図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2020年3月26日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (20)

課題

Cas9酵素ガイドRNA及び関連する特定PAMを利用するIIType II CRISPR−Casシステムを提供すること。

解決手段

1つの態様において、本開示は、ガイドRNA、単分子及び二重分子の双方のガイドRNA、並びにそのガイドRNA及び/またはそのガイドRNAをコードするDNA(ベクターを含む)を使用した細胞中で、DNAを操作する方法を提供する。ガイドRNA及びCas9エンドヌクレアーゼを含む複合体もまた、提供する。

概要

背景

RISPR−Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats−CRISPR associated proteins)の免疫原理を標的化した、RNAにガイドされたDNAを利用する遺伝子編集が、過去数か月にわたり広く利用されている(1−13)。細菌type II CRISPR−Casシステムにより与えられる主要な利点は、設定可能なDNA干渉に対する要件エンドヌクレアーゼ、Cas9、カスタマイズ可能な二重分子RNA構造)について最小限であるという点である(14)。化膿レンサ球菌の元来の第II種システムで主として実証された、trans−activating CRISPR RNA(tracrRNA)(15、16)は、Cas9の存在下でのRNaseIIIによるRNA共成熟(15−17)、及びCas9による侵入DNAの開裂(14、15、17−19)の両方に不可欠である二重分子RNA(14−17)を形成する前駆体CRISPR RNA(pre−crRNA)の不変リピート部に結合する。レンサ球菌で実証されたように、成熟した活性tracrRNA及び標的化crRNA(14−16)間に形成された二本鎖によりガイドされるCas9は、侵入してくる同種DNAにおいて、部位特異定的な二本鎖DNAdsDNA)切断を導く(14、17−19)。Cas9は、標的鎖(crRNAのスペーサー配列に対して相補的であるとして定義される)を開裂するHNHヌクレアーゼドメイン及び非標的鎖を開裂するRuvC様ドメイン(14、22,23)を使用するマルチドメイン酵素であり(14、20、21)、選択的モチーフ不活性化によりdsDNA開裂Cas9のニッカーゼへの変換を可能にする(2、8、14、24、25)。DNA開裂の特異性は、2つのパラメーター、すなわち、変動的であり、プロトスペーサーを標的化するcrRNAのスペーサー由来配列(プロトスペーサーは、crRNAのスペーサーに対して相補的である、当該DNA標的上の配列として定義される)、及びショート配列である、その非標的DNA鎖上のプロトスペーサーのすぐ下流に位置するPAM(the Protospacer Adjacent Motif)により決定される(14、18、23、26−28)。

最近の研究により、RNAにガイドされるCas9は、ヒト細胞(1、2、8、11)、マウス(9、10)、ゼブラフィッシュ(6)、ショウジョウバエ(5)、ワーム(4)、植物(12、13)、酵母(3)及び細菌(7)における効率的なゲノム編集ツールとして使用できることが証明された。このシステムは、単純に複数のガイドRNAを使用することで同時にゲノムの複数個所を編集するため、Cas9をプログラミングすることにより、汎用的に、多重ゲノムの組換えを可能する(2、7、8、10)。Csa9のニッカーゼへの容易な変換は、変異原活性を減らした哺乳類のゲノムにおいて、相同組換え修復を促進することを示した(2、8、24、25)。さらに、Cas9の触媒不活性変異体のDNA結合活性が、RNAのプログラム化可能な転写サイレンシング及び活性化デバイス遺伝子工学的に作るために活用されてきた(29、30)。

現在までに、化膿レンサ球菌、サーモフィルス菌髄膜炎菌及びトレポネーマ・デンティコ−ラ由来のRNAにガイドされたCas9が、ゲノム操作のツールとして記述されている(1−13、24、25、31−34及びEsvelta et al.PMID:24076762)。

概要

Cas9酵素、ガイドRNA及び関連する特定PAMを利用するIIType II CRISPR−Casシステムを提供すること。1つの態様において、本開示は、ガイドRNA、単分子及び二重分子の双方のガイドRNA、並びにそのガイドRNA及び/またはそのガイドRNAをコードするDNA(ベクターを含む)を使用した細胞中で、DNAを操作する方法を提供する。ガイドRNA及びCas9エンドヌクレアーゼを含む複合体もまた、提供する。

目的

1つの態様において、本開示は、ガイドRNA、単分子及び二重分子の双方のガイドRNA、並びにそのガイドRNA及び/またはそのガイドRNAをコードするDNA(ベクターを含む)を使用した細胞中で、DNAを操作する方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

本明細書に記載の発明。

技術分野

0001

本発明は、Cas9酵素ガイドRNA及び関連する特定のPAMを利用するtype II CRISPR−Casシステムに関する。本出願は、2013年11月18日に出願され、米国仮出願第61/905835に係る出願日の利益を主張、その全体を本明細書に参照として援用し、組み入れる。

0002

本出願は、開示の別部分として、コンピューター読み出し可能な配列リストファイル名:48128_SeqListing.txt;7,869,256バイト−ASCIIテキストファイル;作成2014年11月14日)を含み、その全体を本明細書に参照として援用し、組み入れる。

背景技術

0003

CRISPR−Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats−CRISPR associated proteins)の免疫原理を標的化した、RNAにガイドされたDNAを利用する遺伝子編集が、過去数か月にわたり広く利用されている(1−13)。細菌type II CRISPR−Casシステムにより与えられる主要な利点は、設定可能なDNA干渉に対する要件エンドヌクレアーゼ、Cas9、カスタマイズ可能な二重分子RNA構造)について最小限であるという点である(14)。化膿レンサ球菌の元来の第II種システムで主として実証された、trans−activating CRISPR RNA(tracrRNA)(15、16)は、Cas9の存在下でのRNaseIIIによるRNA共成熟(15−17)、及びCas9による侵入DNAの開裂(14、15、17−19)の両方に不可欠である二重分子RNA(14−17)を形成する前駆体CRISPR RNA(pre−crRNA)の不変リピート部に結合する。レンサ球菌で実証されたように、成熟した活性tracrRNA及び標的化crRNA(14−16)間に形成された二本鎖によりガイドされるCas9は、侵入してくる同種DNAにおいて、部位特異定的な二本鎖DNAdsDNA)切断を導く(14、17−19)。Cas9は、標的鎖(crRNAのスペーサー配列に対して相補的であるとして定義される)を開裂するHNHヌクレアーゼドメイン及び非標的鎖を開裂するRuvC様ドメイン(14、22,23)を使用するマルチドメイン酵素であり(14、20、21)、選択的モチーフ不活性化によりdsDNA開裂Cas9のニッカーゼへの変換を可能にする(2、8、14、24、25)。DNA開裂の特異性は、2つのパラメーター、すなわち、変動的であり、プロトスペーサーを標的化するcrRNAのスペーサー由来配列(プロトスペーサーは、crRNAのスペーサーに対して相補的である、当該DNA標的上の配列として定義される)、及びショート配列である、その非標的DNA鎖上のプロトスペーサーのすぐ下流に位置するPAM(the Protospacer Adjacent Motif)により決定される(14、18、23、26−28)。

0004

最近の研究により、RNAにガイドされるCas9は、ヒト細胞(1、2、8、11)、マウス(9、10)、ゼブラフィッシュ(6)、ショウジョウバエ(5)、ワーム(4)、植物(12、13)、酵母(3)及び細菌(7)における効率的なゲノム編集ツールとして使用できることが証明された。このシステムは、単純に複数のガイドRNAを使用することで同時にゲノムの複数個所を編集するため、Cas9をプログラミングすることにより、汎用的に、多重ゲノムの組換えを可能する(2、7、8、10)。Csa9のニッカーゼへの容易な変換は、変異原活性を減らした哺乳類のゲノムにおいて、相同組換え修復を促進することを示した(2、8、24、25)。さらに、Cas9の触媒不活性変異体のDNA結合活性が、RNAのプログラム化可能な転写サイレンシング及び活性化デバイス遺伝子工学的に作るために活用されてきた(29、30)。

0005

現在までに、化膿レンサ球菌、サーモフィルス菌髄膜炎菌及びトレポネーマ・デンティコ−ラ由来のRNAにガイドされたCas9が、ゲノム操作のツールとして記述されている(1−13、24、25、31−34及びEsvelta et al.PMID:24076762)。

課題を解決するための手段

0006

本発明は、RNAプログラム可能なCas9を、追加のオーソロガスシステムに拡張する。系統発生的に定義されたtype II CRISPR−Casグループの8つの代表的なものの中で、本明細書では、二重分子RNA:Cas9の多様性及び互換性を検討する。本研究の結果は、広範囲のCas9酵素、ガイドRNA構造及び関連する特定PAMsを導入するのみならず、当該システムの共進化及び水平伝播を含む、type II CRISPR−Casシステムの進化的側面も明らかにする。

0007

1つの態様において、本開示は、ガイドRNA、単分子及び二重分子の双方のガイドRNA、並びにそのガイドRNA及び/またはそのガイドRNAをコードするDNA(ベクターを含む)を使用した細胞中で、DNAを操作する方法を提供する。ガイドRNA及びCas9エンドヌクレアーゼを含む複合体もまた、提供する。

0008

いくつかの実施形態において、単分子ガイドRNAは、DNA標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含み、ここでそのタンパク質結合セグメントが、補足表S5に提示されるtracrRNAを含み、またはそのタンパク質結合セグメントが、補足表S5に提示されるtracrRNAに対して少なくとも20のヌクレオチドにわたり、少なくとも80%が同一であるtracrRNAを含む。いくつか実施形態において、タンパク質結合セグメントは、補足表S5に提示されるCRISPRリピート部を含み、そのCRISPRリピート部は、タンパク質結合セグメントのtracrRNAと同種である。いくつかの実施形態において、当該DNA標的化セグメントは、PAM配列への標的DNA5’におけるプロトスペーサー様配列に対して相補的であるRNAを含む。いくつかの実施形態において、当該tracrRNA及びCRISPRリピート部は各々、補足表S5に提示されるカンピロバクタージェジュニ(C.jejuni)tracrRNA及びその同種CRISPRリピート部であり、及び当該PAM配列は、NNNNACAである。いくつかの実施形態において、当該tracrRNA及びCRISPRリピート部は各々、補足表S5に提示されるカンピロバクター・ジェジュニtracrRNA及びその同種CRISPRリピート部に対して少なくとも80%が同一であり、及び当該PAM配列は、NNNNACAである。

0009

いくつかの実施形態において、当該単分子ガイドRNAは、SEQID NO:801−2701の1つに提示されるプロトスペーサー様配列にハイブリダイズする配列を含む。

0010

他の態様において、本開示は、本発明の単分子ガイドRNAをコードするDNAを提供する。

0011

さらに他の態様において、本開示は、本発明の単分子ガイドRNAをコードするDNAを含むベクターを提供する。

0012

更に他の態様において、本開示は、本発明の単分子ガイドRNAをコードするDNAを含む細胞を提供する。

0013

1つの態様において、本開示は、標的選択性(targeter)RNA及びそれらの相補的な活性化因子(activator)RNA含み、ここでその活性化因子RNAが、補足表S5に提示されるtracrRNAを含むか、またはその活性化因子RNAが、補足表S5に提示されるtracrRNAに対して少なくとも20のヌクレオチドにわたり、少なくとも80%同一であるtracrRNAを含む、二重分子ガイドRNAを提供する。いくつかの実施形態において、当該二重分子ガイドRNAは、改変バックボーン人工ヌクレオシド間結合核酸擬態、改変糖モイエティー、塩基修飾、安定性の改変または制御に備える改変または配列、細胞内トラッキングに備える改変または配列、トラッキングに備える改変または配列、またはタンパク質またはタンパク質複合体への結合部に備える改変または配列を含む。いくつかの実施形態において、当該標的選択性RNAは、補足表S5に提示されるCRISPRリピート部を含む。いくつかの実施形態において、当該標的選択性RNAは、活性化因子RNAのtracrRNAの同種CRISPRリピート部である、補足表S5に提示されるCRISPRリピート部を含む。いくつかの実施形態において、当該標的選択性RNAはさらに、PAM配列への標的DNA5’におけるプロトスペーサー様配列に対して相補的であるRNAを含む。いくつかの実施形態において、当該tracrRNA及びCRISPRリピート部は各々、補足表S5に提示されるカンピロバクター・ジェジュニtracrRNA及びその同種CRISPRリピート部であり、及び当該PAM配列は、NNNNACAである。いくつかの実施形態において、当該tracrRNA及びCRISPRリピート部は各々、補足表S5に提示されるカンピロバクター・ジェジュニtracrRNA及びその同種CRISPRリピート部に対して少なくとも80%が同一であり、及び当該PAM配列は、NNNNACAである。

0014

いくつかの実施形態において、当該二重分子ガイドRNAは、SEQID NO:801−2701の1つに提示されるプロトスペーサー様配列にハイブリダイズする配列を含む。

0015

他の態様において、本開示は、本発明の二重分子ガイドRNAをコードするDNAを提供する。

0016

さらに他の態様において、本開示は、本発明の二重分子ガイドRNAをコードするDNAを含むベクターを提供する。

0017

更に他の態様において、本開示は、本発明の二重分子ガイドRNAをコードするDNAを含む細胞を提供する。

0018

1つの態様において、本開示は、Cas9オーソログ−ガイドRNA複合体とDNAとの接触を含む、細胞中のDNAの操作法を提供し、ここで当該複合体は、(a)当該細胞対して異種のカンピロバクター・ジェジュニ(C.jejuni)Cas9エンドヌクレアーゼまたはカンピロバクター・ジェジュニCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びPAM配列NNNNACAに対するDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に、当該複合体を標的化しているガイドRNA、(b)当該細胞に対して異種のパスツレラムルトシダ(P.multocida)Cas9エンドヌクレアーゼ、またはパスツレラ・ムルトシダCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びPAM配列GNNNCNNAまたはNNNNCに対するDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に、当該複合体を標的化しているガイドRNA、(c)当該細胞に対して異種のフランシセラノビシダ(F.novicida)Cas9エンドヌクレアーゼ、またはフランシセラ・ノビシダCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びPAM配列NGに対するDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に、当該複合体を標的化しているガイドRNA、(d)当該細胞に対して異種のストレプトコッカスサーモフィルス**(S.thermophilus**)Cas9エンドヌクレアーゼ、またはストレプトコッカス・サーモフィルス**Cas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びPAM配列NNAAAAWに対するDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に、当該複合体を標的化しているガイドRNA、(e)当該細胞に対して異種のリステリア・イノキュア(L.innocua)Cas9エンドヌクレアーゼ、またはリステリア・イノキュアCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びPAM配列NGGに対するDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に、当該複合体を標的化しているガイドRNA、または(f)当該細胞に対して異種のストレプトコッカス・ディガラクティエ(S.dysgalactiae)Cas9エンドヌクレアーゼ、またはストレプトコッカス・ディスガラクティエCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びPAM配列NGGに対するDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に、当該複合体を標的化しているガイドRNA、を含む。いくつかの実施形態において、当該ガイドは、単分子ガイドRNAである。いくつかの実施形態において、当該ガイドRNAは、二重分子ガイドRNAである。当該方法に使用される複合体もまた、提供する。

0019

当該方法のいくつかの実施形態において、標的化される当該プロトスペーサー様配列は、CCR5、CXCR4、KRT5、KRT14、PLECまたはCOL7A1遺伝子中にある。いくつかの実施形態において、当該プロトスペーサー様配列は、慢性肉芽腫性疾患(CGD)の関連遺伝子であるCYBA、CYBB、NCF1、NCF2またはNCF4中にある。いくつかの実施形態において、標的化される当該プロトスペーサー様配列は、B細胞リンパ腫白血病IIA(BCL11A)タンパク質、BCL11AまたはBCL11A結合部位芽球エンハンサーをコードする遺伝子中にある。いくつかの実施形態において、標的化される当該プロトスペーサー様配列は、前述の遺伝子の上流1,000ヌクレオチドまでである。当該方法のいくつかの実施形態において、当該ガイドRNAは、SEQID NO:801−2701の1つに提示されるプロトスペーサー様配列に相補的な配列を含む。

0020

1つの態様において、本開示は、(a)ガイドRNA,ここでそのガイドRNAは、PAM配列NNNNACAへのDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なDNA標的化セグメントを含み、及び(b)カンピロバクター・ジェジュニCas9エンドヌクレアーゼ(例えば、SEQID NO:50に示される)またはカンピロバクター・ジェジュニCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする組換えベクターを提供する。いくつかの実施形態において、当該プロトスペーサー様配列に相補的な当該DNA標的化セグメントは、SEQ ID NO:801−973、1079−1222、1313−1348、1372−1415、1444−1900、2163−2482または2667−2686の1つに示される標的配列に相補的なRNAである。細胞中のDNAを操作するための当該ベクターの使用方法もまた、提供する。

0021

他の態様において、本開示は、(a)ガイドRNA、ここでそのガイドRNAは、PAM配列GNNNCNNAまたはNNNNCへのDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なDNA標的化セグメントを含み、及び(b)パスツレラ・ムルトシダCas9エンドヌクレアーゼ(例えば、SEQID NO:1に提示される)、またはパスツレラ・ムルトシダCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクターを提供する。いくつかの実施形態において、当該プロトスペーサー様配列に相補的な当該DNA標的化セグメントは、SEQ ID NO:974−1078、1223−1312、1349−1371、1416−1443、1901−2162、2483−2666または2687−2701の1つに示される標的配列に相補的なRNAである。細胞中のDNAを操作するための当該ベクターの使用方法もまた、提供する。

0022

さらに他の態様において、本開示は、(a)ガイドRNA,ここでそのガイドRNAは、PAM配列NGに対するDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なDNA標的化セグメントを含み、及び(b)フランシセラ・ノビシダCas9エンドヌクレアーゼ(例えば、SEQID NO:43に提示される)、またはフランシセラ・ノビシダCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクターを提供する。細胞中のDNAを操作するための当該ベクターの使用方法もまた、提供する。

0023

更に他の態様において、本開示は、(a)ガイドRNA,ここでそのガイドRNAは、PAM配列NNAAAAWに対するDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なDNA標的化セグメントを含み、及び(b)ストレプトコッカス・サーモフィラス**Cas9エンドヌクレアーゼ、またはストレプトコッカス・サーモフィラス**Cas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクターを提供する。細胞中のDNAを操作するための当該ベクターの使用方法もまた、提供する。

0024

さらに他の態様において、本開示は、(a)ガイドRNA,ここでそのガイドRNAは、PAM配列NGGに対するDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なDNA標的化セグメントを含み、及び(b)リステリア・イノキュアCas9エンドヌクレアーゼ(例えば、SEQID NO:3に提示される)、またはリステリア・イノキュアCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクターを提供する。細胞中のDNAを操作するための当該ベクターの使用方法もまた、提供する。

0025

そのうえ他の態様において、本開示は、(a)ガイドRNA,ここでそのガイドRNAは、PAM配列NGGに対するDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なDNA標的化セグメントを含み、及び(b)ストレプトコッカス・ディスガラクティエCas9エンドヌクレアーゼ(例えば、SEQID NO:105)、またはストレプトコッカス・ディスガラクティエCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクターを提供する。

0026

当該ベクターのいくつかの実施形態において、当該ガイドRNAは、SEQID NO:801−2701の1つに提示されるプロトスペーサー様配列に相補的な配列を含む。

0027

関連する態様において、本開示は、(a)前述のプロトスペーサー様配列のいずれかに隣接する哺乳類ゲノムDNAの少なくとも7−20塩基を同定し、及び(b)(i)ステップ(a)で特定されたDNA配列に相補的なDNA標的化セグメント、及び(ii)タンパク質結合セグメント、または(i)及び(ii)をコードする核酸、及び(iii)cas9エンドヌクレアーゼまたはそのcas9エンドヌクレアーゼをコードする核酸を哺乳類細胞に接触させるか、または哺乳類に投与することにより、その哺乳類ゲノムのDNA配列を操作し、及び(c)その哺乳類ゲノムDNAの開裂の検出を含む、方法を提供する。

0028

1つの態様において、本開示は、本明細書に記述されるCas9オーソログのいずれかから改変され、化膿レンサ球菌Cas9の突然変異E762A、HH983AAまたはD986Aに相当する1つ以上の突然変異を含む、改変Cas9エンドヌクレアーゼを提供する。いくつかの実施形態において、当該改変Cas9エンドヌクレアーゼはさらに、化膿レンサ球菌Cas9の突然変異D10A、H840A、G12A、G17A、N854A、N863A、N982AまたはA984Aに相当する1つ以上の突然変異を含む。

0029

1つの態様において、本開示は、Cas9オーソログ−ガイドRNA複合体とDNAの接触を含む、細胞中のDNAの操作法を提供し、ここで当該複合体は、(a)その細胞とは異種のCas9エンドヌクレアーゼ、及び(b)補足表S5に提示されるtracrRNAを含むCas9エンドヌクレアーゼの同種ガイドRNA、または少なくとも20のヌクレオチドにわたり補足表S5に提示される同種tracrRNAに対して少なくとも80%同一であるtracrRNAを含むガイドRNAを含む。いくつかの実施形態において、当該ガイドは、単分子ガイドRNAである。いくつかの実施形態において、当該ガイドRNAは、二重分子ガイドRANである。当該方法のいくつかの実施形態において、当該ガイドRNAは、SEQID NO:801−2701の1つに示されるプロトスペーサー様配列に相補的な配列を含む。当該方法に使用される複合体もまた、提供する。

0030

1つの態様において、本開示は、Cas9オーソログ−ガイドRNA複合体とDNAの接触を含む、細胞中のDNAの操作法を提供し、ここで当該複合体は、(a)補足表S2におけるクラスターからの第I種Cas9エンドヌクレアーゼに対応した同種ガイドRNA、及び(b)当該第I種ヌクレアーゼでの高い開裂効率を保持したまま互換的であり及びそれらの長さの80%にわたり当該第I種エンドヌクレアーゼと少なくとも80%の同一性共有する、同じクラスターからの第II種Cas9エンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、当該ガイドは、単分子ガイドRNAである。いくつかの実施形態において、当該ガイドRNAは、二重分子ガイドRNAである。いくつかの実施形態において、当該第I種Cas9エンドヌクレアーゼは、化膿レンサ球菌由来であり及び当該第II種Cas9エンドヌクレアーゼは、ミュータンス菌由来である。いくつかの実施形態において、当該第I種Cas9エンドヌクレアーゼは、サーモフィラス*菌由来であり及び当該第II種Cas9エンドヌクレアーゼは、ミュータンス菌由来である。いくつかの実施形態において、当該第I種Cas9エンドヌクレアーゼは、髄膜炎菌由来であり及び当該第II種Cas9エンドヌクレアーゼは、パスツレラ・ムルトシダ由来である。当該方法に使用する複合体をまた、提供する。

0031

1つの態様において、本開示は、Cas9オーソログ−ガイドRNA複合体とDNAへの接触を含む、細胞中のDNAの操作法を提供し、ここで当該複合体は、(a)補足表S6におけるクラスターからの第I種Cas9エンドヌクレアーゼの同種ガイドRNA、及び(b)当該第I種ヌクレアーゼと同じかまたはより低い開裂効率を保持したまま互換的であり及びそれらの長さの70%にわたり当該第I種エンドヌクレアーゼと少なくとも50%のアミノ酸配列の特定を共有する、補足表S6の同じクラスターからの第II種Cas9エンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、当該ガイドは、単分子ガイドRNAである。いくつかの実施形態において、当該ガイドRNAは、二重分子ガイドRANである。いくつかの実施形態において、当該第I種Cas9エンドヌクレアーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ由来であり及び当該第II種Cas9エンドヌクレアーゼは、パスツレラ・ムルトシダ由来である。いくつかの実施形態において、当該第I種Cas9エンドヌクレアーゼは、髄膜炎菌由来であり及び当該第II種Cas9エンドヌクレアーゼは、パスツレラ・ムルトシダ由来である。当該方法に使用する複合体もまた、提供する。

0032

1つの態様において、本開示は、2つ以上のCas9−ガイドRNA複合体を伴うDNAへの接触を含む、細胞中のDNAの操作法を提供し、ここで各Cas9−ガイドRNA複合体は、(a)それらの長さの70%にわたり、当該方法の他のエンドヌクレアーゼと50%未満のアミノ酸配列の同一性を示す、補足表S6の異なるクラスターからのCas9エンドヌクレアーゼ、及び(b)各Cas9エンドヌクレアーゼと特異的に複合化するガイドRNAを含む。いくつかの実施形態において、当該ガイドは、単分子ガイドRNAである。いくつかの実施形態において、当該ガイドRNAは、二重分子ガイドRANである。いくつかの実施形態において、当該Cas9エンドヌクレアーゼは、フランシセラ・ノビシダ及び化膿レンサ球菌由来である。いくつかの実施形態において、当該Cas9エンドヌクレアーゼは、髄膜炎菌及びミュータンス菌由来である。いくつかの実施形態において、当該Cas9エンドヌクレアーゼは、サーモフィラス*菌Cas9及びサーモフィラス**菌Cas9由来である。当該方法に使用する複合体もまた、提供する。

0033

当該操作法のいくつかの実施形態において、当該細胞中で標的化されるDNAは、CCR5、CXCR4、KRT5、KRT14、PLECまたはCOL7A1遺伝子である。いくつかの実施形態において、当該細胞中で標的化されるDNAは、慢性肉芽腫性疾患(CGD)の関連遺伝子であるCYBA、CYBB、NCF1、NCF2またはNCF4である。いくつかの実施形態において、標的化される当該プロトスペーサー様配列は、B細胞リンパ腫/白血病IIA(BCL11A)タンパク質、BCL11AまたはBCL11A結合部位の芽球系エンハンサーをコードする遺伝子中にある。いくつかの実施形態において、標的化される当該プロトスペーサー様配列は、上述で指摘された遺伝子の上流1,000ヌクレオチドまでである。当該方法のいくつかの実施形態において、当該ガイドRNAは、SEQID NO:801−2701の1つに提示されるプロトスペーサー様配列に相補的な配列を含む。

0034

本明細書に与えられるいずれの方法も、生体外または生体内であって良いことを意図している。
本発明は、例えば、以下を提供する。
項目1)
DNA標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドRNAであって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表S5に提示されるtracrRNAを含む、前記ガイドRNA。
(項目2)
前記タンパク質結合セグメントが、補足表S5に提示されるCRISPRリピート配列を含み、それが該タンパク質結合セグメントのtracrRNAの同種のCRISPRリピート配列である、項目1に記載の単分子ガイドRNA。
(項目3)
前記DNA標的化セグメントが、PAM配列への標的DNA5’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なRNAをさらに含む、項目1または2に記載の単分子ガイドRNA。
(項目4)
前記tracrRNA及びCRISPRリピート部が、カンピロバクター・ジェジュニのtracrRNA及び補足表S5に提示されるCRISPRリピート配列に対し、それぞれ少なくとも80%同一であり、及び前記PAM配列がNNNNACAである、項目3に記載の前記単分子ガイドRNA。
(項目5)
プロトスペーサー様配列に相補的な前記RNAが、SEQID NO:801−973、1079−1222、1313−1348、1372−1415、1444−1900、2163−2482または2667−2686の1つに提示される、標的配列に相補的なRNAである、項目4または8に記載の単分子ガイドRNA。
(項目6)
DNA標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドRNAであって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表S5に提示されるtracrRNAに対し、少なくとも20のヌクレオチドにわたり、少なくとも80%同一であるtracrRNAを含む、前記単分子ガイドRNA。
(項目7)
DNA標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドRNAであって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表S5に提示されるtracrRNAに対し、少なくとも20のヌクレオチドにわたり、少なくとも80%同一であるtracrRNA、補足表S5に提示されるCRISPRリピート部に対し、少なくとも80%同一であるCRISPRリピート部、またはその両方を含む、前記ガイドRNA。
(項目8)
前記tracrRNA及びCRISPRリピート部が、カンピロバクター・ジェジュニtracrRNA及び補足表S5に提示されるCRISPRリピート部に、各々が少なくとも80%同一であり、及び前記PAM配列がNNNNACAである、項目7に記載の単分子ガイドRNA。
(項目9)
前記DNA標的化セグメントと前記タンパク質結合セグメントの間にリンカーを含む、項目1または6に記載の単分子ガイドRNA。
(項目10)
DNA標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドRNAをコードするDNAであって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表S5に提示されるtracrRNAを含む、前記DNA。
(項目11)
DNA標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドRNAをコードするDNAであって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表S5に提示されるtracrRNAに対し、少なくとも20のヌクレオチドにわたり、少なくとも80%同一であるtracrRNA、補足表S5に提示されるCRISPRリピート部に対し、少なくとも80%同一であるCRISPRリピート部、またはその両方を含む、前記DNA。
(項目12)
DNA標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドRNAをコードするDNAを含むベクターであって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表S5に提示されるtracrRNAを含む、前記ベクター。
(項目13)
DNA標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドRNAをコードするDNAを含むベクターであって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表S5に提示されるtracrRNAに対し、少なくとも20のヌクレオチドにわたり、少なくとも80%同一であるtracrRNA、補足表S5に提示されるCRISPRリピート部に対し、少なくとも80%同一であるCRISPRリピート部、またはその両方を含む、前記ベクター。
(項目14)
DNA標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドRNAをコードするDNAを含む細胞であって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表S5に提示されるtracrRNAを含む、前記細胞。
(項目15)
DNA標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドRNAをコードするDNAを含む細胞であって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表S5に提示されるtracrRNAに対し、少なくとも20のヌクレオチドにわたり、少なくとも80%同一であるtracrRNA、補足表S5に提示されるCRISPRリピート部に対し、少なくとも80%同一であるCRISPRリピート部、またはその両方を含む、前記細胞。
(項目16)
標的選択性RNA及びそれらに相補的な活性化因子RNAを含む二重分子ガイドRNAであって、ここで前記活性化因子RNAが、補足表S5に提示されるtracrRNAを含み、及びここで前記ガイドRNAが、改変バックボーン、人工ヌクレオチド間の連結、核酸の擬態、改変糖モイエティー、塩基修飾、改変または調節された安定性に備える改変または配列、細胞内トラッキングに備える改変または配列、トラッキングに備える改変または配列、またはタンパク質またはタンパク質複合体の結合部位に備える改変または配列を含む、前記二重分子ガイドRNA。
(項目17)
前記標的選択性RNAが補足表S5に提示されるCRISPRリピート部を含み、それは前記タンパク質結合セグメントのtracrRNAの同種CRISPRリピート部である、項目16に記載の二重分子ガイドRNA。
(項目18)
前記標的選択性RNAが、PAM配列への標的DNA5’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なRNAをさらに含む、項目16または17に記載の二重分子ガイドRNA。
(項目19)
前記tracrRNA及びCRISPRリピート部が、カンピロバクター・ジェジュニのtracrRNA及び補足表S5に提示されるCRISPRリピート部に対し、それぞれ少なくとも80%同一であり、及び前記PAM配列がNNNNACAである、項目18に記載の二重分子ガイドRNA。
(項目20)
プロトスペーサー様配列に相補的な前記RNAが、SEQ ID NO:801−973、1079−1222、1313−1348、1372−1415、1444−1900、2163−2482または2667−2686の1つに提示される標的配列に相補的なRNAである、項目19または項目23に記載の二重分子ガイドRNA。
(項目21)
標的選択性RNA及び活性化因子RNAを含む二重分子ガイドRNAであって、ここで前記活性化因子RNAが、補足表S5に提示されるtracrRNAに対し、少なくとも20のヌクレオチドにわたり、少なくとも80%同一であるtracrRNAを含む、前記二重分子ガイドRNA。
(項目22)
前記標的選択性RNAが、補足表S5に提示されるCRISPRリピート部、補足表S5に提示される活性化因子RNAのtracrRNAの同種CRISPRリピート部、または補足表S5に提示されるCRISPRリピート部に対し少なくとも80%同一であるCRISPRリピート部を含む、項目21に記載の二重分子ガイドRNA。
(項目23)
前記tracrRNA及びCRISPRリピート部が、カンピロバクター・ジェジュニtracrのRNA及び補足表S5に提示されるCRISPRリピート部に対し、それぞれ少なくとも80%同一であり、及び前記PAM配列がNNNNACAである、項目21に記載の二重分子ガイドRNA。
(項目24)
前記標的選択性RNAと前記活性化因子RNAの間にリンカーを含む、項目16または21に記載の二重分子ガイドRNA。
(項目25)
標的選択性RNA及びそれらと相補的な活性化因子RNAを含む二重分子ガイドRNAをコードするDNAであって、ここで前記活性化因子RNAが、補足表S5に提示されるtracrRNAを含む、前記DNA。
(項目26)
標的選択性RNA及びそれらと相補的な活性化因子RNAを含む二重分子ガイドRNAをコードするDNAであって、ここで前記活性化因子RNAが、補足表S5に提示されるtracrRNAに対し、少なくとも20のヌクレオチドにわたり、少なくとも80%同一であるtracrRNA、補足表S5に提示されるCRISPRリピート部に対し、少なくとも80%同一であるCRISPRリピート部、またはその両方を含む、前記DNA。
(項目27)
標的選択性RNA及びそれらと相補的な活性化因子RNAを含む二重分子ガイドRNAをコードするDNAを含むベクターであって、ここで前記活性化因子RNAが、補足表S5に提示されるtracrRNAを含む、前記ベクター。
(項目28)
標的選択性RNA及びそれらと相補的な活性化因子RNAを含む二重分子ガイドRNAをコードするDNAを含むベクターであって、ここで前記活性化因子RNAが、補足表S5に提示されるtracrRNAに対し、少なくとも20のヌクレオチドにわたり、少なくとも80%同一であるtracrRNA、補足表S5に提示されるCRISPRリピート部に対し、少なくとも80%同一であるCRISPRリピート部、またはその両方を含む、前記ベクター。
(項目29)
標的選択性RNA及びそれらと相補的な活性化因子RNAを含む二重分子ガイドRNAをコードするDNAを含む細胞であって、ここで前記活性化因子RNAが、補足表S5に提示されるtracrRNAを含む、前記細胞。
(項目30)
標的選択性RNA及びそれらと相補的な活性化因子RNAを含む二重分子ガイドRNAをコードするDNAを含む細胞であって、ここで前記活性化因子RNAが、補足表S5に提示されるtracrRNAに対し、少なくとも20のヌクレオチドにわたり、少なくとも80%同一であるtracrRNA、補足表S5に提示されるCRISPRリピート部に対し、少なくとも80%同一であるCRISPRリピート部、またはその両方を含む、前記細胞。
(項目31)
細胞中でDNAを操作する方法であって、前記DNAをCas9オーソログ−ガイドRNA複合体に接触させることを含み、ここで前記複合体が、(a)前記細胞に対して異種のカンピロバクター・ジェジュニ(C.jejuni)Cas9エンドヌクレアーゼまたはカンピロバクター・ジェジュニCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及び前記PAM配列NNNNACAへのDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に、前記複合体を標的化しているガイドRNA、(b)前記細胞に対して異種のパスツレラ・ムルトシダ(P.multocida)Cas9エンドヌクレアーゼ、またはパスツレラ・ムルトシダCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及び前記PAM配列GNNNCNNAまたはNNNNCへのDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に、前記複合体を標的化しているガイドRNA、(c)前記細胞に対して異種のフランシセラ・ノビシダ(F.novicida)Cas9エンドヌクレアーゼ、またはフランシセラ・ノビシダCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及び前記PAM配列NGへのDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に、前記複合体を標的化しているガイドRNA、(d)前記細胞に対して異種のストレプトコッカス・サーモフィルス**(S.thermophilus**)Cas9エンドヌクレアーゼ、またはストレプトコッカス・サーモフィルス**Cas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びそのPAM配列NNAAAAWへのDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に、前記複合体を標的化しているガイドRNA、(e)前記細胞に対して異種のリステリア・イノキュア(L.innocua)Cas9エンドヌクレアーゼ、またはリステリア・イノキュアCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びそのPAM配列NGGへのDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に、前記複合体を標的化しているガイドRNA、または(f)前記細胞に対して異種のストレプトコッカス・ディスガラクティエ(S.dysgalactiae)Cas9エンドヌクレアーゼ、またはストレプトコッカス・ディスガラクティエCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも90%同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びそのPAM配列NGGへのDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に、前記複合体を標的化しているガイドRNAを含む、前記方法。
(項目32)
前記細胞が、細菌細胞真菌細胞古細菌細胞、植物細胞または動物細胞である、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記ガイドRNAが、単分子ガイドRNAである、項目31に記載の方法。
(項目34)
前記ガイドRNAが、二重分子ガイドRNAである、項目31に記載の方法。
(項目35)
前記エンドヌクレアーゼが、ニッカーゼである、項目31に記載の方法。
(項目36)
前記エンドヌクレアーゼが、化膿レンサ球菌E762A、HH983AAまたはD986Aに相当する突然変異を含む、項目31に記載の方法。
(項目37)
前記エンドヌクレアーゼが、タンパク質を結合する死滅した突然変異体/DNAである、項目31に記載の方法。
(項目38)
標的化された前記プロトスペーサー様配列が、CCR5、CXCR4、KRT5、KRT14、PLECまたはCOL7A1遺伝子にある、項目31に記載の方法。
(項目39)
前記プロトスペーサー様配列が、慢性肉芽腫症(CGD)関連の遺伝子CYBA、CYBB、NCF1、NCF2またはNCF4にある、項目31に記載の方法。
(項目40)
標的化された前記プロトスペーサー様配列が、B細胞リンパ腫/白血病IIA(BCL11A)タンパク質、BCL11AまたはBCL11A結合部位の赤芽球系エンハンサーをコードする遺伝子にある、またはその遺伝子の1000ヌクレオチドまでの上流にある、項目31に記載の方法。
(項目41)
前記エンドヌクレアーゼ及び前記ガイドRNAが、前記エンドヌクレアーゼ及び前記ガイドRNAをコードするものと同じかまたは異なる組換えベクターにより、前記細胞に導入される、項目31に記載の方法。
(項目42)
少なくとも1つの組換えベクターが、組換えウイルスベクターである、項目31に記載の方法。
(項目43)
(a)前記PAM配列NNNNACAへのDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なDNA標的化セグメントを含む、ガイドRNA、及び(b)カンピロバクター・ジェジュニCas9エンドヌクレアーゼまたは当該カンピロバクター・ジェジュニCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対し、少なくとも90%同一の活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクター。
(項目44)
(a)前記PAM配列GNNNCNNAまたはNNNNCへのDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なDNA標的化セグメントを含む、ガイドRNA、及び(b)パスツレラ・ムルトシダCas9エンドヌクレアーゼまたは当該パスツレラ・ムルトシダCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対し、少なくとも90%同一の活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクター。
(項目45)
(a)前記PAM配列NGへのDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なDNA標的化セグメントを含む、ガイドRNA、及び(b)フランシセラ・ノビシダCas9エンドヌクレアーゼまたは当該フランシセラ・ノビシダCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対し、少なくとも90%同一の活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクター。
(項目46)
(a)前記PAM配列NNAAAAWへのDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なDNA標的化セグメントを含む、ガイドRNA、及び(b)ストレプトコッカス・サーモフィルス**Cas9エンドヌクレアーゼまたは当該ストレプトコッカス・サーモフィルス**Cas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対し、少なくとも90%同一の活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクター。
(項目47)
(a)前記PAM配列NGGへのDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なDNA標的化セグメントを含む、ガイドRNA、及び(b)リステリア・イノキュアCas9エンドヌクレアーゼまたは当該リステリア・イノキュアCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対し、少なくとも90%同一の活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクター。
(項目48)
(a)前記PAM配列NGGへのDNA5’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なDNA標的化セグメントを含む、ガイドRNA、及び(b)ストレプトコッカス・ディスガラクティエCas9エンドヌクレアーゼまたは当該ストレプトコッカス・ディスガラクティエCas9エンドヌクレアーゼの活性部分に対し、少なくとも90%同一の活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクター。
(項目49)
前記組換えベクターが、組換えウイルスベクターである、項目43、44、45、46、47または48に記載の組換えベクター。
(項目50)
化膿レンサ球菌E762A、HH983AAまたはD986Aに相当する1つ以上の突然変異を含む、改変Cas9エンドヌクレアーゼ。
(項目51)
化膿レンサ球菌変異体D10A、H840A、G12A、G17A、N854A、N863A、N982AまたはA984Aに相当する1つ以上の突然変異をさらに含む、項目50に記載の改変Cas9エンドヌクレアーゼ。
(項目52)
細胞中でDNAを操作する方法であって、前記DNAをCas9オーソログ−ガイドRNA複合体に接触させることを含み、ここで前記複合体が、(a)前記細胞に対して異種であるCas9エンドヌクレアーゼ、及び(b)補足表S5に提示されるtracrRNAを含む前記Cas9エンドヌクレアーゼと同種のガイドRNA、または少なくとも20のヌクレオチドにわたり、補足表S5に提示される同種のtracrRNAに対し、少なくとも80%同一であるtracrRNAを含むガイドRNAを含む、前記方法。
(項目53)
前記細胞が、細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞または動物細胞である、項目52に記載の方法。
(項目54)
前記ガイドRNAが、単分子ガイドRNAである、項目52に記載の方法。
(項目55)
前記ガイドRNAが、二重分子ガイドRNAである、項目52に記載の方法。
(項目56)
前記エンドヌクレアーゼが、ニッカーゼである、項目52に記載の方法。
(項目57)
前記エンドヌクレアーゼが、化膿レンサ球菌突然変異E762、HH983AAまたはD986Aに相当する突然変異を含む、項目52に記載の方法。
(項目58)
前記エンドヌクレアーゼが、タンパク質を結合する死滅した突然変異体/DNAである、項目52に記載の方法。
(項目59)
前記標的化されたプロトスペーサー様配列が、CCR5、CXCR4、KRT5、KRT14、PLECまたはCOL7A1遺伝子にあるか、またはその遺伝子の上流1000ヌクレオチドまでの配列にある、項目52に記載の方法。
(項目60)
前記プロトスペーサー様配列が、慢性肉芽腫症(CGD)関連の遺伝子CYBA、CYBB、NCF1、NCF2またはNCF4にあるか、またはその遺伝子の上流1000ヌクレオチドまでの配列にある、項目52に記載の方法。
(項目61)
前記標的化されたプロトスペーサー様配列が、B細胞リンパ腫/白血病IIA(BCL11A)タンパク質、BCL11AまたはBCL11A結合部位の赤芽球系エンハンサーをコードする遺伝子にあるか、またはその遺伝子の1000ヌクレオチドまでの上流にある、請求52に記載の方法。
(項目62)
前記エンドヌクレアーゼ及び前記ガイドRNAが、前記エンドヌクレアーゼ及び前記ガイドRNAをコードするものと同じかまたは異なる組換えベクターにより前記細胞に導入される、項目52に記載の方法。
(項目63)
少なくとも1つの組換えベクターが、組換えウイルスベクターである、項目52に記載の方法。

図面の簡単な説明

0035

Cas9オーソログの系統及び選択された細菌IItype II CRISPR−Casシステムの模式図。(A)代表的なCas9オーソログの多重配列配置の、選択された及び有益な位置から再構成されたCas9の系統樹を示す(補足図S2及び補足表S2を参照)。II−A、II−B及びII−Cに分類されるCas9オーソログのサブタイプが、網掛け囲みで強調されている。色分けされた枝部は、同じ遺伝子座構造を有する密接に関連した遺伝子座の、異なるタンパク質をグループ化している(15)。各タンパク質は、遺伝子識別番号(the GenInfo identifier(GI))により、次いで細菌株名により表される。ブートストラップ値が、節点ごとに与えられる(物質及び方法を参照)。サブタイプII−A及びII−Bの単系統クラスターは、高いブートストラップ値により支持されていることに留意のこと。その枝長に対する尺度バーが、アミノ酸置換/部位の予測値として与えられる。(B)化膿レンサ球菌SF370、ミュータンス菌UA159、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9*(CRISPR3)、**(CRISPR1)、カンピロバクター・ジェジュニNCTC11168、髄膜炎菌Z2491、パスツレラ・ムルトシダPm70及びフランシセラ・ノビシダU112における、第II種(Nmeni/CASS4)CRISPR−Casの遺伝子座。赤矢印、tracrRNAの転写方向;青矢印、cas遺伝子;黒長方形、CRISPRリピート部;緑ひし形、スペーサー;太い黒線リーダー配列;黒矢印、推定pre−crRNAプロモーター;HP、仮想タンパク質。左側に表示される色分けのバーは、Cas9系統樹の枝の色に対応している。カンピロバクター・ジェジュニ及び髄膜炎菌pre−crRNAsの転写方向及び推定リーダー位置は、既に公開済みRNA配列データから導いた(15)。パスツレラ・ムルトシダのCRISPR−Cas遺伝子座の構造は、それに非常に類似した髄膜炎菌の遺伝子座を基に推定し及び強く予測されるプロモーター及び(15)に記述される転写ターミネーターに基づく、tracrRNAの生物情報学的な予測によりさらに確認した。第II種CRISPR−Casの遺伝子座は、ほとんどが遺伝子の最小セット(タイプII−C、青)であるcas9、cas1及びcas2を伴い、時として第4の遺伝子csn2a/b(タイプII−A、黄及び橙)またはcas4(タイプII−B、緑)を伴う当該cas遺伝子組成において、差異化できる。このCRISPR配置は、同じ方向(タイプII−A、黄及び橙)かまたは反対方向(タイプII−B及びC、青及び緑)のcasオペロンに転写できる。tracrRNAの位置及びその転写方向は、そのグループ内で異なる(ストレプトコッカス・サーモフィルス**のタイプII−Aと、ここ(黄色)に示されるその他の種由来のタイプII−Aとの比較及びカンピロバクター・ジェジュニのタイプII−Cと髄膜炎菌及びパスツレラ・ムルトシダ(青)のタイプII−Cとの比較)。
同上
Cas9オーソログの系統及び選択された細菌IItype II CRISPR−Casシステムの模式図。(A)代表的なCas9オーソログの多重配列配置の、選択された及び有益な位置から再構成されたCas9の系統樹を示す(補足図S2及び補足表S2を参照)。II−A、II−B及びII−Cに分類されるCas9オーソログのサブタイプが、網掛けの囲みで強調されている。色分けされた枝部は、同じ遺伝子座構造を有する密接に関連した遺伝子座の、異なるタンパク質をグループ化している(15)。各タンパク質は、遺伝子識別番号(the GenInfo identifier(GI))により、次いで細菌株名により表される。ブートストラップ値が、節点ごとに与えられる(物質及び方法を参照)。サブタイプII−A及びII−Bの単系統クラスターは、高いブートストラップ値により支持されていることに留意のこと。その枝長に対する尺度バーが、アミノ酸置換/部位の予測値として与えられる。(B)化膿レンサ球菌SF370、ミュータンス菌UA159、ストレプトコッカス・サーモフィルスLMD−9*(CRISPR3)、**(CRISPR1)、カンピロバクター・ジェジュニNCTC11168、髄膜炎菌Z2491、パスツレラ・ムルトシダPm70及びフランシセラ・ノビシダU112における、第II種(Nmeni/CASS4)CRISPR−Casの遺伝子座。赤矢印、tracrRNAの転写方向;青矢印、cas遺伝子;黒長方形、CRISPRリピート部;緑ひし形、スペーサー;太い黒線、リーダー配列;黒矢印、推定pre−crRNAプロモーター;HP、仮想タンパク質。左側に表示される色分けのバーは、Cas9系統樹の枝の色に対応している。カンピロバクター・ジェジュニ及び髄膜炎菌pre−crRNAsの転写方向及び推定リーダー位置は、既に公開済みのRNA配列データから導いた(15)。パスツレラ・ムルトシダのCRISPR−Cas遺伝子座の構造は、それに非常に類似した髄膜炎菌の遺伝子座を基に推定し及び強く予測されるプロモーター及び(15)に記述される転写ターミネーターに基づく、tracrRNAの生物情報学的な予測によりさらに確認した。第II種CRISPR−Casの遺伝子座は、ほとんどが遺伝子の最小セット(タイプII−C、青)であるcas9、cas1及びcas2を伴い、時として第4の遺伝子csn2a/b(タイプII−A、黄及び橙)またはcas4(タイプII−B、緑)を伴う当該cas遺伝子組成において、差異化できる。このCRISPR配置は、同じ方向(タイプII−A、黄及び橙)かまたは反対方向(タイプII−B及びC、青及び緑)のcasオペロンに転写できる。tracrRNAの位置及びその転写方向は、そのグループ内で異なる(ストレプトコッカス・サーモフィルス**のタイプII−Aと、ここ(黄色)に示されるその他の種由来のタイプII−Aとの比較及びカンピロバクター・ジェジュニのタイプII−Cと髄膜炎菌及びパスツレラ・ムルトシダ(青)のタイプII−Cとの比較)。
RNaseIIIは、第II種CRISPR−CasにおいてtracrRNA:pre−crRNAプロセスを一般的に行う。化膿レンサ球菌WT、△rnc及びrncオーソログまたはtracrRNA(上)とcrRNAリピート部(下)に対して精査された変異体(切り捨てられたrnc及び不活性化した(死滅した)(D51A)rnc)と相補的な△rncからの、トータルRNAのノーザンブロッティング解析。nt(ヌクレオチド)でのRNAサイズ及びtracrRNA(赤−黒)そしてcrRNA(緑−黒)の模式図を、右側に示す(16)。縦方向の黒の矢印は、プロセスの場所を示し、tracrRNA−171 nt及びtracrRNA−89 nt形成体は、tracrRNA一次転写産物に対応している。tracrRNA−75 nt及びtracrRNA39−42 nt形成体の存在は、tracrRNAとpre−crRNAの共プロセスを示す。化膿レンサ球菌tracrRNA及びpre−crRNAは、全ての解析RNaseIIIオーソログにより共プロセス化される。化膿レンサ球菌RNaseIIIの短縮型及び触媒不活性変異体はともに、tracrRNA:pre−crRNAプロセスには、欠失している。
Cas9の保存モチーフは、DNA干渉に対して必要であるが、RNaseIIIによる二重分子RNAには必要ではない。(A)化膿レンサ球菌Cas9の模式図。保存HNH及びスプリットRuvCモチーフそして解析されたアミノ酸が示される。(B)化膿レンサ球菌WT、△cas9及びpEC342またはtracrRNAとcrRNAリピートに対して精査された、cas9WTまたは突然変異遺伝子を含むpEC342と相補的な△cas9からの、トータルRNAのノーザンブロッティング解析。tracrRNA−75 nt及びcrRNA−39−42 nt形成体を産生するtracrRNA及びpre−crRNAの成熟が、当該cas9変異体の相補的な全ての△cas9株に観察される。(C)生体内のプロトスペーサーの標的化。化膿レンサ球菌WT及びpEC85(ベクター)、pEC85Ωcas9(cas9)、pEC85ΩspeM(speM)を伴う△cas9、そしてspeM及びcas9変異体を含むpEC85ΩtracrRNA−171 ntプラスミドの、形質転換試験。プラスミドDNAのμg当たりのコロニー形成ユニット(CFU:colony forming units)は、少なくとも3回の独立した実験により決定した。1つの代表的な実験での3連測定結果である+/−SDを示す。Cas9N854Aは、WTCas9に対して観察されたこの残基が、DNA干渉で促進されなかったことを示す、プロトスペーサープラスミド耐性を示さなかった唯一の変異体である。(D)インビトロのプラスミド開裂。等モル量の二重分子RNA−speMの存在下で、25nMのCas9WTまたは変異体と共にインキュベートされたspeMプロトスペーサー(pEC287)を含む、プラスミドDNA(5nM)の寒天ゲル電気泳動(材料及び方法を参照)。その他のCas9変異体が、ニックされた産物のみを創出する一方での、Cas9WT及びN854A産生の直鎖状開裂産物。M:1kbDNAラダー(Fermentas社)、oc:開環状、li:直鎖状、sc:スーパーコイル状。
密接な関係のCRISPR−Cas由来のCas9は、RNase IIIにより、RNAプロセス中に化膿レンサ球菌Cas9の役割置換できる。(A)選ばれた細菌種由来のCas9の模式図。保存モチーフ間(RuvC及びHNH)のタンパク質のサイズ及び距離が、スケール描写される。補足図S1を参照のこと。(B)化膿レンサ球菌WT、△cas9及びtracrRNAとcrRNAリピートに対して精査された、pEC342(tracrRNA−171 nt及び化膿レンサ球菌由来のcasオペロンプロモーターを含むバックボーンベクター)またはcas9オーソログ遺伝子を含むpEC342ベースのプラスミドと相補的な△cas9から抽出された、トータルRNAのノーザンブロッティング解析。化膿レンサ球菌tracrRNA及びpre−crRNAの成熟形態は、化膿レンサ球菌Cas9WTまたは密接な関係の、ミュータンス菌及びストレプトコッカス・サーモフィルス由来のCas9オーソログの存在下においてのみ観察される。
Cas9オーソログは、インビトロで、それらの同種二重分子RNA及び特定のPAMの存在下で、DNAを開裂する。(A)選択された細菌種に対応したスペーサー配列のBLAST解析から誘導されたプロトスペーサー隣接配列ロゴプロット。当該ロゴプロットは、当該プロトスペーサー配列の下流の最も豊富なヌクレオチドの図解表現を与える。カッコ内の数字は、解析されたプロトスペーサーの数に対応している。(B)特定PAMの検証に対応して設計されたDNA部位。各種のロゴプロットを基に、当該speMプロトスペーサー及び提案されたPAMを含むか(PAM+)または含まない(PAM−)、その指示された配列下流を含むように、プラスミドDNA部位を設計した。予測されたPAMは、活性化に必要なヌクレオチド(データは非表示)を絞り込む開裂アッセイにより検証された。したがって、使用された配列は、(A)に示されたロゴプロットとはわずかに異なる。当該PAMの一部ではないその他のヌクレオチドの高存在量は、当該プロトスペーサーを含むコード配列冗長度により、及び見出されたプロトスペーサー標的の限定数により説明できる。最後のカラムは、各種に対応したPAM配列を示しており、それらは、すでに公開済みであり(シンボルマークなし)またはこの業績から導かれる(#)。(C)二重分子RNAによる生体内プラスミド開裂アッセイ。10bpのプロトスペーサー隣接配列を伴うプラスミドDNA上のCas9オーソログ((B)に要約)。その二重分子RNAとの複合体中の各Cas9オーソログは、対応する種特異的なPAMを含む(PAM+)プラスミドを開裂する。その特定PAMを含まない(PAM−)プラスミドには、開裂が観察されない。li:直鎖状開裂産物、sc:スーパーコイル状プラスミドDNA。
Cas9と二重分子RNAの共進化。(A)オーソロガスな二重分子RNAを伴う複合体中の化膿レンサ球菌Cas9(上パネル)及び化膿レンサ球菌二重分子RNAを伴う複合体中のオーソロガスCas9酵素(下パネル)を使用した生体内プラスミド開裂アッセイ。プロトスペーサーspeM及び化膿レンサ球菌PAM(NGG)を含むプラスミドDNAを、化膿レンサ球菌Cas9を伴う複合体中の異なる二重分子RNAと共にインキュベートした。この二重分子RNAのtracrRNA及びcrRNA−リピート配列は、sepMを標的化するcrRNAスペーサーを伴う、指定された細菌種由来である。下パネルにおいて、sepM及び当該特定のPAMを含むプラスミドDNAを、化膿レンサ球菌二重分子RNAを伴う複合体中のCas9オーソログと共にインキュベートした。化膿レンサ球菌Cas9は、化膿レンサ球菌、ミュータンス菌及びストレプトコッカス・サーモフィルス*(黄色)の存在下でのみ、プラスミドDNAを開裂できる。化膿レンサ球菌由来の二重分子RNAは、化膿レンサ球菌、ミュータンス菌及びストレプトコッカス・サーモフィルス*(黄色)由来のCas9を伴ってのみ、DNA開裂を仲介できる。(B)Cas9及び二重分子RNAのオーソログの互換性の概要図5に従い、特定PAM配列を使用した。色分けは、type II CRISPR−Casのサブグループを反映している(図1)。試験条件下で観察された、+++:100−75%の開裂活性、++:75−50%の開裂活性、+:50−25%の開裂活性、−:25−0%の開裂活性。同じtype II グループ由来のCas9と二重分子RNAの二重分子は、交換可能であり、及び依然としてそのPAM配列のCas9特異性を与えるプラスミド開裂を仲介できる。補足図S10も参照。
本研究において精製されたCas9タンパク質の生化学的特性及びSDS−PAGE解析。(A)化膿レンサ球菌Cas9WT及び変異体の生化学的特徴(b遺伝子番号(GI)識別子、cε、吸光係数)が同一である、Cas9オーソロガスタンパク質のa記録の特徴の概要。(B)化膿レンサ球菌由来のCas9の精製変異体のDSD PAGE解析。(C)精製Cas9オーソログのSDS PAGE解析。M:未染色タンパク質ラダーPageRulerTM(Thermo Scientific社)。
代表的なCas9配列の多重配列の配置(補足表S2及び材料と方法を参照)。以下の選択されたCas9配列のGI識別子を伴い、Jnetとして記述される行は、対応するサブグループ内のCas9の予測二次構造を与える(各Jnet以下に示される配列)。保存モチーフは、その配置の下にマークされ及びその変異アミノ酸残基は、強調表示されている。アスタリスクは、当該Cas9系統樹の再構築に対応して選択された情報の位置を示している。
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
同上
代表的なCas1配列の多重配列配置(補足表S2及び材料と方法を参照)。当該Cas1系統樹の再構築に対応して選択された情報の位置は、この配列の下部にアスタリスクでマークされている。
同上
同上
同上
代表的なCas9及びCas1配列の系統解析。選択された、Cas1及びCas9の多重配列配置の情報位置由来のCas1(左)及びCas9(右)の系統樹が示される(図1並びに補足図S2及びS3を参照)。当該Cas1系統樹は、第I種CRISPR−Casシステムの選択されたCas1オーソログの外縁グループと根が繋がっている。II−A、II−B及びII−Cとして分類される種の当該Cas1及びCas9オーソログが、網掛け囲みで強調表示されている。同じ枝の色を、両系統樹の各細菌株に対して使用した。各タンパク質は、遺伝子番号(GI)識別子とそれに続く細菌株名により表示されている。各節点に対して、そのブートストラップ値が与えられている(材料と方法を参照)。その枝長に対するスケールバーが、部位あたりのアミノ酸置換の推定数として与えられている。高ブートストラップ値に支持される両系統樹上における、その樹形とサブグループII−A及びII−Bの単一系統クラスターの類似性に留意のこと。
同上
RNase IIIは、tracrRNAの指示した機能を実行し、type II CRISPR−Casにおいてpre−crRNAを処理する。化膿レンサ球菌WT、△rnc及びrncオーソログまたは(A)tracrRNA及び(B)crRNAリピートと共に精査された、rnc変異体と相補的な△rncからの、トータルRNAのノーザンブロッティング解析。(B)におけるノーザンブロッティングの下に示される破線の囲いは、高い暴露を伴ったブロッティングの場所を示す。全てのRNAse IIIオーソログは、化膿レンサ球菌のtracrRNA及びpre−crRNAを共進化できる。RNase IIIIの短縮型または触媒活性の無い(死滅した)変異体に相補的な△rncにおいて、tracrRNA及びpre−crRNAの成熟形態は、観測されなかった。
同上
本研究に使用した細菌エンドヌクレアーゼIIIの多重配列配置。当該配置の下に示されるドメインは、大腸菌由来のRNase IIIに示されるドメインに従う(58、59)。当該触媒不活性の「rnc死滅」変異体において突然変異した保存触媒活性アスパラギン酸残基及び当該切り捨てられたrnc変異体の最終アミノ酸が、各々アスタリスク及び矢印で、上述の配置に示される。
Cas9の保存された触媒活性アミノ酸残基は、RNase IIIによる二重分子RNAのプロセスで促進されない。化膿レンサ球菌WT、△cas9及びpEC342(tracrRNA−171 nt及び化膿レンサ球菌由来の野生のcasオペロンプロモーターを含むバックボーンベクター)または(A)tracrRNAまたは(B)crRNAリピートプローブ相補形成している、Cas9WTまたは変異体をコードするpEC342由来のプラスミドと相補的な△cas9から抽出されたトータルRNAのノーザンブロッティング解析(補足表S1)。tracrRNA:crRNAの同時処理は、Cas9点変異体をコードする全ての株で観察される。従来の研究において、我々は、cas9欠失変異体において、低い存在量のtracrRNAを観察したことに留意のこと(16)。そのため、cas9の相補性試験に使用されたプラスミドを、cas9に加えてtracrRNAをコードするように設計した。
Cas9とtracrRNA:crRNAの共進化。化膿レンサ球菌WT、△cas9及びpEC342または(A)tracrRNAまたは(B)crRNAリピートプローブとハイブリダイズしている、Cas9WTまたは変異体をコードするpEC342由来のプラスミドと相補的な△cas9から抽出されたトータルRNAのノーザンブロッティング解析(補足表S1)。化膿レンサ球菌Cas9 WT及び密接な関係の、ミュータンス菌及びストレプトコッカス・サーモフィルス由来のCas9オーソログだけが、化膿レンサ球菌のtracrRNA:crRNAの共プロセスに寄与できる。
同上
Cas9オーソログは、それらの同種二重分子RNA及び特定のPAMの存在下においてプラスミドDNAを開裂する。二重分子RNAのアガロースゲル電気泳動解析:speMプロトスペーサー及び隣接するWT PAM(PAM+)、不完全なPAM(PAM±)またはPAMなし(PAM−)を含む、プラスミドDNA(5 nM)へのCas9滴定(0−100 nMの二重分子RNA−Cas9複合体)。化膿レンサ球菌、ミュータンス菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス*、ストレプトコッカス・サーモフィルス**及び髄膜炎菌に対しては、当該PAM配列が、公開済みである(27、28、53、54)。その他の細菌種に対しては、研究された、または関連した菌株において特定されたプロトスペーサーの下流配列に基づいてPAMは予測された(補足表S2及び材料と方法を参照)。speMプロトスペーサーを標的化するcrRNAの直下に位置する10bpの配列を示す。そのPAM配列に従って予測されるヌクレオチドを、グレーで網掛けしてある。li:直鎖状開裂産物、sc:スーパーコイル状プラスミドDNA、M:1kbのDNAラダー。
二重分子RNAとの組み合わせにおけるCas9オーソログのインビトロでのプラスミド開裂アッセイの概要。開裂アッセイのアガロースゲル電気泳動。等モル濃度の各二重分子RNAオーソログとの複合体を形成した、(A)ミュータンス菌Cas9(50nM)、(B)ストレプトコッカス・サーモフィルス*Cas9(25nM)、(C)ストレプトコッカス・サーモフィルス**Cas9(100nM)、(D)カンピロバクター・ジェジュニCas9(100nM)、(E)髄膜炎菌Cas9(100nM)、(F)パスツレラ・ムルトシダCas9(25nM)、(G)フランシセラ・ノビシダCas9(100nM)を、speMプロトスペーサー配列及び解析された当該Cas9オーソログに特異的なPAM配列を含むプラスミドDNA(5 nM)とインキュベートした。li:直鎖状開裂産物、sc:スーパーコイル状プラスミドDNA、M:1 kbのDNAラダー。
Cas9系統の樹形は、type II CRISPR−Casシステムの水平及び垂直伝播示唆している。図1、補足図S4及び補足表S4を参照のこと。代表的なCas9オーソログを含む細菌株の分類(門を色で)及び生息地シンボルで)に対応したコードを示す(右パネル)。進化的に離れている細菌を分類しているが(1及び3)、主として類似の起源(クラスター1のヒト及びクラスター3周囲のサンプル)から単離されるクラスターは、type II システムの水平伝播を示唆する。クラスター2、4及び5は、当該システムの水平伝播を示す多様な生息地から単離された、密接に関連する細菌を分類している。
同上
tracrRNA:crRNAリピート部の二重分子は、密接に関連するCas9オーソログの遺伝子座において、類似した二次構造を形成している。プロセス処理されたtracrRNA(赤)及びリピート部から誘導された成熟crRNA(グレー)配列の非リピート配列は、研究された各type II CRISPR−Cas遺伝子座に対して、共に折りたたまれていた(材料と方法を参照)。密接に関連するCas9の遺伝子座由来の二重分子RNAを、左に示したカラーバーでグループ化している(図1及び補足図S4を参照)。同じグループに属するRNA二重分子は、構造的な類似性を表しており、Cas9による二重分子RNAの認識における構造の役割を示唆している。

0036

専門用語

0037

本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は、その技術的及び科学的用語を本明細書で別に定義しない限り、本発明分野に属する当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。

0038

本明細書で互換的に使用する、用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、本用語は、非限定的に、一本鎖、二本鎖、または多重鎖DNAもしくはRNA、ゲノムDNA、cDNADNA−RNAハイブリッド、またはプリン及びピリミジン塩基またはその他の天然の、化学的にまたは生物学的に改変された、人工の、または誘導体ヌクレオチド塩基を含有するポリマーを含む。「オリゴヌクレオチド」は一般的に、一本鎖または二本鎖DNAの、約5から約100ヌクレオチド間のポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的に対して、オリゴヌクレオチドの長さの上限はない。オリゴヌクレオチドはまた、「オリゴマー」または「オリゴ」として知られており、遺伝子から単離または当技術分野で公知の方法により化学的に合成されて良い。用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、記述される実施形態に応用が可能であるとして、一本鎖(センスまたはアンチセンスなどの)及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。

0039

「ゲノムDNA」は、非限定的に、細菌、真菌、古細菌、植物または動物を含む生命体のゲノムのDNAを指す。

0040

DNAを「操作する」は、結合する、そのDNAの単鎖ニッキングする、または二本鎖を開裂する(すなわち、切断する)を含み、またはそのDNAまたはそのDNAに関連するポリペプチドを改変する(例えば、段落[0161]または[0162]の改変)、ことを含む。DNAの操作では、そのDNAによりコードされたRNAまたはポリペプチドの発現サイレンス、活性化、または調節(増加または減少のいずれか)できる。

0041

ステムループ構造」は、主として単鎖ヌクレオチドの領域(ループ部位)が片側に連結した、二本鎖(ステム部位)を形成する、既知もしくは予測されるヌクレオチド領域を含む二次構造を有する核酸を指す。用語「ヘアピン」及び「折り返し(フォールドバック)」構造はまた、ステムループ構造を指して本明細書で使用する。そのような構造は、当技術分野では公知であり及びこれらの用語は、一貫して当分野で周知の意味で使用する。当業者には公知のことだが、ステムループ構造は、正確な塩基対を必要としない。したがって、このステムは、1つ以上のミスマッチな塩基を含む。あるいは、その塩基対は正確であって良く、すなわちいかなるミスマッチをも含まない。

0042

用語「ハイブリダイズできる(hybridizable)」または「相補的な(complementary)」または「実質的に相補的な(substantially complementary)」により、核酸(例えば、RNA)が、非共有結合、すなわちワトソンクリック型塩基対及び/またはG/U塩基対を形成すること、配列特異、非平行、温度及び溶液イオン強度が適切なインビトロ及び/またはインビボ条件下での方法(すなわち、相補的核酸に特異的に結合する核酸)における他の核酸への「アニール」または「ハイブリダイゼーション」を可能にする核酸の配列を含む、ことを意味する。当技術分野では公知のことであるが、標準的ワトソン・クリック型塩基対には、チミジン(T)と対を成すアデニン(A)、ウラシル(U)と対を成すアデニン(A)、及びシトシン(C)と対を成すグアニン(G)[DNA、RNA]を含む。さらに、2つのRNA分子(例えば、dsRNA)間、グアニン(G)とウラシル(U)の塩基対間でのハイブリダイゼーションもまた、当技術分野では公知である。例えば、G/U塩基対は、mRNAにおけるコドンと塩基対を成すtRNAアンチコドン脈絡において、その遺伝子コード縮退(すなわち、冗長性)に対して部分的に対応している。本開示の文脈において、ガイドRNA分子のタンパク質結合セグメント(dsRNA二重分子)のグアニン(G)は、ウラシル(U)と相補的であると考えられ、及びその逆もある。そのように、G/U塩基対が、目的のヌクレオチドの位置で、ガイドRNA分子のタンパク質結合セグメント(dsRNA二重分子)を形成できる場合、その位置は、非相補的であるとみなされず、代わりに相補的である、とみなされる。

0043

ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は公知であり、Sambrook,J.,Fritsch,E.F.及びManiatis,T. Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(1989)、それらの中の、特に11章及び表11.1、及びSambrook,J.及びRussell,W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor(2001)に例示されている。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「妥当性」を決定する。

0044

ハイブリダイゼーションには、塩基間の不一致が起こり得るとしても、2つの核酸が相補的配列を含むことが必要である。2つの核酸間でのハイブリダイゼーションに適切な条件は、その核酸の長さ、相補性の度合い、当技術分野で公知の変動要因に依存する。2つのヌクレオチド配列間の相補性度合いが大きいほど、それら配列を有する核酸ハイブリッド溶解温度(Tm)の値は大きい。相補性の長さが短い(例えば、35以下の、30以下の、25以下の、22以下の、20以下の、18以下のヌクレオチドにわたる相補性)核酸間のハイブリダイゼーションに対しては、ミスマッチの位置が重要になる(Sambrook et al.,supra,11.7−11.8を参照)。通常、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約10のヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸に対応した具体的な最小の長さは、少なくとも約15ヌクレオチド、少なくとも約20ヌクレオチド、少なくとも約22ヌクレオチド、少なくとも約25ヌクレオチド、及び少なくとも約30ヌクレオチドである。さらに、温度及び洗浄液塩濃度は、相補領域の長さ及び相補性の度合いなどの要因により必要に応じて調整されて良いことは、当業者には理解されるであろう。

0045

ポリヌクレオチドの配列は、特異的に相補的であるまたは相補的である標的核酸の配列に対して、100%相補的である必要がないことは、当業者には理解される。さらに、ポリヌクレオチドは、1つ以上のセグメントにわたりハイブリダイズし、そのため介在するまたは隣接するセグメントは、そのハイブリダイゼーション(例えば、ループ構造またはヘアピン構造)に関与しない。ポリヌクレオチドは、標的核酸配列が標的化された領域に対して少なくとも70%の、少なくとも80%の、少なくとも90%の、少なくとも95%の、少なくとも99%の、または100%の配列相補性を含むことができる。例えば、アンチセンス化合物の20ヌクレオチドの18が標的領域に相補的であるアンチセンス核酸は、特異的にハイブリダイゼーションをし、90%の相補性に相当する。この例において、残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチド一緒にまたは組み入れられて良く及び互いにまたは相補的ヌクレオチドと隣接する必要はない。核酸内の核酸配列の、特定の長さ間の相補性パーセンテージは、当技術分野で公知のBLASTプログラム(基本的な局在配置探査ツール)及びパワーBLASTプログラム(Altschul et al.,J.Mol.Biol.,1990,215,403−410、Zhang及びMadden,Genome Res.,1997,7,649−656)を使用し、または、Smith及びWaterman(Adv.Appl.Math.,1981,2,482−489)のアルゴリズムを利用し、デフォルト設定を使用したギャッププログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package,Version 8 for Unix(登録商標),Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis.)を使用して、規定通りに決定できる。

0046

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用し、及び任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を示し、コードされた及び非コードのアミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導されたアミノ酸、及び改変されたペプチドのバックボーンを有するポリペプチドを含むことができる。

0047

本明細書で使用する「結合している」(例えば、ポリペプチドのRNA結合ドメインを指して)は、高分子間(例えば、タンパク質と核酸の間)の非共有性相互作用を指す。非共有性相互作用の状態にある一方で、その高分子は、「関連している」または「相互作用している」または「結合している」といわれる(例えば、分子Xが、分子Yと相互作用しているといわれる場合、非共有的な方法で、分子Xは、分子Yに結合している)。結合相互作用の全ての成分が、配列特異性である必要は無く(例えば、DNAバックボーンのリン酸残基)、しかし結合相互作用のある部分は、配列特異性であって良い。結合相互作用は一般的に、10−6 M未満の、10−7 M未満の、10−8 M未満の、10−9M未満の、10−10 M未満の、10−11 M未満の、10−12 M未満の、10−13 M未満の、10−14 M未満の、または10−15 M未満の解離定数(Kd)により特徴付けられる。「親和性」は、結合の強さを指し、増加した結合親和性は、低いKdと相関している。「結合ドメイン」により、他の分子に非共有的に結合できるタンパク質ドメインを意味する。結合ドメインは、例えば、DNA分子DNA結合タンパク質)、RNA分子(RNA結合タンパク質)及び/またはタンパク質分子(タンパク質結合タンパク質)に結合できる。タンパク質ドメイン−結合タンパク質の場合、それ自身(ホモダイマーホモトリマーなど)に結合でき及び/または異なるタンパク質または複数タンパク質の1つ以上の分子に結合できる。

0048

用語「保存アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質における互換性を指す。例えば、グリシンアラニンバリンロイシン、及びイソロイシンから成る脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループ、セリン及びスレオニンから成る脂肪族水酸基側鎖を有するアミノ酸のグループ、アスパラギン及びグルタミンから成るアミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループ、フェニルアラニンチロシン、及びトリプトファンから成る芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループ、リジンアルギニン、及びヒスチジンから成る塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループ、グルタミン酸及びアスパラギン酸から成る酸性側鎖を有するアミノ酸のグループ、及びシステイン及びメチオニンから成る硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループである。例示的な保存アミノ酸置換基には、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンがある。

0049

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してあるパーセントの「配列同一性」を有し、並べた際に、及び同じ相対位置において、その2つの配列を比較すると、塩基またはアミノ酸のパーセンテージが同じであることを意味する。配列同一性は、多数の異なる方法により決定できる。配列同一性を決定するために、配列を様々な方法及びコンピュータープログラム(例えば、BLAST、T−COFFEE、MUSCLE、MAFFTなど)で配置することができ、ncbi.nlm.nili.gov/BLAST, ebi.ac.uk/Tools/msa/tcoffee/,ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/, mafft.cbrc.jp/alignment/software/を含むウェブサイトが利用できる。例えば、Altschul et al.(1990),J.Mol.Bioi.215:403−10を参照のこと。当業界における配列配置の標準を、別のCas9オーソログにおけるアミノ酸残基に「対応した」Cas9オーソログにおけるアミノ酸残基を決定するために、本発明において使用する。別のCas9オーソログにおけるアミノ酸残基に対応した、Cas9オーソログにおけるアミノ酸残基は、その配列の配置における同じ位置に現れる。

0050

特定のRNAを「コード」するDNA配列は、RNAに転写されるDNA核酸配列である。DNAのポリヌクレオチドは、タンパク質に転写されるRNA(mRNA)をコードして良く、またはDNAのポリヌクレオチドは、タンパク質に転写されないRNA(例えば、tRNA、rRNA、またはガイドRNA、「非コード」RNAまたは「ncRNA」とも呼ばれる)をコードしても良い。「タンパク質コード配列」または特定のタンパク質またはポリペプチドをコードする配列とは、適切な調整配列の制御下に置かれた場合、インビトロまたはインビボでmRNAに転写され(DNAの場合)及びポリペプチドに翻訳される(mRNAの場合)、核酸配列である。そのコード配列の境界は、5’末端N末端)での開始コドン及び3’末端(C末端)での転写停止のノンセンスコドンにより決定される。コード配列には、非限定的に、原核生物または真核生物mRNA由来のcDNA、原核生物または真核生物DNA由来のゲノムDNA配列、及び合成核酸を含むことができる。転写終了配列は、通常はそのコード配列の3’に位置しているであろう。

0051

本明細書で使用する場合、「プロモーター配列」は、RNAポリメラーゼを結合し及び下流のコード(3’方向)または非コード配列の転写を開始することができるDNA調節領域である。本発明を定義する目的に対応して、当該プロモーター配列は、その転写開始部によりその3’末端に結合され、及び最低限の塩基または背景より高く検出可能なレベルで転写開始するのに必要な最低限のエレメントを含むように、上流(5’方向)に伸長する。当該プロモーター配列内に、RNAポリメラーゼの結合に応答するタンパク質結合ドメインと同時に、転写開始部が見出されるであろう。真核生物プロモーターは多くの場合、常にではないが、「TATA」ボックス及び「CAT」ボックスを含む。誘導性プロモーターを含む多様なプロモーターが、本発明の多様なベクターを誘導するために使用されて良い。

0052

プロモーターは、常時活性型プロモーター(すなわち、恒常的に活性/「ON」状態であるプロモーター)であり得て、それは、誘導性プロモーター(すなわち、活性/「ON」または非活性/「OFF」の状態であるプロモーター)であって良く、外部刺激、例えば、特定の温度、化合物またはタンパク質の存在により制御され、それは、空間的に制約されたプロモーター(すなわち、転写制御エレメント、エンハンサーなど)であって良く(例えば、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーターなど)、及び一時的に制約されたプロモーター(すなわち、そのプロモーターは、胚発生の特定の期間または生物学的過程、例えば、マウスの毛包サイクル、の間に、「ON」状態または「OFF」状態にある)であって良い。

0053

適切なプロモーターは、ウイルスから誘導でき、それゆえウイルスプロモーターと呼ばれ、またはそれらは、原核生物または真核生物を含む、任意の生命体から誘導できる。適切なプロモーターは、任意のRNAポリメラーゼ(例えば、pol I、pol II、pol III)による発現を誘導するために利用できる。例示的なプロモーターには、非限定的に、SV40初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長鎖末端反復LTR)プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター(Ad MLP)、単純ヘルペスウイルス(HSV)プロモーター、CMV即時初期プロモーター領域(CMVIE)などのサイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、ヒトU6小核プロモーター(U6)(Miyagishi et al.,Nature Biotechnology 20,497−500(2002))、強化U6プロモーター(例えば、Xia et al.,Nucleic AcidsRes.2003 Sep 1;31(17))、ヒトH1プロモーター(H1)などを含む。

0054

例示的な誘導性プロモーターには、非限定的に、T7RNAポリメラーゼプロモーター、T3RNAポリメラーゼプロモーター、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシドIPTG)−調節プロモーター、ラクトース誘導プロモーターヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなどを含む。誘導プロモーターはそのため、非限定的に、ドキシサイクリン、T7RNAポリメラーゼなどRNAポリメラーゼ、エストロゲン受容体、エストロゲン受容体融合などを含む分子により調節できる。

0055

いくつかの実施形態において、当該プロモーターは、空間的に制約されたプロモーター(すなわち、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーターなど)であり、そのため多細胞の生命体においては、当該プロモーターは、特定の細胞のサブセットにおいて活性(すなわち「ON」)である。空間的に制約されたプロモーターはまた、エンハンサー、転写制御エレメント、制御配列などを指して良い。任意の便利な空間的に制約されたプロモーターを利用して良く及び適切なプロモーターの選定(例えば、脳特異的プロモーター、ニューロンのサブセットに発現を誘導するプロモーター、生殖細胞に発現を誘導するプロモーター、に発現を誘導するプロモーター、筋肉に発現を誘導するプロモーター、膵臓膵島細胞に発現を誘導するプロモーターなど)は、その生命体に依存するであろう。例えば、様々な空間的に制約されるプロモーターが、植物、ハエ、ワーム、哺乳類、マウス、などで知られている。したがって、空間的に制約されるプロモーターは、生命体に依存して、非常に多様な異なる組織及び細胞における、部位配向性改変ポリペプチドをコードする核酸の発現を調節するために使用できる。いくつかの空間的に制約されるプロモーターはまた、一時的に制約され、そのためそのプロモーターは、胚発生の特定の時期の間または生物学的過程の特定の時期(例えば、マウスの毛包サイクル)の間に、「ON」状態または「OFF」状態にある。

0056

説明のために、空間的に制約されるプロモーターの例として、非限定的に、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、平滑筋特異的プロモーター視細胞特異的プロモーターなどを含む。ニューロン特異的な空間的に制約されるプロモーターには、非限定的に、ニューロン特異的エノラーゼ(NSE)プロモーター(例えば、EMBLHSENO2、X51956を参照)、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素(AADC)プロモーター、ニューロフィラメントプロモーター(例えば、GenBankHUMNFL、L04147を参照)、シナプシンプロモーター(例えば、GenBank HUMSYNIB、M55301を参照)、thy−1プロモーター(例えば、Chen et al.(1987)Cell 51:7−19、及びLlewellyn,et al.(2010)Nat.Med.16(10):1161−1166を参照)、セロトニン受容体プロモーター(例えば、GenBank S62283を参照)、チロシン水酸化酵素プロモーター(TH)(例えば、Oh et al.(2009)Gene Ther 16:437、Sasaoka et al.(1992)Mol.Brain Res.16:274、Boundy et al.(1998)J.Neurosci.18:9989、及びKaneda et al.(1991)Neuron 6:583−594を参照)、GnRHプロモーター(例えば、Radovick et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:3402−3406を参照)、L7プロモーター(例えば、Oberdick et al.(1990)Science 248:223−226を参照)、DNMTプロモーター(例えば、Bartge et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3648−3652を参照)、エンケファリンプロモーター(例えば、Comb et al.(1988)EMBO J.17:3793−3805を参照)、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)プロモーター、Ca2+−カルモジュリン依存性蛋白質キナーゼII−α(CamKIM)プロモーター(例えば、Mayford et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:13250、及びCasanova et al.(2001)Genesis 31:37を参照)、CMVエンハンサー/血小板由来成長因子−pプロモーター(例えば、Liu et al.(2004)Gene Therapy 11:52−60を参照)などを含む。

0057

脂肪細胞特異的なの空間的に制約されるプロモーターには、非限定的に、aP2遺伝子プロモーター/エンハンサー、例えばヒトaP2遺伝子の−5.4kbから+21bpの間の領域(例えば、Tozzo et al.(1997)Endocrinol.138:1604、Ross et al.(1990)Proc.Natl.Acad. Sci.USA 87:9590、及びPavjani et al.(2005)Nat.Med.11:797を参照)、グルコーストランスポーター−4(GLUT4)プロモーター(例えば、Knight et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:14725を参照)、脂肪酸転移酵素FAT/CD36)プロモーター(例えば、Kuriki et al.(2002)Biol.Pharm.Bull.25:1476、及びSato et al.(2002)J.Biol.Chem.277:15703を参照)、ステアロイルCoAデサチュラーゼ−1(SCD1)プロモーター(Tabor et al.(1999)J.Biol.Chem.274:20603)、レプチンプロモーター(例えば、Mason et al.(1998)Endocrinol.139:1013、及びChen et al.(1999)Biochem.Biophys.Res.Comm.262:187を参照)、アディポネクチンプロモーター(例えば、Kita et al.(2005)Biochem.Biophys.Res.Comm. 331:484、及びChakrabarti 2010)Endocrinol.151:2408を参照)、アジシンプロモーター(例えば、Platt et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:7490を参照)、レジスチンプロモーター(例えば、Seo et al.(2003)Molec.Endocrinol.17:1522を参照)、などを含む。

0058

心筋細胞特異的な空間的に制約されるプロモーターには、非限定的に、ミオシン軽鎖−2、ミオシン重鎖AE3、心筋トロポニンC、心筋アクチンなど、遺伝子由来の制御配列を含む。Franz et al.(1997)Cardiovasc.Res.35:560−566、Robbins et al.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.752:492−505、Linn et al.(1995)Circ.es.76:584591、Parmacek et al.(1994)Mol.Cell.Biol.14:1870−1885、Hunter et al.(1993)Hypertension 22:608−617、及びSartorelli et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4047−4051を参照。

0059

平滑筋特異的な空間的に制約されるプロモーターには、非限定的に、SM22aプロモーター(例えば、Akyiirek et al.(2000)Mol.Med.6:983、及びUS7,169,874を参照)、スムーテリン(smoothelin)プロモーター(例えば、WO 2001/018048を参照)、平滑筋アクチンプロモーター、などを含む。例えば、SM22aプロモーターの0.4kb領域内には2つのCArGエレメントが位置しており、血管平滑筋細胞に特異的な発現を仲介することが示されている(例えば、Kim,et al.(1997)Mol.Cell.Biol.17,2266−2278;Li,et al.,(1996)J.Cell Biol.32,849−859、及びMoessler,et al.(1996)Development 122,2415−2425を参照)。

0060

視細胞特異的な空間的に制約されるプロモーターには、非限定的に、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター(Young et al.(2003)Ophthalmol.Vis.Sci.44:4076)、βホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター(Nicoud et al.(2007)J.Gene Med.9:1015)、網膜色素変性症遺伝子プロモーター(Nicoud et al.(2007)supra)、光受容体間(interphotoreceptor)レチノイド結合蛋白質(IRBP)遺伝子エンハンサー(Nicoud et al.(2007)supra)、IRBP遺伝子プロモーター(Yokoyama et al.(1992)Exp Eye Res.55:225)などを含む。

0061

本明細書で互換的に使用する用語「DNA調節配列」、「制御エレメント」、及び「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルターミネータータンパク質分解シグナルなどの転写及び翻訳制御配列を指し、及び非コード配列(例えば、ガイドRNA)またはコード配列(例えば、部位配向性の改変ポリペプチド、またはCas9ポリペプチド)の転写を与え及び/または制御し、及び/またはコードされたポリペプチドの翻訳を制御する。

0062

核酸、ポリペプチド、細胞、または生命体に適用して、本明細書で使用する用語「自然発生の」または「非改変の」は、自然界に見出される核酸、ポリペプチド、細胞、または生命体を指す。例えば、自然の供給源から単離でき及び研究室でヒトにより意図的に改変されていない生命体(ウイルスを含む)に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然界に発生する。

0063

核酸またはポリペプチドに適用して、本明細書で使用する用語「キメラの」は、異なる供給源由来の構造により定義される2つの要素を指す。例えば、「キメラの」が、キメラポリペプチド(例えば、キメラCas9タンパク質)の文脈で使用される場合、そのキメラポリペプチドは、異なるポリペプチド由来のアミノ酸配列を含む。キメラポリペプチドは、改変されたまたは天然発生のポリペプチド配列(例えば、改変されたまたは非改変のCas9タンパク質由来の第1アミノ酸、及びCas9タンパク質以外の第2アミノ酸配列)のいずれかを含む。同様に、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの文脈における「キメラの」は、異なるコード領域由来のヌクレオチド配列(例えば、改変されたまたは非改変のCas9タンパク質をコードする第1ヌクレオチド配列、及びCas9タンパク質以外のポリペプチドをコードする第2ヌクレオチド配列)を含む。

0064

用語「キメラポリペプチド」は、自然発生ではなく、人間が介在したアミノ配列の、2つの別々のセグメントの人為的な組み合わせ(すなわち「融合」)により作られる、ポリペプチドを指す。キメラアミノ酸配列を含むポリペプチドは、キメラポリペプチドである。いくつかのキメラポリペプチドは、「融合変異体」と呼ぶことができる。

0065

本明細書で使用する「異種の」は、天然の核酸またはタンパク質の各々には見出せないヌクレオチドまたはペプチドを意味する。例えば、キメラCas9タンパク質において、自然発生の細菌Cas9ポリペプチド(またはそれらの変異体)のRNA結合ドメインは、異種ポリペプチド配列(すなわち、Cas9以外のタンパク質由来のポリペプチド配列または別の生命体由来のポリペプチド配列)に融合されて良い。当該異種ポリペプチドは、活性(例えば、酵素活性)を示してもよく、当該キメラCas9タンパク質により示され得る(例えば、メチル転移酵素活性、アセチル転移酵素活性キナーゼ活性ユビキチン化活性など)。異種核酸は、キメラポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを産生するために、自然発生の核酸(またはそれらの変異体)に(例えば、遺伝子工学的により)連結されて良い。他の例として、融合変異体Cas9の部位配向性ポリペプチドにおいて、変異体Cas9の部位配向性ポリペプチドは、異種ポリペプチド(すなわち、Cas9以外のポリペプチド)に融合されて良く、その融合変異体Cas9の部位配向性ポリペプチドによっても示される活性を示す。異種核酸は、融合変異体Cas9の部位配向性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを産生するために、変異体Cas9の部位配向性ポリペプチドに(例えば、遺伝子工学的に)連結されて良い。本明細書で使用する「異種の」はさらに、天然細胞ではない細胞中のヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。

0066

用語「同種の」は、通常は、自然界で相互作用しまたは共存している2つの生体分子を指す。

0067

本明細書で使用する「組換え」は、特定の核酸(DNAもしくはRNA)またはベクターがクローニング、制限、ポリメラーゼ連鎖反応PCR)及び/または、自然界システムに見出される内因性核酸由来の区別可能な、構造的コードまたは非コード配列を有するコンストラクトをもたらす連結反応のステップの多様な組換えの産物である、ことを意味する。ポリペプチドをコードするDNA配列は、細胞または無細胞の転写及び翻訳システムに含まれる、組換え転写ユニットから発現され得る合成核酸を与えるように、cDNAフラグメントまたは一連合成オリゴヌクレオチドから組み立てることができる。該当する配列を含むゲノムDNAはまた、組換え遺伝子または転写ユニットの形成に使用できる。非翻訳DNAの配列は、そのオープンリーディングフレームからの5’または3’に存在し、そのような配列は、そのコード領域の操作または発現と干渉せず、及び多様なメカニズムにより目的産物の産生を調整するように確実に作用する(「DNA調節配列」以下を参照)。あるいは、翻訳されないRNA(例えば、ガイドRNA)をコードするDNA配列はまた、組換えが考慮されて良い。したがって、例えば、用語「組換え」核酸は、自然界には発生しないもの、例えば、人間が介在した2つの別の配列セグメントの人工的な組み合わせより作られたものを指す。この人工的組み合わせは、化学的な合成手段、または核酸の単離セグメントの人工的な操作のいずれかにより、例えば、遺伝子組換え技術により、多くの場合行われる。通常、そのような方法は、コドンを同じアミノ酸、保存アミノ酸、または非保存アミノ酸をコードするコドンと入れ替えて行われる。あるいは、望ましい機能を産生するように、望ましい機能の核酸セグメントと共に結合させて実施される。この人工的組み合わせは、化学的な合成手段、または核酸の単離セグメントの人工的な操作のいずれかにより、例えば、遺伝子組換え技術により、多くの場合行われる。組換えポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、コードされたポリペプチドの配列は、自然に発生することができ(「野生型」)または自然発生配列の変異体(例えば、突然変異体)であり得る。したがって、用語「組換え」ポリペプチドは、その配列が自然には発生しないポリペプチドを指す必要はない。代わりに、「組換え」ポリペプチドは、組換えDNA配列によりコードされ、しかしそのポリペプチドの配列は、自然に発生することができ(「野生型」)または非自然に発生する(例えば、多様体、変異体など)ことができる。したがって、「組換え」ポリペプチドは、人間の介入の結果であり、しかし自然発生のアミノ酸配列であって良い。

0068

「ベクター」または「発現ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどの、他のDNAセグメントへの、すなわち「挿入」のレプリコンであり、細胞に付着したセグメントの複製をもたらすように、付着して良い。

0069

発現カセット」は、プロモーターに操作可能に連結されたDNAコード配列を含む。「操作可能に連結された」は、記述される成分が、意図した方法で機能することを許容する関係にある場所において、並置であることを指す。例えば、仮にそのプロモーターが、その転写または発現に影響を与えるならば、プロモーターは、コード配列に操作可能に連結されている。用語「組換え発現ベクター」、または「DNAコンストラクト」は、ベクター及び少なくとも1つの挿入を含むDNA分子を指すために本明細書では互換的に使用する。組換え発現ベクターは、挿入の発現及び/または伝播の目的で、またはその他の組換えヌクレオチド配列の構築のために通常は作製される。当該核酸は、プロモーター配列に操作可能に連結されても、されなくても良く及びDNA調節配列に操作可能に連結されても、されなくても良い。

0070

細胞は、外因性のDNA、例えば、組換え発現ベクターにより、そのようなDNAが、細胞内へ導入された場合に、「遺伝子的に改変され」または「形質転換され」または「遺伝子導入され」ている。その外因性DNAの存在は、恒久的なまたは一時的な遺伝子変化をもたらす。その形質転換DNAは、その細胞のゲノムと一体化されて(共有的に連結されて)いてもまたはいなくても良い。

0071

例えば、原核生物、酵母、哺乳類細胞において、当該形質転換DNAは、プラスミドなどのエピソーム因子上に保持されて良い。真核細胞に対しては、当該形質転換DNAが、染色体と一体化し、そのため染色体の複製を通して娘細胞により継承されるので、安定な形質転換細胞である。この安定性は、当該形質転換DNAを含む娘細胞の集団を含む、細胞株またはクローン確立するその真核細胞の能力により示される。「クローン」は、単一細胞または細胞分裂により共通の祖先から誘導された細胞の集団である。「細胞株」は、多世代にわたりインビトロで安定的に増殖できる初期細胞のクローンである。

0072

遺伝子改変の適切な方法(「形質転換」も参照)には、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、遺伝子導入(トランスフェクション)、接合プロトプラスト融合リポフェクションエレクトロポレーションリン酸カルシウム沈殿ポリエチレンイミン(PEI)介在トランスフェクション、DEAEデキストラン介在トランスフェクション、リポソーム介在トランスフェクション、粒子ガン技術、ダイレクトマイクロインジェクションナノ粒子介在核送達(例えば、Panyam et.,al Adv Drug Deliv Rev.2012 Sep 13.pii:S0169−409X(12)00283−9.doi:10.1016/j.addr.2012.09.023を参照)などを含む。

0073

遺伝子改変法の選択は一般的に、形質転換する細胞の型及びその形質転換が行われる環境(例えば、インビトロ、エクスビボ、インビボ)に依存する。これら方法の一般論議は、Ausubel,et al.,hort Protocols in Molecular Biology,3rd ed.,Wiley & Sons,1995、に見出せる。

0074

本明細書で使用する「宿主細胞」は、インビボまたはインビトロの真核細胞、原核細胞(例えば、細菌または古細菌細胞)、または単細胞実体としてインキュベートされた、多細胞の有機体由来の細胞(例えば、細胞株)を意味し、その真核または原核細胞は、核酸に対する受容体として使用でき、または使用されており、及びその核酸により形質転換された起源細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、自然に、偶発的に、または意図的な突然変異のために、形態においてまたは遺伝子的にまたはその起源細胞と相補的なトータルDNAにおいて、完全に同一である必要はない。「組換え宿主細胞」(また「遺伝子的に改変された宿主細胞」と呼ばれる)は、異種核酸、例えば、発現ベクターを導入された宿主細胞である。例えば、細菌宿主細胞は、外因性核酸(例えば、プラスミドまたは組換え発現ベクター)が適切な細菌宿主細胞に導入されたために、遺伝子的に改変された細菌宿主細胞であり、及び真核宿主細胞は、外因性核酸が適切な真核宿主細胞に導入されたために、遺伝子的に改変された真核宿主細胞(例えば、哺乳類生殖細胞)である。

0075

本明細書で使用する「標的DNA」は、「標的部位」または「標的配列」を含むDNAポリヌクレオチドである。用語「標的部位」、「標的配列」、「標的プロトスペーサーDNA」または「プロトスペーサー様配列」は、結合の存在に適切な条件を与えている、ガイドRNAのDNA標的化セグメントが結合しているだろう場所に対応する、標的DNAに存在する核酸配列を指して、本明細書では互換的に使用する。例えば、標的DNA内の標的部位(または標的配列)である5’−GAGCATATC−3’は、当該RNA配列の5’−GAUAUGCUC−3’により標的化される(または結合される、またはハイブリダイゼーションされる、または相補的である)。適切なDNA/RNA結合の条件には、通常細胞に存在する生理学的な条件を含む。その他の適切なDNA/RNA結合の条件(例えば、無細胞システムにおける条件)が、当技術分野において公知である。例えば、Sambrook,supraを参照。当該ガイドRNAと相補的な及びハイブリダイズする標的DNA鎖は、「相補鎖」と呼ばれ、及びその「相補鎖」に相補的な標的DNAの鎖(及びそれゆえに、当該ガイドRNAには相補的でない)は、「不相補鎖」または「非相補鎖」と呼ばれる。「部位配向性改変ポリペプチド」または「RNA結合部位配向性ポリペプチド」または「RNA結合部位配向性改変ポリペプチド」または「部位配向性ポリペプチド」により、RNAを結合するポリペプチドを意味し及び特定のDNA配列を標的にする。本明細書に記述する部位配向性改変ポリペプチドは、当該RNA分子が、そこに結合することにより特定のDNA配列を標的にする。当該RNA分子は、標的DNA内の標的配列に結合し、ハイブリダイズし、または相補的になり、したがって、その標的DNA(標的配列)内の特定場所へ結合するポリペプチドを標的化する、配列を含む。本発明の例示的な標的配列は、SEQID NO:801−2701に提示される。SEQ ID NO:801−973は、ヒトCCR5遺伝子におけるPAM配列NNNNACAに対応した、プロトスペーサー様標的配列5’である。SEQ ID NO:974−1078は、ヒトCCR5遺伝子におけるPAM配列GNNNCNNAに対応した、プロトスペーサー様配列5’である。SEQ ID NOs:1079−1222は、ヒトCCR5遺伝子のエクソンにおけるPAM配列NNNNACAに対応した、プロトスペーサー様標的配列5’である。SEQ ID NO:1223−1312は、ヒトCCR5遺伝子のエクソンにおけるPAM配列GNNNCNNAに対応した、プロトスペーサー様配列5’である。SEQ ID NO:1313−1348は、ヒトCCR5遺伝子の5’末端周辺のPAM配列NNNNACAに対応した、プロトスペーサー様標的配列5’である。SEQ ID NO:1349−1371は、ヒトCCR5遺伝子の5’末端周辺のPAM配列GNNNCNNAに対応した、プロトスペーサー様配列5’である。SEQ ID NO:1372−1415は、ヒトCCR5遺伝子におけるデルタ32遺伝子座周辺のPAM配列NNNNACAに対応した、プロトスペーサー様標的配列5’である。SEQ ID NO:1416−1443は、ヒトCCR5遺伝子におけるデルタ32遺伝子座周辺のPAM配列GNNNCNNAに対応した、プロトスペーサー様配列5’である。SEQ ID NO:1444−1900は、ヒトBCL11A遺伝子におけるPAM配列NNNNACAに対応した、プロトスペーサー様標的配列5’である。SEQ ID NO:1901−2162は、ヒトBCL11A遺伝子におけるPAM配列GNNNCNNAに対応した、プロトスペーサー様配列5’である。SEQ ID NO:2163−2482は、ヒトBCL11A遺伝子のエクソンにおけるPAM配列NNNNACAに対応した、プロトスペーサー様標的配列5’である。SEQ ID NO:2483−2666は、ヒトBCL11A遺伝子のエクソンにおけるPAM配列GNNNCNNAに対応した、プロトスペーサー様配列5’である。SEQ ID NO:2667−2686は、ヒトBCL11A遺伝子の5’末端周辺におけるPAM配列NNNNACAに対応した、プロトスペーサー様標的配列5’である。SEQ ID NO:2687−2701は、ヒトBCL11A遺伝子の5’末端周辺におけるPAM配列GNNNCNNAに対応した、プロトスペーサー様配列5’である。SEQ ID NO:801−2701に提示される配列に、少なくとも80%同一である標的配列がまた、考えられる。

0076

「開裂」により、DNA分子の共有バックボーンの破壊を意味する。開裂は、非限定的に、リン酸ジエステル結合の酵素によるまたは化学的な加水分解を含む、多様な方法により開始できる。一本鎖開裂及び二本鎖開裂の両方が可能であり、及び二本鎖開裂は、2つの異なる一本鎖開裂事象の結果から、起こすことができる。DNA開裂は、平滑末端または付着末端の生成をもたらすことができる。特定の実施形態において、ガイドRNA及び部位配向性改変ポリペプチドを含む複合体を、標的二本鎖DNA開裂に使用する。

0077

「ヌクレアーゼ」及び「エンドヌクレアーゼ」は、DNA開裂に対するエンドヌクレアーゼ触媒活性を保有する酵素の意味で、本明細書においては互換的に使用する。

0078

ヌクレアーゼの「開裂ドメイン」または「活性ドメイン」または「ヌクレアーゼドメイン」により、DNA開裂に対する触媒活性を保有するヌクレアーゼ内のポリペプチド配列またはドメインを意味する。開裂ドメインは、単鎖ポリペプチドに含まれ得て、または開裂活性は、2つ(またはそれ以上)のポリペプチドの会合によりもたらすことができる。単一ヌクレアーゼドメインは、目的のポリペプチド内の、単離された1つ以上のアミノ酸の長さから成って良い。

0079

「部位配向性ポリペプチド」または「RNA結合部位配向性ポリペプチド」並びに「RNA結合部位配向性ポリペプチド」により、RNAを結合し及び特定のDNA配列に対して標的化されているポリペプチドを意味する。本明細書に記述する部位配向性ポリペプチドは、当該RNA分子が結合する場所により特定のDNA配列に対して標的化される。当該RNA分子は、当該標的DNA内の標的配列に対して相補的な配列を含み、したがって、その標的DNA(標的配列)内の特定場所に結合ポリペプチドを標的化する。

0080

部位配向性改変ポリペプチドを結合し及びそのポリペプチドを、当該DNA内の特定の場所に標的化するRNA分子は、本明細書では、「ガイドRNA」または「ガイドRNAポリヌクレオチド」を指す(また、ここでは「ガイドRNA」または「gRNA」を指す)。ガイドRNAは、「DNA標的化セグメント」及び「タンパク質結合セグメント」の2つのセグメントを含む。「セグメント」により、分子のセグメント/セクション/領域、例えば、RNAにおけるヌクレオチドの連続した長さを意味する。セグメントはまた、複合体の領域/セクションを意味し、そのためセグメントは、1つ以上の分子領域を含んでよい。例えば、いくつかのケースにおいて、ガイドRNAのタンパク質結合セグメント(後述)は、1つのRNA分子であり及びそれらのタンパク質結合セグメントは、そのRNA分子の領域を含む。その他のケースにおいて、ガイドRNAのタンパク質結合セグメント(後述)は、相補的な領域に沿ってハイブリダイゼイズされた2つの別々の分子を含む。非限定的な例示として、2つの別々の分子を含むガイドRNAのタンパク質結合セグメントは、(i)長さが100塩基対の第一RNA分子の40−75の塩基対、及び(ii)長さが50塩基対の第二RNA分子の10−25の塩基対を含むことができる。特定の文脈において特別に定義されない限り、「セグメント」の定義は、トータルの塩基対の特定の数に限定されず、対象のRNA分子の塩基対のいずれの特定数にも限定されず、複合体内の個別分子の特定の数に限定されず、及びいずれの全長のRNA分子の領域を含んで良く、そしてその他の分子と相補的である領域を含んでいても、いなくとも良い。

0081

当該DNA標的化セグメント(または「DNA標的化配列」)は、本明細書における「プロトスペーサー様配列」に指定された標的DNA(その標的DNAの相補鎖)内の、特定の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。当該タンパク質結合セグメント(または「タンパク質結合配列」は、部位配向性の改変ポリペプチドと相互作用する。その部位配向性の改変ポリペプチドが、Cas9またはCas9関連ポリペプチド(より詳細は以下に記述)である場合、当該標的DNAの部位配向性開裂が、(i)当該ガイドRNAと当該標的DNA間の塩基対の相補性、及び(ii)当該標的DNAのショートモチーフ(当該標的DNAにおけるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM))の両方により決定された場所で起きる。

0082

ガイドRNAのタンパク質結合セグメントは、部分的に、互いに、RNAの二重らせんRNA二本鎖(dsRNA二本鎖)をつくるようにハイブリダイズしている、ヌクレオチドの2つの相補的長さを含む。

0083

いくつかの実施形態において、核酸(例えば、ガイドRNA、ガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、部位配向性ポリペプチドをコードする核酸など)は、付加する望ましい特性(例えば、改変されたまたは調節された安定性、細胞内標的、トラッキング、例えば、蛍光標識、タンパク質またはタンパク質複合体に対応した結合部位など)を与える改変または配列を含む。非限定例として、5’キャップ構造(例えば、7−メチルアニレートキャップ構造(m7G))、3’ポリアデニル化テール(すなわち、3’ポリAテール)、リボスイッチ配列(例えば、タンパク質及び/またはタンパク質複合体による調節された安定性及び/または調節された接近性を許容するため)、安定性制御配列、dsRNA二本鎖(すなわち、ヘアピン)を形成する配列、当該RNAを、細胞内の場所(例えば、核、ミトコンドリア葉緑体など)に標的化する改変または配列、トラッキング(例えば、蛍光分子の直接抱合蛍光の検出を促進するモイエティーの抱合、蛍光検出を可能にする配列など)に備える改変または配列、タンパク質(例えば、転写活性化因子、転写リプレッサーDNAメチル基転移酵素、DNA脱メチル化酵素、ヒストンアセチルトランスフェラーゼヒストン脱アセチル化酵素、などを含むDNAに作用するタンパク質)に結合部位を与える改変または配列、及びそれらの組み合わせ、を含む。

0084

いくつかの実施形態において、ガイドRNAは、上述のいずれの特性にも対応して備える5’または3’末端のいずれかにおいて、追加セグメントを含むことができる。例えば、適切な第三のセグメントには、5’キャップ構造(例えば、7−メチルグアニレートキャップ構造(m7G))、3’ポリアデニル化テール(すなわち、3’ポリAテール)、リボスイッチ配列(例えば、タンパク質及び/またはタンパク質複合体による調節された安定性及び/または調節された接近性を許容するため)、安定性制御配列、dsRNA二本鎖(すなわち、ヘアピン)を形成する配列、当該RNAを、細胞内の場所(例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など)に標的化する配列、トラッキング(例えば、蛍光分子の直接抱合、蛍光の検出を促進するモイエティーの抱合、蛍光検出を可能にする配列など)に備える改変または配列、タンパク質(例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、DNAメチル基転移酵素、DNA脱メチル化酵素、ヒストン・アセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素、などを含むDNAに作用するタンパク質)に結合部位を与える改変または配列、及びそれらの組み合わせ、を含むことができる。

0085

ガイドRNA及び部位配向性の改変ポリペプチド(すなわち、部位配向性ポリペプチド)は、複合体(すなわち、非共有相互作用を介した結合)を形成する。そのガイドRNAは、標的DNAの配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことにより、その複合体に標的特異性を与える。その複合体の部位配向性の改変ポリペプチドは、部位に特異的な活性を与える。換言すると、当該部位配向性の改変ポリペプチドは、そのガイドRNAのタンパク質結合セグメントに関連した効力により、標的DNA配列(例えば、染色体核酸中の標的配列、染色体外核酸、例えば、エピソーム核酸、小環などにおける標的配列、ミトコンドリア核酸中の標的配列、葉緑体核酸中の標的配列、プラスミド中の標的配列)にガイドされる。

0086

いくつかの実施形態において、ガイドRNAは、二つの個別のRNA分子(RNAポリヌクレオチド:「活性化因子RNA」及び「標的選択性RNA」、以下を参照)を含み及び、本明細書では、「二重分子ガイドRNA」または「2分子ガイドRNA」と呼ぶ。その他の実施形態において、当該ガイドRNAは、単一のRNA分子(単一RNAポリヌクレオチド)であり及び本明細書では、「単分子ガイドRNA」または「単一ガイドRNA」、または「sgRNA」と呼ぶ。用語「ガイドRNA」または「gRNA」は、二重分子ガイドRNA及び単分子ガイドRNA(すなわち、sgRNA)の両方を含み、指す。

0087

二重分子ガイドRNAは、二つの個別のRNA分子(「標的選択性RNA」及び「活性化因子RNA」)を含む。二重分子ガイドRNAの2つのRNA分子の各々は、互いに相補的であり、そのため2つのRNA分子の相補的ヌクレオチドが、そのタンパク質結合セグメントの二重らせんRNA二本鎖を作るようにハイブリダイズする、ヌクレオチドの長さを含む。

0088

例示的な2分子ガイドRNAには、crRNA様(「CRISPR RNA」または「標的選択性RNA」)分子(CRISPRリピート部またはCRISPRリピート様配列を含む)及び対応するtracrRNA様(「トランス活性化CRISPR RNA」または「活性化因子RNA」または「tracrRNA」)分子を含む。crRNA様分子(標的選択性RNA)は、当該ガイドRNAのDNA標的化セグメント(一本鎖)及び当該ガイドRNAのタンパク質結合セグメントのdsRNA二本鎖の半分を形成するヌクレオチドの長さ(「二本鎖形成セグメント」)の両方を含む。対応するtracrRNA様分子(活性化因子RNA)は、当該ガイドRNAのタンパク質結合セグメントのdsRNA二本鎖のその他の半分を形成するヌクレオチドの長さ(「二本鎖形成セグメント」)を含む。換言すると、crRNA様分子のヌクレオチドの長さは、当該ガイドRNAのタンパク質結合ドメインのdsRNA二本鎖を作るtracrRNA様分子のヌクレオチドの長さと相補的であり及びハイブリダイズする。したがって、各crRNA様分子は、対応するtracrRNA様分子を有する、と言うことができる。当該crRNA様分子はさらに、一本鎖DNA標的化セグメントを与える。したがって、crRNA様分子及びtracrRNA様分子は(対応ペアーとして)、ガイドRNAを作るようにハイブリダイズする。二重分子ガイドRNAは、任意の対応するcrRNA及びtracrRNAペアーを含むことができる。

0089

2分子ガイドRNAは、活性化因子RNAを伴う標的選択性RNAの制御された(すなわち、条件付きの)結合ができるように設計できる。なぜなら、2分子ガイドRNAは、その活性化因子RNAと標的選択性RNAの両方が、Cas9と共に機能性複合体に結合されないかぎり、機能的ではなく、2分子ガイドRNAは、その活性化因子RNAと標的選択性RNAの間を誘導可能な結合状態にすることにより、誘導可能に(例えば、薬剤による誘導可能に)できる。1つの非限定的な例示として、RNAアプタマーは、当該標的選択性RNAと活性化因子RNAの結合を調節する(すなわち、制御する)ために使用できる。したがって、当該活性化因子RNA及び/または標的選択性RNAは、RNAアプタマー配列を含むことができる。

0090

単分子ガイドRNAは、互いに相補的である2つのヌクレオチド(標的選択性RNA及び活性化因子RNA)の長さを含み、共有結合を成し(直接的に、またはヌクレオイチドの介在により)、及びそのタンパク質結合セグメントの二重らせんRNA二本鎖(dsRNA二本鎖)を作るようにハイブリダイゼーションを成し、したがってステムループ構造をもたらす。当該標的選択性RNA及び活性化因子RNAは、その標的選択性RNAの3’末端とその活性化因子RNAの5’末端により共有結合できる。あるいは、標的選択性RNA及び活性化因子RNAは、その標的選択性RNAの5’末端とその活性化因子RNAの3’末端により共有結合できる。

0091

例示的な単分子ガイドRNAは、dsRNA二本鎖を作るようにハイブリダイズするヌクレオイチドの2つの相補的な長さを含む。いくつかの実施形態において、当該単分子ガイドRNA(またはその長さをコードするDNA)のヌクレオチドの2つの相補的長さの1つが、少なくとも8つの隣接するヌクレオチドの長さにわたり、補足表S5に提示される活性化因子RNA(tracrRNA)の1つに、少なくとも約60%同一である。例えば、当該単分子ガイドRNA(またはその長さをコードするDNA)のヌクレオイチドの2つの相補的長さの1つが、隣接する少なくとも8つの、隣接する少なくとも9つの、隣接する少なくとも10つの、隣接する少なくとも11つの、隣接する少なくとも12つの、隣接する少なくとも13つの、隣接する少なくとも14つの、または隣接する少なくとも15つのヌクレオチドの長さにわたり、補足表S5に提示される活性化因子RNAの1つに、少なくとも約65%同一、少なくとも約70%同一、少なくとも約75%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約85%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、少なくとも約98%同一、少なくとも約99%同一、または100%同一である。例えば、当該単分子ガイドRNAは、補足表S5に提示されるtracrRNAの1つの、少なくとも10の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一、少なくとも10の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一、少なくとも11の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一、少なくとも11の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一、少なくとも12の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一、または少なくとも12の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一である。ヌクレオチド配列の一連のパーセントの同一性及び一連の長さは、オプションとして設定されており、ヌクレオチド配列のパーセント同一性と長さ(例えば、8、9、10、12、13、14、15ヌクレオチド)の各々及び全ての組み合わせが意図されていることは理解されよう。

0092

いくつかの実施形態において、当該単分子ガイドRNA(またはその長さをコードするDNA)のヌクレオチドの2つの相補的長さの1つが、少なくとも8の隣接するヌクレオチドの長さにわたり、補足表S5に明記される標的選択性RNA(crRNA/CRISPRリピート部)配列の1つに、少なくとも約60%同一である。例えば、当該単分子ガイドRNA(またはその長さをコードするDNA)のヌクレオチドの2つの相補的長さの1つが、隣接する少なくとも8、隣接する少なくとも9、隣接する少なくとも10、隣接する少なくとも11、隣接する少なくとも12、隣接する少なくとも13、隣接する少なくとも14、または隣接する少なくとも15のヌクレオチドの長さにわたり、補足表S5に提示されるcrRNA/CRISPRリピート部配列の1つに、少なくとも約65%同一、少なくとも約70%同一、少なくとも約75%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約85%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、少なくとも約98%同一、少なくとも約99%同一、または100%同一である。例えば、当該単分子ガイドRNAは、補足表S5に提示されるCRISPRリピート部配列の1つの、少なくとも10の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一、少なくとも10の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一、少なくとも11の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一、少なくとも11の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一、少なくとも12の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一、または少なくとも12の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列を含んでも良い。ヌクレオチド配列の一連のパーセント同一性及び一連の長さは、オプションとして設定されており、ヌクレオチド配列のパーセント同一性と長さ(例えば、8、9、10、12、13、14、15ヌクレオチド)の各及び全ての組み合わせが意図されていることは理解されよう。

0093

用語「活性化因子RNA」は、二重分子ガイドRNAのtracrRNA様分子を意味するとして、本明細書では使用する。用語「標的選択性RNA」は、二重分子ガイドRNAのcrRNA様分子を意味するとして、本明細書では使用する。用語「二本鎖形成セグメント」は、対応する活性化因子RNAまたは標的選択性RNAの分子のヌクレオチドの長さにハイブリダイズにより当該dsRNA二本鎖の形成に寄与する、活性化因子RNAまたは標的選択性RNAのヌクレオチドの長さを意味するとして、本明細書では使用する。換言すれば、活性化因子RNAは、対応する標的選択性RNAの二本鎖形成セグメントと相補的な二本鎖形成セグメントを含む。または、活性化因子RNAは、二本鎖形成セグメントを含む一方、標的選択性RNAは、二本鎖形成セグメント及び当該ガイドRNAのDNA標的化セグメントの両方を含む。したがって、二重分子ガイドRNAは、任意の対応する活性化因子RNA及び標的選択性RNAのペアーを含むことができる。

0094

当技術分野では公知のRNAアプタマーは、一般的にはリボスイッチ合成型である。用語「RNAアプタマー」及び「リボスイッチ」は、互いに一部であるRNA分子の構造(及びそれゆえに特定配列利用性)の誘導調節に備える、合成及び天然の両核酸を網羅するとして、本明細書では使用する。RNAアプタマーは通常、特定の構造(例えば、ヘアピン)に折り込まれる配列を含み、特定の薬剤(例えば、小分子)を特異的に結合する。当該薬剤の結合は、RNAの折り込み構造に変化を起こし、そのアプタマーが一部である核酸の特性を変化させる。非限定的な例示として、(i)アプタマーを伴う活性化因子RNAは、そのアプタマーが、適切な薬剤に結合されるまでは、同種の標的選択性RNAに結合できなくて良く、(ii)アプタマーを伴う標的選択性RNAは、そのアプタマーが、適切な薬剤に結合されるまでは、同種の活性化因子RNAに結合できなくて良く、及び(iii)異なる薬剤を結合する異なるアプタマーを含む、標的選択性RNA及び活性化因子RNAは互いに、両薬剤が存在する限り、互いに結合できなくて良い。これらの例示に説明の通り、2分子ガイドRNAは、誘導的に設計できる。

0095

アプタマー及びリボスイッチの例示は、例えば、Nakamura et al.,Genes Cells.2012 May;17(5):344−64、Vavalle et al.,Future Cardiol.2012 May;8(3):371−82、Citartan et al.,Biosens Bioelectron.2012 Apr 15;34(1):1−11、及びLiberman et al.,Wiley Interdiscip Rev RNA.2012 May−Jun;3(3):369−84に見出され、それらのすべては、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。

0096

用語「幹細胞」は、自己再生し及び分化した細胞型(Morrison et al.(1997)Cell 88:287−298を参照)を産生する両能力を有する細胞(例えば、植物幹細胞、脊椎動物幹細胞)を指し、本明細書で使用する。細胞の個体発生の文脈においては、形容詞「分化した」、または「分化している」は、相対的な用語である。「分化した細胞」は、その細胞と比較して、発達経路がさらに進化した細胞である。したがって、多能性幹細胞(後述)は、血統制限前駆細胞(例えば、胚葉幹細胞)に分化でき、次々と、さらに制限された細胞(例えば、ニューロン前駆細胞)に分化でき、最終段階の細胞(すなわち、神経細胞、心筋細胞などの終末分化細胞)に分化でき、特定の組織型における特徴的な役割を果たし、及びさらに増殖する能力を保持していても、していなくても良い。幹細胞は、特定マーカーの存在(例えば、タンパク質、RNAなど)及び特定マーカーの欠失の両方により特徴づけられて良い。幹細胞はまた、インビトロ内及びインビボの両方の機能アッセイ、特に、複数の分化した子孫を増加させる幹細胞の能力に関連したアッセイにより同定されて良い。

0097

関心のある幹細胞には、多能性幹細胞(PSC)を含む。用語「多能性幹細胞」または「PSC」は、生命体の全ての細胞型を産生することができる幹細胞を意味して、本明細書で使用する。したがって、PSCは、生命体の全ての層の細胞(例えば、脊椎動物の内胚葉中胚葉、および外胚葉)の増加をもたらすことができる。多能性細胞は、奇形種の形成及び生きている生命体の外胚葉、中胚葉、または内胚葉への寄与が可能である。植物の多能性幹細胞は、その植物の全ての細胞型(例えば、根、、葉などの細胞)の増加をもたらすことができる。

0098

動物のPSCは、多数の異なる方法で誘導できる。例えば、胚性幹細胞ESC)は、胚の内部細胞塊から派生し(Thomson et.al,Science.1998 Nov 6;282(5391):1145−7)、誘導多能性幹細胞(iPSC)は、体細胞から派生する(Takahashi et.al,Cell.2007 Nov 30;131(5):861−72、Takahashi et.al,Nat Protoc.2007;2(12):3081−9、Yu et.al,Science.2007 Dec 21;318(5858):1917−20.Epub 2007 Nov 20)。用語PSCは、その由来に関係なく多能性幹細胞を指すので、用語PSCは、用語ESC及びiPSC、同時に、PSCの他の例である、用語の胚性生殖幹細胞EGSC)をも包含する。PSCは、確立された細胞株の形態で良く、1次胚組織から直接取得して良く、または体細胞から誘導して良い。PSCは、本明細書に記述する方法の標的細胞であり得る。

0099

「胚性幹細胞」(ESC)により、胚から、通常は胚盤胞の内部細胞塊から単離されたPSCを意味する。ESC株は、アメリカ国立衛生研究所(NIH)のヒト胚性幹細胞レジストリリスト化されており、例えば、hESBGN−01、hESBGN−02、hESBGN−03、hESBGN−04(BresaGen,Inc.)、HES−1、HES−2、HES−3、HES−4、HES−5、HES−6(ES Cell International)、Miz−hES1(MizMedi Hospital−Seoul National University)、HSF−1、HSF−6(University of California at San Francisco)、及び H1、H7、H9、H13、H14(Wisconsin Alumni Research Foundation(WiCell Research Institute))である。関心のある幹細胞にはまた、アカゲザル(Rh)幹細胞及びマーモセット幹細胞などの、その他の霊長類由来の胚性幹細胞を含む。当該幹細胞は、任意の哺乳類、例えば、ヒト、、齧歯動物、例えばマウス、ラットハムスター、霊長類などから取得して良い(Thomson et al.(1998)Science 282:1145、Thomson et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci USA 92:7844、Thomson et al.(1996)Biol.Reprod.55:254、Shamblott et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998)。培養において、ESCは、大きな核−細胞質比を持つフラットコロニーとして成長し、境界及び突出した核小体として定義される。さらに、ESCは、SSEA−3、SSEA−4、TRA−1−60、TRA−1−81、及びSSEA−1ではないアルカリホスファターゼを発現する。ESCを産生し及び特徴づける方法の例示は、例えば、US7,029,913、US5,843,780及びUS6,200,806に見出され、本開示は、参照としてそれらを援用し、本明細書に組み入れる。未分化形態のhESCを増殖する方法は、WO 99/20741、WO 01/51616、及びWO 03/020920に記述されている。「胚性生殖幹細胞」(EGSC)または「胚性生殖細胞」または「EG細胞」とは、生殖細胞及び/または生殖細胞前駆細胞、例えば、始原生殖細胞、すなわち精子及びになる細胞から派生したPSCを意味する。胚性生殖細胞(EG細胞)は、上述の胚性幹細胞に似た性質を持つと考えられる。EGを産生し及び特徴づける方法の例示は、例えば、US7,153,684、Matsui,Y.,et al.,(1992)Cell 70:841、Shamblott,M.,et al.(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:113、Shamblott,M.,et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:13726、及びKoshimizu,U.,et al.(1996)Development,122:1235に見出され、本開示は、参照としてそれらを援用し、本明細書に組み入れる。

0100

「誘導多能性幹細胞」または「iPSC」とは、PSCではない細胞から(すなわち、PSCに対して相対的に分化した細胞から)派生したPSCを意味する。iPSCは、終末分化細胞を含む、複数の異なる細胞型から誘導できる。iPSCは、ES様形態を有し、大きな核−細胞質比を持つフラットコロニーとして成長し、境界及び突出した核小体として定義される。さらに、iPSCは、非限定的に、アルカリホスファターゼ、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGF 1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26al、TERT、及びzfp42を含む、当業者には公知の1つ以上の主要な多能性マーカーを発現する。iPSCを産生し及び特徴づける方法の例示は、例えば、アメリカ公開特許番号US20090047263、US20090068742、US20090191159、US20090227032、US20090246875、及びUS20090304646に見出され、本開示は、参照としてそれらを援用し、本明細書に組み入れる。一般的に、iPSCを産生するためには、多能性幹細胞になる体細胞を再プログラム化するために、当技術分野では公知の再プログラム化因子(例えば、Oct4、SOX2、KLF4、MYC、Nanog、Lin28)が与えられる。

0101

「体細胞」とは、実験操作なしの条件下で、通常は、生命体の全ての細胞型の増加をもたらさない生命体の任意の細胞を意味する。換言すると、体細胞は、3つの全ての胚葉体、すなわち外胚葉、中胚葉、内胚葉の細胞を、自然には産生しない十分に分化した細胞である。例えば、体細胞は、神経細胞及び神経前駆細胞の両方を含み、中枢神経系の全てのまたはいくつかの細胞型を自然に増加させることができる後者はしかし、胚葉及び内胚葉系統の細胞の増加をもたらすことができない。

0102

分裂細胞」により、細胞が分裂を起こすことを意味する。分裂は、真核細胞が、その核の中の染色体を、2つの別々の核の中の、2つの同じセットに分割することによるプロセスである。一般的には、細胞質分裂が即座に続き、核、細胞質細胞小器官及び細胞膜を、これらの細胞成分のほぼ等しい振り分を含むように2つの細胞中に分割する。

0103

ポスト分裂細胞」とは、分裂が終了した、すなわち、「静止した」、すわなち、もはや分裂しない細胞を意味する。この静止状態は、一時的で、すなわち可逆的であって良く、または恒久的であって良い。

0104

減数分裂細胞」とは、減数分裂が行われている細胞を意味する。減数分裂は、細胞が、配偶子または胞子を産生する目的で、その核物質を分割することによるプロセスである。細胞分裂とは異なり、減数分裂においては、当該染色体が、染色体間遺伝物質シャッフルで組換えるステップを取る。さらに、分裂から生み出される2つの(遺伝的には同じ)2倍体細胞と比較して、減数分裂の結果、4つの(遺伝的には独特な)半数体細胞になる。

0105

「組換え」とは、2つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換プロセスを意味する。本明細書で使用する、「相同配向性修復(HDR)」は、例えば、細胞の二重らせん破壊の修復中に行われる特別形態DNA修復を指す。このプロセスは、配列が相同のヌクレオチドを必要とし、「標的」分子(すなわち、二重らせん破壊を経験した分子)のテンプレート修復に対応した「ドナー」分子を使用し、及びそのドナーから標的への遺伝情報伝達に導く。相同配向性修復は、その標的分子の配列の変更(例えば、挿入、欠損、変異)をもたらし、仮にそのドナーポリヌクレオチドが、その標的分子と異なる場合、そのドナーポリヌクレオチドの一部または全ての配列が、その標的DNAに組み込まれる。いくつかの実施形態において、当該ドナーポリヌクレオチド、当該ドナーポリヌクレオチドの一部、当該ドナーポリヌクレオチドの複製、または当該ドナーポリヌクレオチドの複製の一部は、その標的DNAに統合される。

0106

非相同性末端結合(NHEJ)」により、相同テンプレートの必要性がなく、破壊末端を互いに直接連結することにより、DNAの二重らせん破壊を修復することを意味する(修復をガイドするために相同配列が必要な、相同配向性修復とは対照をなす)。NHEJはしばしば、その二重らせん破壊部分の近くのヌクレオチド配列の欠損(削除)をもたらす。

0107

用語「治療」、「治療する」などは、一般に望ましい薬理学的及び/または生理学的効果を得ることを意味して、本明細書で使用する。その効果とは、疾患またはそれらの症状を完全にまたは部分的に防ぐ観点からの予防のためであって良く、及び/または疾患及び/またはその疾患に起因する悪影響を部分的にまたは完全に治す観点からの治療のためであって良い。本明細書で使用する「治療」は、哺乳類における疾患または症状の任意の治療を対象とし、及び(a)その疾患または症状をもたらす傾向があるが、しかし未だそれを引き起こしたとして診断されていない対象者に起こる疾患または症状を予防すること、(b)その疾患または症状を抑制すること、すなわち、その促進を抑止すること、(c)その疾患を緩和すること、すなわち、その疾患の回復の原因を探ることを含む。当該治療薬は、疾患または傷害発症前、その間またはその後に投与されて良い。当該治療が、患者の望ましくない臨床的症状を安定化させまたは軽減する場合の、進行中の疾患の治療は、特に興味深い治療である。そのような治療は、影響を受ける細胞の機能が完全に失われる前に、望ましくは行われる。当該治療は、その疾患の症候性段階の間に、及びいくつかのケースにおいては、その疾患の症候性段階の後で、望ましくは投与される。

0108

用語「個人」「対象者」「宿主」及び「患者」は、本明細書では互換的に使用し、及び診断を受ける、治療を受ける、または治療が望まれる任意の哺乳類対象者、特にヒトを指す。

0109

分子及び細胞生化学における一般的な方法は、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.(Sambrook et al.,HaRBor Laboratory Press 2001)、Short Protocols in Molecular Biology,4th Ed.(Ausubel et al. eds.,John Wiley & Sons 1999)、Protein Methods(Bollag et al.,John Wiley & Sons 1996)、Nonviral Vectors for Gene Therapy(Wagner et al.eds.,Academic Press 1999)、Viral Vectors(Kaplift & Loewy eds.,Academic Press 1995)、Immunology Methods Manual(I.Lefkovits ed.,Academic Press 1997)、及びCell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle & Griffiths,John Wiley & Sons 1998)などの、標準的な教科書に見出され、その開示物を参照によりそれらを援用し、本明細書に組み入れる。

0110

値に範囲が与えられる場合、その文脈が明確に指示しない限り下限単位の10分の1までの各中間値、その範囲の上限と下限の間及びその提示された範囲における任意のその他の指示値または中間値が、本発明内に包含されることは理解されよう。これらのより狭い範囲の上下限は、独立してそのより狭い範囲に含まれて良く、及びその提示された範囲における特定の除外制限に依存して、本発明内にまた包含される。その提示された範囲が、1つのまたは両方の制限を含む場合、制限を含むそれらのいずれかをまたは両方を除外した範囲もまた、本発明に含まれる。

0111

フレーズ「から本質的に成る」は、特異的に活性な成分またはシステムの複数成分ではない任意の成分、または特異的に活性な部分または分子の複数部分ではない任意の部分を除外することを、本明細書では意味する。

0112

ある特定の範囲は、用語「約」が頭についている数値で本明細書に提示される。用語「約」は、それが頭につく正確な数字を文字通り支持し、同時にその用語がつく数字に近いかまたはおおよそその数字であることを与えるとして、本明細書で使用する。ある数字が、特に記載された数字に近いかまたはおおよそその数字であるかを決定するには、その近くのまたはおおよその記載されていない数字が、それが存在する文脈において、その特に記載された数字に本質的に等価である数字であれば良い。

0113

わかりやすくするために、別々の実施形態の文脈において記述される本発明の特定の特性が、単一の実施形態において組み合わせて与えられて良いことは、受け入れられよう。あるいは、簡素にするために、単一の実施形態の文脈において記述される本発明の多様な特性が、別々にまたは任意の適切な二次的な組み合わせで与えられても良い。本発明に関わる実施形態の全ての組み合わせを、本発明により特別に受け入れ、及びあたかも各及び全ての実施形態が、独立して及び明確に開示されているかのように、本明細書に開示する。さらに、多様な実施形態及びそれらの要素の全ての二次的組み合わせをまた、本発明により特別に受け入れ、及びあたかも各及び全ての二次的組み合わせが、独立して及び明確に開示されているかのように、本明細書に開示する。

0114

本開示の態様−パート

0115

核酸

0116

ガイドRNA

0117

本開示は、関連ポリペプチド(例えば、部位配向性改変ポリペプチド)を標的DNA内の特定の標的配列に向かわせるガイドRNAを提供する。ガイドRNAは、第一セグメント(本明細書ではまた、「DNA標的化セグメント」または「DNA標的化配列」を指す)及び第二セグメント(本明細書ではまた、「タンパク質結合セグメント」または「タンパク質結合配列」を指す)を含む。

0118

ガイドRNAのDNA標的化セグメント

0119

ガイドRNAのDNA標的化セグメントには、標的DNAの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。換言すると、ガイドRNAのDNA標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション(すなわち、塩基対形成)を介した配列特異的方法により、標的DNAと相互作用する。または、当該DNA標的化セグメントのヌクレオチド配列は、当該ガイドRNA及び当該標的DNAが相互作用する標的DNA内の場所を、変化させ及び決定して良い。ガイドRNAのDNA標的化セグメントは、標的DNA内の、任意の望ましい配列にハイブリダイズするように改変(例えば、遺伝子工学により)できる。

0120

当該DNA標的化セグメントは、約12ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまでの長さを有することができる。例えば、当該DNA標的化セグメントは、約12ヌクレオチド(nt)から約80ntまでの、約12ntから約50ntまでの、約12ntから約40ntまでの、約12ntから約30ntまでの、約12ntから約25ntまでの、約12ntから約20ntまでの、または約12ntから約19ntまでの長さを有することができる。例えば、当該DNA標的化セグメントは、約19ntから約20ntまでの、約19ntから約25ntまでの、約19ntから約30ntまでの、約19ntから約35ntまでの、約19ntから約40ntまでの、約19ntから約45ntまでの、約19ntから約50ntまでの、約19ntから約60ntまでの、約19ntから約70ntまでの、約19ntから約80ntまでの、約19ntから約90ntまでの、約19ntから約100ntまでの、約20ntから約25ntまでの、約20ntから約30ntまでの、約20ntから約35ntまでの、約20ntから約40ntまでの、約20ntから約45ntまでの、約20ntから約50ntまでの、約20ntから約60ntまでの、約20ntから約70ntまでの、約20ntから約80ntまでの、約20ntから約90ntまでの、または約20ntから約100ntまでの長さを有することができる。当該標的DNAのヌクレオチド配列(標的配列)に相補的である当該DNA標的化セグメントのヌクレオチド配列(当該DNA標的化配列)は、少なくとも約12ntの長さを有することができる。例えば、当該標的DNAの標的配列に相補的である当該DNA標的化セグメントのDNA標的化配列は、少なくとも約12ntの、少なくとも約15ntの、少なくとも約18ntの、少なくとも約19ntの、少なくとも約20ntの、少なくとも約25ntの、少なくとも約30ntの、少なくとも約35ntの、または少なくとも約40ntの長さを有することができる。例えば、当該標的DNAの標的配列に相補的である当該DNA標的化セグメントのDNA標的化配列は、約12ヌクレオチド(nt)から約80ntまでの、約12ntから約50ntまでの、約12ntから約45ntまでの、約12ntから約40ntまでの、約12ntから約35ntまでの、約12ntから約30ntまでの、約12ntから約25ntまでの、約12ntから約20ntまでの、約12ntから約19ntまでの、約19ntから約20ntまでの、約19ntから約25ntまでの、約19ntから約30ntまでの、約19ntから約35ntまでの、約19ntから約40ntまでの、約19ntから約45ntまでの、約19ntから約50ntまでの、約19ntから約60ntまでの、約20ntから約25ntまでの、約20ntから約30ntまでの、約20ntから約35ntまでの、約20ntから約40ntまでの、約20ntから約45ntまでの、約20ntから約50ntまでの、または約20ntから約60ntまでの長さを有することができる。当該標的DNAの標的配列に相補的である当該DNA標的化セグメントのヌクレオチド配列(当該DNA標的化配列)は、少なくとも約12ntの長さを有することができる。

0121

いくつかのケースにおいて、当該標的DNAの標的配列に相補的である当該DNA標的化セグメントのDNA標的化配列は、20ヌクレオチドの長さである。いくつかのケースにおいて、当該標的DNAの標的配列に相補的である当該DNA標的化セグメントのDNA標的化配列は、16ヌクレオチドの、17ヌクレオチドの、18ヌクレオチドのまたは19ヌクレオチドの長さである。

0122

当該DNA標的化セグメントのDNA標的化配列と当該標的DNAの標的配列の間のパーセント同一性は、少なくとも60%(例えば、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%)である。例えば、当該DNA標的化配列は、当該標的配列の、約10の隣接するヌクレオチド対して少なくとも約80%同一、または約11の隣接するヌクレオチド対して少なくとも約80%同一、または約12の隣接するヌクレオチド対して少なくとも約80%同一、または約13の隣接するヌクレオチド対して少なくとも約80%同一、または約14の隣接するヌクレオチド対して少なくとも約80%同一、または約15の隣接するヌクレオチド対して少なくとも約80%同一、または約16の隣接するヌクレオチド対して少なくとも約80%同一、または約17の隣接するヌクレオチド対して少なくとも約80%同一であって良い。いくつかのケースにおいて、当該DNA標的化セグメントのDNA標的化配列と当該標的DNAの標的配列の間のパーセント同一性は、その標的DNAの相補鎖の標的配列の、最も5’寄りの7つの隣接するヌクレオチドにわたり100%である。いくつかのケースにおいて、当該DNA標的化セグメントのDNA標的化配列と当該標的DNAの標的配列の間のパーセント同一性は、約20の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも60%である。いくつかのケースにおいて、当該DNA標的化セグメントのDNA標的化配列と当該標的DNAの標的配列の間のパーセント同一性は、その標的DNAの相補鎖の標的配列の、最も5’寄りの14の隣接するヌクレオチドにわたり100%であり、及びその他のヌクレオチドに対しては可能な限り0%である。そのようなケースの場合、当該DNA標的化配列は、14ヌクレオチドの長さであると考えることができる。いくつかのケースにおいて、当該DNA標的化セグメントのDNA標的化配列と当該標的DNAの標的配列の間のパーセント同一性は、その標的DNAの相補鎖の標的配列の、最も5’寄りの7つの隣接するヌクレオチドにわたり100%であり、及びその他のヌクレオチドに対しては可能な限り0%である。そのようなケースの場合、当該DNA標的化配列は、7ヌクレオチドの長さであると考えることができる。

0123

ガイドRNAのタンパク質結合セグメント

0124

ガイドRNAのタンパク質結合セグメントは、部位特異的な改変ポリペプチドと相互作用する。当該ガイドRNAは、前述のDNA標的化セグメントを介して標的DNA内の特異的な核酸配列に、その結合されたポリペプチドを導く。ガイドRNAのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的である2つのヌクレオチドの長さを含む。そのタンパク質結合セグメントの相補的なヌクレオチドは、ハイブリダイズして二重らせんRNA二本鎖(dsRNA)を形成する。

0125

二重分子ガイドRNAは、2つの別々のRNA分子を含む。二重分子ガイドRNAの2つのRNA分子のそれぞれは、互いに相補的であるヌクレオチドの長さを含み、そのためその2つのRNA分子の相補的なヌクレオチドは、そのタンパク質結合セグメントの二重らせんRNA二本鎖を形成するためにハイブリダイズする。

0126

いくつかの実施形態において、当該活性化因子RNAの二本鎖形成セグメントは、補足表S5に提示される当該活性化因子RNA(tracrRNA)分子の1つに、少なくとも約60%同一であるか、または少なくとも8つの隣接するヌクレオチドの長さにわたり、それらに相補的である。例えば、当該活性化因子RNAの二本鎖形成セグメント(または当該活性化因子RNAの二本鎖形成セグメントをコードするDNA)は、補足表S5に提示される当該tracrRNAの1つに、少なくとも約60%同一である、少なくとも約65%同一である、少なくとも約70%同一である、少なくとも約75%同一である、少なくとも約80%同一である、少なくとも約85%同一である、少なくとも約90%同一である、少なくとも約95%同一である、少なくとも約98%同一である、少なくとも約99%同一である、もしくは100%同一であるか、または少なくとも8つの隣接する長さにわたり、少なくとも9つの隣接する長さにわたり、少なくとも10の隣接する長さにわたり、少なくとも11の隣接する長さにわたり、少なくとも12の隣接する長さにわたり、少なくとも13の隣接する長さにわたり、少なくとも14の隣接する長さにわたり、もしくは少なくとも15の隣接する長さにわたり、それらに相補的である。例えば、当該活性化因子RNAは、補足表S5に提示される当該tracrRNA配列の1つに、少なくとも10の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一である、少なくとも10の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一である、少なくとも11の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一である、少なくとも11の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一である、少なくとも12の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一である、または少なくとも12の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一であるヌクレオチド配列を含んでよい。

0127

いくつかの実施形態において、当該標的選択性RNAの二本鎖形成セグメントは、補足表S5に提示される標的選択性RNA(crRNA/CRISPRリピート部)の1つに、少なくとも約60%同一であるか、または少なくとも8つの隣接するヌクレオチドの長さにわたり、それらと相補的である。例えば、当該標的選択性RNAの二本鎖形成セグメント(または当該標的選択性RNAの二本鎖形成セグメントをコードするDNA)は、補足表S5に提示されるcrRNA/CRISPRリピート部の1つに、少なくとも約65%同一、少なくとも約70%同一、少なくとも約75%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約85%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、少なくとも約98%同一、少なくとも約99%同一もしくは100%同一であるか、または、少なくとも8つの隣接する、少なくとも9つの隣接する、少なくとも10の隣接する、少なくとも11の隣接する、少なくとも12の隣接、少なくとも13の隣接する、少なくとも14の隣接する、または少なくとも15の隣接するヌクレオチドの長さにわたり、それらと相補的である。例えば、当該標的選択性RNAは、補足表S5に提示されるCRISPRリピート部配列の1つに、少なくとも10の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一、少なくとも10の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一、少なくとも11の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一、少なくとも11の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一、少なくとも12の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一、少なくとも12の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一、少なくとも13の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一、少なくとも14の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一、少なくとも15の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一、少なくとも16の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一、または少なくとも17の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一である、ヌクレオチド配列を含む。

0128

2分子ガイドRNAは、標的選択性RNAと活性化因子RNAの制御された(すなわち、条件付きの)結合ができるように設計できる。2分子ガイドRNAは、当該活性化因子RNA及び当該標的選択性RNAが、Cas9と共に、機能性複合体に結合されるまでは、機能的ではないので、2分子ガイドRNAを、その活性化因子RNA及び標的選択性RNAを誘導可能に結合させることにより、誘導可能(例えば、薬剤の誘導が可能)にできる。非限定的な一例として、当該活性化因子RNAと当該標的選択性RNAとの結合を調節する(すなわち、制御する)ために、RNAアプタマーを使用できる。したがって、当該活性化因子RNA及び/または当該標的選択性RNAは、RNAアプタマーを含み得る。

0129

RNAアプタマーは、当技術分野では公知であり及び一般には、リボスイッチの合成型である。一部分を成すRNA分子の構造(及びそれゆえに特異的配列利用能)の誘導調節を提供する、合成及び天然の両核酸配列を包含するために、用語「RNAアプタマー」及び「リボスイッチ」を、本明細書では互換的に使用する。RNAアプタマーは通常、特定の薬剤(例えば、小分子)を特異的に結合する、特定の構造(例えば、ヘアピン)に折りたたむ配列を含む。そうした薬剤の結合は、当該RNAの折りたたみに変化をもたらし、そのアプタマーを一部とする核酸の特性を変化させる。非限定的な例示としての、(i)当該アプタマーが、適切な薬剤により結合されるまでは、同種の標的選択性RNAに結合できないアプタマーを伴う活性化因子RNA、(ii)当該アプタマーが、適切な薬剤により結合されるまでは、同種の活性化因子RNAに結合できないアプタマーを伴う標的選択性RNA、及び(iii)互いに異なる薬剤を結合した異なるアプタマーを含む、標的選択性RNA及び活性化因子RNAは、両薬剤が存在する限り、互いに結合できなくて良い。これらの例示に説明の通り、2分子ガイドRNAは、誘導可能に設計できる。

0130

アプタマー及びリボスイッチの例示は、例えば、Nakamura et al.,Genes Cells.2012 May,07(5):344−64、Vavalle et al.,Future Cardiol.2012 May,8(3):371−82、Citartan et al.,Biosens Bioelectron.2012 Apr 15,34(1):1−11、及びLiberman et al.,Wiley Interdiscip Rev RNA.2012 May−Jun,3(3):369−84に見出せ、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。

0131

2分子ガイドRNAに含むことができる核酸配列の非限定的な例示には、補足表S5に提示される配列、または補足表S5に提示される任意の配列とペアーとなる相補的配列、またはタンパク質結合セグメントを形成するためにハイブリダイズできる相補的配列のいずれかを含む。

0132

単分子ガイドRNAは、互いに相補的であり、共有結合をし(直接的に、または「リンカー」または「リンカーヌクレオチド」と称されるヌクレオチドの介在により)、及びそのタンパク質結合セグメントの二重らせんRNA二本鎖(dsRNA二本鎖)を形成するために相補的に結合し、その結果、ステムループ構造をもたらす、ヌクレオチド(標的選択性RNA及び活性化因子RNA)の2つの長さを含む。当該標的選択性RNA及び当該活性化因子RNAは、その標的選択性RNAの3’末端及びその活性化因子RNAの5’末端を介して共有結合できる。あるいは、標的選択性RNA及び当該活性化因子RNAは、その標的選択性RNAの5’末端及びその活性化因子RNAの3’末端を介して共有結合できる。

0133

単分子ガイドRNAのリンカーは、約3ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまでの長さを有することができる。例えば、当該リンカーは、約3ヌクレオチド(nt)から約90ntまでの、約3ヌクレオチド(nt)から約80ntまでの、約3ヌクレオチド(nt)から約70ntまでの、約3ヌクレオチド(nt)から約60ntまでの、約3ヌクレオチド(nt)から約50ntまでの、約3ヌクレオチド(nt)から約40ntまでの、約3ヌクレオチド(nt)から約30ntまでの、約3ヌクレオチド(nt)から約20ntまでの、または約3ヌクレオチド(nt)から約10ntまでの長さを有することができる。例えば、当該リンカーは、約3ntから約5ntまでの、約5ntから約10ntまでの、約10ntから約15ntまでの、約15ntから約20ntまでの、約20ntから約25ntまでの、約25ntから約30ntまでの、約30ntから約35ntまでの、約35ntから約40ntまでの、約40ntから約50ntまでの、約50ntから約60ntまでの、約60ntから約70ntまでの、約70ntから約80ntまでの、約80ntから約90ntまでの、または約90ntから約100ntまでの長さを有することができる。いくつかの実施形態において、単分子ガイドRNAのリンカーは、4ntである。

0134

例示的な単分子ガイドRNAは、dsRNA二本鎖を形成するためにハイブリダイズするヌクレオチドの2つの相補的長さを含む。いくつかの実施形態において、当該単分子ガイドRNA(またはその長さをコードするDNA)のヌクレオチドの2つの相補的な長さの1つが、補足表S5に提示される当該活性化因子RNA(tracrRNA)分子の1つと、少なくとも約60%同一であるか、または少なくとも8つの隣接するヌクレオチドの長さにわたり、それらと相補的である。例えば、当該単分子ガイドRNA(またはその長さをコードするDNA)のヌクレオチドの2つの相補的な長さの1つが、補足表S5に提示されるtracrRNA配列の1つと、少なくとも約65%同一、少なくとも約70%同一、少なくとも約75%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約85%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、少なくとも約98%同一、少なくとも約99%同一、もしくは100%同一であるか、または少なくとも8つの隣接する、少なくとも9つの隣接する、少なくとも10の隣接する、少なくとも11の隣接する、少なくとも12の隣接する、少なくとも13の隣接する、少なくとも14の隣接する、もしくは少なくとも15の隣接するヌクレオチドの長さにわたり、それらと相補的である。例えば、当該単分子ガイドRNAは、補足表S5に提示されるtracrRNA配列の1つと、少なくとも10の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一、少なくとも10の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一、少なくとも11の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一、少なくとも11の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一、少なくとも12の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一、または少なくとも12の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一である、ヌクレオチド配列を含む。

0135

いくつかの実施形態において、当該単分子ガイドRNA(またはその長さをコードするDNA)のヌクレオチドの2つの相補的な長さの1つは、補足表S5に提示される当該標的選択性RNA(crRNA/CRISPRリピート)配列の1つと、少なくとも約60%同一であるか、または少なくとも8つの隣接するヌクレオチドの長さにわたり、それらと相補的である。例えば、当該単分子ガイドRNA(またはその長さをコードするDNA)のヌクレオチドの2つの相補的な長さの1つは、補足表S5に提示される当該標crRNA/CRISPRリピート配列の1つと、少なくとも約65%同一、少なくとも約70%同一、少なくとも約75%同一、少なくとも約80%同一、少なくとも約85%同一、少なくとも約90%同一、少なくとも約95%同一、少なくとも約98%同一、少なくとも約99%同一、もしくは100%同一であるか、または少なくとも8の隣接する、少なくとも9の隣接する、少なくとも10の隣接する、少なくとも11の隣接する、少なくとも12の隣接する、少なくとも13の隣接する、少なくとも14の隣接する、もしくはは少なくとも15の隣接するヌクレオチドの長さにわたり、それらと相補的である。例えば、当該単分子ガイドRNAは、補足表S5に提示される当該CRISPRリピート配列の1つに、少なくとも10の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一、少なくとも10の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一、少なくとも11の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一、少なくとも11の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一、少なくとも12の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも70%同一、または少なくとも12の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも80%同一、または少なくとも約13の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも約80%同一、または少なくとも約14の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも約80%同一、または少なくとも約15の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも約80%同一、または少なくとも約16の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも約80%同一、または少なくとも約17の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも約80%同一であるヌクレオチドを含んで良い。

0136

crRNAとtracrRNAの、適切な自然発生の同種ペアーは、適切な同種ペアーの決定に際し、(当該タンパク質結合領域のdsRNA二本鎖に対する)その種名及び塩基対を考慮して慣例的に決定できる。非同種ペアもまた、本発明での利用に検討される。非同種ペアのいくつかの実施形態において、各RNAは、本明細書おけるCas9クラスター由来であり、ここでそのCas9エンドヌクレアーゼは、それらのアミノ酸配列の80%にわたり80%の同一性を共有する。

0137

自然発生のtracrRNA及びcrRNAに対し、非常に低い同一性(おおよそ50%同一、あるいはタンパク質全長の約50%にわたり約70%の同一)を共有する人工的な配列は、当該ガイドRNAのタンパク質結合ドメインの構造が保存されている限り、Cas9と共に機能して標的DNAを開裂する。したがって、自然発生のDNA標的化RNAのタンパク質結合ドメインのRNA折りたたみ構造は、(2分子または単分子型のいずれかの)人工的なタンパク質結合ドメインの設計のために考慮される。いずれかからの任意の自然発生crRNA:tracrRNAペアの構造は、当業者により容易に作り出せるので、人工的なDNA標的化RNAは、対象の種に対する天然構造を、その種由来のCas9(または近縁のCas9)を使用して、模倣的に設計できる。したがって、適切なガイドRNAは、自然発生ガイドRNAのタンパク質結合ドメイン構造を模倣して設計されたタンパク質結合ドメインを含む、人工的に設計されたRNA(非自然発生の)であり得る。

0138

当該タンパク質結合セグメントは、約10ヌクレオチドから約100ヌクレオチドまでの長さを有することができる。例えば、当該タンパク質結合セグメントは、約15ヌクレオチド(nt)から約80ntまでの、約15ntから約50ntまでの、約15ntから約40ntまでの、約15ntから約30ntまでの、または約15ntから約25ntまでの長さを有することができる。

0139

また、単分子ガイドRNA及び二重分子ガイドRNAの両方に関して、当該タンパク質結合セグメントのdsRNA二本鎖は、約6塩基対(bp)から約50bpまでの長さを有することができる。例えば、当該タンパク質結合セグメントのdsRNA二本鎖は、約6bpから約40bpまでの、約6bpから約30bpまでの、約6bpから約25bpまでの、約6bpから約20bpまでの、約6bpから約15bpまでの、約8bpから約40bpまでの、約8bpから約30bpまでの、約8bpから約25bpまでの、約8bpから約20bpまでの、または約8bpから約15bpまでの長さを有することができる。例えば、当該タンパク質結合セグメントのdsRNA二本鎖は、約8bpから約10bpまでの、約10bpから約15bpまでの、約15bpから約18bpまでの、約18bpから約20bpまでの、約20bpから約25bpまでの、約25bpから約30bpまでの、約30bpから約35bpまでの、約35bpから約40bpまでの、または約40bpから約50bpまでの長さを有することができる。いくつかの実施形態において、当該タンパク質結合セグメントのdsRNA二本鎖は、36塩基対の長さを有する。当該タンパク質結合セグメントのdsRNA二本鎖を形成するためにハイブリダイズするヌクレオチド配列間のパーセント相補性は、少なくとも約60%であり得る。例えば、当該タンパク質結合セグメントのdsRNA二本鎖を形成するためにハイブリダイズするヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%であり得る。いくつかのケースにおいて、当該タンパク質結合セグメントのdsRNA二本鎖を形成するためにハイブリダイズするヌクレオチド配列間のパーセント相補性は、100%である。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

  • 株式会社堀場製作所の「 エクソソーム表面分子を特定する方法」が 公開されました。( 2020/10/29)

    【課題・解決手段】本発明はエクソソーム表面分子に対する結合性分子が固相化された担体をカゼイン溶液またはカゼイン分解物溶液でブロックおよび洗浄すること、ならびに該担体とエクソソームを含む被験試料の接触前... 詳細

  • 株式会社資生堂の「 レチノイドの副作用に対する感受性の決定方法」が 公開されました。( 2020/10/29)

    【課題・解決手段】SNP解析により遺伝要素に基づいて対象のレチノイドの副作用に対する感受性を決定する方法、レチノイドの副作用に対する感受性を決定するコンピュータ、及び当該コンピュータを制御するプログラ... 詳細

  • 公立大学法人福島県立医科大学の「 大腸がんの予後バイオマーカー」が 公開されました。( 2020/10/29)

    【課題・解決手段】大腸がん患者の予後を予測するための、及び/又は大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するためのバイオマーカーを提供する。GALNT6タンパク質若しくはそのペプチド断片、又はGAL... 詳細

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ