技術 節足動物の痕跡調査方法および液体回収器

0001

本発明は、植物に来訪した節足動物の痕跡を調査する方法およびそのために用いる液体回収器に関するものである。

0002

植物体上に存在する節足動物群集（植食者や捕食者など）の把握は農業的観点（害虫管理、有益昆虫の利用）や生物多様性の研究からも非常に重要である。これまで植物を利用する節足動物を調査するためには、植物上にいる対象生物を探し出して、目視で確認する必要があった。また、目視では同定できない微小生物、同定情報の少ない卵期や幼虫期は、捕まえて顕微鏡下で同定したり、成虫になるまで育ててから同定したりする必要があった。

0003

さらに同定には、良い状態（同定に重要な部位が壊れていない状況をいう）の対象個体を確保した上で、専門知識と熟練した同定技術が必要であるため、調査を行う人員を確保するのが難しい状況であった。

0004

例えば、特許文献１には、昆虫の生息地域特定方法が開示されているが、昆虫若しくは昆虫の一部を入手したうえで、ＤＮＡ解析を行っている。

0005

水域では生物から排出され、水中に残留したＤＮＡ（環境ＤＮＡ）を回収することで、その水域に生息する生物を特定する技術が発展している。この環境ＤＮＡ研究は、魚や両性類から始まって、そのアイデアをそのまま他の生物群に応用して発展してきている。

0006

例えば、特許文献２では、環境水試料をＤＮＡ分析する際に４級アンモニウム塩に接触させることで、環境水試料中の生物由来のＤＮＡの分解を抑制できる点の記載がある。

0007

特開２０１５−１５４７７２号公報
特開２０１７−０９９３７６号公報

0008

Ｌｅｒａｙ， Ｍ．， Ｙａｎｇ， Ｊ． Ｙ．， Ｍｅｙｅｒ， Ｃ． Ｐ．， Ｍｉｌｌｓ， Ｓ． Ｃ．， Ａｇｕｄｅｌｏ， Ｎ．， Ｒａｎｗｅｚ， Ｖ．， Ｂｏｅｈｍ， ＪＴ．， Ｍａｃｈｉｄａ， Ｒ． Ｊ． （２０１３）． Ａ ｎｅｗ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａ ｓｈｏｒｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ＣＯＩ ｒｅｇｉｏｎ ｆｏｒ ｍｅｔａｂａｒｃｏｄｉｎｇ ｍｅｔａｚｏａｎ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ ｃｏｒａｌ ｒｅｅｆ ｆｉｓｈ ｇｕｔ ｃｏｎｔｅｎｔｓ． Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｚｏｏｌｏｇｙ， １０（１）， １-１４． ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８６／１７４２−９９９４−１０−３４

0009

上記のように従来農作物に取りついている節足動物を特定するためには、節足動物自体を採取する必要があった。しかし、移動性の高いものや微小なものに関してはその場に存在するかどうかも明らかにできないほどであった。また、その場にいたか否かについては、対象の節足動物を採取していないので、調べることができなかった。

0010

また、水域での環境ＤＮＡから水域に生息する生物を特定する技術は、陸上の農作物に集まる節足動物に対しては、水域がないため適用することができない。

0011

本発明は上記の課題に鑑みて想到されたものであり、陸上の農地等に集まる節足動物の痕跡を調べる方法および使用具を提供するものである。

0012

より具体的に本発明に係る節足動物の痕跡調査方法は、
植物に水をかけ、前記植物に触れた前記水を試料水として回収する工程と、
前記試料水に対して特定のプライマーを用いて前記試料水中のＤＮＡを増幅する工程と、
前記増幅されたＤＮＡの塩基配列を決定する工程と、
前記決定された塩基配列を有する節足動物を特定する工程を有することを特徴とする。

0013

また、この調査方法に用いる使用具として、試料水を回収する液体回収器が提供される。具体的には、
植物にかけられた液体を回収する液体回収器であって、
一辺が突き合わせ辺となる底板と、
前記底板の突き合わせ辺以外の部分に設けられ、前記底板に対して略垂直に延設された側壁を有し、
前記突き合わせ辺には前記植物の茎に突き当てる切欠きが設けられた一対の回収部材で構成されることを特徴とする。

0014

本発明に係る節足動物の痕跡調査方法は、農作物を含め植物に対してＤＮＡ解析の際のノイズが含まれていない水をかけ、植物の表面を流れ落ちた水を試料水として回収し、その試料水中に含まれる節足動物の糞や唾液といった排出物、剥離した組織などに含まれるＤＮＡを増幅し、該当する節足動物を特定する。したがって、非常に簡単に調べることができる。

0015

また、調査の際にその場にいなくても、存在した痕跡から、痕跡を残した節足動物がその場に存在していたことを調べられる。したがって、移動速度が速く移動距離が長い節足動物であっても、在不在を調べることができる。このような調査ができることで、さまざまな節足動物の季節ごとの在不在判定が可能になり、害虫や益虫の管理に重要な情報を得ることができる。

0016

本発明に係る液体回収器の構成を示す図である。
液体回収器を使用する際の平面図（図２（ｂ））および側面図（図２（ａ））である。
液体回収器を植物に設置した状態を示す斜視図（図３（ａ））と、側面図（図３（ｂ））である。

0017

以下に本発明に係る節足動物の痕跡調査方法とそれに用いる液体回収器について図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。

0018

本発明に係る節足動物の痕跡調査方法は、対象とする植物にどのような節足動物が存在しているか、若しくは存在したかを調査する。したがって、調査対象植物および調査対象節足動物がある。

0019

調査対象植物は、特に限定されるものではないが、野菜（食用の草本植物）や食用果実をつける多年性植物などが好適に対象とされる。最も身近で調査をする効用も高いからである。しかし、食用に利用される以外のものであっても、環境管理の観点から調査対象植物とすることができる。

0020

調査対象節足動物としては、主として昆虫類、クモ類、ムカデ類であり、陸生の物である。甲殻類であっても陸生のワラジムシは調査対象としてよい。したがって、調査対象節足動物は、陸生の節足動物といってよい。なお、以下の説明では単に節足動物と呼ぶ。

0021

調査対象植物には水をかけ、流れ落ちた水を地面に落ちる前に回収する。水は、後に行うＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖反応）を行う際にノイズがでない若しくは無視できる程度に不純物の含まれていない水が好適に利用できる。

0022

水は調査対象植物に満遍なくかけるのが好適である。しかし、幹を持つような大きな樹木である場合は、特定の枝、若しくは特定の幹だけに水をかけて回収してもよい。植物に接触した後に回収された水は「試料水」と呼ぶ。試料水には、調査対象節足動物の糞や唾液といった分泌物や体の一部が含まれている。

0023

回収するには、水同様に、後のＰＣＲの際にノイズとなる物質が含まれないような容器に回収する。

0024

回収された試料水からＤＮＡを抽出精製後、プライマーと共にＰＣＲで増幅する。プライマーはアダプター配列を持ったユニバーサルプライマーを用いる。増幅されたＤＮＡにインデックス配列をＰＣＲで付加し、塩基配列を読み出す。なお、ＤＮＡの塩基配列の読出しは、サンガー法を用いた方法でも可能であるが、パイロシークエンス法を基本とする読出し手法を用いた所謂次世代シークエンサを用いるのが好適である。塩基配列を読み出す工程は塩基配列を決定する工程といってよい。

0025

読みだされた塩基配列は配列ごとに分類し、データベースに照らし合わせ、節足動物の種類を特定する。利用できるデータベースとしては、Ｃｌａｉｄｅｎｔソフトフェアーに内装されているａｎｉｍａｌｓ、ＣＯＸ１、ｇｅｎｕｓ、またはｓｅｍｉａｌｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｌａｉｄｅｎｔ．ｏｒｇ／）等が好適に利用できる。

0026

図１には、本発明に係る節足動物の痕跡調査方法に好適に利用することのできる、液体回収器を示す。液体回収器１は、ほぼ同形の回収部材１０が一対で構成されている。回収部材１０ａ、１０ｂは、底板１２ａ、１２ｂと、側壁１４ａ、１４ｂで構成されている。以後、回収部材１０ａ、１０ｂの同じ部分を説明する場合は、回収部材１０ａで説明するが、同一箇所が回収部材１０ｂにも存在する。

0027

回収部材１０ａの底板１２ａは１辺が他の回収部材１０ｂの底板１２ｂと突き合わせることができるように、突き合わせ辺１６ａとされる。ここで、突き合わせ辺１６ａとは、両方の回収部材１０ａ、１０ｂの底板１２ａ、１２ｂの突き合わせ辺１６ａ、１６ｂ同士を突き合わせることができるだけでなく、互いに重ね合える状態を含む。

0028

また、両方の回収部材１０ａ、１０ｂの突き合わせ辺１６ａ、１６ｂには、切欠き１８ａ、１８ｂが形成されている。この部分で植物の茎を挟み込み、葉に当たる若しくは茎を流れ落ちてくる試料水を効率よく回収する。

0029

突き合わせ辺１６ａから遠い位置には、貯留部２０ａが形成される。貯留部２０ａは底板１２ａに設けられた凹みである。底板１２ａの形状は特に限定されるものではないが、ここでは簡単に長方形をしているとして説明を続ける。

0030

底板１２ａの突き合わせ辺１６ａ以外の部分には、底板１２ａに略垂直方向に延設された側壁１４ａが形成されている。突き合わせ辺１６ａに直角方向に設けられる側壁１４ａを脇側壁２２ａとよび、脇側壁２２ａに直角（突き合わせ辺に平行）に設けられる側壁１４ａを後側壁２４ａと呼ぶ。

0031

脇側壁２２ａと後側壁２４ａは、底板１２ａの貯留部２０ａからも連続して延設される。従って、貯留部２０ａは、一定量の液体を貯留することができる。また、回収部材１０ａ、１０ｂの少なくとも一方の底板１２ａの下面の突き合わせ辺１６ａ周辺には、ゲタ部３０（図２参照）が設けられている。ゲタ部３０は、回収部材１０ａ、１０ｂ同士を突き合わせ辺１６ａ、１６ｂで突き合わせた際に、突き合わせ辺１６ａ、１６ｂが貯留部２０ａ、２０ｂよりも高くなるように設けられる。

0032

また、脇側壁２２ａには、掛止用突起２６ａが設けられている。掛止用突起２６ａは、一対の回収部材１０ａ、１０ｂを突き合わせて固定する際に用いられる。

0033

なお、後側壁２４ａや脇側壁２２ａには、回収部材１０ａを把持するための把持部２８ａが設けられていてもよい。図では把持部２８ａは握り手としてしめしたが、把持部２８ａの形状はこれに限定するものではない。

0034

図２には、回収部材１０ａと回収部材１０ｂを付き合わせた状態の側面図（図２（ａ））と平面図（図２（ｂ））を示す。回収部材１０ａおよび１０ｂを突き合わせ辺１６ａ、１６ｂで突き合わせると、切欠き１８ａ、１８ｂのところで空間３２ができる。この空間３２に植物の茎を通す。なお、ゲタ部３０が、突き合わせ辺１６ａおよび１６ｂの位置を支えるので、底板１２ａ、１２ｂで受けた試験水は全て貯留部２０ａ、２０ｂに保存させることができる。

0035

また、回収部材１０ａ、１０ｂは掛止用突起２６ａ、２６ｂをゴム３４等で繋いでおくと、作業の際に回収部材１０ａ、１０ｂ同士が離れることなく試験水の回収ができる。

0036

次に図３を参照して本発明に係る液体回収器１の使用方法について説明する。図３（ａ）は、液体回収器１を植物に取り付け、水をかけている斜視図であり、図３（ｂ）は、植物の根本の側面図である。液体回収器１は、検査対象となる植物の茎若しくは幹の部分を一対の回収部材１０ａ、１０ｂの切欠き１８ａ、１８ｂで挟持し、掛止用突起２６ａ、２６ｂに輪ゴム３４などをかけて固定する。この際、ゲタ部３０ａ、３０ｂがあるために、突き合わせ辺１６ａ、１６ｂが貯留部２０ａ、２０ｂよりも高くなるように設定する。

0037

この状態で、植物に満遍なく水をかける。水をかけるには、如雨露（ジョウロ）や、洗浄瓶が利用できる。特に、後の工程でのＰＣＲにノイズが入らないようにするために、密閉されている洗浄瓶は好適に利用することができる。また、「満遍なく」とは、植物の葉、茎にできるだけ触れるように水をかけるということである。場合によっては、葉を裏返し、葉の裏側に水をかけるのもよい。

0038

植物にかけられた水は、葉から茎を伝わり、下方に流れる。流れた水は葉や茎に残留した節足動物の痕跡を洗い流す。このように、葉や茎を流れた水は試料水となる。試料水は突き合わせ辺１６ａの部分で回収され、底板１２ａを流れ、貯留部２０ａに溜まる。

0039

貯留部２０ａに溜まった試料水は、フィルター付きシリンジでろ過したのち、ＤＮＡ以外のものを除去するために精製を行う。精製して得られたＤＮＡは、上記の方法により含まれる節足動物由来のＤＮＡを増幅するためのサンプルとして利用される。

0040

なお、上記の説明では、液体回収器で直接試料水を回収する方法を説明したが、液体回収器全体を一体の樹脂製フィルム（図示せず）で覆っておき、貯留部を覆った樹脂製フィルムに試料水を貯めてシリンジで試験水を回収してもよい。

0041

液体回収器で直接試料水を回収すると、逐次洗浄する若しくは使い捨てなければならないが、液体回収器を覆ったフィルムで試験水を回収すれば、フィルムを使い捨てにすればよく、液体回収器を逐次洗浄する必要がない。

0042

実験は６月から１０月までの夏期に行った。場所は、奈良県奈良市中町３３２７−２０４の近畿大学農学部の圃場および温室で行った。対象の植物として、鉢植えのナス（千両二号：Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ）、キャベツ（ＹＲ５０号：Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ．ｖａｒ．ｃａｐｉｔａｔａ Ｌ．）および地植えのキャベツ（同上）を用いた。

0043

鉢植えのナスには、ワタアブラムシを接種して１週間恒温室で維持した。鉢植えのキャベツは、ガラス温室中で育成しているものの中から、目視によって害虫が付いたものを選んだ。また、地植えのキャベツは上記圃場に植えられたものを任意に選択し用いた。

0044

鉢植えのナスおよび鉢植えのキャベツに対して、サランラップ（登録商標）で覆った液体回収器を根本の茎の部分に配置し、洗浄瓶に入れた水を５００ｍｌかけ、試験水を回収した。また、地植えのキャベツには４Ｌの水をかけ、その水を回収し試験水を得た。なお、地植えのキャベツについては、雨の際に液体回収器をセットし、キャベツにかかった雨水を回収し、試験水としたものも得た。

0045

液体回収器で回収した試験水は、シリンジで吸引した後に、試験水を含んだシリンジカートリッジとカートリッジ型フィルタ（Φ０．４５μｍ、Ｓｔｅｒｉｖｅｘ（登録商標）ｆｉｌｔｅｒ ｃａｒｔｒｉｄｇｅ， Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をつないで、フィルタに試験水を通し、ＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡは精製した後、直ちに解析を行わない場合は、ＤＮＡｌａｔｅｒを入れて、冷凍庫で−２０℃以下の環境で保存した。

0046

カートリッジ型フィルター内のＤＮＡの抽出（Ｍｉｙａ ｅｔ ａｌ ２０１６）および精製はＤＮｅａｓｙ Ｂｌｏｏｄ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ （ＱＩＡＧＥＮ， Ｈｉｌｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。

0047

カートリッジから抽出、精製したＤＮＡ試料は６つのランダムな塩基を含んだアダプター配列（２回目のＰＣＲとペアードエンドシーケンシングに使うための配列（配列番号３および配列番号４））を付けたユニバーサルプライマー（ｍｌＣＯＩｉｎｔＦ（フォワードプライマー）と、ＨＣＯ２１９８（リバースプライマー）：配列番号１および配列番号２）で増幅した。アダプター配列およびユニバーサルプライマーを結合させたプライマーを１ｓｔＰＣＲプライマー（配列番号５および配列番号６）と呼ぶ。表１から表３に配列番号１〜６を示す。

0048

0049

0050

0051

その後、ＰＣＲ産物を（ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｂｒｅａ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）を用いて）精製し、インデックス配列と次世代シーケンサー用のフローセルに結合するアダプター配列を持つプライマーを用いてＰＣＲを行った。表４にフォワードインデックス配列（８つ）、表５にリバースインデックス配列（７つ）を示す。

0052

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0054

この際、試料ごとに異なるフォワードとリバースのインデックスの組み合わせになるようにプライマーを組み合わせた。すべての試料の２回目のＰＣＲ産物を１つにまとめて、４ｎＭに調整し、ライブラリー変性を行い、次世代シーケンサー（Ｍｉｓｅｑ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）で分析を行った。

0055

配列解析は、以下のプロセスで行った。まず、次世代シーケンサーから生データを吸い出し、イルミナ提供のｂｃｌ２ｆａｓｔｑ ｖ２ で生データをｆａｓｔｑファイルに変換した。ＤＮＡの読出しは、ＣＯＩ（シクロトームｃオキシダーゼサブユニットＩ）のうち３１３−ｂｐ領域を読んだ。次に、Ｃｌａｉｄｅｎｔでタグ配列のＱスコアを考慮して、タグごと（サンプルごと）に振り分けた（ｄｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）。そして、フリーソフトＲ用のＤＡＤＡ２パッケージで一塩基の違いを識別して（Ａｍｐｌｉｃｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｖａｒｉａｎｔ 法）いわゆるＯＴＵテーブルに変換（ＡＳＶテーブルともいう。）した。最後にＣｌａｉｄｅｎｔで配列の分類群を割り当てた。

0056

表６には、目視で節足動物を確認したサンプル（植物）からの試験水から、その節足動物のＤＮＡが見つかったケースを示す。目視で節足動物を確認したサンプルとは、鉢植えのナス、鉢植えのキャベツ（これらは、意図して節足動物を接種したか、すでについているものを選択した）と、地植えのキャベツの中で目視で節足動物を見つけたものである。なお、表６において、括弧内の数値は目視でその節足動物を確認した数を示し、括弧外の数値は、試料水からＤＮＡを検出できた数を示す。

0057

また、目視で確認した虫については、上記に示したような、Ｃｌａｉｄｅｎｔによる配列の分類群の割り当て解析に加えて、種を特定できなかった配列に関して、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｗｅｂ Ｂｌａｓｔにかけて種を特定した。

0058

0059

ワタアブラムシはすべて鉢植えのナスに人工的に摂取したものである。これについては、６サンプル中全てのサンプルで試料水からＤＮＡを検出することができた。また、その他の節足動物は、鉢植え若しくは地植えのキャベツで目視し、なおかつそのサンプル植物から得た試料水中にＤＮＡを検出した場合を示す。ハナアブの一種の検出率がおよそ３０％である以外は、５０％以上の確率でＤＮＡ検出に成功した。

0060

また、表７には、目視で確認してないが、試験水から得たＤＮＡによって確認された節足動物のリストを示す。

0061

0062

これらの節足動物は、サンプル植物上に目視では発見できなかったが、そもそも目視での確認は容易でない程度の大きさであるか、または、かつてそこにいた節足動物であると考えられる。

0063

以上のように本発明に係る節足動物の痕跡調査方法によれば、目視で確認できない節足動物や、節足動物の来訪の痕跡を検出することができる。

0064

本発明は、農産物の生産時に、害虫や益虫といった節足動物の挙動や分布の検証に好適に利用できる。

0065

１液体回収器
１０ａ、１０ｂ回収部材
１２ａ、１２ｂ底板
１４ａ、１４ｂ側壁
１６ａ、１６ｂ 突き合わせ辺
１８ａ、１８ｂ切欠き
２０ａ、２０ｂ貯留部
２２ａ、２２ｂ脇側壁
２４ａ、２４ｂ後側壁
２６ａ、２６ｂ掛止用突起
２８ａ、２８ｂ把持部
３０ ゲタ部
３２ 空間
３４ ゴム