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技術 医薬品組成物及び化粧品組成物

出願人 田邊剛士アイピース,インコーポレイテッド
発明者 田邊剛士伊達朗須藤健太
出願日 2019年12月19日 (11ヶ月経過) 出願番号 2019-229254
公開日 2020年3月19日 (8ヶ月経過) 公開番号 2020-040996
状態 未査定
技術分野 化粧料 化合物または医薬の治療活性 動物,微生物物質含有医薬
主要キーワード ラムナン硫酸 剥離溶液 眼瞼下垂症 ダイユータンガム 擦過創 毛組織 合成成分 ゲル培地
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (10)

課題

iPS細胞等の幹細胞培地を有効活用した医薬品組成物を提供する。

解決手段

幹細胞を未分化状態維持培養した培地の上清を含む、医薬品組成物が提供される。医薬品組成物において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。

概要

背景

胚性幹細胞ES細胞)は、ヒトやマウス初期胚から樹立された幹細胞である。ES細胞は、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を有する。現在、ヒトES細胞は、パーキンソン病若年性糖尿病、及び白血病等、多くの疾患に対する細胞移植療法利用可能である。しかし、ES細胞の移植には障害もある。特に、ES細胞の移植は、不成功臓器移植に続いて起こる拒絶反応と同様の免疫拒絶反応惹起しうる。また、ヒト破壊して樹立されるES細胞の利用に対しては、倫理的見地から批判や反対意見が多い。

このような背景の状況の下、京都大学の山中伸弥教授は、4種の遺伝子:Oct3/4、Klf4、c−Myc、及びSox2を体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞iPS細胞)を樹立することに成功した。これにより、山中教授は、2012年のノーベル生理学医学賞を受賞した(例えば、特許文献1参照。)。iPS細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞である。したがって、iPS細胞は、細胞移植療法への利用が期待されている。一方、iPS細胞の培養に用いた培地を、医薬品組成物に再利用したとの報告がある(例えば、特許文献2参照。)。

概要

iPS細胞等の幹細胞の培地を有効活用した医薬品組成物を提供する。 幹細胞を未分化状態維持培養した培地の上清を含む、医薬品組成物が提供される。医薬品組成物において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。なし

目的

本発明は、iPS細胞等の幹細胞の培地を有効活用した医薬品組成物及び化粧品組成物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

幹細胞未分化状態維持培養した培地上清を含む、医薬品組成物又は医薬品組成物原料

請求項2

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項1に記載の医薬品組成物又は医薬品組成物原料。

請求項3

請求項1又は2に記載の医薬品組成物又は医薬品組成物原料を含む、皮膚のシミしわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤

請求項4

幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、化粧品組成物又は化粧品組成物原料。

請求項5

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項4に記載の化粧品組成物又は化粧品組成物原料。

請求項6

請求項4又は5に記載の化粧品組成物又は化粧品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤。

請求項7

幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、コラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料。

請求項8

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項7に記載のコラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料。

請求項9

幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、ヒアルロン酸産生促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤原料。

請求項10

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項9に記載のヒアルロン酸産生促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤原料。

請求項11

幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、創傷治療剤又は創傷治療剤原料。

請求項12

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項11に記載の創傷治療剤又は創傷治療剤原料。

請求項13

幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料。

請求項14

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項13に記載の表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料。

請求項15

幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、発毛剤又は発毛剤原料。

請求項16

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項15に記載の発毛剤又は発毛剤原料。

請求項17

幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、育毛剤又は育毛剤原料。

請求項18

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項17に記載の育毛剤又は育毛剤原料。

請求項19

幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、毛乳頭細胞活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料。

請求項20

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項19に記載の毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料。

請求項21

幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤又は線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤原料。

請求項22

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項21に記載の線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤又は線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤原料。

請求項23

幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、血管内皮細胞増殖因子産生促進剤又は血管内皮細胞増殖因子産生促進剤原料。

請求項24

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項23に記載の血管内皮細胞増殖因子産生促進剤又は血管内皮細胞増殖因子産生促進剤原料。

請求項25

幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、細胞ストレスから保護する細胞保護剤又は細胞保護剤原料。

請求項26

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項25に記載の細胞保護剤又は細胞保護剤原料。

請求項27

幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、ストレスを受けた細胞の生存率を向上させるにする細胞生存率向上剤又は細胞生存率向上剤原料。

請求項28

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項27に記載の細胞生存率向上剤又は細胞生存率向上剤原料。

請求項29

幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、核酸タンパク質タンパク質複合体リポタンパク質リボソーム、及び生体膜からなる群から選択される少なくとも1つの生体物質をストレスから保護する生体物質保護剤又は生体物質保護剤原料。

請求項30

前記幹細胞が、多能性幹細胞である、請求項29に記載の生体物質保護剤又は生体物質保護剤原料。

技術分野

0001

本発明は、医薬品組成物及び化粧品組成物に関する。

背景技術

0002

胚性幹細胞ES細胞)は、ヒトやマウス初期胚から樹立された幹細胞である。ES細胞は、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を有する。現在、ヒトES細胞は、パーキンソン病若年性糖尿病、及び白血病等、多くの疾患に対する細胞移植療法利用可能である。しかし、ES細胞の移植には障害もある。特に、ES細胞の移植は、不成功臓器移植に続いて起こる拒絶反応と同様の免疫拒絶反応惹起しうる。また、ヒト破壊して樹立されるES細胞の利用に対しては、倫理的見地から批判や反対意見が多い。

0003

このような背景の状況の下、京都大学の山中伸弥教授は、4種の遺伝子:Oct3/4、Klf4、c−Myc、及びSox2を体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞iPS細胞)を樹立することに成功した。これにより、山中教授は、2012年のノーベル生理学医学賞を受賞した(例えば、特許文献1参照。)。iPS細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞である。したがって、iPS細胞は、細胞移植療法への利用が期待されている。一方、iPS細胞の培養に用いた培地を、医薬品組成物に再利用したとの報告がある(例えば、特許文献2参照。)。

先行技術

0004

特許第4183742号公報
特開2016−128396号公報

発明が解決しようとする課題

0005

しかし、本発明者らが検証したところ、特許文献2に記載の培養方法では、iPS細胞は分化してしまうため、実際にはiPS細胞ではなく分化した細胞を培養した培地が再利用されているものと考えられる。本発明は、iPS細胞等の幹細胞の培地を有効活用した医薬品組成物及び化粧品組成物を提供することを目的の一つとする。

課題を解決するための手段

0006

本発明者らは、鋭意研究の末、幹細胞を未分化状態維持培養した培地の上清が、医薬品あるいは化粧品の有効成分になることを見出した。

0007

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、医薬品組成物又は医薬品組成物原料が提供される。換言すれば、医薬品組成物又は医薬品組成物原料に用いられるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。医薬品組成物又は医薬品組成物原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、iPS細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ES細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。

0008

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む医薬品組成物を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物あるいは植物であってもよい。

0009

本発明の態様によれば、上記の医薬品組成物を含む、皮膚のシミしわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤が提供される。また、本発明の態様によれば、上記の医薬品組成物を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。

0010

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、化粧品組成物又は化粧品組成物原料が提供される。換言すれば、化粧品又は化粧品組成物原料に用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。化粧品組成物又は化粧品組成物原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、iPS細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ES細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。

0011

本発明の態様によれば、上記の化粧品組成物を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤が提供される。また、本発明の態様によれば、上記の化粧品組成物を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。

0012

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、コラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料が提供される。換言すれば、コラーゲン産生の促進に用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。コラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、iPS細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ES細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。

0013

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含むコラーゲン産生促進剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。

0014

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、ヒアルロン酸産生促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤原料が提供される。換言すれば、ヒアルロン酸産生の促進に用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。ヒアルロン酸産生促進剤又はヒアルロン酸産生促進剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、iPS細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ES細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。

0015

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含むヒアルロン酸産生促進剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。

0016

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、創傷治療剤又は創傷治療剤原料が提供される。換言すれば、創傷治療に用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。創傷治療剤又は創傷治療剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、iPS細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ES細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。

0017

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む創傷治療剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。

0018

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料が提供される。換言すれば、表皮細胞の増殖の促進に用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、iPS細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ES細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。

0019

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む表皮細胞増殖促進剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。

0020

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、発毛剤又は発毛剤原料が提供される。換言すれば、発毛に用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。発毛剤又は発毛剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、iPS細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ES細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。

0021

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む発毛剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。

0022

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、毛乳頭細胞活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料が提供される。換言すれば、毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料として用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、iPS細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ES細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。

0023

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む毛乳頭細胞を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。

0024

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、線維芽細胞成長因子(FGF)ファミリー産生促進剤又はFGFファミリー産生促進剤原料が提供される。換言すれば、FGFファミリーの産生の促進に用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。FGFファミリーの例としては、FGF−2及びFGF−7である。FGFファミリー産生促進剤又はFGFファミリー産生促進剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、iPS細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ES細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。

0025

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含むFGF産生促進剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。

0026

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、血管内皮細胞増殖因子VEGF)産生促進剤又はVEGF産生促進剤原料が提供される。換言すれば、VEGFの産生の促進に用いるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。VEGF産生促進剤又はVEGF産生促進剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、iPS細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ES細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。

0027

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含むVEGF産生促進剤を対象に投与又は塗布することを含む、治療方法が提供される。対象が、ヒト又は非ヒト動物であってもよい。

0028

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、細胞をストレスから保護する細胞保護剤又は細胞保護剤原料が提供される。換言すれば、細胞をストレスから保護するための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。細胞保護剤又は細胞保護剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、iPS細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ES細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。

0029

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、ストレスを受けた細胞の生存率を向上させる細胞生存率向上剤又は細胞生存率向上剤原料が提供される。換言すれば、ストレスを受けた細胞の生存率を向上させるための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。細胞生存率向上剤又は細胞生存率向上剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、iPS細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ES細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。

0030

本発明の態様によれば、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、核酸タンパク質タンパク質複合体リポタンパク質リボソーム、及び生体膜からなる群から選択される少なくとも1つの生体物質をストレスから保護する生体物質保護剤又は生体物質保護剤原料が提供される。換言すれば、核酸、タンパク質、タンパク質複合体、リポタンパク質、リボソーム、及び生体膜からなる群から選択される少なくとも1つの生体物質をストレスから保護するための、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清が提供される。生体物質保護剤又は生体物質保護剤原料において、幹細胞が、多能性幹細胞であってもよい。多能性幹細胞は、iPS細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ES細胞であってもよい。培地がゲル培地であってもよい。培地がジェランガムを含んでいてもよい。

発明の効果

0031

本発明によれば、幹細胞の培地を有効活用した医薬品組成物及び化粧品組成物を提供可能である。

図面の簡単な説明

0032

実施例4に係る線維芽細胞増殖性試験の結果を示すグラフである。
実施例4に係る線維芽細胞の増殖性試験の結果を示すグラフである。
実施例5に係る線維芽細胞によるコラーゲン産生試験の結果を示すグラフである。
実施例5に係る線維芽細胞によるコラーゲン産生試験の結果を示すグラフである。
実施例5に係る線維芽細胞によるヒアルロン酸産生試験の結果を示すグラフである。
実施例6に係る表皮細胞の遊走能試験の結果を示す写真である。
実施例6に係る表皮細胞の遊走能試験の結果を示すグラフである。
実施例7に係る毛乳頭細胞の増殖性試験の結果を示すグラフである。
実施例8に係る毛乳頭細胞によるFGF−7産生試験の結果を示すグラフである。
実施例8に係る毛乳頭細胞によるVEGF産生試験の結果を示すグラフである。

0033

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。

0034

実施形態に係る医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む。幹細胞は、例えば、人工多能性(iPS)細胞、及び胚性幹細胞(ES細胞)等の多能性幹細胞である。幹細胞は、接着培養されてもよいし、浮遊培養されてもよい。

0035

幹細胞用培地としては、例えば、TeSR2(STEMCELLTechnologies)等のヒトES/iPS培地を使用可能である。ただし、幹細胞用培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばPrimate ES Cell Medium、Reprostem、ReproFF、ReproFF2、ReproXF(Reprocell)、mTeSR1、TeSRE8、ReproTeSR(STEMCELL Technologies)、PluriSTEM(登録商標)Human ES/iPS Medium(Merck)、NutriStem (登録商標)XF/FF Culture Medium for Human iPS and ES Cells、Pluriton reprogramming medium(Stemgent)、PluriSTEM(登録商標)、Stemfit AK02N、Stemfit AK03(Ajinomoto)、ESC−Sure(登録商標)serum and feeder free medium for hESC/iPS(Applied StemCell)、L7(登録商標)hPSC Culture System (LONZA)、及びPrimate ES Cell Medium (ReproCELL)等を利用してもよい。

0036

あるいは、幹細胞用培地としては、代替血清、L−グルタミン非必須アミノ酸溶液2−メルカプトエタノール、及びペニシリンストレプトマイシンを添加されたダルベッコ改変イーグル培地ハムF−12(DMEM/F12)であってもよい。幹細胞用培地は、basicfibroblast growth factor(bFGF)等の成長因子を含んでいてもよい。

0037

幹細胞が浮遊培養される場合、ゲル培地が用いられる。ゲル培地は、例えば、幹細胞用培地に脱アシル化ジェランガム等のジェランガムを終濃度が0.5重量%から0.001重量%、0.1重量%から0.005重量%、あるいは0.05重量%から0.01重量%となるよう添加することにより調製される。なお、本開示においては、ジェランガムとは、脱アシル化ジェランガムを含むものとする。

0038

ゲル培地は、ヒアルロン酸ラムザンガムダイユータンガムキサンタンガムカラギーナンフコイダンペクチンペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸ヘパリンヘパリチン硫酸ケラト硫酸コンドロイチン硫酸デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも1種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロース、並びにリゾホスファチジン酸及びスフィンゴシン−1−リン酸等の脂質を含んでいてもよい。これらの物質を含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。

0039

あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA)、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。

0040

ゲル培地には、例えば、ROCK阻害剤を終濃度が1000μmol/L以上0.1μmol/L以下、100μmol/L以上1μmol/L以下、あるいは5μmol/L以上20μmol/L以下となるよう、添加してもよい。ROCK阻害剤をゲル培地に添加することにより、幹細胞によるコロニー形成が促進される。

0041

ゲル培地は、例えば、bFGF等の成長因子を含まなくともよい。あるいは、ゲル培地は、bFGF等の成長因子を、400μg/L以下、100μg/L以下、40μg/L以下、あるいは10μg/L以下の低濃度で含んでいてもよい。

0042

また、ゲル培地は、TGF−βを含まないか、TGF−βを600ng/L以下、300ng/L以下、あるいは100ng/L以下の低濃度で含んでいてもよい。

0043

例えば、幹細胞は、浮遊培養される前に、シングルセルに分解され、シングルセルに分解された幹細胞が、ゲル培地に入れられる。ゲル培地は、撹拌されない。シングルセルは、クローナリティ及び未分化の状態を保ったまま増殖し、ゲル培地中コロニーを形成する。幹細胞が未分化の状態を保っているか否かは、細胞が未分化マーカー発現しているか否かを検査することにより、確認することが可能である。

0044

幹細胞を維持培養する際の温度は、例えば37℃である。幹細胞を維持培養する際の二酸化炭素の濃度は、例えば5%である。幹細胞を維持培養する期間は、例えば、1日以上90日以下、2日以上60日以下、5日以上30日以下、あるいは7日以上21日以下である。幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清は、ろ過及び遠心等により、幹細胞を除去されていてもよい。

0045

実施形態に係る医薬品組成物は、皮膚塗布組成物であってもよい。実施形態に係る医薬品組成物は、皮膚疾患治療剤であってもよい。実施形態に係る皮膚疾患治療剤で治療可能な疾患の例としては、尋常性ざ瘡性乾癬ケロイド脂漏性皮膚炎接触皮膚炎アトピー性皮膚炎アトピー性乾燥皮膚炎、皮膚粗鬆症(dermatoporosis)、光線性弾性線維症、日光性角化症眼瞼下垂症円形脱毛症頭髪脱毛症睫毛貧毛症肝斑老人性色素班、汗疹そばかす遅発性両側性太田母班、脂漏性角化症早老症による皮膚疾患、及び単純疱疹等が挙げられる。

0046

実施形態に係る化粧品組成物で改善又は解消可能な状態の例としては、しみ、そばかす、しわ、たるみ、きしみ、肌のはりの低下、くすみ、敏感肌乾燥肌、及び薄毛等が挙げられる。が挙げられる。実施形態に係る化粧品組成物の効果としては、肌を整える、肌のキメを整える、皮膚をすこやかに保つ、肌荒れを防ぐ、肌をひきしめる、皮膚にうるおいを与える、皮膚の水分及び油分を補い保つ、皮膚の柔軟性を保つ、皮膚を保護する、皮膚の乾燥を防ぐ、肌を柔らげる、肌にはりを与える、肌にツヤを与える、肌を滑らかにする、しみを目立たなくさせる、しわを抑制する及び肌を明るくする等が挙げられる。さらに、実施形態に係る化粧品組成物の頭皮あるいは毛髪に関する効果としては、頭皮を健やかに保つ、育毛、薄毛の予防、かゆみの予防、脱毛の予防、毛生促進、発毛促進、病後又産後の脱毛の予防、及び養毛等が挙げられる。

0047

実施形態に係る医薬品組成物は、創傷治療剤、表皮細胞増殖促進剤、表皮ターンオーバー促進剤、発毛剤、育毛剤、及び睫毛貧毛症治療薬であってもよい。実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、発毛剤、線維芽細胞成長因子(FGF)ファミリー産生促進剤、及び血管内皮細胞増殖因子(VEGF)産生促進剤であってもよい。

0048

毛髪の成長においては毛根毛母細胞分裂し、そこから生じた細胞が毛髪を構成していく。一方、毛髪の成長には毛周期と呼ばれる周期があり、成長期退行期、及び休止期を繰り返す。毛乳頭細胞は増殖因子の産生と放出を通じて、毛包上皮幹細胞の増殖及び分化に影響を及ぼし、毛周期を制御している。毛乳頭細胞や毛母細胞の活性化が毛成長メカニズムに寄与するといわれている。また、毛周期に応じて毛包では活発に血管のリモデリングが行われるが、このときの血管新生に問題があると、毛髪形成のための栄養や酸素の供給が不十分になる。毛包血管網からの血流不足男性型脱毛症(AGA)の病態関与するといわれている。

0049

毛乳頭細胞の遺伝子と発毛及び毛成長については、以下のようなことが知られている。すなわち、乳頭細胞が毛母細胞に対して分泌する増殖因子としては、FGF−7及びIGF−1等が知られている。これら遺伝子には毛包成長を維持する作用がある。血管内皮成長因子(VEGF)は毛乳頭細胞より分泌されて毛包血管の増生に関わり、またオートクラインに毛乳頭細胞を増殖させる効果があるが、成長期から退行期へ移行するにしたがい、発現量は減少する。VEGF遺伝子はAGA(男性型脱毛症)の毛組織で発現が低下している。VEGFBはVEGFが作用する受容体であるVEGFR−1に競合して結合する。VEGFBは血管内皮細胞の増殖や透過性亢進活性を持つが、毛包での効果は不明である。

0050

実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、毛乳頭直接作用し、発毛促進因子であるFGF−7の産生量を高めて発毛を促進することで毛周期の成長期を長くさせ、細く弱い毛から太くて強い毛に育てる効果、血管内皮成長因子(VEGF)を高め、毛乳頭細胞より分泌されて毛包血管の増生に関わり、またオートクラインに毛乳頭細胞を増殖させる効果がある。

0051

実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物が育毛剤又は発毛剤として用いられる場合、ミノキシジルセンブリパントテニルエチルエーテルトコフェロール酢酸エステルグリチルリチン酸二カリウム、及びアデノシン等の他の有効成分を含んでいてもよい。

0052

実施形態に係る創傷治療剤で治療可能な創傷の例としては、熱傷擦過創裂傷挫傷縫合創、褥瘡、及び皮膚欠損創等が挙げられる。

0053

実施形態に係る医薬品組成物又は化粧品組成物は、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、細胞をストレスから保護する細胞保護剤であってもよい。また、実施形態に係る医薬品組成物又は化粧品組成物は、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、ストレスを受けた細胞を安定化し、例えば生存率を向上させる細胞生存率向上剤であってもよい。ストレスを受けた細胞は、例えば線維芽細胞、表皮細胞、及び毛乳頭細胞であるが、これらの細胞に限定されず、いかなる細胞でもよい。あるいは、実施形態に係る医薬品組成物又は化粧品組成物は、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を含む、核酸、タンパク質、タンパク質複合体、リポタンパク質、リボソーム、及び生体膜からなる群から選択される少なくとも1つの生体物質をストレスから保護する生体物質保護剤であってもよい。ここで、生体膜は、細胞膜を含む。

0054

実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、幹細胞を未分化状態で維持培養した培地の上清を有効量含む。ここで、有効量とは、医薬品組成物あるいは化粧品組成物として効用を発揮可能な量をいう。有効量は、患者年齢、対象疾患、他の成功成分の有無、及び他の配合物の量に応じて、適宜設定される。

0055

実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、製剤上許容される担体賦形剤崩壊剤緩衝剤乳化剤懸濁剤無痛化剤、安定剤、保存剤防腐剤、及び生理食塩水等を含んでいてもよい。賦形剤の例としては、乳糖デンプンソルビトール、D−マンニトール、及び白糖が挙げられる。崩壊剤の例としては、カルボキシメチルセルロース、及び炭酸カルシウムが挙げられる。緩衝剤の例としては、リン酸塩クエン酸塩、及び酢酸塩が挙げられる。乳化剤の例としては、アラビアゴムアルギン酸ナトリウム、及びトラガントが挙げられる。

0056

懸濁剤の例としては、モノステアリン酸グリセリンモノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。無痛化剤の例としては、ベンジルアルコールクロロブタノール、及びソルビトールが挙げられる。安定剤の例としては、プロピレングリコール、及びアスコルビン酸が挙げられる。保存剤の例としては、フェノール塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びメチルパラベンが挙げられる。防腐剤の例としては、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、及びクロロブタノールが挙げられる。

0057

また、実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物には、水、アルコール界面活性剤カチオンアニオンノニオン、及び両性界面活性剤等)、保湿剤グリセリン、1,3-ブチレングリコール、プロピレングリコール、プロパンジオールペンタンジオールポリクオタニウムアミノ酸尿素ピロリドンカルボン酸塩核酸類単糖類、及び少糖等、並びにそれらの誘導体等)、増粘剤多糖類ポリアクリル酸塩カルボキシビニルポリマーポリビニルピロリドンポリビニルアルコールキチンキトサンアルギン酸、カラギーナン、キサンタンガム、及びメチルセルロース等、並びにそれらの誘導体等)、ワックスワセリン炭化水素飽和脂肪酸不飽和脂肪酸、及びシリコン油等、並びにそれらの誘導体、トリカプリルカプリン酸グリセリル、及びトリオタン酸グリセリル等のトリグリセライド類、ステアリン酸イソプロピル等のエステル油類、天然油脂類オリブ油椿油アボガド油アーモンド油、カカオ脂月見草油ブドウ種子油マカデミアンナッツ油、ユーカリ油ローズヒップ油スクワラン、オレンジラフィー油、ラノリン、及びセラミド等)、防腐剤(オキシ安息香酸誘導体、デヒドロ酢酸塩、感光素、ソルビン酸、及びフェノキシエタノール等、並びにそれらの誘導体等)、殺菌剤イオウ、トリクロカルバアニリドサリチル酸ジンクピリチオン、及びヒノキチオール等、並びにそれらの誘導体等)、紫外線吸収剤パラアミノ安息香酸、及びメトキシケイ皮酸等、並びにそれらの誘導体等)、抗炎症剤アラントインビサボロール、ε−アミノカプロン酸アセチルファシルシスティン、及びグリチルリチン酸等、並びにそれらの誘導体等)、抗酸化剤トコフェロール、BHA、BHT、及びアスタキサンチン等、並びにそれらの誘導体等)、キレート剤エデト酸、及びヒドロキシエタンジホスホン酸等、並びにそれらの誘導体等)、動植物エキスアシタバアロエエイジツオウゴンオウバク海藻カリンカミツレ甘草キウイキュウリクワシラカバトウキニンニク、ボタン、ホップマロニエラベンダーローズマリーユーカリミルク、各種ペプタイドプラセンタローヤルゼリーユーグレナエキス加水分解ユーグレナエキス、及びユーグレナ油等、並びにこれらの含有成分精製物又は発酵物等)、pH調整剤無機酸、無機酸塩有機酸、及び有機酸塩等、並びにそれらの誘導体等)、ビタミン類ビタミンA類ビタミンB類ビタミンCビタミンD類ユビキノン、及びニコチン酸アミド等、並びにそれらの誘導体等)、酵母麹菌及び乳酸菌発酵液ガラクトミセス培養液美白剤トラネキサム酸、トラネキサム酸セチル塩酸塩、4−n−ブチルレゾルシノールアルブチンコウジ酸エラグ酸カンゾウフラボノイドナイアシンアミド、及びビタミンC誘導体等)、セラミド・セラミド誘導体抗シワ剤レチノール、及びレチナール、並びにそれらの誘導体、ニコチン酸アミド、及びオリゴぺプチド等、並びにそれらの誘導体等、好中球エラスターゼ阻害、並びにMMP−1及びMMP−2阻害作用のある天然及び合成成分等)、酸化チタンタルクマイカシリカ酸化亜鉛酸化鉄シリコン、及びこれらを加工処理した粉体類等を、実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物の目的を達成する範囲内で配合することができる。

0058

なお、実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物に添加可能な成分は、上記に限られるものではなく、医薬品組成物及び化粧品組成物に用い得る成分であれば自由に選択が可能である。実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物をハップ剤として用いる場合、上記成分に加えて、基剤カオリン、及びベントナイト等)、ゲル化剤(ポリアクリル酸塩、及びポリビニルアルコール等)を目的を達成する範囲内で配合することができる。実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物を入浴剤として用いる場合、硫酸塩、炭酸水素塩ホウ酸塩、色素、及び保湿剤を目的を達成する範囲内で適宜配合し、パウダータイプ、液剤タイプに調製してもよい。

0059

実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、当該技術分野において周知慣用されている方法によって製造可能である。

0060

(実施例1:幹細胞を維持培養した培地の上清の調製)
5mLのL−グルタミン(25030−081、Invitrogen)、5mLの非必須アミノ酸溶液(11140−050、Invitrogen)、1mLの2−メルカプトエタノール(21985−023、Invitrogen)、2.5mLのペニシリン/ストレプトマイシン(15140−122、Invitrogen)にDMEM/F12(10565−018、Invitrogen)、及び代替血清(KSR:KnockOut Serum Replacement、登録商標、10828028、Invitrogen)を加えて、全量が500mLの培地を作製した。当該培地に、0.2mLの10μg/mL bFGF(basicfibroblast growth factor、R and D)を添加し、幹細胞用培地とした。幹細胞用培地におけるbFGFの濃度は、4ng/mLであった。

0061

上記のように作製した幹細胞用培地を用いて、接着培養用シャーレ上のフィーダー細胞上で、ヒトiPS細胞接着維持培養した。ヒトiPS細胞は、1週間ごとに継代した。継代の際には、ヒトiPS細胞を、0.25%トリプシン、0.1mg/mLのコラゲナーゼIV、1mmol/LのCaCl2、及び20%のKSRを含む剥離溶液で処理した。

0062

上記の通り維持培養されたヒトiPS細胞を、ES細胞解離液(TrypLESelect、登録商標、ThermoFisher)を用いて、接着培養用シャーレから剥がした。剥がしたヒトiPS細胞を、ラミニン(ニッピ)でコートしたディッシュ上に播種した。その後、10μmol/LのROCK阻害剤を添加したTeSR2培地(Stem cell)を用いて、ヒトiPS細胞を1週間培養した。培地交換は、毎日行った。

0063

その後、培地を幹細胞用培地に置換し、二日後に幹細胞用培地の上清を回収した。回収した幹細胞用培地の上清を1500回転で5分遠心し、培地の上清を再度回収した後に3000回転で3分遠心し、遠心後の幹細胞用培地の上清を0.22μmのフィルターでろ過した。ろ過後の幹細胞用培地の上清を、実施例1に係る上清溶液とした。

0064

また、維持培養されたiPS細胞は、未分化マーカーであるNANOG、OCT3/4、及びTRA 1−60が陽性であることを確認した。

0065

(実施例2:幹細胞を維持培養した培地の上清の調製)
実施例1と同様にヒトiPS細胞を維持培養した。その後、実施例1と同様に、ヒトiPS細胞を接着培養用シャーレから剥がし、シングルセルまで分割した。次に、ジェランガム及び10μmol/LのROCK阻害剤(Selleck)を添加してゲル化した幹細胞用培地にヒトiPS細胞を播種し、ヒトiPS細胞を21日間浮遊培養した。その間、二日に一度、ゲル化した幹細胞用培地を培養器に補充した。

0066

その後、ヒトiPS細胞が懸濁しているゲル化幹細胞用培地をメッシュフィルターでろ過し、細胞塊を除去した。さらに、ろ過されたゲル化幹細胞用培地を1500回転で5分遠心して細胞及びゲルを沈殿させ、遠心後の幹細胞用培地の上清を再度回収した後に3000回転で3分遠心し、遠心後の幹細胞用培地の上清を0.22μmのフィルターでろ過した。ろ過後の幹細胞用培地の上清を、実施例2に係る上清溶液とした。

0067

また、維持培養されたiPS細胞は、未分化マーカーであるNANOG、OCT3/4、及びTRA 1−60が陽性であることを確認した。

0068

(実施例3:幹細胞を維持培養した培地の上清の調製)
実施例1と同様にヒトiPS細胞を維持培養した。その後、実施例1と同様に、ヒトiPS細胞を接着培養用シャーレから剥がし、シングルセルまで分割した。次に、ジェランガム、及び100μmol/LのROCK阻害剤(Selleck)を添加してゲル化した幹細胞用培地にヒトiPS細胞を播種し、ヒトiPS細胞を14日間浮遊培養した。その間、二日に一度、ゲル化した幹細胞用培地を培養器に補充した。

0069

その後、ヒトiPS細胞が懸濁しているゲル化幹細胞用培地をメッシュフィルターでろ過し、細胞塊を除去した。さらに、ろ過されたゲル化幹細胞用培地を1500回転で遠心して細胞及びゲルを沈殿させ、遠心後の幹細胞用培地の上清を再度回収した後に3000回転で3分遠心し、遠心後の幹細胞用培地の上清を0.22μmのフィルターでろ過した。ろ過後の幹細胞用培地の上清を、実施例3に係る上清溶液とした。

0070

また、維持培養されたiPS細胞は、未分化マーカーであるNANOG、OCT3/4、及びTRA 1−60が陽性であることを確認した。

0071

(比較例:分化した細胞を培養した培地の上清の調製)
特開2016−128396号公報に記載の実施例に準じてヒトiPS細胞を培養した。すなわち、実施例1と同じ幹細胞用培地を用いて、接着培養用シャーレ上のフィーダー細胞上で、ヒトiPS細胞を接着維持培養した。ヒトiPS細胞は、1週間ごとに継代した。継代の際には、ヒトiPS細胞を、0.25%トリプシン、0.1mg/mLのコラゲナーゼIV、1mmol/LのCaCl2、及び20%のKSRを含む剥離溶液で処理した。

0072

上記の通り培養されたヒトiPS細胞を、ES細胞解離液(TrypLESelect、登録商標、ThermoFisher)を用いて、接着培養用シャーレから剥がした。剥がしたヒトiPS細胞を、非接着培養用シャーレに入れたゲル化していないヒトiPS細胞中で1週間浮遊培養した。この結果、胚様体(EB)が形成された。形成された胚様体を接着培養用シャーレ上に播種し、10%FBSを含有するDMEM中で1週間成長(outgrowth)させた。

0073

次に、細胞を0.05%トリプシン−EDTA溶液を用いて接着培養用シャーレから剥がし、シングルセルまで分割された細胞を新たな接着培養用シャーレに播種した。その後、培地として10%FBSを含有するDMEMを用い、細胞を一週間培養した。

0074

細胞が70%から80%以上コンフルエントになったことを確認した後に、培地を無血清培地(FBSを含まないDMEM)に置換し、2日間培養後、培地の上清を回収した。回収した培地の上清を1500回転で5分遠心し、培地の上清を再度回収した後に3000回転で3分遠心し、培地の上清を再度回収したものを比較例に係る上清溶液とした。

0075

また、培養された細胞は、未分化マーカーであるNANOG、OCT3/4、及びTRA 1−60が陰性であり、分化した細胞であることが確認された。

0076

(実施例4:線維芽細胞の増殖性試験)
増殖培地Aとして、10%FBS及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン添加DMEM培地を用意した。次に、成人由来正常ヒト線維芽細胞(KF−4109、Strain No.01035、クラボウ)を、濃度が5×103細胞/0.1mL/ウェルとなるよう増殖培地Aで懸濁し、96ウェルプレートに播種して、CO2インキュベーター内(5%CO2、37℃)で1日間培養した。

0077

試験培地Aとして、1%FBS及び1%ペニシリン−ストレプトマイシン添加DMEM培地を用意した。次に、実施例1から3及び比較例に係る上清溶液のそれぞれと、試験培地Aと、を、体積比で、10.00:90.00となるよう混合し、濃度が10.00v/v%の実施例1から3及び比較例に係る上清添加培地Aを得た。一部のウェル内の増殖培地Aを、実施例1から3及び比較例に係る上清添加培地Aのそれぞれに置換した。

0078

陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Aを、1%FBS及び1%ペニシリン−ストレプトマイシンを添加していないDMEM培地(無添加試験培地A)に置換した。また、陰性コントロールとして、DMEM/F12と、試験培地Aと、を、体積比で、10.00:90.00となるよう混合して得られた希釈試験培地Aに、一部のウェルの増殖培地Aを置換した。

0079

置換された培地で、1日間及び3日間、線維芽細胞を培養し、生細胞数測定試薬SF(Cat.No.07553−15、ナカライテスク)及びプレートリーダー(Varioskan MicroPlate Reader、Thermo Scientific)を用いて、WST−8法で生細胞数測定を行った。結果を図1及び図2に示す。濃度が10.00v/v%の実施例1から3に係る上清添加培地Aを用いた場合、無添加試験培地A、希釈試験培地A、及び比較例に係る上清添加培地Aを用いた場合と比較して、線維芽細胞が優位に増殖したことが確認された。また、幹細胞の培地の上清が、細胞の生存率の上昇に有効であることが示唆された。さらに、継代時のシャーレからの剥離の際、あるいはシングルセルに分割される際には、細胞には、圧力等の物理的ストレスと、剥離剤により化学的なストレスが加えられる。しかし、これらのストレスを受けた細胞が、実施例に係る上清添加培地によって増殖したことから、実施例に係る上清添加培地が、細胞が受けたストレスを緩和し、細胞をストレスから保護し、細胞を安定化し、生存率を向上させることが示唆された。これらの結果から、実施例に係る上清添加培地が、細胞に含まれる核酸、タンパク質、タンパク質複合体、リポタンパク質、リボソーム、及び生体膜を保護することが示唆された。ここで、生体膜は、細胞膜を含む。

0080

(実施例5:線維芽細胞によるI型コラーゲン及びヒアルロン酸産生試験)
実施例4と同様に、増殖培地Aで成人由来正常ヒト線維芽細胞を1日間培養した。その後、濃度が1.00v/v%、10.00v/v%又は100.0v/v%である以外は、実施例4と同様に、一部のウェル内の増殖培地Aを、実施例1から3及び比較例に係る上清添加培地Aのそれぞれに置換した。

0081

陽性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Aを置換しなかった。陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Aを、無添加試験培地Aに置換した。また、陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Aを、実施例4と同様に調整した希釈試験培地Aに置換した。

0082

培地を交換した後、3日間、線維芽細胞を培養し、培地の上清を回収し、−80℃で保存した。その後、培地の上清を解凍し、培地の上清のI型コラーゲン濃度を、ヒトコラーゲンタイプ1ELISAkit(Cat.No.EC1−E105)で測定した。また、培地の上清のヒアルロン酸濃度を、DueSet Hyaluronan(Cat.No.DY3614、R&D Systems)を用いて測定した。結果を図3図4及び図5に示す。

0083

図3及び図4において、右側の補正されたバーは、線維芽細胞を培養する前から元々培地に含まれていたコラーゲンの量を除く補正をされたデータを示している。左側の生データのバーは、補正前のデータを示している。図3に示すように、濃度が1.0v/v%の実施例1に係る上清添加培地Aを用いた場合、無添加試験培地A、増殖培地A、希釈試験培地A、及び比較例に係る上清添加培地Aを用いた場合と比較して、I型コラーゲンの産生量が優位に増加していた。図4に示すように、濃度が1.0v/v%及び100.0v/v%の実施例3に係る上清添加培地Aを用いた場合、増殖培地Aを用いた場合と比較して、I型コラーゲンの産生量が顕著に増加していた。したがって、幹細胞の培地の上清が、コラーゲンの産生を促進し、皮膚のシワ及びたるみ形成防止、及び改善に有効であることが示唆された。

0084

図5において、右側の補正されたバーは、線維芽細胞を培養する前から元々培地に含まれていたヒアルロン酸の量を除く補正をされたデータを示している。左側の生データのバーは、補正前のデータを示している。濃度が10.0v/v%及び100.0v/v%の実施例1から3に係る上清添加培地Aを用いた場合、無添加試験培地A、希釈試験培地A、及び比較例に係る上清添加培地Aと比較して、ヒアルロン酸の産生量が顕著に増加していた。したがって、幹細胞の培地の上清が、ヒアルロン酸の産生を促進し、ヒアルロン酸の減少によるシワ及びたるみの形成防止、及び改善に有効であることが示唆された。

0085

(実施例6:表皮細胞の遊走性試験)
増殖培地Bとして、増殖添加剤(10μg/mLのインスリン、0.1ng/mLのhEGF、0.67μg/mLのハイドロコーチゾン、4μL/mLのウシ脳下垂体抽出液BPE)及び抗菌剤(50μg/mLのゲンタマイシン、50ng/mLのアンフォテリシン)を含む500mLの表皮細胞培地(HuMedia−KG2、クラボウ)を用意した。

0086

成人由来正常ヒト表皮細胞を10μg/mLのMitomycin C(Cat.No.20898−21、Nacalai tesque)で2時間処理し、細胞分裂を停止させた。次に、ヒト表皮細胞を、濃度が4×104細胞/0.1mL/ウェルとなるよう増殖培地Bで懸濁し、細胞の遊走能を測定するキット(Oris Cell Migration Assay、登録商標)のコラーゲンコート済みプレートに播種して、CO2インキュベーター内(5%CO2、37℃)で1日間培養し、プレート上のストッパーで塞がれていないストッパーの外縁部に表皮細胞を定着させた。その後、ストッパーをプレート上から撤去した。

0087

試験培地Bとして、500mLの表皮細胞培地に抗菌剤(50μg/mLのゲンタマイシン及び50nm/mLのアンフォテリシン)を添加した培地を用意した。次に、実施例1から3及び比較例に係る上清溶液のそれぞれと、試験培地Bと、を、体積比で、10.0:90.0、1.0:99.0となるよう混合し、実施例1から3及び比較例に係る上清添加培地Bを得た。一部のプレート上の増殖培地Bを、実施例1から3及び比較例に係る上清添加培地Bのそれぞれに置換した。

0088

一部のプレート上の増殖培地Bを、陰性コントロールとして、増殖添加剤を添加していない表皮細胞培地(無添加試験培地B)に置換した。また、陰性コントロールとして、DMEM/F12と、試験培地Bと、を、体積比で、10.0:90.0、1.0:99.0となるよう混合して得られた希釈試験培地Bに、一部のプレート上の増殖培地Bを置換した。

0089

創傷治癒過程では、傷に向かって表皮細胞が遊走して創傷が収縮する。本実施例においては、ストッパーで塞がれていたところに表皮細胞が遊走したか否かを、プレートリーダーを用いて分析した。具体的には、培地を置換してから23時間後、生細胞染色試薬(Calcein AM、Cat.NO.341−07901、DOJINDO)で表皮細胞を染色し、プレートリーダー(Varioskan MicroPlate Reader、Thermo Scientific)を用いて、波長485nmの励起光に対する波長538nmの蛍光を測定した。

0090

結果を図6及び図7に示す。濃度が1.0v/v%及び10.0v/v%の実施例1から3に係る上清添加培地Bを用いた場合、無添加試験培地B、希釈試験培地B、及び比較例に係る上清添加培地Bと比較して、表皮細胞の遊走能の有意な促進効果が認められた。したがって、幹細胞の培地の上清が、創傷治癒に有効であることが示された。また、幹細胞の培地の上清が、例えば、紫外線暴露による皮膚損傷で生じる皮膚表層のしみ及び不均一な肌色の形成の防止及び改善に有効であることが示唆された。また、幹細胞の培地の上清が、細胞を安定化し、生存率の上昇に有効であることが示唆された。さらに、継代時のシャーレからの剥離の際、あるいはシングルセルに分割される際には、細胞には、圧力等の物理的ストレスと、剥離剤により化学的なストレスが加えられる。しかし、これらのストレスを受けた細胞が、実施例に係る上清添加培地によって増殖したことから、実施例に係る上清添加培地が細胞が受けたストレスを緩和し、細胞をストレスから保護し、細胞を安定化し、生存率を向上させることが示唆された。これらの結果から、実施例に係る上清添加培地が、細胞に含まれる核酸、タンパク質、タンパク質複合体、リポタンパク質、リボソーム、及び生体膜を保護することが示唆された。ここで、生体膜は、細胞膜を含む。

0091

(実施例7:毛乳頭細胞の増殖性試験)
増殖培地Cとして、専用添加剤(牛胎児血清、インスリン・トランスフェリントリヨードサイロニン混液牛下垂体抽出液サイプロテロンアセテート)添加済みの毛乳頭細胞専用培地(Cat.No.TMTPGM−250、TOYOBO)を用意した。次に、正常ヒト毛乳頭細胞(Cat.No.CA60205a、Lot.No.2868、TOYOBO)を、濃度が1.2×104細胞/0.3mL/ウェルとなるよう増殖培地Cで懸濁し、typeIコラーゲンコート48ウェルプレートに播種して、CO2インキュベーター内(5%CO2、37℃)で1日間培養した。

0092

実施例1から3及び比較例に係る上清溶液のそれぞれと、添加剤を添加していない毛乳頭細胞専用培地(無添加試験培地C)と、を、体積比で30.0:70.0となるよう混合し、実施例1から3及び比較例に係る上清添加培地Cを得た。一部のウェル内の増殖培地Cを、実施例1から3及び比較例に係る上清添加培地Cのそれぞれに置換した。

0093

陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Cを、添加剤を添加していない毛乳頭細胞専用培地(無添加試験培地C)に置換した。また、陰性コントロールとして、DMEM/F12と、無添加試験培地Cと、を、体積比で30.0:70.0となるよう混合して得られた希釈試験培地Cに、一部のウェルの増殖培地Cを置換した。

0094

置換された培地で、3日間、毛乳頭細胞を培養し、WST−8法で生細胞数測定を行った。結果を図8に示す。濃度が30.0v/v%の実施例1から3に係る上清添加培地Cを用いた場合、無添加試験培地C及び希釈試験培地Cを用いた場合と比較して、毛乳頭細胞が優位に増殖したことが確認された。したがって、幹細胞の培地の上清が、薄毛の治療、脱毛の予防、毛生促進、及び発毛促進等の育毛及び発毛効果を有することが示唆された。

0095

(実施例8:毛乳頭細胞によるFGF−7及びVEGF産生試験)
実施例7と同様に、増殖培地Cで正常ヒト毛乳頭細胞を1日間培養した。その後、濃度が0.3v/v%、30.0v/v%、又は100.0v/v%である以外は、実施例7と同様に、一部のウェル内の増殖培地Cを、実施例1から3及び比較例に係る上清添加培地Cのそれぞれに置換した。

0096

陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Cを、無添加試験培地C及び希釈試験培地Cのそれぞれに置換した。また、参考コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Cを、毛乳頭細胞専用培地に100μmol/Lのアデノシンを添加したアデノシン添加培地、及び毛乳頭細胞専用培地に30μmol/Lのミノキシジルを添加したアデノシン添加培地のそれぞれに置換した。また、ミノキシジルのビヒクル・コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Cを、毛乳頭細胞専用培地に0.1%DMSOを添加したDMSO添加培地に置換した。

0097

培地を交換した後、3日間、毛乳頭細胞を培養し、培地の上清を回収し、−80℃で保存した。その後、培地の上清を解凍し、培地の上清の線維芽細胞成長因子7(FGF−7)濃度を、FGF−7 HumanELISAkit(Cat.No.ab100519、abcam)で測定した。また、培地の上清の血管内皮細胞増殖因子(VEGF)濃度をHuman VEGF Quantikine ELISA(Cat.No.DVE00、R&D Systems)で測定した。結果を図9及び図10に示す。

0098

図9において、右側の補正されたバーは、毛乳頭細胞を培養する前から元々培地に含まれていたFGF−7の量を除く補正をされたデータを示している。左側の生データのバーは、補正前のデータを示している。濃度が0.3v/v%の実施例1から3に係る上清添加培地Cを用いた場合、無添加試験培地C、希釈試験培地C、及び比較例に係る上清添加培地Cを用いた場合と比較して、FGF−7の産生量が有意に増加したのが確認された。

実施例

0099

図10において、右側の補正されたバーは、毛乳頭細胞を培養する前から元々培地に含まれていたVEGFの量を除く補正をされたデータを示している。左側の生データのバーは、補正前のデータを示している。濃度が30.0v/v%及び100.0v/v%の実施例1から3に係る上清添加培地Cを用いた場合、希釈試験培地C及び比較例に係る上清添加培地Cを用いた場合と比較して、VEGFの産生量が有意に増加したのが確認された。

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