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図面 (4)

課題

眼疾患又は眼機能障害治療寛解、又は予防するためのカロテノイド眼組織中に沈着させるための組成物の提供。

解決手段

カロテノイドを含有するリポソームを含む組成物であって、前記組成物はイオントフォレシスデバイス投入され、前記イオントフォレシスデバイスは対象の眼に適用され、そして、前記カロテノイドが、ルテイン及びゼアキサンチンから成る群より選択され、前記リポソームが、正のゼータ電位を有する、組成物。

概要

背景

ルテイン(及びゼアキサンチン)は、その抗酸化及び光保護効果、並びにそれが眼の黄斑に集中的に分布していることにより、AMD(加齢黄斑変性)の発症及び水晶体摘出術リスクの低減と関連付けられている1。加齢は、AMDにおける最も重要なリスク因子の1つであり、典型的には、50を超えた個体が罹患する2〜4。AMDには、「萎縮型AMD」及び「滲出型AMD」の2種類が存在する。萎縮型AMDは、「ドルーゼン」と称される老廃物蓄積の結果として黄斑細胞が損傷された場合に発症する。それは、最も一般的で、重篤度が最も低い種類のAMDである。萎縮型AMDの症状を呈する患者の多くが、滲出型AMDを発症することになると推計され、それは、黄斑の下から異常な血管が成長し、不可逆的な細胞の損傷を引き起こす場合に発症する2〜4。

ルテインは、キサントフィル結合タンパク質を通して、全身循環がルテインを脈絡膜循環(coroidalcirculation)へ運び、黄斑へ取り込むことができるという理由で、経口補
給によって広く用いられてきた5。しかし、いくつかの報告では、少ないパーセントのルテインしか黄斑に到達しないことが示されている6〜8。さらに、眼関門による限界のために、後眼部の治療的治療は困難である。眼は、涙膜角膜硝子体血液網膜関門、及び血液房水関門によって保護されていることから、眼、特に網膜に、充分な濃度及び最小限の副作用で薬物を送達することは非常に困難である9,10。この問題を克服するために、in−situ適用が用いられてきたが、インプラントなどの徐放ステムは、非常に侵襲的であり、高価である。この数年間、多くの研究の結果が、このような治療のリスクを強調している11、12。

最近、ルテインの硝子体内注射が、特定の網膜前膜及びその他の眼の構造体手術中に染色するために用いられている13〜16。これは、ルテインの固有染色効果を利用する黄斑へのルテインのin−situ送達に関する最初のデータである。様々な試験で示されたAMD進行の遅延及び推定される神経保護作用についてのルテインの可能性は、眼内送達に従うin−situ適用によってはまだ証明されていない。予防目的でのルテインの硝子体内注射は、ルテインを黄斑へ送達する戦略としては侵襲的過ぎる可能性があり、患者が許容し難いという欠点を有する。

眼内イオントフォレシスは、経強膜的に及び/又は経角膜的に高濃度ターゲット分子電気の力によって推進させるために用いられる最小侵襲的方法である。それは、対象の分子及び媒体を含有するイオントフォレシスチャンバーに適用される小電流を用いる17。いくつかの報告から、ヒトの眼の黄斑中に高濃度で見られるルテインが、神経保護作用の可能性に加えてAMDの進行を遅延する可能性も有することが明らかにされた18〜20。

概要

眼疾患又は眼機能障害を治療、寛解、又は予防するためのカロテノイド眼組織中に沈着させるための組成物の提供。カロテノイドを含有するリポソームを含む組成物であって、前記組成物はイオントフォレシスデバイス投入され、前記イオントフォレシスデバイスは対象の眼に適用され、そして、前記カロテノイドが、ルテイン及びゼアキサンチンから成る群より選択され、前記リポソームが、正のゼータ電位を有する、組成物。なし

目的

この手法の主たる利点は、より安全で、患者コンプライアンスがより容易である医療デバイスを利用し、頻繁な高用量の注射又は外科的インプラント術といった困難を回避することである

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

カロテノイドを含有するリポソームを含む、カロテノイドを眼組織中に沈着させるためのリポソーム組成物であって、前記組成物イオントフォレシスデバイス投入され、前記イオントフォレシスデバイスは対象の眼に適用され、そして、前記イオントフォレシスデバイスを運転してカロテノイドを眼組織中に沈着し、前記カロテノイドが、ルテイン及びゼアキサンチンから成る群より選択され、前記リポソームが、正のゼータ電位を有する、組成物。

請求項2

前記リポソームが、さらにオクタデシルアミンを含有する、請求項1に記載の組成物。

請求項3

眼疾患又は眼機能障害治療寛解、又は予防するための、請求項1または請求項2に記載の組成物。

請求項4

眼疾患若しくは眼機能障害を治療、寛解、又は予防することが、加齢黄斑変性発症遅延することである、請求項3に記載の組成物。

請求項5

前記眼疾患又は眼機能障害が、加齢黄斑変性である、請求項3に記載の組成物。

請求項6

健康な対象に適用される、請求項3に記載の組成物。

技術分野

0001

本出願は、その全内容が参照により本明細書に援用される2014年12月19日に出願された米国特許出願第62/094,663号の優先権を主張するものである。

0002

本発明は、眼組織への生物活性分子の使用全般に関し、より詳細には、イオントフォレシスを用いたルテイン黄斑への送達に関する。

背景技術

0003

ルテイン(及びゼアキサンチン)は、その抗酸化及び光保護効果、並びにそれが眼の黄斑に集中的に分布していることにより、AMD(加齢黄斑変性)の発症及び水晶体摘出術リスクの低減と関連付けられている1。加齢は、AMDにおける最も重要なリスク因子の1つであり、典型的には、50を超えた個体が罹患する2〜4。AMDには、「萎縮型AMD」及び「滲出型AMD」の2種類が存在する。萎縮型AMDは、「ドルーゼン」と称される老廃物蓄積の結果として黄斑細胞が損傷された場合に発症する。それは、最も一般的で、重篤度が最も低い種類のAMDである。萎縮型AMDの症状を呈する患者の多くが、滲出型AMDを発症することになると推計され、それは、黄斑の下から異常な血管が成長し、不可逆的な細胞の損傷を引き起こす場合に発症する2〜4。

0004

ルテインは、キサントフィル結合タンパク質を通して、全身循環がルテインを脈絡膜循環(coroidalcirculation)へ運び、黄斑へ取り込むことができるという理由で、経口補
給によって広く用いられてきた5。しかし、いくつかの報告では、少ないパーセントのルテインしか黄斑に到達しないことが示されている6〜8。さらに、眼関門による限界のために、後眼部の治療的治療は困難である。眼は、涙膜角膜硝子体血液網膜関門、及び血液房水関門によって保護されていることから、眼、特に網膜に、充分な濃度及び最小限の副作用で薬物を送達することは非常に困難である9,10。この問題を克服するために、in−situ適用が用いられてきたが、インプラントなどの徐放ステムは、非常に侵襲的であり、高価である。この数年間、多くの研究の結果が、このような治療のリスクを強調している11、12。

0005

最近、ルテインの硝子体内注射が、特定の網膜前膜及びその他の眼の構造体手術中に染色するために用いられている13〜16。これは、ルテインの固有染色効果を利用する黄斑へのルテインのin−situ送達に関する最初のデータである。様々な試験で示されたAMD進行の遅延及び推定される神経保護作用についてのルテインの可能性は、眼内送達に従うin−situ適用によってはまだ証明されていない。予防目的でのルテインの硝子体内注射は、ルテインを黄斑へ送達する戦略としては侵襲的過ぎる可能性があり、患者が許容し難いという欠点を有する。

0006

眼内イオントフォレシスは、経強膜的に及び/又は経角膜的に高濃度ターゲット分子電気の力によって推進させるために用いられる最小侵襲的方法である。それは、対象の分子及び媒体を含有するイオントフォレシスチャンバーに適用される小電流を用いる17。いくつかの報告から、ヒトの眼の黄斑中に高濃度で見られるルテインが、神経保護作用の可能性に加えてAMDの進行を遅延する可能性も有することが明らかにされた18〜20。

0007

ここで、本発明者らは、ルテインを網膜に送達する新規な方法を報告するものであり、従って、傍中心窩黄斑領域におけるその存在を大きく高めることができ、それによって
、AMDの進行を遅延させ、網膜内皮細胞を保護することができる。眼科的使用のための様々なイオントフォレシス送達システムが作り出されており、それを用いて、ヒトの前眼部及び後眼部の両方に医薬が安全に、効果的に送達されてきた21。この技術を用いることで、高分子を含む有意な量の生物活性分子を、角膜及び強膜を通して送達することが可能である。ここで報告される研究では、ルテインエマルジョンが、イオントフォレシスにより、黄斑へ拡散送達されている22〜23。発想は、高濃度の荷電ルテインを、経強膜的に(transclerally)及び/又は経角膜的に、イオントフォレシスによって推進する最
侵襲的方法を開発することであった。本発明者らは、強膜及び角膜イオントフォレシス適用後に、二光顕微鏡ラマン分光分析、及びHPLCを用いて様々な眼組織中のルテインの分布及び濃度を調べた。この手法の主たる利点は、より安全で、患者コンプライアンスがより容易である医療デバイスを利用し、頻繁な高用量の注射又は外科的インプラント術といった困難を回避することである。この手順は、手術環境の必要がなく、通常の眼の診療予約過程で、医師診療所にて素早く行うことができる。

0008

低電流を用いてイオン化化合物組織への浸透を向上させる最小侵襲的方法であるイオントフォレシスが、ルテインの眼内送達に有効であることが見出された。14体の有色ウサギを、電流あり又はなし(それぞれ、20.0及び0.0mA)で、ルテインエマルジョンを充填したイオントフォレシスリザーバーの角膜及び強膜への適用によって処理した。イオントフォレシス後、両方の眼(試験及びコントロール)からの眼組織を回収し、処理眼と未処理の反対側の眼とを目視で比較することによってルテインの送達を評価した。経角膜的及び経強膜的イオントフォレシス適用の結果、すべての処理眼において、ウサギ角膜へのルテインの送達が得られた(時間0時間)。ルテインの適用はまた、強膜縁(sclera limbus)にオレンジ色の痕跡を、及び眼の結膜中に僅かなオレンジ色の着色も作り
出し、エマルジョンがこれらの組織にも輸送されたことを示した。この研究では、発明者らは、イオントフォレシスがルテインの眼内送達に有効な技術であることを初めて示した。

0009

本発明では、イオントフォレシス手順後の眼のルテイン分布を評価して、この技術によって高い量のルテインが後部網膜に送達されたことが確認された。結果は、イオントフォレシスが、ルテインの正に荷電したリポソームエマルジョンをウサギの眼に送達する有効な方法であることを示している。さらに、ルテインエマルジョンの最適化された製剤、及び別の選択肢としてのイオントフォレシスプロトタイプを用いて実験を行い、異なる眼組織でのルテイン分布を評価した。

0010

ヒトの死体眼でも試験を行い、低電流を適用して、角膜及び強膜を通してのルテイン送達を評価した。処理及び未処理の眼からの角膜、強膜、脈絡膜、周辺部及び中心部網膜を回収し、ルテイン含有リポソームの分布を可視化するために、二光子顕微鏡で分析した。

0011

経強膜イオントフォレシス適用の結果、後部網膜領域に主としてルテインが送達され、このことから、イオントフォレシス発生後毛様体/毛様体扁平部を介し、続いて受動拡散によって後部網膜に達するまでのルテインの経路が明らかとなった。脈絡膜にルテインが存在しないことは、網膜色素上皮タイトジャンクションのサイズが狭いことによって説明することができ、このことが、より大きいリポソーム小胞の通過を妨げ、それによって、網膜内層中にルテインがトラップされる。

0012

この研究により、発明者らは、新規な最小侵襲的方法を通してルテインを後眼部へin
situ送達することを初めて実証した。結果は、ルテインの強膜イオントフォレシスが、ルテインを黄斑へ送達する有効な戦略であることを実証するものであり、これは、AMDなどの後眼部における疾患を遅延されるために現在用いられている方法の代替法ということになる。

0013

イオントフォレシスは、最小侵襲的方法であるという利点を有しており、従って、化合物の眼内送達の別の選択肢としての方法、すなわち、インプラント及び眼内注射よりも安全である。その結果、イオントフォレシスは、外科的インプラント術又は頻繁な高用量の硝子体内注射といった困難が回避されることから、患者コンプライアンスが高くなる。別の利点は、この技術が、そのような手順よりも安価であり、手術環境の必要なしで、通常の眼の診療予約の過程で、医師の診療所にて素早く行うことができることである。

0014

本特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。カラーの図面を含む本特許又は特許出願公開コピーは、特許申請し、必要な料金を支払うことで提供される。

図面の簡単な説明

0015

図1は、0.9%NaCl(青色)又は蒸留水(赤色)で1:50に希釈したLipo+吸収スペクトル(300から750nm)のチャートであり、コントロールスペクトル(ルテインなしのリポソーム溶液)も示される。
図2は、0.9%NaCl(青色)又は蒸留水(赤色)で1:50に希釈したLipo+蛍光スペクトル(480から650nm)のチャートであり、コントロールスペクトル(ルテインなしのリポソーム溶液)も示される。
図3は、Lipo+溶液粒子サイズ分布及び電荷を算出するための動的光散乱及び電気泳動移動度のチャートであり、蒸留水による1:50希釈物(赤色)を試験し、コントロールとして水による1:50リポソーム希釈物(ルテインなし)も試験した。
図4は、イオントフォレシス適用後のルテインの投射経路の模式図であり、強膜適用は、眼の後部にルテインを沈積させ、一方角膜適用では、ルテインは角膜上皮細胞上に留まった状態で残されており(オレンジ色の点)、矢印は、イオントフォレシス適用後のルテインの進入を示す。

実施例

0016

化合物の「投与」又は化合物を「投与する」の用語は、本発明の化合物を、治療を必要とする個体に、錠剤カプセルシロップ、懸濁液などの経口剤形;IV、IM、又はIPなどの注射用剤形クリームゼリー粉末、又はパッチを含む経皮剤形頬側剤形;吸入用粉末スプレー、懸濁液など;並びに直腸坐薬を含むがこれらに限定されない治療的に有用である形態及び治療有効量でその個体の身体に導入することができる形態で提供することを意味するものと理解されるべきである。

0017

本明細書で用いられる場合、「有効量」の用語は、所望される生物学的応答を誘発するのに必要な量を意味する。当業者であれば理解されるように、コンポジット又は生物活性剤の有効量は、所望される生物的終点、送達されるべき生物活性剤、カプセル化マトリックス組成ターゲット組織などの因子に応じて様々であり得る。

0018

本明細書で用いられる場合、「抽出物」の用語は、抽出によって作製された生成物を意味する。抽出物は、溶媒中の溶液の形態であってよく、又は抽出物は、溶媒を含まないか若しくは実質的に含まない濃縮物又はエッセンスであってもよい。抽出物の用語は、特定の抽出工程若しくは一連の抽出工程から得られた単一の抽出物であってよく、又は抽出物は、別々の抽出工程から得られた抽出物の組み合わせであってもよい。例えば、抽出物「a」は、クランベリーアルコール水溶液で抽出することによって得られてよく、一方抽出物「b」は、クランベリーの超臨界二酸化炭素抽出によって得られてよい。続いて、抽出物a及びbは、組み合わされて、抽出物「c」を形成してもよい。そのような組み合わされた抽出物も、従って、「抽出物」の用語に包含される。

0019

本明細書で用いられる場合、「画分」の用語は、特定の物理的、化学的特性、又は物理的若しくは化学的特性を特徴とする化学化合物の特定の群を含む抽出物を意味する。

0020

癌、感染性疾患、又はその他の医学的疾患若しくは病状などの病状に関連して用いられる場合、「予防する」の用語は、本技術分野において良く理解されており、組成物を受けていない対象と比較して、対象における医学的病状の症状の発生頻度を低下させる、又は発症を遅延する組成物の投与を含む。従って、癌の予防は、例えば、未治療コントロール集団と比較して、予防的治療を受けている患者の集団における検出可能な癌増殖部の数の減少、並びに/又は未治療コントロール集団に対して治療集団における検出可能な癌増殖部の出現の遅延が、例えば、統計的に及び/若しくは臨床的に有意な量で発生することを含む。感染症の予防は、例えば、未治療コントロール集団に対して治療集団における感染症の診断数の減少、及び/又は未治療コントロール集団に対して治療集団における感染症の症状発症の遅延を含む。

0021

「医薬的に許容される」とは、キャリア希釈剤、又は賦形剤が、製剤の他の成分との適合性を有する必要があり、そのレシピエントに対して有害ではないことを意味する。

0022

相乗効果的」の用語は、本技術分野において良く理解されており、全体としての効果が成分の合計よりも大きくなるように一緒に作用する2つ以上の成分を意味する。

0023

「治療する」の用語は、本技術分野において良く理解されており、いずれかの病状又は障害の少なくとも1つの症状を治癒並びに寛解することを意味する。

0024

「予防的又は治療的」治療の用語は、本技術分野において良く理解されており、対象となる組成物の1つ以上をホストへ投与することを含む。望まれない病状(例:ホスト動物の疾患又はその他の望まれない状態)の臨床的発現の前に投与される場合、治療は、予防的であり、すなわち、それは、ホストを望まれない病状の発症から保護するものであり、一方、望まれない病状の発現後に投与される場合、その治療は、治療的である(すなわち、存在する望まれない病状又はその副作用を減少、寛解、又は安定化させることを意図する)。

0025

本発明の化合物は、そのような治療を必要とする対象(ヒト、並びにイヌネコ、及びウマなどの愛玩動物を含む動物)に、最適な医薬的効果を提供する用量で投与されてよい。特定のいずれかの用途での使用に必要とされる用量は、患者によって様々であり、選択された特定の化合物若しくは組成物だけでなく、投与経路によっても、治療されるべき病状の性質、患者の年齢及び病状、併用薬物療法若しくはその場合に患者が従うべき特別な食事制限、並びに当業者であれば認識されるその他の因子に応じて様々であることは理解され、適切な用量は、最終的には、担当医の判断である。

0026

実施例
例1−ウサギの眼におけるルテインの眼内送達
物質及び方法
製剤研究.化合物の安定性を改善するために現在用いられている様々な送達システムの中でも、リポソームは、その生体適合性持続的放出の可能性、及び疎水性及び親水性化合物の両方を運搬する能力に起因する利点を有している16。この研究では、結晶ルテイン(Kemin Foods、FloraGLO(登録商標)結晶ルテインロット1401103302)を、リン脂質90H(Lipoid GmbH、ロット 529400−2120046−12−112、CAS 308068−11−3)及びオクタデシルアミン(Sigma−Aldrich ロット BCBK6340V、CAS 1
24−30−1)を用いてリポソームにカプセル化した。脂質膜を、90Hリン脂質、オクタデシルアミン、及びCHCl3/MeOH(2:1)(Sigma−Aldrich、ロット SHBC4982V、CAS 67−66−3/Sigma−Aldrich、ロット SZBC237BV、CAS 67−56−1)に溶解したルテインを用いて作製した。溶媒を回転蒸発によって真空除去したが;溶液を、Heidolphロータリーエバポレーター(rotavapor)により40℃で真空乾燥し、ロータリーエバポレーター
の速度は、生成物のロスを引き起こす可能性のある気泡形成及び飛び散りを低減するために調節し、乾燥薄膜は、1〜2時間後に得られた。微量の溶媒をも除去するために、この薄膜を、室温で真空下に少なくとも16時間置いた。脂質膜の水和を、40〜45℃で蒸留水(超純水−AquaMaxによるMilliQ−導電率0.054uS/cm)を脂質膜へ添加して脂質を水和することによって行い、大きいリポソーム小胞を形成した。大きいリポソーム小胞のホモジナイゼーションを、Ika Works ULTRA−TURRAX T 25デジタルホモジナイザースタフェン、ドイツ)を用いて達成し、リポソーム小胞のナノサイズ範囲へのサイズ低下は、大型Microfluidizer(登録商標)高流体プロセッサー(high fluid processor)M−110EHを用いて、50〜60℃及び1200バール押出すことによって行った。このプロセスを5回繰り返した。エマルジョンの滅菌は、121℃、1気圧で20分間行った。表1は、リポソームエマルジョンの組成を示す。最終生成物サイズ分布ゼータ電位重量モル浸透圧濃度、及びpHを滅菌後に分析し、表2にまとめる。

0027

0028

0029

眼内イオントフォレシスデバイス. イオントフォレシスデバイスは、2つの使い捨てコンポーネント:眼内アプリケータ及びリターン電極から構成されていた。これら2つのコンポーネントは、再使用可能ジェネレータと接続されていた。眼内アプリケータは、ポリカーボネートリザーバー(直径9mm、高さ4.5mm、容積0.5ml)及びリード線でジェネレータと接続されたステンレス鋼電極AISI 304)(アノード陽極)から構成されていた。リターン電極は、25G皮内針(intradermic needle)であり、首(前側)に挿入して、ワニ口クリップ及びリード線でジェネレータと接続した(カソード)。ジェネレータ(EYEGATE CCIGenerator 6121−EYE、Eyegate Pharma、パリ、フランス)は、定電流タイプであり、電流の設定範囲は、0.25mA〜2.5mA(0.25mAずつ10段階)、時間の設定範囲は、0.5分間〜5分間(0.5分ずつ10段階)であった。得られた印加電圧は、実験の過程でマルチメーターで測定した。

0030

動物. 14体の有色ウサギ系HY79b(ブリーダー:「HYPHARM」−フラン
ス、49450 ルセイ(ROUSSAY))を本実験で用いた。すべての動物は、組み入れ
査(inclusion examination)後、耳タグを用い、及びマーカーを用いて個体識別
た。動物は、到着後3日間観察を続け、特に眼に注意して、病気徴候について毎日観察した。動物は、同一環境条件下の標準的なケージに個別に収容した。温度は15〜21℃に、相対湿度は55±10%に保持した。部屋は継続的に換気した(毎時≧15空気量)。温度及び相対湿度は、継続的に制御し、記録した。動物は、12時間の明期(午前7:00から午後7:00)及び12時間の暗期の制御されたサイクルで、定期的に10〜200lxの光に暴露した(ケージ内)。実験全体を通して、動物は、及び水に自由にアクセス可能とした。動物には、標準的なドライペレットタイプの餌(150g/日)、LASQCdiet(登録商標)Rab−14H(LASVENDIGMBH、ゾースト、ドイツ)を与えた。定期的に分析を行った水道水を、プラスチックボトルから自由に利用可能とした。本実験計画で述べるすべての標準的な操作手順及びプロトコルは、認可された倫理委員会によるレビューを受けた。すべての動物は、実験及びその他の科学的目的に用いられる脊椎動物の保護に関する指令2016/63/UE 欧州代表者会議17、並びに眼科及び視覚研究における動物の使用に関する視覚と眼科学研究協会会議(ARVO)声明18に従って取り扱った。

0031

実験手順. HY79b系からの14体の有色ラビットを、コントロールグループ受動的適用:電流なし;動物番号9〜14)及び試験グループ(イオントフォレシス適用;電流あり;動物番号1〜8)の2つのグループランダムに分割した。これら2つのグループは、2つの時間点(0及び2時間)にサブ分割した。表3に実験設計をまとめる。

0032

0033

ルテインエマルジョンを、麻酔下(キシラジンケタミン合物筋肉内注射)の動物に、開瞼器補助しながら、局所麻酔下で(Cebesine(登録商標)1滴:0.4%オキシブプロカイン、Thea、ロットF6757)適用の約10分前)、イオントフォレシスで投与した。動物を、ルテインを充填した9mmイオントフォレシスアプリケータを右眼の角膜及び強膜上に10分間適用することで処理した。グループに応じて(表3参照)、0.0mA又は20.0mAの通電を各々の眼に適用した。イオントフォレシスアプリケータは、投与の直前に0.5mLのルテインリポソームエマルジョンで含浸させ、デバイスの電極は、ルテインエマルジョンで覆われていた。すべての投与の後に、平衡塩類溶液BSS)洗浄を行った。

0034

右眼のイオントフォレシス適用の直後、又は適用の2時間後(表3参照)、欧州当局によって推奨される方法17の1つである過剰用量のペントバルビタール静脈内投与によって動物を安楽死させた。両眼から角膜(C)、眼房水AH)、毛様体(CB)、網膜(R)、硝子体(V)、及び強膜(SC)をサンプリングし、量した。サンプルの着色を目視検査した後、その後のHPLC(高速液体クロマトグラフィ)分析のために−80℃で保存した。

0035

結果
有色ウサギにおけるルテインエマルジョンの眼内イオントフォレシス送達. イオントフォレシスによるルテイン送達の能力を評価するために、発明者らは、ルテインを有するリポソームを作製し(正に荷電)、このエマルジョンを、2.0mAで10分間、有色ウサギの角膜/強膜に適用した。イオントフォレシスによる送達の効果を、採取した組織の目視検査によって評価した。電流あり及びなしでのルテインエマルジョン適用後の結果を表4にまとめる。

0036

0037

イオントフォレシス適用後、20.0mAの電流で処理したすべての眼は(時間点0時間)は、円形のオレンジ色を角膜に出現させ、この組織中にルテインエマルジョンが存在することが明らかとなった。ルテインの適用はまた、2つの眼(番号2及び3)において、強膜縁にオレンジ色跡を、結膜に僅かなオレンジ色着色を起こした。処理の2時間後、角膜にこの着色を示したのは処理眼の半分のみであり(番号5及び8)、この事象は、適用後にエマルジョンが眼に拡散することを示すものであり得る。電流なしの場合、様々な眼組織への送達は観察されなかった。

0038

考察
世界中で65歳以上の人のおよそ10%がAMD疾患に罹患している19。様々な試験から、ルテインのAMD進行の遅延剤としての可能性、及び神経保護分子としての可能性も示されている13、20〜22。さらに、ルテインは、固有の黄斑指向性を有する眼の天然成分であり、それが先天的に存在する傍中心窩領域に特異的に沈積される1。これらの特徴は、AMDの制御に用いられる現行品に対する利点であり得る。この病態に利用可能である治療は、副作用を有し、患者にとって困難であり、高価である眼内注射を含み、従って、より安全で有効な治療の開発が極めて重要である。この数年の間、多くの研究結果により、硝子体内注射のリスクが強調されてきた。硝子体内注射によって薬物を高頻度で投与する必要があることにより、網膜剥離眼内炎、及び眼圧上昇が引き起こされ得る。非感染性及び感染性炎症の両方が、硝子体内注射の合併症として報告されている。その
使用承認以来、硝子体内注射の比率の高まりと共に、感染性眼内炎の発生率が広く研究されてきた23、23。本研究において、本発明者らは、ルテインをin−situで送達するための最小侵襲的技術を初めて試験した。イオントフォレシスは、最小侵襲的方法であるという利点を有し、従って、外科的インプラント術又は頻繁な高用量の硝子体内注射といった困難を回避することでから、より安全であり、患者コンプライアンスの改善がより容易である12。実際、様々な前臨床及び臨床試験から、繰り返し行われた眼内イオントフォレシス適用の安全性が報告されている14、25、26。別の利点は、この方法が、それほど高価ではなく、手術環境の必要がなく、通常の眼の診療予約の過程で、医師の診療所にて素早く行うことができることである。様々な研究が、能動的(active)角膜移植片拒絶反応の管理27、ドライアイ疾患の治療14、28、非感染性前部ぶどう膜炎15、及び円錐角膜疾患29を例とするヒトの眼疾患の治療のためのイオントフォレシスの使用を確立した。

0039

本研究では、本発明者らは、荷電分子を眼組織を通って移動させる10分間にわたる弱電流の適用を含むイオントフォレシスを用いた。イオントフォレシス適用の結果、ルテイン(イオン化薬物)を有するリポソームのエマルジョンが、眼の角膜部を通って浸透した。

0040

本実験は、イオントフォレシス技術によるルテインエマルジョンの眼内送達を明らかに示す有効な概念実証である。

0041

例2−死体眼におけるルテインの眼内送達
物質及び方法
製剤研究.眼組織中へのより高い浸透のために、負に荷電した粒子よりも正の粒子の方が、イオントフォレシス適用のためのドラッグキャリアとしてのより良好な候補であることが示されている38。さらに、電界は、正に荷電した分子を強制的に眼膜(負に荷電)中へと移動させる39。本研究では、発明者らは、ヒトの眼に存在する膜が、生理学的pHにおいて負に荷電しており、イオントフォレシス適用によって送達されるべき正に荷電したルテインのエマルジョンの開発に適しているという事実を利用した。ルテインが高い分子量で、親油性であり、水に不溶な分子であることから、修飾を行わずにこのカロテノイドをイオントフォレシスで送達することは、ほぼ不可能である1。これを克服するために、ルテイン分子のキャリアとして挙動する正に荷電したリポソーム小胞で製剤を作製した(Lipo+)。脂質膜を、phospholipon 90H(Lipoid GmbH、ロット529400−2120046−12−112、CAS 308068−11−3)、オクタデシルアミン(Sigma−Aldrich ロット BCBK6340V、CAS 124−30−1)、結晶ルテイン(Kemin Health、FloraGLO(登録商標)結晶ルテイン ロット 1401103302)を用いて作製した。4〜5Lの作製のために、これらの化合物を、500〜800mLのCHCl3/MeOH(1:1体積/体積)(Sigma−Aldrich、ロット SHBC4982V、CAS 67−66−3/Sigma−Aldrich、ロット SZBC237BV、CAS 67−56−1)中に、30〜35℃に加熱することによって溶解した。表5の製剤組成を参照されたい。溶媒を回転蒸発によって真空除去したが;溶液を、Heidolphロータリーエバポレーターにより40℃で真空乾燥し、乾燥薄膜は、1〜2時間後に得られた。微量の溶媒をも完全に確実に除去するために、この薄膜を、室温で真空下に少なくとも16時間置いた。有機溶媒含有量ガスクロマトグラフィGC)で分析し、25ppm未満であることを確認した。脂質膜の水和を、65℃で蒸留水(超純水−AquaMaxによるMilliQ−導電率0.054uS/cm)を脂質膜へ添加することによって行い、大きいリポソーム小胞を形成した。これらの大きいリポソーム小胞のホモジナイゼーションを、Ika Works ULTRA−TURRAX T
25デジタルホモジナイザー(スタウフェン、ドイツ)を2000〜4000rpmで
用いて達成し、リポソーム小胞のナノサイズ範囲へのサイズ低下は、大型Microfluidizer(登録商標)高流体プロセッサーM−110EHを用いて、50〜60℃及び1200バールで押出すことによって行った。このプロセスを5回繰り返した。エマルジョンの滅菌は、121℃、1気圧で20分間行った。滅菌プロセスの後、リポソーム製剤の以下の特性を記録した:pH(装置Mettler Toledo S20を用いる)、重量モル浸透圧濃度(Osmomat 3000を用いる)、粒子サイズ及びゼータ電位(動的光散乱(DLS)、光子相関分光分析法としても知られる−Nicomp 380DLSを用いる。

0042

0043

製剤の分光光度分析による評価. 分光光度分析を用いて、Lipo+溶液(水又は0.9% NaClによる1:50希釈)の吸光度及び蛍光特性を測定した。リポソームのみを含む溶液(ルテインなし)を、コントロールとして用いた。各サンプルに対して、吸光度スペクトルを、300から750nmで、蛍光スペクトルを、370nmでの励起(吸光度スペクトルの結果から選択)による480から650nmでトレースした。

0044

粒子サイズ及びゼータ電位. 動的光散乱を用いて、Lipo+溶液中の成分のサイズ分布を評価した。電気泳動を行って、溶液のゼータ電位を評価した。

0045

眼内イオントフォレシスデバイス. 眼内イオントフォレシスの原理は、少なくとも1つの生成物を含有する電解質物質に、治療されるべき身体又は器官中に眼の生物学的膜を介してその生成物を輸送する目的で電界を印加することである12。

0046

典型的なイオントフォレシス装置は、いずれもジェネレータと接続された眼内アプリケータ及びリターン電極の2つのコンポーネントから成る。本実験では、眼内アプリケータは、独立して角膜及び強膜組織を扱う2つの電極を備えていた。眼内アプリケータ(OPIA TechnologiesSAS、パリ、フランス)は、ポリウレタン樹脂製であり、角膜に適用される中央円形状リザーバー(直径8mm、高さ4.5mm、容積1ml)及びステンレス鋼電極、並びにそれを取り囲み、強膜(縁周囲の毛様体扁平部領域)に適用される環状リザーバー(内径12.5mm、外径18mm、高さ4.5mm、容積1ml)及びステンレス鋼電極の2つのリザーバーを備えている。各ステンレス鋼電極は、リード線により、異なる定電流ジェネレータに接続した(アノード−陽極)。リターン電極は、各ジェネレータに割り当てられ、それぞれ、視神経(角膜電極用)及び強膜の赤道領域(equator region)(強膜電極用)に取り付けて、各電気回路を独立して閉じた。ジェネレータ(IONO−25、Iacer Srl、イタリア)は、定電流タイプで、電流の設定範囲は、0.25mA〜2.5mA(0.5mAずつ5段階)であり、時間は、20mA・分の合計電流量給電されるように自動的に調節された。得られた印加電圧は、実験の過程で、2つのマルチメーターで各回路に対して測定した。

0047

死体眼. 異なる健康ドナーからの6つのヒト死体眼球を、ベネトアイバンク(ベネチアラリーノ、イタリア)から入手した。ヒトの眼は、ヒト組織の使用を伴う研究に関するヘルシンキ宣言ガイドラインに従って用い、死亡の3から16時間後に摘出し、直
ちに、6%デキストラン強化した角膜保存媒体中に4℃で保存した。ドナーの平均年齢は、63.6±5.9歳であった。平均内皮細胞密度は、2125±389細胞/mm2であった。各眼球は、デキストラン強化溶液に浸漬した状態で、5日以内に研究室へ輸送した。4つの眼球に、角強膜イオントフォレシスを施して、0.1%ルテイン点眼液網膜組織中に送達した。2つの眼球をコントロールとして用い、製剤の非存在下でイオントフォレシスを行った。

0048

眼の調製. 各眼球を、特別に設計されたホルダー中に、上向きに静かに載せた。強膜及び角膜のパッシブ電極を、それぞれ、視神経及び強膜に適用した。実験中の眼の内部の圧力を15mmHgに維持するために、眼を、0.9%塩化ナトリウム溶液を充填した管で液柱マノメーターに接続した。眼球には、まず、実験中の眼組織及び機構を安定化させるために、15から42mmHgでのプレコンディショニングを3サイクル施した。このプレコンディショニングにより、各実験の開始時に独特レファレンス状態を達成すること、並びに角膜及び強膜の厚さを生理学的レベル回復させることが確実に行われた。プレコンディショニングの後、超音波角膜パキメータ(Pachmate、DGHエクストン、米国)を用いて、中心角膜厚CCT)を測定した。これらのサンプルにおいて、平均CCTは、558±19μmであった。

0049

溶液による含浸.プラスチック槽中のアクティブ電極(カソード)を角膜及び強膜表面に適用した。プラスチック管フォームを充填し、Lipo+に20分間浸漬した。この予備漬処理後、管を静かに眼球の前部表面に適用し、再度2mLのLipo+溶液を充填した。電流密度を2.5mAに設定し、角膜及び強膜に接続された両方のジェネレータに対して5分間給電した。角強膜イオントフォレシスの後、眼球を、眼ホルダー中、上向きで、眼の内部の圧力15mmHgで80分間維持した。この間に、経強膜イオントフォレシスによって網膜に到達したルテインは、網膜組織を通して受動的に拡散し、黄斑へ、特に傍中心窩領域へ向かうことができた。本実験で用いた6つの眼のうちの2つは、コントロールとして用いたため、製剤による含浸は行わなかった。

0050

組織の評価. 80分後、網膜組織を、高解像度二光子イメージングでの使用に支障をきたし得る全体的な損傷を誘発することなく単離した。網膜、脈絡膜、角膜、及び強膜組織の切除は、標準化されたプロトコルを用いて行った47。二光子顕微鏡を用いて、網膜の黄斑領域でのルテインの浸透を評価した。眼組織に対する画像取得を開始する前に、ルテインから発せられる二光子蛍光TPF)シグナルを高めるために適用するのに最適なフィルターを知るために、Lipo+溶液(0.9%塩化ナトリウム中の0.005%、0.002%、及び0.001%希釈)に対して複数のスタック画像を取得した。フィルター550/80nm(Semrock)が、ルテインの実験に最も適していたが(分光光度分析に基づいて)、フィルター525/20nm(Semrock)が、シグナル対ノイズ比(SNR)という意味で良好な結果を与えることが見出された。従って、眼組織評価に用いた励起は、835nmであり、眼組織成分から発せられたTPF光は、反射光反射のためのノンデスキャン検出器(non-descanned detector)(NDD1)によって逆方向に集めた。

0051

共鳴ラマン分光分析.死体眼におけるヒト網膜へのルテインのイオントフォレシス送達の効果を評価するために、共鳴ラマン散乱を用いた。中心波長473.5nmの単一モードレーザー源(50mW出力)を励起源として用いて、共鳴ラマン分光分析測定を行った。レンズの組み合わせ及び顕微鏡対物レンズ(NA=0.25)によって、照射された網膜領域が1mm径となるようにレーザービーム焦点を眼組織上に合わせ、レーザー出力は、ニュートラルフィルターを用いて網膜面で1mWまで低下させた。ラマン散乱光を、光電子増倍管(PMT)により、10cm−1のスペクトル解像度及び平均ダークカウントレート80で集めた。ラマンシグナル強度は、秒あたりの光子カウントcps)と
して記録した。測定は、イオントフォレシス送達部位の内側強膜(inner sclera)(すなわち、毛様体の方に向いている角膜縁周囲強膜(perilimbal sclera));血管アーケー
ド及び視神経乳頭を取り囲む網膜の領域を含む中周辺部網膜:並びに黄斑の3つの網膜領域で行った。測定は、実験及びコントロール眼において正確にデータを推計するのに充分なデータを収集するために、各々の領域全体で4つのエリアにおいて行った。実験の前に、ラマン読み取り値と眼組織の実際のルテイン含有量との間の相関を見つけ出すために、異なる濃度のルテインを充填した薄い石英キュベットを用いた検量実験を行った。

0052

結果
Lipo+分光特性. 本実験では、二光子励起波長を決定するために、Lipo+溶液の吸光度及び蛍光スペクトルを最初に取り扱った。吸収スペクトルは、300から750nmでトレースし、図1に示す。Lipo+溶液は、370nmに吸収ピークを示し、これを、480から650nmのLipo+蛍光スペクトルのトレースのための励起波長として用いた(図2)。Lip+は、500〜530nm及び540〜570nmの2つの蛍光バンドピークを示した。これらの結果に基づいて、二光子実験のために選択したフィルターは、550/88であった。

0053

Lipo+物理的特性. Lipo+の正荷電及びサイズを確認するために、イオントフォレシス試験の前に、粒子サイズ及びゼータ電位も特定した。これらの特定は、それぞれ、蒸留水による1:50 Lipo+希釈物に対する動的光散乱及び電気泳動を通して行い、ルテインを含まないリポソーム溶液(コントロールとして)との比較も行った。図3によると、Lipo+集合体は、3.5μm(平均で)にピークを有し、より小さいピークが300nm(平均で)にも見られ、これは、個別のリポソームを示している。また、ゼータ電位特定は、Lipo+溶液に対して+5mVの荷電を示した。

0054

イオントフォレシス適用後の死体眼におけるルテイン分布.二光子実験のために選択したフィルターは、550/88であったが(これまでの蛍光実験に基づいて)、ルテインリポソーム製剤の初期分析から、525/20フィルターが、SNRという点でより良好な結果を与えることが明らかとなった。この初期較正において(0.9%NaClによる0.005、0.002、及び0.001%Lipo+希釈)、リポソームは球状の小胞として観察されており、顕微鏡は正しく較正されていた(データ示さず)。これは、網膜色素細胞が、ルテインと同じ波長で励起する色素であるメラニンを多く含んでいることから、非常に重要なコントロールである。さらに、このコントロールにより、ルテインリポソームと色素とを区別することができる。

0055

イオントフォレシス適用後のヒトの眼におけるルテインを有するリポソームの分布を評価するために、5つの死体眼を、角膜/強膜への2.5mAの電流に5分間暴露し、80分間放置し(15mmHgの制御された眼内圧力)、眼の様々な構造部:角膜、強膜、脈絡膜、周辺部及び中心部網膜を回収した。リポソームの分布を、二光子顕微鏡(835nmで励起)によって評価した。6つ目の死体眼をコントロールとして用い、この眼は、リポソーム製剤と接触させなかった。この場合、835nmレーザー照射時にリポソームは検出されず、シグナルは、外来性ルテインに特異的であることが示された(データ示さず)。

0056

様々な眼組織の分析から、組み合わされた角強膜イオントフォレシスの後、製剤による試験眼のすべてにおいて、ルテインは網膜中に豊富に存在し、一方脈絡膜組織中には、ルテインリッチリポソームは見られなかった。

0057

また、網膜を調べた結果から、リポソームが血管を取り囲む組織にしか見られなかったことから、Lipo+溶液は、網膜血管壁を透過することができなかった。

0058

前眼部での特定では(強膜及び角膜)、角膜実質又は強膜組織のいずれにもルテインリッチリポソームは見られなかったが、角膜上皮細胞には見られた。

0059

網膜では、網膜の内側部分である神経節細胞よりも、光受容細胞に近い外側部分にルテインをより多く観察することもできた。

0060

脈絡膜の分析から、電流印加後、この領域にリポソームが存在しないことが明らかとなり、これらの結果は、毛様体/毛様体扁平部を介するイオントフォレシスによるルテインの経強膜適用後、ルテインリポソームは、眼膜を通して受動拡散し、中心窩に近い後部網膜に達することを示している。図4は、眼の中でのルテイン経路の模式図を示す。角膜イオントフォレシス適用後の角膜組織の分析から、リポソームが、この組織の上皮細胞上に留まっていることが明らかとなった。

0061

様々な眼組織の共鳴ラマン分光分析も行った。ラマンシグナルは、固有のカロテノイドフルオレセイン及びリポフスチン蛍光に恐らくは由来すると思われる蛍光バックグラウンド上に重なり合った。バックグラウンドシグナルを含まないラマンピーク高さの正確な読み取りを得るために、各測定したスペクトルについて、測定したラマンの線形状の多項式フィッティング(5次まで)により、スペクトル中の重なり合っている可能性のあるノイズスパイクの影響を差し引いた。1530cm−1でのC=C二重結合シグナルの最終ピーク高さを、ルテインの存在のシグネチャとして選択した。

0062

内側強膜では、処理眼における1530cm−1でのラマンピークは、コントロール眼よりも7倍大きく、無傷の強膜を通しての眼へのルテイン送達におけるイオントフォレシスの効果の証拠が提供される。中周辺部網膜では、処理眼で測定された1530cm−1でのラマンピークは、コントロール眼よりも1.7倍大きく、このことは、イオントフォレシス処理の終了後、大量のルテインが、網膜の後極部に到達したことを示していた。黄斑では、処理眼で測定された1530cm−1でのラマンピークは、コントロールの場合よりも1.3倍大きく、このことは、イオントフォレシスが、黄斑へのルテインの送達に有効であることを示していた。

0063

考察
加齢黄斑変性(AMD)は、先進国の50歳以上の人における不可逆的失明原因の第1位である40、41。800万人を超えるアメリカ人がAMDを有しており、この疾患の全体としての罹患率は、2020年までに50%超増加することが予測されている37。いくつかの疫学的研究により、ルテインの補給が、初期段階のAMD患者における黄斑色素光学密度(MPOD)レベルの増加に繋がることが強調され、黄斑疾患からの保護と関連付けられている42、21。実際、ルテインは、網膜中に自然に濃縮されており、そこで、ゼアキサンチンと共に黄斑色素を形成する。青色光フィルターとして作用することで、ルテインは、下にある黄斑中心部の光受容細胞を光化学的損傷から保護することができる43。ルテインの抗酸化特性も、黄斑を酸化ストレスから保護し得る44。

0064

AMDの進行を遅延する利用可能なソリューションは、眼内注射又は外科手術に基づいており、裏付けられている副作用、並びに網膜剥離、眼圧上昇、さらには非感染性及び感染性炎症などの合併症の可能性を包含する23、33。この研究では、本発明者らは、ヒトの後眼部へのルテインの最小侵襲的in situ送達を用いた。イオントフォレシスは、患者コンプライアンスが良好で、高濃度の対象品を網膜に到達するまで様々な眼の層を通して推進するより安全で容易な方法であるという利点を有する。様々な報告から、ドライアイ、非感染性ぶどう膜炎、及び円錐角膜などの様々な疾患の治療のために眼内イオントフォレシスを繰り返し用いた治療の安全性が確立されている14、15、25、26
、28、29。

0065

本明細書にて、死体眼を前臨床モデルとして用いて、本発明者らは、弱電流を印加して、副作用なしでルテインを眼に推進させた。本発明者らの観察によると、ルテインリポソームは、周辺部網膜及び中心窩に近い中心部網膜に主として沈積されるが、脈絡膜領域には存在しなかった。この観察結果から、経強膜適用後、毛様体/毛様体扁平部を介し、続いて後部網膜領域に達するまで眼膜を通して受動拡散するというルテインの経路を外挿することが可能である(図4)。本発明者らは、経強膜イオントフォレシスが、ヒトの眼の網膜にルテインを運ぶ有効な方法であり、黄斑色素を強化する新規な方法を提供することを初めて証明した。後部領域に沈積後、ルテインは、受動拡散/タンパク質勾配によって、光受容細胞が存在する網膜の外側部分に到達することができるものと想定される。脈絡膜にルテインが観察されなかった理由は、メッシュサイズが80〜90nmである神経網膜関門に起因するものであると論ずることができる(リポソームは、341nmのサイズであり、時に2〜3μmのクラスターを形成する場合もあり、ルテインリポソームが網膜中にトラップされたままになることが示唆される(図4)45。重要なことには、共鳴ラマン分光分析から、イオントフォレシス後に、黄斑中のルテイン濃度が上昇することが明らかとなった。この観察結果は、経強膜イオントフォレシスが、黄斑へのルテイン送達の有効な方法であり、AMD発症の予防、その進行の予防、及び/又は発症した疾患の治療のための現行の方法に対する妥当な代替法であることを明らかに実証するものである。

0066

角膜イオントフォレシス適用後、角膜実質中にリポソームは存在しなかった。この事実は、ルテインが疎水性であり、角膜実質は70%の水を含むために非常に親水性であり46、このことによって、ルテインがこの組織を透過することが不可能であることで説明することができる。

0067

上記の記述及び図面は、本発明の実例としての実施形態を含む。本明細書で述べる上記の実施形態及び方法は、当業者の能力、経験、及び選択に応じて変動し得る。方法の工程の特定の順序での単なる列挙は、方法の工程の順序に関するいかなる限定も構成しない。上記の記述及び図面は、単に本発明を説明し、例証するだけのものであり、請求項がそのように限定されない限りにおいて、本発明はそれに限定されない。本開示を面前に有する当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、それに改変及び変更を行うことができる。

0068

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