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技術 T7RNAポリメラーゼの製造方法

出願人 東ソー株式会社
発明者 家亀晴宇
出願日 2018年9月19日 (2年3ヶ月経過) 出願番号 2018-174563
公開日 2020年3月26日 (9ヶ月経過) 公開番号 2020-043813
状態 未査定
技術分野 微生物、その培養処理 酵素・酵素の調製
主要キーワード 容量調整用 ひだ付き 精製純度 圧力式 吸光度ピーク 精製液 陰イオンクロマトグラフ 協奏的
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (6)

課題

大腸菌を用いて生産される、野生型天然型)もしくはそのアミノ酸配列の一部が置換された組換えT7RNAポリメラーゼを効率的に高純度で製造する製造方法を提供すること。

解決手段

T7RNAポリメラーゼを発現可能な組換え大腸菌を培養する工程、及び培養した大腸菌からT7RNAポリメラーゼを精製する工程を含む、T7RNAポリメラーゼの製造方法であって、精製工程で使用するカラムクロマトグラフィーゲルとして、少なくとも疎水性クロマトゲル、陰イオン交換クロマトグラフィーゲル及びアフィニティークロマトグラフィーゲルを用いる、T7RNAポリメラーゼの製造方法により、解決する。

概要

背景

T7RNAポリメラーゼはT7プロモーター配列を含む二本鎖DNA鋳型NTPを基質として、プロモーター下流の鋳型DNAに相補的一本鎖RNAを合成する酵素であり、生化学分野において広く用いられており、例えば、インヴィトロ転写大腸菌における高発現系(特許文献1)、無細胞タンパク合成系塩基配列決定法(特許文献2)、等温核酸増幅法等で利用されている。等温核酸増幅法の1つであるTRC法では、熱安定性及び/または比活性の高いT7RNAポリメラーゼ変異体を用いて46℃にて核酸増幅反応を行っている(特許文献3及び非特許文献1)。

アミノ酸置換により機能改変されたT7RNAポリメラーゼ変異体も多数報告されており、例えば、アミノ酸置換により認識するプロモーター配列を改変した酵素(特許文献4)、高温での比活性及び熱安定性を高めた酵素(特許文献5、特許文献6)、宿主での生産性を高めた酵素(特許文献7)、アミノ酸欠失置換により3’−デオキシリボヌクレオチドの取り込み能を増強した酵素(特許文献8)などがある。

これら組換えT7RNAポリメラーゼの主な製造方法は、大腸菌を用いてT7RNAポリメラーゼ変異体を菌体内発現させ、菌体破砕後、破砕液陰イオン交換クロマトゲルアフィニティークロマトゲル等に供し精製されている(特許文献9、特許文献10、特許文献11、特許文献12)。

T7RNAポリメラーゼは、精製過程において、プロテアーゼによる分解を受けることが報告されており(非特許文献2)、プロテアーゼインヒビターの添加、速やかなプロテアーゼとの分離、プロテアーゼ欠損株の使用などが、高純度なT7RNAポリメラーゼを高収率に製造する上で有効である。また、核酸増幅反応に使用するうえでは、プロテアーゼのほか、DNase、RNaseとの分離は必須である。

概要

大腸菌を用いて生産される、野生型天然型)もしくはそのアミノ酸配列の一部が置換された組換えT7RNAポリメラーゼを効率的に高純度で製造する製造方法を提供すること。T7RNAポリメラーゼを発現可能な組換え大腸菌を培養する工程、及び培養した大腸菌からT7RNAポリメラーゼを精製する工程を含む、T7RNAポリメラーゼの製造方法であって、精製工程で使用するカラムクロマトグラフィーゲルとして、少なくとも疎水性クロマトゲル、陰イオン交換クロマトグラフィーゲル及びアフィニティークロマトグラフィーゲルを用いる、T7RNAポリメラーゼの製造方法により、解決する。 なし

目的

本発明が解決する課題は、大腸菌を用いて生産される、野生型(天然型)もしくはそのアミノ酸配列の一部が置換された組換えT7RNAポリメラーゼを効率的にかつ高純度に製造する製造方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

T7RNAポリメラーゼ発現可能な組換え大腸菌を培養する工程、及び培養した大腸菌からT7RNAポリメラーゼを精製する工程を含む、T7RNAポリメラーゼの製造方法であって、精製工程で使用するカラムクロマトグラフィーゲルとして、少なくとも疎水性クロマトゲル、陰イオン交換クロマトグラフィーゲル及びアフィニティークロマトグラフィーゲルを用いる、T7RNAポリメラーゼの製造方法。

請求項2

カラムクロマトグラフィーの順番が、疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーの順である、請求項1に記載のT7RNAポリメラーゼの製造方法。

請求項3

疎水性クロマトゲルのリガンドフェニルを含み、陰イオン交換クロマトゲルのリガンドがDEAEを含み、アフィニティークロマトゲルのリガンドがヘパリンを含む、請求項1または2に記載のT7RNAポリメラーゼの製造方法。

請求項4

T7RNAポリメラーゼを発現可能な組換え大腸菌を培養する工程、及び培養した大腸菌からT7RNAポリメラーゼを精製する工程を含む、T7RNAポリメラーゼの製造方法であって、培養工程が、培養液中の大腸菌の菌体濃度OD600で2から4である対数増殖期初期イソプロピル‐β‐チオガラクトピラノシド培地に2〜4mMになるように加えた後、22℃〜28℃で16〜24時間培養する工程を含む、方法。

技術分野

0001

本発明は大腸菌を用いて生産される、野生型天然型)もしくはそのアミノ酸配列の一部が置換された組換えT7RNAポリメラーゼを大量に高純度で製造する製造方法に関する。

背景技術

0002

T7RNAポリメラーゼはT7プロモーター配列を含む二本鎖DNA鋳型NTPを基質として、プロモーター下流の鋳型DNAに相補的一本鎖RNAを合成する酵素であり、生化学分野において広く用いられており、例えば、インヴィトロ転写や大腸菌における高発現系(特許文献1)、無細胞タンパク合成系塩基配列決定法(特許文献2)、等温核酸増幅法等で利用されている。等温核酸増幅法の1つであるTRC法では、熱安定性及び/または比活性の高いT7RNAポリメラーゼ変異体を用いて46℃にて核酸増幅反応を行っている(特許文献3及び非特許文献1)。

0003

アミノ酸置換により機能改変されたT7RNAポリメラーゼ変異体も多数報告されており、例えば、アミノ酸置換により認識するプロモーター配列を改変した酵素(特許文献4)、高温での比活性及び熱安定性を高めた酵素(特許文献5、特許文献6)、宿主での生産性を高めた酵素(特許文献7)、アミノ酸欠失と置換により3’−デオキシリボヌクレオチドの取り込み能を増強した酵素(特許文献8)などがある。

0004

これら組換えT7RNAポリメラーゼの主な製造方法は、大腸菌を用いてT7RNAポリメラーゼ変異体を菌体内発現させ、菌体破砕後、破砕液陰イオン交換クロマトゲルアフィニティークロマトゲル等に供し精製されている(特許文献9、特許文献10、特許文献11、特許文献12)。

0005

T7RNAポリメラーゼは、精製過程において、プロテアーゼによる分解を受けることが報告されており(非特許文献2)、プロテアーゼインヒビターの添加、速やかなプロテアーゼとの分離、プロテアーゼ欠損株の使用などが、高純度なT7RNAポリメラーゼを高収率に製造する上で有効である。また、核酸増幅反応に使用するうえでは、プロテアーゼのほか、DNase、RNaseとの分離は必須である。

0006

米国特許第4952496号
特開平11−18799号公報
特開2000−14400号公報
米国特許第5385834号
WO2010/016621
特表2003−525627号公報
特許第5789949号
特開2003−61683号公報
米国特許第5385834号
WO2001/066705号
特許第3480795号
特許第4399684号

先行技術

0007

Ishiguro T. et al.,Analytical Biochemistry,314,77−86(2003)
GRODBERG J. et al.,J.Bacteriol.170,1245−1253(1988)

発明が解決しようとする課題

0008

本発明が解決する課題は、大腸菌を用いて生産される、野生型(天然型)もしくはそのアミノ酸配列の一部が置換された組換えT7RNAポリメラーゼを効率的にかつ高純度に製造する製造方法を提供することである。

課題を解決するための手段

0009

上記課題を解決するために鋭意検討した結果、大腸菌によるT7RNAポリメラーゼの発現は、IPTGによる発現誘導後、25℃にて培養することで、生産効率培養液あたりのT7RNAポリメラーゼ発現量)を落とすことなく終夜実施可能になること、プロテアーゼは、疎水クロマトグラフィーにより、DNase、RNaseは、陰イオンクロマトグラフィーにより、プロテアーゼによって分解されたT7RNAポリメラーゼ分解物は、アフィニティークロマトグラフィーにより、T7RNAポリメラーゼと分離可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。

0010

即ち本発明は、以下の通り例示できる。
[1]
T7RNAポリメラーゼを発現可能な組換え大腸菌を培養する工程、及び
培養した大腸菌からT7RNAポリメラーゼを精製する工程
を含む、T7RNAポリメラーゼの製造方法であって、
精製工程で使用するカラムクロマトグラフィーゲルとして、少なくとも疎水性クロマトゲル、陰イオン交換クロマトグラフィーゲル及びアフィニティークロマトグラフィーゲルを用いる、T7RNAポリメラーゼの製造方法。
[2]
カラムクロマトグラフィーの順番が、疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーの順である、[1]に記載のT7RNAポリメラーゼの製造方法。
[3]
疎水性クロマトゲルのリガンドフェニルを含み、陰イオン交換クロマトゲルのリガンドがDEAEを含み、アフィニティークロマトゲルのリガンドがヘパリンを含む、[1]または[2]に記載のT7RNAポリメラーゼの製造方法。
[4]
T7RNAポリメラーゼを発現可能な組換え大腸菌を培養する工程、及び
培養した大腸菌からT7RNAポリメラーゼを精製する工程
を含む、T7RNAポリメラーゼの製造方法であって、
培養工程が、培養液中の大腸菌の菌体濃度がOD600で2から4である対数増殖期初期イソプロピル‐β‐チオガラクトピラノシド培地に2〜4mMになるように加えた後、22℃〜28℃で16〜24時間培養する工程を含む、方法。
以下、本発明を詳細に説明する。

0011

本発明におけるT7RNAポリメラーゼを発現可能な組換え大腸菌の種類に制限はないが、K−12株やB株を由来とする取り扱いの簡便な大腸菌が望ましい。W3110株、JM109株、HB101株、B834株、BL21株、C1757株などが例示でき、より好ましくは、プロテアーゼを欠損させたB834株、BL21株、C1757株が例示できるが、それらに限定されない。

0012

上記宿主に形質転換されるT7RNAポリメラーゼ発現ベクターは、特に限定されないが、lac、trp、tacプロモーターなどを有する大腸菌で使用可能な発現プラスミドが好ましい。pTrc99A(GEヘルスケアバイオサイエンス製)、pCDF−1b(タカラバイオ製)といった発現用プラスミドが例示できるが、それらに限定されず、一般的な大腸菌用ベクターであればよい。

0013

適切な栄養培地を用いて、T7RNAポリメラーゼの発現を可能にする条件下でT7RNAポリメラーゼを発現可能な組換え大腸菌を培養することで、菌体内にT7RNAポリメラーゼを発現させることができる。培養温度は、大腸菌が生育できる温度であればよく、好ましくは20℃から40℃、より好ましくは25℃から37℃である。製造される菌体量および菌体内のT7RNAポリメラーゼ発現量は、培養時間と培養温度によって調節することが可能である。例えば、培養を10時間程度行う場合、植菌から培養終了まで、培養温度は30℃から37℃が好ましく、培養を20時間程度行う場合、植菌から発現誘導開始まで培養温度を30℃から37℃で行い、発現誘導から培養終了まで、培養温度を22℃から28℃で行うことが好ましい。培養時間に合わせて培養温度を調節することで、T7RNAポリメラーゼの生産効率(培養液あたりのT7RNAポリメラーゼ発現量)を落とすことなく製造することができる。T7の発現誘導のためにIPTGを添加する時期は、対数増殖期であればよいが、好ましくは培養液中の菌体濃度がOD600で1から8、より好ましくは2から4の対数増殖期初期である。添加されるIPTGの培養液中の濃度は、T7が発現誘導される濃度であればよく、好ましくは1〜5mM、より好ましくは2〜4mMである。

0014

菌体内に発現したT7RNAポリメラーゼをカラムクロマトに供するまでの前処理は、タンパク質精製で一般に行われている、プロテアーゼ阻害剤の添加、除核酸、硫安沈殿清澄化フィルター濾過等が有効である。遠心分離により回収された培養菌体をプロテアーゼ阻害剤を添加した適当な水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、圧力式破砕機等により細胞膜を破砕し細胞抽出液を得る。プロテアーゼ阻害剤として、PMSF、Leupeptin、Benzamidine、bacitracin等を用いることができ、濃度は、一般に使用されている濃度でよい。細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清に除核酸剤を添加、混合後、遠心分離することにより、核酸との分離を行うことができる。除核酸剤として、ポリアミンストレプトマイシンを用いることができ、濃度は、一般に使用されている濃度でよい。この遠心上清に残存する核酸や除核酸剤とT7RNAポリメラーゼは、硫安沈殿によって、分離することができる。硫安沈殿に用いる上清中の硫安濃度は、T7RNAポリメラーゼを沈殿させる濃度であればよいが、好ましくは40%飽和硫安濃度以上、より好ましくは50%飽和硫安濃度である。硫安沈殿物を、プロテアーゼ阻害剤を添加した疎水クロマト溶離液(1M硫安含有)に溶解後、遠心分離により不溶物を沈殿除去、上清を清澄化フィルター濾過することで、カラムクロマトに供する溶液が調製できる。

0015

本製造方法に用いるカラムクロマトグラフィーは、疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーであり、前記3種類のクロマトグラフィーのうち、疎水性クロマトグラフィーを最初に実施することが好ましい。陰イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーはどちらを先に実施してもよいが、疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーの順番でクロマトグラフィーを実施することが、精製効率純度を高めるうえで特に好ましい。

0016

疎水性クロマトグラフィーのリガンドは、カラムクロマト供与液混入するプロテアーゼとT7RNAポリメラーゼを分離可能なものであればよいが、好ましくは、ブチル、フェニルであり、より好ましくはフェニルである。陰イオン交換ククロマトグラフィーのリガンドは、カラムクロマト供与液に混入するDNase、RNaseとT7RNAポリメラーゼを分離可能なものであれば構わないが、好ましくは、Q、DEAE、より好ましくはDEAEである。アフィニティークロマトグラフィーのリガンドは、カラムクロマト供与液に混入するT7RNAポリメラーゼ分解物とT7RNAポリメラーゼを分離可能なものであれば構わないが、好ましくは、Phospho、ヘパリン、より好ましくはヘパリンである。

0017

精製工程において、T7RNAポリメラーゼを分解するプロテアーゼのサンプル中の混入具合は、サンプルをSDS−PAGEし、100kDaの位置に泳動されるT7RNAポリメラーゼのバンドの減少具合と80kDaの位置に泳動されるT7RNAポリメラーゼ分解物のバンドの増加具合から判断することができる。また、DNase、RNaseの混入具合は、DNA、RNAのアガロース電気泳動で用いられているDNA Marker、RNA Markerとサンプルを混合し一定時間加温後、アガロース電気泳動し、各バンドの減少具合から判断することができる。T7RNAポリメラーゼの精製純度は、サンプルをSDS−PAGEし、100kDaの位置に泳動されるT7RNAポリメラーゼのバンドとそれ以外の位置に泳動されるバンドの割合により判断することができる。

発明の効果

0018

本発明の製造方法は、スケールアップに容易に対応可能なコンベンショナルなカラムクロマトグラフィーの組み合わせであり、高純度な組換えT7RNAポリメラーゼを大量、高効率に製造することが可能となる。

0019

本発明で製造したT7RNAポリメラーゼは、RNAを合成するために使用することができる。具体的には、基質としてリボヌクレオチドATP、CTPGTPUTP)を使用し、特定の配列を有する二本鎖DNAを鋳型に、一本鎖RNA合成を行なうことができる。さらに本発明で製造したT7RNAポリメラーゼは、逆転写酵素との協奏的作用によって特定のRNA配列を含む標的RNAを増幅する等温核酸増幅反応にも使用することができる。等温核酸増幅反応としてはTRC法(特許文献3及び非特許文献1)、NASBA法、TMA法などが挙げられる。

図面の簡単な説明

0020

図1は、実施例3に記載の疎水クロマト回収後の濾液透析後の回収液のSDS−PAGEを示す。
図2は、実施例5に記載のアフィニティークロマト溶出画分のSDS−PAGEを示す。
図3は、実施例5に記載のT7RNAポリメラーゼ精製液のSDS−PAGEを示す。
図4は、参考例1に記載の精製したT7RNAポリメラーゼを用いた核酸増幅反応での蛍光強度経時変化を示す。
図5は、参考例2に記載のアフィニティークロマト回収液透析後のSDS−PAGEを示す。
図6は、参考例3に記載のアフィニティークロマト回収液透析後のSDS−PAGEを示す。

0021

<実施例1>組換え大腸菌の培養
(M490V+Q786M)二重変異型T7RNAポリメラーゼを発現する大腸菌HB101株を用い、以下の手順で培養し、菌体を製造した。
(1)LBG/Crb液体培地(1%バクトリプトン、0.5%酵母エキス、1% NaCl、0.8%グリセロール、100μg/mLカルベニシリン)100mLに(M490V+Q786M)二重変異型T7RNAポリメラーゼを発現する大腸菌HB101株のグリセロールストックを植菌し、500mL容量のひだ付き三角フラスコにて37℃で一晩振とう培養した。
(2)8Lのペプトン培地(5%トリプチケースペプトン、0.7%リン酸水素二ナトリウム、0.3%リン酸二水素カリウム、0.05% NaCl、0.1%塩化アンモニウム、4.4% グリセロール、4.4% グリセロール、0.074%硫酸マグネシウム水和物、0.0033%塩化カルシウム、0.004%硫酸第一鉄7水和物、100μg/mL カルベニシリン)に前培養液80mLを植菌し、10L容量の発酵槽にて、37℃、1VVM、400rpmで培養した。
(3)(2)の培養約5時間後(O.D.600nmの値としておよそ2.0)に400mMのIPTG(イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド)40mLを添加し、温度を25℃に下げてさらに18時間培養した。培養中酸素濃度は1.6ppm以上、pHは6.7から7.2の範囲に維持されていた。
(4)培養終了後、4℃にて20,000xgで連続遠心分離し、湿菌体100gを得た。菌体は0.8%塩化ナトリウム水溶液洗浄し、直ちに次の処理をしない場合は−80℃で保存した。

0022

<実施例2>クロマトグラフ供与液の調製
実施例1にて調製した組換え大腸菌を用い、以下の手順でクロマトグラフ供与液を調製した。
(1)3種類のプロテアーゼインヒビター(PMSF(10μg/mL)、ベンズアミジン(100μM)、バシトラシン(10μM))を含むBase buffer(20mMリン酸カリウム、50mM塩化ナトリウム、1mMEDTA、1mM DTT pH7.5)を菌体1gあたり5mlの割合で菌体に添加、氷冷下にて菌体を懸濁した。菌体懸濁液を圧力式細胞破砕機にて、700barで処理後、4℃、15,000xg、60分の遠心分離にて可溶性画分を回収した。
(2)回収した画分にPoly(ethylenimine)を0.1%(w/v)、硫酸アンモニウムを0.2Mとなるように添加し、氷冷下で20分攪拌後、4℃、15,000xg、20分の遠心分離にて上清を回収した。
(3)回収した上清に硫酸アンモニウムを2.4Mとなるように添加し、水酸化カリウムにてpHを7.5に調整、氷冷下で10分攪拌後、4℃、15,000xg、60分の遠心分離にて沈殿を回収した。沈殿は、直ちに次の処理をしない場合は−80℃で保存した。
(4)回収した沈殿を疎水クロマト溶離液B(3種類のプロテアーゼインヒビター、1M 硫酸アンモニウムを含むBase buffer pH7.5)の実施例1(1)の1/2量に溶解し、氷冷下で10分攪拌後、4℃、30,000xg、60分の遠心分離にて上清を回収した。回収した上清をポアサイズ2μm程度の清澄化フィルターで濾過し、クロマトグラフ供与液とした。

0023

<実施例3>疎水性クロマトグラフ
実施例2にて調製したクロマトグラフ供与液を用い、以下の手順で疎水性クロマトグラフを実施した。
(1)TOYOPEARLPhenyl−600Mゲルを充填したカラムを疎水クロマト溶離液A(3種類のプロテアーゼインヒビターを含むBase buffer)で3ColumnVolume(CV)洗浄後、疎水クロマト溶離液B3CVで平衡化した。実施例2にて調製したクロマトグラフ供与液を通液後、疎水クロマト溶離液B/Aが7/3の比で3CV洗浄した。疎水クロマト溶離液Aを2CV通液し、280nmの吸光度ピーク立ち上がりから通液終了までの1.5CVを回収した。回収液を滅菌フィルターで濾過後、濾液を20倍量のBase bufferで3回透析した。
(2)疎水クロマト回収後の濾液と透析後の回収液をSDS−PAGEし、100kDaの位置に泳動されるT7RNAポリメラーゼのバンドおよび80kDaの位置に泳動されるT7RNAポリメラーゼ分解物のバンドの濃さの増減を比較したところ、透析前後で両バンドの濃さに変化は見られず、疎水性クロマトグラフにより、T7RNAポリメラーゼ回収画分からプロテアーゼが除去されていることを確認した。(図1
<実施例4>陰イオン交換クロマトグラフ
実施例3にて調製した透析後液を用い、以下の手順で陰イオン交換クロマトグラフを実施した。
(1)TOYOPEARL GigaCapDEAE−650Mゲルを充填したカラムを陰イオン交換クロマト溶離液B(1M塩化ナトリウムを含むBase buffer pH7.5)3ColumnVolume(CV)で洗浄後、陰イオン交換クロマト溶離液A(Base buffer)3CVで平衡化した。実施例3にて調製した透析後液を通液後、陰イオン交換クロマト溶離液A3CVで洗浄した。陰イオン交換クロマト溶離液A100%から陰イオン交換クロマト溶離液B100%へのリニアグラジエント条件で6CV通液し、T7RNAポリメラーゼ画分を溶出した。T7RNAポリメラーゼは、280nmの吸光度ピークの立ち上がり(溶離液中塩化ナトリウム濃度は0.06M)から溶離液中の塩化ナトリウム濃度が0.4Mになるまで間で溶出された。
回収液をBase bufferで3倍希釈後、15倍量のBase bufferで2回透析した。
(2)透析後の回収液をアガロース電気泳動用のDNA Marker、およびRNA Markerと混合し、37℃にて6時間加温後、混合液をアガロース電気泳動し、各バンドの濃さを調べたところ、両Markerとも回収液の添加の有無でバンドの濃さに変化は見られず、陰イオン交換クロマトグラフにより、T7RNAポリメラーゼ回収画分からDNase、RNaseが除去されていることを確認した。

0024

<実施例5>アフィニティークロマトグラフ
実施例4にて調製した透析後液を用い、以下の手順でアフィニティークロマトグラフを実施した。
(1)TOYOPEARLAF−Heparin−HC650Mゲルを充填したカラムをアフィニティークロマト溶離液B(1M塩化ナトリウムを含むBase buffer pH7.5)3ColumnVolume(CV)で洗浄後、アフィニティークロマト溶離液A(Base buffer)3CVで平衡化した。実施例4にて調製した透析後液を通液後、アフィニティークロマト溶離液A3CVで洗浄した。アフィニティークロマト溶離液A100%から陰イオン交換クロマト溶離液B100%へのリニアグラジエント条件で6CV通液し、T7RNAポリメラーゼ画分を溶出した。溶出画分には、まずT7RNAポリメラーゼ分解物が溶出され、その後T7RNAポリメラーゼが溶出される(図2)ため、溶出液の後半を回収することで、T7RNAポリメラーゼを高純度に回収することができる。フラクション分取された溶出液をSDS−PAGEし、T7RNAポリメラーゼの溶出されたフラクションを回収した。回収液を透析buffer(40mMリン酸カリウム、200mM塩化ナトリウム、0.2mMEDTA、2mM DTT pH7.5)で2倍希釈後、20倍量の透析bufferで2回透析した。回収した透析後液を滅菌フィルターで濾過し、T7RNAポリメラーゼ精製液とした。精製したT7RNAポリメラーゼの280nmの吸光度は、14であった。またSDS−PAGEにより酵素タンパク純度を分析し、ほぼ単一のタンパクであることを確認した。(図3
<参考例1>精製したT7RNAポリメラーゼによる核酸増幅反応
実施例5にて調製したT7RNAポリメラーゼ精製液を用い、TRC法による核酸増幅反応を、結核菌リボゾーマルRNA遺伝子(rRNA)を標的RNAとして、以下の方法で実施した。
(1)結核菌群rRNA検出試薬(TRCReadyMTB(商品名)、東ソー製)に添付のMTB RNA陽性標準(濃度:104コピー/5μL)をRNA希釈液(10mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、1mM EDTA、0.5U/μLRNaseInhibitor、5mMジチオスレイトール)にて、103コピー/5μLとなるよう希釈した。
(2)以下の組成反応液20μLを0.5mL容のPCRチューブ分注し、これに上記RNA試料5μLを添加した。

0025

(反応液の組成)(最終反応液量30μLにおける濃度または量)
60mM Tris−HCl緩衝液(pH8.6)
17mM MgCl2
100mM KCl
6URNaseInhibitor
1mMジチオスレイトール
各0.25mM dATP、dCTP、dGTP、 dTTP
3.6mMITP
各3.0mM ATP、CTP、GTP、UTP
0.12μM切断用オリゴヌクレオチド(MTB−S−1)
1.0μM 第一のプライマー(MTB−F−1)
1.0μM 第二のプライマー(MTB−R−1)
7.5nM蛍光色素標識された検出用プローブ(MTB−P−1)
1%DMSO
容量調整用蒸留水
(3)(2)の反応液を46℃で5分間保温後、あらかじめ同温度で2分間保温した以下に示す組成の酵素液5μLを添加した。

0026

(酵素液の組成)(最終反応液量30μLにおける濃度または量)
2%ソルビトール
3.6μg牛血清アルブミン
6.4U AMV逆転写酵素
140U T7RNAポリメラーゼ
容量調整用蒸留水
(4)直接測定可能な温度調節機能付き蛍光光度計(TRCReady−80(商品名)、東ソー製)を用い、励起波長500nm、蛍光波長545nmで、反応溶液中の蛍光強度を経時的に測定した。

0027

酵素添加時の時間を0分として、反応液の蛍光強度の経時変化(n=4で測定)を図4に示した。本発明にて製造したT7RNAポリメラーゼは、MTBrRNAを増幅した。このことから、本発明により製造されたT7RNAポリメラーゼが、核酸増幅反応であるTRC法に使用可能であることが確認された。

0028

<参考例2>アフィニティークロマトグラフ(ヘパリン)
実施例2(3)にて調製した沈殿を用い、以下の手順でアフィニティークロマトグラフを実施した。
(1)実施例2(3)にて調製した沈殿をアフィニティークロマト溶離液A(Base buffer)に溶解し、氷冷下で10分攪拌後、4℃、30,000xg、60分の遠心分離にて上清を回収した。回収した上清をポアサイズ2μm程度の清澄化フィルターで濾過し、クロマトグラフ供与液とした。
(2)TOYOPEARLAF−Heparin−HC650Mゲルを充填したカラムをアフィニティークロマト溶離液B(1M塩化ナトリウムを含むBase buffer pH7.5)3ColumnVolume(CV)で洗浄後、アフィニティークロマト溶離液A(Base buffer)3CVで平衡化した。クロマトグラフ供与液を通液後、アフィニティークロマト溶離液A3CVで洗浄した。アフィニティークロマト溶離液A100%から陰イオン交換クロマト溶離液B100%へのリニアグラジエント条件で6CV通液し、T7RNAポリメラーゼ画分を溶出した。溶出画分には、まずT7RNAポリメラーゼ分解物が溶出され、その後T7RNAポリメラーゼが溶出されるため、溶出液の後半を回収することで、T7RNAポリメラーゼを高純度に回収することができる。フラクション分取された溶出液をSDS−PAGEし、T7RNAポリメラーゼの溶出されたフラクションを回収した。回収液を透析buffer(40mMリン酸カリウム、200mM塩化ナトリウム、0.2mMEDTA、2mM DTT pH7.5)で2倍希釈後、20倍量の透析bufferで2回透析した。
(3)アフィニティークロマト回収液と透析後の回収液をSDS−PAGEし、100kDaの位置に泳動されるT7RNAポリメラーゼのバンドおよび80kDaの位置に泳動されるT7RNAポリメラーゼ分解物のバンドの濃さの増減を比較したところ、透析後の回収液で100kDaの位置に泳動されるT7RNAポリメラーゼのバンドの著しい減少と80kDaの位置に泳動されるT7RNAポリメラーゼ分解物のバンドの著しい増加が見られた。ヘパリンクロマトグラフでは、T7RNAポリメラーゼ回収画分からプロテアーゼは除去できないことを確認した。(図5
<参考例3>アフィニティークロマトグラフ(Phospho)
実施例2(3)にて調製した沈殿を用い、以下の手順でアフィニティークロマトグラフを実施した。
(1)実施例2(3)にて調製した沈殿をアフィニティークロマト溶離液A(Base buffer)に溶解し、氷冷下で10分攪拌後、4℃、30,000xg、60分の遠心分離にて上清を回収した。回収した上清をポアサイズ2μm程度の清澄化フィルターで濾過し、クロマトグラフ供与液とした。
(2)Cellufine Phosphateゲル(JNC株式会社製)を充填したカラムをアフィニティークロマト溶離液B(1M塩化ナトリウムを含むBase buffer pH7.5)3ColumnVolume(CV)で洗浄後、アフィニティークロマト溶離液A(Base buffer)3CVで平衡化した。クロマトグラフ供与液を通液後、アフィニティークロマト溶離液A3CVで洗浄した。アフィニティークロマト溶離液A100%から陰イオン交換クロマト溶離液B100%へのリニアグラジエント条件で6CV通液し、T7RNAポリメラーゼ画分を溶出した。溶出液を透析buffer(40mM リン酸カリウム、200mM 塩化ナトリウム、0.2mM EDTA、2mM DTT pH7.5)で2倍希釈後、20倍量の透析bufferで2回透析した。
(3)アフィニティークロマト回収液と透析後の回収液をSDS−PAGEし、100kDaの位置に泳動されるT7RNAポリメラーゼのバンドおよび80kDaの位置に泳動されるT7RNAポリメラーゼ分解物のバンドの濃さの増減を比較したところ、透析後の回収液で100kDaの位置に泳動されるT7RNAポリメラーゼのバンドの著しい減少と80kDaの位置に泳動されるT7RNAポリメラーゼ分解物のバンドの著しい増加が見られた。Phosphoクロマトグラフでは、T7RNAポリメラーゼ回収画分からプロテアーゼは除去できないことを確認した。(図6
<参考例4>アフィニティークロマトグラフ(ヘパリン)
実施例3にて調製した透析後液を用い、以下の手順でアフィニティークロマトグラフを実施した。
(1)TOYOPEARL AF−Heparin−HC650Mゲルを充填したカラムをアフィニティークロマト溶離液B(1M塩化ナトリウムを含むBase buffer pH7.5)3ColumnVolume(CV)で洗浄後、アフィニティークロマト溶離液A(Base buffer)3CVで平衡化した。実施例3にて調製した透析後液を通液後、アフィニティークロマト溶離液A3CVで洗浄した。アフィニティークロマト溶離液A100%から陰イオン交換クロマト溶離液B100%へのリニアグラジエント条件で6CV通液し、T7RNAポリメラーゼ画分を溶出した。溶出画分には、まずT7RNAポリメラーゼ分解物が溶出され、その後T7RNAポリメラーゼが溶出されるため、溶出液の後半を回収することで、T7RNAポリメラーゼを高純度に回収することができる。フラクション分取された溶出液をSDS−PAGEし、T7RNAポリメラーゼの溶出されたフラクションを回収した。回収液を透析buffer(40mM リン酸カリウム、200mM 塩化ナトリウム、0.2mM EDTA、2mM DTT pH7.5)で2倍希釈後、20倍量の透析bufferで2回透析した。
(2)透析後の回収液をアガロース電気泳動用のDNA Markerと混合し、37℃にて6時間加温後、混合液をアガロース電気泳動し、各バンドの濃さを調べたところ、各バンドは薄く、かつ/もしくは、スメアになっていた。ヘパリンクロマトグラフでは、T7RNAポリメラーゼ回収画分からDNaseは除去できないことを確認した。

0029

<参考例5>アフィニティークロマトグラフ(Phospho)
実施例3にて調製した透析後液を用い、以下の手順でアフィニティークロマトグラフを実施した。
(1)Cellufine Phosphateゲル(JNC株式会社製)を充填したカラムをアフィニティークロマト溶離液B(1M塩化ナトリウムを含むBase buffer pH7.5)3ColumnVolume(CV)で洗浄後、アフィニティークロマト溶離液A(Base buffer)3CVで平衡化した。実施例3にて調製した透析後液を通液後、アフィニティークロマト溶離液A3CVで洗浄した。アフィニティークロマト溶離液A100%から陰イオン交換クロマト溶離液B100%へのリニアグラジエント条件で6CV通液し、T7RNAポリメラーゼ画分を溶出した。溶出液を透析buffer(40mMリン酸カリウム、200mM塩化ナトリウム、0.2mMEDTA、2mM DTT pH7.5)で2倍希釈後、20倍量の透析bufferで2回透析した。
(2)透析後の回収液をアガロース電気泳動用のDNA Markerと混合し、37℃にて6時間加温後、混合液をアガロース電気泳動し、各バンドの濃さを調べたところ、各バンドは薄く、かつ/もしくは、スメアになっていた。Phosphoクロマトグラフでは、T7RNAポリメラーゼ回収画分からDNaseは除去できないことを確認した。

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