNAは相補的な2本のRNA鎖を含み、それらはその中でdsRNAが使用される条件下でハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。dsRNAの1本の鎖(アンチセンス鎖)は相補性領域を含み、それは標的配列と実質的に相補的であり、一般に完全に相補的である。標的配列は、APOC3遺伝子の発現中に形成されるmRNAの配列に由来し得る。他方の鎖(センス鎖)は、適切な条件下で組み合わせると、2本の鎖がハイブリダイズして二本鎖構造を形成するように、アンチセンス鎖と相補的な領域を含む。本明細書の他の箇所に記載されるように、そして当該技術分野で公知のように、dsRNAの相補配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上にあるものとは対照的に、単一核酸分子自己相補領域として含有され得る。

0116

一般に、二本鎖構造は、例えば15〜29、15〜28、15〜27、15〜26、15〜25、15〜24、15〜23、15〜22、15〜21、15〜20、15〜19、15〜18、15〜17、18〜30、18〜29、18〜28、18〜27、18〜26、18〜25、18〜24、18〜23、18〜22、18〜21、18〜20、19〜30、19〜29、19〜28、19〜27、19〜26、19〜25、19〜24、19〜23、19〜22、19〜21、19〜20、20〜30、20〜29、20〜28、20〜27、20〜26、20〜25、20〜24、20〜23、20〜22、20〜21、21〜30、21〜29、21〜28、21〜27、21〜26、21〜25、21〜24、21〜23、または21〜22塩基対長さなどの15〜30塩基対長さである。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。

0117

同様に、標的配列の相補性領域は、例えば15〜29、15〜28、15〜27、15〜26、15〜25、15〜24、15〜23、15〜22、15〜21、15〜20、15〜19、15〜18、15〜17、18〜30、18〜29、18〜28、18〜27、18〜26、18〜25、18〜24、18〜23、18〜22、18〜21、18〜20、19〜30、19〜29、19〜28、19〜27、19〜26、19〜25、19〜24、19〜23、19〜22、19〜21、19〜20、20〜30、20〜29、20〜28、20〜27、20〜26、20〜25、20〜24、20〜23、20〜22、20〜21、21〜30、21〜29、21〜28、21〜27、21〜26、21〜25、21〜24、21〜23、または21〜22ヌクレオチド長など15〜30ヌクレオチド長である。列挙された範囲および長さの中間の範囲および長さもまた、本発明の一部であることが意図される。

0118

いくつかの実施形態では、dsRNAは、約15〜約20ヌクレオチド長、または約25〜約30ヌクレオチド長である。一般にdsRNAは、ダイサー酵素の基質の役割を果たすのに十分長い。例えば約21〜23ヌクレオチド長より長いdsRNAが、ダイサーの基質の役割を果たしてもよいことは、当該技術分野で周知である。当業者は認識するであろうように、切断標的とされるRNAの標的領域は、ほとんどの場合、より大型のRNA分子の一部であり、それはmRNA分子であることが多い。該当する場合、mRNA標的の「部分」は、RNAi指向切断(すなわちRISC経路を通じた切断)の基質となるのに十分長い、mRNA標的の連続配列である。

0119

当業者は、例えば約10〜36、11〜36、12〜36、13〜36、14〜36、15〜36、9〜35、10〜35、11〜35、12〜35、13〜35、14〜35、15〜35、9〜34、10〜34、11〜34、12〜34、13〜34、14〜34、15〜34、9〜33、10〜33、11〜33、12〜33、13〜33、14〜33、15〜33、9〜32、10〜32、11〜32、12〜32、13〜32、14〜32、15〜32、9〜31、10〜31、11〜31、12〜31、13〜32、14〜31、15〜31、15〜30、15〜29、15〜28、15〜27、15〜26、15〜25、15〜24、15〜23、15〜22、15〜21、15〜20、15〜19、15〜18、15〜17、18〜30、18〜29、18〜28、18〜27、18〜26、18〜25、18〜24、18〜23、18〜22、18〜21、18〜20、19〜30、19〜29、19〜28、19〜27、19〜26、19〜25、19〜24、19〜23、19〜22、19〜21、19〜20、20〜30、20〜29、20〜28、20〜27、20〜26、20〜25、20〜24,20〜23、20〜22、20〜21、21〜30、21〜29、21〜28、21〜27、21〜26、21〜25、21〜24、21〜23、または21〜22塩基対などの約9〜36塩基対の二本鎖領域などの二本鎖領域が、dsRNAの主要機能部分であることもまた認識するであろう。したがって一実施形態では、それが例えば、所望のRNAを切断に標的化する15〜30塩基対の機能性二本鎖にプロセシングされる範囲内で、30塩基対を超える二本鎖領域を有するRNA分子またはRNA分子複合体は、dsRNAである。したがって当業者は、一実施形態では、miRNAがdsRNAであることを認識するであろう。別の実施形態では、dsRNAは、天然miRNAでない。別の実施形態では、APOC3発現を標的化するのに有用なiRNA剤は、より大型のdsRNAの切断によって標的細胞内で生成されない。

0120

本明細書に記載されるdsRNAは、例えば1、2、3、または4ヌクレオチドなどの1つまたは複数の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含み得る。少なくとも1つのヌクレオチドオーバーハングを有するdsRNAは、それらの平滑末端相当物と比較して、意外にも優れた阻害特性を有し得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシリボヌクレオチド/ヌクレオシドをはじめとする、ヌクレオチド/ヌクレオシド類似体を含み得て、またはそれからなる。オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはそのあらゆる組み合わせ上にあり得る。さらにオーバーハングのヌクレオチドは、dsRNAのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかの5’末端、3’末端、または双方の末端上に存在し得る。

0121

dsRNAは、以下でさらに考察されるように、例えばBiosearch,Applied Biosystems,Inc.から市販されるものなどの自動DNA合成機を使用して、当該技術分野で公知の標準法によって合成し得る。

0122

本発明のiRNA化合物は、二段階法を使用して調製されてもよい。最初に、二本鎖RNA分子の個々の鎖が、別々に調製される。次に、構成要素鎖がアニールされる。siRNA化合物の個々の鎖は、溶液相または固相有機または双方を使用して調製し得る。有機合成は、非天然または修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド鎖を容易に調製し得る利点を提供する。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、溶液相または固相有機合成または双方を使用して調製し得る。

0123

一態様において、本発明のdsRNAは、少なくとも2つのヌクレオチド配列、センス配列とアンチセンス配列とを含む。センス鎖および対応するアンチセンス鎖は、各々、表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12、および13のいずれか1つに提供される配列の群から選択される。この態様において、これらの2つの配列の一方は、これらの2つの配列の他方と相補的であり、これらの配列の一方は、APOC3遺伝子の発現で生じるmRNAの配列と実質的に相補的である。したがって、この態様において、dsRNAは2つのオリゴヌクレオチドを含み、ここで一方のオリゴヌクレオチドは、表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12、および13のいずれか1つにおけるセンス鎖として記載され、および第2のオリゴヌクレオチドは、表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12、および13のいずれか1つにおけるセンス鎖の対応するアンチセンス鎖として記載される。一実施形態において、dsRNAの実質的に相補的な配列は、別個のオリゴヌクレオチドに含まれる。別の実施形態において、dsRNAの実質的に相補的な配列は単一のオリゴヌクレオチドに含まれる。

0124

表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12、および13の配列の一部は修飾配列および/または共役配列として記載されるが、本発明のiRNAのRNA、例えば本発明のdsRNAは、表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12、および13に示される配列のいずれか1つであって、修飾されていない、共役されていない、および/またはそこに記載されるものとは別様に修飾および/または共役されているものを含み得ることは理解されるであろう。

0125

当業者は、例えば21塩基対などの約20〜23塩基対の二本鎖構造を有するdsRNAが、RNA干渉を誘発するのに特に効果的であるとして支持されていることを十分承知している(Elbashir et al.,EMBO 2001,20:6877−6888)。しかし他の当業者らは、より短いまたはより長いRNA二本鎖構造もまた、同様に効果的であり得ることを見出している。(Chu and Rana(2007)RNA 14:1714−1719;Kim et al.(2005)Nat Biotech 23:222−226)。上述の実施形態では、表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12および13のいずれか1つで提供されるオリゴヌクレオチド配列の性質のために、本明細書に記載されるdsRNAは、最低限21ヌクレオチド長の少なくとも1本の鎖を含み得る。片方または両方の末端の数個のヌクレオチドのみが抜けている、表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12および13のいずれか1つの配列の1つを有するより短い二本鎖が、上で説明したdsRNAと比較して同様に効果的であり得ることは、合理的に予想され得る。したがって表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12および13のいずれか1つの配列の1つに由来する、少なくとも15、16、17、18、19、20以上の連続ヌクレオチドの配列を有して、APOC3遺伝子発現を阻害する能力が、完全長配列を含むdsRNAと、約5、10、15、20、25、または30%の以下異なるdsRNAは、本発明の範囲内であることが意図される。

0126

さらに表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12および13のいずれか1つで提供されるRNAは、RISC媒介切断に対する感受性が高いAPOC3転写物中の部位を同定する。したがって本発明は、これらの配列の1つ内を標的とするiRNAをさらに特徴とする。本明細書の用法では、iRNAが、特定部位内のどこかで転写物の切断を促進する場合、iRNAはRNA転写物のその特定部位内を標的にすると言われる。このようなiRNAは、一般に、APOC3遺伝子中の選択配列に隣接する領域からの追加的なヌクレオチド配列と連結する、表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12および13のいずれか1つで提供される配列の1つからの約15個の連続ヌクレオチドを含む。

0127

標的配列は、一般に約15〜30ヌクレオチド長であるが、この範囲内の特定の配列が、あらゆる所与の標的RNAの切断を誘導する適合性には、幅広多様性がある。本明細書で提示される様々なソフトウェアパッケージおよびガイドラインは、あらゆる所与の遺伝子標的の最適標的配列を同定するためのガイダンスを提供するが、標的RNA配列に、所与のサイズの「ウィンドウ」または「マスク」(非限定的例として21個のヌクレオチド)を実際にまたは比喩的に(例えばコンピュータシミュレーションによるものをはじめとする)配置させて、標的配列の役割を果たし得るサイズ範囲の配列を同定する、経験的アプローチもまた取り得る。配列「ウィンドウ」を最初の標的配列位置の1ヌクレオチド上流または下流に連続的に移動することで、選択されたあらゆる所与の標的サイズについて完全な可能な配列の組が同定されるまで、次の潜在的標的配列が同定され得る。このプロセスは、同定された配列の系統的合成、および(本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知のアッセイを使用した)至適に機能する配列を同定する試験と相まって、iRNA剤で標的化した場合に、標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するRNA配列を同定し得る。したがって例えば表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12および13のいずれか1つ中で同定される配列が、効果的な標的配列を表す一方で、所与の配列の1ヌクレオチド上流または下流に、連続的に「ウィンドウを歩行させる」ことにより、同等またはより良い阻害特性がある配列を同定することで、阻害効率のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。

0128

さらにヌクレオチドを体系的に付加または除去して、より長いまたはより短い配列を作成し、その位置から、標的RNAよりも長いまたはより短いサイズのウィンドウを歩行させることで、これらの作成された配列を試験することにより、例えば表4A、4B、5、8、9、10、11A、11B、12および13のいずれか1つ中で同定される、あらゆる配列のさらなる最適化を達成し得ることが検討される。この場合もやはり、この新しい標的候補を作成するアプローチと、当該技術分野で公知のおよび/または本明細書に記載される阻害アッセイにおける、これらの標的配列に基づくiRNAの有効性の試験とを組み合わせることにより、阻害効率にさらなる改善をもたらし得る。なおもさらに、例えば本明細書に記載されまたは当該技術分野で公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの付加またはその変更、または当該技術分野で公知のおよび/または本明細書で考察されるその他の修飾によって、発現阻害物質として分子をさらに最適化する(例えば血清安定性または循環半減期増大、熱安定増大、膜貫通送達促進、特定位置または細胞型の標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用増大、エンドソームからの放出増大など)ことで、このような最適化配列を調節し得る。

0129

本明細書に記載されるiRNAは、標的配列との1つまたは複数のミスマッチを含有し得る。一実施形態では、本明細書に記載されるiRNAは、3個以下のミスマッチを含有する。iRNAのアンチセンス鎖が、標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチの範囲は、相補性領域の中心に位置しないことが好ましい。iRNAのアンチセンス鎖が標的配列とのミスマッチを含有する場合、ミスマッチは、相補性領域の5’または3’末端のいずれかから、最後の5ヌクレオチド内に限定されることが好ましい。例えばAPOC3遺伝子領域に相補的な23ヌクレオチドiRNA剤鎖では、RNA鎖は、一般に、中心的な13ヌクレオチド内にいかなるミスマッチも含有しない。本明細書に記載される方法または当該技術分野で公知の方法を使用して、標的配列とのミスマッチを含有するiRNAが、APOC3遺伝子の発現の阻害に効果的かどうかを判定し得る。APOC3遺伝子の発現の阻害における、ミスマッチがあるiRNAの有効性の検討は、特にAPOC3遺伝子の特定の相補性領域が、集団内で多型配列バリエーションを有することが知られている場合に、重要である。

0130

III.発明の修飾iRNA
一実施形態では、例えばdsRNAなどの本発明のiRNAのRNAは、未変性であり、例えば当該技術分野で公知であり本明細書に記載される、化学修飾および/または結合を含まない。別の実施形態では、例えばdsRNAなどの発明のiRNAのRNAを化学的に修飾して、安定性またはその他の有益な特性を高める。本発明の特定の実施形態では、本発明のiRNAのヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている。本発明の他の実施形態において、本発明のiRNAのヌクレオチドの全てが修飾ヌクレオチドである。「ヌクレオチドの実質的に全てが修飾されている」本発明のiRNAは、全てではないが、大部分が修飾されており、非修飾ヌクレオチドを5、4、3、2、または1個以下含み得る。

0131

本発明の一部の態様では、本発明のiRNAのヌクレオチドの実質的に全てが修飾されており、iRNA剤は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを10個以下含む(例えば、9個以下の2’−フルオロ修飾、8個以下の2’−フルオロ修飾、7個以下の2’−フルオロ修飾、6個以下の2’−フルオロ修飾、5個以下の2’−フルオロ修飾、4個以下の2’−フルオロ修飾、5個以下の2’−フルオロ修飾、4個以下の2’−フルオロ修飾、3個以下の2’−フルオロ修飾、または2個以下の2’−フルオロ修飾を含む)。例えば、一部の実施形態において、センス鎖は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを4個以下含む(例えば、3個以下の2’−フルオロ修飾、または2個以下の2’−フルオロ修飾を含む)。他の実施形態において、アンチセンス鎖は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを6個以下含む(例えば、5個以下の2’−フルオロ修飾、4個以下の2’−フルオロ修飾、4個以下の2’−フルオロ修飾、または2個以下の2’−フルオロ修飾を含む)。本発明の他の態様では、本発明のiRNAのヌクレオチドの全てが修飾されており、iRNA剤は、2’−フルオロ修飾を含むヌクレオチドを10個以下含む(例えば、9個以下の2’−フルオロ修飾、8個以下の2’−フルオロ修飾、7個以下の2’−フルオロ修飾、6個以下の2’−フルオロ修飾、5個以下の2’−フルオロ修飾、4個以下の2’−フルオロ修飾、5個以下の2’−フルオロ修飾、4個以下の2’−フルオロ修飾、3個以下の2’−フルオロ修飾、または2個以下の2’−フルオロ修飾を含む)。

0132

本発明で取り上げる核酸は、参照によって本明細書に援用する、“Current protocols in nucleic acid chemistry,”Beaucage,S.L.et al.(Edrs.),John Wiley & Sons,Inc.,New York,NY,USAに記載されるものなどの当該技術分野で確立された方法によって、合成および/または修飾し得る。例えば修飾としては、例えば5’末端修飾(リン酸化共役結合逆転結合)または3’末端修飾(共役結合、DNAヌクレオチド、逆転結合など)などの末端修飾;例えば安定化塩基での、不安定化塩基での、または拡大パートナーレパートリーと塩基対形成する塩基での置換、塩基除去(脱塩基ヌクレオチド)、または共役結合塩基などの塩基修飾糖修飾(例えば2’位または4’位における)または糖置換;リン酸ジエステル結合の修飾または置換をはじめとする主鎖修飾が挙げられる。本明細書に記載される実施形態で有用なiRNA化合物の特定の例としては、修飾主鎖を含有するRNA、または天然ヌクレオシド間結合を含有しないRNAが挙げられるが、これに限定されるものではない。修飾主鎖を有するRNAとしては、特に主鎖中にリン原子を有しないものが挙げられる。本明細書の目的では、そして当該技術分野で時に言及されるように、それらのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有しない修飾RNAもまた、オリゴヌクレオシドであると見なされる。いくつかの実施形態では、修飾iRNAは、そのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有する。

0133

修飾RNA主鎖としては、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホジチオエート、ホスホトリエステルアミノアルキルホスホトリエステル、3’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートをはじめとするメチルおよびその他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、3’−アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホルアミダートをはじめとするホスホロアミダート、チオノホスホルアミダート、チオノアキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびノルマル3’−5’結合、それらの2’−5’連結アナログを有するボラノホスフェート、および隣接するヌクレオシド単位対が3’−5’から5’−3’、または2’−5’から5’−2’に連結する、逆転極性を有するボラノホスフェートが挙げられる。様々な塩、混合塩、および遊離酸形態もまた挙げられる。

0134

上記リン含有結合の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第3,687,808号明細書;米国特許第4,469,863号明細書;米国特許第4,476,301号明細書;米国特許第5,023,243号明細書;米国特許第5,177,195号明細書;米国特許第5,188,897号明細書;米国特許第5,264,423号明細書;米国特許第5,276,019号明細書;米国特許第5,278,302号明細書;米国特許第5,286,717号明細書;米国特許第5,321,131号明細書;米国特許第5,399,676号明細書;米国特許第5,405,939号明細書;米国特許第5,453,496号明細書;米国特許第5,455,233号明細書;米国特許第5,466,677号明細書;米国特許第5,476,925号明細書;米国特許第5,519,126号明細書;米国特許第5,536,821号明細書;米国特許第5,541,316号明細書;米国特許第5,550,111号明細書;米国特許第5,563,253号明細書;米国特許第5,571,799号明細書;米国特許第5,587,361号明細書;米国特許第5,625,050号明細書;米国特許第6,028,188号明細書;米国特許第6,124,445号明細書;米国特許第6,160,109号明細書;米国特許第6,169,170号明細書;米国特許第6,172,209号明細書;米国特許第6、239,265号明細書;米国特許第6,277,603号明細書;米国特許第6,326,199号明細書;米国特許第6,346,614号明細書;米国特許第6,444,423号明細書;米国特許第6,531,590号明細書;米国特許第6,534,639号明細書;米国特許第6,608,035号明細書;米国特許第6,683,167号明細書;米国特許第6,858,715号明細書;米国特許第6,867,294号明細書;米国特許第6,878,805号明細書;米国特許第7,015,315号明細書;米国特許第7,041,816号明細書;米国特許第7,273,933号明細書;米国特許第7,321,029号明細書;および米国特許第RE39464号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。

0135

その中にリン原子を含まない修飾RNA主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1つまたは複数の短鎖ヘテロ原子または複素環式ヌクレオシド間結合によって形成された主鎖を有する。これらとしては、モルホリノ結合(一部はヌクレオシドの糖部分から形成される);シロキサン主鎖スルフィドスルホキシドおよびスルホン主鎖;ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖;メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル主鎖;アルケン含有主鎖;スルファメート主鎖;メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ主鎖;スルホネートおよびスルホンアミド主鎖;アミド主鎖を有するもの;および混合N、O、S、およびCH2構成成分を有するその他のものが挙げられる。

0136

上記オリゴヌクレオシドの調製を教示する、代表的な米国特許としては、その全体がそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用される、米国特許第5,034,506号明細書;米国特許第5,166,315;5,185,444号明細書;米国特許第5,214,134号明細書;米国特許第5,216,141号明細書;米国特許第5,235,033号明細書;米国特許第5,64,562号明細書;米国特許第5,264,564号明細書;米国特許第5,405,938号明細書;米国特許第5,434,257号明細書;米国特許第5,466,677号明細書;米国特許第5,470,967号明細書;米国特許第5,489,677号明細書;米国特許第5,541,307号明細書;米国特許第5,561,225号明細書;米国特許第5,596,086号明細書;米国特許第5,602,240号明細書;米国特許第5,608,046号明細書;米国特許第5,610,289号明細書;米国特許第5,618,704号明細書;米国特許第5,623,070号明細書;米国特許第5,663,312号明細書;米国特許第5,633,360号明細書;米国特許第5,677,437号明細書;および米国特許第5,677,439号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。

0137

別の実施形態では、適切なRNA模倣物がiRNA中での使用のために検討され、その中では、糖およびヌクレオシド間結合の双方、すなわち、ヌクレオチド単位骨格が、新しいグループで置換されている。塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このような1つのオリゴマー化合物であり、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているRNA模倣体は、ペプチド核酸(PNA)と称される。PNA化合物中では、RNAの糖主鎖が、アミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖で置換されている。核酸塩基は保持されて、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子と直接または間接的に結合する。PNA化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、そのそれぞれの内容全体を参照によって本明細書に援用する、米国特許第5,539,082号明細書;米国特許第5,714,331号明細書;および米国特許第5,719,262号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに本発明のiRNA中で使用するのに適するPNA化合物は、例えばNielsen et al.,Science,1991,254,1497−1500に記載される。

0138

本発明で取り上げるいくつかの実施形態は、ホスホロチオエート主鎖があるRNA、および特に先述の米国特許第5,489,677号明細書の−−CH2−−NH−−CH2−、−−CH2−−N(CH3)−−O−−CH2−−[メチレン(メチルイミノ)またはMMI主鎖として知られている]、−−CH2−−O−−N(CH3)−−CH2−−、−−CH2−−N(CH3)−−N(CH3)−−CH2−−、および−−N(CH3)−−CH2−−CH2−−[天然リン酸ジエステル主鎖は−−O−−P−−O−−CH2−−として表される]であるヘテロ原子主鎖がある、および先述の米国特許第5,602,240号明細書のアミド主鎖がある、オリゴヌクレオシドとを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で取り上げるRNAは、先述の米国特許第5,034,506号明細書のモルホリノ主鎖構造を有する。

0139

修飾RNAはまた、1つまたは複数の置換糖部分を含有し得る。例えば本明細書で取り上げるdsRNAなどのiRNAは、2’位に、OH;F;O−、S−、またはN−アルキル;O−、S−、またはN−アルケニル;O−、S−、またはN−アルキニル;またはO−アルキル−O−アルキルの1つを含み得て、アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換C1〜C10アルキル、またはC2〜C10アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な適切な修飾としては、O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2、およびO(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2(式中、nおよびmは1〜約10である)が挙げられる。別の実施形態では、dsRNAは、2’位に以下の1つを含む:C1〜C10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリールアラルキル、O−アルカリールまたはO−アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキルヘテロシクロアルカアリールアミノアルキルアミノポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA切断基、レポーター基介入物、iRNAの薬物動態特性を改善する基、またはiRNAの薬力学的特性を改善する基、および同様の特性を有するその他の置換基。いくつかの実施形態では、修飾は、2’−メトキシエトキシ(2’−O−CH2CH2OCH3、2’−O−(2−メトキシエチル)または2’−MOEとしてもまた知られている)(Martin et al.,Helv.Chim.Acta,1995,78:486−504)、すなわちアルコキシアルコキシ基を含む。別の例示的な修飾は、以下に本明細書の実施例で記載されるように、2’−DMAOEとしてもまた知られている、2’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちO(CH2)2ON(CH3)2基、および、2’−ジメチルアミノエトキシエトキシ(当該技術分野で2’−O−ジメチルアミノエトキシエチルまたは2’−DMAEOEとしても公知である)、すなわち2’−O−CH2−O−CH2−N(CH2)2である。

0140

その他の修飾としては、2’−メトキシ(2’−OCH3)、2’−アミノプロポキシ(2’−OCH2CH2CH2NH2)、および2’−フルオロ(2’−F)が挙げられる。同様の修飾はまた、具体的には3’末端ヌクレオチド上の糖の3’位、または2’−5’結合dsRNA中、および5’末端ヌクレオチドの5’位など、iRNAのRNA上のその他の位置でも行い得る。iRNAはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。上記修飾糖構造の調製を教示する、代表的な米国特許としては、特定のものは本出願と所有者が共通である、米国特許第4,981,957号明細書;米国特許第5,118,800号明細書;米国特許第5,319,080号明細書;米国特許第5,359,044号明細書;米国特許第5,393,878号明細書;米国特許第5,446,137号明細書;米国特許第5,466,786号明細書;米国特許第5,514,785号明細書;米国特許第5,519,134号明細書;米国特許第5,567,811号明細書;米国特許第5,576,427号明細書;米国特許第5,591,722号明細書;米国特許第5,597,909号明細書;米国特許第5,610,300号明細書;米国特許第5,627,053号明細書;米国特許第5,639,873号明細書;米国特許第5,646,265号明細書;米国特許第5,658,873号明細書;米国特許第5,670,633号明細書;および米国特許第5,700,920号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。上記のそれぞれの内容全体を参照によって本明細書によりここに援用する。

0141

iRNAはまた、核酸塩基(当該技術分野では単に「塩基」と称されることが多い)修飾または置換を含み得る。本明細書の用法では、「未修飾」または「天然」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン(A)およびグアニン(G)、およびピリミジン塩基チミン(T)、シトシン(C)およびウラシル(U)が挙げられる。修飾核酸塩基としては、デオキシ−チミン(dT)、5−メチルシトシン(5−me−C);5−ヒドロキシメチルシトシンキサンチンヒポキサンチン;2−アミノアデニン;アデニンおよびグアニンの6−メチルおよびその他のアルキル誘導体;アデニンおよびグアニンの2−プロピルおよびその他のアルキル誘導体;2−チオウラシル、2−チオチミンおよび2−チオシトシン;5−ハロウラシルおよびシトシン;5−プロピニルウラシルおよびシトシン;6−アゾウシル、シトシン、およびチミン;5−ウラシル(プソイドウラシル);4−チオウラシル;8−ハロ、8−アミノ、8−チオール、8−チオアルキル、8−ヒドロキシルおよびその他の8置換アデニンおよびグアニン;5−ハロ、具体的には5−ブロモ、5−トリフルオロメチル、およびその他の5置換ウラシルおよびシトシン;7−メチルグアニンおよび7−メチルアデニン8−アザグアニンおよび8−アザアデニン;7−デアザグアニンおよび7−ダアザアデニン(daazaadenine);および3−デアザグアニンおよび3−デアザアデニンなどのその他の合成および天然核酸塩基が挙げられる。さらに核酸塩基としては、米国特許第3,687,808号明細書で開示されるもの、Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.ed.Wiley−VCH,2008で開示されるもの;The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,pages 858−859,Kroschwitz,J.L,ed.John Wiley & Sons,1990で開示されるもの、Englisch et al.,Angewandte Chemie,International Edition,1991,30,613によって開示されるもの、およびSanghvi,Y S.,Chapter 15,dsRNA Research and Applications,pages 289−302,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Ed.,CRCPress, 1993によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基のいくつかは、本発明で取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大させるのに特に有用である。これらとしては、2−アミノプロピルアデニン、5−プロピニルウラシル、および5−プロピニルシトシンをはじめとする、5−置換ピリミジン、6−アザピリミジン、およびN−2、N−6および0−6置換プリンが挙げられる。5−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を0.6〜1.2℃増大させることが示されており(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.and Lebleu,B.,Eds.,dsRNA Research and Applications,CRC Press,Boca Raton,1993,pp.276−278)、模範的な塩基置換であり、なおもより特に、2’−O−メトキシエチル糖修飾と組み合わされた場合にそうである。

0142

上記の特定の修飾核酸塩基ならびにその他の修飾核酸塩基の調製を教示する、代表的な米国特許としては、その内容全体をそれぞれ参照によって本明細書によりここに援用する、上記の米国特許第3,687,808号明細書、米国特許第4,845,205号明細書;米国特許第5,130,30号明細書;米国特許第5,134,066号明細書;米国特許第5,175,273号明細書;米国特許第5,367,066号明細書;米国特許第5,432,272号明細書;米国特許第5,457,187号明細書;米国特許第5,459,255号明細書;米国特許第5,484,908号明細書;米国特許第5,502,177号明細書;米国特許第5,525,711号明細書;米国特許第5,552,540号明細書;米国特許第5,587,469号明細書;米国特許第5,594,121、5,596,091号明細書;米国特許第5,614,617号明細書;米国特許第5,681,941号明細書;米国特許第5,750,692号明細書;米国特許第6,015,886号明細書;米国特許第6,147,200号明細書;米国特許第6,166,197号明細書;米国特許第6,222,025号明細書;米国特許第6,235,887号明細書;米国特許第6,380,368号明細書;米国特許第6,528,640号明細書;米国特許第6,639,062号明細書;米国特許第6,617,438号明細書;米国特許第7,045,610号明細書;米国特許第7,427,672号明細書;および米国特許第7,495,088号明細書が挙げられるが、これに限定されるものではない。

0143

iRNAのRNAはまた、1つ以上の二環式糖部分を含むように修飾されていてもよい。「二環式糖」は、2つの原子の架橋によって修飾されたフラノシル環である。「二環式ヌクレオシド」(「BNA」)は、糖環の2つの炭素原子を結び付ける架橋を含む糖部分を有し、それによって二環式の環系を形成するヌクレオシドである。特定の実施形態において、架橋は糖環の4’−炭素と2’−炭素とを結び付ける。したがって、一部の実施形態において本発明の薬剤は、1つ以上のロックド核酸(LNA)を含み得る。ロックド核酸は、リボース部分が2’および4’炭素を結び付けるさらなる架橋を含む修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。換言すれば、LNAは、4’−CH2−O−2’架橋を含む二環式糖部分を含むヌクレオチドである。この構造は、3’末端構造コンホメーションにおいてリボースを有効に「ロック」する。siRNAにロックド核酸を加えると、血清中のsiRNA安定性が増加し、かつオフターゲット効果が低下することが示されている(Elmen,J.et al.,(2005)Nucleic AcidsResearch 33(1):439−447;Mook,OR.et al.,(2007)Mol Canc Ther 6(3):833−843;Grunweller,A.et al.,(2003)Nucleic Acids Research 31(12):3185−3193)。本発明のポリヌクレオチドに使用される二環式ヌクレオシドの例としては、限定なしに、4’および2’リボシル環原子間に架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態において、本発明のアンチセンスポリヌクレオチド剤は、4’−2’架橋を含む1つ以上の二環式ヌクレオシドを含む。かかる4’−2’架橋二環式ヌクレオシドの例としては、限定はされないが、4’−(CH2)−O−2’(LNA);4’−(CH2)−S−2’;4’−(CH2)2−O−2’(ENA);4’−CH(CH3)−O−2’(「拘束エチル」または「cEt」とも称される)および4’−CH(CH2OCH3)−O−2’(およびその類似体;例えば、米国特許第7,399,845号明細書を参照);4’−C(CH3)(CH3)−O−2’(およびその類似体;例えば、米国特許第8,278,283号明細書を参照);4’−CH2−N(OCH3)−2’(およびその類似体;例えば、米国特許第8,278,425号明細書を参照);4’−CH2−O−N(CH3)−2’(例えば、米国特許出願公開第2004/0171570号明細書を参照);4’−CH2−N(R)−O−2’[式中、Rは、H、C1〜C12アルキル、または保護基である](例えば、米国特許第7,427,672号明細書を参照);4’−CH2−C(H)(CH3)−2’(例えば、Chattopadhyaya et al.,J.Org.Chem.,2009,74,118−134を参照);および4’−CH2−C(=CH2)−2’(およびその類似体;例えば、米国特許第8,278,426号明細書を参照)が挙げられる。前述の各々の内容は全て、本明細書によって参照により本明細書に援用される。

0144

ロックド核酸ヌクレオチドの調製について教示するさらなる代表的な米国特許および米国特許出願公開としては、限定はされないが、以下:米国特許第6,268,490号明細書;米国特許第6,525,191号明細書;米国特許第6,670,461号明細書;米国特許第6,770,748号明細書;米国特許第6,794,499号明細書;米国特許第6,998,484号明細書;米国特許第7,053,207号明細書;米国特許第7,034,133号明細書;米国特許第7,084,125号明細書;米国特許第7,399,845号明細書;米国特許第7,427,672号明細書;米国特許第7,569,686号明細書;米国特許第7,741,457号明細書;米国特許第8,022,193号明細書;米国特許第8,030,467号明細書;米国特許第8,278,425号明細書;米国特許第8,278,426号明細書;米国特許第8,278,283号明細書;米国特許出願公開第2008/0039618号明細書;および米国特許出願公開第2009/0012281号明細書(その各々の内容全体が、本明細書によって参照により本明細書に援用される)が挙げられる。

0145

前述の二環式ヌクレオシドのいずれも、例えばα−L−リボフラノースおよびβ−D−リボフラノースを含む1つ以上の立体化学的糖配置を有するように調製することができる(国際公開第99/14226号パンフレットを参照)。

0146

iRNAのRNAはまた、1つ以上の拘束エチルヌクレオチドを含むように修飾されてもよい。本明細書で使用されるとき、「拘束エチルヌクレオチド」または「cEt」は、4’−CH(CH3)−0−2’架橋を含む二環式糖部分を含むロックド核酸である。一実施形態において、拘束エチルヌクレオチドは、本明細書において「S−cEt」と称されるS配置である。

0147

本発明のiRNAはまた、1つ以上の「配座固定ヌクレオチド」(「CRN」)も含み得る。CRNは、リボースのC2’およびC4’炭素またはリボースのC3および−C5’炭素を結び付けるリンカーを有するヌクレオチド類似体である。CRNはリボース環を安定した配置に固定し、mRNAに対するハイブリダイゼーション親和性を増加させる。リンカーは、酸素を安定性および親和性に関して最適な位置に置くのに十分な長さであり、リボース環のパッカリングが少なくなる。

0148

上述のCRNの幾つかの調製について教示する代表的な文献としては、限定はされないが、米国特許出願公開第2013/0190383号明細書;および国際公開第2013/036868号パンフレット(これらの各々の内容全体が、本明細書によって参照により本明細書に援用される)が挙げられる。

0149

本発明のiRNAのヌクレオチドの1つ以上はまた、ヒドロキシメチル置換ヌクレオチドも含み得る。「ヒドロキシメチル置換ヌクレオチド」は、非環式2’−3’−seco−ヌクレオチドであり、「アンロックド核酸」(「UNA」)修飾とも称される。

0150

UNAの調製について教示する代表的な米国公報としては、限定はされないが、米国特許第8,314,227号明細書;および米国特許出願公開第2013/0096289号明細書;米国特許第2013/0011922号明細書;および米国特許第2011/0313020号明細書(これらの各々の内容全体が、本明細書によって参照により本明細書に援用される)が挙げられる。

0151

RNA分子末端に対する潜在的安定化修飾としては、N−(アセチルアミノカプロイル)−4−ヒドロキシプロリノール(Hyp−C6−NHAc)、N−(カプロイル−4−ヒドロキシプロリノール(Hyp−C6)、N−(アセチル−4−ヒドロキシプロリノール(Hyp−NHAc)、チミジン−2’−0−デオキシチミジン(エーテル)、N−(アミノカプロイル)−4−ヒドロキシプロリノール(Hyp−C6−アミノ)、2−ドコサノイル−ウリジン−3”−リン酸、逆転塩基dT(idT)などが挙げられる。この修飾の開示は、国際公開第2011/005861号パンフレットにある。

0152

A.本発明のモチーフを含む修飾iRNA
本発明の特定の態様では、本発明の二本鎖RNAi剤は、例えば、2012年11月16日に出願された国際公開第2013/075035号パンフレット(この内容は全て、参照により本明細書に援用される)に開示されるとおりの化学修飾を有する薬剤を含む。本明細書および国際公開第2013/075035号パンフレットに示されるとおり、RNAi剤のセンス鎖および/またはアンチセンス鎖に、特に切断部位またはその近傍へと3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾のモチーフを1つ以上導入することにより、優れた結果が得られ得る。一部の実施形態において、RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、他の場合には完全に修飾されていてもよい。これらのモチーフの導入は、存在する場合には、センス鎖および/またはアンチセンス鎖の修飾パターン分断する。RNAi剤は、任意選択で、例えばセンス鎖上でGalNAc誘導体リガンドと共役してもよい。得られるRNAi剤は優れた遺伝子サイレンシング活性を呈する。

0153

より具体的には、意外にも、RNAi剤の少なくとも一方の鎖の切断部位またはその近傍における3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾のモチーフを1つ以上有するように二本鎖RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖を完全に修飾すると、RNAi剤の遺伝子サイレンシング活性が優位に増強されたことが見出されている。

0154

したがって、本発明は、インビボで標的遺伝子(すなわち、アポリポタンパク質C3(APOC3)遺伝子)の発現の阻害能を有する二本鎖RNAi剤を提供する。このRNAi剤はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む。RNAi剤の各鎖は12〜30ヌクレオチド長であってもよい。例えば、各鎖は、14〜30ヌクレオチド長、17〜30ヌクレオチド長、25〜30ヌクレオチド長、27〜30ヌクレオチド長、17〜23ヌクレオチド長、17〜21ヌクレオチド長、17〜19ヌクレオチド長、19〜25ヌクレオチド長、19〜23ヌクレオチド長、19〜21ヌクレオチド長、21〜25ヌクレオチド長、または21〜23ヌクレオチド長であってもよい。

0155

センス鎖およびアンチセンス鎖は、典型的には、本明細書では「RNAi剤」とも称される二重鎖の二本鎖RNA(「dsRNA」)を形成する。RNAi剤の二重鎖領域は12〜30ヌクレオチド対長であってもよい。例えば、二重鎖領域は、14〜30ヌクレオチド対長、17〜30ヌクレオチド対長、27〜30ヌクレオチド対長、17〜23ヌクレオチド対長、17〜21ヌクレオチド対長、17〜19ヌクレオチド対長、19〜25ヌクレオチド対長、19〜23ヌクレオチド対長、19〜21ヌクレオチド対長、21〜25ヌクレオチド対長、または21〜23ヌクレオチド対長であり得る。別の例において、二重鎖領域は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、および27ヌクレオチド長から選択される。

0156

一実施形態において、RNAi剤は、一方または両方の鎖の3’末端、5’末端、または両方の末端に1つ以上のオーバーハング領域および/またはキャッピング基を含み得る。オーバーハングは、1〜6ヌクレオチド長、例えば、2〜6ヌクレオチド長、1〜5ヌクレオチド長、2〜5ヌクレオチド長、1〜4ヌクレオチド長、2〜4ヌクレオチド長、1〜3ヌクレオチド長、2〜3ヌクレオチド長、または1〜2ヌクレオチド長であり得る。オーバーハングは、一方の鎖が他方より長い結果、または同じ長さの2本の鎖がずれている結果であり得る。オーバーハングは標的mRNAとのミスマッチを形成し得るか、またはオーバーハングは標的とする遺伝子配列と相補的であり得るか、または別の配列であり得る。第1および第2の鎖はまた、例えばヘアピンを形成するように追加的な塩基によるか、または他の非塩基リンカーによってつなぎ合わされてもよい。

0157

一実施形態において、RNAi剤のオーバーハング領域にあるヌクレオチドは、各々独立して、限定はされないが、2’−糖修飾、例えば、2−F、2’−Oメチル、チミジン(T)、2’−O−メトキシエチル−5−メチルウリジン(Teo)、2’−O−メトキシエチルアデノシン(Aeo)、2’−O−メトキシエチル−5−メチルシチジン(m5Ceo)、およびこれらの任意の組み合わせを含めた、修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドであり得る。例えば、TTは、いずれかの鎖のいずれかの末端のオーバーハング配列であり得る。オーバーハングは標的mRNAとのミスマッチを形成し得るか、またはオーバーハングは標的とする遺伝子配列と相補的であり得るか、または別の配列であり得る。

0158

RNAi剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の5’−または3’−オーバーハングはリン酸化されていてもよい。一部の実施形態において、1つまたは複数のオーバーハング領域は、間にホスホロチオエートを有する2つのヌクレオチドを含み、ここで2つのヌクレオチドは同じであっても、または異なってもよい。一実施形態において、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖の3’末端に存在する。一実施形態において、この3’−オーバーハングはアンチセンス鎖に存在する。一実施形態において、この3’−オーバーハングはセンス鎖に存在する。

0159

RNAi剤は、単一のオーバーハングのみを含有してもよく、これにより、その全体的な安定性に影響が及ぶことなくRNAiの干渉活性を強化し得る。例えば、この一本鎖オーバーハングはセンス鎖の3’末端端部に位置しても、あるいはアンチセンス鎖の3’末端端部に位置してもよい。RNAiはまた、アンチセンス鎖の5’末端(またはセンス鎖の3’末端)に位置するか、またはその逆の、平滑末端を有してもよい。概して、RNAiのアンチセンス鎖は3’末端にヌクレオチドオーバーハングを有し、5’末端は平滑末端である。理論によって拘束されることを望むものではないが、非対称であるアンチセンス鎖の5’末端の平滑末端およびアンチセンス鎖の3’末端オーバーハングは、RISCプロセスにロードするガイド鎖に有利である。

0160

一実施形態において、RNAi剤は19ヌクレオチド長の両端ブラントマー(bluntmer)であり、ここでセンス鎖は、5’末端から7、8、9位の3連続ヌクレオチド上の3つの2’−F修飾のモチーフを少なくとも1つ含有する。アンチセンス鎖は、5’末端から11、12、13位の3連続ヌクレオチド上の3つの2’−O−メチル修飾のモチーフを少なくとも1つ含有する。

0161

別の実施形態において、RNAi剤は20ヌクレオチド長の両端ブラントマーであり、ここでセンス鎖は、5’末端から8、9、10位の3連続ヌクレオチド上の3つの2’−F修飾のモチーフを少なくとも1つ含有する。アンチセンス鎖は、5’末端から11、12、13位の3連続ヌクレオチド上の2’−O−メチル修飾のモチーフを少なくとも1つ含有する。

0162

さらに別の実施形態において、RNAi剤は21ヌクレオチド長の両端ブラントマーであり、ここでセンス鎖は、5’末端から9、10、11位の3連続ヌクレオチド上の3つの2’−F修飾のモチーフを少なくとも1つ含有する。アンチセンス鎖は、5’末端から11、12、13位の3連続ヌクレオチド上の3つの2’−O−メチル修飾のモチーフを少なくとも1つ含有する。

0163

一実施形態において、RNAi剤は21ヌクレオチドセンス鎖および23ヌクレオチドアンチセンス鎖を含み、ここでセンス鎖は、5’末端から9、10、11位の3連続ヌクレオチド上の3つの2’−F修飾のモチーフを少なくとも1つ含有し;アンチセンス鎖は、5’末端から11、12、13位の3連続ヌクレオチド上の3つの2’−O−メチル修飾のモチーフを少なくとも1つ含有し、ここではRNAi剤の一方の端部が平滑末端であり、他方の端部が2ヌクレオチドオーバーハングを含む。好ましくは、この2ヌクレオチドオーバーハングはアンチセンス鎖の3’末端にある。

0164

2ヌクレオチドオーバーハングがアンチセンス鎖の3’末端にある場合、末端3ヌクレオチドの間に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合があってもよく、ここでこの3ヌクレオチドのうちの2つはオーバーハングヌクレオチドであり、第3のヌクレオチドはオーバーハングヌクレオチドに隣接した対合ヌクレオチドである。一実施形態において、RNAi剤は、さらに、センス鎖の5’末端およびアンチセンス鎖の5’末端の両方の末端3ヌクレオチドの間に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を有する。一実施形態では、モチーフの一部であるヌクレオチドを含めた、RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のあらゆるヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドである。一実施形態では、各残基が、独立に、2’−O−メチルまたは3’−フルオロによって例えば交互モチーフで修飾される。任意選択で、RNAi剤はリガンド(好ましくはGalNAc3)をさらに含む。

0165

一実施形態において、RNAi剤はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、ここでセンス鎖は25〜30ヌクレオチド残基長であり、5’末端ヌクレオチド(1位)を始端として第1の鎖の1〜23位が少なくとも8リボヌクレオチドを含み;アンチセンス鎖は36〜66ヌクレオチド残基長であり、3’末端ヌクレオチドを始端として、センス鎖の1〜23位と対合する位置に少なくとも8リボヌクレオチドを含んで二重鎖を形成する;ここでアンチセンス鎖の少なくとも3’末端ヌクレオチドはセンス鎖と対合せず、および最大6連続3’末端ヌクレオチドがセンス鎖と対合せず、それによって1〜6ヌクレオチドの3’一本鎖オーバーハングを形成する;アンチセンス鎖の5’末端は10〜30連続ヌクレオチドを含み、これらはセンス鎖と対合せず、それによって10〜30ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成する;センス鎖およびアンチセンス鎖が最大の相補性となるように整列したとき、少なくともセンス鎖5’末端および3’末端ヌクレオチドはアンチセンス鎖のヌクレオチドと塩基対合し、それによってセンス鎖とアンチセンス鎖との間に実質的に二重鎖の領域を形成する;およびアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖長さの少なくとも19リボヌクレオチドに沿って標的RNAと十分に相補的であり、哺乳類細胞にこの二本鎖核酸が導入されたとき標的遺伝子発現を低減する;およびセンス鎖は、3連続ヌクレオチド上の3つの2’−F修飾のモチーフを少なくとも1つ含有し、ここでこれらのモチーフの少なくとも1つは切断部位またはその近傍に存在する。アンチセンス鎖は、切断部位またはその近傍の3連続ヌクレオチド上の3つの2’−O−メチル修飾のモチーフを少なくとも1つ含有する。

0166

一実施形態において、RNAi剤はセンス鎖とアンチセンス鎖とを含み、ここでRNAi剤は、25ヌクレオチド以上29ヌクレオチド以下の長さを有する第1の鎖と、5’末端から11、12、13位の3連続ヌクレオチド上の3つの2’−O−メチル修飾のモチーフを少なくとも1つ有する30ヌクレオチド以下の長さを有する第2の鎖とを含み;ここで第1の鎖の3’末端と第2の鎖の5’末端とは平滑末端を形成し、第2の鎖はその3’末端で第1の鎖よりも1〜4ヌクレオチド長く、二重鎖領域は少なくとも25ヌクレオチド長であり、および第2の鎖は第2の鎖長さの少なくとも19ヌクレオチドに沿って標的mRNAと十分に相補的であり、哺乳類細胞にこのRNAi剤が導入されたとき標的遺伝子発現を低減し、およびRNAi剤のダイサー切断は第2の鎖の3’末端を含むsiRNAを優先的にもたらし、それによって哺乳動物における標的遺伝子の発現を低減する。任意選択で、RNAi剤はリガンドをさらに含む。

0167

一実施形態において、RNAi剤のセンス鎖は、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾のモチーフを少なくとも1つ含有し、これらのモチーフのうちの1つはセンス鎖の切断部位に存在する。

0168

一実施形態において、RNAi剤のアンチセンス鎖もまた、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾のモチーフを少なくとも1つ含有することができ、ここでこれらのモチーフのうちの1つはアンチセンス鎖の切断部位またはその近傍に存在する。

0169

17〜23ヌクレオチド長の二重鎖領域を有するRNAi剤について、アンチセンス鎖の切断部位は、典型的には5’末端から約10、11および12位にある。したがって3つの同一の修飾のモチーフは、アンチセンス鎖の9、10、11位;10、11、12位;11、12、13位;12、13、14位;または13、14、15位に存在し得る(カウントはアンチセンス鎖の5’末端から1番目のヌクレオチドから始めるか、またはカウントはアンチセンス鎖の二重鎖領域内における5’末端から1番目の対合ヌクレオチドから始める)。アンチセンス鎖の切断部位はまた、5’末端からのRNAiの二重鎖領域の長さによっても変化し得る。

0170

RNAi剤のセンス鎖は、鎖の切断部位にある3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾のモチーフを少なくとも1つ含有し得る;およびアンチセンス鎖は、鎖の切断部位またはその近傍の3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾のモチーフを少なくとも1つ有し得る。センス鎖およびアンチセンス鎖がdsRNA二重鎖を形成する場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、センス鎖上の3つのヌクレオチドの1つのモチーフおよびアンチセンス鎖上の3つのヌクレオチドの1つのモチーフが少なくとも1ヌクレオチドのオーバーラップを有する、すなわち、センス鎖内のモチーフの3つのヌクレオチドのうちの少なくとも1つがアンチセンス鎖内のモチーフの3つのヌクレオチドのうちの少なくとも1つと塩基対を形成するように整列し得る。あるいは、少なくとも2つのヌクレオチド、または3つ全てのヌクレオチドがオーバーラップしてもよい。

0171

一実施形態において、RNAi剤のセンス鎖は、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾のモチーフを2つ以上含有し得る。第1のモチーフは鎖の切断部位またはその近傍に存在してもよく、他のモチーフはウィング修飾であり得る。用語「ウィング修飾」は、本明細書では、同じ鎖の切断部位またはその近傍にあるモチーフから隔てられている鎖の別の部分に存在するモチーフを指す。ウィング修飾は、第1のモチーフに隣接するか、あるいは少なくとも1ヌクレオチド以上隔てられているかのいずれかである。モチーフが互いに直ちに隣接している場合、モチーフの化学は互いに異なり、モチーフが1ヌクレオチド以上隔てられている場合、それらの化学は同じまたは異なってもよい。2つ以上のウィング修飾が存在してもよい。例えば、2つのウィング修飾が存在する場合、各ウィング修飾は、切断部位またはその近傍にある第1のモチーフに対して片側に存在し得るか、またはリードモチーフの両側に存在し得る。

0172

センス鎖と同様に、RNAi剤のアンチセンス鎖は、3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾のモチーフを2つ以上含有してもよく、それらのモチーフのうちの少なくとも1つは鎖の切断部位またはその近傍に存在し得る。このアンチセンス鎖はまた、センス鎖上に存在し得るウィング修飾と同様に整列して1つ以上のウィング修飾も含有し得る。

0173

一実施形態において、RNAi剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウィング修飾は、典型的には、鎖の3’末端、5’末端または両方の末端における最初の1つまたは2つの末端ヌクレオチドを含まない。

0174

別の実施形態において、RNAi剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖上のウィング修飾は、典型的には、鎖の3’末端、5’末端または両方の末端にある二重鎖領域内の最初の1つまたは2つの対合ヌクレオチドを含まない。

0175

RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、各々、少なくとも1つのウィング修飾を含有する場合、それらのウィング修飾は二重鎖領域の同じ末端に位置して、1、2または3ヌクレオチドのオーバーラップを有し得る。

0176

RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖が、各々、少なくとも2つのウィング修飾を含有する場合、センス鎖およびアンチセンス鎖は、各々1つの鎖からの2つの修飾が二重鎖領域の一方の末端に位置して、1、2または3ヌクレオチドのオーバーラップを有する;各々1つの鎖からの2つの修飾が二重鎖領域の他方の末端に位置して、1、2または3ヌクレオチドのオーバーラップを有する;2つの修飾1つの鎖がリードモチーフの両側に位置して、二重鎖領域に1、2または3ヌクレオチドのオーバーラップを有するように整列してもよい。

0177

一実施形態において、モチーフの一部であるヌクレオチドを含めた、RNAi剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖のあらゆるヌクレオチドが修飾されていてもよい。各ヌクレオチドは、非結合リン酸酸素および/または結合リン酸酸素の1つ以上の一方または両方の1つ以上の改変;リボース糖の構成要素、例えばリボース糖上の2’ヒドロキシルの改変;「デホスホ」リンカーによるリン酸部分の大規模置換;天然に存在する塩基の修飾または置換;およびリボースリン酸骨格の置換または修飾を含み得る同じまたは異なる修飾によって修飾されていてもよい。

0178

核酸はサブユニットポリマーであるため、修飾の多くが、核酸内で繰り返される位置に存在し、例えば、塩基、またはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合Oの修飾である。場合によっては、修飾は核酸内の対象位置の全てに存在し得るが、多くの場合にそうではない。例として、修飾は3’または5’末端位置にのみ存在してもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の2、3、4、5、または10ヌクレオチドに存在するのみであってもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方に存在し得る。修飾は、RNAの二本鎖領域にのみ存在してもよく、またはRNAの一本鎖領域にのみ存在してもよい。例えば、非結合O位置にあるホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端に存在するのみであってもよく、末端領域、例えば、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の2、3、4、5、または10ヌクレオチドに存在するのみであってもよく、または二本鎖および一本鎖領域、特に末端に存在してもよい。1つまたは複数の5’末端がリン酸化されてもよい。

0179

例えば安定性を増強するため、オーバーハングに特定の塩基を含めるか、または一本鎖オーバーハング、例えば5’または3’オーバーハング、または両方に修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドサロゲートを含めることが可能であり得る。例えば、オーバーハングにプリンヌクレオチドを含めることが望ましい場合もある。一部の実施形態において、3’または5’オーバーハング内のこれらの塩基の全てまたは一部が、例えば本明細書に記載される修飾によって修飾されていてもよい。修飾には、当該技術分野において公知の修飾、例えば核酸塩基のリボ糖の代わりに修飾されたデオキシリボヌクレオチド、2’−デオキシ−2’−フルオロ(2’−F)または2’−O−メチルの使用によるリボース糖の2’位における修飾、およびリン酸基における修飾、例えばホスホロチオエート修飾の使用が含まれ得る。オーバーハングは標的配列と相同である必要はない。

0180

一実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、LNA、CRN、cET、UNA、HNA、CeNA、2’−メトキシエチル、2’−O−メチル、2’−O−アリル、2’−C−アリル、2’−デオキシ、2’−ヒドロキシル、または2’−フルオロで修飾される。鎖は2つ以上の修飾を含有し得る。一実施形態において、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、2’−O−メチルまたは2’−フルオロで修飾される。

0181

センス鎖およびアンチセンス鎖上には、少なくとも2つの異なる修飾が典型的には存在する。それらの2つの修飾は、2’−O−メチルまたは2’−フルオロ修飾などであってもよい。

0182

一実施形態において、Naおよび/またはNbは交互パターンの修飾を含む。用語「交互モチーフ」は、本明細書で使用されるとき、1つ以上の修飾を有するモチーフであって、各修飾が一方の鎖の交互のヌクレオチド上に存在するものを指す。交互ヌクレオチドは、1つおきに1つのヌクレオチドまたは3つおきに1つのヌクレオチド、または同様のパターンを指し得る。例えば、A、BおよびCの各々がヌクレオチドに対する1つのタイプの修飾を表す場合、交互モチーフは、「ABABABABABAB...」、「AABBAABBAABB...」、「AABAABAABAAB...」、「AAABAAABAAAB...」、「AAABBBAAABBB...」、または「ABCABCABCABC...」等であり得る。

0183

交互モチーフに含まれる修飾のタイプは同じであっても、または異なってもよい。例えば、A、B、C、Dの各々がヌクレオチド上の1つのタイプの修飾を表す場合、交互パターン、すなわち1つおきのヌクレオチド上の修飾は同じであってもよく、但しセンス鎖またはアンチセンス鎖の各々は、「ABABAB...」、「ACACAC...」、「BDBDBD...」または「CDCDCD...」など、交互モチーフ内で幾つか可能性のある修飾から選択され得る。

0184

一実施形態において、本発明のRNAi剤は、センス鎖上の交互モチーフの修飾パターンがアンチセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンに対してシフトしたものを含む。このシフトは、センス鎖のヌクレオチドの修飾された基がアンチセンス鎖のヌクレオチドの別様に修飾された基に対応するようなもの、およびその逆であり得る。例えば、dsRNA二重鎖においてセンス鎖がアンチセンス鎖と対合しているとき、二重鎖領域内においてセンス鎖の交互モチーフは鎖の5’−3’に「ABABAB」で始まってもよく、アンチセンス鎖の交互モチーフは鎖の5’−3’に「BABABA」で始まってもよい。別の例として、二重鎖領域内においてセンス鎖の交互モチーフは鎖の5’−3’に「AABBAABB」で始まってもよく、アンチセンス鎖(antisenese strand)の交互モチーフは鎖の5’−3’に「BBAABBAA」で始まってもよく、したがってセンス鎖とアンチセンス鎖との間に修飾パターンの完全なまたは部分的なシフトがある。

0185

一実施形態において、RNAi剤は、センス鎖上に2’−O−メチル修飾と2’−F修飾との交互モチーフのパターンを含み、これは、最初はアンチセンス鎖上の2’−O−メチル修飾と2’−F修飾との交互モチーフのパターンに対して最初はシフトを有し、すなわち、センス鎖上の2’−O−メチル修飾ヌクレオチドがアンチセンス鎖上の2’−F修飾ヌクレオチドと塩基対になる、およびその逆である。センス鎖の1位は2’−F修飾で始まってもよく、およびアンチセンス鎖の1位は2’−O−メチル修飾で始まってもよい。

0186

センス鎖および/またはアンチセンス鎖に対して3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾のモチーフを1つ以上導入すると、センス鎖および/またはアンチセンス鎖に存在する当初の修飾パターンが分断される。センスおよび/またはアンチセンス鎖に対して3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾のモチーフを1つ以上導入することによるセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の修飾パターンのこの分断は、意外にも、標的遺伝子に対する遺伝子サイレンシング活性を増強する。

0187

一実施形態において、これらの鎖のいずれかに対して3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾のモチーフが導入される場合、モチーフに隣接するヌクレオチドの修飾は、モチーフの修飾と異なる修飾である。例えば、モチーフを含有する配列の部分は「...NaYYYNb...」[式中、「Y」は3連続ヌクレオチド上の3つの同一の修飾のモチーフの修飾を表し、および「Na」および「Nb」は、モチーフ「YYY」に隣接したヌクレオチドに対する、Yの修飾と異なる修飾を表し、およびNaおよびNbは同じまたは異なる修飾であってもよい]である。あるいは、ウィング修飾が存在するときNaおよび/またはNbは存在しても、または存在しなくてもよい。

0188

RNAi剤は、少なくとも1つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合をさらに含み得る。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖または両方の鎖の、その鎖の任意の位置にある任意のヌクレオチド上に存在し得る。例えば、ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖および/またはアンチセンス鎖上のあらゆるヌクレオチドに存在し得る;各ヌクレオチド間結合修飾は、センス鎖および/またはアンチセンス鎖上に交互パターンで存在し得る;またはセンス鎖またはアンチセンス鎖は、両方ともにヌクレオチド間結合修飾を交互パターンで含有し得る。センス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンはアンチセンス鎖と同じであっても、または異なってもよく、センス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間結合修飾の交互パターンに対してシフトを有してもよい。一実施形態において、二本鎖(double−standed)RNAi剤は6〜8つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。一実施形態において、アンチセンス鎖は5’末端に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合および3’末端に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含み、センス鎖は5’末端または3’末端のいずれかに少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。

0189

一実施形態において、RNAiは、オーバーハング領域にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合を有する2つのヌクレオチドを含有し得る。ヌクレオチド間結合修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを二重鎖領域内の末端対合ヌクレオチドと連結するために作製されてもよい。例えば、少なくとも2、3、4つ、または全てのオーバーハングヌクレオチドが、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合を介して連結されてもよく、任意選択で、オーバーハングヌクレオチドをオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドと連結するさらなるホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合があってもよい。例えば、末端3つのヌクレオチドの間に少なくとも2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合があってもよく、これらの3つのヌクレオチドのうちの2つがオーバーハングヌクレオチドであり、第3のヌクレオチドがオーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。これらの末端3ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の3’末端、センス鎖の3’末端、アンチセンス鎖の5’末端、および/またはアンチセンス鎖の5’末端にあってもよい。

0190

一実施形態において、2ヌクレオチドオーバーハングはアンチセンス鎖の3’末端にあり、末端3ヌクレオチド間に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合があり、ここでこれらの3つのヌクレオチドのうちの2つはオーバーハングヌクレオチドであり、第3のヌクレオチドは、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドである。任意選択で、RNAi剤は、センス鎖の5’末端及びアンチセンス鎖の5’末端の両方における末端3ヌクレオチド間に2つのホスホロチオエートヌクレオチド間結合をさらに有し得る。

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