図面 (/)

技術 眼疾患に関連したアレルのマルチプレックス検出方法

出願人 アベリノラボユーエスエーインコーポレイテッド
発明者 チャオシェーン,コニーチョ,スンヨンイ,ジン
出願日 2019年10月4日 (1年2ヶ月経過) 出願番号 2019-183365
公開日 2020年3月19日 (9ヶ月経過) 公開番号 2020-039339
状態 未査定
技術分野 酵素、微生物を含む測定、試験 突然変異または遺伝子工学
主要キーワード 検査テスト リコンストラクション 渦運動 果粒状 反応ボリューム オンラインツール 臨床担当者 レーシック手術
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2020年3月19日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (13)

課題

ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物、及び角膜ジストロフィー検出方法を提供する。

解決手段

(A)対象由来生物学的サンプルから、第一TGFβI遺伝子配列増幅しそして決定するための、少なくとも1つの第一増幅プライマー対と;(B)少なくとも4つの検出プローブのセットと;を含む、ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物であって、前記少なくとも4つの検出プローブのセットは、第一標識検出プローブ、第二標識検出プローブ、第三標識検出プローブ、及び第四標識検出プローブを含み、それぞれ、特定の配列からなる核酸配列を含む。

概要

背景

リアルタイムPCRは、実質的に同一の配列を有する核酸配列間相違を検出するために使用されることができる。示差的に標識された蛍光核酸プローブ、例えば、一方は野生型配列に結合しそして一方は変異体配列に結合するものの使用により、ヒトのゲノムにおける単一ヌクレオチドの変化を迅速かつ確実に検出することができる。この解決力は、一塩基多型(SNP)、すなわち、タンパク質コード配列及び/又は非コード配列内に見出される単一の塩基変化ヒト疾患相関している医学診断に適用されている。

しかし、リアルタイムPCR分析は、高品質サンプルの収集及び単離に大きく依存する。質の悪いサンプル収集及び/又は単離は、より長いアッセイ条件及びリアルタイムPCR試薬のより多い使用を必要とし、その両方がコスト増加及び生産性の低下につながる。また、リアルタイムPCRの一塩基多型検出アッセイの失敗は、追加サンプルを収集する必要性をもたらす可能性があり、それは時間と資源においてさらに大きな損失を引き起こす。

従って、アッセイの全体的な成功率を向上させる、改良されたサンプル収集及び単離をもたらす方法は、アッセイに必要な試薬を削減し、そして後になってからの追加のサンプル収集の必要性を減少し、非常に望ましい。また、サンプル材料のより少ない量でリアルタイムPCRSNP検出アッセイを実施するための方法もまた、高品質サンプルの収集及び単離に伴う課題を減少させる。

角膜ジストロフィーは、最初に患者角膜の中央に視力障害を呈する、常染色体優性遺伝性疾患であることがある。視力障害は角膜の周辺部に向かって広がり年齢が上がるにつれて、患者の視力を悪化させる。アベリノ角膜ジストロフィー果粒状角膜ジストロフィー、格子1型角膜ジストロフィー、ティール−ベンケ、及びレイス・バックラー角膜ジストロフィー(Reis-bucklers corneal dystrophy)を含む、複数の種類の角膜ジストロフィーの特徴付けがされている。角膜ジストロフィーは、少なくともいくつかのケースでは、βIG−H3タンパク質(TGFβIタンパク質、TGFBIタンパク質、及びケラエピセリン(keratoepithelin)としても知られている)をコードするトランスフォーム増殖因子β誘導(transforming growth factor beta induced)(TGFβIとも略される)遺伝子の変異により引き起こされることが知られている。

アベリノ角膜ジストロフィーを患うヘテロ接合患者は、年齢とともに視力の喪失を増加させており、人生の晩年において重症化する(severe in the later years of life)。対照的に、ホモ接合の患者は、6までに深刻さを示し、視力の損失を完了する。アベリノ角膜ジストロフィーは、角膜ジストロフィーの特殊な種類として1988年に最初に認識された。その前は、顆粒状角膜ジストロフィーとして誤分類されがちであった。今日では、アベリノ角膜ジストロフィーは、世界中で最も一般的な間質角膜ジストロフィーの形態であることが知られている。韓国では、アベリノ角膜ジストロフィーは、おおよそ870人に1人の有病率(prevalence)を有すると考えられている(Lee, J. H. et al., Ophthalmic Epidemiol., 17:160, 2010参照; Holland, E. J. et al., Ophthalmology, 99:1564, 1992; Kennedy, S. M. et al., Br. J. Ophthalmol., 80:489, 1996; Dolmetsch, A. M. et al., Can. J. Ophthalmol., 31:29, 1996; Afshari, N. A. et al., Arch. Ophthalmol., 119:16, 2001; Stewart, H. S. Hum. Mutat., 14:126, 1999も参照)。

これまでに、(例えば、野生型βIG−H3アレル1つと変異体βIG−H3アレル1つとを有する)ヘテロ接合個体は、レーシック手術後の視力喪失加速に対して非常に影響を受けやすいことが発見されている。特に、手術2年後の角膜の不透明度(opacity)の増加が、これらの悪性が深刻化している(increasing aggressiveness)患者で確認され、最終的には、視力の完全な喪失をもたらす(Jun, R. M. et al., Opthalmology, 111:463, 2004)。以前は、目の手術は、レーシック又はエキシマレーザー手術が角膜ジストロフィーを患う患者の視界混濁(vision blurriness)を取り除くであろうことを期待して行われていた。レーシック手術の仮定の数30万例について、アベリノ角膜ジストロフィーを患っているヘテロ接合患者の最小推定の1/1000に基づくと、300人がその視力を失っているであろう。レーシック手術を受けた患者は、主に生産活動を行っている20歳代、30歳代である。したがって、彼らの視力喪失は、社会経済との両方に深刻なトラブルを引き起こす。

また、米国では2000年のレーシック手術の承認後、レーシック手術を受けたアベリノ角膜ジストロフィーを患っているアフリカ系アメリカ人の患者が失明することが発見されており、これにより、世界中で多くの同様のケースが発生する可能性があることが推測される。

従って、レーシック手術によるアベリノ角膜ジストロフィーの進行を防止するためにアベリノ角膜ジストロフィーの正確な診断が必要とされるが、アベリノ角膜ジストロフィーの診断は、単に角膜混濁顕微鏡的観察(例えば、細隙灯検査(slit-lamp examination))により行っており、したがって、多くの場合、医師が患者の潜在症状を見落とし、視力喪失をもたらすレーシック手術を実行する。従って、角膜ジストロフィーの迅速かつ正確な遺伝子診断が求められている。

アベリノ角膜ジストロフィーの原因であるβIG−H3遺伝子における変異検出用DNAチップが開発された(韓国特許公開第10−2007−0076532号公報)。しかし、DNAチップを使用するアベリノ角膜ジストロフィーの診断は、不利益なことに、サンプル中のDNAを増幅する工程、DNAチップに増幅したDNAをハイブリダイズする工程、ハイブリダイズされたDNAチップを洗浄する工程、及び肯定的な応答を検出する工程を含む複数工程を必要とする。

前記背景を考慮すると、当該技術分野において必要とされるものは、角膜ジストロフィーに関連する多数の変異アレルの改良された検出方法である。

概要

ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物、及び角膜ジストロフィー検出方法を提供する。(A)対象由来生物学的サンプルから、第一TGFβI遺伝子配列を増幅しそして決定するための、少なくとも1つの第一増幅プライマー対と;(B)少なくとも4つの検出プローブのセットと;を含む、ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物であって、前記少なくとも4つの検出プローブのセットは、第一標識検出プローブ、第二標識検出プローブ、第三標識検出プローブ、及び第四標識検出プローブを含み、それぞれ、特定の配列からなる核酸配列を含む。なし

目的

本開示は、ヒトの疾患に関連する1つ又はそれ以上のアレルの改良された検出方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

(A)基材の先端に付着した対象の上皮細胞を提供することと;(B)前記基材に付着した細胞を溶解する溶解液中で、前記基材の前記先端を撹拌することと;(C)前記撹拌すること(B)が完了するとすぐに、前記溶解液から前記基材を除去することと;(D)前記除去すること(C)の後に前記溶解液をインキュベートすることと;(E)前記溶解液からゲノムDNAを単離してgDNA溶液を形成することと;(F)少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー対及び前記gDNA溶液を使用して、TGFβI遺伝子中に存在する少なくとも2つのヌクレオチド同一性を決定することと;を含む、対象由来サンプルにおける、角膜ジストロフィーに関連する少なくとも2つのゲノムのアレル検出方法であって、前記少なくとも2つのヌクレオチドは、角膜ジストロフィーに関連するそれぞれの独立した一塩基多型(SNP)に相当するTGFβI遺伝子のそれぞれの独立した位置に位置している、前記方法。

請求項2

TGFβI遺伝子中に存在する前記少なくとも2つのヌクレオチドは、ヒトゲノムにおいて、少なくとも1つのヌクレオチドにより分離されている、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー対の少なくとも1対は、配列番号1を含むヌクレオチド配列を有するフォワードPCRプライマー及び配列番号2を含むヌクレオチド配列を有するリバースPCRプライマーを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

請求項4

前記少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー対の少なくとも1対は、配列番号43を含むヌクレオチド配列を有するフォワードPCRプライマー及び配列番号44を含むヌクレオチド配列を有するリバースPCRプライマーを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

請求項5

前記少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー対は、第一増幅プライマー対及び第二増幅プライマー対を含み、前記第一増幅プライマー対は、配列番号1を含むヌクレオチド配列を有するフォワードPCRプライマー及び配列番号2を含むヌクレオチド配列を有するリバースPCRプライマーを含み、そして、前記第二増幅プライマー対は、配列番号43を含むヌクレオチド配列を有するフォワードPCRプライマー及び配列番号44を含むヌクレオチド配列を有するリバースPCRプライマーを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

請求項6

前記決定すること(F)が、(i)配列番号25を含むヌクレオチド配列を有する第一野生型検出プローブ、及び配列番号26、配列番号48、又は配列番号49を含むヌクレオチド配列を有する第一変異型検出プローブと;(ii)配列番号45又は配列番号47を含むヌクレオチド配列を有する第二野生型検出プローブ、及び配列番号46又は配列番号50を含むヌクレオチド配列を有する第二変異型検出プローブと;を使用することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

(A)少なくとも1つの第一増幅プライマー対及び少なくとも1つの第二増幅プライマー対を含む反応混合液を使用して、ヒト対象由来生物学的サンプルから、第124位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む第一TGFβI遺伝子配列及び第555位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む第二TGFβI遺伝子配列を含む、少なくとも2つのTGFβI遺伝子配列を増幅することと;(B)第一検出オリゴヌクレオチドプローブ対の第一検出プローブを前記第一TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズすることと;(C)第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対の第二検出プローブを前記第二TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズすることと;(D)前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ対及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対を含む少なくとも2つの検出プローブ対の使用に基づいて、前記第一TGFβI遺伝子配列及び/又は前記第二TGFβI遺伝子配列中の、1又はそれ以上の変異を検出することと;を含む、角膜ジストロフィーの検出方法。

請求項8

前記第一TGFβI遺伝子配列及び/又は前記第二TGFβI遺伝子配列中の前記1又はそれ以上の変異を検出することが、前記第一TGFβI遺伝子配列及び/又は前記第二TGFβI遺伝子配列中の2又はそれ以上の変異を検出することを含み、そして前記2又はそれ以上の変異は、ヒトゲノムにおいて、少なくとも1つのヌクレオチドにより分離されている、請求項7に記載の方法。

請求項9

前記少なくとも第一増幅プライマー対が、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、前記第一増幅プライマーが、配列番号1のヌクレオチド配列を含み、そして前記第二増幅プライマーが、配列番号2のヌクレオチド配列を含む、請求項7又は8に記載の方法。

請求項10

前記少なくとも第二増幅プライマー対が、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、前記第三増幅プライマーが、配列番号43のヌクレオチド配列で表され、そして前記第四増幅プライマーが、配列番号44のヌクレオチド配列で表される、請求項7〜9のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

前記第一増幅プライマー対が、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、前記第一増幅プライマーが、配列番号1のヌクレオチド配列を含み、前記第二増幅プライマーが、配列番号2のヌクレオチド配列を含み、前記第二増幅プライマー対が、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、前記第三増幅プライマーが、配列番号43のヌクレオチド配列を含み、そして前記第四増幅プライマーが、配列番号44のヌクレオチド配列を含む、請求項7又は8に記載の方法。

請求項12

前記1又はそれ以上の変異のうちの1つは、コードされたTGFBIタンパク質における、第124位アミノ酸での、システインに変異したアルギニン(R124C)、ヒスチジンに変異したアルギニン(R124H)、及び/又はロイシンに変異したアルギニン(R124L)に相当する、請求項7〜11のいずれか一項に記載の方法。

請求項13

前記1又はそれ以上の変異のうちの1つは、コードされたTGFBIタンパク質における、第555位アミノ酸での、トリプトファンに変異したアルギニン(R555W)、及び/又はグルタミンに変異したアルギニン(R555Q)に相当する、請求項7〜12のいずれか一項に記載の方法。

請求項14

前記少なくとも2つの検出オリゴヌクレオチドプローブ対の各々が、それぞれ、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、配列番号25〜26、配列番号25及び48、配列番号25及び49、配列番号27〜28、配列番号29〜30、配列番号31〜32、配列番号33〜34、配列番号35〜36、配列番号37〜38、配列番号39〜40、配列番号41〜42、配列番号45〜46及び配列番号46〜47、配列番号45及び50、並びに配列番号47及び50から成る群からそれぞれ選択されるヌクレオチド配列対を含む、請求項7〜13のいずれか一項に記載の方法。

請求項15

前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号25及び配列番号26のヌクレオチド配列対を含む、請求項7〜14のいずれか一項に記載の方法。

請求項16

前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号45及び配列番号46のヌクレオチド配列対を含む、請求項7〜15のいずれか一項に記載の方法。

請求項17

前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号47及び配列番号46のヌクレオチド配列対を含む、請求項7〜15のいずれか一項に記載の方法。

請求項18

前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号25及び配列番号48のヌクレオチド配列対を含む、請求項7〜15のいずれか一項に記載の方法。

請求項19

前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号25及び配列番号49のヌクレオチド配列対を含む、請求項7〜15のいずれか一項に記載の方法。

請求項20

前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号45及び配列番号50のヌクレオチド配列対を含む、請求項7〜15のいずれか一項に記載の方法。

請求項21

前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対が、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第四検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号47及び配列番号50のヌクレオチド配列対を含む、請求項7〜15のいずれか一項に記載の方法。

請求項22

前記第一検出プローブが、第一標識に結合しており、そして前記第二検出プローブが、第二標識に結合している、請求項7〜21のいずれか一項に記載の方法。

請求項23

前記第一標識が、VICであり、そして前記第二標識が、FAMである、請求項22に記載の方法。

請求項24

前記ハイブリダイズすること(B)及び前記ハイブリダイズすること(C)が、同じ溶液中で同時に実行される、請求項7に記載の方法。

請求項25

前記ハイブリダイズすること(B)及び前記ハイブリダイズすること(C)が、同じ溶液中又は異なる溶液中で同時に又は異なる時間に実行される、請求項7に記載の方法。

請求項26

(A)(1)対象由来の生物学的サンプルから、第124位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、少なくとも2つのTGFβI遺伝子配列の第一TGFβI遺伝子配列を、及び(2)対象由来の生物学的サンプルから、第555位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、少なくとも2つのTGFβI遺伝子配列の第二TGFβI遺伝子配列を、増幅しそして決定するための、第一増幅プライマー対及び第二増幅プライマー対の少なくとも1つと;(B)少なくとも2つの検出プローブ対と;を含む、ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物であって、前記少なくとも2つの検出プローブ対の各々における検出プローブが、前記少なくとも2つのTGFβI遺伝子配列の少なくとも1つとハイブリダイズする、前記反応混合物。

請求項27

前記第一増幅プライマー対が、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、前記第一増幅プライマーが、配列番号1のヌクレオチド配列を含み、そして、前記第二増幅プライマーが、配列番号2のヌクレオチド配列を含む、請求項26に記載の反応混合物。

請求項28

前記第二増幅プライマー対が、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、前記第三増幅プライマーが、配列番号43のヌクレオチド配列を含み、そして、前記第四増幅プライマーが、配列番号44のヌクレオチド配列を含む、請求項26又は27に記載の反応混合物。

請求項29

前記少なくとも2つの検出プローブ対の少なくとも1つが使用され、コードされたTGFBIタンパク質における、第124位アミノ酸での、システインに変異したアルギニン(R124C)、ヒスチジンに変異したアルギニン(R124H)、及び/又はロイシンに変異したアルギニン(R124L)に相当する変異を検出する、請求項26〜28のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項30

前記少なくとも2つの検出プローブ対の少なくとも1つが使用され、コードされたTGFBIタンパク質における、第555位アミノ酸での、トリプトファンに変異したアルギニン(R555W)、及び/又はグルタミンに変異したアルギニン(R555Q)に相当する変異を検出する、請求項26〜29のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項31

前記少なくとも2つの検出プローブ対のそれぞれの検出プローブ対が、それぞれ、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号25〜26、配列番号25及び48、配列番号25及び49、配列番号27〜28、配列番号29〜30、配列番号31〜32、配列番号33〜34、配列番号35〜36、配列番号37〜38、配列番号39〜40、配列番号41〜42、配列番号45〜46及び配列番号46〜47、配列番号45及び50、並びに配列番号47及び50から成る群からそれぞれ選択されるヌクレオチド配列対を含む、請求項26〜30のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項32

前記少なくとも2つの検出プローブ対の1つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号25及び配列番号26のヌクレオチド配列対を含む、請求項26〜31のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項33

前記少なくとも2つの検出プローブ対の1つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号45及び配列番号46のヌクレオチド配列対を含む、請求項26〜32のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項34

前記少なくとも2つの検出プローブ対の1つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号47及び配列番号46のヌクレオチド配列対を含む、請求項26〜32のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項35

前記少なくとも2つの検出プローブ対の1つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号25及び配列番号48のヌクレオチド配列対を含む、請求項26〜34のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項36

前記少なくとも2つの検出プローブ対の1つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号25及び配列番号49のヌクレオチド配列対を含む、請求項26〜35のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項37

前記少なくとも2つの検出プローブ対の1つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号45及び配列番号50のヌクレオチド配列対を含む、請求項24〜36のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項38

前記少なくとも2つの検出プローブ対の1つが、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、前記第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び前記第二検出オリゴヌクレオチドプローブが、それぞれ、配列番号47及び配列番号50のヌクレオチド配列対を含む、請求項24〜36のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項39

前記少なくとも2つの検出プローブの第一検出プローブが、第一標識に結合しており、そして前記少なくとも2つの検出プローブの第二検出プローブが、第二標識に結合している、請求項26〜38のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項40

前記第一標識が、VICであり、そして前記第二標識が、FAMである、請求項39に記載の反応混合物。

請求項41

(A)対象由来の生物学的サンプルから、TGFβI遺伝子配列を増幅しそして決定するための、少なくとも1つの第一増幅プライマー対と;(B)少なくとも3つの検出プローブのセットと;を含む、ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物であって、前記少なくとも3つの検出プローブのセットのうちの1つの検出プローブが、前記TGFβI遺伝子配列に曝露された場合に、前記TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズする、前記反応混合物。

請求項42

前記TGFβI遺伝子配列が、前記対象の前記生物学的サンプル由来の、第124位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、請求項41に記載の反応混合物。

請求項43

前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号25〜42及び48〜49からなる群から選択される少なくとも1つの検出プローブを含む、請求項41又は42に記載の反応混合物。

請求項44

前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号25〜42及び48〜49からなる群から選択される少なくとも2つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項41〜43のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項45

前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号25〜42及び48〜49からなる群から選択される少なくとも3つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項41〜44のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項46

前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号25の第一検出プローブ及び配列番号26の第二検出プローブを含む、請求項41〜45のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項47

前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号48及び配列番号49からなる群から選択される第三検出プローブを含む、請求項46に記載の反応混合物。

請求項48

前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、第三検出プローブとは異なりそして配列番号48及び配列番号49からなる群から選択される第四検出プローブを含む、請求項47に記載の反応混合物。

請求項49

前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号26及び48〜49からなる群から選択される少なくとも2つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項41〜45のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項50

前記第一増幅プライマー対が、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、前記第一増幅プライマーが、配列番号1のヌクレオチド配列を含み、そして前記第二増幅プライマーが、配列番号2のヌクレオチド配列を含む、請求項41〜49のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項51

(C)前記生物学的サンプルから第二TGFβI遺伝子配列を増幅しそして決定するための少なくとも1つの第二増幅プライマー対と;(D)少なくとも3つの検出プローブの第二セットと;をさらに含み、前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットのうちの1つの検出プローブが、前記第二TGFβI遺伝子配列に曝露された場合に、前記第二TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズする、請求項41〜50のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項52

前記第二TGFβI遺伝子配列が、前記対象の前記生物学的サンプル由来の、第555位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、請求項51に記載の反応混合物。

請求項53

前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットが、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも1つの検出プローブを含む、請求項51又は52に記載の反応混合物。

請求項54

前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットが、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも2つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項51〜53のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項55

前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットが、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも3つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項51〜54のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項56

前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットが、配列番号45又は配列番号47である第一検出プローブ、配列番号46である第二検出プローブ、及び配列番号50である第三検出プローブを含む、請求項51〜55のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項57

前記第二増幅プライマー対が、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、前記第三増幅プライマーが、配列番号43のヌクレオチド配列を含み、そして前記第四増幅プライマーが、配列番号44のヌクレオチド配列を含む、請求項51〜56のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項58

前記TGFβI遺伝子配列が、前記対象の前記生物学的サンプル由来の、第555位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、請求項41に記載の反応混合物。

請求項59

前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも1つの検出プローブを含む、請求項41又は58に記載の反応混合物。

請求項60

前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも2つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項41及び58〜59のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項61

前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも3つ又はそれ以上の検出プローブを含む、請求項41及び58〜60のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項62

前記少なくとも3つの検出プローブのセットが、配列番号45又は配列番号47である第一検出プローブ、配列番号46である第二検出プローブ、及び配列番号50である第三検出プローブを含む、請求項41及び58〜61のいずれか一項に記載の反応混合物。

請求項63

(A−1)少なくとも1つの第一増幅プライマー対及び少なくとも3つの検出プローブのセットを含む反応混合物を使用して、ヒト対象の生物学的サンプルから、第一TGFβI遺伝子配列を増幅することと;(B−1)少なくとも3つの検出プローブのセットの第一検出プローブを前記第一TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズすることと;(C−1)(i)前記少なくとも3つの検出プローブのセットの前記第一検出プローブの、前記第一TGFβI遺伝子配列へのハイブリダイゼーション、並びに(ii)第一TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズするための、前記少なくとも3つの検出プローブのセットの第二及び第三検出プローブの不成功、に基づいて、前記第一TGFβI遺伝子配列中の変異を検出することと;を含む、角膜ジストロフィー検出方法。

請求項64

前記反応混合物が、請求項41〜50及び58〜62のいずれか一項に記載の反応混合物を含む、請求項63に記載の方法。

請求項65

(A−2)同じ反応混合物を使用して、前記生物学的サンプルから、第二TGFβI遺伝子配列を増幅することと、ここで、前記反応混合物は、少なくとも1つの第二増幅プライマー対及び少なくとも3つの検出プローブの第二セットを含ものとし;(B−2)前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットの第一検出プローブを前記第二TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズすることと;(C−2)(i)前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットの前記第一検出プローブの、第二TGFβI遺伝子配列へのハイブリダイゼーション、並びに(ii)前記第二TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズするための、前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットの第二検出プローブ及び第三検出プローブの不成功、に基づいて、前記第二TGFβI遺伝子配列中の変異を検出することと;をさらに含む、請求項63又は64に記載の方法。

請求項66

前記反応混合物が、請求項51〜57のいずれか一項に記載の反応混合物を含む、請求項65に記載の方法。

請求項67

前記増幅すること(A−1)、前記増幅すること(A−2)、前記ハイブリダイズすること(B−1)、前記ハイブリダイズすること(B−2)、前記検出すること(C−1)、及び前記検出すること(C−2)が、前記生物学的サンプルの同じアリコートを用いて実行される、請求項65又は66に記載の方法。

請求項68

前記第一TGFβI遺伝子配列を増幅すること(A−1)及び前記第二TGFβI遺伝子配列を増幅すること(A−2)が、同時に実行される、請求項65〜67のいずれか一項に記載の方法。

請求項69

前記ハイブリダイズすること(B−1)及び前記ハイブリダイズすること(B−2)が、同時に実行される、請求項65〜68のいずれか一項に記載の方法。

請求項70

前記検出すること(C−1)及び前記検出すること(C−2)が、同時に実行される、請求項65〜69のいずれか一項に記載の方法。

請求項71

ヒト対象におけるヘテロ接合性角膜ジストロフィーの検出を通して、前記対象におけるレーザー眼科手術後の合併症リスク予測するための、請求項7〜70のいずれかに記載の反応混合物の使用。

請求項72

前記レーザー眼科手術が、レーシック及びエキシマレーザー手術のうちの1つを含む、請求項71に記載の使用。

請求項73

(A)基材の先端に付着したヒト対象の上皮細胞を提供することと;(B)前記基材に付着した細胞を溶解する溶解液中で前記基材の前記先端を撹拌することと;(C)前記撹拌すること(B)が完了するとすぐに、前記溶解液から前記基材を除去することと;(D)前記除去すること(C)の後に、前記溶解液をインキュベートすることと;(E)前記溶解液からゲノムDNAを単離して、gDNA溶液を形成することと;(F)少なくとも1つの第一プライマー対、少なくとも3つの検出プローブのセット、及び前記gDNA溶液を使用して、前記gDNA溶液を前記少なくとも3つの検出プローブに同時に曝露することにより、TGFβI遺伝子中に存在する少なくとも1つのヌクレオチドの同一性を決定することと;を含む、ヒト対象由来のサンプルにおける角膜ジストロフィーに関連するゲノム変異の検出方法であって、前記少なくとも1つのヌクレオチドが、角膜ジストロフィーに関連する一塩基多型(SNP)に相当する前記TGFβI遺伝子の特定の位置に位置し、そして、前記少なくとも3つの検出プローブのセットのうち少なくとも2つの検出プローブの各々が、前記TGFβI遺伝子の特定の位置の異なる変異を検出するように設計されている、前記方法。

請求項74

(G)少なくとも1つの第二プライマー対、少なくとも3つの検出プローブの第二セット、及び前記gDNA溶液を使用して、前記gDNA溶液を前記少なくとも3つの検出プローブのセット及び前記少なくとも3つの検出プローブの第二セットに同時に曝露することにより、前記TGFβI遺伝子中に存在する少なくとも1つの第二ヌクレオチドの同一性を決定することをさらに含み、前記少なくとも1つの第二ヌクレオチドが、前記少なくとも1つのヌクレオチドの位置から独立している、角膜ジストロフィーに関連する第二一塩基多型(SNP)に相当するT前記GFβI遺伝子の第二の特定の位置に位置しており、そして、前記少なくとも3つの検出プローブの前記第二セットのうちの少なくとも2つの検出プローブが、前記TGFβI遺伝子の前記第二の特定の位置のそれぞれの変異を検出するように設計されている、請求項73に記載の方法。

請求項75

前記決定すること(F)及び前記決定すること(G)が、同時に実行される、請求項75に記載の方法。

請求項76

前記決定すること(F)及び前記決定すること(G)が、同じgDNA溶液を使用して実行される、請求項74又は75に記載の方法。

技術分野

0001

本出願は、全体として疾患関連の遺伝子アレルの単離及び検出方法に関する。特に、本出願は、アベリノ角膜ジストロフィーに関連するアレルの改良された検出方法に関する。

背景技術

0002

リアルタイムPCRは、実質的に同一の配列を有する核酸配列間相違を検出するために使用されることができる。示差的に標識された蛍光核酸プローブ、例えば、一方は野生型配列に結合しそして一方は変異体配列に結合するものの使用により、ヒトのゲノムにおける単一ヌクレオチドの変化を迅速かつ確実に検出することができる。この解決力は、一塩基多型(SNP)、すなわち、タンパク質コード配列及び/又は非コード配列内に見出される単一の塩基変化ヒト疾患相関している医学診断に適用されている。

0003

しかし、リアルタイムPCR分析は、高品質サンプルの収集及び単離に大きく依存する。質の悪いサンプル収集及び/又は単離は、より長いアッセイ条件及びリアルタイムPCR試薬のより多い使用を必要とし、その両方がコスト増加及び生産性の低下につながる。また、リアルタイムPCRの一塩基多型検出アッセイの失敗は、追加サンプルを収集する必要性をもたらす可能性があり、それは時間と資源においてさらに大きな損失を引き起こす。

0004

従って、アッセイの全体的な成功率を向上させる、改良されたサンプル収集及び単離をもたらす方法は、アッセイに必要な試薬を削減し、そして後になってからの追加のサンプル収集の必要性を減少し、非常に望ましい。また、サンプル材料のより少ない量でリアルタイムPCRSNP検出アッセイを実施するための方法もまた、高品質サンプルの収集及び単離に伴う課題を減少させる。

0005

角膜ジストロフィーは、最初に患者角膜の中央に視力障害を呈する、常染色体優性遺伝性疾患であることがある。視力障害は角膜の周辺部に向かって広がり年齢が上がるにつれて、患者の視力を悪化させる。アベリノ角膜ジストロフィー、果粒状角膜ジストロフィー、格子1型角膜ジストロフィー、ティール−ベンケ、及びレイス・バックラー角膜ジストロフィー(Reis-bucklers corneal dystrophy)を含む、複数の種類の角膜ジストロフィーの特徴付けがされている。角膜ジストロフィーは、少なくともいくつかのケースでは、βIG−H3タンパク質(TGFβIタンパク質、TGFBIタンパク質、及びケラエピセリン(keratoepithelin)としても知られている)をコードするトランスフォーム増殖因子β誘導(transforming growth factor beta induced)(TGFβIとも略される)遺伝子の変異により引き起こされることが知られている。

0006

アベリノ角膜ジストロフィーを患うヘテロ接合患者は、年齢とともに視力の喪失を増加させており、人生の晩年において重症化する(severe in the later years of life)。対照的に、ホモ接合の患者は、6までに深刻さを示し、視力の損失を完了する。アベリノ角膜ジストロフィーは、角膜ジストロフィーの特殊な種類として1988年に最初に認識された。その前は、顆粒状角膜ジストロフィーとして誤分類されがちであった。今日では、アベリノ角膜ジストロフィーは、世界中で最も一般的な間質角膜ジストロフィーの形態であることが知られている。韓国では、アベリノ角膜ジストロフィーは、おおよそ870人に1人の有病率(prevalence)を有すると考えられている(Lee, J. H. et al., Ophthalmic Epidemiol., 17:160, 2010参照; Holland, E. J. et al., Ophthalmology, 99:1564, 1992; Kennedy, S. M. et al., Br. J. Ophthalmol., 80:489, 1996; Dolmetsch, A. M. et al., Can. J. Ophthalmol., 31:29, 1996; Afshari, N. A. et al., Arch. Ophthalmol., 119:16, 2001; Stewart, H. S. Hum. Mutat., 14:126, 1999も参照)。

0007

これまでに、(例えば、野生型βIG−H3アレル1つと変異体βIG−H3アレル1つとを有する)ヘテロ接合個体は、レーシック手術後の視力喪失加速に対して非常に影響を受けやすいことが発見されている。特に、手術2年後の角膜の不透明度(opacity)の増加が、これらの悪性が深刻化している(increasing aggressiveness)患者で確認され、最終的には、視力の完全な喪失をもたらす(Jun, R. M. et al., Opthalmology, 111:463, 2004)。以前は、目の手術は、レーシック又はエキシマレーザー手術が角膜ジストロフィーを患う患者の視界混濁(vision blurriness)を取り除くであろうことを期待して行われていた。レーシック手術の仮定の数30万例について、アベリノ角膜ジストロフィーを患っているヘテロ接合患者の最小推定の1/1000に基づくと、300人がその視力を失っているであろう。レーシック手術を受けた患者は、主に生産活動を行っている20歳代、30歳代である。したがって、彼らの視力喪失は、社会経済との両方に深刻なトラブルを引き起こす。

0008

また、米国では2000年のレーシック手術の承認後、レーシック手術を受けたアベリノ角膜ジストロフィーを患っているアフリカ系アメリカ人の患者が失明することが発見されており、これにより、世界中で多くの同様のケースが発生する可能性があることが推測される。

0009

従って、レーシック手術によるアベリノ角膜ジストロフィーの進行を防止するためにアベリノ角膜ジストロフィーの正確な診断が必要とされるが、アベリノ角膜ジストロフィーの診断は、単に角膜混濁顕微鏡的観察(例えば、細隙灯検査(slit-lamp examination))により行っており、したがって、多くの場合、医師が患者の潜在症状を見落とし、視力喪失をもたらすレーシック手術を実行する。従って、角膜ジストロフィーの迅速かつ正確な遺伝子診断が求められている。

0010

アベリノ角膜ジストロフィーの原因であるβIG−H3遺伝子における変異検出用DNAチップが開発された(韓国特許公開第10−2007−0076532号公報)。しかし、DNAチップを使用するアベリノ角膜ジストロフィーの診断は、不利益なことに、サンプル中のDNAを増幅する工程、DNAチップに増幅したDNAをハイブリダイズする工程、ハイブリダイズされたDNAチップを洗浄する工程、及び肯定的な応答を検出する工程を含む複数工程を必要とする。

0011

前記背景を考慮すると、当該技術分野において必要とされるものは、角膜ジストロフィーに関連する多数の変異アレルの改良された検出方法である。

0012

本開示は、ヒトの疾患に関連する1つ又はそれ以上のアレルの改良された検出方法を提供する。以下に記載する方法は、対象に関する医療情報を得るアッセイの実施に関連する時間と費用とを減少させる。例えば、いくつかの実施態様では、改良された方法は、患者に対して低い費用で、アベリノ角膜ジストロフィーに関連するゲノムマーカーの同日の検出(same-day detection)を可能にする。

0013

いくつかの実施態様では、対象由来のサンプルにおける、角膜ジストロフィーに関連する1つ又はそれ以上のゲノムのアレルの改良された検出方法を提供し、この方法は、(A)基材の先端に付着した対象の上皮細胞を提供することと;(B)基材に付着した細胞を溶解する溶解液中で、基材の先端を撹拌することと;(C)撹拌すること(B)が完了するとすぐに、溶解液から基材を除去することと;(D)除去すること(C)の後に溶解液をインキュベートすることと;(E)溶解液からゲノムDNAを単離してgDNA溶液を形成することと;(F)少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー対及びgDNA溶液を使用して、TGFβI遺伝子中に存在する少なくとも2つのヌクレオチドの同一性を決定することとを含み、ここで、前記少なくとも2つのヌクレオチドは、角膜ジストロフィーに関連するそれぞれの独立した一塩基多型(SNP)に相当するTGFβI遺伝子のそれぞれの独立した位置に位置している。

0014

いくつかの実施態様では、TGFβI遺伝子中に存在する少なくとも2つのヌクレオチドは、ヒトゲノムにおいて、少なくとも1つのヌクレオチドにより分離されている。

0015

いくつかの実施態様では、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー対の少なくとも1対は、配列番号1を含むヌクレオチド配列を有するフォワードPCRプライマー及び配列番号2を含むヌクレオチド配列を有するリバースPCRプライマーを含む。

0016

いくつかの実施態様では、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー対の少なくとも1対は、配列番号43を含むヌクレオチド配列を有するフォワードPCRプライマー及び配列番号44を含むヌクレオチド配列を有するリバースPCRプライマーを含む。

0017

いくつかの実施態様では、少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプライマー対は、第一増幅プライマー対及び第二増幅プライマー対を含む。第一増幅プライマー対は、配列番号1を含むヌクレオチド配列を有するフォワードPCRプライマー及び配列番号2を含むヌクレオチド配列を有するリバースPCRプライマーを含む。第二増幅プライマー対は、配列番号43を含むヌクレオチド配列を有するフォワードPCRプライマー及び配列番号44を含むヌクレオチド配列を有するリバースPCRプライマーを含む。

0018

いくつかの実施態様では、決定すること(F)は、(i)配列番号25を含むヌクレオチド配列を有する第一野生型検出プローブ、及び配列番号26、配列番号48、又は配列番号49を含むヌクレオチド配列を有する第一変異型検出プローブと、(ii)配列番号45又は配列番号47を含むヌクレオチド配列を有する第二野生型検出プローブ、及び配列番号46又は配列番号50を含むヌクレオチド配列を有する第二変異型検出プローブとを使用することをさらに含む。

0019

いくつかの実施態様では、本開示は、角膜ジストロフィーの検出方法を提供し、この方法は、(A)少なくとも1つの第一増幅プライマー対及び少なくとも1つの第二増幅プライマー対を含む反応混合液を使用して、ヒト対象由来生物学的サンプルから、第124位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む第一TGFβI遺伝子配列及び第555位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む第二TGFβI遺伝子配列を含む少なくとも2つのTGFβI遺伝子配列を増幅することと;(B)第一検出オリゴヌクレオチドプローブ対の第一検出プローブを第一TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズすることと;(C)第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対の第二検出プローブを第二TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズすることと;(D)第一検出オリゴヌクレオチドプローブ対及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対を含む少なくとも2つの検出プローブ対の使用に基づいて、第一TGFβI遺伝子配列及び/又は第二TGFβI遺伝子配列中の1又はそれ以上の変異を検出することとを含む。

0020

いくつかの実施態様では、第一TGFβI遺伝子配列及び/又は第二TGFβI遺伝子配列中の1又はそれ以上の変異を検出することは、第一TGFβI遺伝子配列及び/又は第二TGFβI遺伝子配列中の2又はそれ以上の変異を検出することを含み、そして2又はそれ以上の変異は、ヒトゲノムにおいて、少なくとも1つのヌクレオチドにより分離されている。

0021

いくつかの実施態様では、少なくとも第一増幅プライマー対は、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、第一増幅プライマーは、配列番号1のヌクレオチド配列を含み、そして第二増幅プライマーは、配列番号2のヌクレオチド配列を含む。

0022

いくつかの実施態様では、少なくとも第二増幅プライマー対は、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、第三増幅プライマーは、配列番号43のヌクレオチド配列で表され、そして第四増幅プライマーは、配列番号44のヌクレオチド配列で表される。

0023

いくつかの実施態様では、第一増幅プライマー対は、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、第一増幅プライマーは、配列番号1のヌクレオチド配列を含み、第二増幅プライマーは、配列番号2のヌクレオチド配列を含み、第二増幅プライマー対は、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、第三増幅プライマーは、配列番号43のヌクレオチド配列を含み、そして第四増幅プライマーは、配列番号44のヌクレオチド配列を含む。

0024

いくつかの実施態様では、1又はそれ以上の変異のうちの1つは、コードされたTGFBIタンパク質における、第124位アミノ酸での、システインに変異したアルギニン(R124C)、ヒスチジンに変異したアルギニン(R124H)、及び/又はロイシンに変異したアルギニン(R124L)に相当する。

0025

いくつかの実施態様では、1又はそれ以上の変異のうちの1つは、コードされたTGFBIタンパク質における、第555位アミノ酸での、トリプトファンに変異したアルギニン(R555W)、及び/又はグルタミンに変異したアルギニン(R555Q)に相当する。

0026

いくつかの実施態様では、少なくとも2つの検出オリゴヌクレオチドプローブ対の各々は、それぞれ、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号25〜26、配列番号25及び48、配列番号25及び49、配列番号27〜28、配列番号29〜30、配列番号31〜32、配列番号33〜34、配列番号35〜36、配列番号37〜38、配列番号39〜40、配列番号41〜42、配列番号45〜46及び配列番号46〜47、配列番号45及び50、並びに配列番号47及び50から成る群からそれぞれ選択されるヌクレオチド配列対を含む。

0027

いくつかの実施態様では、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ対は、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号25及び配列番号26のヌクレオチド配列対を含む。

0028

いくつかの実施態様では、第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対は、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号45及び配列番号46のヌクレオチド配列対を含む。

0029

いくつかの実施態様では、第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対は、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号47及び配列番号46のヌクレオチド配列対を含む。

0030

いくつかの実施態様では、第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対は、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号25及び配列番号48のヌクレオチド配列対を含む。

0031

いくつかの実施態様では、第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対は、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号25及び配列番号49のヌクレオチド配列対を含む。

0032

いくつかの実施態様では、第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対は、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号45及び配列番号50のヌクレオチド配列対を含む。

0033

いくつかの実施態様では、第二検出オリゴヌクレオチドプローブ対は、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第三検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第四検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号47及び配列番号50のヌクレオチド配列対を含む。

0034

いくつかの実施態様では、第一検出プローブは、第一標識に結合しており、そして第二検出プローブは、第二標識に結合している。

0035

いくつかの実施態様では、第一標識は、VICであり、そして第二標識は、FAMである。

0036

いくつかの実施態様では、ハイブリダイズすること(B)及びハイブリダイズすること(C)は、同じ溶液中で同時に実行される。

0037

いくつかの実施態様では、ハイブリダイズすること(B)及びハイブリダイズすること(C)は、同じ溶液中又は異なる溶液中で同時に又は異なる時間に実行される。

0038

いくつかの実施態様では、本開示は、ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物を提供し、この反応混合物は、(A)(1)対象由来の生物学的サンプルから、第124位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、少なくとも2つのTGFβI遺伝子配列の第一TGFβI遺伝子配列を、及び(2)対象由来の生物学的サンプルから、第555位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む、少なくとも2つのTGFβI遺伝子配列の第二TGFβI遺伝子配列を増幅し、そして決定するための、第一増幅プライマー対及び第二増幅プライマー対の少なくとも1つと、(B)少なくとも2つの検出プローブ対と、を含み、少なくとも2つの検出プローブ対の各々における検出プローブは、少なくとも2つのTGFβI遺伝子配列の少なくとも1つとハイブリダイズする。

0039

いくつかの実施態様では、第一増幅プライマー対は、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、第一増幅プライマーは、配列番号1のヌクレオチド配列を含み、そして、第二増幅プライマーは、配列番号2のヌクレオチド配列を含む。

0040

いくつかの実施態様では、第二増幅プライマー対は、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、第三増幅プライマーは、配列番号43のヌクレオチド配列を含み、そして、第四増幅プライマーは、配列番号44のヌクレオチド配列を含む。

0041

いくつかの実施態様では、少なくとも2つの検出プローブ対の少なくとも1つが使用され、コードされたTGFBIタンパク質における、第124位アミノ酸での、システインに変異したアルギニン(R124C)、ヒスチジンに変異したアルギニン(R124H)、及び/又はロイシンに変異したアルギニン(R124L)に相当する変異を検出する。

0042

いくつかの実施態様では、少なくとも2つの検出プローブ対の少なくとも1つが使用され、コードされたTGFBIタンパク質における、第555位アミノ酸での、トリプトファンに変異したアルギニン(R555W)、及び/又はグルタミンに変異したアルギニン(R555Q)に相当する変異を検出する。

0043

いくつかの実施態様では、少なくとも2つの検出プローブ対のそれぞれの検出プローブ対は、それぞれ、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号25〜26、配列番号25及び48、配列番号25及び49、配列番号27〜28、配列番号29〜30、配列番号31〜32、配列番号33〜34、配列番号35〜36、配列番号37〜38、配列番号39〜40、配列番号41〜42、配列番号45〜46及び配列番号46〜47、配列番号45及び50、並びに配列番号47及び50から成る群からそれぞれ選択されるヌクレオチド配列対を含む。

0044

いくつかの実施態様では、少なくとも2つの検出プローブ対の1つは、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号25及び配列番号26のヌクレオチド配列対を含む。

0045

いくつかの実施態様では、少なくとも2つの検出プローブ対の1つは、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号45及び配列番号46のヌクレオチド配列対を含む。

0046

いくつかの実施態様では、少なくとも2つの検出プローブ対の1つは、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号47及び配列番号46のヌクレオチド配列対を含む。

0047

いくつかの実施態様では、少なくとも2つの検出プローブ対の1つは、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号25及び配列番号48のヌクレオチド配列対を含む。

0048

いくつかの実施態様では、少なくとも2つの検出プローブ対の1つは、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号25及び配列番号49のヌクレオチド配列対を含む。

0049

いくつかの実施態様では、少なくとも2つの検出プローブ対の1つは、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号45及び配列番号50のヌクレオチド配列対を含む。

0050

いくつかの実施態様では、少なくとも2つの検出プローブ対の1つは、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブを含み、第一検出オリゴヌクレオチドプローブ及び第二検出オリゴヌクレオチドプローブは、それぞれ、配列番号47及び配列番号50のヌクレオチド配列対を含む。

0051

いくつかの実施態様では、少なくとも2つの検出プローブの第一検出プローブは、第一標識に結合しており、そして少なくとも2つの検出プローブの第二検出プローブは、第二標識に結合している。

0052

いくつかの実施態様では、第一標識は、VICであり、そして第二標識は、FAMである。

0053

いくつかの実施態様では、本開示は、ヒト対象における角膜ジストロフィー検出用反応混合物を提供し、この反応混合物は、(A)対象由来の生物学的サンプルから、TGFβI遺伝子配列を増幅しそして決定するための、少なくとも1つの第一増幅プライマー対と、(B)少なくとも3つの検出プローブのセットとを含み、少なくとも3つの検出プローブのセットのうちの1つの検出プローブは、TGFβI遺伝子配列に曝露された場合に、TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズする。

0054

いくつかの実施態様では、TGFβI遺伝子配列は、対象の生物学的サンプル由来の、第124位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む。

0055

いくつかの実施態様では、少なくとも3つの検出プローブのセットは、配列番号25〜42及び48〜49からなる群から選択される少なくとも1つの検出プローブを含む。

0056

いくつかの実施態様では、少なくとも3つの検出プローブのセットは、配列番号25〜42及び48〜49からなる群から選択される少なくとも2つ又はそれ以上の検出プローブを含む。

0057

いくつかの実施態様では、少なくとも3つの検出プローブのセットは、配列番号25〜42及び48〜49からなる群から選択される少なくとも3つ又はそれ以上の検出プローブを含む。

0058

いくつかの実施態様では、少なくとも3つの検出プローブのセットは、配列番号25の第一検出プローブ及び配列番号26の第二検出プローブを含む。

0059

いくつかの実施態様では、少なくとも3つの検出プローブのセットは、配列番号48及び配列番号49からなる群から選択される第三検出プローブを含む。

0060

いくつかの実施態様では、少なくとも3つの検出プローブのセットは、第三検出プローブとは異なりそして配列番号48及び配列番号49からなる群から選択される第四検出プローブを含む。

0061

いくつかの実施態様では、少なくとも3つの検出プローブのセットは、配列番号26及び48〜49からなる群から選択される少なくとも2つ又はそれ以上の検出プローブを含む。

0062

いくつかの実施態様では、第一増幅プライマー対は、第一増幅プライマー及び第二増幅プライマーを含み、第一増幅プライマーは、配列番号1のヌクレオチド配列を含み、そして第二増幅プライマーは、配列番号2のヌクレオチド配列を含む。

0063

いくつかの実施態様では、反応混合物は、(C)生物学的サンプルから第二TGFβI遺伝子配列を増幅しそして決定するための少なくとも1つの第二増幅プライマー対と、(D)少なくとも3つの検出プローブの第二セットとをさらに含み、少なくとも3つの検出プローブの第二セットのうちの1つの検出プローブは、第二TGFβI遺伝子配列に曝露された場合に、第二TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズする。

0064

いくつかの実施態様では、第二TGFβI遺伝子配列は、対象の生物学的サンプル由来の、第555位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む。

0065

いくつかの実施態様では、少なくとも3つの検出プローブの第二セットは、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも1つの検出プローブを含む。

0066

いくつかの実施態様では、少なくとも3つの検出プローブの第二セットは、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも2つ又はそれ以上の検出プローブを含む。

0067

いくつかの実施態様では、少なくとも3つの検出プローブの第二セットは、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも3つ又はそれ以上の検出プローブを含む。

0068

いくつかの実施態様では、少なくとも3つの検出プローブの第二セットは、配列番号45又は配列番号47である第一検出プローブ、配列番号46である第二検出プローブ、及び配列番号50である第三検出プローブを含む。

0069

いくつかの実施態様では、第二増幅プライマー対は、第三増幅プライマー及び第四増幅プライマーを含み、第三増幅プライマーは、配列番号43のヌクレオチド配列を含み、そして第四増幅プライマーは、配列番号44のヌクレオチド配列を含む。

0070

いくつかの実施態様では、TGFβI遺伝子配列は、対象の生物学的サンプル由来の、第555位アミノ酸残基をコードするヌクレオチドを含む。

0071

いくつかの実施態様では、少なくとも3つの検出プローブのセットは、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも1つの検出プローブを含む。

0072

いくつかの実施態様では、少なくとも3つの検出プローブのセットは、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも2つ又はそれ以上の検出プローブを含む。

0073

いくつかの実施態様では、少なくとも3つの検出プローブのセットは、配列番号45〜47及び50からなる群から選択される少なくとも3つ又はそれ以上の検出プローブを含む。

0074

いくつかの実施態様では、少なくとも3つの検出プローブのセットは、配列番号45又は配列番号47である第一検出プローブ、配列番号46である第二検出プローブ、及び配列番号50である第三検出プローブを含む。

0075

いくつかの実施態様では、本開示は、角膜ジストロフィー検出方法を提供し、この方法は、(A−1)少なくとも1つの第一増幅プライマー対及び少なくとも3つの検出プローブのセットを含む反応混合物を使用して、ヒト対象の生物学的サンプルから、第一TGFβI遺伝子配列を増幅することと;(B−1)少なくとも3つの検出プローブのセットの第一検出プローブを第一TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズすることと;(C−1)(i)少なくとも3つの検出プローブのセットの第一検出プローブの第一TGFβI遺伝子配列へのハイブリダイゼーション、並びに(ii)第一TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズするための、少なくとも3つの検出プローブのセットの第二及び第三検出プローブの不成功、に基づいて、第一TGFβI遺伝子配列中の変異を検出することとを含む。

0076

いくつかの実施態様では、この方法は、(A−2)同じ反応混合物を使用して、生物学的サンプルから、第二TGFβI遺伝子配列を増幅することと、ここで、反応混合物は、少なくとも1つの第二増幅プライマー対及び少なくとも3つの検出プローブの第二セットを含み;(B−2)少なくとも3つの検出プローブの第二セットの第一検出プローブを第二TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズすることと;(C−2)(i)少なくとも3つの検出プローブの第二セットの第一検出プローブの第一TGFβI遺伝子配列へのハイブリダイゼーション、並びに(ii)並びに(ii)第二TGFβI遺伝子配列にハイブリダイズするための、少なくとも3つの検出プローブの第二セットの第二検出プローブ及び第三検出プローブの不成功、に基づいて、第二TGFβI遺伝子配列中の変異を検出することとをさらに含む。

0077

いくつかの実施態様では、増幅すること(A−1)、増幅すること(A−2)、ハイブリダイズすること(B−1)、ハイブリダイズすること(B−2)、検出すること(C−1)、及び検出すること(C−2)は、生物学的サンプルの同じアリコートを用いて実行される。

0078

いくつかの実施態様では、第一TGFβI遺伝子配列を増幅すること(A−1)及び第二TGFβI遺伝子配列を増幅すること(A−2)は、同時に実行される。

0079

いくつかの実施態様では、ハイブリダイズすること(B−1)及びハイブリダイズすること(B−2)は、同時に実行される。

0080

いくつかの実施態様では、検出すること(C−1)及び検出すること(C−2)は、同時に実行される。

0081

いくつかの実施態様では、反応混合物は、上記の特徴のいくつかを有している。簡潔にするために、前記の詳細はここでは繰り返されない。

0082

いくつかの実施態様では、本開示は、ヒト対象におけるヘテロ接合性角膜ジストロフィーの検出を通して対象におけるレーザー眼科手術後の合併症リスク予測するための、上記のいずれかに記載されるような反応混合物の使用を提供する。

0083

いくつかの実施態様では、レーザー眼科手術は、レーシック及びエキシマレーザー手術のうちの1つを含む。

0084

いくつかの実施態様では、本開示は、ヒト対象由来のサンプルにおける角膜ジストロフィーに関連するゲノム変異の検出方法を提供し、この方法は、(A)基材の先端に付着したヒト対象の上皮細胞を提供することと;(B)基材に付着した細胞を溶解する溶解液中で基材の先端を撹拌することと;(C)撹拌すること(B)が完了するとすぐに、溶解液から基材を除去することと;(D)除去すること(C)の後に溶解液をインキュベートすることと;(E)溶解液からゲノムDNAを単離してgDNA溶液を形成することと;(F)少なくとも1つの第一プライマー対、少なくとも3つの検出プローブのセット、及びgDNA溶液を使用して、gDNA溶液を少なくとも3つの検出プローブに同時に曝露することにより、TGFβI遺伝子中に存在する少なくとも1つのヌクレオチドの同一性を決定することとを含み、少なくとも1つのヌクレオチドは、角膜ジストロフィーに関連する一塩基多型(SNP)に相当するTGFβI遺伝子の特定の位置に位置し、そして、少なくとも3つの検出プローブのセットのうち少なくとも2つの検出プローブの各々は、TGFβI遺伝子の特定の位置の異なる変異を検出するように設計されている。

0085

いくつかの実施態様では、この方法は、(G)少なくとも1つの第二プライマー対、少なくとも3つの検出プローブの第二セット、及びgDNA溶液を使用して、gDNA溶液を少なくとも3つの検出プローブのセット及び少なくとも3つの検出プローブの第二セットに同時に曝露することにより、TGFβI遺伝子中に存在する少なくとも1つの第二ヌクレオチドの同一性を決定することをさらに含み、少なくとも1つの第二ヌクレオチドは、少なくとも1つのヌクレオチドの位置から独立している、角膜ジストロフィーに関連する第二一塩基多型(SNP)に相当するTGFβI遺伝子の第二の特定の位置に位置しており、そして、少なくとも3つの検出プローブの第二セットのうちの少なくとも2つの検出プローブは、TGFβI遺伝子の第二の特定の位置のそれぞれの変異を検出するように設計されている。

0086

いくつかの実施態様では、決定すること(F)及び決定すること(G)が、同時に実行される。

0087

いくつかの実施態様では、決定すること(F)及び決定すること(G)は、同じgDNA溶液を使用して実行される。

図面の簡単な説明

0088

いくつかの実施態様による、疾患に関連するゲノムのアレル検出用の改善された方法100を示す。

0089

いくつかの実施態様による、アベリノ角膜ジストロフィーに関連する一塩基多型のリアルタイムPCR検出用に有用なフォワード及びリバースプライマー対の配列リスト(配列番号1〜24)を提供している。

0090

いくつかの実施態様による、アベリノ角膜ジストロフィーに関連する一塩基多型のリアルタイムPCR検出用に有用な野生型及び変異型検出プローブ対の配列リスト(配列番号25〜42)を提供している。

0091

図5〜8に示されているアレル検出実験において使用されるプローブ配列及びプライマーリストを提供している。

0092

図4に記載されたプローブを用いた、R124C、R124H、R124L、R555W、及びR555Q変異体の検出に関する実験データを提供している。図5Aは、示された試薬混合物及び示されたサイクリング条件を用いた(右のパネル)、アレル識別プロットランを提供する(左のパネル)。図5Bは、正常対照と比較した様々な変異体に関するリアルタイムPCRプロットを提供する。図5Cは、ホモ接合対照と比較した様々な変異体に関するリアルタイムPCRプロットを提供する。

0093

図4に記載されたプローブを用いた、R124C、R124H、R124L、R555W、及びR555Q変異体の検出に関する実験データを提供している。図6Aは、示された試薬混合物及び示されたサイクリング条件を用いた(右のパネル)、アレル識別プロットのランを提供する(左のパネル)。図6Bは、正常対照と比較した様々な変異体に関するリアルタイムPCRプロットを提供する。図5Cは、ホモ接合対照と比較した様々な変異体に関するリアルタイムPCRプロットを提供する。

0094

図4に記載されたプローブを用いた、R124C、R124H、R124L、R555W、及びR555Q変異体の検出に関する実験データを提供している。図7は、示された試薬混合物及び示されたサイクリング条件を用いた(右のパネル)、アレル識別プロットのランを提供する(左のパネル)。

0095

図4に記載されたプローブを用いた、R124C、R124H、R124L、R555W、及びR555Q変異体の検出に関する実験データを提供している。具体的には、図8は、示された試薬混合物及び示されたサイクリング条件を用いた(右のパネル)、アレル識別プロットのランを提供する。アレル識別プロット(左のパネル)中の記号「B」は、リアルタイムPCRアッセイを実施する前に溶解バッファで前処理されたサンプルを示している。アレル識別プロット(左のパネル)中の記号「DW−A」は、リアルタイムPCRを実施する前に蒸留水で前処理されたサンプルを示している。異なるサンプル点を囲む円は、検出された各々のアレルに関して(左のパネル参照)、それぞれ、対応した2つのサンプル「B」及び「DW−A」を示しており、各々の円の中には2つの点が存在し、1つはサンプル「B」であり、そして1つは「DW−A」である。

発明の詳細な説明

0096

I.序論
疾患関連SNPの検出は、様々な医学的状態の診断及び予後のためにますます重要なツールとなっている。例えば、TGFβI遺伝子のエクソン4における単一ヌクレオチドの変化の存在が、アベリノ角膜ジストロフィーと強く関連している。このSNPのヘテロ接合の個体が、レーシック手術後の視力喪失のリスクが高いことが見出された。レーシックは多くの人々のクオリティオブライフを大きく向上させる医療処置であるが、G/A TGFβI SNPを保有する個体については、失明につながる可能性がある、4〜18月の期間にわたる段階的な視力障害の原因となる。視力障害は、より長い又はより短い期間で発生する可能性がある。幸いなことに、スクリーニングにより、レーシック処置を避けるべきである変異を有する個体を同定することができる。

0097

本開示は、改良された、サンプル単離、調製、及び分析方法の発見に少なくとも部分的に基づいている。いくつかの実施態様では、前記方法は、例えば、アッセイが失敗した又は追加のフォローアップテストを実行する必要がある場合、患者サンプルの再使用を可能にするために提供される。いくつかの実施態様では、これらの改良された方法は、患者の口腔粘膜(buccal membrane)から剥離(sloughed-off)した細胞を保有する基材(例えば、レーヨンが先端に付いた(a rayon-tipped)又は綿が先端に付いたアプリケーター(cotton-tipped applicator))を、溶解液中で(高温で20分間延長されたインキュベーションよりもむしろ)室温で30〜45秒間静かに回転させる工程を含む。次に、前記溶解液を45℃で30分間インキュベートし、溶解性を改善させそしてゲノムサンプル収率を向上させる。有利には、前記のレーヨンが先端に付いた又は綿が先端に付いたアプリケーターを、その後、再テスト用に使用されるゲノムDNAの再単離用に保存することができる(例えば、凍結又は冷蔵)。

0098

いくつかの実施態様において、本明細書で提供される改良は、リアルタイムPCR検出アッセイ用のゲノムDNAテンプレートのより少ない量の使用を通して提供される。いくつかの実施態様では、これは、実施されるリアルタイムPCRのサイクルを増加させること(例えば約40サイクル)、及び/又は95℃で3秒の変性サイクルの時間を用いることにより達成される。有利なことには、必要なサンプル量がこれらの方法によって減少することから、リアルタイムPCRに必要な試薬の量もまた減少する。診断アッセイにおいて使用される多くの試薬が特許に守られているので(proprietary)、試薬は高価である可能性がある。使用される試薬の量の減少により、試薬に関連するコストもまた有意に削減することができる。

0099

これらの個々の工程の各々を実施するための特定の条件(サンプルハンドリングインキュベーション温度反応ボリューム反応サイクル数、反応サイクル時間、反応サイクル温度)の組み合わせが、本明細書に記載される疾患関連SNP、例えばTGFβI遺伝子のエクソン4中に発見されたアベリノ角膜ジストロフィー関連SNPの検出方法を実施するために使用されることが期待される。

0100

II.定義の選択
明細書中で使用される用語「発明」又は「本発明」は、本発明の特定の実施態様のいずれかに限定することを意図せず、特許請求の範囲及び明細書に記載したように、本発明の任意の及び全ての実施態様に一般に適用される。

0101

本明細書で使用される場合、文脈が特に明確に指示しない限りは、単数形「a」、「an」及び「the」は複数の参照(plural references)を含む。したがって、例えば、「方法(the method)」の参照は、本開示を読めば当業者に明らかとなるであろう本明細書に記載の種類の方法及び/又は工程の1つ又は複数を含む。

0102

本明細書で使用される用語「多型」及びその変形は、異なるゲノム又は個体間の、2又はそれ以上の選択的なゲノム配列又はアレルの発生を意味する。用語「遺伝子変異」又は「遺伝的変異」及びその変形は、多型を含む。

0103

本明細書で使用される用語「一塩基多型」(「SNP」)とその変形は、アレル間で変化するヌクレオチドの1つの部位を意味する。一塩基多型(SNP)は、単一塩基の変化又は点変異であるが、個体間の遺伝的変異をもたらすいわゆる「インデル(indel)」変
異(ヌクレオチドの挿入又は欠失)を含む。人間の全ての遺伝的変異の約90%を構成するSNPは、3億塩基のヒトゲノムに沿って100〜300塩基毎に発生する。しかし、SNPは、ウイルスのような他の生物においてははるかに頻繁に発生する可能性がある。SNPは、ゲノムのコード又は非コード領域において生じる可能性がある。コード領域中のSNPは、タンパク質産物アミノ酸配列を変更することができ又は変更しないこともできる。非コード領域中のSNPは、プロモーター又はプロセシング部位を変更することができ、遺伝子の転写及び/又はプロセシングに影響を及ぼす可能性がある。個人が関心のあるゲノム領域に特定のSNPを有するかどうかを知ることにより、種々の疾患のための、診断、予防、及び治療用途の開発用の十分な情報を提供することができる。いくつかの実施態様において、本開示は、アベリノ角膜ジストロフィーに関連するTGFβI遺伝子のエクソン4に位置するグアニンからアデニンのSNPの検出に関する。

0104

用語「プライマー」及びその変形は、PCR反応においてDNA合成開始点として作用するオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの長さは、通常、約15〜約35ヌクレオチドでありそして標的配列相補的な領域にハイブリダイズする。

0105

用語「プローブ」及びその変形(例えば、検出プローブ)は、PCR反応において標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを意味する。標的配列は、分析されるべきである核酸の領域を意味しそして目的の多型部位を含む。

0106

特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、一般的に、本発明が属する当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似又は同等の任意の方法及び材料が、本発明の実施又は試験において使用されることができるが、方法及び材料の様々な実施態様は、本明細書に具体的に記載されている。

0107

III.サンプル調製
いくつかの実施態様において、本開示は、リアルタイムPCRの一塩基多型検出アッセイで使用されるゲノムサンプルの改良された単離方法を提供する。いくつかの実施態様では、改良された方法100は、図1で説明されている工程の組み合わせを使用する。

0108

いくつかの実施態様では、前記方法は、対象からの細胞サンプルを提供する工程を含む。いくつかの実施態様において、細胞は、患者の細胞表面を基材上に細胞を可逆的に固定化することが可能な基材に接触させることによって収集される。

0109

開示された方法は、様々なサンプルから得られた様々な細胞型に適用可能である。いくつかの実施態様では、開示された方法で使用するための細胞型としては、上皮細胞、内皮細胞結合組織細胞骨格筋細胞内分泌細胞心臓細胞尿路細胞、メラノサイトケラチノサイト血球白血球軟膜血液細胞有毛細胞(例えば、毛根細胞を含む)、及び/又は唾液腺細胞(salival cells)が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、細胞は上皮細胞である。いくつかの実施態様において、細胞は;被膜下血管周囲(subcapsular-perivascular)(上皮型1);ペール(pale)(上皮型2);中間(intermediate)(上皮型3);暗(dark)(上皮型4);未分化(undifferentiated)(上皮型5);及び大髄質(large-medullary)(上皮型6)である。いくつかの実
施態様において、細胞は、口腔上皮細胞(例えば、口腔内スワップ(buccal swap)を使
用して収集された上皮細胞)である。いくつかの実施態様では、開示される方法において使用される細胞のサンプルは、上記の特定の細胞型の任意の組み合わせを含む。

0110

いくつかの実施態様において、方法は、対象からの細胞のサンプルを提供する工程(102)を含む。いくつかの実施態様において、提供される細胞は、口腔上皮細胞である。

0111

細胞サンプルは、対象の細胞の基材への可逆的結合を可能にする様々な方法のいずれかによって収集される。いくつかの実施態様では、基材は、基材に細胞を可逆的に結合するために、対象の細胞を含有するサンプルとの物理的相互作用において用いられる。いくつかの実施態様では、基材に細胞を可逆的に結合するために、被検者の身体との物理的相互作用に直接的に用いられる。いくつかの実施態様では、サンプルは口腔細胞サンプルでありそして口腔細胞のサンプルは、膜から除去される細胞を可逆的に固定化することが可能な基材を用いて対象の口腔粘膜(例えば、の内側)に接触させることによって収集される。前記実施態様では、綿棒(swab)は、人の歯のブラッシングに相当する力を用いて対象の頬の内側に擦り付けられる(例えば、力又は圧力の軽い量)。対象の細胞が基材に可逆的に結合することを可能にする任意の方法を、開示された方法で使用することが意図される。

0112

いくつかの実施態様において、サンプルは、有利には、非侵襲的な方法で収集されそして前記サンプル収集はどこにおいても及びほとんど誰によっても達成される。例えば、いくつかの実施態様において、サンプルは、診療所、対象の自宅、又はレーシック手術が行われている又は行われるべき機関採取される。いくつかの実施態様では、患者、患者の医師、看護師若しくは医師のアシスタント、又は他の臨床担当者がサンプルを収集する。

0113

いくつかの実施態様では、基材は、細胞が可逆的に結合する様々な材料のいずれかで製造されている。典型的な基材は、レーヨン、綿、シリカエラストマーセラックアンバー天然若しくは合成ゴムセルロースベークライト(BAKEITE)、ナイロン(NYLON)、ポリスチレンポリエチレンポリプロピレンポリアクリロニトリル、又は他の材料あるいはこれらの組み合わせから製造されたものを含む。いくつかの実施態様では、基材はレーヨンの先端又は綿の先端を有する綿棒である。

0114

基材の先端(例えば、レーヨン綿棒又は綿の綿棒の先端)を、次いで、約10秒〜60秒(1分)、又は約20秒〜60秒、約20秒〜約45秒、若しくは約20秒〜約30秒、約15秒〜約60秒、約15秒〜約45秒、若しくは約15秒〜約30秒、約10秒〜約60秒、約10秒〜約45秒、約10秒〜約30秒、約10秒〜約15秒、若しくは約10秒〜約20秒溶解液中で撹拌する。いくつかの実施態様では、撹拌は、約60秒又は約1分間生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は1分未満(例えば、60秒未満)の間生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は15秒、20秒、30秒、45秒、60秒、90秒、120秒間、またはそれ以上より多くない時間生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は45秒間以下生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は30秒間以下生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は20秒間以下生じる。いくつかの実施態様では、撹拌は15秒間以下生じる。

0115

いくつかの実施態様において、撹拌は、溶解液中の基材の任意の移動を含む。いくつかの実施態様において、後の時点で及び/又はそれ以降の時間の単離のために口腔細胞の複数が基材に固定されたままであるように、基材の先端(例えば、レーヨン綿棒又は綿の綿棒の先端部)を溶解液中で静かに移動させる。溶解液中の前記の動きは、いくつかの口腔細胞が溶解液中に分散されることを可能にする一方で前記先端部に複数の前記口腔細胞が基材に固定されたままであるような溶解液中の基材の渦運動(swirling motions)、左右の動き(side to side motions)、上下の動き(up and down motions)、及び/又は浸漬する動き(dippingmotion)、又は任意の他の動きを含む。

0116

いくつかの実施態様では、撹拌工程は、例えば、室温で例えば、約15℃〜約30℃、約18℃〜約28℃、約18℃〜25℃、又は約20℃〜約25℃で実施される。

0117

撹拌後、基材(例えば、レーヨン綿棒又は綿の綿棒の先端部)は除去され、そしていくつかの実施態様では、再テスト又はさらなる(異なる又は追加の)テストに備えて後の使用のために貯蔵される。いくつかの実施態様では、基材(例えば、レーヨンの先端又は綿の先端を備えるバッカル綿棒(buccal swab))を容器に入れそして凍結保存する。いくつかの実施態様では、基材(例えば、レーヨンの先端又は綿の先端を備えるバッカル綿棒)を冷蔵する。いくつかの実施態様では、基材は、1つ又はそれ以上の追加の抽出のために未だ有用なままで維持される一方で、様々な温度のいずれか及び様々な時間のいずれかで貯蔵される。

0118

いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、0週、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、若しくは12週又はそれ以上の間保存されている。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、0週〜12週、1週〜12週、2週〜12週、3週〜12週、4週〜12週、5週〜12週、6週〜12週、7週〜12週、8週〜12週、9週、10週〜12週、又は11週〜12週の間貯蔵されている及び/又は貯蔵可能である。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、1、2、3、4、5、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、30、若しくは36月又はそれ以上の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、1月〜36月、2月〜36月、3月〜36月、4月〜36月、5月〜36月、6月〜36月、7月〜36月、8月〜36月、9月〜36月、10月〜36月、12月〜36月、14月〜36月、16月〜36月、18月〜36月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、1月〜30月、2月〜30月、3月〜30月、4月〜30月、5月〜30月、6月〜30月、7月〜30月、8月〜30月、9月〜30月、10月〜30月、12月〜30月、14月〜30月、16月〜30月、18月〜30月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、1月〜24月、2月〜24月、3月〜24月、4月〜24月、5月〜24月、6月〜24月、7月〜24月、8月〜24月、9月〜24月、10月〜24月、12月〜24月、14月〜24月、16月〜24月、18月〜24月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、1月〜22月、2月〜22月、3月〜22月、4月〜22月、5月〜22月、6月〜22月、7月〜22月、8月〜22月、9月〜22月、10月〜22月、12月〜22月、14月〜22月、16月〜22月、18月〜22月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、1月〜20月、2月〜20月、3月〜20月、4月〜20月、5月〜20月、6月〜20月、7月〜20月、8月〜20月、9月〜20月、10月〜20月、12月〜20月、14月〜20月、16月〜20月、18月〜20月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、1月〜18月、2月〜18月、3月〜18月、4月〜18月、5月〜18月、6月〜18月、7月〜18月、8月〜18月、9月〜18月、10月〜18月、12月〜18月、14月〜18月、16月〜18月、又は17月〜18月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、1月〜12月、2月〜12月、3月〜12月、4月〜12月、5月〜12月、6月〜12月、7月〜12月、8月〜12月、9月〜12月、10月〜12月、又は11月〜12月の間貯蔵される。

0119

いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約2℃、約3℃、約4℃、約5℃、約6℃、約7℃、又は約8℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約2℃〜約8℃、約3℃〜約8℃、約4℃〜約8℃、約5℃〜約8℃、約6℃〜約8℃、約7℃〜約8℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−25℃、約−24℃、約−23℃、約−22℃、約−21℃、約−20℃、約−19℃、約−18℃、約−17℃、約−16℃、又は約−15℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−25℃〜約−15℃、約−22℃〜約−17℃、約−20℃〜約−15℃、又は約−25℃〜約−20℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−90℃、約−89℃、約−88℃、約−87℃、約−86℃、約−85℃、約−84℃、約−83℃、約−82℃、約−81℃、約−80℃、約−79℃、約−78℃、約−77℃、約−76℃、約−75℃、約−74℃、約−73℃、約−72℃、約−71℃、約−70℃、約−69℃、約−68℃、約−67℃、約−66℃、又は約−65℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−90℃〜約−65℃、約−85℃〜約−65℃、約−80℃〜約−65℃、約−75℃〜約−65℃、又は約−70℃〜約−65℃で貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、−90℃〜−65℃で貯蔵される。

0120

いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、1回又はそれ以上凍結解凍され(例えば、凍結された後、サンプルを含有する基材を解凍し、本発明の方法に使用してそして再凍結する)及び/又は本発明に使用される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又はそれ以上の回数凍結解凍される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20又はそれ以上の回数使用される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、1〜20回、2〜20回、3〜20回、4〜20回、5〜20回、6〜20回、7〜20回、8〜20回、9〜20回、10〜20回、11〜20回、12〜20回、13〜20回、14〜20回、15〜20回、16〜20回、17〜20回、18〜20回、19〜20回、5〜15回、5〜10回、1〜10回、又は1〜5回凍結解凍される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、1〜20回、2〜20回、3〜20回、4〜20回、5〜20回、6〜20回、7〜20回、8〜20回、9〜20回、10〜20回、11〜20回、12〜20回、13〜20回、14〜20回、15〜20回、16〜20回、17〜20回、18〜20回、19〜20回、5〜15回、5〜10回、1〜10回、1〜5回、1〜4回、1〜3回、又は1〜2回使用される。

0121

いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、室温で又は約15℃〜約30℃で1週間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約2℃〜約8℃又は約4℃で約1、2、又は3週間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−25℃〜約−15℃又は約−20℃で約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12月の間貯蔵される。いくつかの実施態様では、サンプルを含有する基材は、約−90℃〜約−65℃又は約−80℃で約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、又は12月の間貯蔵される。

0122

有利に及び驚くべきことに、基材から抽出された細胞数の減少は、個々の細胞からの核酸の抽出物の増加によって相殺されることが見出された。いくつかの実施態様では、増加した抽出物は、標準的な慣行(standard practices)と比較して細胞を長時間インキュベーションすること、標準的な慣行と比較して高い温度で細胞をインキュベーションすること、又はその組み合わせにより達成される。

0123

いくつかの実施態様では、細胞の核酸の抽出物の増加は、標準的な慣行と比較して増加させた又はより長い期間の抽出物インキュベーションを実施することにより達成される。いくつかの実施態様では、抽出物インキュベーションは、約45分間、例えば45±5、45±10、45±15、又は45±20分間実施される。いくつかの実施態様においては、抽出物インキュベーションは、約25分〜約65分、約30分〜約60分、約35分〜約55分、約45分〜約65分、約45分〜約55分、又は約40分〜約50分の間実施される。抽出物インキュベーション時間は、約25分、約30分、約35分、約40分、約45分、約50分、約55分、約60分、又は約65分である。

0124

いくつかの実施態様では、細胞の核酸の抽出物の増加は、標準的な慣行と比較して増加した又は高い温度の抽出物インキュベーションにより達成される。いくつかの実施態様では、抽出物インキュベーションは、約45℃、例えば45±2℃、45±5℃、又は45±10℃で実施される。いくつかの実施態様では、抽出物インキュベーション温度は、約35℃〜約55℃、約40℃〜約50℃、又は約43℃〜約47℃である。いくつかの実施態様では、抽出物インキュベーション温度は、約43℃、約44℃、約45℃、約46℃、約47℃、約48℃、約49℃、約50℃、約51℃、約52℃、約53℃、約54℃、又は約55℃である。いくつかの実施態様では、1より多い抽出温度が使用される。例えば、いくつかの実施態様では、基準温度は、抽出の一部のために使用され、そして、上昇させた温度が抽出の別の部分のために使用される。

0125

いくつかの実施態様では、実質的に少ない数の細胞が基材から次に続く本発明のシステム及び方法の溶解のために放出される。いくつかの実施態様では、細胞の少なくとも1個、細胞の少なくとも2個、細胞の少なくとも5個、細胞の少なくとも10個、細胞の少なくとも15個、細胞の少なくとも20個、細胞の少なくとも50個、細胞の少なくとも75個、細胞の少なくとも100個、細胞の少なくとも125個、細胞の少なくとも150個、細胞の少なくとも175個、細胞の少なくとも200個、細胞の少なくとも250個、細胞の少なくとも300個、細胞の少なくとも350個、細胞の少なくとも400個、細胞の少なくとも450個、細胞の少なくとも500個、又はそれ以上が撹拌中に基材から放出される。

0126

いくつかの実施態様では、純度約0.55〜2.00、約0.6〜約2.00、約0.7〜約2.00、約0.8〜約2.00、約0.9〜約2.00、約1.0〜約2.00、約1.1〜約2.00、約1.2〜約2.00、約1.3〜約2.00、約1.4〜約2.00、約1.5〜約2.00、約1.6〜約2.00、約1.7〜約2.00、約1.8〜約2.00、又は約1.9〜約2.00の核酸約1ng/μL〜約50ng/μL、約1ng/μL〜約40ng/μL、約1ng/μL〜約30ng/μL、約1ng/μL〜約20ng/μL、約1ng/μL〜約10ng/μL、約1ng/μL〜約5ng/μL、約1ng/μL〜約4ng/μL、約1ng/μL〜約3ng/μL、約1ng/μL〜約2ng/μLが、記載される方法を用いて単一の対象から採用される(得られる)。いくつかの実施態様では、純度約0.55〜2.00を有する1ng/μL〜50ng/μLが、記載される方法を用いて単一の対象から採用される(得られる)。

0127

IV.溶解液
様々な溶解液が記載されておりそして当業者に公知である。これらの周知の溶解液のうちのいくつかは、本方法に使用することができ、サンプルから核酸を単離する。典型的な溶解液は、市販されているもの、例えばINVITROGEN(登録商標)、QIAGEN(登録商標)、LIFE TECHNOLOGIES(登録商標)及び他の製造業者によって販売されているもの、並びに実験室の環境で当業者により生成することができるものが含まれる。溶解バッファもまた十分に記載されており、そして溶解バッファは記載された方法、例えば、Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)及びCurrent Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)に記載されたもの、を用いた使用を見出すことができ、これらの文献の両方は全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

0128

細胞溶解は、細胞内の核酸を回収するために一般的に実施される方法である。多くの場合、細胞を溶解液、一般に界面活性剤を含むアルカリ溶液と、又は溶菌酵素溶液と接触させる。前記溶解液は、典型的には、塩、界面活性剤、及びバッファ、並びに当業者が使用することを理解するであろう他の薬剤を含む。完全な及び/又は部分的な溶解後、核酸は溶解液から回収される。

0129

いくつかの実施態様では、細胞は、pH約4〜約10、約5〜約9、約6〜約8、又は約7〜約9のpH範囲水溶液バッファ中で再懸濁される。

0130

いくつかの実施態様では、バッファ塩の濃度は約10mM〜約200mM、約10mM〜約100mM、又は約20mM〜約80mMである。

0131

いくつかの実施態様では、バッファは、キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸EDTA)又はエチレングリコール四酢酸(EGTA)をさらに含む。

0132

いくつかの実施態様では、溶解液は、細胞からの核酸の放出を支援する他の化合物、例えばこれには限定されないが例としてスクロースを含むポリオール、並びに糖アルコール例えばマルチトールソルビトールキシリトールエリスリトール、及び/又はイソマルトをさらに含む。いくつかの実施態様では、ポリオールは、約2%〜約15%w/w、又は約5%〜約15%w/w、又は約5%〜約10%w/wの範囲である。

0133

いくつかの実施態様では、溶解液は、界面活性剤例えばTriton X−100、SDS、CTAB、X−114、CHAPS、DOC、及び/又はNP−40をさらに含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、前記の界面活性剤は、約1%〜約5%w/w、約1%〜約4%w/w、又は約1%〜約3%w/wの範囲である。

0134

実施態様では、溶解液はカオトロープ(chaotropes)例えば尿素ドデシル硫酸ナトリウム、及び/又はチオ尿素をさらに含むがこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、カオトロープは、約0.5M〜8M、又は約1M〜約6M、約2M〜約6M、又は約1M〜3Mの範囲の濃度で使用されている。

0135

いくつかの実施態様では、溶解液は、追加の溶解試薬の1種又はそれ以上をさらに含み、例えば、溶解試薬は当該分野で周知である。いくつかの実施態様では、溶解試薬は、細胞壁溶解酵素例えばリゾチームを含むが、これには限定されない。いくつかの実施態様において、溶解試薬は、アルカリ性界面活性剤溶液、例えば0.5%ドデシル硫酸ナトリウムを含む0.1水酸化ナトリウム水溶液を含む。

0136

いくつかの実施態様では、溶解液は水性糖溶液、例えばスクロース溶液及びキレート化剤例えばEDTA例えばSTETバッファをさらに含む。特定の実施態様において、溶解試薬は、細胞懸濁液と所望の2倍の濃度を有する溶解液等量とを混合することによって調製される(例えば0.2水酸化ナトリウム、1.0%ドデシル硫酸ナトリウム)。

0137

いくつかの実施態様では、所望の程度の溶解が達成された後、溶解液と溶解した細胞とを含む混合物中和又はクエンチ剤と接触させ、溶解試薬が所望の生成物に悪影響を与えないような条件に調整する。いくつかの実施態様では、pHを約5〜約9、約6〜約8、約5〜約7、約6〜約7、又は約6.5〜7.5に調整し、例えばこれには限定されないが核酸を含む細胞内容物の分解を最小化及び/又は防止する。いくつかの実施態様では、溶解試薬がアルカリ性溶液を含む場合、中和試薬は、酸性バッファ例えばアルカリ金属酢酸塩酢酸バッファを含む。いくつかの実施態様では、溶解条件例えば温度及び溶解試薬の組成物は、核酸を含むがこれに限定されるものではない所望の生成物の劣化を最小限に抑えながら、溶解が実質的に完了するように選択される。

0138

いくつかの実施態様では、第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、又は第二十溶解液が本方法に使用される。いくつかの実施態様では、使用される溶解バッファは、約10μL、約20μL、約30μL、約40μL、約50μL、約60μL、約70μL、約80μL、約90μL、約100μL、約120μL、約130μL、約140μL、約150μL、約160μL、約170μL、約180μL、約190μL、約200μL、約220μL、約230μL、約240μL、約250μL、約260μL、約270μL、約280μL、約290μL、約300μL、約320μL、約330μL、約340μL、約350μL、約360μL、約370μL、約380μL、約390μL、約400μL、約450μL、約500μL、約550μL、約600μL、約650μL、約700μL、約750μL、約800μL、約850μL、約900μL、約950μL、約1000μL、約1500μL、又は約2000μLである。いくつかの実施態様では、溶解バッファは、約10μL〜約1000μL、約10μL〜約800μL、約10μL〜約600μL、約10μL〜約400μL、約20μL〜約400μL、約50μL〜約300μL、約50μL〜約200μL、約50μL〜約400μL、約100μL〜約400μL、約10μL〜約300μL、約100μL〜約200μLである。

0139

他の公知の及び通常の方法の組み合わせと同様に上記の任意の組み合わせが当業者によって使用されることができ、前記の組合せは、本発明によって意図される。

0140

V.溶解液からの核酸の精製
いくつかの実施態様では、例えば、ゲノムDNAを含むがこれに限定されない核酸は、その後の分析を実施する前に、溶解バッファから単離される。いくつかの実施態様では、核酸は、追加の分析例えばこれには限定されないがリアルタイムPCR分析を実施する前に、溶解バッファから単離される。少量の核酸の単離に有用な様々な任意の方法が、開示された方法の様々な実施態様によって使用される。これらには、沈殿ゲル濾過密度勾配、及び固相結合が含まれるが、これらに限定されない。前記の方法は、例えば、全ての目的のために本明細書に参照として組み込まれる、Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)及びCurrent Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)に記載されている。

0141

核酸の沈殿は、当業者に知られている周知の単離方法である。様々な固相結合法(solid phase binding methods)もまた、当該技術分野で公知であり、ビーズ、(例えば、シリカ、磁性体)、カラム、膜、又は他の様々な当該技術分野で公知の物理的形態を含む固相結合法を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、開示された方法において使用される固相は、可逆的に核酸と結合する。前記の固相の例は、少なくとも2種の固相の混合物であるいわゆる「混合床(mixed-bed)」固相を含み、各々のそれらは、異
なる溶液条件下での核酸の限度容量、そして異なる条件下;例えば、全ての目的のために本明細書にその全体が参照として組み込まれる米国特許出願公開第2002/0001812号明細書、での核酸を放出する能力及び/又は限度容量を有する。開示された方法による核酸の固相の親和性は、典型的には、基材への溶質を結合するために使用される多くの手段のいずれかを介してであることができる。前記の手段の例は、イオン性相互作用(例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー)及び疎水性相互作用(例えば、逆相クロマトグラフィー)、pH値の差及び変化、塩の差及び変化(例えば、濃度変化カオトロピック塩エージェント)が含まれるが、これらに限定されない。pHに基づいた固相の典型的な例は、これには限定されないがINVITROGEN ChargeSwitch Normalized Buccal Kit magnetic beadsにおいて使用されているものを含み、これは低pH(<6.5)で核酸に結合し、そして高pH(>8.5)で核酸を放出し、そしてモノアミノ−N−アミノエチルMANAE)は7.5より低いpHで核酸と結合し、そして8より大きいpHで核酸を放出する。典型的なイオン交換系基材(ion exchange based substrates)としては、PHARMACIA(Piscataway,N.J.)からの、DEA−SEPHAROSETM、Q−SEPHAROSETM、及びDEAE−SEPHADEXTM、Dow Chemical Company(Midland,Mich.)からのDOWEX(登録商標)I、Rohm&Haas(Philadelphia,Pa.)からのAMBERLITE(登録商標)、Duolite International, In.(Cleveland,Ohio)からのDUOLITE(登録商標)、DIALON TI及びDIALON TIIが含まれるが、これらに限定されない。

0142

任意の個々の方法が、単独での又は他の方法と組み合わせた使用が意図され、そして前記の有用な組み合わせは当業者には周知であり、よく理解されている。

0143

VI.核酸分析
開示された方法は、核酸例えば、ゲノム分析を含む様々な核酸分析のためのゲノムDNA(gDNA)を単離するために使用される。いくつかの実施態様では、前記の分析は、様々な遺伝的変異の検出を含み、この遺伝的変異は、欠失、挿入、トランジション、及びトランスバージョンが含むが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、変異は一塩基多型(SNP)である。

0144

前記の単離された核酸例えばこれには限定されないがゲノムDNA(gDNA)の様々な分析方法は、当該技術分野で公知であり、そして核酸の構成(nucleic acid compositions)が分析され当業者に公知である様々な方法並びにPCR法例えばリアルタイムPCR分析、マイクロアレイ分析、ハイブリダイゼーション分析、及び核酸シーケンス分析を含む。例えば、Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 2012)及びCurrent Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)参照。

0145

a.リアルタイムPCR
リアルタイムPCRアッセイの設計のために、いくつかの部分は、多くの場合、アンプリコンと頻繁に呼ばれる、プライマーの2つによって挟まれその後増幅されるDNA断片を含み、プライマーの2つ及び検出プローブの1つ又は複数が使用されるべきである。

0146

リアルタイムPCRは、配列特異的様式でゲノムのアレルに結合する短いポリヌクレオチド(検出プローブと称する)と結合する蛍光色素視覚的な放出に依存している。単一ヌクレオチドが異なるリアルタイムPCRプローブは、異なる波長蛍光を発するプローブの結合及び検出によるリアルタイムPCRアッセイにおいて区別することができる。リアルタイムPCRは、検出用途診断用途)、定量化用途、及びジェノタイピング用途における使用を見出す。

0147

リアルタイムPCR実施のための関連するいくつかの方法は、TAQMAN(登録商標)プローブ(米国特許第5,210,015号明細書及び米国特許第5,487,972号明細書、並びにLee et al., Nucleic AcidsRes. 21:3761-6, 1993)、分子ビーコンプローブ(molecular beacon probes)(米国特許第5,925,517号明細書及び米国
特許第6,103,476号明細書、並びにTyagi and Kramer, Nat. Biotechnol. 14:303-8, 1996)、自己プローブ化アンプリコン(self-probing amplicons)(scorpions)(米国特許第6,326,145号明細書、及びWhitcombe et al., Nat. Biotechnol. 17:804-7, 1999)、Amplisensor(Chen et al., Appl. Environ. Microbiol. 64:4210-6, 1998)、Amplifluor(米国特許第6,117,635号明細書、及びNazarenko et al., Nucleic Acids Res. 25:2516-21, 1997)、置換ハイブリダイゼーションプローブ(displacement hybridization probes)(Li et al., Nucleic Acids Res. 30:E5, 2002)、DzyNA−PCR(Todd et al., Clin. Chem. 46:625-30, 2000)、蛍光制限酵素検出(fluorescent restriction enzyme detection)(Cairnset al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 318:684-90, 2004)、並びに近接ハイブリダイゼーションプローブ(adjacent hybridization probes)(米国特許第6,174,670号明細書、及びWittwer et al., Biotechniques 22:130- 1, 134-8, 1997)に依存するアッセイを含むものが、当該技術分野において公知である。

0148

いくつかの例では、リアルタイムPCRは、例えばSNPを含むがこれに限定されるものではない遺伝子変異の様々な検出をもたらすことができる。いくつかの実施態様では、特定の遺伝子候補(gene candidates)におけるSNPの検出は、繋留消光部分(tethered quenching moiety)を使用することによる蛍光分子分子内消光の使用に基づいて、リアルタイムPCRを用いて行われる。したがって、例示的な実施態様によれば、リアルタイムPCR法はまた、分子ビーコン技術の使用を含む。分子ビーコン技術は、関心のあるDNA標的に結合することによってその蛍光を復元される内部消光蛍光体を用いたヘアピン状分子を利用する(例えば、Kramer, R. et al. Nat. Biotechnol. 14:303-308, 1996参照)。いくつかの実施態様では、蓄積しているPCR産物に対する分子ビーコンプローブの増加された結合は、ゲノムDNAにおけるSNPの存在を特異的に検出するために使用される。

0149

多くの適切なジェノタイピング手順の1つは、TAQMAN(登録商標)アレル識別アッセイである。このアッセイのいくつかの例では、プローブの5’末端蛍光レポーター色素によりそしてプローブの3’末端でクエンチャーダイ(quencher dye)により標識されるオリゴヌクレオチドプローブが利用される。インタクトプローブ(intact probe)に対するクエンチャーの近接は、レポーター用の低い蛍光を維持する。PCR反応の間、DNAポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性がプローブを切断し、そして色素とクエンチャーとを分離する。これは、レポーターの蛍光の増加をもたらす。PCR産物の蓄積は、レポーター色素の蛍光の増加を監視することにより直接的に検出される。プローブが標的にハイブリダイズしそしてPCRの間に増幅されている場合にのみ、DNAポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性が、レポーターとクエンチャーとの間でプローブを切断する。プローブは、標的SNP位置またがり(straddle)、特定のSNPアレルが存在する場合にのみ核酸分子にハイブリダイズするように設計されている。

0150

例として、TGFβI遺伝子のエクソン4に位置するアベリノ角膜ジストロフィー関連SNPを増幅するために、米国特許出願公開第2012/0077200号に記載されているように、フォワード及びリバースPCRプライマー対が設計された(図2の配列番号1〜24)。いくつかの実施態様では、その中に開示されているフォワード及びリバースプライマー対のいずれかが、本明細書で開示されている改良された方法で使用されている。好ましい実施態様では、配列番号1(フォワード)及び配列番号2(リバース)のプライマー対が、本明細書で開示されている改良された方法で使用される。

0151

TGFβI遺伝子のエクソン4におけるグアニンからアデニンへの変異を検出するために、米国特許出願公開第2012/0077200号に記載されているように、図3に示される配列番号25〜42によるヌクレオチド配列を有する、野生型(「G」)及びアベリノ角膜ジストロフィー関連変異(「A」)検出用に蛍光標識されたリアルタイムPCRプローブ対が設計された。いくつかの実施態様では、野生型及び変異型プローブのいずれかが、本明細書中に開示される改良された方法において使用される。好ましい実施態様では、配列番号25(野生型)及び配列番号26(変異体)の野生型及び変異体プローブ対が、本明細書で提供される改善された方法において使用される。疾患関連アレルから野生型アレルを識別するために、野生型プローブはVICで標識し、そして変異型プローブはFAMで標識した。相補的な遺伝子断片への結合を促進するようにマイナーグルーブバインダー(MGB)をプローブに結合した。

0152

b.リアルタイムPCRサイクル
リアルタイムPCR法は、増幅のための方法の一部として、様々な工程又はサイクルを含む。これらのサイクルは、二本鎖核酸を変性させる工程、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び標的ゲノムDNA配列の検出プローブをアニーリングする工程、そしてアニーリングされたフォワードプライマー及びリバースプライマーから第二鎖DNAを合成(すなわち、複製)する工程を含む。この3段階のプロセスは、本明細書ではサイクルと称する。

0153

いくつかの実施態様では、約10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、又は60サイクルが採用される。いくつかの実施態様では、約10〜約60サイクル、約20〜約50サイクル、又は約30〜約40サイクルが採用される。いくつかの実施態様では、40サイクルが採用される。

0154

いくつかの実施態様では、二本鎖核酸の変性工程は、約1秒〜約5秒、約2秒〜約5秒、又は約3秒〜約4秒の間、約80℃〜100℃、約85℃〜約99℃、約90℃〜約95℃の温度で生じる。いくつかの実施態様では、二本鎖核酸の変性工程は、約3秒の間、95℃の温度で生じる。

0155

いくつかの実施態様では、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び標的ゲノムDNA配列の検出プローブをアニーリングする工程は、約15秒〜約45秒、約20秒〜約40秒、約25秒〜約35秒の間、約40℃〜約80℃、約50℃〜約70℃、約55℃〜約65℃で生じる。いくつかの実施態様では、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び標的ゲノムDNA配列の検出プローブをアニーリングする工程は、約30秒の間、約60℃で生じる。

0156

いくつかの実施態様では、アニーリングされたフォワードプライマー及びリバースプライマーから第二鎖DNAを合成(すなわち、複製)する工程は、約15秒〜約45秒、約20秒〜約40秒、約25秒〜約35秒の間、約40℃〜約80℃、約50℃〜約70℃、約55℃〜約65℃で生じる。いくつかの実施態様では、フォワードプライマー、リバースプライマー、及び標的ゲノムDNA配列の検出プローブをアニーリングする工程は、約30秒の間、約60℃で生じる。

0157

いくつかの実施態様では、本明細書に記載される本方法に従って調製したゲノムDNAサンプルの約1μL、約2μL、約3μL、約4μL、又は約5μLが、30X、35X、40X、45X、50X、又は100XのリアルタイムPCRアッセイミックスのわずか約0.05μL、約0.10μL、約0.15μL、約0.20μL、約0.25μL、又は約0.25μL及び蒸留水と組み合わされPCRマスターミックスを形成することが見出された。いくつかの実施態様では、PCRマスターミックスは、約5μL、約6μL、約7μL、約8μL、約9μL、約0μL、約11μL、約12μL、約13μL、約14μL、約15μL、約16μL、約17μL、約18μL、約19μL、若しくは約20μL又はそれ以上の最終体積を有する。いくつかの実施態様では、上記のように調製されたゲノムDNAサンプル2μLが、40XのリアルタイムPCRアッセイミックスのわずか0.15μL及び蒸留水2.85μLと組み合わされることが見出された。

0158

例示的な反応が本明細書に記載されているが、当業者は、プローブの設計に基づいて、温度と時間を変更する方法を理解するであろう。また、本方法は、前記の時間及び温度の任意の組み合わせを意図する。

0159

c.PCRプライマー及びプライマー設計
いくつかの実施態様において、プライマーは、実験室の設定において試験されそして設計される。いくつかの実施態様において、プライマーは、インシリコ方法(in silico methods)に基づいて、コンピュータによって設計される。プライマー配列は、アンプリコン又は増幅される標的核酸配列の配列に基づいている。より短いアンプリコンは、典型的には、より長いアンプリコンと比較して、より効率的に複製しそしてより効率的な増幅につながる。

0160

プライマーの設計において、当業者は、二次構造の考慮事項と同様に設計されるプライマーのGC及びAT含量に基づき(増加されたGC含量は、二次構造の増加をもたらす可能性がある)、融解温度(melting temperature)(Tm;プライマー標的二重鎖の半分が解離しそして一本鎖になるとされ、そして二本鎖の安定性指標となる温度;Tmの増加は安定性の増加を示す)を考慮に入れる必要があることを理解するであろう。TMは、当該技術分野において公知の様々な方法を用いて計算されそして当業者は前記の様々なTMの計算方法を容易に理解するであろう;前記方法は例えばこれには限定されないが、promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htmでワールドワイドウェブ使用可能なTM計算機のようなオンラインで使用可能なものが含まれる。プライマーの特異性は、Taqポリメラーゼにより伸長する部分である3’末端配列と組み合わせたその完全な配列によって定義される。いくつかの実施態様では、3’末端は、誤った増幅産物プライミング(false-priming)及び生成を軽減するために、標的配列のどこにも見られない、固
有のヌクレオチド少なくとも5〜7個を有していなければならない。フォワード及びリバースプライマーは、典型的には、同様の効率で標的と結合する。いくつかの例では、ツール例えばNCBIBLAST(ncbi.nlm.nih.govのワールドワイドウェブ上に位置する
)がアラインメントを実行するために使用され、プライマー設計を支援する。

0161

当業者は、標的核酸配列についてのプライマー設計についての基本、並びに前記の方法に対して広範な教示を持つ様々なリファレンスマニュアル及びテキスト、例えば、Molecular Cloning (three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012)及びCurrent Protocols (Genetics and Genomics; Molecular Biology; 2003-2013)及びReal-timePCRin Microbiology: From Diagnostics to Characterization (Ian M. MacKay, Calster Academic Press; 2007); primerdigital.com/tools/PrimerAnalyser.htmlのワールドワイドウェブ上で使用可能なプライマーアナライザーJavaツール、及びKalendar R, et al. (Genomics, 98(2): 137-144 (2011))を十分に承知しており、これらの全てが全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

0162

プライマー設計の追加の観点は、プライマーの複雑性(primer complexity)又は言語的配列複雑性(linguistic sequence complexity)である(Kalendar R, et al. (Genomics, 98(2): 137-144 (2011)参照)。多大な言語的配列複雑性を有しているプライマー(例えばヌクレオチドの配列及び組成)は、典型的にはより有効である。いくつかの実施態様では、言語的配列複雑性の計算方法は、単純反復配列(simple sequence repeats)、不完全直接又は逆方向反復(imperfect direct or inverted repeats)、ポリプリン及びポリピリミジン三本鎖cDNA構造(triple-stranded cDNA structures)、及び四本鎖構造(four-stranded structures)(例えば、G四重鎖)を含む低複雑領域の検出のために、比較配列間の保存領域を探索するために使用される。いくつかの実施態様では、言語的複雑性(LC)測定は、アルファベットキャパシティーL−グラム法(alphabet-capacity L-gram method)(A. Gabrielian, A. Bolshoy, Computer & Chemistry 23:263-274 (1999)及びY.L. Orlov, V.N. Potapov, Complexity: an internet resource for analysis of DNA sequence complexity, Nucleic AcidsRes. 32: W628-W633(2004)参照)を用いて全長配列に沿って実施され、配列の長さについての期待された値の合計(E)により除算された、配列における1〜Lの大きさの言葉(word)の観察された範囲(xi)の合計として計算される。いくつかのGリッチ(及びCリッチ)核酸配列は、Gカルテットスタックを含有する四本鎖DNA構造に折り畳まれる(quadruplex.orgでのワールドワイドウェブ参照)。いくつかの例では、これらの四重鎖は、DNA分子2個又は4個の分子間集合G塩基2つを含む配列の二量体化により、又はグアニンの4ブロックを含む一本鎖分子間の折り畳みにより形成される(P.S. Ho, PNAS, 91:9549-9553 (1994); I.A. Il'icheva, V.L. Florent'ev, Russian Journal of Molecular Biology 26:512-531 (1992); D. Sen, W. Gilbert, Methods Enzymol. 211:191-199 (1992); P.A. Rachwal, K.R. Fox, Methods 43:291-301 (2007); S. Burge, G.N. Parkinson, P. Hazel, A.K. Todd, K. Neidle, Nucleic Acids Res. 34:5402-5415 (2006); A. Guedin, J. Gros, P. Alberti, J. Mergny, Nucleic Acids Res. 38:7858-7868 (2010); O. Stegle, L. Payet, J.L. Mergny, D.J. MacKay, J.H. Leon, Bioinformatics 25:i374-i382 (2009)参照。いくつかの例では、これらは、それらの低言語的複雑性のためにプライマー設計から排除される、(TTAGGG)4についてLC=32%。)。

0163

これらの方法は、CG含量及び融解温度に関する、GCスキュー(GC skew)、(G−C)/(G+C)、ATスキュー、(A−T)/(A+T)、CG−ATスキュー、(S−W)/(S+W)、又はプリン−ピリミジン(R−Y)/(R+Y)スキューを有する配列におけるパターン分析用の様々なバイオインフォマティクスツールを含み、そして言語的配列複雑性プロファイルを決定するためのツールを提供する。例えば、n塩基(nは正の整数である)のスライディングウィンドウにおけるGCスキューは、ウインドウにおける全配列についての、Gがグアニンの総数でありCがシトシンの総数である式(G−C)/(G+C)に従って、1塩基のステップを用いて計算される(Y. Benita, et al., Nucleic AcidsRes. 31:e99 (2003))。負のGC−スキュー値はC塩基の過剰を示すのに対し、正のGC−スキュー値は、G塩基の過剰を示した。同様に、他のスキューが順次算出される。前記の及び他の方法は、いくつかの実施態様では、プライマーの複雑性を決定するために使用される。

0164

非限定的な例の実施態様によれば、リアルタイムPCRは、エキソヌクレアーゼプライマー(TaqMan(登録商標)プローブ)を用いて実施される。前記の実施態様では、プライマーは、熱安定性ポリメラーゼ例えばTaqのエキソヌクレアーゼ活性を利用して、増幅反応中に存在する二重標識プローブを切断する(例えばWittwer, C. et al. Biotechniques 22:130-138, 1997参照)。PCR産物と相補的である一方で、このアッセイで
使用されたプライマープローブは、PCRプライマーとは異なり、そして蛍光可能な分子と蛍光を消光することができる分子との両方で二重標識されている。プローブがインタクトである場合、DNAプローブ内の蛍光シグナルの分子内消光が少ないシグナルをもたらす。蛍光分子が増幅中にTaqのエキソヌクレアーゼ活性によって遊離されると、消光が大幅に減少しそして蛍光シグナルの増加をもたらす。非限定的な例として、蛍光プローブは、6−カルボキシ蛍光部分などが挙げられる。代表的なクエンチャーは、ブラックホールクエンチャー1部分(Black Hole Quencher 1 moiety)などが挙げられる。

0165

様々なPCRプライマーが、開示された方法における使用を見出すことができる。例示的なプライマーは、本明細書に記載したものを含むがこれらに限定されない。開示された方法における使用のためのプライマーはまた、米国特許出願公開第20120077200号において見出され、本出願は全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施態様では、本開示の方法において使用されるためのPCRプライマーは、これに限定されるものではないが、以下の表1のリストを含み、そしてTGFβI遺伝子の検出における使用を見出す。表2及び3は、primerdigital.com/tools/PrimerAnalyser.htmlでのワールドワイドウェブを使用して掲載されたような、各々のプライマーのた
めの生物物理学的パラメータを提供する。

0166

いくつかの実施態様において、開示された方法で使用するためのリアルタイムPCRプライマーは、言語的配列複雑性の少なくとも70%、少なくとも72%、少なくとも75%、少なくとも77%、少なくとも80%、少なくとも82%、少なくとも85%、少なくとも88%、少なくとも90%、少なくとも92%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は少なくとも99%を有する。

0167

d.検出プローブ設計及び検出プローブ
様々な検出プローブが開示された発明と一緒の使用を見出すことができそしてジェノタイピング及び/又は定量化のために用いられる。当業者に一般的に採用される検出プロ—ブは、加水分解プローブ(TaqMan(登録商標)プローブ、5’ヌクレアーゼプローブ、又は二重標識プローブとしても公知である)、ハイブリダイゼーションプローブ、及びスコーピオンプライマー、(プライマーを組み合わせそして検出プローブは1つの分子内にある)が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、検出プローブの設計は、プローブが用いられたPCRプライマーと互換性があるように、所望のプローブの標的に基づいて当業者によって決定される(例えば、プライマー及びプローブは、リアルタイムPCRアッセイにおいてお互いの機能を妨害してはならない)。いくつかの実施態様では、プローブは、効果的なシグナルの生成を促進するために、プライマーよりも高いTmを有するように設計される。Tmは、当該技術分野で公知の様々な方法のいずれかを使用して計算され、当業者はTmを計算するための様々な方法を容易に理解するであろう;前記の方法には、オンラインツールで使用可能なもの例えば、promega.com/techserv/tools/biomath/calc11.htm.でのワールドワイドウェブで使用可能な計算機が含まれる。いくつかの実施態様では、検出プローブの増加したTmは、プライマーがポリメラーゼによって伸長される前に検出プローブが結合していることを提供する。

0168

いくつかの実施態様において、検出プローブは、様々な修飾を含む。いくつかの実施態様では、検出プローブには核酸残基の修飾、例えば2’−O−メチルリボヌクレオチド修飾、ホスホロチオエート骨格修飾、ホスホジチオエート骨格修飾、ホスホロアデート骨格修飾、メチルホスホネート骨格修飾、3’末端リン酸修飾、及び/又は3’アルキル置換が含まれるが、これらに限定されない。

0169

いくつかの実施態様では、検出プローブは、修飾のために、標的配列に対する増加した親和性を有する。前記の検出プローブは、化学修飾を含む検出プローブと同様に、長さが増加した検出プローブを含む。前記の修飾は、2’−フルオロ(2’−デオキシ−2’−フルオロ−ヌクレオシド)修飾、LNA(ロックド核酸)、PNA(ペプチド核酸)、ZNA(ジッパー核酸)、モルホリノ、メチルホスホネート、ホスホロアミド酸ポリカチオン複合体、及び2’−ピレン修飾を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施態様において、検出プローブは、2’フルオロ修飾(別名、2’−デオキシ−2’−フルオロ−ヌクレオシド)、LNA(ロックド核酸)、PNA(ペプチド核酸)、ZNA(ジッパー核酸)、モルホリノ、メチルホスホネート、ホスホロアミド酸、及び/又はポリカチオン複合体を含む修飾の1つ又はそれ以上を含む。

0170

いくつかの実施態様において、検出プローブは、検出可能な部分、例えば当業者に公知の任意の検出可能な部分と本明細書で記載したものとを含む。前記の検出可能な部分は、例えば蛍光標識及び化学発光標識を含むがこれらに限定されない。前記の検出可能な部分の例としてはまた、FRET対の群を含むことができる。いくつかの実施態様において、検出プローブは、検出可能な実体(detectable entity)を含んでいる。

0171

蛍光標識の例としては、AMCA、DEAC(7−ジエチルアミノクマリン−3−カルボン酸)、7−ヒドロキシ−4−メチルクマリン−3;MCA(7−メトキシクマリン−4−酢酸);7−メトキシクマリン−3;AMF(4’−(アミノメチルフルオレセイン);5−DTAF(5−(4,6−ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセイン);6−DTAF(6−(4,6−ジクロロトリアジニル)アミノフルオレセイン);6−FAM(6−カルボキシフルオレセイン;aka FAM;TaqMan(登録商標)FAMTMを含む);TaqMan VIC(登録商標);5(6)−FAMカダベリン;5−FAMカダベリン;5(6)−FAMエチレンジアミン;5−FAMエチレンジアミン;5−FITC(FITC異性体I;フルオレセイン−5−イソチオシアネート);5−FITCカダベリン;フルオレセイン−5−マレイミド;5−IAF(5−ヨードアセトアミドフルオレセイン);6−JOE(6−カルボキシ−4’,5’−ジクロロ—2’,7’−ジメトキシフルオレセイン);5−CRl 10−(5−カルボキシローダミン110);6−CRl 10−(6−カルボキシローダミン110);5−CR6G(5−カルボキシローダミン6G);6−CR6G(6−カルボキシローダミン6G);5(6)−カルボキシローダミン6Gカダベリン;5(6)−カルボキシローダミン6Gエチレンジアミン;5−ROX(5−カルボキシ−X−ローダミン);6−ROX(6−カルボキシ−X−ローダミン);5−TAMRA(5−カルボキシテトラメチルローダミン);6−TAMRA(6−カルボキシテトラメチルローダミン);5−TAMRAカダベリン;6−TAMRAカダベリン;5−TAMRAエチレンジアミン;6−TAMRAエチレンジアミン;5−TMRC6マレイミド;6−TMR C6マレイミド;TR C2マレ
イミド;TRカダベリン;5−TRITC;G異性体(テトラメチルローダミン−5−イソチオシアネート);6−TRITC;R異性体(テトラメチルローダミン−6−イソチオシアネート);ダンシルカダベリン(5−ジメチルアミノナフタレン−1−(N−(5−アミノペンチル))スルホンアミド);EDANS C2マレイミド;フルオレスカミン(fluorescamine);NBD;及びピロメテン(pyrromethene)並びにそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

0172

化学発光標識の例は、Southern Blot and Western Blotprotocols(例えば全体が参照として本明細書に組み込まれるSambrook and Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (3rd ed.) (2001)参照)と共に用いられる標識を含むが、これらに限定されない。例としては、−(2’−スピロアダマンタン)−4−メトキシ−4−(3”−ホスホリルオキシフェニル−1,2−ジオキセタンAMPPD);アクリジニウムエステル、及びアダマンチル安定化1,2−ジオキセタン並びにそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

0173

プローブの標識は、当該技術分野で公知である。標識プローブは、増幅中に増幅された領域内でハイブリダイズするために使用される。プローブは修飾され、増幅用プライマーとして作用することから回避する。検出プローブは蛍光色素の2つを用いて標識され、1つは、他の色素の蛍光を消光することができるものである。色素の1つがプローブの5’末端に結合され、そして他方は、内部部位に結合されており、プローブは、非ハイブリダイズ状態(non-hybridized state)にあるときに消光が起こる。

0174

典型的には、リアルタイムPCRプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)に関与している染料の対(レポーター色素とアクセプター色素)から成り、それによってアクセプター色素は、レポーター色素の発光を消光する。一般に、蛍光標識したプローブはアンプリコン定量の特異性を高める。

0175

開示された方法のいくつかの実施態様において使用されるリアルタイムPCRはまた、本開示を考慮して、当業者によって決定されるように、ハイブリダイゼーションプローブ(すなわち、検出プローブ)の1つ以上の使用を含む。非限定的な例として、前記のハイブリダイゼーションプローブとしては、記載された方法において提供されたものの1つ又はそれ以上が含まれるが、これには限定されない。例示的プローブ例えばHEチャネル(HEX channel)及び/又はFAMチャネル(FAM channel)プローブは、当業者により理解される。

0176

例示的な実施態様によれば、検出プローブ及びプライマーは、好都合には、例えばプライマー設計ソフトウェアを用いたインシリコ分析、並びにNational Cente
r for Biotechnology Information(NCBI)に寄託
れた遺伝子及びゲノムの利用可能なヌクレオチドデータベースに対する相互参照を使用して選択される。いくつかの追加的なガイドラインが、いくつかの実施態様において、プライマー及び/又はプローブの選択のために使用されることができる。例えば、いくつかの実施態様において、プライマー及びプローブは、それらが互いに近くにあるものの重複しないように選択される。いくつかの実施態様において、プライマーは、同じ(又は近いTM)(例えば、約58℃〜約60℃)を有することができる。いくつかの実施態様では、プローブのTMは、プライマーのTMのために選択されたものよりも約10℃高い。いくつかの実施態様では、プローブ及びプライマーの長さは、約17〜39塩基対などであるように選択される。これら及び他のガイドラインは、適切なプライマー及び/又はプローブを選択する際に、いくつかの場合において当業者により使用されている。

0177

本発明の方法において使用するためのプローブとしては、以下の表4に示す例示的なプローブが含まれるが、これらに限定されない。

0178

VII.診断テスト
いくつかの実施態様において、診断テストは、様々な変異の検出により遺伝的条件の1つ又はそれ以上を決定するために使用される。いくつかの実施態様において、診断テストは、特定の条件が、例えば物理的な症状、徴候及び/又は症状、並びに家族歴情報に基づいて疑われる場合に、診断を確定するために使用される。いくつかの実施態様では、診断テストの結果は、任意の患者に対する適切な治療計画の決定において医学分野の当業者を支援し、そしてより個人化されさらにより効果的な治療計画を可能にする。いくつかの実施態様において、治療計画は、当業者によって決定されるような、様々な薬剤治療外科的治療ライフスタイルの変化、又はそれらの組み合わせのいずれかを含む。

0179

開示された方法により得られた核酸は、変異、例えば欠失、挿入、トランスバージョン及びトランジションを検出するためのテストを含む様々な診断テストに有用である。いくつかの実施態様では、前記の診断は、発現されるべき病気のために2コピーを必要とする病気について遺伝子の1コピーを保有する影響を受けていない個体を同定するのに有用であり、遺伝子の1コピーを保有する影響を受けていない個体の同定における情報は、治療計画、着床前遺伝子診断、出生前診断検査、新生児スクリーニング家系DNAテスト(遺伝的系譜目的)、成人発症障害例えばハンチントン病予測用の前駆症状テスト、成人発症型がん及びアルツハイマー病発症リスク推定用前駆症状テスト、症候性個体の確定診断(confirmational diagnosis of a symptomatic individual)、及び/又は法医学/同
性試験の開発における使用を見出すことができる。いくつかの実施態様では、本方法は、角膜ジストロフィーの検出における使用を見出すことができる。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、アベリノ角膜ジストロフィー関連SNP、例えば、TGFβI遺伝子のR124突然変異をもたらすもの(例えば、これには限定されないが、C(G/A)C SNPとも称されるTGFβI遺伝子の第418位ヌクレオチドのG
からAへのトランジションにより引き起こされるR124H突然変異を含む)の検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、顆粒状角膜ジストロフィー関連SNP、例えば、TGFβI遺伝子のR555突然変異をもたらすもの(例えば、これには限定されないが、(C/T)GG SNPとも称されるTGFβI遺伝子の第1663位ヌクレオチドのCからTへのトランジションにより引き起こされるR555W突然変異を含む)の検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、格子型ジストロフィー関連SNP、例えば、TGFβI遺伝子のR124及び/又は626突然変異をもたらすもの(例えば、これには限定されないが、(C/T)GCSNPとも称されるTGFβI遺伝子の第417位ヌクレオチドのCからTへのトランジション、又はTGFβI遺伝子の第1924位ヌクレオチドのAからCへのトランジションにより引き起こされるH626P突然変異を含む)の検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、レイス・バックラー角膜ジストロフィー関連SNP、例えば、TGFβI遺伝子のR124突然変異をもたらすもの(例えば、これには限定されないが、C(G/T)C SNPとも称されるTGFβI遺伝子の第418位ヌクレオチドのGからTへのトランジションにより引き起こされるR124L突然変異を含む)の検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、ティール−ベンケ角膜ジストロフィー関連SNP、例えば、TGFβI遺伝子のR555突然変異をもたらすもの(例えば、これには限定されないが、C(G/A)G SNPとも称されるTGFβI遺伝子の第1664位ヌクレオチドのGからAへのトランジションにより引き起こされるR555Q突然変異を含む)の検出を通して検出される。

0180

いくつかの実施態様では、新生児スクリーニングは、遺伝的障害を識別するためにのみ使用される任意の出生後遺伝子スクリーニングを含む。いくつかの実施態様では、新生児スクリーニングは、遺伝的疾患の識別における使用を見出し、治療計画が人生の早い段階で決定される。前記のテストとしては、フェニルケトン尿症(phenylketonuria)及び先天性甲状腺機能低下症(congenital hypothyroidism)のために幼児をテストすることが挙げられるが、これらに限定されない。

0181

いくつかの実施態様では、保因者テスト(carrier testing)は、遺伝子変異の単一のコピーを保有する人の識別用に使用される。いくつかのケースでは、コピー2つが存在する場合に、変異は遺伝的障害を引き起こす可能性がある。いくつかのケースでは、コピー1つが遺伝病を引き起こすのに十分である。いくつかのケースでは、コピー2つの存在が、特定の治療計画について例えばアベリノ突然変異の存在下で及び外科的処置実行前のスクリーニングで禁忌とされており(contra-indicated)、任意の患者のために追及する適切な治療計画を保証する。いくつかの実施態様では、前記の情報はまた、個々の生殖力検討(contemplating procreation)のために有用でありそして個々の患者並びに患者の血
縁者に重要なアドバイスを提供する医学分野の当業者を支援するのと同様に個人の詳細な情報を得たうえでの決断(informed decision)を支援する。

0182

いくつかの実施態様では、テストの予測の及び/又は前駆症状の種類は、様々な障害に関連する遺伝的変異を検出するために使用される。いくつかのケースでは、これらのテストは、遺伝性疾患を持つ家族を有するがテスト時には障害のない特徴を示す可能性がある人に有用である。いくつかの実施態様では、予測テストは、例えば特定の種類のがんを含むがこれには限定されない遺伝的背景を有する障害の発症の機会を増加させる変異を同定する。いくつかの実施態様では、発症前検査は、任意の物理的な徴候や症状が現れる前に、人が、遺伝性疾患を発症するかどうかを決定するのに有用である。予測及び発症前検査テストの結果は、特定の障害を発症する人のリスクに関する情報を提供し、患者並びに患者の血縁者にとって、適切な医療処置計画に関する意思決定を行う助けとなる。いくつかの実施態様では、予測テストはまた、アベリノ角膜ジストロフィー存在下での禁忌であるLASIK手術、及び/又はその他の屈折矯正手術、例えばこれらに限定されないが、フォトセラピューティックケラテクトミー(PTK)、及び/又はフォトリフラクティブケラテクトミー(PRK))の実施のような特定の治療計画において禁忌となる変異を検出するために使用される。例えば、アベリノ角膜ジストロフィーを示す患者は、LASIK手術、又はその他の屈折矯正手術を受けるべきではない。

0183

いくつかの実施態様において、診断テストはまた、薬物応答における遺伝的変異の影響を決定する遺伝子テストを含む薬理ゲノミクスを含む。前記の薬理ゲノミクス分析からの情報は、適切な治療計画の決定及び開発における使用が見出される。医学分野の当業者は、適切な治療計画を設計する際の遺伝子変異の存在及び/又は不存在に関する情報を使用する。

0184

いくつかの実施態様において、その遺伝子プロファイルが本開示の方法を用いて決定される疾患は、眼疾患、がん、糖尿病(diabetes mellitus)、高血圧症統合失調症、並びに最も一般的な先天性奇形、例えば口唇裂(cleft lip)、口蓋裂(cleft palate)、神経管欠陥(neural tube defects)、軟骨無形成症(Achondroplasia)、α−1アンチトリプシン欠損症(Alpha-1 Antitrypsin Deficiency)、抗リン脂質症候群(Antiphospholipid Syndrome)、自閉症、常染色体優性多発性嚢胞腎病(Autosomal Dominant Polycystic Kidney Disease)、シャルコー・マリー・トゥース(Charcot-Marie-Tooth)、大腸癌鳴き症候群(Cri du chat)、クローン病嚢胞性線維症(Cystic fibrosis)、有痛脂肪症(Dercum Disease)、ダウン症デュアン症候群(Duane Syndrome)、デュシェンヌ筋ジストロフィー(Duchenne Muscular Dystrophy)、第V因子ライデン血栓形成(Factor V Leiden Thrombophilia)、家族性高コレステロール血症(Familial Hypercholesterolemia)、家族性地中海熱(Familial Mediterranean Fever)、脆弱X症候群(Fragile X Syndrome)、ゴーシェ病(Gaucher Disease)、ヘモクロマトーシス(Hemochromatosis)、血友病(Hemophilia)、全前脳症(Holoprosencephaly)、ハンチントン病、クラインフェルター症候群(Klinefelter syndrome)、マルファン症候群(Marfan syndrome)、筋緊張性ジストロフィー(Myotonic Dystrophy)、神経線維腫症(Neurofibromatosis)、ヌーナン症候群(Noonan Syndrome)、骨形成不全症(Osteogenesis imperfecta)、パーキンソン病(Parkinson's disease)、フェニルケトン尿症、ポーランド異常(Poland Anomaly)、ポルフィリン症(Porphyria)、早老症(Progeria)、網膜色素変性症(Retinitis Pigmentosa)、重症複合免疫不全(SCID)(Severe Combined Immunodeficiency)、鎌状赤血球症(Sickle cell disease)、脊髄性筋萎縮症(Spinal Muscular Atrophy)、テイサックス(Tay-Sachs)、サラセミア(Thalassemia)、トリメチルアミン尿症(Trimethylaminuria)、ターナー症候群(Turner Syndrome)、口蓋顔面症候群(Velocardiofacial)、WAGR症候群(WAGR Syndrome)、ウィルソン病(Wilson Disease)、並びに遺伝的要素を有するその他の疾患が含まれるがこれらに限定されない。眼
疾患及び/又は眼の要素を含む疾患は、霰粒腫(chalazion)、麦粒腫(stye)、睫毛乱生症(trichiasis)、内反(entropion)、外反(ectropion)、兎眼(lagophthalmos)、眼瞼炎(bleharitis)、涙嚢炎(dacryocystitis)、眼窩蜂巣炎(orbital cellulitis)、翼状片(ptergium)、翼状片角膜ジストロフィー(pterygiumcorneal dystrophy)、結膜炎(conjuctivitis)、新生児眼炎(ophtalmia neonatorum)、細菌性角膜潰瘍(bacterial corneal ulcer)、真菌性角膜潰瘍(fungal corneal ulcer)、緑内障(glaucoma)、フックスジストロフィー(Fuchs Dystrophy)、円錐角膜(keratoconus)、進行性黄斑変性症(Advanced Macular Degeneration)、網膜色素変性症(Retinitis pigmentosa
)、白内障(cataracts)、網膜障害、黄斑変性症、糖尿病性の眼の問題(例えば、糖尿病性網膜症)、眼瞼裂狭小眼瞼下垂−逆内眼角贅皮症候群(blepharophimosis-ptosis-epicanthus-inversus syndrome)(BPES)、眼皮膚白皮症(oculocutaneous albinism)、マルファン症候群(Marfan syndrome)、スティックラー症候群(Stickler syndrome)、及びCHARGE(欠損症心臓異常、後鼻孔閉鎖症、成長発達遅延生殖器
泌尿器の異常、の異常又は難聴)を含むが、これらに限定されない。角膜ジストロフィーは、アベリノ角膜ジストロフィー、果粒状角膜ジストロフィー、格子状1型角膜ジストロフィー、フックスジストロフィー、ティール−ベンケ、及びレイス・バックラー角膜ジストロフィーを含むが、これらに限定されない。がんとしては、癌腫肉腫芽細胞腫リンパ腫白血病生殖細胞腫瘍、及び起源が不明のがんが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様では、がんとしては、頭頸部、皮膚、結腸、経口、神経膠芽腫胸部喉頭食道、内皮細胞、子宮内膜卵巣泌尿生殖器直腸前立腺腎臓黒色腫、腎臓、膵臓消化管、血液、肝臓子宮、脳、及びウイルス誘導性のがん例えばパピローマウイルス誘発性のものが含まれるが、これらに限定されない。

0185

いくつかの実施態様では、本方法は、個人の遺伝子プロファイルの決定に使用されたゲノムDNAを提供することにより、個別化医療処置計画の開発における使用を見出す。いくつかの実施態様では、前記の遺伝子プロファイル情報は、治療計画を開発及び/又は決定するために当業者によって使用される。いくつかの実施態様において、記載された方法により単離された核酸において同定された様々な遺伝的変異及び変異の存在及び/又は不存在は、個別化医療処置計画又は計画の一部として、当業者によって使用される。例えば、いくつかの実施態様では、開示された方法を用いて得られた情報は、データベース又は他の確立された情報と比較され、特定の疾患の診断を決定する及び/又は治療計画を決定する。いくつかのケースでは、特定の患者における遺伝子変異の有無に関する情報は、データベース又は他の権威ある情報源と比較され、提案された治療計画に対する決定をする。いくつかの場合において、遺伝子変異の存在は、特定の治療計画を追求することを示す。いくつかのケースでは、遺伝子変異の不存在は、特定の治療計画を追求しないことを示す。

0186

いくつかの実施態様では、特定の遺伝子変異の存在及び/又は不存在に関する情報は、治療的実体での治療の治療効果を決定するため、並びに治療的実体での治療のための治療計画を調整するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び/又は不存在に関する情報は、治療計画を追求するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び/又は不存在に関する情報は、治療計画を継続するか否かを決定するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び/又は不存在は、治療計画を中止するかどうかを決定するために使用される。他の実施態様では、遺伝子変異の存在及び/又は不存在は、治療計画を変更するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び/又は不存在は、治療計画の一部として投与される治療の投薬量を増加又は減少させるかどうかを決定するために使用される。他の実施態様では、遺伝子変異の存在及び/又は不存在は、治療計画の一部として投与される治療の投与頻度を変更するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び/又は不存在は、一日当たりの、週当たりの投薬数、治療の一日当たりの回数を変更するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び/又は不存在は、治療の投薬量を変更するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施態様において、遺伝子変異の存在及び/又は不存在は、治療計画を開始する前及び/又は治療計画を開始した後に決定される。いくつかの実施態様では、遺伝子変異の存在及び/又は不存在は、遺伝子変異の有無に関する所定の基準情報と比較されそして決定される。

0187

いくつかの実施態様では、遺伝子変異の1つ又はそれ以上の存在及び/又は不存在の複合体(composite)は、開示された方法を用いて生成され、前記の複合体は、複数の遺伝
子変異の存在及び/又は不存在に関する情報の任意の集合を含む。いくつかの実施態様において、遺伝子変異の2以上、3以上、4以上、5以上、6以上、7以上、8以上、9以上、10以上、20以上、30以上、又は40以上の存在及び/又は不存在が検査され、複合体の生成に使用される。いくつかの実施態様における例示的な情報は、核酸及び/又はタンパク質の遺伝子変異の両方に関する組み合わせの、又は核酸若しくはタンパク質の情報が含まれる。一般に、複合体は、遺伝子変異の存在及び/又は不存在に関する情報を含む。いくつかの実施態様では、前記の複合材料は、所定の基準情報と比較されそして治療計画が、追求、維持、又は中止される。

0188

いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、これらに限定されないが、アベリノ角膜ジストロフィー関連SNP、果粒状角膜ジストロフィー関連SNP、格子状ジストロフィー関連SNP、レイス・バックラー角膜ジストロフィー関連SNP、及び/又はティール−ベンケ角膜ジストロフィー関連SNPから選択されるSNPの2、3、4、又は5つの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、果粒状角膜ジストロフィー関連SNP、格子状ジストロフィー関連SNP、レイス・バックラー角膜ジストロフィー関連SNP、及び/又はティール−ベンケ角膜ジストロフィー関連SNPと組み合わせて、例えば、アベリノ角膜ジストロフィー関連SNPの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、アベリノ角膜ジストロフィー関連SNP、格子状ジストロフィー関連SNP、レイス・バックラー角膜ジストロフィー関連SNP、及び/又はティール−ベンケ角膜ジストロフィー関連SNPと組み合わせて、例えば、果粒状角膜ジストロフィー関連SNPの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、アベリノ角膜ジストロフィー関連SNP、果粒状角膜ジストロフィー関連SNP、レイス・バックラー角膜ジストロフィー関連SNP、及び/又はティール−ベンケ角膜ジストロフィー関連SNPと組み合わせて、例えば、格子状ジストロフィー関連SNPの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、アベリノ角膜ジストロフィー関連SNP、果粒状角膜ジストロフィー関連SNP、格子状ジストロフィー関連SNP、及び/又はレイス・バックラー角膜ジストロフィー関連SNPと組み合わせて、例えば、ティール−ベンケ角膜ジストロフィー関連SNPの検出を通して検出される。

0189

いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、アベリノ角膜ジストロフィー関連SNPから選択されるSNPの2、3、4、5、及び/又は6個の検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、SNPは、ヒトTGFβI遺伝子によりコードされているポリペプチドの第124、555、及び/又は626位の突然変異をもたらすSNPを含む。これらの突然変異は、TGFβI遺伝子のR124突然変異をもたらすもの(例えば、C(G/A)C SNPとも称されるTGFβI遺伝子の第418位ヌクレオ
ドのGからAへのトランジションにより引き起こされるR124H突然変異を含むが、これらに限定されない)、果粒状角膜ジストロフィー関連SNP、例えば、TGFβI遺伝子のR555突然変異をもたらすもの(例えば、(C/T)GG SNPとも称されるT
GFβI遺伝子の第1663位ヌクレオチドのCからTへのトランジションにより引き起こされるR555W突然変異を含むが、これらに限定されない)、格子状ジストロフィー関連SNP、例えば、TGFβI遺伝子のR124突然変異をもたらすもの(例えば、(C/T)GCSNPとも称されるTGFβI遺伝子の第417位ヌクレオチドのCから
Tへのトランジションにより引き起こされるR124C突然変異を含むが、これらに限定されない)、レイス・バックラー角膜ジストロフィー関連SNP、例えば、TGFβI遺伝子のR124突然変異をもたらすもの(例えば、C(G/T)C SNPとも称される
TGFβI遺伝子の第418位ヌクレオチドのGからTへのトランジションにより引き起こされるR124L突然変異を含むが、これらに限定されない)、及び/又はティール−ベンケ角膜ジストロフィー関連SNP、例えば、TGFβI遺伝子のR555突然変異をもたらすもの(例えば、C(G/A)G SNPとも称されるTGFβI遺伝子の第16
64位ヌクレオチドのGからAへのトランジションにより引き起こされるR555Q突然変異を含むが、これらに限定されない)を含む。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、果粒状角膜ジストロフィー関連SNP、例えば、TGFβI遺伝子のR555突然変異をもたらすもの(例えば、(C/T)GG SNPとも称されるTGFβI遺伝
子の第1663位ヌクレオチドのCからTへのトランジションにより引き起こされるR555W突然変異を含むが、これらに限定されない)と組み合わせて、アベリノ角膜ジストロフィー関連SNP、例えば、TGFβI遺伝子のR124突然変異をもたらすもの(例えば、C(G/A)C SNPとも称されるTGFβI遺伝子の第418位ヌクレオチド
のGからAへのトランジションにより引き起こされるR124H突然変異を含むが、これらに限定されない)、の検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、アベリノ角膜ジストロフィー関連SNP、例えば、TGFβI遺伝子のH626P突然変異をもたらすもの(例えば、TGFβI遺伝子の第1924位ヌクレオチドのAからCへのトランジションにより引き起こされるH626P突然変異を含むが、これらに限定されない)、の検出を通して検出される。

0190

いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q、及び/又はH626Pの2、3、4、5、及び/又は6個の検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、例えば、R124C、R124H、R124L、R555W、及び/又はR555Qの2、3、4、及び/又は5つの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、R124H、R124L、R555W、及び/又はR555Qの1つ以上と組み合わせて、例えば、R124Cの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、R124C、R124L、R555W、及び/又はR555Qの1つ以上と組み合わせて、例えば、R124Hの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、R124C、R124H、R124L、及び/又はR555Qの1つ以上と組み合わせて、例えば、R555Wの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、R124C、R124H、R124L、及び/又はR555Wの1つ以上と組み合わせて、例えば、R555Qの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、R124Hは、R555Wと組み合わせて検出される。いくつかの実施態様では、角膜ジストロフィーは、R124C、R124H、R124L、R555W、及び/又はR555Qの1つ以上と組み合わせて、例えば、H262Pの検出を通して検出される。いくつかの実施態様では、R124C、R124H、R124L、R555W、及び/又はR555Qの全てが検出される。いくつかの実施態様では、R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q、及び/又はH626Pの全てが検出される。

0191

VIII.診断キット
いくつかの実施態様では、上記の試薬のいずれか又は全ては、診断キットにパッケージされる。前記キットは、本明細書に記載される、プライマー、プローブ、バッファ、及び/又は他の試薬のいずれか及び/又は全てを任意の組み合わせで含む。いくつかの実施態様では、キットは、R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q、及び/又はH626Pの2、3、4、5、及び/又は6個の検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、R124C、R124H、及びR124Lの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、R555W及びR555Qの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、R124Cの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、R124Hの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、R124Lの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、R555Wの検出用の試薬を含む。いくつかの実施態様では、キットは、R555Qの検出用の試薬を含む。

0192

いくつかの実施態様では、キットは、R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q、及び/又はH626Pの2、3、4、5、及び/又は6個の検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、R124C、R124H、R124L、R555W、及びR555Qの2、3、4、及び/又は5個の検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、R124C、R124H、及びR124Lの検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、R555W及びR555Qの検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、R124Cの検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、R124Hの検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、R124Lの検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、R555Wの検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、R555Qの検出用のプライマー及びプローブを含む。いくつかの実施態様では、キットは、H626Pの検出用のプライマー及びプローブを含む。

0193

いくつかの実施態様では、キット中の試薬は、凍結乾燥粉末として含まれている。いくつかの実施態様では、キット中の試薬は、リコンストラクション(reconstitution)用指示書と一緒に凍結乾燥粉末として含まれている。いくつかの実施態様では、キット中の試薬は、液体として含まれている。いくつかの実施態様では、試薬は、プラスチック及び/又はガラスバイアル、又は他の適当な容器に含まれている。いくつかの実施態様では、プライマー及びプローブは、全てキット内の個別の容器に収容されている。いくつかの実施態様では、プライマーは、1つの容器に一緒に包装され、プローブは、別の容器に一緒に包装されている。いくつかの実施態様では、プライマー及びプローブは、単一の容器内に一緒に包装されている。

0194

いくつかの実施態様では、キットは、対照gDNA及び/又はDNAサンプルをさらに含む。いくつかの実施態様では、含まれている対照DNAサンプルは、TGFBI R1
24正常である。いくつかの実施態様では、含まれている対照DNAサンプルは、R124C、R124H、R124L、R555W、R555Q、及び/又はH626Pを含む、検出されている突然変異に相当する。いくつかの実施態様では、TGFBI R124
正常に相当する対照DNAサンプルとR124C、R124H、R124L、R555W、R555Q、及び/又はH626Pに相当する突然変異DNAサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、TGFBI R124正常に相当する対照DNAサンプルとR
124C、R124H、R124L、R555W、及び/又はR555Qに相当する突然変異DNAサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、TGFBI R124正常
に相当する対照DNAサンプルとR124C、R124H、及び/又はR124Lに相当する突然変異DNAサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、TGFBI R1
24正常に相当する対照DNAサンプルとR555W及び/又はR555Qに相当する突然変異DNAサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、TGFBI R124正
常に相当する対照DNAサンプルとR124Cに相当する突然変異DNAサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、TGFBI R124正常に相当する対照DNAサン
プルとR124Hに相当する突然変異DNAサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、TGFBI R124正常に相当する対照DNAサンプルとR124Lに相当する
突然変異DNAサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、TGFBI R124
正常に相当する対照DNAサンプルとR555Wに相当する突然変異DNAサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、TGFBI R124正常に相当する対照DNAサ
ンプルとR555Qに相当する突然変異DNAサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、TGFBI R124正常に相当する対照DNAサンプルとH626Pに相当す
る突然変異DNAサンプルとが含まれる。いくつかの実施態様では、対照DNAサンプルの濃度は、5ng/μL、10ng/μL、20ng/μL、30ng/μL、40ng/μL、50ng/μL、60ng/μL、70ng/μL、80ng/μL、90ng/μL、100ng/μL、110ng/μL、120ng/μL、130ng/μL、140ng/μL、150ng/μL、160ng/μL、170ng/μL、180ng/μL、190ng/μL、又は200ng/μLである。いくつかの実施態様では、対照DNAサンプルの濃度は、50ng/μL、100ng/μL、150ng/μL、又は200ng/μLである。対照DNAサンプルの濃度は、100ng/μLである。いくつかの実施態様では、対照DNAサンプルは、同じ濃度を有している。いくつかの実施態様では、対照DNAサンプルは、異なる濃度を有している。

0195

いくつかの態様において、キットは、バッファ、例えばGTXpress TAQMA
N(登録商標)試薬混合物、又は任意の同等のバッファをさらに含むことができる。いくつかの実施態様では、バッファは、本明細書に記載される任意のバッファを含む。

0196

いくつかの実施態様では、キットは、クローニングに使用するための試薬、例えばベクター(例えば、M13ベクターを含む)をさらに含むことができる。

0197

いくつかの実施態様では、キットは、DNAの精製に使用するための試薬をさらに含む。

0198

いくつかの実施態様では、キットは、対象における角膜ジストロフィー検出用キットを使用するための指示書をさらに含む。いくつかの実施態様では、これらの指示書は、本明細書に記載されたプロトコルの様々な観点を含む。

0199

実施例1:DNA抽出(DNA Extract All Reagents,Therm
oFisher)
以下に記載するようにそして本明細書において提供される開示に従って、DNAを口腔上皮又は毛根又は全血から抽出した。

0200

口腔上皮又は毛根由来のDNA抽出のために、サンプルをまず1×PBS300μL
で前処理した。次に、30μLの溶解液をチューブに添加し、そして混合物をボルテックスした。次に、混合物を95℃で3分間インキュベートした。次に、DNA Stabi
lizing Solution(ライフテクノロジーズ/サーモサイエンティフィック
製、米国)30μLを添加し、そして混合物をボルテックスした。次に、混合物を13,000RPMで1分間遠心分離した。

0201

全血由来のDNA抽出のために、全血3μLから続けて、サンプルをまず1×PBS
300μLで前処理した。次に、30μLの溶解液をチューブに添加し、そして混合物をボルテックスした。次に、混合物を95℃で3分間インキュベートした。次に、DNA
Stabilizing Solution(ライフテクノロジーズ/サーモサイエンテ
フィック製、米国)30μLを添加し、そして混合物をボルテックスした。次に、混合物を13,000RPMで1分間遠心分離した。

0202

上記の手順が完了した後、DNA濃度を市販のTecan(登録商標)Infinite(登録商標)200 PRO NanoQuantを用いて読み取った。定量のために、溶出液100μLを透明な96ウェルプレートピペットで移した。次に、調製したブランク溶液100μLをウェルH12に十分に添加した。その後、濃度をNanoQuantから提供されたメーカーの指示書を使用して読み取った。

0203

反応混合物を、下記表5及び6に記載されているプローブ及びプライマーを使用して調製した。

0204

例示的な反応混合物中で使用される成分及び比率を以下の表7に示す。

0205

例示的なPCRサイクリング条件を以下の表8に示す。

0206

上記のプロトコルを図4〜8において提供されているリアルタイムPCRのデータを作成するために使用した。

参考文献

0207

全ての表題セクションの指定は、明確かつ参照のみを目的として使用され、決して限定と考えるべきではない。例えば、当業者は、本明細書に記載される本発明の精神及び範囲に応じて異なる適切な表題の様々な観点を組み合わせることの有用性を理解するであろう。

0208

本明細書において引用される全ての参考文献は、それぞれ個々の刊行物又は特許若しくは特許出願が具体的かつ個別に全ての目的のためにその全体が参照により組み込まれることが示された場合と同じ程度に、その全体が、全ての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

0209

当業者には明らかであるように、本出願の多くの修正及び変形が、その精神及び範囲から逸脱することなく行われることが可能である。本明細書に記載の特定の実施態様及び実施例は例としてのみ提供され、そして、出願は、特許請求の範囲が権利を有する等価物全範囲とともに、添付の請求項によってのみ限定されるものである。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ