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図面 (20)

課題

レセプターリガンド相互作用ハイスループット同定のための方法及びシステムの提供。

解決手段

(i)(a)第一の所定の異種タンパク質、及び(b)第一の蛍光タンパク質発現するように形質転換された第一の複数の細胞と、(ii)(a)第二の所定の異種タンパク質、及び(b)第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された少なくとも第二の複数の細胞とを含む細胞マイクロアレイであって、第一及び第二の複数の細胞が、該マイクロアレイの固体表面に接着されており、第一と第二の複数の細胞が、該固体表面の空間的に別個の位置に存在する、前記細胞マイクロアレイ。

概要

背景

発明の背景
本出願全体を通して、様々な発行物が、括弧内に参照される。これらの参考資料の全ての引用を、明細書の最終部分見出すことができる。これらの発行物、並びに本明細書で参照される全ての特許、特許出願刊行物及び書物は全体として、表題の発明が所属する技術分野をより完全に記載する表題の出願に、参照により取り込まれる。

細胞表面のレセプター及び接着分子は、正常な生理及び病理の中心となる発達工程、形態発生工程及び環境工程をはじめとする細胞機能門番である。これらの分子は、最も主要な治療ターゲットである。これらの複合体の高分解能構造の特性が、これらの相互作用及びその関連のシグナル伝達経路を細胞全体の生理に統合するのに重要となるレセプター:リガンド特異性、親和性、オリゴマー状態結合価及び全体的な構造特性基礎となる化学的及び物理決定因子を定義する。これらの特色全ては、複雑な細胞工程を指揮して治療的介入特有の機会を提供する根本メカニズムを理解する上で不可欠である。残念なことに現在のところ、ほとんどではないにしろ多くのレセプター:リガンド対は定義されておらず、つまり構造的特徴づけることができないため、これらの重要な複合体の系統的構造特性(即ち、セクレトームの構造ゲノミクス)は、非現実的な目標である。

概要

レセプター:リガンド相互作用のハイスループット同定のための方法及びシステムの提供。(i)(a)第一の所定の異種タンパク質、及び(b)第一の蛍光タンパク質発現するように形質転換された第一の複数の細胞と、(ii)(a)第二の所定の異種タンパク質、及び(b)第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された少なくとも第二の複数の細胞とを含む細胞マイクロアレイであって、第一及び第二の複数の細胞が、該マイクロアレイの固体表面に接着されており、第一と第二の複数の細胞が、該固体表面の空間的に別個の位置に存在する、前記細胞マイクロアレイ。

目的

これらの特色全ては、複雑な細胞工程を指揮して治療的介入に特有の機会を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

(i)(a)第一の所定の異種タンパク質、及び(b)第一の蛍光タンパク質発現するように形質転換された第一の複数の細胞と、(ii)(a)第二の所定の異種タンパク質、及び(b)第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された少なくとも第二の複数の細胞とを含む細胞マイクロアレイであって、第一及び第二の複数の細胞が、該マイクロアレイの固体表面に接着されており、第一と第二の複数の細胞が、該固体表面の空間的に別個の位置に存在する、前記細胞マイクロアレイ。

請求項2

(i)異種タンパク質の1つのための候補タンパク質若しくはペプチドリガンドと、(ii)異種タンパク質の1つに結合した第三の蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質をさらに含むか、又は異種タンパク質の1つのためのペプチド若しくはタンパク質リガンドを含む化合物をさらに含む、前記細胞マイクロアレイであって、該化合物が、非ペプチド結合により結合された第三の蛍光タンパク質を有し、細胞マイクロアレイの異種タンパク質の1つに結合されている、請求項1に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項3

第三の複数の細胞を対照としてさらに含む、前記細胞マイクロアレイであって、第三の複数の細胞が、第一の蛍光タンパク質を発現するように任意で形質転換されているが、第一又は第二の所定の異種タンパク質では形質転換されていない、請求項1又は2に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項4

前記複数の細胞がそれぞれ、複数の哺乳動物細胞である、請求項1、2又は3に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項5

哺乳動物細胞が、単離されたヒト細胞である、請求項1、2、3又は4に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項6

前記細胞が、ヒト胎児HEK)細胞株の細胞である、請求項1、2、3又は4に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項7

前記細胞が、HEK293細胞株の細胞である、請求項1、2、3、4又は6に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項8

前記マイクロアレイが、少なくとも10の異なる複数の細胞を含み、複数の細胞がそれぞれ、所定の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換されており、該異種タンパク質が、マイクロアレイ内の他の複数の形質転換された細胞それぞれにより発現される異種タンパク質とは異なる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項9

前記マイクロアレイが、少なくとも100の異なる複数の細胞を含み、複数の細胞がそれぞれ、所定の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換されており、該異種タンパク質が、マイクロアレイ内の他の複数の形質転換された細胞それぞれにより発現される異種タンパク質とは異なる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項10

第一のタンパク質及び/又は蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質又は黄色蛍光タンパク質である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項11

第三の蛍光タンパク質が、赤色蛍光タンパク質である、請求項2〜10のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項12

前記複数の細胞がそれぞれ、第一の所定の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換されているに過ぎず、任意の他の異種タンパク質を発現するようには形質転換されていない、請求項1〜11のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項13

第一の所定の異種タンパク質が、マルチサブユニット異種タンパク質のあるサブユニットであり、前記複数の細胞が、マルチサブユニット異種タンパク質の1つ以上の残りのメンバーも発現するように形質転換されている、請求項1〜11のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項14

第一の所定の異種タンパク質が、発現される際に、C末端を介して第一の蛍光タンパク質に付着される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項15

第一の所定の異種タンパク質が、発現される際に、膜貫通アンカーペプチドに付着される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項16

第一の異種タンパク質及び蛍光タンパク質をコードする第一の複数の発現構築物を、マイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びに第二の異種タンパク質及び蛍光タンパク質をコードする少なくとも第二の複数の発現構築物を、貼付された第一の複数の発現構築物とは異なる空間的に別個の位置の固体表面で、マイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びにトランスフェクション剤の存在を含む条件下で、発現構築物を複数の細胞と接触させ、それにより各発現構築物によるそれぞれ空間的に別個の位置にある細胞の少なくとも一部のトランスフェクションを可能にすることにより、前記細胞マイクロアレイが、組み立てられる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項17

発現構築物が、pEGFP−N1発現構築物を含む、請求項16に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項18

発現構築物が、CMVプロモータを含む、請求項16又は17に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項19

前記細胞が、昆虫細胞である、請求項1、2、3、又は8〜18のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項20

前記細胞が、ショウジョウバエS2細胞である、請求項19に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項21

第一及び/又は第二の異種タンパク質が、イムノグロブリンスーパーファミリータンパク質、TNFレセプタータンパク質、サイトカインケモカイン1型膜貫通レセプタータンパク質2型膜貫通レセプタータンパク質、イオンチャネルタンパク質、又は膜輸送タンパク質である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項22

第一及び/又は第二の異種タンパク質が、Toll様レセプター、TNFレセプター、GPCR増殖因子レセプターネクチンインターロイキン、又はインターロイキンレセプターである、請求項1〜20のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項23

第一及び/又は第二の異種タンパク質が、哺乳動物のものである、請求項1〜22のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項24

第一及び/又は第二の異種タンパク質が、細胞膜局在化した位置に発現される、請求項1〜22のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項25

第一及び/又は第二の所定の異種タンパク質が、分泌タンパク質膜貫通タンパク質、又は細胞表面タンパク質である、請求項1〜24のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項26

前記細胞マイクロアレイが、異種タンパク質を発現するように形質転換された、500以上の異なる複数の細胞を含み、複数の細胞がそれぞれ、他の複数の形質転換細胞により発現された異種タンパク質と互いに異なる異種タンパク質を発現する、請求項1〜25のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項27

異種タンパク質が、分泌タンパク質であり、膜貫通へリックスに融合されて発現される、請求項1〜26のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項28

第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質が、同じタイプであり、第三の蛍光タンパク質が、異なるタイプのものである、請求項1〜27のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイ。

請求項29

第一の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質をコードする第一の複数の発現構築物を、マイクロアレイの固体表面に貼付する段階、並びに第二の異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質をコードする少なくとも第二の複数の発現構築物を、貼付された第一の複数の発現構築物とは異なる空間的に別個の位置でマイクロアレイの固体表面に貼付する段階、並びに細胞を固体表面に接着させるように、かつそれぞれ空間的に別個の位置にある細胞の少なくとも一部に各発現構築物によるトランスフェクションを起こさせるために、トランスフェクション剤の存在を含む条件下で、発現構築物を複数の細胞と接触させる段階を含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイを作製するための方法。

請求項30

ライゲーション非依存性クローニング(LIC)を用いて、発現構築物を調製する、請求項29に記載の方法。

請求項31

候補タンパク質又はペプチドが第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、第二のタンパク質を請求項1〜28のいずれか一項に記載の細胞マイクロアレイの異種タンパク質として発現させる段階、及び細胞マイクロアレイを第三の蛍光タンパク質又はペプチドに貼付された候補タンパク質又はペプチドと接触させる段階、候補タンパク質又はペプチドと接触させた細胞マイクロアレイを洗浄して、非結合候補タンパク質又はペプチドを除去する段階、及び洗浄後に細胞マイクロアレイに結合された任意の候補タンパク質又はペプチドが存在するかどうかを決定する段階を含み、第一の異種タンパク質で形質転換された細胞に対応する第一の空間的位置に洗浄後の細胞マイクロアレイに結合された候補タンパク質又はペプチドが存在すれば、候補タンパク質又はペプチドが第一の異種タンパク質に結合していることが示され、洗浄後の第一の空間的位置に細胞マイクロアレイに結合された候補タンパク質又はペプチドが存在しなければ、候補タンパク質又はペプチドが異種タンパク質に結合していないことが示される、前記方法。

請求項32

洗浄後に細胞マイクロアレイに結合された任意の候補タンパク質又はペプチドが存在するかどうかを決定する段階が、第三の蛍光タンパク質の蛍光を測定すること、及び細胞マイクロアレイでの位置を決定することにより実行され、第三の蛍光タンパク質と、第一又は第二の蛍光タンパク質が空間的に別個の位置に共存することにより、第一のタンパク質又はペプチドが、空間的に別個の位置に対応する異種タンパク質に結合されていることが示される、請求項31に記載の方法。

請求項33

(i)マイクロアレイの固体表面、及び、細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第一のC−末端細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、浮遊培養適合細胞株と、(ii)少なくとも(a)所定の異種タンパク質を細胞表面で発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、第二の複数の細胞、又は(b)異種タンパク質を表面に貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数のマイクロビーズとを含むシステムであって、(a)又は(b)が、前記マイクロアレイの固体表面に貼付されている、前記システム。

請求項34

(c)異なる所定の異種タンパク質を細胞表面で発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の細胞、又は(d)異なる所定の異種タンパク質を表面に貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、1つ以上のさらなる複数のマイクロビーズをさらに含み、(c)又は(d)が、複数の(a)及び/又は(b)とは空間的に別個の位置でマイクロアレイ固体表面に貼付されている、請求項33に記載のシステム。

請求項35

異種タンパク質が、プロテインA分子を介してマイクロビーズに貼付されている、請求項33又は34に記載のシステム。

請求項36

細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように形質転換された浮遊培養適合細胞株が、候補リガンドタンパク質又はペプチドをコードする核酸構築物一過性トランスフェクトされている、請求項33、34又は35に記載のシステム。

請求項37

異種タンパク質が、マイクロビーズに付着された抗体により結合させることによりマイクロビーズに貼付されている、請求項33〜36のいずれか一項に記載のシステム。

請求項38

第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質が、異なる色である、請求項33〜37のいずれか一項に記載のシステム。

請求項39

一方の蛍光タンパク質が、緑色であり、他方の蛍光タンパク質が、赤色である、請求項38に記載のシステム。

請求項40

前記複数の細胞が、複数の哺乳動物細胞である、請求項33〜39のいずれか一項に記載のシステム。

請求項41

前記細胞が、単離されたヒト細胞である、請求項33〜40のいずれか一項に記載のシステム。

請求項42

前記細胞が、ヒト胎児腎(HEK)細胞株の細胞である、請求項33〜41のいずれか一項に記載のシステム。

請求項43

前記細胞が、HEK293細胞株の細胞である、請求項33〜42のいずれか一項に記載のシステム。

請求項44

所定の異種タンパク質が、マルチサブユニット異種タンパク質のあるサブユニットであり、前記複数の細胞が、マルチサブユニット異種タンパク質の1つ以上の残りのメンバーも発現するように形質転換されている、請求項33〜43のいずれか一項に記載のシステム。

請求項45

所定の異種タンパク質が、分泌タンパク質、膜タンパク質、又は細胞表面タンパク質である、請求項33〜44のいずれか一項に記載のシステム。

請求項46

所定の異種タンパク質が、発現される際に、C末端を介して蛍光タンパク質に付着される、請求項33〜45のいずれか一項に記載のシステム。

請求項47

所定の異種タンパク質が、分泌タンパク質であり、発現される際に、膜貫通アンカーペプチド又はタンパク質に付着される、請求項33〜46のいずれか一項に記載のシステム。

請求項48

発現構築物が、pEGFP−N1発現構築物及び/又はCMVプロモータを含む、請求項33〜47のいずれか一項に記載のシステム。

請求項49

異種タンパク質が、イムノグロブリンスーパーファミリータンパク質、TNFレセプタータンパク質、サイトカイン、ケモカイン、1型膜貫通レセプタータンパク質、2型膜貫通レセプタータンパク質、イオンチャネルタンパク質、又は膜輸送タンパク質である、請求項33〜48のいずれか一項に記載のシステム。

請求項50

異種タンパク質が、Toll様レセプター、TNFレセプター、GPCR、増殖因子レセプター、ネクチン、インターロイキン、又はインターロイキンレセプターである、請求項33〜49のいずれか一項に記載のシステム。

請求項51

異種タンパク質が、哺乳動物のものである、請求項33〜50のいずれか一項に記載のシステム。

請求項52

異種タンパク質が、細胞膜に局在化した位置で発現される、請求項33〜51のいずれか一項に記載のシステム。

請求項53

候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、請求項33〜52のいずれか一項に記載のシステムの浮遊培養適合細胞株の複数において候補リガンドタンパク質又はペプチド及び第一の蛍光タンパク質を発現させる段階、並びに前記細胞株の複数を、(a)異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された第二の複数の細胞、又は(b)異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質を表面に貼付させた複数のマイクロビーズ、と接触させる段階、並びに洗浄して非結合候補リガンドタンパク質又はペプチドを除去する段階、並びにFACS分析又は磁気分離により第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示す細胞を同定する段階を含み、細胞が空間的に別個の位置の第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示していれば、第一のタンパク質又はペプチドが空間的に別個の位置に対応する異種タンパク質に結合していることが示される、前記方法。

請求項54

第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存が、FACS分析により決定される、請求項53に記載の方法。

請求項55

細胞表面で第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するようにあるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドに対する独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含み、独特な配列が1つ以上のユニバーサルプライマーにより鎖延長することが可能である、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように第二のベクターで形質転換された、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二のベクターが第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドに対する別の独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含む、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、(i)細胞表面でレセプタータンパク質若しくはペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は(ii)表面にレセプタータンパク質を貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズとを含むシステム。

請求項56

細胞表面で第一の異種タンパク質を発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するようにあるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが第一の異種タンパク質に対する独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含み、独特な配列が1つ以上のユニバーサルプライマーにより鎖延長することが可能である、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、細胞表面で第二の異種タンパク質を発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように第二のベクターで形質転換された、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二のベクターが第二の異種タンパク質に対する別の独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含む、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、(i)細胞表面で候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は(ii)表面に候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズとを含むシステム。

請求項57

ユニバーサルプライマーが、T7フォワード及びリバースユニバーサルプライマーを含む、請求項55又は56に記載のシステム。

請求項58

ペプチド細胞表面エピトープが、FLAGエピトープ(DYKDDDDK)である、請求項55、56又は57に記載のシステム。

請求項59

磁気分子物質を含む抗FLAGエピトープ抗体をさらに含み、該抗体がFLAGエピトープに結合されている、請求項58に記載のシステム。

請求項60

磁気分子物質が、超常磁性含浸ビーズである、請求項59に記載のシステム。

請求項61

独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列が、28ヌクレオチド長である、請求項55〜60のいずれか一項に記載のシステム。

請求項62

表面に候補リガンドタンパク質又はペプチドを貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズを含む、請求項55〜61のいずれか一項に記載のシステム。

請求項63

細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上の更なる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞を含み、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、請求項55〜61のいずれか一項に記載のシステム。

請求項64

表面に候補リガンドタンパク質又はペプチドを貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズを、少なくとも1つのウェルが含み、表面に異なる候補リガンドタンパク質又はペプチドを貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、異なる複数の磁気マイクロビーズを、第二のウェルが含む、マルチウェルプレートを含む、請求項56〜63のいずれか一項に記載のシステム。

請求項65

細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、更なる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞を、少なくとも1つのウェルが含み、更なる複数の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含み、細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、異なる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞を、第二のウェルが含み、異なる複数の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、マルチウェルプレートを含む、請求項55〜63のいずれか一項に記載のシステム。

請求項61

候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二の所定のタンパク質に結合するかどうかを決定する方法であって、第二の所定のタンパク質を請求項55〜60のいずれか一項に記載のシステムの異種タンパク質として発現させる段階、及び(i)細胞表面で候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は(ii)表面に候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズの候補リガンドタンパク質又はペプチドと接触させる段階;第二の複数の細胞の1つ以上に又は複数の磁気マイクロビーズに結合された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞のいずれかを、磁気引力により分離する段階;そのような分離された細胞間又は細胞−マイクロビーズのコンジュゲートからDNAを得て、存在するならばDNA中の独特な配列を、ユニバーサルプライマーを用いて増幅させる段階;独特な配列の複数のコピーシークエンシングして独特な配列の存在を確認する段階;そのように同定された独特な配列をデータベースに対して比較して、独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を特異的異種タンパク質又はペプチドに相関させ、それによりそのように相関された任意の異種タンパク質又はペプチド結合を同定し、それにより特異的異種タンパク質又はペプチドを、候補タンパク質又はペプチドに結合しているとして同定する段階を含む、前記方法。

請求項62

候補リガンドタンパク質又はペプチドが、プロテインA分子を介してマイクロビーズに貼付されている、請求項61に記載の方法。

請求項63

候補リガンドタンパク質又はペプチドが、マイクロビーズに付着された抗体により結合させることによりマイクロビーズに貼付されている、請求項61又は62に記載の方法。

請求項64

第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質が、異なる色である、請求項61〜63のいずれか一項に記載の方法。

請求項65

一方の蛍光タンパク質が、緑色であり、他方の蛍光タンパク質が、赤色である、請求項61〜64のいずれか一項に記載の方法。

請求項66

前記複数の細胞が、複数の哺乳動物細胞である、請求項61〜65のいずれか一項に記載の方法。

請求項67

哺乳動物細胞が、単離されたヒト細胞である、請求項61〜66のいずれか一項に記載の方法。

請求項68

哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎(HEK)細胞株の細胞である、請求項61〜67のいずれか一項に記載の方法。

請求項69

哺乳動物細胞が、HEK293細胞株の細胞である、請求項68に記載の方法。

請求項70

所定の異種タンパク質が、マルチサブユニット異種タンパク質のあるサブユニットであり、前記複数の細胞が、マルチサブユニット異種タンパク質の1つ以上の残りのメンバーも発現するように形質転換されている、請求項61〜69のいずれか一項に記載の方法。

請求項71

所定の異種タンパク質が、発現される際に、C末端を介して蛍光タンパク質に付着される、請求項61〜70のいずれか一項に記載の方法。

請求項72

所定の異種分泌タンパク質が、発現される際に、膜貫通アンカーペプチドに付着される、請求項61〜71のいずれか一項に記載の方法。

請求項73

異種タンパク質が、イムノグロブリンスーパーファミリータンパク質、TNFレセプタータンパク質、サイトカイン、ケモカイン、1型膜貫通レセプタータンパク質、2型膜貫通レセプタータンパク質、イオンチャネルタンパク質、又は膜輸送タンパク質である、請求項61〜72のいずれか一項に記載の方法。

請求項74

異種タンパク質が、Toll様レセプター、TNFレセプター、GPCR、増殖因子レセプター、ネクチン、インターロイキン、又はインターロイキンレセプターである、請求項61〜73のいずれか一項に記載の方法。

請求項75

異種タンパク質が、哺乳動物のものである、請求項61〜74のいずれか一項に記載の方法。

請求項76

異種タンパク質が、細胞膜に局在化した位置で発現される、請求項61〜75のいずれか一項に記載の方法。

請求項77

(i)マイクロアレイの固体表面と、(ii)(a)複数の異なるタンパク質の各タンパク質タイプが、1〜25アミノ酸残基点突然変異により複数のタンパク質の他のタイプそれぞれと異なる、複数の異なる第一の異種タンパク質のうちの単一タイプを、複数の細胞の細胞表面で、および(b)第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように形質転換された浮遊培養適合細胞株の複数の細胞と、(iii)少なくとも(1)所定の第二の異種タンパク質を細胞表面で発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、第二の複数の細胞、又は(2)浮遊培養適合細胞株に関して異種の第二のタンパク質を表面に貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数のマイクロビーズとを含み、(1)又は(2)が、前記マイクロアレイの固体表面に貼付されている、システム。

請求項78

前記複数の第一の異種タンパク質の異なるタイプが、野生型タンパク質の各突然変異体である、請求項77に記載のシステム。

請求項79

第二の異種タンパク質が、野生型タンパク質である、請求項78に記載のシステム。

請求項80

複数の異なるタンパク質の各タンパク質タイプが、1、2、3、4又は5アミノ酸残基の点突然変異により複数のタンパク質の互いのタイプと異なっている、請求項77、78又は79に記載のシステム。

請求項81

複数の異なるタンパク質の各タンパク質タイプが、1アミノ酸残基の点突然変異により複数のタンパク質の互いのタイプと異なっている、請求項77、78又は79に記載のシステム。

請求項82

第一又は第二の蛍光タンパク質が、緑色である、請求項77〜81のいずれか一項に記載のシステム。

請求項83

他の蛍光タンパク質が、赤色である、請求項77〜82のいずれか一項に記載のシステム。

請求項84

野生型タンパク質中の残基を、野生型タンパク質と第二のタンパク質との物理的相互作用に影響を及ぼすものであると決定する方法であって、野生型タンパク質に関して変異されたタンパク質を、請求項77〜83のいずれか一項に記載のシステムの浮遊培養適合細胞株の複数のうちの異なる複数として発現させる段階、並びに前記複数を、第二のタンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された請求項77〜83のいずれか一項に記載のシステムの第二の複数の細胞の形態の第二のタンパク質と、又は(b)表面に第二のタンパク質及び第二の蛍光タンパク質を貼付させた複数のマイクロビーズと、接触させる段階、並びに洗浄して非結合細胞を除去する段階、並びにFACS分析により第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示す細胞を同定する段階を含み、空間的に別個の位置において細胞が第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示していれば、空間的に別個の位置に対応する共存する浮遊培養適合細胞株の細胞上のタンパク質中で変異された1つ又は複数の残基が、野生型タンパク質と第二のタンパク質との物理的相互作用に必要でないことが示される、前記方法。

請求項85

野生型タンパク質及び第二のタンパク質が、互いに物理的に相互作用することが公知である、請求項84に記載の方法。

請求項86

第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存が、FACS分析により決定される、請求項85に記載の方法。

請求項87

(i)(a)細胞表面で異種タンパク質を発現するように、かつ(b)第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが発現された異種タンパク質に対する独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含むことで、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞が少なくとも2つの異なるタイプの第一の異種タンパク質を発現する、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、(ii)細胞表面で第二の異種タンパク質を発現するように、かつ第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換されており、単一タイプの第二の異種タンパク質を発現する、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞とを含むシステム。

請求項88

第一の複数の細胞の任意の個々の細胞が、細胞表面の唯一の異種タンパク質を発現する、請求項87に記載のシステム。

請求項89

第二の異種タンパク質が、膜レセプターである、請求項87又は88に記載のシステム。

請求項90

第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞中で発現された異種タンパク質のそれぞれが、分泌されたペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である、請求項87、88又は89に記載のシステム。

請求項91

複数の第一の異種タンパク質の異なるタイプが、所定の野生型タンパク質の各突然変異体である、請求項87、88、89又は90に記載のシステム。

請求項92

第二の異種タンパク質が、野生型タンパク質である、請求項87〜91のいずれか一項に記載のシステム。

請求項93

第一の複数の異なるタンパク質の異種タンパク質の各タイプが、1、2、3、4又は5アミノ酸残基の点突然変異により複数の異種タンパク質の互いのタイプと異なっている、請求項87〜92のいずれか一項に記載のシステム。

請求項94

複数の異なるタンパク質の各タンパク質タイプが、1アミノ酸残基の点突然変異により複数の異種タンパク質の互いのタイプと異なっている、請求項87〜93のいずれか一項に記載のシステム。

請求項95

独特な配列が、1つ以上のユニバーサルプライマーにより鎖延長することが可能である、請求項87〜94のいずれか一項に記載のシステム。

請求項96

第一又は第二の蛍光タンパク質が、緑色である、請求項87〜95のいずれか一項に記載のシステム。

請求項97

他の蛍光タンパク質が、赤色である、請求項96に記載のシステム。

請求項98

候補リガンドタンパク質又はペプチドが第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、第一の異種タンパク質を第二の異種タンパク質に結合させる条件下で、候補リガンドタンパク質又はペプチドを請求項87〜97のいずれか一項に記載のシステムにおいて第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質として発現させ、かつ第二のタンパク質又はペプチドを請求項87〜97のいずれか一項に記載のシステムにおいて第二の異種タンパク質として発現させる段階、並びに任意で洗浄して非結合の第一の異種タンパク質をいずれも除去する段階、その後、第一及び第二の異種タンパク質が両方とも共存する細胞を回収する段階、回収された細胞から核酸を得る段階、及び核酸をシークエンシングして、それに含まれる独特な15〜35ヌクレオチド配列を同定することで、第二のタンパク質又はペプチドに結合した独特な15〜35ヌクレオチドに対応する候補リガンドタンパク質又はペプチドを同定する段階を含む、前記方法。

請求項99

第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合に及ぼす、第一のタンパク質の所定のアミノ酸残基の影響を決定する方法であって、第一のタンパク質に対して1つ以上の点突然変異により変異されたタンパク質を、請求項87〜97に記載のシステムの第一の浮遊培養適合細胞株の複数の中の複数の異なるタイプの異種タンパク質として発現させる段階、並びに該複数を、第二のタンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された請求項87〜97に記載のシステムの第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質の形態の第二のタンパク質と接触させる段階、並びに第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存を示す細胞を回収する段階、回収された細胞から核酸を得る段階、及び核酸をシークエンシングしてそれに含まれる独特な15〜35ヌクレオチド配列を同定することで、第二のタンパク質又はペプチドに結合された第一のタンパク質を同定する段階、並びに第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルを、所定の参照レベルと比較する段階を含み、第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルが所定の参照レベルよりも多ければ、タンパク質中で変異された1つ又は複数の残基が、第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合を増大させていることが示され、第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルが所定の参照レベルよりも少なければ、タンパク質中で変異された1つ又は複数の残基が、第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合を阻害していることが示される、前記方法。

請求項100

所定のレベルが、対照である、請求項99に記載の方法。

請求項101

所定のレベルが、第二のタンパク質に結合する未変異の第一のタンパク質のレベルをアッセイすることにより得られる、請求項99に記載の方法。

請求項102

第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存を示す細胞が、FACS分析により回収される、請求項98〜101のいずれか一項に記載の方法。

請求項103

(i)細胞表面で第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するようにあるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、及び細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように第二のベクターで形質転換された、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と(ii)表面に標的タンパク質、ペプチド、又は抗体を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズとを含む、システム。

請求項104

2つの候補リガンドタンパク質又はペプチドの1つ以上が標的タンパク質、ペプチド、又は抗体に結合するかどうかを決定する方法であって、第一の異種タンパク質及び第二の異種タンパク質を、標的タンパク質、ペプチド、又は抗体に結合させる条件下で、第一の候補リガンドタンパク質又はペプチドを、請求項103に記載のシステムにおいて第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質として発現させ、かつ第二の候補リガンドタンパク質又はペプチドを、請求項103に記載のシステムにおいて第二の異種タンパク質として発現させる段階、並びに第一の蛍光タンパク質発現細胞複合体化されかつ/又は第二の蛍光タンパク質発現細胞と複合体化された任意のマイクロビーズを回収する段階、並びに複合体中の候補リガンドタンパク質を同定する段階を含み、第一の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、第一の候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第二の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、第二の候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第一の蛍光タンパク質発現細胞又は第二の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されなければ、それぞれ第一の候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないこと、及び第二の候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないことが示される、前記方法。

請求項105

(i)細胞表面で第一の異種標的タンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するようにあるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、及び細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように第二のベクターで形質転換された、1つ以上の第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、(ii)候補リガンドタンパク質若しくはペプチドのいずれかに対する抗体又は標的タンパク質若しくはペプチドに対する抗体を表面に貼付させた、複数の磁気マイクロビーズとを含むシステム。

請求項106

候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、候補リガンドタンパク質又はペプチドと標的タンパク質又はペプチドを結合させる条件下で、候補リガンドタンパク質又はペプチドを請求項105に記載のシステムにおいて第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質として発現させ、かつ標的タンパク質又はペプチドを請求項105に記載のシステムにおいて第一の異種タンパク質として発現させる段階、並びに第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方と複合体化された任意のマイクロビーズを回収する段階を含み、第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されなければ、候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないことが示される、前記方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2012年12月11日出願の米国特許仮出願第61/735,791号及び2013年6月11日出願の同第61/833,588号の利益を主張するものであり、それらの各内容は、参照により本明細書に取り込まれる。

0002

政府による後援の表明
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された認可番号3U54GM094662−02、5U01GM094665−02及びAI057158の下、米国連邦政府による後援を受けてなされた。連邦政府は、本発明において特定の権利を有する。

背景技術

0003

発明の背景
本出願全体を通して、様々な発行物が、括弧内に参照される。これらの参考資料の全ての引用を、明細書の最終部分見出すことができる。これらの発行物、並びに本明細書で参照される全ての特許、特許出願刊行物及び書物は全体として、表題の発明が所属する技術分野をより完全に記載する表題の出願に、参照により取り込まれる。

0004

細胞表面のレセプター及び接着分子は、正常な生理及び病理の中心となる発達工程、形態発生工程及び環境工程をはじめとする細胞機能門番である。これらの分子は、最も主要な治療ターゲットである。これらの複合体の高分解能構造の特性が、これらの相互作用及びその関連のシグナル伝達経路を細胞全体の生理に統合するのに重要となるレセプター:リガンド特異性、親和性、オリゴマー状態結合価及び全体的な構造特性基礎となる化学的及び物理決定因子を定義する。これらの特色全ては、複雑な細胞工程を指揮して治療的介入特有の機会を提供する根本メカニズムを理解する上で不可欠である。残念なことに現在のところ、ほとんどではないにしろ多くのレセプター:リガンド対は定義されておらず、つまり構造的特徴づけることができないため、これらの重要な複合体の系統的構造特性(即ち、セクレトームの構造ゲノミクス)は、非現実的な目標である。

発明が解決しようとする課題

0005

本発明は、ヒトの生理、疾患及び医薬に関連するレセプター:リガンド相互作用のレパートリーの効率的かつ系統的な同定のための技術を提供することにより、この要求に取り組んでいる。

課題を解決するための手段

0006

(i)第一の所定の異種分泌タンパク質異種膜タンパク質又は異種細胞表面タンパク質、及び第一の蛍光タンパク質発現するように形質転換された第一の複数の細胞と、(ii)第二の所定の異種分泌タンパク質又は第二の異種タンパク質、及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された少なくとも第二の複数の細胞と、を含む細胞マイクロアレイであって、
該第一及び第二の複数の細胞が、マイクロアレイの固体表面に接着されていて、該第一と第二の複数の細胞が、固体表面の空間的に別個の位置に存在する、細胞マイクロアレイが提供される。

0007

(i)(a)第一の所定の異種タンパク質、及び(b)第一の蛍光タンパク質、を発現するように形質転換された第一の複数の細胞と、(ii)(a)第二の所定の異種タンパク質、及び(b)第二の蛍光タンパク質、を発現するように形質転換された少なくとも第二の複数の細胞と、を含む細胞マイクロアレイであって、
該第一及び第二の複数の細胞が、マイクロアレイの固体表面に接着されていて、該第一と第二の複数の細胞が、固体表面の空間的に別個の位置に存在する、細胞マイクロアレイが提供される。

0008

本明細書に記載された細胞マイクロアレイを作製する工程であって、第一の異種タンパク質及び蛍光タンパク質をコードする第一の複数の発現構築物を、マイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びに第二の異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質をコードする少なくとも第二の複数の発現構築物を、該貼付された第一の複数の発現構築物とは異なる空間的に別個の位置の固体表面でマイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びに細胞を固体表面に接着させるように、そしてそれぞれ空間的に別個の位置にある細胞の少なくとも一部に各発現構築物によるトランスフェクションを起こさせるために、トランスフェクション剤の存在を含む条件下で、発現構築物を複数の細胞と接触させること、を含む、工程が提供される。

0009

候補タンパク質又はペプチドが第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、第二のタンパク質を本明細書に記載された細胞マイクロアレイの異種タンパク質として発現させること、細胞マイクロアレイを第三の蛍光タンパク質又はペプチドに貼付された候補タンパク質又はペプチドと接触させること、候補タンパク質又はペプチドと接触された細胞マイクロアレイを洗浄して、非結合候補タンパク質又はペプチドを除去すること、及び洗浄後に細胞マイクロアレイに結合された任意の候補タンパク質又はペプチドが存在するかどうかを決定すること、を含み、第一の異種タンパク質で形質転換された細胞に対応する第一の空間的位置に洗浄後の細胞マイクロアレイに結合された候補タンパク質が存在すれば、候補タンパク質又はペプチドが第一の異種タンパク質に結合していることが示され、洗浄後の第一の空間的位置に細胞マイクロアレイに結合された候補タンパク質又はペプチドが存在しなければ、候補タンパク質又はペプチドが異種タンパク質に結合していないことが示される、方法も提供される。

0010

(i)マイクロアレイの固体表面、及び、細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するようにかつ第一のC−末端細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように形質転換された浮遊培養適合細胞株と、
(ii)少なくとも(a)所定の異種タンパク質を細胞表面で発現するようにかつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、第二の複数の細胞、又は(b)異種タンパク質を表面に貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数のマイクロビーズ
を含むシステムであって、(a)又は(b)が、マイクロアレイの固体表面に貼付されている、システムも提供される。先のものに必要な変更を加えたシステムであって、候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二の複数の形質転換された細胞又は複数のマイクロビーズ上で発現され、異種タンパク質が形質転換された浮遊培養適合細胞株の細胞表面で発現される、システムも提供される。

0011

候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、本発明のシステムの浮遊培養適合細胞株の複数において候補リガンドタンパク質又はペプチド及び第一の蛍光タンパク質を発現させること、並びにその細胞株の複数を、(a)異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された第二の複数の細胞、又は(b)異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質を表面に貼付させた複数のマイクロビーズ、と接触させること、並びに洗浄して非結合候補リガンドタンパク質又はペプチドを除去すること、並びにFACS分析により第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示す細胞を同定すること、を含み、空間的に別個の位置で細胞が第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示していれば、第一のタンパク質又はペプチドが空間的に別個の位置に対応する異種タンパク質に結合していることが示される、方法。

0012

細胞表面で第一の異種タンパク質を発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが第一の異種タンパク質に対する独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含み、該独特配列が1つ以上のユニバーサルプライマー複数可)により鎖延長することが可能である、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、細胞表面で第二の異種タンパク質を発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換された第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二のベクターが第二の異種タンパク質に対する別の独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含む、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、(i)細胞表面で候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを発現するように、そして第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は(ii)表面に候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを貼付させ、第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズと、を含むシステムが提供される。

0013

候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二の所定のタンパク質に結合するかどうかを決定する方法であって、第二の所定のタンパク質を本発明のシステムの異種タンパク質として発現させて、(i)細胞表面で候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを発現するように、そして第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は(ii)表面に候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを貼付させ、第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズ、の候補リガンドタンパク質又はペプチドと接触させること;
該第二の複数の細胞の1つ以上に、又は該複数の磁気マイクロビーズに結合された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞のいずれかを、磁気引力により分離すること;
そのような分離された細胞間又は細胞−マイクロビーズコンジュゲートからDNAを得て、存在するならばDNA中の独特な配列を、ユニバーサルプライマーを用いて増幅させること;
該独特な配列の複数のコピーシークエンシングして独特な配列の存在を確認すること;
そのように同定された独特な配列(複数可)をデータベースに対して比較して、独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を特異的異種タンパク質又はペプチドに相関させ、それによりそのように相関された任意の異種タンパク質又はペプチド結合を同定し、それにより特異的異種タンパク質又はペプチドを候補タンパク質又はペプチドに結合しているとして同定すること、
を含む方法も提供される。

0014

(i)(a)細胞表面で異種タンパク質を発現するように、かつ(b)第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが発現された異種タンパク質に対する独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含むことで、該第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞が少なくとも2つの異なるタイプの第一の異種タンパク質を発現する、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、(ii)細胞表面で第二の異種タンパク質を発現するように、そして第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換されており、単一タイプの第二の異種タンパク質を発現する、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、を含むシステム。一実施形態において、第一の複数の細胞の任意の各細胞は、細胞表面の唯一の異種タンパク質を発現する。一実施形態において、第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質の異なるタイプのいずれも、第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質と同じ配列を有さない。

0015

候補リガンドタンパク質又はペプチドが第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、第一の異種タンパク質を第二の異種タンパク質に結合させる条件下で、候補リガンドタンパク質又はペプチドを本明細書に記載されたシステムにおいて第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質として発現させ、第二のタンパク質又はペプチドを本明細書に記載されたシステムにおいて第二の異種タンパク質として発現させること、任意で洗浄して非結合の第一の異種タンパク質をいずれも除去すること、その後、第一及び第二の異種タンパク質が両者とも共存する細胞を回収すること、回収された細胞から核酸を得ること、核酸をシークエンシングして、それに含まれる独特な15〜35ヌクレオチド配列を同定することで、第二のタンパク質又はペプチドに結合した独特な15〜35ヌクレオチド配列に対応する候補リガンドタンパク質又はペプチドを同定すること、を含む、方法も提供される。

0016

第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合に及ぼす、第一のタンパク質の所定のアミノ酸残基の影響を決定する方法であって、第一のタンパク質に対して1つ以上の点突然変異により変異されたタンパク質を、本明細書に記載されたシステムの第一の浮遊培養適合細胞株の複数の中の複数の異なるタイプの異種タンパク質として発現させること、該細胞株の複数を、該第二のタンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された本明細書に記載されたシステムの第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質の形態の該第二のタンパク質と接触させること、第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存を示す細胞を回収すること、回収された細胞から核酸を得ること、核酸をシークエンシングしてそれに含まれる独特な15〜35ヌクレオチド配列を同定することで、第二のタンパク質又はペプチドに結合された第一のタンパク質を同定すること、並びに第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルを、所定の参照レベルと比較すること、を含み、
第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルが所定の参照レベルよりも多ければ、該タンパク質中で変異された1つ又は複数の残基が、第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合を増大させていることが示され、第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルが所定の参照レベルよりも少なければ、該タンパク質中で変異された1つ又は複数の残基が、第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合を阻害していることが示される、方法も提供される。

0017

(i)細胞表面で第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、及び細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、そして第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換された第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、(ii)表面に標的タンパク質、ペプチド又は抗体を貼付させた複数の磁気マイクロビーズと、を含むシステムも提供される。

0018

2つの候補リガンドタンパク質又はペプチドの1つ以上が標的タンパク質、ペプチド又は抗体に結合するかどうかを決定する方法であって、第一の異種タンパク質及び第二の異種タンパク質を標的タンパク質、ペプチド又は抗体に結合させる条件下で、第一の候補リガンドタンパク質又はペプチドを、本発明のシステムにおいて第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質として発現させ、第二の候補リガンドタンパク質又はペプチドを、本発明のシステムにおいて第二の異種タンパク質として発現させること、第一の蛍光タンパク質発現細胞複合体化された、そして/又は第二の蛍光タンパク質発現細胞と複合体化された任意のマイクロビーズを回収すること、並びに該複合体中の候補リガンドタンパク質を同定すること、を含み、第一の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、第一の候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第二の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、第二の候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第一の蛍光タンパク質発現細胞又は第二の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されなければ、それぞれ第一の候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないこと、及び第二の候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないことが示される、方法も提供される。

0019

(i)細胞表面で第一の異種標的タンパク質又はペプチドを発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、及び細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、そして第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換された1つ以上の第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、(ii)表面に、候補リガンドタンパク質若しくはペプチドのいずれかに対する抗体、又は標的タンパク質又はペプチドに対する抗体を貼付させた複数の磁気マイクロビーズと、を含むシステムが提供される。候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、候補リガンドタンパク質又はペプチドと標的タンパク質又はペプチドを結合させる条件下で、候補リガンドタンパク質又はペプチドを本発明のシステムにおいて第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質として発現させ、そして標的タンパク質又はペプチドを本発明のシステムのシステムにおいて第一の異種タンパク質として発現させること、並びに第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方と複合体化された任意のマイクロビーズを回収すること、を含み、第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されなければ、候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないことが示される、方法も提供される。
[本発明1001]
(i)(a)第一の所定の異種タンパク質、及び(b)第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された第一の複数の細胞と、
(ii)(a)第二の所定の異種タンパク質、及び(b)第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された少なくとも第二の複数の細胞と
を含む細胞マイクロアレイであって、
第一及び第二の複数の細胞が、該マイクロアレイの固体表面に接着されており、第一と第二の複数の細胞が、該固体表面の空間的に別個の位置に存在する、前記細胞マイクロアレイ。
[本発明1002]
(i)異種タンパク質の1つのための候補タンパク質若しくはペプチドリガンドと、(ii)異種タンパク質の1つに結合した第三の蛍光タンパク質とを含む融合タンパク質をさらに含むか、又は異種タンパク質の1つのためのペプチド若しくはタンパク質リガンドを含む化合物をさらに含む、前記細胞マイクロアレイであって、
該化合物が、非ペプチド結合により結合された第三の蛍光タンパク質を有し、細胞マイクロアレイの異種タンパク質の1つに結合されている、本発明1001の細胞マイクロアレイ。
[本発明1003]
第三の複数の細胞を対照としてさらに含む、前記細胞マイクロアレイであって、第三の複数の細胞が、第一の蛍光タンパク質を発現するように任意で形質転換されているが、第一又は第二の所定の異種タンパク質では形質転換されていない、本発明1001又は1002の細胞マイクロアレイ。
[本発明1004]
前記複数の細胞がそれぞれ、複数の哺乳動物細胞である、本発明1001、1002又は1003の細胞マイクロアレイ。
[本発明1005]
哺乳動物細胞が、単離されたヒト細胞である、本発明1001、1002、1003又は1004の細胞マイクロアレイ。
[本発明1006]
前記細胞が、ヒト胎児HEK)細胞株の細胞である、本発明1001、1002、1003又は1004の細胞マイクロアレイ。
[本発明1007]
前記細胞が、HEK293細胞株の細胞である、本発明1001、1002、1003、1004又は1006の細胞マイクロアレイ。
[本発明1008]
前記マイクロアレイが、少なくとも10の異なる複数の細胞を含み、複数の細胞がそれぞれ、所定の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換されており、該異種タンパク質が、マイクロアレイ内の他の複数の形質転換された細胞それぞれにより発現される異種タンパク質とは異なる、本発明1001〜1007のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1009]
前記マイクロアレイが、少なくとも100の異なる複数の細胞を含み、複数の細胞がそれぞれ、所定の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換されており、該異種タンパク質が、マイクロアレイ内の他の複数の形質転換された細胞それぞれにより発現される異種タンパク質とは異なる、本発明1001〜1008のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1010]
第一のタンパク質及び/又は蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質又は黄色蛍光タンパク質である、本発明1001〜1009のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1011]
第三の蛍光タンパク質が、赤色蛍光タンパク質である、本発明1002〜1010のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1012]
前記複数の細胞がそれぞれ、第一の所定の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換されているに過ぎず、任意の他の異種タンパク質を発現するようには形質転換されていない、本発明1001〜1011のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1013]
第一の所定の異種タンパク質が、マルチサブユニット異種タンパク質のあるサブユニットであり、前記複数の細胞が、マルチサブユニット異種タンパク質の1つ以上の残りのメンバーも発現するように形質転換されている、本発明1001〜1011のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1014]
第一の所定の異種タンパク質が、発現される際に、C末端を介して第一の蛍光タンパク質に付着される、本発明1001〜1013のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1015]
第一の所定の異種タンパク質が、発現される際に、膜貫通アンカーペプチドに付着される、本発明1001〜1013のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1016]
第一の異種タンパク質及び蛍光タンパク質をコードする第一の複数の発現構築物を、マイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びに第二の異種タンパク質及び蛍光タンパク質をコードする少なくとも第二の複数の発現構築物を、貼付された第一の複数の発現構築物とは異なる空間的に別個の位置の固体表面で、マイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びにトランスフェクション剤の存在を含む条件下で、発現構築物を複数の細胞と接触させ、それにより各発現構築物によるそれぞれ空間的に別個の位置にある細胞の少なくとも一部のトランスフェクションを可能にすること
により、前記細胞マイクロアレイが、組み立てられる、本発明1001〜1015のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1017]
発現構築物が、pEGFP−N1発現構築物を含む、本発明1016の細胞マイクロアレイ。
[本発明1018]
発現構築物が、CMVプロモータを含む、本発明1016又は1017の細胞マイクロアレイ。
[本発明1019]
前記細胞が、昆虫細胞である、本発明1001、1002、1003、又は1008〜1018のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1020]
前記細胞が、ショウジョウバエS2細胞である、本発明1019の細胞マイクロアレイ。
[本発明1021]
第一及び/又は第二の異種タンパク質が、イムノグロブリンスーパーファミリータンパク質、TNFレセプタータンパク質、サイトカインケモカイン1型膜貫通レセプタータンパク質2型膜貫通レセプタータンパク質、イオンチャネルタンパク質、又は膜輸送タンパク質である、本発明1001〜1020のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1022]
第一及び/又は第二の異種タンパク質が、Toll様レセプター、TNFレセプター、GPCR増殖因子レセプターネクチンインターロイキン、又はインターロイキンレセプターである、本発明1001〜1020のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1023]
第一及び/又は第二の異種タンパク質が、哺乳動物のものである、本発明1001〜1022のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1024]
第一及び/又は第二の異種タンパク質が、細胞膜局在化した位置に発現される、本発明1001〜1022のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1025]
第一及び/又は第二の所定の異種タンパク質が、分泌タンパク質、膜貫通タンパク質、又は細胞表面タンパク質である、本発明1001〜1024のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1026]
前記細胞マイクロアレイが、異種タンパク質を発現するように形質転換された、500以上の異なる複数の細胞を含み、複数の細胞がそれぞれ、他の複数の形質転換細胞により発現された異種タンパク質と互いに異なる異種タンパク質を発現する、本発明1001〜1025のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1027]
異種タンパク質が、分泌タンパク質であり、膜貫通へリックスに融合されて発現される、本発明1001〜1026のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1028]
第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質が、同じタイプであり、第三の蛍光タンパク質が、異なるタイプのものである、本発明1001〜1027のいずれかの細胞マイクロアレイ。
[本発明1029]
第一の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質をコードする第一の複数の発現構築物を、マイクロアレイの固体表面に貼付する段階、並びに
第二の異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質をコードする少なくとも第二の複数の発現構築物を、貼付された第一の複数の発現構築物とは異なる空間的に別個の位置でマイクロアレイの固体表面に貼付する段階、並びに
細胞を固体表面に接着させるように、かつそれぞれ空間的に別個の位置にある細胞の少なくとも一部に各発現構築物によるトランスフェクションを起こさせるために、トランスフェクション剤の存在を含む条件下で、発現構築物を複数の細胞と接触させる段階
を含む、本発明1001〜1028のいずれかの細胞マイクロアレイを作製するための方法。
[本発明1030]
ライゲーション非依存性クローニング(LIC)を用いて、発現構築物を調製する、本発明1029の方法。
[本発明1031]
候補タンパク質又はペプチドが第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、
第二のタンパク質を本発明1001〜1028のいずれかの細胞マイクロアレイの異種タンパク質として発現させる段階、及び細胞マイクロアレイを第三の蛍光タンパク質又はペプチドに貼付された候補タンパク質又はペプチドと接触させる段階、候補タンパク質又はペプチドと接触させた細胞マイクロアレイを洗浄して、非結合候補タンパク質又はペプチドを除去する段階、及び洗浄後に細胞マイクロアレイに結合された任意の候補タンパク質又はペプチドが存在するかどうかを決定する段階を含み、
第一の異種タンパク質で形質転換された細胞に対応する第一の空間的位置に洗浄後の細胞マイクロアレイに結合された候補タンパク質又はペプチドが存在すれば、候補タンパク質又はペプチドが第一の異種タンパク質に結合していることが示され、洗浄後の第一の空間的位置に細胞マイクロアレイに結合された候補タンパク質又はペプチドが存在しなければ、候補タンパク質又はペプチドが異種タンパク質に結合していないことが示される、前記方法。
[本発明1032]
洗浄後に細胞マイクロアレイに結合された任意の候補タンパク質又はペプチドが存在するかどうかを決定する段階が、第三の蛍光タンパク質の蛍光を測定すること、及び細胞マイクロアレイでの位置を決定することにより実行され、
第三の蛍光タンパク質と、第一又は第二の蛍光タンパク質が空間的に別個の位置に共存することにより、第一のタンパク質又はペプチドが、空間的に別個の位置に対応する異種タンパク質に結合されていることが示される、本発明1031の方法。
[本発明1033]
(i)マイクロアレイの固体表面、及び、細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第一のC−末端細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、浮遊培養適合細胞株と、
(ii)少なくとも(a)所定の異種タンパク質を細胞表面で発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、第二の複数の細胞、又は(b)異種タンパク質を表面に貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数のマイクロビーズと
を含むシステムであって、(a)又は(b)が、前記マイクロアレイの固体表面に貼付されている、前記システム。
[本発明1034]
(c)異なる所定の異種タンパク質を細胞表面で発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の細胞、又は
(d)異なる所定の異種タンパク質を表面に貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、1つ以上のさらなる複数のマイクロビーズ
をさらに含み、(c)又は(d)が、複数の(a)及び/又は(b)とは空間的に別個の位置でマイクロアレイ固体表面に貼付されている、本発明1033のシステム。
[本発明1035]
異種タンパク質が、プロテインA分子を介してマイクロビーズに貼付されている、本発明1033又は1034のシステム。
[本発明1036]
細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように形質転換された浮遊培養適合細胞株が、候補リガンドタンパク質又はペプチドをコードする核酸構築物一過性トランスフェクトされている、本発明1033、1034又は1035のシステム。
[本発明1037]
異種タンパク質が、マイクロビーズに付着された抗体により結合させることによりマイクロビーズに貼付されている、本発明1033〜1036のいずれかのシステム。
[本発明1038]
第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質が、異なる色である、本発明1033〜1037のいずれかのシステム。
[本発明1039]
一方の蛍光タンパク質が、緑色であり、他方の蛍光タンパク質が、赤色である、本発明1038のシステム。
[本発明1040]
前記複数の細胞が、複数の哺乳動物細胞である、本発明1033〜1039のいずれかのシステム。
[本発明1041]
前記細胞が、単離されたヒト細胞である、本発明1033〜1040のいずれかのシステム。
[本発明1042]
前記細胞が、ヒト胎児腎(HEK)細胞株の細胞である、本発明1033〜1041のいずれかのシステム。
[本発明1043]
前記細胞が、HEK293細胞株の細胞である、本発明1033〜1042のいずれかのシステム。
[本発明1044]
所定の異種タンパク質が、マルチサブユニット異種タンパク質のあるサブユニットであり、前記複数の細胞が、マルチサブユニット異種タンパク質の1つ以上の残りのメンバーも発現するように形質転換されている、本発明1033〜1043のいずれかのシステム。
[本発明1045]
所定の異種タンパク質が、分泌タンパク質、膜タンパク質、又は細胞表面タンパク質である、本発明1033〜1044のいずれかのシステム。
[本発明1046]
所定の異種タンパク質が、発現される際に、C末端を介して蛍光タンパク質に付着される、本発明1033〜1045のいずれかのシステム。
[本発明1047]
所定の異種タンパク質が、分泌タンパク質であり、発現される際に、膜貫通アンカーペプチド又はタンパク質に付着される、本発明1033〜1046のいずれかのシステム。
[本発明1048]
発現構築物が、pEGFP−N1発現構築物及び/又はCMVプロモータを含む、本発明1033〜1047のいずれかのシステム。
[本発明1049]
異種タンパク質が、イムノグロブリンスーパーファミリータンパク質、TNFレセプタータンパク質、サイトカイン、ケモカイン、1型膜貫通レセプタータンパク質、2型膜貫通レセプタータンパク質、イオンチャネルタンパク質、又は膜輸送タンパク質である、本発明1033〜1048のいずれかのシステム。
[本発明1050]
異種タンパク質が、Toll様レセプター、TNFレセプター、GPCR、増殖因子レセプター、ネクチン、インターロイキン、又はインターロイキンレセプターである、本発明1033〜1049のいずれかのシステム。
[本発明1051]
異種タンパク質が、哺乳動物のものである、本発明1033〜1050のいずれかのシステム。
[本発明1052]
異種タンパク質が、細胞膜に局在化した位置で発現される、本発明1033〜1051のいずれかのシステム。
[本発明1053]
候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、
本発明1033〜1052のいずれかのシステムの浮遊培養適合細胞株の複数において候補リガンドタンパク質又はペプチド及び第一の蛍光タンパク質を発現させる段階、並びに
前記細胞株の複数を、(a)異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された第二の複数の細胞、又は(b)異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質を表面に貼付させた複数のマイクロビーズ、と接触させる段階、並びに
洗浄して非結合候補リガンドタンパク質又はペプチドを除去する段階、並びに
FACS分析又は磁気分離により第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示す細胞を同定する段階
を含み、
細胞が空間的に別個の位置の第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示していれば、第一のタンパク質又はペプチドが空間的に別個の位置に対応する異種タンパク質に結合していることが示される、前記方法。
[本発明1054]
第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存が、FACS分析により決定される、本発明1053の方法。
[本発明1055]
細胞表面で第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するようにあるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドに対する独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含み、独特な配列が1つ以上のユニバーサルプライマーにより鎖延長することが可能である、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、
細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように第二のベクターで形質転換された、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二のベクターが第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドに対する別の独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含む、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、
(i)細胞表面でレセプタータンパク質若しくはペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は(ii)表面にレセプタータンパク質を貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズと
を含むシステム。
[本発明1056]
細胞表面で第一の異種タンパク質を発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するようにあるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが第一の異種タンパク質に対する独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含み、独特な配列が1つ以上のユニバーサルプライマーにより鎖延長することが可能である、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、
細胞表面で第二の異種タンパク質を発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように第二のベクターで形質転換された、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二のベクターが第二の異種タンパク質に対する別の独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含む、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、
(i)細胞表面で候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は(ii)表面に候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズと
を含むシステム。
[本発明1057]
ユニバーサルプライマーが、T7フォワード及びリバースユニバーサルプライマーを含む、本発明1055又は1056のシステム。
[本発明1058]
ペプチド細胞表面エピトープが、FLAGエピトープ(DYKDDDDK)である、本発明1055、1056又は1057のシステム。
[本発明1059]
磁気分子物質を含む抗FLAGエピトープ抗体をさらに含み、該抗体がFLAGエピトープに結合されている、本発明1058のシステム。
[本発明1060]
磁気分子物質が、超常磁性含浸ビーズである、本発明1059のシステム。
[本発明1061]
独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列が、28ヌクレオチド長である、本発明1055〜1060のいずれかのシステム。
[本発明1062]
表面に候補リガンドタンパク質又はペプチドを貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズを含む、本発明1055〜1061のいずれかのシステム。
[本発明1063]
細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上の更なる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞を含み、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、本発明1055〜1061のいずれかのシステム。
[本発明1064]
表面に候補リガンドタンパク質又はペプチドを貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズを、少なくとも1つのウェルが含み、表面に異なる候補リガンドタンパク質又はペプチドを貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、異なる複数の磁気マイクロビーズを、第二のウェルが含む、マルチウェルプレート
を含む、本発明1056〜1063のいずれかのシステム。
[本発明1065]
細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、更なる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞を、少なくとも1つのウェルが含み、更なる複数の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含み、細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、異なる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞を、第二のウェルが含み、異なる複数の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、マルチウェルプレート
を含む、本発明1055〜1063のいずれかのシステム。
[本発明1061]
候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二の所定のタンパク質に結合するかどうかを決定する方法であって、
第二の所定のタンパク質を本発明1055〜1060のいずれかのシステムの異種タンパク質として発現させる段階、及び
(i)細胞表面で候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は
(ii)表面に候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズ
の候補リガンドタンパク質又はペプチドと接触させる段階;
第二の複数の細胞の1つ以上に又は複数の磁気マイクロビーズに結合された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞のいずれかを、磁気引力により分離する段階;
そのような分離された細胞間又は細胞−マイクロビーズのコンジュゲートからDNAを得て、存在するならばDNA中の独特な配列を、ユニバーサルプライマーを用いて増幅させる段階;
独特な配列の複数のコピーをシークエンシングして独特な配列の存在を確認する段階;
そのように同定された独特な配列をデータベースに対して比較して、独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を特異的異種タンパク質又はペプチドに相関させ、それによりそのように相関された任意の異種タンパク質又はペプチド結合を同定し、それにより特異的異種タンパク質又はペプチドを、候補タンパク質又はペプチドに結合しているとして同定する段階
を含む、前記方法。
[本発明1062]
候補リガンドタンパク質又はペプチドが、プロテインA分子を介してマイクロビーズに貼付されている、本発明1061の方法。
[本発明1063]
候補リガンドタンパク質又はペプチドが、マイクロビーズに付着された抗体により結合させることによりマイクロビーズに貼付されている、本発明1061又は1062の方法。
[本発明1064]
第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質が、異なる色である、本発明1061〜1063のいずれかの方法。
[本発明1065]
一方の蛍光タンパク質が、緑色であり、他方の蛍光タンパク質が、赤色である、本発明1061〜1064のいずれかの方法。
[本発明1066]
前記複数の細胞が、複数の哺乳動物細胞である、本発明1061〜1065のいずれかの方法。
[本発明1067]
哺乳動物細胞が、単離されたヒト細胞である、本発明1061〜1066のいずれかの方法。
[本発明1068]
哺乳動物細胞が、ヒト胎児腎(HEK)細胞株の細胞である、本発明1061〜1067のいずれかの方法。
[本発明1069]
哺乳動物細胞が、HEK293細胞株の細胞である、本発明1068の方法。
[本発明1070]
所定の異種タンパク質が、マルチサブユニット異種タンパク質のあるサブユニットであり、前記複数の細胞が、マルチサブユニット異種タンパク質の1つ以上の残りのメンバーも発現するように形質転換されている、本発明1061〜1069のいずれかの方法。
[本発明1071]
所定の異種タンパク質が、発現される際に、C末端を介して蛍光タンパク質に付着される、本発明1061〜1070のいずれかの方法。
[本発明1072]
所定の異種分泌タンパク質が、発現される際に、膜貫通アンカーペプチドに付着される、本発明1061〜1071のいずれかの方法。
[本発明1073]
異種タンパク質が、イムノグロブリンスーパーファミリータンパク質、TNFレセプタータンパク質、サイトカイン、ケモカイン、1型膜貫通レセプタータンパク質、2型膜貫通レセプタータンパク質、イオンチャネルタンパク質、又は膜輸送タンパク質である、本発明1061〜1072のいずれかの方法。
[本発明1074]
異種タンパク質が、Toll様レセプター、TNFレセプター、GPCR、増殖因子レセプター、ネクチン、インターロイキン、又はインターロイキンレセプターである、本発明1061〜1073のいずれかの方法。
[本発明1075]
異種タンパク質が、哺乳動物のものである、本発明1061〜1074のいずれかの方法。
[本発明1076]
異種タンパク質が、細胞膜に局在化した位置で発現される、本発明1061〜1075のいずれかの方法。
[本発明1077]
(i)マイクロアレイの固体表面と、
(ii)(a)複数の異なるタンパク質の各タンパク質タイプが、1〜25アミノ酸残基の点突然変異により複数のタンパク質の他のタイプそれぞれと異なる、複数の異なる第一の異種タンパク質のうちの単一タイプを、複数の細胞の細胞表面で、および
(b)第一の細胞質発現蛍光タンパク質を
発現するように形質転換された浮遊培養適合細胞株の複数の細胞と、
(iii)少なくとも(1)所定の第二の異種タンパク質を細胞表面で発現するように、かつ第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、第二の複数の細胞、又は(2)浮遊培養適合細胞株に関して異種の第二のタンパク質を表面に貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数のマイクロビーズと
を含み、(1)又は(2)が、前記マイクロアレイの固体表面に貼付されている、システム。
[本発明1078]
前記複数の第一の異種タンパク質の異なるタイプが、野生型タンパク質の各突然変異体である、本発明1077のシステム。
[本発明1079]
第二の異種タンパク質が、野生型タンパク質である、本発明1078のシステム。
[本発明1080]
複数の異なるタンパク質の各タンパク質タイプが、1、2、3、4又は5アミノ酸残基の点突然変異により複数のタンパク質の互いのタイプと異なっている、本発明1077、1078又は1079のシステム。
[本発明1081]
複数の異なるタンパク質の各タンパク質タイプが、1アミノ酸残基の点突然変異により複数のタンパク質の互いのタイプと異なっている、本発明1077、1078又は1079のシステム。
[本発明1082]
第一又は第二の蛍光タンパク質が、緑色である、本発明1077〜1081のいずれかのシステム。
[本発明1083]
他の蛍光タンパク質が、赤色である、本発明1077〜1082のいずれかのシステム。
[本発明1084]
野生型タンパク質中の残基を、野生型タンパク質と第二のタンパク質との物理的相互作用に影響を及ぼすものであると決定する方法であって、
野生型タンパク質に関して変異されたタンパク質を、本発明1077〜1083のいずれかのシステムの浮遊培養適合細胞株の複数のうちの異なる複数として発現させる段階、並びに
前記複数を、第二のタンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された本発明1077〜1083のいずれかのシステムの第二の複数の細胞の形態の第二のタンパク質と、又は(b)表面に第二のタンパク質及び第二の蛍光タンパク質を貼付させた複数のマイクロビーズと、接触させる段階、並びに
洗浄して非結合細胞を除去する段階、並びに
FACS分析により第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示す細胞を同定する段階
を含み、空間的に別個の位置において細胞が第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示していれば、空間的に別個の位置に対応する共存する浮遊培養適合細胞株の細胞上のタンパク質中で変異された1つ又は複数の残基が、野生型タンパク質と第二のタンパク質との物理的相互作用に必要でないことが示される、前記方法。
[本発明1085]
野生型タンパク質及び第二のタンパク質が、互いに物理的に相互作用することが公知である、本発明1084の方法。
[本発明1086]
第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存が、FACS分析により決定される、本発明1085の方法。
[本発明1087]
(i)(a)細胞表面で異種タンパク質を発現するように、かつ(b)第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが発現された異種タンパク質に対する独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含むことで、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞が少なくとも2つの異なるタイプの第一の異種タンパク質を発現する、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、
(ii)細胞表面で第二の異種タンパク質を発現するように、かつ第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換されており、単一タイプの第二の異種タンパク質を発現する、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と
を含むシステム。
[本発明1088]
第一の複数の細胞の任意の個々の細胞が、細胞表面の唯一の異種タンパク質を発現する、本発明1087のシステム。
[本発明1089]
第二の異種タンパク質が、膜レセプターである、本発明1087又は1088のシステム。
[本発明1090]
第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞中で発現された異種タンパク質のそれぞれが、分泌されたペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質である、本発明1087、1088又は1089のシステム。
[本発明1091]
複数の第一の異種タンパク質の異なるタイプが、所定の野生型タンパク質の各突然変異体である、本発明1087、1088、1089又は1090のシステム。
[本発明1092]
第二の異種タンパク質が、野生型タンパク質である、本発明1087〜1091のいずれかのシステム。
[本発明1093]
第一の複数の異なるタンパク質の異種タンパク質の各タイプが、1、2、3、4又は5アミノ酸残基の点突然変異により複数の異種タンパク質の互いのタイプと異なっている、本発明1087〜1092のいずれかのシステム。
[本発明1094]
複数の異なるタンパク質の各タンパク質タイプが、1アミノ酸残基の点突然変異により複数の異種タンパク質の互いのタイプと異なっている、本発明1087〜1093のいずれかのシステム。
[本発明1095]
独特な配列が、1つ以上のユニバーサルプライマーにより鎖延長することが可能である、本発明1087〜1094のいずれかのシステム。
[本発明1096]
第一又は第二の蛍光タンパク質が、緑色である、本発明1087〜1095のいずれかのシステム。
[本発明1097]
他の蛍光タンパク質が、赤色である、本発明1096のシステム。
[本発明1098]
候補リガンドタンパク質又はペプチドが第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、
第一の異種タンパク質を第二の異種タンパク質に結合させる条件下で、候補リガンドタンパク質又はペプチドを本発明1087〜1097のいずれかのシステムにおいて第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質として発現させ、かつ第二のタンパク質又はペプチドを本発明1087〜1097のいずれかのシステムにおいて第二の異種タンパク質として発現させる段階、並びに
任意で洗浄して非結合の第一の異種タンパク質をいずれも除去する段階、
その後、第一及び第二の異種タンパク質が両方とも共存する細胞を回収する段階、
回収された細胞から核酸を得る段階、及び核酸をシークエンシングして、それに含まれる独特な15〜35ヌクレオチド配列を同定することで、第二のタンパク質又はペプチドに結合した独特な15〜35ヌクレオチドに対応する候補リガンドタンパク質又はペプチドを同定する段階
を含む、前記方法。
[本発明1099]
第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合に及ぼす、第一のタンパク質の所定のアミノ酸残基の影響を決定する方法であって、
第一のタンパク質に対して1つ以上の点突然変異により変異されたタンパク質を、本発明1087〜1097のシステムの第一の浮遊培養適合細胞株の複数の中の複数の異なるタイプの異種タンパク質として発現させる段階、並びに
該複数を、第二のタンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された本発明1087〜1097のシステムの第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質の形態の第二のタンパク質と接触させる段階、並びに
第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存を示す細胞を回収する段階、
回収された細胞から核酸を得る段階、及び核酸をシークエンシングしてそれに含まれる独特な15〜35ヌクレオチド配列を同定することで、第二のタンパク質又はペプチドに結合された第一のタンパク質を同定する段階、並びに
第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルを、所定の参照レベルと比較する段階
を含み、
第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルが所定の参照レベルよりも多ければ、タンパク質中で変異された1つ又は複数の残基が、第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合を増大させていることが示され、第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルが所定の参照レベルよりも少なければ、タンパク質中で変異された1つ又は複数の残基が、第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合を阻害していることが示される、前記方法。
[本発明1100]
所定のレベルが、対照である、本発明1099の方法。
[本発明1101]
所定のレベルが、第二のタンパク質に結合する未変異の第一のタンパク質のレベルをアッセイすることにより得られる、本発明1099の方法。
[本発明1102]
第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存を示す細胞が、FACS分析により回収される、本発明1098〜1101のいずれかの方法。
[本発明1103]
(i)細胞表面で第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するようにあるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、及び細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように第二のベクターで形質転換された、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と
(ii)表面に標的タンパク質、ペプチド、又は抗体を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズと
を含む、システム。
[本発明1104]
2つの候補リガンドタンパク質又はペプチドの1つ以上が標的タンパク質、ペプチド、又は抗体に結合するかどうかを決定する方法であって、
第一の異種タンパク質及び第二の異種タンパク質を、標的タンパク質、ペプチド、又は抗体に結合させる条件下で、第一の候補リガンドタンパク質又はペプチドを、本発明1103のシステムにおいて第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質として発現させ、かつ第二の候補リガンドタンパク質又はペプチドを、本発明1103のシステムにおいて第二の異種タンパク質として発現させる段階、並びに
第一の蛍光タンパク質発現細胞と複合体化されかつ/又は第二の蛍光タンパク質発現細胞と複合体化された任意のマイクロビーズを回収する段階、並びに
複合体中の候補リガンドタンパク質を同定する段階
を含み、
第一の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、第一の候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第二の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、第二の候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第一の蛍光タンパク質発現細胞又は第二の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されなければ、それぞれ第一の候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないこと、及び第二の候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないことが示される、前記方法。
[本発明1105]
(i)細胞表面で第一の異種標的タンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するようにあるベクターで形質転換された、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、及び細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、かつ第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように第二のベクターで形質転換された、1つ以上の第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、
(ii)候補リガンドタンパク質若しくはペプチドのいずれかに対する抗体又は標的タンパク質若しくはペプチドに対する抗体を表面に貼付させた、複数の磁気マイクロビーズと
を含むシステム。
[本発明1106]
候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、
候補リガンドタンパク質又はペプチドと標的タンパク質又はペプチドを結合させる条件下で、候補リガンドタンパク質又はペプチドを本発明1105のシステムにおいて第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質として発現させ、かつ標的タンパク質又はペプチドを本発明1105のシステムにおいて第一の異種タンパク質として発現させる段階、並びに
第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方と複合体化された任意のマイクロビーズを回収する段階
を含み、
第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されなければ、候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないことが示される、前記方法。

図面の簡単な説明

0020

T細胞と抗原提示細胞の間に形成された免疫シナプス結晶学的図。免疫シナプスの中枢領域のTCR:MHC複合体及び共刺激レセプター:リガンド複合体複合体モデル。TCR:MHC(PDBコード 1G6R)、PD−1:PD−L1(3BIK)、PD−1:PD−L2(3BP5)及びCTLA−4:B7−1(1I8L)の複合体は、既存の結晶構造の代表であり、一価CD28:B7−1複合体のモデルは、CD28モノマー(1YJD)及びCTLA−4:B7−1構造に基づいている。該複合体のおおよその寸法(即ち、長さ)と、構成されたIgドメインを膜に結合させる残基の数が示されている。免疫シナプス内の細胞膜の間のおよそ140A°の距離も、留意されたい。レセプター:リガンド・エクトドメインの間の相互作用により課された局在化及び組織化を採用する細胞質シグナル伝達及びスカフォールティングタンパク質を、略図として(即ち、幾何記号で)示している。この図により、細胞表面レセプター及びリガンドに関する機能の重要な決定因子である基本的特色(例えば、オリゴマー状態、結合価、リガンド特異性)及び全体的な組織原理を定義する上で、レセプター:リガンド構造の重要性が強調される[45]。
レセプター:リガンド構造の活用。左:ネズミPD−1:PD−L2複合体の構造。右:親和性が増大し、特異性が変化した、PD−1レセプターをもたらす点突然変異の位置。
細胞マイクロアレイプラットフォーム。左:細胞マイクロアレイを作製に関する略図。右:例として、GFP発現構築物(即ち、プラスミド)を、発現アレイを作製するためにガラス表面に「固定した」。HEK293細胞をプリントされたcDNAの上に播種し、続いてトランスフェクトされるようになり、生存する細胞アレイが得られた。この2000スポットグリッドは、カスタマイズされたマイクロアレイプリンターを利用して構築された。各スポットは、細胞50〜80個のクラスターである。
図4A〜4Cは、細胞マイクロアレイプラットフォームを用いた、T細胞リガンドとレセプターの結合の検出を示す。(A)細胞質GFP又は形質膜に埋入されたPD−L1−GFPのいずれかを発現するHEK細胞の交互の列を含む高密度細胞マイクロアレイ(略図)。(B)アレクサ(Alexa)594二次抗体(赤色)と予め混合された精製PD−1IgGによりアレイを処理して、アキソン(Axon)4000Bマイクロアレイスキャナーで画像化した。PD−L1エクトドメインを提示する細胞のみが、染色を示し;細胞質GFPを発現する細胞は、染色を示さず、陰性対照として働く。(C)マージングされた画像から、標識されたPD−1−Ig融合タンパク質とPD−L1 GFPの共存が示されるが、細胞質GFPの構築物は示されない。これらの結果から、マイクロアレイの特異性が実証される。PD−L1と対照(GFPのみ)とのGFP蛍光強度の差が、発現方法により明示される。
Igスーパーファミリーの異なるメンバーの間の特異的結合を示す3つの細胞マイクロアレイ。スライドには、PD−1、B7−1及びCD200RのGFP融合構築物、又はGFPのみをコードしたプラスミドDNAの交互の列がプリントされた。3つのプリントされたスライドを、10cm2ペトリ皿に入れ、トランスフェクション試薬で処理し、その後、HEK細胞を播種した。トランスフェクションの3日後に、スライドを洗浄し、続いてPD−L2(スライド1)、CTLA−4(スライド2)又はCD200(スライド3)のIg融合物で処理し、検出のためにIg融合物をCy7二次抗体とプレインキュベートした。プリントされた列は全て、トランスフェクトに成功しており、GFP陽性であった(データは示さない)。画像は、Cy7チャネルのみからの蛍光シグナルを示している。各アレイでは、Ig融合物の顕著な結合が、コグネイトレセプター又はリガンドが存在する列のみで検出された。例えば、レセプターPD−1のリガンドであるPD−L2のみが、PD−1 GFPがプリントされた列で結合している。各スライドは、明瞭にするために疑似色を付されており、オーバーレイにより結合の特異的パターンが明らかである。
Igスーパーファミリーの哺乳動物発現ライブラリの作製。略図(上)で、I型分泌タンパク質の迅速かつ効率的クローニングのために特異的に操作されたライゲーション非依存性ベクターを示している。Igスーパーファミリーの283のメンバーをクローニングして、HEK293細胞の一過性トランスフェクションによる発現をテストした。蛍光顕微鏡検査を利用すると、クローンのうち240(約85%の成功)がバックグランドを超えて発現し、正しい膜局在性を示した。240の発現ライブラリメンバーのうち24の代表的組み合わせについて、GFP蛍光画像を示している。各発現構築物の予備検証が、さらなる「救済努力」を必要とするそれらのタンパク質を強調しており、それは完全に特徴づけられたロバストなプラットフォームのために不可欠である。
細胞マイクロアレイ形式でのコトランスフェクション。左)細胞質GFPでトランスフェクトされたHEK293細胞。中)細胞質mCherryでトランスフェクトされたHEK293細胞。右)細胞質GFP及びmCherryでコトランスフェクトされたHEK293細胞。緑色及び赤色蛍光体によるコトランスフェクションは、黄色蛍光をもたらす。このことから、細胞マイクロアレイ形式での機能的な多成分レセプター(multicomponent receptors)を実現する上で必要となる複数のポリペプチドを発現させるための原理証明がもたらされる。
図8A〜8Cは、高結合活性のマイクロビーズによるリセプタ:リガンド発見戦略を示す。A)浮遊培養適合HEK293細胞を、細胞質mCHERRYに結合された、選択された細胞表面で一過性にトランスフェクトする(例えば、PD−L1;赤色の細胞)。B)50nmプロテインAでコーティングされたGFPタグのあるマイクロビーズを、PD−1 Ig又はB7−1 Ig融合タンパク質のいずれかで修飾する(緑色のビーズ)。C)赤色の細胞及び緑色のマイクロビーズをインキュベートすると、赤色:緑色コンジュゲートが得られる。D)フローサイトメトリーにより、レセプター:リガンド相互作用の検出及び定量が可能になる。Y軸に沿って、赤色の非結合トランスフェクト細胞;X軸に沿って非結合の緑色マイクロビーズ;対角線に沿ってレセプター:リガンド相互作用を報告する赤色:緑色の細胞:マイクロビーズコンジュゲートとなる。
PD−L1:PD−1及びPD−L1:B7−1相互作用のマイクロビーズを基にした実証。プロテインAマイクロビーズを、1:4比のFITC−IgG対Ig−融合物(即ち、PD−1又はB7−1)中でプレミックスされたIgGで飽和させ、ペレット化させ、続いてPBS再懸濁させた。コンジュゲートされたマイクロビーズを、mCherry単独又はPD−L1 mCherry融合物のいずれかを発現するHEK細胞と共にインキュベートして、結合の度合いをフローサイトメトリーにより決定した。これらのデータから、PD−1コンジュゲート、及びB7−1コンジュゲートされたマイクロビーズが、PD−L1のみを発現するHEK細胞に結合することが実証され、リガンドの結合活性上昇で実験的に測定され得る潜在的レセプター−リガンド相互作用のダイナミックレンジを改善するという戦略が裏づけられる。
フローサイトメトリーによる特異的に操作された細胞間相互作用の検出。HEK293細胞を、GFP、mCherry、PD−LI mCherry又はPD−1 GFPでトランスフェクトした。細胞を2%BSAを含む氷冷DMEMに再懸濁させて、細胞株を1:1化学量論比一緒に混合した。個々の集団及び混合されたバイナリーペアを、4℃で2時間インキュベートした。赤色及び緑色蛍光イベント(event)(即ち、コンジュゲート)の数の有意な増加(約60倍)が、リガンド及びレセプターが両者とも存在する場合のみで観察される。
フローサイトメトリーによるCD200:CD200−レセプター相互作用の検出。HEK293細胞を、GFP、mCherry、CD200 mCherry、又はCD200−レセプターGFPでトランスフェクトした。細胞を図10の通り処理して、分析した。赤色:緑色蛍光イベント(即ち、コンジュゲート)の数の有意な増加が、リガンド及びレセプターの両者を個別に発現する細胞が存在する場合のみで観察される。
高度に選択性の機能を有するPD−L1突然変異体を同定するためのマイクロビーズ及び細胞間FACSアッセイの利用。A)100を超える組み合わせのPD−L1 mCherry突然変異体構築物を、HEK293細胞に一過性にトランスフェクトした。これらの細胞株を、その後、PD−1のIg融合物を予め飽和させたマイクロビーズで(橙色のマイクロビーズデータ)、又は別の組の実験ではPD−1 GFPを一過性に発現する細胞で(青色の細胞間データ)チャレンジした。各実験において、FACS分析により決定された結合率%を、野生型結合に対して標準化した。データから、マイクロビーズ又は細胞間法のいずれかを利用して観察された平均結合率の直接比較が示される。明瞭にするために、データのサブセットのみを示している。PD−L1突然変異体を、PD−L1の他の公知リガンドであるB7−1によりチャレンジする類似の実験組も実施した(データは示さない)。B)PD−L1突然変異体のスクリーニングにより、PD−1、B7−1又はそれらの両方のいずれかへの結合欠損を示す複数の突然変異体を生成した。これらの結果をさらに検証するために、PD−L1突然変異体のうちの7つをIg融合物として発現させた。精製されたPD−L1突然変異体を、検出のためにアレクサ594二次Ab(赤色)と共にプレインキュベートして、PD−1 GFP又はB7−1 GFP(緑色)のいずれかを発現するHEK293細胞に添加した。FACSデータにより、GFPの蛍光(X軸)とアレクサ594の蛍光(Y軸)の対比が示される。精製されたタンパク質を利用して観察された結合の程度は、スクリーニング法の両方で観察された結合の程度を反映しているが、データは、細胞間結合法により得られた結果とより密接に相関するように見える。
図13A〜13Eは、細胞表面のタンパク質間相互の並行同定のための戦略を示す。A)バーコード化されたライブラリを、バーコード化ライブラリベクター(BC−Lベクター。ユニバーサルT7フォワード及びリバースプライマー部位により挟まれたGFPレポーター及び28ヌクレオチドの独特なコアバーコード(unique core barcode)を作製する)へのLICクローニングにより作製する。ライブラリをプールして、一緒に浮遊培養適合HEK293細胞にトランスフェクトする。B)別の反応において、単一のクエリーレセプターを、mCherry及び細胞表面提示FLAGエピトープも標識されたHEK293細胞にトランスフェクトして、磁気捕捉/分離を可能にする。C)プールされたライブラリをクエリー発現細胞と混合して(1:1)、コグネイトレセプターの間の生成的相互作用を可能にする。D)陽性相互作用(即ち、コンジュゲート)を、クエリーレセプター細胞の磁気捕捉(「選別」)により発現プールから回収する。E)プラスミドDNAを抽出して、バーコードPCR増幅をユニバーサルプライマーにより実施する。F)大規模並行次世代シークエンシングを利用して、各PCR産物の配列を得る。独特なバーコードのシグネーチャは、クエリーレセプターとの複合体中のリガンドを特有なやり方で同定する。注目すべきこととして、このプロトコルは、多数のクエリータンパク質で先のステップを実施し、得られたコンジュゲートをマルチウェルプレート形式(例えば、24ウェルプレート)で個別に捕捉して、ステップEにおいてプライマーに「ウェル特異性」同定物質(独特な8ヌクレオチドバーコード)を付加することにより、多重化することができる。これらのアンプリコンは、その後、1つの次世代シークエンシング試料にプールされて、シークエンシング後にデコンボリュートされ、各反応のコストを削減することができる。
図14Aおよび14B:磁気マイクロビーズを用いて、特異的な細胞間結合イベントを捕捉及び単離することができる。A)PD−L1 mCherry融合物を一過性発現するHEK293細胞を、GFP又はPD−1 GFP融合物を一過性発現する細胞と、1:1比(総細胞数4×106個)で混合した。PD−L1抗体で修飾されたプロテインAコーティング磁気マイクロビーズ(ミルニー)を添加して、試料を取り出した(総量;これは出発混合物組成を表す)。混合物を磁気細胞分離カラムアプライして、結合した細胞を洗浄し、溶出させた。「総量」の試料及び「結合」の試料を、FACSにより分析して、GFP陽性細胞パーセント率を決定した。PD−L1発現細胞が磁気ビーズにより捕捉され、GFPのみを発現する細胞よりもPD−1 GFP融合物を発現する細胞が有意に多く単離されており、コグネイトレセプター:リガンドコンジュゲートが明確かつ特異的な濃縮が実証された。B)ハイスループットスクリーニングにおいて遭遇するであろう「レア」イベントを単離する能力を実証するために、106個のPD−L1 mCherry細胞を、PD−1 GFP融合物又はGFPのいずれかを発現する細胞0.1×106個と、そして5×106個の非トランスフェクト細胞(疑似ライブラリを模倣するため)と混合した。この実験では、GFP陽性細胞は、総細胞数の約1.5%となる。2時間後に、抗PD−L1コーティングマイクロビーズを添加して、「総量」の試料を取り出して、結合画分をAに記載された通り単離した。データから、磁気捕捉されたPD−L1発現細胞による、PD−1 GFP融合物発現細胞の有意な濃縮が示される。
模擬信号雑音比:FACS選別と組み合わせた細胞間結合による、プールからの「レア」レセプターの濃縮。A)発現ライブラリを模擬するために、GFPを一過性に発現する107個のHEK293細胞を、PD−1 GFP融合物を発現する細胞0.02×106個(GFP陽性細胞の0.2%)と混合した。この「ライブラリ」を、その後、mCherry(陰性対照)又はPD−L1 mCherry融合物を一過性に発現するHEK293細胞106個でチャレンジした。データは、3×106個のイベント総数のフローサイトメトリー分析を示している。ゲートを、GFP「ライブラリ」、mCherry又はPD−L1 mCherry融合物のみでの10,000イベントの読み取りに基づいて設定した。B)PD−1 GFP融合物の濃縮を検証するために用いられたプライマーの位置を示す略図。C)PD−L1 mCherryチャレンジ(Aの右パネル)のために、陽性結合イベント(Q2)を選別して、10,000のイベントを回収した。比較のために、選別の前に10,000個の細胞も細胞混合物から回収した(選別前試料)。PD−1 GFP融合物のPCR対照が、左のレーンである。選別前及び選別後のPCR産物の比較から、選別された陽性結合イベントでPD−1 GFPが濃縮されたことが検証される。
細胞間FACSアッセイの多重化:分泌タンパク質の哺乳動物発現ライブラリを、特有にバーコード化された各発現構築物を用いて作製した(3'末端の下流にある発現プラスミド上の可変性の約20塩基対配列)。これらの構築物は、GFP蛍光タンパク質マーカで発現される。「チャレンジャー」である非コード化の分泌タンパク質発現構築物も、例えばmCherry蛍光タンパク質マーカを用いて作製される。ライブラリ構築物及び「チャレンジャー」構築物は、哺乳動物細胞内で別個に発現される。「ライブラリ」及び「チャレンジャー」の細胞集団を、一緒に混合する。その後、細胞間相互作用を、非相互作用細胞から選別する。選別を、蛍光により(即ち、全ての二重陽性イベント、mCherry+GFP)又は磁気ビーズを用いて磁気的に実施して、「チャレンジャー」細胞を任意の結合ライブラリパートナーにより捕捉することができる。細胞試料を、選別の前及び後に取り出し、溶解して、上清を発現プラスミドのPCR増幅に用いる。プールされたPCR試料を、ディープシークエンシングに進めて、存在する特定のバーコードのコピー数定量的評価を得る。本発明者らの実験において、バックグランドを超える特定のバーコードの濃縮が、特異的なタンパク質間相互作用指標となろう。本発明者らは、その後、特異的なバーコード配列を利用して、ライブラリから得られたタンパク質を同定することができた。
細胞間「レアイベント」のアッセイ:多重化アプローチにより、該当するタンパク質がライブラリ全体に比較して相対的にレアとなっていれば、ライブラリからその特異的結合相互作用を取り出すことができる。例えば、100の遺伝子のライブラリを有し、それらを哺乳動物細胞内で別個に発現させて、それらの100の発現集団を互いに等量で混合する場合、発現された任意の一遺伝子は、ライブラリ全体の1/100を表すことになる。この実験から、該当する遺伝子、この場合PD−1が、GFP陽性細胞の全集団の1/100の場合でも、本明細書に記載された技術を利用すればPD−1/PD−L1相互作用を濃縮し得ることが実証される。ディープシークエンシングアプローチの初期テストとして、これまで特徴づけられたPD−L1突然変異体の組み合わせを利用した。各PD−L1突然変異体配列は、本来、異なるため、理想は、「バーコード」として突然変異体配列を使用することであった。これらの突然変異体の幾つかは、PD−1への結合の減少を示し、多重化されたディープシークエンシングアプローチを利用してそれらの同じ突然変異体を同定することが可能であった。
PD−L1突然変異体:被験物質の例:示された配列は、マウスPD−L1遺伝子の一部についてである。強調されたアミノ酸は、独特な点突然変異の位置を示している。緑色は、突然変異を受けた場合にPD−1への結合に影響がないことを示す残基である。赤色の残基は、突然変異を受けた場合に、PD−1への結合の大きな欠損を示す残基であり、黄色の残基は、PD−1への結合のより少量の欠損を示している。青色で強調されたDNA配列は、選別前及び後の両方で、プールされたPD−L1ライブラリをPCR増幅するために用いられたプライマーの位置を示す。FACSのパネルは、PD−L1突然変異体ライブラリをチャレンジするためにGFPを利用した陰性対照の模擬選別、及びその実験的PD−1チャレンジの選別を示している。実験では、20,000個の細胞を、選別の前(選別前)に、そして選別された集団Q2から(選別後)回収し、上記の通り強調されたプライマーを用いてPCR増幅させた。下の右側のアガロースゲルの画像は、選別前及び選別後の試料から得られたPCR産物を示している。これらの試料は、その後、ディープシークエンシング分析に進めた。
ディープシークエンシングの結果を分析して、独特なPD−L1配列それぞれが同定された回数を決定した(発生数の合計)。その後、選別前の試料と選別後の試料の間の発生において、濃縮比を計算した。例えば選別前の試料では10の野生型PD−L1配列がカウントされ、選別後の試料では100がカウントされた場合、野生型PD−L1の10倍濃縮が観察された(100÷10)。特定のPD−L1突然変異体、例えばD122Aが、PD−1に結合していない場合、本発明者らは、それでも選別前試料の10のD122A配列をカウントし得たが、選別後の試料では5の配列のみをカウントし得た。これにより、0.5の濃縮比が得られる(5÷10)。伝統的なFACS結合法を利用して得られたデータを比較するために(淡青色のバー)、データの全てを野生型PD−L1結合に対して標準化した。データから、これまで不十分なPD−1バインダとして同定されたそれらの突然変異体が、多重化されたディープシークエンシングアプローチを利用することで同様に同定されることが明白に実証される。
T細胞リガンドの検出。本明細書に記載された細胞マイクロアレイプラットフォームを利用したレセプター結合を用いて、複数のIgSFレセプター/リガンド対を検査した。結合は、特異的である。
PD−L1突然変異体を選択的機能により同定するためのマイクロビーズプラットフォームの使用。
ガラススライドに、プラスミドDNAコード、野生型PD−L1、mCherry単独、又は一連のPD−L1突然変異体をプリントした。各プリントされた構築物の位置は、図では最も右側に示されている。mCherry(Cy3)レーザからの蛍光シグナルから、各プリントされた構築物の発現レベルが示される。アレクサ647(Cy5)レーザは、PD−L1発現細胞に対するPD−1(上パネル)又はB7−1(下パネル)のいずれかのFc融合タンパク質の結合を示している。それゆえ、Cy5チャネル内で蛍光のないスポットは、結合を示さない。右へのグリッドは、マイクロビーズの結合実験を利用して観察された結合を示すために色分けされている。緑色の構築物は、野生型と同様の結合を示した。黄色の突然変異体は、結合低下を示し、赤色の突然変異体は、ほとんど又は全く結合を示さなかった。同一の結合パターンが、マイクロアレイで観察される。
細胞間結合アッセイの、ハイスループットなタンパク質間相互作用スクリーニングに適した96ウェルプレート形式への拡張。A)16の対照細胞試料を二本ずつ、3種の異なる総細胞濃度に設定して、96ディープウェルブロックにおいて4℃で2時間インキュベートした。コグネイトリガンド:レセプター対を含み、それゆえ有意な結合を実証するはずである細胞間混合物を、緑色で強調している(表Aの下側の2列)。インキュベーション後に、細胞のアリコットを96ウェル丸底プレートに移し、BDアキュリ(Accuri)サイトメータに連結されたインテリサイト(Intellicyt)HTFC連続フローシステムを利用して分析した。
細胞間結合アッセイの、ハイスループットなタンパク質間相互作用スクリーニングに適した96ウェルプレート形式への拡張。B)使用された代表的な96ウェルプレートからのウェルファインダーの表示。各ピークは、1つのウェルから回収されたイベントを表す。識別子は、96ウェルプレートの各列の最後を標識している。ピークのサイズが、ウェル内の細胞濃度を表していて、3つの異なる細胞濃度を明確に識別可能にしていることに留意されたい。
細胞間結合アッセイの、ハイスループットなタンパク質間相互作用スクリーニングに適した96ウェルプレート形式への拡張。C)96ウェルプレート全体の単一細胞全てを、GFP蛍光、mCherry蛍光、又はそれらの両方(二重陽性の「ヒット」(Double Positive "Hits"))についてゲーティングした。
細胞間結合アッセイの、ハイスループットなタンパク質間相互作用スクリーニングに適した96ウェルプレート形式への拡張。D)「二重陽性のヒット」を全ての単一細胞イベントのパーセント率として示したヒートマップ
細胞間結合アッセイの、ハイスループットなタンパク質間相互作用スクリーニングに適した96ウェルプレート形式への拡張。E)グラフは、二重陽性(ヒット)を、テストされた細胞濃度それぞれでの16の対照細胞試料の全てに関する単一細胞イベント全体のパーセント率として示している。細胞間結合のパーセント率が、総細胞濃度の低下に伴って低下するが、陰性対と陽性対の間の倍率差が、1×106細胞/mLの約6倍から0.2×106細胞/mLの約10倍に改善していることに留意されたい。データは、2つの独立した実験の平均を表し、エラーバーは、標準偏差を示している。
Igスーパーファミリーの細胞マイクロアレイ発現メンバー。A)ポリ−1−リシンコーティングガラススライドに、IgGスーパーファミリー内の144のヒト遺伝子に関する発現構築物をプリントした。各構築物は、一列に4つずつプリントして、合計で4×144スポットのアレイを得た。トランスフェクション後に、プリントされた各構築物の発現を、mCherryの蛍光を介して直接観察することができる(模擬着色された緑色。単一チャネルは示さない)。この細胞アレイを、続いてアレクサ647標識抗ヒトIgGとプレインキュベートされた組換えPD−L1 Fcで処理して洗浄し、4%ホルムアルデヒドで固定した(模擬着色された赤色。単一チャネルは示さない)。データは、緑色と赤色がオーバーレイされた模擬着色画像を示しており、結合は緑色蛍光シグナルと赤色蛍光シグナルのマージングにより生じる黄/橙色として観察される。A及びBと標識された列は、PD−L1、PD−1(A)及びB7−1(B)の2つの既知の結合ターゲットを含む。B)PD−1及びB7−1に結合したPD−L1に関して観察された陽性シグナルを、周囲のスポットで観察されたシグナルと比較して示した、Aで強調された列の10倍画像

0021

(i)第一の所定の異種分泌タンパク質、異種膜タンパク質、又は異種細胞表面タンパク質、及び第一の蛍光タンパク質とを発現するように形質転換された第一の複数の細胞と、(ii)第二の所定の異種分泌タンパク質又は第二の異種タンパク質、及び第二の蛍光タンパク質とを発現するように形質転換された少なくとも第二の複数の細胞と、を含む細胞マイクロアレイであって、
該第一及び第二の複数の細胞が、マイクロアレイの固体表面に接着されていて、該第一と第二の複数の細胞が、固体表面の空間的に別個の位置に存在する、細胞マイクロアレイが提供される。

0022

(i)(a)第一の所定の異種タンパク質、及び(b)第一の蛍光タンパク質、を発現するように形質転換された第一の複数の細胞と、(ii)(a)第二の所定のタンパク質、及び(b)第二の蛍光タンパク質、を発現するように形質転換された少なくとも第二の複数の細胞と、を含む細胞マイクロアレイであって、
該第一及び第二の複数の細胞が、マイクロアレイの固体表面に接着されていて、該第一と第二の複数の細胞が、固体表面の空間的に別個の位置に存在する、細胞マイクロアレイが提供される。

0023

一実施形態において、第一又は第二の所定のタンパク質は、古典的に分泌されたタンパク質である。一実施形態において、第一又は第二の所定のタンパク質は、非古典的に分泌されたタンパク質である。非古典的分泌としては、明確な非古典的分泌経路を有するFGF2などのタンパク質、及び細胞溶解細胞死により放出される細胞質タンパク質が挙げられる。

0024

一実施形態において、該細胞マイクロアレイは、(i)異種タンパク質の1つのための候補タンパク質若しくはペプチドリガンドと、(ii)異種タンパク質の1つに結合した第三の蛍光タンパク質と、を含む融合タンパク質をさらに含むか、又は異種タンパク質の1つのためのペプチド若しくはタンパク質リガンドを含む化合物をさらに含み、該化合物は、非ペプチド結合により結合された第三の蛍光タンパク質を有し、細胞マイクロアレイの異種タンパク質の1つに結合されている。

0025

一実施形態において、該細胞マイクロアレイは、第三の複数の細胞を対照としてさら含み、該第三の複数の細胞は、第一の蛍光タンパク質を発現するように任意で形質転換されているが、第一又は第二の所定の異種タンパク質では形質転換されていない。

0026

一実施形態において、複数の細胞はそれぞれ、複数の哺乳動物細胞である。

0027

一実施形態において、該哺乳動物細胞は、単離されたヒト細胞である。

0028

一実施形態において、該哺乳動物細胞は、ヒト胎児腎(HEK)細胞株の細胞である。

0029

一実施形態において、該哺乳動物細胞は、HEK293細胞株の細胞である。

0030

一実施形態において、マイクロアレイは、少なくとも10の異なる複数の細胞を含み、複数の細胞はそれぞれ、所定の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換されており、該異種タンパク質は、マイクロアレイ内の他の複数の形質転換された細胞それぞれにより発現される異種タンパク質とは異なる。

0031

一実施形態において、マイクロアレイは、少なくとも100の異なる複数の細胞を含み、複数の細胞はそれぞれ、所定の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換されており、該異種タンパク質は、マイクロアレイ内の他の複数の形質転換された細胞それぞれにより発現される異種タンパク質とは異なる。

0032

一実施形態において、第一のタンパク質及び/又は蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質又は黄色蛍光タンパク質である。

0033

一実施形態において、第三の蛍光タンパク質は、赤色蛍光タンパク質である。

0034

一実施形態において、複数の細胞はそれぞれ、第一の所定の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質を発現するように形質転換されているに過ぎず、任意の他の異種タンパク質を発現するように形質転換されていない。

0035

一実施形態において、第一の所定の異種タンパク質は、マルチサブユニット異種タンパク質のあるサブユニットであり、該複数の細胞は、マルチサブユニット異種タンパク質の1つ以上の残りのメンバーも発現するように形質転換されている。

0036

一実施形態において、第一の所定の異種タンパク質は、発現される際に、C末端を介して第一の蛍光タンパク質に付着される。

0037

一実施形態において、第一の所定の異種タンパク質は、発現される際に、膜貫通アンカーペプチドに付着される。

0038

一実施形態において、細胞マイクロアレイは、第一の異種タンパク質及び蛍光タンパク質をコードする第一の複数の発現構築物を、マイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びに第二の異種タンパク質及び蛍光タンパク質をコードする少なくとも第二の複数の発現構築物を、該貼付された第一の複数の発現構築物とは異なる空間的に別個の位置の固体表面で、マイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びにトランスフェクション剤の存在を含む条件下で、発現構築物を複数の細胞と接触させ、それにより各発現構築物によるそれぞれ空間的に別個の位置にある細胞の少なくとも一部のトランスフェクションを可能にすること、により組み立てられる。

0039

一実施形態において、該発現構築物は、pEGFP−N1発現構築物を含む。一実施形態において、該発現構築物は、CMVプロモータを含む。

0040

一実施形態において、該細胞は、昆虫細胞である。一実施形態において、該細胞は、ショウジョウバエS2細胞である。

0041

一実施形態において、該第一又は第二の所定の異種タンパク質は、イムノグロブリンスーパーファミリータンパク質、TNFレセプタータンパク質、サイトカイン、ケモカイン、1型膜貫通レセプタータンパク質、2型膜貫通レセプタータンパク質、イオンチャネルタンパク質、又は膜輸送タンパク質である。

0042

一実施形態において、本明細書に記載された第一又は第二の所定の異種タンパク質は、1)ヒトのセクレトーム全体(即ち、GPCRCをはじめとする、約8000の分泌タンパク質及び内在性膜タンパク質);2)ヒト/マウスの非古典的分泌タンパク質;3)細胞表面若しくは分泌タンパク質への結合を介して細胞外機能を示す細胞質タンパク質;又は4)病原性分泌タンパク質又は内在性膜タンパク質、である。

0043

一実施形態において、第一又は第二の所定の異種タンパク質は、Toll様レセプター、TNFレセプター、GPCR、増殖因子レセプター、ネクチン、インターロイキン、又はインターロイキンレセプターである。

0044

一実施形態において、第一又は第二の所定の異種タンパク質は、哺乳動物のものである。

0045

一実施形態において、第一又は第二の所定の異種タンパク質は、形質膜に局在化した位置に発現される。一実施形態において、第一及び/又は第二の異種タンパク質は、分泌タンパク質、膜貫通タンパク質、又は細胞表面タンパク質である。一実施形態において、細胞マイクロアレイは、異種タンパク質を発現するように形質転換された、100、200、300、400又は500又はそれを超える異なる複数の細胞を含み、複数の細胞はそれぞれ、他の複数の形質転換細胞により発現された異種タンパク質と互いに異なる異種タンパク質を発現する。一実施形態において、細胞マイクロアレイは、異種タンパク質を発現するように形質転換された、750又はそれを超える異なる複数の細胞を含み、複数の細胞はそれぞれ、他の複数の形質転換細胞により発現された異種タンパク質と互いに異なる異種タンパク質を発現する。一実施形態において、細胞マイクロアレイは、異種タンパク質を発現するように形質転換された、1000又はそれを超える異なる複数の細胞を含み、複数の細胞はそれぞれ、他の複数の形質転換細胞により発現された異種タンパク質と互いに異なる異種タンパク質を発現する。

0046

一実施形態において、異種タンパク質は、分泌タンパク質であり、膜貫通へリックスに融合されて発現される。

0047

一実施形態において、第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質は、同じタイプであり、第三の蛍光タンパク質は、異なるタイプのものである。

0048

一実施形態において、複数の細胞はそれぞれ、多数の細胞のスポットに分別され、多数の細胞はそれぞれ、該複数の細胞の総数よりも少なく、各スポットは、別の複数の細胞のスポットに対してよりも同じ複数の細胞の別のスポットに対して接近するように配置される。

0049

本明細書に記載された細胞マイクロアレイを作製する工程であって、第一の異種タンパク質及び第一の蛍光タンパク質をコードする第一の複数の発現構築物を、マイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びに第二の異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質をコードする少なくとも第二の複数の発現構築物を、該貼付された第一の複数の発現構築物とは異なる空間的に別個の位置でマイクロアレイの固体表面に貼付すること、並びに細胞を固体表面に接着させるように、そしてそれぞれ空間的に別個の位置にある細胞の少なくとも一部に各発現構築物によるトランスフェクションを起こさせるために、トランスフェクション剤の存在を含む条件下で、発現構築物を複数の細胞と接触させること、を含む、工程が提供される。

0050

一実施形態において、該発現構築物は、異種タンパク質及び蛍光タンパク質を、単一の共有結合的に融合されたポリペプチドとして含む融合タンパク質の単一の転写物をコードすることができる。一実施形態において、該発現構築物は、異種タンパク質及び蛍光タンパク質を、2つの異なるポリペプチドとして(例えば、IRES構築物)コードすることができる。一実施形態において、ライゲーション非依存性クローニング(LIC)を用いて、発現構築物を調製する。一実施形態において、伝統的な制限部位クローニングが、利用される。

0051

候補タンパク質又はペプチドが第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、第二のタンパク質を本明細書に記載された細胞マイクロアレイの異種タンパク質として発現させること、細胞マイクロアレイを第三の蛍光タンパク質又はペプチドに貼付された候補タンパク質又はペプチドと接触させること、候補タンパク質又はペプチドと接触された細胞マイクロアレイを洗浄して、非結合候補タンパク質又はペプチドを除去すること、及び洗浄後に細胞マイクロアレイに結合された任意の候補タンパク質又はペプチドが存在するかどうかを決定すること、を含み、第一の異種タンパク質で形質転換された細胞に対応する第一の空間的位置に洗浄後の細胞マイクロアレイに結合された候補タンパク質が存在すれば、候補タンパク質又はペプチドが第一の異種タンパク質に結合していることが示され、洗浄後の第一の空間的位置に細胞マイクロアレイに結合された候補タンパク質又はペプチドが存在しなければ、候補タンパク質又はペプチドが異種タンパク質に結合していないことが示される、方法も提供される。

0052

一実施形態において、洗浄後に細胞マイクロアレイに結合された任意の候補タンパク質又はペプチドが存在するかどうかの決定が、第三の蛍光タンパク質の蛍光を測定すること、及び細胞マイクロアレイでの位置を決定すること、により実行され、第三の蛍光タンパク質と、第一又は第二の蛍光タンパク質が空間的に別個の位置に共存することにより、第一のタンパク質又はペプチドが、その空間的に別個の位置に対応する異種タンパク質に結合されていることが示される。

0053

(i)マイクロアレイの固体表面、及び細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを、及び第一のC−末端細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように形質転換された浮遊培養適合細胞株と、(ii)少なくとも(a)所定の異種タンパク質を細胞表面で、そして第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された第二の複数の細胞、又は(b)異種タンパク質を表面に貼付させ、かつ第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数のマイクロビーズと、を含むシステムであって、(a)又は(b)が、マイクロアレイの固体表面に貼付されている、システムも提供される。先のものに必要な変更を加えたシステムであって、候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二の複数の形質転換された細胞又は複数のマイクロビーズ上で発現され、異種タンパク質が形質転換された浮遊培養適合細胞株の細胞表面で発現される、システムも提供される。

0054

マイクロアレイ上の細胞を、(1)蛍光標識されたプローブタンパク質;(2)蛍光マイクロビーズ上に提示されたプローブタンパク質;及び/又は(3)プローブ分子を表面で発現する細胞、でプローブすることができる。

0055

一実施形態において、該システムは、(c)細胞表面の異なる所定の異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された1つ以上のさらなる複数の細胞、又は(d)異なる所定の異種タンパク質を表面に貼付させ、第二の蛍光タンパク質を貼付させた、1つ以上のさらなる複数のマイクロビーズ、をさらに含み、(c)又は(d)は、複数の(a)及び/又は(b)とは空間的に別個の位置でマイクロアレイ固体表面に貼付される。

0056

一実施形態において、該異種タンパク質は、プロテインA分子を介してマイクロビーズに貼付される。

0057

一実施形態において、細胞表面で候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように形質転換された浮遊培養適合細胞株は、候補リガンドタンパク質又はペプチドをコードする核酸構築物で一過性にトランスフェクトされている。一実施形態において、異種タンパク質は、マイクロビーズに付着された抗体により結合させることによりマイクロビーズに貼付される。一実施形態において、第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質は、異なる色である。一実施形態において、一方の蛍光タンパク質は、緑色であり、他方の蛍光タンパク質は、赤色である。非限定的例としては、緑色蛍光タンパク質及びmCherry(商標)が挙げられる。

0058

一実施形態において、該複数の細胞は、複数の哺乳動物細胞である。一実施形態において、該哺乳動物細胞は、単離されたヒト細胞である。一実施形態において、該哺乳動物細胞は、ヒト胎児腎(HEK)細胞株の細胞である。一実施形態において、該哺乳動物細胞は、HEK293細胞株の細胞である。

0059

一実施形態において、所定の異種タンパク質は、マルチサブユニット異種タンパク質のあるサブユニットであり、該複数の細胞は、マルチサブユニット異種タンパク質の1つ以上の残りのメンバーも発現するように形質転換されている。一実施形態において、所定の異種タンパク質は、分泌タンパク質、膜タンパク質又は細胞表面タンパク質である。一実施形態において、所定の異種タンパク質は、発現される際に、C末端を介して蛍光タンパク質に付着される。一実施形態において、所定の異種タンパク質は、分泌タンパク質であり、発現される際に、膜貫通アンカーペプチド又はタンパク質に付着される。一実施形態において、該発現構築物は、pEGFP−N1発現構築物及び/又はCMVプロモータを含む。一実施形態において、該異種タンパク質は、イムノグロブリンスーパーファミリータンパク質、TNFレセプタータンパク質、サイトカイン、ケモカイン、1型膜貫通レセプタータンパク質、2型膜貫通レセプタータンパク質、イオンチャネルタンパク質、又は膜輸送タンパク質である。一実施形態において、該異種タンパク質は、Toll様レセプター、TNFレセプター、GPCR、増殖因子レセプター、ネクチン、インターロイキン、又はインターロイキンレセプターである。一実施形態において、該異種タンパク質は、哺乳動物のものである。一実施形態において、該異種タンパク質は、細胞膜に局在化した位置で発現される。

0060

候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、本発明のシステムの浮遊培養適合細胞株の複数において候補リガンドタンパク質又はペプチド及び第一の蛍光タンパク質を発現させること、並びにその細胞株の複数を、(a)異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された第二の複数の細胞、又は(b)異種タンパク質及び第二の蛍光タンパク質を表面に貼付させた複数のマイクロビーズ、と接触させること、並びに洗浄して非結合候補リガンドタンパク質又はペプチドを除去すること、並びにFACS分析により第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示す細胞を同定すること、を含み、空間的に別個の位置で細胞が第一及び第二の両方の蛍光タンパク質の共存を示していれば、第一のタンパク質又はペプチドが空間的に別個の位置に対応する異種タンパク質に結合していることが示される、方法。

0061

一実施形態において、第一及び第二の蛍光タンパク質の両者の共存は、FACS分析により決定される。

0062

血友病性相互作用の特定の実施形態において、候補リガンドタンパク質又はペプチドと、第二のタンパク質又はペプチドは、同じ配列を有する。

0063

細胞表面で第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドに対する独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含み、該独特な配列が1つ以上のユニバーサルプライマー(複数可)により鎖延長することが可能である、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換された第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二のベクターが第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドに対する別の独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含む、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、(i)細胞表面でレセプタータンパク質若しくはペプチドを発現するように、そして第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は(ii)表面にレセプタータンパク質を貼付させ、第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズと、を含むシステムが提供される。

0064

一実施形態において、該レセプタータンパク質は、古典的に認識されたレセプターであり得る。一実施形態において、該レセプタータンパク質は、古典的に認識されたレセプターではあり得ず、単にリガンドの受容タンパク質である。

0065

細胞表面で第一の異種タンパク質を発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが第一の異種タンパク質に対する独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含み、該独特な配列が1つ以上のユニバーサルプライマー(複数可)により鎖延長することが可能である、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、細胞表面で第二の異種タンパク質を発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換された第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二のベクターが第二の異種タンパク質に対する別の独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含む、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、(i)細胞表面で候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを発現するように、そして第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は(ii)表面に候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを貼付させ、第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズと、を含むシステムが提供される。

0066

一実施形態において、該ユニバーサルプライマーは、T7フォワード及びリバースユニバーサルプライマーを含む。

0067

一実施形態において、該ペプチド細胞表面エピトープは、FLAGエピトープ(DYKDDDDK)(SEQID NO:l)である。一実施形態において、該システムは、磁気分子物質を含む抗FLAGエピトープ抗体をさらに含み、該抗体は、FLAGエピトープに結合されている。

0068

一実施形態において、該磁気分子物質は、超常磁性鉄含浸ビーズである。一実施形態において、該独特な所定の20〜35ヌクレオチド配列は、28ヌクレオチド長である。

0069

候補リガンドタンパク質又はペプチドが、第二の所定のタンパク質に結合するかどうかを決定する方法であって、第二の所定のタンパク質を本発明のシステムの異種タンパク質として発現させて、(i)細胞表面で候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを発現するように、そして第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、第二の浮遊培養適合細胞株が、安定して発現されるペプチド細胞表面エピトープを含む、1つ以上のさらなる複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、又は(ii)表面に候補リガンドタンパク質若しくはペプチドを貼付させ、第二の蛍光タンパク質を貼付させた、複数の磁気マイクロビーズ、の候補リガンドタンパク質又はペプチドと接触させること;
該第二の複数の細胞の1つ以上に、又は該複数の磁気マイクロビーズに結合された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞のいずれかを、磁気引力により分離すること;
そのような分離された細胞間又は細胞−マイクロビーズコンジュゲートからDNAを得て、存在するならばDNA中の独特な配列を、ユニバーサルプライマーを用いて増幅させること;
該独特な配列の複数のコピーをシークエンシングして独特な配列の存在を確認すること;
そのように同定された独特な配列(複数可)をデータベースに対して比較して、独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を特異的異種タンパク質又はペプチドに相関させ、それによりそのように相関された任意の異種タンパク質又はペプチド結合を同定し、それにより特異的異種タンパク質又はペプチドを候補タンパク質又はペプチドに結合しているとして同定すること、
を含む方法も提供される。

0070

一実施形態において、該候補リガンドタンパク質又はペプチドは、プロテインA分子を介してマイクロビーズに貼付される。一実施形態において、該候補リガンドタンパク質又はペプチドは、マイクロビーズに付着された抗体により結合させることによりマイクロビーズに貼付される。一実施形態において、第一の蛍光タンパク質と第二の蛍光タンパク質は、異なる色である。一実施形態において、一方の蛍光タンパク質は、緑色であり、他方の蛍光タンパク質は、赤色である。そのような蛍光タンパク質の非限定的例は、上記に示されている。一実施形態において、該複数の細胞は、複数である。一実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒト胎児腎(HEK)細胞株の細胞である。一実施形態において、該哺乳動物細胞は、HEK293細胞株の細胞である。一実施形態において、所定の異種タンパク質は、マルチサブユニット異種タンパク質のあるサブユニットであり、該複数の細胞は、マルチサブユニット異種タンパク質の1つ以上の残りのメンバーも発現するように形質転換されている。一実施形態において、所定の異種タンパク質は、発現される際に、C末端を介して蛍光タンパク質に付着される。一実施形態において、所定の異種分泌タンパク質は、発現される際に、膜貫通アンカーペプチドに付着される。一実施形態において、該異種タンパク質は、イムノグロブリンスーパーファミリータンパク質、TNFレセプタータンパク質、サイトカイン、ケモカイン、1型膜貫通レセプタータンパク質、2型膜貫通レセプタータンパク質、イオンチャネルタンパク質、又は膜輸送タンパク質である。一実施形態において、該異種タンパク質は、Toll様レセプター、TNFレセプター、GPCR、増殖因子レセプター、ネクチン、インターロイキン、又はインターロイキンレセプターである。一実施形態において、該異種タンパク質は、哺乳動物のものである。一実施形態において、該異種タンパク質は、細胞膜に局在化した位置で発現される。

0071

(i)(a)細胞表面で異種タンパク質を発現するように、そして(b)第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換されている第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞であって、該ベクターが発現された異種タンパク質に対する独特な所定の15〜35ヌクレオチド配列を含むことで、該第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞が少なくとも2つの異なるタイプの第一の異種タンパク質を発現する、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、(ii)細胞表面で第二の異種タンパク質を発現するように、そして第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換されており、単一タイプの第二の異種タンパク質を発現する、第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、を含むシステム。一実施形態において、第一の複数の細胞の任意の各細胞は、細胞表面で唯一の異種タンパク質を発現する。一実施形態において、第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質の異なるタイプのいずれも、第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質と同じ配列を有さない。

0072

一実施形態において、該第二の異種タンパク質は、膜レセプターである。一実施形態において、第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞において発現された該異種タンパク質のそれぞれは、分泌されたペプチド、ポリペプチド又はタンパク質である。一実施形態において、該複数の細胞の第一の異種タンパク質の異なるタイプは、所定の野生型タンパク質の各突然変異体である。一実施形態において、該第二の異種タンパク質は、野生型タンパク質である。一実施形態において、該第一の複数の異なるタンパク質の異種タンパク質の各タイプは、1、2、3、4又は5アミノ酸残基の点突然変異により該複数の細胞の異種タンパク質の互いのタイプと異なっている。一実施形態において、該複数の異なるタンパク質の各タンパク質タイプは、1つのアミノ酸残基の点突然変異により複数の細胞の異種タンパク質の互いのタイプと異なっている。

0073

一実施形態において、該独特な配列は、1つ以上のユニバーサルプライマー(複数可)により鎖延長することが可能である。一実施形態において、該独特な配列は、15〜35ヌクレオチドである。一実施形態において、該第一又は第二の蛍光タンパク質は、緑色である。一実施形態において、他の蛍光タンパク質は、赤色である。

0074

候補リガンドタンパク質又はペプチドが第二のタンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、第一の異種タンパク質を第二の異種タンパク質に結合させる条件下で、候補リガンドタンパク質又はペプチドを本明細書に記載されたシステムにおいて第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質として発現させ、第二のタンパク質又はペプチドを本明細書に記載されたシステムにおいて第二の異種タンパク質として発現させること、任意で洗浄して非結合の第一の異種タンパク質をいずれも除去すること、その後、第一及び第二の異種タンパク質が両者とも共存する細胞を回収すること、回収された細胞から核酸を得ること、核酸をシークエンシングして、それに含まれる独特な15〜35ヌクレオチド配列を同定することで、第二のタンパク質又はペプチドに結合した独特な15〜35ヌクレオチド配列に対応する候補リガンドタンパク質又はペプチドを同定すること、を含む、方法も提供される。

0075

第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合に及ぼす、第一のタンパク質の所定のアミノ酸残基の影響を決定する方法であって、第一のタンパク質に対して1つ以上の点突然変異により変異されたタンパク質を、本明細書に記載されたシステムの第一の浮遊培養適合細胞株の複数の中の複数の異なるタイプの異種タンパク質として発現させること、及び該細胞株の複数を、該第二のタンパク質及び第二の蛍光タンパク質を発現するように形質転換された本明細書に記載されたシステムの第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質の形態の該第二のタンパク質と接触させること、第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存を示す細胞を回収すること、回収された細胞から核酸を得ること、核酸をシークエンシングしてそれに含まれる独特な15〜35ヌクレオチド配列を同定することで、第二のタンパク質又はペプチドに結合された第一のタンパク質を同定すること、並びに第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルを、所定の参照レベルと比較すること、を含み、
第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルが所定の参照レベルよりも多ければ、該タンパク質中で変異された1つ又は複数の残基が、第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合を増大させていることが示され、第二のタンパク質又はペプチドに結合されたタンパク質のレベルが所定の参照レベルよりも少なければ、該タンパク質中で変異された1つ又は複数の残基が、第二のタンパク質への第一のタンパク質の結合を阻害していることが示される、方法も提供される。

0076

一実施形態において、該所定のレベルは、対照である。一実施形態において、該所定のレベルは、第二のタンパク質に結合する未変異の第一のタンパク質のレベルをアッセイすることにより得られる。該方法の一実施形態において、第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存を示す細胞は、FACS分析により回収される。

0077

(i)細胞表面で第一の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、及び細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、そして第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換された第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、(ii)表面に標的タンパク質、ペプチド又は抗体を貼付させた複数の磁気マイクロビーズと、を含むシステムも提供される。

0078

2つの候補リガンドタンパク質又はペプチドの1つ以上が標的タンパク質、ペプチド又は抗体に結合するかどうかを決定する方法であって、第一の異種タンパク質及び第二の異種タンパク質を標的タンパク質、ペプチド又は抗体に結合させる条件下で、第一の候補リガンドタンパク質又はペプチドを、本発明のシステムにおいて第一の複数の細胞の第一の異種タンパク質として発現させ、第二の候補リガンドタンパク質又はペプチドを、本発明のシステムにおいて第二の異種タンパク質として発現させること、第一の蛍光タンパク質発現細胞と複合体化された、そして/又は第二の蛍光タンパク質発現細胞と複合体化された任意のマイクロビーズを回収すること、並びに該複合体中の候補リガンドタンパク質を同定すること、を含み、第一の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、第一の候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第二の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、第二の候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第一の蛍光タンパク質発現細胞又は第二の蛍光タンパク質発現細胞の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されなければ、それぞれ第一の候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないこと、及び第二の候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないことが示される、方法も提供される。

0079

(i)細胞表面で第一の異種標的タンパク質又はペプチドを発現するように、そして第一の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、あるベクターで形質転換された第一の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞、及び細胞表面で第二の異種候補リガンドタンパク質又はペプチドを発現するように、そして第二の細胞質発現蛍光タンパク質を発現するように、第二のベクターで形質転換された1つ以上の第二の複数の浮遊培養適合細胞株の細胞と、(ii)表面に、候補リガンドタンパク質若しくはペプチドのいずれかに対する抗体、又は標的タンパク質又はペプチドに対する抗体を貼付させた複数の磁気マイクロビーズと、を含むシステムが提供される。候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合するかどうかを決定する方法であって、候補リガンドタンパク質又はペプチドと標的タンパク質又はペプチドを結合させる条件下で、候補リガンドタンパク質又はペプチドを本発明のシステムにおいて第二の複数の細胞の第二の異種タンパク質として発現させ、そして標的タンパク質又はペプチドを本発明のシステムのシステムにおいて第一の異種タンパク質として発現させること、並びに第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方と複合体化された任意のマイクロビーズを回収すること、を含み、第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されれば、候補リガンドタンパク質又はペプチドが標的タンパク質又はペプチドに結合していることが示され、第一の蛍光タンパク質発現細胞及び第二の蛍光タンパク質発現細胞の両方の複合体に付着されたマイクロビーズが回収されなければ、候補リガンドタンパク質が標的タンパク質又はペプチドに結合していないことが示される、方法も提供される。

0080

該方法の一実施形態において、第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存を示す細胞は、磁気的に選別される。第一及び第二の蛍光タンパク質の両方の共存を示す細胞が同定される際に、ビーズなどの磁気物質を第二の複数の細胞に付着させて、磁気分離を実行することができる。したがって本明細書に記載された方法及びシステムは、第二の複数の細胞のうちの細胞に付着された、磁気マイクロビーズなどの磁気物質を含んでいてもよく、第二の複数の細胞のうちの細胞に付着された、磁気マイクロビーズなどの磁気物質を付着させることを含んでいてもよい。

0081

一実施形態において、該異種タンパク質又はペプチドは、タンパク質の供給源に関し、発現される細胞に対して異種である(例えば、別の細胞型又は別の種のもの)。一実施形態において、該異種タンパク質又はペプチドは、位置に関し、発現される細胞に対して異種であり、例えば該タンパク質は、正常な生理学的条件(例えば、インビボ)の下でその位置(例えば、細胞表面)では発現されない。

0082

該方法の一実施形態において、PCRが、独特な15〜35ヌクレオチド配列で実施される。一実施形態において、ディープシークエンシングが、プールされたPCR産物で実施されて、独特な15〜35ヌクレオチド配列を同定する。該方法の一実施形態において、該方法は、独特な15〜35ヌクレオチド配列が選別前(又は回収前)に対比して選別後(又は回収後)に濃縮されているかどうかを決定することを含む。

0083

本明細書に記載された方法及びシステムの実施形態において、該独特な配列は、20〜35ヌクレオチドである。本明細書に記載された方法及びシステムの実施形態において、該独特な配列は、20〜30ヌクレオチドである。本明細書に記載された方法及びシステムの実施形態において、該独特な配列は、25〜30ヌクレオチドである。本明細書に記載された方法及びシステムの実施形態において、該独特な配列は、20ヌクレオチド長である。本明細書に記載された方法及びシステムの実施形態において、該独特な配列は、28ヌクレオチド長である。

0084

本明細書に記載された方法の実施形態において、共存する細胞又は回収された細胞は、溶解され、シークエンシングが、その上清の内容物について実施される。

0085

本明細書に記載された方法のさらなる実施形態において、該方法は、マルチウェルディッシュにおいて、各ウェルのアプリコンが残りのウェルのアプリコンと異なるように実施される。一実施形態において、マルチウェルディッシュの異なるウェルは、異なるレセプタータンパク質を含む。

0086

他に断りがなければ、又は文脈により明確に矛盾していなければ、本明細書に記載された様々な要素の全ての組み合わせが、本発明の範囲内である。

0087

本発明は、以下に示す実験的詳細からよりよく理解されよう。しかし、議論された具体的方法及び結果が本明細書の例示に過ぎず、以後に示される特許請求の範囲においてより完全に記載されることは、当業者に即座に認識されよう。

0088

実験的詳細
レセプター:リガンド複合体の連続した構造的特徴づけの必要性。イムノグロブリン(Ig)のメンバー、TNF/TNFR、GPCR、ケモカイン及びレセプターキナーゼスーパーファミリーをはじめとする広範囲生体分子が、セクレトームの系統的な構造的特徴づけの中心的な到達目標である。以下に、最適なT細胞機能の基本的シグナルを提供するイムノグロブリンスーパーファミリー(IgSF)のサブセットであるCD28レセプターファミリー(即ち、CD28、CTLA−4、ICOS及びPD−1)[41〜43]を、記載する。これらのシグナル伝達レセプターは、構造的特色を共有し、関連の細胞表面リガンド(例えば、B7−1、B7−2、ICOS−L、PD−Ll及びPD−L2)を類似の相互作用様式で認識する(図1)[44、45]。例えばCD28とB7−1及びB7−2のエンゲージメントは、T細胞の活性化を誘導し、CTLA−4による同じB7リガンドのエンゲージメントは、阻害性のシグナルをもたらす。誘導性共刺激レセプター(ICOS)は、ICOS−Lを結合させる際にさらなる重要な陽性シグナル(即ち、共刺激)をもたらし、PD−1と、2つのB7様リガンド、つまりPD−L1及びPD−L2のいずれかとのエンゲージメントは、さらなる阻害性経路を始動させる(即ち、共抑制)。この実験室から得られた幾つかを含むこれらの分子及び複合体の構造は[28、35、46−48]、図1に要約した通り、根本的なメカニズム特性(例えば、オリゴマー状態、結合価、リガンド特異性など)、並びに共刺激及び共抑制シグナルに必要となる全体的組織的原理を定義する上で手助けとなった[45]。

0089

これらの構造は、基本的な生物生理学的及び組織的特色を定義すること以上に、新規生化学的試薬及び特有のメカニズム情報のモデルシステムを生成するための基礎をもたらす。例えば、PD−1:PD−L2複合体の本明細書に開示された構造により誘導されて[35]、野生型の親和性により突然変異体ネズミPD−L2に結合するがPD−L1とは相互作用を示さない突然変異体ネズミPD−1レセプターを作製した。これらの知見に基づいて、正常な生理作用及び疾患における2つのリガンド関連シグナル伝達経路のメカニズム上の役割精査する前例のない機会を提供する得るIg融合タンパク質及びノックインマウスモデルの作製を、本明細書に開示している(図2)。同じく、この複合体の構造に基づき、ヒトPD−1レセプターの単一の点突然変異体を、それぞれヒトPD−L1及びPD−L2に関して50倍及び30倍高い親和性により作製した(非公開のデータ)。この試薬は、特有の治療機会を提示し得る新規な高親和性化学種となる(以下参照)。これらの例から、そのようなレセプター:リガンド構造の標準をはるかに超える値と、生物学的見識及び新しい治療機会のために活用され得る手法が強調される。

0090

新しい重大なレセプター:リガンド相互作用は、なおも定義づけされている。非常に多くの研究が行われたレセプターのCD28ファミリーの中でもこの適用に特に関連するさらに重要な相互作用は、ごく最近になってようやく発見された。B7−1は、PD−L1に結合して、二方向性の阻害シグナルをもたらすことが実証されたが、ICOS−Lは、CD28及びCTLA4の両方に結合し、CD28:ICOS−L相互作用がヒトT細胞活性化に必須であることが実証された[49、50]。これらの交差的及び競合的相互作用により、シグナル伝達経路の非常に複雑なネットワークが得られる。単一の新しいレセプター:リガンド対の発見でさえも、T細胞機能、ヒトの生理学的作用及び疾患に関連するシグナル伝達経路のメカニズムの理解に著しい影響を及ぼし得るため、これらの例から、レセプター:リガンド相互作用の全レパートリーを系統的に定義する価値が強調される。

0091

レセプター:リガンド複合体の治療的関連性。重要なこととして、多くの細胞表面分子及びそれらに関連する結合パートナーは、広範囲のヒト疾患処置するためのシグナル伝達経路を意図的に調整するための実に優れたターゲットである。細胞表面の免疫レセプター及びリガンドをターゲットとする機能阻害抗体は、免疫反応を操作して感染疾患自己免疫疾患、及び悪性腫瘍を処置するタンパク質治療薬の重要な分類である。最も主要な例としては、包括的な免疫刺激をもたらすCTLA−4阻害性レセプターへの機能阻害mAbであり、2011年3月に末期メラノーマの処置のためにFDA認可を受けている、ヤーボイ(Yervoy)(商標)(ブリストルマイヤー・スクイブ(Bristol Myers Squibb))が挙げられる[51]。これらの免疫レセプターは、ターゲットであるだけでなく、それ自体が強力な治療薬である。例えばオレンシア(Orencia)(商標)(BMS)として販売されるCTLA−4の可溶性のタイプは、B7リガンドへの結合をめぐってCD28と競合し、CD28関連刺激経路を阻害する。CD28刺激の阻害は、包括的免疫抑制をもたらすため、オレンシアは、関節リウマチをはじめとする自己免疫疾患のための先進的処置となった[52]。特に注目されるのは、2つの点突然変異を有するオレンシアの可溶性CTLA−4変異体であるベラセプト(Belatacept)(商標)(BMS)である。ベラタセプトは、急性腎移植片拒絶の予防用に2011年11月にFDAに認可されており、既存の処置と同等の効能を示し、突然変異の結果、副作用及び毒性を大幅に低減している。とりわけベラタセプトは、B7リガンドへの結合活性において2倍の上昇しか有さないが、その生物学的能力においては10倍の増強を示す[26、53]。そのような知見から、新規な治療薬の開発を支援する分子的洞察増進するために、一次共刺激分子及びそのコグネイト複合体の構造的及び生化学的分析を行うための継続的役割が支援される。これらの原理を、セクレトーム全体に概括することができる。

0092

提案されたハイスループット技術の実現は、例えばヒトセクレトームに関連する相互作用において、使用のための強力な研究ツールをもたらし、ウイルス、細菌、真菌及び寄生虫疾患に関連する細胞外宿主病原相互作用の範囲を定義し(例えば[54])、宿主:病原相互作用を同定する。加えて近年の証明から、多数の「表面上の」細胞質タンパク質もまた、細胞外機能を有することが示唆されている[55〜59]。非古典的な分泌メカニズム(即ち、シグナル配列非依存性分泌)は、継続して記載されており、考慮すべき研究対象である[60、61]。注目すべきこととして、これらの非古典的分泌タンパク質の多くの細胞表面レセプターは、同定されていない。

0093

哺乳動物セクレトームに関連する相互作用を定義することの大きな価値は、古くから認識されていて、小規模生体工学団体、大規模な製薬団体及び学術的機関から少なからぬ注目を集めてきた。学術機関の検査室から始まった試みは、非常に小規模に実施されており[62、63]、最も卓越/発展した例には、表面プラズモン共鳴技術を利用して直接結合分析のために1000を超えるIg融合タンパク質のライブラリを作製する相当な量の供給源を開拓したジーンテック(Genetech)、ファイブ・プライムセラピューティクス・インコーポレーション(Five Prime Therapeutics, Inc.)及びジェネンテック(Genentech)の貢献がある。これらの努力により、Igスーパーファミリーのメンバーの新しいリガンドであるBTLA及びTIGITが発見された[64、65]。個々のターゲット(例えば、TIGIT)がライブラリの各メンバーに対して個別にスクリーニングされる必要があるという条件があるならば、このアプローチは、真のハイスループットな実現に求められる特色が欠けている。ジーンテックは、近年に、その中で約700の分泌タンパク質が固体支持体上に個別に固定されたタンパク質アレイを記載しており、このアレイは、続いて、多価試薬を用いてスクリーニングされて、約90のヒトIg融合タンパク質を個別に表示する[66]。このプラットフォームは、B7−1とNGFRとの予想外の相互作用をはじめとし、新しく意外なレセプター:リガンド相互作用の発見を裏づけた。

0094

これらの「アレイによる」アプローチとは異なり、ファイブ・プライム・セラピューティクス・インコーポレーションは、より「総当たり的な」アプローチを採り入れて、分泌タンパク質の約3400の構築物と、膜貫通タンパク質のエクトドメインを、293のT細胞内で個別に発現させた[67]。これらのタンパク質を、広範囲の細胞株において、免疫及び心臓血管機能だけでなく癌の増殖に関連する代謝、転写及び増殖反応調査する30の別個のHTPアッセイで検査した。これらの功績により、それまで特徴づけられていなかったタンパク質IL−34が、(表面上は)はっきりとした特徴のあるコロニー刺激因子1レセプターのリガンドであるという実証が得られた。この研究は、分子(例えば、IL−34)をデオーファナイズするための要件の最も重要な例であり、十分に特徴付けされた細胞表面分子でさえ、思いもよらぬ相互作用を有し得るという事実を明示している。

0095

レセプター:リガンド相互を同定するためのこれらのハイスループットなアプローチは、新しい基本的な生体メカニズムを発見して新しい治療戦略を得るための潜在能力を含むことから、生物科学において最もエキサイティング最新開発の一部である。しかし幾つかの理由から、これらの研究は、望まれるであろう広範囲の影響を実現しない可能性がある。第一に、これらのアッセイに求められる莫大な数の分泌タンパク質/Ig融合物を作製する能力が、プロテインストラクチャー・イニシエーティブ(Protein Structure Initiative)により後援された機関など、最も意欲的な学術的検査室の能力さえも超えている。さらに、タンパク質を精製できない例、貯蔵及びその後の操作の間に不安定性を示す例、又は非好適な溶解挙動(例えば、一般にはIg融合タンパク質を悩ます凝集)を示す例では、これらのアプローチの全てが実現不能である。ファイブ・プライム・セラピューティクスのスクリーニングの場合、選択された細胞系スクリーニングに含まれない生物学的機能を有するタンパク質(又はコグネイト結合タンパク質)は、相互作用を生じないことになる。特に注意すべきこととして、これらのアプローチの全てが、GPCR、トランスポーター及びチャネルをはじめとする内在性膜タンパク質の最も重要な分類の一部と適合性がなく、それはこれらのタンパク質が一般に、機能的に活性の材料のハイスループット精製と適合性がなく、アレイ作製の物理的工程に耐容できないためである。最後に、そしておそらく最も重要なこととして、これらの商業的業績から報告された結果は、一般大衆への販売に許容され得ると思われる相互作用のみを表すが、大多数の「非科学的要因がこれらの決定に影響を及ぼしていて、これらの重要なデータの実質的割合が決してパブリックドメインにならないことは、ほぼ確実である。

0096

高分解能構造の発見、生化学的分析及び創薬のために、例えば哺乳動物セクレトームを含む相互作用の入手可能な効率的ハイスループット同定のための3種の技術を、本明細書に開示している。開示された技術は、既存の方法を超える数多くの利点を示し、1)細胞マイクロアレイ形式での発現によりタンパク質の全分類(GPCR及びトランスポーターなどのマルチスパン型内在性膜タンパク質に加え、インテグリンなどの多成分レセプターなど)の系統的発現が可能であり;2)細胞マイクロアレイの発現は、DNAのみ(即ち、発現ベクター)を必要とし、精製タンパク質そのものを必要としないため、取り扱い性が高く;3)その技術は、全てが直接の物理的相互作用の検出に基づいており、そのため生物学的機能の任意の知識を必要とせず;4)フローサイトメトリーに基づく方法は、ベイトプレイの両方を独立した識別可能な細胞の表面で発現させることができ、こうして精製タンパク質の全ての要件が排除され;5)分泌タンパク質発現細胞のディープシークエンシング及びバーコード化ライブラリと連結した磁気分離を実行することで、潜在的レセプターのパネル全体に対する多くの(全ての)リガンドの大量に並行したインターロゲーションが得られる。

0097

細胞表面のタンパク質間相互作用のハイスループット同定のための細胞マイクロアレイの開発:細胞マイクロアレイ技術は、単一のクエリーリガンドに対する細胞表面レセプター(即ち、セクレトーム)のパンゲノムライブラリを系統的にスクリーニングするようになっている。このアプローチは、精密なアレイ形式で、生存する宿主細胞の環境下にあるレセプターを大多数に示す。潜在的なレセプター構築物のライブラリを効率的にスクリーニングするために、細胞マイクロアレイ技術[68、69]を適合させることに成功した。各発現構築物(例えば、CMVプロモータを介した発現を誘導するpEGFP−N1バックボーン及び他の蛍光変異体に基づくプラスミド)を、ガラス表面に個別に「固定」して、ライブラリ分子の発現アレイを作製する。哺乳動物細胞は、トランスフェクション試薬(例えば、脂質を基にした試薬)の存在下でプリントされたcDNAの上に播種されると、トランスフェクトされるようになり、個々のクラスターがライブラリの異なるメンバーを発現する生存細胞アレイが得られる(図3)。(プリントされたcDNAの間で成長する細胞は、トランスフェクトされず、「黒色」のままである。)これらの発現アレイは、その後、精製された蛍光タグのあるクエリータンパク質でチャレンジされる。洗浄して非結合リガンドを除去した後、陽性の相互作用を、蛍光の関数としてスコアする。各構築物は、マイクロアレイの既知の位置に「固定」されるため、陽性の「ヒット」を、直ちに相互作用パートナーに相関させることができる。

0098

細胞マイクロアレイのプラットフォームを、PD−1:PD−L1相互作用を利用して検証した(Kd約5.5μM)。PD−L1のGFP融合物又はGFPのみのいずれかを発現する細胞の交互の列からなる生存する細胞マイクロアレイを、作製した(図4A)。図に示す通り(図4の左端)、GFP対照は、細胞質内で発現され(緑色の丸)、PD−L1に融合されたGFP(緑色の輪)は、膜に配置されている(細胞質GFP構築物の発現レベルが高いため、PD−L1−GFPではより低い絶対GFP蛍光が観察される)。これらのアレイを、PD−1エクトドメインの赤色アレクサ594結合二価Ig融合物(即ち、Fc融合物)でチャレンジすることにより、コグネイトPD−L1リガンドを特異的に発現するスポットが、正しく同定された(図4B/C)。これらの実験から、レセプター:リガンド複合体の同定に関する細胞マイクロアレイ技術が、明確に実証される。図5に、異なるタンパク質相互作用(PD−1:PD−L2、CTLA−4:B7−1及びCD200R:CD200)の範囲に関する細胞マイクロアレイ技術が示され、これらの結果から、細胞マイクロアレイのプラットフォームの広範囲での適用性がさらに確証され、このアプローチの信号雑音比及び特異性が強調される。

0099

Igスーパーファミリー(IgSF)に属するネクチン/ネクチン様ファミリーの14のメンバーを、同様に検討した。これらのタンパク質の少なくとも10種が、同種親和性相互作用を示し、ネクチンファミリーのメンバーの間には、少なくとも20種の異種親和性相互作用が存在する[70〜72]。ヒトIgSFの全体を含む約500のエクトドメイン及び分泌タンパク質もまた、このシステムに供試した。これらの実験において、IgSFの各メンバーの発現ベクターをプリントして、マイクロアレイを作製し(即ち、各スポットはIgSFの1つのメンバーを表す)、特異的なIgSFメンバーのIg融合構築物でプローブする。IgSFメンバーの大部分は、IgSFの他のメンバーと結合するため、これにより、IgSF内で新しいレセプター:リガンド相互作用を定義するための絶好の機会が得られる。癌の生物学及び自己免疫疾患におけるそれらの顕著なメカニズム的及び治療的重要性に基づけば、IgSFメンバーであるB7−H4[73〜80]、VISTA[81]、B7−H3[74、79、82〜85]、LAG−3[86−90]及びブチフィリンファミリーの10種のメンバー[91〜94]のリガンドの同定も、保証される。広範囲のB7の他のメンバー、癌胎児性抗原関連細胞接着分子CEACAM)[95]及び白血球レセプター複合体[96]ファミリーをはじめとするIgSFの他のメンバーが、候補となるターゲットである。IgSFを多く含む画分の発現試薬を、作製及び検証することに成功した(図6)。

0100

TNF及びTNFRスーパーファミリーのメンバーの全てが、このプラットフォームの一部になることができ、これらのタンパク質の全てが、重要なメカニズム及び治療のターゲットであり、II型膜タンパク質(即ち、TNFスーパーファミリーのメンバー)である。その技術は、GPCR、Toll様レセプター、増殖因子レセプター、インターロイキン、インターロイキンレセプター、イオンチャネルなどをはじめとするセクレトーム全体に適用可能である。

0101

クローニング:必要となるクローニングテンプレートの多数へのアクセスを、利用することができる。例えば、NYSGRCは、オープンバイオシステムズ(OpenBiosystems)から得たヒト哺乳動物ゲノムコレクション(MGC)cDNAセットの全体を管理しており、これらのクローニングテンプレートは、自由に入手することができる。好ましい実施形態において、高効率のライゲーション非依存性クローニング(LIC)[97]が、発現ライブラリの作製に用いられ、該当する遺伝子が挿入された後、膜貫通アンカー続き、そのC末端(I型膜タンパク質)で細胞質局在化GFP発現レポーターに共有結合的に融合される(図4及び6)。近年になり、LICクローニングを実行することで、大規模な構造的ゲノム(nysgrcオーガニゼーション(nysgrc.org))及び機能的ゲノム(エンザイムファンクション・オーガニゼーション(enzymefunction.org))のプログラムのために過去18ヶ月にわたり15,000を超える配列検証された構築物の作製が支援された。その方法は、上記のライブラリを迅速に作製するために必要となるハイスループットな分子生物学のための自動化された液体処理ロボット、例えばバイオメックFxP(Biomek FxP)リキッドハンドラー及びパーキンエルマーEP3(Perkin-Elmer EP3)ロボットにより補助されている。必要となる発現ベクターの全てが、即座に作製される(図6)。

0102

クエリータンパク質の高品質なIg融合構築物の作製:ハイスループットな一過性トランスフェクション及びレンチウイルス誘導性プラットフォームが、分泌タンパク質、及び特にIg融合タンパク質の作製のために樹立された。図12に、近年作製された多数の突然変異体PD−L1 Ig融合構築物が示されている。このプラットフォームは、デイダラス(Daedelus)システム[98]に基づいており、1週間あたり48のレンチウイルスを作製する能力を有する。さらに無数の分泌タンパク質及びエクトドメインが、効果的に作製されて、メカニズムの研究[21〜23]及び治療用途[24〜27]に関して可溶性Ig融合タンパク質として用いられている。この卓越した文献により、非ネイティブドメインへの共有結合的融合が有害作用を有さず、広範囲の分泌タンパク質及びエクトドメインと適合性があることが実証される。

0103

細胞マイクロアレイにおける機能的な形質膜局在化GFP融合物の発現:天然の内在性膜タンパク質は、細胞マイクロアレイスクリーニングの環境下で、ネイティブの膜貫通要素を利用して内在性膜タンパク質のI型とII型を識別する問題を回避する。重要なこととして、Igのメンバー、TNF/TNFR[l−3]、GPCR[4−6]、インテグリン[7]及びトランスポーター[8]スーパーファミリーをはじめとし、生物学的に関連する蛍光タンパク質融合物(例えば、GFP融合物)の数多くの例が、報告されている。細胞マイクロアレイについては、分泌タンパク質が、続くプロービングのために細胞表面に固定される膜貫通へリックスを添加することにより、内在性膜タンパク質中に効果的に遺伝子操作することができる。選択的スプライシング及び/又はシェディング(即ち、タンパク質分解)により生物学的に重要な膜固定及び分泌形態を有する数多くのファミリー由来の数多くのタンパク質の存在を基にすれば[9〜19]、繋ぎ留めることは問題にならない。さらに、多数の分泌タンパク質(例えば,IL−2及びGM−CSF)を、シングルスパンの内在性膜タンパク質として意図的に操作して、新規な治療戦略(例えば、ワクチンの設計)を得た[20]。

0104

幾つかのレセプターは、コグネイトリガンド(例えば、T細胞レセプター、インテグリン)への結合活性を示すために、複数の成分を必要とする。適宜、これらのより複雑化したレセプターは、細胞マイクロアレイの1つの位置で複数の成分を同時発現させることにより、取り組まれている(図7)。

0105

マイクロアレイの提示用に選択された細胞株:細胞マイクロアレイ技術は、HEK293細胞により確固として樹立された。HEK293細胞により内在的に発現される細胞表面タンパク質に結合するクエリータンパク質を識別する場合、全てのマイクロアレイ中に存在する非トランスフェクトの対照細胞(即ち、形質膜局在化タンパク質についてコードしている発現ベクターを受容していないそれらの細胞)への結合は、簡便な対照として働く。しかしほとんどの例では、強力なCMVプロモータにより誘導された過剰発現のレベルを飽和させることが、細胞表面発現の低い内在レベルを圧倒するであろう。その上、適切な統計方法で、シグナル結合イベントを統計的に同定することができる。これらの統計解析を補助するために、全ての発現ベクターを、細胞マイクロアレイにおいて二重にプリントすることができる。重要なこととして、広範囲の代替的細胞株を、マイクロアレイにおいて「レスキュー宿主株」として利用することも可能である。例えばショウジョウバエS2細胞は、Sabatiniにより、マイクロアレイ形式でのゲノム規模の機能欠失試験に用いられた[99、100]。

0106

結合活性及びダイナミックレンジ:二価Ig融合物は、中等度の親和性(即ち、PD−1:PD−L1;Kd=5.5μM)での相互作用の同定に効果的であった。PD−L1発現細胞をより高い結合価のB7−1修飾マイクロビーズでチャレンジすることで、フローサイトメトリーを基にした実験において、レセプター:リガンド結合の旺盛な動員(robust recruitment)及び特異的な同定が可能になる(図9)。この比較により、リガンドの結合活性上昇が実験的に測定可能な潜在的レセプター:リガンド相互作用のダイナミックレンジを拡大して、プリントされた細胞マイクロアレイへの結合を検出する能力が改善する、という見解が裏づけられる。親和性が低い場合、マイクロアレイを、例えばIg融合タンパク質などで修飾された結合活性の高い多価マイクロビーズでプローブすることが、有用となる。

0107

一過性にトランスフェクトされた細胞とのより高い結合活性:先に記載された実験は、生存する細胞アレイを精製されたクエリーリガンドでプローブして、最終的には実験の負担を押し分けてクエリータンパク質の生成及び標識に向かわせることを含む。容易さ、プラットフォームの有用性及びスループットを促すために、クエリータンパク質を細胞表面で発現する接着性の低い浮遊培養適合哺乳動物細胞株(即ち、HEK293フリースタイル(Freestyle)(インビトロジェン(Invitrogen))[101])を用いて、細胞質C末端mCherryレポータータンパク質(又は他の適切な蛍光タンパク質)と融合された単一膜貫通へリックスにより固定することができる。mCherry(赤色)浮遊細胞は、その後、固定された緑色の「レセプター」細胞をアレイ上でチャレンジするために用いられる。GFP(例えば、マイクロアレイに配置されたレセプター)及びmCherry(例えば、浮遊するクエリーリガンド)の両方を含む共存細胞のスポットにより、正のスコアが得られる。細胞環境でクエリーリガンドを発現させれば、クエリーリガンドの精製及び標識の負担が取り除かれ、GPCRなどのタンパク質に不可欠のネイティブ状態により近い環境にクエリータンパク質を維持するという追加の利点を有する。非特異的結合及びバックグランドに取り組むためには、以下のことに留意する。細胞マイクロアレイでの各「スポット」は、単層の非トランスフェクト細胞のうちの定義された遺伝子産物を過剰発現する細胞のクラスターを表している。観察されたバックグランドは、マイクロアレイの単層の非トランスフェクト細胞との非特異的相互作用から生じており、蛍光検出の前にマイクロアレイを激しく洗浄するという一般的な不可能を伴う。洗浄の困難に抵抗するために単層の接着を高めること、又は細胞を明確な境界により特別に画定されたエリアに空間的に制限して堆積させることが、これらの問題を緩和する可能性がある。マイクロアレイの環境でスポットされた細胞の局在的接着を改善するために、機能的な細胞表面常在性単鎖アビジン(scAvidin)を安定発現するHEK293細胞株を、非古典的分泌システムを利用して遺伝子操作して、scAvidinを形質膜外層内に誘導して固定することに成功した(データは示さない)[102]。この安定した細胞株は、非細胞透過性アレクサ594を標識したビオチンに特異的に結合し、この戦略は、より困難な洗浄ステップが望ましい場合に細胞をアレイ全体に固定するのに用いることができ、又はビオチンコンジュゲートの部位特異性プリンティングを介して細胞を画定されたエリアに特異的に繋ぎ留めるのに用いることができる。両者のシナリオは共に、バックグランドシグナルを低減することになる。

0108

細胞マイクロアレイの統計解析:高度に有意な相互作用は、肉眼で即座に識別できるが(例えば、図4及び6)、統計的に有意なより弱い相互作用を同定するためには、好ましくは適切な統計基準を適合させる。

0109

細胞表面のタンパク質間相互作用のハイスループット同定のための自動フローサイトメトリー技術。フローサイトメトリーを利用した特異的レセプター:リガンド相互作用を決定するための強力な代替法も、開示する。このプラットフォームにより、広範囲の結合活性を有する親和性プローブ(即ち、二価Ig融合物、高結合活性のマイクロビーズ及び非常に高い結合活性で一過性にトランスフェクトされた細胞)の容易な検査が可能になる。Ig融合タンパク質の使用は、先に記載された実験と概念が類似している。新しいレセプター:リガンド相互作用の発見へのマイクロビーズ及び一過性トランスフェクト細胞の有用性を、以下により完全に記載する。

0110

マイクロビーズに基づくアプローチを、先に記載されたのと同じPD−1:PD−L1相互作用により実証して、PD−L1:B7−1相互作用を含めることにより拡大する。図8は、マイクロビーズ実験の全体的戦略を示している。図9は、PD−1又はB7−1Ig融合タンパク質のいずれかを負荷されたマイクロビーズと、形質膜に局在化するPD−L1:mCherry融合タンパク質を発現するHEK293細胞との高度に特異的な相互作用を示している。これらの実験から、複数のタンパク質(例えば、PD−1及びB7−1)がマイクロビーズの提示に向けて修正可能であり、予測され得る高い信号雑音比を実証することが示された(即ち、細胞質GFPのみを発現する細胞により検出される非常に低いバックグランド結合が存在する)。これらの原理証明実験により、レセプター:リガンド相互作用を定義するためのフローサイトメトリー分析と連結したマイクロビーズ提示の有用性及び能力が強調される。細胞−マイクロビーズアプローチに関して記載されたのと同じPD−L1相互作用を利用して、細胞間フローサイトメトリーアプローチをさらに示す。マイクロビーズ提示は、Ig融合タンパク質に対して高い結合活性を与え、真核細胞の形質膜上でのクエリータンパク質の発現は、弱いレセプター:リガンド相互作用を検出するためのより大きなレセプター密度、有意に高い結合活性、及びダイナミックレンジの拡大を提供する。

0111

以下のものを、浮遊培養適合HEK293細胞において個別に発現させた:1)mCherry融合物としての全長PD−L1、2)GFP融合物としての全長PD−1、3)細胞質mCherry、及び4)細胞質GFP。個別及び混合集団のフローサイトメトリー分析から、PD−1を発現する細胞及びPD−L1を発現する細胞が両者とも存在する場合のみで、特異的細胞間相互作用を提示するシグナルの有意な増加(約60倍)が明確に実証された(図10)。さらなる陰性対照として、PD−1もまたmCherry融合物として発現させ、予測通りPD−1は、それ自体では相互作用しなかった(データは示さない)。マイクロビーズ分析と同様に、細胞間アプローチは、一過性発現されたHEK293細胞からのPD−L1−mCherryとB7−1−GFPの相互作用も実証した(データは示さない)。このアプローチは、PD−1、PD−L1、B7−1タンパク質ファミリーとは無関係のCD200とCD200−レセプター(CD200R)の予測された相互作用も明確に解明したため(図11)、概ね有用性があると思われる。

0112

これらのフローサイトメトリーアプローチは、先に記載されたネクチンファミリー内の同種親和性及び異種親和性相互作用をはじめとし、他の公知T細胞共刺激レセプター:リガンド対に適用可能である(図5)。マイクロビーズと一過性トランスフェクトHEK293細胞は両者とも、公知の免疫レセプターを使用して、Igスーパーファミリー、TNF/TNFRスーパーファミリー全体に及ぶ結合を探査する方法にチャレンジして、究極的にはこれらの実験をセクレトーム全体の探査に拡張するのに用いることができる。

0113

生化学的機能の精査:多数の突然変異体分子をスクリーニングすることにより、マイクロビーズ−細胞及び細胞間相互作用を、複雑な生化学的機能の精査に用いることができる。これらの可能性は、PD−1及びB7−1に関して広範囲の親和性を示すPD−L1点突然変異体と、PD−1又はB7−1のいずれかに専ら結合する特に重要なPD−L1点突然変異体を作製することにより実証された。これらの研究は、多数の(即ち、>100の)PD−L1突然変異体−mCherry融合物で個別に一過性トランスフェクトされたHEK293細胞株の作製を利用した。これらの細胞を、野生型PD−1Ig融合タンパク質若しくは野生型B7−1 Ig融合タンパク質で修飾されたGFP負荷マイクロビーズ、又は形質膜に局在化された野生型PD−1−GFP若しくはB7−1−GFP融合物で一過性にトランスフェクトされたHEK293細胞のいずれかに結合する能力について、フローサイトメトリーにより探査した。特に留意されることは、マイクロビーズアッセイにおいて結合がない複数の突然変異体が、細胞間形式の環境下で有意な結合を示す、という観察であった(例えば、K124A及びK125A)(図12)。この差異は、細胞表面発現に関連する高い結合価/結合活性に直接寄与する可能性があり、一定範囲の結合活性を有するマルチプルプラットフォームの価値を際立たせている。これらの研究により、PD−1(G119A、G120A)又はB7−1(D122A、Y123A)のいずれかに特異的に結合する突然変異体PD−L1 Ig融合タンパク質の作製が得られ(図12)、PD−1及びB7−1の認識を担う、別個であるが重複したPD−L1表面のマッピングを提供し(図示しない)、これらの特有の試薬により、哺乳動物の免疫性へのPD−L1:PD−1及びPD−L1:B7−1相互作用の異なる寄与を定義することができた。これらの結果により、マイクロビーズ−細胞及び細胞間相互作用プラットフォームの選択性、有用性及び相補性が強調される。さらに、これらのPD−L1突然変異体相互作用でのKdの継続的定量測定(例えば、表面プラズモン共鳴)が、結合親和性に関連して、これらのマイクロビーズ−細胞及び細胞間のプラットフォームだけでなく、細胞マイクロアレイのプラットフォームの感受性を評価する際の支援となるであろう。

0114

スループットの増大。上記の通り実施された研究は、ユーザーによる一定した注意が必要となる「ワンオフ」形式で、1分あたりおよそ1試料という高くないスループットを支援するBD FacsAria IIIを利用して実施された。これらの方法は、ハイスループットなスクリーニング利用、例えばインテリサイト(Intellicyt)TMHTFCシステムを支援する、96/384ウェルプレート形式などの他のシステムで実施することができる。インテリサイトTMは、ハンズフリー方式で94ウェルプレートを3分間/384ウェルを12分間のスループットで支援する。このフローサイトメトリーを基にした方法は、マルチウェルでのサイトメータ及び完全自動組織培養ロボットを利用して実施される場合には、大規模レセプターデオーファニング実験に必要となるハイスループットを提供する。該方法で使用可能なシステムの他の例としては、パーキンエルマー(Perkin Elmer)のセル::エクスプローラ(Cell::Explorer)、完全自動化された組織培養によるリキッドハンドラー、ジェイナスワークステーション(Janus workstation)、リコニック(Liconic)振とうインキュベータエンビジョン(Envision)プレートリーダーが挙げられ、それらの全てが、例えば滅菌性を確保するためにBSL−2バイオセイフティフード内に含まれる六軸ロボットアームを介して利用可能である。細胞の成長、培地交換、トランスフェクションなどを含む、完全実施されている自動化組織培養の能力が、効率を補助する。マルチウェル形式のプラットフォームは、任意で、立証された相互作用対(PD−1:PD−L1、PD−1:PD−L2、PD−L1:B7−1、CTLA−4:B7、CD200R:CD200;図4、6、10、11)に加え、PD−L1突然変異のパネル全体に対しても評価することができる(図12)。これは、先に記載されたIgスーパーファミリーの全てのメンバー、及び究極的にはセクレトーム全体に拡張することができる。多くの検査室が、細胞間の相互作用がFACS分析により即座に検査され得ることを示してきたが(図10及び11)、これらの業績が全てロースループットな性質であり、本明細書に記載された利点を付与する専用のスクリーニングに容易に移行し得ないことに留意することが重要である。

0115

細胞表面のタンパク質間相互作用の高多重化同定のための磁気捕捉技術及び次世代シークエンシングの適合:本明細書に記載された別のプラットフォームは、特異的レセプター:リガンド相互作用[103]及び大規模に並行する次世代シークエンシング(例えばイルミナ(Illumina)/454[104−106])の結果、形成された細胞−マイクロビーズ(又は細胞間)コンジュゲートを迅速に濃縮して、得られたプールをデコンボリュートする(例えば、[107〜110])磁気捕捉技術を利用している。このプラットフォームは、「ユニバーサルプライマー」を用いて増幅され、ディープシークエンシングにより即座に同定され得る独特なヌクレオチドバーコード(実施例では28ヌクレオチドであるが、他の範囲を利用してもよい)を含む発現ライブラリの各メンバーについてタグを付けた発現ベクターを活用している(図13)[107〜110]。バーコード化されたベクターのライブラリをプールして、浮遊培養適合HEK293細胞にひとまとめにトランスフェクトすることができる。プールされた発現ライブラリをクエリータンパク質と混合して(マイクロビーズ又は細胞表面提示の環境下で)、コンジュゲートを形成し、それをマルチウェル磁気分離により回収する(例えば、30分未満で24の並行した分離を実施する)。クエリータンパク質は、プールされたライブラリ中に存在するが、磁気クエリータンパク質は(マイクロビーズ又は細胞表面提示の環境下で)、大過剰に存在し、そのためプールされたライブラリ成分からの競合が排除される。濃縮されたプールメンバーからのバーコードが増幅されて、次世代ディープシークエンシング(例えば、75のヌクレオチドそれぞれの最大10,000,000の読み取り)に供されて、捕捉工程により濃縮されたバーコードを同定する。これらの濃縮されたバーコードは、次のインビトロ生化学的アプローチによる検証(SPR、ITC、SEC、FACS)のために、潜在的なレセプター:リガンド相互作用を直接同定する。その方策により、単一クエリータンパク質の結合パートナーの迅速な同定が可能になるが、スループットを大幅に上昇させてコストを削減するように即座に多重化することができる。例えば組織培養の自動化を利用して、IgSFの500のメンバーのそれぞれを個別にクエリーとして使用し、各クエリーから捕捉されたコンジュゲートを、マルチウェルプレートの別個のウェルに回収することができる。各クエリータンパク質の候補となる相互作用物質をこのように物理的に分離することで、「複合体」プライマーを増幅ステップで使用することができる(即ち、各ウェルが独特なプライマーセットを受容し、そこでその2つの「ユニバーサルT7プライミング配列」が、さらなる8つの独特なウェル特異性ヌクレオチドに挟まれる)。複合体プライマーの使用により、特定のウェルに対応するクエリータンパク質との相互作用により濃縮されたそれらのライブラリメンバー(28のヌクレオチドコアバーコード)の特異的同定が可能になる(さらなるウェル特異性ヌクレオチドバーコード、例えば8つのヌクレオチド)(図13)。これらの複合体プライマーを用いた各ウェルの別個の増幅の後、アンプリコンをプールして、単一のディープシークエンシングを行ってデコンボリュートする。これにより、IgSFの各メンバーに割り付けられた独特なヌクレオチドバーコードに基づき、ライブラリの相互作用メンバーが同定される。これらの相互作用物質は、各ウェルに特異的な特有の(例えば、8つのヌクレオチドの)バーコードにより特異的クエリータンパク質の結合パートナーとして同定される。

0116

磁気捕捉/濃縮:細胞−マイクロビーズコンジュゲートの環境下では、細胞濃縮でミルテニー(Miltenyi)システムを使用することが、正攻法である[103]。細胞濃縮のために50nm磁気ビーズを使用することが好ましいが、制約がある。図14に、コグネイトレセプター:リガンド相互作用の結果、形成された特異的細胞間コンジュゲートを分離/濃縮するための磁気マイクロビーズの使用が実証されている。磁気分離により細胞間コンジュゲートのハイスループット捕捉に向けてこのアプローチを作製するために、膜貫通固定タグ(例えば、FLAG)を表面で安定発現する細胞株の中でクエリータンパク質を発現させて、抗FLAGを負荷した磁気ビーズにより捕捉を可能にする。この方策は、マイクロビーズが結合した捕捉試薬(例えば抗FLAG)が特異的レセプター:リガンド複合体と干渉するのを防ぐ。そうすれば、これらの変数が選択の収率及びストリンジェンシーに影響を及ぼすため、ライブラリプール:クエリー細胞の反応速度範囲を検査して、用いられる磁気ビーズの量を変動させることが可能である。重要なこととして、磁気マイクロビーズの捕捉は、大規模な洗浄ステップを可能にし、バックグランドを低下させる。細胞間コンジュゲートの形成に関連する非常に高い多価相互作用の強度は、相対的に穏やかな磁気分離技術と完全に適合性がある。このアプローチは、「結合」及び「非結合」イベントを決定する蛍光シグナルの測定に依存せず、ゲーティング、レーザ設定などの混乱を取り除く。

0117

信号雑音比:非特異的結合は、クエリー発現細胞株と「オフ・ターゲット」(即ち、コグネイトリガンドを発現しない細胞)の間に起こり得る。図14Bは、「レアイベント」を特異的に濃縮する磁気捕捉技術の能力を実証している(即ち、全ての可能な相互作用のうちの1.5%)。図15は、バーコードアプローチがより多くのレアイベントを検出し得るという証拠を示している。集団がコグネイトレセプター:リガンド対(例えば、PD−1:PD−L1及びCD200:CD200R)を発現する細胞の1:1混合物で構成された、典型的なバイナリー細胞間アッセイの場合、10〜30%のイベントが、典型的には陽性結合相互作用としてスコアされる(図10及び11参照)。陰性対照(例えば、GFP及びmCherry)では、典型的には約0.2〜0.5%のイベントが、結合としてスコアされる(ここでの「結合」は、GFP及びmCherryの両方が陽性となるイベントの数として定義される)(即ち、図15Aの四分区画の2番目)。

0118

発現ライブラリの環境下でコグネイトの相互作用を同定することに関連してチャレンジを特異的に評価するために、GFPを一過性に発現する107個のHEK293細胞を、PD−1 GFP融合物を発現する細胞0.02×106個(GFP陽性細胞の0.2%、全てが同じ効率でトランスフェクトされる場合には、IgSFの1つのメンバーを表す)と混合することにより、バックグランドをシミュレートした。このライブラリを、106個のmCherry(陰性対照)又はPD−L1 mCherry融合物を一過性に発現するHEK293細胞でチャレンジした。図15は、特異的なPD−1:PD−L1相互作用により、GFP:mCherryコンジュゲートの明確な濃縮が実証される(四分区画の2番目)。重要なこととして、PD−1発現細胞の濃縮のPCRによる検証は、プールされたアンプリコンをデコンボリュートするように実行されるバーコード化戦略と完全に類似している(即ち、PD−1コード配列は、本来のバーコードとして働く)。重要なこととして、図14及び15で実現された濃縮レベルは、用いられた次世代ディープシークエンシングアプローチの検出限界に完全に含まれる[113]。

0119

ヒトIgSFに属する500の遺伝子は、2つの発現ベクターのそれぞれに組み込まれ得るため(即ち、500のレセプター、500のリガンド)、PD−L1:PD−1及びPD−L1:B7−1相互作用を、図13に記載された独特なバーコードアプローチで検査して、相互作用スクリーニングに供することができる。このシステムは、潜在的レセプターのパネル全体に対する多くのリガンドの同時クエリーを実行させて、大きなクエリーリストの同時の効率的かつ費用効果のあるインターロゲーションを可能にする。このアプローチは、セクレトーム全体に及ぶことができる。

0120

本発明のさらなる態様、及びその検証を、図16〜24に実証する。

実施例

0121

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