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図面 (4)

課題

細胞株からラブドウイルスを検出および除去する方法に関する。

解決手段

本開示は、昆虫細胞において産生される産物からウイルスの存在を検出するため、および昆虫細胞において産生される産物からウイルスを除去するための組成物、方法、混合物およびキットに関する。本開示はまた、昆虫細胞において産生される、ウイルスを含まないかまたは実質的に含まないタンパク質ペプチドポリペプチド原体生物学的産物ワクチン抗原およびウイルス様粒子に関する。本開示はまた、試料中のラブドウイルスを検出するための組成物、方法、アッセイおよびキットに関する。

概要

背景

[0003]SF21およびSF9細胞等の昆虫細胞は、ヒト疾患における使用のための治療用生物学的産物の産生を含む、タンパク質発現のために一般的に用いられる。昆虫細胞は、バキュロウイルス発現系と併せて用いられることが多い。このようなバキュロウイルス昆虫細胞発現系は、高密度成長し、十分なレベルタンパク質発現するそれらの能力や大規模懸濁培養に容易に適応させることができるという事実があることから、生物学的産物の産生のために用いられてきた。これらの細胞は、広範な検査の結果、混入ウイルスを含まないと長らく考えられてきた。

概要

細胞株からラブドウイルスを検出および除去する方法に関する。本開示は、昆虫細胞において産生される産物からウイルスの存在を検出するため、および昆虫細胞において産生される産物からウイルスを除去するための組成物、方法、混合物およびキットに関する。本開示はまた、昆虫細胞において産生される、ウイルスを含まないかまたは実質的に含まないタンパク質、ペプチドポリペプチド原体、生物学的産物、ワクチン抗原およびウイルス様粒子に関する。本開示はまた、試料中のラブドウイルスを検出するための組成物、方法、アッセイおよびキットに関する。

目的

[0005] 一態様において、本開示は、試料中の混入因子(agent)を検出するための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

列番号1または配列番号1の逆相補体配列の少なくとも50個の近接ヌクレオチドを含む核酸配列を検出する工程を含む、ウイルスを検出するための方法。

請求項2

配列番号1または配列番号1の逆相補体配列の少なくとも1000個の近接ヌクレオチドを含む核酸を検出する工程を含む、請求項1に記載の方法。

請求項3

配列番号1または配列番号1の逆相補体配列の少なくとも1500個の近接ヌクレオチドを含む核酸を検出する工程を含む、請求項1に記載の方法。

請求項4

PCRアッセイにおいて1種または複数のプライマーおよび1種または複数の標識されたプローブを用いる工程を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。

請求項5

配列番号2(TCTGTATTATGGGTTTGATCGCTAAG)の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号3(CTCGTGCTGAGCGGTTT)の配列を有するリバースプライマーとを用いる工程を含む、請求項4に記載の方法。

請求項6

標識されたプローブのヌクレオチド配列が、配列番号4(AGGATTGGAGAATTATAC)による、請求項5に記載の方法。

請求項7

約2分子のRNA〜約20分子のRNAの間の感度レベルを有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。

請求項8

感度レベルが約20分子のRNAである、請求項7に記載の方法。

請求項9

感度レベルが約4分子のRNAである、請求項7に記載の方法。

請求項10

昆虫細胞由来するタンパク質またはウイルス様粒子(VLP調製物からウイルスを除去するための方法であって、ウイルスが配列番号1に対し少なくとも70%相同性を有する配列を含む、方法。

請求項11

ウイルスが、配列番号1の配列を含む、請求項10に記載の方法。

請求項12

昆虫細胞が、SF細胞である、請求項10または11に記載の方法。

請求項13

SF9細胞が、ATCCCRL−1711として寄託された細胞株に由来する、請求項12に記載の方法。

請求項14

昆虫細胞に由来するタンパク質またはウイルス様粒子(VLP)調製物であって、タンパク質またはVLPが、配列番号1に対し少なくとも70%相同性を有するヌクレオチド配列を含むウイルスを実質的に含まない、タンパク質またはVLP調製物。

請求項15

ウイルスが、配列番号1の配列を含む、請求項14に記載のタンパク質またはVLP。

請求項16

昆虫細胞が、SF9細胞である、請求項14または15に記載のタンパク質またはVLP。

請求項17

SF9細胞が、ATCCCRL−1711として寄託された細胞株に由来する、請求項16に記載のタンパク質またはVLP。

請求項18

昆虫細胞において産生された、タンパク質またはウイルス様粒子調製物を含む組成物であって、配列番号1に対し少なくとも70%相同性を有する配列を含むウイルスを実質的に含まない組成物。

請求項19

ウイルスが、配列番号1の配列を含む、請求項18に記載の組成物。

請求項20

昆虫細胞が、SF9細胞である、請求項18または19に記載の組成物。

請求項21

SF9細胞が、ATCCCRL−1711として寄託された細胞株に由来する、請求項20に記載の組成物。

請求項22

ワクチンである、請求項18〜21のいずれか一項に記載の組成物。

請求項23

配列番号1に対し少なくとも70%相同性を有するウイルスを実質的に含まない、ヒトにおける使用に承認された生物製剤であって、昆虫細胞において産生された生物製剤。

請求項24

ウイルスが、配列番号1の配列を含む、請求項23に記載の生物製剤。

請求項25

昆虫細胞が、SF9細胞である、請求項23または24に記載の生物製剤。

請求項26

SF9細胞が、ATCCCRL−1711として寄託された細胞株に由来する、請求項25に記載の生物製剤。

請求項27

ワクチンまたはウイルス様粒子調製物である、請求項23または24に記載の生物製剤。

請求項28

配列番号1に対し少なくとも70%相同性の配列を有するウイルスの存在または非存在を検出するためのキットであって、1種または複数のプライマーを含むキット。

請求項29

フォワードプライマーと、リバースプライマーと、プローブとを含む、請求項28に記載のキット。

請求項30

細胞におけるウイルスの存在または非存在を検出するためのキットであって、(i)配列番号2の配列を有するフォワードプライマーと、(ii)配列番号3の配列を有するリバースプライマーと、(iii)配列番号4の配列を有するプローブとを含むキット。

請求項31

プローブが、6−カルボキシフルオレセインFAM)で標識される、請求項29または30に記載のキット。

請求項32

試料中の粒子会合したSf9ラブドウイルスを検出するための方法であって、(i)試料をRNaseで処理する工程と、(ii)試料中のRNaseを不活性化し、粒子を破壊する工程と、(iii)RT−PCRによってRNase処理した試料中のSf9ラブドウイルスRNAの存在または非存在を検出する工程とを含み、RNase処理した試料中のSf9ラブドウイルスRNAの存在が、検出されたSf9ラブドウイルスが、試料中の粒子上に凝集していることまたは粒子内にパッケージングされていることを示す方法。

請求項33

RNaseが、RNaseAである、請求項32に記載の方法。

請求項34

RT−PCRが、配列番号2の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号3の配列を有するリバースプライマーと、配列番号4の配列を有するプローブとを用いて行われる、請求項32に記載の方法。

請求項35

工程(ii)が、カオトロピック剤を用いて行われる、請求項32に記載の方法。

請求項36

RNaseによる試料の処理に先立ち、RT−PCRによって試料中のSf9ラブドウイルスRNAの存在または非存在を検出する工程をさらに含む、請求項32に記載の方法。

請求項37

試料中の複製コンピテントSf9ラブドウイルスを検出するための方法であって、Spodopteraexigua細胞株と共に試料をインキュベートする工程と、試料とのインキュベーション後に前記細胞株を少なくとも1回継代する工程と、試料と前記細胞株とのインキュベート後および前記細胞の各継代の後の時点で、Sf9ラブドウイルスRNAの存在または非存在を検出する工程とを含み、試料と前記細胞株とのインキュベーションの直後に検出されるSf9ラブドウイルスRNAシグナルのレベルと比べた、1回または複数の継代のうち少なくとも1回の後のSf9ラブドウイルスRNAシグナルのレベルの増加が、Sf9ラブドウイルスが試料に存在し、複製することができることを示す、方法。

請求項38

試料中の複製コンピテントな粒子会合したSf9ラブドウイルスの存在または非存在を検出するための方法であって、(i)試料をRNaseで処理する工程と、(ii)RNaseを不活性化し、試料中の粒子を破壊する工程と、(iii)RT−PCRによって、RNase処理した試料中のSf9ラブドウイルスRNAの存在または非存在を検出する工程と、(iv)Spodopteraexigua細胞株と共にRNase処理した試料をインキュベートする工程と、(v)前記細胞株を少なくとも1回継代する工程と、(vi)RNase処理した試料とのインキュベーション後および少なくとも1回の細胞継代のそれぞれの後の時点で、前記細胞株から全RNAを精製する工程と、(vii)RT−PCRによって、各時点由来の全RNA中のSf9ラブドウイルスRNAを検出する工程とを含み、RNase処理した試料と前記細胞株とのインキュベーションの直後に検出されるSf9ラブドウイルスRNAのレベルと比べた、少なくとも1回の継代の後に検出されるSf9ラブドウイルスRNAのレベルの増加が、Sf9ラブドウイルスが複製することができることを示す方法。

請求項39

RNaseが、RNaseAである、請求項38に記載の方法。

請求項40

RT−PCRが、配列番号2の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号3の配列を有するリバースプライマーと、配列番号4の配列を有するプローブとを用いて行われる、請求項38に記載の方法。

請求項41

工程(ii)が、カオトロピック剤を用いて行われる、請求項38に記載の方法。

請求項42

RNaseによる試料の処理に先立ち、RT−PCRによって試料中のSf9ラブドウイルスRNAの存在または非存在を検出する工程をさらに含む、請求項38に記載の方法。

請求項43

試料が原体であり、方法が、原体のための放出アッセイにおいて用いられる、請求項32、37または38に記載の方法。

請求項44

試料中の複製コンピテントSf9ラブドウイルスの存在または非存在を検出するためのキットであって、(i)Sf9ラブドウイルスRNAの検出のためのフォワードおよびリバースプライマーならびにプローブと、(ii)RNaseと、(iii)カオトロピック剤と、(iv)S.exigua細胞株とを含むキット。

請求項45

S.exigua細胞と、ラブドウイルスとを含む組成物。

請求項46

ラブドウイルスが、配列番号1に対し少なくとも70%相同性を有する配列を含む、請求項45に記載の組成物。

請求項47

ラブドウイルスが、配列番号1の配列を含む、請求項46に記載の組成物。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
[0001] 本願は、全ての目的のため本明細書に参照によりその全体の内容が組み込まれる、2013年10月3日に出願された米国特許仮出願第61/886,438号に対する優先権を主張するものである。

0002

本明細書に添付して電子的に提出されたテキストファイルの説明
[0002] 本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる:配列表コンピュータ読み取り可能フォーマットコピーファイル名:LIGO_026_01WO_SeqList_ST25.txt;記録された日付:2014年10月3日;ファイルサイズ18Kb)。

背景技術

0003

[0003]SF21およびSF9細胞等の昆虫細胞は、ヒト疾患における使用のための治療用生物学的産物の産生を含む、タンパク質発現のために一般的に用いられる。昆虫細胞は、バキュロウイルス発現系と併せて用いられることが多い。このようなバキュロウイルス昆虫細胞発現系は、高密度成長し、十分なレベルタンパク質発現するそれらの能力や大規模懸濁培養に容易に適応させることができるという事実があることから、生物学的産物の産生のために用いられてきた。これらの細胞は、広範な検査の結果、混入ウイルスを含まないと長らく考えられてきた。

発明が解決しようとする課題

0004

[0004] 本技術分野において、混入ウイルスを含まない昆虫細胞、昆虫細胞が混入ウイルスを含まないかを決定するための方法、および混入ウイルスを含まない昆虫細胞から産生されるヒト治療法に適した産物が必要とされている。

課題を解決するための手段

0005

[0005] 一態様において、本開示は、試料中の混入因子(agent)を検出するための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供する。一部の実施形態において、試料は、昆虫細胞株において産生されるかまたはこれを用いて作製されるタンパク質、ペプチド原体(drug substance)、生物学的産物、ウイルス、ワクチン抗原またはウイルス様粒子(VLP調製物である。一部の実施形態において、昆虫細胞株は、Sf9またはSf21である。一部の実施形態において、混入因子は、ウイルスまたはウイルスゲノムの一部である。一部の実施形態において、本開示は、本明細書において「Sf9ラブドウイルス」と称する新規ウイルスの検出のための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供する。一態様において、本開示は、Sf9ラブドウイルスの核酸配列および他の特徴を提供する。別の態様において、本開示は、試料中のSf9ラブドウイルスまたはSf9ラブドウイルス核酸またはSf9ラブドウイルス粒子が、複製することができるかを決定するための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供する。一部の実施形態において、本開示は、(i)試料が、RTPCRによって測定される検出可能レベルのSf9ラブドウイルスRNAを含有するか;(ii)Sf9ラブドウイルスRNAが、試料中のヌクレアーゼ抵抗性粒子に存在するか;および/または(iii)Sf9ラブドウイルスRNAが、複製することができるかを決定するための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供する。

0006

[0006] 一態様において、本発明は、配列番号1または配列番号1の逆相補体(reverse complement)の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500または少なくとも2000個の近接ヌクレオチドを含む核酸配列を検出する工程を含む、ウイルスを検出するための方法を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示されているウイルスを検出するための方法は、PCRアッセイにおいて1種または複数のプライマーおよび1種または複数の標識されたプローブを用いる工程を含む。一部の実施形態において、プローブは、標識されたプローブである。

0007

[0007] 一部の実施形態において、本開示は、ウイルスを検出するための方法であって、約1分子のRNA〜約50分子のRNAの間の感度レベルを有する方法を提供する。

0008

[0008] 一態様において、本開示は、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはウイルス様粒子(VLP)調製物からウイルスを除去するための方法であって、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはVLP調製物が、昆虫細胞を用いて作製されるかまたは昆虫細胞において産生され、ウイルスが、配列番号1に対し少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%相同性を有する配列を含む方法を提供する。さらなる実施形態において、ウイルスは、配列番号1の配列を含む。複数の実施形態において、昆虫細胞は、Sf9細胞またはSf21細胞である。さらなる実施形態において、Sf9細胞は、ATCCCRL−1711として寄託された細胞株由来する。

0009

[0009] 一態様において、本開示は、昆虫細胞において産生されるタンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはVLP調製物であって、配列番号1に対し少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%相同性を有するヌクレオチド配列を含むウイルスを実質的に含まないタンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはVLPを提供する。さらなる実施形態において、ウイルスは、配列番号1の配列を含む。実施形態において、昆虫細胞は、Sf9細胞またはSf21細胞である。さらなる実施形態において、Sf9細胞は、ATCCCRL−1711として寄託された細胞株に由来する。本発明は、このような物質を含み、薬学的に許容される担体任意選択により組み合わされた組成物、ならびにこのような物質におけるウイルスの存在または非存在を検出するためのキットも包含する。

0010

[0010] 一態様において、本開示は、試料中の粒子上に凝集した、および/またはその中にキャプシド形成した、Sf9ラブドウイルスの存在または非存在を検出するための方法を提供する。一部の実施形態において、試料は、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはVLP調製物である。一部の実施形態において、本方法は、(i)RNAを分解する酵素による処理に試料を付す工程と、(ii)酵素活性を停止させ、粒子を破壊するために、カオトロピック剤等、1種または複数の剤に試料を付す工程と、(iii)RT−PCRによって、得られた試料中のSf9ラブドウイルスRNAの存在または非存在を検出する工程とを含む。さらなる実施形態において、本方法は、工程(i)において酵素処理に試料を付す前に、RT−PCRによって試料中のSf9ラブドウイルスRNAの存在または非存在を検出する工程を含む。一部の実施形態において、工程(i)および(ii)の後に検出されるRNAシグナルは、工程(i)に先立ち検出されるRNAシグナルと比較される。一部の実施形態において、酵素処理および粒子破壊後に検出されるRNAは、試料中の粒子に存在する。

0011

[0011] 一態様において、本開示は、配列番号1によるウイルスの断片または配列番号1に相補的な配列の断片であって、標識または化学修飾された断片をさらに提供する。

0012

[0012] 一態様において、本開示は、S.exigua細胞と、ラブドウイルスとを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、ラブドウイルスは、配列番号1に対し少なくとも70%相同性を有する配列を含む。一部の実施形態において、ラブドウイルスは、配列番号1の配列を含む。

図面の簡単な説明

0013

[0013]図1は、センス配向性(5’から3’)で示される、Sf9ラブドウイルスゲノムマップ提示する。
[0014]図2は、透過型電子顕微鏡TEM)によって撮像された、Sf9ラブドウイルスの9枚の個々の画像を提示する。
[0015]図3は、感染前(pre-infection)の、または継代0、1もしくは2の、Sf9細胞馴化培地曝露された昆虫細胞(AMCY-SeE1、AMCY-SeE4、AMCY-SeE5、HvAM1、HzAM1、HzFB33、HsAM1またはAgAM1)中のSf9ラブドウイルスRNAシグナルの検出を示すグラフである。全細胞RNA1μg当たりのフェムトグラム(fg)ラブドウイルスRNAとして、データを表す。

0014

[0016] 本開示は、試料中の混入因子を同定するためおよび/または試料から混入因子を除去するための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供する。一部には、本開示は、昆虫細胞株Sf9細胞に存在することが同定された新規ウイルスを提供する。治療目的の生物学的産物を産生するために創薬において一般的に用いられるSf9細胞および他の昆虫細胞株は、混入ウイルスを含まないと以前から考えられてきた。しかし、本発明者らは、驚くべきことに、本明細書に開示されている新規ウイルスが、Sf9細胞に存在したことを見出した。本明細書に記載されている研究に基づき、新規ウイルスは、ラブドウイルスであると決定された。このラブドウイルスは、Sf9以外の細胞株に見出されたものの、本明細書に開示されているラブドウイルスは、本明細書において「Sf9ラブドウイルス」と称する。Sf9ラブドウイルスの配列は、配列番号1として本明細書に提示されている。

0015

[0017] 本開示は、ウイルスの核酸および他の特徴、ウイルスの検出における使用のための方法、アッセイおよびキット、ならびにウイルスを実質的に含まない細胞または生物学的産物を提供する。一実施形態において、生物学的産物は、治療および/または診断目的の産物である。さらなる実施形態において、治療および/または診断目的の生物学的産物は、少なくとも一部には、昆虫細胞株を用いて作製される。さらなる実施形態において、昆虫細胞株は、Sf9またはSf21である。

0016

[0018] 一態様において、本開示は、Sf9細胞におけるウイルスの存在を検出するための組成物、アッセイ、方法およびキットを提供する。一態様において、本開示は、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはVLP調製物におけるウイルスの存在を検出するための組成物、アッセイ、方法およびキットを提供する。さらなる実施形態において、原体は、Sf9細胞等、昆虫細胞を用いて作製されたかまたは昆虫細胞において産生された。一態様において、本開示は、Sf9ラブドウイルスが、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはVLP調製物等、試料中の粒子上に凝集されるかまたはその内にキャプシド形成されるかを決定するための組成物、アッセイ、方法およびキットを提供する。一態様において、本開示は、試料(例えば、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはVLP調製物)において同定されたSf9ラブドウイルスが、複製することができるかを決定するための組成物、アッセイ、方法およびキットを提供する。

0017

[0019] 一態様において、本開示は、試料中のウイルスの検出に関する。一実施形態において、標的核酸は、単離、増幅および検出される。標的RNA配列を検出および増幅するための方法(例えば、逆転写PCR(RT-PCR)による)を含む、核酸を単離、増幅または検出するための方法は、本技術分野において周知であり、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第4版(2012) and Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology(2011)に記載されている。

0018

[0020] 一態様において、本開示は、配列番号1または配列番号1の逆相補体の少なくとも25、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも250、少なくとも500、少なくとも750、少なくとも1000、少なくとも1250、少なくとも1500または少なくとも2000個の近接ヌクレオチドを含む核酸配列を検出する工程を含む、ウイルスを検出するための方法を提供する。一部の実施形態において、本明細書に開示されているウイルスを検出するための方法は、PCRアッセイにおいて1種または複数のプライマーおよび1種または複数の標識されたプローブを用いる工程を含む。さらなる実施形態において、本方法は、配列番号2(TCTGTATTATGGGTTTGATCGCTAAG)の配列を有するフォワードプライマーおよび配列番号3(CTCGTGCTGAGCGGTTT)の配列を有するリバースプライマーを用いる工程を含む。一部の実施形態において、本方法は、配列番号4(AGGATTGGAGAATTATAC)の配列を有するプローブを用いる工程を含む。

0019

[0021] 一部の実施形態において、本開示は、配列番号1によるウイルスを提供する。一部の実施形態において、本開示は、配列番号1によるウイルスの断片または配列番号1に相補的な配列の断片をさらに提供する。一部の実施形態において、Sf9ラブドウイルスゲノムまたはラブドウイルスゲノムに相補的な配列の断片は、標識または化学修飾される。

0020

[0022] 一部の実施形態において、本開示は、Sf9ラブドウイルスを検出することができる配列を含む標識されたプローブを提供する。一部の実施形態において、標識されたプローブは、Sf9ラブドウイルスゲノムの一部またはSf9ラブドウイルスゲノムにおける配列の逆相補体に相補的である。

0021

[0023] 一部の実施形態において、配列、断片またはプローブは、例えば、FAM、VIC、JOE、5−(2’−アミノエチルアミノナフタレン−1−スルホン酸クマリンおよびクマリン誘導体ルシファーイエローテキサスレッドテトラメチルローダミン、6−カルボキシフルオレセインテトラクロロ−6−カルボキシフルオレセイン、5−カルボキシローダミンならびにシアニン色素等、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体からなる群から選択されるフルオロフォアで標識される。一実施形態において、プローブは、6−カルボキシ−フルオレセイン(FAM)で標識される。一部の実施形態において、本開示は、ウイルスを検出するための方法であって、約1分子のRNA〜約50分子のRNAの間の感度レベルを有する方法を提供する。さらなる実施形態において、本方法は、約2分子のRNA〜約20分子のRNAの間の感度レベルを有する。他の実施形態において、本方法の感度レベルは、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、約21、約22、約23、約24または約25分子のRNAである。

0022

[0024] 一態様において、本開示は、昆虫細胞において産生されるタンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原、ウイルスもしくはVLP調製物、または昆虫細胞において産生されるタンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原、ウイルスもしくはVLP調製物を含む組成物を提供する。一部の実施形態において、VLP調製物は、カリシウイルスVLP調製物である。さらなる実施形態において、VLP調製物は、ノロウイルスVLP調製物である。VLP調製物は、1種または複数のウイルスまたはウイルス株由来の1種もしくは複数のカプシドタンパク質またはカプシドタンパク質の一部を含む一価または多価VLP調製物を含む。例えば、ノロウイルスVLP調製物は、1種または複数のノロウイルス遺伝子群(genogroup)由来の1種もしくは複数のカプシドタンパク質またはカプシドタンパク質の一部を含む一価または多価VLP調製物を含む。本明細書における「一価VLP」が、単一ウイルス株由来のVLP抗原を含有するVLPを指す一方、本明細書における「多価VLP」は、2種以上のウイルス株由来のVLP抗原を含有するVLPを指す。異なる一価VLPが、同じVLP製剤において共に存在してもよい。例えば、一部の実施形態において、ノロウイルスVLP調製物は、1種のノロウイルス遺伝子群由来のVP1および/またはVP2カプシドを含むことができる、あるいは1種のノロウイルス遺伝子群由来のVP1および/またはVP2タンパク質と共に、第2のノロウイルス遺伝子群由来のVP1および/またはVP2タンパク質を含むことができる。ノロウイルスVLP調製物の例は、ノロウイルス遺伝子群I、遺伝子型1/ノロウイルス遺伝子群II、遺伝子型4(GI.1/GII.4)二価VLPであり、これは、例えば、に記載されている。

0023

[0025] 一態様において、本開示は、試料中の、配列番号1に対し少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも99%相同性の配列を有するウイルスの存在または非存在を検出するためのキットであって、1種または複数のプライマーを含むキットを提供する。一部の実施形態において、本キットは、フォワードプライマー、リバースプライマーおよびプローブを含む。さらなる実施形態において、フォワードプライマーは、配列番号2の配列を有し;リバースプライマーは、配列番号3の配列を有し;プローブは、配列番号4の配列を有する。一部の実施形態において、プローブは、例えば、FAM、VIC、JOE、5−(2’−アミノエチル)アミノナフタレン−1−スルホン酸、クマリンおよびクマリン誘導体、ルシファーイエロー、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、6−カルボキシフルオレセイン、テトラクロロ−6−カルボキシフルオレセイン、5−カルボキシローダミンならびにシアニン色素等、フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体からなる群から選択されるフルオロフォアで標識される。一実施形態において、プローブは、6−カルボキシ−フルオレセイン(FAM)で標識される。

0024

[0026] 一態様において、本開示は、Sf9ラブドウイルスが試料に存在するかを決定し、Sf9ラブドウイルスが複製することができるかを決定するための、検査のための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供する。一部の実施形態において、本方法は、RT−PCRによって試料中のSf9ラブドウイルスの存在または非存在を検出する工程を含み、この方法は、PCRアッセイにおいて1種または複数のプライマーおよび1種または複数の標識されたプローブを用いる工程を含み、このアッセイは、配列番号2(TCTGTATTATGGGTTTGATCAGCTAAG)の配列を有するフォワードプライマーと、配列番号3(CTCGCTGCTGAGCGGTTT)の配列を有するリバースプライマーと、配列番号4(AGGATTGGAGAATTATAC)の配列を有する標識されたプローブの使用を含む。実施形態において、本開示は、試料中のSf9ラブドウイルスRNAシグナルが、粒子および/または凝集体に存在するかを決定するための方法であって、試料をRNaseA処理に付し、続いてRNase A活性を停止し、粒子を破壊するためにカオトロピック剤で処理する工程を含む方法をさらに提供する。次に、処理された試料を上述のRT−PCRアッセイに付す。得られた試料中のSf9ラブドウイルスRNAシグナルは、Sf9ラブドウイルスが、試料中の粒子に存在することを示す。実施形態において、本開示は、Sf9ラブドウイルスRNAが複製することができるかを決定するための方法をさらに提供する。そのため、例えば、S.exigua細胞等、Sf9ラブドウイルス複製に許容的な細胞株と共に試料をインキュベートし、続いて細胞を継代する。増加するSf9ラブドウイルスRT−PCRシグナルは、ウイルスが複製することができることを示す。よって、本開示は、Sf9ラブドウイルスの存在または非存在を検出するためのならびにSf9ラブドウイルスの感染力を評価するためのキットを提供する。実施形態において、本キットは、(i)Sf9ラブドウイルスRNAの検出のためのフォワードおよびリバースプライマーならびにプローブと、(ii)RNaseと、(iii)カオトロピック剤と、(iv)S.exigua細胞株とを含む。

0025

[0027] 一態様において、本開示は、ラブドウイルス、ラブドウイルス核酸もしくはラブドウイルス粒子を含まない、またはラブドウイルス発現のない昆虫細胞を提供する。さらなる実施形態において、昆虫細胞は、Sf9またはSf21細胞である。一部の実施形態において、昆虫細胞は、本明細書に開示されているSf9ラブドウイルスを含まず、Sf9ラブドウイルス核酸または粒子を含まない。一部の実施形態において、ラブドウイルスは、Sf9またはSf21細胞から除去されている。他の実施形態において、ラブドウイルス、ラブドウイルス核酸またはラブドウイルス粒子の発現は、昆虫細胞においてブロックされている。例えば、一部の実施形態において、ラブドウイルス発現は、ラブドウイルスゲノムに標的化されたsiRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドによってブロックされている。よって、一部の実施形態において、本開示は、Sf9ラブドウイルスゲノムまたはラブドウイルスゲノムに相補的な配列の断片を提供する。さらなる実施形態において、Sf9ラブドウイルスゲノムまたはラブドウイルスゲノムに相補的な配列の断片は、標識または化学修飾される。よって、一部の実施形態において、本開示は、配列番号1またはその相補的配列に対応する標識または化学修飾されたsiRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。

0026

[0028] 一態様において、本開示は、昆虫細胞において産生されるタンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはVLP調製物からラブドウイルスを除去するための方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、精製後にラブドウイルス(例えば、Sf9ラブドウイルス)の存在または非存在を検出する工程をさらに含む。一部の実施形態において、昆虫細胞において産生されるタンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはVLP調製物からラブドウイルスを除去するための方法は、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー疎水性相互作用クロマトグラフィー、SDR HyperDクロマトグラフィーおよび本技術分野において公知の、例えば、本明細書に参照によりその全体が組み込まれる米国特許第8,481,693号に開示されている他のクロマトグラフィー方法)、濾過(例えば、限外濾過ダイアフィルトレーションおよび0.2μm濾過)、洗剤による処理または他の精製方法を含み、この方法は、精製後にラブドウイルスの存在または非存在を検出する工程をさらに含む。

0027

[0029]ラブドウイルスは、Rhabdoviridiae科(目:Mononegavirales)に属し、この科は、マイナス(−)センスRNAウイルスの多様な科であり、少なくとも6属:Lyssavirus(とりわけ、狂犬病ウイルスを含む)、vesiculovirus(とりわけ、水疱性口内炎(vesicular stromatitis)ウイルス(VSV)を含む)、ephemerovirus(とりわけウシ流行熱ウイルスを含む)、cytorhabdovirus(とりわけ、レタス壊死性黄変病(necrotic yellows)ウイルス等の植物ウイルスを含む)、nucleorhabdovirus(とりわけ、ジャガイモ黄萎病ウイルス等の植物ウイルスを含む)およびnorvirhabdovirusを含む。

0028

[0030] Spodoptera frugiperdaおよび他のLepidopteran昆虫種由来の細胞等、昆虫細胞は、本技術分野において周知であり、組換えタンパク質の産生のため、例えば、ワクチンを含む治療用産物の産生のため、バキュロウイルスまたは他のウイルスの感染および複製の支持に一般的に用いられている。Sf9細胞株は、S.frugiperda卵巣細胞から元々得られた、Sf21細胞のクローン分離株である。Sf9細胞株ATCCCRL−1711は、1983年にアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(American Type Culture Collection)(ATCC)に寄託された。他の昆虫細胞株として、Spodoptera exigua、Heliothis virescens、Helicoverpa zea、Heliothis subflexa、Anticarsia gemmatalisその他が挙げられるがこれらに限定されない。

0029

[0031] 用語「Sf9ラブドウイルス」は、本明細書において、本明細書に開示されている新規ウイルスを指す。Sf9ラブドウイルスの核酸配列は、配列番号1として本明細書に提示されている。本明細書において、用語「複製コンピテント」または「複製可能」は、Sf9ラブドウイルスまたはSf9ラブドウイルスRNA分子の記載に用いられる場合、自己複製し、宿主細胞における転写をもたらすウイルスまたはRNA分子を意味する。

0030

[0032] 本明細書において、用語「プライマー」は、PCR反応において用いられるために十分な数の塩基を有する一連ヌクレオチド残基を指す。プライマーは、試料中の同一、同様または相補的なDNAまたはRNAの存在を増幅、確認または明らかにするために用いることができる。本明細書において、用語「プローブ」は、同一、同様または相補的な核酸配列の検出において用いられる核酸配列を指す。

0031

[0033] 一態様において、本開示は、試料中のウイルスを検出するためまたは試料からウイルスを除去するための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供し、試料は、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原またはVLP調製物である。本明細書において、用語「ウイルス様粒子およびVLP」は、互換的に用いられ、一属性においてウイルスに似ているが、感染性が明示されていない構造を指す。用語「原体」は、本明細書において、治療薬を含有し、医薬組成物または薬製品の製剤化に賦形剤と共に用いられる材料を指す。「生物学的産物」は、本明細書において、細胞または生物によって産生される産物または材料を指す。生物学的産物は、生物の天然の産物となり得るか、あるいはこの生物学的産物を産生するように何らかの仕方で変更された生物によって産生され得る。生物学的産物の例として、ワクチン、抗体(例えば、モノクローナル抗体)、治療用タンパク質、ウイルス(例えば、バキュロウイルス等、例えば、遺伝子療法のための組換えウイルス)、酵素、成長因子多糖、DNAおよびRNAを含む核酸ならびに粒子(例えば、ウイルス様粒子)が挙げられるがこれらに限定されない。生物学的産物は、例えば、グリコシル化または放射標識によって変更することができる。

0032

[0034] 一態様において、本開示は、複製することができるSf9ラブドウイルスを検出するため、またはSf9ラブドウイルスが複製コンピテントであるかを決定するための組成物、方法、アッセイおよびキットを提供する。よって、一態様において、本開示は、試料に存在するSf9ラブドウイルスが複製することができるかを決定するための手段を提供する。一部の実施形態において、本方法は、Sf9ラブドウイルスRNAシグナルを含む試料を、Sf9ラブドウイルス複製を支持することができる細胞株と共にインキュベートする工程を含む。一部の実施形態において、Sf9ラブドウイルス複製を支持することができる細胞株は、例えば、Spodoptera exigua細胞株となり得る。このような細胞株のいくつかは、本明細書に開示されており、例えば、BCIRL/AMCY−SeE1、BCIRL/AMCY−SeE4およびBCIRL/AMCY−SeE5等、Spodoptera exigua細胞に由来する細胞株を含む。一部の実施形態において、S.exigua細胞株は、10%ウシ胎仔血清を含有するEX−Cell420培地において培養される。一部の実施形態において、複製するSf9ラブドウイルスは、本明細書に開示されているとおりRT−PCRによってSf9ラブドウイルスRNAシグナルをいくつかの時点で測定することにより検出される。例えば、一実施形態において、Sf9ラブドウイルスRNAを検出するためのRT−PCRは、細胞株とのインキュベーションの前に、細胞株とのインキュベーションの直後に(継代0において)、および細胞株のその後の継代の後に(例えば、継代1および2の後に)試料において行われる。少なくとも1回の継代の後に、RT−PCRによって検出されるSf9ラブドウイルスRNAシグナルの増加は、S.exigua細胞株においてウイルスが複製していることを示す。RT−PCRによって検出されるSf9ラブドウイルスRNAシグナルの減少または変化の欠如は、Sf9ラブドウイルスRNAシグナルが、複製することができるウイルスに関連しないことを示す。

0033

[0035] 本明細書において、細胞株、試料、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原、VLP調製物その他が、ウイルスを「実質的に含まない」という用語は、この細胞、試料、タンパク質、ペプチド、原体、生物学的産物、ワクチン抗原、VLP調製物その他が、PCRまたはRT−PCRアッセイその他によって測定される検出可能レベルのウイルスを含んでいないことを意味する。

0034

[0036] 一部の実施形態において、本明細書に記載されている組成物、方法およびキットは、リボヌクレアーゼ(RNase)等、RNAを分解する酵素を利用する。RNaseは、RNAを分解するヌクレアーゼである。一部の実施形態において、RNaseは、さもなければ凝集によって分解に抵抗性となり得るキャプシド形成していないRNAを分解する徹底的な手段をもたらす。RNaseは、RNase A、RNase H、RNase III、RNase Iその他等、エンドリボヌクレアーゼ;またはRNase II、RNase R、エキソリボヌクレアーゼIその他等、エキソリボヌクレアーゼであってもよい。リボヌクレアーゼA(RNase A)は、よく研究に用いられる膵臓リボヌクレアーゼであり、一本鎖RNAを特異的に切断する。

0035

[0037]カオトロピック剤は、本技術分野において公知であり、その例として、ブタノールエタノールプロパノールフェノール塩化マグネシウム過塩素酸リチウム酢酸リチウム塩化グアニジウムドデシル硫酸ナトリウムチオ尿素および尿素が挙げられるがこれらに限定されない。カオトロピック剤は、水素結合を破壊することにより他の分子の疎水性作用を弱める。よって、カオトロピック剤は、核酸、タンパク質および脂質二重層等、分子の構造を破壊するおよび/またはこれを変性する。加えて、カオトロピック剤は、酵素を変性することにより、RNase酵素またはDNase酵素の活性を妨げることができ、VLP等、粒子を破壊または解体することもできる。

0036

[0038] 本明細書において、単数形「a」、「an」および「the」は、使用の前後関係がそれ以外を明らかに示さなければ、複数の項目(plural term)を含む。用語「または」は、包括的であると本明細書において理解される。語句「少なくとも1個」の意義は、語句「1個または複数」の意義に等しい。用語「を含み(comprise)」、「を含む(comprising)」、「を含有する(containing)」、「を有する(having)」その他は、「を含む(including)」その他を意味することができる。用語「約」の使用は、本願を通して、ある値が、その値の決定に用いられている方法の誤差標準偏差を含み、必要に応じて、表示の値よりも20%大きいまたは小さい値を含むと示すことを意図する。

0037

実施例1.Spodoptera frugiperda Sf9昆虫細胞株におけるラブドウイルスの検出
[0039] Spodoptera frugiperda Sf9昆虫細胞株の組換えバキュロウイルス感染に起因する産生後細胞(End of production cell)(EOPC)材料を、昆虫起源レトロウイルスエレメントランダムスクリーニングに付した。この目的のため、EOPC材料からウイルス粒子会合(particle-associated)RNAを調製し、ランダムプライマーRT−PCRクローニングに付した。得られたプラスミドDNAクローンDNA配列分析は、13,267ヌクレオチドからなり、6個のオープンリーディングフレームを含有する複製コンピテントラブドウイルスゲノムの存在と一致した配列コンティグ集合を可能にした。アミノ酸配列レベルの相同性検索から、植物起源のラブドウイルスに関する最高相同性スコアを伴う、多数のラブドウイルスのLタンパク質に対する弱いが一貫した相同性が明らかになった。

0038

[0040] Sf9細胞関連ラブドウイルスのためのqRT−PCRアッセイを開発し、使用可能な(working)Sf9細胞バンクの全細胞RNA、馴化培地およびバキュロウイルスライセートにおける一貫性あるシグナルが示された。1983年の凍結保存(freeze-down)に遡るATCC由来のSf9細胞株(ATCC CRL−1711)において同様のシグナルが検出され、ラブドウイルス混入物が、Sf9細胞株の元々の単離体に存在した可能性があることが明示された。

0039

[0041] EOPC材料への曝露後に異なる継代レベルで収集された2種のヒト細胞株試料の分析は、継代1の細胞における強いラブドウイルスシグナルを明示したが、継代に伴うEOPC材料の希釈と一致した、継代4〜6の間におけるバックグラウンドレベルへと急速に減少するシグナルを明示し、ヒト細胞において複製するウイルスの明らかな能力を明示しなかった。

0040

[0042]ノーウォークVLPおよびコンセンサスVLPワクチン製剤等、ノロウイルスVLPワクチンは、例えば、これらそれぞれ、全ての目的のため本明細書に参照によりその全体が組み込まれる米国特許第7,955,603号、同第8,431,116号、同第8,481,693号および同第8,841,120号;ならびに米国特許出願公開第2011−0182975号、同第2013−0273102号および同第2014−0004145号に記載されている。モノホスホリルリピドA(MPL)および水酸化アルミニウム(Al(OH)3)をアジュバントとする、筋肉内ノロウイルスGI.1/GII.4二価ウイルス様粒子(VLP)ワクチンが、少なくとも133名の対象(総計234名の対象が試験登録された;133名の対象にワクチンを与え、101名にプラセボを与えた)において検査された。

0041

実施例2.EOPC材料における粒子会合RNA配列のランダムプライマークローニングおよび分析
[0043] RNAを含有する可能性のあるウイルスまたはウイルス様粒子を検出するために、本発明者らは、ランダムRT−PCRクローニング目的のためEOPC材料から始めた。EOPC材料を清澄化してデブリを除き、続いてヌクレアーゼ消化に付して、遊離(粒子会合していない)核酸を排除した。ヌクレアーゼ消化後に、ウイルス粒子を採取するために、20%ショ糖クッションを通して100,000×gで材料を遠心分離した。このプロセスにおいて著しい量のインタクトなバキュロウイルスも採取されることが予想された。次に、高速ペレット形成された材料を核酸抽出に付し、続いて、いかなるウイルスRNAもインタクトに保ちつつ、バキュロウイルスおよびゲノムDNAを除去するために、RNase不含DNaseで処理した。

0042

[0044] その5’端にNot I制限部位タグ付けしたランダムN9プライマー(TATTGCGGCCGCTTCTTNNNNNNNNN)を、第1鎖逆転写酵素反応および第2鎖クレノウDNAポリメラーゼ反応の両方のために用いて、Not I配列タグ(TATTGCGGCCGCTTCTT)からなるPCRプライマーを用いて増幅され得る二本鎖DNAを得た。PCR増幅は、数本の別個バンドの増幅をもたらし、単離されたRNA集団における限定的な量の配列複雑性(sequence complexity)を示した。この手順を数回反復し、各回に異なるが区別できるバンドを採取した(ランダムプライマー使用(priming)のため予想しなかった訳ではない)。最初に配列決定された142個のクローンのうち、1個のクローンは、昆虫ウイルス逆転写酵素に対し相同性を示すことが判明した一方、32個のクローンは、ラブドウイルスのLタンパク質に対する相同性が低いことが示された。ラブドウイルス相同性は、アミノ酸配列レベルのみで観察され、L遺伝子の一部を通して24〜26%相同性の範囲内であった。残る配列は、リボソーム配列、バキュロウイルス配列またはヌクレオチドもしくはアミノ酸配列レベルにおいて公知の相同性がない配列を提示することが判明した。バキュロウイルスおよびリボソームクローンの単離は、ウイルスRNA単離プロセスにおいてヌクレアーゼ処理に抵抗したある特定のRNAおよびDNA配列の存在を示唆する。

0043

[0045]ラブドウイルス相同性を示す全クローンならびにGenbankデータベースに対して検出可能な相同性を示さなかったクローンのさらなる配列分析は、それぞれおよそ7,000および4,500ヌクレオチドの2種の大型の配列コンティグの構築をもたらし、それぞれが、ラブドウイルスLタンパク質に対し相同性を有するオープンリーディングフレームの一部を含有した。この2種の配列コンティグが、同じウイルスゲノム配列の一部であるかを決定するために、各コンティグ由来の1種のプライマーを用いて追加的なRT−PCRクローニングを行った。追加的なクローニングの結果、これら2種のコンティグにわたる配列を示すクローンが単離された。最後に、cDNA末端の迅速増幅(rapid amplification of cDNA ends)(RACE)技法の使用により、5’および3’端クローンの単離が可能となり、13,267ヌクレオチドの新規ラブドウイルスゲノム(配列番号1)の配列を完成した。

0044

[0046]ラブドウイルスゲノムの特徴マップ図1に示す。マップは、次の判断基準に基づく、Rhabdoviridae科のメンバーであるマイナス鎖RNAウイルスのセンス配向性(5’から3’)を示す:
1.このウイルスの大型のオープンリーディングフレームと、Genbankにおいて報告される多数のラブドウイルス配列のL(大型のポリメラーゼ)遺伝子との間のアミノ酸配列相同性;
2.残る遺伝子のゲノム構築およびサイズが、一般にラブドウイルスに典型的である;
3.GおよびLの間の短いアクセサリー遺伝子の存在が、多くの種類のラブドウイルスに共通する;
4.このウイルスおよびその他のウイルスのN、P、MおよびG遺伝子の間の相同性の非存在。後者は、メンバー間の相同性が多くはL遺伝子産物のみに見出されるウイルスの大型で非常に多様な群を代表するラブドウイルスの典型である(Ammarら、Annu Rev Entomol 54; 447(2009);Jacksonら、Annu. Rev. Phytopathol 43, 623(2005);Walkerら、Virus Res. 162(1-2), 110(2011)を参照)。

0045

[0047] N、P、MおよびGオープンリーディングフレームの割り当ては、標準ラブドウイルスゲノムレイアウトおよびコード配列のサイズに基づいた。これと一致したのは、G遺伝子が、期待された疎水性シグナルペプチドおよび膜貫通ドメインを有する1型膜糖タンパク質を明らかにコードするという事実であった。

0046

[0048] Sf9ラブドウイルスは、昆虫細胞株から単離されたが、他のラブドウイルスとの相同性の関係性によると、これは、媒介昆虫(insect vector)に保有された植物ウイルスとなり得ることを示す(下表1を参照)。植物ラブドウイルスは、媒介昆虫によって保有されることが多く、一般に、媒介昆虫において数世代にわたり複製する(Ammarら(2009))。実際に、Sf9細胞株(元のSf21細胞株の派生物)は、Spodoptera frugiperda(ツマジロクサヨトウ(fall armyworm))の卵巣組織に由来し、ウイルスが、媒介昆虫宿主において垂直伝播できることを示唆する(Vaughnら、In Vitro, 13(4); 213(1977))。

0047

[0049] 表1中の相同性データの検査は、Sf9ラブドウイルスが、L遺伝子アミノ酸配列相同性を介した検査では他のラブドウイルスと遠縁であることを示した。最高スコアによるヒットは、全ての植物ラブドウイルスであり、続いて哺乳類ラブドウイルスであった。重要なことに、Sf9ラブドウイルスにおける他の遺伝子のいずれも、RNAまたはアミノ酸配列レベルのいずれにおいてもその他のウイルスとはいかなる相同性も示さず、このレベルの相違は、植物ラブドウイルスに典型的である(Ammarら(2009);Jacksonら(2005);Walkerら(2011))。

0048

0049

0050

実施例3.Sf9細胞、馴化培地およびバキュロウイルスライセートにおけるSf9ラブドウイルスの定量
[0050] 様々な培養画分におけるSf9ラブドウイルスRNAを定量するために、Taqman qRT−PCRアッセイを開発した。ラブドウイルスRNAの定量に用いたqRT−PCRアッセイは、RTおよびPCR工程の両方においてフォワードおよびリバースプライマーを用いる単一工程Taqmanアッセイであった。したがって、アッセイは、プラスおよびマイナス鎖RNAの両方を検出することができる。このアッセイにおいて陽性対照としておよび定量目的で用いられるRNA標準は、in vitro転写により産生されるマイナス鎖RNAであった。この標準を用いると、本アッセイは、およそ4分子のRNAの検出限界を有した。

0051

[0051]プライマーおよびプローブ配列は、L遺伝子内のヌクレオチド7200〜7264位に及ぶ64ヌクレオチド標的配列に位置する。プライマーおよびプローブ配列を次に示す:
EOPC60 FWD: TCTGTATTATGGGTTTGATCAGCTAAG
EOPC60 REV: CTCGCTGCTGAGCGGTTT
EOPC60 Prb:6FAM−AGGATTGGAGAATTATAC

0052

[0052]プラスミドDNAの直鎖化に続く、T7RNAポリメラーゼを用いたEOPCクローン60 DNAのin vitro転写により、定量目的の検量線RNAを調製した。鋳型プラスミドDNAをその後、DNaseで消化し、検量線RNAを精製した。およそ5kbのRNAが予想されたが、グリオキサール(gyoxal)−アガロースゲル分析によって示されるとおり、等しい強度の2種のRNA、3.5kbおよび5kbが産生された。2種のRNAのうち小さい方は、標的配列を含有するのに十分な大きさであり、未成熟な転写終結の結果として産生された可能性がある。定量目的では、したがって、検量線RNAの平均分子量は、4.25kbまたは1.4×106ダルトンである。検量線RNAは、逆転写酵素工程なしのPCR反応においては、微量のシグナルしか生じないことが示され、これが鋳型DNAを含まないことを明示する。Taqmanアッセイにおける検量線としてのこのRNAの使用は、4分子の検量線RNAに等しい0.01fgのRNAの再現性のある検出限界を明示した。

0053

[0053] EOPC 60 Taqmanアッセイを用いて、膜濃縮および超遠心の前後でSf9細胞馴化培地におけるSf9ラブドウイルスを追跡した。これらのデータを表2に示し、培地におけるウイルスシグナルが、0.2ミクロン滅菌濾過膜によって保持されないが、100,000kD分子量カットオフ膜によって十分に保持されることを明示する。加えて、100,000×g遠心分離は、より少容量に再懸濁することができるペレットへとウイルスシグナルを濃縮する。これらのデータは、Sf9細胞馴化培地におけるインタクトなラブドウイルス粒子の存在と一致した。

0054

0055

[0054] 表3は、Sf9馴化培地、バキュロウイルスライセートおよび全細胞RNAの様々な供給源中のSf9ラブドウイルスの濃度に関する追加的なデータを示す。EOPC材料(Sf9細胞のバキュロウイルスライセート)中に著しい量のラブドウイルスRNAが検出された。EOPC材料の直接的サンプリングは、1mL当たりおよそ2×10e+08RNAコピーのラブドウイルスRNA濃度を明示した。ウイルス粒子が、高速遠心分離によってEOPC材料から採取された場合、およそ4.5×10e+07の力価が計算された。この4倍の矛盾は、EOPC材料の直接的サンプリングが、粒子会合および遊離RNAの両方を検出する一方、高速遠心分離が、粒子会合したRNAに特異的であるという見込みと一致した。ラブドウイルスRNAシグナルは、1mL当たり10e+07RNAコピー近くで、Sf9細胞馴化培地においても検出された。

0056

0057

[0055]生存Sf9細胞中のラブドウイルスRNA濃度に関して、対数期Sf9細胞は、細胞当たりおよそ1500RNAコピーを含有することが判明し、これは、低レベル感染を示唆し、細胞壊死性の観察の欠如と一致した。データは、ラブドウイルス感染が、その元々の単離体(Vaughnら、1977)由来のSf9細胞株に固有であり、1983年に寄託されたアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)Sf9クローン(ATCC CRL−1711)の分析に由来するルーチン培養の間の偽りの混入によるものではないという見解を支持する。この場合、ラブドウイルスRNAシグナルは、ATCC細胞株において細胞当たり3273 RNAコピーで検出され、Sf9の使用可能な細胞バンク(WCB)内で観察されるレベルと一致した。

0058

実施例4.Sf9ラブドウイルスは、ヒト細胞株A549およびHEK293において複製しない
[0056]ノーウォークおよびコンセンサスVLP産生の実施からのEOPC材料による細胞の処理の後に、ウイルス組み込みの証拠に関してHEK293およびA549細胞を検査した。3種のヒト細胞株における培養により、複製コンピテントレトロウイルスの存在に関してノーウォークVLP EOPC材料(Meridian Part#85190、ロット08110043)およびコンセンサスVLP EOPC材料(Meridian Part#85188、ロット09110048)を検査したところ、増幅可能な逆転写酵素活性の非存在のために陰性であることが判明した。接種後の異なる継代におけるこれらの細胞株(Raji、293およびA549細胞)の試料を、追加的な検査に付した。

0059

[0057] Sf9ラブドウイルスRNAシグナルの存在に関して、継代0、1、4および6由来のA549およびHEK293細胞の追加的な凍結細胞試料を検査した。この目的のため、細胞試料を解凍し、全細胞RNAを調製し、EOPC60 qRT−PCRアッセイに付した。これらのデータは、表4に示され、継代0で収集された細胞のRNAにおける強いラブドウイルスRNAシグナルを明示するが、このシグナルは、培養における細胞の継続した継代に伴い、バックグラウンドレベルへと劇的に下落する。これらのデータは、継代に伴うEOPCの希釈と一致し、Sf9単離ラブドウイルスの複製と一致しない。したがって、Sf9ラブドウイルスがヒト細胞において複製することができることの証拠はない。

0060

0061

実施例5.Sf9ラブドウイルスRNAの存在に関するノーウォーク原体の検査
[0058] 4.5mLの原体試料をヌクレアーゼで処理して、いかなる残渣遊離核酸も排除し、続いて100,000×gの遠心分離により粒子を採取することにより、粒子会合したラブドウイルスRNAシグナルの存在に関してノーウォークVLP原体(NWDS13)を検査した。次に、再懸濁した材料をカオトロピック剤により溶解し、RNAを精製した。ヌクレアーゼ処理および遠心分離に先立ち、この試料に、エンベロープを有するウイルス粒子回収内部対照としてマウス白血病ウイルス(MLV)の試料をスパイクした。その後のMLV qRT−PCR分析は、MLVスパイクの優れた回収を明示した。この調製物由来のRNAをSf9ラブドウイルスに関して検査し、元の原体試料中の1mL当たり240分子のラブドウイルスRNAに等しいシグナルが検出された。50μgの各VLPの推定的用量において、本発明者らは、ヒト用量当たり10分子未満のラブドウイルスRNAを計算した。特に、ウイルスクリアランス試験で、ノロウイルスVLP精製プロセスを用いエンベロープウイルスの感染力の15〜18 logの累積的な低下を既に明示しているため、試験した試料は、原体に存在する粒子会合したRNAを提示するものの、これが、インタクトなゲノムRNAを有する残渣インタクトラブドウイルス粒子の存在の何らかの指標結論付けることはできない。

0062

[0059] 2通りの異なるシナリオにおいてヌクレアーゼ消化を用いて、遊離核酸を排除した。EOPC材料の場合、ウイルス粒子会合したRNAをRT−PCRクローニングのために単離することができるように、ヌクレアーゼ消化を用いて、遊離核酸を排除した。これは、ラブドウイルスcDNAクローンの同定を導く実験である。このような実験において、清澄化されたEOPC材料を滴定してpH7.0とし、それぞれ最終濃度50および5ユニット/mLとなるようBenzonaseおよびTurbo DNaseを添加した。EOPC材料はSf900II昆虫細胞培地に基づくため、マグネシウムの添加は、ヌクレアーゼ活性の活性化に必要とされなかった。ヌクレアーゼ添加後に、材料を37℃で2時間インキュベートし、その後、最終濃度20mMとなるようEDTAを添加した。次に、ショ糖クッションを通した100,000×gの遠心分離によりウイルス粒子を採取し、Qiagen製のQIAampウイルスRNA単離キットを用いて粒子会合した核酸を単離した。このキットは、カオトロピック剤を用いて、いかなる持ち越されたヌクレアーゼ活性も不活性化し、インタクトな粒子会合したRNAの単離をもたらす。この材料をその後、Life Technologies製のTurbo DNAフリーキットで処理して、ウイルス粒子会合したRNAと同時単離され得るバキュロウイルスDNAを排除した。ヌクレアーゼ処理工程には内部対照を用いなかったが、得られたcDNAクローンにおいて相対的に僅かなリボソームまたはバキュロウイルス配列が同定されたという事実は、ヌクレアーゼ処理の有効性を示す。

0063

[0060]遊離核酸を排除するためのヌクレアーゼの使用の第2の事例は、粒子会合したラブドウイルス配列の存在に関してノーウォークVLP原体を試験することが関与した。この場合、最終濃度30mMとなるようTris−HCl、pH7.4を添加し、続いてNaOHで滴定することにより、VLP試料を調整してpH7.5とする。マウス白血病ウイルス(MLV)の内部対照試料の添加後に、最終濃度10mMとなるようMgCl2を添加し、それぞれ1mL当たり最終濃度25および5ユニットとなるようBenzonaseおよびTurbo DNaseを添加した。37摂氏度で1時間ヌクレアーゼ消化を進め、その後、試料を20mMEDTAに調整し、20%ショ糖クッション上にて100,000×gで遠心分離し、Life Technologies製のMagMAXウイルスRNA単離キットを用いてペレットからRNAを単離した。内部MLVスパイクは、粒子会合したRNAがヌクレアーゼ消化から保護され、最終RNA調製物に見出されたことを明示した。遊離核酸の消化の程度をモニターするための対照を用いなかったが、特に、微量の核酸しか原体に存在しないため、有利な反応条件の存在下での著しい量のヌクレアーゼの使用は、基本的にあらゆる遊離核酸を排除することが予想される。

0064

[0061]試験の結果は、植物または昆虫起源のラブドウイルスが、Sf9細胞株において同定され、このウイルス混入が、その元々の単離体由来のSf9細胞株に固有である可能性が高いことを示した。Sf9ラブドウイルスゲノムを完全に配列決定したところ、植物ラブドウイルスに最も近い相同性が明示され、あらゆるラブドウイルスに典型的なゲノム構築およびオープンリーディングフレームサイズ分布が示された。Sf9細胞馴化培地およびバキュロウイルスライセートにおいてウイルス粒子が検出され、細胞当たりのRNAコピーを単位としてラブドウイルスRNAを定量した。内在性感染によるSf9細胞における細胞壊死性の証拠はない。加えて、本試験は、ウイルスが、ヒト細胞において複製する能力を欠くことを示した。本明細書に開示されている原体製造プロセスは、エンベロープを有するウイルスを有効に除去および/または不活性化することが示された。例えば、エンベロープを有するウイルスは洗剤処理によって破壊することができ、バキュロウイルスは、酸処理によって不活性化および除去し、続いて遠心分離して、不活性かつ凝集したバキュロウイルスを除去することができる。例えば、プロセスにおける工程は、モデルとなるエンベロープを有するウイルス、A−MuLV(GI.1 DS製造における累積的>18.22 log10低下およびGII.4 DS製造における>15.73 log10)およびAcNPV(GI.1 DS製造における累積的>15.30 log10低下およびGII.4 DS製造における>11.54 log10)を除去することが示された。

0065

実施例6.RNaseA抵抗性Sf9ラブドウイルスRNAシグナルに関する原体の分析
[0062] 実施例5は、Sf9昆虫細胞に関連する新規ラブドウイルスの特徴評価について記載する。一実験は、ノーウォークVLP原体の1種の研究用ロットにおけるBenzonase抵抗性の、粒子会合したSf9ラブドウイルスRNAシグナルの証拠を報告し、ノロウイルスVLP上に凝集した、あるいはその内にパッケージングされた小型の残渣ラブドウイルスRNA断片の存在の可能性を示す。加えて、残渣インタクトラブドウイルス粒子混入の可能性は、実施例5に記載されている試験によって除外されなかった。先立つRNase A処理ありおよびなしで、Sf9ラブドウイルスRNAシグナルに関して精製ノーウォークVLP原体材料およびコンセンサスVLP原体材料それぞれの2種のロットを検査した。得られたデータは、原体において観察されたSf9ラブドウイルスRNAシグナルが、RNase A分解に対し感受性であり、VLPまたは残渣Sf9ラブドウイルス粒子においてキャプシド形成されるRNAを提示しなかったことを明示した。適切な工程を採用して、RT−PCR阻害剤を制御し、実際の粒子会合したラブドウイルスRNAが、RNase A分解に感受性ではないことを明示した。

0066

[0063] 本試験において、総計4ロットの原体材料を調査し、さもなければ凝集により分解抵抗性となり得るキャプシド形成されないラブドウイルスRNAシグナルを分解する、より徹底的な手段としてリボヌクレアーゼA(RNaseA)を用いることにより、ノーウォークおよびコンセンサスVLP原体におけるヌクレアーゼ抵抗性Sf9ラブドウイルスRNAシグナルの問題にさらに取り組むための実験を行った。RNase Aありおよびなしでの原体の処理後に、実験設計は、カオトロピック剤(RNase A活性を破壊するため)の存在下におけるRNA精製工程と、高感度qRT−PCRアッセイによるあらゆる残るSf9ラブドウイルスRNAシグナルの定量化を含んだものであった。

0067

[0064]ノーウォーク原体の分析。pH6.5、37℃で1時間、最終濃度10μg/mL(4×1014RNaseA分子/mL)となるRNase Aの添加ありまたはなしで、ノーウォーク原体材料をインキュベートした。インキュベーション後に、RNase活性を直ちに非活性化し、キャプシド形成したRNAを有し得るいかなるVLPまたはウイルス粒子も破壊するための強いカオトロピック剤を用いたMagMaxウイルス単離プロトコールを用いて、試料をRNA精製に付した。精製したRNA試料をspeedvac乾燥によりさらに濃縮し、実施例3に記載されているEOPC−60 qRTPCRアッセイを用いてqRT−PCR分析に付した。840μLの原体材料をRNase Aで処理してまたは処理せず、続いてRNase活性の変性条件下でRNA抽出に付した。最終精製RNA試料を、元の原体試料から84倍に濃縮した。3×1μLの各精製RNA試料を3重のqRT−PCR反応において検査した。

0068

[0065] 下表5は、2種のノーウォークVLP原体ロットのうち1種のみ(NWDS16)が、Sf9ラブドウイルスRNAシグナルを提示し、このシグナルが、元の原体材料における1mL当たり51RNAコピーに等しかった本実験の結果を示す。ノーウォーク原体ロットNWDS09は、シグナルを生じることができなかった(元の原体における1mL当たり<12 RNAコピー)。ロットNWDS16材料は陽性であったが、RNaseAで処理した同じ材料は、シグナルを提示しなかった。この観察は、非粒子キャプシド形成(非保護)状態におけるSf9ラブドウイルスRNAシグナルの存在と一致した。

0069

0070

[0066] 表6は、RT−PCR阻害剤の対照として、qRT−PCR分析の直前に、規定されたラブドウイルスRNAスパイクを添加した後の同じ試料のCt値を示す。全4種の試料の同様のCt値は、混入RT−PCR阻害剤の非存在の証拠をもたらした。

0071

0072

[0067]コンセンサス原体材料の分析。R&DロットDCN12またはDCN15由来のコンセンサス原体材料を、pH6.5、37℃で1時間、最終濃度10μg/mL(4×1014RNaseA分子/mL)となるRNase Aの添加ありまたはなしでインキュベートした。インキュベーション後に、RNase活性を直ちに非活性化し、キャプシド形成したRNAを有し得るいかなるVLPまたはウイルス粒子も破壊するために強いカオトロピック剤を用いるMagMaxウイルス単離プロトコールを用いて、試料をRNA精製に付した。精製されたRNA試料をspeedvac乾燥によってさらに濃縮し、実施例3に記載されているEOPC−60 qRT−PCRアッセイを用いてqRT−PCR分析に付した。1000μLの原体材料をRNase Aで処理してまたは処理せず、続いてRNase活性の変性条件下でRNA抽出に付した。最終精製RNA試料を、元の原体試料から100倍に濃縮した。3回複製qRT−PCR反応において、3×1μLの各精製RNA試料を検査した。

0073

[0068] 下表7は、本実験の結果を示す。2種のコンセンサスVLP原体ロットのうち1種のみ(DCN12)が、Sf9ラブドウイルスRNAシグナルを提示し、このシグナルは、元の原体材料における1mL当たり128RNAコピーに等しかった。コンセンサス原体ロットDCN15は、シグナルを生じることができなかった(元の原体における1mL当たり<10 RNAコピー)。ロットDCN12材料は陽性であったが、RNaseAで処理した同じ材料は、シグナルを提示しなかった。この観察は、非粒子キャプシド形成(非保護)状態におけるSf9ラブドウイルスRNAシグナルの存在と一致した。

0074

0075

[0069] 表8は、RT−PCR阻害剤の対照として、qRT−PCR分析の直前に、規定されたラブドウイルスRNAスパイクを添加した後の同じ試料のCt値を示す。全4種の試料の同様のCt値は、混入RT−PCR阻害剤の非存在の証拠をもたらした。

0076

0077

[0070]RNaseA処理が、ラブドウイルス粒子内部のRNAを分解しないことを明示するための対照実験。上述のデータは、精製ノーウォークおよびコンセンサスVLP原体材料におけるキャプシド形成したラブドウイルスRNAの非存在の証拠をもたらしているが、追加的な対照実験を行って、RNase A処理が、ウイルス粒子においてキャプシド形成されることが公知のRNAシグナルの低下または排除をもたらさないことを明示した。これらのデータは、表6および8に示すデータを補強した。この対照実験において、著しい量のSf9ラブドウイルスを含有することが公知の産生後(EOP)材料を、ノーウォークおよびコンセンサス原体のため上述のとおり処理し、シグナルをRT−PCRによって定量した。280μLのEOP材料をRNase Aで処理してまたは処理せず、続いてRNase活性の変性条件下でRNA抽出に付した。最終精製RNA試料を、元のEOP試料から5.6倍に濃縮した。3回複製qRT−PCR反応において、3×1μLの各精製RNA試料を検査した。データを下表9に示す。RNA抽出工程に先立つRNase A処理は、EOP材料において検出されるラブドウイルスRNAシグナルに影響しなかった。EOP材料におけるラブドウイルスRNAに対するRNase Aの理論混合比は、>10,000:1であった。これらのデータは、カオトロピック剤を用いて、著しい濃度のRNase Aを不活性化することに成功し、分解されない、粒子会合RNAの精製の成功をもたらすことを明示する。

0078

0079

実施例7.Sf9ラブドウイルスの透過型電子顕微鏡(TEM)
[0071] Sf9細胞馴化培地およびバキュロウイルスライセートにおいて同定されたSf9ラブドウイルスを、接線流濾過およびショ糖勾配遠心分離により部分的に精製し、透過型電子顕微鏡(TEM)により撮像した。多数の明らかにエンベロープを有する球状から楕円形(oblong)の粒子が観察された。270個の粒子の測定は、65.6×49.6nmの平均寸法を明らかにした。ウイルス粒子のこれらの観察は、Sf9培養物およびライセートにおける明らかに機能的な粒子会合したラブドウイルスゲノムRNAの存在を示す以前の分子生物学データと一致した。

0080

[0072] 本試験において、Sf9ラブドウイルスの透過型電子顕微鏡像を作製するように設計された実験を行った。「空ベクター」バキュロウイルスに感染させたSf9細胞の10リットルウェーブバッグ(wave bag)培養を確立し、その後に収集した。清澄化したライセートを、接線流濾過によりおよそ112mLに濃縮した。2×6mLの濃縮物をそれぞれ2個の20〜60%ショ糖密度工程勾配上に重層し、100,000×gで90分間10℃にて遠心分離した。ショ糖工程溶液は、150mM NaClを含有する10mMクエン酸緩衝液、pH6.0(クエン酸緩衝食塩水、CBS)を用いて調製した。ショ糖勾配を1.5mL画分へと分画し、実施例3に記載されているSf9ラブドウイルス特異的qRT−PCRアッセイ(EOPC60アッセイ)を用いて画分を分析した。最も強いSf9ラブドウイルスシグナルを含有するピーク画分(各勾配から画分#13)をプールした。プールした画分を、最終容量32mLとなるようCBSで調整し、続いてCBSにおける4mLの30%ショ糖クッション上に重層し、100,000×gで1時間10℃にて遠心分離した。遠心分離後に、上清デカントし、ペレット形成した材料を300μLのCBSに再懸濁した。この最終材料を、酢酸ウラニルによるネガティブ染色後にTEM分析に付した。球状から楕円形の、サイズおよび形状の両方が若干不規則な多数のエンベロープを有するウイルス粒子の存在を明示する複数の顕微鏡像を撮った。大部分の顕微鏡像は、精製ウイルス粒子調製物に混入するデブリまたは他の材料が殆どないクリーンな画像を示した。270個の粒子の寸法の分析は、65.61±14.52×49.56±11.58nmの平均サイズを明示した。代表的TEM画像を図2に示す。

0081

実施例8.昆虫細胞感染力試験
[0073]ウイルスに以前に感染したことがない追加的な選択昆虫細胞株において複製するラブドウイルスの能力を明示するための試験を行った。

0082

[0074] 本明細書に開示されているSf9ラブドウイルスは、組換えバキュロウイルスに感染した後のSf9細胞ライセートにおいて最初に発見されたが、このウイルスは、バキュロウイルス感染に独立的なSf9細胞馴化培地においても検出および定量された。健康なSf9細胞内のラブドウイルスRNAレベルも同様に定量した。検査した全Sf9細胞においてウイルスが同定され、細胞壊死性効果を誘導しないほど十分に低いレベルで複製すると思われた。

0083

[0075] Sf9ラブドウイルスの感染力アッセイを開発するため、実験を開始して、追加的な昆虫細胞株においてSf9ラブドウイルスが繁殖できるかを決定した。表10は、米国農務省(U.S. Department of Agriculture)(USDA)の農業研究局(Agricultural Research Service)(ARS)から入手した数種類の昆虫細胞株のリストを示す。

0084

0085

[0076] 表10に示す細胞株のそれぞれを、10mlのEX−Cell420培地+10%ウシ胎仔血清の入ったT25組織培養フラスコに配置し、培養培地のうち5mLを除去し、Sf9細胞の持ち越しがないことを確実にするために遠心分離および0.2ミクロン膜による濾過に付したSf9細胞由来の5mlの馴化培地とこれを交換することにより、Sf9ラブドウイルスに曝露した。Sf9馴化培地を細胞培養に24時間残し、その後、培地を除去し、EX−Cell420培地+10%FBSにおいて昆虫細胞株をさらに培養した。コンフルエンスに達したら、各培養物の細胞のおよそ10%を採取し、凍結細胞ペレット(p0)として貯蔵した一方、継続した成長および継代のためにそれぞれの新たな継代培養を確立した。このようにして、各細胞株の2種の追加的な凍結細胞ペレットを継代数p1およびp2のために採取した。

0086

[0077] Sf9ラブドウイルスに曝露された各細胞株由来の凍結細胞試料の採取後に、各細胞試料ならびにSf9ラブドウイルスに曝露されていない各細胞株由来の対照細胞から全細胞RNAを精製した。上述のSf9ラブドウイルスqRT−PCRアッセイにおいて、いずれかのラブドウイルスRNAシグナルの検出および定量に関して各RNA試料を検査した。「全細胞RNA1μg当たりのfgラブドウイルスRNA」を単位としてデータを表し、これを図3に示す。

0087

[0078]図3におけるデータの検査は、いくつかの有意な観察をもたらす。第一に、細胞株HsAM1は、Sf9細胞馴化培地への曝露の前後にSf9ラブドウイルスRNAシグナルを提示し、この細胞株が、Sf9ラブドウイルスまたはそのごく近縁の種に既に感染されていることを示す。Sf9細胞馴化培地へのさらなる曝露は、感染力シグナルのさらなる増加をもたらさなかった。第二に、細胞株HvAM1、HzAM1、HzFB33およびAgAM1は、Sf9ラブドウイルスを有意に複製する能力を提示しなかった。予想されるとおり、馴化培地への即時曝露後に、低レベルRNAシグナルが観察されたが、このようなシグナルは、その後の継代におけるウイルス複製の場合に予想されるとおり増加しなかった。最後に、対照的に3種のS.exigua細胞株は、Sf9ラブドウイルスの著しい複製を示し、RNAシグナルは各継代に伴い少なくとも2桁増加する。継代2におけるこれらの細胞におけるSf9ラブドウイルスRNAシグナルレベルは、Sf9細胞において構成的に観察されるレベルに等しい。

0088

[0079] よって、試験の結果は、Sf9 Spodoptera frugiperda細胞株において元々同定されたSf9ラブドウイルス(または近縁種)が、Heliothis sublexa卵巣に由来する異なるlepidopteran種由来の第2の昆虫細胞株に構成的に存在することを示した。加えて、Sf9ラブドウイルスは、元のS.exiguaに由来する3種のSpodoptera exigua細胞株において容易に複製することが観察された。

0089

[0080] 上述の説明的な実施例に表記されているとおり、本発明における多数の修正および変種は、当業者であれば想到すると予想される。結果的に、添付の特許請求の範囲に現れる限定のみを本発明に課すべきである。本明細書に引用されているあらゆる刊行物は、全ての目的のため本明細書に参照によりそれらの全体が組み込まれる。

実施例

0090

参考文献
1. Ammar el D, Tsai CW, WhitfieldAE, Redinbaugh MG, Hogenhout SA. Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts. Annu Rev Entomol, 54, 447-468 (2009).
2. Jackson AO, Dietzgen RG, Goodin MM, Bragg JN, Deng M. Biology of plant rhabdoviruses. Annu Rev Phytopathol, 43, 623-660 (2005).
3. Walker PJ, Dietzgen RG, Joubert DA, Blasdell KR. Rhabdovirus accessory genes. Virus Res, 162(1-2), 110-125).
4. Vaughn JL, Goodwin RH, Tompkins GJ, McCawley P. The establishment of two cell lines from the insect Spodoptera frugiperda (Lepidoptera; Noctuidae). In Vitro, 13(4), 213-217 (1977).

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