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課題

本発明は、多数の化合物ハイスループット多重検出のためのシステム、装置及び方法に関する。

解決手段

本発明は、捕捉アレイと連結して、マイクロウェル固定化された捕捉剤のセットとの間に複数のインターフェースを形成するマイクロウェルアレイを含む。捕捉剤のセットは、複数の識別可能フィーチャを含み、各フィーチャは関心のある特定の化合物の検出に対応している。特定の態様においては、各マイクロウェルは単一細胞を含むように構成されている。したがって、本発明は、分泌された化合物のプロファイルを含む、単一細胞プロファイルのハイスループット解析を実施することができる。

概要

背景

サイトカインケモカイン及び増殖因子を含む分泌タンパク質は、例えば、免疫系(Rothenberg, 2007 Nat.Immunol 8(5):441-4)、腫瘍微小環境(Hanahan and Weinberg, 2011, Cell 144(5):646-74)、又は幹細胞微小環境(Gnecchi et al., 2008,Circ.Res103(1):1204-19)において、様々な細胞挙動及び細胞−細胞パラクリンオートクリンシグナル伝達を媒介する重要な機能的レギュレータを代表する。これらのタンパク質を検出することは、基礎細胞生物学だけでなく、疾患の診断及び治療モニタリングにとっても大きな価値がある。しかし、多機能性と呼ばれる単一細胞由来の複数のエフェクタータンパク質共生産のため、単一細胞レベルで、分泌されたタンパク質の一団、又はセクレトームの特徴を判断することは生物学的に有益である。更に、最近の証拠によれば、遺伝的に同一の細胞集団多種多様表現型相違を生じ得ることが示された(Niepelet al., 2009, Curr Opin Chem Biol 13(5-6):556-561)。更に、細胞性免疫及び効果的な薬物治療の正確なモニタリングに対する潜在的なバリアとして非遺伝的不均一性も浮上してくる(Gascoigne and Taylor, 2008, Cancer Cell 14(2):111-22;Cohen et al., 2008, Science 322(5907):1511-6)。これは、プロテオームの特徴の単一細胞分析のための実用的な手段の必要性を示唆する。

蛍光活性細胞分取(FACS)は、単一細胞の分析のための最新の技術を代表する(Sachs et al., 2005, Science 308(5721):523-9)。通常、FACSは細胞表面マーカーによって細胞表現型を検出し、選別するために使用される。FACSの使用は、小胞輸送を抑制することにより(Prussin, 1997, Clin Immunol 17(3):195-204)、細胞質内のサイトカインを含む、細胞内タンパク質の検出にまで拡張されている(Sachs et al., 2005, Science 308(5721):523-9;Kotecha et al., 2008, Cancer Cell 14(4):335-43;Irish et al., 2004, Cell 118(2):217-28)。しかし、細胞内サイトカイン染色法(ICS)は真の分泌解析ではなく、細胞の固定をも必要とし、これは、フローサイトメトリー分析のあとには細胞がもはや生存しておらず、更なる試験のために細胞を回収できないことを意味する。ICSの更なる欠点は、現在の能力12重化を超える正確な多重化を妨げるスペクトル重複、細胞内染色抗体の非特異的結合の可能性である。今までの単一細胞分泌分析の中心は、免疫サンドイッチベースとする試験法を用いて個々の細胞の分泌フットプリントを検出する標準ELISA検出法を用いるプレートをベースとする細胞培養試験である、ELISpotと呼ばれる簡便なアプローチである(Sachdeva and Asthana, 2007, Front Biosci 12:4682-95)。免疫細胞を、一次抗体の層でプレコートしたマイクロタイタープレートに添加する。インキュベーション後、分泌したタンパク質を細胞の近位にある抗体で捕捉し、単一細胞分泌フットプリントを示すスポットを生じさせる(Stratov et al., 2004, Curr Drug Targets 5(l):71-88)。近年、タンパク質分泌フットプリントを可視化するための2種の蛍光色素を利用するFLUOROSpotと呼ばれるELISpotの変形は、同時の二重機能分析を可能にしたが、この技術は低い多重化能力に限定される。

細胞集団から分泌されたタンパク質の高度の多重化測定は、Illumina VeraCodeシステム(Henshall and Gorfain, 2007, Genet Eng Biotechnol News 27(17):1)等のコード化ビーズ試験法、又はピンスポット法を用いて製造された抗体マイクロアレイ(Chen et al., 2007, Nat Methods4(5):437-44;Liotta et al., 2003, Cancer Cell 3(4):317-25)を用いて実施することができる。しかし、これらの高度の多重化技術では、単一細胞の測定を実施することができない。微細加工チップは、単一細胞分析技術の新しい範疇として現れた(Wang and Bodovitz, 2010, Trends Biotechnol 28(6):281-90
;Cheong et al., 2009, Sci Signal 2(75):pl2;Love et al., 2006, Nat Biotechnol 24(6):703-7;
Lee et al., 2012, Integr Biol(Camb)4(4):381-90;
Rowat et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106(43):18149-54;Lecault et al., 2011, Nat.Methods 8(7):581-6)。プロトタイプマイクロチップにより、多重化タンパク質分泌試験法の可能性が立証され、臨床診断及び治療モニタリングにおける単一細胞分泌プロファイリングの緊急の必要性を指摘する患者からの表現型が類似の免疫細胞におけるかなりの多機能不均一性が明らかになった(Shin et al., 2011, Biophys J 100(10):2378-86;Ma et al., 2011, Nat Med 17(6):738-43)。しかし、これらのマイクロチップは、十分な処理量又は多重性不足し、又は洗練された操作を必要とし、細胞生物学及び細胞機能臨床評価における広範な応用を妨げている。この方法では、単一細胞における高度な多重化タンパク質分析を実施することができない。例えば、これまで、単一細胞レベルでの分泌タンパク質のハイコンテント(>1000細胞)及び高多重化(>35タンパク質)測定を実施するのに有用な技術は存在していない。
したがって、単一細胞からの多数の化合物多重分析のための装置及び方法が当該技術分野において必要である。本発明は、この未だ満たされていない要求を満たす。

概要

本発明は、多数の化合物のハイスループット多重検出のためのシステム、装置及び方法に関する。本発明は、捕捉アレイと連結して、マイクロウェル固定化された捕捉剤のセットとの間に複数のインターフェースを形成するマイクロウェルアレイを含む。捕捉剤のセットは、複数の識別可能フィーチャを含み、各フィーチャは関心のある特定の化合物の検出に対応している。特定の態様においては、各マイクロウェルは単一細胞を含むように構成されている。したがって、本発明は、分泌された化合物のプロファイルを含む、単一細胞プロファイルのハイスループット解析を実施することができる。

目的

一態様においては、懸濁液をマイクロウェルアレイの表面に加えることにより、それぞれが単一細胞を含む複数の個々のマイクロウェルが生成し、それによって複数の単一細胞により分泌される化合物のハイスループット多重検出方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

単一細胞由来の複数の化合物多重検出用装置であって、均一な配置における複数の個々のマイクロウェルを含むマイクロウェルアレイであって、複数の個々のマイクロウェルの少なくとも一部は50μmを超える長さを有し、単離された単一細胞をサブナノリトルの内容に含むように構成されている、前記マイクロウェルアレイ;及び、複数の固定化捕捉剤を含む捕捉剤アレイであって、各固定化補足剤は複数の化合物の1種と特異的に結合する能力を有し、固定化捕捉剤は均一な捕捉剤のセット内に配置され、各捕捉剤のセットは空間的に同定可能な位置で複数の分離フィーチャを有し、各分離フィーチャは少なくとも1種の固定化捕捉剤を含む、前記捕捉剤アレイを含み、マイクロウェルアレイ及び捕捉剤アレイが連結して複数の閉鎖インターフェースを形成し、各閉鎖インターフェースは、各マイクロウェルの内容物が少なくとも1つのセットの分離フィーチャの全てにアクセス可能であり、それによって固定化捕捉剤の全てにアクセス可能であるようにマイクロウェル及び捕捉剤のセットを含む、前記装置。

請求項2

複数の分離フィーチャのそれぞれが、識別可能な空間位置を有する、請求項1に記載の装置。

請求項3

複数の分離フィーチャのそれぞれが、線、形及び点からなる群から選択されるフィーチャである、請求項1に記載の装置。

請求項4

各分離フィーチャの形状が、他の全ての分離フィーチャの形状から識別可能である、請求項3に記載の装置。

請求項5

複数のマイクロウェルの少なくとも一部が、長さ約1〜2mm、及び深さ約5〜50μmの寸法を有する、高いアスペクト比長方形ウェルである、請求項1に記載の装置。

請求項6

複数の化合物が、タンパク質ペプチドペプチド断片細胞表面受容体核酸ホルモン抗原及び増殖因子からなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む、請求項1に記載の装置。

請求項7

複数の化合物が、マイクロウェル内に含まれる単一細胞から分泌される少なくとも1種のタンパク質を含む、請求項1に記載の化合物。

請求項8

複数の捕捉剤が、抗体、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片及び核酸からなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む、請求項1に記載の装置。

請求項9

少なくとも1種の分離フィーチャが、1種以上の固定化捕捉剤を含み、分離フィーチャ内の各固定化捕捉剤が、異なる検出可能な標識を有する関連二次捕捉剤を有する、請求項1に記載の装置。

請求項10

各マイクロウェルが、約10〜2000μmの長さ、約10〜100μmの幅、及び約10〜100μmの深さを有する長方形である、請求項1に記載の装置。

請求項11

各捕捉剤のセットが、約10〜100個の分離フィーチャを含み、各分離フィーチャが、1種の化合物と特異的に結合する少なくとも1種の固定化捕捉剤を含む、請求項1に記載の装置。

請求項12

各分離フィーチャが、約25〜30μmの幅を有する、請求項1に記載の装置。

請求項13

各分離フィーチャが、約50μm以上のピッチサイズに対して、約25μmの距離で同じセットの別の分離フィーチャから分離されている、請求項1に記載の装置。

請求項14

捕捉剤アレイが、10種超の異なる捕捉剤を含み、それによって10種超の異なる化合物の検出が可能である、請求項1に記載の装置。

請求項15

捕捉剤アレイが、40種超の異なる捕捉剤を含み、それによって40種超の異なる化合物の検出が可能である、請求項1に記載の装置。

請求項16

マイクロウェルアレイが、約200マイクロウェル/cm2〜約20,000マイクロウェル/cm2のマイクロウェル密度を有する、請求項1に記載の装置。

請求項17

単一細胞由来の複数の化合物の空間的符号化多重検出方法であって、該方法が以下:均一な配置における複数の個々のマイクロウェルを含むマイクロウェルアレイを供給すること;単一細胞を含むサブナノリットルの体積流体が少なくとも1個のマイクロウェルに流入するように、マイクロウェルアレイの表面に流体を加えること;複数の固定化捕捉剤を含む捕捉剤アレイを供給すること、ここで、各捕捉剤は複数の化合物の1種と特異的に結合可能であり、固定化捕捉剤は捕捉剤のセット内に配置され、各捕捉剤セットは空間的に同定可能な位置で複数の分離フィーチャを有し、各分離フィーチャは少なくとも1種の固定化捕捉剤を含む;マイクロウェルアレイを捕捉剤アレイと接触させ、複数の閉鎖インターフェースを形成すること、ここで、各閉鎖インターフェースは各マイクロウェル内の流体がセットの分離フィーチャの全てにアクセス可能であり、それによって固定化捕捉剤の全てにアクセス可能であるように、マイクロウェル及び捕捉剤のセットを含む;複数の化合物が固定化捕捉剤に結合し、固定化捕捉剤−化合物複合体を形成することを可能にする適切な条件を供給すること;マイクロウェルアレイから捕捉剤アレイを除去すること;捕捉剤アレイを複数の標識化二次捕捉剤と接触させること、ここで、各標識化二次捕捉剤が、形成された固定化捕捉剤−化合物複合体と特異的に結合し、固定化捕捉剤−化合物−標識化二次捕捉剤複合体を形成する;捕捉剤アレイ上の検出可能な標識の存在を検出すること;及び捕捉剤アレイ上の検出可能な標識の存在を、少なくとも1種の化合物の存在と関連づけることを含む、前記方法。

請求項18

複数の分離フィーチャのそれぞれが、線、形及び点からなる群から選択されるフィーチャである、請求項17に記載の方法。

請求項19

各分離フィーチャの形状が、他の全ての分離フィーチャの形状から識別可能である、請求項18に記載の方法。

請求項20

マイクロウェル表面に加えられた流体が細胞を含む、請求項17に記載の方法。

請求項21

流体が、重力のみにより、個々のマイクロウェルに流入する、請求項17に記載の方法。

請求項22

複数の化合物が、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、細胞表面受容体、核酸、ホルモン、抗原及び増殖因子からなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む、請求項17に記載の方法。

請求項23

複数の化合物が、マイクロウェル内に含まれる単一細胞から分泌される少なくとも1種のタンパク質を含む、請求項17に記載の方法。

請求項24

複数の捕捉剤が、抗体、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片及び核酸からなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む、請求項17に記載の方法。

請求項25

少なくとも1種の分離フィーチャが、1種超の固定化捕捉剤を含み、分離フィーチャ内の各固定化捕捉剤が、異なる検出可能な標識を有する関連二次捕捉剤を有する、請求項17に記載の方法。

請求項26

各マイクロウェルが、約10〜2000μmの長さ、約10〜100μmの幅、及び約10〜100μmの深さを有する長方形である、請求項17に記載の方法。

請求項27

各捕捉剤のセットが、約10〜100個の分離フィーチャを含み、各分離フィーチャが、1種の化合物と特異的に結合する少なくとも1種の固定化捕捉剤を含む、請求項17に記載の方法。

請求項28

各分離フィーチャが、約25〜30μmの幅を有する、請求項17に記載の方法。

請求項29

各分離フィーチャが、約25μmの距離で同じセットの別の分離フィーチャから分離されている、請求項17に記載の方法。

請求項30

捕捉剤アレイが、10種超の異なる捕捉剤を含み、それによって10種超の異なる化合物の検出が可能である、請求項17に記載の方法。

請求項31

捕捉剤アレイが、40種超の異なる捕捉剤を含み、それによって40種超の異なる化合物の検出が可能である、請求項17に記載の方法。

請求項32

マイクロウェルアレイが、約200マイクロウェル/cm2〜約20,000マイクロウェル/cm2のマイクロウェル密度を有する、請求項17に記載の方法。

請求項33

マイクロウェルアレイの表面に流体を加えることにより、単一細胞を含む複数の個々のマイクロウェルが形成される、請求項17に記載の方法。

請求項34

捕捉剤アレイ上で検出される検出可能な標識の空間的位置が、複数の化合物の少なくとも1種の正体と、化合物が検出された個々のマイクロウェルと関連づけられる、請求項17に記載の方法。

請求項35

捕捉剤アレイ上で検出される検出可能な標識の形状が、複数の化合物の少なくとも1種の正体と関連づけられる、請求項17に記載の方法。

請求項36

捕捉剤アレイ上で検出される検出可能な標識のスペクトル特性が、複数の化合物の少なくとも1種の正体と関連づけられる、請求項17に記載の方法。

請求項37

捕捉剤アレイ上で検出される検出可能な標識の空間的位置、及び検出される検出可能な標識のスペクトル特性が、複数の化合物の1種の正体と、化合物が検出された個々のマイクロウェルと関連づけられる、請求項17に記載の方法。

請求項38

捕捉剤アレイ上で検出される検出可能な標識の空間的位置、検出される検出可能な標識の形状、及び検出される検出可能な標識のスペクトル特性が、複数の化合物の1種の正体と、化合物が検出された個々のマイクロウェルと関連づけられる、請求項17に記載の方法。

請求項39

試料内の複数の単一細胞の表現型を、単一細胞により分泌される5種以上の化合物を検出することによって試験する、請求項17に記載の方法。

請求項40

懸濁液をマイクロウェルアレイの表面に加えることにより、それぞれが単一細胞を含む複数の個々のマイクロウェルが生成し、それによって複数の単一細胞により分泌される化合物のハイスループット多重検出方法を提供する、請求項39に記載の方法。

請求項41

個々のマイクロウェル中に検出される化合物の組み合わせが、マイクロウェル中に含まれる単一細胞の表現型を示す、請求項40に記載の方法。

請求項42

細胞の表現型が、がん細胞として細胞を定義する、請求項40に記載の方法。

請求項43

細胞の表現型が、転移性のがん細胞として細胞を定義する、請求項40に記載の方法。

請求項44

細胞の表現型が、がん細胞の進行性を定義する、請求項40に記載の方法。

請求項45

複数の単一細胞が、免疫細胞集団を含み、方法が免疫細胞の不均一性を試験する、請求項40に記載の方法。

請求項46

1種以上の単一細胞の表現型が、疾患の進行を示し、又は個々の疾患の段階を明らかにする、請求項40に記載の方法。

請求項47

単一細胞由来の複数の化合物の空間的及びスペクトル的符号化多重検出方法であって、該方法が以下:均一な配置における複数の個々のマイクロウェルを含むマイクロウェルアレイを供給すること;単一細胞を含むサブナノリットルの体積の流体が少なくとも1個のマイクロウェルに流入するように、マイクロウェルアレイの表面に流体を加えること;複数の固定化捕捉剤を含む捕捉剤アレイを供給すること、ここで、各捕捉剤は複数の化合物の1種と特異的に結合可能であり、固定化捕捉剤は捕捉剤のセット内に配置され、各捕捉剤セットは空間的に同定可能な位置で複数の分離フィーチャを有し、各分離フィーチャは1種超の固定化捕捉剤を含む;マイクロウェルアレイを捕捉剤アレイと接触させ、複数の閉鎖インターフェースを形成すること、ここで、各閉鎖インターフェースは各マイクロウェル内の流体がセットの分離フィーチャの全てにアクセス可能であり、それによって固定化捕捉剤の全てにアクセス可能であるように、マイクロウェル及び捕捉剤のセットを含む;複数の成分が固定化捕捉剤に結合し、固定化捕捉剤−化合物複合体を形成することを可能にする適切な条件を供給すること;マイクロウェルアレイから捕捉剤アレイを除去すること;捕捉剤アレイを複数の標識化二次捕捉剤と接触させること、ここで、各二次捕捉剤が複数の検出可能な標識の1種で標識され、各二次捕捉剤が、分離フィーチャで固定化捕捉剤−化合物複合体と結合して固定化捕捉剤−化合物−二次捕捉剤複合体を形成し、分離フィーチャの固定化捕捉剤−化合物−二次捕捉剤複合体が、それぞれスペクトル的に異なる標識を有するように構成されている;捕捉剤アレイ上で複数の検出可能な標識の存在を検出すること;捕捉剤アレイ上で検出される各検出可能な標識の空間的位置及びスペクトル特性を、少なくとも1種の化合物と存在と関連づけることを含む、前記方法。

請求項48

複数の分離フィーチャのそれぞれが、線、形、及び点からなる群から選択されるフィーチャである、請求項47に記載の方法。

請求項49

各分離フィーチャの形状が、他の全ての分離フィーチャの形状から識別可能である、請求項48に記載の方法。

請求項50

マイクロウェルの表面に加えられる流体が細胞を含む、請求項47に記載の方法。

請求項51

流体が、重力のみにより、個々のマイクロウェルに流入する、請求項47に記載の方法。

請求項52

複数の化合物が、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、細胞表面受容体、核酸、ホルモン、抗原及び増殖因子からなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む、請求項47に記載の方法。

請求項53

複数の化合物が、マイクロウェル内に含まれる単一細胞から分泌される少なくとも1種のタンパク質を含む、請求項47に記載の方法。

請求項54

複数の捕捉剤が、抗体、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片及び核酸からなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む、請求項47に記載の方法。

請求項55

各マイクロウェルが、約10〜2000μmの長さ、約10〜100μmの幅、及び約10〜100μmの深さを有する長方形である、請求項47に記載の方法。

請求項56

各捕捉剤のセットが、約10〜100個の分離フィーチャを含み、各分離フィーチャが、1種の化合物と特異的に結合する少なくとも1種の固定化捕捉剤を含む、請求項47に記載の方法。

請求項57

各分離フィーチャが、約25〜30μmの幅を有する、請求項47に記載の方法。

請求項58

各分離フィーチャが、約25μmの距離で同じセットの別の分離フィーチャから分離されている、請求項47に記載の方法。

請求項59

捕捉剤アレイが、10種超の異なる捕捉剤を含み、それによって10種超の異なる化合物の検出が可能である、請求項47に記載の方法。

請求項60

捕捉剤アレイが、40種超の異なる捕捉剤を含み、それによって40種超の異なる化合物の検出が可能である、請求項47に記載の方法。

請求項61

マイクロウェルアレイが、約200マイクロウェル/cm2〜約20,000マイクロウェル/cm2のマイクロウェル密度を有する、請求項47に記載の方法。

請求項62

マイクロウェルアレイの表面への流体を加えることにより、単一細胞を含む複数の個々のマイクロウェルが形成される、請求項47に記載の方法。

請求項63

捕捉剤アレイ上の検出可能な標識の空間的位置、及び検出可能な標識のスペクトル特性が、複数の化合物の1種の正体と、化合物が検出された個々のマイクロウェルと関連づけられる、請求項47に記載の方法。

請求項64

捕捉剤アレイ上の検出可能な標識の空間的位置、検出可能な標識の形状、及び検出可能な標識の型が、複数の化合物の1種の正体と、化合物が検出された個々のマイクロウェルと関連づけられる、請求項47に記載の方法。

請求項65

試料内の複数の単一細胞の表現型を、単一細胞により分泌される5種以上の化合物を検出することによって試験する、請求項47に記載の方法。

請求項66

懸濁液をマイクロウェルアレイの表面に加えることにより、それぞれが単一細胞を含む複数の個々のマイクロウェルが生成され、それによって複数の単一細胞により分泌される化合物のハイスループット多重検出方法を提供する、請求項47に記載の方法。

請求項67

個々のマイクロウェル中に検出される化合物の組み合わせが、マイクロウェル中に含まれる単一細胞の表現型を示す、請求項66に記載の方法。

請求項68

細胞の表現型が、がん細胞として細胞を定義する、請求項66に記載の方法。

請求項69

細胞の表現型が、転移性のがん細胞として細胞を定義する、請求項66に記載の方法。

請求項70

細胞の表現型が、がん細胞の進行性を定義する、請求項66に記載の方法。

請求項71

複数の単一細胞が、免疫細胞の集団を含み、方法が免疫細胞の不均一性を試験する、請求項66に記載の方法。

請求項72

1種以上の単一細胞の表現型が、疾患の進行を示し、又は個々の疾患の段階を明らかにする、請求項66に記載の方法。

請求項73

単一細胞由来の複数の化合物の多重検出用システムであって、均一な配置で複数の個々のマイクロウェルを含み、複数の個々のマイクロウェルの少なくとも一部が、サブナノリットルの内容に単一細胞を含むように構成されている、マイクロウェルアレイと、複数の固定化捕捉剤を含む捕捉剤アレイであって、各固定化補足剤は複数の化合物の1種と特異的に結合する能力を有し、固定化捕捉剤は均一な捕捉剤のセット内に配置され、各捕捉剤のセットは空間的に同定可能な位置で複数の分離フィーチャを有し、各分離フィーチャは少なくとも1種の固定化捕捉剤を含む、前記捕捉剤アレイとを含む装置、ここで、マイクロウェルアレイ及び捕捉剤アレイが、連結して複数の閉鎖インターフェースを形成し、各閉鎖インターフェースは、各マイクロウェルの内容物が少なくとも1つのセットの分離フィーチャの全てにアクセス可能であり、それによって固定化捕捉剤の全てにアクセス可能であるようにマイクロウェル及び捕捉剤のセットを含む;並びに、複数の二次捕捉剤、ここで各二次捕捉剤は検出可能な標識を含み、複数の化合物の1つの化合物が複数の固定化捕捉剤の1つの固定化捕捉剤と結合することにより、分離フィーチャで形成した固定化捕捉剤−化合物複合体と結合するように構成されている、を含む、前記システム。

請求項74

複数の分離フィーチャのそれぞれが、識別可能な空間的位置を有する、請求項73に記載のシステム。

請求項75

複数の分離フィーチャのそれぞれが、線、形及び点からなる群から選択されるフィーチャである、請求項73に記載のシステム。

請求項76

各分離フィーチャの形状が、他の全ての分離フィーチャの形状から識別可能である、請求項75に記載のシステム。

請求項77

複数のマイクロウェルの少なくとも一部が、長さ約1〜2mm、及び深さ約5〜50μmの寸法を有する高いアスペクト比の長方形のウェルである、請求項73に記載のシステム。

請求項78

複数の化合物が、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、細胞表面受容体、核酸、ホルモン、抗原及び増殖因子からなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む、請求項73に記載のシステム。

請求項79

複数の化合物が、マイクロウェル内に含まれる単一細胞から分泌される少なくとも1種のタンパク質を含む、請求項73に記載のシステム。

請求項80

複数の捕捉剤が、抗体、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片及び核酸からなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む、請求項73に記載のシステム。

請求項81

少なくとも1種の分離フィーチャが、1種以上の固定化捕捉剤を含み、分離フィーチャ内の各固定化捕捉剤が、異なる検出可能な標識を有する関連二次捕捉剤を有する、請求項73に記載のシステム。

請求項82

各マイクロウェルが、約10〜2000μmの長さ、約10〜100μmの幅、及び約10〜100μmの深さを有する長方形である、請求項73に記載のシステム。

請求項83

各捕捉剤のセットが、約10〜100個の分離フィーチャを含み、各分離フィーチャが、1種の化合物と特異的に結合する少なくとも1種の固定化捕捉剤を含む、請求項73に記載のシステム。

請求項84

各分離フィーチャが、約25〜30μmの幅を有する、請求項73に記載のシステム。

請求項85

各分離フィーチャが、約25μmの距離で同じセットの別の分離フィーチャから分離されている、請求項73に記載のシステム。

請求項86

捕捉剤アレイが、10種超の異なる捕捉剤を含み、それによって10種超の異なる化合物の検出が可能である、請求項73に記載のシステム。

請求項87

捕捉剤アレイが、40種超の異なる捕捉剤を含み、それによって40種超の異なる化合物の検出が可能である、請求項73に記載のシステム。

請求項88

マイクロウェルアレイが、約200マイクロウェル/cm2〜約20,000マイクロウェル/cm2のマイクロウェル密度を有する、請求項73に記載のシステム。

請求項89

検出可能な標識が、蛍光標識放射性標識強磁性標識、常磁性標識、発光標識電気化学発光標識リン光標識及び呈色標識からなる群から選択される、請求項73に記載のシステム。

請求項90

複数の二次捕捉剤のそれぞれが、同じ検出可能な標識を含む、請求項73に記載のシステム。

請求項91

各二次捕捉剤が、複数の検出可能な標識の1種で標識され、各二次捕捉剤が、分離フィーチャで固定化捕捉剤−化合物複合体と結合して固定化捕捉剤−化合物−二次捕捉剤複合体を形成し、分離フィーチャの固定化捕捉剤−化合物−二次捕捉剤複合体が、それぞれスペクトル的に異なる標識を有するように構成されている、請求項73に記載のシステム。

技術分野

0001

関連出願に対する相互参照
本出願は、2012年8月24日に出願された米国仮特許出願第61/692,895号、及び2013年3月13日に出願された米国仮特許出願第61/779,299号に対する米国特許法第119条(e)による優先権に対する権利を有し、これらは全て、参照として全体が本明細書に組み込まれる。

0002

連邦支援型研究又は開発に関する記載
本発明は、国立衛生研究所(NIH)により与えられた、NIH UO1 CA164252、NIH 4R00 CA136759、NIH U54CA143868、NIH RO1GM084201、及びNIH U54 CA143798による政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

背景技術

0003

サイトカインケモカイン及び増殖因子を含む分泌タンパク質は、例えば、免疫系(Rothenberg, 2007 Nat.Immunol 8(5):441-4)、腫瘍微小環境(Hanahan and Weinberg, 2011, Cell 144(5):646-74)、又は幹細胞微小環境(Gnecchi et al., 2008,Circ.Res103(1):1204-19)において、様々な細胞挙動及び細胞−細胞パラクリンオートクリンシグナル伝達を媒介する重要な機能的レギュレータを代表する。これらのタンパク質を検出することは、基礎細胞生物学だけでなく、疾患の診断及び治療モニタリングにとっても大きな価値がある。しかし、多機能性と呼ばれる単一細胞由来の複数のエフェクタータンパク質共生産のため、単一細胞レベルで、分泌されたタンパク質の一団、又はセクレトームの特徴を判断することは生物学的に有益である。更に、最近の証拠によれば、遺伝的に同一の細胞集団多種多様表現型相違を生じ得ることが示された(Niepelet al., 2009, Curr Opin Chem Biol 13(5-6):556-561)。更に、細胞性免疫及び効果的な薬物治療の正確なモニタリングに対する潜在的なバリアとして非遺伝的不均一性も浮上してくる(Gascoigne and Taylor, 2008, Cancer Cell 14(2):111-22;Cohen et al., 2008, Science 322(5907):1511-6)。これは、プロテオームの特徴の単一細胞分析のための実用的な手段の必要性を示唆する。

0004

蛍光活性細胞分取(FACS)は、単一細胞の分析のための最新の技術を代表する(Sachs et al., 2005, Science 308(5721):523-9)。通常、FACSは細胞表面マーカーによって細胞表現型を検出し、選別するために使用される。FACSの使用は、小胞輸送を抑制することにより(Prussin, 1997, Clin Immunol 17(3):195-204)、細胞質内のサイトカインを含む、細胞内タンパク質の検出にまで拡張されている(Sachs et al., 2005, Science 308(5721):523-9;Kotecha et al., 2008, Cancer Cell 14(4):335-43;Irish et al., 2004, Cell 118(2):217-28)。しかし、細胞内サイトカイン染色法(ICS)は真の分泌解析ではなく、細胞の固定をも必要とし、これは、フローサイトメトリー分析のあとには細胞がもはや生存しておらず、更なる試験のために細胞を回収できないことを意味する。ICSの更なる欠点は、現在の能力12重化を超える正確な多重化を妨げるスペクトル重複、細胞内染色抗体の非特異的結合の可能性である。今までの単一細胞分泌分析の中心は、免疫サンドイッチベースとする試験法を用いて個々の細胞の分泌フットプリントを検出する標準ELISA検出法を用いるプレートをベースとする細胞培養試験である、ELISpotと呼ばれる簡便なアプローチである(Sachdeva and Asthana, 2007, Front Biosci 12:4682-95)。免疫細胞を、一次抗体の層でプレコートしたマイクロタイタープレートに添加する。インキュベーション後、分泌したタンパク質を細胞の近位にある抗体で捕捉し、単一細胞分泌フットプリントを示すスポットを生じさせる(Stratov et al., 2004, Curr Drug Targets 5(l):71-88)。近年、タンパク質分泌フットプリントを可視化するための2種の蛍光色素を利用するFLUOROSpotと呼ばれるELISpotの変形は、同時の二重機能分析を可能にしたが、この技術は低い多重化能力に限定される。

0005

細胞集団から分泌されたタンパク質の高度の多重化測定は、Illumina VeraCodeシステム(Henshall and Gorfain, 2007, Genet Eng Biotechnol News 27(17):1)等のコード化ビーズ試験法、又はピンスポット法を用いて製造された抗体マイクロアレイ(Chen et al., 2007, Nat Methods4(5):437-44;Liotta et al., 2003, Cancer Cell 3(4):317-25)を用いて実施することができる。しかし、これらの高度の多重化技術では、単一細胞の測定を実施することができない。微細加工チップは、単一細胞分析技術の新しい範疇として現れた(Wang and Bodovitz, 2010, Trends Biotechnol 28(6):281-90
;Cheong et al., 2009, Sci Signal 2(75):pl2;Love et al., 2006, Nat Biotechnol 24(6):703-7;
Lee et al., 2012, Integr Biol(Camb)4(4):381-90;
Rowat et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106(43):18149-54;Lecault et al., 2011, Nat.Methods 8(7):581-6)。プロトタイプマイクロチップにより、多重化タンパク質分泌試験法の可能性が立証され、臨床診断及び治療モニタリングにおける単一細胞分泌プロファイリングの緊急の必要性を指摘する患者からの表現型が類似の免疫細胞におけるかなりの多機能不均一性が明らかになった(Shin et al., 2011, Biophys J 100(10):2378-86;Ma et al., 2011, Nat Med 17(6):738-43)。しかし、これらのマイクロチップは、十分な処理量又は多重性不足し、又は洗練された操作を必要とし、細胞生物学及び細胞機能臨床評価における広範な応用を妨げている。この方法では、単一細胞における高度な多重化タンパク質分析を実施することができない。例えば、これまで、単一細胞レベルでの分泌タンパク質のハイコンテント(>1000細胞)及び高多重化(>35タンパク質)測定を実施するのに有用な技術は存在していない。
したがって、単一細胞からの多数の化合物多重分析のための装置及び方法が当該技術分野において必要である。本発明は、この未だ満たされていない要求を満たす。

課題を解決するための手段

0006

本発明は、マイクロウェルアレイ及び捕捉剤アレイを含む、単一細胞由来の複数の化合物の多重検出用装置を含む。マイクロウェルアレイは、均一な配置で複数の個々のマイクロウェルを含み、複数の個々のマイクロウェルの少なくとも一部は50μmを超える長さを有し、単離された単一細胞をサブナノリトルの内容に含むように構成されている。捕捉剤アレイは、複数の固定化捕捉剤を含み、各固定化補足剤は複数の化合物の1種と特異的に結合する能力を有する。固定化捕捉剤は均一な捕捉剤のセット内に配置され、各捕捉剤のセットは空間的に同定可能な位置で複数の分離フィーチャを有し、各分離フィーチャは少なくとも1種の固定化捕捉剤を含む。マイクロウェルアレイ及び捕捉剤アレイは連結して複数の閉鎖インターフェースを形成し、各閉鎖インターフェースは、各マイクロウェルの内容物が少なくとも1つのセットの分離フィーチャの全てにアクセス可能であり、それによって固定化捕捉剤の全てにアクセス可能であるようにマイクロウェル及び捕捉剤のセットを含む。

0007

一態様においては、複数の分離フィーチャのそれぞれは識別可能空間的位置を有する。一態様においては、複数の分離フィーチャのそれぞれは、線、形及び点からなる群から選択されるフィーチャである。例えば、一態様においては、各分離フィーチャの形状は、他の全ての分離フィーチャの形状から識別可能である。

0008

一態様においては、複数のマイクロウェルの少なくとも一部は、長さ約1〜2mm、及び深さ約5〜50μmの寸法を有する高いアスペクト比長方形ウェルである。

0009

一態様においては、複数の化合物が、タンパク質、ペプチドペプチド断片細胞表面受容体核酸ホルモン抗原及び増殖因子からなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む。一態様においては、複数の化合物は、マイクロウェル内に含まれる単一細胞から分泌される少なくとも1種のタンパク質を含む。

0010

一態様においては、複数の捕捉剤は、抗体、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片及び核酸からなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む。

0011

一態様においては、少なくとも1種の分離フィーチャは1種以上の固定化捕捉剤を含み、分離フィーチャ内の各固定化捕捉剤は、異なる検出可能な標識を有する関連二次捕捉剤を有する。

0012

一態様においては、各マイクロウェルが、約10〜2000μmの長さ、約10〜100μmの幅、及び約10〜100μmの深さを有する長方形である。

0013

一態様においては、各捕捉剤のセットは約10〜100個の分離フィーチャを含み、各分離フィーチャは、1種の化合物と特異的に結合する少なくとも1種の固定化捕捉剤を含む。

0014

一態様においては、各分離フィーチャは約25〜30μmの幅を有する。一態様においては、各分離フィーチャは、約50μm以上のピッチサイズに対して、約25μmの距離で同じセットの別の分離フィーチャから分離されている。

0015

一態様においては、捕捉剤アレイは、10種超の異なる捕捉剤を含み、それによって10種超の異なる化合物の検出が可能である。一態様においては、捕捉剤アレイは、40種超の異なる捕捉剤を含み、それによって40種超の異なる化合物の検出が可能である。

0016

一態様においては、マイクロウェルアレイは、約200マイクロウェル/cm2〜約20,000マイクロウェル/cm2のマイクロウェル密度を有する。

0017

また、本発明は以下を含む、単一細胞由来の複数の化合物の空間的符号化多重検出方法を含む。均一な配置における複数の個々のマイクロウェルを含むマイクロウェルアレイを供給すること;単一細胞を含むサブナノリットルの体積流体が少なくとも1個のマイクロウェルに流入するように、マイクロウェルアレイの表面に流体を加えること;複数の固定化捕捉剤を含む捕捉剤アレイを供給することであって、各捕捉剤は複数の化合物の1種と特異的に結合可能であり、固定化捕捉剤は捕捉剤のセット内に配置され、各捕捉剤セットは空間的に同定可能な位置で複数の分離フィーチャを有し、各分離フィーチャは少なくとも1種の固定化捕捉剤を含む;及びマイクロウェルを捕捉剤アレイと接触させ、複数の閉鎖インターフェースを形成することであって、各閉鎖インターフェースは各マイクロウェル内の流体がセットの分離フィーチャの全てにアクセス可能であり、それによって固定化捕捉剤の全てにアクセス可能であるように、マイクロウェル及び捕捉剤のセットを含む。該方法は、更に複数の化合物が固定化捕捉剤に結合し、固定化捕捉剤−化合物複合体を形成することを可能にする適切な条件を供給すること;マイクロウェルアレイから捕捉剤アレイを除去すること;捕捉剤アレイを複数の標識化二次捕捉剤と接触させることであって、各標識化二次捕捉剤が、生成された固定化捕捉剤−化合物複合体と特異的に結合し、固定化捕捉剤−化合物−標識化二次捕捉剤複合体を形成すること;捕捉剤アレイ上の検出可能な標識の存在を検出すること;及び捕捉剤アレイ上の検出可能な標識の存在を、少なくとも1種の化合物の存在と関連づけることを含む。

0018

一態様においては、複数の分離フィーチャのそれぞれは、線、形及び点からなる群から選択されるフィーチャである。例えば、一態様においては、各分離フィーチャの形状は他の全ての分離フィーチャの形状から識別可能である。

0019

一態様においては、マイクロウェル表面に加えられた流体は細胞を含む。一態様においては、流体は、重力のみにより、個々のマイクロウェルに流入する。

0020

一態様においては、複数の化合物は、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、細胞表面受容体、核酸、ホルモン、抗原及び増殖因子からなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む。一態様においては、複数の化合物は、マイクロウェル内に含まれる単一細胞から分泌される少なくとも1種のタンパク質を含む。

0021

一態様においては、複数の捕捉剤は、抗体、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片及び核酸からなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む。

0022

一態様においては、少なくとも1種の分離フィーチャが1種超の固定化捕捉剤を含み、分離フィーチャ内の各固定化捕捉剤が、異なる検出可能な標識を有する関連二次捕捉剤を有する。

0023

一態様においては、各マイクロウェルは、約10〜2000μmの長さ、約10〜100μmの幅、及び約10〜100μmの深さを有する長方形である。

0024

一態様においては、各捕捉剤のセットは約10〜100個の分離フィーチャを含み、各分離フィーチャは、1種の化合物と特異的に結合する少なくとも1種の固定化捕捉剤を含む。

0025

一態様においては、各分離フィーチャは約25〜30μmの幅を有する。一態様においては、各分離フィーチャは、約25μmの距離で同じセットの別の分離フィーチャから分離されている。

0026

一態様においては、捕捉剤アレイは、10種超の異なる捕捉剤を含み、それによって10種超の異なる化合物の検出が可能である。一態様においては、捕捉剤アレイは、40種超の異なる捕捉剤を含み、それによって40種超の異なる化合物の検出が可能である。

0027

一態様においては、マイクロウェルアレイは、約200マイクロウェル/cm2〜約20,000マイクロウェル/cm2のマイクロウェル密度を有する。

0028

一態様においては、マイクロウェルアレイの表面に流体を加えることにより、単一細胞を含む、複数の個々のマイクロウェルが生成する。

0029

一態様においては、捕捉剤アレイ上で検出される検出可能な標識の空間的位置は、複数の化合物の少なくとも1種の正体(identity)と、化合物が検出された個々のマイクロウェルと関連づけられる。一態様においては、捕捉剤アレイ上で検出される検出可能な標識の形状が、複数の化合物の少なくとも1種の正体と関連づけられる。一態様においては、捕捉剤アレイ上で検出される検出可能な標識のスペクトル特性が、複数の化合物の少なくとも1種の正体と関連づけられる。一態様においては、捕捉剤アレイ上で検出される検出可能な標識の空間的位置、及び検出される検出可能な標識のスペクトル特性は、複数の化合物の1種の正体と、化合物が検出された個々のマイクロウェルと関連づけられる。一態様においては、捕捉剤アレイ上で検出される検出可能な標識の空間的位置、検出される検出可能な標識の形状、及び検出される検出可能な標識のスペクトル特性は、複数の化合物の1種の正体と、化合物が検出された個々のマイクロウェルと関連づけられる。

0030

一態様においては、方法は、試料内の複数の単一細胞の表現型を、単一細胞により分泌される5種以上の化合物を検出することによって試験する。

0031

一態様においては、懸濁液をマイクロウェルアレイの表面に加えることにより、それぞれが単一細胞を含む複数の個々のマイクロウェルが生成し、それによって複数の単一細胞により分泌される化合物のハイスループット多重検出方法を提供する。

0032

一態様においては、個々のマイクロウェル中に検出される化合物の組み合わせは、マイクロウェル中に含まれる単一細胞の表現型を示す。一態様においては、細胞の表現型が、がん細胞として細胞を定義する。一態様においては、細胞の表現型が、転移性のがん細胞として細胞を定義する。

0033

一態様においては、細胞の表現型が、がん細胞の進行性を定義する。一態様においては、複数の単一細胞は免疫細胞の集団を含み、該方法は免疫細胞の不均一性を試験する。一態様においては、1種以上の単一細胞の表現型は、疾患の進行を示し、又は個々の疾患の段階を明らかにする。

0034

また、本発明は、以下を含む、単一細胞由来の複数の化合物の空間的及びスペクトル的符号化多重検出方法を含む。均一な配置における複数の個々のマイクロウェルを含むマイクロウェルアレイを供給すること;単一細胞を含むサブナノリットルの体積の流体が少なくとも1個のマイクロウェルに流入するように、マイクロウェルアレイの表面に流体を加えること;複数の固定化捕捉剤を含む捕捉剤アレイを供給することであって、各捕捉剤は複数の化合物の1種と特異的に結合可能であり、固定化捕捉剤は捕捉剤のセット内に配置され、各捕捉剤セットは空間的に同定可能な位置で複数の分離フィーチャを有し、各分離フィーチャは1種超の固定化捕捉剤を含む;及びマイクロウェルアレイを捕捉剤アレイと接触させ、複数の閉鎖インターフェースを形成することであって、各閉鎖インターフェースは各マイクロウェル内の流体がセットの分離フィーチャの全てにアクセス可能であり、それによって固定化捕捉剤の全てにアクセス可能であるように、マイクロウェル及び捕捉剤のセットを含む。方法は、更に、複数の化合物が固定化捕捉剤に結合し、固定化捕捉剤−化合物複合体を形成することを可能にする適切な条件を供給すること;マイクロウェルアレイから捕捉剤アレイを除去すること;捕捉剤アレイを複数の標識化二次捕捉剤と接触させることであって、各二次捕捉剤が複数の検出可能な標識の1種で標識され、各二次捕捉剤が、分離フィーチャで固定化捕捉剤−化合物複合体と結合して固定化捕捉剤−化合物−二次捕捉剤複合体を形成し、分離フィーチャの固定化捕捉剤−化合物−二次捕捉剤複合体が、それぞれスペクトル的に異なる標識を有するように構成されていること;捕捉剤アレイ上で複数の検出可能な標識の存在を検出すること;及び捕捉剤アレイ上で検出される各検出可能な標識の空間的位置及びスペクトル特性を、少なくとも1種の化合物の存在と関連づけることを含む。

0035

一態様においては、複数の分離フィーチャのそれぞれは、線、形、及び点からなる群から選択されるフィーチャである。例えば、一態様においては、各分離フィーチャの形状は、他の全ての分離フィーチャの形状から識別可能である。

0036

一態様においては、マイクロウェルの表面に加えられる流体は細胞を含む。
一態様においては、流体は、重力のみにより、個々のマイクロウェルに流入する。

0037

一態様においては、複数の化合物は、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、細胞表面受容体、核酸、ホルモン、抗原及び増殖因子からなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む。一態様においては、複数の化合物は、マイクロウェル内に含まれる単一細胞から分泌される少なくとも1種のタンパク質を含む。

0038

一態様においては、複数の捕捉剤は、抗体、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片及び核酸からなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む。

0039

一態様においては、少なくとも1種の分離フィーチャは1種超の固定化捕捉剤を含み、分離フィーチャ内の各固定化捕捉剤が、異なる検出可能な標識を有する関連二次捕捉剤を有する。

0040

一態様においては、各マイクロウェルは、約10〜2000μmの長さ、約10〜100μmの幅、及び約10〜100μmの深さを有する長方形である。

0041

一態様においては、各捕捉剤のセットは約10〜100個の分離フィーチャを含み、各分離フィーチャが、1種の化合物と特異的に結合する少なくとも1種の固定化捕捉剤を含む。

0042

一態様においては、各分離フィーチャは、約25〜30μmの幅を有する。一態様においては、各分離フィーチャは、約25μmの距離で同じセットの別の分離フィーチャから分離されている。

0043

一態様においては、捕捉剤アレイは、10種超の異なる捕捉剤を含み、それによって10種超の異なる化合物の検出が可能である。一態様においては、捕捉剤アレイは、40種超の異なる捕捉剤を含み、それによって40種超の異なる化合物の検出が可能である。

0044

一態様においては、マイクロウェルアレイは、約200マイクロウェル/cm2〜約20,000マイクロウェル/cm2のマイクロウェル密度を有する。

0045

一態様においては、マイクロウェルアレイの表面に流体を加えることにより、単一細胞を含む、複数の個々のマイクロウェルが生成する。

0046

一態様においては、捕捉剤アレイ上で検出される検出可能な標識の空間的位置、及び検出される検出可能な標識のスペクトル特性は、複数の化合物の1種の正体と、化合物が検出された個々のマイクロウェルと関連づけられる。一態様においては、捕捉剤アレイ上で検出される検出可能な標識の空間的位置、検出される検出可能な標識の形状、及び検出される検出可能な標識のスペクトル特性は、複数の化合物の1種の正体と、化合物が検出された個々のマイクロウェルと関連づけられる。

0047

一態様においては、方法は、試料内の複数の単一細胞の表現型を、単一細胞により分泌される5種以上の化合物を検出することによって試験する。

0048

一態様においては、懸濁液をマイクロウェルアレイの表面に加えることにより、それぞれが単一細胞を含む複数の個々のマイクロウェルが生成し、それによって複数の単一細胞により分泌される化合物のハイスループット多重検出方法を提供する。

0049

一態様においては、個々のマイクロウェル中に検出される化合物の組み合わせは、マイクロウェル中に含まれる単一細胞の表現型を示す。一態様においては、細胞の表現型が、がん細胞として細胞を定義する。一態様においては、細胞の表現型が、転移性のがん細胞として細胞を定義する。一態様においては、細胞の表現型が、がん細胞の進行性を定義する。

0050

一態様においては、複数の単一細胞は免疫細胞の集団を含み、該方法は免疫細胞の不均一性を試験する。一態様においては、1種以上の単一細胞の表現型は、疾患の進行を示し、又は個々の疾患の段階を明らかにする。

0051

また、本発明は、マイクロウェルアレイ及び捕捉剤アレイを含む装置と、複数の二次捕捉剤とを含む、単一細胞由来の複数の化合物の多重検出用システムを含む。マイクロウェルアレイは均一な配置で複数の個々のマイクロウェルを含み、複数の個々のマイクロウェルの少なくとも一部が、サブナノリットルの内容に単一細胞を含むように構成されている。捕捉剤アレイは複数の固定化捕捉剤を含み、各固定化補足剤は複数の化合物の1種と特異的に結合する能力を有し、固定化捕捉剤は均一な捕捉剤のセット内に配置され、各捕捉剤のセットは空間的に同定可能な位置で複数の分離フィーチャを有し、各分離フィーチャは少なくとも1種の固定化捕捉剤を含む。マイクロアレイ及び捕捉剤アレイが連結して複数の閉鎖インターフェースを形成し、各閉鎖インターフェースは、各マイクロウェルの内容物が少なくとも1つのセットの分離フィーチャの全てにアクセス可能であり、それによって固定化捕捉剤の全てにアクセス可能なようにマイクロウェル及び捕捉剤のセットを含む。各二次捕捉剤は検出可能な標識を含み、複数の化合物の1つの化合物を複数の固定化捕捉剤の1つの固定化捕捉剤と結合させることにより、分離フィーチャで形成した固定化捕捉剤−化合物複合体と結合するように構成されている。

0052

一態様においては、複数の分離フィーチャのそれぞれは識別可能な空間的位置を有する。一態様においては、複数の分離フィーチャのそれぞれは、線、形及び点からなる群から選択されるフィーチャである。例えば、一態様においては、各分離フィーチャは、他の全ての分離フィーチャの形状から識別可能である。

0053

一態様においては、複数のマイクロウェルの少なくとも一部は、長さ約1〜2mm、及び深さ約5〜50μmの寸法を有する高いアスペクト比の長方形のウェルである。

0054

一態様においては、複数の化合物が、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片、細胞表面受容体、核酸、ホルモン、抗原及び増殖因子からなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む。一態様においては、複数の化合物は、マイクロウェル内に含まれる単一細胞から分泌される少なくとも1種のタンパク質を含む。

0055

一態様においては、複数の捕捉剤は、抗体、タンパク質、ペプチド、ペプチド断片及び核酸からなる群から選択される少なくとも1種の化合物を含む。

0056

一態様においては、少なくとも1種の分離フィーチャは1種以上の固定化捕捉剤を含み、分離フィーチャ内の各固定化捕捉剤は、異なる検出可能な標識を有する関連二次捕捉剤を有する。

0057

一態様においては、各マイクロウェルが、約10〜2000μmの長さ、約10〜100μmの幅、及び約10〜100μmの深さを有する長方形である。

0058

一態様においては、各捕捉剤のセットは約10〜100個の分離フィーチャを含み、各分離フィーチャは、1種の化合物と特異的に結合する少なくとも1種の固定化捕捉剤を含む。

0059

一態様においては、各分離フィーチャは約25〜30μmの幅を有する。一態様においては、各分離フィーチャは、約50μm以上のピッチサイズに対して、約25μmの距離で同じセットの別の分離フィーチャから分離されている。

0060

一態様においては、捕捉剤アレイは、10種超の異なる捕捉剤を含み、それによって10種超の異なる化合物の検出が可能である。一態様においては、捕捉剤アレイは、40種超の異なる捕捉剤を含み、それによって40種超の異なる化合物の検出が可能である。

0061

一態様においては、マイクロウェルアレイは、約200マイクロウェル/cm2〜約20,000マイクロウェル/cm2のマイクロウェル密度を有する。

0062

一態様においては、検出可能な標識が、蛍光標識放射性標識強磁性標識、常磁性標識、発光標識電気化学発光標識リン光標識及び呈色標識からなる群から選択される。

0063

一態様においては、複数の二次捕捉剤のそれぞれが、同じ検出可能な標識を含む。

0064

一態様においては、各二次捕捉剤が複数の検出可能な標識の1種で標識され、各二次捕捉剤が、分離フィーチャで固定化捕捉剤−化合物複合体と結合して固定化捕捉剤−化合物−二次捕捉剤複合体を形成し、分離フィーチャの固定化捕捉剤−化合物−二次捕捉剤複合体が、それぞれスペクトル的に異なる標識を有するように構成されている。

図面の簡単な説明

0065

以下の本発明の好ましい態様の詳細な説明は、添付した図面と組み合わせて読む場合に、より理解できるであろう。本発明の説明の目的のため、現時点で好ましい態様を図面に示す。しかし、本発明は、図面に示した態様の正確な配置及び手段に限定されないことを理解すべきである。

0066

図1A〜図1Cを含む図1は、例示的なハイスループットの多重単一細胞セクレトーム試験の構造を示す一連の画像である。図1Aは、単一細胞のレベルにおける、ハイスループット多重タンパク質分泌試験用の高密度捕捉剤アレイチップ及びサブナノリットルマイクロチャンバーアレイの組み合わせを示す略図を示す。図1Bは、全体の捕捉剤マイクロアレイにわたるタンパク質積載の高い均一性を示す、スキャンした蛍光画像である(1in.×2in.)。この試験では、蛍光標識したウシ血清アルブミンFITCBSA)を使用した。図1Cは、自動化された、電動式位相差顕微鏡によって収集された多数の個々の画像から作成した写真である。ともに、この写真は、ヒト免疫細胞(U973)を積載した、全体のサブナノリットルマイクロチャンバーチップ包含する。スケールバーは2mm。最初の拡大した画像は、マイクロチャンバーアレイのカラムを示す(スケールバーは300μm)。2つ目の拡大した画像は、マイクロチャンバーに積載した個々の細胞を示す(スケールバーは50μm)。

0067

図2A及び図2Bを含む図2は、本発明の典型的な装置で試験した典型的なタンパク質パネルを示す。図2Aは、単一細胞マイクロチップ中で試験した全部で22種のタンパク質のリスト及びヒト生理学におけるそれらの機能である。図2Bは、組み換えタンパク質を用いて得られた一連の滴定曲線である。合計18種の抗体対を検証し、使用できる組換え体が存在しないため、他の4種は滴定曲線において除外した。蛍光強度は、各タンパク質について16スポットからの平均されたオリジナル光子カウントを表す。エラーバーは、3×SDを示す。

0068

図3A〜図3Dを含む図3は、U87細胞株による単一細胞セクレトーム解析の結果を示す一連の画像である。図3Aは、単一細胞セクレトーム測定の生データを示す、スキャンされた画像の代表的領域を示す画像である。右側の3個のサブパネルは、16個のマイクロチャンバーについての、光学顕微鏡写真、蛍光画像、及びオーバーレイである。図3Bは、1278個の単一細胞(U87)から分泌された14種のタンパク質のプロファイルを示すヒートマップを示す。各行は単一細胞であり、各カラムは対象のタンパク質に対応する。図3Cは、マイクロチャンバー内の細胞数に対する6種の選択したタンパク質(FGF、VEGF、MIFIL−6、IL−8、MCP−1)について測定した蛍光強度を示す一連の散布図である(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。図3Dは、U87細胞株についての集団動力学を示す。対照MEM培地)、異なる時点(0時間、1時間、2時間、3時間、6時間、9時間、12時間、24時間)において、集団からの分泌上清

0069

図4A〜図4Dを含む図4は、A549細胞についてタンパク質分泌プロファイルと細胞遊走との相関関係を証明する実験の結果を示す一連の画像である。図4Aは、タンパク質分泌試験の前(0時間)及び後(24時間)の3種の単一細胞(n=384)を示す代表的な光学的画像を示す画像である。図4Bは、個々の細胞の遊走距離に対するIL−8の分泌に対応する蛍光強度を示す散布図である(P<0.05)。図4Cは、MCP−1における同様の分析を示す散布図である(P=0.14)。図4Dは、IL−6における同様の分析を示す散布図である(P=0.75)。各ドットは単一細胞を表す。

0070

図5A〜図5Eを含む図5は、患者由来原発性腫瘍の単一細胞セクレトーム解析を示す一連の画像である。図5Aは、組織試料の処理、単一細胞懸濁液の調製、一次細胞のサブナノリットルマイクロチャンバーアレイチップへの適用のための手順についての模式図を示す。図5Bは、患者1についてスキャンした画像の代表的領域を示す。図5C及び図5Dは、それぞれ2名の患者(患者1及び2)由来の原発性腫瘍細胞の単一細胞セクレトームの特徴を示すヒートマップを示す。データは、教師なしの階層クラスタリング分析の結果として表す。図5Eは、単一細胞におけるタンパク質−タンパク質相関を示す一連の散布図マトリクスである。各サブパネルは、測定した全ての単一細胞における他のタンパク質に対するタンパク質のレベルを示す散布図である。タンパク質は、対角線に示す。相関係数は、線形回帰分析により、Rとして計算する。全体のマトリクスは、赤(正の相関)及び青(負の相関)により色分けする。色の強さは、R値に比例している。

0071

図6は、例示的な完全な単一細胞セクレトーム解析装置の構成を示す一連の画像である。高密度抗体アレイスライドグラス及び5440個のマイクロチャンバーPDMスラブを、加えられたばね力によって、クランプを含む装置筐体システムを使用して二枚の透明板と一緒に固定した。

0072

図7は、捕捉剤アレイの全体のチップの均一性の評価を示すグラフである。フローパターン型のポリ−L−リジンスライド(3cm×2cm)の蛍光強度の定量化により、固定化タンパク質(FITC−BSA)の優れた均一性が明らかになり、これにより、単一細胞の不均一性を評価するための、この高密度アレイ技術の有効性保証される。

0073

図8は、全体のマイクロチップにわたる、細胞数の分布を示すグラフである。種々の量の細胞懸濁液(細胞密度:106細胞/mL)を使用して4回の実験を行った。

0074

図9A〜図9Cを含む図9は、U937細胞株による単一細胞セクレトーム解析を示す一連の画像である。図9Aは、単一細胞セクレトーム測定の生データを示す、スキャンを行った画像の代表的領域を示す画像である。右側の3つのサブパネルは、14個のマイクロチャンバーについての光学顕微鏡写真、蛍光画像及びオーバーレイである。図9Bは、551個の単一細胞(U937)から分泌された14種のタンパク質のプロファイルを示すヒートマップである。各行は単一細胞であり、各カラムは関心のあるタンパク質に対応する。図9Cは、マイクロチャンバー内の細胞数に対する4種の選択したタンパク質(IL8、MCP−1、RANTES及びTNFa)について測定した蛍光強度を示す一対の散布図である。細胞は、20μg/mLのPMAを用いてマクロファージ分化するように刺激され、1mg/mLのLPS投与され、分泌分析のためのマイクロチップに乗せる直前に、活性化された。

0075

図10は、U87細胞株を用いたチャンバーから分泌された14種のタンパク質のプロファイルを示すヒートマップである。各列は単一細胞であり、各カラムは関心のあるタンパク質に対応する。0個の細胞(n=1821)、単一細胞(n=1278)、2個の細胞(n=544)、3個の細胞(n=214)、4個の細胞(n=100)、及び5個の細胞(n=35)。

0076

図11は、U87細胞株についての細胞集団動態を示すグラフである。対照(MEM培地)、異なる時点(0時間、1時間、2時間、3時間、6時間、9時間、12時間、24時間)における集団からの分泌上清。

0077

図12は、平均を示す画像である。バルクパターンに近づいて行く、単一細胞プラットホーム内のU87細胞の平均シグナル(上)、及びU87細胞の24時間バルク分泌プロファイル(下)。

0078

図13は、U937集団の分泌を測定した対照実験の結果を示す一連の画像である。大量のU937細胞から分泌されたタンパク質を、従来の抗体マイクロアレイにより測定した(上のパネル)。23種全てのタンパク質の定量を、下のパネルに示す。

0079

図14は、刺激なしで、その基底レベルにおける1個のA549細胞のタンパク質分泌プロファイルを示すヒートマップである。

0080

図15は、A549の細胞集団の分泌を測定した対照実験の結果を示す一連の画像である。大量のA549細胞から分泌されたタンパク質を、従来の抗体マイクロアレイにより測定した(上のパネル)。23種全てのタンパク質の定量結果を、下のパネルに示す。

0081

図16は、A549単一細胞の遊走距離と、その対応するタンパク質分泌シグナルとの相関を示すヒートマップである。

0082

図17は、患者1由来の試料で測定した個々のタンパク質の一連のヒストグラムプロットである。

0083

図18は、患者2由来の8種の選択されたタンパク質について測定した蛍光強度を示す一連の散布図である。(FGF、IL−6、IL−8、MCP−1、MIF、PDGF、RANTES、TNF−a)

0084

図19は、転移性髄膜種の患者番号3由来の試料における単一細胞タンパク質分泌プロファイルを示すヒートマップである。

0085

図20は、患者3から得られた単一細胞分泌データについての一連の散布図及びタンパク質相関分析である。

0086

図21は、本発明の典型的な装置を示す一連の画像である。

0087

図22は、本発明の典型的なマイクロウェルアレイ及び捕捉プローブアレイを示す概略図である。

0088

図23A及び図23Bを含む図23は、本発明の典型的な分離フィーチャを示す一連の概略図である。図23Aは、分離フィーチャの典型的なセットを示す。フィーチャは、ラインあたり25ミクロンと見つもられ、非平行ラインセットあたり50ミクロンのピッチサイズを実現するために25ミクロンの間隔を有している。図23Bは、異なる形状を有するフィーチャを有する、本発明の典型的な分離フィーチャを示す概略図である。

0089

図24は、超高密度抗体マイクロアレイを示す一連の画像である。各マイクロウェルの形状は変化する場合があり(例えば、四角形ひし形の形状)、このアレイは、単一細胞多重タンパク質プロファイリングを実施するために、単一細胞マイクロウェル捕捉チップとインターフェース形成し得る。このアレイは、クロスフローパターニング技術により製造され、マイクロスポッティング及びインジェクトプリンティング等のマイクロスケール印刷技術により製造することもできる。

0090

図25は、個々のマイクロウェル内の細胞の検出(下の右側)、及び関心のある特定の化合物の存在の検出(下の中央)を示す一連の画像である。

0091

図26は、本発明の装置を用いた、45重のサイトカイン、ケモカイン、及び細胞外タンパク質(例えば、増殖因子)の3色スペクトル検出の相関マップ分析である。

0092

図27は、本発明の単一細胞化合物単一細胞試験の捕捉の、空間的及びスペクトル(すなわち、蛍光比色分析)符号化を提供するための3種の異なる一次抗体及びそれぞれ異なる蛍光標識で標識された、3種の異なる検出抗体の使用を示す図である。

0093

図28は、抗体アレイの同一の視野における3種の異なる検出可能な標識の画像化を示す一連の画像であり、アレイのスペクトル的符号化、及び多くの化合物の多重検出の能力を証明する。

0094

図29は、多数の異なる検出可能な標識を用いる装置の画像化の均一性を示す一連の画像である。スキャンした蛍光画像(混合及び分離)は、ポリ−L−リジンスライドグラスにおける、多重抗体共固定化の結果を示す。挿入図は、捕捉剤スライド全体にわたる、タンパク質コーティングの高い均一性を示す(領域中、1インチ×2においてC.V.<5%)。本試験では、蛍光標識ウシ血清アルブミン(それぞれ、488−BSA、532−BSA、647−BSA)を使用した。

0095

図30は、14の空間的位置(ライン)及び位置あたり3色を用いた、42種の異なるサイトカイン、細胞外タンパク質、増殖因子及び抗原の典型的パネルの表である。

0096

捕捉剤の示された非交差性によって、試験の特異性を示す実験の結果を示す。EGFのみを含む試料は、EGFに相当する位置/波長の組み合わせにおいてのみ、蛍光の存在をもたらす。

0097

図32A図32Cを含む図32は、488群(図32A)、532群(図32B)、及び635群(図32C)の化合物群について組換えタンパク質を用いて得られた一連の検量線である。これらの曲線は、検出強度に基づき、試料中の各サイトカイン濃度を定量するために使用することができる。

0098

図33は、本発明のスペクトル試験を用いて、488nmの画像化した波長から得られた生データを示す。

0099

図34は、本発明のスペクトル試験を用いて、532nmの画像化した波長から得られた生データを示す。

0100

図35は、本発明のスペクトル試験を用いて、635nmの画像化した波長から得られた生データを示す。

0101

図36は、本発明のスペクトル試験を用いて、488nm、532nm及び635nmの画像化した波長から得られた、生データの組み合わせを示す。

0102

図37は、細胞集団に基づくマイクロELISAを用いた、サイトカイン検出の生データを示す。

0103

図38は、細胞集団に基づくマイクロELISAと、本発明の単一細胞試験との比較を示すグラフである。

0104

図39は、LPS(100ng/mL)で刺激した細胞に対する非刺激細胞の単一細胞分泌を比較する45重の単一細胞試験を用いた実験の結果を示す。データは、平均化したシグナルのヒストグラム(上)、ヒートマップ(中央)及び2d棒グラフ(下)として示される。

0105

図40は、本発明の単一細胞試験(SCMA)を、非刺激(対照)及びLPS刺激細胞中のサイトカイン検出について細胞内サイトカイン染色(ICS)と比較した表である。

0106

図41は、本発明の単一細胞試験(SCMA)を、非刺激(対照)及びLPS刺激細胞中のサイトカイン検出について細胞内サイトカイン染色(ICS)と比較したグラフである。

0107

図42は、対照及び刺激細胞について、本発明の単一細胞試験により測定された、細胞あたりの分泌されたサイトカインの数を示すことにより、細胞の多機能性を示す一連のグラフである。

0108

図43は、45重の単一細胞タンパク質分泌プロファイリングシステムの作業の流れの説明を示す。

0109

図44A図44Dを含む図44は、45重のタンパク質分泌プロファイリングプラットホームにおけるU937マクロファージ単一細胞の結果を実証する実験の結果を示す。図44Aは、U937に由来するマクロファージ単一細胞タンパク質分泌の結果の、集団細胞の分泌の結果との比較を示す。図44Bは、単一細胞分泌プラットホーム及びICS(細胞内サイトカイン染色)から得られるタンパク質分泌頻度の比較を示す。図44Cは、SCMA(左側)及びICS(右側)の両方によって、IL−8及びMCP−1タンパク質分泌の結果により定義される類似の細胞亜集団の定義を示す一連のグラフである。図44Dは、U937マクロファージ単一細胞のタンパク質分泌試験の結果に基づく、マクロファージ単一細胞の多機能性分析を示す。

0110

図45A〜図45Cを含む図45は、TLR4リガンドLPS刺激によるマクロファージ応答を証明する実験の結果を示す。図45Aは、未処理及びLPSで刺激したU937単球由来マクロファージのタンパク質分泌プロファイルの比較を示すヒートマップを示す。図45Bは、VISNEによる単一細胞分泌の結果の可視化を示す。図45Cは、VISNEによる個々のタンパク質(MIF、IL−8、MCP−1、RANTES、MIP−1a、MIP−1b)の分泌の結果の可視化を示す。

0111

図46A図46Dを含む図46は、異なるTLRリガンド(LPS、PAM3、ポリIC)刺激によるマクロファージ応答を示す実験の結果を示す。図46Aは、未処理及び刺激(LPS、PAM3、ポリIC)U937単球由来マクロファージのタンパク質分泌プロファイルの比較を示すヒートマップを示す。図46Bは、種々の刺激下に個々の任意のタンパク質を分泌するU937マクロファージ細胞の頻度を示すヒートマップを示す。図46Cは、VISNEによる単一細胞の結果の可視化を示す。図46Dは、VISNEによる個々のタンパク質(MIF、IL−8、MCP−1、MIP−1b)分泌の結果の可視化を示す。

0112

図47A及び図47Bを含む図47は、Alexa fluor488及び532コンジュゲート間の補正調査した実験からの結果を示す。図47A:BSTと結合したAlexa fluor488を、ポリ−L−リジンスライドグラスにスポットした。488チャンネルシグナル及び532チャンネルシグナルは、相互間の良好かつ安定な相関を示し(R2は約98%)、補正式を抽出することができる。図47B:BSAと結合したAlexa fluor532についての532チャンネルからの現実のシグナル及び488チャンネルからのクロストーク間の相関性

0113

図48は、PMA(50ng/mL)で48時間分化したU937単球のマクロファージマーカーCD11b(FL4)及びCD14(FL2)による特徴づけを示す一連のグラフである。

0114

図49は、種々の基板からのU937単球由来マクロファージ集団細胞のタンパク質分泌の結果を、それぞれ96ウェルプレート、5:1、10:1、20:1比のPDMSで比較した実験結果を示すグラフである。結果は、IL−8、MCP−1、IL−6等の高レベル分泌タンパク質及びIL−la、IL−3、IL−4等の低レベル分泌タンパク質の両方の種々の基板における変化の類似の倍数を示す。

0115

図50は、0個の細胞、単一細胞、2個の細胞及び複数の細胞(3を超える)を含む種々の細胞数からの分泌結果を示す、代表的な全体のマイクロチップヒートマップ(1つの実験からの)である。各行は単一細胞であり、各カラムは対象のタンパク質に対応する。0個の細胞のマイクロチャンバーからのシグナルは、正の分泌のための閾値(平均シグナル+標準偏差の2倍)として使用することができる。

0116

図51A及び図51Bを含む図51は、U937単球に由来するマクロファージ単一細胞タンパク質の並行する2個のチップからの分泌の比較を示す一連のグラフである。図51A:これら2個のチップからの単一細胞シグナル対0個の細胞シグナルの比は非常に類似している。図51B:これら2個のチップからの単一細胞分泌シグナル比は1にきわめて近い。

0117

図52は、U937マクロファージタンパク質分泌(例として、IL−8、MCP−1、MIP−1b、MIF)と細胞数(0、1、2、3・・・・)との相関関係を示す一連のグラフである。

0118

図53A及び図53Bを含む図53は、U937マクロファージ(対照及びLPS刺激)の多機能分析の結果を示す。図53Aは、様々な数のタンパク質が分泌されることを証明する棒グラフ及び折れ線グラフを示す。図53Bは、様々な範囲のタンパク質を分泌する細胞の割合を示す一連の円グラフを示す。

0119

図54は、VISNE及びクラスターの結果の比較を示す。未処理及びLPSで刺激したU937単一細胞を、そのタンパク質分泌パターンに基づいてそれらの2種の方法により3つの亜集団に分類することができる。

0120

図55A及び図55Bを含む図55は、0〜48時間のU937マクロファージタンパク質分泌動態を示す一連のグラフである。図55A:対照;図55B:LPSで刺激。結果は、異なるタンパク質が、選択した刺激条件下で、種々の分析の時点で、異なる分泌動態を有することを示す。

0121

図56A〜図56Fを含む図56は、100ng/mLのLPSによる刺激の前(未処理)及び後のU937由来マクロファージタンパク質分泌プロファイルを示す実験結果を示す。図56A:刺激前後の全ての同一の細胞。図56B:刺激前後の同一の単一細胞の比較。図56C〜図56E:IL−8(処置前及び後)とIL−6、IL−10、TNF−8の関係を示す散布図。図56F:LPS刺激前後の同一細胞からのIL−8、MCP−1、Rantes、MMP−9の変化。

0122

図57は、CyTOF(登録商標) Mass Cytometerシステムと本発明の単一細胞多重アレイ(Isoplexis)の比較を示す。

0123

本発明は、全体としてハイスループット単一細胞解析システム、装置及び方法に関する。一態様においては、本発明は、単一細胞由来の多種類の化合物の存在を定量的に検出するために使用される。例えば、一態様においては、本発明は、単一細胞から分泌された化合物の多重検出のために使用される。特定の態様においては、本発明は、単一細胞由来のケモカイン、サイトカイン、増殖因子及び抗原等の分泌されたタンパク質の多重検出を可能にする。単一細胞から分泌された化合物を分析する能力は、細胞集団内の細胞の表現型の変動の評価を可能にする。更に、本発明は、集団内の表現型的にまで及び/又は潜在的に有害な細胞型を確認するための有効なメカニズムを提供する。そうでないと、その活性は、従来の集団を基準とする試験では隠れてしまうであろう。一態様においては、本発明の装置は、別個の成分:(1)高密度サブナノリットルマイクロウェルアレイ、及び(2)高密度捕捉剤アレイを含む基板を含むマイクロチップである。一態様においては、本発明は、化合物捕捉の空間的及びスペクトル的符号化を使用する。

0124

定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料は、本発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料を記載する。
本明細書で用いられる場合、以下の各用語は、この節でそれと関連する意味を有する。

0125

「a」及び「an」は、本明細書において、詞の文法的な対象の1又は1超(すなわち、少なくとも1)を意味するために使用される。例として、「要素」は、1個の要素又は1個超の要素を意味する。

0126

量、時間等の測定可能な値を意味する場合に本明細書で用いられる場合、「約」は、記載の値から±20%又は±10%、より好ましくは±5%、更に好ましくは±1%、更により好ましくは±0.1%の変動を包含することを意味し、このような変動は、開示された方法を実施するために妥当である。

0127

本明細書で用いられる場合、「抗体」という用語は、抗原上で特定のエピトープと特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を意味する。抗体は、天然源又は組換え源由来の完全な免疫グロブリンであってもよく、完全な免疫グロブリンの免疫活性部分であってもよい。抗体は、通常は免疫グロブリン分子の四量体である。本発明の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体モノクローナル抗体、Fv、Fab及びF(ab)2、並びに一本鎖抗体及びヒト化抗体を含む種々の形態(Harlow et al.,1988;Houston et al.,1988;Bird et al.,1988)で存在していてもよい。

0128

本明細書で用いられる場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド鎖として定義される。更に、核酸はヌクレオチドポリマーである。従って、本明細書で用いられる場合、核酸及びポリヌクレオチドは交換可能である。当業者は、核酸が、単量体の「ヌクレオチド」に加水分解され得るポリヌクレオチドであるという一般知識を有している。単量体ヌクレオチドはヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書で用いられる場合、ポリヌクレオチドとしては、通常のクローニング技術及びPCR(商標)等を用いる組換え手段、すなわち、組換えライブラリー又は細胞ゲノム由来の核酸配列のクローニング、並びに合成手段を含むが、これらに限定されない任意の当分野で利用可能な方法によって得られる全核酸配列が挙げられるが、限定されない。

0129

本明細書で用いられる場合、「ポリペプチド」という用語は、通常、定義された配列を有するアミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書で用いられる場合、ポリペプチドという用語は、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語について相互に包括的である。

0130

本明細書で用いられる場合、「特異的に結合する」という用語は、捕捉剤が特定の化合物を認識するが、試料中の他の化合物を実質的に認識しないか結合しないことを意味する。例えば、1つの種由来の抗原と特異的に結合する抗体は、1種以上の種由来の抗原とも結合する可能性がある。しかし、このような異種間反応性は、それ自体が特異的という抗体の分類を変更しない。他の例においては、抗原と特異的に結合する抗体は、異なるアレル型の抗原と結合することもできる。しかし、このような交差反応性は、それ自体が特異的という抗体の分類を変更しない。ある例においては、「特異的な結合」又は「特異的に結合」という用語は、抗体、タンパク質又はペプチドと第2の化学種との相互作用に関して使用することができ、この相互作用が、化学種における特定の構造(例えば、抗原決定基又はエピトープ)の存在に依存することを意味する。例えば、抗体はタンパク質全般でなく特定のタンパク質構造を認識して結合する。抗体がエピトープ「A」に特異的であるなら、エピトープAを含む分子(又は遊離非標識のA)の存在は、標識された「A」及び抗体を含む反応において、抗体に結合する標識されたAの量を減少させるであろう。

0131

本明細書で用いられる場合、「分離フィーチャ」又は「フィーチャ」は、本明細書に記載される捕捉剤のセット内に見られる識別可能な要素を意味する。特定の態様においては、分離フィーチャは、連続ライン、非連続ライン、ドット、四角形、三角形、若しくは他の識別可能な形状、又は形状の組み合わせである。上記形状は、捕捉剤のセットが分離フィーチャの再現可能な数及び配置を含むいずれであってもよい。

0132

本明細書で用いられる場合、「インターフェース」は、本明細書に記載される1個のマイクロウェル及び捕捉剤のセットを含むユニットを意味する。インターフェースは、本発明のマイクロウェルアレイと捕捉剤アレイとが、一定の繰り返されるパターンで一緒に接触したときに形成される。

0133

範囲:本明細書の開示の全体にわたって、本発明の種々の側面は、範囲形式で示すことができる。範囲形式での記載は単に便宜上及び簡潔化のためであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈すべきでないことを理解すべきである。したがって、範囲の記載は範囲内の全ての可能な部分的範囲、並びに個々の数値を具体的に開示したものと考えるべきである。例えば、1〜6の範囲の記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6等の部分的範囲、並びにその範囲内の個々の数字、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3及び6を特に開示していると考えるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。

0134

説明
本発明は、全体としてハイスループット単一細胞分析のためのシステム、装置及び方法に関する。特定の態様においては、本発明は、単一細胞から分泌される多くの種類の化合物の定量的多重検出に使用される。本発明は、そうでないと、従来の集団を基準とする試験では隠れてしまう、細胞集団内の単一細胞の表現型を特定するための有効なメカニズムを提供する。例えば、本発明は、表現型的にまれな、又は診断的に価値がある単一細胞の特定を可能にする。一態様においては、本発明は、刺激又は負荷により、単一細胞の多機能性の特定及び定量を可能にする。特定の態様においては、本発明は、細胞集団中の潜在的に有害な単一細胞の特定を可能にする。単一細胞から分泌される化合物を分析する能力により、細胞集団中の細胞の表現型の可変性の評価が可能になる。

0135

一態様においては、本発明の装置は、2種の別個の成分:(1)高密度サブナノリットルのマイクロウェルアレイ、及び(2)高密度捕捉剤アレイを含む基板を含むマイクロチップである。

0136

捕捉剤アレイは、複数の捕捉剤から構成され、各捕捉剤は、関心のある化合物を特異的に認識する。捕捉剤は、基板に沿って異なる分離フィーチャ内に配置され、本明細書で「空間的符号化」と記載されているように、種々の捕捉剤間に空間的差異をもたらしている。例えば、一態様においては、捕捉剤アレイは、複数のラインから構成され、各ラインは1種以上の特異的捕捉剤から構成される。一態様においては、捕捉剤アレイは、分離フィーチャのセットの繰り返しを含み、各セットは複数の捕捉剤の全てを含むのに必要なフィーチャの全てを含む。本明細書の他の場所で記載されているように、本発明の装置は、5〜100種の異なる化合物の検出及び定量を可能にする。したがって、本発明の捕捉剤アレイは5〜100種の捕捉剤を含み、それぞれは、関心のある1種の化合物に特異的である。特定の態様においては、本発明の捕捉剤は、関心のある分泌タンパク質と特異的に結合する。一態様においては、本発明の捕捉剤は、1個のマイクロウェル内に捕捉される関心のある、45種のタンパク質又は抗原の1種と特異的に結合する。

0137

本発明の多重能力は、2以上、3以上、4以上、5以上、10以上、20以上、40以上、50以上、100以上のような化合物の検出を可能にする。例えば、本明細書の他の場所に記載されているように、本発明によって提供される空間的及びスペクトル符号化は、非常に多くの種々の化合物を検出する能力を可能にする。

0138

本明細書に記載の説明は、1種又は1種超の捕捉剤を含むフィーチャについて説明しているが、これは、フィーチャが捕捉剤の1分子を有することを意味しないことに留意すべきである。どちらかといえば、当業者は、固定化捕捉剤を含むフィーチャは、フィーチャがいくつかの数又は濃度の特定の捕捉剤を含むことを記載していることを理解するであろう。更に、3種の捕捉剤を含むフィーチャは、フィーチャがいくつかの数又は濃度の3種の特異的捕捉剤を含むことを意味する。

0139

マイクロウェルアレイは、複数のサブナノリッターサイズのマイクロウェルから構成され、それぞれは単一細胞を収容するように構成されている。各マイクロウェルは、単一細胞の拘束を可能にし、ある態様においては、単一細胞によって分泌した分泌化合物をマイクロウェルに拘束する。それによって、本発明のマイクロウェルは、分泌された、特に拘束された単一細胞によって分泌されたタンパク質の分析を可能にする。

0140

本発明の装置は、捕捉剤アレイと接続されたマイクロウェルアレイを含み、各マイクロウェルと、捕捉剤アレイ上に配置された一式の捕捉剤との間にインターフェースを形成している。特定の態様においては、マイクロウェル内に収容された単一細胞から分泌された化合物は、捕捉剤アレイ上の捕捉剤と特異的に結合する。その後、結合したタンパク質は、例えば、サンドイッチELISAにおいて、一群の標識された二次捕捉剤を使用することにより可視化される。

0141

特定の態様においては、結合した化合物は、二次捕捉剤を用いて可視化される。一態様においては、結合した化合物は、本明細書の他の場所で記載されているように、本明細書において「スペクトルの符号化」と呼ばれる、特定のライン又はフィーチャに結合するようになっている1種以上の別々に標識された二次捕捉剤により、一群の標識化された二次捕捉剤を使用して可視化される。

0142

一態様においては、本発明の装置は、関心のある各化合物の存在又は非存在を決定するために複数の分離フィーチャの空間的位置又は形状を使用する多重試験を可能にする。例えば、特定の空間的位置で及び/又は識別可能なフィーチャ内で検出可能な標識を観察することにより(標識された二次検出試薬の結合を通して)、特定の化合物の存在に関する情報が提供される。

0143

他の態様においては、本発明の装置は、識別可能な空間的フィーチャ、並びに該フィーチャにおける選択された標識の色が、関心のある各化合物の存在又は非存在を決定する、多重の空間的及びスペクトル試験を可能にする。

0144

例えば、特定の態様においては、各フィーチャは、1個超の捕捉剤から構成され、それぞれは異なる色の標識に対応する。例えば、一態様においては、試験は、m×n種の関心のある化合物の検出を可能にする。ここで、mは識別可能な分離フィーチャの数に等しく、nはフィーチャあたりに使用される検出可能な標識の数に等しい。重要なことに、試験は、m×n種の化合物それぞれについての独特の標識を必要としない。どちらかといえば、空間的フィーチャと着色された標識の組み合わせは、n種の異なる標識の必要のみをもたらす。例えば、一態様においては、各分離フィーチャ内に3種の異なる捕捉剤が配置され、3種の異なる標識された二次捕捉剤が使用され、各異なる標識された二次捕捉剤が3種の配置された捕捉剤の1つに対応する。一態様においては、各セットは、15種の分離フィーチャを含み、それによって単一細胞あたり45種(15×3)の化合物の検出を可能にする。

0145

また、本発明は、単一細胞のセクレトーム解析法を提供する。該方法は、マイクロウェルアレイを提供し、該アレイを、細胞を含む溶液と接触させることを含む。細胞がアレイのウェル内に流入するように、溶液をアレイ上に広げる。該方法は、更に、ウェル内の細胞及び溶液が、捕捉剤アレイ上に固定化された捕捉剤の集団に接触するように、捕捉剤アレイをマイクロウェルアレイに取り付けることを含む。したがって、単一細胞から分泌された化合物(例えば、タンパク質)は、捕捉剤アレイ上に積載した捕捉剤と特異的に結合することができる。一態様においては、方法は、更に分泌された化合物と固定化捕捉剤との結合部位で検出可能な複合体を形成するように、捕捉剤アレイに、検出可能な標識でタグ付けされた第2の捕捉剤の群を投与することを含む。

0146

また、本発明は、対象から得た試料内の特定の表現型を有する細胞の存在を確認する方法を提供する。本明細書の他の場所に記載しているように、本発明の装置は、個々の細胞から分泌される化合物の特異的なプロファイルを検出する能力を可能にする。したがって、本発明の装置及び方法は、そのプロファイルが特定の細胞表現型を示す、1種以上の細胞の特定を可能にする。例えば、一態様においては、方法は、分泌されたタンパク質のプロファイルが、がん細胞、悪性がん細胞等を示す、細胞の特定を含む。一態様においては、方法は、特定の特徴を有する個々の細胞の亜集団を特定する。

0147

装置
一態様においては、本発明の装置は、捕捉剤アレイとインターフェース形成しているマイクロウェルアレイを含む。典型的な装置の図を図21に示し、装置及びその要素の典型的概略図は図1及び図22に示す。図22に示すように、装置100は、捕捉剤アレイ20と連結したマイクロウェルアレイ10を有する。装置100は、捕捉剤の完全なセット21を個々のマイクロウェル11と連結し、複数のインターフェース101を形成する。各インターフェース101は、個々のマイクロウェル11及び捕捉アレイのセット21を有し、これは、マイクロウェル11内に存在する多数の化合物の多重検出を実施するために使用される。したがって、マイクロウェルアレイ10及び捕捉剤アレイ20は、個々のマイクロウェルからのハイスループット検出及び分析を可能にするために正確に連結するように構成されている。一態様においては、装置は、捕捉剤のセットに連結した、約1,000〜100,000個のマイクロウェルを有する。マイクロウェルアレイ10及び捕捉剤アレイ20の更なる記載を以下に提供する。

0148

マイクロウェルアレイ
特定の態様においては、本発明の装置はマイクロウェルアレイを有する。マイクロウェルアレイは、細胞及び細胞が分泌した化合物を、各ウェルの限定的空間内に捕捉及び拘束し、それによって、実施の間の細胞の逸脱を防止する。更に、マイクロウェルアレイは、分泌される化合物の放出に関しては細胞が正常に機能することを可能にする。一態様においては、細胞は生きたままであり(すなわち、固定されず)、マイクロウェル内で正常に機能する。

0149

本発明のマイクロウェルアレイは、複数の個々のマイクロウェルを有する。特定の態様においては、マイクロウェルアレイは、ハイスループット分析を可能にする装置を提供するために、高密度の個々のマイクロウェルのアレイを有する。マイクロウェルアレイは、装置の好ましい実施のために、任意の形状又は大きさであってよい。一態様においては、マイクロウェルアレイは、所定の長さ及び幅を有する長方形である。

0150

一態様においては、マイクロウェルアレイは、長さが0.5〜10cmである。他の態様においては、マイクロウェルアレイは、長さが1〜5cmである。他の態様においては、マイクロウェルアレイは長さが2〜3.5cmである。

0151

一態様においては、マイクロウェルアレイは、幅が0.5〜10cmである。他の態様においては、マイクロウェルアレイは、幅が1〜5cmである。他の態様においては、マイクロウェルアレイは、幅が2〜3.5cmである。

0152

一態様においては、マイクロウェルアレイは、約10〜1,000,000個の個々のマイクロウェルを有する。他の態様においては、マイクロウェルアレイは、約500〜500,000個の個々のマイクロウェルを有する。他の態様においては、マイクロウェルアレイは、約100〜100,000個の個々のマイクロウェルを有する。

0153

一態様においては、マイクロウェルアレイは、約200マイクロウェル/cm2〜約20,000マイクロウェル/cm2の密度でマイクロウェルを有する。

0154

本明細書で用いられる場合、マイクロウェルは、細胞が生存し、機能する環境で細胞を捕捉し、拘束するチャンバーである。各マイクロウェルは、細胞のかなりの生存を確実にするように構成されている。例えば、マイクロウェル内の細胞は、インビボの環境で期待されるのと同様の生存率を有する。更に、各マイクロウェルは、本発明の装置の実施の間、捕捉した細胞の正常な機能を可能にするように構成されている。

0155

マイクロウェルアレイの各マイクロウェルの寸法は、拘束された細胞の正常な機能及び生存を促進しながら、細胞及び分泌された化合物を有効に拘束するように設計されている。マイクロウェルは、1種以上のインターフェース形成した捕捉剤のセットの全領域をカバーするように設計されている。したがって、各マイクロウェルの大きさ及び形状は制限されず、使用される細胞及び所望の多重能力にとって適切な任意の大きさ及び形状を採用することができる。一態様においては、各マイクロウェルは、所定の長さ、幅及び深さを有する長方形である。各マイクロウェルは、例えば、細胞懸濁液、生理的液体流体試料、可能な試薬等を含む、サブナノリットル体積の流体を捕捉する。

0156

一態様においては、各マイクロウェルは、長さが1〜10,000μmである。他の態様においては、各マイクロウェルは、長さが5〜5,000μmである。他の態様においては、各マイクロウェルは、長さが10〜2,000μmである。

0157

一態様においては、各マイクロウェルは、幅が1〜1,000μmである。他の態様においては、各マイクロウェルは、幅が5〜500μmである。他の態様においては、各マイクロウェルは、幅が10〜100μmである。

0158

一態様においては、各マイクロウェルは、深さが1〜1,000μmである。他の態様においては、各マイクロウェルは、深さが5〜500μmである。他の態様においては、各マイクロウェルは、深さが10〜100μmである。

0159

一態様においては、各マイクロウェルは、高いアスペクト比の長方形のウェルである。例えば、一態様においては、各ウェルは、長さが約1.8mmであり、幅が約20μmである。

0160

一態様においては、各マイクロウェルは、幅が約10〜100μmであり、深さが20〜200μmであり、長さが100〜2,000μmである。

0161

特定の態様においては、個々のマイクロウェルは、カラム及び/又は行の配列として横方向及び縦方向に離間されている。一態様においては、個々のマイクロウェルは、約10〜100μmの間隔で規則正しく離間されている。

0162

マイクロウェルアレイの製造は、本明細書に記載されるアレイを構築するために必要な任意の適切な方法を使用して実施することができる。例えば、一態様においては、マイクロウェルアレイは、レイアウトのための標準的な手順を用いて、ネガ型フォトリソグラフィウエハ形成、それに続くソフトポリマー(PDMS, Sylgard 184)により製造される。一態様においては、ソフトリソグラフィ技術は、アレイのエラストマースタンピング及び成型のために使用される。

0163

一態様においては、マイクロウェルアレイは、光学的に透明であり、アレイ又はアレイ中の細胞の画像生成を可能にする。本発明の特定の態様においては、アレイの画像生成は、細胞の計数、マイクロウェルの配置、及び/又はマイクロウェル内の細胞の位置の決定のために好ましい。

0164

一態様においては、マイクロウェルアレイは、1回使用のために製造及び形成される。他の態様においては、マイクロウェルアレイは、再利用可能なように製造及び形成される。例えば、特定の態様においては、マイクロウェルアレイは、水、食塩水緩衝液又はそれらの組み合わせを使用することによる標準的な洗浄手順後に再利用可能である。特定の態様においては、マイクロウェルアレイは、例えばオートクレーブ又はUV照射の使用により滅菌することが適切である。

0165

一態様においては、マイクロウェルは、細胞の係留又は他の固定化のために機能化又は別様に処置される。

0166

各マイクロウェルは、付随する捕捉剤アレイの全領域にわたって個々の細胞又は細胞集団を捕捉及び拘束するように構成される。例えば、各マイクロウェルは、特にマイクロウェルが所望数の特定の細胞型の細胞を含むように設計することができる。特定の態様においては、各マイクロウェルは、1、2、3、5、10、15、20、50又は100個の細胞を含む。特定の態様においては、各マイクロウェルは、単一細胞を含むように構成されている。本明細書で用いられる場合、単一細胞は、任意の細胞型又は細胞株の1個の細胞として定義される。特定の態様においては、細胞は分泌性細胞である。他の態様においては、細胞は非分泌性細胞である。好ましい態様においては、装置の実行時間の一部、ほとんど又は全てにおいて、単一細胞は生存したままである。更に好ましい態様においては、単一細胞は、装置の実行の全ての期間で生存したままである。例えば、特定の態様においては、装置は、単一細胞から分泌されるタンパク質のプロファイルを24時間試験するために使用される。マイクロウェルは、単一細胞が24時間生存することを可能にすることが好ましい。

0167

一態様においては、マイクロウェルアレイは、マイクロウェルアレイが捕捉剤アレイに固定された時に、それぞれの個々のマイクロウェル、そこに含まれる細胞及びタンパク質が、捕捉剤フィーチャ(例えば、ライン、ドット等)の少なくとも1つの完全なセットと接触し、複数の捕捉剤の全てがマイクロウェルの内容物にアクセス可能にするように、捕捉剤アレイと適合性であるように構成されている。

0168

捕捉剤アレイ
特定の態様においては、本発明の装置は捕捉剤アレイを有する。捕捉剤アレイは、複数の捕捉剤のセットを有し、各捕捉剤のセットは、化合物の多重検出に好ましい複数の捕捉剤の全てを有する。本明細書の他の場所に記載したように、各セットは、1個のマイクロウェルの内容物にアクセス可能なように構成されている。特定の態様においては、捕捉剤アレイは、捕捉剤セットの繰り返しを有する。

0169

一態様においては、各セットは他の全てのセットから空間的に異なっている。一態様においては、各セットは約10〜100μm分離されている。

0170

一態様においては、捕捉剤アレイは、10〜1,000,000個の個々の捕捉剤セットを有する。他の態様においては、捕捉剤アレイは、約500〜500,000個の個々の捕捉剤セットを有する。他の態様においては、捕捉剤アレイは、約100〜100,000個の個々の捕捉剤セットを有する。

0171

各セットは、上述したように、1個以上のマイクロウェルと対応するような大きさであり、形状である。例えば、一態様においては、各セットは1個のマイクロウェルに対応している。マイクロウェルアレイを捕捉剤アレイと接触させることにより装置を構築することで、複数のインターフェースが形成され、各インターフェースはマイクロウェル及びセットを有している。装置は各マイクロウェルの内容が本明細書の他の場所に記載されるように、セットに含む全ての分離フィーチャにアクセス可能でなければならないという点で、制限されるだけである。特定の態様においては、各セットは、望ましい多重化サイズを基準として構成されている。したがって、一態様においては、各セットは所定の長さ及び幅を有する長方形である。

0172

一態様においては、各セットは長さが1〜10,000μmである。他の態様においては、各セットは長さが5〜5,000μmである。他の態様においては、各セットは長さが10〜2,000μmである。

0173

一態様においては、各セットは幅が1〜1,000μmである。他の態様においては、各セットは幅が5〜500μmである。他の態様においては、各セットは幅が10〜100μmである。

0174

図23Aに示すように、特定の態様においては、各セット21は、1種以上の異なる固定化捕捉剤を含む複数の空間的分離フィーチャ22を有する。装置10は、各マイクロウェル11の内容物が複数のフィーチャ22のそれぞれにアクセス可能なように、各セット21及び各マイクロウェル11の間にインターフェース101が形成されるように構築されている。例えば、一態様においては、セット21は複数のフィーチャ22を有し、各フィーチャ22はラインであり、各ラインは1種以上の固定化捕捉剤を含んでいる。フィーチャ22はあらゆる特定の大きさ又は形状に限定されない。例えば、一態様においては、フィーチャ22は直線である。他の態様においては、フィーチャ22はジグザグ形の線である(図23に示す)。各フィーチャ22は、関心のある化合物を検出するための、1種以上の固定化捕捉剤を含む。例えば、一態様においては、セット21は、20種の個々のフィーチャ22を有し、各フィーチャは、関心のある20種の化合物のうちの1種を検出するための特異的捕捉剤を含んでいる。一態様においては、1個のフィーチャ22に固定化された捕捉剤は、他のフィーチャ22には含まれていない。したがって、本明細書の他の場所に記載されたように、特定のフィーチャ22と結合する化合物を検出することにより、関心のある特定の化合物の存在に関する情報が提供される。

0175

図23Bは、複数の分離フィーチャ122を有する他の態様を示す。この態様においては、各フィーチャ122は異なる形状又は形態を有する。各フィーチャ122は、特定の形状のフィーチャ122内に固定された、1種以上の固定化捕捉剤を含む。非常に高解像度でフィーチャの大きさ及び形状を製造するために、マイクロパターニング技術を使用することができる。典型的な技術としては、マイクロインジェクトプリンティング、マイクロコンタクトプリンティングディップペンリソグラフィマイクロチャンネルガイドフローパターニング等が挙げられる。しかし、装置は、捕捉剤を分離フィーチャに固定する任意の特定の方法に限定されない。例えば、図24は、四角形又はひし形に配置された捕捉剤を含む典型的な捕捉剤アレイを示す。このアレイは、クロスフローパターニング技術により製造され、マイクロスポッティング及びインジェクトプリンティング等のマイクロスケールプリンティング技術によっても製造することができる。

0176

分離フィーチャは、各マイクロウェルにどの化合物(又は化合物の組み合わせ)が存在するかの検出を可能にする。例えば、フィーチャの空間的位置、フィーチャの形状、及び/又はそれらの組み合わせは、どの関心のある化合物(又は関心のある化合物の組み合わせ)がフィーチャに固定された特定の捕捉剤と結合したかを特定するために使用される。更に、各セットが個々のマイクロウェルに対応しているので、捕捉剤アレイ上の捕捉剤セットの空間的位置は、化合物(又は化合物の組み合わせ)がどの個々のマイクロウェルに存在したかの検出を可能にする。したがって、これは、各マイクロウェルの内容物に由来する個別化されたプロファイルの検出を可能にする。特定の態様においては、分離フィーチャは繰り返し、マイクロウェルあたりに少なくとも1セットの完全な分離フィーチャが含まれる。一態様においては、例えば対照として、各マイクロウェル内に2個以上のセットを含んでいてもよい。

0177

一態様においては、本明細書の他の場所に記載されているように、関心のある結合化合物の検出は、ELISAをベースとする免疫測定法を用いて行われる。重要なことに、識別可能な分離フィーチャ(空間的に識別可能、及び/又は形状若しくは形態により識別可能)を使用することにより、各化合物に対して独自の二次抗体標識を必要としないので、単一細胞由来の多くの化合物の多重検出が可能になる。このタイプの「空間的符号化」により、従来のELISAにおけるような、化合物に対して特異的な各二次捕捉剤の特異的標識よりもむしろ、特定のマイクロウェルとインターフェース形成する分離フィーチャのセット内の空間的位置との結合の観察からの各マイクロウェルについての関連する分泌された化合物の検出を可能にする。例えば、従来の試験は、標識を関心のある特定の化合物と相関させるために、検出可能な標識に対する1:1の化合物の関係を必要とする。本明細書に記載されるように、分離フィーチャを使用することにより、各化合物を同じ検出可能な標識(又は本明細書の他の場所に記載したスペクトル試験を使用する少なくとも同じグループの標識)と関連させることが可能になる。

0178

本明細書の他の場所に記載されているように、各特定の捕捉剤は、関心のある化合物(タンパク質、抗原、受容体、核酸等)と特異的に結合する。各分離フィーチャは、捕捉剤のセット内に所定の空間的位置及び/又は形状を有しているので、関心のある特定の化合物が対応するマイクロウェル中に存在するかを容易かつ有効に検出することが可能になる。例えば、一態様においては、各分離フィーチャは、お互いに約2〜25μm離れている。一態様においては、各セットは、複数の分離フィーチャの少なくとも1個を有する。すなわち、各分離フィーチャは各セット内に少なくとも1回出現する。

0179

ある態様においては、1種以上の分離フィーチャが各インターフェース内で複数回繰り返される。例えば、一態様においては、インターフェースは、複数のセットとインターフェース形成する1個のウェルを有していてもよい。一態様においては、各セットは、合計で約5〜100個の異なる捕捉剤を含む。他の態様においては、各セットは合計で約10〜75個の異なる捕捉剤を含む。他の態様においては、各セットは合計で約20〜50個の異なる捕捉剤を含む。例えば、一態様においては、本発明は、各セットが45種の異なる捕捉剤を含む、45重の化合物の検出を提供する。

0180

一態様においては、各セットは約5〜100個の分離フィーチャを有する。他の一態様においては、各セットは約10〜50個の分離フィーチャを有する。他の一態様においては、各セットは約20〜30個の分離フィーチャを有する。

0181

特定の態様においては、分離フィーチャは、複数の捕捉剤セットにわたって連続的である。例えば、一部の製造技術において、複数のセットにまたがる連続的ライン又は形状を製造することが容易であり得る。捕捉剤アレイをマイクロウェルアレイと接触させることにより、個々のマイクロウェルに対応する個々のセットにおいて連続フィーチャ分断される。他の態様においては、捕捉アレイは、分離フィーチャが非連続的で、その結果、マイクロウェルと捕捉剤セット間のインターフェースに対応するであろう位置にのみ配置されるように製造される。

0182

特定の態様においては、各分離フィーチャ(例えば、線、形等)は1種の特定の捕捉剤を含む。他の態様においては、各分離フィーチャは、2、3、5、10、又はそれ以上の異なる捕捉剤を含む。これらの態様においては、フィーチャ内の特定の捕捉剤への特異的結合は、本明細書で「スペクトル符号化」と名付けた、各標識が特定の捕捉剤に対応する、ELISAをベースとする試験で使用される第2の捕捉剤のセットにおける異なる検出可能な標識を使用することによって検出される。

0183

例えば、一態様においては、アレイは、15種のフィーチャ(例えば、ライン、ドット等)を有する少なくとも1つのセットを有する。一態様においては、第1のフィーチャは、1分子以上の第1の捕捉剤を含み、第2のフィーチャは、1分子以上の第2の捕捉剤を含み、第3のフィーチャは、1分子以上の第3の捕捉剤を含む、などである。これは、1分子以上の15種の捕捉剤を含む第15のフィーチャまで繰り返される。

0184

一態様においては、各フィーチャは1種超の捕捉剤を含む。例えば、一態様においては、第1のフィーチャは1分子以上の第1の捕捉剤、1分子以上の第2の捕捉剤、及び1分子以上の第3の捕捉剤を含むが、第2のフィーチャは1分子以上の第4の捕捉剤、1分子以上の第5の捕捉剤、及び1分子以上の第6の捕捉剤を含む。これは、1分子以上の第43の捕捉剤、1分子以上の第44の捕捉剤、及び1分子以上の第45の捕捉剤を含む第15のフィーチャまで繰り返される。この態様においては、フィーチャ内の各捕捉剤は、本明細書の他の場所で記載されたようなスペクトル符号化として定義される、捕捉剤を標的とする第2の捕捉剤の色で識別可能である。

0185

例えば、一態様においては、分離フィーチャは、関心のある3種の化合物にそれぞれ特異的な3種の捕捉剤を含む。マイクロウェル中に関心のある3種の化合物(又は関心のある化合物の組み合わせ)のいずれが見いだされるかの検出は、ELISAをベースとする反応において固定化された捕捉剤に、赤い標識で標識されたもの、緑色の標識で標識されたもの、及び青い標識で標識されたものの3種の異なる捕捉剤の第2のセットを適用し、フィーチャにおいて検出可能な複合体を形成することによって行われる。したがって、捕捉剤アレイにおける各分離フィーチャの空間的位置で赤、緑及び青の標識の存在を検出することにより、関心のある3種の化合物(又はその組み合わせ)のいずれが分離フィーチャに存在するかを判定することが可能になる。この原理を、捕捉剤セット内に存在する全ての分離フィーチャにわたって規模を拡大することにより、非常に多くの種類の化合物の多重検出が可能になる。例えば、装置が製造され、60種までの化合物を検出したことが証明された。

0186

特定の態様においては、本発明は、関心のある化合物の空間的及びスペクトル的多重化を提供する。例えば、一態様においては、多重化する能力は、捕捉剤セットあたりの空間的に識別可能な分離フィーチャの数によって部分的に定義される。一態様においては、各分離フィーチャは、幅が約5〜50μmである。一態様においては、各分離フィーチャは、幅が約25〜30μmである。一態様においては、各分離フィーチャは、長さが約500〜2000μmである。一態様においては、各分離フィーチャは、約5〜50μm離れている。一態様においては、各分離フィーチャは、約25〜30μm離れている。一態様においては、各分離フィーチャは幅が約25μmであり、次のフィーチャから約25μm離れており、その結果、約50μmのピッチサイズをもたらす。本発明は、非常に小さい空間的に識別可能な分離フィーチャを生成し、それによって、装置の空間的多重能力を増大する能力を証明した。

0187

一態様においては、多重能力は、各分離フィーチャが1種超の捕捉剤を含み、それによって分離フィーチャあたり1種超のタイプの関心のある化合物の検出を可能にするように使用される、スペクトル的に異なる標識の数によって定義される。例えば、一態様においては、捕捉剤アレイセットは15種の空間的に異なるフィーチャを含み、各フィーチャは3種の捕捉剤を含み、異なる検出可能な標識に連結した3種のELISAをベースとする第2の捕捉剤の使用を通して識別可能である。したがって、この構成は45重の検出を可能にする。

0188

捕捉剤アレイは、単一細胞を分離するマイクロウェルに連結することにより、単一細胞あたりの分泌物高感度の多重定量分析を実施する。繰り返しのセットは、設計の均一性のために、各マイクロウェル間で正確さが著しく異なることなく、単一細胞あたり5〜100種の範囲の化合物の十分な検出が各マイクロウェルにより可能になるのに役立つ。

0189

分離フィーチャ及びセットにおける捕捉剤のパターニングは、任意の適切な技術により実施される。例えば、捕捉剤パターニングは、インクジェットプリンティングファインプリントスポッティング、機能化された基板でのフローパターニング、機能化されたガラス基板での密着プリンティング、又は2〜30μmのフィーチャ解像度印点針(printing needle)又はストリップを用いたエポキシコーティングガラス基板若しくはポリアミンガラス基板を使用するマイクロプリンティングにより、高精度で実施することができる。特定の態様においては、機能化された基板はポリ−L−リジンで被覆した基板を含む。しかし、本発明のアレイの限定的な交差反応性を有する捕捉剤に、高度の再現性をもって捕捉剤を固定するために物理的及び/又は化学的親和性をもたらす、任意の機能化された基板を使用してもよい。

0190

上述したように、各捕捉剤のセットは複数の捕捉剤を有し、各捕捉剤は、所望の実施において試験される関心のある化合物に特異的に結合する。関心のある典型的な化合物としては、タンパク質、ペプチド、抗体、酵素表面受容体、核酸、ペプチド断片、サイトカイン、増殖因子、ホルモン等があげられるが、これらに限定されない。特定の態様においては、関心のある化合物又は複数の化合物は、装置のマイクロウェル内に含まれる細胞又は複数の細胞によって分泌されることが知られているか、分泌すると考えられる化合物である。しかし、本発明は、分泌性化合物の検出に限定されず、どちらかといえば捕捉剤アレイにアクセス可能な任意の化合物であってもよい。例えば、関心のある化合物としては、細胞死又は後の使用者の操作のいずれかによる、細胞の溶解によりアクセス可能なものが含まれる。

0191

捕捉剤としては、抗体、抗体断片、タンパク質、ペプチド及び核酸が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様においては、捕捉剤は、その標的化合物に対し、約1pM〜約150pMの捕捉親和性を有する。本明細書の他の場所で記載されたように、アレイ上に固定化された捕捉剤とその標的化合物との結合の検出は、第2群の捕捉剤を使用するELISAをベースとする結合(ここで、各第2群の捕捉剤が捕捉剤−化合物複合体と特異的に結合する)により実施される。特定の態様においては、第2群の捕捉剤の各構成要素は、色素又はフルオロフォアが挙げられるが、これらに限定されない検出可能な標識で標識されている。二次捕捉剤としては、抗体、抗体断片、タンパク質及び核酸を挙げることができる。ある態様においては、二次捕捉剤は、捕捉剤アレイの固定化捕捉剤と特異的に結合する。他の態様においては、検出抗体等の二次捕捉剤は、関心のある化合物と特異的に結合する。

0192

一態様においては、本発明の捕捉剤はペプチドを含む。特定の態様においては、ペプチド捕捉剤は、関心のある化合物、例えば関心のある分泌された化合物と特異的に結合する。

0193

本発明のペプチドは、化学的方法を用いて製造することができる。例えば、ペプチドは、固相法(Roberge J Y et al.(1995)Science 269:202-204)により合成し、樹脂から切断し、調製用高速液体クロマトグラフィーにより精製することができる。自動化合成は、例えば、製造業者により供給されている説明書に従い、ABI431 A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)を用いて実施することができる。

0194

また、ペプチドは組換え手段、又はより長いポリペプチドを切断することにより製造することができる。ペプチドの組成は、アミノ酸分析又は配列決定により確認することができる。

0195

本発明のペプチドの変異体は、(i)1個以上のアミノ酸残基が保存又は非保存アミノ酸残基(好ましくは保存アミノ酸残基)と置換されており、このような置換されたアミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされているか、若しくはされていないもの、(ii)1個以上の修飾アミノ酸残基があり、例えば置換基の結合により修飾されているもの、(iii)ペプチドが本発明のペプチドの他のスプライスバリアントであるもの、(iv)ペプチド断片、及び/又は(v)ペプチドが、他のペプチド、例えば、精製(例えば、Hisタグ)又は検出(例えば、Svエピトープタグ)のために使用される、リーダー配列又は分泌配列と融合しているものであってもよい。断片としては、最初の配列のタンパク質切断(多部位タンパク質分解を含む)により生成するペプチドが挙げられる。変異体は、翻訳後修飾又は化学的修飾であってもよい。このような変異体は、本明細書の教示から、当業者の範囲内であるとみなされる。

0196

当該技術分野において公知であるように、2つのペプチド間の「類似性」は、1つのペプチドのアミノ酸配列及びその保存アミノ酸置換基と第2のペプチドの配列の比較により決定される。変異体は、最初の配列から異なるペプチド配列、好ましくは関心のある断片あたり40%未満の残基において最初の配列から異なり、更に好ましくは関心のある断片あたり25%未満の残基において最初の配列から異なり、更に好ましくは関心のある断片あたり10%未満の残基において最初の配列から異なり、最も好ましくは関心のある断片あたりわずか数個の残基において最初の配列から異なり、同時に最初の配列と十分に相同的であり、最初の配列の機能性を保存している配列を含むと定義される。本発明には、最初のアミノ酸配列と60%、65%、70%、72%、74%、76%、78%、80%、90%又は95%類似又は同一であるアミノ酸配列が含まれる。2つのペプチド間の同一性の程度は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズム及び方法を用いて決定される。2つのアミノ酸配列の同一性は、好ましくはBLASTPアルゴリズム[BLAST Manual,Altschul,S.et al.,NCBINLM NIH Bethesda,Md.20894, Altschul,S.et al.,J.Mol.Biol.215:403-410 (1990)]を用いることにより決定される。

0197

本発明のポリペプチドは翻訳後に修飾されてもよい。例えば、本発明の範囲内である翻訳後修飾としては、シグナルペプチド切断、グリコシル化アセチル化イソプレニル化、タンパク質分解、ミリストイル化、タンパク質折りたたみ、及びタンパク質分解プロセシング等が挙げられる。一部の修飾又はプロセシング事象は、追加の生物学的機構の導入を必要とする。例えば、シグナルペプチド切断及びコアグリコシル化等のプロセシング事象は、標準的な翻訳反応に、イヌミクロソーム膜又はツメガエル抽出物を加えることによって検査する(米国特許第6,103,489号)。

0198

本発明のペプチドは、翻訳後修飾、又は翻訳の際に非天然のアミノ酸を導入することにより生成される非天然のアミノ酸を含んでいてもよい。

0199

一態様においては、本発明の捕捉剤は、抗体、又は抗体断片を含む。特定の態様においては、抗体捕捉剤は、関心のある化合物、例えば関心のある分泌化合物と特異的に結合する。

0200

このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらのFab及び一本鎖Fv(scFv)断片、二重特異性抗体ヘテロ複合体(heteroconjugate)、ヒト抗体及びヒト化抗体が挙げられる。このような抗体は、ハイブリドーマ培養、細菌又はほ乳動物細胞培養における組換え体発現、並びに形質転換動物における組換え体発現を含む種々の方法により製造することができる。製造方法の選択は、所望の抗体の構造、抗体上の炭水化物部分重要性、培養及び精製の容易さ、並びに費用を含むいくつかの因子に依存する。全長抗体、Fab及びFv断片のような抗体断片、並びに異なる種由来の成分を含むキメラ抗体を含む多くの異なる抗体構造は、標準的な発現技術を用いて生成することができる。エフェクター機能を有さず、薬物動態活性が制限されているFab及びFv等の小さいサイズの抗体断片は、細菌発現系において生成することができる。一本鎖Fv断片は免疫原性が低い。

0201

一態様においては、本発明の捕捉剤は、例えば、DNAオリゴヌクレオチド及びRNAオリゴヌクレオチドを含む、分離された核酸を含む。特定の態様においては、核酸捕捉剤は、関心のある化合物、例えば、関心のある分泌された化合物と特異的に結合する。例えば、一態様においては、核酸は、関心のある化合物と特異的に結合するヌクレオチド配列を含む。例えば、一態様においては、核酸は、関心のある分泌核酸と相補的である。

0202

また、核酸捕捉剤のヌクレオチド配列は、得られた核酸は最初のものと同様に機能し、関心のある化合物と特異的に結合する条件で、最初のヌクレオチド配列に関して配列の変異、例えば、1個以上のヌクレオチドの置換、挿入及び/又は欠失を含んでいてもよい。

0203

本明細書で用いられる意味において、ヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列について少なくとも60%、有利には少なくとも70%、好ましくは少なくとも85%、更に好ましくは少なくとも95%の同一性の程度を有する場合、ヌクレオチド配列は、本明細書に開示されるヌクレオチド配列のいずれかと「実質的に相同的」である。可能な修飾の他の例としては、配列中の1個以上のヌクレオチドの挿入、配列のいずれかの末端における1個以上のヌクレオチドの付加、又は配列のいずれかの末端又は内部における1個以上のヌクレオチドの欠失が挙げられる。2つのポリヌクレオチド間の同一性の程度は、当業者に広く知られているコンピュータアルゴリズム及び方法を用いて決定される。2つのアミノ酸配列間の同一性は、好ましくはBLASTNアルゴリズム[BLAST Manual,Altschul,S.et al.,NCBINLM NIH Bethesda,Md.20894, Altschul,S.et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)]を用いることにより決定される。

0204

多重検出のためのシステム
一態様においては、本発明は、単一細胞により分泌される化合物の多重検出用システムを含む。特定の態様においては、システムは、本明細書の他の場所に詳細に説明した装置を有する。すなわち、一態様においては、システムは、上述したマイクロウェルアレイ及び捕捉剤アレイを有する装置を有している。

0205

一態様においては、システムの装置は複数のセットを有する捕捉剤アレイを有し、各セットは複数の分離フィーチャを有し、各フィーチャは関心のある特定の化合物と結合する1種以上の固定化捕捉剤を有する。

0206

一態様においては、システムは、単一細胞の集団を捕捉剤アレイの固定化捕捉剤とインキュベーションした後に装置に投入される、一群の二次捕捉剤を含む。二次捕捉剤は、固定化捕捉剤、関心のある化合物、又は固定化捕捉剤−化合物複合体と特異的に結合する。すなわち、二次捕捉剤はサンドイッチ型試験において使用され、特定の態様においては、捕捉剤アレイと結合した化合物の検出を補助する。

0207

特定の態様においては、二次捕捉剤には、抗体、抗体断片、タンパク質、ペプチド及び核酸が含まれる。一態様においては、二次捕捉剤は検出可能な標識で標識されている。固定化捕捉剤−化合物複合体との結合に特異的な二次捕捉剤は、蛍光標識、放射標識、強磁性標識、常磁性標識、発光標識、電気化学発光標識、リン光標識、呈色標識等が挙げられるが、これらに限定されない任意の検出可能な標識で標識することができる。蛍光標識の非限定的例としては、緑色蛍光タンパク質(GFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、オレンジ色蛍光タンパク質(OFP)、eGFP、mCherry、hrGFP、hrGFPII、ストレプトアビジンAPC、Alexa488、Alexa532、Alexa594等が挙げられる。また、蛍光標識は、例えば、キンドリングレッド蛍光タンパク質(KFP−red)、PS−CFP2、Dendra2、CoralHue Kaede及びCoralHue Kikume等の光で変換され得るものであってもよい。

0208

一態様においては、二次捕捉剤は、例えばペプチド又は他のエピトープを含むタグ領域で標識される。例えば、一態様においては、二次捕捉剤は、蛍光標識されたストレプトアビジン、又は他の検出可能な標識ストレプトアビジンの使用が、ビオチン化された二次捕捉剤を可視化するために使用されるように、ビオチンで標識される(すなわち、ビオチン化)。

0209

一態様においては、全ての二次捕捉剤は同一の検出可能な標識で標識されている。他の態様においては、二次捕捉剤は、1種の二次捕捉剤の結合を他から識別するために別々に標識されている。一態様においては、捕捉剤アレイに固定された各捕捉剤は、所定のフィーチャにおける各捕捉剤が異なる対応する標識を有するように、対応する標識されたELISA検出二次捕捉剤に割り当てられている。特定の態様においては、所定のフィーチャ内の複数の固定化捕捉剤に対応する複数の標識は、本明細書に記載のスペクトル符号化態様の間、いかなる交差反応性も示さない。

0210

例えば、一態様においては、一群の二次捕捉剤は1以上のサブグループを有し、各サブグループは特定の検出可能な標識を有している。したがって、システムは、各サブグループからの二次捕捉剤が、特定のフィーチャで形成された1個の特異的固定化捕捉剤−化合物複合体と結合するように構成されている。したがって、例えば、所定のマイクロウェル内に全ての化合物が存在する場合、種々の検出可能な標識の全ては各フィーチャで観察される。別々に標識された二次捕捉剤によれば、所定の化合物の存在のスペクトル的符号化が可能になる。すなわち、標識の空間的位置と正確なタイプ(すなわち、色)の組み合わせにより、存在する化合物が特定される。

0211

一態様においては、システムは、各検出可能な標識の正体及び位置を検出するための検出器を有する。検出器は、蛍光顕微鏡蛍光検出器、又は蛍光スキャナーが挙げられるが、これらに限定されない各標識を検出可能な任意の適切な検出器であってもよい。

0212

一態様においては、システムはコンピュータデバイスを有している。コンピュータデバイスは、デスクトップコンピュータラップトップコンピュータタブレットスマートフォン、又は他のデバイスを有していてもよく、システム要素を制御し、生データを表示し、得られたデータを解析するためのソフトウェアプラットホームを有している。コンピュータデバイスは、少なくとも1つのプロセッサ、標準的な入出力装置、並びにデータを記憶し、プログラムを実行し、ネットワークによりデータを送受信するためのコンピュータデバイスに通常に見られる全てのハードウェア及びソフトウェアを有していてもよい。

0213

特定の態様においては、本発明のシステムは、アレイからの検出シグナルを検出及び定量するハードウェア及びソフトウェアを有している。シグナルは、任意の適切な解析ソフトウェアパッケージを用い、又はオーダーメイド解析アルゴリズムを用いて定量することができる。データの典型的な解析及び図による出力を、本明細書の他の場所に示す。

0214

多重検出方法
本発明は、少量の試料中の関心のある多種類の化合物を同時に検出する方法を提供する。例えば、一態様においては、本発明は、本明細書の他の場所で説明したように、マイクロウェル中に収容されている単一細胞由来のタンパク質の多重検出を可能にする。特定の態様においては、この方法は、細胞の集団からのプロファイルよりも好ましい単一細胞由来の個別化プロファイルの決定を可能にする。個々の細胞からのプロファイルを識別する能力は、全集団内に隠れている、特定の細胞の表現型を決定するのに役立つ。例えば、これは、他の方法では検出が困難であるか又はほとんど不可能な組織試料中のがん性細胞、悪性細胞、又は転移性細胞の検出に有用である。特定の態様においては、方法は、集団をベースとする試験よりも多くの情報を提供する、平均的な単一細胞のパラメータを計算する能力を提供する。このような解析は、例えば、亜集団及び/又はグループ化した表現型の特定に使用することができる。単一細胞多重化パラメータによってグループ化された、個々の細胞の亜集団を単離することは、組織試料中の悪性がん細胞及び応答免疫細胞の重要な活性群の分離に役立ち得る。したがって、本発明の多重化能力によれば、表現型サブタイプの単離又は特定が可能になる。例えば、方法は、集団内の所定の表現型の相対量を特定する。更に、このような解析によれば、分泌された化合物又は細胞性生成物相互相関の定量、集団又はチップ全体の化合物の分布統計の作成、及び試験を行った集団の全体にわたる単一細胞レベルで発現する多機能性の評価(これらに限定されない)が可能になる。

0215

一態様においては、方法は、単一細胞を、本明細書に開示されたマイクロウェルに積載することを含む。本発明の装置によれば、マイクロウェル積載が能動的な流体工学(すなわち、ポンプ高圧流など)、又は生きた細胞の外力操作を必要としないことが可能になる。どちらかといえば、方法は、重力のみを用い、単一細胞をマイクロウェルに積載することを含む。これにより、時間がかかり、及び/または費用のかかる可能性のある、大規模な操作なしで、単一細胞を生きた状態で分離し、プロファイリングする方法が可能になる。

0216

本発明の方法によってプロファイリングされる細胞は、任意の適切な細胞型であってもよい。検討のための適用可能な細胞としては、接着細胞及び非接着細胞初代細胞及び不死化細胞株器官組織由来の細胞、並びにエクスビボで増殖した細胞が挙げられる。特定の態様においては、細胞は、細胞を含む溶液の形態でマイクロウェルに投与される。例えば、溶液は、単一細胞懸濁液、培地細胞懸濁液、細胞を自然に含む生理的流体であってもよい。細胞は、細胞株由来であっても、ヒトを含む対象から分離されたものであってもよい。一態様においては、溶液は、対象から分離された組織に由来する。例えば、溶液は、ホモジナイズされた組織に由来する。

0217

一態様においては、細胞をマイクロウェルに積載する方法は、細胞を含む溶液を、マイクロウェルアレイの湿潤した表面に直接加えることを含む。例えば、マイクロウェルアレイの表面を、水、生理食塩水、緩衝液、又は適切な細胞培養用培地で湿潤させてもよい。一態様においては、添加は、表面の上方少なくとも約0.1mm、マイクロウェルアレイのほぼ中央で1回の動きで実施される。表面への溶液の添加は、標準的な細胞培養調製について当該技術分野で公知の任意の標準的ピペット操作又は液体移動法により実施することができる。マイクロウェルアレイ表面に加える溶液の体積は、利用可能な多重解析手段と比較して最小量である。一態様においては、方法は、表面に約1〜500μLを投与することを含む。溶液中の細胞の数は、細胞の入手可能性及び所望の処理量に依存する。例えば、溶液は103、102又は101個ほど少ない細胞を含んでいてもよい。マイクロアレイ表面に溶液を加えることにより、溶液の細胞は重力のみによってそれぞれ個々のマイクロウェル中に入り、ウェルあたりの細胞のポアゾン分布を示す。特定の態様においては、0個の細胞又は複数の細胞を含むウェルは、後に解析から除外することができ、又は対照及び/又はバックグラウンド信号処理に含まれる。

0218

特定の態様においては、実施の間、溶液は、細胞の生存及び/又は正常な機能を促進する1種以上の成分を含んでいる。例えば、溶液は、細胞培養において通常に使用される増殖因子、ホルモン、タンパク質、酵素、低分子、抗菌剤等を含んでいてもよい。ある態様においては、溶液は適切な細胞培養用培地を含む。ある態様においては、溶液は、その効果が本発明の実施の際に試験が望まれる試薬、又は試験化合物を含む。例えば、試薬は、低分子、タンパク質、核酸、ペプチド等を含んでいてもよく、検出プロファイルにおいて効果を有していても有していなくてもよい。例えば、試薬は、関心のある1種以上の化合物の分泌を増大させてもさせなくてもよく、又は関心のある1種以上の化合物の分泌を減少させてもさせなくてもよい。

0219

方法は、更に捕捉剤アレイをマイクロウェルアレイと接触させることを含む。対応する捕捉剤アレイのセットとの個々のマイクロウェルの整列による、マイクロウェルアレイと捕捉剤アレイとの間の正しいインターフェースの形成は、一態様においては、統合された装置筐体を用い、加圧されたクランプ機構により、実施される。しかし、マイクロウェルアレイと捕捉剤アレイとの正確な整列が必須でないことは本明細書に言及されている。例えば、アレイの均一性は、捕捉アレイ上の特定のセットと特定のマイクロアレイが整列することを必ずしも必要としない、厳密でない整列を可能にする。更に、特定の態様においては、実験後に実施する自動化分析は、正しくない整列を克服し得る、シグナルの照合を実施する。しかし、本発明の方法は、このインターフェースを形成する任意の特定の方法に限定されない。例えば、持続性及び非持続性の接着剤ネジ、クランプ等を使用することもできる。

0220

この積載法は、両者ともマイクロウェルあたりの単一細胞の平均数を示す、個々の細胞の大きさ及びマイクロウェルの大きさに全く依存する。ある態様においては、本明細書に記載された積載法は、マイクロウェルあたり約0〜20個の細胞の拘束を確実にする。ウェルあたりの細胞の数の全体の分布はポアソン分布に近づく。

0221

一態様においては、細胞は、単一又は複数の時点にわたる所望の期間、装置内に拘束される。一態様においては、方法は、細胞を装置内に約1分、5分、10分、30分、1時間、2時間、4時間、8時間、16時間、1日、2日、4日、1週間、2週間、1ヶ月、1年、又はそれ以上拘束する。

0222

一態様においては、方法は、各マイクロウェル内の細胞の数及び位置を記録する画像を取得することを含む。特定の態様においては、これにより、決定されたプロファイルが、単一細胞によって産生されたのか、又は単一細胞の集団によって産生されたのかの決定が可能になる。画像の取得は、当該技術分野で公知のあらゆる方法で実施することができる。

0223

一態様においては、所望の時間の経過後、装置は捕捉剤アレイを除去するために分解される。その後、捕捉剤アレイを公知のELISA免疫試験手段に供し、化合物結合部位で検出可能な複合体を生成させる。例えば、一態様においては、本明細書の他の場所で記載されたように、それぞれが異なる固定化捕捉剤−化合物複合体に特異的な複数の二次捕捉剤が、特異的結合を促進するための適切な条件下、捕捉剤アレイの表面に適用される。本明細書の他の場所に説明したように、各二次捕捉剤は、検出可能な標識、例えば蛍光標識で標識される。特定の態様においては、複数の二次捕捉剤のそれぞれは、全て同じ標識で標識されている。他の態様においては、二次捕捉剤は、同じ空間的位置で生成した可能性のある複合体間でスペクトル的に識別するために異なる標識で標識されている。

0224

一態様においては、一群の二次捕捉剤を適用した後、捕捉剤アレイは、異なる空間的位置の1種以上の検出可能な標識の存在について画像化される。図25は、(1)マイクロウェルあたりの細胞の存在及び/又は量を検出するために使用した一群のマイクロウェルの明視野画像、(2)特定の空間的位置(各位置が関心のある特定の化合物に対応している)において検出可能な標識の存在を検出するための蛍光画像、並びに(3)明視野及び蛍光画像のオーバーレイを示す読み取り図である。

0225

捕捉剤アレイの画像化は、当該技術分野で公知の任意な適切な方法で実施することができる。例えば、特定の態様においては、捕捉剤アレイの画像化は、蛍光顕微鏡、蛍光検出器、及び/又は蛍光スキャナーの使用を含む。その後、各捕捉剤セットの空間的フィーチャが検出可能な標識を有するかの決定を含む画像解析は、各セットからの多重化プロファイル、したがって各マイクロウェル由来のプロファイルに対応するプロファイルを構築するために使用される。特定の態様においては、複数の検出可能な標識を使用する場合、画像は解析の前に色と組み合わせてもよい。

0226

単一細胞の表現型の決定法
本発明は、単一細胞プロファイルを明らかにするための方法を提供する。例えば、一態様においては、本発明は、単一細胞からのプロテオミクスプロファイルを決定する方法を提供する。他の態様においては、本発明は、単一細胞からのゲノムプロファイルを決定する方法を提供する。他の態様においては、本発明は、単一細胞からのセクレトーム(すなわち、分泌されるタンパク質及び化合物)を決定する方法を提供する。他の態様においては、本発明は、単一細胞からのプロテオミクスゲノム、及び/又はセクレトームを統合したプロファイルを決定する方法を提供する。更に、本発明の方法は、大量の単一細胞のプロファイルを同時に決定するハイスループット法を提供する。

0227

一態様においては、本発明の方法は、免疫細胞の不均一性又は多機能性を評価するために使用される。免疫細胞は、種々の感染症に対する予防及び保護において必須の役割を有している(Seder et al., 2008, Nature Reviews Immunology, 8:247)。強力なフローサイトメトリー技術を使用した免疫細胞の表現型決定が急速に開発されてきたにもかかわらず、一部はT細胞及び単球/マクロファージに含まれる非常に高レベルの細胞性不均一性のために異なる表現型の機能の十分な分析は困難なままである(Gordon et al., 2005, Nature Reviews Immunology, 5:953-964)。更に、このような不均一性は、表現型のレベルにおいてだけでなく、多様なエフェクター機能及び活性化状態によって反映されるような細胞の挙動のレベルにおいても存在する(Seder et al., 2008, Nature Reviews Immunology, 8:247)。免疫細胞は、多機能性と呼ばれる多くの機能を示し、複数の機能の組み合わせにより、単一細胞の免疫生物学、及び所定の感染症に対するこの細胞の「質」が決定される。TH1細胞の簡略化された線形分化モデルにおいては、表現型及び機能的不均一性の両方がCD4+T細胞のサイトカイン応答について観察されている。これらの細胞は、異なる段階で異なるエフェクター機能(サイトカインプロファイル)を示し、このような機能パターンは時間とともに劇的に変化することが指摘されている。複数の機能を有する細胞が、強力なエフェクターの可能性を有するメモリーCD4+T細胞として最高に役立つことも見いだされている。真実は、おそらく、この線形分化モデルよりも複雑であり、40種を超えるエフェクター機能がヘルパーT細胞と関連している。多機能性の重要性は、ノンプログレッサーAIDS患者が、プログレッサー患者と比較し、多くの種類のサイトカインを分泌するHIV特異的T細胞のレパートリーを発生したという観察によって更に実証される。しかし、単一細胞のレベルで、免疫エフェクター機能の完全なスペクトルを評価することが可能な技術はなく、これらの劇的に変化する細胞の細胞免疫学は十分に理解されていないままである。特定の態様においては、本発明の方法は、本明細書に開示されている多重システムを使用することにより、1個以上の単一免疫細胞のセクレトームを検出することにより、免疫細胞の不均一性の評価を可能にする。例えば、単一細胞のセクレトームは、未処置のままにするか、1種以上の試験化合物により刺激された時に評価することができる。したがって、これは、対象の免疫応答の質を評価するために使用することができる。

0228

単数形の「がん」という用語は決して疾患の一種ではないが、一般的アプローチを使用してがんを完全に治療することを不可能にする多くの種類の不均一な疾病状態をまぎらわしく包含する。これは、部分的には腫瘍内の著しい不均一性のためである(Furnari et al., 2007, Genes Dev, 21:2683-2710)。更に、このような不均一性は、腫瘍微少環境内の単一細胞レベルで存在しているほど根本的である。例えば、ヒトの脳の腫瘍多形性膠芽腫においては、グリオーマ細胞だけでなく、腫瘍開始免疫細胞(Bao et al., 2006, Cancer Research, 66:7843-7848;Singh et al., 2004, Nature, 432:396-401)、神経/グリア前駆細胞ニューロンアストロサイトオリゴデンドロサイト及び脳常在免疫細胞、ミクログリアなどの他の重要な細胞型が存在する。神経膠芽腫微小環境のこのような著しい不均一性及び固形ヒト腫瘍内の異なる細胞の系統関係は、腫瘍細胞の能力の重要な決定因子であり得る。個々のGBMは、さまざまな腫瘍成長パターンを促進する表現型が異なる一連の自己複製細胞型を有する(Chen et al., 2010, Cancer Cell, 17:362-375)。したがって、GMB中の神経膠腫幹細胞/開始細胞の階層的不均一構造を明らかにし、細胞−細胞相互作用ネットワークを示すことが重要である。

0229

このような相互作用は、主として種々の細胞型から分泌される可溶性メディエータに介在される。神経膠腫細胞がサイトカイン及びケモカインを分泌し、次に腫瘍形成を促進する炎症性因子を産生する、形質転換していない隣接するミクログリアを誘引及び破壊し(Leung et al., 1997, Acta Neuropathol, 93:518-527;Prat et al., 2000, Neurosci Lett, 283:177-180;Platten et al., 2003, Annals of Neurology, 54:388-392;Galasso et al., 2000, Experimental Neurology, 161:85-95)、小グリア細胞と神経膠腫細胞との間の相互のパラクリン刺激を反映する。高度に不均一な腫瘍微少環境における、このような複雑な細胞−細胞ダイアログはがん免疫細胞学における主要な支配的機構であるが、単一細胞タンパク質プロファイル、特に細胞−細胞コミュニケーションを調節するために分泌されるタンパク質のプロファイルの有益な解析を実施し得る技術を欠くため、研究をすることが困難である。特定の態様においては、本発明の方法により、微少環境における細胞−細胞シグナル伝達を評価するために、腫瘍内部又は近傍の細胞から分泌されるタンパク質の単一細胞解析が可能になる。これは、観察されるシグナル伝達の表現型に基づき、腫瘍の進行性や段階など、腫瘍の特徴づけを可能にする。

0230

本発明の装置及び方法は、任意の化合物の存在及び/又は量を決定するために使用することができる。適切なタイプの化合物としては、タンパク質、核酸、タンパク質断片、表面受容体、ホルモン、増殖因子等が挙げられる。本発明により試験される、関心のある化合物の組み合わせそのものは、最終的な使用者によって容易に調節可能であり、定義される。例えば、特定の化合物の検出は、化合物と特異的に結合する捕捉剤(例えば、抗体、ペプチド、核酸等)の入手可能性によって制限されるのみである。特定の態様においては、関心のある化合物の組み合わせは、装置のマイクロウェル内に含まれる細胞の表現型に関する情報を使用者に提供する。一態様においては、装置は、分泌可能なタンパク質の多重検出用に構成されている。例えば、一態様においては、装置は、MIF、IL−1RA、IL−15、IL−13、IL−12、IL−10、IL−8、IL−7、IL−6、IL−5、IL−4、IL−3、IL−1b、IL−1a、VEGF、PDGF、NGFβ、HGF、EGF、MCSF、SCF、MIP−1b、IL−22、TNFβ、TNFα、RANTES、MCP−1、IL−17A、TSLP、IL−27、IL−27−1、MMP9、MMP2、IL−23、IL−9、GMCSF、IFNGCSF、TGFβ、TGFα、ΜΙΡ−1a、及びIL−2の1以上の多重検出用に構成されている。

0231

本明細書に詳細に説明したように、本発明の装置及び方法は、多くの種類の化合物の多重同時検出を可能にする。分離フィーチャの空間的位置/形状及び各フィーチャ内の種々の検出可能な標識を利用することにより、特定の態様において、本発明は、20種以下、30種以下、40種以下、50種以下、75種以下、100種以下、200種以下、又はそれ以上の化合物の同時検出を可能にする。例えば、図26は、本明細書に開示される装置及び方法を用いて検出された45種の化合物の相関マップを示す。

0232

単一細胞の不均一性が、所定の組織内であってもあるので、本発明の方法は、集団内の複数の表現型の存在を迅速かつ有効に決定する強力な手段を提供する。例えば、本発明の方法及び装置は、全ての細胞が同一又は類似のプロテオミクス、ゲノム、及び/若しくはセクレトームプロファイルを共有するか、又はプロファイルが変化した集団内に分離された単一細胞が存在するかの決定を可能にする。

0233

方法は、特定の有害な表現型の存在を検出するために、特に使用することができる特徴的な細胞性表現型の決定を可能にする。単一細胞を基準とするプロファイルの決定は、その個々のプロファイルが集団プロファイルに隠されてしまう特定の表現型の決定を可能にする。更に、多くの種類の化合物の多重検出に基づくプロファイルの決定は、1又は数種の化合物のみを検出する方法において隠されてしまう表現型を特定することができる。

0234

例えば、これは、がん細胞を示すプロファイルを有する細胞の存在を決定するのに使用することができる。一態様においては、方法は、1以上の単一細胞の観察される表現型段階に基づく特定の疾患の進行を評価するために使用される。他の態様においては、方法は、がん細胞の特定の型を検出し、がん細胞の進行性又は侵襲性特徴づけるために使用することができる。他の態様においては、方法は、転移性細胞を示す表現型を有する細胞を検出するために使用することができる。例えば、本明細書に記載の単一細胞の多重プロファイリングは、腫瘍由来の単一細胞のセクレトームプロファイルを調査するために使用することができ、そのプロファイルが転移を示す個々の細胞のサブセットの存在を特定することができる。したがって、これは、そうでなければ検出することが不可能に近いであろう段階で、非常に早期の診断を可能にするであろう。

0235

本発明を、以下の実施例を参照して更に詳細に説明する。これらの実施例は説明の目的のためにのみ提供され、特に明記しない限り限定を意図するものではない。したがって、本発明は以下の実施例に限定されると解釈すべきでなく、本明細書に提供される教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈すべきである。

0236

更なる説明なしで、当業者は、説明及び以下の説明的実施例を使用し、本発明の化合物を製造及び利用し、請求項に記載の方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、特に本発明の好ましい態様を示し、いかなる方法においても開示の残りを限定すると解釈すべきでない。

0237

例1:機能的細胞不均一性を評価するための単一細胞のハイスループットセクレトーム解析
分泌されたタンパク質は、ヒトの健康及び疾患においてさまざまな細胞機能を表す。高い程度の細胞の不均一性のため、更に重要なことには、個々の細胞の多機能性のため、単一細胞由来の一連のタンパク質を同時に測定し、平行して多く(1000個超)の単一細胞を迅速に試験する、まだ満たされていない要求がある。本明細書の開示は、数千の単一細胞の高度な多重タンパク質検出を平行して行うための高密度の捕捉剤マイクロアレイを組み合わせた多くのサブナノリットルマイクロチャンバーから構成される、簡単な生物学的解析試験プラットホームである。このプラットホームは、細胞株、及び患者由来の初代細胞等の複雑な生物試料の両方について試験された。単一細胞のセクレトーム的特徴間の明らかな不均一性を、遊走性等の細胞の物理的挙動直接相関させることができることが初めて観察された。ELISpot及び先端ミクロ技術によって可能な試験のような最先端のタンパク質分泌試験と比較し、本明細書に開示されたアプローチは、ハイスループット及び高多重度の両方を提供する。また、患者の細胞機能及び免疫の有益な監視のための潜在的に革新的な手段となる、操作の容易さ、サンプ消費量の少なさ、及び標準化されたデータ分析等の臨床医に優しい多くの特徴を有している。本明細書に示されるデータの更なる説明は、全体として本明細書に組み入れられるLu et al., 2013, Anal Chem,85(4):2518-2556に見いだすことができる。
例で使用される材料及び方法を以下に説明する。

0238

捕捉剤アレイの製造
PDMSレプリカ鋳型は、深堀反応イオンエッチング(DRIE)法によりエッチングしたシリコンマスターである。これは、PDMSの離型を容易にするために、クロロトリメチルシラン(Aldrich)の蒸気で一晩前処理した。PDMSプレポリマー及び硬化剤RTV615, Momentive)を完全に混合し(部分A及びBを10:1の割合で)、シリコンマスター上に注いだ。真空乾燥機1hにより気泡を除去し、80℃のオーブンで2hr、PDMSを硬化させた。硬化後、PDMS層を鋳型から離し、入り口部及び出口部の穴をあけた。装置を、エタノール及び2−プロパノール中で超音波処理することによって洗浄し、ポリ−L−リジンマイクロアレイスライド(Erie Scientific)と結合させた。その後、アセンブリを、オーブン中、80℃で2時間焼き、結合を強化した。抗体フローパターニング用PDMSマイクロチップは、それぞれ20種までの抗体をパターニングすることができる、20個の分離されたマイクロチャンネルを有している。PDMSフローパターニングマイクロチップにおける、一連のラインの典型的な幅及びピッチは、それぞれ25μm、50μmである。

0239

捕捉剤アレイのフローパターニングのために、1.5μLの異なる抗体をマイクロチャンネルに別個に注入し、乾燥するまで微少流体チャンネルを流した。実験に使用する全ての抗体を表1に要約する。抗体をポリ−L−リジンスライドグラスに固定し、捕捉剤アレイを作製する。フローパターニング後、スライドグラスは、4℃の冷蔵庫に保存し、使用前にPDMS層をはずす。

0240

0241

サブナノリットルマイクロチャンバーアレイチップの製造
サブナノリットルマイクロチャンバーアレイの鋳型は、DRIE法によりエッチングしたシリコンマスターである。これは、PDMSの離型を容易にするために、クロロトリメチルシラン(Aldrich)の蒸気で一晩前処理した。単一細胞捕捉のためのサブナノリットル微少流体チャンバーアレイチップは、ソフトリソグラフィ技術を用いて、PDMS(RTV615, Momentive、部分A及びBを10:1の割合で)から製造した。真空乾燥機1時間により気泡を除去し、80℃のオーブンで2時間、PDMSを硬化させた。サブナノリットルマイクロチャンバーアレイチップは、カラムあたり約550個のマイクロウェルを有し、14個のカラムに5044個の細胞捕捉チャンバーを有している。結果として得られるマイクロウェルアレイの異なる空間的位置に、自動的マイクロウェル及び細胞認識のために、リソグラフィーマスクに、画像「マーカー」が含まれている。

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