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技術 抗EGFR抗体及び抗体薬物コンジュゲート

出願人 アッヴィ・インコーポレイテッド
発明者 エドワード・ビー・ライリーアンドリュー・シー・フィリップスロレンゾ・ベナトゥイルフリッツ・ジー・ブキャナンジョナサン・エイ・ムールブルックチャン-ミン・シェイジェニファー・ペレス
出願日 2019年11月25日 (1年0ヶ月経過) 出願番号 2019-212012
公開日 2020年3月19日 (9ヶ月経過) 公開番号 2020-039360
状態 未査定
技術分野 微生物による化合物の製造 ペプチド又は蛋白質 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性 突然変異または遺伝子工学 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 医薬品製剤 微生物、その培養処理
主要キーワード 所定種 キットシステム クエンチ反応 光化学作用 可変度 系列会社 規則的構造 非多孔質材料
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図面 (20)

課題

癌治療において治療目的で使用することができる抗上皮成長因子受容体(EGFR)抗体及び抗体薬物コンジュゲートADC)の提供。

解決手段

以下のa)からc)の特性を有する抗ヒトEGFR抗体又はその抗原結合部分。a)特定のアミノ酸配列内のエピトープに結合するか、又は、競合結合アッセイにおいて、特定のアミノ酸配列を有するEGFR変異体IIIとの結合に関して、別の特定のアミノ酸配列を有する第2の抗ヒトEGFR抗体と競合する。b)表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、一定以下の解離定数(Kd)で、前記とは別の特定のアミノ酸配列を有するEGFRと結合する。c)インビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、前記抗hEGFR抗体又はその抗原結合部分と同一の用量と頻度投与されEGFRに非特異的なヒトIgG抗体と比較して、一定以上の割合で腫瘍増殖阻害する。

概要

背景

ヒト上皮成長因子受容体HER−1又はErb−B1とも言い、本願では「EGFR」と言う。)はc−erbB癌原遺伝子によりコードされる170kDa膜貫通型受容体であり、固有チロシンキナーゼ活性を示す(Modjtahedi et al.,Br.J.Cancer 73:228−235(1996);Herbst and Shin,Cancer 94:1593−1611(2002))。SwissProtデータベースエントリーP00533はヒトEGFRの配列を提供している。EGFRはチロシンキナーゼ介在性シグナル伝達経路を介して多数の細胞内プロセスを調節し、限定されないが、細胞増殖分化、細胞生存アポトーシス血管新生有糸分裂及び転移を制御するシグナル伝達経路の活性化が挙げられる(Atalay et al.,Ann.Oncology 14:1346−1363(2003);Tsao and Herbst,Signal 4:4−9(2003);Herbst and Shin,Cancer 94:1593−1611(2002);Modjtahedi et al.,Br.J.Cancer 73:228−235(1996))。

EGFRの公知リガンドとしては、EGF、TGFA/TGF−α、アンフィレグリンエピジェン/EPGN、BTCベタセルリンエピレグリンEREG及びHBEGF/ヘパリン結合性EGFが挙げられる。リガンドがEGFRと結合すると、受容体ホモ及び/又はヘテロ二量化と主要な細胞質残基の自己リン酸化を引き起こす。リン酸化したEGFRはGRB2等のアダプタータンパク質動員し、その結果、少なくとも以下の主要な下流シグナル伝達カスケード、即ちRAS−RAF−MEK−ERK、PI3キナーゼ−AKT、PLCγ−PKC及びSTATモジュールを含む複雑な下流のシグナル伝達カスケードを活性化する。この自己リン酸化は更にそれ自体のホスホチロシン結合性SH2ドメインを介してリン酸化チロシン会合する複数の他のタンパク質による下流の活性化とシグナル伝達を誘発する。これらの下流のシグナル伝達タンパク質はMAPK、Akt及びJNK経路を始めとする複数のシグナル伝達カスケードを開始し、細胞増殖をもたらす。リガンドがEGFRと結合すると、NF−κBシグナル伝達カスケードを活性化する場合もある。リガンド結合は更にRGS16等の他のタンパク質を直接リン酸化し、そのGTPase活性を活性化し、潜在的にEGF受容体シグナル伝達をGタンパク質共役型受容体シグナル伝達と連動させる。リガンド結合は更にMUC1をリン酸化し、SRC及びCTNNB1/β−カテニンとのその相互作用亢進する。

膀胱癌脳腫瘍頭頸部癌膵臓癌肺癌乳癌卵巣癌結腸癌前立腺癌及び腎臓癌を含む多数のヒト悪性病態でEGFRの過剰発現報告されている。(Atalay et al.,Ann.Oncology 14:1346−1363(2003);Herbst and Shin,Cancer 94:1593−1611(2002);及びModjtahedi et al.,Br.J.Cancer 73:228−235(1996))。これらの病態の多くにおいて、EGFRの過剰発現は患者の予後不良と相関又は関連する。(Herbst and Shin,Cancer 94:1593−1611(2002);及びModjtahedi et al.,Br.J.Cancer 73:228−235(1996))。悪性細胞よりも一般に低レベルではあるが、EGFRは正常組織、特に皮膚、及び胃腸管上皮組織の細胞でも発現される(Herbst and Shin,Cancer 94:1593−1611(2002))。

EGFR遺伝子増幅(即ちEGFR遺伝子の複数のコピー)を含む腫瘍はかなりの割合のものがde2−7EGFR、ΔEGFR、EGFRvIII又はΔ2−7(本願ではこれらの用語を同義に使用する。)と呼ばれる前記受容体の短縮型(Wikstrand et al.(1998)J.Neurovirol.4,148−158)を同時発現する(Olapade−Olaopa et al.(2000)Br.J.Cancer.82,186−94)。de2−7EGFRに見られる再構成の結果、エキソン2〜7にまたがる801ヌクレオチド欠失するインフレーム成熟mRNAが生成される(Wong et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89,2965−9;Yamazaki et al.(1990)Jpn.J.Cancer Res.81,773−9;Yamazaki et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8,1816−20;及びSugawa et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,8602−6)。対応するEGFRタンパク質細胞外領域の残基6〜273からなる267アミノ酸を欠失すると共に、融合接合部に新規グリシン残基をもつ(Sugawa et al.,1990)。この欠失とグリシン残基の挿入が相俟って欠失界面にユニークな接合ペプチドが生成される(Sugawa et al.,1990)。

EGFRvIIIは神経膠腫、乳癌、肺癌、卵巣癌及び前立腺癌を含む多数の腫瘍種で報告されている(Wikstrand et al.(1997)Cancer Res.57,4130−40;Olapade−Olaopa et al.(2000)Br.J.Cancer.82,186−94;Wikstrand,et al.(1995)Cancer Res.55,3140−8;Garcia de Palazzo et al.(1993)Cancer Res.53,3217−20)。この短縮型受容体はリガンドと結合しないが、構成的活性が低く、ヌードマウス腫瘍異種移植片として増殖させた神経膠腫細胞に有意な増殖効果を付与し(Nishikawa et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91,7727−31)、NIH3T3細胞(Batra et al.(1995)Cell Growth Differ.6,1251−9)とMCF−7細胞を形質転換させることができる。神経膠腫細胞でde2−7EGFRにより利用される細胞内メカニズムは完全には解明されていないが、アポトーシスの低下(Nagane et al.(1996)Cancer Res.56,5079−86)と増殖の若干の亢進(Nagane et al.,1996)を伴うことが報告されている。この短縮型受容体の発現は腫瘍細胞に限定されているので、抗体療法の高度に特異的な標的となる。

抗体薬物コンジュゲートADC)は化学的リンカーを介して抗体を細胞毒性薬と結合させた新規類の治療薬である。ADCの治療概念は抗体の結合能を薬物と結び付けるものであり、標的表面抗原との結合により薬物を腫瘍細胞に送達するために抗体を使用する。

概要

癌治療において治療目的で使用することができる抗上皮成長因子受容体(EGFR)抗体及び抗体薬物コンジュゲート(ADC)の提供。以下のa)からc)の特性を有する抗ヒトEGFR抗体又はその抗原結合部分。a)特定のアミノ酸配列内のエピトープに結合するか、又は、競合結合アッセイにおいて、特定のアミノ酸配列を有するEGFR変異体IIIとの結合に関して、別の特定のアミノ酸配列を有する第2の抗ヒトEGFR抗体と競合する。b)表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、一定以下の解離定数(Kd)で、前記とは別の特定のアミノ酸配列を有するEGFRと結合する。c)インビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、前記抗hEGFR抗体又はその抗原結合部分と同一の用量と頻度投与されEGFRに非特異的なヒトIgG抗体と比較して、一定以上の割合で腫瘍増殖阻害する。

目的

本発明はEGFRvIIIと特異的に結合する抗EGFR抗体及び抗体薬物コンジュゲート(ADC)を提供する

効果

実績

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請求項1

抗ヒト上皮成長因子受容体(抗hEGFR)抗体又はその抗原結合部分であって、a)アミノ酸配列CGADSYEMEEDGVRKC(配列番号45)内のエピトープに結合するか、又は競合結合アッセイにおいて上皮成長因子受容体変異体III(EGFRvIII)(配列番号33)との結合に関して第2の抗hEGFR抗体と競合し、ここで前記第2の抗EGFR抗体は、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む;b)表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約1×10−6M以下の解離定数(Kd)でEGFR(1−525)(配列番号47)と結合し;およびc)インビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、前記NSCLC異種移植アッセイにおいて、EGFRに特異的ではないヒトIgG抗体と比較して少なくとも約50%の腫瘍増殖阻害率%(TGI%)で腫瘍増殖阻害する、ここで、前記抗hEGFR抗体又はその抗原結合部分と同一の用量と頻度でEGFRに非特異的なヒトIgG抗体を投与される、前記抗体又はその抗原結合部分。

請求項2

表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約1×10−6M〜約1×10−10MのKdでEGFR(1−525)(配列番号47)と結合する請求項1に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項3

表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約1×10−6M〜約1×10−7MのKdでEGFR(1−525)(配列番号47)と結合する請求項1に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項4

表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約8.2×10−9M以下のKdでEGFRvIII(配列番号33)と結合する請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項5

表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約8.2×10−9M〜約6.3×10−10MのKdでEGFRvIII(配列番号33)と結合する請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項6

表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約8.2×10−9M〜約2.0×10−9MのKdでEGFRvIII(配列番号33)と結合する請求項1から3のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項7

インビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、EGFRに非特異的なヒトIgG抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約60%阻害する請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項8

インビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、EGFRに非特異的なヒトIgG抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約70%阻害する請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項9

インビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、EGFRに非特異的なヒトIgG抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約80%阻害する請求項1から6のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項10

前記抗体又はその抗原結合部分が、配列番号12に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDRドメイン、配列番号11に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2ドメイン及び配列番号10に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1ドメインと;配列番号8に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3ドメイン、配列番号7に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2ドメイン及び配列番号6に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1ドメインとを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項11

前記抗体又はその抗原結合部分が、配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項12

配列番号15に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号13に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む請求項1から9のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項13

配列番号40に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3ドメイン、配列番号39に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2ドメイン及び配列番号38に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1ドメインと;配列番号37に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3ドメイン、配列番号36に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2ドメイン及び配列番号35に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1ドメインとを含む抗hEGFR抗体又はその抗原結合部分。

請求項14

50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76及び78から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と;51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77及び79から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗hEGFR抗体又はその抗原結合部分。

請求項15

配列番号10、11及び12;配列番号16、17及び18;配列番号10、11及び19;配列番号20、11及び12;配列番号21、3及び22;配列番号16、17及び19;配列番号2、3及び4;配列番号10、3及び12;配列番号80、11及び18;配列番号80、3及び18;配列番号20、3及び12;配列番号80、11及び12;並びに配列番号81、11及び22から構成される群から選択される重鎖CDRセット(CDR1、CDR2及びCDR3)と;配列番号6、7及び8;配列番号23、24及び25;配列番号26、27及び28;配列番号29、30及び31;配列番号6、7及び84;配列番号82、83及び31;並びに配列番号82、27及び85から構成される群から選択される軽鎖CDRセット(CDR1、CDR2及びCDR3)を含む抗hEGFR抗体又はその抗原結合部分であって、前記抗体又はその抗原結合部分が、配列番号2、3及び4の重鎖CDRセットと、配列番号6、7及び8の軽鎖CDRセットを同時に含むことはない前記抗hEGFR抗体又はその抗原結合部分。

請求項16

配列番号41に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び/又は配列番号43に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項17

前記抗体又はその抗原結合部分が、ヒトIgG定常領域、ヒトIgM定常領域、ヒトIgE定常領域及びヒトIgA定常領域から構成される群から選択される重鎖免疫グロブリン定常領域を含む、請求項1から15のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項18

前記IgG定常領域が、IgG1定常領域、IgG2定常領域、IgG3定常領域及びIgG4定常領域から構成される群から選択される請求項17に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項19

前記抗体が、多重特異性抗体である、請求項1から18のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項20

前記抗体又はその抗原結合部分が、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド結合したFv、scFv、シングルドメイン抗体及びダイアボディから構成される群から選択される、請求項1から19のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項21

前記抗体又はその抗原結合部分が、造影剤と結合している、請求項1から20のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項22

前記造影剤が、放射性標識物質酵素蛍光標識物質発光標識物質生物発光標識物質磁気標識物質及びビオチンから構成される群から選択される、請求項21に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項23

前記放射性標識物質が、インジウムである請求項22に記載の抗体又はその抗原結合部分。

請求項24

請求項1から23のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分と、医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物

請求項25

請求項1から23のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分を少なくとも1個の薬物と結合させた抗体薬物コンジュゲートADC)。

請求項26

請求項27

前記有糸分裂阻害剤が、ドラスタチンアウリスタチンメイタンシノイド及び植物アルカロイドから構成される群から選択される、請求項26に記載のADC。

請求項28

前記アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)又はモノメチルアウリスタチンE(MMAE)である、請求項27に記載のADC。

請求項29

前記メイタンシノイドが、DM1、DM2、DM3及びDM4から構成される群から選択される、請求項27に記載のADC。

請求項30

前記抗腫瘍性抗生物質が、アクチノマイシンアントラサイクリンカリケアマイシン及びデュオカルマイシンから構成される群から選択される、請求項26に記載のADC。

請求項31

請求項25から30のいずれか一項に記載のADCを複数個含むADC混合物と、医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。

請求項32

前記ADC混合物が、2〜4の平均薬物対抗体比(DAR)を有する、請求項31に記載の医薬組成物。

請求項33

前記ADC混合物が、各々2〜8のDARを有するADCを含む、請求項31に記載の医薬組成物。

請求項34

癌をもつ対象の治療方法であって、前記癌をもつ対象を治療するように、請求項24又は31から33のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

請求項35

前記癌が、乳癌肺癌膠芽腫前立腺癌膵臓癌結腸癌頭頸部癌及び腎臓癌から構成される群から選択される、請求項34に記載の方法。

請求項36

前記癌が、扁平上皮癌である、請求項34に記載の方法。

請求項37

前記扁平上皮癌が、扁平上皮癌又は頭頸部扁平上皮癌である、請求項36に記載の方法。

請求項38

前記癌が、トリプルネガティブ乳癌である、請求項34に記載の方法。

請求項39

前記癌が、非小細胞肺癌である、請求項34に記載の方法。

請求項40

前記癌が、EGFR過剰発現を特徴とする、請求項34から39のいずれか一項に記載の方法。

請求項41

固形腫瘍をもつ対象における固形腫瘍増殖の阻害又は抑制方法であって、前記固形腫瘍増殖を阻害又は抑制するように、前記固形腫瘍をもつ対象に請求項24又は31から33のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

請求項42

固形腫瘍をもつ対象における固形腫瘍増殖の阻害又は抑制方法であって、前記固形腫瘍増殖を阻害又は抑制するように、前記固形腫瘍をもつ対象に有効量の請求項1から23又は25から30のいずれか一項に記載の抗体又はADCを投与することを含む、方法。

請求項43

前記固形腫瘍が、EGFRを発現する固形腫瘍又はEGFRvIII陽性固形腫瘍である、請求項41又は42に記載の方法。

請求項44

前記固形腫瘍がEGFRを過剰発現する固形腫瘍である、請求項41又は42に記載の方法。

請求項45

前記固形腫瘍が、非小細胞肺癌又は膠芽腫である、請求項41から44のいずれか一項に記載の方法。

請求項46

前記抗体、ADC又は医薬組成物を別の薬剤又は別の療法と併用投与する、請求項34から45のいずれか一項に記載の方法。

請求項47

前記別の薬剤が、抗PD1抗体、抗CTLA−4抗体、テモゾロミド、bcl−xl阻害剤イブルチニブ、ドゥベリシブ、イデラリシブ、ベネトクラックス及びニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)阻害剤から構成される群から選択される、請求項46に記載の方法。

請求項48

前記別の療法が、放射線である、請求項46に記載の方法。

請求項49

前記別の薬剤が、化学療法剤である、請求項46に記載の方法。

請求項50

請求項1から23のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合部分をコードする単離核酸

請求項51

請求項50に記載の核酸を含むベクター

請求項52

請求項51に記載のベクターを含む宿主細胞

請求項53

原核細胞又は真核細胞である請求項52に記載の宿主細胞。

請求項54

前記真核細胞が、動物細胞原生動物細胞植物細胞及び真菌細胞から構成される群から選択される、請求項53に記載の宿主細胞。

請求項55

前記動物細胞が、哺乳動物細胞昆虫細胞及び鳥類細胞から構成される群から選択される請求項54に記載の宿主細胞。

請求項56

前記哺乳動物細胞が、CHO細胞、COS細胞及びSp2/0細胞から構成される群から選択される、請求項55に記載の宿主細胞。

請求項57

抗hEGFR抗体をアウリスタチンと結合させた抗hEGFR抗体薬物コンジュゲート(ADC)であって、前記抗体が配列番号12のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3ドメイン、配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2ドメイン及び配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1ドメインと;配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3ドメイン、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2ドメイン及び配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1ドメインとを含む前記抗hEGFR抗体薬物コンジュゲート(ADC)。

請求項58

前記抗体が、配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項57に記載のADC。

請求項59

前記抗体が、IgG重鎖免疫グロブリン定常領域を含む、請求項57又は58に記載のADC。

請求項60

前記IgGが、IgG1又はIgG4重鎖免疫グロブリン定常領域である、請求項59に記載のADC。

請求項61

前記アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)又はモノメチルアウリスタチンE(MMAE)である、請求項57から60のいずれか一項に記載のADC。

請求項62

前記抗体が、配列番号15のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む、請求項57又は58に記載のADC。

請求項63

前記抗体が、マレイミドカプロイルバリンシトルリン、p−アミノベンジルアルコール(mc−vc−PABA)を含むリンカーにより前記アウリスタチンと共有結合している、請求項61に記載のADC。

請求項64

前記ADCが、放射性標識物質を含む、請求項57から63のいずれか一項に記載のADC。

請求項65

前記放射性標識物質が、インジウムである、請求項64に記載のADC。

請求項66

請求項57から65のいずれか一項に記載のADCと、医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物。

請求項67

請求項57から65のいずれか一項に記載のADCを含むADC混合物を含有する医薬組成物であって、前記ADC混合物における平均薬物対抗体比(DAR)の範囲が2〜4である、医薬組成物。

請求項68

抗hEGFR抗体薬物コンジュゲート(ADC)を含むADC混合物と、医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物であって、前記ADC混合物は平均薬物対抗体比(DAR)が2〜4であり、前記ADCは配列番号12のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3ドメイン、配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2ドメイン及び配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1ドメインと;配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3ドメイン、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2ドメイン及び配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1ドメインとを含む抗hEGFR抗体と、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)を結合させたものである、医薬組成物。

請求項69

前記抗体の重鎖可変領域が配列番号9に記載のアミノ酸配列を含み、前記抗EGFR抗体の軽鎖可変領域が配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む、請求項68に記載の医薬組成物。

請求項70

前記抗体が、IgG重鎖免疫グロブリン定常領域を含む、請求項68又は69に記載の医薬組成物。

請求項71

前記IgGが、IgG1又はIgG4重鎖免疫グロブリン定常領域である請求項70に記載の医薬組成物。

請求項72

前記抗体が、配列番号15に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む請求項68又は69に記載の医薬組成物。

請求項73

前記MMAEが、マレイミドカプロイル、val−cit、PABAを含むリンカーにより前記抗体と結合している、請求項68から72のいずれか一項に記載の医薬組成物。

請求項74

癌をもつ対象の治療方法であって、前記癌をもつ対象を治療するように、請求項68から73のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。

請求項75

前記癌が、乳癌、肺癌、膠芽腫、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、頭頸部癌及び腎臓癌から構成される群から選択される、請求項74に記載の方法。

請求項76

前記癌が、扁平上皮癌である、請求項74に記載の方法。

請求項77

前記扁平上皮癌が、肺扁平上皮癌又は頭頸部扁平上皮癌である、請求項76に記載の方法。

請求項78

前記癌が、トリプルネガティブ乳癌である、請求項74に記載の方法。

請求項79

前記癌が、非小細胞肺癌である、請求項74に記載の方法。

請求項80

前記癌が、EGFR過剰発現を特徴とする、請求項74から79のいずれか一項に記載の方法。

請求項81

固形腫瘍をもつ対象における固形腫瘍増殖の阻害又は抑制方法であって、前記固形腫瘍増殖が阻害又は抑制されるように、前記固形腫瘍をもつ対象に請求項66から73のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。

請求項82

前記固形腫瘍が、非小細胞肺癌又は膠芽腫である、請求項81に記載の方法。

請求項83

前記固形腫瘍が、扁平上皮癌である、請求項81に記載の方法。

請求項84

前記固形腫瘍が、EGFRvIII陽性固形腫瘍又はEGFRを発現する固形腫瘍である、請求項81から83のいずれか一項に記載の方法。

請求項85

前記固形腫瘍が、EGFRを過剰発現する、請求項81から83のいずれか一項に記載の方法。

請求項86

前記医薬組成物を別の薬剤又は別の療法と併用投与する、請求項74から85のいずれか一項に記載の方法。

請求項87

前記別の薬剤が抗PD1抗体、抗CTLA−4抗体、テモゾロミド、bcl−xl阻害剤、イブルチニブ、ドゥベリシブ、イデラリシブ、ベネトクラックス及びニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)阻害剤から構成される群から選択される、請求項86に記載の方法。

請求項88

前記別の療法が、放射線である、請求項86に記載の方法。

請求項89

前記別の薬剤が、化学療法剤である、請求項86に記載の方法。

背景技術

0001

ヒト上皮成長因子受容体HER−1又はErb−B1とも言い、本願では「EGFR」と言う。)はc−erbB癌原遺伝子によりコードされる170kDa膜貫通型受容体であり、固有チロシンキナーゼ活性を示す(Modjtahedi et al.,Br.J.Cancer 73:228−235(1996);Herbst and Shin,Cancer 94:1593−1611(2002))。SwissProtデータベースエントリーP00533はヒトEGFRの配列を提供している。EGFRはチロシンキナーゼ介在性シグナル伝達経路を介して多数の細胞内プロセスを調節し、限定されないが、細胞増殖分化、細胞生存アポトーシス血管新生有糸分裂及び転移を制御するシグナル伝達経路の活性化が挙げられる(Atalay et al.,Ann.Oncology 14:1346−1363(2003);Tsao and Herbst,Signal 4:4−9(2003);Herbst and Shin,Cancer 94:1593−1611(2002);Modjtahedi et al.,Br.J.Cancer 73:228−235(1996))。

0002

EGFRの公知リガンドとしては、EGF、TGFA/TGF−α、アンフィレグリンエピジェン/EPGN、BTCベタセルリンエピレグリンEREG及びHBEGF/ヘパリン結合性EGFが挙げられる。リガンドがEGFRと結合すると、受容体ホモ及び/又はヘテロ二量化と主要な細胞質残基の自己リン酸化を引き起こす。リン酸化したEGFRはGRB2等のアダプタータンパク質動員し、その結果、少なくとも以下の主要な下流シグナル伝達カスケード、即ちRAS−RAF−MEK−ERK、PI3キナーゼ−AKT、PLCγ−PKC及びSTATモジュールを含む複雑な下流のシグナル伝達カスケードを活性化する。この自己リン酸化は更にそれ自体のホスホチロシン結合性SH2ドメインを介してリン酸化チロシン会合する複数の他のタンパク質による下流の活性化とシグナル伝達を誘発する。これらの下流のシグナル伝達タンパク質はMAPK、Akt及びJNK経路を始めとする複数のシグナル伝達カスケードを開始し、細胞増殖をもたらす。リガンドがEGFRと結合すると、NF−κBシグナル伝達カスケードを活性化する場合もある。リガンド結合は更にRGS16等の他のタンパク質を直接リン酸化し、そのGTPase活性を活性化し、潜在的にEGF受容体シグナル伝達をGタンパク質共役型受容体シグナル伝達と連動させる。リガンド結合は更にMUC1をリン酸化し、SRC及びCTNNB1/β−カテニンとのその相互作用亢進する。

0003

膀胱癌脳腫瘍頭頸部癌膵臓癌肺癌乳癌卵巣癌結腸癌前立腺癌及び腎臓癌を含む多数のヒト悪性病態でEGFRの過剰発現報告されている。(Atalay et al.,Ann.Oncology 14:1346−1363(2003);Herbst and Shin,Cancer 94:1593−1611(2002);及びModjtahedi et al.,Br.J.Cancer 73:228−235(1996))。これらの病態の多くにおいて、EGFRの過剰発現は患者の予後不良と相関又は関連する。(Herbst and Shin,Cancer 94:1593−1611(2002);及びModjtahedi et al.,Br.J.Cancer 73:228−235(1996))。悪性細胞よりも一般に低レベルではあるが、EGFRは正常組織、特に皮膚、及び胃腸管上皮組織の細胞でも発現される(Herbst and Shin,Cancer 94:1593−1611(2002))。

0004

EGFR遺伝子増幅(即ちEGFR遺伝子の複数のコピー)を含む腫瘍はかなりの割合のものがde2−7EGFR、ΔEGFR、EGFRvIII又はΔ2−7(本願ではこれらの用語を同義に使用する。)と呼ばれる前記受容体の短縮型(Wikstrand et al.(1998)J.Neurovirol.4,148−158)を同時発現する(Olapade−Olaopa et al.(2000)Br.J.Cancer.82,186−94)。de2−7EGFRに見られる再構成の結果、エキソン2〜7にまたがる801ヌクレオチド欠失するインフレーム成熟mRNAが生成される(Wong et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89,2965−9;Yamazaki et al.(1990)Jpn.J.Cancer Res.81,773−9;Yamazaki et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8,1816−20;及びSugawa et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,8602−6)。対応するEGFRタンパク質細胞外領域の残基6〜273からなる267アミノ酸を欠失すると共に、融合接合部に新規グリシン残基をもつ(Sugawa et al.,1990)。この欠失とグリシン残基の挿入が相俟って欠失界面にユニークな接合ペプチドが生成される(Sugawa et al.,1990)。

0005

EGFRvIIIは神経膠腫、乳癌、肺癌、卵巣癌及び前立腺癌を含む多数の腫瘍種で報告されている(Wikstrand et al.(1997)Cancer Res.57,4130−40;Olapade−Olaopa et al.(2000)Br.J.Cancer.82,186−94;Wikstrand,et al.(1995)Cancer Res.55,3140−8;Garcia de Palazzo et al.(1993)Cancer Res.53,3217−20)。この短縮型受容体はリガンドと結合しないが、構成的活性が低く、ヌードマウス腫瘍異種移植片として増殖させた神経膠腫細胞に有意な増殖効果を付与し(Nishikawa et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91,7727−31)、NIH3T3細胞(Batra et al.(1995)Cell Growth Differ.6,1251−9)とMCF−7細胞を形質転換させることができる。神経膠腫細胞でde2−7EGFRにより利用される細胞内メカニズムは完全には解明されていないが、アポトーシスの低下(Nagane et al.(1996)Cancer Res.56,5079−86)と増殖の若干の亢進(Nagane et al.,1996)を伴うことが報告されている。この短縮型受容体の発現は腫瘍細胞に限定されているので、抗体療法の高度に特異的な標的となる。

0006

抗体薬物コンジュゲートADC)は化学的リンカーを介して抗体を細胞毒性薬と結合させた新規類の治療薬である。ADCの治療概念は抗体の結合能を薬物と結び付けるものであり、標的表面抗原との結合により薬物を腫瘍細胞に送達するために抗体を使用する。

先行技術

0007

Modjtahedi et al.,Br.J.Cancer 73:228−235(1996)
Herbst and Shin,Cancer 94:1593−1611(2002)
Atalay et al.,Ann.Oncology 14:1346−1363(2003)
Tsao and Herbst,Signal 4:4−9(2003)
Wikstrand et al.(1998)J.Neurovirol.4,148−158
Olapade−Olaopa et al.(2000)Br.J.Cancer.82,186−94
Wong et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89,2965−9
Yamazaki et al.(1990)Jpn.J.Cancer Res.81,773−9
Yamazaki et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8,1816−20
Sugawa et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,8602−6
Wikstrand et al.(1997)Cancer Res.57,4130−40
Wikstrand,et al.(1995)Cancer Res.55,3140−8
Garcia de Palazzo et al.(1993)Cancer Res.53,3217−20
Nishikawa et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91,7727−31
Batra et al.(1995)Cell Growth Differ.6,1251−9
Nagane et al.(1996)Cancer Res.56,5079−86

発明が解決しようとする課題

0008

従って、癌治療において治療目的で使用することができる抗EGFR抗体及びADCが当技術分野で依然として必要とされている。

課題を解決するための手段

0009

ある種の態様において、本発明はEGFRvIIIと特異的に結合する抗EGFR抗体及び抗体薬物コンジュゲート(ADC)を提供する。

0010

1実施形態において、本発明は抗ヒト上皮成長因子受容体(抗hEGFR)抗体又はその抗原結合部分であって、アミノ酸配列CGADSYEMEEDGVRKC(配列番号45)内のエピトープに結合するか、又は競合結合アッセイにおいて上皮成長因子受容体変異体III(EGFRvIII)(配列番号33)との結合に関して第2の抗hEGFR抗体と競合し、ここで、前記第2の抗EGFR抗体は、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む;表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約1×10−6M以下の解離定数(Kd)でEGFR(1−525)(配列番号47)と結合し;およびインビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、前記NSCLC異種移植アッセイにおいて、EGFRに特異的ではないヒトIgG抗体と比較して少なくとも約50%の腫瘍増殖阻害率%(TGI%)で腫瘍増殖阻害する、ここで、前記抗hEGFR抗体又はその抗原結合部分と同一の用量と頻度でEGFRに非特異的なヒトIgG抗体を投与される、ものに関する。

0011

本発明のある種の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約1×10−6M〜約1×10−10MのKdでEGFR(1−525)(配列番号47)と結合する。

0012

本発明の他の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約1×10−6M〜約1×10−7MのKdでEGFR(1−525)(配列番号47)と結合する。

0013

ある種の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約8.2×10−9M以下のKdでEGFRvIII(配列番号33)と結合する。その他の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約8.2×10−9M〜約6.3×10−10MのKdでEGFRvIII(配列番号33)と結合する。所定の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約8.2×10−9M〜約2.0×10−9MのKdでEGFRvIII(配列番号33)と結合する。

0014

本発明の更に他の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、インビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、EGFRに非特異的なヒトIgG抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約60%阻害する。

0015

ある種の実施形態において、本発明はインビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、EGFRに非特異的なヒトIgG抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約70%阻害する抗体又はその抗原結合部分に関する。ある種の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、インビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、EGFRに非特異的なヒトIgG抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約80%阻害する。

0016

所定の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号12に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3ドメイン、配列番号11に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2ドメイン及び配列番号10に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1ドメインと;配列番号8に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3ドメイン、配列番号7に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2ドメイン及び配列番号6に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1ドメインとを含む。更に別の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。他の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号41に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び/又は配列番号43に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。別の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号15に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号13に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。別の実施形態では、前記抗体又はその抗原結合部分をアウリスタチンと結合させる。

0017

本発明は更に、ある種の実施形態において、本願に記載するもの等の抗体又はその抗原結合部分をコードする単離核酸を提供する。

0018

本発明は更に、ある種の実施形態において、配列番号40に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3ドメイン、配列番号39に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2ドメイン及び配列番号38に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1ドメインと;配列番号37に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3ドメイン、配列番号36に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2ドメイン及び配列番号35に記載のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1ドメインを含む抗hEGFR抗体又はその抗原結合部分を包含する。

0019

ある種の実施形態において、本発明は50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76及び78から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と;51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77及び79から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗hEGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。

0020

他の実施形態において、本発明は配列番号10、11及び12;配列番号16、17及び18;配列番号10、11及び19;配列番号20、11及び12;配列番号21、3及び22;配列番号16、17及び19;配列番号2、3及び4;配列番号10、3及び12;配列番号80、11及び18;配列番号80、3及び18;配列番号20、3及び12;配列番号80、11及び12;並びに配列番号81、11及び22から構成される群から選択される重鎖CDRセット(CDR1、CDR2及びCDR3)と;配列番号6、7及び8;配列番号23、24及び25;配列番号26、27及び28;配列番号29、30及び31;配列番号6、7及び84;配列番号82、83及び31;並びに配列番号82、27及び85から構成される群から選択される軽鎖CDRセット(CDR1、CDR2及びCDR3)を含む抗hEGFR抗体又はその抗原結合部分を包含する(但し、前記抗体又はその抗原結合部分が、配列番号2、3及び4の重鎖CDRセットと、配列番号6、7及び8の軽鎖CDRセットを同時に含むことはない。)。所定の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、配列番号41に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び/又は配列番号43に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。

0021

本発明の所定の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、ヒトIgG定常領域、ヒトIgM定常領域、ヒトIgE定常領域及びヒトIgA定常領域から構成される群から選択される重鎖免疫グロブリン定常領域を含む。所定の実施形態において、前記IgG定常領域はIgG1定常領域、IgG2定常領域、IgG3定常領域及びIgG4定常領域から構成される群から選択される。他の実施形態において、前記抗体は多重特異性抗体である。

0022

本発明の他の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド結合したFv、scFv、シングルドメイン抗体及びダイアボディを含む。

0023

本発明の更に他の実施形態では、前記抗体又はその抗原結合部分を造影剤と結合させる。本発明のある種の実施形態において、前記造影剤は、放射性標識物質酵素蛍光標識物質発光標識物質生物発光標識物質磁気標識物質及びビオチンから構成される群から選択される。本発明の他の実施形態において、前記放射性標識物質は、インジウムである。更に他の実施形態において、本発明は前記抗体又はその抗原結合部分と、医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物を包含する。

0024

本発明は更に、所定の実施形態では、本願に記載する抗体又はその抗原結合部分を少なくとも1個の薬物と結合させた抗体薬物コンジュゲート(ADC)を包含する。ある種の実施形態において、前記抗体は抗ヒト上皮成長因子受容体(抗hEGFR)抗体又はその抗原結合部分であり、アミノ酸配列CGADSYEMEEDGVRKC(配列番号45)内のエピトープに結合するか、又は競合結合アッセイにおいて上皮成長因子受容体変異体III(EGFRvIII)(配列番号33)との結合に関して第2の抗hEGFR抗体と競合し、ここで前記第2の抗EGFR抗体は、配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、;表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約1×10−6M以下の解離定数(Kd)でEGFR(1−525)(配列番号47)と結合し;およびインビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、前記NSCLC異種移植アッセイにおいて、EGFRに特異的ではないヒトIgG抗体と比較して少なくとも約50%の腫瘍増殖阻害率%(TGI%)で腫瘍増殖を阻害する、ここで、前記抗hEGFR抗体又はその抗原結合部分と同一の用量と頻度でEGFRに非特異的なヒトIgG抗体を投与される、本発明の1実施形態において、前記少なくとも1個の薬物は、抗アポトーシス剤有糸分裂阻害剤抗腫瘍性抗生物質免疫調節剤遺伝子治療用核酸アルキル化剤抗血管新生薬代謝拮抗剤ホウ素含有剤、化学療法剤ホルモン剤抗ホルモン剤コルチコステロイド感光性治療剤オリゴヌクレオチド放射性核種剤、放射線増感剤トポイソメラーゼ阻害剤及びチロシンキナーゼ阻害剤から構成される群から選択される。ある種の実施形態において、前記有糸分裂阻害剤は、ドラスタチン、アウリスタチン、メイタンシノイド及び植物アルカロイドである。ある種の実施形態において、前記薬物はドラスタチン、アウリスタチン、メイタンシノイド及び植物アルカロイドである。アウリスタチンの1例はモノメチルアウリスタチンF(MMAF)又はモノメチルアウリスタチンE(MMAE)である。メイタンシノイドの例としては、限定されないが、DM1、DM2、DM3及びDM4が挙げられる。ある種の実施形態において、前記抗腫瘍性抗生物質は、アクチノマイシンアントラサイクリンカリケアマイシン及びデュオカルマイシンから構成される群から選択される。ある種の実施形態において、前記アクチノマイシンはピロロベンゾジアゼピン(PBD)である。

0025

本発明は更に、所定の実施形態において、抗EGFR抗体をアウリスタチンと結合させたADCを包含し、前記抗体は配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と;配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインとを含む軽鎖可変領域を含む。1実施形態において、前記抗体は配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。更に別の実施形態において、本発明は配列番号15に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体又はその抗原結合部分を包含する。

0026

本発明は更に、所定の実施形態では、抗EGFR抗体を少なくとも1個の薬物(例えばMMAEが挙げられるが、これに限定するものではない。)と結合させたADCを包含し、薬物1〜8分子を抗体と結合させる。1実施形態では、薬物1〜4分子をADCの抗体と結合させる。1実施形態では、薬物2〜4分子をADCの抗体と結合させる。

0027

本発明は更に、所定の実施形態では、抗EGFR抗体を少なくとも1個の薬物と結合させたADCを包含し、前記薬物はマレイミドカプロイルバリンシトルリンリンカーを介して結合させている。別の実施形態において、前記薬物はマレイミドカプロイル、バリン−シトルリン、p−アミノベンジルオキシカルバモイル(PABA)リンカーを介して薬物と結合させている。

0028

本発明は更に、所定の実施形態では、リンカー(例えばマレイミドカプロイル、バリン−シトルリン)を介して抗EGFRIgG1抗体をモノメチルアウリスタチンE(MMAE)と共有結合させたADCを包含する。ある種の実施形態において、前記抗体は配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。ある種の実施形態では、MMAE1〜4分子を抗体と連結する。

0029

本発明は更に、所定の実施形態では、抗EGFRIgG1抗体をマレイミドカプロイル、バリン−シトルリン、p−アミノベンジルオキシカルバモイル−モノメチルアウリスタチンE(mc−vc−PABA−MMAE)と共有結合させたADCを包含し、前記抗体は配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含み、MMAE1〜4分子を前記抗体と連結する。ある種の実施形態において、前記抗体は配列番号15に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号13に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖とを含む。ある種の実施形態では、MMAE2〜4分子を前記抗体と連結する。ある種の実施形態では、図11に示すように前記EGFR抗体をmc−vc−PABA−MMAEと連結する。

0030

本発明は更に、所定の実施形態では、ヒトEGFRに特異的なIgG1抗体と、MMAEと、MMAEを前記抗体に共有結合させるリンカーを含むEGFR特異的ADCを包含する。ある種の実施形態において、前記抗体は配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と;配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインとを含む軽鎖可変領域を含む。1実施形態において、前記抗体は配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。更に別の実施形態において、本発明は配列番号15に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体又はその抗原結合部分を包含する。

0031

更に他の実施形態において、本発明は本願に記載するADCを複数含むADC混合物と医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物を包含する。ある種の実施形態において、前記ADC混合物は平均薬物対抗体比(DAR)が2〜4である。他の実施形態において、前記ADC混合物は各々DARが2〜8であるADCを含む。ある種の実施形態において、前記ADC混合物は平均薬物対抗体比(DAR)が約2.4〜約3.6である。

0032

ある種の実施形態において、本発明は癌をもつ対象の治療方法として、前記癌をもつ対象を治療するように、本願に記載する医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法を包含する。1実施形態において、前記癌は乳癌、肺癌、膠芽腫、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、頭頸部癌及び腎臓癌から構成される群から選択される。1実施形態において、前記癌は乳癌、肺癌、膠芽腫、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、大腸癌、頭頸部癌、中皮腫、腎臓癌、扁平上皮癌トリプルネガティブ乳癌及び非小細胞肺癌から構成される群から選択される。1実施形態において、前記癌は乳癌である。1実施形態において、前記癌は肺癌である。1実施形態において、前記癌は前立腺癌である。1実施形態において、前記癌は膵臓癌である。1実施形態において、前記癌は結腸癌である。1実施形態において、前記癌は頭頸部癌である。1実施形態において、前記癌は腎臓癌である。1実施形態において、前記癌は大腸癌である。1実施形態において、前記癌は中皮腫である。1実施形態において、前記癌は扁平上皮癌である。1実施形態において、前記癌はトリプルネガティブ乳癌である。1実施形態において、前記癌は非小細胞肺癌である。ある種の実施形態において、前記扁平上皮癌は肺扁平上皮癌又は頭頸部扁平上皮癌である。

0033

更に別の実施形態において、前記癌はEGFRの増幅を含み、又はEGFRを過剰発現する。ある種の実施形態において、前記癌はEGFR過剰発現を特徴とする。ある種の実施形態において、前記癌はEGFR増幅を特徴とする。

0034

本発明は更に、ある種の実施形態において、固形腫瘍をもつ対象における固形腫瘍増殖の阻害又は抑制方法として、前記固形腫瘍増殖を阻害又は抑制するように、前記固形腫瘍をもつ対象に本願に記載する医薬組成物を投与することを含む方法を包含する。ある種の実施形態において、前記固形腫瘍はEGFR過剰発現を特徴とする。ある種の実施形態において、前記固形腫瘍はEGFR増幅を特徴とする。

0035

本発明の1実施形態において、本発明は固形腫瘍をもつ対象における固形腫瘍増殖の阻害又は抑制方法として、前記固形腫瘍増殖を阻害又は抑制するように、前記固形腫瘍をもつ対象に有効量の本願に記載する抗体又はADCを投与することを含む方法を包含する。

0036

ある種の実施形態において、前記固形腫瘍はEGFRを発現する固形腫瘍又はEGFRvIII陽性固形腫瘍である。他の実施形態において、前記固形腫瘍は、非小細胞肺癌又は膠芽腫である。他の実施形態において、前記固形腫瘍は、扁平上皮癌である。

0037

本発明の1実施形態において、本発明は癌をもつ対象の治療方法として、抗EGFR抗体又はその抗原結合部分を少なくとも1個のアウリスタチンと結合させた有効量のADCを投与することを含む方法を提供し、前記抗EGFR抗体又はその抗原結合部分は、IgGアイソタイプであり、配列番号12に記載のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号11に記載のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号10に記載のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号8に記載のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号7に記載のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号6に記載のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。ある種の実施形態では、前記抗体又はその抗原結合部分をmc−vc−PABA−MMAEと連結している。

0038

ある種の実施形態において、本発明は癌をもつ対象の治療方法として、本願に記載する医薬組成物を別の薬剤又は別の療法と併用投与することを含む方法を包含する。ある種の実施形態において、前記別の薬剤は、抗PD1抗体(例えばペンブロリズマブ(Keytruda(R))ないしニボルマブ)、抗CTLA−4抗体(例えばイピリムマブ)、イブルチニブ、ドゥベリシブ、イデラリシブ、ベネトクラックス及びテモゾロミドから構成される群から選択される。ある種の実施形態において、前記別の療法は、放射線である。ある種の実施形態において、前記別の薬剤は、抗PD1抗体(例えばペンブロリズマブ(Keytruda(R))ないしニボルマブ)である。ある種の実施形態において、前記別の薬剤は、抗CTLA−4抗体(例えばイピリムマブ)である。ある種の実施形態において、前記別の薬剤はイブルチニブである。ある種の実施形態において、前記別の薬剤はドゥベリシブである。ある種の実施形態において、前記別の薬剤はイデラリシブである。ある種の実施形態において、前記別の薬剤はベネトクラックスである。ある種の実施形態において、前記別の薬剤はテモゾロミドである。

0039

本発明は更に、ある種の実施形態において、本願に記載するもの等の抗体又はその抗原結合部分をコードする単離核酸を提供する。更に、本発明は前記核酸を含むベクターと、前記ベクターを含む宿主細胞、例えば原核細胞又は真核細胞(例えば動物細胞原生動物細胞、植物細胞及び真菌細胞)を包含する。本発明の実施形態において、前記動物細胞は哺乳動物細胞昆虫細胞及び鳥類細胞から構成される群から選択される。1実施形態において、前記哺乳動物細胞はCHO細胞、COS細胞及びSp2/0細胞から構成される群から選択される。

0040

ある種の実施形態において、本発明は抗hEGFR抗体をアウリスタチンと結合させた抗hEGFR抗体薬物コンジュゲート(ADC)に関し、前記抗体は配列番号12のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3ドメイン、配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2ドメイン及び配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1ドメインと;配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3ドメイン、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2ドメイン及び配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1ドメインとを含む。1実施形態において、前記抗体は配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。更に別の実施形態において、前記抗体はIgG重鎖免疫グロブリン定常領域を含む。更に別の実施形態において、前記IgGは、IgG1又はIgG4重鎖免疫グロブリン定常領域である。

0041

1実施形態において、本発明は前記アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)又はモノメチルアウリスタチンE(MMAE)である、ADCを包含する。1実施形態において、本発明は前記アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)であるADCを包含する。1実施形態において、本発明は前記アウリスタチンが、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)である、ADCを包含する。

0042

別の実施形態において、本発明は配列番号15のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

0043

本発明の更に別の実施形態において、前記抗EGFR抗体はマレイミドカプロイル、バリン−シトルリン、p−アミノベンジルアルコール(mc−vc−PABA)を含むリンカーを介して前記アウリスタチンと共有結合している。

0044

1実施形態において、本発明は抗EGFRと放射性標識物質(例えばインジウム)を含むADCを包含する。

0045

1実施形態では、本願に記載する抗EGFR抗体を少なくとも1個のピロロベンゾジアゼピン(PBD)と共有結合させる。ある種の実施形態では、図21に示すように本願に開示する抗EGFR抗体をPBDと連結する(即ちSGD−1882)。

0046

所定の実施形態において、本発明は本願に記載するADCと医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物に関する。ある種の実施形態において、本発明は本願に記載するADCを含むADC混合物を含有する医薬組成物に関し、前記ADC混合物における平均薬物対抗体比(DAR)の範囲は2〜4である。ある種の実施形態において、前記ADC混合物における平均薬物対抗体比(DAR)の範囲は2.4〜3.6である。

0047

1実施形態において、本発明は抗hEGFR抗体薬物コンジュゲート(ADC)を含むADC混合物と医薬的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物に関し、前記ADC混合物は、平均薬物対抗体比(DAR)が2〜4であり、前記ADCは配列番号12のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3ドメイン、配列番号11のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2ドメイン及び配列番号10のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1ドメインと、配列番号8のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3ドメイン、配列番号7のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2ドメイン及び配列番号6のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1ドメインとを含む、抗hEGFR抗体にモノメチルアウリスタチンE(MMAE)を結合させたものである。

0048

1実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域は配列番号9に記載のアミノ酸配列を含み、前記抗EGFR抗体の軽鎖可変領域は配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む。

0049

本発明の他の実施形態において、前記抗体はIgG重鎖免疫グロブリン定常領域を含む。その他の実施形態において、本発明はIgG1又はIgG4重鎖免疫グロブリン定常領域を含む抗体を包含する。1実施形態において、本発明はIgG1アイソタイプである抗体を包含する。

0050

更に別の実施形態において、本発明は配列番号15に記載のアミノ酸配列を含む重鎖と、配列番号13のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体を包含する。1実施形態において、本発明はマレイミドカプロイル、val−cit、PABAリンカーによりMMAEを前記抗体と結合させる。

0051

本発明の1実施形態において、本発明は癌をもつ対象の治療方法として、前記癌をもつ対象を治療するように、本願に記載する抗体又はADCを含有する医薬組成物を前記対象に投与することを含む方法を提供する。1実施形態において、前記癌は乳癌、肺癌、膠芽腫、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、頭頸部癌及び腎臓癌から構成される群から選択される。1実施形態において、前記癌は乳癌、肺癌、膠芽腫、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、大腸癌、頭頸部癌、中皮腫、腎臓癌、扁平上皮癌、トリプルネガティブ乳癌及び非小細胞肺癌から構成される群から選択される。更に別の実施形態において、前記癌はEGFRの増幅を含み、又はEGFRを過剰発現する。1実施形態において、前記扁平上皮癌は肺扁平上皮癌又は頭頸部扁平上皮癌である。1実施形態において、前記癌はEGFRを過剰発現する癌である。1実施形態において、前記癌はEGFR増幅を特徴とする。1実施形態において、前記癌は乳癌である。1実施形態において、前記癌は肺癌である。1実施形態において、前記癌は前立腺癌である。1実施形態において、前記癌は膵臓癌である。1実施形態において、前記癌は結腸癌である。1実施形態において、前記癌は頭頸部癌である。1実施形態において、前記癌は腎臓癌である。1実施形態において、前記癌は大腸癌である。1実施形態において、前記癌は中皮腫である。1実施形態において、前記癌は扁平上皮癌である。1実施形態において、前記癌はトリプルネガティブ乳癌である。1実施形態において、前記癌は非小細胞肺癌である。ある種の実施形態において、前記扁平上皮癌は肺扁平上皮癌又は頭頸部扁平上皮癌である。

0052

また、ある種の実施形態において、本発明は固形腫瘍をもつ対象における固形腫瘍増殖の阻害又は抑制方法を提供し、前記方法は前記固形腫瘍増殖を阻害又は抑制するように、前記固形腫瘍をもつ対象に本願に記載する医薬組成物を投与することを含む。1実施形態において、前記固形腫瘍は、非小細胞肺癌又は膠芽腫である。更に別の実施形態において、前記固形腫瘍はEGFRvIII陽性腫瘍又はEGFRを発現する固形腫瘍である。更に別の実施形態において、前記固形腫瘍はEGFRを過剰発現する固形腫瘍である。更に別の実施形態において、前記固形腫瘍はEGFRが増幅している腫瘍である。1実施形態において、前記固形腫瘍はEGFRが増幅している非小細胞肺癌である。1実施形態において、前記固形腫瘍はEGFRが過剰発現している非小細胞肺癌である。1実施形態において、前記固形腫瘍はEGFRが増幅している膠芽腫である。1実施形態において、前記固形腫瘍はEGFRが過剰発現している膠芽腫である。

0053

ある種の実施形態において、本発明は投与を必要とする対象(例えば癌又は固形腫瘍をもつ対象)に本願に記載する医薬組成物を投与する併用療法を提供する。別の薬剤又は別の療法の投与と同時、投与前又は投与後に本願に記載する医薬組成物を投与することができる。ある種の実施形態において、前記別の薬剤は、抗PD1抗体、抗CTLA−4抗体、テモゾロミド、bcl−xl阻害剤及びニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)阻害剤から構成される群から選択される。更に他の実施形態において、前記別の薬剤は、化学療法剤である。ある種の実施形態において、前記別の療法は、放射線である。他の実施形態において、前記別の薬剤はイブルチニブ(Imbruvica(R),Pharmacyclics)である。他の実施形態において、前記別の薬剤はドゥベリシブである。他の実施形態において、前記別の薬剤はイデラリシブ(Zydelig(R),Gilead Sciences,Inc.)である。他の実施形態において、前記別の薬剤はベネトクラックス(ABT−199/GDC−0199,AbbVie,Inc.)である。ある種の実施形態において、前記別の薬剤は、抗PD1抗体(例えばペンブロリズマブ(Keytruda(R))ないしニボルマブ)である。ある種の実施形態において、前記別の薬剤は抗CTLA−4抗体(例えばイピリムマブ)である。ある種の実施形態において、前記別の薬剤はテモゾロミドである。

0054

ある種の実施形態において、本発明は本願に記載する抗体の抗原結合領域(例えばCDR)又は本願に記載するscFvを含むキメラ抗原受容体(CAR)に関する。ある種の実施形態において、本発明は、配列番号40に記載のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号39に記載のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号38に記載のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と;配列番号37に記載のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号36に記載のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号35に記載のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインとを含む重鎖可変領域を含むCARに関する。

0055

ある種の実施形態において、本発明は配列番号12に記載のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号11に記載のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号10に記載のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と;配列番号8に記載のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号7に記載のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号6に記載のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域を含むCARに関する。

図面の簡単な説明

0056

Ab1(配列番号1及び5)及びAbA(配列番号9及び5)の重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列を示す。VH領域及びVL領域内のCDR配列四角囲み、Ab1VH配列とAbA VH配列の不一致部分を影付きで示す。
Ab1(配列番号13及び14)及びAbA(配列番号13及び15)の全長軽鎖及び重鎖を示す。重鎖におけるAb1配列とAbA配列の不一致部分を影付きで示す。
複数のAb1変異体抗体をAb1及びAb2と比較したBiacore結合アッセイ親和性測定値をまとめた表である。EGFR(1−525)とEGFRvIIIを結合解析に使用した。図3に示すka(M−1s−1)は抗体が抗原と会合して抗体/抗原複合体を形成する際の速度定数を意味し、kd(s−1)は抗体が抗体/抗原複合体から解離する際の解離速度定数を意味し、Kd(M)は平衡解離定数を意味する。
FACS解析の結果をまとめたグラフであり、AbAはA431腫瘍細胞(ヒト扁平上皮癌細胞)との結合がAb1よりも改善されたが、Ab2と比較すると結合親和性が低いことが明らかである。
FACS競合アッセイの結果を示し、Ab1変異体抗体はAb1と同一のEGFRエピトープを認識することが分かる。
Ab1及びAb1変異体抗体とEGFR(1−525)の結合の結果をまとめたものである。黒丸はAb1又はAb2(対照)を表し、黒丸はAb1変異体抗体を表す。円はグループ1及びグループ2を表し、図7にデータをまとめる。
種々の細胞株でAb1及びAb1変異体抗体の活性をインビトロ試験したウェスタンブロット分析の結果を示す。SCC−15からの細胞(図7A)とH292細胞を実施例4に記載するような条件に暴露し、抗ホスホチロシンEGFR(pY EGFR)、抗EGFR(tot EGFR(全長EGFR))及び抗アクチン(アクチン)抗体を使用してウェスタンブロット分析により分析した。図7AはAb1、Ab2及びAb1変異体抗体がSCC−15細胞においてEGFRのEGF介在性チロシンリン酸化を阻害する能力を表す結果を示す。図7BはAb1、Ab2及びAb1変異体抗体がH292細胞においてEGFRのEGF介在性チロシンリン酸化を阻害する能力を表す結果を示す。
Ab1、Ab2及びAb1変異体を使用したpEGFRELISAアッセイの結果(図8A)と、A431阻害試験でAb2及びAbPと比較したAb1の阻害レベル図8B)をグラフにより示す。図8AのY軸は450nmにおける光学密度OD)である。
FACS結合アッセイを使用して野生型EGFRを発現する正常ヒト上皮角化細胞とAb1、Ab2及びAb1変異体抗体の結合を試験した結果をグラフにより示す。
AbA、AbG、AbK、AbM及びAbPがヒトNSCLC癌異種移植片において腫瘍増幅を阻害する能力をAb1、Ab2及びヒトIgG(huIgG)対照と比較したマウス異種移植片阻害アッセイの結果をグラフにより示す。矢印は各種抗体の投与時点を示す。
AbA−マレイミドカプロイル−vc−PABA−MMAEADC(本願では「AbA−vcMMAE」と称する。)の構造を示す。
AbA−vcMMAEの精製の疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)分析の結果を示す。
AbA−vcMMAEのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)分析の結果を示す。
抗EGFR ADCを使用した2種類のマウス異種移植片阻害アッセイの結果をグラフにより示す。図14AはヒトNSCLC癌異種移植片に由来するNCI−H1703細胞における腫瘍増幅の阻害を比較したマウス異種移植片阻害アッセイの結果を示し、AbA−vcMMAEの阻害がAb1及びAb1−mcMMAFADCと比較して増加していることが明らかである。図14BはヒトNSCLC癌異種移植片に由来するEBC−1細胞における腫瘍増幅の阻害を比較したマウス異種移植片阻害アッセイの結果を示し、AbA−vcMMAEの阻害がAb1及びAb1−mcMMAF ADCと比較して増加していることが明らかである。矢印は抗体の投与時点を示す。
抗EGFR ADCを使用したマウス異種移植片阻害アッセイの結果をグラフにより示す。図15AはNCI−H292細胞における腫瘍増殖の阻害を比較したマウス異種移植片阻害アッセイの結果を示し、精製AbA−vcMMAE(AbA−vcMMAEp)及びAbA−vcMMAEによる阻害が精製Ab1−vcMMAE(Ab1−vcMMAEp)、Ab1−vcMMAE、精製Ab1−mcMMAF ADC(Ab1−mcMMAFp)及びAb1−mcMMAF(3種類の対照と比較)と比較して増加していることが明らかである。図15BはNCI−H292細胞における腫瘍増殖の阻害を比較したマウス異種移植片阻害アッセイの結果を示し、AbA−vcMMAEの阻害活性が精製AbA−vcMMAE(AbA−vcMMAEp)と比較して増加し、AbA−vcMMAEの阻害活性が精製Ab1−vcMMAE(Ab1−vcMMAEp)、Ab1−vcMMAE、Ab1−mcMMAF及びAb1−mcMMAFpと比較して増加していることが明らかである。図15A及びBの分子の投与量は括弧内に示す(即ち3mg/kg又は6mg/kg)。矢印は抗体又はADCの投与時点を示す。図15の対照2はEGFRと結合しない抗破傷風毒素抗体である陰性対照を表す。
Ab1変異体重鎖可変領域(VH)ライブラリーデザイン図16A)及びAb1変異体軽鎖可変領域(VL)ライブラリーデザイン(図16B)のアミノ酸配列を示す。
EGFRの模式図であり、Ab1及びAb2が結合する領域を示す。
抗EGFR ADCを使用した(NCI−H292(NSCLC)細胞による)マウス異種移植片阻害アッセイの結果をグラフにより示す。分子の投与量を括弧内に示す(即ち3mg/kg又は6mg/kg)。矢印は抗体又はADCの投与時点を示す。
抗EGFR MMAE及びMMAF ADCを使用したマウス膠芽腫異種移植片阻害アッセイの結果をグラフにより示す。図19の分子の投与量を括弧内に示す(即ち1mg/kg)。矢印は抗体又はADCの投与時点を示す。図19の対照2はEGFRと結合しない抗破傷風毒素抗体である陰性対照を表す。
図20A及びBは111Inで標識したAbA、Ab1又は対照抗体を使用して2種類の腫瘍モデル(夫々SW48(図20A)及びEBC1(図20B)腫瘍モデル)でEGFRを発現する腫瘍による抗体取込み効率を比較した単一光子放射断層撮影SPECT)画像アッセイの結果をグラフにより示す。
マレイミドカプロイル−バリン−アラニンリンカーを介して抗体(Ab)と結合させたPBD二量体(SGD−1882)(全体をSGD−1910と称する。)の構造を示す。

0057

本発明の各種態様は抗EGFR抗体及び抗体フラグメント、抗EGFRADC、並びにその医薬組成物、更にこのような抗体及びフラグメントを作製するための核酸、組換え発現ベクター及び宿主細胞に関する。ヒトEGFRを検出するため、ヒトEGFR活性を(インビトロ又はインビボで)阻害するため、更に上皮癌、乳癌、大腸癌、頭頸部癌(例えば膠芽腫)、肺癌、腎臓癌、膵臓癌、中皮腫、扁平上皮癌(例えば肺扁平上皮癌又は頭頸部扁平上皮癌)、トリプルネガティブ乳癌、非小細胞肺癌及び前立腺癌等の癌を治療するために本願に記載する抗体又はADCを使用する方法も本発明の対象とする。

0058

I.定義
本発明を理解し易くするために、先ず所定の用語を定義する。更に、当然のことながら、パラメータ数値又は数値範囲を記載する場合には、記載する数値の中間の数値及び範囲も本発明に含むものとする。

0059

「抗上皮成長因子(EGF)受容体抗体」又は「抗EGFR抗体」なる用語は本願では同義に使用し、EGFRと特異的に結合する抗体を意味する。着目抗原(即ちEGFR)と「結合する」抗体とは、前記抗原を発現する細胞を標的とするのに有用となるような十分な親和性で前記抗原と結合することができる抗体である。好ましい実施形態において、前記抗体はヒトEGFR(hEGFR)と特異的に結合する。抗EGFR抗体の例は下記実施例1に開示する。特に指定しない限り、「抗EGFR抗体」なる用語は野生型EGFR又はEGFRの任意変異体(例えばEGFRvIII)と結合する抗体を意味するものとする。

0060

野生型ヒトEGFRのアミノ酸配列を配列番号32として以下に示し、同配列中、シグナルペプチドアミノ酸残基1−24)は下線で示し、細胞外領域のアミノ酸残基(ECD,アミノ酸残基25−645)は太字で強調する。EGFRの短縮型野生型ECD(本願ではEGFR(1−525)とも言う。)は配列番号47に対応し、配列番号32のアミノ酸と等価である。野生型EGFRの成熟型はこのタンパク質からシグナルペプチドを除いたもの、即ち配列番号32のアミノ酸残基25〜1210に対応する。

0061

0062

シグナル配列(下線部)を含めたヒトEGFRのECDのアミノ酸配列を配列番号34として以下に示す。

0063

0064

EGFRの全体構造図17に示す。EGFRのECDは4領域からなる(Cochran et al.(2004)J.Immunol.Methods,287,147−158)。領域I及びIIIはリガンドの高親和性結合部位の形成に寄与することが示唆されている。領域II及びIVはシステインリッチラミニン様領域であり、タンパク質折畳みを安定化させ、予想されるEGFR二量化界面を含む。

0065

EGFR遺伝子増幅を伴う遺伝子再構成の結果としてEGFR変異体が生じると思われる。

0066

ヒト癌に最も一般的に存在するEGFRの変異体はEGFRvIIIである(Kuan et al. Endocr Relat Cancer.8(2):83−96(2001))。遺伝子増幅過程でEGFRの細胞外領域に267アミノ酸の欠失が生じ、融合接合部にグリシン残基が挿入される。従って、EGFRvIIIは野生型EGFRの細胞外領域のアミノ酸6〜273を欠失し、接合部にグリシン残基が挿入されている。EGFRのEGFRvIII変異体は細胞外領域の267アミノ酸残基を欠失し、欠失接合部にグリシンが挿入されている。EGFRvIIIアミノ酸配列を配列番号33として以下に示す(ECDは太字で強調し、配列番号46に対応し、シグナル配列は下線で示す。)。

0067

0068

EGFRvIIIは構成的シグナル伝達によりリガンド非依存的腫瘍進行に寄与する。EGFRvIIIは正常組織で発現されることは知られていない(Wikstrand et al.Cancer Research 55(14):3140−3148(1995);Olapade−Olaopa et al.Br J Cancer.82(1):186−94(2000))が、乳癌、神経膠腫、NSCL癌、卵巣癌及び前立腺癌を含む腫瘍細胞で顕著な発現を示す(Wikstrand et al.Cancer Research 55(14):3140−3148(1995);Ge et al.Int J Cancer.98(3):357−61(2002);Wikstrand et al.Cancer Research 55(14):3140−3148(1995);Moscatello et al.Cancer Res.55(23):5536−9(1995);Garcia de Palazzo et al.Cancer Res.53(14):3217−20(1993);Moscatello et al.Cancer Res.55(23):5536−9(1995);及びOlapade−Olaopa et al.2(1):186−94(2000))。

0069

本願で使用する「EGFRの生物活性」とはEGFRの全ての固有の生物的性質を意味し、限定されないが、上皮成長因子(EGF)との結合、腫瘍増殖因子α(TGFα)との結合、ホモ二量化、JAK2キナーゼ活性の活性化、MAPKキナーゼ活性の活性化、及び膜貫通型受容体タンパク質チロシンキナーゼ活性の活性化が挙げられる。

0070

抗体又はADCと第2の化学種の相互作用に関して本願で使用する「特異的結合」又は「特異的に結合する」なる用語はこの相互作用が前記化学種上の特定の構造(例えば抗原決定基又はエピトープ)の存在に依存することを意味し、例えば、抗体はタンパク質一般を認識するのではなく、特定のタンパク質構造を認識してこれと結合する。抗体又はADCがエピトープ「A」に特異的である場合、標識した「A」と前記抗体を含有する反応混合物中にエピトープA(又は遊離した未標識のA)を含む分子が存在するならば、標識したAが前記抗体又はADCと結合する量は減少する。

0071

本願で使用する「hEGFRと特異的に結合する」又は「hEGFRとの特異的結合」なる表現は抗EGFR抗体又はADCがAb1又はAb1 ADCと比較して同等以上の親和性でhEGFRと相互作用できることを意味する。

0072

本願で使用する「EGFR(1−525)との特異的結合」又は「EGFR(1−525)と特異的に結合する」なる用語はEGFR(1−525)と結合し、表面プラズモン共鳴法により測定した場合の解離定数(KD)が2.3×10−6M以下である抗体又はADCを意味する。

0073

「抗体」なる用語は、一般に2本の重(H)鎖と2本の軽(L)鎖の4本のポリペプチド鎖から構成される免疫グロブリンIg)分子、又はIg分子の本質的な標的結合特徴を保持するその任意の機能的フラグメント突然変異体、変異体もしくは誘導体広義に意味する。このような突然変異体、変異体又は誘導体抗体フォーマットは当分野で公知である。その非限定的な実施形態について以下に説明する。

0074

全長抗体において、各重鎖は重鎖可変領域(本願ではHCVR又はVHと略称する。)と重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域はCH1、CH2及びCH3の3個のドメインから構成される。各軽鎖は軽鎖可変領域(本願ではLCVR又はVLと略称する。)と軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は1個のドメインCLから構成される。VH及びVL領域は更に相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域とその間に配置されたフレームワーク領域(FR)と呼ばれる保存度の高い領域に区分することができる。各VH及びVLはアミノ末端からカルボキシ末端に向かってFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順に配置された3個のCDRと4個のFRから構成される。免疫グロブリン分子は任意タイプ(例えばIgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)及びクラス(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスとすることができる。

0075

本願で使用する抗体の「抗原結合部分」(又は単に「抗体部分」)なる用語は抗原(例えばhIL−13)と特異的に結合する能力を保持する抗体の1個以上のフラグメントを意味する。全長抗体のフラグメントにより抗体の抗原結合機能を実施できることが示されている。このような抗体の実施形態は2種以上の異なる抗原と特異的に結合する二重特異性デュアル特異性又は多重特異性フォーマットでもよい。抗体の「抗原結合部分」なる用語に含まれる結合フラグメントの例としては、(i)VL、VH、CL及びCH1ドメインから構成される1価フラグメントであるFabフラグメント;(ii)ヒンジ領域でジスルフィド橋により連結された2個のFabフラグメントからなる2価フラグメントであるF(ab’)2フラグメント;(iii)VHドメインとCH1ドメインから構成されるFdフラグメント;(iv)抗体のシングルアームのVLドメインとVHドメインから構成されるFvフラグメント;(v)単一可変ドメインから構成されるdAbフラグメント(本願に援用するWard et al,(1989)Nature 341:544−546,Winter et al.,PCT公開WO90/05144A1);並びに(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が挙げられる。更に、FvフラグメントのVL及びVHの2つのドメインは別々の遺伝子によりコードされるが、組換え法を使用して合成リンカーにより結合し、VL領域とVH領域が対合して1価分子を形成する1本のタンパク鎖として作製することができる(1本鎖Fv(scFv)と言う;例えばBird et al.(1988)Science 242:423−426;及びHuston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883参照。)。このような1本鎖抗体も抗体の「抗原結合部分」なる用語に含むものとする。本発明のある種の実施形態では、scFv分子融合タンパク質に組込んでもよい。ダイアボディ等の他の形態の1本鎖抗体も含む。ダイアボディはVHドメインとVLドメインが1本のポリペプチド鎖上で発現される2価の二重特異性抗体であるが、非常に短いリンカーを使用するため、同一鎖上の2つのドメイン間で対合することができず、これらのドメインは別の鎖の相補性ドメインと対合し、2つの抗原結合部位を形成する(例えばHolliger,P.,et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−6448;Poljak,R.J.,et al.(1994)Structure 2:1121−1123参照。)。このような抗体結合部分は当分野で公知である(Kontermann and Dubel eds.,Antibody Engineering(2001)Springer−Verlag.New York.790 pp.(ISBN 3−540−41354−5)。

0076

本願で使用する「抗体コンストラクト」なる用語はリンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常領域に連結された1個以上の本発明の抗原結合部分を含むポリペプチドを意味する。リンカーポリペプチドはペプチド結合により結合した2個以上のアミノ酸残基を含み、1個以上の抗原結合部分と連結するために使用される。このようなリンカーポリペプチドは当分野で周知である(例えばHolliger,P.,et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−6448;Poljak,R.J.,et al.(1994)Structure 2:1121−1123参照。)。免疫グロブリン定常領域とは重鎖又は軽鎖定常領域を意味する。ヒトIgG重鎖及び軽鎖定常領域アミノ酸配列の例は当分野で公知であり、以下の通りである。

0077

0078

更に、抗体又はその抗原結合部分は、前記抗体又はその抗原結合部分と1個以上の他のタンパク質又はペプチドの共有的又は非共有的結合により形成されるより大きな免疫接着分子の一部でもよい。このような免疫接着分子の例としてはストレプトアビジンコア領域を使用して形成される四量体scFv分子(Kipriyanov,S.M.,et al.(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93−101)や、システイン残基マーカーペプチド及びC末端ポリヒスチジンタグを使用して形成される2価ビオチン化scFv分子(Kipriyanov,S.M.,et al.(1994)Mol.Immunol.31:1047−1058)が挙げられる。Fab及びF(ab’)2フラグメント等の抗体部分は夫々全長抗体のパパイン又はペプシン消化等の慣用技術を使用して全長抗体から作製することができる。更に、抗体、抗体部分及び免疫接着分子は本願に記載するような標準組換えDNA技術を使用して取得することができる。

0079

本願で使用する「単離抗体」とは異なる抗原特異性をもつ他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する(例えばEGFRと特異的に結合する単離抗体はEGFR以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない。)。しかし、EGFRと特異的に結合する単離抗体は他の抗原(例えば他の種に由来するEGFR分子)と交差反応性をもつ場合がある。更に、単離抗体は他の細胞材料及び/又は化学物質を実質的に含まない場合がある。

0080

ヒト化抗体」なる用語は非ヒト種(例えばマウス)に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、VH及び/又はVL配列の少なくとも一部が「ヒト様」の程度を増すように、即ちヒト生殖細胞系列可変配列との類似性を増すように改変された抗体を意味する。特に、「ヒト化抗体」なる用語は着目抗原と免疫特異的に結合し、実質的にヒト抗体のアミノ酸配列をもつフレームワーク(FR)領域と、実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列をもつ相補性決定領域(CDR)を含む抗体又はその変異体、誘導体、アナログもしくはフラグメントである。CDRに関連して本願で使用する「実質的に」なる用語は非ヒト抗体CDRのアミノ酸配列と少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は少なくとも99%一致するアミノ酸配列をもつCDRを意味する。ヒト化抗体はCDR領域の全部又は実質的に全部が非ヒト免疫グロブリン(即ちドナー抗体)のCDR領域に対応し、フレームワーク領域の全部又は実質的に全部がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域である少なくとも1個、典型的には2個の可変ドメイン(Fab、Fab’、F(ab’)2、FabC、Fv)の実質的に全部を含む。好ましくは、ヒト化抗体は更に免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。所定の実施形態において、ヒト化抗体は軽鎖と重鎖の少なくとも可変領域を含む。抗体は更に重鎖のCH1、ヒンジ、CH2、CH3及びCH4領域を含んでいてもよい。所定の実施形態において、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみを含む。他の実施形態において、ヒト化抗体はヒト化重鎖のみを含む。特定の実施形態において、ヒト化抗体は軽鎖のヒト化可変領域及び/又はヒト化重鎖のみを含む。

0081

ヒト化抗体はIgM、IgG、IgD、IgA及びIgEを含む任意クラスの免疫グロブリンと、限定されないが、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を含む任意アイソタイプから選択することができる。ヒト化抗体は2種以上のクラス又はアイソタイプに由来する配列を含むことができ、当分野で周知の技術を使用して所望のエフェクター機能を最適化するように特定の定常領域を選択することができる。

0082

「Kabatナンバリング」、「Kabat定義」及び「Kabatラベリング」なる用語を本願では同義に使用する。これらの用語は当分野で認知されており、抗体又はその抗原結合部分の重鎖及び軽鎖可変領域において他のアミノ酸残基よりも可変度の高い(即ち超可変性の)アミノ酸残基のナンバリングシステムを意味する(Kabat et al.(1971)Ann.NY Acad,Sci.190:382−391及びKabat,E.A.,et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH Publication No.91−3242)。重鎖可変領域では、超可変領域はCDR1のアミノ酸31〜35位、CDR2のアミノ酸50〜65位、及びCDR3のアミノ酸95〜102位に位置する。軽鎖可変領域では、超可変領域はCDR1のアミノ酸24〜34位、CDR2のアミノ酸50〜56位、及びCDR3のアミノ酸89〜97位に位置する。

0083

本願で使用する「CDR」なる用語は抗体可変領域配列内の相補性決定領域を意味する。重鎖(HC)と軽鎖(LC)の可変領域の各々に3個ずつCDRが存在し、可変領域の各々でCDR1、CDR2及びCDR3(又は特定的にHC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2及びLC CDR3)と呼称される。本願で使用する「CDRセット」なる用語は抗原と結合することが可能な単一の可変領域に存在する3個1組のCDRを意味する。これらのCDRの厳密な境界は種々のシステムにより種々に定義されている。Kabatにより記載されているシステム(Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987)及び(1991))は抗体の任意可変領域に適用可能な明確な残基ナンバリングシステムを規定するのみならず、3個のCDRを定義する厳密な残基境界を規定する。これらのCDRをKabat CDRと言う場合がある。Chothiaら(Chothia & Lesk,J.Mol.Biol.196:901−917(1987)及びChothia et al.,Nature 342:877−883(1989))はKabat CDR内の所定のサブ部分がアミノ酸配列レベルでは多様性に富んでいるにも拘わらず、ほぼ同一のペプチド主鎖構造をとることを見いだした。これらのサブ部分はL1、L2及びL3又はH1、H2及びH3と呼ばれ、ここで「L」及び「H」は夫々軽鎖領域と重鎖領域を表す。これらの領域をChothia CDRと呼ぶ場合があり、その境界はKabat CDRとオーバーラップする。Kabat CDRとオーバーラップするCDRを定義する他の境界はPadlan(FASEB J.9:133−139(1995))とMacCallum(J Mol Biol 262(5):732−45(1996))により記載されている。上記システムの1種に厳密には従わないとしても、Kabat CDRとオーバーラップする更に他のCDR境界定義もあり、特定残基もしくは残基群又はCDR全体が抗原結合に有意に影響を与えないという予想又は実験結果に基づいて短くしたものや長くしたものがある。本願で使用する方法はこれらのシステムのいずれに従って定義されたCDRも使用することができるが、好ましい実施形態はKabat又はChothiaの定義によるCDRを使用する。

0084

本願で使用する「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」なる用語は可変領域からCDRを除いた残りの配列を意味する。CDR配列の厳密な定義は種々のシステムにより決定することができるので、フレームワーク配列の意味は相応に種々に解釈される。6個のCDR(軽鎖のCDR−L1、CDR−L2及びCDR−L3と重鎖のCDR−H1、CDR−H2及びCDR−H3)は軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域を更に各鎖で4個のサブ領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)に分割し、CDR1はFR1とFR2の間、CDR2はFR2とFR3の間、CDR3はFR3とFR4の間に位置する。個々のサブ領域をFR1、FR2、FR3又はFR4と特定せずに、単にフレームワーク領域と言う場合もあるが、その場合には、1本の天然型免疫グロブリン鎖の可変領域内のFR全体を意味する。本願で使用するFRとは4個のサブ領域の1個を意味し、FRsとはフレームワーク領域を構成する4個のサブ領域の2個以上を意味する。

0085

ヒト化抗体のフレームワーク領域とCDR領域は親配列に厳密に対応する必要はなく、例えばその部位のCDR又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレームワークのいずれにも対応しないように少なくとも1個のアミノ酸残基の置換、挿入及び/又は欠失によりドナー抗体CDR又はコンセンサスフレームワークに突然変異を誘発してもよい。しかし、好ましい1実施形態において、このような突然変異は広範囲にならない。通常では、ヒト化抗体残基の少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%が親FR及びCDR配列に対応する。本願で使用する「コンセンサスフレームワーク」なる用語はコンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を意味する。本願で使用する「コンセンサス免疫グロブリン配列」なる用語は近縁免疫グロブリン配列のファミリー最高頻度で存在するアミノ酸(又はヌクレオチド)から形成される配列を意味する(例えばWinnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany 1987参照。)。免疫グロブリンファミリーにおいて、コンセンサス配列の各位置はこのファミリーでこの位置に最高頻度で存在するアミノ酸により占められる。2種類のアミノ酸が同等の高頻度で存在する場合には、どちらをコンセンサス配列に加えてもよい。

0086

ペプチド又はポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列一致度百分率(%)」は特定ペプチド又はポリペプチド配列と候補配列整列させ、保存置換を配列一致度の一部として考慮せずに必要に応じて最大の配列一致度百分率に達するようにギャップを導入した後にこのペプチド又はポリペプチド配列中のアミノ酸残基と一致する候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列一致度を決定する目的での整列は例えば、BLAST、BLAST−2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェア等の公共入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して当業者に公知の各種方法により実施することができる。当業者は比較する配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するために必要な任意アルゴリズムを含めてアラインメントの測定に適したパラメータを決定することができる。1実施形態において、本発明は配列番号1〜31、35〜40又は50〜85のいずれか1種に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%又は少なくとも99%の一致度をもつアミノ酸配列を包含する。

0087

多価抗体」なる用語は本願では2個以上の抗原結合部位を含む抗体の意味で使用する。ある種の実施形態において、多価抗体は3個以上の抗原結合部位をもつように作製することができ、一般には天然型抗体以外のものである。

0088

「多重特異性抗体」なる用語は2種以上の無関係の抗原と結合することが可能な抗体を意味する。1実施形態において、多重特異性抗体は2種の無関係の抗原と結合することが可能な二重特異性抗体であり、例えばEGFR(例えばEGFRvIII)とCD3とに結合する二重特異性抗体又はその抗原結合部分である。

0089

「デュアル可変ドメイン」又は「DVD」なる用語は本願では同義に使用し、2個以上の抗原結合部位を含み、四価以上の結合性タンパク質である抗原結合性タンパク質である。このようなDVDは単一特異性(即ち1種の抗原と結合可能)でもよいし、多重特異性(即ち2種以上の抗原と結合可能)でもよい。2本の重鎖DVDポリペプチドと2本の軽鎖DVDポリペプチドを含むDVD結合性タンパク質をDVDIgと呼ぶ。DVDIgの各半分は重鎖DVDポリペプチド及び軽鎖DVDポリペプチドと、2個の抗原結合部位を含む。各結合部位は重鎖可変領域と軽鎖可変領域を含み、抗原結合部位1個当たり合計6個のCDRが抗原結合に関与する。1実施形態では、本願に記載するCDRを抗EGFRDVDで使用する。

0090

「キメラ抗原受容体」又は「CAR」なる用語は少なくとも(1)抗原結合領域(例えば抗体の重鎖又は軽鎖可変領域)と、(2)CARをT細胞に固定するための膜貫通領域と、(3)1個以上の細胞内シグナル伝達領域を含む組換えタンパク質を意味する。

0091

「活性」なる用語は抗体(例えばhEGFR抗原と結合する抗hEGFR抗体)もしくはADCの抗原との結合特異性/親和性及び/又は抗体(例えばhEGFRと結合してhEGFRの生物活性を阻害する抗hEGFR抗体)の中和力価等の活性を包含し、例えばEGFRを発現する細胞株(例えばヒト肺癌細胞株H292)におけるEGFRのリン酸化の阻害、又はEGFRを発現する細胞株(例えばヒトH292肺癌細胞、ヒトH1703肺癌細胞株又はヒトEBC1肺癌細胞)の増殖の阻害が挙げられる。

0092

本願で使用する「非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイ」なる用語は抗EGFR抗体又はADCが腫瘍増殖(例えば更なる増殖)を阻害できるか否か及び/又は免疫不全マウスへのNSCLC細胞移植に起因する腫瘍増殖を抑制できるか否かを調べるために使用されるインビボアッセイを意味する。NSCLC異種移植アッセイは腫瘍が所望のサイズ(例えば200〜250mm3)まで増殖するようにNSCLC細胞を免疫不全マウスに移植後、抗体又はADCを前記マウスに投与し、抗体又はADCが腫瘍増殖を阻害及び/又は抑制できるか否かを調べる。ある種の実施形態では、対照抗体、例えば腫瘍細胞と特異的に結合しないヒトIgG抗体(又はその集合)、例えば癌に関連しない抗原に特異的な抗体又は非癌性材料(例えば正常ヒト血清)から得られる抗体と比較した腫瘍増殖阻害百分率(%TGI)により前記抗体又はADCの活性を測定する。このような実施形態では、抗体(又はADC)と対照抗体を同一用量、同一頻度及び同一経路でマウスに投与する。1実施形態において、NSCLC異種移植アッセイで使用されるマウスは重症複合免疫不全症(SCID)マウス及び/又は無胸腺CD−1ヌードマウスである。NSCLC異種移植アッセイで使用することができるNSCLC細胞の例としては、限定されないが、H292細胞(例えばNCIH292[H292](ATCC(R)CRL1848(TM))が挙げられる。

0093

「エピトープ」なる用語は抗体又はADCが結合する抗原の領域を意味する。ある種の実施形態において、エピトープ決定基はアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル等の化学的に活性な表面分子群を含み、ある種の実施形態では、特定の三次元構造特徴及び/又は特定の電荷特徴をもつ場合がある。ある種の実施形態では、タンパク質及び/又は巨大分子の複雑な混合物中でその標的抗原優先的に認識する場合に抗体は抗原と特異的に結合すると言う。特定の実施形態において、本発明の抗体は(hEGFRの成熟形のアミノ酸残基287〜302に対応する)アミノ酸配列CGADSYEMEEDGVRKC(配列番号45)により表されるエピトープと結合する。

0094

本願で使用する「表面プラズモン共鳴」なる用語は例えばBIAcoreシステム(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,スウェーデン及びPiscataway,NJ)を使用してバイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変化の検出によりリアルタイム生体特異的相互作用の解析を可能にする光学現象を意味する。詳細な説明については、Jonsson,U.,et al.(1993)Ann.Biol.Clin.51:19−26;Jonsson,U.,et al.(1991)Biotechniques 11:620−627;Johnsson,B.,et al.(1995)J.Mol.Recognit.8:125−131;及びJohnnson,B.,et al.(1991)Anal.Biochem.198:268−277参照。1実施形態において、表面プラズモン共鳴は実施例2に記載する方法に従って測定される。

0095

本願で使用する「kon」又は「ka」なる用語は抗体が抗原と会合して抗体/抗原複合体を形成する際の速度定数を意味するものである。

0096

本願で使用する「koff」又は「kd」なる用語は抗体が抗体/抗原複合体から解離する際の解離速度定数を意味するものである。

0097

本願で使用する「KD」なる用語は特定の抗体−抗原相互作用(例えばAbA抗体とEGFR)の平衡解離定数を意味するものである。KDはka/kdにより計算される。

0098

本願で使用する「競合結合」なる用語は第3の分子(例えば抗原)上の結合部位に関して第1の抗体が第2の抗体と競合する状況を意味する。1実施形態では、FACS解析を使用して2種の抗体間の競合結合を測定する。

0099

「競合結合アッセイ」なる用語は2種以上の抗体が同一エピトープと結合するか否かを判定するために使用されるアッセイである。1実施形態において、競合結合アッセイは標識抗体蛍光シグナル非標識抗体の導入により低下するか否かを調べることにより、2種以上の抗体が同一エピトープと結合するか否かを判定するために使用される競合蛍光活性セルソーティング(FACS)アッセイであり、同一エピトープに関して競合している場合には蛍光レベルが低下する。競合結合FACSアッセイの1例を実施例3に示し、(EGFRvIIIを発現する)U87MG細胞を使用した競合FACSアッセイについて記載する。

0100

本願で使用する「標識抗体」なる用語は結合性タンパク質(例えば抗体)の同定を可能にする標識物質を組込んだ抗体又はその抗原結合部分を意味する。好ましくは、標識物質は検出可能なマーカーであり、例えば放射性標識アミノ酸を組込む方法や、標識アビジン(例えば光学的方法もしくは比色法により検出可能な蛍光マーカー又は酵素活性を付加したストレプトアビジン)により検出可能なビオチニル部分をポリペプチドに結合する方法が挙げられる。ポリペプチドの標識物質の例としては限定されないが、放射性同位体ないし放射性核種(例えば3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho又は153Sm)、蛍光標識物質(例えばFITCローダミン及びランタニド蛍光体)、酵素標識物質(例えば西ワサビペルオキシダーゼルシフェラーゼアルカリホスファターゼ)、化学発光マーカー、ビオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えばロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメインエピトープタグ)、及び磁性物質(例えばガドリニウムキレート剤)が挙げられる。

0101

「抗体薬物コンジュゲート」又は「ADC」なる用語は抗体又はその抗原結合フラグメント等の結合性タンパク質を1個以上の化学的薬物(本願では薬剤とも言う。)と化学的に連結したものを意味し、このような薬物は場合により治療剤又は細胞毒性剤でもよい。好ましい1実施形態において、ADCは抗体と、細胞毒性薬又は治療薬と、前記薬物を前記抗体に結合又は連結させるリンカーを含む。ADCは通常では1〜8の任意数の薬物を抗体に結合しており、2、4、6又は8の薬物負荷種が挙げられる。ADCに含むことができる薬物の非限定的な例は有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、免疫調節剤、遺伝子治療用ベクター、アルキル化剤、抗血管新生薬、代謝拮抗剤、ホウ素含有剤、化学療法剤、ホルモン剤、抗ホルモン剤、コルチコステロイド、感光性治療剤、オリゴヌクレオチド、放射性核種剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤及び放射線増感剤である。

0102

「抗上皮成長因子抗体薬物コンジュゲート」、「抗EGFR抗体薬物コンジュゲート」又は「抗EGFRADC」なる用語は本願では同義に使用され、EGFRと特異的に結合する抗体を1個以上の化学物質と結合させたADCを意味する。1実施形態において、前記抗EGFR ADCは抗体AbAをアウリスタチン(例えばMMAE又はMMAF)と結合させたものである。抗体AbAの軽鎖と重鎖に対応するアミノ酸配列を夫々配列番号13及び配列番号15に示す。

0103

本願で使用する「アウリスタチン」なる用語は有糸分裂阻害剤のファミリーを意味する。アウリスタチン誘導体も「アウリスタチン」なる用語の定義に含まれる。アウリスタチンの例としては、限定されないが、アウリスタチンE(AE)、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、及びドラスタチンの合成アナログが挙げられる。1実施形態では、本願に記載する抗EGFR抗体をアウリスタチンと結合させ、抗EGFRADCを形成する。

0104

本願で使用する「AbA−vcMMAE」なる用語はマレイミドカプロイル、バリン−シトルリン、p−アミノベンジルオキシカルバモイル(PABA)リンカーを介して抗体AbAをモノメチルアウリスタチンE(MMAE)と結合させたADCの意味で使用する。AbA−vcMMAEを図11に示す。

0105

本願で使用する「mcMMAF」なる用語はマレイミドカプロイル−モノメチルアウリスタチンF(MMAF)のリンカー/薬物組合せの意味で使用する。

0106

「薬物対抗体比」又は「DAR」なる用語はADCの抗体に結合した薬物(例えばアウリスタチン)の数を意味する。ADCのDARは1〜8とすることができるが、抗体上の連結部位数に応じてそれ以上(例えば10)とすることも可能である。DARなる用語は個々の抗体に負荷される薬物の数の意味で使用する場合もあるし、あるいは1群のADCの平均DARの意味で使用する場合もある。

0107

本願で使用する「望ましくないADC種」なる用語は薬物負荷数の異なるADC種から分離すべき任意薬物負荷種を意味する。1実施形態において、望ましくないADC種なる用語は6以上の薬物負荷種、即ちDAR6、DAR7、DAR8及びDAR8超(即ち6、7、8又は8超の薬物負荷種)等のDARが6以上のADCを意味することができる。別の実施形態において、望ましくないADC種なる用語は8以上の任意薬物負荷種、即ちDAR8及びDAR8超(即ち8又は8超の薬物負荷種)等のDARが8以上のADCを意味することができる。

0108

本願で使用する「ADC混合物」なる用語は不均一なDAR分布のADCを含有する組成物を意味する。1実施形態において、ADC混合物は、DAR分布が1〜8、例えば2、4、6及び8(即ち2、4、6及び8の薬物負荷種)のADCを含有する。特に、1、3、5及び7のDARも混合物に含むような分解生成物でもよい。更に、混合物内のADCは、DARが8超でもよい。ADC混合物は分子鎖間ジスルフィド還元後に結合させることにより得られる。1実施形態において、ADC混合物は、DARが4以下(即ち4以下の薬物負荷種)のADCと、DARが6以上(即ち6以上の薬物負荷種)のADCを併有する。

0109

「癌」なる用語は無制御な細胞増殖を典型的な特徴とする哺乳動物生理的状態を意味又は表現するものである。癌の例としては、限定されないが、癌腫リンパ腫芽細胞腫肉腫及び白血病又はリンパ系悪性腫瘍が挙げられる。このような癌のより具体的な例としては、膠芽腫、非小細胞肺癌、肺癌、結腸癌、大腸癌、頭頸部癌、乳癌(例えばトリプルネガティブ乳癌)、膵臓癌、扁平上皮腫瘍、扁平上皮癌(例えば肺扁平上皮癌又は頭頸部扁平上皮癌)、肛門癌、皮膚癌及び外陰癌が挙げられる。1実施形態では、EGFR遺伝子の増幅により、EGFRの短縮型であるEGFRvIIIを発現する腫瘍をもつ患者に本発明の抗体又はADCを投与する。1実施形態では、EGFRを過剰発現する可能性のある固形腫瘍をもつ患者に本発明の抗体又はADCを投与する。1実施形態では、扁平上皮非小細胞肺癌(NSCLC)をもつ患者に本発明の抗体又はADCを投与する。1実施形態では、進行固形腫瘍を含む固形腫瘍をもつ患者に本発明の抗体又はADCを投与する。

0110

本願で使用する「EGFRを発現する腫瘍」なる用語はEGFRタンパク質を発現する腫瘍を意味する。1実施形態において、腫瘍におけるEGFR発現は腫瘍細胞膜免疫組織化学染色を使用して判定され、腫瘍試料中でバックグラウンドレベルを上回る免疫組織化学染色が検出されるならば、この腫瘍はEGFRを発現する腫瘍であると判断される。腫瘍におけるEGFRの発現の検出方法は当分野で公知であり、例えばEGFR pharmDx(TM)Kit(Dako)が挙げられる。一方、「EGFR陰性腫瘍」は免疫組織化学技術により測定した場合に、腫瘍試料中でバックグラウンドを上回るEGFR膜染色のない腫瘍として定義される。

0111

本願で使用する「EGFRvIII陽性腫瘍」なる用語はEGFRvIIIタンパク質を発現する腫瘍を意味する。1実施形態において、腫瘍におけるEGFRvIII発現は腫瘍細胞膜の免疫組織化学染色を使用して判定され、腫瘍試料中でバックグラウンドレベルを上回る免疫組織化学染色が検出されるならば、この腫瘍はEGFRvIIIを発現する腫瘍であると判断される。腫瘍におけるEGFRの発現の検出方法は当分野で公知であり、免疫組織化学アッセイが挙げられる。一方、「EGFRvIII陰性腫瘍」は免疫組織化学技術により測定した場合に、腫瘍試料中でバックグラウンドを上回るEGFRvIII膜染色のない腫瘍として定義される。

0112

「過剰発現する」、「過剰発現」又は「過剰発現している」なる用語は同義であり、通常では癌細胞において正常細胞に比較して検出可能な高レベル転写又は翻訳される遺伝子を意味する。従って、過剰発現とは(転写亢進、転写後プロセシング、翻訳、翻訳後プロセシング、安定性改変及びタンパク質分解改変に起因する)タンパク質及びRNAの過剰発現と、タンパク質トラフィックパターン改変(核内転座増加)及び例えば基質酵素加水分解増加の場合のような機能活性亢進に起因する局所過剰発現の両者を意味する。従って、過剰発現とはタンパク質又はRNA濃度を意味する。過剰発現は正常細胞又は比較細胞に比較して50%、60%、70%、80%、90%又はそれ以上とすることもできる。ある種の実施形態では、EGFRを過剰発現する可能性のある固形腫瘍を治療するために本発明の抗EGFR抗体又はADCを使用する。

0113

本願で使用する「投与する」なる用語は治療目的(例えばEGFR関連障害の治療)を達成するために物質(例えば抗EGFR抗体又はADC)を送達することを意味するものである。投与方式非経口経腸及び局所とすることができる。非経口投与は通常では注射による方法であり、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節腔内、眼窩内心臓内、皮内、腹腔内、経気管支、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下脊髄内及び胸骨内注射及び輸液が挙げられる。

0114

本願で使用する「併用療法」なる用語は2種以上の治療物質(例えば抗EGFR抗体又はADCと別の治療剤)の投与を意味する。前記別の治療剤は抗EGFR抗体又はADCの投与と同時、投与前又は投与後に投与することができる。

0115

本願で使用する「有効量」又は「治療有効量」なる用語は障害(例えば癌)もしくはその1種以上の症状の重症度及び/もしくは持続期間を低減もしくは改善するため、障害の進行を予防するため、障害の退縮誘導するため、障害に伴う1種以上の症状の再発、発現、発症もしくは進行を予防するため、障害を検出するため、又は別の療法(例えば予防剤又は治療剤)の予防もしくは治療効果強化もしくは改善するために十分な薬物(例えば抗体又はADC)の量を意味する。有効量の抗体又はADCは例えば腫瘍増殖を阻害(例えば腫瘍体積の増加を抑制)、腫瘍増殖を抑制(例えば腫瘍体積を減少)、癌細胞数を減少、及び/又は癌に伴う症状の1種以上をある程度まで緩和することができる。有効量は例えば無病生存率DFS)を改善すること、全生存率(OS)を改善すること、又は再発確率を低下させることができる。

0116

以下のサブセクションでは本発明の種々の態様を更に詳細に説明する。

0117

II.抗EGFR抗体
本発明の1態様はAb1及び当分野で公知の他の抗体よりも改善された特徴(例えばEGFRとの結合親和性の増加)をもつ抗EGFR抗体又はその抗原結合部分を提供する。本発明の別の態様は本願に記載する抗EGFR抗体と少なくとも1個の薬物(限定されないが、例えばアウリスタチン)を含む抗体薬物コンジュゲート(ADC)に関する。本発明の抗体又はADCは限定されないが、EGFRvIIIを発現する腫瘍細胞と結合する、EGFRを発現する腫瘍細胞上の野生型EGFRと結合する、EGFR上のエピトープCGADSYEMEEDGVRKC(配列番号45)を認識する、正常ヒト上皮角化細胞上のEGFRと結合する、及びマウスモデルにおける異種移植片腫瘍増殖を抑制又は阻害する等の特徴をもつ。

0118

Ab1(抗体1)はヒト化抗EGFR抗体である。Ab1の軽鎖及び重鎖配列を夫々配列番号13及び配列番号14に記載する(本願に援用する米国特許出願公開第20120183471号も参照。)。Ab1の軽鎖可変領域は配列番号5に記載し、配列番号6に記載のCDR1アミノ酸配列と、配列番号7に記載のCDR2アミノ酸配列と、配列番号8に記載のCDR3アミノ酸配列を含む。Ab1の重鎖可変領域は配列番号1に記載し、配列番号2に記載のCDR1アミノ酸配列と、配列番号3に記載のCDR2アミノ酸配列と、配列番号4に記載のCDR3アミノ酸配列を含む。

0119

一般に、本発明のAb1変異体抗体は親抗体Ab1のエピトープ特異性を保持する。従って、1実施形態において、本発明の抗EGFR抗体は配列番号45に記載のEGFRにおけるエピトープと結合することができ、及び/又はEGFRとの結合に関してAb1と競合することができる。各種実施形態において、前記結合は後記実施例3に記載するプロトコールに従って検定することができる。本発明の好ましい1実施形態において、前記抗EGFR抗体はAb1と競合し、EGFRの1−525(配列番号47)との結合親和性が改善され、例えば表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、解離定数(Kd)が約1×10−6M〜約1×10−10Mである。

0120

1実施形態において、本発明はAb1の変異体であり、改善された特徴(例えば後記実施例に記載するように、改善された結合親和性や、NSCLC腫瘍細胞増殖のインビボ阻害能)をもつ抗EGFR抗体に関する。これらの新規抗体を本願では総称して「Ab1変異体抗体」と言う。一般に、Ab1変異体抗体はAb1と同一のエピトープ特異性を保持する。従って、1実施形態において、本発明の抗EGFR抗体又はその抗原結合部分は、配列番号45に記載のアミノ酸配列内のエピトープと結合し、競合結合アッセイでEGFRvIIIとの結合に関して配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗EGFR抗体と競合する。Ab1とは対照的に、本発明の抗EGFR抗体はヌードマウスでのH292ヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、腫瘍増殖をインビボ阻害もしくは抑制することができ、及び/又は正常ヒト上皮角化細胞上の野生型EGFRと結合することができる。各種実施形態において、本発明の抗EGFR抗体又はその抗原結合フラグメントはEGFRの生物学的機能を調節することが可能である。上記態様の他の実施形態において、前記抗EGFR抗体又はその抗原結合フラグメントはEGFRvIIIと結合し、EGFRを過剰発現する細胞上のEGFRと結合し、EGFR上のエピトープCGADSYEMEEDGVRKC(配列番号45)を認識する。別の実施形態において、前記抗EGFR抗体又はその抗原結合フラグメントはEGFRvIII接合部ペプチドとは異なるエピトープにおいてEGFRvIIIと結合する。上記態様のその他の実施形態において、前記抗EGFR抗体又はその抗原結合フラグメントはEGFRとの結合に関してセツキシマブと競合しない。後記実施例に記載するAbA抗体及びAb1変異体は以下の特徴をもつ。

0121

即ち、本発明は競合結合アッセイでAb1と競合することができるが、腫瘍増殖を阻害又は抑制するのにより有効である抗EGFR抗体又はその抗原結合部分を包含する。1実施形態において、本発明の抗EGFR抗体又はその抗原結合部分は、アミノ酸配列CGADSYEMEEDGVRKC(配列番号45)内のエピトープと結合することができ、競合結合アッセイで上皮成長因子受容体変異体III(EGFRvIII)(配列番号33)との結合に関してAb1(即ち配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗EGFR抗体)と競合することができる。

0122

1実施形態において、本発明の抗EGFR抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約1×10−6M以下の解離定数(Kd)でEGFR(1−525)(配列番号47)と結合する。あるいは、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約1×10−6M〜約1×10−10MのKdでEGFR(1−525)(配列番号47)と結合する。あるいは、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約1×10−6M〜約1×10−7MのKdでEGFR(1−525)(配列番号47)と結合する。あるいは、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約1×10−6M〜約5×10−10MのKd、約1×10−6M〜約1×10−9MのKd、約1×10−6M〜約5×10−9MのKd、約1×10−6M〜約1×10−8MのKd、約1×10−6M〜約5×10−8MのKd、約5.9×10−7M〜約1.7×10−9MのKd、約5.9×10−7M〜約2.2×10−7MのKdでEGFR(1−525)(配列番号47)と結合する。ある種の実施形態において、本発明の抗体及び抗原結合フラグメントの解離定数(Kd)は1実施形態ではAb1の解離定数よりも小さく且つ抗EGFR抗体であるセツキシマブの速度よりも大きい。

0123

本発明の抗EGFR抗体及びその抗原結合部分の1つの利点は、前記抗体がEGFRvIIIを発現する腫瘍細胞と結合できるという点である。EGFRvIIIは所定種の癌に関係があるが、当分野で公知の多くの抗EGFR抗体(例えばセツキシマブ)はEGFRvIIIを発現する腫瘍における腫瘍増殖を阻害又は抑制するのに有効ではない。従って、1実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約8.2×10−9M以下のKdでEGFRvIII(配列番号33)と結合する。あるいは、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約8.2×10−9M〜約6.3×10−10MのKd、約8.2×10−9M〜約2.0×10−9MのKd、約2.3×10−9M〜約1.5×10−10MのKdでEGFRvIII(配列番号33)と結合する。

0124

本発明の抗体は1実施形態において、インビボ異種移植片マウスモデルにおいて腫瘍増殖を阻害又は抑制することができる。例えば、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、インビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、EGFRに非特異的なヒトIgG抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約50%阻害することができる。ある種の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、インビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、同一の用量と投与周期で投与した場合にEGFRに非特異的なヒトIgG抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%又は少なくとも約80%阻害又は抑制することができる。ある種の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、インビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、同一の用量と投与周期で投与した場合にEGFRに非特異的なヒトIgG抗体と比較して、腫瘍増殖を約80%〜約90%、又は約84%〜約90%、又は約88%〜約90%阻害又は抑制することができる。

0125

本願で使用する「異種移植アッセイ」なる用語はヒト細胞拒絶しない免疫不全マウスの皮下又は腫瘍の原発巣である臓器種にヒト腫瘍細胞を移植するヒト腫瘍異種移植アッセイを意味する。

0126

なお、上記特徴を併有する抗EGFR抗体又はその抗原結合部分も本発明の実施形態とみなす。例えば、本発明の抗体は表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約1×10−6M以下の解離定数(Kd)でEGFR(1−525)(配列番号47)と結合し、アミノ酸配列CGADSYEMEEDGVRKC(配列番号45)内のエピトープと結合し、競合結合アッセイで上皮成長因子受容体変異体III(EGFRvIII)(配列番号33)との結合に関してAb1(即ち配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗EGFR抗体)と競合することができる。

0127

ある種の実施形態において、前記抗EGFR抗体又はその抗原結合部分は、アミノ酸配列CGADSYEMEEDGVRKC(配列番号45)内のエピトープと結合し、競合結合アッセイで上皮成長因子受容体変異体III(EGFRvIII)(配列番号33)との結合に関してAb1(即ち配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗EGFR抗体)と競合し、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約8.2×10−9M以下のKdでEGFRvIII(配列番号33)と結合する。

0128

ある種の実施形態において、前記抗EGFR抗体又はその抗原結合部分は、アミノ酸配列CGADSYEMEEDGVRKC(配列番号45)内のエピトープと結合し、競合結合アッセイで上皮成長因子受容体変異体III(EGFRvIII)(配列番号33)との結合に関してAb1(即ち配列番号1に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む、抗EGFR抗体)と競合し、インビボ異種移植片マウスモデルにおいて腫瘍増殖を阻害又は抑制する。より具体的には、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、インビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、同一の用量と投与周期で投与した場合にEGFRに非特異的なヒトIgG抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約50%阻害することができる。あるいは、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、インビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、同一の用量と投与周期で投与した場合にEGFRに非特異的なヒトIgG抗体と比較して、腫瘍増殖を少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%又は少なくとも約80%阻害又は抑制することができる。ある種の実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、インビボヒト非小細胞肺癌(NSCLC)異種移植アッセイにおいて、同一の用量と投与周期で投与した場合にEGFRに非特異的なヒトIgG抗体と比較して、腫瘍増殖を約80%〜約90%、又は約84%〜約90%、又は約88%〜約90%阻害又は抑制することができる。

0129

上記特徴のいずれかを併有する抗体を本発明の態様とする。以下に詳述する本発明のADCも上記特徴のいずれかをもつことができる。

0130

1実施形態において、本発明は配列番号40に記載のアミノ酸配列を含むLCCDR3ドメイン、配列番号39に記載のアミノ酸配列を含むLC CDR2ドメイン、及び配列番号38に記載のアミノ酸配列を含むLC CDR1ドメインと、配列番号37に記載のアミノ酸配列を含むHC CDR3ドメイン、配列番号36に記載のアミノ酸配列を含むHC CDR2ドメイン、及び配列番号35に記載のアミノ酸配列を含むHC CDR1ドメインを含む抗hEGFR抗体又はその抗原結合部分を包含する。

0131

1実施形態において、本発明は50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76及び78から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77及び79から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗hEGFR抗体又はその抗原結合部分を包含する。

0132

1実施形態において、本発明は配列番号10、11及び12;配列番号16、17及び18;配列番号10、11及び19;配列番号20、11及び12;配列番号21、3及び22;配列番号16、17及び19;配列番号2、3及び4;配列番号10、3及び12;配列番号80、11及び18;配列番号80、3及び18;配列番号20、3及び12;配列番号80、11及び12;並びに配列番号81、11及び22から構成される群から選択されるHCCDRセット(CDR1、CDR2及びCDR3)と;配列番号6、7及び8;配列番号23、24及び25;配列番号26、27及び28;配列番号29、30及び31;配列番号6、7及び84;配列番号82、83及び31;並びに配列番号82、27及び85から構成される群から選択されるLC軽鎖CDRセット(CDR1、CDR2及びCDR3)を含む抗hEGFR抗体又はその抗原結合部分を包含する(但し、前記抗体又はその抗原結合部分が、配列番号2、3及び4のHC CDRセットと配列番号6、7及び8のLC CDRセットを同時に含むことはない)。

0133

好ましくは、本発明の抗EGFR抗体は例えば当分野で公知の複数のインビトロ及びインビボアッセイのいずれか1種により評価した場合にEGFR活性を低下又は中和させる高い能力を示す。例えば、EGFRを発現する細胞株(例えばh292細胞株)におけるEGFRのリン酸化の阻害を測定することができる。ある種の実施形態において、前記単離抗体又はその抗原結合部分は、ヒトEGFRと結合し、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約5.9×10−7M以下のKD速度定数でヒトEGFR(EGFR1−525)から解離する。あるいは、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約4.2×10−7MのKD速度定数でヒトEGFR(1−525)から解離することができる。あるいは、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約2.5×10−7Mの概算KD速度定数のkoff速度定数でヒトEGFR(1−525)から解離することができる。ある種の実施形態において、本発明の抗EGFR抗体又はその抗原結合部分は、5.9×10−7M〜5×10−9MのKD速度定数をもつ。

0134

あるいは、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約6.1×10−9M以下のKD速度定数でヒトEGFRvIIIから解離することができる。あるいは、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約3.9×10−9M以下のKD速度定数でヒトEGFRvIIIから解離することができる。あるいは、前記抗体又はその抗原結合部分は、表面プラズモン共鳴法により測定した場合に、約2.3×10−9M以下のKD速度定数でヒトEGFRvIIIから解離することができる。

0135

1実施形態において、本発明は抗体AbAである抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。AbAはEGFRとの結合親和性がAb1よりも改善されており、更にAb1に比較してユニークなインビトロ及びインビボ特徴を示す。AbAはインビトロ角化細胞結合アッセイにおいてAb1よりも著しく高い親和性でEGFRと結合する。更に、AbAは異種移植H292細胞アッセイで腫瘍増殖を阻害又は抑制することができる。特に、AbAはインビトロ及びインビボ特徴が改善され、AbAよりも結合親和性が高かった他のAb1変異体抗体と同等である。AbAは他のAb1変異体抗体と比較して結合親和性が低い(例えば図3のAbP及びAbQとAbAを対比参照。)にも拘わらず、インビボアッセイにおける細胞増殖阻害は同等であった。

0136

「AbA」なる用語はAbAの少なくとも6個のCDRをもつIgG抗体を包含するものである。AbA抗体はAb1と同一の軽鎖をもつが、重鎖は親抗体Ab1に対して6カ所のアミノ酸配列変異(重鎖の可変領域に4カ所のアミノ酸変異と定常領域に2カ所の変異)を含む。AbA抗体は配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインとを含む軽鎖可変領域を含む。AbAの重鎖可変領域は配列番号9に記載のアミノ酸配列と配列番号5のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域により表される。抗体AbAの全長重鎖を配列番号15に記載のアミノ酸配列に示し、抗体AbAの全長軽鎖を配列番号13に記載のアミノ酸配列に示す(図2参照。)。AbAの重鎖の核酸配列を以下に示す。

0137

0138

AbAの軽鎖の核酸配列を以下に示す。

0139

0140

1実施形態において、本発明は抗体AbBである抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。前記AbB抗体は配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインとを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号64のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号65のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。

0141

1実施形態において、本発明は抗体AbCである抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。前記AbC抗体は配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインとを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号66のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号67のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。

0142

1実施形態において、本発明は抗体AbDである抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。前記AbD抗体は配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号83のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号82のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号68のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号69のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。

0143

1実施形態において、本発明は抗体AbEである抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。前記AbE抗体は配列番号4のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号2のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号85のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号82のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号50のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号51のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。

0144

1実施形態において、本発明は抗体AbFである抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。前記AbF抗体は配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号8のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号7のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号6のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインとを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号52のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号53のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。

0145

1実施形態において、本発明は抗体AbGである抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。前記AbG抗体は配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号17のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号16のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号24のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号72のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号73のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。

0146

1実施形態において、本発明は抗体AbHである抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。前記AbH抗体は配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号80のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号24のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号54のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号55のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。

0147

1実施形態において、本発明は抗体AbJである抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。前記AbJ抗体は配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号80のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号25のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号24のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号23のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号56のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号57のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。

0148

1実施形態において、本発明は抗体AbKである抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。前記AbK抗体は配列番号19のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号10のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号74のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号75のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。

0149

1実施形態において、本発明は抗体AbLである抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。前記AbL抗体は配列番号18のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号80のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号58のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号59のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。

0150

1実施形態において、本発明は抗体AbMである抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。前記AbM抗体は配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号76のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号77のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。

0151

1実施形態において、本発明は抗体AbNである抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。前記AbN抗体は配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号20のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号60のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号61のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。

0152

1実施形態において、本発明は抗体AbOである抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。前記AbO抗体は配列番号12のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号80のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号28のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号27のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号26のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号62のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号63のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。

0153

1実施形態において、本発明は抗体AbPである抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。前記AbP抗体は配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号3のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号21のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号78のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号79のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。

0154

1実施形態において、本発明は抗体AbQである抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。前記AbQ抗体は配列番号22のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号11のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号81のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号31のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号30のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号29のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。その他の実施形態において、本発明は配列番号70のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号71のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をもつ抗体を提供する。

0155

後記実施例で表1に記載するように、Ab1変異体抗体配列はAb1 EGFRエピトープとの結合を改善させるCDR領域に相当するアミノ酸コンセンサス配列を提供する。従って、1実施形態において、本発明は配列番号40に記載のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号39に記載のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号38に記載のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域と、配列番号37に記載のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号36に記載のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号35に記載のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインとを含む重鎖可変領域を含む抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に関する。

0156

1実施形態において、前記抗上皮成長因子受容体(抗EGFR抗)抗体又はその抗原結合部分は、50、52、53、56、58、60、62、64、66及び68から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、51、53、55、57、59、61、63、65、67及び69から構成される群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む。

0157

別の実施形態において、本発明の抗EGFR抗体又はその抗原結合部分は、配列番号12、18、19及び22に記載のアミノ酸配列を含むCDR3ドメインと、配列番号11又は17に記載のアミノ酸配列を含むCDR2ドメインと、配列番号10、16、20及び21に記載のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と;配列番号8、25、28及び31に記載のアミノ酸配列を含むCDR3ドメインと、配列番号7、24、27及び30に記載のアミノ酸配列を含むCDR2ドメインと、配列番号6、23、26及び29に記載のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。

0158

リン酸化及び増殖アッセイの結果、本願に記載する抗体はEGFR介在性リン酸化と腫瘍細胞増殖を阻害することが実証された。例えば、実施例6に記載するように、本発明のEGFR抗体(試験したもの)は腫瘍細胞増殖をインビボで阻害することが分かった。

0159

上記抗EGFR抗体CDR配列は、本発明に従って単離され、下表1〜3に示すCDR配列を含むポリペプチドを含むEGFR結合タンパク質の新規ファミリーを確立する。

0160

hEGFRに対して好ましいEGFR結合及び/又は中和活性をもつCDRを作製及び選択するためには、抗体又はその抗原結合部分を作製してこれらの抗体又はその抗原結合部分のEGFR結合及び/又は中和特性を評価する方法として当分野で公知の標準方法を使用することができ、限定されないが、本願に具体的に記載する方法が挙げられる。

0161

ある種の実施形態において、前記抗体はIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM又はIgD定常領域等の重鎖定常領域を含む。ある種の実施形態において、前記抗EGFR抗体又はその抗原結合部分は、ヒトIgG定常領域、ヒトIgM定常領域、ヒトIgE定常領域及びヒトIgA定常領域から構成される群から選択される重鎖免疫グロブリン定常領域を含む。その他の実施形態において、前記抗体又はその抗原結合部分は、IgG1重鎖定常領域、IgG2重鎖定常領域、IgG3定常領域又はIgG4重鎖定常領域を含む。好ましくは、前記重鎖定常領域はIgG1重鎖定常領域又はIgG4重鎖定常領域である。更に、前記抗体はκ軽鎖定常領域又はλ軽鎖定常領域のいずれかの軽鎖定常領域を含むことができる。好ましくは、前記抗体κ軽鎖定常領域を含む。あるいは、前記抗体部分は例えばFabフラグメント又は1本鎖Fvフラグメントとすることができる。

0162

ある種の実施形態において、前記抗EGFR抗体結合部分はFab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド結合したFv、scFv、シングルドメイン抗体又はダイアボディである。

0163

ある種の実施形態において、前記抗EGFR抗体又はその抗原結合部分は、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)である。

0164

ある種の実施形態において、前記抗EGFR抗体又はその抗原結合部分は、配列番号41に記載のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域及び/又は配列番号43に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。

0165

抗体エフェクター機能を改変するようにFc部分のアミノ酸残基を置換することは従来記載されている(本願に援用するWinterら.米国特許第5,648,260号及び5,624,821号)。抗体のFc部分は複数の重要なエフェクター機能に介在し、例えばサイトカイン誘導、ADCC貪食作用補体依存性細胞傷害作用(CDC)並びに抗体及び抗原−抗体複合体半減期クリアランス速度が挙げられる。これらのエフェクター機能は治療目的に応じて治療用抗体に望ましい場合もあるが、不必要または有害な場合もある。ある種のヒトIgGアイソタイプ、特にIgG1及びIgG3は夫々FcγR及び補体C1qと結合することによりADCC及びCDCに介在する。胎児性Fc受容体(FcRn)は抗体の循環半減期を決定する重要な要素である。更に別の実施形態では、抗体のエフェクター機能を改変するように抗体の定常領域(例えば抗体のFc領域)の少なくとも1個のアミノ酸残基を置換する。

0166

本発明の1実施形態は本願に記載する抗体の結合領域(例えばAbAの重鎖及び/又は軽鎖CDR)を含む組換えキメラ抗原受容体(CAR)を包含する。本願に記載するような組換えCARはヒト白血球抗原HLA)に非依存的にT細胞特異性を抗原に再指向させるために使用することができる。従って、本発明のCARは対象の腫瘍を認識して攻撃するようにヒト対象自身の免疫細胞を改変し易くするために免疫療法で使用することができる(例えばCAR技術に関して各々本願に援用する米国特許第6,410,319号;8,389,282号;8,822,647号;8,906,682号;8,911,993号;8,916,381号;8,975,071号;及び米国特許出願公開第US20140322275号参照。)。この種の免疫療法は養子免疫療法(ACT)と呼ばれ、治療を必要とする対象における癌を治療するために使用することができる。

0167

本発明の抗EGFRCARはEGFR(例えばEGFRvIII)に特異的な細胞外抗原結合ドメインと、CARをT細胞に固定するために使用される膜貫通ドメインと、1個以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含むことが好ましい。本発明の1実施形態において、前記CARはT細胞受容体のα、β又はζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及びCD154から構成される群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。本発明の1実施形態において、前記CARは共刺激ドメイン(例えばOX40、CD2、CD27、CD28、CD5、ICAM−1、LFA−1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及び4−1BB(CD137)から構成される群から選択されるタンパク質の機能的シグナル伝達ドメインを含む共刺激ドメイン)を含む。本発明のある種の実施形態において、前記CARは本願に記載するCDR又は可変領域(例えばAbA抗体に由来するCDR又は可変領域)を含むscFvと、膜貫通ドメインと、共刺激ドメイン(例えばCD28又は4−1BBに由来する機能的シグナル伝達ドメイン)と、CD3に由来する機能的シグナル伝達ドメイン(例えばCD3−zeta)を含むシグナル伝達ドメインを含む。

0168

ある種の実施形態において、本発明は本願に記載する抗体又は本願に記載するscFvの抗原結合領域(例えばCDR)を含むCARを含むT細胞(CAR T細胞とも言う。)を包含する。

0169

本発明のある種の実施形態において、前記CARは配列番号40に記載のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号39に記載のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号38に記載のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号37に記載のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号36に記載のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号35に記載のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインとを含む重鎖可変領域を含む。

0170

本発明のある種の実施形態において、前記CARは配列番号12に記載のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号11に記載のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号10に記載のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域と、配列番号8に記載のアミノ酸配列を含むCDR3ドメイン、配列番号7に記載のアミノ酸配列を含むCDR2ドメイン及び配列番号6に記載のアミノ酸配列を含むCDR1ドメインを含む重鎖可変領域を含む。

0171

本発明の1実施形態は標識抗EGFR抗体又はその抗体部分を包含し、前記抗体は誘導体化されているか又は1個以上の機能的分子(例えば別のペプチド又はタンパク質)と連結されている。例えば、標識抗体は本発明の抗体又は抗体部分を(別の抗体(例えば二重特異性抗体又はダイアボディ)、検出可能な物質、薬剤、前記抗体もしくは抗体部分と別の分子の会合に介在することができるタンパク質もしくはペプチド(例えばストレプトアビジンコア領域又はポリヒスチジンタグ)、並びに/又は有糸分裂阻害剤、抗腫瘍性抗生物質、免疫調節剤、遺伝子治療用ベクター、アルキル化剤、抗血管新生薬、代謝拮抗剤、ホウ素含有剤、化学療法剤、ホルモン剤、抗ホルモン剤、コルチコステロイド、感光性治療剤、オリゴヌクレオチド、放射性核種剤、トポイソメラーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、放射線増感剤及びその組合せから構成される群から選択される細胞毒性剤もしくは治療剤等の1個以上の他の分子体と(化学的カップリング遺伝子融合非共有結合的会合又は他の方法により)機能的に連結することにより得ることができる。

0172

抗体又はその抗体部分を誘導体化することができる有用な検出可能な物質としては蛍光化合物が挙げられる。検出可能な蛍光物質の例としては、フルオレセインフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、5−ジメチルアミン−1−ナフタレンスルホニルクロリドフィコエリスリン等が挙げられる。アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等の検出可能な酵素で抗体を誘導体化してもよい。検出可能な酵素で抗体を誘導体化する場合には、酵素が検出可能な反応生成物を生成するために使用する他の試薬を加えることにより抗体を検出する。例えば、検出可能な物質として西洋ワサビペルオキシダーゼが存在する場合には、過酸化水素ジアミノベンジジンを加えて検出可能な着色反応生成物を得る。抗体をビオチンで誘導体化し、アビジン又はストレプトアビジンとの結合の間接的測定により検出してもよい。

0173

1実施形態では、本発明の抗体を造影剤と結合させる。本願に記載する組成物及び方法で使用することができる造影剤の例としては、限定されないが、放射性標識物質(例えばインジウム)、酵素、蛍光標識物質、発光標識物質、生物発光標識物質、磁気標識物質及びビオチンが挙げられる。

0174

1実施形態では、前記抗体又はADCを限定されないが、インジウム(111In)等の放射性標識物質と連結する。111インジウムはEGFR陽性腫瘍の同定用として本願に記載する抗体又はADCを標識するために使用することができる。ある種の実施形態において、本願に記載する抗EGFR抗体(又はADC)は二官能性シクロヘキシルジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)キレートである二官能性キレート剤を介して111Iで標識される(各々本願に援用する米国特許第5,124,471号、5,434,287号及び5,286,850号参照。)。

0175

本発明の別の実施形態は前記抗EGFR抗体又はその抗原結合部分に1個以上の糖残基を含むグリコシル化結合性タンパク質を提供する。胎児インビボタンパク質産生は更に翻訳後修飾と呼ばれるプロセシングを受ける場合がある。特に、酵素により糖(グリコシル)残基を付加することができ、グリコシル化と呼ばれるプロセスである。得られたタンパク質はオリゴ糖側鎖が共有結合しており、グリコシル化タンパク質又は糖タンパク質と呼ばれる。抗体はFcドメインと可変ドメインに1個以上の糖残基をもつ糖タンパク質である。Fcドメインの糖残基はFcドメインのエフェクター機能に大きな影響を与えるが、抗体の抗原結合や半減期には殆ど影響を与えない(R.Jefferis,Biotechnol.Prog.21(2005),pp.11−16)。他方、可変ドメインのグリコシル化は抗体の抗原結合活性に影響を与える場合がある。可変ドメインのグリコシル化は恐らく立体障害により抗体結合親和性に負の影響を与える可能性があり(Co,M.S.,et al.,Mol.Immunol.(1993)30:1361−1367)、あるいは抗原との親和性を増す可能性がある(Wallick,S.C.,et al.,Exp.Med.(1988)168:1099−1109;Wright,A.,et al.,EMBO J.(1991)10:2717−2723)。

0176

本発明の1態様は結合性タンパク質のO結合型又はN結合型グリコシル化部位を突然変異させたグリコシル化部位突然変異体の作製に関する。当業者は周知標準技術を使用してこのような突然変異体を作製することができる。生物活性を維持しながら結合活性増減させたグリコシル化部位突然変異体も本発明の目的である。

0177

更に別の実施形態では、本発明の抗EGFR抗体又は抗原結合部分のグリコシル化を改変する。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる(即ちこの抗体はグリコシル化されていない)。例えば抗体の抗原との親和性を増すようにグリコシル化を改変することができる。このような糖鎖修飾は例えば抗体配列内の1箇所以上のグリコシル化部位を改変することにより実施することができる。例えば、1箇所以上の可変領域グリコシル化部位を除去することによりこの部位のグリコシル化を排除するように1箇所以上のアミノ酸置換を行うことができる。このような非グリコシル化により抗体の抗原との親和性を増すことができる。このようなアプローチはPCT公開WO2003016466A2、並びに米国特許第5,714,350号及び6,350,861号に更に詳細に記載されており、各々その開示内容全体を本願に援用する。

0178

上記に加え、又は上記の代わりに、フコシル残基量の少ない低フコシル化抗体やバイクティングGlcNAc構造の多い抗体等の改変型グリコシル化タイプをもつ本発明の改変型抗EGFR抗体を作製することができる。このような改変型グリコシル化パターンは抗体のADCC能を増すことが実証されている。このような糖鎖修飾は例えばグリコシル化機序を改変させた宿主細胞で抗体を発現させることにより実施することができる。グリコシル化機序を改変させた細胞は当分野で従来記載されており、グリコシル化を改変させた抗体を産生するように本発明の組換え抗体を発現させる宿主細胞として使用することができる。例えば、各々その開示内容全体を本願に援用するShields,R.L.et al.(2002)J.Biol.Chem.277:26733−26740;Umana et al.(1999)Nat.Biotech.17:176−1並びにヨーロッパ特許第EP1,176,195号;PCT公開WO03/035835;WO99/54342 80参照。

0179

タンパク質グリコシル化は着目タンパク質のアミノ酸配列と、タンパク質を発現させる宿主細胞に依存する。生物によって異なるグリコシル化酵素(例えばグリコシルトランスフェラーゼグリコシダーゼ)が産生され、利用可能な基質(ヌクレオチド糖類)も異なる場合がある。このような要因により、タンパク質グリコシル化パターングリコシル残基組成は特定のタンパク質を発現させる宿主系によって異なる場合がある。本発明で有用なグリコシル残基としては、限定されないが、グルコースガラクトースマンノースフコース、n−アセチルグルコサミン及びシアリル酸が挙げられる。グリコシル化結合性タンパク質はグリコシル化パターンがヒトのパターンとなるようなグリコシル残基を含むことが好ましい。

0180

タンパク質グリコシル化が異なると、タンパク質特性も異なる場合がある。例えば、酵母等の微生物宿主で産生され、酵母内因性経路を利用してグリコシル化された治療用タンパク質効力はCHO細胞株等の哺乳動物細胞で発現される同一タンパク質と比較して低下する場合がある。このような糖タンパク質は更にヒトにおいて免疫原性となる場合があり、投与後にインビボ半減期が短くなる場合がある。ヒト及び他の動物における特定の受容体は特定のグリコシル残基を認識し、血流からのタンパク質の迅速なクリアランスを助長する場合がある。他の有害な影響としては、タンパク質折畳み、溶解度、プロテアーゼ感受性トラフィッキング輸送区画化分泌、他のタンパク質もしくは因子による認識、抗原性又はアレルゲン性の変化が挙げられる。従って、実施者は特定のグリコシル化組成及びパターン(例えばヒト細胞又は所期対象動物種特異的細胞で発現されるものと同一又は少なくとも同様のグリコシル化組成及びパターン)をもつ治療用タンパク質を優先的に選択することができる。

0181

宿主細胞とは異なるグリコシル化タンパク質を発現させるには、異種グリコシル化酵素を発現するように宿主細胞を遺伝子改変することにより実施することができる。組換え技術を使用して実施者はヒトタンパク質グリコシル化を示す抗体又はその抗原結合部分を作製することができる。例えば、非天然型グリコシル化酵素を発現するように酵母株が遺伝子改変され、これらの酵母株で産生されるグリコシル化タンパク質(糖タンパク質)が動物細胞、特にヒト細胞と同一のタンパク質グリコシル化を示すように改変されている(米国特許公開第20040018590号及び20020137134号並びにPCT公開WO2005100584A2)。

0182

多数の技術のいずれにより抗体を作製してもよい。例えば、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを標準技術により宿主細胞にトランスフェクションして宿主細胞から発現させる。「トランスフェクション」なる用語の各種語形原核又は真核宿主細胞外来DNAを導入するために広く使用されている多様な技術を包含するものであり、例えばエレクトロポレーションリン酸カルシウム沈殿法DEAEデキストラントランスフェクション等が挙げられる。原核宿主細胞又は真核宿主細胞のどちらでも抗体を発現させることが可能であるが、真核細胞(特に哺乳動物細胞)は原核細胞よりも正しく折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を組み立てて分泌する可能性が高いので、真核細胞で抗体を発現させることが好ましく、哺乳動物宿主細胞が最も好ましい。

0183

本発明の組換え抗体を発現させるために好ましい哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣(CHO細胞)(Urlaub and Chasin,(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216−4220に記載されているdhfr欠損CHO細胞と、例えばR.J.Kaufman and P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159:601−621に記載されているようなDHFR選択マーカーの併用を含む)、NS0ミエローマ細胞、COS細胞及びSP2細胞が挙げられる。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合には、宿主細胞における抗体の発現を可能にするため、又はより好ましくは宿主細胞を増殖させる培養培地への抗体の分泌を可能にするために十分な時間にわたって宿主細胞を培養することにより抗体を産生させる。標準タンパク質精製法を使用して培養培地から抗体を回収することができる。

0184

FabフラグメントやscFv分子等の機能的抗体フラグメントを作製するために宿主細胞を使用することもできる。当然のことながら、上記手順の変形も本発明の範囲に含まれる。例えば、本発明の抗体の軽鎖及び/又は重鎖のいずれかの機能的フラグメントをコードするDNAを宿主細胞にトランスフェクトすることが望ましい場合がある。着目抗原との結合に必要ない軽鎖及び重鎖の一方又は両方をコードするDNAの一部又は全部を除去するために組換えDNA技術を使用してもよい。このような短縮型DNA分子から発現される分子も本発明の抗体に含まれる。更に、標準化架橋法により本発明の抗体を第2の抗体と架橋させることにより、一方の重鎖と一方の軽鎖が本発明の抗体であり、他方の重鎖と軽鎖が着目抗原以外の抗原に特異的である2価抗体を作製してもよい。

0185

本発明の抗体又はその抗原結合部分の組換え発現に好ましいシステムでは、抗体重鎖抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターをリン酸カルシウムトランスフェクション法によりdhfr欠損CHO細胞に導入する。組換え発現ベクター内で、遺伝子の高レベル転写を誘導するように抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を各々CMVエンハンサー/AdMLPプロモーター調節エレメントと機能的に連結する。メトトレキサート選択/増幅を使用してベクターをトランスフェクトされたCHO細胞の選択を可能にするDHFR遺伝子も組換え発現ベクターに組込む。選択された形質転換宿主細胞を培養し、抗体重鎖及び軽鎖を発現させ、無傷の抗体を培養培地から回収する。標準分子生物学技術を使用して組換え発現ベクターを作製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換細胞を選択し、宿主細胞を培養し、培養培地から抗体を回収する。更に、本発明は組換え抗体が合成されるまで宿主細胞を適切な培養培地で培養することにより本発明の組換え抗体を合成する方法を提供する。本発明の組換え抗体は本願に開示するアミノ酸配列に対応する核酸分子を使用して作製することができる。1実施形態では、配列番号86及び/又は87に記載の核酸分子を組換え抗体の作製に使用する。前記方法は更に培養培地から組換え抗体を単離する工程を含むことができる。

0186

III.抗EGFR抗体薬物コンジュゲート(ADC)
本願に記載する抗EGFR抗体を薬物部分と結合させて抗EGFR抗体薬物コンジュゲート(ADC)を形成してもよい。抗体薬物コンジュゲート(ADC)は腫瘍関連抗原(例えばEGFRを発現する腫瘍)等の標的組織に1個以上の薬物部分を選択的に送達することができるため、疾患(例えば癌)の治療において抗体の治療効力を増すことができる。従って、ある種の実施形態において、本発明は治療(例えば癌の治療)用の抗EGFR ADCを提供する。

0187

本発明の抗EGFRADCはEGFR抗体(即ちEGFRと特異的に結合する抗体)を1個以上の薬物部分と連結したものである。ADCの特異性は抗体(即ち抗EGFR抗体)の特異性により決定される。1実施形態では、EGFRを発現する形質転換癌細胞に体内で送達される1個以上の細胞毒性薬と抗EGFR抗体を連結する。

0188

本発明の抗EGFRADCで使用することができる薬物の例と、抗体と1個以上の薬物を結合させるために使用することができるリンカーの例を以下に挙げる。「薬物」、「薬剤」及び「薬物部分」なる用語は本願では同義に使用する。「連結」及び「結合」なる用語も本願では同義に使用し、抗体と薬物部分を共有結合させることを意味する。

0189

所定の実施形態において、前記ADCは下式(式I):
Ab−(L−D)n (I)
で表され、式中、Abは抗体(例えば抗EGFR抗体AbA)であり、(L−D)はリンカー−薬物部分である。リンカー−薬物部分はリンカーであるL−と、例えば標的細胞(例えばEGFRを発現する細胞)に対する細胞増殖抑制作用細胞傷害作用又は他の治療作用をもつ薬物部分である−Dから構成され、nは1〜20の整数である。所定の実施形態において、nは1〜8、1〜7、1〜6、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、又は1である。ADCのDARは式Iに記載する「n」と等価である。1実施形態において、前記ADCは式Ab−(L−D)nで表され、式中、Abは抗EGFR抗体(例えばAbA)であり、Lはリンカー、例えばバリン−シトルリン(vc)であり、Dは薬物(例えばMMAFやMMAE等のアウリスタチン)であり、nは2〜4(DAR2〜4に等価)である。本発明のADCで使用することができる薬物(式IのD)及びリンカー(式IのL)と代替ADC構造について以下に更に詳細に説明する。

0190

A.抗EGFRADC:結合用薬物の例
1個以上の薬物を着目細胞(例えばEGFRを発現する癌細胞)に標的送達するためにADCで抗EGFR抗体を使用することができる。本発明の抗EGFR ADCは例えば1個以上の薬物を特定細胞に送達する際に抗癌治療で頻繁に認められる副作用を減らすことができる標的療法を実現する。

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