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技術 分泌物の多細胞アッセイにおけるマイクロ流体デバイスおよびその使用方法

出願人 ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア
発明者 リシコバ,マルケタヘイリーズ,ケビンアルバートザーン,ハンズペトリヴ,オレアリカルト,ヴェロニクシンガール,アヌパムディーエーコスタ,ジェイ.,ダニエルハンセン,カール,エル.,ジー.ネルソン,ブラッドネルソン,ジュリーリサインゴ,キャスリン
出願日 2019年10月24日 (1年0ヶ月経過) 出願番号 2019-193725
公開日 2020年3月26日 (7ヶ月経過) 公開番号 2020-043856
状態 未査定
技術分野 微生物・酵素関連装置 生物学的材料の調査,分析 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード ブランク層 流体形状 コントロールチャンバ バスチャネル 特性長さ 下流チャンバ テクスチャ加工表面 微細加工構造
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図面 (20)

課題

標的エピトープに結合する抗体を分泌する抗体分泌細胞(ASC)を含む不均一細胞集団を同定するための方法の提供。

解決手段

10〜500の細胞を含む不均一細胞集団をマイクロリアクターに保持する工程であって、マイクロリアクターの中身は、標的エピトープを提示する1又は複数の読み出し粒子412、413、414を含む、読み出し粒子集団をさらに含む工程と、マイクロリアクター内で、不均一細胞集団と、読み出し粒子412、413、414とをインキュベートする工程であって、マイクロリアクターはその周囲の環境から実質的に隔離されている工程と、ASCから分泌された抗体419、423が不均一細胞集団中で標的エピトープに結合しているかをアッセイする工程と、及びアッセイする工程の結果に基づいて、不均一細胞集団が標的エピトープに結合する抗体419、423を分泌するASCを含むかどうかを決定する工程、を含む方法。

概要

背景

細胞生命の基本的単位であり、同じ細胞は2つない。例えば、遺伝子型表現型および/または形態学的特性における差異は、細胞の多様性に寄与することができる。実際、細胞の「外見的に同一の」クローン集団は、集団内の細胞間の表現型差異を提示するために示されている。細胞の差異は、生命のすべてのレベルにわたって存在している。そのレベルの範囲は、バクテリア細胞から高分化した哺乳類細胞(例えば、免疫細胞)、部分的に分化した細胞(例えば、成体幹細胞および前駆細胞)に及ぶ。細胞の状態、機能および応答における差異は、異なる履歴、異なる分化状態エピジェネティックな多様性、細胞周期への影響、確率的変動ゲノム配列の差、遺伝子発現タンパク質発現および異なる細胞の交互作用効果を含む種々のメカニズムから生じる。

発現タンパク質またはRNAの測定を含む従来のバルク細胞レベルの分析は、かなり多くの(一般的には個別のアッセイにつき1000細胞より多い)細胞を平均化して実行されている。細胞集団のこの平均化は、細胞集団内に存在する異成分を隠し、その集団内の個々の細胞の基本的な生物学的機能不明瞭にする。そのような平均化測定が不適切である多くの例がある。例えば、細胞集団の細胞プロセスにおける測定は、個々の細胞の応答によって複雑にされ、非同期である。こうして、プロセスの動的特性を不鮮明にさせている。例えば、優性遺伝子の存在、また、表現型の異なる細胞の亜集団は、集団における大多数の細胞の内部状態を反映しにくい集団測定をもたらしている。例えば、Altshuler and Wu. (2010). Cell//141, pp 559-563を参照されたし。

ユニークな細胞型の集団を単離するための既存の方法は、多くの場合、達成可能である集団の純度に制限されている。例えば、一次多能性幹細胞濃縮された集団は、ほとんど50%の優れた機能的純度を達成しておらず、しばしば10%以下の純度である。その結果、これらの細胞の分子署名は、他の細胞型から大きく、圧倒的な汚染によって隠されている。多くの細胞型は、生存、死、分化または他のいくつかの機能を促進するために、直接接触および分泌された因子の両方を介して、互いに相互作用する。そして、これらの相互作用は、大多数の細胞を含む混合物で分離し研究することが困難である。さらに、細胞は、発現されたmRNAまたはタンパク質の異なるレベルまたは異なるタイプをもたらすゲノム配列および/または細胞の状態において差異を有する。バルク集団、ユニークな細胞状態での特定の細胞、または発現されたmRNAまたは目的のタンパク質を有する特定の細胞で分析された場合は、工業的に高い価値であるが、集団から分離することは非常に困難または不可能である。

バルク集団の細胞分析の欠点を克服するために、単一細胞アッセイのプラットフォームが開発されている。例えば、マイクロ流体デバイスは、過去に単一細胞を研究するために使用されている(Lecault et al. (2012). CURR. OPIN. CHEM. BIOL. 16, pp. 381-390)。MA et al. (Nat Med, 17, pp. 738-743 (2011))は、健康なドナーおよび転移性黒色腫患者の両方から得られたヒトマクロファージおよび細胞傷害性Tリンパ球(CTLs)から複数のサイトカイン(例えば、IL-10、TNF-β、IFN-γ)を同時に測定するために単一細胞のバーコードチップを適用した。微細加工チャンバアレイはまた、免疫したヒトおよびマウスの両方から抗原特異的抗体を分泌するB細胞スクリーニングし、選択するために使用されている(Story et al. (2009). PROC. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, pp. 17902-17907; Jin et al. (2009). Nat. Med. 15, pp. 1088-1092)。このアプローチでは、単一のB細胞は、ウェル表面が捕捉抗体官能化された何万もの微細加工ウェル(〜10-100 μmの深さ)を含む表面上に配列された。3時間未満のウェル表面上での細胞のインキュベーションの後、表面は、蛍光標識された抗原を用いて洗浄され、抗原特異的B細胞を同定するためにスキャンされた。これらの細胞は、これらの細胞から抗体をエンコードする遺伝子を増幅し、配列し、およびクローン化するために、マイクロキャピラリーによってアレイからマニュアル回収された。

二相マイクロ流体デバイスは、油の流れによって分離されたサブナノリトル水滴でそれらをカプセル化することによって、単一の免疫細胞から分泌されたタンパク質の分析に適用されている(Konry et al. (2011). Biosens. Bioelectron. 26. Pp. 2702-2710)。これらの液滴は、FACSに類似するフロースルー形式で分析され、単一の細胞から分泌されたタンパク質の超ハイスループット検出のための機会を提供している。油中水型エマルジョンはまた、マイクロ流体生成のアガロースビーズにおいて共カプセル化細胞による細胞パラクリンシグナル伝達を研究するために使用されている(Tumarkin et al. (2011). Integer. Biol. 3, pp. 653-662)。マイクロ流体液滴の生成は、異なる組成物曝露されカプセル化された単一細胞の生存能力の分析を可能にすることによって、薬物スクリーニングおよび開発に使用されている(Brouzes et al. (2009). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, pp. 14195-14200)。

抗体は、感染および疾患を撃退するために、ヒトまたは動物の免疫系によって自然に産生される分子である。これは、特定の標的(例えば、タンパク質、ウイルス、細菌)を認識して結合する能力を有する抗体の膨大な多様性を生成する免疫系の固有の能力によって成し遂げられる。この比類のない特異性は、癌、自己免疫疾患、炎症、神経学および感染を含む多様な条件のために臨床的承認された治療法で、抗体が非常に強力かつ低副作用の薬を作ることである。従来の小分子薬剤と比較して、抗体は、優れた薬物動態、より少ない副作用、改善された忍容性および臨床試験で非常に高い成功率(小分子の27%対7%)を含むいくつかの利点を提供する(Reichert (2009). Mabs 1, pp. 387-389.)。これは、2012年に500億ドル、年間9%の割合で成長している世界全体の市場で、抗体が最も急成長しているクラスの薬であるという理由である(Nelson et al. (2010). Nat. Rev. Drug Disc. 9(10), pp. 767-774.)。

最適な治療特性を有する抗体、および特に、表面受容体を標的とする抗体の発見は、医薬品開発における重大なボトルネックのままとなっている。免疫化に応答して、動物は、何百万という異なるモノクローナル抗体(mAbs)を作ることができる。各mAbは、抗体分泌細胞(ASC)と呼ばれる単一の細胞によって産生され、各ASCは、一種類のmAbのみを産生する。したがって、例えば、創薬目的のための抗体分析は、単一細胞分析につながる。しかし、ASCが個別に分析されたとして(細胞のバルク集団内でない)、単一のASCは微量の抗体のみを生成するため、従来のアッセイ形式の容量で分析したとき、抗体は、かなり低濃度であり、完全に検出不能となっている。したがって、個々のASCとその分泌された抗体を研究するための新しい方法が必要とされている。本発明は、この必要性および他の必要性に取り組む。

概要

標的エピトープに結合する抗体を分泌する抗体分泌細胞(ASC)を含む不均一細胞集団を同定するための方法の提供。10〜500の細胞を含む不均一細胞集団をマイクロリアクターに保持する工程であって、マイクロリアクターの中身は、標的エピトープを提示する1又は複数の読み出し粒子412、413、414を含む、読み出し粒子集団をさらに含む工程と、マイクロリアクター内で、不均一細胞集団と、読み出し粒子412、413、414とをインキュベートする工程であって、マイクロリアクターはその周囲の環境から実質的に隔離されている工程と、ASCから分泌された抗体419、423が不均一細胞集団中で標的エピトープに結合しているかをアッセイする工程と、及びアッセイする工程の結果に基づいて、不均一細胞集団が標的エピトープに結合する抗体419、423を分泌するASCを含むかどうかを決定する工程、を含む方法。

目的

従来の小分子薬剤と比較して、抗体は、優れた薬物動態、より少ない副作用、改善された忍容性および臨床試験で非常に高い成功率(小分子の27%対7%)を含むいくつかの利点を提供する

効果

実績

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請求項1

細胞外効果を有するエフェクター細胞を含む細胞集団を同定する方法であって、1または複数の読み出し粒子を含む読み出し粒子集団を含むマイクロリアクターに、1または複数のエフェクター細胞を含む細胞集団を保持する工程と、前記マイクロリアクター内で、前記細胞集団と、前記1または複数の読み出し粒子とをインキュベートする工程と、前記細胞外効果の存在のために前記細胞集団をアッセイする工程と、前記アッセイする工程の結果に基づいて、前記細胞集団内の前記1または複数のエフェクター細胞が前記細胞外効果を発揮するかどうかを決定する工程と、を含み、前記読み出し粒子集団またはその亜集団は、前記細胞外効果の読み出しを直接的または間接的に提供することを特徴とする細胞集団を同定する方法。

請求項2

前記マイクロリアクターは、マイクロ流体チャンバである請求項1に記載の方法。

請求項3

前記マイクロ流体チャンバは、膜バルブを含むマイクロ流体構造の一部である請求項2に記載の方法。

請求項4

前記1または複数のエフェクター細胞は、抗体分泌細胞(ASC)を含む請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。

請求項5

前記1または複数のエフェクター細胞は、形質細胞B細胞形質芽球メモリーB細胞の増殖によって生成される細胞ハイブリドーマ細胞、T細胞、CD8 + T細胞、CD4 + T細胞、抗体を産生するように操作された組換え細胞T細胞受容体発現するように操作された組換え細胞、またはそれらの組み合わせを含む請求項1ないし4のいずれか1項に記載の方法。

請求項6

前記細胞集団は、約2から約500個の細胞、または約10から約50個の細胞を含む請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。

請求項7

前記細胞集団は、約2から約10個の細胞を含む請求項6に記載の方法。

請求項8

前記細胞集団は、約50から約100個の細胞を含む請求項6に記載の方法。

請求項9

前記読み出し粒子集団は、1または複数の読み出しビーズ、読み出し細胞またはそれらの組合せを含む請求項1ないし8のいずれか1項に記載の方法。

請求項10

前記読み出し粒子集団は、タンパク質またはペプチドを含む請求項1ないし9のいずれか1項に記載の方法。

請求項11

前記読み出し粒子集団は、ウイルス粒子サイトカインケモカイン神経伝達物質成長因子ホルモン、膜抽出物脂質粒子、安定化受容体、受容体の細胞外ドメイン、膜抽出物で官能化された小胞、膜抽出物で官能化されたビーズ、可溶性タンパク質として安定であるように操作されたGタンパク質共役受容体(GPCR)またはそれらの組み合わせを含む請求項1ないし10のいずれか1項に記載の方法。

請求項12

前記読み出し粒子集団の前記読み出し粒子は、約500nm未満、または約500nmから約50μmの平均直径を有する請求項1ないし11のいずれか1項に記載の方法。

請求項13

前記読み出し粒子集団の前記読み出し粒子は、約1μmから約10μmの平均直径を有する請求項12に記載の方法。

請求項14

前記読み出し粒子集団は、表面上にATP結合カセットトランスポーターABCトランスポーター)を発現する1または複数の読み出し細胞を含み、前記細胞外効果は、前記ABCトランスポーターのアンタゴニズム、前記ABCトランスポーターのアゴニズム、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞による前記ABCトランスポーターへの結合、または、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞によって分泌された分子への結合である請求項1ないし13のいずれか1項に記載の方法。

請求項15

前記読み出し粒子集団は、表面上にGタンパク質共役型受容体(GPCR)または可溶化GPCRを発現する1または複数の読み出し細胞を含み、前記細胞外効果は、前記GPCRのアンタゴニズム、前記GPCRのアゴニズム、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞による前記GPCRへの結合、または、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞によって分泌された分子への結合である請求項1ないし13のいずれか1項に記載の方法。

請求項16

前記読み出し粒子集団は、表面上にチロシンキナーゼ受容体RTK)を発現する1または複数の読み出し細胞を含み、前記細胞外効果は、前記RTKのアンタゴニズム、前記RTKのアゴニズム、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞による前記RTKへの結合、または、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞によって分泌された分子への結合である請求項1ないし13のいずれか1項に記載の方法。

請求項17

前記読み出し粒子集団は、表面上にイオンチャネルを発現する1または複数の読み出し細胞を含み、前記細胞外効果は、前記イオンチャネルのアンタゴニズム、前記イオンチャネルのアゴニズム、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞による前記イオンチャネルへの結合、または、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞によって分泌された分子への結合である請求項1ないし13のいずれか1項に記載の方法。

請求項18

前記読み出し粒子集団は、表面上に内因性酵素活性を有する受容体を発現する1または複数の読み出し細胞を含み、前記細胞外効果は、前記内因性酵素活性を有する前記受容体のアンタゴニズム、前記内因性酵素活性を有する前記受容体のアゴニズム、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞による前記内因性酵素活性を有する前記受容体への結合、または、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞によって分泌された分子への結合である請求項1ないし13のいずれか1項に記載の方法。

請求項19

前記読み出し粒子集団は、サイトカイン受容体を発現する1または複数の読み出し細胞を含み、前記細胞外効果は、前記サイトカイン受容体のアンタゴニズム、前記サイトカイン受容体のアゴニズム、前記1または複数のエフェクター細胞による前記サイトカイン受容体の結合、または、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞によって分泌された分子による前記サイトカイン受容体への結合である請求項1ないし13のいずれか1項に記載の方法。

請求項20

前記Gタンパク質共役型受容体は、ケモカイン受容体、サイトカイン受容体、クラスA GPCR、クラスB GPCR、接着GPCR、フリルドGPCR、アセチルコリン受容体メラトニン受容体メラコルチン受容体、モチリン受容体リゾリン脂質LPA)受容体、アデノシン受容体アドレナリン受容体アンギオテンシン受容体、ブラジキニン受容体カルシトニン受容体カルシウム感知受容体、カンナビノイド受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、補体成分(C5AR1)受容体、副腎皮質放出因子受容体、ドーパミン受容体内皮分化遺伝子受容体、エンドセリン受容体ホルミルペプチド様受容体ガラニン受容体ガストリン放出ペプチド受容体、受容体グレリン受容体胃抑制ポリペプチド受容体、グルカゴン受容体ゴナドトロピン放出ホルモン受容体、ヒスタミン受容体、キスペプチン(KiSS1)受容体、ロイコトリエン受容体、メラニン凝集ホルモン受容体、メラノコルチン受容体、メラトニン受容体、モチリン受容体、神経ペプチド受容体、ニコチン酸オピオイド受容体オレキシン受容体オーファン受容体、血小板活性化因子受容体、プロキネチシン受容体、プロラクチン放出ペプチドプロスタノイド受容体、プロテアーゼ活性化受容体、P2Y(プリン)受容体、リラキシン受容体セクレチン受容体セロトニン受容体ソマトスタチン受容体タキキニン受容体、バソプレッシン受容体オキシトシン受容体血管作動性腸管ペプチド(VIP)受容体または下垂体アデニル酸シクラーゼ活性ポリペプチド(PACAP)受容体、テースト1受容体、メタトロピックグルタミン酸受容体、カルシウム感知受容体、脳特異的血管新生阻害剤受容体(1、2または3)、カドヘリン受容体またはエストロゲン受容体である請求項15に記載の方法。

請求項21

前記チロシンキナーゼ受容体(RTK)は、ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3、ErbB-4、インスリン受容体血小板由来成長因子α受容体血小板由来増殖因子β受容体マストステム細胞成長因子受容体(SCFR)、コロニー刺激因子1受容体、CD135、線維芽細胞増殖因子受容体‐1(CD331)、線維芽細胞成長因子受容体‐2(CD332)、線維芽細胞成長因子受容体‐3(CD333)、線維芽細胞成長因子受容体‐4(CD334)、線維芽細胞増殖因子受容体‐6、血管内皮増殖因子VEGF)1受容体、VEGF 2受容体、VEGF 3受容体、肝細胞増殖因子受容体トロポミオシン受容体キナーゼ(Trk)A、Trk B、Trk C、エフリン(EPH)受容体A1、EPH受容体A2、EPH受容体A3、EPH受容体A4、EPH受容体A5、EPH受容体A6、EPH受容体A7、EPH受容体A8、EPH受容体A9、EPH受容体A10、EPH受容体B1、EPH受容体B2、EPH受容体B3、EPH受容体B4、EPH受容体B5、EPH受容体B6、AXL、RTKクラスIX受容体ファミリーメンバー未分化リンパ腫キナーゼ白血球チロシンキナーゼ(ALK/LTK)受容体ファミリーのメンバー、RTKクラスXI受容体ファミリーのメンバー、神経栄養性チロシンキナーゼ、受容体関連1受容体、ジスコイジンドメイン受容体、RTKクラスXIV受容体ファミリーのメンバー、RTKクラスXV受容体ファミリーのメンバー、RTKクラスXVI受容体ファミリーのメンバーまたは筋肉特異的キナーゼ受容体である請求項16に記載の方法。

請求項22

前記イオンチャネルは、GABAA受容体グリシン受容体(GlyR)、セロトニン(5‐ヒドロキシトリプトアミン)受容体、ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)、亜鉛活性化イオンチャネルイオンチャネル型グルタミン酸受容体、AMPA受容体、カイナイト受容体、NMDA受容体またはATP依存性チャネルである請求項17に記載の方法。

請求項23

前記内因性酵素活性を有する前記受容体は、受容体チロシンキナーゼ(RTK)、受容体セリントレオニンキナーゼ、受容体チロシンホスファターゼまたは受容体グアニリルシクラーゼである請求項18に記載の方法。

請求項24

前記サイトカイン受容体は、I型サイトカイン受容体、II型サイトカイン受容体、インターロイキン-1受容体、腫瘍壊死因子受容体、ケモカイン受容体またはトランスフォーミング増殖因子β受容体である請求項19に記載の方法。

請求項25

前記ケモカイン受容体は、インターロイキン‐8受容体、C-Cケモカイン受容体1型CXCケモカイン受容体、CXC3ケモカイン受容体またはXCケモカイン受容体である請求項20に記載の方法。

請求項26

前記ケモカイン受容体は、前記インターロイキン‐8受容体、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、XCR1(GPR5)、またはCX3CR1(フラクタルカイン)である請求項25に記載の方法。

請求項27

前記読み出し粒子集団は、前記読み出し粒子の均一な集団または不均一な集団である請求項1ないし25のいずれか1項に記載の方法。

請求項28

前記読み出し粒子集団は、複数の読み出しビーズを含む請求項1ないし27のいずれか1項に記載の方法。

請求項29

前記読み出し粒子集団は、複数の読み出し細胞を含む請求項1ないし27のいずれか1項に記載の方法。

請求項30

前記読み出し粒子集団は、読み出しビーズと、読み出し細胞とを含む請求項1ないし25および27ないし29のいずれか1項に記載の方法。

請求項31

前記読み出し粒子集団は、複数の読み出しビーズと、読み出し細胞とを含む請求項1ないし25および27ないし30のいずれか1項に記載の方法。

請求項32

前記読み出し粒子集団は、読み出しビーズと、複数の読み出し細胞とを含む、請求項1ないし25および27ないし30のいずれか1項に記載の方法。

請求項33

前記読み出し粒子集団または前記亜集団は、抗原またはエピトープで官能化されている請求項26ないし32のいずれか1項に記載の方法。

請求項34

前記読み出し粒子集団または前記亜集団は、抗体結合部分を含む分子で官能化されている請求項26ないし32のいずれか1項に記載の方法。

請求項35

前記抗体結合部分を含む前記分子は、プロテインA、プロテインA/G、プロテインG、免疫グロブリンを結合するモノクローナル抗体、免疫グロブリンを結合するモノクローナル抗体フラグメント、免疫グロブリンを結合するポリクローナル抗体、免疫グロブリを結合するポリクローナル抗体フラグメントまたはそれらの組み合わせである請求項34に記載の方法。

請求項36

前記複数の読み出し細胞は、前記読み出し細胞の均一な集団または不均一な集団である請求項29に記載の方法。

請求項37

前記サイトカイン受容体は、(IL)-1α、IL-1β、IL-1RA、IL18、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL17、IL-18、IL-19、IL-20、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSF)、白血病阻害因子オンコスタチンMインターフェロン(IFN)-α、IFN -β、IFN-γ、CD154、リンホトキシンβ(LTB)、腫瘍壊死因子(TNF)-α、TNF-β、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-β、エリスロポイエチン巨核球増殖および発達因子(MGDF)、Fms-関連チロシンキナーゼ3リガンド(Flt-3L)、幹細胞因子、コロニー刺激因子-1(CSF-1)、マクロファージ刺激因子、4-1BBリガンド、増殖誘導リガンド(APRIL)、分化クラスター70(CD70)、分化クラスター153(CD153)、分化クラスター178(CD178)、グルココルチコイド誘導性TNF受容体リガンドGITRL)、CD258、OX40L、CD252、TALL-1、TNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)、アポトーシスの腫瘍壊死因子弱誘導剤(TWEAK)またはTNF関連活性化誘導サイトカイン(TRANCE)のサイトカインのうちのいずれか1つの受容体である請求項20に記載の方法。

請求項38

前記読み出し粒子集団は、複数の読み出しビーズと、複数の読み出し細胞とを含む請求項27または28に記載の方法。

請求項39

前記読み出し粒子集団または前記亜集団は、前記マイクロリアクターの表面に固定化されている請求項1ないし38のいずれか1項に記載の方法。

請求項40

前記イオンチャネルまたは細胞表面受容体は、前記1または複数の読み出し細胞によって過剰発現される請求項15ないし25のいずれか1項に記載の方法。

請求項41

前記細胞集団および前記読み出し粒子集団を複数のアクセサリー粒子とインキュベートする工程をさらに含む請求項1いし40のいずれか1項に記載の方法。

請求項42

前記細胞外効果は、前記1または複数のエフェクター細胞またはそのサブセットによって分泌される分子と、前記読み出し粒子集団または前記亜集団との間の結合相互作用である請求項1いし40のいずれか1項に記載の方法。

請求項43

前記細胞外効果は、前記1または複数のエフェクター細胞またはそのサブセットによって分泌される分子と、前記複数のアクセサリー粒子の1または複数のアクセサリー粒子との間の結合相互作用である請求項41に記載の方法。

請求項44

前記1または複数のエフェクター細胞によって分泌される分子は、前記インキュベートする工程の間中、アクセサリー粒子に結合する請求項41ないし43のいずれか1項に記載の方法。

請求項45

前記結合相互作用は、抗原-抗体結合特異性相互作用、抗原-抗体結合親和性の相互作用、または抗原-抗体結合動態の相互作用であり、前記抗体は、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞によって分泌される分子であることを特徴とする請求項42または43に記載の方法。

請求項46

前記細胞外効果は、アポトーシスの調節、細胞増殖の調節、前記み出し粒子の形態学外観の変化、前記読み出し粒子内のタンパク質の局在の変化、前記読み出し粒子によるタンパク質の発現、アクセサリー粒子の生物学的活性中和、前記エフェクター細胞によって誘発される読み出し細胞の細胞溶解、前記エフェクター細胞によって誘発される前記読み出し細胞の細胞アポトーシス、読み出し細胞壊死、抗体の内在化、前記アクセサリー粒子の内在化、前記エフェクター細胞による酵素中和、可溶性シグナル伝達分子の中和またはそれらの組み合わせである請求項1ないし41のいずれか1項に記載の方法。

請求項47

前記細胞集団を実質的に単一平面内に維持する工程をさらに含む請求項1ないし46のいずれか1項に記載の方法。

請求項48

前記読み出し粒子集団を実質的に単一平面内に維持する工程をさらに含む請求項1ないし47のいずれか1項に記載の方法。

請求項49

前記インキュベートする工程は、前記細胞集団を含む前記マイクロリアクター中培地交換する工程をさらに含む請求項1ないし48のいずれか1項に記載の方法。

請求項50

前記複数のアクセサリー粒子は、タンパク質、ペプチド、成長因子、サイトカイン、神経伝達物質、脂質、リン脂質アミノ酸モノアミン糖タンパク質炭水化物、ホルモン、ウイルス粒子、抗体、抗体フラグメント蛍光基質フルオロフォアまたはそれらの組み合わせを含む請求項41に記載の方法。

請求項51

前記インキュベートする工程は、30分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間、84時間、96時間、1週間、少なくとも約30分、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約4時間、少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、少なくとも約24時間、少なくとも約36時間、少なくとも約48時間、少なくとも約60時間、少なくとも約72時間、少なくとも約84時間、少なくとも約96時間または少なくとも約1週間である請求項1ないし50のいずれか1項に記載の方法。

請求項52

前記1または複数のエフェクター細胞またはそのサブセットは、前記インキュベートする工程中、分割される請求項1ないし50のいずれか1項に記載の方法。

請求項53

前記複数の読み出し細胞またはそのサブ複数は、前記インキュベートする工程中、分割される請求項29に記載の方法。

請求項54

前記複数のアクセサリー粒子は、複数のアクセサリー細胞である請求項41に記載の方法。

請求項55

前記複数のアクセサリー細胞またはそのサブ複数は、前記インキュベートする工程中、分割される請求項54に記載の方法。

請求項56

前記複数のアクセサリー粒子は、二次抗体、フルオロフォア、サイトカインまたは蛍光基質を含む請求項41に記載の方法。

請求項57

前記複数のアクセサリー粒子は、アクセサリー粒子の不均一な集団を含む請求項41、50および54ないし56のいずれか1項に記載の方法。

請求項58

前記複数のサイトカインは、サイトカインの均一または不均一な集団である請求項41、50および54ないし57のいずれか1項に記載の方法。

請求項59

前記サイトカインの集団は、インターロイキン(IL)-1α、IL-1β、IL-1RA、IL18、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL17、IL-18、IL-19、IL-20、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、白血病阻害因子、オンコスタチンM、インターフェロン(IFN)-α、IFN-β、IFN-γ、CD154、リンホトキシン-β(LTB)、腫瘍壊死因子(TNF)-α、TNF-β、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-β、エリスロポイエチン、巨核球増殖および発達因子(MGDF)、FMS関連チロシンキナーゼ3リガンド(FLT-3L)、幹細胞因子、コロニー刺激因子-1(CSF-1)、マクロファージ刺激因子、4-1BBリガンド、増殖誘導リガンド(APRIL)、分化クラスター70(CD70)、分化クラスター153(CD153)、分化クラスター178(CD178)、グルココルチコイド誘導性TNF受容体リガンド(GITRL)、CD258、OX40L、CD252、TALL-1、TNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)、アポトーシスの腫瘍壊死因子弱誘導体(TWEAK)またはTNF-関連活性化誘導サイトカイン(TRANCE)を含む請求項58に記載の方法。

請求項60

前記複数のアクセサリー粒子は、スフィンゴシン-1-リン酸リゾホスファチジン酸またはそれらの組合せを含む請求項41および56ないし59のいずれか1項に記載の方法。

請求項61

前記複数のアクセサリー粒子は、蛍光基質または開裂されたとき蛍光になる非蛍光基質を含む請求項41および56ないし60のいずれか1項に記載の方法。

請求項62

前記複数のアクセサリー細胞は、線維芽細胞ナチュラルキラー(NK)細胞、キラーT細胞抗原提示細胞樹状細胞、組換え細胞またはそれらの組み合わせを含む請求項41および55ないし61のいずれか1項に記載の方法。

請求項63

前記複数のアクセサリー粒子は、複数のウイルス粒子を含む請求項41および56ないし62のいずれか1項に記載の方法。

請求項64

前記複数のアクセサリー粒子は、因子を誘導する複数の補体経路である請求項41および56ないし63のいずれか1項に記載の方法。

請求項65

前記細胞集団を含む前記マイクロリアクターをその周囲の環境から実質的に単離する工程をさらに含む請求項1または2に記載の方法。

請求項66

前記マイクロリアクターは、マイクロ流体チャンバであり、膜バルブまたはその複数は、前記マイクロ流体チャンバをその周囲の環境から実質的に隔離するために使用される請求項65に記載の方法。

請求項67

前記読み出し細胞の少なくとも70%は、生存能力がある請求53に記載の方法。

請求項68

前記細胞外効果は、細胞表面受容体またはイオンチャネルのアンタゴニズムである請求項15ないし25のいずれか1項に記載の方法。

請求項69

前記細胞外効果は、受容体またはイオンチャネルのアゴニズムである請求項15ないし25のいずれか1項に記載の方法。

請求項70

前記細胞表面受容体は、GPCRであり、前記細胞外効果は、GPCRのアゴニズムであり、前記アゴニズムは、細胞内cAMP又はカルシウムの増加、タンパク質レポーターの発現またはタンパク質の局在化によって測定される請求項68に記載の方法。

請求項71

前記細胞表面受容体は、GPCRであり、アンタゴニズムは、細胞内のcAMP又はカルシウムの減少、タンパク質レポーターの発現またはタンパク質の局在化によって測定される請求項69に記載の方法。

請求項72

前記細胞外効果は、前記1または複数のエフェクター細胞またはそのサブセットによって誘発される、前記複数の読み出し細胞またはそのサブ複数の細胞溶解である請求項29に記載の方法。

請求項73

前記細胞外効果は、前記1または複数のエフェクター細胞またはそのサブセットによって誘発される前記複数の読み出し細胞またはそのサブ複数の細胞アポトーシスまたは細胞壊死である請求項29に記載の方法。

請求項74

前記アクセサリー細胞の少なくとも70%は、生存能力がある請求55に記載の方法。

請求項75

前記細胞外効果は、前記1または複数のエフェクター細胞またはそのサブセットによる酵素中和である請求項1ないし14のいずれか1項に記載の方法。

請求項76

前記細胞外効果は、サイトカインシグナル伝達プロセスの中和である請求項1ないし14のいずれか1項に記載の方法。

請求項77

前記細胞外効果は、前記1または複数のエフェクター細胞によって分泌された抗体の内在化、またはアクセサリー粒子の内在化である請求項1ないし14のいずれか1項に記載の方法。

請求項78

前記細胞外効果は、前記1または複数の読み出し細胞による酵素の発現であり、前記酵素は、蛍光シグナルを生成するために、前記複数のアクセサリー粒子またはそのサブ複数に作用する請求項41に記載の方法。

請求項79

前記細胞集団内の前記1または複数のエフェクター細胞は、前記読み出し粒子集団または前記亜集団で前記細胞外効果を示す場合、前記方法は、回収された細胞集団を得るために、前記細胞集団またはその一部を回収する工程をさらに含む請求項1ないし78のいずれか1項に記載の方法。

請求項80

前記回収する工程は、1または複数の細胞を含む前記細胞集団を含む前記マイクロ流体チャンバをマイクロキャピラリー穿孔する工程と、回収吸引された細胞集団を得るために、チャンバの内容物またはその一部を吸引する工程と、を含み、前記1または複数の細胞は、前記読み出し粒子集団または前記亜集団で前記細胞外効果を示す請求項79に記載の方法。

請求項81

前記回収する工程は、前記細胞外効果を示す前記細胞集団を含む前記マイクロリアクターで選択的に対処する工程と、前記マイクロリアクターの内容物をポートに流す工程と、を含む請求項79に記載の方法。

請求項82

前記マイクロキャピラリーは、約5μm〜約200μmの直径を有する請求項79に記載の方法。

請求項83

前記マイクロキャピラリーは、ベベル先端を有する請求項80または82に記載の方法。

請求項84

前記マイクロキャピラリーは、楕円形正方形または円形の断面を有する請求項80および82ないし83のいずれか1項に記載の方法。

請求項85

前記マイクロキャピラリーは、顕微鏡上のロボットマイクロマニピュレーションシステムに搭載されている請求項80および82ないし84のいずれか1項に記載の方法。

請求項86

前記マイクロキャピラリーは、ロボット制御されている請求項80および82ないし85のいずれか1項に記載の方法。

請求項87

前記マイクロキャピラリーは、単一のバレル、二重バレル、三重バレルまたは四重以上のバレルを有する請求項80および82ないし86のいずれか1項に記載の方法。

請求項88

前記1または複数の読み出し粒子を含む前記読み出し粒子集団を含む、マイクロ流体デバイス別個のチャンバで、前記回収された細胞集団に由来する複数の細胞亜集団を保持する工程と、前記チャンバ内で個々の前記細胞亜集団と、前記読み出し粒子集団とをインキュベートする工程と、第2の細胞外効果の存在のために前記個々の細胞亜集団をアッセイする工程と、前記アッセイする工程の結果に基づいて、前記第2の細胞外効果を示す1または複数の細胞を含む前記複数の細胞亜集団の中から1つの細胞亜集団を同定する工程と、をさらに含み、前記読み出し粒子集団または前記亜集団は、前記第2の細胞外効果の読み出しを提供し、前記第2の細胞外効果は、前記回収された細胞集団で測定された前記細胞外効果と同じ細胞外効果または異なる細胞外効果である請求項80ないし87ののいずれか1項に記載の方法。

請求項89

前記複数の細胞亜集団は、約1個の細胞から約25個の細胞の平均値を含む請求項88に記載の方法。

請求項90

前記複数の細胞亜集団のうちの前記細胞亜集団は、約1から約3個の細胞または約1から約5個の細胞の平均値を含む請求項89に記載の方法。

請求項91

前記保持する工程は、前記マイクロ流体デバイスの1つの壁を穿孔する前記マイクロキャピラリーで、前記マイクロ流体デバイスの中に前記吸引回収された細胞集団を注入する工程と、前記マイクロ流体デバイスの前記別個のチャンバに前記吸引回収された細胞集団を流すために、圧力を加える工程と、構造体の壁が前記マイクロ流体デバイスの前記壁をほぼ再密封させるように前記マイクロキャピラリーを後退させる工程と、を含む請求項88に記載の方法。

請求項92

複数の容器に、前記回収された細胞集団に由来し、個々の容器中に存在する複数の細胞亜集団を保持する工程と、前記個々の細胞亜集団を溶解し、溶解した細胞亜集団を提供する工程と、前記溶解した細胞集団のそれぞれの内の1または複数の核酸増幅する工程と、をさらに含む請求項79ないし87のいずれか1項に記載の方法。

請求項93

前記増幅する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、cDNA末端の5'-迅速増幅(RACE)、インビトロ転写または全トランスクリプトーム増幅(WTA)を含む請求項92に記載の方法。

請求項94

前記PCRは、逆転写酵素(RT)-PCRまたはPCRプライミング縮重オリゴヌクレオチドである請求項93に記載の方法。

請求項95

増幅は、1または複数の抗体遺伝子または1または複数の受容体遺伝子の増幅を含む請求項90ないし92のいずれか1項に記載の方法。

請求項96

前記第2の細胞外効果は、前記エフェクター細胞またはその分泌されたタンパク質と、前記読み出し粒子との間の結合相互作用、読み出し細胞に存在する細胞表面受容体のアンタゴニズム、前記読み出し細胞に存在する前記細胞表面受容体のアゴニズム、ABCトランスポーターのアンタゴニズム、前記ABCトランスポーターのアゴニズム、イオンチャネルのアンタゴニズム、前記イオンチャネルのアゴニズム、前記エフェクター細胞によって誘発される前記読み出し細胞の細胞溶解、前記エフェクター細胞によって誘導される前記読み出し細胞の細胞アポトーシス、前記読み出し細胞の細胞壊死、抗体の内在化、アクセサリー粒子の内在化、前記エフェクター細胞による酵素中和、可溶性シグナル伝達分子の中和またはそれらの組み合わせである請求項88ないし95のいずれか1項に記載の方法。

請求項97

前記可溶性シグナル伝達分子は、サイトカインである請求項96に記載の方法。

請求項98

前記細胞亜集団内の前記1または複数の細胞が前記読み出し粒子の集団またはその亜集団で前記第2の細胞外効果を示す場合、前記回収された細胞亜集団を得るために、前記細胞亜集団またはその一部を回収する工程を含む請求項88ないし97のいずれか1項に記載の方法。

請求項99

前記1または複数の読み出し粒子を含む前記読み出し粒子集団を含む、前記マイクロ流体デバイスの前記別個のチャンバで、前記回収された細胞亜集団に由来する前記複数の細胞亜集団を保持する工程と、前記チャンバ内で前記個々の細胞亜集団と、前記読み出し粒子集団とをインキュベートする工程と、第3の細胞外効果の存在のために前記個々の細胞亜集団をアッセイする工程と、前記アッセイする工程の結果に基づいて、前記第3の細胞外効果を示す前記1または複数の細胞を含む前記複数の細胞亜集団の中から1つの細胞亜集団を同定する工程と、をさらに含み、前記読み出し粒子集団または前記亜集団は、前記第3の細胞外効果の読み出しを提供する請求項98に記載の方法。

請求項100

複数の容器に、前記回収された細胞亜集団に由来し、個々の容器中に存在する複数の細胞亜集団を保持する工程と、前記細胞亜集団を溶解し、溶解した細胞亜集団を提供する工程と、前記溶解した細胞集団内の1または複数の核酸を増幅する工程と、をさらに含む請求項98に記載の方法。

請求項101

前記第3の細胞外効果は、前記エフェクター細胞またはその分泌タンパク質と、前記読み出し粒子との間の結合結合相互作用、読み出し細胞に存在する細胞表面受容体のアンタゴニズム、前記読み出し細胞に存在する前記細胞表面受容体のアゴニズムは、ABCトランスポーターのアンタゴニズム、前記ABCトランスポーターのアゴニズム、イオンチャネルのアンタゴニズム、前記イオンチャネルのアゴニズム、前記エフェクター細胞によって誘発される前記読み出し細胞の細胞溶解、前記エフェクター細胞によって誘発される前記読み出し細胞の細胞アポトーシス、前記読み出し細胞の細胞壊死、抗体の内在化、アクセサリー粒子の内在化、前記エフェクター細胞による酵素中和、可溶性シグナル伝達分子の中和またはそれらの組み合わせである請求項99に記載の方法。

請求項102

前記細胞亜集団内の前記1または複数の細胞が前記読み出し粒子集団またはその亜集団で前記第3の細胞外効果を示す場合、前記回収された細胞亜集団を得るために、前記細胞亜集団またはその一部を回収する工程を含む請求項99または101に記載の方法。

請求項103

複数の容器に、前記回収された細胞亜集団に由来し、個々の容器中に存在する複数の細胞亜集団を保持する工程と、前記細胞亜集団を溶解し、溶解した細胞亜集団を提供する工程と、前記溶解した細胞集団内の1または複数の核酸を増幅する工程と、をさらに含む請求項102に記載の方法。

請求項104

前記増幅する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、cDNA末端の5'-迅速増幅(RACE)、インビトロ転写または全トランスクリプトーム増幅(WTA)を含む請求項103に記載の方法。

請求項105

前記PCRは、逆転写酵素(RT)-PCRまたはPCRプライミング縮重オリゴヌクレオチドである請求項104に記載の方法。

請求項106

増幅は、1または複数の抗体遺伝子の増幅を含む請求項103ないし105のいずれか1項に記載の方法。

請求項107

前記回収する工程は、前記第3の細胞外効果を示す前記1または複数の細胞を含む前記細胞亜集団を含む前記マイクロ流体チャンバを前記マイクロキャピラリーで穿孔する工程と、回収吸引された細胞亜集団を得るために、前記チャンバの内容物またはその一部を吸引する工程と、を含む請求項102に記載の方法。

請求項108

前記個々の細胞集団は、約1から約10個の細胞の平均細胞数を有する請求項99に記載の方法。

請求項109

前記複数のアクセサリー粒子とともに、前記個々の細胞亜集団と、前記読み出し粒子集団とをインキュベートする工程をさらに包む請求項99に記載の方法。

請求項110

細胞外効果の変動を提示する細胞集団を同定する方法であって、1または複数の読み出し粒子を含む読み出し粒子集団を含む別個のマイクロ流体チャンバ内に、複数の個々の細胞集団を保持する工程と、前記マイクロ流体チャンバ内で、前記個々の細胞集団と、前記1または複数の読み出し粒子とをインキュベートする工程と、前記細胞外効果の存在のために前記個々の細胞集団をアッセイする工程と、前記アッセイする工程の結果に基づいて、前記細胞外効果の前記変動を示す1つの細胞集団を、前記複数の細胞集団の中から、前記複数の細胞集団のうちの1または複数の残りの細胞集団と比較して、識別する工程と、を含み、前記個々の細胞集団の少なくとも一つは、1または複数のエフェクター細胞を含み、前記読み出し粒子集団またはその亜集団は、前記細胞外効果の読み出しを提供することを特徴とする細胞集団を同定する方法。

請求項111

前記1または複数のエフェクター細胞は、抗体分泌細胞(ASC)を含む請求項110に記載の方法。

請求項112

前記1または複数のエフェクター細胞は、形質細胞、B細胞、形質芽球、メモリーB細胞の増殖によって生成される細胞、ハイブリドーマ細胞、T細胞、CD8 + T細胞、CD4 + T細胞、抗体を産生するように操作された組換え細胞、T細胞受容体を発現するように操作された組換え細胞またはそれらの組み合わせを含む請求項110または111に記載の方法。

請求項113

前記細胞集団は、約2から約500個の細胞を含む請求項110ないし112のいずれか1項に記載の方法。

請求項114

前記細胞集団は、約10から約50個の細胞を含む請求項113に記載の方法。

請求項115

前記細胞集団は、約2から約10個の細胞を含む請求項114に記載の方法。

請求項116

前記読み出し粒子集団は、読み出したビーズまたは読み出し細胞を含む請求項110ないし115のいずれか1項に記載の方法。

請求項117

前記読み出し粒子集団は、タンパク質またはペプチドを含む請求項110ないし115のいずれか1項に記載の方法。

請求項118

前記読み出し粒子集団は、シグナル伝達分子、脂質、炭水化物、代謝産物、ウイルス粒子、サイトカイン、ケモカイン、神経伝達物質、成長因子、ホルモン、膜抽出物、脂質粒子、安定化受容体、受容体の細胞外ドメイン、膜抽出物で官能化された小胞、膜抽出物で官能化されたビーズ、可溶性タンパク質として安定であるように操作されたGタンパク質共役受容体(GPCR)またはそれらの組合せを含む請求項110ないし115のいずれか1項に記載の方法。

請求項119

前記読み出し粒子集団の前記1または複数の読み出し粒子は、約500nm未満、または約500nmから約50μmの平均直径を有する請求項110ないし118のいずれか1項に記載の方法。

請求項120

前記読み出し粒子集団の前記1または複数の読み出し粒子は、約1μmから約10μmの平均直径を有する請求項119に記載の方法。

請求項121

前記読み出し粒子集団または前記亜集団は、前記マイクロ流体チャンバの表面に固定化されている請求項110ないし120のいずれか1項に記載の方法。

請求項122

前記読み出し粒子集団は、表面上にATP結合カセットトランスポーター(ABCトランスポーター)を発現する読み出し細胞を含み、前記細胞外効果は、前記ABCトランスポーターのアンタゴニズム、前記ABCトランスポーターのアゴニズム、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞による前記ABCトランスポーターへの結合、または、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞によって分泌された分子である請求項110ないし120のいずれか1項に記載の方法。

請求項123

前記読み出し粒子集団は、表面上にGタンパク質共役受容体(GPCR)または可溶化GPCRを発現する読み出し細胞を含み、前記細胞外効果は、前記GPCRのアンタゴニズム、前記GPCRのアゴニズム、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞による前記GPCRへの結合、または、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞によって分泌された分子への結合である請求項110ないし121のいずれか1項に記載の方法。

請求項124

前記読み出し粒子集団は、表面上にチロシンキナーゼ受容体(RTK)を発現する読み出し細胞を含み、前記細胞外効果は、前記RTKのアンタゴニズム、前記RTKのアゴニズム、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞による前記RTKへの結合、または、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞によって分泌された分子への結合である請求項110ないし121のいずれか1項に記載の方法。

請求項125

前記読み出し粒子集団は、表面上にイオンチャネルを発現する読み出し細胞を含み、前記細胞外効果は、前記イオンチャネルのアンタゴニズム、前記イオンチャネルのアゴニズム、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞による前記イオンチャネルへの結合、または、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞によって分泌された分子への結合である請求項110ないし121のいずれか1項に記載の方法。

請求項126

前記読み出し粒子集団は、表面上に内因性酵素活性を有する受容体を発現する読み出し細胞を含み、前記細胞外効果は、前記内因性酵素活性を有する前記受容体のアンタゴニズム、前記内因性酵素活性を有する前記受容体のアゴニズム、前記1または複数のエフェクター細胞による前記内因性酵素活性を有する前記受容体への結合、または、前記1または複数のエフェクター細胞によって分泌された分子への結合である請求項110ないし121のいずれか1項に記載の方法。

請求項127

前記GPCRは、ケモカイン受容体、サイトカイン受容体、クラスA GPCR、クラスB GPCR、接着GPCR、フリズルドGPCR、アセチルコリン受容体、メラトニン受容体、メラコルチン受容体、モチリン受容体、リゾリン脂質(LPA)受容体、アデノシン受容体、アドレナリン受容体、アンギオテンシン受容体、ブラジキニン受容体、カルシトニン受容体、カルシウム感知受容体、カンナビノイド受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、補体成分(C5AR1)受容体、副腎皮質放出因子受容体、ドーパミン受容体、内皮分化遺伝子受容体、エンドセリン受容体、ホルミルペプチド様受容体、ガラニン受容体、ガストリン放出ペプチド受容体、受容体グレリン受容体、胃抑制ポリペプチド受容体、グルカゴン受容体、ゴナドトロピン放出ホルモン受容体、ヒスタミン受容体、キスペプチン(KiSS1)受容体、ロイコトリエン受容体、メラニン凝集ホルモン受容体、メラノコルチン受容体、メラトニン受容体、モチリン受容体、神経ペプチド受容体、ニコチン酸、オピオイド受容体、オレキシン受容体、オーファン受容体、血小板活性化因子受容体、プロキネチシン受容体、プロラクチン放出ペプチド、プロスタノイド受容体、プロテアーゼ活性化受容体、P2Y(プリン)受容体、リラキシン受容体、セクレチン受容体、セロトニン受容体、ソマトスタチン受容体、タキキニン受容体、バソプレッシン受容体、オキシトシン受容体、血管作動性腸管ペプチド(VIP)受容体または下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド(PACAP)受容体、テースト1受容体、メタボトロピックグルタミン酸受容体、カルシウム感知受容体、脳特異的血管新生阻害剤受容体(1、2または3)、カドヘリン受容体またはエストロゲン受容体である請求項116または123に記載の方法。

請求項128

前記GPCRは、サイトカインまたはケモカイン受容体である請求項123または127に記載の方法。

請求項129

前記チロシンキナーゼ受容体(RTK)は、ErbB-1、ErbB-2、ErbB-3、ErbB-4、インスリン受容体、血小板由来成長因子α受容体、血小板由来増殖因子β受容体、マスト/ステム細胞成長因子受容体(SCFR)、コロニー刺激因子1受容体、CD135、線維芽細胞増殖因子受容体‐1(CD331)、線維芽細胞成長因子受容体‐2(CD332)、線維芽細胞成長因子受容体‐3(CD333)、線維芽細胞成長因子受容体‐4(CD334)、線維芽細胞増殖因子受容体6、血管内皮増殖因子(VEGF)1受容体、VEGF 2受容体、VEGF 3受容体、肝細胞増殖因子受容体、トロポミオシン受容体キナーゼ(Trk)A、Trk B、Trk C、エフリン(EPH)受容体A1、EPH受容体A2、EPH受容体A3、EPH受容体A4、EPH受容体A5、EPH受容体A6、EPH受容体A7、EPH受容体A8、EPH受容体A9、EPH受容体A10、EPH受容体B1、EPH受容体B2、EPH受容体B3、EPH受容体B4、EPH受容体B5、EPH受容体B6、AXL、RTKクラスIX受容体ファミリーのメンバー、未分化リンパ腫キナーゼ/白血球チロシンキナーゼ(ALK/LTK)受容体ファミリーのメンバー、RTKクラスXI受容体ファミリーのメンバー、神経栄養性チロシンキナーゼ、受容体関連1受容体、ジスコイジンドメイン受容体、RTKクラスXIV受容体ファミリーのメンバー、RTKクラスXV受容体ファミリーのメンバー、RTKクラスXVI受容体ファミリーのメンバーまたは筋肉特異的キナーゼ受容体である請求項124に記載の方法。

請求項130

前記イオンチャネルは、GABAA、グリシン(GlyR)、セロトニン(5-HT)、ニコチン性アセチルコリン(nAChR)、亜鉛活性化イオンチャネル、イオンチャネル型グルタミン酸受容体、AMPA受容体、カイナイト受容体、NMDA受容体またはATP依存性チャネルである請求項125に記載の方法。

請求項131

前記内因性酵素活性を有する前記受容体は、受容体チロシンキナーゼ(RTK)、受容体セリン−トレオニンキナーゼ、受容体チロシンホスファターゼまたは受容体グアニリルシクラーゼである請求項126に記載の方法。

請求項132

前記サイトカイン受容体は、インターロイキン(IL)-1α、IL-1β、IL-1RA、IL18、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL17、IL-18、IL-19、IL-20、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、白血病阻害因子、オンコスタチンM、インターフェロン(IFN)-α、IFN -β、IFN-γ、CD154、リンホトキシンβ(LTB)、腫瘍壊死因子(TNF)-α、TNF-β、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-β、エリスロポイエチン、巨核球増殖および発達因子(MGDF)、Fms-関連チロシンキナーゼ3リガンド(Flt-3L)、幹細胞因子、コロニー刺激因子-1(CSF-1)、マクロファージ刺激因子、4-1BBリガンド、増殖誘導リガンド(APRIL)、分化クラスター70(CD70)、分化クラスター153(CD153)、分化クラスター178(CD178)、グルココルチコイド誘導性TNF受容体リガンド(GITRL)、CD258、OX40L、CD252、TALL-1、TNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)、アポトーシスの腫瘍壊死因子弱誘導剤(TWEAK)、TNF関連活性化誘導サイトカイン(TRANCE)またはそれらの結合のためのの受容体である請求項127または128に記載の方法。

請求項133

前記ケモカイン受容体は、インターロイキン‐8受容体、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10、CCR11、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、CXCR7、XCR1(GPR5)またはCX3CR1(フラクタルカイン)である請求項127または128に記載の方法。

請求項134

前記読み出し粒子集団または前記亜集団は、抗原またはエピトープで官能化されている請求項99に記載の方法。

請求項135

前記読み出し粒子集団または前記亜集団は、抗体結合部分を含む分子で官能化されている請求項110ないし121のいずれか1項に記載の方法。

請求項136

前記抗体結合部分を含む前記分子は、プロテインA、プロテインA/G、プロテインG、免疫グロブリンを結合するモノクローナル抗体、免疫グロブリンを結合するモノクローナル抗体フラグメント、免疫グロブリンを結合するポリクローナル抗体、、免疫グロブリを結合するポリクローナル抗体フラグメントまたはそれらの組み合わせである請求項135に記載の方法。

請求項137

前記別箇のマイクロ流体チャンバ内で、前記個々の細胞集団および前記読み出し粒子集団を複数のアクセサリー粒子とインキュベートする工程をさらに含む請求項110ないし136のいずれか1項に記載の方法。

請求項138

前記細胞外効果は、前記1または複数のエフェクター細胞またはそのサブセットによって分泌される分子と、前記読み出し粒子集団または前記亜集団との間の結合相互作用である請求項110いし137のいずれか1項に記載の方法。

請求項139

前記結合相互作用は、抗原-抗体結合特異性の相互作用、抗原-抗体結合親和性の相互作用、または抗原-抗体結合動態の相互作用であり、前記抗体は、前記エフェクター細胞またはその複数、またはそのサブ複数によって分泌される分子であるこ請求項138に記載の方法。

請求項140

前記細胞外効果は、アポトーシスの調節、細胞増殖の調節、前記読み出し粒子の形態学的外観の変化、前記読み出し粒子内のタンパク質の局在の変化、前記読み出し粒子によるタンパク質の発現、アクセサリー粒子の中和またはそれらの組み合わせである請求項110ないし137のいずれか1項に記載の方法。

請求項141

前記1または複数の細胞集団を実質的に単一平面内に維持する工程をさらに含む請求項110ないし140のいずれか1項に記載の方法。

請求項142

前記読み出し粒子集団を実質的に単一平面内に維持する工程をさらに含む請求項110ないし141のいずれか1項に記載の方法。

請求項143

前記インキュベートする工程は、前記細胞集団を含む前記マイクロ流体チャンバ中の前記培地を交換する工程をさらに含む請求項110ないし142のいずれか1項に記載の方法。

請求項144

前記インキュベートする工程は、30分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、36時間、48時間、60時間、72時間、84時間、96時間、1週間、少なくとも約30分、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間、少なくとも約4時間、少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、少なくとも約24時間、少なくとも約36時間、少なくとも約48時間、少なくとも約60時間、少なくとも約72時間、少なくとも約84時間、少なくとも約96時間または少なくとも約1週間である請求項110ないし143のいずれか1項に記載の方法。

請求項145

前記1または複数のエフェクター細胞またはそのサブセットは、前記インキュベートする工程中、分割される請求項110ないし143のいずれか1項に記載の方法。

請求項146

前記読み出し粒子集団または前記亜集団は、前記インキュベートする工程中、分割される請求項110ないし145のいずれか1項に記載の方法。

請求項147

前記読み出し細胞の少なくとも70%は、生存能力がある請求146に記載の方法。

請求項148

前記複数のアクセサリー粒子は、複数のアクセサリー細胞である請求項137に記載の方法。

請求項149

前記複数のアクセサリー細胞またはそのサブ複数は、前記インキュベートする工程中、分割される請求項148に記載の方法。

請求項150

前記アクセサリー細胞の少なくとも70%は、生存能力がある請求149に記載の方法。

請求項151

前記複数のアクセサリー粒子は、タンパク質、ペプチド、成長因子、サイトカイン、神経伝達物質、脂質、リン脂質、アミノ酸、モノアミン、糖タンパク質、ホルモン、炭水化物、ウイルス粒子、蛍光色素酵素基質またはそれらの組み合わせを含む請求項137に記載の方法。

請求項152

前記複数のアクセサリー粒子は、複数のサイトカインを含む請求項137または151に記載の方法。

請求項153

前記複数のサイトカインは、サイトカインの均一な集団である請求項152に記載の方法。

請求項154

前記複数のサイトカインは、サイトカインの不均一な集団である請求項152に記載の方法。

請求項155

前記サイトカインの前記均一な集団は、インターロイキン(IL)-1α、IL-1β、IL-1RA、IL18、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL17、IL-18、IL-19、IL-20、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、白血病阻害因子、オンコスタチンM、インターフェロン(IFN)-α、IFN -β、IFN-γ、CD154、リンホトキシンβ(LTB)、腫瘍壊死因子(TNF)-α、TNF-β、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-β、エリスロポイエチン、巨核球増殖および発達因子(MGDF)、Fms-関連チロシンキナーゼ3リガンド(Flt-3L)、幹細胞因子、コロニー刺激因子-1(CSF-1)、マクロファージ刺激因子、4-1BBリガンド、増殖誘導リガンド(APRIL)、分化クラスター70(CD70)、分化クラスター153(CD153)、分化クラスター178(CD178)、グルココルチコイド誘導性TNF受容体リガンド(GITRL)、CD258、OX40L、CD252、TALL-1、TNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)、アポトーシスの腫瘍壊死因子弱誘導剤(TWEAK)またはTNF関連活性化誘導サイトカイン(TRANCE)を含む請求項153に記載の方法。

請求項156

前記不均一な集団のサイトカインは、インターロイキン(IL)-1α、IL-1β、IL-1RA、IL18、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL17、IL-18、IL-19、IL-20、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、白血病阻害因子、オンコスタチンM、インターフェロン(IFN)-α、IFN -β、IFN-γ、CD154、リンホトキシンβ(LTB)、腫瘍壊死因子(TNF)-α、TNF-β、トランスフォーミング増殖因子(TGF)-β、エリスロポイエチン、巨核球増殖および発達因子(MGDF)、Fms-関連チロシンキナーゼ3リガンド(Flt-3L)、幹細胞因子、コロニー刺激因子-1(CSF-1)、マクロファージ刺激因子、4-1BBリガンド、増殖誘導リガンド(APRIL)、分化クラスター70(CD70)、分化クラスター153(CD153)、分化クラスター178(CD178)、グルココルチコイド誘導性TNF受容体リガンド(GITRL)、CD258、OX40L、CD252、TALL-1、TNF関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)、アポトーシスの腫瘍壊死因子弱誘導剤(TWEAK)、TNF関連活性化誘導サイトカイン(TRANCE)またはそれらの組み合わせを含む請求項154に記載の方法。

請求項157

前記複数のアクセサリー細胞は、線維芽細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、キラーT細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、組換え細胞またはそれらの組み合わせを含む請求項148に記載の方法。

請求項158

前記複数のアクセサリー粒子は、因子を誘導する複数の補体経路である請求項137に記載の方法。

請求項159

前記細胞集団を含む前記マイクロ流体チャンバをその周囲の環境から実質的に単離する工程をさらに含む請求項110ないし158のいずれか1項に記載の方法。

請求項160

前記細胞外効果は、前記細胞表面受容体またはイオンチャネルのアンタゴニズムである請求項123ないし133のいずれか1項に記載の方法。

請求項161

前記細胞外効果は、細胞表面受容体またはイオンチャネルのアゴニズムである請求項123ないし133のいずれか1項に記載の方法。

請求項162

前記細胞表面受容体は、GPCRであり、前記アゴニズムは、細胞内cAMP又はカルシウムの増加、タンパク質レポーターの発現の増加、またはタンパク質の局在化の増加によって測定される請求項161に記載の方法。

請求項163

前記細胞表面受容体は、GPCRであり、アンタゴニズムは、細胞内のcAMP又はカルシウムの減少、タンパク質レポーターの発現の減少、またはタンパク質の局在化の減少によって測定される請求項160に記載の方法。

請求項164

前記細胞外効果は、前記エフェクター細胞によって誘発される前記読み出し細胞の細胞溶解である請求項116に記載の方法。

請求項165

前記読み出し粒子集団は、読み出し粒子を含み、前記細胞外効果は、前記1または複数のエフェクター細胞のうちの1つのエフェクター細胞によって誘発される読み出し細胞の細胞アポトーシスまたは細胞壊死である請求項110ないし122のいずれか1項に記載の方法。

請求項166

前記細胞外効果は、前記1または複数のエフェクター細胞うちの1つのエフェクター細胞による酵素中和である請求項110ないし122のいずれか1項に記載の方法。

請求項168

前記細胞外効果は、サイトカインシグナル伝達プロセスの中和である請求項110ないし122のいずれか1項に記載の方法。

請求項169

前記細胞外効果は、読み出し粒子基質の開裂である請求項110ないし122のいずれか1項に記載の方法。

請求項170

前記1または複数の細胞集団が、前記細胞外効果の前記変動を示す場合、前記方法は、1または複数の回収された細胞集団を得るために、前記1または複数の細胞集団またはその一部を回収する工程をさらに含む請求項110ないし169のいずれか1項に記載の方法。

請求項171

前記回収する工程は、前記細胞外効果の前記変動を示す前記1または複数の細胞集団を含む1または複数のマイクロ流体チャンバをマイクロキャピラリーで穿孔する工程と、1または複数の吸引回復された細胞集団を得るために、前記1または複数のマイクロ流体チャンバまたはその一部のチャンバの内容物を吸引する工程と、を含む請求項170に記載の方法。

請求項172

前記マイクロキャピラリーは、約5μmから約200μmの平均直径を有する請求項171に記載の方法。

請求項173

前記マイクロキャピラリーは、ベベル先端を有する請求項171また172に記載の方法。

請求項174

前記マイクロキャピラリーは、楕円形、正方形または円形の断面を有する請求項171ないし173のいずれか1項に記載の方法。

請求項175

前記マイクロキャピラリーは、顕微鏡上のロボットマイクロマニピュレーションシステムに搭載されている請求項171ないし174のいずれか1項に記載の方法。

請求項176

前記マイクロキャピラリーは、ロボット制御されている請求項171ないし175のいずれか1項に記載の方法。

請求項177

前記マイクロキャピラリーは、単一のバレル、二重バレル、三重バレルまたは四重以上のバレルを有する請求項171ないし176のいずれか1項に記載の方法。

請求項178

前記1または複数の読み出し粒子を含む前記読み出し粒子集団を含む、マイクロ流体デバイスの別個のチャンバで、前記回収された1または複数の細胞集団に由来する複数の細胞亜集団を保持する工程と、前記チャンバ内で、前記個々の細胞亜集団と前記読み出し粒子集団とをインキュベートする工程と、第2の細胞外効果の変動のために前記個々の細胞亜集団をアッセイする工程と、前記アッセイする工程の結果に基づいて、前記第2の細胞外効果の前記変動を示す前記複数の細胞亜集団の中から1または複数の細胞亜集団を同定する工程と、をさらに含み、前記読み出し粒子集団または前記亜集団は、前記第2の細胞外効果の読み出しを提供し、前記第2の細胞外効果は、前記回収された細胞集団で測定された前記細胞外効果と同じ細胞外効果または異なる細胞外効果である請求項170ないし177ののいずれか1項に記載の方法。

請求項179

前記複数の細胞亜集団のうちの前記細胞亜集団は、約1個の細胞から約25個の細胞の平均値を含む請求項178に記載の方法。

請求項180

前記複数の細胞亜集団のうちの前記細胞亜集団は、約1個の細胞から約15個の細胞の平均値を含む請求項178に記載の方法。

請求項181

前記複数の細胞亜集団のうちの前記細胞亜集団は、約1の細胞の平均値を含む請求項179または180に記載の方法。

請求項182

前記保持する工程は、前記マイクロ流体デバイスの1つの壁を穿孔するマイクロキャピラリーで、前記マイクロ流体デバイスの中に前記吸引回収された細胞集団を注入する工程と、前記マイクロ流体デバイスの前記別個のチャンバに前記吸引回収された細胞集団を流すために圧力を加える工程と、構造体の壁が前記マイクロ流体デバイスの前記壁をほぼ再密封させるように前記マイクロキャピラリーを後退させる工程と、を含む請求項178に記載の方法。

請求項183

複数の容器に、前記回収された1または複数の細胞集団に由来し、個々の容器中に存在する複数の細胞亜集団を保持する工程と、前記細胞亜集団を溶解し、溶解した細胞亜集団を提供する工程と、前記溶解した細胞集団内で1または複数の核酸を増幅する工程と、をさらに含む請求項170ないし177のいずれか1項に記載の方法。

請求項184

前記増幅する工程は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、cDNA末端の5'-迅速増幅(RACE)、インビトロ転写または全トランスクリプトーム増幅(WTA)を含む請求項183に記載の方法。

請求項185

前記PCRは、逆転写酵素(RT)-PCRまたはPCRプライミング縮重オリゴヌクレオチドである請求項184に記載の方法。

請求項186

増幅は、1または複数の抗体遺伝子の増幅を含む請求項183ないし185のいずれか1項に記載の方法。

請求項187

前記第2の細胞外効果は、前記エフェクター細胞またはその生産物と、前記読み出し粒子との間の結合相互作用、読み出し細胞に存在する過剰発現された細胞表面受容体のアンタゴニズム、前記読み出し細胞に存在する過剰発現された前記細胞表面受容体のアゴニズム、前記エフェクター細胞によって誘発される前記読み出し細胞の細胞溶解、前記エフェクター細胞によって誘導される前記読み出し細胞の細胞アポトーシス、前記エフェクター細胞によって誘導される前記読み出し細胞の細胞壊死、前記エフェクター細胞によって誘導されるウイルス中和、前記エフェクター細胞による酵素中和またはサイトカインシグナル伝達プロセスの中和である請求項178ないし182のいずれか1項に記載の方法。

請求項188

前記細胞亜集団内の1または複数の細胞が前記読み出し粒子で前記第2の細胞外効果を示す場合、前記回収された細胞亜集団を得るために、前記細胞亜集団またはその一部を回収する工程を含む請求項178ないし182および187のいずれか1項に記載の方法。

請求項189

前記1または複数の読み出し粒子を含む前記読み出し粒子集団を含む、前記マイクロ流体デバイスの前記別個のチャンバで、前記回収された細胞亜集団に由来する前記複数の細胞亜集団を保持する工程と、前記チャンバ内で、前記個々の細胞亜集団と前記読み出し粒子集団とをインキュベートする工程と、第3の細胞外効果の存在のために前記個々の細胞亜集団をアッセイする工程と、前記アッセイする工程の結果に基づいて、1または複数の亜集団の中から1つの細胞が前記1または複数の読み出し粒子またはそのサブセットで前記第3の細胞外の効果を示すかどうかを同定する工程と、をさらに含み、前記読み出し粒子集団または前記亜集団は、前記第3の細胞外効果の読み出しを提供する請求項188に記載の方法。

請求項190

複数の容器に、前記回収された細胞亜集団に由来し、個々の容器中に存在する複数の細胞亜集団を保持する工程と、前記細胞亜集団を溶解し、溶解した細胞亜集団を提供する工程と、前記溶解した細胞集団内の1または複数の核酸を増幅する工程と、をさらに含む請求項188に記載の方法。

請求項191

細胞外効果を示す1または複数のエフェクター細胞を含む細胞の出発集団から前記細胞外効果を発揮する前記エフェクター細胞を濃縮する方法であって、複数の細胞亜集団を得るために、複数のマイクロ流体チャンバに前記細胞の出発集団を保持する工程と、前記細胞外効果を示す前記1または複数のエフェクター細胞を含む1または複数のチャンバを識別するために、前記マイクロ流体チャンバ内で前記細胞亜集団をアッセイする工程と、前記細胞外効果を発揮する前記1または複数のエフェクター細胞を含む前記1または複数のチャンバを識別する工程と、前記エフェクター細胞のために濃縮された細胞の濃縮集団を提供するために、前記識別された1または複数のチャンバから、前記細胞細胞亜集団またはその一部を回収する工程と、を含み、前記チャンバあたりの前記エフェクター細胞の平均数はYより大きく、前記細胞の出発集団中の細胞の総数はXよりも大きく、前記細胞の出発集団における前記エフェクター細胞の予想される割合は1 / Xであり、前記エフェクター細胞のために前記濃縮された細胞の前記濃縮集団は、1 / Yの前記エフェクター細胞の割合を有することを特徴とするエフェクター細胞を濃縮する方法。

請求項192

前記1 / Xは、0.05未満である請求項191に記載の方法。

請求項193

前記1 / Xは、0.01未満である請求項191に記載の方法。

請求項194

前記1 / Xは、0.001未満である請求項191に記載の方法。

請求項195

前記細胞外効果は、目的の抗原に結合する抗体の発現である請求項191または192に記載の方法。

請求項196

前記細胞の出発集団は、免疫化された動物または前記抗原に曝露された動物から単離された末梢血単核細胞(PBMC)である請求項195に記載の方法。

請求項197

前記細胞の出発集団は、免疫化された動物または前記抗原に曝露された動物から単離されたB細胞である請求項195に記載の方法。

請求項198

前記細胞の出発集団の供給源は、免疫化された動物または前記抗原に曝露された前記動物からの全血である請求項196または197に記載の方法。

請求項199

前記動物は、脊椎動物である請求項196ないし198のいずれか1項に記載の方法。

請求項200

前記動物は、マウスウサギヒツジヤギラマラット霊長類イヌネコ、またはサメである請求項196ないし198のいずれか1項に記載の方法。

請求項201

前記動物は、ヒトである請求項196ないし199のいずれか1項に記載の方法。

請求項202

前記細胞集団は、免疫された動物から採取された出発細胞集団に由来する請求項1ないし78のいずれか1項に記載の方法。

請求項203

前記細胞集団は、非免疫動物から採取された出発細胞集団に由来する請求項1ないし78のいずれか1項に記載の方法。

請求項204

前記動物は、ヒトである請求項202または203に記載の方法。

請求項205

前記出発細胞集団は、自己抗体を分泌する1または複数のエフェクター細胞を含む請求項203または204に記載の方法。

請求項206

前記複数の個々の細胞集団は、免疫化された動物から採取された出発細胞集団に由来する請求項110ないし169のいずれか1項に記載の方法。

請求項207

前記複数の個々の細胞集団は、非免疫動物から採取された出発細胞集団に由来する請求項110ないし169のいずれか1項に記載の方法。

請求項208

前記動物は、ヒトである請求項206または207に記載の方法。

請求項209

前記出発細胞集団は、自己抗体を分泌する1または複数のエフェクター細胞を含む請求項207または208に記載の方法。

請求項210

前記読み出し細胞は、生きているまたは固定されている請求項9および14ないし32のいずれか1項に記載の方法。

請求項211

前記細胞外効果は、結合相互作用であり、前記読み出し細胞の細胞外タンパク質で測定される請求項210に記載の方法。

請求項212

前記読み出し細胞は、固定され、前記細胞外効果は、結合相互作用であり、前記読み出し細胞の細胞内タンパク質で測定される請求項210に記載の方法。

請求項213

前記読み出し細胞は、生きているまたは固定されている請求項116および122ないし133のいずれか1項に記載の方法。

請求項214

前記細胞外効果は、結合相互作用であり、前記読み出し細胞の細胞外タンパク質で測定される請求項213に記載の方法。

請求項215

前記読み出し細胞は、固定され、前記細胞外効果は、結合相互作用であり、前記読み出し細胞の細胞内タンパク質で測定される請求項213に記載の方法。

請求項216

上記に記載される方法のいずれかによって識別されるエフェクター細胞。

請求項217

前記エフェクター細胞は、抗体分泌細胞である請求項216に記載のエフェクター細胞。

請求項218

請求項217に記載の前記エフェクター細胞によって分泌されるモノクローナル抗体。

関連出願への相互参照

0001

本出願は、2013年3月28日に出願されたアメリカ仮出願No.61/806,329の優先権を主張する。その開示の内容は、すべての目的のために参考としてここに組み込まれる。

背景技術

0002

細胞生命の基本的単位であり、同じ細胞は2つない。例えば、遺伝子型表現型および/または形態学的特性における差異は、細胞の多様性に寄与することができる。実際、細胞の「外見的に同一の」クローン集団は、集団内の細胞間の表現型差異を提示するために示されている。細胞の差異は、生命のすべてのレベルにわたって存在している。そのレベルの範囲は、バクテリア細胞から高分化した哺乳類細胞(例えば、免疫細胞)、部分的に分化した細胞(例えば、成体幹細胞および前駆細胞)に及ぶ。細胞の状態、機能および応答における差異は、異なる履歴、異なる分化状態エピジェネティックな多様性、細胞周期への影響、確率的変動ゲノム配列の差、遺伝子発現タンパク質発現および異なる細胞の交互作用効果を含む種々のメカニズムから生じる。

0003

発現タンパク質またはRNAの測定を含む従来のバルク細胞レベルの分析は、かなり多くの(一般的には個別のアッセイにつき1000細胞より多い)細胞を平均化して実行されている。細胞集団のこの平均化は、細胞集団内に存在する異成分を隠し、その集団内の個々の細胞の基本的な生物学的機能不明瞭にする。そのような平均化測定が不適切である多くの例がある。例えば、細胞集団の細胞プロセスにおける測定は、個々の細胞の応答によって複雑にされ、非同期である。こうして、プロセスの動的特性を不鮮明にさせている。例えば、優性遺伝子の存在、また、表現型の異なる細胞の亜集団は、集団における大多数の細胞の内部状態を反映しにくい集団測定をもたらしている。例えば、Altshuler and Wu. (2010). Cell//141, pp 559-563を参照されたし。

0004

ユニークな細胞型の集団を単離するための既存の方法は、多くの場合、達成可能である集団の純度に制限されている。例えば、一次多能性幹細胞濃縮された集団は、ほとんど50%の優れた機能的純度を達成しておらず、しばしば10%以下の純度である。その結果、これらの細胞の分子署名は、他の細胞型から大きく、圧倒的な汚染によって隠されている。多くの細胞型は、生存、死、分化または他のいくつかの機能を促進するために、直接接触および分泌された因子の両方を介して、互いに相互作用する。そして、これらの相互作用は、大多数の細胞を含む混合物で分離し研究することが困難である。さらに、細胞は、発現されたmRNAまたはタンパク質の異なるレベルまたは異なるタイプをもたらすゲノム配列および/または細胞の状態において差異を有する。バルク集団、ユニークな細胞状態での特定の細胞、または発現されたmRNAまたは目的のタンパク質を有する特定の細胞で分析された場合は、工業的に高い価値であるが、集団から分離することは非常に困難または不可能である。

0005

バルク集団の細胞分析の欠点を克服するために、単一細胞アッセイのプラットフォームが開発されている。例えば、マイクロ流体デバイスは、過去に単一細胞を研究するために使用されている(Lecault et al. (2012). CURR. OPIN. CHEM. BIOL. 16, pp. 381-390)。MA et al. (Nat Med, 17, pp. 738-743 (2011))は、健康なドナーおよび転移性黒色腫患者の両方から得られたヒトマクロファージおよび細胞傷害性Tリンパ球(CTLs)から複数のサイトカイン(例えば、IL-10、TNF-β、IFN-γ)を同時に測定するために単一細胞のバーコードチップを適用した。微細加工チャンバアレイはまた、免疫したヒトおよびマウスの両方から抗原特異的抗体を分泌するB細胞スクリーニングし、選択するために使用されている(Story et al. (2009). PROC. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, pp. 17902-17907; Jin et al. (2009). Nat. Med. 15, pp. 1088-1092)。このアプローチでは、単一のB細胞は、ウェル表面が捕捉抗体官能化された何万もの微細加工ウェル(〜10-100 μmの深さ)を含む表面上に配列された。3時間未満のウェル表面上での細胞のインキュベーションの後、表面は、蛍光標識された抗原を用いて洗浄され、抗原特異的B細胞を同定するためにスキャンされた。これらの細胞は、これらの細胞から抗体をエンコードする遺伝子を増幅し、配列し、およびクローン化するために、マイクロキャピラリーによってアレイからマニュアル回収された。

0006

二相マイクロ流体デバイスは、油の流れによって分離されたサブナノリトル水滴でそれらをカプセル化することによって、単一の免疫細胞から分泌されたタンパク質の分析に適用されている(Konry et al. (2011). Biosens. Bioelectron. 26. Pp. 2702-2710)。これらの液滴は、FACSに類似するフロースルー形式で分析され、単一の細胞から分泌されたタンパク質の超ハイスループット検出のための機会を提供している。油中水型エマルジョンはまた、マイクロ流体生成のアガロースビーズにおいて共カプセル化細胞による細胞パラクリンシグナル伝達を研究するために使用されている(Tumarkin et al. (2011). Integer. Biol. 3, pp. 653-662)。マイクロ流体液滴の生成は、異なる組成物曝露されカプセル化された単一細胞の生存能力の分析を可能にすることによって、薬物スクリーニングおよび開発に使用されている(Brouzes et al. (2009). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, pp. 14195-14200)。

0007

抗体は、感染および疾患を撃退するために、ヒトまたは動物の免疫系によって自然に産生される分子である。これは、特定の標的(例えば、タンパク質、ウイルス、細菌)を認識して結合する能力を有する抗体の膨大な多様性を生成する免疫系の固有の能力によって成し遂げられる。この比類のない特異性は、癌、自己免疫疾患、炎症、神経学および感染を含む多様な条件のために臨床的承認された治療法で、抗体が非常に強力かつ低副作用の薬を作ることである。従来の小分子薬剤と比較して、抗体は、優れた薬物動態、より少ない副作用、改善された忍容性および臨床試験で非常に高い成功率(小分子の27%対7%)を含むいくつかの利点を提供する(Reichert (2009). Mabs 1, pp. 387-389.)。これは、2012年に500億ドル、年間9%の割合で成長している世界全体の市場で、抗体が最も急成長しているクラスの薬であるという理由である(Nelson et al. (2010). Nat. Rev. Drug Disc. 9(10), pp. 767-774.)。

0008

最適な治療特性を有する抗体、および特に、表面受容体を標的とする抗体の発見は、医薬品開発における重大なボトルネックのままとなっている。免疫化に応答して、動物は、何百万という異なるモノクローナル抗体(mAbs)を作ることができる。各mAbは、抗体分泌細胞(ASC)と呼ばれる単一の細胞によって産生され、各ASCは、一種類のmAbのみを産生する。したがって、例えば、創薬目的のための抗体分析は、単一細胞分析につながる。しかし、ASCが個別に分析されたとして(細胞のバルク集団内でない)、単一のASCは微量の抗体のみを生成するため、従来のアッセイ形式の容量で分析したとき、抗体は、かなり低濃度であり、完全に検出不能となっている。したがって、個々のASCとその分泌された抗体を研究するための新しい方法が必要とされている。本発明は、この必要性および他の必要性に取り組む。

発明が解決しようとする課題

0009

本発明は、単一のエフェクター細胞に起因する細胞外効果を分析するためのマイクロ流体プラットフォームを提供する。エフェクター細胞は、一実施形態では、生物学的因子(例えば、抗体(ASC))を分泌する細胞である。さらなる実施形態では、エフェクター細胞のマイクロ流体分析は、単一のエフェクター細胞を含む細胞集団で実行された細胞外効果アッセイである。

課題を解決しようとするための手段

0010

一態様では、細胞外効果を有するエフェクター細胞を含む細胞集団を同定する方法が提供される。一実施形態では、方法は、1または複数のエフェクター細胞を含む細胞集団をマイクロリアクターで保持する工程を含む。マイクロリアクターの内容物は、1または複数の読み出し粒子を含む読み出し粒子集団をさらに含む。方法はまた、マイクロリアクター内で1または複数の読み出し細胞と細胞集団とをインキュベートする工程と、細胞外効果の存在のために細胞集団をアッセイする工程とを含む。読み出し粒子集団またはその亜集団は、細胞外効果の直接的または間接的な読み出しを提供する。方法はさらに、アッセイ工程の結果に基づいて、細胞集団内の1または複数のエフェクター細胞が細胞外効果を発揮するかどうかを決定する工程を含む。更なる実施形態では、マイクロリアクターは、マイクロ流体チャンバである。さらなる実施形態では、マイクロ流体チャンバは、膜バルブを含むマイクロ流体構造の一部である。

0011

この態様では、エフェクター細胞は、生物学的因子、例えば、抗体を分泌する細胞である。細胞外効果の存在が特定のマイクロリアクター内で検出されるかぎり、特定の細胞外効果を有する特定のエフェクター細胞または複数のエフェクター細胞が、最初に同定される必要はない。すなわち、効果が測定されるマイクロリアクター中の一部またはすべての細胞は、細胞外効果を提供する特定の細胞を同定することがさらなる特徴付けのために求められていれば、回収されることができる。

0012

一実施形態では、1または複数のエフェクター細胞を含む細胞集団が、細胞外効果を示すと判断された場合、回収された細胞集団を得るために細胞集団またはその一部は回収される。回収は、一実施形態では、細胞外効果を示す1または複数の細胞を含む細胞集団を含むマイクロ流体チャンバをマイクロキャピラリーで穿孔する工程と、チャンバの内容物またはその一部を吸引する工程を含む。それにより、回収された吸引細胞集団を得る。

0013

また、一実施形態において、1または複数のエフェクター細胞を含む細胞集団が細胞外効果を示すと判断された場合は、回収された細胞集団を得るために細胞集団またはその一部は回収される。回収された細胞集団は、細胞亜集団としてさらに分析される。一実施形態における方法は、マイクロ流体デバイスの別個のチャンバに回収された細胞集団に由来する複数の細胞の亜集団を保持する工程を含む。別個のチャンバは、1または複数の読み出し粒子を含む読み出し粒子集団を含む。また、方法は、チャンバ内で読み出し粒子集団と、個々の細胞亜集団とをインキュベートする工程と、第2の細胞外効果の存在のために個々の細胞亜集団をアッセイする工程とを含む。読み出し粒子集団またはその亜集団は、第2の細胞外効果の読み出しを提供する。第2の細胞外効果は、回収された細胞集団で測定された細胞外効果と同じ細胞外効果または異なる細胞外効果である。細胞亜集団がインキュべートされ、アッセイされると、方法は、アッセイ工程の結果に基づいて、読み出し粒子集団またはその亜集団で第2の細胞外効果を示す1または複数の細胞を含む複数の細胞亜集団の中から一つの細胞亜集団を同定する工程を含む。

0014

別の態様において、本発明は、細胞外効果の変動を提示する細胞集団を同定する方法に関する。一実施形態において、本方法は、別個のマイクロ流体チャンバ内に個々の複数の細胞集団を保持する工程と、マイクロ流体チャンバ内で個々の細胞集団と読み出し粒子集団とをインキュベートする工程と、細胞外効果の存在のために個々の細胞集団をアッセイする工程とを含む。個々の細胞集団の少なくとも一つは、1または複数のエフェクター細胞を含み、別個のマイクロ流体チャンバの内容物は、1または複数の読み出し粒子を含む読み出し粒子集団を含む。読み出し粒子集団またはその亜集団は、その細胞外効果の読み出しを提供する。細胞集団がインキュベートされ、アッセイされると、方法は、複数の細胞集団のうちの1または複数の残りの細胞集団と比較して、アッセイの結果に基づいて、細胞外効果の変動を示す複数の細胞集団の中から一つの細胞集団を同定する工程を含む。さらなる実施形態では、1または複数のエフェクター細胞は、抗体分泌細胞を含む。別の実施形態では、1または複数のエフェクター細胞は、形質細胞、B細胞、形質芽球メモリーB細胞の増殖を通して産生された細胞、ハイブリドーマ細胞、T細胞、CD8 + T細胞およびCD4 + T細胞、抗体を産生するために操作された組み換え細胞T細胞受容体を発現するように操作された組換え細胞、またはそれらの組合せを含む。

0015

細胞外効果または細胞外効果の変動を示す1または複数の細胞集団は、一実施形態で、回収され、1または複数の回収された細胞集団を得る。回収は、例えば、マイクロキャピラリーを用いて実行される。1または複数の個々の細胞集団が同定され、回収されると、1または複数の個々の細胞集団は、観察された細胞外効果の原因となる複数の細胞または細胞を決定するためにさらに分析される。一実施形態では、方法は、マイクロ流体デバイスの別個のチャンバ内に、1または複数の回収された細胞集団に由来する複数の細胞亜集団を保持する工程を含む。別個のチャンバの各々は、1または複数の読み出し粒子を含む読み出し粒子集団を含む。個々の細胞亜集団は、チャンバ内で読み出し粒子集団とインキュベートされる。個々の細胞亜集団は、第2の細胞外効果の変動のためにアッセイされる。読み出し粒子集団またはその亜集団は、第2の細胞外効果の読み出しを提供する。第2の細胞外効果は、回収された細胞集団で測定された細胞外効果と同じ細胞外効果または異なる細胞効果である。第2の細胞外効果のアッセイに基づいて、1または複数の個々の細胞亜集団は、第2の細胞外効果の変動を示すよう同定される。一実施形態では、1または複数の個々の細胞亜集団は、その後、さらなる分析のために回収される。細胞外効果アッセイは、明細書全体に記載されている。

0016

1つの実施形態では、回収された細胞集団または回収された細胞亜集団からの細胞は、細胞の亜集団またはサブ亜集団として複数の容器内に保持され、各細胞亜集団または細胞サブ亜集団は、個々の容器中に存在する。個々の亜集団またはサブ亜集団は、提供するために溶解され、溶解された細胞亜集団または溶解された細胞サブ亜集団内の1または複数の核酸は増幅される。さらなる実施形態では、1または複数の核酸は、抗体遺伝子を含む。

0017

本明細書に記載する方法の一実施形態では、インキュベート工程は、個々の細胞集団または亜集団を含むそれぞれのマイクロリアクター(例えば、マイクロ流体チャンバ)内の培地交換する工程を含む。培地交換は、例えば、チャンバ内の細胞の生存能力を維持するために、または細胞外効果のアッセイを実行するための試薬を提供するために、または連続形式で複数の細胞外効果アッセイを行うために実施される。

0018

一実施形態において、インキュベート工程は、複数のアクセサリー粒子で細胞集団または細胞亜集団をインキュベートする工程を含む。複数のアクセサリー粒子は、例えば、細胞外効果のアッセイのための追加の試薬として提供されるか、または細胞の生存を維持するために提供される。一実施形態において、複数のアクセサリー粒子は、スフィンゴシン-1-リン酸リゾホスファチジン酸成長因子、サイトカイン、ケモカイン神経伝達物質ウイルス粒子二次抗体蛍光粒子蛍光基質補体経路誘導因子、ウイルス粒子またはアクセサリー細胞を含む。アクセサリー細胞は、一実施形態では、線維芽細胞ナチュラルキラー(NK)細胞、キラーT細胞抗原提示細胞樹状細胞、組換え細胞またはそれらの組み合わせである。

0019

一実施形態において、本明細書に記載される方法およびデバイスによって測定される細胞外効果は、エフェクター細胞またはエフェクター細胞によって分泌される分子の細胞表面タンパク質への結合、読み出し細胞(読み出し粒子の種類)での細胞表面受容体アンタゴニズムまたは細胞表面受容体のアゴニズムである。さらなる実施形態では、細胞表面受容体は、受容体チロシンキナーゼRTK)、Gタンパク質共役受容体(GPCR)、受容体セリントレオニンキナーゼ、受容体チロシンホスファターゼまたはレセプターグアニリルシクラーゼである。GPCRは、クラスまたは種に限定されるものではない。例えば、GPCRは、一実施形態では、本明細書の表3Aまたは3Bに設けられたGPCRである。

0020

別の実施形態では、本明細書に記載の方法およびデバイスによって測定される細胞外効果は、エフェクター細胞またはエフェクター細胞によって分泌される分子のイオンチャネルへの結合、イオンチャネルのアンタゴニズムまたはイオンチャネルのアゴニズムである。イオンチャネルは、一実施形態では、GABAA、グリシン(GlyR)、セロトニン5-HT)、ニコチン性アセチルコリン(nAChR)、亜鉛活性化イオンチャネルイオンチャネル型グルタミン酸AMPA、カイナイトNMDA受容体またはATP依存性チャネルである。

0021

細胞外効果は、細胞表面受容体またはイオンチャネルのアゴニズム、アンタゴニズム、結合である。一実施形態における効果は、細胞表面受容体もしくはイオンチャネルを発現する読み出し細胞内で、細胞内のcAMP又はカルシウムの検出、タンパク質レポーターの発現、またはタンパク質の局在化によって測定される。

0022

別の実施形態では、細胞外効果は、1または複数の読み出し粒子または1または複数のアクセサリー粒子に対する1または複数のエフェクター細胞またはそのサブセットアポトーシスの調節、細胞増殖の調節、読み出し粒子の形態学的外観の変化、読み出し粒子内のタンパク質の局在の変化、読み出し粒子によるタンパク質の発現、読み出し粒子に影響を与えるように動作可能なアクセサリー粒子の中和、またはそれらの組み合わせによって分泌される分子間の結合相互作用である。

0023

いくつかの実施形態では、細胞外効果は、エフェクター細胞によって分泌される細胞産物の効果である。細胞外効果は、エフェクター細胞によって産生されるたんぱく質と、読み出し粒子またはアクセサリー粒子のいずれかとの間の結合相互作用である。例えば、一実施形態におけるエフェクター細胞は、抗体分泌細胞(ASC)であり、読み出しまたはアクセサリー粒子は、エピトープまたは抗原を含む。結合相互作用は、一実施形態において、抗原‐抗体結合特異性、抗原‐抗体結合親和性および抗原‐抗体結合反応速度のうちの1または複数の程度である。別の実施形態では、エフェクター細胞は、サイトカインを分泌する活性化T細胞であり、読み出し粒子は、分泌されたサイトカインを捕捉するために1または複数の抗体を含む。

0024

上記の方法およびデバイスは、細胞を検査または選択するために使用されてもよい。その細胞は、希少であり、例えば、集団において1%未満の細胞であり、または、検査または選択される細胞の約1%〜約10%または約5%から約10%の細胞である。

0025

別の態様では、ここに記載される方法で見出される機能性抗体および受容体が提供される。この態様の一実施形態では、細胞外効果の原因となるエフェクター細胞の核酸を増幅し、配列決定する。核酸は、分泌生体分子をコードする遺伝子(例えば、抗体またはそのフラグメント)、または、細胞受容体またはそのフラグメント(例えば、T細胞受容体)をコードする遺伝子である。抗体またはそのフラグメントまたは細胞受容体またはそのフラグメントは、クローン化されおよび/または当該分野で公知の方法によって配列決定される。

図面の簡単な説明

0026

図1は、マイクロ流体多細胞アッセイに基づく、単一のエフェクター細胞の同定および選択のためのマイクロ流体アプローチの一実施形態のプロセスフロー図である。単一細胞は、任意の動物から得られ、必要に応じてエフェクター細胞集団のために濃縮されている。ハイスループットマイクロ流体分析は、不均一な細胞集団に存在するいくつかの例において、単一のエフェクター細胞から分泌された抗体に機能的スクリーニングを実行するために使用される。マイクロ流体分析の1または複数のラウンドの後、細胞は回収され、抗体可変領域遺伝子は、細胞株クローニングおよび配列決定(Vh/Vl)のために増幅される。このプロセスは、一週間後に回収された配列を用いて、一日で10万細胞以上のスクリーニングを可能にする。

0027

図2は、マイクロ流体エフェクター細胞濃縮方法の一実施形態のプロセスフロー図である。エフェクター細胞は、チャンバあたり25個の細胞の平均濃度で最初にロードされ、抗体のポリクローナル混合物を作成するために培養される。ポリクローナル混合物のスクリーニングは、細胞外効果(例えば、結合性、親和性または機能活性)の変動を有するチャンバを特定するために使用される。40個のポジティブチャンバは、目的の抗体を作製する〜4%のエフェクター細胞で濃縮された集団を得るために回収される。濃縮された集団のエフェクター細胞は、次いで、細胞外効果の変動を有する単一のASC(s)を選択するために、限界希釈法で第2のアレイにおいて分析される。濃縮のために必要な時間は約4時間であり、合計のスクリーニングのスループットは、実行ごとに100,000個の細胞である。濃縮工程は、必要に応じて2回実施されてもよく、各スクリーンに同じまたは異なる特性を使用してもよい。

0028

図3は、本発明の実施形態に係る標的の読み出し粒子に特異的に結合することができる生体分子を産生するエフェクター細胞の存在を同定する方法の上面及び断面を模式的に示す図である。

0029

図4は、正常細胞ではなく悪性細胞に特異的に結合する生体分子(例えば、抗体)を産生する少なくとも一つのエフェクター細胞の存在を同定する方法の上面及び断面を模式的に示す図である。

0030

図5は、本発明の一実施形態による、エフェクター細胞の存在を同定する方法の上面及び断面を模式的に示す図である。そのエフェクター細胞は、読み出し細胞に結合する生体分子を産生する。エフェクター細胞の亜集団は、読み出し細胞として振る舞うように官能化されている。

0031

図6は、抗体テトラマーの模式図である。

0032

図7は、本発明の実施形態に係る、既知の生体分子が結合する標的のエピトープ/分子用スクリーニング方法の上面及び断面を模式的に示す図である。

0033

図8は、本発明の実施形態に係る、標的のエピトープ/抗原に特異的に結合する抗体を産生するエフェクター細胞の存在を同定する方法の上面及び断面を模式的に示す図である。

0034

図9は、細胞溶解定量化する方法の上面及び断面を模式的に示す図である。

0035

図10は、本発明の実施形態に係る、標的のエピトープ/抗原に特異的に結合する抗体を産生するエフェクター細胞の存在を同定する方法の上面及び断面を模式的に示す図である。

0036

図11は、細胞溶解を定量化する方法の上面及び断面を模式的に示す図である。

0037

図12は、読み出し細胞の増殖を誘導する生体分子を産生するエフェクター細胞の存在を同定する方法の上面及び断面を模式的に示す図である。

0038

図13は、アポトーシスを受けるように読み出し細胞を刺激する生体分子を産生するエフェクター細胞の存在を同定する方法の上面及び断面を模式的に示す図である。

0039

図14は、読み出しのオートファジーを刺激する生体分子を産生するエフェクター細胞の存在を同定する方法の上面及び断面を模式的に示す図である。

0040

図15は、目的のサイトカインを中和する生体分子を産生するエフェクター細胞の存在を同定する方法の上面及び断面を模式的に示す図である。

0041

図16は、細胞に感染するウイルスの能力を阻害する生体分子を産生するエフェクター細胞の存在を同定する方法の上面及び断面を模式的に示す図である。

0042

図17は、本発明の実施形態に係る、標的酵素の機能を阻害する生体分子を産生するエフェクター細胞の存在を同定する方法の上面及び断面を模式的に示す図である。

0043

図18は、第2のタイプのエフェクター細胞の活性化を誘発する分子を表示するエフェクター細胞の存在を同定する方法の上面及び断面を模式的に示す図である。そのエフェクター細胞は、読み出し粒子に効果を有する分子を順番に分泌する。

0044

図19は、第2のタイプのエフェクター細胞の活性化を誘導する分子を分泌するエフェクター細胞の存在を同定する方法の上面及び断面を模式的に示す図である。そのエフェクター細胞は、読み出し粒子に効果を有する分子を順番に分泌する。

0045

図20は、不均一な細胞集団から高親和性を有する抗体を分泌する少なくとも一つのエフェクター細胞の存在を検出する方法の上面及び断面を模式的に示す図である。その細胞集団は、同じ抗原に対して、低い親和性を有する抗体を分泌する細胞を含む。

0046

図21は、本発明の実施形態に係る、抗原の増加した特異性を有する抗体のスクリーニング方法の上面及び断面を模式的に示す図である。異なるエピトープを表示する読み出し粒子が異なる光学的特性によって区別できる。

0047

図22は、均一または不均一なエフェクター細胞の集団において生体分子を分泌する細胞の存在を同時に同定する工程と、分子によって影響を受ける1または複数の細胞内化合物を分析する工程を含む方法の上面及び断面を模式的に示す図である。

0048

図23は、読み出し粒子の複数のセットのエフェクター細胞の細胞外効果を同時に評価する方法の平面を模式的に示す図である。

0049

図24は、ヒト、ウサギ、マウス、ラットのPDGFRαのための細胞外ドメインアライメントである。(上)リボンは、(Shim et al. (2010). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, pp. 11307-11312(その全体が参照により本明細書に組み込まれる))PDGFBBのダイマー複合体中の2つのPDGFRβの細胞外ドメイン(ECD)の構造を示す図である。PDGFRαの同様の構造が期待されたが、利用できなかったので、PDGFRβが示されていることに注意されたい。(下)ECDのアライメントは、ヒト、マウス、ウサギ、ラットのPDGFRαである。ヒトアイソフォームからの変動の領域は、より明るい陰影と、「*」で示される。実質的な変動は、人間から最も変動を有するウサギで、抗体認識に利用可能な多数のエピトープがあることを示している。

0050

図25は、多層ソフトリソグラフィマイクロ流体工学の種々の態様を示す画像を提供する。(A)は、MSL製のバルブ光学顕微鏡写真である。二つの交差微細加工チャネル(一方は活性流体の「フローチャネル」(垂直)、他方はバルブ作動用制御チャネル(水平))は、バルブ構造を作成する。フローチャネルは、「ピンチ弁」を作成するために、薄いエラストマー膜によって制御チャネルから分離される。コントロールチャネル加圧は、フローチャネルを閉鎖するために膜を偏向させる。(B)は、(緑色及び青色食用色素充填された)複数のバルブを一体化するデバイスの断面である。(C)は、合計、16,000個のバルブ、4000個のチャンバ、および3000個以上の層‐層相互接続(矢印)を有するUBCで組み立てられたデバイスの断面である。(D)は、スケール用のペニーとマイクロ流体デバイスの例である。

0051

図26は、本発明の一つのデバイスの概略図である。(A)は、単一の抗体分泌細胞から抗体を選択するためのマイクロ流体デバイスの構造を示す模式図である。(B)は、4032個の分析チャンバのアレイである。各チャンバは、インキュベーション中に隔離され、培地は数分以内に交換される。(C)は、個々のチャンバの拡大図である。細胞、読み出し粒子および試薬は、連続的に注入され、重力により沈降する。画像イメージングは、自動化された明視野蛍光顕微鏡を用いて実行される。

0052

図27は、一実施形態のデバイス製造中に組み立てられている層の概略図である。

0053

図28の(A)は、インフレータブルチャンバデザインの上面図と側面図である。チャンバは、上部に大きな円形の「リップ」を有する円形の形状を有し、かつ薄い膜によって分離された凹部によって覆われている。流路にチャンバを接続するバルブが密封され、細胞が流路の下へロードされる。(B)チャンバに対しバルブが開放され、圧力がチャンバを膨張させるために付与される。これにより、細胞がチャンバの上部に入る原因となる。(C)バルブは、チャンバを密閉するために閉じられ、そして細胞は、チャンバの床に落下する。チャネルは、新鮮な培地でフラッシュされる。(D)バルブが開放され、圧力が解放され、チャンバが当初のボリュームに戻るように「収縮」する。このプロセスの繰り返しは、培地および/または可溶性因子を交換するために使用されてもよい。

0054

図29は、細胞フェンスの片側に粒子を向かわせるために層流の使用を示す本発明の実施形態に係る細胞フェンスを有するマイクロ流体チャンバの概略図である。

0055

図30は、入口チャネルの一方の側に粒子を優先的に向かわせるために、チャンバの入口の上流が制限されていることを示す本発明の実施形態に係る細胞フェンスを有するマイクロ流体チャンバの概略図である。

0056

図31は、PDMSマイクロ流体デバイスの製造に使用される、シリコンウエハ基板上のフォトレジストの複数の層から作られた再利用可能な金型の概略図である。

0057

図32は、粒子サイズに基づいて、粒子を選択的に分離する細胞フェンスの使用を示す本発明の実施形態に係る細胞フェンスを有するマイクロ流体チャンバの概略図である。

0058

図33は、チャンバ(全体のチャンバ寸法は300μmX160μm)の下面に、ウェルのアレイを形成する一連の交差細胞フェンス(複数のエフェクターおよび読み出しゾーンを定義している)を有するチャンバの実施形態の上面図である。

0059

図34は、粒子トラップを規定する一般的な円形部分によって接続された2つの垂直細胞のフェンスを有するチャンバ用の粒子トラップの実施形態(グリッドピッチが2μmである)の図である。

0060

図35は、チャンバ内に特定のサイズの粒子を保持するために、出口に位置された微細加工構造の使用を示す本発明の実施形態によるマイクロ流体チャンバの概略図である。

0061

図36は、チャンバの底部にデッドエンドカップを含むマイクロ流体チャンバの側面模式図である。

0062

図37は、構造要素がエフェクター細胞および読み出し粒子を保持するために流路内に配置された本発明の実施形態によるチャンバの側面概略図である。

0063

図38は、構造要素が大きさに基づいて粒子を保持および分離するためにチャンバ内に連続して配置された本発明の実施形態に係るチャンバの側面模式図である。

0064

図39は、多孔質膜が読み出し粒子からエフェクター細胞を分離するために使用されるマイクロ流体チャンバの連続フロースルー配置の平面模式図である。

0065

図40は、非官能化ビーズの層が読み出し粒子からエフェクター細胞を分離するために使用されるマイクロ流体チャンバの連続フロースルー配置の平面模式図である。

0066

図41は、チャンバ内に粒子を配置するために磁場の使用を示す本発明の実施形態によるマイクロ流体チャンバの概略図である。

0067

図42は、本発明の実施形態に係る粒子を分離する方法の概略図である。その方法は、あるタイプの粒子をチャンバ内のある位置に向かわせるために、磁性粒子が結合される磁場を使用する。磁粒子が結合されない粒子には、効果はないか、ほとんどない。

0068

図43は、細胞フェンスを有するチャンバの実施形態の断面図である。チャンバは、読み出したゾーンに読み出し粒子(ビーズ)のローディングを促進するために傾けられている。

0069

図44は、本発明の実施形態に係る細胞フェンスを有するマイクロ流体チャンバの概略図である。これは、フェンスの一方の側に粒子を優先的に向かわせるためにチャンバの回転の使用を示している。

0070

図45は、エフェクター細胞及び読み出し粒子の差分密度を用いた本発明の実施形態によるエフェクター細胞および読み出し粒子を分離する方法の概略図である。

0071

図46は、チャンバ内の粒子を配置するための誘電場の使用を示す本発明の実施形態に係る集積電極を含むマイクロ流体チャンバの概略図である。

0072

図47は、本発明の実施形態に係るチャンバの平面概略図を示す。エフェクター細胞および読み出し粒子は、別個の入口を介してチャンバに導入されている。

0073

図48は、本発明の実施形態による化合物チャンバの平面模式図である。エフェクターゾーンサブチャンバと読み出しゾーンサブチャンバとが互いに流体連通するように配置されている。

0074

図49は、チャンバの底部にサスペンションエフェクター細胞をとどめるための重力、チャンバの天井で読み出しゾーンの足場依存性読み出し細胞をとどめるための表面機能とを使用して、エフェクター細胞と読み出し粒子とを分離する方法の概略図である。

0075

図50は、浮遊細胞が重力によって一方の側に分離されている間、反対側のみに接着細胞を維持するための官能化されたチャンバの平面模式図である。

0076

図51は、表面上に異なる種類の抗体を提示する粒子を分離するために、2種類の抗体で官能化されたチャンバの平面模式図である。

0077

図52は、マイクロ流体チャンバの直列「フロースルー」配置の平面模式図である。各チャンバは、チャンバ間に位置するバルブによって、その隣のものから隔離されている。

0078

図53は、マイクロ流体チャンバの直列「フロースルー」配置の平面模式図である。各チャンバは、「蓋」構造により、隣のチャンバで共有される流路から分離されている。

0079

図54は、マイクロ流体チャンバの並列「フロースルー」配置の平面を模式的に示す図である。隣接するチャンバは、共通の入口チャネル及び出口バスチャネルを共有する。
図55は、マイクロ流体チャンバの並列「フロースルー」配置の平面を模式的に示す図である。隣接するチャンバは、共通の入口チャネル及び出口バスチャネルを共有する。

0080

図56は、マイクロ流体チャンバの並列配置で使用される「デッドエンド」充填チャンバの上面および側面を概略的に示す図である。

0081

図57は、化合物チャンバの機能を提供することができるデッドエンド充填チャンバの並列配置の模式図である。

0082

図58は、細胞の回収中、細胞の回収用のマイクロ流体機器と、画像シーケンスとの画像である。上の図は、左から右へ流れ、チャンバ内の細胞と細胞回収中の画像シーケンスの光学顕微鏡写真、キャピラリーピアスチャンバルーフ(左端)、吸引、空のチャンバ、およびチューブに細胞を分配するキャピラリー(右端)である。左下の図は、次の(i)〜(viii)を含む特注のマイクロ流体スクリーニング機器の画像である。(i)は、ロボットマイクロマニピュレータに取り付けられたマイクロキャピラリーである。(ii)は、ナノリットル流量吸引/分注用のデジタル空気力学である。(iii)は、X-Y翻訳マウントである。(iv)は、回収管マウント付きインキュベーターインサートである。(V)は、アレイの全域イメージ獲得用のX-Yステージスキャニングである。(vi)は、倒立顕微鏡である。(vii)は、高感度蛍光イメージングのために冷却されたHamamatzCCDカメラである。(viii)は、キャピラリー操作用制御ソレノイドである。右下の図は、細胞の回収用の配置キャピラリーを有するインキュベーターインサートの下に取り付けられたマイクロ流体デバイスの近接撮影である。(C)チャンバ内の細胞と細胞回収中の画像シーケンスの光学顕微鏡写真(左上)、キャピラリーピアスチャンバルーフ(右上)、吸引、空のチャンバ(左下)、およびチューブに細胞を分配するキャピラリー(右下)。(D)細胞回収の性能である。モードIで動作しているときに、複数のチャンバは、分注する前に吸引される。これは、細胞の2段階スクリーニング(濃縮)、または細胞のプールの回収のために使用される。各チャンバからの回収は、約3秒かかる。モードIIで動作している場合、単一のチャンバの内容物は、吸引され、分注される。単一の細胞間にキャリーオーバーがないことを保証するように4回の洗浄工程が続いて行われる。

0083

図59は、テンプレート切替えを使用して、単一の細胞のHV/LVアプローチの概略図である。単一細胞がマイクロチューブ内堆積され、cDNAは、重鎖および軽鎖定常領域を標的とする多重化遺伝子特異的プライマーから生成される。MMLV酵素のテンプレート切替え活性は、得られたcDNAの3 '末端にテンプレート切替えオリゴ逆相補体を付加するために使用される。半ネステッドPCRは、その重鎖および軽鎖の定常領域と、オリゴ切替えコピーテンプレートに相補的ユニバーサルプライマーとをアニールする多重化プライマーを使用する。半ネステッドPCRは、cDNAを増幅し、各単一の細胞のアンプリコンに特異的であるインデックス配列を導入するために使用される。その後、アンプリコンは、プールされ、配列決定される。

0084

図60、従来のハイブリドーマアプローチの概略図である。免疫マウスからの脾細胞骨髄腫細胞と融合させる。低効率では、これらの融合体は、mAbsを分泌することができ、培養で増殖させることができる実行可能な「ハイブリドーマ」を作成する。ハイブリドーマのプールは、増殖され、抗原特異的細胞の存在を検出するためにアッセイされる。その抗原特異的細胞は、その後サブクローニングされ、機能的スクリーニングのための十分なmAbsを生成するために拡張される。独自のハイブリドーマ技術がウサギのために開発されたが、このアプローチは、適切な融合パートナーを必要とし、マウスまたはラットと使用するためにに大きく制限される。典型的な融合は、100未満の安定したハイブリドーマをもたらし、培養およびサブクローニングのために〜9週間を必要とする。

0085

図61は、細胞培養チャンバ、バルブ、およびチャネル接続チャンバを示すラベルを有する薄い膜内に含まれるマイクロ流体チャンバレイの断面図を示す図である。

0086

図62は、図61に示されるマイクロ流体デバイスのチャンバの概略図である。

0087

図63は、2048個の4つサブアレイに配置された8192個のチャンバを有するマイクロ流体デバイスの写真を示す。マイクロ流体チャンバアレイは、エラストマーの300ミクロンの厚さの層内の浸透槽貯水層の下に直接的に位置されている。

0088

図64は、図62に示されたマイクロ流体デバイスの模式図である。

0089

図65は、エフェクター細胞と標的細胞の分離を可能にするマイクロ流体デバイスの概略図である。

0090

図66は、図6のマイクロ流体デバイスの単一ユニット細胞の概略図である。

0091

図67は、図66縦方向点線に沿って切断した断面の顕微鏡写真である。

0092

図68は、図66の水平方向の点線に沿って切断した断面の顕微鏡写真である。

0093

図69は、サイトカイン中和アッセイの実施形態を示す連続の模式図である。

0094

図70Aは、エフェクターゾーン(上)の右端に示される5つのエフェクター細胞と、読み出しゾーン(下)の4つの読み出し粒子とを有する具体化チャンバの平面光顕微鏡画像を示す。

0095

図70Bは、読み出しゾーンの4つの読み出し粒子と関連する蛍光と、エフェクターゾーンの右端でエフェクター細胞に関連するいくつかの蛍光を有する、図70Aに示される具体化チャンバの平面蛍光顕微鏡画像を示す。

0096

図70Cは、エフェクターゾーンに示された一つのエフェクター細胞(左)と、読み出しゾーン(右)内の1つの読み出し粒子とを有する具体化チャンバの平面光学顕微鏡像である。

0097

図70Dは、読み出しゾーンにおける読み出し粒子に関連した蛍光を有する図70Cに示される具体化チャンバの平面蛍光顕微鏡像である。

0098

図70Eは、エフェクターゾーンにおける2つのエフェクター細胞(左)と、読み出しゾーンにおける6つの読み出し粒子(右)とを有する具体化チャンバの平面光学顕微鏡像である。

0099

図70Fは、読み出しゾーンにおける読み出し粒子に関連したいくつかの蛍光を有する図70Eに示される具体化チャンバの平面蛍光顕微鏡像である。

0100

図71は、抗体分泌細胞からの抗体の捕捉および検出のためのワークフローの概略図である。

0101

図72は、ビーズ免疫捕捉アッセイからの蛍光明視野画像、それに続く4.5日間のクローンタイムラプス画像の例である。

0102

図73は、マイクロ流体アレイにおけるCHO抗体分泌細胞の強固な細胞培養物を示している。それは、96マルチウェルプレート播種された単一細胞と、バッチ振盪フラスコとで比較されている。

0103

図74Aは、抗リゾチーム抗体を分泌するHyHEL5ハイブリドーマ細胞がロードされたマイクロ流体チャンバ(上のパネル)と、HyHEL5ハイブリドーマ細胞がロードされなかったマイクロ流体チャンバ(下のパネル)の光顕微鏡写真である。

0104

図74Bは、図74Aに示されるチャンバの光顕微鏡写真である。リゾチームに結合しない「バックグラウンド」抗体を分泌する4B2ハイブリドーマ細胞がHyHEL5細胞に加えて、ロードされている。

0105

図74Cは、蛍光リゾチームとのインキュベーション後、図74Bに示されるチャンバの蛍光顕微鏡写真である。

0106

図74Dは、蛍光抗IgG抗体とのインキュベーション後、図18Cに示されるチャンバの蛍光顕微鏡写真である。

0107

図74Eは、図74Cに示されるチャンバの抗体の蓄積と解放との反応速度論を示すグラフである。

0108

図74Fは、経時的に記録された増殖培地における10 nMのリゾチームと、タンパク質Aとの存在下でインキュベートされた4B2ハイブリドーマ細胞とHyHEL5との混合物を含む600個のチャンバの蛍光を示すグラフである。

0109

図75Aは、抗体を分泌する細胞を含むが、目的の抗原に対する抗体を分泌する細胞を含まないチャンバ内のシグナル欠如の3つの代表的な例を示す。

0110

図75Bは、3つの代表的なチャンバの例を示す。目的の抗原に対する抗体を分泌する単一の細胞は、目的の抗原に特異的でない抗体を分泌する複数の細胞のバックグラウンドの中で検出される。

0111

図75Cは、目的の抗原に対する抗体を分泌しないハイブリドーマ細胞のみを含むチャンバの全てにおける蛍光信号ヒストグラムを示す。

0112

図75Dは、目的の抗原(ニワトリ卵白リゾチーム)に対する抗体を産生するHyHEL5ハイブリドーマ細胞と、異なる光源に対する抗体を産生するDMS-1ハイブリドーマ細胞との混合物を含有するチャンバにおける蛍光信号のヒストグラムを示す。

0113

図76Aは、固定されたK562細胞上でヒトCD45に対する抗体を分泌する単一のハイブリドーマ細胞(4B2)の概略図である。細胞とビーズは、インキュベーションに続き検出抗体で染色される。

0114

図76Bは、単一のハイブリドーマを含むチャンバと、空のチャンバとの自動画像解析により測定された読出し細胞およびビーズの平均蛍光強度を示す。

0115

図76Cは、左から右へ、単一のハイブリドーマ細胞を有するチャンバを示す。同一チャンバ内で抗CD45抗体染色の明視野画像、蛍光画像および統合画像は、標的固定K562細胞との一晩のインキュベーションおよびプロテインAビーズとの2時間のインキュベーションに続いている。

0116

図77Aは、免疫化および結合アッセイの概略図である。マウスは、卵巣癌細胞(TOV21G)からライブ細胞で免疫された。抗体分泌細胞は、FACSを用いて選別され、次いで、マイクロ流体デバイスに注入され、CFSEで染色された読み出し細胞(固定ライブTOV21G細胞)と共にインキュベートされた。結合抗体は、二次標識抗体を用いて可視化されている。

0117

図77Bは、チップ上にロードした後の形質細胞および読み出し細胞(ライブおよび固定)を示す。読み出し細胞は、同定するためにCFSEで染色されている。ライブ細胞や固定細胞の細胞表面に結合する抗体は、二次標識抗体を用いて可視化されている。右端に、読み出し細胞に非常に低い信号を有するネガティブチャンバを示している。

0118

図78は、(A)8日間成長させたマウスASC、及び(B)5日間増殖させたヒトのASCのELISPOTによる細胞生存および抗体分泌を示す画像である。ウェルあたり播種された細胞数が示されている。

0119

図79は、卵巣癌細胞で免疫したマウスからのASC選択を示す。(A)は、PE抗マウスCD138で染色されたマウス脾臓細胞蛍光活性細胞選別を示すプロットである。ゲーティングは、CD138 +集団を示している。(B)は、ソートされていない脾臓コントロール、CD138-コントロール、およびCD138 +集団からの抗体の分泌を示すELISPOTである。ウェルあたりプレートされた細胞数が示されている。(C)は、各集団用にプレートされた細胞あたりの%スポットとしてELISPOTカウントを示すグラフである。

0120

図80は、インフルエンザで免疫したウサギからのASC選択を示す。(A)は、ER-トラッカーおよびマウス抗ウサギIgGを用いて、ウサギPBMCの蛍光活性化細胞選別を示すプロットである。ゲーティングは、ERhighIgGlow集団の選択を示す。(B)は、ソートされていないPBMCコントロール、ERhighIgGlow集団、および無細胞コントロールからの抗体の分泌を示すELISPOTである。ウェルあたりプレートされた細胞数が示される。(C)は、ソートされていないPBMCコントロールおよびERhighIgGlow集団のためにプレートされた細胞あたりの%スポットとしてELISPOTカウントを示すグラフである。

0121

図81Aは、濃縮の前の抗原特異的ポジティブチャンバからの明視野(上)および蛍光(下)画像の代表的な例を示す。

0122

図81Bは、一晩の培養と回収後のマルチウェルプレート中の細胞を示す。

0123

図81Cは、濃縮した後の単一細胞希釈でロードされた抗原特異的ポジティブチャンバの明視野(上)および蛍光(下)画像の代表的な例を示す。

0124

図81Dは、濃縮前後、H1N1-ポジティブチャンおよびH3N2-ポジティブチャンバの頻度を示す。

0125

図82は、2つのチャンバを示す光学顕微鏡画像である。それは、抗体(上)を分泌する2つのチャンバの少なくとも一つと、任意のエフェクター細胞(下)がないもう一つのチャンバとともに複数のエフェクター細胞を含む。読み出し粒子は、分泌された抗体が、存在し(上)、抗体分泌エフェクター細胞(下)の不存在下で分散したままである時、凝集体を形成する。

0126

図83は、16Gにおける2つのチャンバを示す蛍光顕微鏡画像である。それは、抗体(上)を分泌する2つのチャンバの少なくとも一つと、任意のエフェクター細胞(底)なしのもう一つのチャンバとともに、複数のエフェクター細胞を含む。両方のチャンバは、細胞外効果の存在を決定するために、蛍光標識された抗ヒト抗体で染色されている読み出し粒子(プロテインAビーズ)を含む。

0127

図84Aは、実施例13に示された実験を示す図である。

0128

図84Bは、標識抗原の濃度が異なるマイクロ流体チャンバの光学顕微鏡写真である。

0129

図84Cは、異なる親和性を有する抗体を分泌する単一のハイブリドーマ細胞(HyHEL5とD1.3)とのインキュベーション後、標識された抗原(鶏卵リゾチーム)の異なる濃度でのビーズの蛍光強度のグラフである。

0130

図84Dは、異なる親和性を有する抗体を分泌する単一のD1.3とHyHEL5細胞とのインキュベーション後および異なる濃度の抗原(ニワトリ卵白リゾチーム)で標識した後、図84Bにおける画像に対応したビーズの蛍光強度を示すグラフである。

0131

図85は、分離維持された各チャンバのバルブを閉じた状態でインキュベーションした後、H3N2に対する抗体を分泌するヒト血漿細胞を含むマイクロ流体アレイの断面を示す。

0132

図86は、隔離バルブを用いずにインキュベートした後、H3N2に対する抗体を分泌するヒト血漿の細胞を含有するマイクロ流体アレイの断面を示す。チャンバは、流路によって接続されたままであることを可能にする。

0133

図87は、ニワトリ卵白リゾチームに対する抗体を産生する二つの単一の一次マウス血漿細胞用マイクロ流体スクリーニングによって得られる親和性測定の代表的な例を示す。

0134

図88は、HyHEL5ポジティブチャンバ中のビーズの残りの蛍光レベルが、洗浄の終了時にチャンバの残りの部分よりも高いことを示す棒グラフである。

0135

図89Aは、不均一な細胞(赤血球およびヒトB細胞)集団を含むチャンバの上面光学顕微鏡の例である。

0136

図89Bは、不均一な細胞集団と、読み出し粒子の集団(プロテインAビーズ)とを含むチャンバの上面光学顕微鏡の一例である。

0137

図84Cは、不均一な集団中の少なくとも1つの細胞がヒトIgG抗体を分泌することを示すチャンバの上面蛍光顕微鏡の一例である。抗体は、Dylight594結合抗ヒト抗体で染色された読み出し粒子によって捕獲された。

0138

図89Dは、チャンバ内にH1N1抗原を流した後、不均一な細胞集団と、読み出し粒子の集団とを有するチャンバの上面光学顕微鏡の一例である。

0139

図89Eは、チャンバ内にH1N1抗原を流した後、読み出し粒子(プロテインAビーズ)の集団とともに不均一な細胞集団の平面蛍光顕微鏡の一例である。H1N1抗原は、全IgG染色からの抗原特異的な染色を区別するように、4Dylight88に結合された。

0140

図89Fは、細胞の回収後のチャンバの上面光学顕微鏡の例である。

0141

図90は、マルチウェルプレートにおいて、PathHunter(登録商標)eXpressCCR4 CHO-K1のβアレスチンGPCRアッセイを用いる化学発光シグナル伝達アッセイの一例を示す。

0142

図91は、実験の概略図である。ヒトボランティアは、形質細胞を濃縮するためにフローサイトメトリーで選別され、回収された季節性インフルエンザワクチン末梢血単核細胞(PBMCs)で免疫化された。細胞は、マイクロ流体デバイス内に注入され、H1N1およびH3N2特異性についてアッセイされた。

0143

図92は、プロテインAビーズを有するチャンバ内の単一ヒト形質細胞の例である。ビーズ上に捕捉され分泌された抗体は、H1N1とH3N2の両方の標識抗原に結合する。したがって、その抗体は交差反応性である。標識抗ヒトIgGは、総IgG分泌の可視化を可能にする。

0144

図93は、マイクロ流体デバイスで一晩のインキュベーション中、分割され(右上)、ビーズアッセイを使用してインフルエンザに対する抗体を産生する(左下)ように同定された一次ヒト抗体分泌細胞(左上)の一例を示す図である。

0145

図94は、マイクロ流体デバイス内の単一細胞スクリーニングの後、抗体の重鎖および軽鎖遺伝子特異的PCR生産物のSizeSelect(登録商標)の2%アガロースゲルの写真である。レーンI〜IVはそれぞれ、サンプル3〜6の重鎖PCR増幅の生産物を示す。レーンVは、核酸ラダーを示す。レーンVI〜VIIIはそれぞれ、サンプル3,5,6のκ鎖PCR増幅を示している。レーンIXは、サンプル4のラムダ鎖のPCR増幅を示している。

0146

図95Aは、インフルエンザに対する抗体を分泌する2つの単一細胞からの重鎖および軽鎖の両方の増幅を示すゲルである。

0147

図95Bは、H1N1およびH3N2に対する抗体を分泌する2つの細胞からの可変重および軽アミノ酸配列を示す。

0148

図95Cは、H1N1とH3N2の両方と交差反応する組換えヒトmAbsの機能的検証である。

0149

図96Aは、読み出し捕捉ビーズ上の蛍光シグナルによって検出されたH1N1に対する抗体を分泌する少なくとも一つのエフェクター細胞を含有するウサギ血漿細胞の不均一な集団を有する容器の一例を示す図である。

0150

図96Bは、読み出し捕捉ビーズ上の蛍光シグナルによって検出されたH3N2に対する抗体を分泌する少なくとも一つのエフェクター細胞を含有するウサギ血漿細胞の不均一な集団を有する容器の一例を示す図である。

0151

図97Aは、複数の濃縮されたウサギ血漿細胞でロードされた4つのチャンバの明視野画像を示す。

0152

図97Bは、H1N1を検出した後の図123Aのチャンバの蛍光画像を示す。すべてのチャンバは、陰性であり、H1N1に対する抗体を分泌する細胞を含んでいない。

0153

図97Cは、H3N2を検出した後の図123Cのチャンバの蛍光画像を示す。チャンバは、可変ビーズ強度を示すが、それらのすべてが陽性であり、H3N2に対する抗体を分泌する少なくとも一つの細胞を含む。

0154

図97Dは、図123CにおけるH3N2陽性マイクロ流体チャンバからの回収後、ウサギの細胞から増幅された重鎖および軽鎖を示すゲルである。

0155

図98は、濃縮のために再注入する直前に、注入ポートに近づいている回収された細胞でロードされたキャピラリーの画像を示す。

0156

図99は、抗体のクローニング、発現および特徴付けによって、ヒト抗体配列の検証の一例を示す図である。

0157

図100は、マイクロ流体デバイスから回収されたハイブリドーマ単一細胞のRT-PCR増幅からのバンドを示すゲルである。

0158

図101は、マイクロ流体デバイスでスクリーニングされた単一のD1.3およびHyHEL5ハイブリドーマ細胞から取得された配列の組換え発現と、ハイブリドーマ(D1.3とHyHEL5)によって産生された抗鶏卵リゾチーム抗体の親和性を比較したグラフである。抗マウス抗体捕捉ビーズは、D1.3およびHyHEL5抗体を発現する組換えHEK293細胞またはハイブリドーマからの細胞上清と共にインキュベートされ、洗浄され、異なる濃度の標識された抗原でインキュベートされた。蛍光測定は、組換えにより産生された抗体の結合特性を検証するために、最も高い抗原濃度で最大のビーズの強度に正規化された。

0159

図102は、R05C14抗体を一時的に発現するHEK293細胞またはHEK293細胞(対照)からの上清とインキュベートされ、続いて、標識されたニワトリ卵白リゾチーム(10nM)とインキュベートされたビーズの蛍光強度を示すグラフである。ニワトリ卵白リゾチームに対する新規マウス抗体の結合は、配列R05C14がマイクロ流体スクリーンで抗原特異的として同定された一次マウス血漿細胞から得られた後、確認された。

0160

図103Aは、40〜60℃のRT温度の勾配を用いて、実施例25に記載の方法によって産生されたアンプリコンを示すPCRゲルの画像である。

0161

図103Bは、図103Aに示される400〜600塩基対のバンドのサンガー法による配列決定の結果を示す。配列を整列し、D1.3の重鎖の可変領域配列に一致することを確認した。

0162

図104Aは、次世代シークエンシングに基づいたIgGレパートリーの機能的解釈の方法の概略図である。
図104Bは、次世代シークエンシングに基づいたIgGレパートリーの機能的解釈の方法の概略図である。
図104Cは、次世代シークエンシングに基づいたIgGレパートリーの機能的解釈の方法の概略図である。

0163

図105Aは、異なる蛍光強度のビーズを用いた抗原検出多重化の概略図である。

0164

図105Bは、マイクロ流体チャンバ内にロードされた3種類の読み出しビーズの明視野像である。

0165

図105Cは、マイクロ流体チャンバ内の抗原および異なる強度を有する3種類の読み出しビーズの蛍光画像である。

0166

図105Dは、信号を表示するH1N1でコーティングされたビーズ(矢印)のみで、ウサギ抗H1N1抗体および二次抗ウサギ抗体との検出後の3種類の読み出しビーズの蛍光画像である。

0167

図105Eは、異なるインフルエンザ株でコーティングされ、蛍光強度に基づいて区別された3種類のビーズのH1N1検出後の信号を示す。

0168

図106Aは、TNF-α濃度の関数として、アクチノマイシンDの存在下、L929細胞の毒性応答を示す。

0169

図106Bは、TNF-αおよびアクチノマイシン-Dの存在下、マイクロ流体デバイス内で培養されたL929細胞を使用するアポトーシス壊死アッセイを示す。

0170

図107Aは、TNFα機能アッセイからのタイムラプス蛍光顕微鏡画像を示す。(A)上のパネル:TNFαリガンド非存在下、蛍光局在は細胞質である。中央のパネル:TNFαリガンド10ng / mLにより活性化されると、細胞質から核の蛍光の変化が観察される。下のパネル:TNFαリガンド10ng / mLに加え、TNFαリガンドを中和する抗体を含む細胞上清の存在下、蛍光局在は細胞質のままである。

0171

図107Bは、核蛍光局在化を示す活性化細胞の頻度を示すプロットである。定量した細胞の数がnで示されている。

0172

図108は、個々のマイクロ流体チャンバにおけるSKBR3細胞集団の0日、1日、3日後の光学顕微鏡写真を示す。SKBR3細胞は、LC3-GFPレポーターを含んでいる。

0173

図109Aは、CEFペプチドで活性化された後、IFNγ捕捉ビーズの存在下でインキュベートされた末梢血単核細胞の集団を含むチャンバの明視野像を示す。

0174

図109Bは、CEFペプチドで活性化された後、IFNγを分泌する少なくとも一つの活性化T細胞を含むチャンバの蛍光画像を示す。

0175

図109Cは、CEFペプチドで活性化された後、5日間培養されたT細胞クローンを含むチャンバの明視野像を示す。

0176

図109Dは、CEFペプチドで刺激された末梢血単核細胞の集団中の抗原特異的T細胞の数を測定するELISPOTと比較して、マイクロ流体アッセイを使用する方が感度が高いことを示す。

0177

図110は、細胞生存PDGFRα機能的細胞外効果アッセイから、3つのサブアレイからのチャンバの蛍光顕微鏡像である。T=48時間で、(A)リガンドの不存在下または(B)PDGF-AAの25ng/ mLの存在下、PDGFRαおよびヒストン2B-YFPを発現するBaF3クローンにおいて、YFP蛍光読み出しを示している。挿入図は、個々のマイクロ流体チャンバを拡大する。図110Cは、マイクロ流体デバイス中での12、24、36および48時間の培養後、ライブ読み出し細胞集団(PDGFRAを過剰発現させているBaF3、白い矢印)と共培養され、少なくとも1つのエフェクター抗体分泌細胞を含む濃縮化マウス脾細胞(2細胞、黒い矢印)の集団の顕微鏡写真を示す。

0178

図111は、プレート系アッセイから得られた蛍光画像を示す。そのアッセイにおいて、PathHunter(登録商標)eXpressCCR4 CHO-K1のβアレスチンのGPCRレポーター細胞は、異なるの濃度のアゴニストCCL22、その後に続く異なる濃度の基質C12FDGでインキュベートされた。GPCR CCR4の活性化は、βガラクトシダーゼ酵素の相補性の原因となり、順番に蛍光生成物中の基質を切断した。

0179

図112Aは、マイクロ流体GPCRシグナル伝達アッセイの明視野蛍光画像を示す。そのアッセイにおいて、PathHunter(登録商標)eXpressCCR4 CHO-K1のβアレスチンのGPCRレポーター細胞は、マイクロ流体デバイスにロードされ、90分間C12FDG基質でインキュベートされた。その後、90分間、異なる濃度のアゴニストCCL12とのインキュベートが続いた。アゴニストによるGPCR CCR4の活性化は、βガラクトシダーゼ酵素の相補性の原因となり、順番に蛍光生成物中の基質を切断した。

0180

図112Bは、図112Aに示すように、基質C12GDFおよび異なる濃度のアゴニストCCL12とインキュベートされたPathHunter(登録商標)eXpressCCR4 CHO-K1βアレスチンGPCRレポーター細胞の蛍光強度の測定値を示すグラフである。

0181

本明細書で使用される、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈から明らかに別の指示がない限り、複数の場合を含む。したがって、例えば、「もの」は、一つのそのようなもの以上のものを含む。ここに記載された参考文献は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。

0182

明細書中で使用される「読み出し」は、細胞外効果が報告される方法を指す。本明細書に記載されるように、「読み出し粒子集団」は、一つ以上の読み出し粒子を含むことができる。

0183

本明細書で使用される「細胞外効果」とは、エフェクター細胞の細胞外にある読み出し粒子の直接的または間接的な効果である。それは、特に限定されないが、増加した細胞増殖、減少した増殖、アポトーシス、溶解、分化、感染、結合(例えば、細胞表面受容体またはエピトープへの結合)、形態変化、誘導またはシグナル伝達カスケードの阻害、酵素阻害、ウイルス阻害、サイトカイン阻害、補体の活性化を含む。本明細書で提供されるように、一実施形態では、細胞外効果は、エフェクター細胞によって分泌される目的の生体分子の読み出し粒子への結合である。別の実施形態では、細胞外効果は、読み出し細胞またはアクセサリー細胞のアポトーシスなどの応答である。

0184

本明細書において提供される方法は、細胞外効果の変動を提示するエフェクター細胞を含む細胞集団またはエフェクター細胞を同定するために使用される。細胞外効果の変動は、コントロール(陰性または陽性対照)と比較される変動、または1または複数の他の細胞集団と比較される変動である。

0185

特に粒子または不均一な細胞集団に関して、本明細書で言及される「不均一な集団」は、異なる機能を有する、少なくとも2の粒子または細胞を含む粒子または細胞の集団を意味する。例えば、一実施形態における特徴は、形態、大きさ、蛍光レポーターの種類、異なる細胞種、表現型、遺伝子型、細胞分化型、1または複数の発現されたRNA種の配列または機能的特性である。

0186

本明細書で言及される「亜集団」とは、粒子(細胞)の大きな集団の割合を意味する。一実施形態では、細胞の集団は、例えば、個々のマイクロ流体チャンバ内の個々の亜集団を単離することによって、亜集団に分割される。さらに、個々の亜集団は、例えば、複数のマイクロ流体チャンバまたは他の反応容器中で、さらなる亜集団に分割されることができる。亜集団は、同じマイクロ流体チャンバ内に位置された大きな集団内の粒子のほんの一部であってもよい。亜集団は、1または複数の粒子を含み、複数の粒子は、亜集団中に存在する。複数の粒子内の個々の粒子は、互いに対して均一または不均一であることができる。

0187

一つの態様において、「細胞固定器具」は、連続的又は断続的に、少なくとも一つのエフェクターゾーンと、少なくとも一つの読み出しゾーンとを規定する。固定器具は、バルブ、細胞フェンス、外部フィールドまたはフィールド勾配(例えば、重力、磁気電磁気加速度など)の方向付け電極または光学部品または磁気プローブ細胞接着を促進または阻害する表面修飾(例えば、テクスチャリング、コーティング等)によって局所的に生成されたフィールドの局在化および/または方向付け、または、チャンバ内の溶液比重によって局所的に生成されたフィールドの局在化および/または方向付けのような構造的要素であってもよく、またはこれらの1または複数の組み合わせであってもよい。

0188

本明細書で使用する「コーティング」は、チャンバの表面に付着するエフェクター細胞または読み出し粒子の能力を促進または阻害するチャンバ表面へのいずれの添加であってもよい。コーティングは、以下の1または複数から選択される。それは、細胞、ポリマーブラシ高分子ヒドロゲル自己組織化単分子膜(SAM)、フォトグラフト分子、細胞結合特性を有するタンパク質またはタンパク質断片(例えば、アクチンフィブロネクチンインテグリン、プロテインA、プロテインGなどからの細胞結合ドメイン)などである。より一般的には、アルギニン‐グリシン‐アスパラギン酸(セリン)(RGD(S))のペプチド配列モチーフが使用される。ポリ-L-リシンはまた、静電相互作用を介して細胞接着を強化するために、PDMSを有するポリマーコーティングとして広く使用されている(細胞結合性を有するリン脂質、細胞結合特性を有するコレステロール、細胞結合特性を有する糖タンパク質および細胞結合特性を有する糖脂質)。また、ビオチン化生体分子を使用するPDMS表面機能は、シンプルで、非常に魅力的であり、かつ柔軟なアプローチである。疎水性ドメインのために、ウシ血清アルブミンBSA)がPDMS表面上の疎水性効果によって容易に吸着することは、広く知られている。そのPDS表面は、チャンバにおけるストレプトアビジン系複合体(タンパク質、DNA、ポリマーフルオロフォア)の更なる直接結合を可能にする。疎水性のポリエチレングリコール系重合体はまた、バイオファウリング特性のために知られており、PDMS表面(吸着、共有結合グラフト化)上に塗布されることができる。それにより、細胞接着を防止している。ポリ(パラキシキシレン)、例えば、パリレンCはまた、PDMSの表面上に化学蒸着(CDV)を使用して堆積され、細胞の付着を防止することができる。

0189

本明細書で使用される「単離される」とは、特定のチャンバがマイクロ流体デバイスの別のチャンバの粒子または生体分子を用いて分析されたエフェクター細胞および/または読み出し粒子の実質的な汚染を認めないという状況を指す。このような単離は、例えば、化合物のチャンバの場合には、チャンバのセットまたは一つのチャンバを密封することによって、チャンバ間の流体連通を制限することによって、またはチャンバ間の流体の流れを制限することによって、成し遂げられる。

0190

本明細書中で使用される「入口」または「出口」は、流体がチャンバ内に流れるおよびチャンバの外に流れる任意の開口を含む。流体の流れは、その周囲環境からチャンバを分離するために、入口または出口もしくはその両方を介して制限されてもよい。1または複数のバルブがあってもよく、流れは、流れを防止する層(たとえば、制御層又は絶縁層)を有する入口および出口に至る流体流路を制限することによって制御されてもよい。あるいは、流れは、流体がデバイスを通過する速度によって調節されてもよい。入口または出口はまた、エフェクター細胞または読み出し粒子、または分析中に必要とされるような流れで運ばれる他の成分を運ぶためのデバイスに流体の流れを提供してもよい。いくつかの実施形態では、入口と出口は、流体が入口側から出口側に向かって流れるチャンバの頂部で単一の開口によって提供されてもよい。

0191

本明細書中で使用される「磁石」は、任意の強磁性体または常磁性材料を含む。本明細書で使用される「強磁性体」は、鉄、ニッケルクロムコバルトまたはそれらの組み合わせおよび種々の合金で構成される材料を含むという意味である。その結果、磁性材料は、磁石に引きつけられ、または磁石自体である。例えば、磁性材料は、強磁性ステンレス鋼から作られてもよく、磁性を有するステンレス鋼または希土類磁石から作られてもよい。磁石はまた、規定された形状または配向における磁性流体を使用することによって作られていてもよい。磁石はまた、電流通電されたたとき、磁界を発生するように設計されたコイルまたは他の電気的に作動するデバイスを用いて実現されてもよい。

0192

本明細書中で使用される「ウェルのアレイ」は、特定の読み出しゾーンまたはエフェクターゾーンに一つまたは他を局在化することによって、エフェクター細胞および/または読み出し粒子の移動を制限するチャンバ内の構造体の任意の配列を意味する。ゾーン(すなわち、エフェクターまたは読み出し)は、粒子の種類がその中に存在することによって定義される。例えば、ウェルのアレイの一実施形態は、図33に示されている。連続して交差する細胞フェンスは、チャンバの表面上のウェルのアレイを形成する。

0193

本明細書中で使用される「粒子トラップ」は、アッセイ中、動きを制限するように特定の空間位置にエフェクター細胞または読み出し粒子(ビーズ)を空間的にとどめることが可能な構造を意味する。「細胞フェンス」は、一種の「粒子トラップ」である。一実施形態では、「エフェクター細胞トラップ」と呼ばれる場合に、粒子トラップは、エフェクター細胞をとどめるために使用される。いくつかの実施形態では、「読み出し粒子トラップ」または「読み出し細胞トラップ」と呼ばれる場合に、粒子トラップは、読み出し粒子をとどめるために使用される。一実施形態では、「粒子トラップ」は、固定位置を有するようにトラップされた粒子を可能にする。固定位置を有することは、撮像及び画像解析単純化する。読み出し粒子または粒子のために固定位置を有することも、エフェクター細胞と読み出し粒子との間の拡散距離を制御するまたは制限するという利点を有する。また、固定位置を有することは、エフェクター細胞および読み出し粒子の相互作用を防止することができる。

0194

本明細書で使用されるように、「テクスチャ加工表面」は、チャンバ表面への細胞接着を促進するか、または低減させる任意のタイプの表面改質であってもよい。例えば、表面は、バンプ、へこみ、粗さ、突起フックペグ、ウェル、溝、隆起部、粒子、模様ウェブ、疎水性、親水性等の1以上でテクスチャード加工されてもよい。

0195

人間の体は、どんなときでも、数百万から数十億の異なる種類の抗体を作成する。それらは、「抗体分泌細胞」また「ASC」と呼ばれる異なる単一形質細胞によって産生される。各ASCは、約7μm〜約15μmの直径を有し、供給源に応じて、人間の髪の毛の幅の約1/10の直径を有し、微量の抗体のみを生成する。ヒトの体内における数十億の異なるのASCのうち、ごくまれな数が治療薬として使用するのに適している抗体を産生する。従来の形式の容量で分析すると、この少量の抗体はとても希薄であり完全に検出不能である。この理由のため、現在、抗体の発見は、各ASCを分離し、ハイブリドーマを作成する不死癌細胞と融合し、「成長」させることを必要とする(図60参照)。結局のところ、測定するために十分な抗体を産生することができる何千もの同一の細胞を生成している。例えば、McCullough and Spier (1990).バイオテクノロジーにおけるモノクローナル抗体:理論と実用化、第2章、ケンブリッジ大学出版局(これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる)を参照されたし。このプロセスは、信じられないほど非効率的(出発免疫細胞の99.9%が失われている)だけでなく、非常に遅く、高価であり、治療機能テストすることができる前に、最小3ヶ月の労力を必要とする。その結果、最適な治療特性を有する抗体の発見は、薬剤開発の主要な未解決のボトルネックである。

0196

ASCは、培養で直接増殖されることができない最終分化細胞である。上述したように、この問題を克服するための既存の方法(例えば、ハイブリドーマ法、図60を参照)は非常に非効率的であり、抗体多様性(通常は<0.1%)のごく一部を捕捉している。これらのアプローチは、げっ歯類での使用に制限され、非常に遅く、高価である。治療機能を試験することができる前に、数ヶ月の労力を必要としている。以下に説明するように、本発明は、供給源に関係なく、抗体とASCに直接機能的アッセイを可能にすることによって、これらの制限を克服している。

0197

様々な技術は、抗体スクリーニングの速度およびスループットを向上させるために進歩しているが、これらの技術は、情報を使用して進歩している。具体的には、既存の技術は、結合、親和性および特異性に基づいて、抗体の選択に制限されている。研究用途のために十分であるが、多くの治療への応用は、標的への単なる結合より、結合する高親和性抗体を必要とする。むしろ、治療への応用は、所望の生物学的応答を誘導する抗体を必要とする(例えば、アゴニスト/細胞シグナル伝達アンタゴニスト免疫応答の活性化;アポトーシスの誘導;細胞増殖や分化の阻害)。現在、すべてのハイスループット抗体の検出技術は、この機能的特徴付けが、標的の結合が評価された後、下流で実行されることを必要とする。それにより、ハイブリドーマ手法と比較しても、面倒で費用がかかり、低スループットである方法を用いている。このため、40年以上前に開発されたハイブリドーマ方法は、まだ治療用抗体発見において主力である。

0198

一態様において、本発明は、目的の性質(以下、「細胞外効果」と称す)のための細胞集団をスクリーニングするために、マイクロ流体プラットフォームの大規模並列アッセイの能力と、小さな反応容積とを活用する。各細胞集団は、必要に応じて1または複数のエフェクター細胞を含む。細胞外効果は、特定の効果に限定されるものではなく、むしろ、結合特性(特異性、親和性)または機能的特性であってもよい(例えば、細胞表面受容体のアンタゴニズムまたはアゴニズム)。一実施形態では、細胞外効果は、特定のエフェクター細胞の分泌物によって発揮される効果である。

0199

本明細書に提供される統合されたマイクロ流体デバイスおよび方法は、一部、小さいものが敏感であるというコンセプトに基づいている。それぞれのデバイスは、何千ものナノリットルの体積細胞分析チャンバを含む。各チャンバは、従来のプレート系アッセイよりも約10万倍小さい。これらの小さなナノリットルのチャンバにおいて、単一エフェクター細胞のそれぞれは、数分以内に分泌される生体分子を高濃度で産生する。例えば、各ASCは、数分以内に、抗体を高濃度で産生する。この濃度の効果は、一実施形態では、細胞系スクリーニングアッセイを実行するために利用される。このアッセイは、細胞表面受容体活性の調節(例えば、アゴニズムまたはアンタゴニズム)などのような特定の機能的特性を有する単一の第1のASCによって作られる抗体を特定する。本明細書で提供される方法およびデバイスを使用するために適した機能的アッセイを以下に詳細に説明する。重要なことに、本明細書で提供されるスクリーニング方法において、細胞外効果の存在が、細胞集団を含む特定のマイクロ流体チャンバ内で検出されるかぎり、特定の性質を有する特定のエフェクター細胞またはエフェクター細胞の亜集団は、特定される必要がない。効果が測定されるチャンバ内の細胞のいくつかまたは全ては、細胞外効果の原因となる細胞または特定な細胞を同定するためのさらなる特徴付けのために回収される。スクリーニング前の細胞培養の必要性を完全に排除することによって、本明細書中に提供される単一細胞アプローチは、1回の実行につき100,000個の細胞より多いスループットで、わずか数日で、任意の種から機能的抗体の直接的な選択を初めて可能にする(図1)。

0200

本明細書で提供されるマイクロ流体デバイスおよび方法は、単一細胞の細胞外効果(例えば、単一のASCによって分泌された抗体の細胞外効果)を評価するために現在利用可能な戦略上の利点を提供する。例えば、本明細書に記載されるデバイスは、拡大縮小が可能であり、試薬消費量の減少とスループットの向上が、研究用の大規模な単一細胞アッセイプラットフォームを提供することができる。そうでなければ、研究は非現実的または非常に高価である。また、現在利用可能な単一細胞アッセイプラットフォームは、下流分析(例えば、定量PCR)に必要な製品を生成するために、従来のチューブ内において、複数の細胞の取り扱いおよび処理ステップを必要とする。したがって、本明細書に記載されているようなマイクロ流体細胞の取り扱いと処理を含めることは、小容量の制限を通じて精度と感度を向上させながら、改善されたスループットおよびコストに対して重要な手段を提供する。

0201

理論に束縛されることなく、正確な細胞の取り扱いおよび操作(例えば、培地条件の時空基準コントロール)と同時に、本明細書で提供されるナノリットルマイクロ流体チャンバによって与えられる濃度の向上と迅速な拡散混合は、免疫細胞(例えば、B細胞、T細胞およびマクロファージ)などのエフェクター細胞の単一細胞分析を可能にする。その免疫細胞の主要機能は、抗体およびサイトカインのような異なるエフェクタータンパク質の分泌を含んでいる。

0202

本明細書に記載の実施形態は、1または複数のエフェクター細胞を含む細胞集団から分泌された産物の多細胞アッセイを実施することのできる方法と、マイクロ流体システムとを提供し、続いて、その後の分析のための細胞集団の回収を提供する。いくつかの実施形態において、細胞集団は、不均一の細胞集団である。すなわち、集団中の2つ以上の細胞は、遺伝子型、表現型、またはいくつかの他の特性において異なる。さらに、細胞集団は、1つのデバイス上で並行にアッセイされる。少なくとも2つの集団は、互いに対して不均一である(例えば、細胞の異なる数、細胞型等)。本明細書に記載のアッセイにおいて、読み出し粒子集団は、1または複数の読み出し粒子を含む。その読み出し粒子は、検出試薬(例えば、細胞受容体を発現する読み出し細胞、読み出しビーズ、センサー、可溶性酵素など)が、検出される読み出し信号のために十分な濃度(例えば、蛍光シグナル)で、1または複数のエフェクター細胞を含む細胞集団と、1または複数のエフェクター細胞からの分泌された生産物とにさらされるように働く。いくつかの実施形態で、読み出し信号は、1または複数の読み出し粒子(例えば、読み出し細胞)の集団における1または複数のエフェクター細胞によって誘発される生物学的応答/機能的効果(例えば、アポトーシス)を報告する。例えば、所与のASCから産生される抗体にとって、ASC、または、読み出し粒子および必要に応じてアクセサリー検出試薬とともに1または複数のASCを含む細胞集団は、デバイス上に小さい体積で隔離されている。そして、アッセイが実行される(チャンバは、約100pL〜50nLの容積を有する。例えば、約1 nL〜約5 nL)。重要なことに、一実施形態におけるエフェクター細胞は、稀な細胞であるため、本明細書に記載した方法によってアッセイされた全ての細胞集団は、最初にエフェクター細胞を含むとは限らない。例えば、数千の細胞集団が単一のデバイスでアッセイされる場合、一実施形態では、チャンバの一部のみが、エフェクター細胞を含む。本明細書において提供される方法は、エフェクター細胞とチャンバの同定を可能にする。

0203

本発明は、前述のマイクロ流体の方法とは異なるアプローチを採用する。後者は、個々のチャンバにおいて、単一の細胞の数を最大化するような密度で単一細胞をロードする方法を取る(例えば、液滴またはマイクロウェルが使用される)。これは、限界希釈法によって単一細胞を単離し、これに続く、単一の細胞を含むチャンバまたは容量の一部の分析によって達成される。このような戦略は、スループットを犠牲にする。なぜなら、最適な単一細胞のロードが、ウェル平均密度あたり約1個の細胞で達成されるからである。同様に、これらの方法について記載した配列は、通常、チャンバ内の少数の細胞よりも多くできず、多くの場合において、単一の細胞のみを物理的に収容するように設計されている。減少したスループットのほかに、多くの技術的課題は、単一のマイクロ流体チャンバで単一細胞を単離およびアッセイするアプローチから生じる。例えば、栄養枯渇エアレーションの必要性、不要な蒸気透過効果、コントロール不良の培地条件、および廃棄物の除去の必要性が原因で、個々の細胞を生かし続けること、不均一の集団から有意義な読み出しを実現するために十分な細胞濃度を達成することは、信頼性の高い、再現可能な単一細胞のマイクロ流体アッセイを達成するために深刻な問題を引き起こす。多くの機能的アッセイで、細胞増殖の阻害と同様に、数日間生存するエフェクター細胞および読み出し細胞の両方を維持することが必要である。このようなアッセイは、マイクロウェル系システムおよび液滴において現実的ではない。しかし、本明細書で説明するように、本発明は、数日にわたるアッセイのために堅牢なプラットフォームを提供する。

0204

本明細書に記載のデバイスおよびアッセイは、単一細胞アッセイを提供する。それによって、1または複数のエフェクター細胞は、単一のマイクロ流体チャンバにおける個々の細胞集団に存在する。細胞集団は、各チャンバ内で細胞外効果を発揮するために、それぞれの能力についてアッセイされる。それによって、前述した方法よりも高い総スループットを提供する。重要なことに、単一のエフェクター細胞の効果は、より大きな細胞集団(例えば、不均一の細胞集団)内で検出される。単一のマイクロ流体チャンバ内で多細胞アッセイアプローチをとることにより、本明細書に記載の実施形態は、以前に報告されたスループットより100倍以上のスループットで動作する。細胞集団が、読み出した粒子の細胞外効果、または別の集団と比較されるような細胞外効果の変動を識別すると、一実施形態における細胞集団は、集団内のエフェクター細胞が細胞外効果の原因であるかを決定するために回収され、さらに、個々の細胞亜集団としてアッセイされる(例えば、回収された細胞集団が限界希釈法でアッセイされる)。

0205

単一細胞よりも多くを収容するように設計されている、当技術分野で知られている方法およびデバイスは、本明細書に記載されるアッセイの種類に不適当な制限を有する。それは、例えば、生存可能な状態で細胞を維持すること、目的のエフェクター細胞を選択的に回収する能力がないこと、デバイス内での蒸発圧力変動交差汚染イメージング機能を制限するデバイスアーキテクチャ(例えば、異なる焦点面に粒子を提供すること、低減された解像度)、およびスループットの欠如(WO2012/072822およびBocchi et al. (2012)、これらはその全体が参照により本明細書に組み込まれる)である。

0206

本明細書に記載の実施形態は、機能的エフェクター細胞アッセイの一部に関連する(ここで、細胞外効果アッセイと称する)。そのアッセイは、不均一な細胞集団において、個々のマイクロ流体チャンバ内に存在する目的の単一のエフェクター細胞の検出を可能にする。具体的には、チャンバが不均一な細胞集団を含む場合において、集団の各細胞が抗体(すなわち、単一のマイクロ流体チャンバ内の不均一なASC集団)を分泌し、または、集団における一部のみの細胞が抗体を分泌する。これにより、一つのエフェクター細胞のみまたはエフェクター細胞の亜集団は、読み出した粒子に所望の細胞外効果をもたらす抗体を分泌する。本明細書に記載の実施形態は、所望の細胞外効果を測定し、検出する方法を提供する。チャンバが効果を示す細胞集団を含むことを識別されると、集団は、例えば、限界希釈法でサブ集団に細胞集団を分割することによって、下流分析のために回収される。一実施形態では、後述するように、細胞外効果を提示する細胞の1または複数の不均一な集団は、細胞外効果が細胞に起因することを決定するために、回収され、限界希釈法(例えば、アッセイ当たり1から約25個の細胞)でさらにスクリーニングにかけられる。

0207

一実施形態では、マイクロ流体アッセイは、一つの集団の中のエフェクター細胞が、読み出し細胞の増殖を阻害する抗体または他の生体分子を分泌するかどうかを決定するために、個々のマイクロ流体チャンバに存在する複数の細胞集団で行われる。この実施形態において、読み出し細胞の増殖に影響しない抗体を分泌する複数のASCを含む不均一な細胞集団の存在下でさえ、読み出し細胞の増殖は、依然として均等に抑制される。マイクロ流体チャンバは、所望のエフェクター細胞および分泌物を含むように特定できる。チャンバの内容物は、例えば、エフェクター細胞が効果を提示することを決定するために、エフェクター細胞を限界希釈法で、さらなるマイクロ流体分析または卓上型分析のために回収される。抗体配列はまた、当業者に公知の方法により回収される。

0208

一実施形態では、新規な抗体は、本明細書に記載の方法により提供される。例えば、1または複数のASCは、本明細書に記載の方法によって同定され、回収され、そしてそれらの抗体遺伝子を配列決定し、クローニングすることができる。

0209

単一細胞がチャンバ当たり約1個の細胞密度で個々のチャンバにロードされる場合、本明細書において提供されるデバイスは、1回の実験当たり約1000個の単一細胞(例えば、ASC)のスクリーニングを可能にする。1または複数の単一細胞は、ASCまたは異なる種類のエフェクター細胞であることができる。ハイブリドーマ法よりも約10倍高いが、数万の細胞、または数百万の細胞でさえもスクリーニングすることは、多くの場合に望ましい。この例としては、ASCが高純度(例えば、ASCマーカー/抗体が利用可能でない種、または乏しい免疫応答の場合のために)で得られない場合、または、結合する抗体は頻繁であるが、所望の特性を有する抗体は非常に稀である場合(受容体の遮断のような)を含む。しかしながら、目的の細胞外効果を提示する1または複数のエフェクター細胞を含有する細胞集団を特定した後、細胞集団は、一実施形態において、細胞外効果の原因となる個々のエフェクター細胞の同一性を決定するために、例えば、個々のマイクロ流体チャンバ内の単一の細胞、または個々のチャンバ内の小さい集団(第1画面と比較して)として、再び(しかし、限界希釈法で)分析される。この二段階のスクリーニング方法の一実施形態は、図2に示される。エフェクター細胞が同定されると、その遺伝情報は増幅され、配列決定される。一実施形態では、遺伝情報は、新規抗体遺伝子を含む。

0210

図2に示す実施形態では、マイクロ流体アレイは、チャンバ当たり約25個の細胞の密度でロードされ、単一のデバイスにおいて、合計で約100,000個の細胞をもたらす。その後、チャンバは、単離され、インキュベートされ、各チャンバ内で抗体の固有のポリクローナル混合物を生成する。これらの抗体は、所望の細胞外効果、例えば、抗原結合、高い結合親和性抗原特異性または一つ以上の機能的特性を発揮するチャンバを同定するためにスクリーニングされる。その後、各ポジティブチャンバの内容物を回収する。一実施形態では、各集団の回収は、単一のマイクロキャピラリーでなされ、チャンバの内容物は、同じデバイスまたは異なったマイクロ流体デバイスに限界希釈法でマイクロキャピラリーにプールされ、再ロードされる。図2に示す実施形態で、アレイのいずれかからの細胞は、チャンバあたり約1個の細胞の密度で、異なるチャンバにリロードされる。その後、回収された集団からの細胞は、同じ細胞外効果または異なる細胞外の効果のために再スクリーニングされる。二番目のアレイからのポジティブチャンバの内容物は、例えば、次世代のシーケンシングおよび/またはPCRによって、目的の抗体配列を同定するために回収される。1つの実施形態において、抗体配列が配列決定され、クローン化される。したがって、一実施形態では、本明細書で提供される方法は、新規な抗体遺伝子の発見を可能にする。

0211

別の実施形態では、細胞外効果を提示する細胞集団は、チャンバが個々に対処することを可能にするマイクロ流体バルブを統合したシステムを使用して回収される(例えば、Singhal et al. (2010), Anal. Chem. 82, pp 8671-8679、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。なお、本発明は、「アレイ1」のポジティチャンバの内容物に対して実行される細胞外効果アッセイのタイプに限定されるものではない(図2)。例えば、いくつかの実施形態では、むしろ第2のマイクロ流体アレイよりも、ベンチトップ法を介して「アレイ1」からポジティブチャンバの内容物をさらにアッセイすることが望ましい。ベンチトップ法としては、例えば、RT-PCRおよび次世代シークエンシングを含む。

0212

単一細胞と、本明細書に記載の単一の細胞および多細胞マイクロ流体アッセイに関して、本明細書で「チャンバ」を参照する。そのチャンバにおいて、1または複数のエフェクター細胞を任意に含む細胞集団は、細胞外効果(例えば、機能的効果または結合効果)のためにアッセイされる。しかしながら、当業者は、本明細書で提供されるデバイスが何万ものチャンバを組み込む大規模並列システムを提供することを認識する。また、当業者は、アッセイが、すべてのチャンバまたは実質的にすべてのチャンバ、またはデバイスのサブアレイ内のすべてのチャンバにおいて、エフェクター細胞または複数のエフェクター細胞を任意に含む複数の個々の細胞集団で並行して行われることを認識する。なぜなら、いくつかのエフェクター細胞の希少性により、全ての細胞集団が、マイクロ流体チャンバ内に存在するとき、エフェクター細胞を含むとは限らないからである。複数のチャンバを個々にまたは一緒に対処する流体構造(例えば、マルチプレクサ)を以下に説明する。

0213

本明細書に記載の実施形態のいくつかは、1または複数の以下の特徴を提供する。

0214

エフェクター細胞生産物をアッセイするために小さな容量を有するマイクロ流体チャンバ内に1または複数のエフェクター細胞を含む細胞集団を濃縮させ、ロードする能力。チャンバ内で所望の特性を有する個々のエフェクター細胞生産物(例えば、分泌タンパク質)の存在を検出するために使用される読み出し粒子(読み出しビーズ、読み出し細胞等)に共局在化する能力。

0215

従来の培養法またはマイクロ流体デバイスを用いて、細胞生存不足または成長をもたらすことが報告されている濃度で、本明細書に記載の浸透浴によって支援された細胞集団の成長および/または生存能力を維持する能力と、個々の細胞の周囲の培地を交換する能力。

0216

エフェクター細胞が不健康になる、またはその各マイクロ流体チャンバより大きくなる前に、所望のエフェクター細胞生成物の特性を測定するための十分な時間で、チャンバ内にエフェクター細胞生産物を濃縮する能力。

0217

マイクロ流体チャンバ内で細胞の集団を維持しながら、細胞のクラスターに検出試薬を追加する能力、または培地内容物を選択的に交換する能力。

0218

1または複数のマイクロ流体構造、マニュアル方法またはロボットの方法を使用する、選択された細胞集団を指定可能に回収する能力。

0219

不均一な集団における各単一細胞からのエフェクター細胞生成物、または不均一な集団における各単一細胞から発生した複数のクローンまたは一つのクローンの分析を可能にする第2低級スループットスクリーニングに回収された細胞集団を移動する能力。

0220

単一細胞の回収された不均一な集団から凝集遺伝物質を直接的に分析し、次いで、目的の細胞に関連する遺伝子を同定するために、この情報または遺伝物質を使用する能力。

0221

いくつかの実施形態では、細胞の出発集団から細胞外効果を発揮するエフェクター細胞を濃縮する方法が提供される。その出発集団は、細胞外効果を発揮する1または複数のエフェクター細胞を含む。一実施形態では、方法は、複数の細胞の亜集団を得るための複数のマイクロ流体チャンバにおいて、細胞の出発集団を保持する工程を含む。チャンバあたりのエフェクター細胞の平均数は、Yより大きく、集団中の細胞の総数は、Xよりも大きく、集団中のエフェクター細胞の予想される割合は、1 / Xである。マイクロ流体チャンバ内の細胞亜集団は、細胞外効果を提示する1または複数のエフェクター細胞を含む1または複数のチャンバを識別するために、細胞外効果アッセイに供される。細胞外効果アッセイの結果に基づいて、1または複数のチャンバは、その後、細胞外効果を示す1または複数のエフェクター細胞を含むものとして同定される。同定されたチャンバの内容物は、濃縮された細胞集団を提供するために回収される。エフェクター細胞のために濃縮された細胞の濃縮された集団は、1/Yのエフェクター細胞の割合を有している。さらなる実施形態では、1/Xは、0.05未満、又は0.01未満、又は0.001未満である。細胞外効果は、本明細書に記載の1または複数の細胞外効果であることができる。一実施形態では、細胞の出発集団は、免疫化または抗原に曝露された動物から単離した末梢血単核細胞(PBMC)である。別の実施形態では、細胞の出発集団は、免疫化または抗原に曝露された動物から単離されたB細胞の集団である。さらに別の実施形態では、細胞の出発集団の供給源は、免疫化または抗原に曝露された動物からの全血である。

0222

本明細書において提供されるように、一態様では、本発明のデバイスおよび方法は、細胞外効果の存在のために、1または複数のエフェクター細胞を任意に含む細胞集団をアッセイするために使用される。別の態様では、本明細書で提供されるデバイスおよび方法は、他の細胞集団と比較して、細胞外効果の変動を提示する細胞集団の同定を可能にする。この態様で、複数の個々の細胞集団は、別々のマイクロ流体チャンバ内に保持される。個々の細胞集団の少なくとも一つは、1または複数のエフェクター細胞を含む。別々のマイクロ流体チャンバは、1または複数の読み出し粒子を含む読み出し粒子集団をさらに含む。細胞集団は、細胞外効果の存在のためにアッセイされる。それによって、読み出し粒子集団またはその亜集団は、細胞外効果の読み出しを提供する。複数の細胞集団の中からの一つの細胞集団は、複数の細胞集団の中の1または複数の残りの細胞集団と比べて、細胞外効果の変動を示すことを同定することができる。細胞集団が細胞外効果の変動を提示することを確認されると、集団は、回収され、細胞外効果の原因となる集団内の細胞または複数の細胞を同定するために限界希釈法でさらにアッセイされてもよい。

0223

本明細書で分析される細胞集団は、特定のタイプに限定されるものではない。例えば、一実施形態では、マイクロリアクター中の個々の細胞集団に分割された細胞の出発集団は、免疫化されまたは抗原に曝露された動物から単離された末梢血単核細胞(PBMCs)であってもよい。別の実施形態では、細胞の出発集団は、免疫化されまたは抗原に曝露された動物から単離されたB細胞である。細胞の出発集団の供給源は、免疫化されまたは抗原に曝露された動物からの全血であってもよい。

0224

本明細書において使用される「エフェクター細胞」は、細胞外効果を発揮する能力を有する細胞を指す。以下に詳細に記載されるように、細胞効果は、読み出し粒子の直接的または間接的な効果である。細胞外効果は、エフェクター細胞、またはエフェクター細胞によって分泌される分子(例えば、シグナル伝達分子代謝産物、抗体、神経伝達物質、ホルモン、酵素、サイトカイン)に起因する。一実施形態では、エフェクター細胞は、タンパク質(例えば、T細胞レセプター)を分泌するか、提示する細胞である。本明細書に記載の実施形態では、細胞外効果は、読み出し粒子(例えば、読み出し細胞または読み出しビーズ、または読み出し粒子集団または亜集団)を使用することによって特徴づけられる。例えば、本明細書に記載の一実施形態では、細胞外効果は、読み出し細胞または読み出しビーズ上に存在する、細胞表面受容体、イオンチャネルまたはATP結合カセット(ABC)トランスポーターアゴナイズまたはアンタゴナイズである。一実施形態では、エフェクター細胞は、抗体分泌細胞(ASC)である。本明細書中で使用されるようなASCは、抗体を産生及び分泌する任意の細胞型を指す。形質細胞(「プラズマB細胞」、「プラズモサイト」および「エフェクターB細胞」と呼ばれる)は、最終分化され、ASCの一種である。本発明の目的のために、「エフェクター細胞」とみなされる他のASCは、形質、メモリーB細胞の増殖により生成した細胞、組換えモノクローナル抗体を発現する細胞株、ハイブリドーマ細胞株を含む。別の実施形態では、エフェクター細胞は、タンパク質を分泌する細胞である。エフェクター細胞とみなされる他の細胞型は、T細胞(例えば、CD8 + T細胞およびCD4 + T細胞)、造血細胞、ヒトおよび動物由来の細胞株、組換え細胞株(例えば、抗体を産生するように操作された組換え細胞株、T細胞受容体を発現するように操作された組換え細胞株)を含む。

0225

1または複数のエフェクター細胞を任意に含む個々の細胞集団は、それぞれの細胞集団が、細胞外効果、または他の個々の細胞集団またはその複数の細胞集団と比較される細胞外効果の変動を発揮するエフェクター細胞を含むかどうかを決定するために、アッセイされる。上記のように、細胞集団が1つのデバイス上で並行してアッセイされる場合、全ての細胞集団がエフェクター細胞を含むとは限らない。本明細書に記載の方法は、1または複数のエフェクター細胞を含む細胞集団の同定を可能にする。また、エフェクター細胞を含む細胞集団は、複数のエフェクター細胞を含む必要なない、またはエフェクター細胞のみの集団である必要はない。むしろ、本明細書に記載の実施形態では、非エフェクター細胞が集団に含まれている。非エフェクター細胞は、集団の大多数または少数であってもよい。エフェクター細胞を含む不均一な集団は、複数のエフェクター細胞を含む必要はない。むしろ、不均一な細胞集団は、2つの細胞が互いに不均一である限り、不均一である。細胞集団は、エフェクター細胞を含んでいなくてもよく、1つのエフェクター細胞または複数のエフェクター細胞を含んでいてもよい。同様に、細胞の亜集団は、エフェクター細胞を含んでいなくてもよく、1つのエフェクター細胞または複数のエフェクター細胞を含んでいてもよい。

0226

一実施形態における細胞外効果は、抗原または機能的効果との結合相互作用である。例えば、一実施形態では、細胞外効果は、細胞表面受容体のアゴニズムまたはアンタゴニズム、イオンチャネルのアゴニズムまたはアンタゴニズムまたはABC輸送体のアゴニズムまたはアンタゴニズム、アポトーシスの調節、細胞増殖の調節、読み出し粒子の形態学的外観の変化、読み出し粒子内のタンパク質の局在の変化、読み出し粒子によるタンパク質の発現、アクセサリー粒子の生物学的活性の中和、エフェクター細胞によって誘発される読み出し細胞の細胞溶解、細胞エフェクター細胞によって誘発される読み出し細胞の細胞アポトーシス、読み出し細胞の細胞壊死、読み出し細胞による抗体の内在化、読み出し細胞によるアクセサリー粒子の内在化、エフェクター細胞による酵素中和、可溶性シグナル伝達分子の中和、またはそれらの組み合わせである。

0227

目的の標的(例えば、抗原)を結合する生体分子(例えば、抗体)を分泌するエフェクター細胞の存在と同定は、エフェクター細胞が目的の標的に特異的でない抗体を分泌する複数のエフェクター細胞を含む不均一な細胞集団中に存在する実施形態において、容易に確認される。一実施形態では、これは、抗体(例えば、プロテインGまたはプロテインAで官能化された)を捕捉するために官能化された読み出し粒子(例えば、ビーズ)上で集団の分泌された抗体のすべてまたは実質的にすべてをチャンバに最初にキャプチャし、チャンバ内に蛍光標識された抗原を添加し、固定化抗体に対する抗原の結合に起因する蛍光の増加の有無を検出するために粒子をイメージングすることによって、個々のマイクロ流体チャンバ内で達成される。信頼できる検出のために必要とされるビーズ上に捕捉された抗体の最小数推定は、単一細胞からの抗体の分泌を測定する実験を行うことによって得られる。一実施形態では、約500個の細胞の不均一な集団中の単一のASCから分泌された抗原特異的抗体を検出することができる。本発明の場合には、個々のマイクロ流体チャンバ内に存在する細胞集団は、約2〜約500個の細胞(例えば、約2〜約250のASC)を含むことができる。上述のように、細胞集団は、エフェクター細胞以外の細胞を含むことができ、全ての細胞集団がエフェクター細胞を含むとは限らない。これは、従来の濃縮プロトコル(例えば、FACS)が同じ細胞型のほぼ純粋な細胞集団を得るために使用できない場合に、特に当てはまる

0228

不均一な細胞集団(すべての細胞が互いに不均一というわけではない)について、集団に互いに不均一である少なくとも2つの細胞がある(エフェクター細胞と非エフェクター細胞)とする。不均一な細胞集団は、わずか2つの細胞から構成されてもよい。細胞集団または細胞亜集団は、単一細胞から構成されてもよい。原理的には、不均一な細胞集団は、細胞外効果アッセイ(例えば、本明細書で提供される細胞外効果アッセイの一つ)の必要な期間、実行可能な状態で維持される任意の数の細胞を含んでもよい。一実施形態では、細胞集団中の細胞の数は、チャンバあたり1個の細胞から約500個の細胞である。一実施形態では、個々の細胞または読み出し粒子のイメージングが必要とされる場合、集団中の細胞の数は、チャンバの床を覆うには不十分であるように選択される。その結果、撮像される細胞が単層に配置される。あるいは、細胞集団は、チャンバの表面を覆う二重層を形成するには不十分である多くの細胞を含む。

0229

いくつかの実施形態では、細胞の大きな集団は、特定の集団内の単一のエフェクター細胞または少数のエフェクター細胞から生じる効果の検出を阻害することなく、単一のマイクロ流体チャンバまたはマイクロリアクター内で集団に存在することができる。例えば、一実施形態では、細胞集団中の細胞の数は、2から約900、または約10から約900、または約100から約900である。別の実施形態では、細胞集団中の細胞の数は、2〜約800、または約10から約800、または約100から約800である。別の実施形態で、細胞集団中の細胞の数は、2から約700、または約10から約700、または約100から約700である。別の実施形態で、細胞集団中の細胞の数は、2から約600、または約10から約600、または約100から約600である。他の実施形態で、細胞集団中の細胞の数は、2から約500、または約10から約500、または約100から約500である。別の実施形態で、細胞集団中の細胞の数は、2から約400、または約10から約400、または約100から約400である。別の実施形態において、細胞集団中の細胞の数は、2から約300、または約10から約300、または約100から約300である。別の実施形態では、細胞集団中の細胞の数は、2から約200、または約10から約200、または約100から約200である。別の実施形態で、細胞集団中の細胞の数は、2から約100、または約10から約100、約50から約100である。別の実施形態で、細胞集団中の細胞の数は、2から約90、または約10から約90、または約50から約900である。さらに別の実施形態では、細胞集団中の細胞の数は、2から約80、または約10から約80、または2から約70、または約10から約70、または約2から約60、または約10から約60、または約2から約50、または約10から約50、または約2から約40、または約10から約40、または2から約30、または約10から約20、または2から約10である。いくつかの実施形態で、細胞集団中の細胞の大部分は、エフェクター細胞である。

0230

本発明の一態様において、本明細書で提供される方法によって分析される細胞または細胞集団は、1または複数のエフェクター細胞(例えば、抗体分泌細胞(ASC)または複数のASC)を含む。一実施形態において、細胞は、数千のマイクロ流体チャンバで、複数の細胞集団に分離されている。そして、1または複数のエフェクター細胞を含む個々の細胞集団(すなわち、単一のマイクロ流体チャンバ内)は、細胞外効果のためにアッセイされる。1または複数の集団内のエフェクター細胞が、細胞外または細胞外効果のへ変動を発揮すると、1または複数の個々の細胞集団は、特定され、回収される。細胞外効果は、ユーザによって決定され、一実施形態では、抗原、細胞表面受容体、ABCトランスポーター又はイオンチャネルとの結合相互作用である。

0231

本明細書で提供される方法は、結合相互作用(例えば、抗原親和性および特異性)に基づいて、単一のエフェクター細胞(単独で、または異種集団内で)を識別するために使用されるが、本発明はこれに限定されない。むしろ、細胞集団の同定は、一実施形態では、直接に機能的アッセイの実施を介して行われる。従って、本発明の一態様は、結合特性(例えば、抗原標的に対する親和性および選択性)のために「機能的抗体」を最初にスクリーニングする必要なく、「機能的抗体」を分泌する細胞集団内でASCの直接検出を可能にする方法およびデバイスを含む。

0232

これらの方向に沿って、一つの態様において、本明細書における方法によって発見できる受容体および機能的抗体が提供される。この態様の一実施形態では、細胞外効果の原因となるエフェクター細胞の核酸が増幅され、配列決定される。核酸は、分泌された生体分子(例えば、抗体またはそのフラグメント)をコードする遺伝子、または細胞受容体またはそのフラグメント(例えば、T細胞受容体)をコードする遺伝子である。抗体またはそのフラグメントまたは細胞受容体またはそのフラグメントは、当該分野で公知の方法によってクローン化され、および/または配列決定される。例えば、一実施形態で、本明細書で提供される方法およびデバイスによって発見できる機能的抗体を分泌するASCは、標的細胞表面タンパク質(例えば、イオンチャネル受容体、ABCトランスポーター、G-タンパク質共役受容体(GPCR)、受容体チロシンキナーゼ(RTK)または固有のグアニル酸シクラーゼ活性のような固有の酵素活性を有する受容体)に結合することによって細胞シグナル伝達を調節するものである。

0233

本発明の一態様では、1または複数のエフェクター細胞を含む細胞集団は、チャンバ内で行われる細胞外効果アッセイの結果に基づいて、マイクロリアクター(例えば、マイクロ流体チャンバ)で同定される。細胞外効果または細胞外効果の変動がマイクロリアクターで測定されると、細胞集団は、効果の原因となる集団内のエフェクター細胞または複数のエフェクター細胞を決定するために、回収され、分析される(例えば、図2)。エフェクター細胞が抗体を分泌する実施形態では、ASCまたは複数のASCによって産生される抗体をコードするDNA配列は、決定され、続いてクローン化される。一実施形態では、抗体のDNA配列は、さらなる検証および前臨床試験用のモノクローナル抗体の不滅のソースを提供するために、細胞株中で発現され、クローン化される。

0234

本明細書に記載のように、不均一な細胞集団は、典型的には2から約1000、または2から約500、または約2から約250、または約2から約100の範囲の数を有する細胞の集団を含む。不均一な細胞集団は、細胞の集団を特徴付ける。その細胞の集団は、遺伝子型、タンパク質発現、mRNA発現または分化状態(少なくとも一つの細胞がエフェクター細胞である)において基本的な差異を有する少なくとも2つの細胞を含んでいる。特に、不均一な細胞集団は、一実施形態では、2つ以上のエフェクター細胞(例えば、約2から約250の細胞)を含む。その2以上のエフェクター細胞は、異なる免疫グロブリン遺伝子を発現または含み、免疫グロブリン遺伝子に由来する異なる遺伝子を発現または含み、T細胞受容体の遺伝子に由来する異なる遺伝子を発現または含み、異なる免疫グロブリンタンパク質を分泌し、免疫グロブリンタンパク質に由来する異なるタンパク質を分泌し、異なるタンパク質を分泌し、または、T細胞受容体タンパク質に由来する異なるタンパク質を発現する。

0235

一つの態様において、細胞集団は、標的エピトープに結合し得る分子のライブラリーを発現するように遺伝的に操作された細胞と、目的のcDNAライブラリーに由来する遺伝子のフラグメントまたは遺伝子を発現するように遺伝的に操作された細胞と、様々な生物学的機能のためのレポーターで遺伝子的に操作された細胞と、不死化株や一次情報源に由来する細胞との集団を含む。注目すべきことに、単一の細胞に由来するクローンは、一実施形態では、例えば、遺伝子サイレンシング、分化、遺伝子発現の変化、形態の変化等の原因のために、互いに不均一である。加えて、不死化株または一次供給源に由来する細胞は、単一細胞の同一クローンではなく、互いに対して不均一であると考えられている。むしろ、細胞のクローン集団は、単一の細胞に由来しており、遺伝的に修飾されず、RNAで形質導入されず、DNAで形質導入されず、ウイルスで感染されず、差別されず、または別の方法で重要な機能的かつ分子的手段で異なる細胞を作るように操作されない。単一の細胞に由来する細胞(しかし、体細胞超変異を自然に受けるまたは(例えば、活性化誘導シチジンデアミナーゼの発現を誘導すること等によって)体細胞超変異を受けるように操作される)は、クローンとみなされない。したがって、これらの細胞は、ともに存在する場合、不均一な細胞集団とみなされる。

0236

全体を通し提供されるように、一態様において、方法およびデバイスは、1または複数の細胞集団を同定するために、1または複数のエフェクター細胞を任意に含む複数の個々の細胞集団のアッセイのために提供される。その細胞集団は、読み出し粒子集団またはそれらの亜集団で細胞効果(例えば、所望の特性を有する生体分子の分泌)を有する少なくとも一つのエフェクター細胞を含む。細胞集団が識別されると、一実施形態では、それは、回収した細胞集団を得るために選択的に回収される。複数の細胞集団が同定されると、一実施形態では、それらは、回収された細胞集団を得るために、回収され、プールされる。回収された細胞集団は、エフェクター細胞のために濃縮され、デバイス上に最初にロードされた細胞の出発集団と比較される。この点において、前者は後者と比較して、エフェクター細胞の割合が大きい。

0237

回収された細胞集団の亜集団は、読み出し粒子集団の第2の細胞外効果の存在のためにアッセイされる。読み出し粒子集団または亜集団は、その第2の細胞外効果の読み出しを提供する。細胞外効果は、識別された細胞集団でアッセイされた効果と同じ効果、または異なる細胞外効果であることができる。さらなる実施形態では、識別された集団の亜集団は、それぞれ約1から約10個の細胞含む。さらなる実施形態でさえ、識別された集団の亜集団は、それぞれ、平均1個の細胞を含む。その後、細胞外効果を提示する1または複数の亜集団は、回収された亜集団を得るために識別され、回収される。それは、一実施形態では、エフェクター細胞のために濃縮されている。複数の細胞亜集団が同定されると、一実施形態では、それらは、回収された細胞亜集団を得るために、回収され、プールされる。回収された細胞亜集団からの遺伝情報は、その後、単離され、増幅されおよび/または配列決定される。

0238

本発明は、本発明の方法に従ってアッセイすることができるエフェクター細胞または細胞集団のタイプによって限定されるものではない。本発明で使用するエフェクター細胞の種類としては、例えば、上記のものが挙げられ、任意の種(例えば、ヒト、マウス、ウサギなど)からの一次抗体分泌細胞、一次メモリ細胞(例えば、これは、IgG、IgMIgD、または細胞の表面に提示された他の免疫グロビン抗体をアッセイすること、または形質細胞に増殖/分化させることができる)、T細胞、選択後または融合直後のハイブリドーマ融合物、モノクローナル抗体(mAb)の1または複数のライブラリーで核酸を導入された(安定または一過性である)細胞株(例えば、fab領域で突然変異体のライブラリーを使用して同定されたmAbの親和性成熟、またはFc領域突然変異を有する同定されたmAbを使したエフェクター機能の最適化用)、人/動物/ライブラリーから得られた増幅HC / LC可変領域からの重鎖(HC)および軽鎖(LC)の組み合わせ、または細胞発現mAbの組み合わせ(相乗効果探すために特徴付けられているか特徴づけられていないのいずれか)で核酸を導入された細胞株を含む。

0239

形質細胞(「形質B細胞」、「プラズモサイト」と「エフェクターB細胞」と呼ばれる)は、末期的に分化され、本発明のデバイスおよび方法でアッセイすることができるエフェクター細胞(ASC)の一種である。本発明の目的のための「エフェクター細胞」としてみなす他のASCは、形質芽球、メモリーB細胞の増殖によって生成した細胞、組換えモノクローナル抗体を発現する細胞株、サイトカインを分泌する初代造血細胞、T細胞(例えば、CD4+およびCD8+ T細胞)、それらの表面上のタンパク質またはペプチドを提示する樹状細胞、タンパク質を分泌する組換え細胞株、ハイブリドーマ細胞株、抗体を産生するよう操作された組換え細胞、T細胞受容体を発現するように操作された組換え細胞を含む。

0240

また、本発明で使用するための細胞集団は、供給源によって限定されるものではないことが理解されるが、むしろ、それは、インビトロ組織培養物からヒトまたは他の哺乳動物あるいは別のものを含む任意の動物由来であってもよい。細胞は、本技術分野(例えば、フローサイトメトリー)で知られている様々なプロトコルを使用することによって、所望の特性(例えば、特定の抗原に結合する抗体の分泌)を有する集団の濃縮後、直接的に分析されてもよく、または、例えば、供給源から採取した後直接に分析されてもよい。動物源から採取する前、一実施形態では、動物は1または複数の免疫化を受ける。一実施形態では、フローサイトメトリーは、本明細書に提供されるデバイスの一つにロードする前に、エフェクター細胞を濃縮するために使用される。そして、フローサイトメトリーは、蛍光活性化細胞選別(FACS)である。出発細胞集団がエフェクター細胞(例えば、ASC)のために濃縮され、個々のマイクロ流体チャンバ内の個々の細胞集団として保持されることを使用する場合、個々の細胞集団は、エフェクター細胞で完全に構成される必要はない。むしろ、他の細胞型は、大多数派または少数派として存在してもよい。さらに、1または複数の個々の細胞集団は、エフェクター細胞を含有していなくてもよい。

0241

当業者に公知の動物由来のASCの濃縮用のいくつかの方法がある。それは、本明細書において提供される方法およびデバイスによる分析用の細胞の出発集団を濃縮するために使用される。例えば、一実施形態において、FACSは、表面マーカーCD19+CD20lowCD27hiCD38hiを使用するヒトのASCを濃縮するために使用される(Smith et al. (2009). Nature Protocols, 4. pp. 372-384、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)。別の実施形態において、細胞集団は、表面マーカーを提示する細胞の磁気免疫捕捉系ポジティブまたはネガティブ選択により濃縮される。別の実施形態では、プラークアッセイ(Jerne et al. (1963). Science 140, p. 405、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)、ELISPOTアッセイ(Czerkinsky et al. (1983). J. Immunol. Methods65, pp.109-121、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)、液滴アッセイ(Powel et al. (1990). Bio/Technology 8, pp. 333-337、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)、細胞表面蛍光‐結合免疫吸着アッセイ(Yoshimoto et al. (2013). Scientific Reports, 3, 1191、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)または細胞表面親和性マトリックスアッセイ(Manz et al. (1995). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, pp. 1921-1925、その全体が参照により本明細書に組み込まれる)は、本明細書で提供される方法の一つを実行する前、または本明細書に提供されるデバイスの一つに出発細胞集団をロードする前に、ASCを濃縮するために使用される。

0242

種々の実施形態において、細胞集団内の2つ以上のエフェクター細胞は、細胞生産物(例えば、読み出し粒子集団またはそれらの亜集団に直接的または間接的な効果を有する抗体)を産生し、分泌する。本明細書で提供されるデバイスに関して、デバイス上の全てのチャンバが必ずしも細胞集団および/または読み出し粒子集団を含むという訳ではないことに留意されたい。例えば、空のチャンバまたは部分的に充填されたチャンバが存在してもよい。また、全体に提供されるように、それは、個々のチャンバ内で、細胞集団内の細胞のサブセット、または抗体を産生及び分泌する集団内の個々の細胞のみであってもよい。いくつかの実施形態では、マイクロ流体チャンバ内の細胞集団は、エフェクター細胞を含まない。これらのチャンバは、細胞集団の各々に対して一つ以上の細胞外効果アッセイを実行することにより同定可能である。

0243

いくつかの態様では、1または複数のアクセサリー粒子を有することが望ましい。そのアクセサリー粒子は、細胞集団内の1または複数の細胞の生存能力および/または機能を支持するため、または細胞外効果アッセイを実行するために、マイクロリアクター(例えば、マイクロ流体チャンバ)中に存在する1または複数のアクセサリー細胞を含むことができる。例えば、一実施形態では、アクセサリー細胞または複数のアクセサリー細胞は、線維芽細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、キラーT細胞、抗原提示細胞、樹状細胞、組換え細胞、またはそれらの組み合わせを含む。

0244

アクセサリー粒子または細胞、またはそれを含む集団は、一実施形態では、細胞集団と共に、マイクロリアクター(例えば、マイクロ流体チャンバ)に運ばれる。換言すれば、一実施形態におけるアクセサリー細胞は、マイクロ流体チャンバに搬送される細胞集団の一部である。代替的にまたは追加的に、アクセサリー粒子またはアクセサリー細胞は、エフェクター細胞または複数のエフェクター細胞を含む細胞の不均一な集団をマイクロリアクターまたは複数のマイクロリアクター(例えば、マイクロ流体チャンバまたは複数のマイクロ流体チャンバ)にローディングする前後にチャンバに送出される。

0245

本明細書における「アクセサリー粒子」は、特に限定されないが、タンパク質、タンパク質フラグメント、細胞を含む任意の粒子を意味する。その粒子は、(i)エフェクター細胞の生存能力および/または機能をサポートし、(ii)細胞外効果を容易にし、(iii)細胞外効果の測定を容易にし、または(iv)エフェクター細胞の細胞外効果を検出する。

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