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図面 (7)

課題

組換え単純ヘルペスウィルス2(HSV−2)ワクチンベクター、そのビリオン、そのようなものを含む組成物およびワクチン、ならびにこれらの使用の方法の提供。

解決手段

ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)Us6遺伝子が欠失し、かつ、脂質二重層上に単純ヘルペスウィルス−1(HSV−1)糖タンパク質Dである表面糖タンパク質を含む組換えHSV−2、又はそのビリオンを含む、対象においてHSV−2感染若しくはHSV−1感染を処置する、または対象においてHSV−2もしくはHSV−1感染によって引き起こされる疾患を処置するためのワクチン又は医薬組成物

概要

背景

本出願の全体を通して、種々の刊行物引用され、角括弧内に番号によって挙げられる。これらの引用文献の完全な引用を、本明細書の最後に見出すことができる。これらの刊行物、ならびに本明細書中に引用される全ての特許、特許出願公開、および書籍の開示は、それらの全体が、本発明が属する技術をより完全に記載するために、引用を以て本出願中に組み込まれる。

単純ヘルペスウィルス1型および2型(HSV−1およびHSV−2)は、世界的に重大な健康問題として残存しており、世界中の発展途上国および貧困コミュニティ不均衡に影響を与え、かつHIVエピデミックあおっている。現在、HSV−1、HSV−2、またはHIVの有効なワクチンがないので、これらの感染用のワクチンが緊急に必要とされている。HSV−1は感染性失明の主な原因である一方、HSV−2は世界的に、性器潰瘍の主な原因であるが、HSV−1は目下、先進諸国において、性器疾患と関連してより一般的に同定されている。性器ヘルペスは、感染した人々に汚名をきせ、かつ心理的に衝撃を与えるおそれがある、再発性の、生涯にわたる疾患である。HSV−2による感染は、HIVに感染して伝染させる可能性を著しく増大させる一方、いずれかの血清型の垂直伝染は多くの場合、重度乳児罹患または乳児死亡の原因となる。ウィルス糖タンパク質Dを単独で、または糖タンパク質Bと組み合わせて(gDおよびgB)用いるサブユニット製剤に基づくHSV−2ワクチンの最近の臨床試験は、全身中和抗体誘導するにもかかわらず、失敗した。驚くべきことに、HSV−2 gDサブユニット(gD−2)ワクチンが、HSV−1に対する部分的な防御を提供したが、HSV−2からの防御を実現しなかった。いくつかの弱毒化ウィルスがプレ臨床的に評価されてきたが、臨床研究は現在まで、治療薬用途(再発頻度引下げ)に限定されてきた。そしてまた、有効性を示すこともなかった。ゆえに、新規のワクチン戦略が開発され、かつ評価されなければならない。

概要

組換え単純ヘルペスウィルス2(HSV−2)ワクチンベクター、そのビリオン、そのようなものを含む組成物およびワクチン、ならびにこれらの使用の方法の提供。ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)Us6遺伝子が欠失し、かつ、脂質二重層上に単純ヘルペスウィルス−1(HSV−1)糖タンパク質Dである表面糖タンパク質を含む組換えHSV−2、又はそのビリオンを含む、対象においてHSV−2感染若しくはHSV−1感染を処置する、または対象においてHSV−2もしくはHSV−1感染によって引き起こされる疾患を処置するためのワクチン又は医薬組成物。なし

目的

HSV−2 ΔgDが、不稔感染を誘導する:HSV−2 ΔgD−/+が、gDをトランスで提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)Us6遺伝子が欠失し、かつ、脂質二重層上に単純ヘルペスウィルス−1(HSV−1)糖タンパク質Dである表面糖タンパク質を含む組換えHSV−2、又はそのビリオンを含む、対象においてHSV−2感染若しくはHSV−1感染を処置する、または対象においてHSV−2もしくはHSV−1感染によって引き起こされる疾患を処置するためのワクチン又は医薬組成物

請求項2

前記組換えHSV−2がその脂質二重層上に非HSV−2ウィルス表面糖タンパク質をさらに含む、請求項1に記載のワクチン又は医薬組成物。

請求項3

前記組換えHSV−2が、その脂質二重層上に細菌又は寄生体の表面糖タンパク質をさらに含み、前記寄生体は、哺乳類の寄生体である、請求項1に記載のワクチン又は医薬組成物。

請求項4

前記表面糖タンパク質は、前記組換えHSV−2の前記ゲノム中に挿入されたトランスジーンによってコードされる、請求項1〜3のいずれか一項に記載のワクチン又は医薬組成物。

請求項5

前記表面糖タンパク質は、脂質二重層上に存在するが、これは、細胞を、HSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した組換えHSV−2で感染させて、前記細胞がトランスフェクトされて、その細胞膜上に前記表面糖タンパク質を発現し、脂質二重層上に存在する前記表面糖タンパク質を含む前記組換えHSV−2が、前記細胞から産生されることによるものである、請求項1〜4のいずれか一項に記載のワクチン又は医薬組成物。

請求項6

前記組換え単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)が、対象において免疫応答を誘発する、請求項1〜5のいずれか一項に記載のワクチン又は医薬組成物。

請求項7

対象においてHSV−2感染を処置する、または対象においてHSV−2感染によって引き起こされる疾患を処置するための、請求項1〜6のいずれか一項に記載のワクチン又は医薬組成物。

請求項8

HSV−2感染によって引き起こされる前記疾患は、性器潰瘍を含む、請求項7に記載の、ワクチン又は医薬組成物。

請求項9

対象にHSV−2のワクチン接種をするための、請求項1〜8のいずれか一項に記載のワクチン。

請求項10

ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)Us6遺伝子が欠失し、かつ、脂質二重層上に単純ヘルペスウィルス−1(HSV−1)糖タンパク質Dである表面糖タンパク質を含む組換え単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)又はそのビリオンを含む、対象において抗原性標的に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害ADCC)を誘導するための、ワクチン又は医薬組成物であって、前記単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)が、脂質二重層上に異質抗原を含む、ワクチン又は医薬組成物。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2014年3月3日出願の米国仮特許出願第61/946965号明細書、および2014年11月17日出願の米国仮特許出願第62/080663号明細書の利益を主張する。各出願の内容は、引用を以て本明細書中に組み込まれる。

0002

連邦政府による資金提供の記載
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって授与された認可番号AI−061679およびAI−51519の下に、政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において、一定の権利を有する。

背景技術

0003

本出願の全体を通して、種々の刊行物が引用され、角括弧内に番号によって挙げられる。これらの引用文献の完全な引用を、本明細書の最後に見出すことができる。これらの刊行物、ならびに本明細書中に引用される全ての特許、特許出願公開、および書籍の開示は、それらの全体が、本発明が属する技術をより完全に記載するために、引用を以て本出願中に組み込まれる。

0004

単純ヘルペスウィルス1型および2型(HSV−1およびHSV−2)は、世界的に重大な健康問題として残存しており、世界中の発展途上国および貧困コミュニティ不均衡に影響を与え、かつHIVエピデミックあおっている。現在、HSV−1、HSV−2、またはHIVの有効なワクチンがないので、これらの感染用のワクチンが緊急に必要とされている。HSV−1は感染性失明の主な原因である一方、HSV−2は世界的に、性器潰瘍の主な原因であるが、HSV−1は目下、先進諸国において、性器疾患と関連してより一般的に同定されている。性器ヘルペスは、感染した人々に汚名をきせ、かつ心理的に衝撃を与えるおそれがある、再発性の、生涯にわたる疾患である。HSV−2による感染は、HIVに感染して伝染させる可能性を著しく増大させる一方、いずれかの血清型の垂直伝染は多くの場合、重度乳児罹患または乳児死亡の原因となる。ウィルス糖タンパク質Dを単独で、または糖タンパク質Bと組み合わせて(gDおよびgB)用いるサブユニット製剤に基づくHSV−2ワクチンの最近の臨床試験は、全身中和抗体誘導するにもかかわらず、失敗した。驚くべきことに、HSV−2 gDサブユニット(gD−2)ワクチンが、HSV−1に対する部分的な防御を提供したが、HSV−2からの防御を実現しなかった。いくつかの弱毒化ウィルスがプレ臨床的に評価されてきたが、臨床研究は現在まで、治療薬用途(再発頻度引下げ)に限定されてきた。そしてまた、有効性を示すこともなかった。ゆえに、新規のワクチン戦略が開発され、かつ評価されなければならない。

発明が解決しようとする課題

0005

本発明はこの、新しく、かつ向上したHSV−1ワクチンおよびHSV−2ワクチンの必要性を扱う。

課題を解決するための手段

0006

ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子(Us6)が欠失した単離組換えHSV−2が提供される。

0007

また、ゲノム中のHSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子(Us6)が欠失した単離組換えHSV−2のビリオンが提供される。

0008

本明細書中に記載される組換えHSV−2ゲノムまたは本明細書中に記載される組換えHSV−1遺伝子を内部に含む単離細胞であって、ヒト中に存在しない細胞が提供される。

0009

また、本明細書中に記載される組換えHSV−2ウィルス、または本明細書中に記載されるビリオンを含むワクチン組成物が提供される。

0010

また、本明細書中に記載される組換えHSV−2ウィルス、または本明細書中に記載されるビリオンを含む組成物であって、ウィルスまたはビリオンのゲノムは、少なくとも第2の遺伝子の欠失を含み、第2の遺伝子は、HSV−2ウィルスの複製または病原性に必須である、組成物が提供される。

0011

本明細書中に記載される組換えHSV−2ウィルス、または本明細書中に記載されるビリオン、および医薬的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物

0012

また、対象において免疫応答を誘発する方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載される組換えHSV−2ウィルス;(ii)その、本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、対象において免疫応答を誘発するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0013

また、対象においてHSV−1、HSV−2、もしくはHSV−1およびHSV−2の重感染処置する、または対象においてHSV−1、HSV−2、もしくは重感染によって引き起こされる疾患を処置する方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載される組換えHSV−2ウィルス;(ii)その、本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、対象において、HSV−1、HSV−2もしくは重感染を処置する、またはHSV−1、HSV−2もしくは重感染によって引き起こされる疾患を処置するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0014

また、対象にHSV−1、HSV−2または重感染のワクチン接種をする方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載される組換えHSV−2ウィルス;(ii)その、本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、対象にHSV−1、HSV−2または重感染のワクチン接種をするのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0015

また、HSV−1、HSV−2または重感染に対して対象を免疫化する方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載される組換えHSV−2ウィルス;(ii)その、本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、HSV−1、HSV−2または重感染に対して対象を免疫化するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0016

ワクチン、組成物および医薬組成物の、そしてこれらの使用の方法の実施形態において、組換えHSV−2の量は、明示された目的を達成するのに有効な組換えHSV−2のpfuの量である。

0017

また、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失しており、かつ脂質二重層上にHSV−1糖タンパク質DまたはHSV−2糖タンパク質Dを含む組換えHSV−2のビリオンを生産する方法であって、HSV−1糖タンパク質DまたはHSV−2糖タンパク質Dをコードする異種核酸を含む細胞を、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した組換えHSV−2で、組換え単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)の複製を可能にする条件下で感染させることと、細胞によって産生されたHSV−2ビリオンを回収することとを含む方法が提供される。

0018

また、組換え核酸がHSV−2糖タンパク質Dをコードする配列を含まないこと以外、野生型HSV−2のゲノムと同じ配列を有する組換え核酸が提供される。

0019

また、対象においてHSV−1、HSV−2または重感染を処置または予防するための、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した単離組換えHSV−2が提供される。

0020

また、対象においてHSV−1、HSV−2または重感染を処置または予防するための、ゲノム中のHSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した単離組換えHSV−2のビリオンが提供される。

0021

ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した単離組換えHSV−2が提供される。

0022

また、ゲノム中のHSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した単離組換えHSV−2のビリオンが提供される。

0023

また、本明細書中に記載されるウィルスまたは本明細書中に記載されるビリオンを内部に含む単離細胞であって、ヒト中に存在しない細胞が提供される。

0024

本明細書中に記載されるウィルス、または本明細書中に記載されるビリオンを含むワクチン組成物。

0025

また、提供されるのは、本明細書中に記載されるウィルス、または本明細書中に記載されるビリオンを含む組成物であり、当該ウィルスまたは当該ビリオンのゲノムは、少なくとも第2の遺伝子の欠失を含み、第2の遺伝子は、HSV−2ウィルスの複製に必須である。

0026

また、本明細書中に記載されるウィルス、または本明細書中に記載されるビリオン、および医薬的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物が提供される。

0027

また、対象において免疫応答を誘発する方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載されるウィルス;(ii)本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、対象において免疫応答を誘発するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0028

また、対象においてHSV−2感染を処置する、または対象においてHSV−2感染によって引き起こされる疾患を処置する方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載されるウィルス;(ii)本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、対象において、HSV−2感染を処置する、またはHSV−2感染によって引き起こされる疾患を処置するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0029

また、対象にHSV−2感染のワクチン接種をする方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載されるウィルス;(ii)本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、対象にHSV−2のワクチン接種をするのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0030

また、HSV−2感染に対して対象を免疫化する方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載されるウィルス;(ii)本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、HSV−2に対して対象を免疫化するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0031

また、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失しており、かつ脂質二重層上にHSV−1糖タンパク質Dを含む、組換えHSV−2のビリオンを生産する方法であって、HSV−1糖タンパク質Dをコードする異種核酸を含む細胞を、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した組換えHSV−2で、組換え単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)の複製を可能にする条件下で感染させることと、細胞によって産生された、脂質二重層上にHSV−1糖タンパク質Dを含む組換えHSV−2ビリオンを回収することとを含む方法が提供される。

0032

また、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失しており、かつ脂質二重層上に非HSV−2表面糖タンパク質を含む組換えHSV−2のビリオンを生産する方法であって、非HSV−2表面糖タンパク質をコードする異種核酸を含む細胞を、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した組換えHSV−2で、組換え単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)の複製を可能にする条件下で感染させることと、細胞によって産生された、脂質二重層上に非HSV−2表面糖タンパク質を含む組換えHSV−2ビリオンを回収することとを含む方法が提供される。

0033

また、配列がHSV−2糖タンパク質Dをコードする配列を含まないこと以外、HSV−2のゲノムと同じ配列を有する組換え核酸が提供される。

0034

また、対象においてHSV−2感染を処置または予防するための、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した単離組換えHSV−2が提供される。

0035

また、対象においてHSV−1感染を処置または予防するための、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した単離組換えHSV−2が提供される。

0036

また、対象においてHSV−2感染を処置または予防するための、ゲノム中のHSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した単離組換えHSV−2のビリオンが提供される。

0037

また、対象においてHSV−1感染もしくはHSV−1およびHSV−2の重感染を処置する、または対象においてHSV−2感染もしくはHSV−1およびHSV−2の重感染によって引き起こされる疾患を処置する方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載されるウィルス;(ii)本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、対象においてHSV−2感染を処置する、もしくはHSV−2感染によって引き起こされる疾患を処置するのに有効な量、または対象においてHSV−1およびHSV−2の重感染を処置する、もしくはHSV−1およびHSV−2の重感染によって引き起こされる疾患を処置するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0038

また、対象にHSV−1感染、またはHSV−1およびHSV−2の重感染のワクチン接種をする方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載されるウィルス;(ii)本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、対象にHSV−1感染、またはHSV−1およびHSV−2の重感染のワクチン接種をするのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0039

また、HSV−1感染、またはHSV−1およびHSV−2の重感染に対して対象を免疫化する方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載されるウィルス;(ii)本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、HSV−1感染、またはHSV−1およびHSV−2の重感染に対して対象を免疫化するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0040

また、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失しており、さらに病原体異質抗原を含む単離組換えHSV−2が提供される。

0041

また、対象において抗原性標的に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害ADCC)を誘導する方法であって、対象に、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失しており、さらに脂質二重層上に異質抗原を含む単離組換えHSV−2を、抗原性標的に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を誘発するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

図面の簡単な説明

0042

HSV−2 ΔgDが、不稔感染を誘導する:HSV−2 ΔgD−/+が、gDをトランスで提供する細胞(例えばVD60[40、41])においてのみ首尾よく複製するが、US6をコードしないVero細胞ATCCCCL−81、ミドリザル腎臓)またはCaSki(ATCC CRL−1550、ヒト、頸部)等の細胞において複製しない。非補完HSV−2 ΔgD(Vero細胞から得られたΔgD−/−)は、US6をコードしない、VeroおよびCaSki等の細胞に感染することができない。
A.最大107プラーク形成単位(pfu)のHSV−2 ΔgD−/+ウィルスを接種した重症複合型免疫不全(SCID)マウスは、高い用量の内接種または皮下接種後に、疾患の徴候を呈しない。対照的に、1,000倍低いウィルス用量(104pfu)にて野生型ウィルスを接種したSCIDマウスは、疾患に屈する。Aにおいて生存曲線が、Bにおいて紅斑浮腫、または性器潰瘍の証拠に関する上皮スコア(0から5のスケール)が、そしてCにおいてニューロン感染の証拠に関する神経学的スコア(0から5のスケール)が示される。
HSV−2 ΔgD−/+ウィルスによる免疫処置が、抗HSV−2抗体を誘発する。sc.−sc.免疫処置が、かなりのレベル全身性抗HSV−2抗体および粘膜膣洗浄液)抗HSV−2抗体を誘発する一方、HSV−2 ΔgD−/+によるsc.−i.vag.免疫化が、全身性抗HSV−2抗体をより低いレベルで誘発し、膣洗浄液中抗体レベルの増大を誘発しなかった。Aにおいて血清中の抗HSV−2抗体レベルが示され、Bにおいて膣洗浄液中の抗HSV−2抗体レベルが示される。ΔgD−/+で免疫化したマウスは、病原性HSV−2によるチャレンジ後、血清中に中和抗HSV−2抗体を示す。ΔgD−/+免疫化によって誘発される抗体の中和能力は、Cにおいて示される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001)。
A:Tg T細胞が伝達されてから、HSV−2 ΔgD−/+またはVD60溶解物コントロール)でプライムブーストされたC57Bl/6マウスの脾臓におけるCD8+gBT−I T細胞カウント。B:ワクチン接種マウスまたはコントロールマウスの脾臓におけるgBT−I記憶T細胞のパーセンテージ。C:ブースト後14日目に、脾細胞が単離されて、gB498−505ペプチドによりin vitroで再刺激されて、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリによって、サイトカイン産生について6時間後に分析された(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001)。
HSV−2 ΔgD−/+(106pfu/マウス)による免疫化が、マウスを致死HSV−2チャレンジから防御する。マウスは皮下でプライムされ、かつ3週間の間隔をあけてsc.またはi.vag.でブーストされてから、ブーストの3週後、LD90の病原性野生型HSV−2(4674)により膣内でチャレンジされた。コントロール(VD60細胞溶解物で免疫化された)マウスが、かなりの体重損失(A)および死亡(B)によって呈されるように、疾患に屈したが、ΔgD−/+免疫化マウスが、有意に少ない病状しか示さなかった。さらに、ΔgD−/+免疫化マウスは、致死チャレンジ後、より少ない上皮疾患(C)および神経学的病状(D)しか示さなかった。加えて、ΔgD−/+ワクチン接種マウスが、病原性HSV−2の致死用量による膣内チャレンジ後、膣洗浄液(E)、膣組織および後根神経節(DRG)(F)において、コントロールとしての、VD60細胞溶解物により免疫化したマウスと比較して、有意に少ないウィルス負荷しか示さなかった。感染性ウィルスは、ΔgD−/+免疫化マウスから、4日目の膣洗浄液または5日目の膣組織およびDRG中に回収され得なかった(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001)。
HSV−2 ΔgD−/+により免疫化したマウスが、病原性HSV−2によるチャレンジ後、膣洗浄液においてより少ない炎症サイトカインしか分泌しない。HSV−2 ΔgD−/+により免疫化したマウスの膣洗浄液中に分泌したTNF−α、IL−6およびIL−1βは、VD60溶解物により免疫化され、かつ病原性HSV−2によりチャレンジされたマウスよりも少ない。炎症サイトカイン発現差異が、チャレンジ後の様々な時点にて観察される(*p<0.05;**p<0.01;***p<0.001)。
HSV−2 ΔgD−/+による免疫化が、感染部位、および関連するLNにT細胞をリクルートする。ΔgD−/+によりsc.−sc.で免疫化したマウスが、病原性HSV−2によるチャレンジ後、仙骨リンパ節(LN)中の活性化抗HSV−2 gBT−I CD8+T細胞(A)およびCD4+T細胞(B)のパーセンテージの増大を示した。フローサイトメトリ分析のために、LNが抽出されて、UV不活化ΔgD−/−と6時間インキュベートされてから抗体で染色された。ΔgD−/+によりsc.−i.vag.で免疫化したマウスが、病原性HSV−2によるチャレンジ後、膣中の抗HSV−2 gBT−I CD8+T細胞(C)およびCD4+T細胞(D)の数の増大を示した。フローサイトメトリ分析のために、T細胞を抽出し、かつ抗体で染色するように、膣の組織プロセシングされた。細胞カウンティングが、CountBright(商標)(Lifetechnologies)によりなされた(*p<0.05;**p<0.01)。

実施例

0043

ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した単離組換えHSV−2が提供される。

0044

ある実施形態において、HSV−2糖タンパク質Dは、配列番号1に記載されるアミノ酸配列を含む:
MGRLTSGVGTAALLVVAVGLRVVCAKYALADPSLKMADPNRFRGKNLPVDQLTDPPGVKRVYHIQSLEDPFQPPSIPITVYYAVLEACRSVLLHAPSEAPQIVRASDEARKHTYNLTIAWYRMGDNCAIPITVMEYTECPYNKSLGVCPIRTQPRWSYYDSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKIDWEITQFILEHRARASCKYALPRIPPAACLTSKAYQQGVTDSIGMLPRFIENQRTVALYSLKIAGWHGPKPPYTSTLLPPELSDTTNATQPELVPEDPDSALLEDPAGTVSSQIPPNWHIPSIQDVAPHHAPAAPSNPGLIIGALAGSTLAVLVIGGIAFWVRRRAQMAPKRLRLPHIRDDDAPPSHQPLFY(HSV−2参照株HG52)。

0045

ある実施形態において、単離組換えHSV−2はさらに、その脂質二重層上に、単純ヘルペスウィルス−1(HSV−1)糖タンパク質Dを含む。

0046

ある実施形態において、HSV−1糖タンパク質Dは、配列番号2に記載されるアミノ酸配列を含む:
MGGAAARLAVILFVVIVGLHGVRGKYALADASLKMADPNRFRGKDLPVLDQLTDPPGVRRVYHIQAGLPDPFQPPSLPITVYYAVLERACRSVLLNAPSEAPQIVRGASEDVRKQPYNLTIAWFRMGGNCAIPITVMEYTECSYNKSLGACPIRTQPRWNYYDSFSAVSEDNLGFLMHAPAFETAGTYLRLVKINDWTEITQFILEHRAKGSCKYALPLRIPPSACLSPQAYQQGVTVDSIGMLPRFIPENQRTVAVYSLKIAGWHGPKAPYTSTLLPPELSETPNATQPELAPEDPEDSALLEDPVGTVAPQIPPNWHIPSIQDAATPYHPPATPNNMGLIAGAVGGSLLAALVICGIVYWMRRRTQKAPKRIRLPHIREDDQPSSHQPLFY(HSV−1参照株F)。

0047

ある実施形態において、HSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子は、HSV−2 US6遺伝子である。(例えば、HSV−2ゲノムおよびUS6遺伝子について、Dolan et al.J Virol.1998 March;72(3):2010−2021.(PMCID:PMC109494)“The Genome Sequence of Herpes Simplex Virus Type 2”参照(その全体が引用を以て本明細書中に組み込まれる))。

0048

また、ゲノム中のHSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した単離組換えHSV−2のビリオンが提供される。

0049

ある実施形態において、ビリオンはさらに、その脂質二重層上にHSV−1糖タンパク質DまたはHSV−2糖タンパク質Dを含む。実施形態において、HSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子は、HSV−2 US6遺伝子である。

0050

ある実施形態において、ウィルスはさらに、その脂質二重層上にHSV−1糖タンパク質DまたはHSV−2糖タンパク質Dを含む。実施形態において、HSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子は、HSV−2 US6遺伝子である。

0051

HSV−2 US6遺伝子を含まない組換えHSV−2ゲノムを内部に含む単離細胞が提供される。

0052

ある実施形態において、細胞は、組換えHSV−2ゲノムによってコードされない発現HSV 1糖タンパク質または発現HSV 2糖タンパク質を提供する補完細胞(complementing cell)である。ある実施形態において、補完細胞は、HSV−1糖タンパク質DまたはHSV−2糖タンパク質Dをコードする異種核酸を含む。ある実施形態において、該細胞は、その膜上にHSV−1糖タンパク質Dを発現する。該細胞のある実施形態において、HSV−1糖タンパク質Dは、異種核酸によってコードされ、当該異種核酸は、HSV−1糖タンパク質D遺伝子もしくはHSV−2糖タンパク質D遺伝子である、またはHSV−1糖タンパク質D遺伝子もしくはHSV−2糖タンパク質D遺伝子と同一の配列を有する核酸である。

0053

また、本明細書中に記載される組換えHSV−2ウィルス、または本明細書中に記載されるビリオンを含むワクチン組成物が提供される。ある実施形態において、該ワクチンは免疫アジュバントを含む。ある実施形態において、該ワクチンは免疫アジュバントを含まない。組換えHSV−2を含む、本明細書中に記載されるワクチン、組成物、または医薬組成物の実施形態において、HSV−2は生きている。

0054

また、本明細書中に記載される組換えHSV−2ウィルス、または本明細書中に記載されるビリオンを含む組成物であって、ウィルスまたはビリオンのゲノムは、少なくとも第2の遺伝子の欠失を含み、第2の遺伝子は、HSV−2ウィルスの複製または病原性に必須である、組成物が提供される。

0055

本明細書中に記載される組換えHSV−2ウィルス、または本明細書中に記載されるビリオン、および医薬的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物。

0056

ある実施形態において、組成物、医薬組成物、またはワクチンは、ヒト対象への皮下投与に適切であるように製剤化される。ある実施形態において、組成物、医薬組成物、またはワクチンは、ヒト対象への膣内投与に適切であるように製剤化される。ある実施形態において、組成物、医薬組成物、またはワクチンは、ヒト対象への筋肉内投与鼻腔内投与、または粘膜投与に適切であるように製剤化される。

0057

また、対象において免疫応答を誘発する方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載される組換えHSV−2ウィルス;(ii)その、本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、対象において免疫応答を誘発するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0058

また、対象においてHSV−2感染を処置する、または対象においてHSV−1、HSV−2もしくは重感染によって引き起こされる疾患を処置する方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載される組換えHSV−2ウィルス;(ii)その、本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、対象において、HSV−1、HSV−2もしくは重感染を処置する、またはHSV−1、HSV−2もしくは重感染によって引き起こされる疾患を処置するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。ある実施形態において、本方法は、HSV−1、HSV−2または重感染によって引き起こされるHSV−1またはHSV−2の病状を処置することを含む。本方法の実施形態において、HSV−1、HSV−2または重感染によって引き起こされる疾患は、性器潰瘍である。本方法の実施形態において、HSV−1、HSV−2または重感染によって引き起こされる疾患は、ヘルペス口腔ヘルペス、ヘルペスひょうそ、性器ヘルペス、ヘルペス性湿疹、闘技ヘルペス(herpes gladiatorum)、HSV角膜炎、HSV網膜炎、HSV脳炎、またはHSV髄膜炎である。

0059

HSV−1、HSV−2または重感染(すなわち、HSV−1およびHSV−2の双方による感染)のための処置またはワクチン接種に関する本明細書中の方法の実施形態において、HSV−1感染を処置する、HSV−2感染を処置する、重感染を処置する、HSV−1感染に対してワクチン接種する、HSV−2感染に対してワクチン接種する、そして重感染に対してワクチン接種する、別個の、個々の実施形態がそれぞれ提供される。

0060

また、対象にHSV−1、HSV−2または重感染のワクチン接種をする方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載される組換えHSV−2ウィルス;(ii)その、本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、対象にHSV−1、HSV−2または重感染のワクチン接種をするのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0061

また、HSV−1、HSV−2または重感染に対して対象を免疫化する方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載される組換えHSV−2ウィルス;(ii)その、本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、HSV−1、HSV−2または重感染に対して対象を免疫化するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0062

本方法のある実施形態において、対象は、皮下または膣内にプライミング用量が投与され、そして第2の用量が、皮下または膣内に投与される。本方法のある実施形態において、該対象は、抗HSV抗体およびT細胞を誘発するために、皮下または膣内のプライミング用量と同じくらい多く投与される。

0063

また、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失しており、かつ脂質二重層上にHSV−1糖タンパク質DまたはHSV−2糖タンパク質Dを含む組換えHSV−2のビリオンを生産する方法であって、HSV−1糖タンパク質DまたはHSV−2糖タンパク質Dをコードする異種核酸を含む細胞を、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した組換えHSV−2で、組換え単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)の複製を可能にする条件下で感染させることと、細胞によって産生されたHSV−2ビリオンを回収することとを含む方法が提供される。

0064

ある実施形態において、細胞は、その膜上にHSV−1糖タンパク質DまたはHSV−2糖タンパク質Dを発現する。

0065

また、組換え核酸がHSV−2糖タンパク質Dをコードする配列を含まないこと以外、野生型HSV−2のゲノムと同じ配列を有する組換え核酸が提供される。ある実施形態において、組換え核酸はDNAである。ある実施形態において、組換え核酸はRNAである。

0066

また、対象においてHSV−1、HSV−2または重感染を処置または予防するための、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した単離組換えHSV−2が提供される。ある実施形態において、単離組換えHSV−2はさらに、その脂質二重層上に単純ヘルペスウィルス−1(HSV−1)糖タンパク質Dまたは単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質Dを含む。単離組換えHSV−2のある実施形態において、HSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子は、HSV−2 US6遺伝子である。

0067

また、対象においてHSV−1、HSV−2または重感染を処置または予防するための、ゲノム中のHSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した単離組換えHSV−2のビリオンが提供される。ある実施形態において、ビリオンはさらに、その脂質二重層上にHSV−1糖タンパク質DまたはHSV−2糖タンパク質Dを含む。ある実施形態において、HSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子は、HSV−2 US6遺伝子である。

0068

記載されるウィルスまたはビリオンのある実施形態において、HSV−1、HSV−2または重感染は、性器潰瘍を引き起こす。

0069

ゲノム中のHSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した単離組換え単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)が提供される。

0070

ある実施形態において、単離組換えHSV−2はさらに、その脂質二重層上に表面糖タンパク質を含み、これは、単純ヘルペスウィルス−1(HSV−1)糖タンパク質Dである。ある実施形態において、単離組換えHSV−2はさらに、その脂質二重層上に非HSV−2ウィルス表面糖タンパク質を含む。ある実施形態において、単離組換えHSV−2はさらに、その脂質二重層上に細菌表面糖タンパク質を含む。ある実施形態において、単離組換えHSV−2はさらに、その脂質二重層上に寄生体の表面糖タンパク質を含み、寄生体は、哺乳類の寄生体である。

0071

ある実施形態において、HSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子は、HSV−2 US6遺伝子である。ある実施形態において、表面糖タンパク質は、組換えHSV−2のゲノム中に挿入されたトランスジーンによってコードされる。ある実施形態において、表面糖タンパク質は、脂質二重層上に存在するが、これは、細胞を、HSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した組換えHSV−2で感染させて、当該細胞がトランスフェクトされて、その細胞膜上に表面糖タンパク質を発現し、脂質二重層上に存在する表面糖タンパク質を含む組換えHSV−2が、細胞から産生されることによるものである。ある実施形態において、ウィルス糖タンパク質は、HIV、エンテロウィルス、RSV、インフルエンザウィルスパラインフルエンザウィルスブタコロナ呼吸器ウィルス、狂犬病ウィルスラッサ熱ウィルス、ブニアウィルス、CMV、またはフィロウィルス由来である。ある実施形態において、糖タンパク質はHIV gp120である。ある実施形態において、フィロウィルスはエボラウィルスである。ある実施形態において、ウィルスは、HIV、結核菌(M.tuberculosis)、クラミジア(chlamydia)、マイコバクテリウム・ウルセランス(Mycobacterium ulcerans)、M.マリヌム(M.marinum)、らい菌(M.leprae)、M.アブセンエンス(M. absenscens)、淋菌(Neisseria gonnorhea)、またはトレポネーマ属(Treponeme)である。ある実施形態において、トレポネーマ属(Treponeme)は梅毒トレポネーマ(Treponeme palidum)である。

0072

また、ゲノム中のHSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した単離組換えHSV−2のビリオンが提供される。

0073

ある実施形態において、単離組換えHSV−2のビリオンはさらに、その脂質二重層上に表面糖タンパク質を含み、これは、単純ヘルペスウィルス−1(HSV−1)糖タンパク質Dである。ある実施形態において、単離組換えHSV−2のビリオンはさらに、その脂質二重層上に非HSV−2ウィルス表面糖タンパク質を含む。ある実施形態において、単離組換えHSV−2のビリオンはさらに、その脂質二重層上に細菌表面糖タンパク質を含む。ある実施形態において、単離組換えHSV−2のビリオンはさらに、その脂質二重層上に寄生体表面糖タンパク質を含み、寄生体は、哺乳類の寄生体である。ある実施形態において、HSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子は、HSV−2 US6遺伝子である。ある実施形態において、表面糖タンパク質は、ビリオンの組換えHSV−2のゲノム中に挿入されたトランスジーンによってコードされる。ある実施形態において、表面糖タンパク質は、脂質二重層上に存在するが、これは、細胞を、HSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した組換えHSV−2で感染させて、当該細胞がトランスフェクトされて、その細胞膜上に表面糖タンパク質を発現し、脂質二重層上に存在する表面糖タンパク質を含む組換えHSV−2が、細胞から産生されることによるものである。ある実施形態において、ビリオンはそのようなものから回収された。ある実施形態において、ウィルス糖タンパク質は、HIV、エンテロウィルス、RSV、インフルエンザウィルス、パラインフルエンザウィルス、ブタコロナ呼吸器ウィルス、狂犬病ウィルス、ラッサ熱ウィルス、ブニアウィルス、CMV、またはフィロウィルス由来である。ある実施形態において、糖タンパク質はHIV gp120である。ある実施形態において、フィロウィルスはエボラウィルスである。ある実施形態において、ウィルスは、HIV、結核菌(M.tuberculosis)、クラミジア(chlamydia)、マイコバクテリウム・ウルセランス(Mycobacterium ulcerans)、M.マリヌム(M.marinum)、らい菌(M.leprae)、M.アブセンシエンス(M. absenscens)、淋菌(Neisseria gonnorhea)、またはトレポネーマ属(Treponeme)である。ある実施形態において、トレポネーマ属(Treponeme)は梅毒トレポネーマ(Treponeme palidum)である。

0074

また、本明細書中に記載されるウィルスまたは本明細書中に記載されるビリオンを内部に含む単離細胞であって、ヒト中に存在しない細胞が提供される。該細胞のある実施形態において、細胞は、HSV−1糖タンパク質Dをコードする異種核酸を含む。該細胞のある実施形態において、細胞は、その膜上にHSV−1糖タンパク質Dを発現する。

0075

前記細胞のある実施形態において、HSV−1糖タンパク質Dは、異種核酸によってコードされ、当該異種核酸は、HSV−1糖タンパク質D遺伝子である、またはHSV−1糖タンパク質D遺伝子と同一の配列を有する核酸である。

0076

本明細書中に記載されるウィルス、または本明細書中に記載されるビリオンを含むワクチン組成物。ワクチン組成物のある実施形態において、該ワクチン組成物は、免疫アジュバントを含む。

0077

また、本明細書中に記載されるウィルス、または本明細書中に記載されるビリオンを含む組成物が提供され、当該ウィルスまたは当該ビリオンのゲノムは、少なくとも第2の遺伝子の欠失を含み、第2の遺伝子は、HSV−2ウィルスの複製に必須である。ある実施形態において、組成物は、免疫応答を誘発するためにウィルスまたはビリオンが予め導入されている哺乳類由来血清を含む、または当該血清に由来する。

0078

また、本明細書中に記載されるウィルス、または本明細書中に記載されるビリオン、および医薬的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物が提供される。

0079

また、対象において免疫応答を誘発する方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載されるウィルス;(ii)本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、対象において免疫応答を誘発するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0080

また、対象においてHSV−2感染を処置する、または対象においてHSV−2感染によって引き起こされる疾患を処置する方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載されるウィルス;(ii)本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、対象において、HSV−2感染を処置する、またはHSV−2感染によって引き起こされる疾患を処置するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0081

また、対象にHSV−2感染のワクチン接種をする方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載されるウィルス;(ii)本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、対象にHSV−2のワクチン接種をするのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0082

また、HSV−2感染に対して対象を免疫化する方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載されるウィルス;(ii)本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、HSV−2に対して対象を免疫化するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0083

HSV−2疾患およびHSV−1疾患は、当該技術分野において知られており、そしてまた本明細書中に記載されている。HSV−2疾患およびHSV−1疾患の処置および予防が、それぞれ別個に包含される。HSV−2およびHSV−1の重感染の処置または予防もまたカバーされる。予防は、未処置の対象と比較して、本明細書中に記載されるウィルス、ビリオン、ワクチンまたは組成物で処置された対象において、関連する疾患または感染の発症の程度の改善を意味すると理解される。

0084

また、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失しており、かつ脂質二重層上にHSV−1糖タンパク質Dを含む、組換えHSV−2のビリオンを生産する方法であって、HSV−1糖タンパク質Dをコードする異種核酸を含む細胞を、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した組換えHSV−2で、組換え単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)の複製を可能にする条件下で感染させることと、細胞によって産生された、脂質二重層上にHSV−1糖タンパク質Dを含む組換えHSV−2ビリオンを回収することとを含む方法が提供される。

0085

また、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失しており、かつ脂質二重層上に非HSV−2表面糖タンパク質を含む組換えHSV−2のビリオンを生産する方法であって、非HSV−2表面糖タンパク質をコードする異種核酸を含む細胞を、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した組換えHSV−2で、組換え単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)の複製を可能にする条件下で感染させることと、細胞によって産生された、脂質二重層上に非HSV−2表面糖タンパク質を含む組換えHSV−2ビリオンを回収することとを含む方法が提供される。

0086

また、配列がHSV−2糖タンパク質Dをコードする配列を含まないこと以外、HSV−2のゲノムと同じ配列を有する組換え核酸が提供される。

0087

また、対象においてHSV−2感染を処置または予防するための、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した単離組換えHSV−2が提供される。

0088

また、対象においてHSV−1感染を処置または予防するための、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した単離組換えHSV−2が提供される。

0089

また、対象においてHSV−2感染を処置または予防するための、ゲノム中のHSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失した単離組換えHSV−2のビリオンが提供される。

0090

また、対象においてHSV−1感染もしくはHSV−1およびHSV−2の重感染を処置する、または対象においてHSV−2感染もしくはHSV−1およびHSV−2の重感染によって引き起こされる疾患を処置する方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載されるウィルス;(ii)本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、対象においてHSV−2感染を処置する、もしくはHSV−2感染によって引き起こされる疾患を処置するのに有効な量、または対象においてHSV−1およびHSV−2の重感染を処置する、もしくはHSV−1およびHSV−2の重感染によって引き起こされる疾患を処置するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0091

また、対象にHSV−1感染、またはHSV−1およびHSV−2の重感染のワクチン接種をする方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載されるウィルス;(ii)本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、対象にHSV−1感染、またはHSV−1およびHSV−2の重感染のワクチン接種をするのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0092

また、HSV−1感染、またはHSV−1およびHSV−2の重感染に対して対象を免疫化する方法であって、対象に、(i)本明細書中に記載されるウィルス;(ii)本明細書中に記載されるビリオン;(iii)本明細書中に記載されるワクチン;(iv)本明細書中に記載される組成物;または(v)本明細書中に記載される医薬組成物の量を、HSV−1感染、またはHSV−1およびHSV−2の重感染に対して対象を免疫化するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0093

免疫化する、ワクチン接種をする、または免疫応答を誘発する、本明細書中の方法のある実施形態において、ビリオンもしくはウィルスの受動伝達、またはそれによって誘導される抗体もしくは免疫因子は、ある対象から別の対象にもたらされてよい。関連する産物は、一方の対象からの獲得後に、第2の対象への投与前に、処理されてよい。本明細書中に記載される本発明の好ましい実施形態において、対象は、哺乳類の対象である。ある実施形態において、哺乳類の対象は、ヒト対象である。
また、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失しており、さらに病原体の異質抗原を含む単離組換えHSV−2が提供される。ある実施形態において、異質抗原は、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、または糖タンパク質である。ある実施形態において、異質抗原は、HSV−2に関する異質抗原であるが、関連する「病原体」に見られる抗原である。ウィルス病原体および細菌病原体が、本明細書中に記載される。ある実施形態において、病原体は、哺乳類の細菌病原体または哺乳類のウィルス病原体である。ある実施形態において、抗原、または病原体をコードするトランスジーンは、病原体から実際にとられることはない、または物理的に取り出されないが、それでもやはり、病原体抗原またはコードする核酸配列と同じ配列を有する。ある実施形態において、単離組換えHSV−2は、その脂質二重層上に病原体の異質抗原を含む。単離組換えHSV−2のある実施形態において、病原体は、細菌またはウィルスである。ある実施形態において、病原体は、哺乳類の寄生体である。ある実施形態において、HSV−2糖タンパク質D−コード遺伝子は、HSV−2 US6遺伝子である。単離組換えHSV−2のある実施形態において、異質抗原は、組換えHSV−2のゲノム中に挿入されたトランスジーンによってコードされる。

0094

また、対象において抗原性標的に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を誘導する方法であって、対象に、ゲノム中の単純ヘルペスウィルス−2(HSV−2)糖タンパク質D−コード遺伝子が欠失しており、さらに脂質二重層上に異質抗原を含む単離組換えHSV−2を、抗原性標的に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)を誘発するのに有効な量投与することを含む方法が提供される。

0095

適切なトランスジーンを発現する組換えHSV−2 ΔgD−/+ gD−/+は、病原体による皮膚感染または粘膜感染から防御する抗体および細胞免疫応答を選択的に誘導するであろう。

0096

ある実施形態において、異質抗原は、表面抗原である。

0097

ある実施形態において、トランスジーンは、HIV、結核菌(M.tuberculosis)、クラミジア(chlamydia)、マイコバクテリウム・ウルセランス(Mycobacterium ulcerans)、M.マリヌム(M.marinum)、らい菌(M.leprae)、M.アブセンシエンス(M. absenscens)、淋菌(Neisseria gonnorhea)、またはトレポネーマ属(Treponeme)由来の抗原をコードする。ある実施形態において、トレポネーマ属(Treponeme)は梅毒トレポネーマ(Treponeme palidum)である。ある実施形態において、トランスジーンは、結核菌(M.tuberculosis)バイオフィルム−コード遺伝子である。ある実施形態において、トランスジーンは、HIV gp120−コード遺伝子である。

0098

ある実施形態において、異質抗原は、抗原性標的の表面抗原である。実施形態において、異質抗原は、寄生体抗原である。ある実施形態において、異質抗原は、細菌抗原またはウィルス抗原である。

0099

ある実施形態において、抗原性標的はウィルスであり、ラッサ熱ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス、RSV、エンテロウィルス、インフルエンザウィルス、パラインフルエンザウィルス、ブタコロナ呼吸器ウィルス、狂犬病ウィルス、ブニアウィルス、またはフィロウィルスである。

0100

ある実施形態において、抗原性標的は細菌であり、結核菌(Mycobaterium tuberculosis)、M.ウルセランス(M.ulcerans)、M.マリヌム(M.marinum)、らい菌(M.leprae)、M.アブセンシエンス(M. absenscens)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)、淋菌(Neisseria gonnorhea)、または梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)である。

0101

ある実施形態において、単離組換えHSV−2トランスジーンは、結核菌(M.tuberculosis)バイオフィルム−コード遺伝子であり、トランスジーンは、HIVgp120−コード遺伝子である。

0102

本明細書中に記載される方法の好ましい実施形態において、対象はヒトである。本明細書中に記載される方法の実施形態において、対象は、HSV−1にもHSV−2にもまだ感染していないし、重感染もしていない。本明細書中に記載される方法の実施形態において、対象は、HSV−1もしくはHSV−2に感染し、または重感染している。

0103

本明細書中に記載されるように、重感染は、HSV−1およびHSV−2による重感染を意味する。

0104

本明細書中に記載される種々の要素の全ての組合せは、本明細書中で特に明記しない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明の範囲内である。

0105

本発明は、以下の実験の詳細からよりよく理解されるであろう。しかしながら、当業者であれば、議論される具体的な方法および結果は単に、後に続く特許請求の範囲においてより完全に記載される本発明の例示であると容易に理解するであろう。

0106

実験の詳細
本明細書中で、遺伝子操作した、HSV−2のgD(US6)遺伝子の欠失変異体を開示し、その安全性、免疫原性、およびワクチンの有効性を、マウス感染モデルにおける膣内HSV−2チャレンジに照らして評価した。gD遺伝子を、緑色蛍光タンパク質(gfp)をコードするDNAフラグメントと置き換えて、HSV−1 gDを発現するVero細胞(VD60細胞)をこの構築体でトランスフェクトして、緑色プラークを形成する相同組換えウィルスに関してスクリーニングした。分子分析により、正確な組換えが操作されたことが明らかとなった。これは、補完VD60細胞において高い力価となるように複製するが、非補完細胞で増殖した場合には非感染性である。野生型マウスまたはSCIDマウスの、107pfu/マウスの補完gD−ヌルウィルス(本明細書中で、遺伝子型的にgDが欠失しているが、VD60細胞上での増殖によって表現型的に補完されているウィルスについて、HSV−2 ΔgD−/+と表す)による膣内チャレンジは、病原性を明らかにしなかったが、104pfu/マウスほどに低い用量の親の野生型ウィルスでは、100%致死であった。さらに、HSV−2 ΔgD−/+によるマウスの免疫化は、HSV−2の臨床単離体による膣内チャレンジに対して完全な防御をもたらした。HSV−2 ΔgD−/+によって誘発したロバスト体液性免疫および細胞性免疫を測定して、gDが、in vivo増殖性感染に必要であること、そして必須の糖タンパク質において欠失した弱毒化株が、HSV−2に対して防御免疫を誘発することが結論される。ゆえに、HSV−2 ΔgD−/+は、性器ヘルペスの予防または処置に有望なワクチンである。

0107

HSV−2 ΔgD−/+によって誘発した防御の機構および関連。gD−2ヌルウィルスが生じ、これは、免疫正常マウスおよび免疫不全マウスの双方において非常に弱毒化され、そして、ワクチン候補として試験すると、HSV−2による膣内チャレンジに対する防御免疫応答を誘導することが実証された。HSV−2 ΔgD−/+による皮下免疫化は、HSVの双方の血清型(HSV−2およびHSV−1)による膣内チャレンジに対する防御に必要とされる体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘導するであろう。

0108

HSV−2 ΔgD−/+は、不稔感染を誘導する:US6が欠失しているHSV−2株を、シグナリング事象の初めの、細胞感染中に起こる際の寄与を評価するために構築した[41]。このウィルスは、US6をコードするgD補完細胞系統(例えば、gD−1をコードするVD60細胞[40、41])上で、内在性プロモータ(例えば、ある実施形態において、gD−1プロモータ)の制御下で増殖しない限り、宿主細胞に感染することができない。実際に、非補完細胞から単離したHSV−2 ΔgD粒子は、上皮細胞図1)にもニューロン細胞(SK−N−SH、不図示)にも感染しない。しかしながら、VD60細胞中で増殖すれば、表現型的に補完されたウィルス(ΔgD−/+)が得られ、これは、野生型HSV−2に共通の標的である細胞に完全に感染することができる。しかしながら、ΔgD−/+による感染後、感染性の粒子もウィルスプラーク(pfu)も、これらの細胞から産生されず、ウィルスは、感染細胞から非感染細胞に広がることができない。このことは、これらのプロセスにおけるgDの必要条件を反映している;ゆえに、これは不稔感染である。

0109

HSV−2 ΔgD−/+は、マウス感染モデルにおいて安全である:野生型マウスおよび重症複合型免疫不全(SCID)マウスにおいて、皮下に、または膣内に高用量接種することによって、ΔgD−/+を安全性についてin vivo評価した。107pfuのΔgD−/+(補完細胞で力価測定(titered)した)を膣内接種したマウスは、実験全体を通して、ウィルス誘導病状の徴候を何ら呈しなかったが、1,000倍低い野生型ウィルス(104pfu)を接種した動物は、HSV−2疾患に屈して、接種後8日目から死亡し始めた(図2A)。107pfuのΔgD−/+を膣内接種したマウスは、実験全体を通して、ウィルス誘導上皮疾患または神経疾患の徴候を何ら呈しなかった(図2Bおよび図2C)。感染性ウィルスは、プラークアッセイまたはVero細胞とのDRGの共存培養によって判定して(不図示)、性器組織からもDRGからも回収されなかった。

0110

HSV−2 ΔgD−/+は、HSV−2に対する全身性抗体および粘膜抗体を誘発する:マウスにΔgD−/+を接種して皮下でブーストして(sc.−sc.)、またはこの候補ワクチン株(106pfu/マウス)を皮下接種して膣内でブーストして(sc.−i.vag.)、血清および膣洗浄液の抗HSV−2抗体の増大によって明示されるように、HSV−2に対する体液性免疫応答を誘発した(図3Aおよび図3B)。コントロール動物を、非感染VD60細胞溶解物で免疫化した(コントロールと呼ぶ)。抗体は、抗原として感染細胞溶解物を用いるELISAによって測定した(非感染細胞溶解物に対する反応は、バックグラウンドとして差し引いた)。注目すべきは、抗体反応の大きさは、免疫化の経路に応じて異なることである。実際に、s.c.−s.c.免疫処置は、s.c.−i.vag.免疫化よりも有意に多くの、HSV−2に対する血清および膣洗浄液の抗体を誘発した。この発見は、膣洗浄液抗体がおそらく血液由来IgG漏出液を表すことを示唆し、そしてsc.−sc.が、HSV−2に対する高いレベルの全身性IgG抗体および局所IgG抗体を誘発するのにより適切な経路であることを示唆している。加えて、ΔgD−/+(106pfu/マウス)を接種して皮下でブーストした(sc.−sc.)マウスは、ウィルスおよびこれらのマウス由来の血清によるVero細胞単層のin vitro中和によって明示されるように、中和抗HSV−2を誘発した(図3C)。

0111

HSV−2 ΔgD−/+は、HSV−2特異的T細胞活性化を誘発する:gB498−505−特異的トランスジェニックCD8+T細胞(gBT−I)を、ワクチン接種前にC57BL/6マウス中に伝達した。ワクチン接種済みマウスに、106pfu ΔgD−/+を、またはVD60細胞溶解物(コントロール)を接種した。ブースト後14日目に脾臓を採取して、カウンティングビーズ(CountBright(商標)、Lifetechnologies)を用いるフローサイトメトリによって定量化した(図4A)。同じ日に、脾臓を記憶表面マーカーについて染色して、フローサイトメトリによって分析した(図4B)。最後に、同じ日に採取した脾細胞を、アゴニストgB498−505−ペプチドで6時間、in vitroで再刺激し、細胞内サイトカイン染色を実行して、これらの細胞によるIFN−γ産生を測定した。ΔgD−/+による免疫化は、コントロールマウスと比較して、ワクチン接種済みマウスにおいて、IFN−γ産生を増大させた(図4C)。コントロールマウスの反応は、おそらく、伝達後の未感作マウスにおけるgBT−I T細胞の持続性を反映している。同様の結果が、gB498−505−ペプチドによりin vitroで再刺激した脾細胞の上澄みにマルチプレックスサイトカイン分析を用いて得られた(不図示)。これらの発見は、ワクチンがT細胞反応を誘導することを実証している。

0112

HSV−2 ΔgD−/+で免疫化したマウスは、膣内HSV−2致死チャレンジから防御される:HSV−2 ΔgD−/+によりsc.−sc.またはsc.−i.vagのいずれかでワクチン接種をした動物は、LD90に等しい膣内致死用量チャレンジ(5×104pfu/マウス)後、体重減を伴ってチャレンジを生存するが、VD60コントロール溶解物で免疫化したマウスは、10日目までに疾患に屈した(図5Aおよび図5B)。ワクチンはまた、LD90の10倍(5×105pfu/マウス、図示せず)に対して完全な防御を提供した。この防御は、有意に引き下げられた上皮疾患スコア図5C)および神経学的徴候の完全な不在図5D)を伴った。スコアリングは、先に記載されるように実行した[44]。さらに、膣チャレンジ後2日目に、コントロールマウスと比較して有意に少ないウィルスが、ΔgD−/+免疫化マウスの膣洗浄液において回収され、これにより迅速なクリアランスが示唆された(図5E)。さらに、非感染性ウィルスを、4日目の膣洗浄液中で(図5E)、またはチャレンジ後5日目に単離した膣組織もしくはDRG中で(図5F)回収した。後者は、ワクチンが、DRGへのウィルスの到達および/またはDRG中での複製を予防することを示唆している。

0113

HSV−2 ΔgD−/+による免疫化は、病原性HSV−2によるチャレンジ後に感染部位での炎症を予防する:HSV−2 ΔgD−/+でワクチン接種をし、かつ病原性HSV−2により膣内でチャレンジしたマウスは、VD60溶解物を接種した動物(コントロール)と比較して、感染部位にて有意に少ない炎症サイトカインしか示さない。実際に、ワクチン接種済みマウスは、感染後2日目および7日目の膣洗浄液中に、コントロールマウスよりも有意に少ないTNF−α(図6A)、IL−6(図6B)およびIL−1β(図6C)しか分泌しない。注目すべきは、炎症サイトカインのレベル増大が、HIV複製の増大、ならびにHSV−2およびHIVにより重感染した性器での排出を伴うことである[45、46]。同様の現象がin vitroでも観察されている[47]。

0114

HSV−2 ΔgD−/+による免疫化は、T細胞を、感染部位および関連するLNにリクルートする。ΔgD−/+によりsc.−sc.で免疫化したマウスは、病原性HSV−2によるチャレンジ後の仙骨リンパ節(LN)において、活性化抗HSV−2 gBT−I CD8+T細胞(図7A)およびCD4+T細胞(図7B)のパーセンテージの増大を示した。ΔgD−/+によりsc.−i.vag.で免疫化したマウスは、病原性HSV−2によるチャレンジ後の膣において、抗HSV−2 gBT−I CD8+T細胞(図7C)およびCD4+T細胞(図7D)の数の増大を示し、ΔgD−/+によるワクチン接種が、抗HSV−2 CD8+T細胞および活性化CD4+T細胞(抗HSV−2の可能性がある)を、感染部位および関連するリンパ節にリクルートすることが示唆された。

0115

更なる実験において、HSV−2−ΔgD−/+gD−1による免疫化は、C57BL/6およびBalb/Cにおける防御を、病原性HSV−2による膣チャレンジに対して与えることが見出された。また、膣内HSV−2チャレンジ済みΔgD−/+gD−1免疫化マウスは、チャレンジ後5日目に膣または神経組織においてHSV−2が検出可能でなかった。HSV−2 ΔgD−/+gD−1 sc.sc.抗体は、HSV−2病的結合マウス(HSV-2 morbid-bound mice)とは異なり、多数のHSV−2タンパク質(gDおよびgBの双方)を認識することが見出された。ワクチン接種した動物由来血清抗体は、HSV−1およびHSV−2のin vitro中和を示した。さらに、ΔgD−/+gD−1ワクチン接種済みマウス由来の血清は、HSV−2感染した細胞の抗体依存性細胞傷害(ADCC)をin vitroで誘発した。

0116

要約すると、HSV−2 ΔgD−/+gD−1は弱毒化され、wtマウスおよびSCIDマウスにおいて完全に安全である。組換えHSV−2 ΔgD−/+gD−1は、致死HSV−2膣内感染およびHSV−2/HSV−1皮膚感染から防御した。防御が、2つの異なるマウス株において観察された。検出可能な感染および殺菌免疫はなかった。また、観察されたのは、HSV−2特異的CD8+T細胞、ならびに全身性HSV抗体および粘膜HSV抗体の誘導であった。IgG2aおよびIgG2bが、主な抗HSVアイソタイプであった。また、観察されたのは、FcyRIII/II−依存性ADCCであった。驚くべきことに、免疫血清の受動伝達が、感作マウスを防御し、FcRnノックアウトマウスおよびFcyRノックアウトマウスは、免疫血清により防御されなかった。

0117

考察
世界保健機構(World Health Organization)は、5億を超える人々が世界中で単純ヘルペスウィルス2型(HSV−2)に感染し、毎年おおよそ2000万の新しい症例を伴うと推定した[1]。感染リスク年齢と共に増大する。ウィルスは頻度の高い亜臨床的再活性または臨床的再活性により潜在性確立するので、感染の影響は生涯にわたる。憂慮すべきことに、HSV−2は、HIVの感染および伝染の危険を著しく増大させる[2〜4]。HSV−2の蔓延は、世界地域間で異なり、日本の8.4%から、HIV蔓延がエピデミックな地域であるサハラのアフリカの70%にまで変動する([5、6])。米国において、HSV−2の蔓延は約16%であり、HSV−1の蔓延は約54%に下落した。米国(および他の欧州の国)におけるHSV−1の蔓延の減少は、性器ヘルペス疾患の大部分の症例がHSV−1によって引き起こされた、最近の予想外の糖タンパク質D(gD)サブユニットワクチン試験の結果[7〜9]によって明示されるように、性器HSV−1の増大と関連がある。HSV−1が、HSV−2と比較して、より少ない再発、およびより少ない性器ウィルス排出を伴う一方、双方の血清型が周産期に伝染して、新生児疾患を引き起こす;新生児疾患は、アシクロビル処置によってすら、高い罹患率および死亡率を伴う[10〜12]。性器ヘルペスを伴う罹患率、HIVエピデミックとの相乗効果、およびその直接的な医学コスト(米国だけで5億ドルを越える)は、安全かつ有効なワクチンを開発する緊急事態を強調している[13]。

0118

アジュバントと組み合わせたウィルスエンベロープ糖タンパク質からなるサブユニット製剤が、ほぼ20年間、HSV−2ワクチン分野を支配し、そして大部分の臨床試験は、この戦略に集中してきた[8、14〜19]。サブユニット調製が安全であり、かつ中和抗体を誘発するが、この製剤は、臨床試験において、HSV−2感染または疾患に対して少しの有効性しか提供しなかった[8、14]。驚くべきことに、HSV−2 gDサブユニットワクチンが、HSV−2ではなく性器HSV−1からの防御を提供した[8、20]。以降の研究により、血清HSV−2 gD抗体レベルがHSV−1からの防御に相関することが見出され、HSV−2防御に必要とされる抗体力価は、HSV−1から防御するのに必要な抗体力価よりも高くなり得ることが示唆された[21]。対照的に、細胞媒介性免疫(重なり合うgDペプチドに対する細胞内サイトカインの反応)が、どちらの血清型からの防御とも相関しなかった[21]。ワクチンは、CD8+T細胞反応ではなくCD4+T細胞反応を誘発したが、ワクチン接種した感染女性と非感染女性との間で、CD4+T細胞反応の差異はなかった[21]。性器または他の粘膜の抗体反応は、測定されなかった。gHがゲノムから欠失したHSV−2ワクチン候補は、血清反応陽性の対象間で行なった臨床試験において、ウィルスの再発の頻度を引き下げることができず、ワクチンは主な感染に対する有効性について評価されなかった[29]。

0119

中和血清抗体の誘導にも拘らず、CD8+T細胞反応を何ら誘発できないgDサブユニットワクチンと組み合わせた、HIV感染患者におけるHSV−2再活性率の増大を示す臨床研究により、有効なワクチンは、防御T細胞反応も誘発しなければならないことが示唆される[28、30〜32]。T細胞の重要性はさらに、ヒト三叉神経節におけるHSV−1反応性T細胞の選択的な保持を示す研究によって強調される。ニューロンを取り囲むCD4+T細胞およびCD8+T細胞が同定された。標的とされるウィルスタンパク質異質性が存在する一方、外皮タンパク質、ビリオンタンパク質16(VP16)は、多様なHLA−Aおよび−B対立遺伝子との関連で、複数の三叉神経節T細胞によって認識された;これらの発見は、外皮タンパク質が重要な免疫原であるかもしれないことを示唆する[33]。同様に、外皮タンパク質に向けられる細胞障害性T細胞は、HSV−2に潜在的に感染したヒトの研究においても同定された[34]。CD8+T細胞(CD8αα+T細胞を含む)が、HSV再活性後真皮表皮接合部の性器皮膚および粘膜中に残存することから、それらは免疫制御関与することが示唆される[35]。

0120

本明細書中で開示されるのは、本来あるHSV−2 gDが遺伝的に欠失した操作済みHSV−2ウィルスである。HSV−2 gD遺伝子は、ウィルス侵入および細胞間スプレッドに必須のエンベロープ糖タンパク質をコードする。糖タンパク質Dはまた、ヘルペスウィルス侵入メディエータHVEM)としても知られる免疫調節スイッチである腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリメンバ14(TNFRSF14)に結合する。HVEMが複数のリガンドのためのドッキング部位を保有し、そしてシグナリングが、これらの分子がシスまたはトランスのいずれでHVEMに結合するかに応じて異なるので、gDは、免疫細胞に調節影響を及ぼし得る[36、37]。実際に、最近の研究は、gDが、この受容体の本来あるリガンド(natural ligand)と競合して、ウィルスに対するサイトカイン反応を調節することを示唆している[38、39]。gD遺伝子は、緑色蛍光タンパク質(gfp)をコードするDNAフラグメントと置き換えられて、この構築体により形質転換された、HSV−1 gDを発現する補完Vero細胞(VD60細胞[40])(例えば、gD−1プロモータ下にgD−1がある)が、緑色のプラークを形成する相同組換えウィルスに関してスクリーニングされた。変異体ウィルスは、補完Vero細胞系統において、高い力価となるように複製する(補完細胞で継代された場合、HSV−2 ΔgD−/+と表される)が、非補完細胞において非感染性である(非補完細胞から単離された場合、HSV−2 ΔgD−/−と表される)。このウィルスが精製されて、in vitroで特徴付けられた[41]。免疫正常マウスまたは免疫不全(SCID)マウスの膣内接種または皮下接種により、親の野生型ウィルスによって引き起こされる致死感染と比較して、病原性がないことが明らかとなった。免疫化(皮下プライムに続く、皮下投与または膣内投与の単回ブースト)が、病原性HSV−2による膣内チャレンジから100%防御された。ロバストな体液性免疫および細胞性免疫がHSV−2 ΔgD−/+によって誘発され、US6(gD−2)は、in vivo増殖性感染に必要とされると結論された。この生弱毒化ウィルス株は、HSVに対する殺菌免疫を提供するであろう。また、血清または血清産物の受動伝達が利用されてもよい。

0121

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