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技術 口腔細菌の分析用核酸センサ、口腔細菌の分析デバイス、および口腔細菌の分析方法

出願人 NECソリューションイノベータ株式会社
発明者 藤田智子金子直人白鳥行大加藤信太郎
出願日 2018年10月15日 (2年10ヶ月経過) 出願番号 2018-193966
公開日 2020年4月23日 (1年4ヶ月経過) 公開番号 2020-061943
状態 未査定
技術分野 酵素、微生物を含む測定、試験 突然変異または遺伝子工学 生物学的材料の調査,分析 微生物・酵素関連装置
主要キーワード 分画領域 分析センサ 絶縁性プラスチック 前処理試料 ペルオキシダーゼ様活性 ベータプロテオバクテリア 簡易検査 半定量分析
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2020年4月23日)のものです。
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図面 (8)

課題

口腔フローラ分析に利用できる、簡便且つ特異的に口腔細菌を検出できるセンサを提供する。

解決手段

核酸配列Cと核酸配列Dのブロック配列BDと核酸配列Dと核酸配列Cのブロック配列BCとがこの順序で連結された核酸分子を含む。核酸配列Cはターゲット核酸配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、ブロック配列BCは核酸配列Cの部分領域に配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、核酸配列Dは触媒機能生起する核酸配列であり、ブロック配列BDは核酸配列Dの部分領域に配列依存的にアニーリングする核酸配列である。ターゲット核酸の存在下、核酸分子内において核酸配列Cにターゲット核酸が結合し、核酸配列Cとブロック配列BCとが解離し核酸配列Dとブロック配列BDとの解離により核酸配列Dの触媒機能がオンとなる。

概要

背景

歯周病は、口腔フローラバランス崩壊が原因の一つであることが知られている。フローラとは、例えば、細菌の集団であり、細菌叢ともいい、前記口腔フローラとは、口腔内の細菌叢である。そして、近年、歯周病と、糖尿病等の全身性の疾患との関連性が示唆されていることから、口腔フローラのバランスは、口腔にとどまらず、全身の健康の指標としても重要になると考えられる(非特許文献1)。

概要

口腔フローラの分析に利用できる、簡便且つ特異的に口腔細菌を検出できるセンサを提供する。核酸配列Cと核酸配列Dのブロック配列BDと核酸配列Dと核酸配列Cのブロック配列BCとがこの順序で連結された核酸分子を含む。核酸配列Cはターゲット核酸配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、ブロック配列BCは核酸配列Cの部分領域に配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、核酸配列Dは触媒機能生起する核酸配列であり、ブロック配列BDは核酸配列Dの部分領域に配列依存的にアニーリングする核酸配列である。ターゲット核酸の存在下、核酸分子内において核酸配列Cにターゲット核酸が結合し、核酸配列Cとブロック配列BCとが解離し核酸配列Dとブロック配列BDとの解離により核酸配列Dの触媒機能がオンとなる。

目的

本発明は、例えば、口腔フローラの分析に利用できる、簡便且つ特異的に口腔細菌を検出できるセンサの提供を目的とする

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

核酸分子を含み、前記核酸分子は、核酸配列Cと、前記核酸配列Cに対するブロック配列BCと、核酸配列Dと、前記核酸配列Dに対するブロック配列BDとを含み、前記核酸配列Cは、口腔細菌由来ターゲット核酸に対して配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、前記ブロック配列BCは、前記核酸配列Cの部分領域に対して、配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、前記核酸配列Dは、触媒機能生起する核酸配列であり、前記ブロック配列BDは、前記核酸配列Dの部分領域に対して、配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、前記核酸分子内で、前記核酸配列Cと前記ブロック配列BCとがアニーリングし、且つ、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BDとがアニーリングした状態において、前記各配列の順序が、前記核酸分子の一端から、前記核酸配列C、前記ブロック配列BD、前記核酸配列D、および前記ブロック配列BCの順序、または、前記核酸配列D、前記ブロック配列BC、前記核酸配列C、および前記ブロック配列BDの順序であり、前記ターゲット核酸の非存在下、前記核酸分子内において、前記核酸配列Cと前記ブロック配列BCとがアニーリングし、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BDとがアニーリングすることによって、前記核酸配列Dの触媒機能がオフとなり、前記ターゲット核酸の存在下、前記核酸分子内において、前記核酸配列Cに前記ターゲット核酸が結合し、前記核酸配列Cと前記ブロック配列BCとが解離し、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BDとが解離することによって、前記核酸配列Dの触媒機能がオンとなることを特徴とする、口腔細菌の分析用核酸センサ

請求項2

前記核酸分子が、一本鎖の核酸分子(I)であり、前記核酸配列C、前記ブロック配列BD、前記核酸配列D、および前記ブロック配列BCの順序で連結されている、または、前記核酸配列D、前記ブロック配列BC、前記核酸配列C、および前記ブロック配列BDの順序で連結されている、請求項1記載の分析用核酸センサ。

請求項3

前記核酸配列Cと前記ブロック配列BDとの間に介在配列IXを有し、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BCのとの間に介在配列IYを有し、前記介在配列IXと前記介在配列IYとは、前記核酸分子内において、互いに、配列依存的にアニーリングしない配列である、請求項1または2に記載の分析用核酸センサ。

請求項4

前記核酸分子が、二本鎖の核酸分子(II)であり、前記一本鎖の核酸分子(I)におけるいずれかの前記配列間が非連結である二本鎖分子である、請求項1記載の分析用核酸センサ。

請求項5

前記核酸分子が、三本鎖の核酸分子(III)であり、前記一本鎖の核酸分子(I)における、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BDとの間が非連結であり、その他のいずれかの前記配列間が非連結である三本鎖分子である、請求項1記載の分析用核酸センサ。

請求項6

前記ターゲット核酸が、前記口腔細菌が有する核酸、または、前記核酸を鋳型として増幅させた増幅核酸である、請求項1から5のいずれか一項に記載の分析用核酸センサ。

請求項7

前記核酸配列Cは、前記ターゲット核酸の部分領域に対して相補的な配列であり、前記ブロック配列BCは、前記核酸配列Cの部分領域に対して相補的な配列であり、前記ブロック配列BDは、前記核酸配列Dの部分領域に対して相補的な配列である、請求項1から6のいずれか一項に記載の分析用核酸センサ。

請求項8

担体、および分析用核酸センサを含み、前記分析用核酸センサが、請求項1から7のいずれか一項に記載の分析用核酸センサであり、前記担体に、前記分析用核酸センサが配置されていることを特徴とする、口腔細菌の分析デバイス

請求項9

請求項1から7のいずれか一項に記載の分析用核酸センサに、口腔由来の試料を接触させる接触工程、および、前記分析用核酸センサにおける前記核酸配列Dの触媒機能を検出することによって、前記試料中の口腔細菌由来のターゲット核酸を検出する検出工程を含むことを特徴とする、口腔細菌の分析方法

請求項10

請求項1から7のいずれか一項に記載の分析用核酸センサ、または、請求項8に記載の分析用デバイスと、試薬とを含むことを特徴とする口腔細菌の分析キット

技術分野

0001

本発明は、口腔細菌分析用核酸センサ、口腔細菌の分析デバイス、および口腔細菌の分析方法に関する。

背景技術

0002

歯周病は、口腔フローラバランス崩壊が原因の一つであることが知られている。フローラとは、例えば、細菌の集団であり、細菌叢ともいい、前記口腔フローラとは、口腔内の細菌叢である。そして、近年、歯周病と、糖尿病等の全身性の疾患との関連性が示唆されていることから、口腔フローラのバランスは、口腔にとどまらず、全身の健康の指標としても重要になると考えられる(非特許文献1)。

先行技術

0003

口腔細菌研究の新展開、日本細菌学雑誌、70(2)、333−338頁、2015年、日本細菌学会

発明が解決しようとする課題

0004

前記口腔フローラのバランスは、例えば、口腔内に存在する多種類の細菌(いわゆる口腔細菌)の組成比率で表すことができる。前記口腔フローラのバランスは、遺伝子解析によれば、口腔細菌の種類を判別し、それぞれの量を定量できるため、測定可能といえる。しかし、このような遺伝子解析による方法は、高額で特殊な専用装置が必要であり、また、その工程も煩雑である。他方、いわゆるヘルスケアの分野においては、簡便に検査を行えることが重要であることから、口腔内の状態を検査するための簡易検査用のデバイス報告されている。しかしながら、これらのデバイスは、口腔細菌の有無は検出できても、量が測定できないという定量性の問題があったり、口腔細菌の量は検出できても、特異性欠けるため、複数の口腔細菌の組成分析することができない。前述のように、口腔フローラのバランスは、複数の口腔細菌の組成比率で表されることから、現状、ヘルスケアの分野で、簡易に口腔フローラのバランスを検出することは困難である。

0005

そこで、本発明は、例えば、口腔フローラの分析に利用できる、簡便且つ特異的に口腔細菌を検出できるセンサの提供を目的とする。

課題を解決するための手段

0006

本発明の分析用核酸センサは、口腔細菌の分析用核酸センサであり、核酸分子を含み、
前記核酸分子は、核酸配列Cと、前記核酸配列Cに対するブロック配列BCと、核酸配列Dと、前記核酸配列Dに対するブロック配列BDとを含み、
前記核酸配列Cは、口腔細菌由来ターゲット核酸に対して配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、
前記ブロック配列BCは、前記核酸配列Cの部分領域に対して、配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、
前記核酸配列Dは、触媒機能生起する核酸配列であり、
前記ブロック配列BDは、前記核酸配列Dの部分領域に対して、配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、
前記核酸分子内で、前記核酸配列Cと前記ブロック配列BCとがアニーリングし、且つ、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BDとがアニーリングした状態において、前記各配列の順序が、前記核酸分子の一端から、前記核酸配列C、前記ブロック配列BD、前記核酸配列D、および前記ブロック配列BCの順序、または、前記核酸配列D、前記ブロック配列BC、前記核酸配列C、および前記ブロック配列BDの順序であり、
前記ターゲット核酸の非存在下、前記核酸分子内において、前記核酸配列Cと前記ブロック配列BCとがアニーリングし、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BDとがアニーリングすることによって、前記核酸配列Dの触媒機能がオフとなり、
前記ターゲット核酸の存在下、前記核酸分子内において、前記核酸配列Cに前記ターゲット核酸が結合し、前記核酸配列Cと前記ブロック配列BCとが解離し、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BDとが解離することによって、前記核酸配列Dの触媒機能がオンとなることを特徴とする。

0007

本発明の分析用デバイスは、担体、および分析用核酸センサを含み、前記分析用核酸センサが、前記本発明の分析用核酸センサであり、前記担体に、前記分析用核酸センサが配置されていることを特徴とする。

0008

本発明の分析方法は、前記本発明の分析用核酸センサに、口腔由来の試料を接触させる接触工程、および、前記分析用核酸センサにおける触媒配列Dの触媒機能を検出することによって、前記試料中の口腔細菌由来のターゲット核酸を検出する検出工程を含むことを特徴とする。

発明の効果

0009

本発明によれば、簡便且つ特異的に口腔細菌を検出できるため、例えば、目的の口腔細菌ごとのセンサを使用することで、組成比率により表される口腔フローラの簡便な分析も可能となる。

図面の簡単な説明

0010

図1は、本発明の核酸センサの一例を示す模式図である。
図2は、本発明の核酸センサの他の例を示す模式図である。
図3は、本発明の核酸センサの他の例を示す模式図である。
図4は、本発明の核酸センサの他の例を示す模式図である。
図5は、本発明の核酸センサの他の例を示す模式図である。
図6は、実施例1における化学発光測定の結果を示すグラフである。
図7は、実施例2における化学発光測定の結果を示すグラフである。

0011

<核酸センサ>
本発明の口腔細菌の分析用核酸センサは、前述のように、核酸分子を含み、
前記核酸分子は、核酸配列Cと、前記核酸配列Cに対するブロック配列BCと、核酸配列Dと、前記核酸配列Dに対するブロック配列BDとを含み、
前記核酸配列Cは、口腔細菌由来のターゲット核酸に対して配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、
前記ブロック配列BCは、前記核酸配列Cの部分領域に対して、配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、
前記核酸配列Dは、触媒機能を生起する核酸配列であり、
前記ブロック配列BDは、前記核酸配列Dの部分領域に対して、配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、
前記核酸分子内で、前記核酸配列Cと前記ブロック配列BCとがアニーリングし、且つ、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BDとがアニーリングした状態において、前記各配列の順序が、前記核酸分子の一端から、前記核酸配列C、前記ブロック配列BD、前記核酸配列D、および前記ブロック配列BCの順序、または、前記核酸配列D、前記ブロック配列BC、前記核酸配列C、および前記ブロック配列BDの順序であることを特徴とする。

0012

そして、本発明のセンサは、前記ターゲット核酸の非存在下、前記核酸分子内において、前記核酸配列Cと前記ブロック配列BCとがアニーリングし、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BDとがアニーリングすることによって、前記核酸配列Dの触媒機能がオフとなり、前記ターゲット核酸の存在下、前記核酸分子内において、前記核酸配列Cに前記ターゲット核酸が結合し、前記核酸配列Cと前記ブロック配列BCとが解離し、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BDとが解離することによって、前記核酸配列Dの触媒機能がオンとなる。

0013

本発明において、以下、分析用核酸センサは、「センサ」といい、口腔細菌由来のターゲット核酸に対して配列依存的にアニーリングする核酸配列Cは、「ターゲット用配列C」といい、触媒機能を生起する核酸配列Dは、「触媒配列D」といい、核酸配列は、「配列」という。本発明において、分析は、例えば、定量分析半定量分析定性分析を含む。

0014

本発明のセンサは、ターゲット用配列Cが、口腔細菌由来のターゲット核酸に配列依存的にアニーリングする配列であるため、前記ターゲット核酸に特異的に結合でき、且つ、前記ターゲット核酸にアニーリングしたか否かによって、触媒配列Dの触媒機能のON−OFFスイッチングできる。このため、本発明のセンサによれば、触媒配列Dの触媒機能を検出することで、前記ターゲット核酸の有無または量を検出でき、それにより、口腔細菌の有無または量を間接的に検出できる。本発明のセンサは、前記核酸分子であることから、例えば、前記センサを搭載するデバイスを小型化したり、チップ化すること等も可能である。また、本発明のセンサは、例えば、口腔細菌の種類ごとにターゲット用配列Cを設計できる。このため、複数の口腔細菌に対して、それぞれ本発明のセンサを作製し、1つの口腔サンプルについて、前記口腔細菌ごとに異なる本発明のセンサを使用して分析を行うことにより、前記複数の口腔細菌を特異的に判別して、定量することが可能である。そして、その結果から、口腔細菌の組成比率で表される口腔フローラを分析することもできる。このため、本発明は、例えば、全身のヘルスケアにも繋がる口腔ヘルスケアの分野、口腔医療の分野等において、極めて有用な技術である。

0015

本発明において、ターゲットとなる前記口腔細菌は、特に制限されず、例えば、口腔フローラを形成する細菌である。前記口腔細菌は、そのは、例えば、ガンマプロテオバクテリア綱(Gammaproteobacteria)、フソバクテリウム綱(Fusobacteriia)、フラボバクテリア綱(Flavobacteriia)、クロストリジウム綱(Clostridia)、ベータプロテオバクテリア綱(Betaproteobacteria)、バクテロイデス綱(Bacteroidia)、バシラス綱 (Bacilli)、放線菌綱(Actinobacteria)、ネガティウィクテス綱(Negativicutes)等があげられる。また、前記口腔細菌の属は、例えば、レンサ球菌属(Streptococcus)、ナイセリア属(Neisseria)、ヴェイロネラ属(Veillonella)、プレボテーラ属(Prevotella)、フソバクテリウム属(Fusobacterium)、ヘモフィルス属(Haemophilus)、アクチノマイセス属(Actinomyces)、ゲメラ属(Gemella)、ポルフィロモナス属(Porphyromonas)、グラニュリカテラ属(Granulicatella)等があげられる。前記口腔細菌の具体例としては、大腸菌(Escherichia coli)、カンジダアルビカンス(Candida albicans)等があげられ、この他にも、歯周病発症と強い関連性のある細菌として、例えば、Porphyromonas gingivalis、Aggregatibacter actinomycetemcomitans、Tannerella forsythensis、Treponema denticola等、う蝕発症と強い関連性のある細菌として、例えば、Streptococcus mutans、Streptococcus sobrinus等があげられる。

0016

ターゲット用配列Cは、特に制限されず、口腔細菌由来のターゲット核酸に対して配列依存的にアニーリングする核酸分子であればよい。本発明のセンサは、前述のように、口腔フローラの分析に有用であることから、前記口腔細菌由来のターゲット核酸は、例えば、口腔フローラの分析対象となる複数の口腔細菌間において、特異的な塩基配列を領域に設定することが好ましい。前記口腔細菌由来のターゲット核酸は、例えば、前記口腔細菌が細菌内に有する核酸でもよいし、前記口腔細菌が有する核酸を鋳型として増幅させた増幅核酸でもよい。前記口腔細菌が有する核酸は、例えば、DNA、RNA等の遺伝子があげられる。前記RNAは、例えば、mRNAtRNArRNA、機能性ノンコーティングRNA等があげられる。前記rRNAは、例えば、16SrRNA等があげられる。前記増幅核酸は、例えば、cDNA等のDNAでも、RNAでもよい。前記増幅核酸は、例えば、前記口腔細菌が有する核酸を鋳型として、PCRRT−PCR等の核酸増幅方法により増幅することで調製できる。前記ターゲット核酸は、例えば、口腔フローラの分析対象となる口腔細菌を任意に選択し、既存のデータベースを利用して、選択した複数の口腔細菌の塩基配列をアライメントし、前記口腔細菌間で異なる配列領域を抽出し、この抽出結果に基づいて設定することができる。

0017

本発明のセンサにおける特異性は、例えば、口腔フローラの分析目的に応じて適宜設定でき、具体例として、前記口腔細菌の分類を、どの分類階級で行うかによって設定できる。前記口腔細菌を「網」で分類する場合は、例えば、「網」間で異なる配列領域を、前記ターゲット核酸として設定し、前記口腔細菌を「属」で分類する場合は、例えば、「属」間で異なる配列領域を、前記ターゲット核酸として設定し、前記口腔細菌を「種」で分類する場合は、例えば、「種」間で異なる配列領域を、前記ターゲット核酸として設定することができる。

0018

ターゲット用配列Cは、前記ターゲット核酸に対して配列依存的にアニーリングすればよいことから、例えば、前記ターゲット核酸の配列情報に基づいて、前記ターゲット核酸の任意の部分領域に対して、相補性を示す配列(相補的な配列)として設計できる。前記ターゲットにおける任意の部分領域とは、例えば、前述のような、前記口腔細菌間で異なる配列領域である。前記ターゲット核酸の部分領域に対するターゲット用配列Cの相補性は、前記部分領域の塩基数に対するターゲット用配列Cのマッチする塩基数の割合(%)で表した場合、例えば、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、好ましくは100%である。また、前記ターゲット用配列Cは、前記部分領域の配列に対するTm値融解温度)が、例えば、50℃以上、55℃以上、60℃以上である。

0019

口腔細菌の判別が、例えば、数塩基(例えば、1〜3塩基程度)の違いの判別により行われる場合がある。このような場合、ターゲット用配列Cは、例えば、前記ターゲット核酸の部分領域に対して、パーフェクトマッチする配列に設定してもよいし、1〜3塩基、2塩基、または1塩基がミスマッチする配列に設定してもよい。

0020

ターゲット用配列Cは、例えば、一本鎖であり、その長さは、特に制限されず、その下限は、例えば、18塩基長、20塩基長、24塩基長であり、その上限は、例えば、120塩基長、60塩基長、26塩基長である。

0021

触媒配列Dは、触媒機能を生起する核酸配列であればよい。前記触媒機能は、例えば、酸化還元反応の触媒機能である。前記酸化還元反応は、例えば、基質から生成物が生成される過程において、二つの基質の間で電子の授受を生じる反応である。前記酸化還元反応の種類は、特に制限されない。前記酸化還元反応の触媒機能は、例えば、酵素と同様の活性があげられ、具体的には、例えば、ペルオキシダーゼと同様の活性(以下、「ペルオキシダーゼ様活性」という)等があげられる。前記ペルオキシダーゼ様活性は、例えば、西洋わさび由来ペルオキシダーゼ(HRP)と同様の活性があげられる。触媒配列Dは、後述するように、その構成単位がDNAの場合、DNAエンザイムまたはDNAzymeと呼ぶことができ、また、その構成単位がRNAの場合、RNAエンザイムまたはRNAzymeと呼ぶことができる。前記DNAzymeおよび前記RNAzymeは、例えば、既存のものが利用できる。

0022

触媒配列Dは、例えば、G−カルテット(またはG−tetradという)構造を形成する核酸配列であり、好ましくは、グアニン四重鎖(またはG−quadruplexという)構造を形成する核酸配列である。前記G−カルテット構造を形成する場合、触媒配列Dは、例えば、全長が、12〜40塩基長であり、4つのグアニン領域と、前記グアニン領域間介在領域とを含む配列であり、前記グアニン領域は、3または4塩基のグアニンが連続した領域であり、前記介在領域は、グアニン以外の1塩基または2塩基の領域である。

0023

前記Gカルテット構造は、例えば、グアニンが四量体となった面の構造であり、G−quadruplex構造は、例えば、前記Gカルテット構造が複数面重なった構造をいう。前記Gカルテット構造および前記G−quadruplex構造は、例えば、反復してGリッチ構造モチーフを有する核酸配列において、形成される。前記G−tetrad構造は、例えば、パラレル型およびアンチパラレル型があげられ、パラレル型が好ましい。触媒配列Dが前記G−カルテット構造を形成する配列の場合、触媒配列Dは、例えば、前記G−カルテット構造を形成することで、前記触媒機能が生起され、前記G−カルテット構造の形成が阻害されることで、前記触媒機能の生起も阻害される。なお、本発明のセンサにおける、触媒配列Dの触媒機能のON-OFFは、後述する。

0024

触媒配列Dは、例えば、ポルフィリンと結合可能な核酸配列があげられ、具体的には、前記G−カルテット構造を形成し且つ前記ポルフィリンと結合可能な核酸配列があげられる。前記G−カルテット構造を形成する核酸配列には、例えば、前記ポルフィリンと結合して複合体を形成することによって、前述のような酸化還元反応の触媒機能を生起するものが知られている。触媒配列Dが、前記ポルフィリンと結合可能な核酸配列の場合、本発明のセンサは、例えば、試薬としてポルフィリンを併用することが好ましい。

0025

前記ポルフィリンは、特に制限されず、例えば、無置換体のポルフィリン、その誘導体があげられる。前記誘導体は、例えば、置換体のポルフィリン、および金属元素錯体を形成した金属ポルフィリン等があげられる。前記置換体のポルフィリンは、例えば、N−メチルメソポルフィリン等があげられる。前記金属ポルフィリンは、例えば、三価鉄錯体であるヘミン等があげられる。前記ポルフィリンは、例えば、前記金属ポルフィリンが好ましく、より好ましくはヘミンである。

0026

触媒配列Dは、例えば、一本鎖であり、その長さは、特に制限されず、その下限は、例えば、11塩基長、13塩基長、15塩基長であり、その上限は、例えば、60塩基長、36塩基長、18塩基長である。

0027

触媒配列Dは、例えば、ペルオキシダーゼ活性を有するDNAとして、下記論文(1)〜(4)等に開示されている、後述する配列番号1〜41のDNAzymeが例示できる。
(1)Travascioら, Chem. Biol., 1998年, vol.5, p.505-517
(2)Chengら, Biochimistry, 2009年, vol.48, p.7817-7823
(3)Tellerら, Anal. Chem., 2009年, vol.81, p.9114-9119
(4)Taoら, Anal. Chem., 2009年, vol.81, p.2144-2149

0028

触媒配列Dは、具体例として、下記(d1)、(d2)、または(d3)のポリヌクレオチドを含む配列があげられる。触媒配列Dは、例えば、前記ポリヌクレオチドからなる配列でもよいし、前記ポリヌクレオチドを含む配列でもよい。

0029

(d1)配列番号1〜41のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド
(d2)前記(d1)の前記塩基配列において、1または複数の塩基が、置換欠失、付加および/または挿入された塩基配列からなり、且つ、前記酸化還元反応の触媒機能を生起するポリヌクレオチド
(d3)前記(d1)の前記塩基配列との同一性が80%以上の塩基配列からなり、且つ、前記酸化還元反応の触媒機能を生起するポリヌクレオチド

0030

EAD2(配列番号1)
CTGGGAGGGAGGGAGGGA
c−Myc(配列番号2)
TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA
m_c−Myc−0527(配列番号3)
TGAGGGGAGGGAGGGCGGGGAA
m_c−Myc−0579(配列番号4)
TGAGGGGTGGGAGGGAGGGGAA
m_c−Myc−0580(配列番号5)
TGAGGGGTGGGAGGGACGGGAA
m_c−Myc−0583(配列番号6)
TGAGGGGTGGGAGGGTGGGGAA
m_c−Myc−0584(配列番号7)
TGAGGGGTGGGAGGGTCGGGAA
neco0584(配列番号8)
GGGTGGGAGGGTCGGG
m_c−Myc−0586(配列番号9)
TGAGGGGTGGGAGGGGTGGGAA
m_c−Myc−0588(配列番号10)
TGAGGGGTGGGAGGGGCGGGAA
m_c−Myc−0605(配列番号11)
TGAGGGGTGGGTGGGCAGGGAA
m_c−Myc−0608(配列番号12)
TGAGGGGTGGGTGGGCCGGGAA
m_c−Myc−0627(配列番号13)
TGAGGGGTGGGCGGGAGGGGAA
m_c−Myc−0632(配列番号14)
TGAGGGGTGGGCGGGTCGGGAA
m_c−Myc−0706(配列番号15)
TGAGGGGCGGGAGGGATGGGAA
m_c−Myc−0711(配列番号16)
TGAGGGGCGGGAGGGTGGGGAA
m_c−Myc−0712(配列番号17)
TGAGGGGCGGGAGGGTCGGGAA
m_EAD2−0032(配列番号18)
CTGGGTGGGCGGGCGGGA
m_c−Myc−0520(配列番号19)
TGAGGGGAGGGAGGGTCGGGAA
m_c−Myc−0714(配列番号20)
TGAGGGGCGGGAGGGGTGGGAA
m_TA−0420(配列番号21)
GGGCGGGAGGGAGGG

0031

GTGGGTCATTGTGGGTGGGTGTGG (配列番号22)
GTGGGTAGGGCGGGTTGG (配列番号23)
GGTTGGTGTGGTTGG (配列番号24)
GGGGTTGGGGTGTGGGGTTGGGG (配列番号25)
AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG (配列番号26)
GGGGTTTTGGGGTTTTGGGGTTTTGGGG (配列番号27)
GGGCGCGGGAGGAAGGGGGCGGG (配列番号28)
GTGGGTAGGGCGGTTGG (配列番号29)
CGAGGTGGGTGGGTGGGA (配列番号30)
CTGGGTGGGTGGGTGGGA (配列番号31)
CTGGGAGGGAGGGAGGGA (配列番号32)
CTGGGCGGGCGGGCGGGA (配列番号33)
CTGGGTTGGGTTGGGTTGGGA (配列番号34)
CTGGGGTGGGGTGGGGTGGGGA (配列番号35)
GGGCGGGCCGGGGGCGGG (配列番号36)
TGAGGGTGGGGAGGGTGGGGAA (配列番号37)
CGGGCGGGCGCGAGGGAGGGG (配列番号38)
GGGAGGGAGAGGGGGCGGG (配列番号39)
GGGCGGGCGCGGGCGGG (配列番号40)
GGGTAGGGCGGGTTGGG (配列番号41)

0032

前記(d2)において、「1または複数」は、特に制限されず、前記(d2)のポリヌクレオチドが、前記酸化還元反応の触媒機能を生起すればよい。「1または複数」は、例えば、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1個または2個である。

0033

前記(d3)において、前記同一性は、例えば、80%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上である。前記同一性は、例えば、BLAST等を用いて、デフォルトの条件で計算することにより、算出できる。

0034

本発明のセンサにおいて、前記核酸分子は、例えば、特に制限されず、例えば、一本鎖でも、二本鎖でも、三本鎖でもよい。以下に、本発明のセンサとして、一本鎖の核酸分子(I)を含むセンサ(以下、本発明のセンサIともいう)、二本鎖の核酸分子(II)を含むセンサ(以下、本発明のセンサIIともいう)、三本鎖の核酸分子を含むセンサ(以下、本発明のセンサIIIともいう)のそれぞれについて、具体例をあげて、図を用いて、説明する。各図において、同一箇所には同一符号を付している。

0035

(1)センサI
まず、前記一本鎖の核酸分子(I)を含む本発明のセンサIの具体例について説明する。本発明のセンサIにおいて、前記核酸分子(I)は、例えば、ターゲット用配列C、ブロック配列BC、触媒配列D、およびブロック配列BDを含み、各配列は、例えば、ターゲット用配列C、ブロック配列BD、触媒配列D、およびブロック配列BCの順序で連結されてもよいし、触媒配列D、ブロック配列BC、ターゲット用配列C、およびブロック配列BDの順序で連結されてもよい。

0036

本発明のセンサIのうち、ターゲット用配列C、ブロック配列BD、触媒配列D、およびブロック配列BCの順序で連結された核酸分子を含むセンサI−1の具体例を、図1に示す。なお、図1は例示であって、本発明のセンサIは、これには制限されない。図1は、センサI−1の構造の一例であり、前記ターゲット核酸が存在しない状態の構造である。図1において、Cは、ターゲット用配列C、BDは、ブロック配列BD、Dは、触媒配列D、BCは、前記ブロック配列BCを示し、矢印は、各配列について、5’から3’に向かう方向を示す。

0037

前記センサI−1において、前記核酸分子(I)は一本鎖分子である。そして、前記核酸分子(I)は、前述のように、ターゲット用配列Cと触媒配列Dの他に、さらに、ブロック配列BCおよびブロック配列BDを含む。前記核酸分子(I)において、ターゲット用配列C、触媒配列D、ブロック配列BCおよびブロック配列BDは、「ターゲット用配列C−ブロック配列BD−前記核酸配列D−ブロック配列BC」の順序で連なっていればよく、その方向は、図1(A)に示すように、例えば、5’側から、「ターゲット用配列C−ブロック配列BD−触媒配列D−ブロック配列BC」の順序となってもよいし、図1(B)に示すように、例えば、3’側から、「ターゲット用配列C−ブロック配列BD−触媒配列D−ブロック配列BC」の順序となってもよい。後者の場合、5’側から、「ブロック配列BC−前記核酸配列D−ブロック配列BD−ターゲット用配列C」の順序ということもできる。

0038

ブロック配列BCは、ターゲット用配列Cの部分領域に対して、配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、ブロック配列BDは、触媒配列Dの部分領域に対して、配列依存的にアニーリングする核酸配列である。このため、前記センサI−1は、前記ターゲット核酸が存在しない状態において、自己アニーリング(自己会合ともいう)する。具体的には、図1に示すように、ブロック配列BCは、ターゲット用配列Cの部分領域にアニーリングして、ブロック配列BCとターゲット用配列Cの部分領域との間でステムCを形成し、ブロック配列BDは、触媒配列Dの部分領域にアニーリングし、ブロック配列BDと触媒配列Dの部分領域との間でステムDを形成する。このように、前記センサIの核酸分子内において、ブロック配列BDと触媒配列Dの部分領域とがアニーリングすることにより、触媒配列Dは、フリーの状態(例えば、触媒配列D単独の状態)と比較すると、触媒機能を生起する構造を取り難くなり、さらに、前記核酸分子(I)の一端側に位置し且つ触媒配列Dに連結されたブロック配列BCと、前記核酸分子(I)の他端側に位置するターゲット用配列Cとがアニーリングすることにより、触媒配列Dが前記構造をとり難い状態が、ロックされる(触媒配列Dのケージ化ともいう)。このため、前記センサI−1は、前記ターゲット核酸が存在しない状態では、触媒配列Dの触媒機能をOFFに制御することができる。

0039

一方、前記ターゲット核酸が存在すると、前記センサI−1におけるターゲット用配列Cに、前記ターゲット核酸が配列依存的にアニーリングすると、これによって、ブロック配列BCとターゲット用配列Cとが解離する(ステムCの解除)。そして、ブロック配列BCとターゲット用配列Cとの解離により、前記ロックが解除される。前記ロックが解除されると、触媒配列Dは、ブロック配列BDがアニーリングしているものの、触媒機能を生起する構造をとろうとする。この構造変化に伴って、触媒配列Dからブロック配列BDが解離し、触媒配列Dは、前記構造を形成して、触媒機能を生起する。このため、前記センサI−1は、前記ターゲット核酸が存在する状態では、触媒配列Dの触媒機能をONに制御することができる。なお、本発明は、これらのメカニズムには制限されない。

0040

前記センサI−1において、触媒配列Dが、例えば、前述のように、G−カルテット構造を形成することにより、触媒反応を生起する配列の場合、前記ターゲット核酸が存在しない状態では、ブロック配列BCとターゲット用配列Cとのアニーリングおよびブロック配列BDと触媒配列Dとのアニーリングにより、触媒配列DのG−カルテット構造の形成が阻害されることで、触媒機能がOFFとなり、前記ターゲット核酸が存在する状態では、前記アニーリングが解除されるため、触媒配列DがG−カルテット構造を形成することで、触媒機能がONになる。

0041

前記センサI−1において、ブロック配列BCは、ターゲット用配列Cの部分領域に対して、配列依存的にアニーリングすればよいことから、例えば、ターゲット用配列Cの配列に基づいて、ターゲット用配列Cの任意の部分領域に対して、相補性を示す配列(相補的な配列)として設計できる。前記ターゲット用配列Cの部分領域に対するブロック配列BCの相補性は、前記部分領域の塩基数に対するブロック配列BCのマッチする塩基数の割合(%)で表した場合、例えば、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、好ましくは100%(パーフェクトマッチ)である。また、ブロック配列BCは、ターゲット用配列Cの部分領域の配列に対するTm値(融解温度)が、例えば、50℃以上、55℃以上、60℃以上である。

0042

ブロック配列BCは、例えば、ターゲット用配列Cの部分領域に対して、パーフェクトマッチする配列に設定してもよいし、1〜3塩基、2塩基、または1塩基がミスマッチする配列に設定してもよい。

0043

前記センサI−1において、ブロック配列BCは、前記ターゲット核酸が存在しない状態では、ターゲット用配列Cの部分領域にアニーリングし、前記ターゲット核酸が存在する状態では、ターゲット用配列Cが前記ターゲット核酸とアニーリングにするに伴って、ターゲット用配列Cから解離する必要がある。このため、ブロック配列BCは、例えば、ターゲット用配列とのTm値が、ターゲット用配列Cと前記ターゲット核酸の部分領域とのTm値よりも低くなるような配列に設定することが好ましい。二重鎖のTm値は、相対的に高い程、結合力が強く、相対的に低い程、結合力が弱いことを意味する。このため、ブロック配列BCとターゲット用配列CとのTm値(BC・C)が、ターゲット用配列Cと前記ターゲット核酸の部分領域とのTm値(C・T)よりも低くなるように、ブロック配列BCとターゲット用配列Cとを設定することが好ましい。つまり、本発明において、ブロック配列BCおよびターゲット用配列Cは、例えば、ブロック配列BCとターゲット用配列CとのTm値(BC・C)が、ターゲット用配列Cと前記ターゲット核酸の部分領域とのTm値(C・T)よりも低いとの条件を満たすことが好ましい。Tm値(BC・C)とTm値(C・T)との差は、特に制限されず、Tm値は、例えば、市販のソフトウェアを用いて算出することができる。

0044

ブロック配列Bcは、例えば、パーフェクトマッチな配列であり、且つ、本発明のセンサI全体の自由エネルギーが、−20〜−10kcal/molとなるような配列が好ましい。前記自由エネルギーは、例えば、公開されているソフトウェアRNAfold(Institute for Theoretical Chemistry)により算出できる。

0045

ブロック配列BCがアニーリングする部分領域は、例えば、ターゲット用配列Cのいずれか一方の末端領域である。図1(A)のように、ブロック配列BCがセンサの3’末端側に位置する場合は、例えば、ターゲット用配列Cの3’末端領域にアニーリングするように設計し、図1(B)に示すように、ブロック配列BCがセンサの5’末端側に位置する場合は、例えば、ターゲット用配列Cの5’末端領域にアニーリングするように設計する。

0046

ブロック配列BCの長さは、特に制限されず、ターゲット用配列Cの長さや配列等に応じて、適宜設定できる。ブロック配列BCの長さは、ブロック配列BCとターゲット用配列Cとの間でアニーリングにより形成されるステムCの長さである。ブロック配列BCの長さは、例えば、1〜60塩基長、1〜10塩基長、1〜7塩基長である。ターゲット用配列Cにおいて、ブロック配列BCとステムCを形成する末端領域の長さは、例えば、前記ステムCの長さ、すなわちブロック配列BCの長さと同様である。

0047

前記センサI−1において、ブロック配列BDは、触媒配列Dの部分領域に対して、配列依存的にアニーリングすればよいことから、例えば、触媒配列Dの配列に基づいて、触媒配列Dの任意の部分領域に対して、相補性を示す配列(相補的な配列)として設計できる。触媒配列Dの部分領域に対するブロック配列BDの相補性は、前記部分領域の塩基数に対するブロック配列BDのマッチする塩基数の割合(%)で表した場合、例えば、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、好ましくは100%である。また、ブロック配列BDは、触媒配列Dの部分領域の配列に対するTm値(融解温度)が、例えば、50℃以上、55℃以上、60℃以上である。

0048

ブロック配列BDは、例えば、触媒配列Dの部分領域に対して、パーフェクトマッチする配列に設定してもよいし、1〜3塩基、2塩基、または1塩基がミスマッチする配列に設定してもよい。

0049

触媒配列Dは、前述のように、ブロック配列Bcとターゲット用配列Cとのアニーリングによるロックが解除されると、ブロック配列BDはアニーリングしているものの、触媒機能を生起する構造をとろうとし、この構造変化に伴って、触媒配列Dからブロック配列BDが解離し、前記構造が形成され、触媒機能を生起すると考えられる。このため、ブロック配列BDは、例えば、触媒配列Dに対する結合力が、触媒配列Dが、触媒機能を生起する構造を取ろうとするエネルギーよりも弱くなるような配列に設計すればよい。ブロック配列BDの触媒配列Dに対する結合力は、例えば、ブロック配列BDと触媒配列DとのTm値により表すこともできる。

0050

ブロック配列BDがアニーリングする部分領域は、例えば、触媒配列Dのいずれか一方の末端領域である。図1(A)のように、ブロック配列BDが触媒配列Dの5’側に位置する場合は、例えば、触媒配列Dの3’末端領域にアニーリングするように設計し、図1(B)に示すように、ブロック配列BDが触媒配列Dの3’末端側に位置する場合は、例えば、触媒配列Dの5’末端領域にアニーリングするように設計する。

0051

ブロック配列BDの長さは、特に制限されず、触媒配列Dの長さや配列等に応じて、適宜設定できる。ブロック配列BDの長さは、ブロック配列BDと触媒配列Dとの間でアニーリングにより形成されるステムDの長さである。ブロック配列BDの長さは、例えば、1〜60塩基長、1〜10塩基長、1〜7塩基長である。触媒配列Dにおいて、ブロック配列BDとステムDを形成する末端領域の長さは、例えば、前記ステムDの長さ、すなわちブロック配列BDの長さと同様である。

0052

前記センサI−1の長さは、特に制限されない。前記センサI−1において、ターゲット用配列C、触媒配列D、ブロック配列BCおよびブロック配列BDの長さの合計は、下限が、例えば、25塩基長、35塩基長、40塩基長であり、上限が、例えば、200塩基長、120塩基長、80塩基長である。本発明のセンサの全長は、例えば、下限が、例えば、40塩基長、45塩基長、50塩基長であり、上限が、例えば、120塩基長、100塩基長、80塩基長である。

0053

前記センサI−1は、例えば、ターゲット用配列C、触媒配列D、ブロック配列BCおよびブロック配列BDの他に、末端に付加配列等を含んでもよい。前記付加配列は、例えば、前記センサI−1を担体等に固定化する場合、リンカーとして付加してもよい。

0054

前記センサI−1は、例えば、配列間に、介在配列を含んでもよい。具体的に、前記センサI−1は、例えば、ターゲット用配列Cとブロック配列BDとの間に介在配列IXを有し、触媒配列Dとブロック配列BCのとの間に介在配列IYを有し、前記介在配列IXと前記介在配列IYとは、前記核酸分子内において、互いに、配列依存的にアニーリングしない配列である。

0055

ここで、前記センサI−1の具体例として、図1に示したセンサI−1が、さらに、介在配列を有する形態を、図2に示す。なお、図2は例示であって、本発明のセンサI−1は、これには制限されない。図2は、前記センサI−1の構造の一例であり、前記ターゲット核酸が存在しない状態の構造である。特に示さない限り、図2のセンサI−1は、図1のセンサI−1に関する記載を援用できる。図2において、I1およびI2は、それぞれ介在配列である。

0056

前記センサI−1は、例えば、図2に示すように、ターゲット用配列Cとブロック配列BDとの間に介在配列I1を有し、触媒配列Dとブロック配列BCとの間に介在配列I2を有してもよい。前記介在配列I1と前記介在配列I2とは、例えば、前記核酸分子内において、互いに、配列依存的にアニーリングしない配列であり、前記介在配列I1と前記介在配列I2とは、互いに非相補的な配列である。

0057

図2のセンサI−1は、前述と同様に、前記ターゲット核酸が存在しない状態において、ブロック配列BCとターゲット用配列Cとがアニーリングし、ブロック配列BDと触媒配列Dとがアニーリングするが、前記介在配列I1と前記介在配列I2とは、互いに非相補的な配列であるため、アニーリングせず、分子内部にループ構造を形成する。図2のセンサI−1においても、ターゲット核酸の有無によって、触媒配列Dについて、触媒機能のON−OFFが制御される。このように、前記センサは、前記分子内部にループ構造を形成させることによって、例えば、前記ターゲット核酸の存在下において、よりステム構造が解除されやすくなる。

0058

前記介在配列I1およびI2の長さは、特に制限されない。前記介在配列I1およびI2の長さは、前記内部ループの長さである。前記介在配列I1およびI2の長さは、それぞれ、下限が、例えば、1以上であり、上限が、例えば、30塩基長、15塩基長、6塩基長である。前記介在配列I1とI2の長さは、例えば、同じでも、異なってもよい。後者の場合、長さの差は、特に制限されず、例えば、1〜10塩基、1塩基または2塩基である。また、前記センサI−1は、例えば、前記介在配列I1およびI2のいずれか一方のみを有してもよい。前記センサI−1が、前記介在配列I1およびI2の少なくとも一方、または両方を含む場合、前記センサI−1の全長は、例えば、下限が、例えば、40塩基長、45塩基長、50塩基長であり、上限が、例えば、120塩基長、100塩基長、80塩基長である。

0059

前記ステムの長さが10塩基長以上の場合、例えば、前記介在配列I1および前記介在配列I2の少なくとも一方を含むことにより、前記内部ループを有することが好ましい。前記ステムは、例えば、ブロック配列BCとターゲット用配列CとのステムC、およびブロック配列BDと触媒配列DとのステムDである。ステムCとステムDとの間に、例えば、このような前記内部ループを設定することにより、自由エネルギーが大きくなり、前記センサ全体の構造が不安定になり、ターゲット存在下において、ターゲット用配列C等の構造変化が、より生じやすくなると推定される。

0060

前記センサI−1において、前記核酸分子の各配列は、例えば、直接的な連結でも、間接的な連結でもよい。前記直接的な連結の場合、例えば、各配列がホスホジエステル結合により連結する。前記間接的な連結の場合、例えば、介在配列(リンカーともいう)を介して、各配列が連結する。

0061

図1および図2は、本発明のセンサIとして、前記核酸分子(I)において、ターゲット用配列C、ブロック配列BD、触媒配列D、およびブロック配列BCが、この順序で連結されたセンサI−1の形態を示した。本発明のセンサIは、これには制限されず、前述のように、触媒配列D、ブロック配列BC、ターゲット用配列C、およびブロック配列BDが、この順序で連結された核酸分子(I)を含むセンサI−2でもよい。

0062

この場合、前記センサI−2は、前述したセンサI−1におけるターゲット用配列C、ブロック配列BD、触媒配列D、およびブロック配列BCの位置に、それぞれ、触媒配列D、ブロック配列BC、ターゲット用配列C、およびブロック配列BDが位置する以外は、前記センサI−1と同様である。前記センサI−2において、前記センサI−1の記載を援用できる。

0063

前記センサI−2は、前述したセンサI−1と同様に、例えば、配列間に、介在配列を含んでもよい。ここで、前記センサI−2の具体例として、さらに、介在配列を有する形態を、図3に示す。なお、図3は例示であって、前記センサI−2は、これには制限されない。図3は、前記センサI−2の構造の一例であり、前記ターゲット核酸が存在しない状態の構造である。特に示さない限り、図3のセンサI−2は、図1および図2のセンサI−1に関する記載を援用できる。図3において、I1およびI2は、それぞれ介在配列である。

0064

前記センサI−2は、例えば、図3に示すように、ターゲット用配列Cとブロック配列BDとの間に介在配列I1を有し、触媒配列Dとブロック配列BCとの間に介在配列I2を有してもよい。前記介在配列I1と前記介在配列I2とは、例えば、前記核酸分子内において、互いに、配列依存的にアニーリングしない配列であり、前記介在配列I1と前記介在配列I2とは、互いに非相補的な配列である。

0065

(2)センサII
つぎに、前記二本鎖の核酸分子(II)を含む本発明のセンサIIの具体例について説明する。本発明のセンサIIにおいて、前記核酸分子(II)は、前述のように、前記一本鎖の核酸分子(I)におけるいずれかの前記配列間が非連結でとなった二本鎖の核酸分子である。本発明のセンサは、前記センサIで述べたように、アニーリングとその解除とによって、触媒配列Dの触媒機能のOFFとONとが制御されればよく、前記核酸分子の構造は、前述のような一本鎖には限定されず、例えば、二本鎖であってもよい。前記二本鎖の核酸分子(II)の構造は、例えば、前記一本鎖の核酸分子(I)に基づいて、設定することができる。

0066

前記二本鎖の核酸分子(II)は、第1鎖と第2鎖とを含む。前記一本鎖のセンサI−1に基づく場合、本発明のセンサ(以下、本発明のセンサII−1ともいう)において、前記第1鎖および前記第2鎖は、例えば、(IIa)、(IIb)または(IIc)の組合せがあげられる。

0067

(IIa)
前記第1鎖は、前記核酸配列C、前記ブロック配列BD、および前記核酸配列Dを含み、この順で連結された鎖であり、
前記第2鎖は、前記ブロック配列BCを含む鎖である
(IIb)
前記第1鎖は、前記核酸配列C、および前記ブロック配列BD、を含み、この順序で連結された鎖であり、
前記第2鎖は、前記核酸配列D、および前記ブロック配列BCを含み、この順序で連結された鎖である
(IIc)
前記第1鎖は、前記核酸配列Cを含む鎖であり、
前記第2鎖は、前記ブロック配列BD、前記核酸配列D、および前記ブロック配列BCを含み、この順序で連結された鎖である

0068

前記センサII−1の具体例を、図4に示す。なお、図4は例示であって、本発明のセンサIIは、これには制限されない。図4は、センサII−1の構造の一例であり、前記ターゲット核酸が存在しない状態の構造である。

0069

図4(A)は、前記第1鎖および前記第2鎖が前記組み合わせ(IIa)のセンサII−1の具体例である。前記センサII−1は、例えば、図2(A)に示す一本鎖のセンサI−1において、触媒配列Dとブロック配列BCとの間が未連結となることによって、二本鎖となる形態である。具体的に、前記第1鎖は、ターゲット用配列C、ブロック配列BD、および触媒配列Dを含み、この順で連結された鎖であり、図4(A)においては、さらに、ターゲット用配列Cとブロック配列BDとの間に、介在配列I1が連結されている。前記第1鎖の方向は、特に制限されない。具体例として、図4(A)に示すように、例えば、前記第1鎖は、5’側から、「ターゲット用配列C−介在配列I1−ブロック配列BD−触媒配列D」の順序となってもよいし、3’側から、「ターゲット用配列C−介在配列I1−ブロック配列BD−触媒配列D」の順序となってもよい(図示せず)。前記第2鎖は、ブロック配列BCを含む鎖である。

0070

図4(B)は、前記第1鎖および前記第2鎖が前記組み合わせ(IIb)のセンサII−1の具体例である。前記センサII−1は、例えば、図2(A)に示す一本鎖のセンサI−1において、ブロック配列BDと触媒配列Dとの間が未連結となることによって、二本鎖となる形態である。具体的に、前記第1鎖は、ターゲット用配列C、およびブロック配列BDを含み、この順で連結された鎖であり、図4(B)においては、さらに、ターゲット用配列Cとブロック配列BDとの間に、介在配列I1が連結されている。前記第2鎖は、触媒配列D、およびブロック配列BCを含み、この順で連結された鎖であり、図4(B)においては、さらに、触媒配列Dとブロック配列BDとの間に、介在配列I2が連結されている。前記第1鎖および前記第2鎖の方向は、特に制限されない。具体例として、図4(A)に示すように、前記第1鎖は、5’側から、「ターゲット用配列C−介在配列I1−ブロック配列BD」の順序となり、前記第2鎖は、5’側から、「触媒配列D−ブロック配列BC」の順序となってもよいし、また、反対に、前記第1鎖は、3’側から、「ターゲット用配列C−介在配列I1−ブロック配列BD」の順序となり、前記第2鎖は、3’側から、「触媒配列D−ブロック配列BC」の順序となってもよい(図示せず)。

0071

図4(C)は、前記第1鎖および前記第2鎖が前記組み合わせ(IIc)のセンサII−1の具体例である。前記センサII−1は、例えば、図2(A)に示す一本鎖のセンサI−1において、ターゲット用配列Cとブロック配列BDとの間が未連結となることによって、二本鎖となる形態である。具体的に、前記第1鎖は、ターゲット用配列Cを含む鎖である。前記第2鎖は、ブロック配列BD、触媒配列D、およびブロック配列BCを含み、この順で連結された鎖であり、図4(C)においては、さらに、触媒配列Dとブロック配列BCとの間に、介在配列I2が連結されている。前記第2鎖の方向は、特に制限されない。具体例として、図4(C)に示すように、例えば、前記第2鎖は、5’側から、「ブロック配列BD−触媒配列D−介在配列I2−ブロック配列BC」の順序となってもよいし、3’側から、「ブロック配列BD−触媒配列D−介在配列I2−ブロック配列BC」の順序となってもよい(図示せず)。

0072

図4は、本発明のセンサIIとして、前記核酸分子(II)が分子内でアニーリングした状態において、各配列の順序が、ターゲット用配列C、ブロック配列BD、触媒配列D、およびブロック配列BCの順序となるセンサII−1の形態を示した。本発明のセンサIIは、これには制限されず、前述のように、アニーリングした状態において、各配列の順序が、触媒配列D、ブロック配列BC、ターゲット用配列C、およびブロック配列BDの順序となる核酸分子(II)を含むセンサII−2でもよい。

0073

この場合、前記センサII−2は、前述したセンサII−1におけるターゲット用配列C、ブロック配列BD、触媒配列D、およびブロック配列BCの位置に、それぞれ、触媒配列D、ブロック配列BC、ターゲット用配列C、およびブロック配列BDが位置する以外は、前記センサII−1と同様である。前記センサII−2において、前記センサII−1の記載を援用できる。

0074

前記センサIIは、前記核酸分子が二本鎖であるが、触媒配列Dの触媒機能のON−OFFのメカニズムは、前記センサIと同様である。すなわち、本発明のセンサIIにおいても、ターゲット核酸が存在しない状態において、ブロック配列BDと触媒配列Dの部分領域とがアニーリングすることにより、触媒配列Dは、フリーの状態(例えば、触媒配列D単独の状態)と比較すると、触媒機能を生起する構造を取り難くなり、さらに、ブロック配列BCとターゲット用配列Cとがアニーリングすることにより、触媒配列Dが前記構造をとり難い状態が、ロックされる(触媒配列Dのケージ化ともいう)。このため、前記センサIIは、前記ターゲット核酸が存在しない状態では、触媒配列Dの触媒機能をOFFに制御することができる。

0075

一方、前記ターゲット核酸が存在すると、前記センサIIにおけるターゲット用配列Cに、前記ターゲット核酸が配列依存的にアニーリングすると、これによって、ブロック配列BCとターゲット用配列Cとが解離する(ステムCの解除)。そして、ブロック配列BCとターゲット用配列Cとの解離により、前記ロックが解除される。前記ロックが解除されると、触媒配列Dは、ブロック配列BDがアニーリングしているものの、触媒機能を生起する構造をとろうとする。この構造変化に伴って、触媒配列Dからブロック配列BDが解離し、触媒配列Dは、前記構造を形成して、触媒機能を生起する。このため、前記センサIIは、前記ターゲット核酸が存在する状態では、触媒配列Dの触媒機能をONに制御することができる。なお、本発明は、これらのメカニズムには制限されない。

0076

本発明のセンサIIにおいて、各領域の配列の長さ等は、本発明のセンサIの記載を援用できる。本発明のセンサIIにおいて、前記第1鎖および前記第2鎖の合計長さは、例えば、本発明のセンサIの全長と同様である。

0077

(3)センサIII
つぎに、前記三本鎖の核酸分子(III)を含む本発明のセンサIIIの具体例について説明する。本発明のセンサIIIにおいて、前記核酸分子(III)は、前述のように、前記一本鎖の核酸分子(I)における、触媒配列Dとブロック配列BDとの間が非連結であり、その他のいずれかの前記配列間が非連結となった三本鎖分子である。本発明のセンサは、前記センサIで述べたように、アニーリングとその解除とによって、触媒配列Dの触媒機能のOFFとONとが制御されればよく、前記核酸分子の構造は、前述のような一本鎖には限定されず、例えば、三本鎖であってもよい。前記三本鎖の核酸分子(III)の構造は、例えば、前記一本鎖の核酸分子(I)に基づいて、設定することができる。

0078

前記三本鎖の核酸分子(III)は、第1鎖と第2鎖と第3鎖とを含む。前記一本鎖のセンサI−1に基づく場合、本発明のセンサ(以下、本発明のセンサIII−1ともいう)において、前記第1鎖、前記第2鎖、および前記第3鎖は、例えば、(IIIa)、または(IIIb)の組合せがあげられる。

0079

(IIIa)
前記第1鎖は、前記核酸配列C、および前記ブロック配列BD、を含み、この順序で連結された鎖であり、
前記第2鎖は、前記核酸配列Dを含む鎖であり、
前記第3鎖は、前記ブロック配列BCを含む鎖である
(IIIb)
前記第1鎖は、前記核酸配列Cを含む鎖であり、
前記第2鎖は、前記ブロック配列BDを含む鎖であり、
前記第3鎖は、前記核酸配列D、および前記ブロック配列BCを含み、この順序で連結された鎖である

0080

前記センサIII−1の具体例を、図5に示す。なお、図5は例示であって、本発明のセンサIIIは、これには制限されない。図5は、センサIII−1の構造の一例であり、前記ターゲット核酸が存在しない状態の構造である。

0081

図5(A)は、前記第1鎖、前記第2鎖、および前記第3鎖が前記組み合わせ(IIIa)のセンサIII−1の具体例である。前記センサIII−1は、例えば、図2(A)に示す一本鎖のセンサI−1において、触媒配列Dとブロック配列BCとの間、および、ブロック配列BDと触媒配列Dとの間が未連結となることによって、三本鎖となる形態である。具体的に、前記第1鎖は、ターゲット用配列C、およびブロック配列BDを含み、この順で連結された鎖であり、図5(A)においては、さらに、ターゲット用配列Cとブロック配列BDとの間に、介在配列I1が連結されている。前記第1鎖の方向は、特に制限されない。具体例として、図5(A)に示すように、例えば、前記第1鎖は、5’側から、「ターゲット用配列C−介在配列I1−ブロック配列BD」の順序となってもよいし、3’側から、「ターゲット用配列C−介在配列I1−ブロック配列BD」の順序となってもよい(図示せず)。前記第2鎖は、触媒配列Dを含む鎖であり、前記第3鎖は、ブロック配列BCを含む鎖である。

0082

図5(B)は、前記第1鎖、前記第2鎖、および前記第3鎖が前記組み合わせ(IIIb)のセンサIII−1の具体例である。前記センサIII−1は、例えば、図2(A)に示す一本鎖のセンサI−1において、ブロック配列BDと触媒配列Dとの間、および、ターゲット用配列Cとブロック配列BDとの間が未連結となることによって、三本鎖となる形態である。具体的に、前記第1鎖は、ターゲット用配列Cを含む鎖であり、前記第2鎖は、ブロック配列BDを含む鎖である。前記第3鎖は、触媒配列D、およびブロック配列BCを含み、この順で連結された鎖であり、図5(B)においては、さらに、触媒配列Dとブロック配列BCとの間に、介在配列I2が連結されている。前記第3鎖の方向は、特に制限されない。具体例として、図5(B)に示すように、前記第3鎖は、5’側から、「触媒配列D−介在配列I2−ブロック配列BC」の順序となってもよいし、また、反対に、3’側から、「触媒配列D−介在配列I2−ブロック配列BC」の順序となってもよい(図示せず)。

0083

図5は、本発明のセンサIIIとして、前記核酸分子(III)が分子内でアニーリングした状態において、各配列の順序が、ターゲット用配列C、ブロック配列BD、触媒配列D、およびブロック配列BCの順序となるセンサIII−1の形態を示した。本発明のセンサIIIは、これには制限されず、前述のように、アニーリングした状態において、各配列の順序が、触媒配列D、ブロック配列BC、ターゲット用配列C、およびブロック配列BDの順序となる核酸分子(III)を含むセンサIII−2でもよい。

0084

この場合、前記センサIII−2は、前述したセンサIII−1におけるターゲット用配列C、ブロック配列BD、触媒配列D、およびブロック配列BCの位置に、それぞれ、触媒配列D、ブロック配列BC、ターゲット用配列C、およびブロック配列BDが位置する以外は、前記センサIII−1と同様である。前記センサIII−2において、前記センサIII−1の記載を援用できる。

0085

前記センサIIIは、前記核酸分子が三本鎖であるが、触媒配列Dの触媒機能のON−OFFのメカニズムは、前記センサIと同様である。すなわち、本発明のセンサIIIにおいても、ターゲット核酸が存在しない状態において、ブロック配列BDと触媒配列Dの部分領域とがアニーリングすることにより、触媒配列Dは、フリーの状態(例えば、触媒配列D単独の状態)と比較すると、触媒機能を生起する構造を取り難くなり、さらに、ブロック配列BCとターゲット用配列Cとがアニーリングすることにより、触媒配列Dが前記構造をとり難い状態が、ロックされる(触媒配列Dのケージ化ともいう)。このため、前記センサIIIは、前記ターゲット核酸が存在しない状態では、触媒配列Dの触媒機能をOFFに制御することができる。

0086

一方、前記ターゲット核酸が存在すると、前記センサIIIにおけるターゲット用配列Cに、前記ターゲット核酸が配列依存的にアニーリングすると、これによって、ブロック配列BCとターゲット用配列Cとが解離する(ステムCの解除)。そして、ブロック配列BCとターゲット用配列Cとの解離により、前記ロックが解除される。前記ロックが解除されると、触媒配列Dは、ブロック配列BDがアニーリングしているものの、触媒機能を生起する構造をとろうとする。この構造変化に伴って、触媒配列Dからブロック配列BDが解離し、触媒配列Dは、前記構造を形成して、触媒機能を生起する。このため、前記センサIIIは、前記ターゲット核酸が存在する状態では、触媒配列Dの触媒機能をONに制御することができる。なお、本発明は、これらのメカニズムには制限されない。

0087

本発明のセンサIIIにおいて、各領域の配列の長さ等は、本発明のセンサIの記載を援用できる。本発明のセンサIIIにおいて、前記第1鎖、前記第2鎖、および前記第3鎖の合計長さは、例えば、本発明のセンサIの全長と同様である。

0088

本発明のセンサにおいて、前記核酸分子を構成する構成単位は、特に制限されず、天然でもよいし、非天然であってもよく、本発明のセンサは、例えば、いずれか一方のみで構成されてもよいし、両方を含んで構成されてもよい。前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、ヌクレオチドは、例えば、リボヌクレオチドデオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体である。前記核酸分子は、例えば、例えば、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそれらの誘導体のいずれか一種類のみを含んでもよいし、二種類以上を含んでもよいし、全てを含んでもよい。具体的に、前記核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチドおよび/またはその誘導体を含むDNAでもよいし、リボヌクレオチドおよび/またはその誘導体を含むRNAでもよいし、前者と後者とを含むキメラ(DNA/RNA)でもよい。

0089

前記ヌクレオチドは、塩基として、例えば、天然塩基(非人工塩基)および非天然塩基(人工塩基)のいずれを含んでもよい。前記天然塩基は、例えば、A、C、G、T、Uおよびこれらの修飾塩基があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化フルオロ化アミノ化チオ化等があげられる。前記非天然塩基は、例えば、2’−フルオロピリミジン、2’−O−メチルピリミジン等があげられ、具体例としては、2’−フルオロウラシル、2’−アミノウラシル、2’−O−メチルウラシル2−チオウラシル等があげられる。前記ヌクレオチドは、例えば、修飾されたヌクレオチドでもよく、前記修飾ヌクレオチドは、例えば、2’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基、2’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基、2’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基、2’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基、2’−アミノ化−ウラシルヌクレオチド残基、2’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基、2’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基、2’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基等があげられる。前記核酸分子は、例えば、PNA(ペプチド核酸)、LNA(Locked Nucleic Acid)等の非ヌクレオチドを含んでもよい。

0090

本発明のセンサは、例えば、遊離状態で使用してもよいし、担体等に固定化した状態で使用してもよい。本発明のセンサは、例えば、後述する本発明の口腔細菌の分析方法に使用できる。本発明のセンサを固定化する場合、前記核酸分子における固定化の位置は、特に制限されないが、例えば、前記核酸分子のいずれかの末端において固定化することが好ましい。前記核酸分子が、一本鎖の前記核酸分子(I)の場合、例えば、5’末端でもよいし、3’末端でもよい。前記核酸分子が、前記二本鎖の核酸分子(II)および前記三本鎖の核酸分子の場合、例えば、ターゲット用配列Cを含む鎖を固定化することが好ましく、5’末端で固定化しても、3’末端で固定化してもよい。

0091

分析センサを用いた分析方法>
本発明の分析方法は、口腔細菌の分析方法であり、前記本発明の分析用核酸センサに、口腔由来の試料を接触させる接触工程、および、前記センサにおける前記核酸配列Dの触媒機能を検出することによって、前記試料中の口腔細菌由来のターゲット核酸を検出する検出工程を含むことを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のセンサの使用が特徴であって、その他の工程や条件は、何ら制限されない。

0092

前記口腔由来の試料は、口腔内から採取された検体そのものでもよいし、前記検体を前処理した前処理試料でもよい。前記検体は、例えば、唾液、口腔内からの吐出液(例えば、蒸留水を口に含み軽く洗口した後の吐出液)、歯石歯垢等があげられる。前記前処理試料は、例えば、前記検体に含まれる細菌から、核酸を抽出する前処理を施して、調製することが好ましい。前記前処理の方法は、特に制限されず、例えば、市販の核酸抽出キットを用いて抽出できる。前記市販キットは、例えば、DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN)、RNeasy Protect Saliva Mini Kit (QIAGEN)等が利用できる。前記試料は、取り扱い性から、液体試料が好ましい。

0093

前記接触工程において、前記センサは、例えば、遊離状態で使用してもよいし、固定化状態で使用してもよい。前者の場合、例えば、容器内に前記センサを入れ、前記容器内で前記試料と接触させる。後者の場合、例えば、後述するような担体に前記センサを固定化した状態で、前記センサと前記試料とを接触させる。

0094

触媒配列Dの触媒機能は、例えば、前記触媒機能により生成されるシグナルの検出により、間接的に検出できる。前記シグナルの種類は、特に制限されず、例えば、光学的シグナルまたは電気化学的シグナルがあげられ、前記光学的シグナルは、例えば、発色シグナル発光シグナル蛍光シグナル等があげられる。

0095

前記シグナルは、例えば、触媒配列Dと基質との反応により、生成させることができる。このため、前記検出工程は、例えば、触媒配列Dの触媒機能に対する基質の存在下で行うことが好ましい。前記シグナルの種類は、例えば、使用する基質の種類によって決定できる。

0096

前記基質は、例えば、前記触媒機能によって、発色、発光もしくは蛍光の生成物を生成する基質、発色、発光もしくは蛍光の基質であり且つ前記触媒機能によって発色、発光もしくは蛍光が消失する生成物を生成する基質、また、前記触媒機能によって、異なる発色、発光もしくは蛍光の生成物を生成する基質等があげられる。前記基質によれば、例えば、発色、発光もしくは蛍光の有無、または、発色、発光もしくは蛍光の変化(増加または減少)や強度等をシグナルとして、目視で確認することにより、前記触媒機能を検出できる。また、例えば、吸光度反射率蛍光強度等をシグナルとして、光学的な手法で測定することにより、前記触媒機能を検出することもできる。前記触媒機能は、例えば、前述のような酸化還元反応の触媒機能があげられる。

0097

また、触媒配列Dが、前記酸化還元反応の触媒機能を有する場合、例えば、電子の授受が可能な基質があげられる。この場合、前記触媒機能によって、例えば、前記基質から生成物が生成され、その過程において、電子の授受が生じる。この電子授受は、例えば、電極への印加により、電気シグナルとして、電気化学的に検出できる。前記電気シグナルの検出は、例えば、電流等のような、前記電気シグナルの強度を測定することにより行える。

0098

前記基質は、特に制限されず、例えば、過酸化水素、3,3’,5,5’−Tetramethylbenzidine(TMB)、1,2−Phenylenediamine(OPD)、2,2’−Azinobis(3−ethylbenzothiazoline−6−sulfonic Acid Ammonium Salt(ABTS)、3,3’−Diaminobenzidine (DAB)、3,3’−Diaminobenzidine Tetrahydrochloride Hydrate(DAB4HCl)、3−Amino−9−ethylcarbazole(AEC)、4−Chloro−1−naphthol(4C1N)、2,4,6−Tribromo−3−hydroxybenzoic Acid、2,4−Dichlorophenol、4−Aminoantipyrine、4−Aminoantipyrine Hydrochloride、ルミノール等があげられる。

0099

前記検出工程において、前記基質は、例えば、前記センサに前記試料を接触させる前に、予め、前記センサに供給してもよいし、前記試料の接触と同時または前記試料を接触させた後、前記センサに供給してもよい。前記基質は、例えば、液体に混合した基質液として、前記センサに供給することが好ましい。前記基質を混合する液体は、例えば、Tris−HCl等の緩衝液が好ましい。前記基質液における前記基質の濃度は、特に制限されず、例えば、0.1〜5mmol/L、0.5〜2mmol/Lである。前記基質液のpHは、例えば、6〜9、6.8〜9である。

0100

前記検出工程において、触媒配列Dによる反応条件は、特に制限されず、温度は、例えば、15〜37℃であり、時間は、例えば、10〜900秒である。

0101

前記検出工程において、前記基質の他に、例えば、前述のような理由から、ポルフィリンを共存させてもよい。前記ポルフィリンの供給のタイミング等は、特に制限されず、前記基質と同様に行うことができる。前記ポルフィリンは、例えば、前述と同様である。

0102

本発明の分析方法によれば、このように、口腔細菌由来のターゲット核酸の検出から、間接的に、前記試料に含まれる口腔細菌を検出できる。

0103

<分析デバイス>
本発明の分析デバイスは、前述のように、担体、および分析用核酸センサを含み、前記分析用核酸センサが、本発明のセンサであり、前記担体に、前記分析用核酸センサが配置されていることを特徴とする。

0104

本発明の分析用デバイスは、本発明のセンサを使用することが特徴であって、その他の構成に関しては何ら制限されない。本発明の分析用デバイスは、例えば、本発明のセンサの説明を援用できる。

0105

前記担体は、本発明のセンサを配置できればよく、特に制限されない。前記担体の形状は、例えば、基板(例えば、フィルムシート、板等)、ビーズチューブ等があげられる。

0106

前記担体の材質は、特に制限されず、例えば、樹脂製、ガラス製等があげられる。前記担体は、例えば、表面が絶縁性の基板があげられ、具体例として、絶縁材料からなる担体でもよいし、表面に絶縁材料からなる絶縁層を有する担体でもよい。前記絶縁材料は、特に制限されず、例えば、ガラス、セラミック絶縁性プラスチック、紙等の公知の材料があげられる。前記絶縁性プラスチックは、特に制限されず、例えば、シリコーン樹脂ポリイミド樹脂エポキシ樹脂フッ素樹脂等があげられる。

0107

前記担体への本発明のセンサの配置方法は、特に制限されず、本発明のセンサは、例えば、前記担体に固定化されてもよいし、未固定でもよい。前記担体に前記センサを固定する場合、前記センサは、例えば、前記担体に、直接的に固定化されてもよいし、間接的に固定化されてもよい。後者の場合、例えば、前記リンカーを介して、前記センサを前記担体に固定化した形態があげられる。前記リンカーは、例えば、前記センサの機能に影響を与えない範囲であればよく、配列も長さも、特に制限されず、例えば、1〜200塩基長、1〜20塩基長、3〜12塩基長、5〜9塩基長である。

0108

前記固定化の形式は、特に制限されず、例えば、化学的結合による連結があげられる。前記固定化の方法は、例えば、公知の核酸固定化方法が採用できる。前記方法は、例えば、フォトリソグラフィーを利用する方法があげられ、具体例として、米国特許5,424,186号明細書等を参照できる。また、前記固定化方法としては、例えば、前記担体上で、前記センサを合成する方法があげられる。この方法は、例えば、いわゆるスポット法であり、具体例として、米国特許5,807,522号明細書、特表平10−503841号公報等を参照できる。

0109

本発明の分析用デバイスは、例えば、さらに、触媒配列Dの触媒機能を検出する検出部を含んでもよい。前記触媒配列Dの触媒機能は、前述のように、触媒機能により生成されるシグナルの検出により、間接的に検出でき、前記シグナルは、例えば、光学的シグナルまたは電気化学的シグナルがあげられる。前記シグナルは、例えば、触媒配列Dと基質との反応により生成するシグナルである。本発明の分析デバイスは、例えば、使用時において、前記基質が、外部から供給されてもよいし、予め、前記基質等の試薬を有してもよい。

0110

本発明の分析デバイスは、例えば、試薬部を有してもよい。前記試薬部の位置は、特に制限されず、例えば、前記担体において、前記センサと同様の位置でもよいし、前記検出部と同様の位置でもよい。前記試薬部は、例えば、予め試薬が配置されてもよいし、使用時に試薬が供給されてもよい。前記試薬は、例えば、前記基質、前記ポルフィリン等があげられる。

0111

前記検出部の種類は、例えば、前記シグナルの種類に応じて、適宜設定できる。前記シグナルが光学的シグナルの場合、前記検出部は、例えば、光学的シグナルの検出部であり、具体例として、吸光度、反射率、蛍光強度等の光学的シグナルを検出する検出部が例示できる。

0112

前記シグナルが前記電気化学的シグナルの場合、前記検出部は、例えば、電気化学的シグナルの検出部であり、電極系を含む検出部が例示できる。前記検出部は、例えば、前記担体の表面に、前記電極系を配置することによって形成できる。前記電極系の配置方法は、特に制限されず、例えば、公知の方法が採用でき、具体例は、蒸着法、スパッタリング法スクリーン印刷法メッキ法等の薄膜形成方法があげられる。前記電極は、例えば、前記担体に、直接配置してもよいし、間接的に配置してもよい。間接的な配置は、例えば、他の部材を介した配置があげられる。

0113

前記電極系は、例えば、作用極および対極を含み、さらに、参照極を含んでもよい。前記電極の材料は、特に制限されず、例えば、白金、銀、金、カーボン等があげられる。前記作用極および前記対極は、例えば、白金電極銀電極金電極カーボン電極等があげられ、前記参照極は、例えば、銀/塩化銀の電極があげられる。前記銀/塩化銀の電極は、例えば、銀電極への塩化銀電極の積層により形成できる。

0114

前記検出部が前記電極系を有する場合、前記センサは、例えば、前記電極系に配置すること好ましく、前記電極の中でも前記作用極に配置することが好ましい。本発明の分析用デバイスが、前記電極系と前記試薬部とを有する場合、例えば、前記電極系の上に、前記試薬部を配置することが好ましい。

0115

本発明の分析用デバイスは、例えば、複数の検出部を備えてもよい。この場合、本発明の分析用デバイスは、例えば、前記担体の表面をマトリックス分画し、各分画領域に、前述のような検出部を備えることが好ましい。本発明の分析用デバイスにおいて、1つの検出部に配置する核酸センサの数は、特に制限されない。

0116

本発明の分析用デバイスにおいて、前記担体に配置するセンサの種類は、例えば、1種類でもよいし、2種類以上であってもよい。本発明のセンサは、前述のように、例えば、口腔細菌の遺伝子に対して特異的に結合するように、ターゲットの口腔細菌ごとにターゲット用配列Cを設定でき、口腔フローラの分析に使用することができる。このため、本発明の分析用デバイスは、例えば、同じ担体に、ターゲット核酸が異なる2種類以上の前記センサが配置されたアレイが好ましい。このような分析用デバイスによれば、例えば、一つの分析用デバイスで、複数種類の口腔細菌由来のターゲット核酸を分析できる。このため、本発明の分析用デバイスは、口腔フローラの分析に適している。前記担体に2種類以上の前記センサを配置する場合、例えば、前記各分画領域に、それぞれ異なるセンサを配置することが好ましい。

0117

<分析用デバイスを用いた分析方法>
本発明の分析方法は、口腔細菌の分析方法であり、前記本発明の分析用デバイスを使用し、前記分析用デバイスにおける前記本発明のセンサに、口腔由来の試料を接触させる接触工程、および、前記センサにおける前記核酸配列Dの触媒機能を検出することによって、前記試料中の口腔細菌由来のターゲット核酸を検出する検出工程を含むことを特徴とする。本発明の分析方法は、前記本発明のセンサを有する本発明の分析用デバイスの使用が特徴であって、その他の工程や条件は、何ら制限されない。本発明の分析方法は、前記分析用デバイスを使用する以外は、前記本発明のセンサを用いた分析方法の記載を援用できる。

0118

分析キット
本発明の分析キットは、前記本発明のセンサまたは本発明のデバイスと、試薬とを含むことを特徴とする。本発明の分析キットは、前記センサまたは前記デバイスと前記試薬を含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。

0119

前記試薬は、例えば、前記基質、前記ポルフィリン、前記緩衝液等があげられる。また、さらに、使用説明書を含んでもよい。

0120

(実施例1)
(1)センサの作製
大腸菌O157:H7(enterohemorrhagic Escherichia coli O157:H7)のインチミンをコードする下記RNAを、ターゲットRNA(A)とした。下記配列において、下線部が、ターゲット用配列Cがアニーリングする部分領域である。
ターゲットRNA(A)
5’-GUACUCCAGAACGCUGCUCACUAGAUGUAC -3’(配列番号42)

0121

前記センサにおけるターゲット用配列Cは、前記ターゲットRNAの下線部領域とパーフェクトマッチする下記DNA配列(EcoR01)とした。
5’-ACATCTAGTGAGCAGCGTTCTGGAGT-3’ (配列番号43)

0122

前記センサにおける触媒配列Dは、以下のDNAzymeとした(neco0584)。
neco0584 5’-GGGTGGGAGGGTCGGG-3’ (配列番号8)

0123

そして、これらの配列に基づいて、下記表1に示す前記センサを作製した。ターゲット用配列Cの「*」を付した領域が、ブロック配列BCがアニーリングする部分領域であり、触媒配列Dの「*」を付した領域が、ブロック配列BDがアニーリングする部分領域である。

0124

0125

(2)ターゲット核酸の検出
下記表2の反応液100μLを調製し、95℃、3分で反応を行った。そして、前記反応液について、検出器商品名TECAN Infinite 200 reader、TECAN Japan, Kawasaki, Japan)を用いて、反応開始から経時的に415nmの発光を検出し、相対発光量(RLU)として測定した。前記反応液において、前記基質は、L−012(化合物名8-amino-5-chloro-7-phenylpyrido[3,4-d]pyridazine-1,4-(2H,3H)dione sodium salt)を使用した。

0126

0127

ネガティブコントロールNC)として、前記センサを除いた反応液(w/o sensor)についても、同様に反応を行い、相対発光量(RLU)を測定した。ポジティブコントロール(PC)として、前記センサに代えて、前記センサの触媒配列Dと同じ前記DNAzyme(neco0584)を含む反応液についても、同様に反応を行い、相対発光量(RLU)を測定した。

0128

これらの結果を、図6に示す。図6は、センサとターゲットRNAとの反応による化学発光(RLU)を示すグラフであり、具体的には、(A)および(B)は、化学発光(RLU)の経時変化を示すグラフであり、(C)は、反応開始から5分後の化学発光(RLU)を示すグラフである。図6の各グラフにおいて、縦軸は、化学発光の相対発光量(RLU:Reactive Light Unit)であり、(A)および(B)の横軸は、反応時間を示し、(C)の横軸は、前記ターゲットRNAの濃度を示す。

0129

図6(A)〜(C)に示すように、本発明のセンサによれば、前記ターゲットRNAを発光により検出でき、また、前記ターゲットRNA濃度が10nmol/Lでも検出できた。

0130

(実施例2)
前記実施例1の核酸センサを用いて、ミスマッチを有するターゲットRNAの検出を行った。

0131

前記ターゲットRNAを下記表3に示す。下記表3において、配列中の下線部は、ターゲット用配列Cがアニーリングする部分領域である。(A)の部分領域は、ターゲット用配列Cとパーフェクトマッチする配列、(B)は、ターゲット用配列Cと1塩基ミスマッチする配列、(C)の部分配列は、ターゲット用配列Cと2塩基ミスマッチする配列であり、(D)は、ターゲット用配列Cと4塩基ミスマッチする配列であり、(E)は、ターゲット用配列Cに対して非相補的な配列である。そして、前記ターゲットRNA(A)〜(E)を使用し、前記反応液中の濃度を100nmol/Lとした以外は、前記実施例1と同様にして反応を行い、相対発光量を測定した。また、ネガティブコントロール(NC)は、ターゲットRNA(A)を使用した以外は、前記実施例1と同様に前記センサを除いた反応液を使用した。また、ポジティブコントロール(PC)は、ターゲットRNA(A)を使用した以外は、前記実施例1と同様のDNAzymeを使用した。

0132

0133

これらの結果を、図7に示す。図7は、センサとターゲットRNAとの反応による化学発光(RLU)を示すグラフであり、縦軸は、化学発光の相対発光量(RLU)である。図7に示すように、ターゲットRNA(A)〜(E)に対して、同じセンサを使用した結果、非相補のターゲットRNA(E)とネガティブコントロール(NC)との間に有意差はなく、また、ターゲットRNA(A)〜(D)は、いずれも、非相補のターゲットRNA(E)およびネガティブコントロール(NC)に対して有意差を示した。そして、パーフェクトマッチのターゲットRNA(A)と比較して、ミスマッチのターゲットRNA(B)〜(D)は、ミスマッチの塩基数の増加に伴い、相対発光量が減少した。この結果から、本発明のセンサによれば、パーフェクトマッチのターゲットRNAと、ミスマッチのRNAとを判別でき、さらに、ミスマッチの塩基数を判別できることがわかった。

0134

上記の実施形態の一部または全部は、以下の付記のようにも記載しうるが、以下に限定されない。
(付記1)
核酸分子を含み、
前記核酸分子は、核酸配列Cと、前記核酸配列Cに対するブロック配列BCと、核酸配列Dと、前記核酸配列Dに対するブロック配列BDとを含み、
前記核酸配列Cは、口腔細菌由来のターゲット核酸に対して配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、
前記ブロック配列BCは、前記核酸配列Cの部分領域に対して、配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、
前記核酸配列Dは、触媒機能を生起する核酸配列であり、
前記ブロック配列BDは、前記核酸配列Dの部分領域に対して、配列依存的にアニーリングする核酸配列であり、
前記核酸分子内で、前記核酸配列Cと前記ブロック配列BCとがアニーリングし、且つ、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BDとがアニーリングした状態において、前記各配列の順序が、前記核酸分子の一端から、前記核酸配列C、前記ブロック配列BD、前記核酸配列D、および前記ブロック配列BCの順序、または、前記核酸配列D、前記ブロック配列BC、前記核酸配列C、および前記ブロック配列BDの順序であり、
前記ターゲット核酸の非存在下、前記核酸分子内において、前記核酸配列Cと前記ブロック配列BCとがアニーリングし、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BDとがアニーリングすることによって、前記核酸配列Dの触媒機能がオフとなり、
前記ターゲット核酸の存在下、前記核酸分子内において、前記核酸配列Cに前記ターゲット核酸が結合し、前記核酸配列Cと前記ブロック配列BCとが解離し、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BDとが解離することによって、前記核酸配列Dの触媒機能がオンとなることを特徴とする、口腔細菌の分析用核酸センサ。
(付記2)
前記核酸分子が、一本鎖の核酸分子(I)、二本鎖の核酸分子(II)、または三本鎖の核酸分子(III)である、付記1記載の分析用核酸センサ。
(付記3)
前記核酸分子が、前記一本鎖の核酸分子(I)であり、前記核酸配列C、前記ブロック配列BD、前記核酸配列D、および前記ブロック配列BCの順序で連結されている、または、前記核酸配列D、前記ブロック配列BC、前記核酸配列C、および前記ブロック配列BDの順序で連結されている、付記1または2記載の分析用核酸センサ。
(付記4)
前記(I)の核酸分子において、前記順序は、前記核酸分子における5’側からの順序である、付記3に記載の分析用核酸センサ。
(付記5)
前記(I)の核酸分子が、5’側から、前記核酸配列C、前記ブロック配列BD、前記核酸配列D、および前記ブロック配列BCの順序で連結されている、付記3または4記載の分析用核酸センサ。
(付記6)
前記核酸配列Cと前記ブロック配列BDとの間に介在配列IXを有し、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BCのとの間に介在配列IYを有し、
前記介在配列IXと前記介在配列IYとは、前記核酸分子内において、互いに、配列依存的にアニーリングしない配列である、付記1から5のいずれかに記載の分析用核酸センサ。
(付記7)
前記介在配列IXおよび前記介在配列IYの長さは、それぞれ、1〜30塩基長である、付記6に記載の分析用核酸センサ。
(付記8)
前記核酸分子が、前記二本鎖の核酸分子(II)であり、
前記一本鎖の核酸分子(I)におけるいずれかの前記配列間が非連結である二本鎖分子である、付記1から7のいずれかに記載の分析用核酸センサ。
(付記9)
前記二本鎖の核酸分子(II)は、第1鎖と第2鎖とを含み、
前記第1鎖および前記第2鎖が、(IIa)、(IIb)または(IIc)の組合せである、付記8記載の分析用核酸センサ。
(IIa)
前記第1鎖は、前記核酸配列C、前記ブロック配列BD、および前記核酸配列Dを含み、この順で連結された鎖であり、
前記第2鎖は、前記ブロック配列BCを含む鎖である
(IIb)
前記第1鎖は、前記核酸配列C、および前記ブロック配列BD、を含み、この順序で連結された鎖であり、
前記第2鎖は、前記核酸配列D、および前記ブロック配列BCを含み、この順序で連結された鎖である
(IIc)
前記第1鎖は、前記核酸配列Cを含む鎖であり、
前記第2鎖は、前記ブロック配列BD、前記核酸配列D、および前記ブロック配列BCを含み、この順序で連結された鎖である
(付記10)
前記核酸分子(II)において、前記順序は、それぞれ、前記第1鎖および前記第2鎖における5’側からの順序である、付記9に記載の分析用核酸センサ。
(付記11)
前記第1鎖は、前記核酸配列Cと前記ブロック配列BDとの間に介在配列IXを有し、
前記第2鎖は、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BCのとの間に介在配列IYを有し、
前記介在配列IXと前記介在配列IYとは、前記第1鎖と前記第2鎖との間において、互いに、配列依存的にアニーリングしない配列である、付記9または10に記載の分析用核酸センサ。
(付記12)
前記介在配列IXおよび前記介在配列IYの長さは、それぞれ、1〜30塩基長である、付記11に記載の分析用核酸センサ。
(付記13)
前記核酸分子が、前記三本鎖の核酸分子(III)であり、
前記一本鎖の核酸分子(I)における、前記核酸配列Dと前記ブロック配列BDとの間が非連結であり、その他のいずれかの前記配列間が非連結である三本鎖分子である、付記1から7のいずれかに記載の分析用核酸センサ。
(付記14)
前記二本鎖の核酸分子(II)は、第1鎖、第2鎖、および第3鎖とを含み、
前記第1鎖、前記第2鎖、および前記第3鎖が、(IIIa)または(IIIb)の組合せである、付記13記載の分析用核酸センサ。
(IIIa)
前記第1鎖は、前記核酸配列C、および前記ブロック配列BD、を含み、この順序で連結された鎖であり、
前記第2鎖は、前記核酸配列Dを含む鎖であり、
前記第3鎖は、前記ブロック配列BCを含む鎖である
(IIIb)
前記第1鎖は、前記核酸配列Cを含む鎖であり、
前記第2鎖は、前記ブロック配列BDを含む鎖であり、
前記第3鎖は、前記核酸配列D、および前記ブロック配列BCを含み、この順序で連結された鎖である
(付記15)
前記核酸分子(III)において、前記順序は、それぞれ、前記第1鎖、前記第2鎖、および前記第3鎖における5’側からの順序である、付記14に記載の分析用核酸センサ。
(付記16)
前記核酸分子(III)において、
前記核酸配列Cと前記ブロック配列BDとの間に介在配列IXを有し、または、
前記核酸配列Dと前記ブロック配列BCのとの間に介在配列IYを有する、付記14または15に記載の分析用核酸センサ。
(付記17)
前記介在配列IXおよび前記介在配列IYの長さは、それぞれ、1〜30塩基長である、付記16に記載の分析用核酸センサ。
(付記18)
前記ターゲット核酸が、前記口腔細菌が有する核酸、または、前記核酸を鋳型として増幅させた増幅核酸である、付記1から17のいずれかに記載の分析用核酸センサ。
(付記19)
前記ターゲット核酸が、口腔細菌が有する16SrRNA、または、前記16SrRNAを鋳型として増幅させた増幅核酸である、付記1から18のいずれかに記載の分析用核酸センサ。
(付記20)
前記核酸配列Cは、前記ターゲット核酸の部分領域に対して相補的な配列であり、
前記ブロック配列BCは、前記核酸配列Cの部分領域に対して相補的な配列であり、
前記ブロック配列BDは、前記核酸配列Dの部分領域に対して相補的な配列である、付記1から19のいずれかに記載の分析用核酸センサ。
(付記21)
前記核酸配列Cは、前記ターゲット核酸の部分領域に対する相補性が、90〜100%の配列である、付記1から20のいずれかに記載の分析用核酸センサ。
(付記22)
前記核酸配列Cは、前記ターゲット核酸の部分領域に対して、パーフェクトマッチする配列である、付記1から21のいずれかに記載の分析用核酸センサ。
(付記23)
前記核酸配列Cは、部分領域前記ターゲット核酸の部分領域に対して、1〜3塩基がミスマッチする配列である、付記1から21のいずれかに記載の分析用核酸センサ。
(付記24)
前記核酸分子の長さの合計が、25〜200塩基長である、付記1から23のいずれかに記載の分析用核酸センサ。
(付記25)
前記ブロック配列BCおよび前記ブロック配列BDの長さは、それぞれ、1〜20塩基長である、付記1から24のいずれかに記載の分析用核酸センサ。
(付記26)
前記核酸配列Dの触媒機能が、酸化還元反応の触媒機能である、付記1から25のいずれかに記載の分析用核酸センサ。
(付記27)
前記核酸配列Dが、DNAzymeである、付記1から26のいずれかに記載の分析用核酸センサ。
(付記28)
担体、および分析用核酸センサを含み、
前記分析用核酸センサが、付記1から27のいずれかに記載の分析用核酸センサであり、
前記担体に、前記分析用核酸センサが配置されていることを特徴とする、口腔細菌の分析デバイス。
(付記29)
前記担体に、ターゲット核酸が異なる2種類以上の前記分析用核酸センサが配置されている、付記28記載の分析デバイス。
(付記30)
さらに、検出部を含み、
前記検出部は、前記分析用核酸センサにおける前記核酸配列Dの触媒機能を検出する、付記28または29に記載の分析デバイス。
(付記31)
前記検出部は、電気化学的シグナルを検出する、付記30に記載の分析デバイス。
(付記32)
前記検出部は、光学的シグナルを検出する、付記28から31のいずれかに記載の分析デバイス。
(付記33)
さらに、試薬部を有し、
前記試薬部は、前記核酸配列Dの触媒機能に対する基質を含む、付記28から32のいずれかに記載の分析デバイス。
(付記34)
付記1から27のいずれかに記載の分析用核酸センサに、口腔由来の試料を接触させる接触工程、および、
前記分析用核酸センサにおける前記核酸配列Dの触媒機能を検出することによって、前記試料中の口腔細菌由来のターゲット核酸を検出する検出工程を含むことを特徴とする、口腔細菌の分析方法。
(付記35)
前記核酸配列Dの触媒機能に対する基質の存在下、前記検出工程を行う、付記33に記載の分析方法。
(付記36)
付記1から27のいずれかに記載の分析用核酸センサ、または、付記28から33のいずれかに記載の分析用デバイスと、試薬とを含むことを特徴とする口腔細菌の分析キット。

実施例

0135

以上、実施形態を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。

0136

本発明の核酸センサによれば、簡便且つ特異的に口腔細菌を検出できるため、例えば、目的の口腔細菌ごとのセンサを使用することで、組成比率により表される口腔フローラの簡便な分析も可能となる。

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