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図面 (20)

課題

標的化された/免疫調節性融合タンパク質およびそれを作製するための方法に関する。

解決手段

本発明は、一般的に、癌治療に用いられる融合タンパク質を作製する分野、より具体的には、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に関し、ここで、キメラ融合タンパク質は、少なくとも1つの標的化部分、および癌細胞免疫寛容対抗する少なくとも1つの免疫調節性部分を含む。

概要

背景

[004] 関連技術
[005] 免疫系は、ヒト身体に、異物として、または潜在的に有害であるとして認識された微生物および物質を認識し、かつそれらから防御する手段を提供する。モノクローナル抗体での癌の受動免疫治療、および腫瘍細胞攻撃するT細胞受動伝達は、臨床効果を示しているが、これらの免疫エフェクター誘導し、かつ腫瘍細胞に対する免疫記憶確立する積極的な治療ワクチン接種目標は、まだ達成されないままである。いくつかの腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原が同定されているが、まだこれらの抗原は一般的に免疫原性が弱く、腫瘍は、免疫性攻撃を逃れることを可能にする免疫寛容誘発性環境を生み出す多様な機構を用いる。そのような免疫寛容を克服するストラテジー、ならびに頑強なレベルの抗体および/またはT細胞応答活性化することが、効果的な癌免疫治療の鍵を握っている。より重要なことには、個々のタンパク質、および活性三次構造を有する活性キメラポリペプチドを作製する方法が探索される必要がある。

概要

標的化された/免疫調節性融合タンパク質およびそれを作製するための方法に関する。本発明は、一般的に、癌治療に用いられる融合タンパク質を作製する分野、より具体的には、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に関し、ここで、キメラ融合タンパク質は、少なくとも1つの標的化部分、および癌細胞の免疫寛容に対抗する少なくとも1つの免疫調節性部分を含む。

目的

[004] 関連技術
[005] 免疫系は、ヒト身体に、異物として、または潜在的に有害であるとして認識された微生物および物質を認識し、かつそれらから防御する手段を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

癌細胞を標的とするための少なくとも1つの標的化部分、および免疫寛容対抗する少なくとも1つの免疫調節性部分を含むキメラ融合タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド配列であって、前記標的化部分と前記免疫調節性部分が、両方の部分がそれらの個々の標的に首尾よく結合することができるように、アミノ酸残基の十分な長さのアミノ酸スペーサーによって連結されている、ポリヌクレオチド配列。

請求項2

免疫調節性部分が以下の分子:(i)トランスフォーミング成長因子−β(TGF-β)、(ii)プログラム死−1(PD-1)リガンド、(iii)4−1BB、(iv)インスリン様成長因子1(IGF-1)、または(v)インターロイキン−6(IL-6)の1つに特異的に結合する、請求項1に記載のポリヌクレオチド配列。

請求項3

標的化部分が、上皮成長因子受容体(EGFR1、Erb-Bl)、HER2/neu(Erb-B2)、CD20、CTLA−4、ムチン1(MUC-1)、IGF−1、上皮細胞接着分子(EpCAM)、インターロイキン−2(IL-2)、インターロイキン−6(IL-6)受容体、PD−L1、および41BB−L1、またはそれらの部分に結合する抗体またはその断片である、請求項1に記載のポリヌクレオチド配列。

請求項4

少なくとも1つの標的化部分をコードする核酸配列が、配列番号12、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号25、および配列番号26からなる群から選択される、請求項1に記載のポリヌクレオチド配列。

請求項5

少なくとも1つの免疫調節性部分をコードする核酸配列が、配列番号13、配列番号27、および配列番号28からなる群から選択される、請求項1に記載のポリヌクレオチド配列。

請求項6

標的化部分が、EGFR1、HER2/neu、CD20、CTLA−4、インターロイキン−6(IL−6)、ムチン1(MUC-1)、インスリン様成長因子I(IGF-1)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、およびインターロイキン−2(IL-2)からなる群から選択されるメンバーに結合する抗体の重鎖および軽鎖を含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド配列。

請求項7

免疫調節性部分が、前記軽鎖および/または重鎖に融合し、かつTGFECD、プログラム細胞死−1(PD−1)受容体ECD、CTLA−4受容体ECD、4−1BBリガンドから選択されるメンバーである、請求項6に記載のポリヌクレオチド配列。

請求項8

免疫調節性部分が、トランスフォーミング成長因子−β受容体TGF−βRII、TGF−βRIIb、またはTGF−βRIIIの細胞外リガンド結合ドメインを含む、請求項1に記載のポリヌクレオチド配列。

請求項9

ヒト対象において癌を処置するための、少なくとも1つの標的化部分および少なくとも1つの免疫調節性部分を含む融合ポリペプチドをコードする最適化された遺伝子であって、ヒト対象において発現を増加するように改変されており、かつ配列番号12〜28から選択される、最適化された遺伝子。

請求項10

CG配列を増加させるように改変されている請求項9に記載の最適化された遺伝子を含むベクター

請求項11

対象において癌を処置する方法であって、配列番号12〜28から選択される、少なくとも1つの標的化部分および少なくとも1つの免疫調節性部分をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの組換えベクターを提供する工程と、前記ヌクレオチド配列が、対象において治療的有効量のコードされた融合タンパク質を産生するレベルで発現するような条件下で、組換えベクターを対象に投与する工程とを含む、方法。

請求項12

配列番号12〜28から選択される、少なくとも1つの標的化部分および少なくとも1つの免疫調節性部分をコードする最適化された遺伝子のポリヌクレオチドを含む発現ベクター

請求項13

請求項12に記載の発現ベクターをトランスフェクトした組換え宿主細胞

請求項14

本発明の融合タンパク質を調製する方法であって、形質転換された宿主細胞を産生するために、キメラ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を宿主細胞にトランスフェクトする工程であって、前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号12〜28から選択される、少なくとも1つの標的化部分および少なくとも1つの免疫調節性部分をコードする、工程と、前記ペプチドの発現に十分な生物学的条件下で、形質転換された宿主細胞を維持する工程とを含む、方法。

請求項15

癌細胞を標的とするための少なくとも1つの標的化部分、および免疫寛容に対抗する少なくとも1つの免疫調節性部分を含むキメラ融合タンパク質であって、前記標的化部分と前記免疫調節性部分が、両方の部分がそれらの個々の標的に首尾よく結合することができるように、アミノ酸残基の十分な長さのアミノ酸スペーサーによって連結されており、前記免疫調節性部分が配列番号4、配列番号9、および配列番号10から選択され、前記アミノ酸スペーサーが、配列番号3および配列番号11から選択され、1つの標的化部分が、抗HER2/Neu(重鎖配列番号1および軽鎖配列番号2);抗EGFR1(重鎖配列番号5および軽鎖配列番号6);抗CTLA4(重鎖配列番号7および軽鎖配列番号82);カンツズマブ(重鎖配列番号29および軽鎖配列番号30);シクスツムマブ(重鎖配列番号31および軽鎖配列番号32);クリバツズマブ(重鎖配列番号33および軽鎖配列番号34);およびプリツムマブ(重鎖配列番号35および軽鎖配列番号36)から選択される抗体である、キメラ融合タンパク質。

請求項16

新生物疾患を処置する方法であって、それを必要としている対象への、請求項15に記載のキメラ融合タンパク質の投与を含む、方法。

請求項17

治療的に活性な抗体−ペプチド融合タンパク質を調製する方法であって、a)前記融合タンパク質のコドン最適化配列を調製する工程と、b)一過性または持続的発現の能力がある宿主細胞に前記融合タンパク質の最適化配列をクローニングする工程と、c)培地中で十分に宿主細胞を成長させる工程であって、その宿主細胞がクローン化タンパク質を発現することを可能にする工程と、d)前記発現したタンパク質を精製に供する工程であって、任意に、前記タンパク質のその標的への二重特異性結合能力を調べる工程とを含む、方法。

請求項18

治療的に活性な抗体−ペプチド融合タンパク質が、癌細胞の免疫寛容に対抗する1つまたは複数の免疫調節性部分に融合した標的化抗体である、請求項17に記載の方法。

請求項19

免疫調節性部分が、前記分子の二重特異性結合を可能にするのに十分な長さのアミノ酸スペーサーによって連結されている、請求項18に記載の方法。

請求項20

免疫調節性部分が、抗体の重鎖かまたは軽鎖のいずれかのC末端に結合している、請求項19に記載の方法。

請求項21

免疫調節性部分が、(i)トランスフォーミング成長因子−β(TGF-β)、(ii)プログラム死−1(PD-1)リガンド、(iii)4−1BB、(iv)インスリン様成長因子1(IGF-1)、または(v)インターロイキン−6(IL-6)の細胞外ドメイン(ECD)である、請求項20に記載の方法。

請求項22

抗体が、上皮成長因子受容体(EGFR1、Erb-Bl)、HER2/neu(Erb-B2)、CD20、CD6、CTLA−4、ムチン1(MUC-1)、インターロイキン−2(IL-2)、またはインターロイキン−6(IL-6)に結合する、請求項21に記載の方法。

請求項23

宿主細胞が、一過性細胞株または安定細胞株である、請求項17に記載の方法。

請求項24

一過性発現が、前記融合タンパク質を哺乳動物宿主細胞運ぶベクターを宿主にトランスフェクトまたは形質転換することにより行われる、請求項23に記載の方法。

請求項25

一過性に発現した融合ペプチドが、精製、およびその二重特異性を調べるためのインビトロ試験に供される、請求項24に記載の方法。

請求項26

インビトロ試験が、二機能性標的結合または免疫細胞刺激を検証するためのELISAまたはNK/T細胞結合アッセイである、請求項25に記載の方法。

請求項27

所望の二重特異性を示すペプチドが、より大きなスケールの発現および精製のための安定細胞株へのサブクローニングのために選択される、請求項25に記載の方法。

請求項28

安定細胞株における発現レベルが前世代と同程度である、請求項27に記載の方法。

請求項29

宿主が哺乳動物細胞株である、請求項17に記載の方法。

請求項30

哺乳動物細胞が、HEK293、CHO、またはNSOである、請求項29に記載の方法。

請求項31

培地が、既知組成培地である、請求項30に記載の方法。

請求項32

培養中のラクテート蓄積を低下させるおよび/または前記融合タンパク質の不均一性を低下させるために、最初にまたはフェッドバッチ様式細胞培養物二価遷移金属塩が添加される、請求項32に記載の方法。

技術分野

0001

[001] 関連出願の相互参照
本出願は、2012年4月30日に出願されたインド特許出願第1689/CHE/2012号および2012年4月30日に出願されたインド特許出願第1690/CHE/2012号の優先権を主張し、その両方の特許出願の内容は、全ての目的のために参照により本明細書に組み入れられている。

0002

[002] 技術分野
[003] 本発明は、一般的に、癌治療に用いられる融合タンパク質を作製する分野、より具体的には、その融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に関し、その融合またはキメラポリペプチドは、少なくとも1つの標的化部分、および癌細胞免疫寛容対抗する少なくとも1つの免疫調節性部分を含む。

背景技術

0003

[004] 関連技術
[005] 免疫系は、ヒト身体に、異物として、または潜在的に有害であるとして認識された微生物および物質を認識し、かつそれらから防御する手段を提供する。モノクローナル抗体での癌の受動免疫治療、および腫瘍細胞攻撃するT細胞受動伝達は、臨床効果を示しているが、これらの免疫エフェクター誘導し、かつ腫瘍細胞に対する免疫記憶確立する積極的な治療ワクチン接種目標は、まだ達成されないままである。いくつかの腫瘍特異的抗原および腫瘍関連抗原が同定されているが、まだこれらの抗原は一般的に免疫原性が弱く、腫瘍は、免疫性攻撃を逃れることを可能にする免疫寛容誘発性環境を生み出す多様な機構を用いる。そのような免疫寛容を克服するストラテジー、ならびに頑強なレベルの抗体および/またはT細胞応答活性化することが、効果的な癌免疫治療の鍵を握っている。より重要なことには、個々のタンパク質、および活性三次構造を有する活性キメラポリペプチドを作製する方法が探索される必要がある。

発明が解決しようとする課題

0004

[006] 本発明は、癌細胞において発現するポリヌクレオチド、およびそれらによりコードされるポリペプチドを提供する。これらのポリヌクレオチドおよび発現したポリペプチドは、癌の処置のための様々な治療方法において有用である。本発明はさらに、癌細胞の免疫寛容に対抗することにより癌細胞の成長を低下させる方法であって、T細胞が活性状態を維持し、かつ腫瘍に対する免疫系の応答を抑制することが知られている制御性T細胞動員をT細胞が阻害する、方法を提供する。したがって、本発明のポリヌクレオチド配列によって生じたキメラポリペプチドは、発現した融合またはキメラポリペプチドのおかげで癌を処置するのに有用である。

課題を解決するための手段

0005

[007] 一態様において、本発明は、癌細胞を標的とするための少なくとも1つの標的化部分、および癌細胞の免疫寛容に対抗する少なくとも1つの免疫調節性部分を含有するキメラポリペプチドであって、その標的化部分と免疫調節性部分が、両方の部分がそれらの個々の標的に首尾よく結合することができるように、アミノ酸残基の十分な長さのアミノ酸スペーサーによって連結されている、キメラポリペプチドを提供する。代替の態様においては、標的化部分と癌細胞の免疫寛容に対抗する免疫調節性部分は、お互いに直接、結合していてもよい。本発明のキメラ融合ポリペプチドは、癌細胞受容体に結合し、かつ癌細胞の免疫応答を回避する能力を低下させるのに有用である。

0006

[008] 本発明は、癌細胞の免疫寛容に対抗し、またはそれを逆転させる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現によってキメラ/融合タンパク質を調製することに基づいている。癌細胞は、化学療法剤または腫瘍を標的とする抗体による排除を、腫瘍微小環境における特異的な免疫抑制機構を介して逃れることができ、そのような癌細胞の能力は、免疫寛容として認識されている。そのような免疫抑制機構は、免疫抑制性サイトカイン(例えば、トランスフォーミング成長因子β(TGF-β))および制御性T細胞および/または免疫抑制性骨髄樹状細胞(DC)を含む。腫瘍誘発性免疫寛容に対抗することにより、本発明は、任意に別の既存の癌処置と併用した、癌処置のための効果的な組成物および方法を提供する。本発明は、腫瘍誘発性免疫寛容に対抗し、かつ抵抗性または播種性癌細胞に対するT細胞媒介性適応抗腫瘍を活性化し、かつ活用することにより、化学療法の抗腫瘍効力を増強するストラテジーを提供する。

0007

[009] 別の態様において、本発明は、少なくとも1つの免疫調節性部分と融合した少なくとも1つの標的化部分を含む分子を提供する。標的化部分は、標的分子に特異的に結合し、免疫調節性部分は、以下の分子の1つに特異的に結合する:(i)トランスフォーミング成長因子−β(TGF-β);(ii)プログラム死−1リガンド1(PD-L1)またはプログラム死−1リガンド2(PD-L2);(iii)核因子KB活性化受容体(RANK)リガンド(RANKL);(iv)トランスフォーミング成長因子−β受容体(TGF-pR);(v)プログラム死−1(PD-1);(vi)4−1BB受容体、または(vii)核因子−κB活性化受容体(RANK)。

0008

[0010] さらなる態様において、標的化部分には、腫瘍細胞、腫瘍抗原腫瘍脈管構造、腫瘍微小環境、または腫瘍浸潤性免疫細胞の成分に特異的に結合する、抗体、抗体の軽鎖もしくは重鎖、scFv、またはFc含有ポリペプチドを含む抗体断片が挙げられる。好ましくは、標的化部分は、腫瘍細胞上の成分への結合親和性を有する抗体またはその断片である。注目すべきことには、重鎖および軽鎖のそれぞれは個々に、離れた、別々の免疫調節性部分に連結していてもよい。さらに、抗体標的化部分の重鎖または軽鎖は、免疫調節性部分に連結していてもよく、順に第2の免疫調節性部分にさらに連結することができ、その2つの免疫調節性部分の間にリンカーがある。

0009

[0011] なおさらなる態様において、腫瘍標的化部分、およびトランスフォーミング成長因子β(TGF-β)に結合する分子を含む免疫調節性部分を含むキメラポリペプチドであって、その腫瘍標的化部分が、EGFR1に結合する抗体であり、その抗体が完全抗体、重鎖、または軽鎖であり得る、キメラポリペプチドが提供される。腫瘍標的化部分として、癌細胞を標的とするモノクローナル抗体が挙げられ、それらには、セツキシマブトラスツズマブリツキシマブイピリムマブトレリムマブ、ムロモナブ−CD3、アブシキシマブダクリズマブバシリキシマブパリビズマブインフリキシマブゲムツズマブ、オゾガマイシンアレムツズマブイブツモマブ、チウキセタンアダリムマブオマリズマブトシツモマブ、I−131トシツモマブ、エファリズマブベバシズマブパニツムマブペルツズマブナタリズマブエタネルセプト、IGN101(Aphton)、ボロシキシマブ(Biogen IdecおよびPDL BioPharm)、抗CD80mAb(Biogen Idec)、抗CD23mAb(Biogen Idel)、CAT−3888(Cambridge Antibody Technology)、CDP−791(Imclone)、エプラツズマブ(Immunomedics)、MDX−010(MedarexおよびBMS)、MDX−060(Medarex)、MDX−070(Medarex)、マツズマブ(Merck)、CP−675、206(Pfizer)、CAL(Roche)、SGN−30(Seattle Genetics)、ザノリムマブ(SeronoおよびGenmab)、アデカツムマブ(Sereno)、オレゴボマブ(United Therapeutics)、ニモツズマブ(YM Bioscience)、ABT−874(Abbott Laboratories)、デノスマブ(Amgen)、AM 108(Amgen)、AMG 714(Amgen)、フォントリズマブ(Biogen IdecおよびPDL BioPharm)、ダクリズマブ(Biogent IdecおよびPDL BioPharm)、ゴリムマブ(CentocorおよびSchering-Plough)、CNTO 1275(Centocor)、オクレリズマブ(GenetechおよびRoche)、HuMax−CD20(Genmab)、ベリムマブ(HGSおよびGSK)、エプラツズマブ(Immunomedics)、MLN1202(Millennium Pharmaceuticals)、ビシリズマブ(PDL BioPharm)、トシリズマブ(Roche)、オクレリズマブ(Roche)、セルトリズマブペゴール(UCB、以前はCelltech)、エクリズマブ(Alexion Pharmaceuticals)、パキセリズマブ(Alexion PharmaceuticalsおよびProcter & Gamble)、アブシキシマブ(Centocor)、ラニビズマブ(Genetech)、メポリズマブ(GSK)、TNX−355(Tanox)、またはMYO−029(Wyeth)が挙げられるが、それらに限定されない。

0010

[0012] 別の態様において、腫瘍標的化部分は、HER2/Neu、CD20、CTLA4、EGFR1に結合するモノクローナル抗体であり、その抗体は、完全抗体、重鎖、または軽鎖であり得る。

0011

[0013] さらに別の態様において、標的化部分は、上皮成長因子受容体(EGFR1、Erb-Bl)、HER2/neu(Erb-B2)、CD20、Treg機能(CD 152)に必須である細胞傷害性Tリンパ球抗原−4(CTLA-4);H−1およびインターロイキン−6(IL-6)に特異的に結合する分子である。

0012

[0014] なおさらなる態様において、標的化部分は、制御性T細胞(treg)、骨髄系サプレッサー細胞、または樹状細胞の成分に特異的に結合する。別の態様において、標的化部分は、以下の分子の1つに特異的に結合する:(i)CD4;(ii)CD25(IL-2ct受容体;IL-2aR);(iii)トランスフォーミング成長因子−β受容体(TGF-pR);(vi)トランスフォーミング成長因子−β(TGF-β);(vii)プログラム死−1(PD-1);(viii)プログラム死−1リガンド(PD-L1またはPD-L2)。

0013

[0015] 別の態様において、免疫調節性部分は、以下の分子の1つに特異的に結合する:(i)トランスフォーミング成長因子−β(TGF-β);(ii)プログラム死−1リガンド(PD-L1またはPD-L2);または4−1BB受容体。

0014

[0016] さらに別の態様において、免疫調節性部分として、TGF−βに結合し、かつその機能を阻害する分子が挙げられる。具体的には、免疫調節性部分には、トランスフォーミング成長因子−β受容体TGF−βRII、TGF−βRIIb、またはΤGF−βRIIIの細胞外リガンド結合ドメインが挙げられる。別の態様において、免疫調節性部分には、TGF−βRIIの細胞外リガンド結合ドメイン(ECD)が挙げられる。なおさらに、免疫調節性部分には、4−1BB受容体に結合して、T細胞を刺激し、腫瘍を根絶する(eradicate)のを助けるH−4−1BBリガンドが挙げられ得る。

0015

[0017] なおさらなる態様において、標的化部分には、HER2/neu、EGFR1、CD20、または細胞傷害性Tリンパ球抗原−4(CTLA−4)に特異的に結合する抗体、抗体断片、またはポリペプチドが挙げられ、免疫調節性部分には、TGF−βRIIの細胞外リガンド結合ドメインが挙げられる。

0016

[0018] さらに別の態様において、免疫調節性部分には、プログラム死−1リガンド1(PD-L1)またはプログラム死−1リガンド2(PD-L2)に特異的に結合して、その活性を阻害する分子が挙げられる。別の態様において、免疫調節性部分には、プログラム死−1(PD-1)の細胞外リガンド結合ドメインまたは外部ドメインが挙げられる。

0017

[0019] さらなる態様において、標的化部分には、HER2/neu、EGFRl、CD20、細胞傷害性Tリンパ球抗原−4(CTLA−4)、CD25(lL−2a受容体;IL−2aR)、またはCD4に特異的に結合する抗体、抗体断片、またはポリペプチドが挙げられ、免疫調節性部分には、プログラム死−1(PD-1)の細胞外リガンド結合ドメインまたは外部ドメインが挙げられる。

0018

[0020] なおさらなる態様において、標的化部分には、CD20に特異的に結合する抗体または抗体断片が挙げられ、免疫調節性部分には、トランスフォーミング成長因子−β(TGF−β)由来の配列が挙げられる。

0019

[0021] 一態様において、本発明は、ヒト対象において癌を処置するための、少なくとも1つの標的化部分および少なくとも1つの免疫調節性部分を含む融合ポリペプチドをコードする最適化された遺伝子であって、ヒト対象において発現を増加させるように改変されている、最適化された遺伝子を提供する。好ましくは、最適化された遺伝子は、配列番号12〜28から選択される、標的化部分または免疫調節性部分をコードするための配列を含む。

0020

[0022] 別の態様において、本発明は、ヒト対象において癌を処置するための最適化された遺伝子を含むベクターであって、その最適化された遺伝子が、CG配列を増加させるように改変されている、ベクターを提供する。好ましくは、ベクターは、配列番号12〜28から選択される、少なくとも1つの標的化部分および少なくとも1つの免疫調節性部分をコードするための配列を含む。

0021

[0023] さらに別の態様において、本発明は、対象において癌を処置する方法であって、
a.配列番号12〜28から選択される、少なくとも1つの標的化部分および少なくとも1つの免疫調節性部分をコードするヌクレオチド配列を含む少なくとも1つの組換えベクターを提供する工程と、
b.該ヌクレオチド配列が、対象において治療的有効量のコードされた融合タンパク質を産生するレベルで発現するような条件下で、組換えベクターを対象に投与する工程と
を含む、方法を提供する。

0022

[0024]代替の態様において、本発明は、配列番号12〜28から選択される、少なくとも1つの標的化部分および少なくとも1つの免疫調節性部分をコードする最適化された遺伝子のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。

0023

[0025] さらに別の態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質ペプチドをコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトした組換え宿主細胞を提供する。

0024

[0026] なおさらなる態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質を調製する方法であって、
a.キメラ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を宿主細胞にトランスフェクトして、形質転換された宿主細胞を産生する工程であって、そのポリヌクレオチド配列が、配列番号12〜28から選択される、少なくとも1つの標的化部分および少なくとも1つの免疫調節性部分をコードする、工程と、
b.そのペプチドの発現に十分な生物学的条件下で、形質転換された宿主細胞を維持する工程と
を含む、方法を企図する。

0025

[0027] 別の態様において、本発明は、癌の処置のための薬物の使用における、図1〜15に示されているようなキメラ融合タンパク質の使用に関する。好ましくは、融合タンパク質は、宿主細胞において発現し、そのような発現したタンパク質は、それを必要としている対象において癌の影響を低下させる治療的量で投与される。

0026

[0028] なおさらなる態様において、本発明は、新生物疾患を防止または処置する方法を提供する。方法は、それを必要としている対象への本発明の1つまたは複数の融合タンパク質の投与を含み、様々な態様において、対象は、本発明の1つまたは複数の分子を、別の抗癌治療と併用して、投与され、一態様において、抗癌治療には、化学療法分子、抗体、小分子キナーゼ阻害剤ホルモン剤、または細胞傷害性薬物が挙げられる。抗癌治療にはまた、電離放射線紫外線放射凍結融解壊死治療、熱剥離、またはラジオ波焼灼療法が挙げられ得る。

0027

[0029] さらに別の態様において、本発明は、治療的に活性な抗体−ペプチド融合タンパク質を調製する方法であって、
a.該融合タンパク質のコドン最適化配列を調製する工程と
b.一過性または持続的発現の能力がある宿主細胞において該融合タンパク質の最適化配列をクローニングする工程と、
c.培地中で成長させるのに適切な条件下で宿主細胞を成長させ、その宿主細胞がクローン化タンパク質を発現することを可能にする工程と、
d.発現したタンパク質を精製に供し、任意に、そのタンパク質のその標的への二重特異性(bi-specificity)結合能力を調べる工程と
を含む、方法を提供する。

0028

[0030] 好ましい実施形態において、治療的に活性な抗体−ペプチド融合タンパク質は、癌細胞の免疫寛容に対抗する1つまたは複数の免疫調節性部分に融合した標的化抗体である。一態様において、免疫調節性部分は、その分子の二重特異性結合を可能にするのに十分な長さのアミノ酸スペーサーによって連結されていてもよい。免疫調節性部分は、抗体の重鎖または軽鎖のいずれかのC末端に結合していてもよい。

0029

[0031] 上記のような好ましい方法において、免疫調節性部分は、(i)トランスフォーミング成長因子−β(TGF-β)、(ii)プログラム死−1(PD-1)、(iii)CTLA−4、もしくは(iv)4−1BB、またはその部分であり、標的化抗体は、上皮成長因子受容体(EGFR1、Erb-Bl)、HER2/neu(Erb-B2)、CD20、CD6、CTLA−4、ムチン1(MUC-1)、インターロイキン−2(IL-2)、またはインターロイキン−6(IL-6)に結合する。

0030

[0032] 本発明の方法は、治療的に活性な抗体−ペプチド融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を提供し、そのような発現は、一過性細胞株または安定細胞株において行われ得る。一過性発現は、融合タンパク質を有するベクターを哺乳動物宿主細胞へトランスフェクトまたは形質転換することにより、達成される。

0031

[0033]融合ペプチドが発現したならば、それらは、好ましくは、精製、およびその二重特異性、すなわち、標的部分および免疫調節性部分の両方に結合する能力を有することを調べるためのインビトロ試験に供される。そのような試験には、二機能性(bi-functional)標的結合または免疫細胞刺激を検証するためのELISAまたはNK/T細胞結合アッセイなどのインビトロ試験が挙げられ得る。

0032

[0034] 注目すべきことには、特異的融合ペプチドが所望の二重特異性を示したならば、そのような融合ペプチドは、より大きなスケールの発現および精製のための安定細胞株へのサブクローニングのために選択される。そのような安定細胞株は、以前に開示されており、非限定的にHEK293、CHO、またはNSOを含む哺乳動物細胞株などである。

0033

[0035] さらなる態様において、培地は、そのような培地への添加により改善することができる。例えば、培地は、培養中のラクテート蓄積および/または融合タンパク質の不均一性(heterogeneity)を低下させるために、最初にまたはフェッドバッチ様式細胞培養物へ添加される二価遷移金属塩を含んでもよい。望ましい遷移金属塩には、亜鉛イオンが挙げられ、金属イオンの添加は、産生の様々な相の中で実行されてもよい。

0034

[0036] 本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図面、および特許請求の範囲から明らかであろう。

図面の簡単な説明

0035

[0037]抗HER2/neu重鎖のアミノ酸配列(配列番号1)、および太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着した抗HER2/neu軽鎖のアミノ酸配列(配列番号2)を含む、LC定常領域における抗HER2/neu−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、リンカー(配列番号3)は、抗HER2/neu軽鎖とTGF−βRIIとの間に位置し、イタリック体で示されている。
[0038]抗EGFR1重鎖のアミノ酸配列(配列番号5)、および太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着した抗EGFR1軽鎖のアミノ酸配列(配列番号6)を含む、LC定常領域における抗EGFR1−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、リンカー(配列番号3)は、抗EGFR1軽鎖とTGF−βRIIとの間に位置し、イタリック体で示されている。
[0039]抗CTLA4重鎖のアミノ酸配列(配列番号7)、および太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着した抗CTLA4軽鎖のアミノ酸配列(配列番号8)を含む、LC定常領域における抗CTLA4−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、リンカー(配列番号3)は、抗CTLA4軽鎖とTGF−βRIIとの間に位置し、イタリック体で示されている。
[0040]抗HER2/neu HC−4−1BBおよびLC−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗HER2/neu/HC−4−1BB融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗HER2/neu重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号1)がイタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、4−1BB(免疫調節性部分)についての配列(配列番号9)が手書きテキストフォント(written text font)で示され、抗HER2/neu軽鎖のアミノ酸配列(配列番号2)が太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着しており、リンカー(配列番号3)が、抗HER2/neu軽鎖とTGF−βRIIとの間に位置する。
[0041] 抗EGFR1 HC−4−1BBおよびLC−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗EGFR1重鎖−4−1BB融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗EGFR1重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号5)がイタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、4−1BB(免疫調節性部分)についての配列(配列番号9)が手書きテキストフォントで示され、軽鎖抗EGFR1のアミノ酸配列(配列番号6)が太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着しており、それらの間にリンカー(配列番号3)を伴う。
[0042] 抗CTLA4 HC−4−1BBおよびLC−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗CTLA4重鎖−4−1BB融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗CTLA4重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号7)がイタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、4−1BB(免疫調節性部分)についての配列(配列番号9)が手書きテキストフォントで示され、抗CTLA4軽鎖のアミノ酸配列(配列番号8)が太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着しており、それらの間にリンカー(配列番号3)を伴う。
[0043] 抗HER2/neu HC−PD1およびLC−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗HER2/neu重鎖−PD1融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗HER2/neu重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号1)がイタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、PD1(免疫調節性部分)についての配列(配列番号10)が手書きテキストフォントで示され、抗HER2/neu軽鎖のアミノ酸配列(配列番号2)が太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着しており、それらの間にリンカー(配列番号3)を伴う。
[0044] 抗EGFR1 HC−PD1およびLC−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗EGFR1重鎖−PD1融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗EGFR1重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号5)がイタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、PD1(免疫調節性部分)についての配列(配列番号10)が手書きテキストフォントで示され、抗EGFR1軽鎖のアミノ酸配列(配列番号6)が太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着しており、それらの間にリンカー(配列番号3)を伴う。
[0045] 抗CTLA4 HC−PD1およびLC−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗CTLA4重鎖−PD1融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗CTLA4重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号7)がイタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、PD1(免疫調節性部分)についての配列(配列番号10)が手書きテキストフォントで示され、抗CTLA4軽鎖のアミノ酸配列(配列番号8)が太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着しており、それらの間にリンカー(配列番号3)を伴う。
[0046] 抗HER2/neu HC−TGFβRII−4−1BB融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗HER2/neu重鎖−TGFβRII−4−1BB融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗HER2/neu重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号1)がイタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、TGFβRII(免疫調節性部分)についての配列(配列番号4)が太字で示され、間にリンカー(配列番号11)を伴う4−1BB(免疫調節性部分)についてのアミノ酸配列(配列番号9)が手書きテキストフォントで示され、図は抗HER2/neu軽鎖のアミノ酸配列(配列番号2)を含む。
[0047] 抗EGFR1 HC−TGFβRII−4−1BB融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗EGFR1重鎖−TGFβRII−4−1BB融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗EGFR1重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号5)がイタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、TGFβRII(免疫調節性部分)についての配列(配列番号4)が太字で示され、間にリンカー(配列番号11)を伴う4−1BB(免疫調節性部分)についてのアミノ酸配列(配列番号9)が手書きテキストフォントで示され、図は抗EGFR1軽鎖のアミノ酸配列(配列番号6)を含む。
[0048] 抗CTLA4 HC−TGFβRII−4−1BB融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗CTLA4重鎖−TGFβRII−4−1BB融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗CTLA4重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号7)がイタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、TGFβRII(免疫調節性部分)についての配列(配列番号4)が太字で示され、間にリンカー(配列番号11)を伴う4−1BB(免疫調節性部分)についてのアミノ酸配列(配列番号9)が手書きテキストフォントで示され、図は抗CTLA4軽鎖のアミノ酸配列(配列番号8)を含む。
[0049] 抗HER2/neu HC−TGFβRII−PD1融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗HER2/neu重鎖−TGFβRII−PD1融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗HER2/neu重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号1)がイタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、TGFβRII(免疫調節性部分)についての配列(配列番号4)が太字で示され、間にリンカー(配列番号11)を伴うPD−1(免疫調節性部分)についてのアミノ酸配列(配列番号10)が手書きテキストフォントで示され、図は抗HER2/neu軽鎖のアミノ酸配列(配列番号2)を含む。
[0050] 抗EGFR1 HC−TGFβRII−PD1融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗EGFR1重鎖−TGFβRII−PD1融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗EGFR1重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号5)がイタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、TGFβRII(免疫調節性部分)についての配列(配列番号4)が太字で示され、間にリンカー(配列番号11)を伴うPD−1(免疫調節性部分)についてのアミノ酸配列(配列番号10)が手書きテキストフォントで示され、図は抗EGFR1軽鎖のアミノ酸配列(配列番号6)を含む。
[0051] 抗CTLA4 HC−TGFβRII−PD1融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、抗CTLA4重鎖−TGFβRII−PD1融合タンパク質のアミノ酸配列において、抗CTLA4重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号7)がイタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、TGFβRII(免疫調節性部分)についての配列(配列番号4)が太字で示され、間にリンカー(配列番号11)を伴うPD−1(免疫調節性部分)についてのアミノ酸配列(配列番号8)が手書きテキストフォントで示され、図は抗CTLA4軽鎖のアミノ酸配列(配列番号8)を含む。
[0052]CHO細胞における発現のためにコドン最適化されている、リンカーを伴う抗HER2/neu重鎖定常領域のヌクレオチド配列(配列番号12)およびTGFβRII ECDのヌクレオチド配列(配列番号13)を示す図である。
[0053]CHO細胞における発現のためにコドン最適化されている、抗HER2/neu重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号14)、抗HER2/neu軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号15)、およびリンカーを伴う抗EGFR1重鎖定常領域のヌクレオチド配列(配列番号16)を示す図である。
[0054]CHO細胞における発現のためにコドン最適化されている、抗EGFR1重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号17)、抗EGFR1軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号18)、抗CTLA4重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号19)、および抗CTLA4軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号20)を示す図である。
[0055]CHO細胞における発現のためにコドン最適化されている、抗CD20IgG1分子のヌクレオチド配列(配列番号21)、抗CD20重鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号22)、および抗CD20軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号23)を示す図である。
[0056]CHO細胞における発現のためにコドン最適化されている、4−1BBのヌクレオチド配列(配列番号24)および抗IL6R重鎖のヌクレオチド配列(配列番号25)を示す図である。
[0057]CHO細胞における発現のためにコドン最適化されている、抗IL6R軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号26)、抗4−1BB重鎖のヌクレオチド配列(配列番号27)、および抗4−1BB軽鎖可変領域のヌクレオチド配列(配列番号28)を示す図である。
[0058]プロテインA精製された抗HER2/neu−TGFβRIIおよび抗EGFR1−TGFβRIIの12%PAGEにおける分析を示す図である。
[0059]Aは、プロテインA/SECクロマトグラフィーにより分析された抗HER2/neu−TGFβRII試料を示す図であり、Bは、プロテインA/SECクロマトグラフィーにより分析された抗EGFR1−TGFβRII試料を示す図である。
[0060]Aは、抗HER2/neu−TGFβRIIおよび抗EGFR1−TGFβRII分子がTGFβに結合することを示す図であり、そのことは、その融合タンパク質が機能しうることを示し、Bは、抗HER2−TGFβRIIが、Bmab200(ハーセプチン)と同様に、BT474細胞株の増殖を阻害することを示す図である。
[0061]抗EGFR1−TGFβRIIが、セツキシマブと同様に、A431細胞株の増殖を阻害することを示す図である。
[0062]抗HER2−TGFβRIIのBT474細胞へのADCC活性がBmab200(ハーセプチン)のそれと類似していることを示す図である。
[0063]抗EGFR1−TGFβRIIのA431細胞へのADCC活性を示す図であり、そのADCC活性がセツキシマブのそれと類似している。
[0064]抗EGFR1−TGFβRIIおよびセツキシマブと比較した、抗EGFR1−4−1BBのADCC活性を示す図である。
[0065]Aは、抗CTLA4−TGFβRIIのTGFβ1への結合活性が抗EGFR1−TGFβRIIと同程度であることを示す図であり、Bは、抗CTLA4−TGFβRIIのCTLA4への結合活性を示す図である。
[0066]Aは、PD1−Fc結合のレベルを決定するための抗CTLA4−TGFβRIIの結合活性を示す図であり、Bは、4−1BBLの結合を決定するための抗EGFR1−4−1BBの結合活性を示す図である。
[0067]Aは、抗EGFR1−4−1BBのEGFRへの結合活性を示す図であり、Bは、PDL1−Fcを見出すためのPD1−Fc−4−1BBの結合活性を示す図である。
[0068]抗EGFR1−PD1のEGFRおよびPD1への結合活性を示す図である。
[0069]発現したタンパク質およびその還元アルキル化写真である。
[0070]Aは、抗HER2/neu−TGFβRII ECD融合体の軽鎖(LC)(還元型)のマススペクトル/マススペクトルを示す図であり、Bは、抗HER2/neu−TGFβRII ECD融合体のLC(還元型)のデコンボリューション化マススペクトルを示す図である。
[0071]抗HER2/neu−TGFβRII ECD融合体の重鎖(HC)(還元型)のマススペクトルを示す図である。
[0072]Aは、抗EGFR1−TGFβRII ECDのLC(還元型)のマススペクトルを示す図であり、Bは、抗EGFR1−TGFβRII ECDのLC(還元型)のデコンボリューション化マススペクトルを示す図である。
[0073]抗EGFR1−TGFβRII ECDのHC(還元型)のマススペクトルを示す図である。
[0074]Aは、抗HER2/neu−TGFβRII ECD融合タンパク質のトリプシンペプチドのUVクロマトグラムを示す図であり、Bは、抗HER2/neu−TGFβRII ECD融合タンパク質のトリプシンペプチドの総イオンクロマトグラム(TIC)を示す図である。
[0075]抗HER2/neu−TGFβRII ECD融合タンパク質の軽鎖の予想される/観察されたトリプシンペプチドのリストを示す図である。
抗HER2/neu−TGFβRII ECD融合タンパク質の重鎖の予想される/観察されたトリプシンペプチドのリストを示す図である。
抗HER2/neu−TGFβRII ECD融合タンパク質の連結モチーフの予想される/観察されたトリプシンペプチドのリストを示す図である。
[0076]Aは、抗EGFR1−TGFβRII ECD融合タンパク質のトリプシンペプチドのUVクロマトグラムを示す図であり、Bは、抗EGFR1−TGFβRII ECD融合タンパク質のトリプシンペプチドの総イオンクロマトグラム(TIC)を示す図である。
[0077]抗EGFR1−TGFβRII ECD融合タンパク質の軽鎖の予想される/観察されたトリプシンペプチドのリストを示す図である。
[0078]抗EGFR1−TGFβRII ECD融合タンパク質の重鎖の予想される/観察されたトリプシンペプチドのリストを示す図である。
[0079]抗EGFR1−TGFβRII ECD融合タンパク質の重鎖の予想される/観察されたトリプシンペプチドのリストを示す図である。
[0080]カンツズマブ(Cantuzumab)重鎖のアミノ酸配列(配列番号29)、および太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着したカンツズマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号30)を含む、LC定常領域におけるカンツズマブ−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、リンカー(配列番号3)は、カンツズマブ軽鎖とTGF−βRIIとの間に位置し、イタリック体で示されている。
[0081]シクスツムマブ(Cixutumumab)重鎖のアミノ酸配列(配列番号31)、および太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着したシクスツムマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号32)を含む、LC定常領域におけるシクスツムマブ−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、リンカー(配列番号3)は、シクスツムマブ軽鎖とTGF−βRIIとの間に位置し、イタリック体で示されている。
[0082]クリバツズマブ(Clivatuzumab)重鎖のアミノ酸配列(配列番号33)、および太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着したクリバツズマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号33)を含む、LC定常領域におけるクリバツズマブ−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、リンカー(配列番号3)は、クリバツズマブ軽鎖とTGF−βRIIとの間に位置し、イタリック体で示されている。
[0083]プリツムマブ(Pritumumab)重鎖のアミノ酸配列(配列番号35)、および太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着したプリツムマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号36)を含む、LC定常領域におけるプリツムマブ−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、リンカー(配列番号3)は、プリツムマブ軽鎖とTGF−βRIIとの間に位置し、イタリック体で示されている。
[0084]カンツズマブ HC−4−1BBおよびLC−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、カンツズマブ重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号29)が、イタリック体で示されているリンカー(配列番号3)に付着しており、4−1BB(免疫調節性部分)についての配列(配列番号9)が手書きテキストフォントで示され、カンツズマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号30)が、太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着し、その間にリンカー(配列番号3)を有する。
[0085] シクスツムマブ HC−4−1BBおよびLC−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、シクスツムマブ重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号31)が、イタリック体で示されているリンカー(配列番号3)に付着しており、4−1BB(免疫調節性部分)についての配列(配列番号9)が手書きテキストフォントで示され、シクスツムマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号32)が、太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着し、その間にリンカー(配列番号3)を有する。
[0086] クリバツズマブ HC−4−1BBおよびLC−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、クリバツズマブ重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号33)が、イタリック体で示されているリンカー(配列番号3)に付着しており、4−1BB(免疫調節性部分)についての配列(配列番号9)が手書きテキストフォントで示され、クリバツズマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号34)が、太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着し、その間にリンカー(配列番号3)を有する。
[0087] プリツムマブ HC−4−1BBおよびLC−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、プリツムマブ重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号35)が、イタリック体で示されているリンカー(配列番号3)に付着しており、4−1BB(免疫調節性部分)についての配列(配列番号9)が手書きテキストフォントで示され、プリツムマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号36)が、太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着し、その間にリンカー(配列番号3)を有する。
[0088]カンツズマブ HC−PD1およびLC−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、カンツズマブ重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号29)が、イタリック体で示されているリンカー(配列番号3)に付着しており、PD1(免疫調節性部分)についての配列(配列番号10)が手書きテキストフォントで示され、カンツズマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号30)が、太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着し、その間にリンカー(配列番号3)を有する。
[0089] シクスツムマブ HC−PD1およびLC−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、シクスツムマブ重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号31)が、イタリック体で示されているリンカー(配列番号3)に付着しており、PD1(免疫調節性部分)についての配列(配列番号10)が手書きテキストフォントで示され、シクスツムマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号32)が、太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着し、その間にリンカー(配列番号3)を有する。
[0090] クリバツズマブ HC−PD1およびLC−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、クリバツズマブ重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号33)が、イタリック体で示されているリンカー(配列番号3)に付着しており、PD1(免疫調節性部分)についての配列(配列番号10)が手書きテキストフォントで示され、クリバツズマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号34)が、太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着し、その間にリンカー(配列番号3)を有する。
[0091] プリツムマブ HC−PD1およびLC−TGFβRII融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、プリツムマブ重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号35)が、イタリック体で示されているリンカー(配列番号3)に付着しており、PD1(免疫調節性部分)についての配列(配列番号10)が手書きテキストフォントで示され、プリツムマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号36)が、太字で特定されたTGF−βRII(免疫調節性部分)についてのアミノ酸残基(配列番号4)に付着し、その間にリンカー(配列番号3)を有する。
[0092]カンツズマブHC−TGFβRII−4−1BB融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、カンツズマブ重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号29)が、イタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、TGFβRII(免疫調節性部分)についての配列(配列番号4)が太字で特定され、4−1BB(免疫調節性部分)についてのアミノ酸配列(配列番号9)が手書きテキストフォントで示され、その間にリンカー(配列番号11)を有し、図はカンツズマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号30)を含む。
[0093]シクスツムマブHC−TGFβRII−4−1BB融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、シクスツムマブ重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号31)が、イタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、TGFβRII(免疫調節性部分)についての配列(配列番号4)が太字で特定され、4−1BB(免疫調節性部分)についてのアミノ酸配列(配列番号9)が手書きテキストフォントで示され、その間にリンカー(配列番号11)を有し、図はシクスツムマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号32)を含む。
[0094]クリバツズマブHC−TGFβRII−4−1BB融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、クリバツズマブ重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号33)が、イタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、TGFβRII(免疫調節性部分)についての配列(配列番号4)が太字で特定され、4−1BB(免疫調節性部分)についてのアミノ酸配列(配列番号9)が手書きテキストフォントで示され、その間にリンカー(配列番号11)を有し、図はクリバツズマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号34)を含む。
[0095]プリツムマブHC−TGFβRII−4−1BB融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、プリツムマブ重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号35)が、イタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、TGFβRII(免疫調節性部分)についての配列(配列番号4)が太字で特定され、4−1BB(免疫調節性部分)についてのアミノ酸配列(配列番号9)が手書きテキストフォントで示され、その間にリンカー(配列番号11)を有し、図はプリツムマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号36)を含む。
[0096]カンツズマブHC−TGFβRII−PD1融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、カンツズマブ重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号29)が、イタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、TGFβRII(免疫調節性部分)についての配列(配列番号4)が太字で特定され、PD1(免疫調節性部分)についてのアミノ酸配列(配列番号10)が手書きテキストフォントで示され、その間にリンカー(配列番号11)を有し、図はカンツズマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号30)を含む。
[0097]シクスツムマブHC−TGFβRII−PD1融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、シクスツムマブ重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号31)が、イタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、TGFβRII(免疫調節性部分)についての配列(配列番号4)が太字で特定され、PD1(免疫調節性部分)についてのアミノ酸配列(配列番号10)が手書きテキストフォントで示され、その間にリンカー(配列番号11)を有し、図はシクスツムマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号32)を含む。
[0098]クリバツズマブHC−TGFβRII−PD1融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、クリバツズマブ重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号33)が、イタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、TGFβRII(免疫調節性部分)についての配列(配列番号4)が太字で特定され、PD1(免疫調節性部分)についてのアミノ酸配列(配列番号10)が手書きテキストフォントで示され、その間にリンカー(配列番号11)を有し、図はクリバツズマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号34)を含む。
[0099]プリツムマブHC−TGFβRII−PD1融合タンパク質のアミノ酸配列を示す図であり、プリツムマブ重鎖についてのアミノ酸配列(配列番号35)が、イタリック体で示されたリンカー(配列番号3)に付着しており、TGFβRII(免疫調節性部分)についての配列(配列番号4)が太字で特定され、PD1(免疫調節性部分)についてのアミノ酸配列(配列番号10)が手書きテキストフォントで示され、その間にリンカー(配列番号11)を有し、図はプリツムマブ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号36)を含む。

0036

[00100] 本発明の実施は、他の指示がない限り、免疫学分子生物学微生物学細胞生物学、および組換えDNAの通常の技術を用い、それらは、当業者の能力の範囲内である。例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING:A LABORATORYMANUAL、第2版(1989);CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F. M. Ausubelら編(1987));シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press, Inc.):PCR2:A PRACTICAAPPROACH(M. J. MacPherson、B. D. Hames、およびG. R. Taylor編(1995))、HarlowおよびLane編(1989)ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL、ならびにANIMAL CELLCULTURE(R. I. Freshney編(1987))を参照されたい。

0037

[00101] 定義
[00102] 他の規定がない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における通常の技能を有する者によって一般的に理解された意味をもつ。本明細書で用いられる用語法は、特定の実施形態のみを記載することを目的とし、本発明を限定することを意図するものではない。本発明の説明および添付された特許請求の範囲に用いられる場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈が明らかに別な意図で示していない限り、複数形もまた含むことを意図される。以下の用語は下記に示された意味をもつ:

0038

[00103] 本明細書で用いられる場合、用語「ポリヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチドの配列を意味する。ポリヌクレオチドは、本明細書では、5’から3’方向への方向で提示される。本発明のポリヌクレオチドは、デオキシリボ核酸(DNA)分子またはリボ核酸(RNA)分子であり得る。ポリヌクレオチドがDNA分子である場合、その分子は、遺伝子またはcDNA分子であり得る。ヌクレオチド塩基は、本明細書では、以下の一文字コードによって示される:アデニン(A)、グアニン(G)、チミン(T)、シトシン(C)、イノシン(I)、およびウラシル(U)。本発明のポリヌクレオチドは、当業者によく知られた標準技術を用いて調製することができる。

0039

[00104] 本明細書で用いられる場合、用語「最適化された」は、ヌクレオチド配列が、産生細胞または生物体、一般的に真核細胞、例えば、ピキアの細胞、トリコデルマの細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、またはヒト細胞において好ましいコドンを用いてアミノ酸配列をコードするように変化していることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、出発のヌクレオチド配列(「親」配列としても知られている)によって本来コードされたアミノ酸配列を完全に、またはできる限り多く保持するように操作される。本明細書における最適化された配列は、CHO哺乳動物細胞において好ましいコドンを有するように操作されている;しかしながら、他の真核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現もまた、本明細書において構想される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列もまた、最適化されたと言われる。本明細書で用いられる場合、用語「発現」は、特定のヌクレオチド配列のそのプロモーターによって駆動される転写および/または翻訳として定義される。

0040

[00105] 本明細書で用いられる場合、細胞の「トランスフェクション」という用語は、細胞を遺伝子改変するために、遺伝子材料が細胞へ導入されることを意味する。トランスフェクションは、形質導入またはエレクトロポレーションなどの当技術分野で知られた様々な手段によって達成することができる。

0041

[00106] 本明細書で用いられる場合、用語「癌」は、異常な細胞の急速かつ制御されない成長によって特徴づけられる疾患として定義される。癌細胞は、身体の他の部分へ、局所的に、または血流およびリンパ系を通して、広がることができる。様々な癌の例には、乳癌前立腺癌卵巣癌子宮頚癌皮膚癌、眼癌、膵臓癌結腸直腸癌腎臓癌肝臓癌、脳癌、リンパ腫白血病肺癌などが挙げられるが、それらに限定されない。

0042

[00107] 用語「導入遺伝子」は、標的細胞における発現のためのベクター内に組み込まれた任意の異種性ヌクレオチド配列、およびプロモーターなどの付随した発現調節配列を意味するように広い意味で用いられる。発現調節配列は、標的細胞において導入遺伝子の発現を促進する能力に基づいて選択されることが当業者に認識される。導入遺伝子の例は、本発明のキメラ融合タンパク質をコードする核酸である。

0043

[00108] 本明細書で用いられる場合、用語「発現ベクター」は、転写され得る遺伝子産物の少なくとも部分をコードする核酸配列を含有するベクターを意味する。発現ベクターは、様々な調節配列を含有することができ、その調節配列は、特定の宿主生物体における、作動可能に連結されたコード配列の転写および場合により、翻訳に必要な核酸配列を指す。転写および翻訳を支配する調節配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能を果たす核酸配列もまた含有してもよい。その用語はまた、インビトロまたはインビボのいずれかで、宿主細胞へ送達されるポリヌクレオチドを含む組換えプラスミドまたはウイルスを含む。好ましくは、宿主細胞は、一過性細胞株または安定細胞株であり、より好ましくは、哺乳動物宿主細胞であり、HEK293、CHO、およびNSOからなる群から選択される。

0044

[00109] 本明細書で用いられる場合、用語「対象」は、ヒト、またはイヌネコウマウシブタヒツジヤギニワトリサルラット、およびマウスを含む脊椎動物を意味する。

0045

[00110] 本明細書で用いられる場合、用語「治療的有効量」は、研究者獣医医師、または他の臨床医が達成しようと努力している、組織、系、動物、またはヒトの生物学的または医学的応答を引き起こすだろう対象化合物の量を意味する。

0046

[00111] 本明細書で用いられる場合、用語「薬学的に許容される」は、担体希釈剤、または賦形剤が、製剤の他の成分と適合し、かつそのレシピエントにとって有害ではないことを意味する。

0047

[00112] 本明細書で用いられる場合、用語「組換え体」は、一般的に天然で見出されるものとは異なる遺伝的実体を意味する。ポリヌクレオチドまたは遺伝子に適用される場合、これは、そのポリヌクレオチドが、天然で見出されるポリヌクレオチドとは異なる構築物の産生を生じる、クローニング、制限、および/またはライゲーション工程、ならびに他の手順の様々な組み合わせの産物であることを意味する。

0048

[00113] 本明細書で用いられる場合、用語「実質的同一性」または「実質的類似性」は、核酸またはその断片に言及される時は、別の核酸(またはその相補鎖)と、適切なヌクレオチド挿入または欠失を含めて最適に整列した場合、その配列の少なくとも約95〜99%においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。

0049

[00114] 用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は、アミド結合によって共有結合された少なくとも2個のアミノ酸の配列重合体を表示するように、交換可能に用いられる。

0050

[00115] 本明細書で用いられ、かつペプチドに関する場合、用語「相同の」は、2つのペプチド間のアミノ酸配列類似性を指す。そのペプチドの両方におけるアミノ酸位置が、同一のアミノ酸によって占有される場合、それらはその位置において相同である。したがって、「実質的に相同の」は、全てというわけではないが、大部分は、相同であるアミノ酸配列であって、それが相同である配列の活性の大部分または全部を保持する、アミノ酸配列を意味する。本明細書で用いられる場合、「実質的に相同の」は、配列が、参照ペプチドと少なくとも50%同一であり、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは95%相同性であることを意味する。ペプチドが、非改変ペプチドと実質的に同じ活性または機能を有する限り、本明細書に開示された配列のアミノ酸配列の微量なバリエーション、欠失、置換、または誘導体化などの追加のペプチド配列改変が含まれる。とりわけ、改変ペプチドは、非改変ペプチドに関連した活性または機能を保持するだろうし、改変ペプチドは、一般的に、非改変配列のアミノ酸配列と「実質的に相同な」アミノ酸配列を有する。

0051

[00116] 本明細書で用いられる場合、用語「投与すること」は、宿主対象の(必要に応じて)中へ、または上への組成物の実際の物理的導入として定義される。組成物を対象の中へ導入するありとあらゆる方法は、本発明により企図される;方法は、導入のいかなる特定の手段にも依存せず、そのように解釈されるべきではない。導入の手段は当業者によく知られており、好ましくは、組成物は、皮下に、または腫瘍内に投与される。1つより多い経路を投与のために用いることができるが、特定の経路が、別の経路より、より迅速で、かつより効果的な反応を提供することができることを当業者は認識しているだろう。局所的または全身的送達は、体腔への免疫ワクチンの適用もしくは滴下エアロゾル吸入もしくは吸送を含む投与により、または筋肉内、静脈内、門脈内肝臓内腹膜、皮下、もしくは皮内投与を含む非経口導入により、達成することができる。腫瘍が中枢神経系内にある場合、中枢神経系において免疫系のプライミングがないため、組成物は、腫瘍内に投与されなければならない。

0052

[00117]化学療法剤は、「免疫原性」腫瘍細胞死を誘導し、樹状細胞による抗原の交差提示を促進することができるが、腫瘍は、自然免疫応答および適応免疫応答の活性化を抑制し、かつ免疫エフェクター細胞による免疫的攻撃を腫瘍が逃れることを可能にする免疫寛容誘発環境を生み出す。本発明は、腫瘍微小環境における腫瘍誘発性免疫寛容に対抗するストラテジーを提供し、播種性癌細胞に対するT細胞媒介性適応抗腫瘍免疫を活性化および活用することにより、化学療法の抗腫瘍効力を増強することができる。

0053

[00118] 本発明は、本発明の標的化された免疫調節性抗体または融合タンパク質が、癌細胞の免疫寛容に対抗し、またはそれを逆転させることができるという発見に基づいている。癌細胞は、化学療法剤または腫瘍を標的とする抗体による排除を、腫瘍微小環境における特異的免疫抑制機構を介して避れることができ、そのような癌細胞の能力は、免疫寛容として認識されている。腫瘍誘発性免疫寛容に対抗することにより、本発明は、任意に別の既存の癌処置と併用した、癌処置のための効果的な組成物および方法を提供する。

0054

[00119] 本発明は、腫瘍微小環境における免疫寛容に対抗し、かつ再発性または播種性癌に対する耐久性のある長期保護の維持のためのT細胞媒介性適応抗腫瘍免疫を促進する融合タンパク質を作製するための組成物および方法を提供する。これらの融合タンパク質は、以下の少なくとも1つにより腫瘍細胞に対する効果的な長期T細胞媒介性免疫応答を促進するように設計される:
a.抗体依存性細胞傷害性(ADCC)の増強を介して腫瘍細胞の死を促進すること;および
b.制御性T細胞および骨髄系サプレッサー細胞によって媒介される免疫抑制を無効にすることにより抗腫瘍CD8+ T細胞の活性化および増殖を増加させること。これらの抗腫瘍免疫応答は、腫瘍細胞の免疫エフェクター媒介性細胞傷害性に対する感受性並行して活性化され、それにより、腫瘍細胞切除(cytoreduction)を増強し、かつ適応抗腫瘍免疫を強化するポジティブフィードバックループを確立し得る。

0055

[00120] 加えて、本発明の融合タンパク質は、以下の態様の少なくとも1つにおいて、既存の治療用分子と区別され、かつそれらより優れている:(i)腫瘍微小環境における免疫寛容に対抗し、かつ(多様な癌の防止または処置として)再発性または播種性癌に対する長期保護の維持のためにT細胞媒介性適応抗腫瘍免疫を促進すること;(ii)多様な癌の養子(adoptive)細胞治療のための免疫細胞組成物を作製すること、および(iii)多様な癌または感染性疾患の予防のための免疫アジュバントまたはワクチンとして機能すること。

0056

[00121] 本発明の標的化された免疫刺激性抗体および/または融合タンパク質は、腫瘍微小環境における免疫抑制ネットワーク破壊する能力を提供する。腫瘍は、免疫応答を回避または抑制する豊富制御機構を利用する。癌細胞は、抗原提示樹状細胞(DC)の分化および成熟を阻害するサイトカインおよび分子の発現を介して、腫瘍微小環境における免疫寛容を能動的に促進する。腫瘍細胞により産生される免疫抑制性サイトカインおよびリガンドには以下が挙げられる:(i)トランスフォーミング成長因子−β(TGF-β);(ii)プログラム死−1リガンド1(PD-L1;B7-H1);(iii)血管内皮成長因子VEGF);および(iv)インターロイキン−10(IL-10)。

0057

[00122]樹状細胞(DC)成熟をブロックすることに加えて、これらの分子は、免疫抑制性CD4+ T細胞(制御性T細胞;Treg細胞)および骨髄系由来サプレッサー細胞(MDSC)の特定化されたサブセットの発生を促進する。Tregは、CD25[インターロイキン−2(IL-2)受容体cc鎖]およびフォークヘッドボックスP3(FOXP3)転写因子を構成的に発現するCD4+ T細胞の少数派亜集団である。Treg(CD4+CD25+FoxP3+細胞)は、インビトロおよびインビボで、CD4 T細胞およびCDS T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞およびNKT細胞B細胞、ならびに抗原提示細胞APC)を含む広範な免疫細胞の活性化、増殖、およびエフェクター機能を制限することにより免疫寛容を維持する。

0058

[00123]腫瘍微小環境におけるTreg細胞の蓄積は、腫瘍免疫寛容を強化し、腫瘍進行および転移を促進する。免疫抑制性サイトカイン(TGF-β;PD-L1)および腫瘍浸潤性Tregの発現の増加は、多様な型の癌を有する患者生存の低下と相関している。本発明の融合タンパク質は、標的化された腫瘍細胞または腫瘍浸潤性Treg細胞および骨髄系サプレッサー細胞(DCまたはMDSC)によって発現した鍵となる免疫抑制性分子を阻害する。したがって、それらは、腫瘍微小環境内におけるTregの発生または機能を阻害する標的化された能力を提供する。

0059

[00124] 本発明は、新生物疾患を防止または処置する方法を提供する。方法は、それを必要としている対象への、別の抗癌治療と併用した、本発明の1つまたは複数の融合タンパク質の投与を含み、その抗癌治療は、化学療法分子、抗体、小分子キナーゼ阻害剤、ホルモン剤、細胞傷害性物質、標的化された治療剤抗血管新生薬、電離放射線、紫外線照射、凍結融解壊死治療、熱剥離、またはラジオ波焼灼療法である。

0060

[00125] 本明細書で用いられる場合、用語「抗体」は、天然または人工の、一価または多価抗体を含み、それには、ポリクローナルモノクローナル、多特異性の、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体一本鎖抗体Fab断片、F(ab’)断片、Fab発現ライブラリーによって作製される断片、抗イディオタイプ(抗Id)抗体(例えば、本発明の抗体に対する抗Id抗体が挙げられる)、および上記のいずれかのエピトープ結合断片が挙げられるが、それらに限定されない。抗体は、トリおよび哺乳動物を含む任意の動物起源由来であってもよい。一態様において、抗体は、ヒト、マウス(例えば、マウスおよびラット)、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモットラクダ、ウマ、またはニワトリ由来であり、またはそれらに由来する。さらに、そのような抗体は、抗体のヒト化型であってもよい。抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはより多い多重特異性であってもよい。本明細書における抗体には、具体的には、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種由来の、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であると同時に、その鎖(複数可)の残りが、別の種由来の、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体、加えて、所望の生物活性を示す限りは、そのような抗体の断片が挙げられる。

0061

[00126] 本明細書に開示された組成物および方法に組み入れることができる抗体の例には、トラスツズマブ(抗HER2/neu抗体);ペルツズマブ(抗HER2 mAb);セツキシマブ(上皮成長因子受容体EGFRに対するキメラモノクローナル抗体):パニツムマブ(抗EGFR抗体);ニモツズマブ(抗EGFR抗体);ザルツムマブ(抗EGFR mAb);ネシツムマブ(抗EGFR mAb);MDX−210(ヒト化抗HER-2二重特異性抗体);MDX-210(ヒト化抗HER-2二重特異性抗体);MDX−447(ヒト化抗EGF受容体二重特異性抗体);リツキシマブ(キメラマウス/ヒト抗CD20 mAb);オビヌツズマブ(抗CD20 mAb);オファツムマブ(抗CD20 mAb);トシツモマブ−1131(抗CD20 mAb);イブリツモマブチウキセタン(抗CD20 mAb);ベバシズマブ(抗VEGF mAb);ラムシルマブ(抗VEGFR2 mAb);ラニビズマブ(抗VEGF mAb);アフリベルセプト(IgGl Fcに融合したYEGFR1およびVEGFR2の細胞外ドメイン):AMG386(IgGl Fcに融合したアンジオポエチン−1および−2結合ペプチド);ダロツズマブ(抗lGF-lR mAb):ゲムツズマブオゾガマイシン(抗CD33 mAb);アレムツズマブ(抗Campath-l/CD52 mAb);ブレツキシマブベドチン(抗CD30 mAb);カツマキソマブ(上皮細胞接着分子およびCD3を標的とする二重特異性mAb);ナプツモマブ(抗5T4 mAb);ギレンツキシマブ(抗炭酸脱水酵素ix):またはファルレツズマブ(抗葉酸受容体)が挙げられるが、それらに限定されない。他の例には、Panorex(商標)(17-1 A)(マウスモノクローナル抗体);Panorex(@(17-1 A)(キメラマウスモノクローナル抗体);BEC2(抗イディオタイプmAb、GDエピトープ模倣する)(BCGと共に):Oncolym(Lym-1 モノクローナル抗体);SMARTM l 95 Ab、ヒト化13’1 LYM−1(Oncolym)、Ovarex(B43.13、抗イディオタイプマウスmAb);腺癌上のEGP40(17-1 A)汎癌腫(pancarcinoma)抗原に結合する3622W94 mAb;Zenapax(SMART抗Tac(IL-2受容体);SMART Ml 95 Ab、ヒト化Ab、ヒト化);NovoMAb−G2(汎癌腫特異的Ab):TNTヒストン抗原に対するキメラmAb);TNT(ヒストン抗原に対するキメラmAb);GJiomab−H(モノクローナル抗体 − ヒト化Ab);GN1−250Mab;EMD−72000(キメラ-EGFアンタゴニスト);LymphoCide(ヒト化IL.L.2抗体);およびMDX−260二重特異性、GD−2を標的とする、ANA Ab、SMART lDiO Ab、SMART ABL364 Ab、またはImmuRAIT−CEAなどの抗体が挙げられる。

0062

[00127] 抗体を作製するために様々な方法が用いられている。単一の型の抗体を産生するクローン化細胞株を指すハイブリドーマテクノロジーは、マウス(ネズミ)、ハムスター、ラット、およびヒトを含む様々な種の細胞を用いる。抗体を調製するための別の方法は、組換えDNA技術を含む遺伝子操作を用いる。例えば、これらの技術から作製された抗体には、とりわけ、キメラ抗体およびヒト化抗体が挙げられる。キメラ抗体は、1つより多い型の種由来のDNAコード領域を組み合わせる。例えば、キメラ抗体は、可変領域がマウスに由来し、定常領域がヒトに由来する。ヒト化抗体は、それが非ヒト部分を含有したとしても、大部分はヒトに由来する。キメラ抗体と同様に、ヒト化抗体は、完全にヒトの定常領域を含有してもよい。しかし、キメラ抗体とは違って、可変領域は、部分的にヒトに由来してもよい。ヒト化抗体の非ヒトの合成部分は、マウス抗体におけるCDRに由来する場合が多い。いずれにしても、これらの領域は、その抗体が特定の抗原を認識し、かつ結合することを可能にするのに重要である。

0063

[00128] 一実施形態において、ハイブリドーマは、標的化部分および免疫調節性部分を含む標的化された融合タンパク質を産生することができる。一実施形態において、抗体、抗体断片、またはポリペプチドを含む標的化部分は、リンカーと共に、またはリンカーなしで、ポリペプチドからなる免疫調節性部分に連結または融合している。リンカーは、アミノ酸リンカーであり得る。一実施形態において、リンカーは、(GGGGS)n(式中、nは1、2、3、4、5、6、7、または8である)である。例えば、GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号4)。別の実施形態において、リンカーは、EPKSCDK(配列番号11)である。様々な態様において、リンカーの長さは、標的部分の結合または免疫調節性部分の機能を最適化するように改変され得る。様々な態様において、免疫調節性部分は、標的化抗体の重鎖またはFc含有融合タンパク質のFc領域のC末端に融合するポリペプチドである。別の態様において、免疫調節性部分は、標的化抗体の軽鎖のC末端に融合するポリペプチドである。

0064

[00129]抗体断片は、無傷抗体の一部(例えば、その抗原結合領域または可変領域が挙げられる)を含むことができる。抗体断片の例には、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv断片;Fc断片またはFc融合産物ダイアボディ;線状抗体;一本鎖抗体分子;および抗体断片(複数可)から形成された多特異性抗体が挙げられる。無傷抗体は、抗原結合性可変領域、加えて、軽鎖定常領域(CL)ならびに重鎖定常領域、CH1、CH2、およびCH3を含むものである。定常ドメインは、天然の配列定常ドメイン(例えば、ヒト天然配列定常ドメイン)またはそのアミノ酸配列バリアントもしくは任意の他の修飾されたFc(例えば、グリコシル化または他の操作されたFc)であってもよい。

0065

[00130] 本発明の融合タンパク質は、当技術分野において知られた通常の技術により、例えば、固相ペプチド合成などの化学合成により、合成されてもよい。そのような方法は、当業者に知られている。一般的に、これらの方法は、当技術分野においてよく知られた、固相かまたは溶液相のいずれかの合成方法を用いる。具体的には、方法は、1つまたは複数のアミノ酸または適切に保護されたアミノ酸の成長ペプチド鎖への逐次付加を含む。通常、最初のアミノ酸のアミノ基かまたはカルボキシル基のいずれかが、適切な保護基によって保護される。その後、保護された、または誘導体化されたアミノ酸は、アミド結合を形成するのに適した条件下で、適切に保護された、相補(アミノまたはカルボキシル)基を有するその配列において次のアミノ酸を付加することで、不活性固体支持体に付着するか、または溶液中で利用することができる。その後、保護基は、この新しく付加されたアミノ酸残基から除去され、その後、(適切に保護された)次のアミノ酸が付加される、など。結局、所望のアミノ酸は、正しい配列において連結されており、いかなる残存する保護基もいかなる固体支持体も逐次的か、または同時かのいずれかで除去されて、最終ポリペプチドが得られる。この一般的な手順の簡単な改変により、一度に1個より多いアミノ酸を成長鎖へ付加することが可能であり、例えば、保護されたトリペプチドを適切に保護されたジペプチドと(キラル中心ラセミ化しない条件下で)カップリングさせて、脱保護後、ペンタペプチドを形成することにより、これが可能である。

0066

[00131] 典型的な保護基には、t−ブチルオキシカルボニル(Boc)、9−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、ベンジルオキシカルボニルCbz)、p−トルエンスルホニル(Tos);2,4−ジニトロフェニルベンジル(Bzl)、ビフェニルイソプロピルオキシカルボキシカルボニルシクロヘキシルイソプロピルアセチル、o−ニトロフェニルスルホニルなどが挙げられる。これらのうち、BocおよびFmocが好ましい。

0067

[00132] 典型的な固体支持体は、一般的に、架橋したポリマー材料である。これらには、ジビニルベンゼン架橋スチレンに基づいたポリマー、例えば、ジビニルベンゼン−ヒドロキシメチルスチレンコポリマー、ジビニルベンゼン−クロロメチルスチレンコポリマー、およびジビニルベンゼン−ベンズヒドリルアミノポリスチレンコポリマーが挙げられる。p−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を用いる、本明細書に図示されているようなジビニルベンゼン−ベンズヒドリルアミノポリスチレンコポリマーは、末端アミ官能基をペプチド鎖へ直接導入するという利点を提供し、その機能は、鎖が支持体から切断された場合、その鎖によって保持される。

0068

[00133] 一つの方法において、ポリペプチドは、アミドペプチド型の合成を可能にする樹脂を用い、かつ標準溶媒および試薬と共にt−Bocアミノ酸誘導体(Peninsula Laboratories, Inc.)を用いる、例えば、Applied Biosystems,Inc.(ABI)430Aペプチド合成機における通常の固相化学合成により調製される。L−アミノ酸かまたはD−アミノ酸のいずれかを含有するポリペプチドは、この様式で合成されてもよい。ポリペプチド組成物は、定量的アミノ酸分析により確認され、各ペプチドの特定の配列は、配列分析により決定されてもよい。

0069

[00134] 好ましくは、ポリペプチドは、所望のポリペプチドをコードするDNAを合成することによる組換えDNA技術により作製することができる。いったん所望のポリペプチドについてのコード配列が合成または単離されたならば、それらは、発現のために任意の適切なベクターへクローニングすることができる。多数のクローニングベクターが当業者に知られており、適切なクローニングベクターの選択は選択できる事柄である。遺伝子は、プロモーター、(細菌発現について)リボソーム結合部位、および任意に、オペレーター(まとめて、本明細書では「調節」エレメントと呼ばれる)の調節下に置くことができ、その結果、所望のポリペプチドをコードするDNA配列は、この発現構築を含有するベクターによって形質転換された宿主細胞においてRNAへ転写される。コード配列は、シグナルペプチドまたはリーダー配列を含有してもよいし、含有しなくてもよい。異種性リーダー配列は、宿主生物体からの発現したポリペプチドの分泌を引き起こすコード配列に付加することができる。宿主細胞の成長に関連してタンパク質配列の発現の制御を可能にする他の制御配列もまた望ましい場合がある。そのような制御配列は、当業者に知られており、例として、制御化合物の存在を含む化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにするものが挙げられる。制御エレメントの他の型もまた、ベクター内に存在してもよく、例えば、エンハンサー配列である。

0070

[00135]調節配列および他の制御配列は、上記のクローニングベクターなどのベクターへの挿入の前にコード配列にライゲーションされてもよい。あるいは、コード配列は、調節配列および適切な制限部位をすでに含有する発現ベクターへ直接、クローニングすることができる。

0071

[00136] その後、発現ベクターは、適切な宿主細胞を形質転換するために用いられてもよい。いくつかの哺乳動物細胞株が当技術分野において知られており、それらには、American Type Culture Collection(ATCC)から入手可能な不死化細胞株が挙げられ、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、HEK293、ベビーハムスター腎臓(BHK)細胞、サル腎臓細胞(COS)、ヒト肝細胞癌細胞(例えば、Hep G2)、メイディンダービー・ウシ腎臓(「MDBK」)細胞、肉腫などの癌腫細胞由来のNOS細胞、およびその他があるが、それらに限定されない。同様に、大腸菌枯草菌、および連鎖球菌種などの細菌宿主が、本発現構築物と共に用いられる。本発明において有用な酵母宿主には、とりわけ、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、カンジダアルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・マルトーサ(Candida maltosa)、ハンゼヌラポリモーファ(Hansenula polymorpha)、クルイベロミセスフラギリス(Kluyveromyces fragilis)、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)、ピキア・ギリエルモンディ(Pichia guillerimondii)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)、およびヤロウィアリポリティカ(Yarrowia lipolytica)が挙げられる。バキュロウイルス発現ベクターと共に用いられる昆虫細胞には、とりわけ、ネッタイシマカAedes aegypti)オートグラファ・カリフォルニア(Autographa californica)、カイコ(Bombyx mori)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)、およびイラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)が挙げられる。そのタンパク質はまた、トリパノソーマにおいて発現してもよい。

0072

[00137] 選択された発現系および宿主に依存して、本発明のタンパク質は、対象とするタンパク質が発現する条件下で上記の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞を成長させることにより産生される。その後、タンパク質は、宿主細胞から単離され、精製される。発現系がそのタンパク質を成長培地へ分泌する場合には、そのタンパク質は、培地から直接、精製することができる。そのタンパク質が分泌されない場合には、それは、細胞可溶化物から単離される。適切な成長条件および回収方法の選択は当業者の能力の範囲内である。いったん精製されたならば、そのタンパク質のアミノ酸配列は、すなわち、エドマン分解、続いてHPLCによるアミノ酸分析のサイクルの繰り返しにより決定することができる。アミノ酸シーケンシングの他の方法もまた当技術分野において知られている。

0073

[00138] いったん合成され、または別の方法で作製されたならば、候補ポリペプチド阻害活性は、例えば、マウス内皮細胞を用いることにより、NF−κBのリポ多糖誘導性核移行を阻害する候補物質の能力を評価することにより試験することができる。

0074

[00139] 本発明の融合タンパク質は、非限定的に、液体溶液または懸濁液、錠剤丸薬粉末、座剤、高分子マイクロカプセルまたはマイクロベシクルリポソーム、および注射用または注入用溶液などの様々な剤形治療用組成物へ製剤化することができる。好ましい形は、投与様式および標的とされる特定の癌型に依存する。組成物はまた、好ましくは、ヒト血清アルブミンイオン交換体アルミナレシチンリン酸塩などの緩衝物質グリシンソルビン酸ソルビン酸カリウム、および硫酸プロタミンなどの塩または電解質などの、当技術分野においてよく知られた、薬学的に許容される媒体、担体、または補助剤を含む。適切な媒体は、例えば、水、食塩水デキストロースグリセロールエタノールなど、およびそれらの組み合わせである。そのような組成物を調製する実際の方法は、当業者に知られており、または明らかであろう。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Company、Easton、Pa.、第18版、1990を参照。

0075

[00140] 上記の組成物は、非限定的に、静脈内、腹腔内、経口、リンパ管内、または皮下投与を含む通常の送達様式を用いて投与することができる。問題の腫瘍への、または炎症部位への局所投与、例えば、関節炎関節への直接的注射もまた、本発明と共に用いられる。

0076

[00141]治療的有効用量は、当業者によって容易に決定され、疾患の重症度および経過、患者の健康状態、および処置に対する応答、ならびに処置する医師の判断に依存する。

0077

[00143] 以下は、本発明を実行するための特定の実施形態の例である。その例は、例証のみを目的として提供され、決して、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。用いられる数(例えば、量、温度など)に関して正確さを保証するために努力がなされているが、いくらか実験誤差および偏差は、当然のことながら、許容されるべきである。

0078

[00144] (実施例1)
[00145]免疫調節物質サプレッサーかまたはアクチベーターのいずれか)リガンドに連結されたIgG重鎖を含む融合タンパク質を、CHO細胞の発現のためにコドン最適化遺伝子により発現させた。配列番号12〜28により定義されたコドン最適化ヌクレオチド配列が、(CHO)細胞において発現し、発現したキメラ/融合タンパク質は表1に示されている。

0079

0080

[00146]発現したタンパク質を、SDS PAGEを用いることにより特徴づけ、発現した融合タンパク質抗HER2/neu−TGFβRIIおよび抗EGFR1−TGFβRIIを、プロテインAカラムを用いて培養上清から精製し、その結果は図22に示されている。注目すべきことには、抗EGFR1−TGFβRII軽鎖の質量が、より高く、それは、軽鎖および重鎖の可変領域上の2つのグリコシル化部位の存在のためである可能性がある。抗HER2/neu−TGFβRII重鎖および抗EGFR1−TGFβRII重鎖の質量はどちらも、TGFβRIIのためにより高い。また、抗HER2/neu−TGFβRII重鎖は、4つのN−グリコシル化部位を有し、一方、抗EGFR1−TGFβRIIは5つのN−グリコシル化部位を有する。

0081

[00147] (実施例2)
[00148]プロテインA/SECクロマトグラフィー。抗HER2/neu−TGFβRIIおよび抗EGFR1−TGFβRII試料を、プロテインA/SECクロマトグラフィーにより分析し、その結果は図23に示されている。図23Aは、TGFβRII領域に存在する3つの追加のN−グリコシル化部位があるので、Bmab200(ハーセプチン)の溶出の鋭いピーク対より幅広溶出ピークが、グリコシル化の存在による不均一性の度合いであると考えられることを示す。注目すべきことには、−80Cでの保存が、凝集を引き起こさなかった。SECカラムにおける初期でのピークの位置または出現シフトは、分子量の増加が融合パートナーによることを示している。これにより、完全長分子が発現しつつあることが再度、確認される。図23Bは、Bmab200(ハーセプチン)の溶出の鋭いピーク対より幅広い溶出ピークを示し、TGFβRII領域に存在する3つの追加のN−グリコシル化部位があるので、グリコシル化部位の存在による不均一性の度合いであると考えられる。この場合もやはり、−80Cでの保存が、凝集を引き起こさなかった。SECカラムにおける初期でのピークの位置または出現のシフトは、分子量の増加が融合パートナーによることを示している。これにより、完全長分子が発現しつつあることが、再度確認される。

0082

[00149] (実施例3)
[00150]融合タンパク質についての機能アッセイ。抗HER2/neu−TGFβRIIおよび抗EGFR1−TGFβRIIのTGFβへの結合能力を調べるためにELISA実験を行った。図24Aは、抗HER2/neu−TGFβRII分子および抗EGFR1−TGFβRII分子がTGFβに結合することを示し、その融合タンパク質が機能しうることを表している。図24Bは、抗HER2−TGFβRIIが、Bmab200(ハーセプチン)と同様に、BT474細胞株の増殖を阻害することを示している。図25は、抗EGFR1−TGFβRIIが、セツキシマブと同様に、A431細胞株の増殖を阻害することを示している。

0083

[00151] (実施例4)
[00152] 抗HER2/neu−TGFβRII融合タンパク質についての抗体依存性細胞傷害性ADCC活性を導き、そのタンパク質が、細胞上の標的受容体に結合することを決定した。結果は図26に示されており、活性がBT474細胞において決定され、BT474細胞における抗HER2−TGFβRIIのADCC活性(細胞の%溶解)が、Bmab200(ハーセプチン)のそれと類似していることが明らかである。図27は、A431細胞における抗EGFR1−TGFβRIIのADCC活性を示し、そのADCC活性は、セツキシマブのそれと類似している。図28は、抗EGFR1−TGFβRIIおよびセツキシマブと比較した、抗EGFR1−4−1BBのADCC活性を示す。

0084

[00153] (実施例5)
[00154]発現したタンパク質の結合活性。このアッセイの目的は、用量依存的様式で細胞上の標的受容体に結合する、融合タンパク質の機能性を試験することである。図29Aは、抗CTLA4−TGFβRIIのTGFβ1への結合活性が、抗EGFR1−TGFβRIIと同程度であることを示し、Bは、抗CTLA4−TGFβRIIのCTLA4への結合活性を示す。図30Aは、PD1−Fc結合のレベルを決定するための抗CTLA4−TGFβRIIの結合活性を示し、Bは、4−1BBLの結合を決定するための抗EGFR1−4−1BBの結合活性を示す。図31Aは、抗EGFR1−4−1BBのEGFRへの結合活性を示し、Bは、PDL1−Fcを見出すためのPD1−Fc−4−1BBの結合活性を示す。図32は、抗EGFR1−PD1のEGFRおよびPD1への結合活性を示す。

0085

[00155] (実施例6)
[00156]分子の一次構造の確認。図33に示されているように、発現したタンパク質は、分子量およびグリコシル化の存在を決定するために評価される。試料を、還元性および非還元性SDS PAGEによって分析した。抗体の重鎖および軽鎖は、還元アルキル化によって分離され、その結果、還元された構造を評価することができる。融合タンパク質のトリプシン消化により、一次配列の同定がもたらされる。タンパク質のMS/MS分析を実施する。

0086

[00157] 抗HER2/neu−TGFβRIIおよび抗EGFR1−TGFβRIIの質量分析図1に示された融合タンパク質を発現させ、試験した。図34Aは、抗HER2/neu−TGFβRII ECD融合体の軽鎖(LC)(還元型)のマススペクトル/マススペクトルを示し、Bは、抗HER2/neu−TGFβRII ECD融合体のLC(還元型)のデコンボリューション化マススペクトルを示す。図35は、抗HER2/neu−TGFβRII ECD融合体の重鎖(HC)(還元型)のマススペクトルを示す。

0087

[00158]図2に示された融合タンパク質を発現させ、試験した。図36Aは、抗EGFR1−TGFβRII ECDのLC(還元型)のマススペクトルを示し、Bは、抗EGFR1−TGFβRII ECDのLC(還元型)のデコンボリューション化マススペクトルを示す。図37は、抗EGFR1−TGFβRII ECDのHC(還元型)のマススペクトルを示す。

0088

[00159] (実施例7)
[00160]図1および2に記載されているようなアミノ酸配列を有する融合タンパク質を、UVクロマトグラフィーを用い、かつ融合タンパク質のトリプシン消化物クロマトグラフィー的分離から生じたクロマトグラムを作成して、点検し、UV218〜222nm波長で試験した。UVトレースに対応する総イオン電流(TIC)もまた評価した。図38Aは、抗HER2/neu−TGFβRII ECD融合タンパク質のトリプシンペプチドのUVクロマトグラムを示し、Bは、抗HER2/neu−TGFβRII ECD融合タンパク質のトリプシンペプチドの総イオンクロマトグラム(TIC)を示す。図39、40、および41は、抗HER2/neu−TGFβRII ECD融合タンパク質の軽鎖、重鎖、および連結モチーフの予想される/観察されたトリプシンペプチドのリストをそれぞれ、提供する。注目すべきことには、軽鎖ペプチドおよび重鎖ペプチドおよび連結モチーフ(TGF βRII)のペプチドを含む、その分子の予想されるペプチド全てが、同定された。

0089

[00161]図42Aは、抗EGFR1−TGFβRII ECD融合タンパク質のトリプシンペプチドのUVクロマトグラムを示し、Bは、抗EGFR1−TGFβRII ECD融合タンパク質のトリプシンペプチドの総イオンクロマトグラム(TIC)を示す。図43、44、45は、抗EGFR1−TGFβRII ECD融合タンパク質の軽鎖、重鎖、および連結モチーフの予想される/観察されたトリプシンペプチドのリストをそれぞれ、提供する。この場合もやはり、軽鎖ペプチドおよび重鎖ペプチドおよび連結モチーフ(TGF βRII)のペプチドを含む、その分子の予想されるペプチド全てが、同定された。

0090

[00162] (実施例8)
[00163]組換え融合タンパク質発現に用いられる宿主細胞株は、CHO細胞、またはCHO細胞の派生物である。本明細書で言及されるCHO細胞は、freedom CHO−S細胞(CHO−S細胞は、高レベル分泌型組換えタンパク質を産生する能力がある、既知組成培地(chemically defined media)中、高密度無血清懸濁培養に適応したCHO派生細胞である)かまたはCHO K1細胞(ATCC番号CCL−61と同じである)のいずれかである。それは基本的に接着性細胞株である。安定細胞株に用いられるベクター:

0091

[00164]ベクターの2つの異なるハイブリッドCMVプロモーターの下流の対象とする1つまたは2つの遺伝子を発現するようにProBioGen AGによって設計されたFreedom pCHO 1.0ベクター。このベクターは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)選択マーカーおよびピューロマイシン抵抗性遺伝子を含有し、MTXおよびピューロマイシンを同時に用いる選択を可能にする。

0092

[00165]軽鎖または軽鎖融合タンパク質をコードする核酸配列を、EF2/CMVプロモーターの調節下で制限酵素部位AvrIIおよびBstZ17にクローニングする。重鎖または重鎖融合タンパク質をコードする核酸配列を、CMV/EF1プロモーターの調節下で制限酵素部位EcoRVおよびPadにおいてクローニングする。

0093

[00166]構築物(複数可)を、Freedom CHO−S細胞/CHOK1細胞にトランスフェクトする。高産生株の単一のクローン細胞系統を、組換え融合タンパク質を産生するために選択する。MCBを調製し、細胞生存率生産性、安定性、および他のパラメーターについて特徴づける。それらの細胞を、培養に用い、続いて精製する。

0094

[00167] (実施例9)
[00168]細胞培養を、フェッドバッチ培養様式で実施する。細胞培養において、用いられる哺乳動物宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞であり、培地は最初に供給される。CHO細胞を、抗体−ペプチド融合タンパク質を産生するように遺伝子操作する。硫酸亜鉛七水和物塩を0.4mMの濃度で培地中に加える。対照的に、対照培地において、いかなる亜鉛塩の添加もない。産生発酵実行を、37±1℃、0.3〜0.45×106細胞/mlの最初の細胞数で開始し、バッチ相において、最初の3〜4日間を、細胞を成長させることに費やす。次の工程は、温度を31±1℃へ低下させ、7日目までその実行を継続することを含む。ラクテートは、その実行を通して、約10〜40%、低下する。その後、産生された融合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーの技術を用いて、培地から収集する。

0095

[00169] (実施例10)
[00170]細胞培養を、フェッドバッチ培養様式で実施する。細胞培養において、哺乳動物宿主細胞、およびHyclone CDM4Mabである培地を最初に供給する。塩(亜鉛)もまた培地に加える(0.3mM)。産生発酵実行を、37±1℃、0.3〜0.45×106細胞/mlの最初の細胞数で開始し、バッチ相において、最初の3〜4日間を、細胞を成長させることに費やす。次の工程は、温度を31+1−1℃へ低下させ、7日目までその実行を継続することを含む。

0096

[00171] (実施例11)
[00172]プロテインAカラムを用いる、抗体−ペプチド融合免疫刺激性分子の精製。融合モノクローナル抗体を含有する組換えCHO細胞株から分泌された上清培養物を、無菌条件下力価および内毒素について試験する。上清を、Mab Select XtraプロテインAアフィニティー樹脂を用いるアフィニティークロマトグラフィーに供し、洗浄し、結合緩衝液平衡化する。上清のpHを、カラムと同じpHへ、0.5Mリン酸塩を用いて調整する;上清を、0.5ml/分の流速で、カラムに結合させ/カラムを通過させ、最大結合を達成させる。全ての抗体−タンパク質融合分子はFc領域を通して結合するが、不純物は、通過画分として排除される。カラムを平衡緩衝液で洗浄し、結合した融合分子を、pH3.0での0.1Mグリシンを用いて溶出させる。溶出したタンパク質のpHを、中性pHまたは安定な製剤pHに調整し、精製されたタンパク質を、−20℃または2〜8℃で保存する。

0097

[00173] (実施例12)
[00174]トラスツズマブとトラスツズマブ−TGF βRII受容体融合分子の差異の認識
[00175] ErbB2受容体を過剰発現する乳癌腫瘍は、恒常的活性化かまたは受容体のErbBファミリーの他のメンバーとのヘテロ二量体化のいずれかにより、腫瘍進行に至る。これは、ErbBシグナル伝達経路と関連した成長因子の結合を含む。これに加えて、その腫瘍は、抑えられた免疫応答に関与するTGF βおよび特定のサイトカインを活性化することにより免疫系が抑制される環境を生み出す。トラスツズマブ(抗ErbB2)が融合タンパク質としてTGF βRII受容体と融合している新規な分子が作製される。トラスツズマブが、ErbB2過剰発現乳癌細胞へ誘導される標的化された分子として働くことが仮定される一方で、TGFβRII受容体は、TGFβを封鎖し、免疫活性化をもたらすだろう。実験は、TGFβ、細胞傷害性CD8陽性細胞、およびNK細胞の存在下で、(ハーセプチンの存在下でBT474細胞を成長させることにより選択された)ハーセプチン抵抗性ErbB2発現細胞株の成長を利用する。トラスツズマブは、細胞傷害性を誘導することにおいて無効であるが、トラスツズマブ TGFβRII受容体融合分子は、TGFβを封鎖し、それにより細胞傷害性CD8およびNK細胞の阻害を防止するだろう。これは、トラスツズマブ単独で処置された細胞と比較して、トラスツズマブ−TGFβRII受容体融合体で処置された細胞において観察される細胞傷害性の増強をもたらすだろう。実験についての読み出しは、存在する生細胞正比例して活性化されるレザズリン色素である、Alamar Blueを用いる。別の方法は、比例した死細胞に直接対応するプロテアーゼ放出を測定するcytotox gloを用いることにより細胞傷害性を測定することであり得る。さらに別の方法は、アネキシンVおよびヨウ化プロピジウムを用いることにより、アポトーシス細胞集団および壊死細胞集団を直接測定するフローサイトメトリーの使用であり得る。これらの複数の実験からの結果は、トラスツズマブ単独と比較して、コンジュゲート分子の活性の理解を明瞭にするだろう。

実施例

0098

[00176] 本発明は、上記の実施例を参照して記載されているが、改変およびバリエーションが、本発明の精神および範囲の内に包含されることは理解されているだろう。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。

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