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技術 細胞培養用インサート及び電気刺激用培養装置

出願人 国立大学法人東北大学
発明者 神崎展
出願日 2019年2月26日 (1年11ヶ月経過) 出願番号 2019-033091
公開日 2020年9月3日 (5ヶ月経過) 公開番号 2020-137418
状態 未査定
技術分野 微生物、その培養処理 微生物・酵素関連装置
主要キーワード スリット無し 幾何学的形 ニッケル被覆炭素繊維 基板プレート 微弱電位 電圧パルス発生装置 不活性フィルム 電気刺激用
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2020年9月3日)のものです。
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図面 (19)

課題

電気刺激に適した細胞培養用インサート及び回路の構成を簡素化した電気刺激用培養装置を提供すること。

解決手段

培養容器ウェル挿入可能な細胞培養用インサート20は、略環状側壁21と、側壁21に取り付けられて細胞培養用インサート20の底部を形成する多孔質膜23とを備え、側壁21の少なくとも一部が通電部としての貫通孔27を備え、貫通孔27が、側壁21の高さ方向における半分の高さよりも細胞培養用インサート20の底部に近い部分に設けられている。

概要

背景

細胞電気刺激を加える電気刺激負荷培養装置として、例えば特許文献1及び2に記載されているような培養装置が知られている。しかしながら、このような従来の電気刺激用培養装置は、細胞を収容する容器の上部と下部に電極が設けられており、二つの電極が細胞を収容する容器に対して垂直に対向する構成である。このため、各容器内の細胞に電流を与えるための培養基板上における回路の配置が複雑となり、電気刺激用培養装置の製造単価が増大する問題がある。

概要

電気刺激に適した細胞培養用インサート及び回路の構成を簡素化した電気刺激用培養装置を提供すること。培養容器ウェル挿入可能な細胞培養用インサート20は、略環状側壁21と、側壁21に取り付けられて細胞培養用インサート20の底部を形成する多孔質膜23とを備え、側壁21の少なくとも一部が通電部としての貫通孔27を備え、貫通孔27が、側壁21の高さ方向における半分の高さよりも細胞培養用インサート20の底部に近い部分に設けられている。

目的

本発明が解決すべき課題は、電気刺激に使用される細胞培養用インサートと、かかる細胞培養用インサートを備え、より単純な回路の配置を有する電気刺激用培養装置とを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

培養容器ウェル挿入可能な細胞培養用インサートであって、略環状側壁と、前記側壁に取り付けられて前記細胞培養用インサートの底部を形成する多孔質膜とを備え、側壁の少なくとも一部が通電部を備え、前記通電部が、前記側壁の高さ方向における半分の高さよりも前記細胞培養用インサートの底部に近い部分に設けられている細胞培養用インサート。

請求項2

前記通電部が、前記側壁に互いに離間して設けられた少なくとも二つの貫通孔を有する請求項1に記載の細胞培養用インサート。

請求項3

前記少なくとも二つの貫通孔が、細胞培養用インサートの軸に対して約150°〜約180°の角度をなして互いに対向する二つの貫通孔である請求項2に記載の細胞培養用インサート。

請求項4

前記少なくとも二つの貫通孔が同じ高さに設けられている請求項2又は3に記載の細胞培養用インサート。

請求項5

前記少なくとも二つの貫通孔が異なる高さに設けられている請求項2又は3に記載の細胞培養用インサート。

請求項6

前記通電部が、前記多孔質膜に設けられている請求項1に記載の細胞培養用インサート。

請求項7

前記通電部が、前記多孔質膜に設けられた少なくとも一つの貫通孔と、前記側壁に設けられた少なくとも一つの貫通孔とを有する請求項6に記載の細胞培養用インサート。

請求項8

前記通電部が、前記側壁の一部を構成する導電性材料から形成された部分を有する請求項1に記載の細胞培養用インサート。

請求項9

前記通電部が、前記側壁の周方向に沿って帯状に形成された1又は複数の部分を有する請求項8に記載の細胞培養用インサート。

請求項10

電気刺激用培養装置であって、基板プレートを備えた培養容器と、前記培養容器内に挿入された請求項1〜9のいずれか一項に記載の細胞培養用インサートと、前記培養容器内に挿入され、前記細胞培養用インサートの側壁と対面し、前記細胞培養用インサートを間に挟んで配置された少なくとも一対の電極と、を備えた電気刺激用培養装置。

技術分野

0001

本発明は、細胞培養用インサート及び電気刺激用培養装置に関する。

背景技術

0002

細胞電気刺激を加える電気刺激負荷培養装置として、例えば特許文献1及び2に記載されているような培養装置が知られている。しかしながら、このような従来の電気刺激用培養装置は、細胞を収容する容器の上部と下部に電極が設けられており、二つの電極が細胞を収容する容器に対して垂直に対向する構成である。このため、各容器内の細胞に電流を与えるための培養基板上における回路の配置が複雑となり、電気刺激用培養装置の製造単価が増大する問題がある。

先行技術

0003

特開2003−225
特開2006−296282

発明が解決しようとする課題

0004

本発明が解決すべき課題は、電気刺激に使用される細胞培養用インサートと、かかる細胞培養用インサートを備え、より単純な回路の配置を有する電気刺激用培養装置とを提供することにある。

課題を解決するための手段

0005

本発明者らは、上記の目的を達成すべく、細胞培養用インサートの側壁の少なくとも一部に通電部を設けることにより、かかる細胞培養用インサートが挿入されたウェルを挟んで該ウェルの軸に対して略平行に互いに対向する一対の電極で細胞に効率的に電気刺激を与えることができることを見出し、本発明を完成するに至った。

0006

すなわち本発明は、以下の項に記載の主題包含する。

0007

項1.培養容器のウェルに挿入可能な細胞培養用インサートであって、略環状の側壁と、前記側壁に取り付けられて前記細胞培養用インサートの底部を形成する多孔質膜とを備え、側壁の少なくとも一部が通電部を備え、前記通電部が、前記側壁の高さ方向における半分の高さよりも前記細胞培養用インサートの底部に近い部分に設けられている細胞培養用インサート。

0008

項2.前記通電部が、前記側壁に互いに離間して設けられた少なくとも二つの貫通孔を有する項1に記載の細胞培養用インサート。

0009

項3.前記少なくとも二つの貫通孔が、細胞培養用インサートの軸に対して約150°〜約180°の角度をなして互いに対向する二つの貫通孔である項2に記載の細胞培養用インサート。

0010

項4.前記少なくとも二つの貫通孔が同じ高さに設けられている項2又は3に記載の細胞培養用インサート。

0011

項5.前記少なくとも二つの貫通孔が異なる高さに設けられている項2又は3に記載の細胞培養用インサート。

0012

項6.前記通電部が、前記多孔質膜に設けられている項1に記載の細胞培養用インサート。

0013

項7.前記通電部が、前記多孔質膜に設けられた少なくとも一つの貫通孔と、前記側壁に設けられた少なくとも一つの貫通孔とを有する項6に記載の細胞培養用インサート。

0014

項8.前記通電部が、前記側壁の一部を構成する導電性材料から形成された部分を有する項1に記載の細胞培養用インサート。

0015

項9.前記通電部が、前記側壁の周方向に沿って帯状に形成された1又は複数の部分を有する項8に記載の細胞培養用インサート。

0016

項10.電気刺激用培養装置であって、基板プレートを備えた培養容器と、前記培養容器内に挿入された項1〜9のいずれか一項に記載の細胞培養用インサートと、前記培養容器内に挿入され、前記細胞培養用インサートの側壁と対面し、前記細胞培養用インサートを間に挟んで配置された少なくとも一対の電極と、を備えた電気刺激用培養装置。

発明の効果

0017

本発明によれば、細胞培養用インサートを電気刺激に適した構成とすることができる。また、細胞への電気刺激の効果を奏しつつ、電気刺激用培養装置の回路の構成を簡素化すると共に製造コストを抑えることができる。

図面の簡単な説明

0018

本発明の実施形態の細胞培養用インサートと、該細胞培養用インサートが挿入された複数のウェルを備えた培養容器と、電極とを備えた電気刺激用培養装置の略斜視図。
本発明の第1実施形態の細胞培養用インサートの(A)略斜視図及び(B)正面図。
本発明の第2実施形態の細胞培養用インサートの(A)略斜視図及び(B)正面図。
本発明の第3実施形態の細胞培養用インサートの(A)略斜視図及び(B)正面図。
本発明の第4実施形態の細胞培養用インサートの(A)略斜視図及び(B)正面図。
本発明の第5実施形態の細胞培養用インサートの(A)略斜視図及び(B)正面図。
本発明の第6実施形態の細胞培養用インサートの(A)略斜視図及び(B)正面図。
本発明の第7実施形態の細胞培養用インサートの(A)略斜視図及び(B)正面図。
本発明の第8実施形態の細胞培養用インサートの(A)略斜視図及び(B)正面図。
本発明の第9実施形態の細胞培養用インサートの(A)略斜視図及び(B)正面図。
別の培養容器の例の略斜視図。
図11の培養容器の平面図。
図12の13−13線で沿った断面図。
図11の培養容器と、培養容器の基板プレートの対向する側壁に取り付けられた一対の電極とを備えた電気刺激用培養装置の略斜視図。
別の培養容器の例の略斜視図。
種々の細胞培養用インサートに収容したヒト筋細胞を電気刺激した場合のマイオカイン(CXCL1)の発現量を示すグラフ
インサートで培養したマウスC2C12筋芽細胞電気パルス刺激中の筋管細胞倒立顕微鏡に設置したCCDカメラを用いて動画撮影し、その収縮能力をImage Jソフトウエアを用いてイメージング解析を行った画像データ。(A)側面にスリット無しのインサートで培養したマウスC2C12筋芽細胞の電気パルス刺激中の筋管細胞の画像データ(B)多孔膜を有する底面と側面に1つスリットを有するインサートで培養したマウスC2C12筋芽細胞の電気パルス刺激中の筋管細胞の画像データ(収縮活動部位が赤く表示される)。(C)スリット無し(A)および1スリット(B)で培養したC2C12筋芽細胞におけるMovement Indexを示すグラフ。
多孔膜を有する底面と側面に1つスリットを有するインサートで培養したヒト骨格筋芽細胞における電気刺激後の(A)CXCL1遺伝子、(B)IL6遺伝子、及び(C)IL8遺伝子の発現量を示すグラフ。(−)EPS無し群、(+)EPS群。

0019

以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。

0020

本発明の実施形態の細胞培養用インサート及び電気刺激用培養装置を図面に従って説明する。

0021

図1に示すように、電気刺激用培養装置50は、培養容器10と、培養容器10内に挿入された細胞培養用インサート20と、培養容器10内に挿入され、細胞培養用インサート20を間に挟んで配置された少なくとも一対の電極30とを備えている。電極30は電極30に取り付けられた導線32を介して電圧パルス発生装置34に接続される。

0022

培養容器10は、基板プレート11と、基板プレート11内に一体的に形成された複数のウェル14とを備えている。ウェル14の数は図では4個のウェルが示されているが、使用される特定の目的に応じて、1、4、8、12、24、48、96、384、1536個又はその他の数のウェルとすることができる。培養容器10は、任意の材料から形成することができ、例えば合成樹脂、金属又はガラスから形成され、好ましくは透明な合成樹脂から形成される。透明な合成樹脂としては例えば、ポリスチレンポリエチレンポリプロピレンポリエチレンテレフタレートポリカーボネートポリ塩化ビニル等が挙げられる。

0023

図2(A)に示すように、細胞培養用インサート20は、略環状(より具体的には略円筒状)の側壁21と、側壁21の一端に側壁21と接続する底壁22と、底壁22に取り付けられた多孔質膜23とを備えている。底壁22及び多孔質膜23は細胞培養用インサート20の底部を形成し、側壁21の一端は多孔質膜23により塞がれているが、側壁21の頂端24は開放されている。多孔質膜23は細胞培養面として作用し、細胞は、細胞培養用インサート20の側壁21及び多孔質膜23に区画形成された収容部25に収容される。側壁21及び底壁22は、合成樹脂、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート等から形成することができるが、これらに限定されない。多孔質膜23は、多孔性不活性フィルム、水化ゲルを含む適当な材料で形成することが出来るが、これらに限定されない。多孔質膜23の孔径は例えば0.05〜50μmであり、好ましくは0.1〜15μmである。多孔質膜23の膜厚は例えば1〜200μmであり、好ましくは10〜100μmである。孔密度は例えば1×104〜1×108、好ましくは1×105〜1×107である。

0024

本実施形態では、側壁21は細胞培養用インサート20の底部に向かうにつれて直線状に先細りする形状となっているが、側壁21の一端から他端まで側壁21の直径が変化しない構成としてもよい。側壁21の頂端24には、細胞培養用インサート20の軸Axに対して略垂直方向に側壁21に対し径方向外側に延びるフランジ26が接続され、フランジ26は細胞培養用インサート20をウェル14に対して支持する把持面を提供する。このため、フランジ26の最大長さはウェル14の内径よりも大きい。

0025

また、細胞培養用インサート20は、側壁21を貫通して延びる2つの貫通孔27を備えている。貫通孔27は通電部として機能する。貫通孔27は本実施形態ではスリットの形状をしており、互いに離間して設けられており、細胞培養用インサート20の軸Axに対して約180°の角度をなして互いに対向している。貫通孔27の長さは特に限定されないが、例えば0.1μm〜1cmであり、より好ましくは1μm〜1mmである。

0026

本実施形態では、2つの貫通孔27が異なる高さに設けられており、一方の貫通孔27は側壁21の高さ方向における半分の高さ(H/2)よりも細胞培養用インサート20の底部に近い部分に設けられているが、別の貫通孔27は側壁21の高さ方向における半分の高さ(H/2)よりも細胞培養用インサート20の頂部に近い部分に設けられている。これは細胞培養用インサート20の底部の方が電気刺激が強く高効率であるためである。2つの貫通孔27が異なる高さに設けられているため、細胞培養用インサート20内から培養液漏れないか又は漏れにくい構造とすることができる。

0027

本実施形態において、貫通孔27の形状は帯状である。より具体的には側壁21を広げたときに貫通孔27は直線状である。貫通孔27の形状は同じであっても異なっていてもよい。側壁21の周方向に沿って貫通孔27が帯状に延びるようにすることにより、後述するように細胞培養用インサート20を間に挟んで配置した一対の電極30(図4及び5)から電流を流したときに、細胞培養用インサート20の内部をより多くの電流がより効率的に流れる。また、2つの貫通孔27を設けることで、電極30の正極と負極に対応させることができるため、電流がより効率的に流れる。

0028

細胞培養用インサート20内の細胞を培養する際には、培養容器10のウェル14により区画形成された空間15に培養液が入れられる。培養液は細胞培養用インサート20の多孔質膜23を浸透し、ウェル14内に配置された細胞培養用インサート20内の細胞は、培養液に浸される。

0029

各ウェル14内の細胞培養用インサート20の外側には、一対の電極30が配置されている。電極30としては例えば炭素電極が挙げられるが、これに限定されない。通常、電極30は、通電時に培養液(図13の符号16参照)中に存在するようウェル14の底部17の上に底部17に接して配置される。一対の電極30は互いに略水平方向に並んで配置されている。本明細書では、水平方向とは重力の方向に垂直な方向を指す。また、一対の電極30は、1又は複数の細胞培養用インサート20の側壁21の対向する側に(より具体的には細胞培養用インサート20の軸Axに対して中心角180°をなして)、細胞培養用インサート20を間に挟んで配置される。本実施形態では、一対の電極30は、各ウェル14の幅方向に延びる対向する壁14aのそれぞれに近接して配置されている。図1では電極30を平板状の平面電極で示しているが、電極30は細胞培養用インサート20の側壁21の形状に適合すべく湾曲させた電極であってもよいし、他の任意の形状でもよい。

0030

一つのウェル14内には1又は複数の細胞培養用インサート20を収容することができ、特には1又は複数行かつ1又は複数列の細胞培養用インサート20を収容することができる。一つのウェル14内に複数個の細胞培養用インサート20を収容することにより、一対の電極30で複数の細胞培養物インサート20内の各細胞に効率よく電気刺激を付加することができ、ハイスループット化が可能となる。

0031

電圧パルス発生装置34により電極30に印加して、ウェル14に挿入された細胞培養用インサート20内の細胞に選択的電気刺激を与えることができる。細胞培養用インサート20には通電部としての貫通孔27が設けられているため、細胞培養用インサート20の収容部25に収容された細胞はより効果的に電気刺激される。電気刺激の大きさ及び持続時間は目的に応じて適宜選択することができる。電気刺激は、好ましくは10〜50V、0.001〜4Hz、1〜24msパルス幅にて0.5〜120時間、更に好ましくは、20〜40V、0.1〜1Hz、1〜24msパルス幅にて2〜24時間与えられる。この電気刺激により、細胞の膜電位依存性チャンネル活性化し、筋細胞サルコメア構造を発達させる。さらに、同時に収縮活動を促進させてエネルギー消費量を高める電極30に対する複数の細胞培養用インサート20の各々の貫通孔27の向きを、電極30に向き合うように合わせれば、電流を複数の細胞培養用インサート20を通ってより均一に流すことができる。

0032

本発明の実施形態の細胞培養用インサート20及びこれを備えた培養装置1並びに電気刺激用培養装置50を用いて培養される細胞は限定されず、電気刺激の対象となる任意の細胞が含まれる。細胞の例としては、例えば、平滑筋細胞心筋細胞、C2C12筋芽細胞等の培養細胞株、若しくはこれら細胞株から培養して分化した筋管細胞等の筋細胞、膵β細胞等の内分泌細胞、及び神経細胞などが挙げられる。

0033

本発明の実施形態の電気刺激用培養装置50を用いて、細胞の各種性質、特性及び/又は機能(例えば、運動、増殖、及び、分化)を調査、研究及び/又は評価することができる。例えば、本発明の実施形態の細胞培養用インサート20を備えた電気刺激用培養装置50を用いて、動物由来繊維芽細胞をウェル14内で培養し、微弱電位刺激を加えることによって心筋細胞へ分化誘導し、さらに分化誘導した心筋細胞に電気刺激を与え、拍動再現を可能とし、培養心筋細胞細胞電位及び/又形態を計測することできる。或いは、動物由来の筋芽細胞をウェル14内で培養し、筋芽細胞を高アミノ酸含有培地で筋管細胞に分化誘導し、分化誘導した筋管細胞に電気刺激を与え、高い糖取り込み代謝能を有する培養筋管細胞を製造作製することができる。高アミノ酸含有培地を用いた筋芽細胞からの筋管細胞の作製方法については特開2006-296282及び特開2008-99616を参照されたい。或いは、筋細胞の電気生理学的機能の解明及び/又は筋細胞に対する薬剤効果の評価を目的とする各種の細胞検査方法を実施することが出来る。

0034

さらには、本発明の実施形態の電気刺激用培養装置50を用いて、動物より採取した筋細胞又は培養筋細胞系を用いて、運動強度と関連して発現量が変動する酵素タンパク質分泌タンパク質、若しくはそれらの受容体、又は、それらをコードする遺伝子を利用した、正常あるいは病態時における運動が、運動強度の評価ならびに筋エネルギー消費をはじめとする総合的な代謝状態に及ぼす影響を低侵襲的かつ簡便に測定することもできる。本発明者らは、筋管細胞の粗精製方法の開発と網羅的遺伝子発現解析などの方法を駆使して、特定の分泌タンパク質及び/又はその受容体をコードする遺伝子が運動依存的に発現変動することを見出し、更に、それらの中で筋の健康状態や代謝を調節するあるいは連関する遺伝子/タンパク質を同定したが(特許第5246740号)、当該特許に開示されている下記の遺伝子群から選択される少なくとも一種類の遺伝子の発現量を測定し、その変動に基づき、筋肉に負荷された運動刺激の強度を検出することができる:(1) C-X-C ligand 1 、(2) C-X-C receptor 7 (CXCR7) 、(3) C-X-C ligand 5 、(4) Oncostatin R 、(5) Wnt inhibitory factor-1 (WIF-1)、 (6) GPR43、 (7)VEGF-D 、(8)SCF/kit-ligand 、(9) COX2、 (10) prrx1、 (11) HDAC9 、(12) Interleukin-6 (IL-6)、 (13) FKBP11、 (14) oxysterol binding protein-like 1 (OSBPL1)、(15) SERPING、(16)Ubiquitin-conjugating enzyme E2B、(17)TBCdomain family member1、(18)Ubiquitin-conjugating enzyme E2N、(19)Fibroblast growth factor 21、(20)Adaptor-related protein complex 2、(21)Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 2、(22)IGFBP5、(23)Ubiquitin specific peptidase 15、(24)CD28 antigen、(25)Epsin 2、(26)Toll interacting protein、(27)von Hippel-Lindau syndrome homolog、(28)Ubiquitin specific peptidase 12、(29)SUMO/sentrin specific peptidase 2、(30)Heme oxygenase (decycling)1、(31)Dual specificity phosphatases 18、(32)Ubiquitin specific peptidase 22、(33)Ubiquitin protein ligase E3A、(34)Protein phosphatase 1、(35)Hect domain and RCC1-like domain、(36)Calpastatin、(37)RABGTPase activating protein 1、(38)Ubiquitin-conjugating enzyme E2L3、(39)interleukin 13 receptor alpha1、(40)RAD23a homolog (S. cerevisiae)、(41)Ubiquitin specific peptidase 9、 (42) Ubiquitin fusion degradation 1 like、(43)protein phosphatases 4 catalytic subunit、(44)ubiquitin-conjugating enzyme E2D3、(45)IGFBP6、(46)Sphingosine phosphate lyase 1、(47)adaptor protein complexAP-2 alpha2 subunit、(48)RAB10、(49)HECT domain containing 1、(50)Ubiquitin specific peptidase 14、(51)Ubiquitin specific peptidase 32、(52)interleukin-1 receptor associated kinase 2、(53)ubiquitin-conjugating enzyme E2M、(52)adaptor-related protein complex 3、 (53)Ubiquitin specific peptidase 4、及び(54)Dual specificity phosphatases 4。

0035

図3は本発明の第2実施形態の細胞培養用インサート20の(A)略斜視図及び(B)正面図である。この例では、細胞培養用インサート20の側壁21に1つの貫通孔27が設けられると共に、多孔質膜23の中心に、多孔質膜23に設けられている複数の孔よりも孔径が大きい、多孔質膜23を貫通して延びる貫通孔29が設けられている。貫通孔29は通電部として機能する。貫通孔27は第1実施形態に関連して説明した通りであり、スリットの形状をしており、側壁21の高さ方向における半分の高さ(H/2)よりも細胞培養用インサート20の底部に近い部分に設けられている。貫通孔29の形状は略円形に示されているが、特に限定されず、略矩形、略矩形以外の多角形楕円形等、他の形状であることができる。貫通孔29の最大長さ又は孔径は特に限定されないが、例えば0.1μm〜1cm、より好ましくは100μm〜5mmである。このような構成によっても、細胞培養用インサート20の内部に電流をより効率的に流すことができる。

0036

図4は本発明の第3実施形態の細胞培養用インサート20の(A)略斜視図及び(B)正面図である。この例では、細胞培養用インサート20の側壁21の同じ高さに2つの貫通孔27が設けられている。

0037

図4(B)に示すように、2つの貫通孔27は、側壁21の高さ方向における半分の高さ(H/2)よりも細胞培養用インサート20の底部に近い部分に設けられていると共に、同じ高さに設けられている。このような構成によっても、細胞培養用インサート20の内部に電流をより効率的に流すことができる。

0038

図5は本発明の第4実施形態の細胞培養用インサート20の(A)略斜視図及び(B)正面図である。この例では、側壁21の貫通孔27が、側壁21の周方向に沿って整列した複数の貫通孔27からなる第1の組と、側壁21の周方向に沿って整列した複数の貫通孔27からなる第2の組とからなる。このような構成によっても、細胞培養用インサート20の内部に電流をより効率的に流すことができる。

0039

図6は本発明の第5実施形態の細胞培養用インサート20の(A)略斜視図及び(B)正面図である。この例では、細胞培養用インサート20の側壁21に、4つの貫通孔27が設けられている。そのうち、2つの貫通孔27は側壁21の高さ方向における半分の高さ(H/2)よりも細胞培養用インサート20の底部に近い部分に設けられている。2つの貫通孔27は側壁21の高さ方向における半分の高さ(H/2)よりも細胞培養用インサート20の頂部に近い部分に設けられている。このような構成によっても、細胞培養用インサート20の内部に電流をより効率的に流すことができる。

0040

図7は本発明の第6実施形態の細胞培養用インサート20の(A)略斜視図及び(B)正面図である。この例では、細胞培養用インサート20の側壁21に、貫通孔27,29の代わりに、導電性材料から形成された部分36が設けられている。導電性材料から形成された部分36は通電部として機能する。導電性材料としては、導電性プラスチック、金属、又はこれらの組み合わせ等が挙げられる。導電性材料は導電性充填剤樹脂に配合した公知の複合材料である。導電性充填剤としては、炭素系物質(カーボンブラックグラファイトカーボンナノチューブグラフェン等)、金属 (銀、銅、ニッケル、スズ、アルミニウムステンレス鋼等を繊維状、フレーク状、樹枝状円筒状、楕円体状等の形状にして利用)、及びこれらの組み合わせ(ニッケル被覆炭素繊維銀めっきアルミニウム粉末等)が挙げられるがこれらに限定されない。

0041

導電性材料から形成された部分36は、側壁21の高さ方向における半分の高さ(H/2)よりも細胞培養用インサート20の底部に近い部分に、側壁21の一部として側壁21の全周に渡って設けられている。このような構成によっても、細胞培養用インサート20の内部に電流をより効率的に流すことができる。

0042

図8は本発明の第7実施形態の細胞培養用インサート20の(A)略斜視図及び(B)正面図である。この例では、細胞培養用インサート20の側壁21に、2箇所の導電性材料から形成された部分36が設けられている。導電性材料から形成された部分36は、各々が側壁21の一端から他端まで延び、細胞培養用インサートの軸Axに対して180°の角度をなして互いに対向している。このような構成によっても、細胞培養用インサート20の内部に電流をより効率的に流すことができる。

0043

図9は本発明の第8実施形態の細胞培養用インサート20の(A)略斜視図及び(B)正面図である。この例では、細胞培養用インサート20の側壁21の全部が、導電性材料から形成された部分36により形成されている。このような構成によっても、細胞培養用インサート20の内部に電流をより効率的に流すことができる。

0044

図10は本発明の第9実施形態の細胞培養用インサート20の(A)略斜視図及び(B)正面図である。この実施形態では、第1実施形態の細胞培養用インサート20と比較して、側壁21の断面形状が略矩形である。側壁21は細胞培養用インサート20の底部に向かうにつれて直線状に先細りしている。本実施形態によっても、細胞培養用インサート20の内部に電流をより効率的に流すことができる。

0045

ここまで、本発明を第1〜9実施形態を例にとって説明してきたが、本発明はこれに限られず、以下のような種々の変形が可能である。
・貫通孔27,29の形状及び数は限定されない。例えば、貫通孔27は合計で1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個以上であってよい。側壁21の高さ方向における半分の高さ(H/2)よりも細胞培養用インサート20の底部に近い部分に設けられた貫通孔27は、少なくとも一つであればよく、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個以上であってもよい。側壁21の高さ方向における半分の高さ(H/2)よりも細胞培養用インサート20の頂部に近い部分に設けられた貫通孔27は0、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個以上であってもよい。多孔質膜23に設けられる貫通孔29は、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個以上であってもよい。
・第1実施形態の細胞培養用インサート20の2つの貫通孔27が細胞培養用インサート20の軸Axに対して互いになす角度、第3実施形態の細胞培養用インサート20の2つの貫通孔27が細胞培養用インサート20の軸Axに対して互いになす角度、及び第6実施形態の細胞培養用インサート20の2つの導電性材料から形成された部分36が細胞培養用インサート20の軸Axに対して互いになす角度は、それぞれ約180°に限定されず、0°よりも大きく180°よりも小さい任意の角度であってよい。ただし、約90°〜180°が好ましく、約150°〜約180°がより好ましい。
図5に示した第4実施形態において、複数の貫通孔27からなる第1の組と、複数の貫通孔27からなる第2の組は、側壁21の周方向に沿って整列していたが、整列する方向は限定されず、例えば細胞培養物インサート20の軸Axに対して平行に整列していてもよい。

0046

図10に示した第9実施形態の細胞培養用インサート20において、細胞培養用インサート20の側壁21の断面形状は先細りせず、断面形状が側壁21の上端から下端まで一定面積の略矩形であってもよい。この場合、平板電極30と側壁21との形状がよく適合し、平板電極30と側壁21とが良好に接触できるため、細胞培養用インサート20の内部に電流をより効率的に流すことができる。
・フランジ26を省略してもよい。その場合、細胞培養物インサート20の底部の多孔質膜23と培養容器10のウェル14の底部17との間にスペースを維持することが望ましい。このため、細胞培養物インサート20が、底面から突出する複数の脚部を備えるか、ウェル14の底部17から突出する突出部を備えることが好ましい。
・側壁21は、断面形状が三角形、矩形、正方形六角形八角形等のように幾何学的形状を形成し得るように相互に関して配置することが望ましい。
・一対の電極30の代わりに、一対よりも多くの電極を用いてもよい。
蓋部材40は省略してもよい。
・培養容器10及び電気刺激用培養装置50は図1に示す実施形態に限定されない。図11は別の培養容器10及び電気刺激用培養装置50の例である。図11において、細胞を培養させるための装置は、培養容器10と、細胞培養用インサート20と、培養容器10に装着される蓋部材40とを備えている。

0047

培養容器10は、基板プレート11と、基板プレート11の側壁13により区画された空間に収容された複数(図では6個)のウェル14とを備えている。培養容器10の材料は第1実施形態に関して説明した通りである。

0048

図12図11の培養容器10の平面図であり、一つの細胞培養用インサート20がウェル14に挿入された状態が示されている。

0049

図13図12の13−13線で沿った断面図である。細胞培養物インサート20は培養容器10のウェル14の上端でフランジ26により支持された状態でウェル14に挿入されている。細胞培養用インサート20の側壁21の外径は、ウェル14により区画形成された空間15内の溶液又は培養液16が毛管作用によって側壁14とウェル14の間を上昇してウェル14からあふれて流出するのを防ぐために、ウェル14の内径よりも十分に小さいことが好ましい。また、多孔質膜23は、培養容器10のウェル14の底部から離間させて上方に配置するのが一般的である。

0050

ウェル14内であって細胞培養用インサート20の外側に一対の電極30が配置されている。通常、電極30は、通電時に培養液16中に存在するようウェル14の底部17の上に配置される。一対の電極30は、細胞培養用インサート20の側壁21の対向する側に(より具体的には細胞培養用インサート20の軸Axに対して中心角180°をなして)、細胞培養用インサート20を間に挟んで配置される。図13では電極30を平板状の平面電極で示しているが、電極30は細胞培養用インサート20の側壁21の形状に適合すべく湾曲させた電極であってもよいし、他の任意の形状でもよい。

0051

図14は、培養容器10の一つのウェル14内に一つの細胞用インサートチャンバー20を挿入するとともに一対の電極30を配置した電気刺激用培養装置50の略斜視図である。一対の電極30は互いに水平方向に並ぶと共に、互いに略平行に配置されている。本実施形態では、一対の電極30は細胞培養用インサート20の側壁と対面し、細胞培養用インサート20を間に挟んでウェル14の軸Axに対して略平行に配置されている。このような構成により、電極30間の複数列のウエル14の各細胞に電気刺激を付加することができ、ハイスループット化が可能となる。
図15は、培養容器10の基板プレート11内に複数の細胞用インサートチャンバー20が配置されており、基板プレート11の対向する面の付近に一対の電極30を配置した電気刺激用培養装置の略斜視図である。一対の電極30は互いに水平方向に並ぶと共に、互いに略平行に配置されている。本実施形態では、一対の電極30は細胞培養用インサート20の側壁と対面し、細胞培養用インサート20を間に挟んで配置されている。このような構成により、電極30間の複数列のウエル14の各細胞に電気刺激を付加することができ、ハイスループット化が可能となる。

0052

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

0053

実施例1マウスC2C12筋芽細胞の電気パルス刺激
マウスC2C12筋芽細胞をインサートチェンバー(スリット無し、1スリット、および2スリット)に播種し、コンフルエントになるまで増殖させ、その後筋管細胞へと分化させた。 なお、「スリット無し」は市販のインサート、「1スリット」は該市販のインサートに対し側面に1つのスリットを設けたインサートに対応し、「2スリット」は該市販のインサートに対し側面に2つのスリットを設けたインサートに対応する。

0054

分化したC2C12筋管細胞を含むインサートチェンバーを電極付き培養装置に設置し、電気パルス刺激(周波数:1 Hz,電圧:20 V/4 cm,パルス幅:2, 4, 8, 16 ms)を16時間にわたり付与した。電気パルス刺激と培養液条件等は特開2006-296282を参照されたい。インサートチェンバー内のC2C12筋管細胞からトータルRNAを抽出し、定法に従ってcDNAを合成後に定量PCR解析を行い、CXCL1遺伝子の発現量を計測した(図16)。

0055

分化したC2C12筋管細胞を含むインサートチェンバー(スリット無し、1スリット)を電極付き培養装置に設置し、電気パルス刺激(周波数:1 Hz,電圧:20V/2.5 cm,パルス幅:8ms)を16時間にわたり付与した後、EPS応答性の収縮能力(Movement Index)を計測した(図17(A)−(C))。Movement Indexの計測については特開2006-296282およびFujita H. et al., Exp.Cell Res.313(9):1853-1865, 2007を参照されたい。

実施例

0056

実施例2 ヒト骨格筋芽細胞の電気パルス刺激
ヒト骨格筋芽細胞(LONZA社、HSMM)をインサートチェンバー(1スリット)に播種し、コンフルエントになるまで増殖させ、その後筋管細胞へと分化させた。分化したヒトHSMM筋管細胞を含むインサートチャンバーを電極付き培養装置に設置し、電気パルス刺激(周波数:1 Hz,電圧:20 V/2.5 cm,パルス幅:4ms)を24時間(8hEPSx3回、各EPSの間に1時間の休憩)にわたり付与した。EPS無し群を対照とした。電気パルス刺激と培養液条件等は特開2006-296282を参照されたい。 インサートチェンバー内のヒトHSMM筋管細胞からトータルRNAを抽出し、定法に従ってcDNAを合成後に定量PCR解析を行い、CXCL1遺伝子、IL6遺伝子及びIL8遺伝子の発現量を計測した(図18(A)−(C))。

0057

10・・・培養容器
11・・・基板プレート
14・・・ウェル
20・・・細胞培養用インサート
21・・・インサート側壁
23・・・多孔質膜
27・・・側壁に設けられた通電部としての貫通孔
29・・・多孔質膜に設けられた通電部としての貫通孔
30・・・電極
36・・・導電性材料から形成された部分
50・・・電気刺激用培養装置

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