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技術 微生物DNA抽出装置、粒子破砕装置、及び微生物DNA抽出装置の使用方法

出願人 国立大学法人京都大学
発明者 潮雅之
出願日 2018年9月18日 (2年2ヶ月経過) 出願番号 2018-173812
公開日 2020年3月26日 (7ヶ月経過) 公開番号 2020-043793
状態 未査定
技術分野 微生物・酵素関連装置 突然変異または遺伝子工学
主要キーワード カートリッジ型フィルター 検出種 脱落防止部材 粒子破砕 フィルター構造体 筒状態 ビーズ入り 遠心分離作業
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2020年3月26日)のものです。
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図面 (9)

課題

液体サンプル中の微生物などの粒子収集破砕する作業を、コンタミネーションリスクを抑えつつ、簡便に行えるようにする。

解決手段

微生物DNA抽出装置10は、内部空間17を有し、前記内部空間17に連通するインレット15及びアウトレット16を備える容器11と、前記内部空間内に設けられ、前記インレット15から流入し前記アウトレット16から流出する液体サンプル中の微生物を捕捉する第1フィルター20と、前記内部空間17内に配置され、前記第1フィルター20に捕捉された前記微生物のDNAを抽出するために前記微生物を破砕するビーズ30と、を備える。

概要

背景

水中に存在する微生物は目には見えないが、水域生態系の動態・維持に大きな貢献をしている。例えば、有害物質の分解・光合成を介した無機物質有機化・大型生物への病原性などの機能はよく知られている。これらの役割をよく理解するために、水中にいる微生物の検出方法は非常に重要である。

現在、水(やその他の環境中)からの微生物検出はDNAを利用した方法が主流である。この方法では、まず水サンプル収集し、ろ過・濃縮などの前処理を経てDNA抽出を行う。

ここで、非特許文献1は、ろ過用のカートリッジ型フィルターを、水中に浮遊する魚類DNAの捕捉に利用することを開示している。カートリッジ型フィルター(例えば、Sterivex(登録商標),メルクミリポア)は、カートリッジ内にフィルター収納されている。フィルターがカートリッジ内に収納されていることで、外部からのコンタミネーションを抑制することが可能である。非特許文献1では、カートリッジ内部に細胞融解溶液(Lysis buffer)を入れることで、DNAを抽出する。

概要

液体サンプル中の微生物などの粒子を収集し破砕する作業を、コンタミネーションのリスクを抑えつつ、簡便に行えるようにする。微生物DNA抽出装置10は、内部空間17を有し、前記内部空間17に連通するインレット15及びアウトレット16を備える容器11と、前記内部空間内に設けられ、前記インレット15から流入し前記アウトレット16から流出する液体サンプル中の微生物を捕捉する第1フィルター20と、前記内部空間17内に配置され、前記第1フィルター20に捕捉された前記微生物のDNAを抽出するために前記微生物を破砕するビーズ30と、を備える。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

内部空間を有し、前記内部空間に連通するインレット及びアウトレットを備える容器と、前記内部空間内に設けられ、前記インレットから流入し前記アウトレットから流出する液体サンプル中の微生物捕捉する第1フィルターと、前記内部空間内に配置され、前記第1フィルターに捕捉された前記微生物のDNAを抽出するために前記微生物を破砕するビーズと、を備える微生物DNA抽出装置

請求項2

前記第1フィルターは、前記内部空間を、前記インレット側の第1空間と前記アウトレット側の第2空間と区分けするように設けられ、前記ビーズは、前記第1空間に配置されている請求項1に記載の微生物DNA抽出装置。

請求項3

前記ビーズが前記インレットから前記容器外脱落するのを防止する脱落防止部材を更に備える請求項2に記載の微生物DNA抽出装置。

請求項4

前記脱落防止部材は、前記第1フィルターよりも前記インレット側に設けられ、前記微生物を透過させるが前記ビーズを透過させない第2フィルターを含む請求項3に記載の微生物DNA抽出装置。

請求項5

前記内部空間から前記インレットを通って流出する内容物を収容できるように前記容器に着脱自在に装着される遠沈管を更に備える請求項1から4のいずれか1項に記載の微生物DNA抽出装置。

請求項6

前記インレットを塞ぐように着脱自在に装着された第1部材と、前記アウトレットを塞ぐように着脱自在に装着された第2部材と、を更に備える請求項1から5のいずれか1項に記載の微生物DNA抽出装置。

請求項7

前記第1フィルターは、ろ過孔径が0.1μmから1μmの範囲内である請求項1から6のいずれか1項に記載の微生物DNA抽出装置。

請求項8

前記ビーズは、直径が0.1mm以上1mm以下である請求項1から7のいずれか1項に記載の微生物DNA抽出装置。

請求項9

内部空間を有し、前記内部空間に連通するインレット及びアウトレットを備える容器と、前記内部空間内に設けられ、前記インレットから流入し前記アウトレットから流出する液体サンプル中の粒子を捕捉する第1フィルターと、前記内部空間内に配置され、前記第1フィルターに捕捉された粒子を破砕するビーズと、を備える粒子破砕装置。

請求項10

請求項1から8のいずれか1に記載の微生物DNA抽出装置の使用方法であって、前記インレットから注入された液体サンプル中の微生物を前記第1フィルターによって捕捉する工程と、前記内部空間に溶液を保持させる工程と、前記容器を振とうさせることで、前記第1フィルターによって捕捉された前記微生物を前記内部空間内において前記ビーズによって破砕する工程と、を含む使用方法。

請求項11

前記インレットを通って流出する内容物を収容できるように前記容器に遠沈管を装着する工程と、前記容器に装着された前記遠沈管を遠心分離機にかけることで、前記インレットから前記内部空間内の内容物を遠心力により前記遠沈管に移行させ、前記遠沈管内の内容物の遠心分離を行う遠心分離工程と、を更に含む請求項10に記載の使用方法。

請求項12

前記遠心分離工程では、前記内部空間内のビーズを含む前記内容物が遠心力により前記遠沈管に移行する請求項11に記載の使用方法。

技術分野

0001

本開示は、微生物DNA抽出装置フィルター装置、及び微生物DNA抽出装置の使用方法に関する。

背景技術

0002

水中に存在する微生物は目には見えないが、水域生態系の動態・維持に大きな貢献をしている。例えば、有害物質の分解・光合成を介した無機物質有機化・大型生物への病原性などの機能はよく知られている。これらの役割をよく理解するために、水中にいる微生物の検出方法は非常に重要である。

0003

現在、水(やその他の環境中)からの微生物検出はDNAを利用した方法が主流である。この方法では、まず水サンプル収集し、ろ過・濃縮などの前処理を経てDNA抽出を行う。

0004

ここで、非特許文献1は、ろ過用のカートリッジ型フィルターを、水中に浮遊する魚類DNAの捕捉に利用することを開示している。カートリッジ型フィルター(例えば、Sterivex(登録商標),メルクミリポア)は、カートリッジ内にフィルター収納されている。フィルターがカートリッジ内に収納されていることで、外部からのコンタミネーションを抑制することが可能である。非特許文献1では、カートリッジ内部に細胞融解溶液(Lysis buffer)を入れることで、DNAを抽出する。

先行技術

0005

Miya et al. (2016) “Use of a filter cartridge for filtration of water samples and extraction of environmental DNA” Journal of Visualized Experiments 117DOI:10.3791/54741

0006

非特許文献1の方法では、硬い細胞壁を持つ微生物を検出できない可能性がある。すなわち、水中に浮遊する魚類DNAとは異なり、細胞壁を持つ微生物の場合、細胞融解溶液だけではDNAを抽出するのが困難なことがある。

0007

また、カートリッジからフィルターを取り出し、フィルターに捕捉された微生物をビーズ破砕することで、DNAを効率的に抽出する方法も考えられるが、この場合、フィルター取り出しのため、カートリッジの破壊が必要となる。カートリッジの破壊は、手間がかかり煩雑である。しかも、カートリッジの破壊によりフィルターが外気に直接晒され、他の微生物等が混入するコンタミネーションのリスクが増大する。

0008

そこで、液体サンプル中の微生物などの粒子を収集し破砕する作業を、コンタミネーションのリスクを抑えつつ、簡便に行えることが望まれる。

0009

本開示の一側面は、微生物DNA抽出装置である。微生物DNA抽出装置は、内部空間を有し、前記内部空間に連通するインレット及びアウトレットを備える容器と、前記内部空間内に設けられ、前記インレットから流入し前記アウトレットから流出する液体サンプル中の微生物を捕捉する第1フィルターと、前記内部空間内に配置され、前記第1フィルターに捕捉された前記微生物のDNAを抽出するために前記微生物を破砕するビーズと、を備える。

0010

本開示の他の側面は、粒子破砕装置である。上記の微生物DNA抽出装置は、微生物DNAの抽出に限らず、液体サンプル中の粒子を捕捉し、捕捉された粒子を破砕するためにも用いることができる。すなわち、粒子破砕装置は、内部空間を有し、前記内部空間に連通するインレット及びアウトレットを備える容器と、前記内部空間内に設けられ、前記インレットから流入し前記アウトレットから流出する液体サンプル中の粒子を捕捉する第1フィルターと、前記内部空間内に配置され、前記第1フィルターに捕捉された粒子を破砕するビーズと、を備える。

0011

本開示の他の側面は、微生物DNA抽出装置の使用方法である。使用方法は、前記インレットから注入された液体サンプル中の微生物を前記第1フィルターによって捕捉する工程と、前記内部空間に溶液を保持させる工程と、前記容器を振とうさせることで、前記第1フィルターによって捕捉された前記微生物を前記内部空間内において前記ビーズによって破砕する工程と、を含む。

0012

更なる詳細は、後述の実施形態として説明される。

図面の簡単な説明

0013

図1は、微生物DNA抽出装置の断面図である。
図2は、微生物DNA抽出装置の外観側面図である。
図3は、微生物DNA抽出装置を用いた微生物DNA抽出及び分析の手順を示すフローチャートである。
図4は、遠沈管が装着された微生物DNA抽出装置の遠心分離作業を示す説明図である。
図5は、微生物DNA抽出装置の第1変形例を示す部分断面図である。
図6は、微生物DNA抽出装置の第2変形例を示す断面図である。
図7は、実験に用いた装置の写真である。
図8は、実験結果を示すグラフである。

実施例

0014

<1.微生物DNA抽出装置、粒子破砕装置、及び微生物DNA抽出装置の使用方法の概要

0015

(1)実施形態に係る微生物DNA抽出装置は、内部空間を有し、前記内部空間に連通するインレット及びアウトレットを備える容器を備える。実施形態に係る装置はさらに、前記内部空間内に設けられ、前記インレットから流入し前記アウトレットから流出する液体サンプル中の微生物を捕捉する第1フィルターを備える。第1フィルターが容器内に設けられていることで、第1フィルターが直接外部に晒されず、コンタミネーションのリスクを抑制できる。ここで、液体サンプルとは、例えば、水サンプルであり、水サンプルは、例えば、河川・海など微生物が生息する水域から採取される。液体サンプルは、第1フィルターによってろ過され、ろ過の際に、微生物は第1フィルターに捕捉される。実施形態に係る装置はさらに、前記内部空間内に配置され、前記第1フィルターに捕捉された前記微生物のDNAを抽出するために前記微生物を破砕するビーズ、を備える。破砕ビーズを備えることで、微生物が硬い細胞壁を有していても、微生物を破砕でき、効率的にDNAを抽出できる。

0016

(2)前記第1フィルターは、前記内部空間を、前記インレット側の第1空間と前記アウトレット側の第2空間と区分けするように設けられ、前記ビーズは、前記第1空間に配置されているのが好ましい。微生物は、主に、第1フィルターの第1空間側で捕捉されるため、ビーズが第1空間に配置されていることで、効率的に微生物を破砕できる。

0017

(3)実施形態に係る装置は、前記ビーズが前記インレットから前記容器外脱落するのを防止する脱落防止部材を更に備えることができる。

0018

(4)前記脱落防止部材は、前記第1フィルターよりも前記インレット側に設けられ、前記微生物を透過させるが前記ビーズを透過させない前記第2フィルターを含むことができる。

0019

(5)実施形態に係る装置は、前記内部空間から前記インレットを通って流出する内容物を収容できるように前記容器に着脱自在に装着される遠沈管を更に備えることができる。

0020

(6)実施形態に係る装置は、前記インレットを塞ぐように着脱自在に装着された第1部材と、前記アウトレットを塞ぐように着脱自在に装着された第2部材と、を更に備えることができる。第1部材及び第2部材により、装置の取り扱いの簡便性が向上するとともに、コンタミネーションのリスクをより抑制できる。

0021

(7)前記第1フィルターは、ろ過孔径が0.1μmから1μmの範囲内であるのが好ましい。

0022

(8)前記ビーズは、直径が0.1mm以上1mm以下であるのが好ましい。

0023

(9)実施形態に係る装置は、粒子破砕装置としてとらえることもできる。粒子は、例えば、微生物であってもよいが、微生物以外の他の粒子、例えば土壌粒子そのもの、硬い外骨格を持つミジンコなど微小無脊椎動物、細胞壁を持つ植物プランクトンなど、であってもよい。粒子破砕装置は、内部空間を有し、前記内部空間に連通するインレット及びアウトレットを備える容器と、前記内部空間内に設けられ、前記インレットから流入し前記アウトレットから流出する液体サンプル中の粒子を捕捉する第1フィルターと、前記内部空間内に配置され、前記第1フィルターに捕捉された粒子を破砕するビーズと、を備えることができる。

0024

(10)実施形態に係る方法は、前記微生物DNA抽出装置の使用方法である。使用方法は、前記インレットから注入された液体サンプル中の微生物を前記第1フィルターによって捕捉する工程と、前記内部空間に溶液を保持させる工程と、前記容器を振とうさせることで、前記第1フィルターによって捕捉された前記微生物を前記内部空間内において前記ビーズによって破砕する工程と、を含む。溶液は、例えば、細胞融解溶液を含むのが好ましい。容器の振とうにより、微生物をビーズにより破砕することができる。

0025

(11)使用方法は、前記インレットを通って流出する内容物を収容できるように前記容器に遠沈管を装着する工程と、前記容器に装着された遠沈管を遠心分離機にかけることで、前記インレットから前記内部空間内の内容物を遠心力により前記遠沈管に移行させ、前記遠沈管内の内容物の遠心分離を行う遠心分離工程と、を更に含むことができる。

0026

(12)前記遠心分離工程では、前記内部空間内のビーズを含む前記内容物が遠心力により前記遠沈管に移行するのが好ましい。

0027

<2.微生物DNA抽出装置、粒子破砕装置、及び微生物DNA抽出装置の使用方法の例>

0028

<2.1微生物DNA抽出装置(粒子破砕装置)の構造>

0029

図1及び図2は、微生物DNA抽出装置10を示している。微生物DNA抽出装置10は、液体サンプル中の微生物を捕捉し、捕捉された微生物を破砕するために用いられる。なお、図1及び図2に示す装置10は、微生物以外の粒子を捕捉し、捕捉された粒子を破砕するために用いてもよい。

0030

装置10は、容器(カートリッジ)11を備える。容器11は、中空円筒状の容器本体13と、容器本体13の長手方向の一端側に設けられたインレット15と、長手方向の他端側に設けられたアウトレット16と、を備える。容器本体13は、円筒部131と、円筒部131の長手方向両端に設けられた端面部132,133と、を備える。インレット15は、容器本体13よりの細径円筒状であり、端面部132から突出状に形成されている。インレット15は、液体サンプルを容器11の内部空間17に流入させる流入口となる開口151を備える。アウトレット16は、容器本体13よりも細径の円筒状であり、端面部133から突出状に形成されている。アウトレット16は、内部空間17から液体サンプルを流出させる流出口となる開口161を備える。

0031

容器11は、例えば、合成樹脂製であり、より具体的には、強化プラスチック製である。容器11は、透明であってもよいし、不透明であってもよい。容器11は、内部空間17への紫外線の透過を減少又は遮るための処理(例えば、コーティング処理など)が施されていてもよい。

0032

容器本体13の内部には、容器本体13の内部空間17を外径側空間171と内径側空間172とに仕切るように形成されたコア部19を備える。コア部19は、内部空間17内において、端面部133からインレット15側へ立設された中空の円筒部191を備える。円筒部191は、例えば、合成樹脂製であり、容器11と同様に、強化プラスチック製であるのが好ましい。

0033

外径側空間171は、インレット15と連通している。したがって、インレット15から流入した液体は、まず、外径側空間171に入る。

0034

円筒部191には、円筒部191の外から内への液体の通過を許容するための複数の貫通孔193が形成されている。したがって、外径側空間171の液体は、貫通孔193を通って、内径側空間172へ移動することができる。内径側空間172は、アウトレット16と連通している。したがって、インレット15から流入した液体は、外径側空間171、貫通孔193、内径側空間172を順に通って、アウトレット16から流出する。

0035

なお、円筒部191の上部には通気口フィルター192が設けられている。通気口フィルター192は、例えば、疎水性ベントフィルター膜によって構成される。通気口フィルター192のフィルター孔径は、例えば、0.1μmである。

0036

装置10は、容器11の内部空間17内に設けられたフィルター(第1フィルター)20を備える。フィルター20は、液体サンプル中の微生物を捕捉する。実施形態において、フィルター20は、コア部19の円筒部191表面に張り付けられた膜状のろ過フィルターによって構成されている。フィルター20は多孔質膜又は繊維膜であるのが好ましい。フィルター20は、例えば、フッ素樹脂製であり、より好ましくは、ポリフッ化ビニリデンPVDF)製である。

0037

フィルター20のろ過孔径は、微生物を捕捉する観点から適切な大きさに設定される。ろ過孔径の好ましい範囲は、例えば、0.1μmから1μmである。微生物の大きさは、1μm前後又は数μm程度であることが多いため、捕捉される微生物の大きさよりも小さいろ過孔径のフィルターを採用することで、微生物を効率的に捕捉できる。例えば、ろ過孔径が、1μm以下であれば、1μmより大きい微生物を捕捉できるため、好ましく、0.5μm以下であれば、0.5μmより大きい微生物を捕捉できるため、より好ましく、0.3μm以下であれば、ほとんどの微生物を捕捉でき、さらに好ましい。なお、ろ過孔径の好適な一例は、0.22μmである。0.22μmのフィルター20としては、例えば、メルク社のデュポア(Durapore:登録商標)メンブレンフィルタ(ポアサイズ0.22μm,PVDF)を用いることができる。

0038

フィルター20は、複数の貫通孔193全てを覆うように、円筒部191の表面に張り付けられている。フィルター20によって、容器11の内部空間17は、外径側空間(第1空間)171と内径側空間(第2空間)172とに区分けされる。したがって、インレット15から流入した液体サンプルに含まれる微生物は、フィルター20の外径側空間171側表面付近において捕捉され、フィルター20を透過できない。フィルター20によってろ過された液体サンプルは、貫通孔193を通って、内径側空間172に流入し、アウトレット16から容器11外へ流出する。

0039

なお、前述の通気口フィルター192が設けられていることで、液体サンプルが、外径側空間171側から内径側空間172側へ流入した際に、内径側空間172内の空気を、通気口フィルター192から外径側空間171へ逃がすことができる。これにより、液体サンプルの流れが円滑になる。また、通気口フィルター192にも微生物が捕捉されることがある。

0040

装置10は、容器11の内部空間17内に配置されたビーズ30を備える。ビーズ30は、フィルター20,192に捕捉された微生物などの粒子を破砕すべく容器11内に収納されている。実施形態において、ビーズ30は、内部空間17のうち、外径側空間(第1空間)171に配置され、内径側空間(第2空間)172には配置されていない。実施形態においては、微生物は、フィルター20の外径側空間171側の表面付近において捕捉されるため、破砕用ビーズ30は、外径側空間(第1空間)171に配置されていれば足りる。

0041

なお、内部空間17は、フィルター20によって外径側空間171と内径側空間172とに区切られており、ビーズ30は、外径側空間171内を自由に移動できるが、外径側空間171にあるビーズ30は、内径側空間172へは移動できない。

0042

ビーズ30は、微生物などの粒子を効率的に破砕すべく、セラミックス又はガラスなどの硬質材料によって構成されている。ビーズ30径は、破砕対象粒子(ここで、微生物)を効率的に破砕する観点から、適切な大きさに設定される。ビーズ30の直径の好ましい範囲は、例えば、0.1mm以上1mm以下である。ビーズ30は、一般に、ビーズ直径の1/1000程度から1/10程度の大きさの粒子を破砕することができる。したがって、ビーズ直径が、0.1mmであれば、0.1μm程度から10μm程度の粒子を破砕できる。また、ビーズ直径が、1mmであれば、1μm程度から100μm程度の粒子を破砕できる。微生物の大きさは、1μm前後又は数μm程度であることが多いため、ビーズ直径が、0.1mm以上1mm以下であれば、ほとんどの微生物を効率的に破砕できる。

0043

ビーズ直径のより好ましい範囲の下限は、0.3mmであり、さらに好ましい下限は0.4mmである。ビーズ直径のより好ましい範囲の上源は、0.7mmであり、さらに好ましい上限は0.6mmである。ビーズ直径の好適な一例は、0.5mmである。直径0.5mmのビーズ30としては、例えば、ニッカトー、ジルコニアボール型番:YTZ−0.5)を用いることができる。

0044

ビーズ30は、容器11内においてビーズ30が配置される空間(ここでは、外径側空間171)の体積Aの50%以下の体積を占める量が、容器11内に収納されているのが好ましい。ビーズ30は、より好ましくは、体積Aの30%以下の体積、さらに好ましくは、体積Aの20%以下の体積を占める量が収納されているのが好ましい。ビーズ30は、効率的な破砕のため、体積Aの1%以上の体積、より好ましくは、体積Aの5%以上の体積、さらに好ましくは、体積の10%以上の体積を占める量が収納されているのが好ましい。

0045

図2に示すように、インレット15には、インレットキャップ(脱落防止部材;第1部材)50が着脱自在に装着されている。インレットキャップ50は、インレット15に嵌合されて、インレット15を塞ぐ。インレットキャップ50が装着されていることで、ビーズ30が、インレット15から容器11外へ脱落するのが防止される。また、インレットキャップ50は、容器11内に注入された溶液がインレット15から流出するのを防止できる。さらに、インレットキャップ50は、インレット15からの異物進入を防止でき、コンタミネーションの抑制に寄与する。

0046

アウトレット16には、アウトレットキャップ(第2部材)60が着脱自在に装着されている。アウトレットキャップ60は、アウトレット16に嵌合されて、アウトレット16を塞ぐ。アウトレットキャップ60は、容器11内に注入された溶液がアウトレット16から流出するのを防止できる。さらに、アウトレットキャップ60は、アウトレット16からの異物の進入を防止でき、コンタミネーションの抑制に寄与する。

0047

なお、キャップ50,60を容器11へ着脱自在に装着するための構造としては、上述の嵌合構造に限られず、ねじ構造など、着脱自在に装着するための公知の様々な構造を採用することができる。

0048

実施形態においては、装置10は、容器11に着脱自在に装着される遠沈管(遠心菅)40を備える。後述するように、遠沈管40は、液体サンプルを容器11に注入する際には取り外される。遠沈管40は、後述する遠心分離工程において容器11に装着される。遠沈管40は、例えば、マイクロチューブである。容器11のインレット15側の端面132は、遠沈管40の開口に嵌入される嵌合部132Aを備えている。嵌合部132Aは、インレット15の基端付近において端面132から突出状に形成されている。嵌合部132Aは、遠沈管40の内面とほぼ同径同大に形成されており、嵌合部132Aが、遠沈管40の開口から挿入されることで、遠沈管40が容器11に装着される。遠沈管40が容器11に装着された状態においては、遠沈管40内部にインレット15が位置する。したがって、遠沈管40は、容器11の内部空間17からインレット15を通って流出する溶液を、その内部に収容することができる。

0049

なお、遠沈管40を容器11へ着脱自在に装着するための構造としては、上述の嵌合構造に限られず、ねじ構造など、着脱自在に装着するための公知の様々な構造を採用することができる。

0050

<2.2 DNA抽出>

0051

図3は、装置10を利用したDNA抽出の工程を示している。まず、湖、河川、海などの水サンプルの採取地において、水サンプルを採取する。水サンプルには、微生物が含まれる。採取された水サンプルを、ビーズ30入りの容器11へ注入する(ステップS11)。水サンプルの容器11への注入には、図示しない注入器シリンジ)を用いる。注入に先立って、容器11からキャップ50,60が取り外される。なお、遠沈管40が容器11に装着されている場合には、遠沈管40も容器11から取り外される。続いて、容器11のインレット15と水サンプルを保持した注入器の先端とを接続する。そして、注入器のプランジャ押操作により、注入器からインレット15を通って容器11内へ水サンプルが注入される。

0052

図1に示すように、インレット15から注入された水サンプルは、まず、外径側空間171に流入し、フィルター20及び貫通孔193を通って、内径側空間172へ移動する。この際、水サンプルは、フィルター20によってろ過される。すなわち、水サンプル中の微生物が、フィルター20によって捕捉される。ろ過後の水サンプルは、内径側空間172からアウトレット16を通って、容器11外へ排出される。

0053

フィルター20による微生物の捕捉を、水サンプルの採取地で行った場合、その後のDNA抽出処理を直ちに行えないことが多い。そのような場合、容器11内に、組織保存試薬を入れ、微生物の組織内に組織保存試薬を浸透させる。また、インレット15にインレットキャップ50を装着するとともに、アウトレット16にアウトレットキャップ60を装着する。これにより、容器11内部が密閉状態となり、内部からの溶液・ビーズ等の流出が防止されるとともに、外部からの異物混入が防止される。この状態で、容器11を、DNA抽出を行う施設(例えば、実験室)に持ち帰る。

0054

DNA抽出を行う際には、組織保存試薬が使用されている場合は組織保存試薬をアウトレット16から排出した後、容器11からキャップ50,60を取り外し、容器11内へ細胞溶解溶液を注入する(ステップS12)。細胞溶解溶液は、例えば、インレット15から注入される。そして、必要に応じて、キャップ50,60を再び容器11へ装着する。

0055

その後、容器11を振とうする(ステップS13)。容器11を振とうすることで、容器11内で、フィルター20によって捕捉された微生物が、容器11内のビーズ30によりビーズ破砕される。振とうは、ボルテックスミキサーなどの機器を用いてもよいし、手動で行ってもよい。

0056

振とう後の容器11内の内容物(ビーズ、細胞溶解溶液、破砕された微生物など)は、マイクロチューブなどの遠沈管40に移され、遠心分離機により遠心分離される。ただし、本実施形態では、効率化のため、内容物のマイクロチューブ40への移行と遠心分離とを並行して行う。すなわち、まず、インレット15からインレットキャップ50を取り外し、振とう後の容器11の嵌合部132Aにマイクロチューブ40を装着する(ステップS14;図4参照)。そして、容器11ごとマイクロチューブ40を遠心分離機にセットする(ステップS15)。このとき、インレット15からマイクロチューブ40の底部40Aに向かう方向が、遠心力が働く方向と一致するように、遠心分離機にセットされる。そして、遠心分離を実行する(ステップS16)。

0057

図4に示すように、遠心力により、容器11内のビーズを含む内容物は、容器11からマイクロチューブ40へ移行する。さらに、遠心力により、ビーズ30などの異物・不要物がマイクロチューブ40の底部40Aに沈降する。遠心後に容器11からマイクロチューブ40を取り外し、上清をマイクロチューブ40から回収することで、DNAとビーズ分離が達成される。

0058

上清として回収されたDNAは、さらに精製され、精製後に、溶出バッファを用いて溶出され、公知の方法によりDNA分析される(ステップS17)。

0059

<2.3 変形例>

0060

<2.3.1 第1変形例>

0061

図5は、第1の変形例に係る装置10を示している。第1の変形例に係る装置10は、ビーズ30の脱落防止部材として、フィルター(第2フィルター)80を備える。フィルター80は、例えば、微生物などの捕捉対象粒子を透過させるが、ビーズ30を透過させない程度の大きさの通過孔を有する網目構造体により構成される。フィルター80は、フィルター20よりもインレット15側の範囲に設けられている。フィルター80は、インレットキャップ50がインレット15に装着されていなくても、ビーズ30が容器11外へ脱落するのを防止することができる。また、フィルター80は、微生物の大きさに比べて十分に大きな通過孔を有しているため、インレット15からの微生物の流入出を疎外しない。

0062

フィルター80が設けられていると、微生物のビーズ破砕後に、容器11から破壊された微生物を含む溶液をインレット15から排出させる際に、ビーズ30は容器11内に残る。したがって、前述のような遠心分離によるビーズ分離の必要がなくなる。

0063

図5に示す装置10は、更に、液体サンプルを容器11へ注入する際に(ステップS11)、液体サンプル中の比較的大きな異物が容器11内へ入るのを防止する第3フィルター構造体90を備える。第3フィルター構造体90は、インレット15に着脱自在に装着される筒状体91と筒状態の内部に設けられた第3フィルター92とを備える。第3フィルター構造体90をインレット15に装着した状態で、液体サンプルを容器11へ注入すると(ステップS11)、比較的大きな異物が容器11内へ入るのを防止できる。液体サンプル注入後は、第3フィルター構造体90を取り外せばよい。第1変形例において、説明を省略した点は、図1及び図2に示す装置10と同様である。

0064

<2.3.2 第2変形例>

0065

図6は第2の変形例に係る装置10を示している。図1に示す装置10では、容器11の内部空間17が、フィルター20によって径方向に2つの空間171,172に区分けされていたのに対して、第2の変形例に係る装置10では、容器11の内部空間17が、インレット15からアウトレットへ向かう方向(円筒状容器11の軸方向)に2つの空間171,172に区分けされている。

0066

すなわち、第2変形例に係る装置10において、円筒状の容器11が、インレット15を備える第1容器部材11Aとアウトレット16を備える第2容器部材11Bとを接続して構成されている。微生物などの粒子を捕捉するフィルター20は、第1容器部材11Aと第2容器部材11Bによって挟み込んで保持されている。フィルター20は、容器11の内部空間17を、インレット15側の第1空間171と、アウトレット16側の第2空間172とに区分けしている。第2変形例に係る装置10においても、ビーズ30は、インレット15側の第1空間171に配置されている。

0067

インレット15から注入された液体サンプルは、第1空間171、フィルター20、第2空間172を通って、アウトレット16から排出される。液体サンプルは、フィルター20によってろ過され、液体サンプル中の微生物は、フィルター20によって捕捉される。捕捉された微生物は、振とうによりビーズ破砕される。

0068

<2.4実験>

0069

図1に示す装置10と類似の構造の装置10を実験に用いた。図7は、実験に用いた装置10を示している。実験に用いた装置10は、液体のろ過に用いられる市販のカートリッジ型ろ過フィルターに、破砕用のジルコニアビーズ投入し、カートリッジのインレット及びアウトレットにキャップを装着することで製作した。
市販のカートリッジ型ろ過フィルターとして、図7(a)に示すφ0.22μm Sterivex(登録商標)フィルターカートリッジ(SVGV010RS, Merck Millipore, Darmstadt, Germany)を用いた。このカートリッジ型ろ過フィルターは、インレット15及びアウトレット16を備える容器11内にフィルター20が設けられた構造を持つ。このカートリッジ型ろ過フィルターは、ポアサイズ0.22μmろ過フィルター(PVDF製)20を備える。

0070

このカートリッジ型ろ過フィルターのインレット15から直径0.5mmのジルコニアビーズ30を投入した。ジルコニアビーズ30として、ニッカトー、ジルコニアボール(型番:YTZ−0.5)を用いた。

0071

カートリッジ型ろ過フィルターのインレット15には、インレット15への装着に適したサイズの閉鎖用プラグをインレットキャップ50として装着した。同様に、アウトレット16には、アウトレット16への装着に適したサイズの閉鎖用プラグをアウトレットキャップ60として装着した(inlet cap = Luer FittingVRMP6; outlet cap = Luer FittingVRSP6, AsOne, Osaka, Japan)。

0072

図10(b)は、カートリッジ型ろ過フィルター内に、ビーズ30が投入され、インレット15及びアウトレット16にキャップ50,60が装着されて構成された装置10を示している。図10(c)は、図10(b)の拡大写真であり、投入されたビーズ30を示している。

0073

なお、実験に用いた装置10における容器11は、マイクロチューブ40を嵌合させるための構造は有していない。

0074

水サンプルを、川サイト及び湖サイトにて採取した。川サイトは、日本国滋賀県の天神川(35° 4’ 19’’ N, 135° 55’ 59’’ E)であり、湖サイトは同じく滋賀県の琵琶湖(34° 55’ 45’’ N, 135° 56’ 41’’ E)である。

0075

実験では、DNA抽出を3つの試験方法にて行った。第1の試験方法(実施例)では、図7(b)に示すビーズ入りのカートリッジ型ろ過フィルターを用いて微生物を捕捉する。第2の試験方法(比較例)では、図7(a)に示すビーズなしのカートリッジ型ろ過フィルターを用いて微生物を捕捉する。第3の試験方法(比較例)では、図7(a)に示すビーズなしのカートリッジ型ろ過フィルターを用いて微生物を捕捉した後、容器11であるカートリッジを破壊し、内部のろ過フィルター20を取り出し、Power Soil(登録商標) DNA isolation kit(QIAGEN)を用いてDNAを抽出する。

0076

第1の試験方法では、採取した水サンプルを、採取地にて、ビーズ入りのカートリッジ型ろ過フィルターに注入し、ろ過によって微生物をフィルター20に捕捉させた。ろ過後、2mlの組織保存試薬(RNAlater solution, ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA)を容器へ入れ、4°Cに維持しつつ、実験室へ持ち帰った。

0077

第2の試験方法及び第3の試験方法でも、ろ過に用いるのがビーズなしのカートリッジ型ろ過フィルターである以外は、採取地での作業は、第1の試験方法と同様に行った。

0078

第1の試験方法及び第2の試験方法では、DNA抽出に、DNeasy(登録商標) Blood and Tissue Kit(QIAGEN)を用いた。第3の試験方法では、DNA抽出に、Power Soil(登録商標) DNA isolation kit(QIAGEN)を用いた。いずれの試験方法でも、まず、実験室に持ち帰ったカートリッジ型ろ過フィルターから、組織保存試薬を吸引により除去し、洗浄水により洗浄した。

0079

第2の試験方法では、非特許文献1に記載されているのと同様の方法で、DNAを抽出する。すなわち、細胞融解溶液などの溶液をカートリッジ内部に入れ、DNAを抽出する。一方、第1の試験方法では、細胞溶解液などの溶液をカートリッジ内部に入れた後、ビーズ入りのカートリッジ型ろ過フィルターをボルテックスミキサーにて激しく振とうする(180sec 3200rpm)。この振とうにより、フィルター20にて捕捉された微生物が破砕され、DNAが効率的に抽出される。

0080

第1の試験方法及び第2の試験方法では、DNA抽出の後、カートリッジ型ろ過フィルターの内容物がインレット15からマイクロチューブに移される。第1の試験方法では、マイクロチューブに移される内容物はビーズを含む。マイクロチューブは、遠心分離機にセットされ、遠心分離される。遠心分離後、上清をマイクロチューブ40から回収する。その際に、第1の試験方法では、ビーズが分離される。回収されたDNAは、DNeasy(登録商標) Blood and Tissue Kit(QIAGEN)の添付文書に記載されたプロトコールに従って、精製・溶出される。

0081

第3の試験方法では、組織保存試薬の除去・洗浄後、容器11であるカートリッジを破壊し、微生物が捕捉されている内部のフィルター20を取り出した。膜状のフィルター20を、切断により細片化した。細片化したフィルター20からPowerSoil(登録商標) DNA Isolation Kitを用いてDNAを抽出した。DNA抽出は、PowerSoil(登録商標) DNA Isolation Kitの添付文書に記載されたプロトコールに従って行った。PowerSoil(登録商標) DNA Isolation KitによるDNA抽出工程には、微小ビーズによって、フィルター20上の微生物を破砕する工程を含んでいる。この第3の試験方法では、カートリッジの破壊が必要となり煩雑である。しかも、カートリッジの破壊によりフィルターが外気に直接晒され、他の微生物等が混入するコンタミネーションのリスクが増大する。

0082

各試験方法で抽出されたDNAを、PCRを用いてDNA分析した。図8は、その結果を示す。図8において、「Beads」は第1の試験方法を示し、「No Beads」は第2の試験方法を示し、「PowerSoil」は、第3の試験方法を示す。また、図8において、「lake」は、湖サイトで採取した水サンプルの分析結果を示し、「river」は川サイトで採取した水サンプルの分析結果を示す。図8の分析結果は、試験方法特異的に検出された微生物の門(phylum)ごとのDNA量を示す。すなわち、それぞれのパネルは各試験方法を用いたときにしか検出されなかった(他の方法では検出できなかった)微生物の門を示している。

0083

図8に示すように、第1の試験方法(「Beads」:実施例)では、第2の試験方法(「No Beads」:比較例)及び第3の試験方法(「PowerSoil」:比較例)に比べて、検出可能な微生物の種類が増加した。また、いくつかの微生物種は、第1の試験方法でのみ検出され、他の試験方法では検出されなかった。例えば、Bacteroidetes門及びCyanobacteria門に属するいくつかの微生物は、第1の試験方法でのみ検出された。また、DNAの抽出量や微生物の総検出種数も第1の試験方法で増大した。これらは、ビーズ破砕による効果であると考えることができる。したがって、第1試験方法は、微生物DNAの効率的抽出に非常に有用である。

0084

<3.付記>
本発明は、上記実施形態に限定されるものではなく、様々な変形が可能である。

0085

10 :微生物DNA抽出装置
11 :容器
11A :第1容器部材
11B :第2容器部材
13 :容器本体
15 :インレット
16 :アウトレット
17 :内部空間
19 :コア部
20 :フィルター
30 :ビーズ
40 :遠沈管
40A :底部
50 :インレットキャップ(第1部材)
60 :アウトレットキャップ(第2部材)
80 :フィルター
90 :第3フィルター構造体
91 :筒状体
92 :第3フィルター
131 :円筒部
132 :端面部
132 :端面
132A :嵌合部
133 :端面部
151 :開口
161 :開口
171 :第1空間
172 :第2空間
191 :円筒部
192 :通気口フィルター
193 :貫通孔

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