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図面 (13)

課題

PV及びHPV関連疾患に対する新規ワクチンの提供。

解決手段

抗CD40抗体、又は抗CD40抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の各々に由来する少なくとも3つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む融合タンパク質

概要

背景

ヒトパピローマウイルス(HPV)は、最も一般的な性感染性病原体のうちの1つである。現行のHPV予防ワクチンは、HPV感染の予防において、著明臨床的効性を示しているが、感染した患者及びHPV関連がん処置においては有効性を呈示しない。HPV感染は、事実上全ての子宮頸がん、並びに多くの肛門がん、がん、外陰がん、陰茎がん、及び中咽頭喉頭)がんを引き起こす。したがって、HPVに感染し、HPV関連がんを有する患者に安全で有効なワクチンの開発に対する需要は大きい。HPV感染はまた、HIV関連悪性腫瘍及びHIV関連がんも引き起こす。

現行のHPVワクチンは、HPV6、HPV11、HPV16、及びHPV18のカプシド(L1)タンパク質から作製される組換えウイルス様粒子である。これらのワクチンは、強い抗体応答を誘発することが可能であり、したがって、HPV感染を予防することが可能である。ウイルスの複製を抑制し、HPV関連がんを根絶するには、ワクチンは、強いT細胞応答、特に、ウイルス感染細胞死滅させ得る細胞傷害性CD8+リンパ球(CTL,cytotoxic lymphocyte)に続いて、HPVの複製の阻害のほか、HPV関連腫瘍細胞の阻害も惹起することが必要である。

複数種類のワクチンモデルペプチド、タンパク質、及びDNAベースのワクチン、並びに弱毒化ベクターにより保有されるワクチンを含む)が調べられているが、これらのワクチンは、特に、免疫不全患者に対する有効性又は安全性において欠点を有する。このギャップのために、HPV関連がんに対する、安全で強力な免疫療法用ワクチンの開発が必要となる。

多くの証拠から、子宮頸がんの事実上全ての症例は、HPV型サブセット、とりわけ、HPV16型(HPV16,HPV type 16)及びHPV18型(HPV18,HPV type 18)による持続性の感染に帰せられるという結論が導かれている。これらのHPV型はまた、外陰がん、膣がん、肛門がん、陰茎がん、及び中咽頭がんを含む、他の粘膜がんの一部の原因ともなる。HPV16は、子宮頸部扁平上皮癌における主な種類であり、HPV18は、これに次いで一般的な種類であり、発症率は、中米における12.6%〜南アジアにおける25.7%の範囲にある。加えて、HPV18は、発症が急速であり、潜在的により侵襲性子宮頚癌にも関与している。しかし、亜臨床感染は、HPV感染の最も一般的な症状である。異なる研究が、性的に活動的成人において、15%〜36%の間の亜臨床感染を報告している。

概要

HPV及びHPV関連疾患に対する新規のワクチンの提供。抗CD40抗体、又は抗CD40抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の各々に由来する少なくとも3つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む融合タンパク質。なし

目的

CDRを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

抗CD40抗体、又は抗CD40抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の各々に由来する少なくとも3つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む融合タンパク質であって、前記E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原であり、前記少なくとも1つのHPVE6又はE7抗原が、配列番号1〜4の少なくとも1つのアミノ酸配列を含むペプチドを含む、前記融合タンパク質。

請求項2

抗CD40抗体又はその断片がヒト化されている、請求項1に記載の融合タンパク質。

請求項3

少なくとも1つのペプチドリンカーが、1又は2以上のグリコシル化部位を含む、請求項1又は2に記載の融合タンパク質。

請求項4

少なくとも1つのペプチドリンカーが、配列番号5のアミノ酸配列からなるFlexv1及び/又は配列番号6のアミノ酸配列からなるf1である、請求項1〜3のいずれかに記載の融合タンパク質。

請求項5

少なくとも1つのHPVE6又はE7抗原が、E6及びE7である、請求項1〜4のいずれかに記載の融合タンパク質。

請求項6

配列番号1又は3の1つのHPVE6抗原、及び、配列番号2又は4の1つのHPVE7抗原を含む、請求項1〜5のいずれかに記載の融合タンパク質。

請求項7

配列番号19のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。

請求項8

配列番号21のアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の融合タンパク質。

請求項9

それぞれ配列番号11〜13のCDR1、CDR2及びCDR3を含む軽鎖可変領域及びそれぞれ配列番号14〜16のCDR1、CDR2及びCDR3を含む重鎖可変領域を含む、請求項1〜8のいずれか一つに記載の融合タンパク質。

請求項10

請求項1〜9のいずれかに記載の融合タンパク質を作製する方法であって、前記融合タンパク質を発現する組換え宿主細胞から、前記融合タンパク質を単離するステップを含む、前記方法。

請求項11

請求項1〜10のいずれかに記載の融合タンパク質を含む、患者において少なくとも1つのHPVエピトープに対する免疫応答誘導するための組成物

請求項12

組成物が、アジュバントをさらに含む、請求項11に記載の組成物。

請求項13

患者が、別個のHPVワクチン投与された患者である、請求項11又は12に記載の組成物。

請求項14

別個のHPVワクチンが、Gardasil(商標)又はCervarix(商標)である、請求項13に記載の組成物。

請求項15

抗CD40抗体又はその断片の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の各々に由来する少なくとも3つずつの相補性決定領域と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6抗原及び少なくとも1つのHPVE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体を含む、HPV関連疾患患者処置するための組成物であって、前記重鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号14〜16を含んでおり、前記軽鎖可変領域のCDR1、CDR2及びCDR3がそれぞれ配列番号11〜13を含んでおり、前記抗原が配列番号1又は3、及び、2又は4を含む、前記組成物。

技術分野

0001

本出願は、2014年1月13日に出願された米国仮特許出願第61/926,821号明細書、及び2014年5月23日に出願された米国仮特許出願第62/002,718号明細書に対する優先権の利益を主張するものであり、それらはどちらも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

0002

本発明は、米国国立衛生研究所及び米国国立アレルギー感染症研究所により授与される助成金第U19AI057234号の下における政府援助によりなされた。政府は本発明において、一定の権利を有する。

0003

本発明は一般に、医療の分野に関する。より詳細には、本発明は、ヒトパピローマウイルス(HPV,human papilloma Virus)及び複数種類がんを含むHPV関連疾患に対する新たな新規ワクチンに関わる。

背景技術

0004

ヒトパピローマウイルス(HPV)は、最も一般的な性感染性病原体のうちの1つである。現行のHPV予防ワクチンは、HPV感染の予防において、著明臨床的効性を示しているが、感染した患者及びHPV関連がんの処置においては有効性を呈示しない。HPV感染は、事実上全ての子宮頸がん、並びに多くの肛門がん、がん、外陰がん、陰茎がん、及び中咽頭喉頭)がんを引き起こす。したがって、HPVに感染し、HPV関連がんを有する患者に安全で有効なワクチンの開発に対する需要は大きい。HPV感染はまた、HIV関連悪性腫瘍及びHIV関連がんも引き起こす。

0005

現行のHPVワクチンは、HPV6、HPV11、HPV16、及びHPV18のカプシド(L1)タンパク質から作製される組換えウイルス様粒子である。これらのワクチンは、強い抗体応答を誘発することが可能であり、したがって、HPV感染を予防することが可能である。ウイルスの複製を抑制し、HPV関連がんを根絶するには、ワクチンは、強いT細胞応答、特に、ウイルス感染細胞死滅させ得る細胞傷害性CD8+リンパ球(CTL,cytotoxic lymphocyte)に続いて、HPVの複製の阻害のほか、HPV関連腫瘍細胞の阻害も惹起することが必要である。

0006

複数種類のワクチンモデルペプチド、タンパク質、及びDNAベースのワクチン、並びに弱毒化ベクターにより保有されるワクチンを含む)が調べられているが、これらのワクチンは、特に、免疫不全患者に対する有効性又は安全性において欠点を有する。このギャップのために、HPV関連がんに対する、安全で強力な免疫療法用ワクチンの開発が必要となる。

0007

多くの証拠から、子宮頸がんの事実上全ての症例は、HPV型サブセット、とりわけ、HPV16型(HPV16,HPV type 16)及びHPV18型(HPV18,HPV type 18)による持続性の感染に帰せられるという結論が導かれている。これらのHPV型はまた、外陰がん、膣がん、肛門がん、陰茎がん、及び中咽頭がんを含む、他の粘膜がんの一部の原因ともなる。HPV16は、子宮頸部扁平上皮癌における主な種類であり、HPV18は、これに次いで一般的な種類であり、発症率は、中米における12.6%〜南アジアにおける25.7%の範囲にある。加えて、HPV18は、発症が急速であり、潜在的により侵襲性子宮頚癌にも関与している。しかし、亜臨床感染は、HPV感染の最も一般的な症状である。異なる研究が、性的に活動的成人において、15%〜36%の間の亜臨床感染を報告している。

課題を解決するための手段

0008

抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも3つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む融合タンパク質であって、E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である融合タンパク質が開示される。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、抗CD40抗体に由来する可変領域を少なくとも含む。可変領域は、軽鎖に由来する場合もあり、重鎖に由来する場合もある。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、抗CD40抗体の軽鎖に由来する可変領域を少なくとも含み、抗CD40抗体の重鎖に由来する可変領域を少なくとも含む。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、抗CD40抗体に由来する6つのCDRを含む。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、ヒト化されている。一部の実施形態では、1又は2以上のペプチドリンカーは、フレキシブルリンカーである。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、1又は2以上のグリコシル化部位を含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、Flexv1(配列番号5)及び/又はf1(配列番号6)である。一部の実施形態では、HPV抗原は、E6及びE7である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号19の配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号21の配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。

0009

また、少なくとも配列番号11〜13又は配列番号14〜16のアミノ酸配列と、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む融合タンパク質も開示される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号11〜13及び配列番号14〜16を含む。一部の実施形態では、E6又はE7抗原は、HPV16型又はHPV18型抗原である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ペプチドリンカーをさらに含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、フレキシブルリンカーである。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、1又は2以上のグリコシル化部位を含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、Flexv1(配列番号5)及び/又はf1(配列番号6)である。

0010

また、上記の融合タンパク質のうちのいずれかを含む医薬組成物も開示される。

0011

また、上記の融合タンパク質のうちのいずれかを作製する方法であって、融合タンパク質を発現する組換え宿主細胞から融合タンパク質を単離するステップを含む方法も開示される。

0012

また、抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも3つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体を含む組成物であって、E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である組成物も開示される。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、抗CD40抗体に由来する可変領域を少なくとも含む。可変領域は、軽鎖に由来する場合もあり、重鎖に由来する場合もある。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、抗CD40抗体の軽鎖に由来する可変領域を少なくとも含み、抗CD40抗体の重鎖に由来する可変領域を少なくとも含む。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、抗CD40抗体に由来する6つのCDRを含む。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、ヒト化されている。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、フレキシブルリンカーである。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、1又は2以上のグリコシル化部位を含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、Flexv1(配列番号5)及びf1(配列番号6)から選択される。一部の実施形態では、HPV抗原は、E6及びE7である。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号19の配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号21の配列を含む。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。

0013

一部の実施形態では、HPVE6抗原及びHPV E7抗原は、配列番号1〜4から選択される。他の実施形態では、HPV E6抗原及びHPV E7抗原は、配列番号1〜4の任意の組合せと、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%若しくは100%、又はこれらの中で導出される任意の範囲にわたり同一である。他の実施形態では、HPV E6抗原及びHPV E7抗原は、配列番号1〜4と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%若しくは100%、又はこれらの中で導出される任意の範囲にわたり同一である。さらに他の実施形態では、HPV E6抗原は、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115若しくは120、又はこれらの中で導出される任意の範囲の、配列番号1及び/又は3の連続アミノ酸のサブセットであり、HPV E7抗原は、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115若しくは120、又はこれらの中で導出される任意の範囲の、配列番号2及び/又は4の連続アミノ酸のサブセットである。

0014

また、抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも3つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原であるベクターも開示される。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、抗CD40抗体の軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、抗CD40抗体の重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、少なくとも1つのHPV16型E6抗原、少なくとも1つのHPV16型E7抗原、又は少なくとも1つのHPV18型E6抗原、及び少なくとも1つのHPV18型E7抗原をコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号19を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、配列番号21を含むポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、少なくとも1つのHPV16型E6抗原、少なくとも1つのHPV16型E7抗原、少なくとも1つのHPV18型E6抗原、及び少なくとも1つのHPV18型E7抗原をコードする。

0015

また、ヒトパピローマウイルス(HPV)感染を予防するための方法であって、患者に、抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも6つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体を含む組成物を投与するステップを含み、E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である方法も開示される。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、抗CD40抗体の軽鎖可変領域及び抗CD40抗体の重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、ヒト化されている。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、樹状細胞ターゲティング複合体は、配列番号19を含む。一部の実施形態では、樹状細胞ターゲティング複合体は、配列番号21を含む。一部の実施形態では、組成物は、アジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、患者に、別個のHPVワクチンを投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、別個のHPVワクチンは、Gardasil(商標)又はCervarix(商標)である。

0016

また、ヒトパピローマウイルス(HPV)感染を処置するための方法であって、患者に、抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも6つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体を含む組成物を投与するステップを含み、E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である方法も開示される。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、抗CD40抗体の軽鎖可変領域及び抗CD40抗体の重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、ヒト化されている。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、樹状細胞ターゲティング複合体は、配列番号19を含む。一部の実施形態では、樹状細胞ターゲティング複合体は、配列番号21を含む。一部の実施形態では、方法は、患者に、別個のHPV処置を施すステップをさらに含む。

0017

また、少なくとも1つのHPVエピトープに対する免疫応答誘導するための方法であって、患者に、抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも6つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体を含む組成物を投与するステップを含み、E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である方法も開示される。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、抗CD40抗体の軽鎖可変領域及び抗CD40抗体の重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、ヒト化されている。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、樹状細胞ターゲティング複合体は、配列番号19を含む。一部の実施形態では、樹状細胞ターゲティング複合体は、配列番号21を含む。一部の実施形態では、組成物は、アジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、患者に、別個のHPVワクチンを投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、別個のHPVワクチンは、Gardasil(商標)又はCervarix(商標)である。

0018

また、少なくとも1つのHPVエピトープに対する免疫応答を強化するための方法であって、患者に、抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも6つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体を含む組成物を投与するステップを含み、E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である方法も開示される。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、抗CD40抗体の軽鎖可変領域及び抗CD40抗体の重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、ヒト化されている。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、樹状細胞ターゲティング複合体は、配列番号19を含む。一部の実施形態では、樹状細胞ターゲティング複合体は、配列番号21を含む。一部の実施形態では、免疫応答の強化を、メモリー細胞の強化又は増大又は増強へと方向づける。一部の実施形態では、方法は、患者に、別個のHPV処置を施すステップをさらに含む。

0019

また、ヒトパピローマウイルス(HPV)関連疾患を予防するための方法であって、患者に、抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも6つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体を含む組成物を投与するステップを含み、E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である方法も開示される。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、抗CD40抗体の軽鎖可変領域及び抗CD40抗体の重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、ヒト化されている。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、樹状細胞ターゲティング複合体は、配列番号19を含む。一部の実施形態では、樹状細胞ターゲティング複合体は、配列番号21を含む。一部の実施形態では、組成物は、アジュバントをさらに含む。一部の実施形態では、HPV関連疾患は、異形成良性新生物、前悪性新生物、又はがんである。一部の実施形態では、HPV関連疾患は、がんである。一部の実施形態では、がんは、子宮頸部、外陰部、膣、陰茎、肛門、中咽頭、喉頭又はのがんである。一部の実施形態では、方法は、患者に、別個のHPVワクチンを投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、別個のHPVワクチンは、Gardasil(商標)又はCervarix(商標)である。

0020

また、ヒトパピローマウイルス(HPV)関連疾患を処置するための方法であって、患者に、抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも6つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体を含む組成物を投与するステップを含み、E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である方法も開示される。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、抗CD40抗体の軽鎖可変領域及び抗CD40抗体の重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、ヒト化されている。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、樹状細胞ターゲティング複合体は、配列番号19を含む。一部の実施形態では、樹状細胞ターゲティング複合体は、配列番号21を含む。一部の実施形態では、HPV関連疾患は、異形成、良性新生物、前悪性新生物、又はがんである。一部の実施形態では、HPV関連疾患は、がんである。一部の実施形態では、がんは、子宮頸部、外陰部、膣、陰茎、肛門、中咽頭、喉頭又は肺のがんである。なおさらなる実施形態では、がんは、頭頸部がんである。一部の実施形態では、方法は、患者に、別個の処置を施すステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、患者に、がん処置を施すステップをさらに含む。

0021

また、患者におけるHPV感染細胞を阻害する方法であって、患者に、上記の融合タンパク質又はベクターのうちのいずれかを含む、有効量の組成物を投与するステップを含む方法も開示される。一部の実施形態では、HPV感染細胞は、腫瘍内にある。

0022

また、HPV感染又はHPV感染細胞を含む腫瘍を患う患者における腫瘍のサイズ又は重量を低減する方法であって、患者に、上記の融合タンパク質又はベクターのうちのいずれかを含む、有効量の組成物を投与するステップを含む方法も開示される。処置中又は処置後における、腫瘍のサイズ又は重量の低減パーセント又は腫瘍の退縮パーセントは、少なくとも10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%若しくは100%、又はこれらの中で導出される任意の範囲であり得る。腫瘍のサイズ又は重量の低減パーセント又は腫瘍の退縮パーセントは、不快感和らげ、患者の生活の質を改善するか、又は臨床的に好適な転帰をもたらすか若しくはこれと関連するようなものであり得る。

0023

HPV関連疾患を患う患者又は対象の生存延長する方法であって、患者に、抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも6つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体を含む組成物を投与するステップを含み、E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である方法が開示される。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、抗CD40抗体の軽鎖可変領域及び抗CD40抗体の重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、抗CD40抗体又はその断片は、ヒト化されている。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原は、HPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原は、HPV18型抗原である。一部の実施形態では、樹状細胞ターゲティング複合体は、配列番号19を含む。一部の実施形態では、樹状細胞ターゲティング複合体は、配列番号21を含む。一部の実施形態では、HPV関連疾患は、異形成、良性新生物、前悪性新生物、又はがんである。一部の実施形態では、HPV関連疾患は、がんである。一部の実施形態では、がんは、子宮頸部、外陰部、膣、陰茎、肛門、中咽頭、喉頭又は肺のがんである。なおさらなる実施形態では、がんは、頭頸部がんである。一部の実施形態では、方法は、患者に、別個の処置を施すステップをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、患者に、がん処置を施すステップをさらに含む。一部の態様では、生存を、1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10日間、又はこれらの中で導出される任意の範囲だけ延長する。一部の態様では、生存を、1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10週間、又はこれらの中で導出される任意の範囲だけ延長する。一部の態様では、生存を、1、2、3、4、5、6、7、8、9若しくは10カ月間、又はこれらの中で導出される任意の範囲だけ延長する。一部の態様では、生存を、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25若しくは30年間、又はこれらの中で導出される任意の範囲だけ延長する。

0024

上記で開示した方法のうちのいずれかは、上記で開示した融合タンパク質、組成物、及び/又はベクターのうちのいずれかを使用して実施することができる。

0025

本明細書で使用される「ある(a)」又は「ある(an)」は、1又は2以上(one or more)を意味する場合がある。「〜を含むこと」という語と共に使用される場合に特許請求の範囲で使用される「ある(a)」又は「ある(an)」という語は、1又は2以上(one or more than one)を意味する場合がある。

0026

代替物だけを指すことが明示的に指し示されるか、又は代替物が、互いに排除的でない限りにおいて、特許請求の範囲における「又は」という用語は、「及び/又は」を意味するのに使用されるが、本開示は、代替物だけを指す定義も、「及び/又は」を指す定義も支持する。本明細書で使用される「別の」は、「少なくとも第2の又はそれ以外の」を意味する場合がある。

0027

本出願を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するのに援用されるデバイス、方法についての誤差固有のばらつき、又は研究対象間に存在するばらつきを含むことを指し示すのに使用される。

0028

本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な記載から明らかとなろう。しかし、当業者には、本発明の精神及び範囲内の多様な変化及び変更は、この詳細な記載から明らかとなるので、詳細な記載及び具体例は、本発明の好ましい実施形態を指し示すが、例示だけを目的として示されることを理解されたい。
すなわち本発明は以下に関する。
(1)ヒトパピローマウイルス(HPV)関連疾患の処置又は予防のための医薬の製造における、抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも6つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体の使用であって、前記E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である、前記使用。
(2)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体の軽鎖可変領域及び抗CD40抗体の重鎖可変領域を含む、上記(1)に記載の使用。
(3)抗CD40抗体又はその断片がヒト化されている、上記(1)に記載の使用。
(4)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原である、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の使用。
(5)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の使用。
(6)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の使用。
(7)樹状細胞ターゲティング複合体が配列番号19を含む、上記(4)に記載の使用。
(8)樹状細胞ターゲティング複合体が配列番号21を含む、上記(5)に記載の使用。
(9)組成物がアジュバントをさらに含む、上記(1)〜(8)のいずれかに記載の使用。
(10)HPV関連疾患が、異形成、良性新生物、前悪性新生物、又はがんである、上記(1)〜(8)のいずれかに記載の使用。
(11)HPV関連疾患が、がんである、上記(10)に記載の使用。
(12)がんが、頭部、頸部、子宮頸部、外陰部、膣、陰茎、肛門、中咽頭、喉頭又は肺のがんである、上記(11)に記載の使用。
(13)患者に、ヒトパピローマウイルス(HPV)関連疾患を処置又は予防するための別個の医薬組成物を投与するステップをさらに含む、上記(1)〜(12)のいずれかに記載の使用。
(14)ヒトパピローマウイルス(HPV)関連疾患を処置又は予防するための別個の医薬組成物が、Gardasil(商標)又はCervarix(商標)である、上記(13)に記載の使用。
(15)処置が、がん関連腫瘍のサイズ又は容積の低減をもたらす、上記(10)に記載の使用。
(16)抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも3つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む融合タンパク質であって、前記E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である、前記融合タンパク質。
(17)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体に由来する可変領域を少なくとも含む、上記(16)に記載の融合タンパク質。
(18)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体の軽鎖に由来する可変領域を少なくとも含む、上記(16)又は(17)に記載の融合タンパク質。
(19)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体の重鎖に由来する可変領域を少なくとも含む、上記(16)又は(17)に記載の融合タンパク質。
(20)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体の軽鎖に由来する可変領域を少なくとも含み、抗CD40抗体の重鎖に由来する可変領域を少なくとも含む、上記(16)〜(19)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(21)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体に由来する6つのCDRを含む、上記(16)に記載の融合タンパク質。
(22)抗CD40抗体又はその断片がヒト化されている、上記(21)に記載の融合タンパク質。
(23)ペプチドリンカーがフレキシブルリンカーである、上記(16)〜(22)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(24)ペプチドリンカーが、1又は2以上のグリコシル化部位を含む、上記(16)〜(23)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(25)ペプチドリンカーが、Flexv1(配列番号5)及び/又はf1(配列番号6)である、上記(16)〜(24)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(26)HPV抗原がE6及びE7である、上記(16)〜(25)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(27)融合タンパク質が配列番号19の配列を含む、上記(26)に記載の融合タンパク質。
(28)融合タンパク質が配列番号21の配列を含む、上記(26)に記載の融合タンパク質。
(29)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原である、上記(16)〜(25)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(30)少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(16)〜(25)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(31)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(16)〜(25)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(32)少なくとも配列番号11〜13又は配列番号14〜16のアミノ酸配列と、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む融合タンパク質。
(33)配列番号11〜13及び配列番号14〜16を含む、上記(32)に記載の融合タンパク質。
(34)E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である、上記(32)又は(33)に記載の融合タンパク質。
(35)ペプチドリンカーをさらに含む、上記(32)〜(34)のいずれかに記載の融合タンパク質。
(36)ペプチドリンカーがフレキシブルリンカーである、上記(35)に記載の融合タンパク質。
(37)ペプチドリンカーが、1又は2以上のグリコシル化部位を含む、上記(36)に記載の融合タンパク質。
(38)ペプチドリンカーが、Flexv1(配列番号5)及び/又はf1(配列番号6)である、上記(36)又は(37)に記載の融合タンパク質。
(39)上記(16)〜(38)に記載の融合タンパク質のいずれかを含む、薬学的に許容される組成物。
(40)抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも3つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体を含む組成物であって、前記E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である、前記組成物。
(41)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体に由来する可変領域を少なくとも含む、上記(40)に記載の組成物。
(42)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体の軽鎖に由来する可変領域を少なくとも含む、上記(40)又は(41)に記載の組成物。
(43)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体の重鎖に由来する可変領域を少なくとも含む、上記(40)又は(41)に記載の組成物。
(44)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体の軽鎖に由来する可変領域を少なくとも含み、抗CD40抗体の重鎖に由来する可変領域を少なくとも含む、上記(40)〜(43)のいずれかに記載の組成物。
(45)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体に由来する6つのCDRを含む、上記(40)に記載の組成物。
(46)抗CD40抗体又はその断片がヒト化されている、上記(45)に記載の組成物。
(47)ペプチドリンカーがフレキシブルリンカーである、上記(40)〜(46)のいずれかに記載の組成物。
(48)ペプチドリンカーが1又は2以上のグリコシル化部位を含む、上記(40)〜(47)のいずれかに記載の組成物。
(49)ペプチドリンカーが、Flexv1(配列番号5)及びf1(配列番号6)から選択される、上記(40)〜(48)のいずれかに記載の組成物。
(50)HPV抗原がE6及びE7である、上記(40)〜(49)のいずれかに記載の組成物。
(51)融合タンパク質が、配列番号19の配列を含む、上記(50)に記載の組成物。
(52)融合タンパク質が、配列番号21の配列を含む、上記(50)に記載の組成物。
(53)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原である、上記(40)〜(49)のいずれかに記載の組成物。
(54)少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(40)〜(49)のいずれかに記載の組成物。
(55)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(40)〜(49)のいずれかに記載の組成物。
(56)上記(16)〜(39)のいずれかに記載の融合タンパク質を作製する方法であって、前記融合タンパク質を発現する組換え宿主細胞から、前記融合タンパク質を単離するステップを含む、前記方法。
(57)抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも3つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターであって、前記E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である、前記ベクター。
(58)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体の軽鎖可変領域を含む、上記(57)に記載のベクター。
(59)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体の重鎖可変領域を含む、上記(57)に記載のベクター。
(60)ポリヌクレオチド配列が、少なくとも1つのHPV16型E6抗原、少なくとも1つのHPV16型E7抗原、又は少なくとも1つのHPV18型E6抗原、及び少なくとも1つのHPV18型E7抗原をコードする、上記(57)〜(59)のいずれかに記載のベクター。
(61)ポリヌクレオチド配列が、配列番号19を含むポリペプチドをコードする、上記(60)に記載のベクター。
(62)ポリヌクレオチド配列が、配列番号21を含むポリペプチドをコードする、上記(60)に記載のベクター。
(63)ポリヌクレオチド配列が、少なくとも1つのHPV16型E6抗原、少なくとも1つのHPV16型E7抗原、少なくとも1つのHPV18型E6抗原、及び少なくとも1つのHPV18型E7抗原をコードする、上記(57)〜(60)のいずれかに記載のベクター。
(64)ヒトパピローマウイルス(HPV)感染を予防するための方法であって、患者に、抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも6つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体を含む組成物を投与するステップを含み、前記E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である、前記方法。
(65)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体の軽鎖可変領域及び抗CD40抗体の重鎖可変領域を含む、上記(64)に記載の方法。
(66)抗CD40抗体又はその断片がヒト化されている、上記(64)に記載の方法。
(67)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原である、上記(64)〜(66)のいずれかに記載の方法。
(68)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(64)〜(66)のいずれかに記載の方法。
(69)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(64)〜(66)のいずれかに記載の方法。
(70)樹状細胞ターゲティング複合体が、配列番号19を含む、上記(67)に記載の方法。
(71)樹状細胞ターゲティング複合体が、配列番号21を含む、上記(68)に記載の方法。
(72)組成物が、アジュバントをさらに含む、上記(64)〜(71)のいずれかに記載の方法。
(73)患者に、別個のHPVワクチンを投与するステップをさらに含む、上記(64)〜(72)のいずれかに記載の方法。
(74)別個のHPVワクチンが、Gardasil(商標)又はCervarix(商標)である、上記(73)に記載の方法。
(75)ヒトパピローマウイルス(HPV)感染を処置するための方法であって、患者に、抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも6つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体を含む組成物を投与するステップを含み、前記E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である、前記方法。
(76)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体の軽鎖可変領域及び抗CD40抗体の重鎖可変領域を含む、上記(75)に記載の方法。
(77)抗CD40抗体又はその断片がヒト化されている、上記(75)に記載の方法。
(78)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原である、上記(75)〜(77)のいずれかに記載の方法。
(79)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(75)〜(77)のいずれかに記載の方法。
(80)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(75)〜(77)のいずれかに記載の方法。
(81)樹状細胞ターゲティング複合体が、配列番号19を含む、上記(78)に記載の方法。
(82)樹状細胞ターゲティング複合体が、配列番号21を含む、上記(79)に記載の方法。
(83)患者に、別個のHPV処置を施すステップをさらに含む、上記(75)〜(82)のいずれかに記載の方法。
(84)少なくとも1つのHPVエピトープに対する免疫応答を誘導するための方法であって、患者に、抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも6つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体を含む組成物を投与するステップを含み、前記E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である、前記方法。
(85)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体の軽鎖可変領域及び抗CD40抗体の重鎖可変領域を含む、上記(84)に記載の方法。
(86)抗CD40抗体又はその断片がヒト化されている、上記(84)に記載の方法。
(87)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原である、上記(84)〜(86)のいずれかに記載の方法。
(88)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(84)〜(86)のいずれかに記載の方法。
(89)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(84)〜(86)のいずれかに記載の方法。
(90)樹状細胞ターゲティング複合体が、配列番号19を含む、上記(87)に記載の方法。
(91)樹状細胞ターゲティング複合体が、配列番号21を含む、上記(88)に記載の方法。
(92)組成物が、アジュバントをさらに含む、上記(84)〜(91)のいずれかに記載の方法。
(93)患者に、別個のHPVワクチンを投与するステップをさらに含む、上記(84)〜(92)のいずれかに記載の方法。
(94)別個のHPVワクチンが、Gardasil(商標)又はCervarix(商標)である、上記(93)に記載の方法。
(95)少なくとも1つのHPVエピトープに対する免疫応答を強化するための方法であって、患者に、抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも6つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体を含む組成物を投与するステップを含み、前記E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である、前記方法。
(96)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体の軽鎖可変領域及び抗CD40抗体の重鎖可変領域を含む、上記(95)に記載の方法。
(97)抗CD40抗体又はその断片がヒト化されている、上記(95)に記載の方法。
(98)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原である、上記(95)〜(97)のいずれかに記載の方法。
(99)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(95)〜(97)のいずれかに記載の方法。
(100)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(95)〜(97)のいずれかに記載の方法。
(101)樹状細胞ターゲティング複合体が、配列番号19を含む、上記(98)に記載の方法。
(102)樹状細胞ターゲティング複合体が、配列番号21を含む、上記(99)に記載の方法。
(103)患者に、別個のHPV処置を施すステップをさらに含む、上記(95)〜(102)のいずれかに記載の方法。
(104)ヒトパピローマウイルス(HPV)関連疾患を予防するための方法であって、患者に、抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも6つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体を含む組成物を投与するステップを含み、前記E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である、前記方法。
(105)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体の軽鎖可変領域及び抗CD40抗体の重鎖可変領域を含む、上記(104)に記載の方法。
(106)抗CD40抗体又はその断片がヒト化されている、上記(104)に記載の方法。
(107)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原である、上記(104)〜(106)のいずれかに記載の方法。
(108)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(104)〜(106)のいずれかに記載の方法。
(109)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(104)〜(106)のいずれかに記載の方法。
(110)樹状細胞ターゲティング複合体が、配列番号19を含む、上記(107)に記載の方法。
(111)樹状細胞ターゲティング複合体が、配列番号21を含む、上記(108)に記載の方法。
(112)組成物が、アジュバントをさらに含む、上記(104)〜(111)のいずれかに記載の方法。
(113)HPV関連疾患が、異形成、良性新生物、前悪性新生物、又はがんである、上記(104)〜(111)のいずれかに記載の方法。
(114)HPV関連疾患が、がんである、上記(113)に記載の方法。
(115)がんが、子宮頸部、外陰部、膣、陰茎、肛門、中咽頭、喉頭又は肺のがんである、上記(114)に記載の方法。
(116)患者に、別個のHPVワクチンを投与するステップをさらに含む、上記(104)〜(115)のいずれかに記載の方法。
(117)別個のHPVワクチンが、Gardasil(商標)又はCervarix(商標)である、86に記載の方法。
(118)ヒトパピローマウイルス(HPV)関連疾患を処置するための方法であって、患者に、抗CD40抗体又は抗CD40抗体に由来する少なくとも6つの相補性決定領域を含むその断片と、少なくとも1つのペプチドリンカーと、少なくとも1つのヒトパピローマウイルス(HPV)E6又はE7抗原とを含む樹状細胞ターゲティング複合体を含む組成物を投与するステップを含み、前記E6又はE7抗原が、HPV16型又はHPV18型抗原である、前記方法。
(119)抗CD40抗体又はその断片が、抗CD40抗体の軽鎖可変領域及び抗CD40抗体の重鎖可変領域を含む、上記(118)に記載の方法。
(120)抗CD40抗体又はその断片がヒト化されている、上記(118)に記載の方法。
(121)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原である、上記(118)〜(120)のいずれかに記載の方法。
(122)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(118)〜(120)のいずれかに記載の方法。
(123)少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV16型抗原であり、少なくとも1つのHPV E6抗原がHPV18型抗原であり、少なくとも1つのHPV E7抗原がHPV18型抗原である、上記(118)〜(120)のいずれかに記載の方法。
(124)樹状細胞ターゲティング複合体が、配列番号19を含む、上記(121)に記載の方法。
(125)樹状細胞ターゲティング複合体が、配列番号21を含む、上記(122)に記載の方法。
(126)HPV関連疾患が、異形成、良性新生物、前悪性新生物又はがんである、上記(118)〜(125)のいずれかに記載の方法。
(127)HPV関連疾患ががんである、上記(118)〜(125)のいずれかに記載の方法。
(128)がんが、子宮頸部、外陰部、膣、陰茎、肛門、中咽頭、喉頭又は肺のがんである、上記(114)に記載の方法。
(129)患者に、別個の処置を施すステップをさらに含む、上記(118)〜(128)のいずれかに記載の方法。
(130)患者に、がん処置を施すステップをさらに含む、上記(126)〜(128)のいずれかに記載の方法。
(131)投与が、がん関連腫瘍のサイズ又は容積の低減をもたらす、上記(127)に記載の方法。
(132)患者におけるHPV感染細胞を阻害する方法であって、前記患者に、上記(16)〜(39)のいずれかに記載の融合タンパク質又は上記(43)〜(49)のいずれかに記載のベクターを含む有効量の組成物を投与するステップを含む、前記方法。
(133)HPV感染細胞が腫瘍内にある、上記(132)に記載の方法。
(134)投与が、がん関連腫瘍のサイズ又は容積の低減をもたらす、上記(133)に記載の方法。

図面の簡単な説明

0029

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに明示するように組み入れられる。これらの図面のうちの1又は2以上を、本明細書で提示される具体的な実施形態についての詳細な記載と組み合わせて参照することにより、本発明をよりよく理解することができる。
組換え抗DC受容体抗体−E6/E7ワクチンを開発するためのスキームを示す図である。
HPV16 E6抗原及びHPV16 E7抗原に融合した、プロテインAによりアフィニティー精製された抗DC受容体抗体についてのSDS−PAGE解析を示す図である。
抗CD40抗体−HPV16.E6/7は、ヒト血中DCに効率的に結合し得ることを示す図である。
抗CD40抗体−HPV16.E6/7は、HPV16.E6/7特異的CD4+T細胞応答及びHPV16.E6/7特異的CD8+T細胞応答を誘発し得ることを示す図である。
抗CD40抗体−HPV16.E6/7は、HPV16.E6/7特異的CD4+T細胞応答及びHPV16.E6/7特異的CD8+T細胞応答を効率的に誘導し得ることを示す図である。
抗CD40抗体−HPV16.E6/7は、ヒトCD40TgマウスにおけるTC−1腫瘍の進行を抑制し得ることを示す図である。
アジュバントの、抗CD40抗体−HPV16.E6/7との共投与の効果を示す図である。
ポリICを加えたCD40HVacは、hCD40トランスジェニック動物において、E6/7特異的CD8+T細胞を誘導することを示す図である。
ポリICを加えたCD40HVacは、hCD40Tgマウスにおいて、治療的免疫を誘導することを示す図である。(a)生存曲線を示す図である。1群当たりのマウスを10匹とする。(b)TC−1腫瘍の進行を示す図である。1群当たりのマウスを10匹とする。
腫瘍内のE7特異的四量体+CD8+T細胞のパーセントは、腫瘍容積逆相関するが、血中のE7特異的四量体+CD8+T細胞のパーセントは、腫瘍容積と逆相関しないことを示す図である。
抗CD40抗体(クローン12E12)により作製されたCD40HVacは、E6/7特異的CD8+T細胞応答の誘導において、抗CD40抗体(クローン12B6)により作製されたCD40HVacより効率的であることを示す図である。

0030

実施例で記載される通り、HPVE6抗原及びHPV E7抗原を融合させた抗CD40抗体(本明細書の以下では、「抗CD40抗体−HPV16.E6/7」と呼ぶ)は、前記抗原に対する強い免疫応答(強いT細胞応答を含む)を誘導することが示されている。これにより、HPV抗原に対する免疫応答の誘発及び強化の効率的で有効な方法がもたらされる。さらに、抗CD40抗体−HPV16.E6/7は、ポリICアジュバントと組み合わせたプライムブースト戦略において使用されて、ヒトCD40トランスジェニックマウスにおけるTC−1腫瘍の進行を抑制している。したがって、前記抗CD40抗体−HPV16.E6/7は、E6/E7特異的CD8+細胞傷害性Tリンパ球を誘発することが可能であり、ポリICアジュバントと共に投与されると、効率的ワクチンとして用いられることが裏付けられている。

0031

I.核酸
ある特定の実施形態では、本明細書で記載されるタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードする組換え核酸がある。方法及び組成物における使用のために想定されるポリヌクレオチドは、DC受容体若しくはその結合性部分に対する抗体、HPV抗原、リンカー領域、又はアジュバントをコードするポリヌクレオチドを含む。

0032

本出願で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、組換え核酸分子又は全ゲノム核酸を含有しない単離核酸分子を指す。「ポリヌクレオチド」という用語には、オリゴヌクレオチド(100残基又はこれより短い長さの核酸)、例えば、プラスミドコスミドファージ、ウイルスなどを含む組換えベクターが含まれる。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、それらの自然発生の遺伝子又はタンパク質コード配列から実質的に単離された調節的配列を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖(コード又はアンチセンス)の場合もあり、二本鎖の場合もあり、RNA、DNA(ゲノムcDNA、又は合成)、これらのアナログ、又はこれらの組合せであり得る。さらなるコード配列又は非コード配列が、ポリヌクレオチド内に存在してもよいが、存在しなくてもよい。

0033

この点で、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードする核酸(適正な転写翻訳後修飾、又は局在化要請される任意の配列を含む)を指すのに使用される。当業者により理解される通り、この用語は、ゲノム配列発現カセットcDNA配列、及びタンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、及びミュータントを発現するか又はこれらを発現するように適合され得る、小型の人工核酸セグメント包摂する。ポリペプチドの全部又は一部をコードする核酸は、このようなポリペプチドの全部又は一部をコードする連続核酸配列を含有し得る。また、特定のポリペプチドは、わずかに異なる核酸配列を有するばらつきを含有するが、これにも関わらず、同じタンパク質又は実質的に類似のタンパク質をコードする核酸によりコードされ得ることも想定される(上記を参照されたい)。

0034

特定の実施形態では、単離核酸セグメント、及びDC受容体に結合するポリペプチド(例えば、抗体又はその断片)、HPV抗原であるポリペプチド、リンカー領域であるポリペプチド、或いは1若しくは2以上のDC受容体抗体又はそれらの断片と、HPV抗原(任意のHPV型に由来するE6又はE7など)と、リンカー領域との任意の組合せを含む融合タンパク質であるポリペプチドをコードする核酸配列を組み込む組換えベクターがある。「組換え」という用語は、ポリペプチド又は具体的なポリペプチドの名称と共に使用することができ、これが一般に、インビトロにおいて操作されているか、又はこのような分子複製産物である核酸分子から産生されるポリペプチドを指す。

0035

核酸セグメントは、コード配列自体の長さに関わらず、それらの全体の長さが大幅に変化し得るように、プロモーターポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、複数のクローニング部位、他のコードセグメントなど、他の核酸配列と組み合わせることができる。したがって、ほぼ任意の長さの核酸断片を援用し得ることが想定されるが、全長は、意図される組換え核酸プロトコールにおける調製及び使用の容易さにより制限することが好ましい。場合によって、核酸配列は、例えば、ポリペプチドの精製、輸送分泌、翻訳後修飾、又はターゲティングなどの治療的利益、若しくは有効性を可能とする、さらなる異種コード配列を伴うポリペプチド配列をコードし得る。上記で論じた通り、タグ又は他の異種ポリペプチドを、修飾ポリペプチドコード配列へと付加し得るが、ここで、「異種」とは、修飾ポリペプチドとは同じでないポリペプチドを指す。

0036

ある特定の実施形態では、本明細書で開示される配列に対して実質的な同一性を有するポリヌクレオチドバリアント;本明細書で記載される方法(例えば、標準的なパラメータを使用するBLAST解析)を使用して、本明細書で提示されるポリヌクレオチド配列と比較した、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、若しくは99%又はこれを超える配列同一性であって、全ての値及びそれらの間の範囲を含む配列同一性を含むポリヌクレオチドバリアントがある。ある特定の態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書で記載されるアミノ酸配列に対して、配列の全長にわたり、少なくとも90%、好ましくは95%及びこれを上回る同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;又は前記単離ポリヌクレオチドに対して相補的なヌクレオチド配列を含むであろう。

0037

ベクター
ポリペプチドは、核酸分子によってコードされ得る。核酸分子は、核酸ベクターの形態であり得る。「ベクター」という用語は、それを複製し、発現する細胞への導入のために、異種核酸配列を挿入し得る、担体核酸分子を指すのに使用される。核酸配列は、「異種」の場合があり、これは、ベクターが導入される細胞、又は組み込まれる核酸に対して外来性文脈にあることを意味し、細胞内又は核酸内の配列と相同であるが、宿主細胞内又は核酸内の、通常見出されない位置にある配列を含む。ベクターは、DNA、RNA、プラスミド、コスミド、ウイルス(バクテリオファージ動物ウイルス、及び植物ウイルス)、及び人工染色体(例えば、YAC)を含む。当業者であれば、標準的な組換え法によりベクターを構築することが十分にできるであろう(例えば、いずれも、参照により本明細書に組み込まれる、Sambrook et al., 2001;Ausubel et al., 1996)。ベクターは、樹状細胞受容体に結合する抗体若しくはその断片、1若しくは2以上のHPV抗原(例えば、1又は複数のHPV型に由来するE6及び/又はE7)、1若しくは複数のリンカー領域、1若しくは複数のアジュバント、前出のタンパク質の任意の組合せ、又は前出のタンパク質の任意の組合せを含む、1若しくは2以上の融合タンパク質を産生する宿主細胞内で使用することができる。

0038

発現ベクター」という用語は、転写が可能な遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターを指す。場合によっては、RNA分子はその後、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドへと翻訳される。発現ベクターは、特定の宿主生物における、作動可能に連結されたコード配列の転写に必要であり、おそらく、その翻訳にも必要な核酸配列を指す、様々な「制御配列」を含有し得る。転写及び翻訳を統御する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、他の機能を果たす核酸配列も含有する場合があり、本明細書でも記載される。

0039

宿主細胞
本明細書で使用される「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」という用語は、互換的に使用することができる。これらの用語の全てはまた、任意の後続の世代であり、全ての後続の世代である、それらの後代細胞も含む。全ての後代細胞は、意図的な変異又は不測の変異のために、同一ではない場合もあることが理解される。異種核酸配列の発現の文脈では、「宿主細胞」とは、原核細胞又は真核細胞を指し、ベクターを複製するか、又はベクターによりコードされる異種遺伝子を発現することが可能な、任意の形質転換生物を含む。宿主細胞は、ベクター又はウイルスのレシピエントとして使用することができ、レシピエントとして使用されている。宿主細胞は、「トランスフェクト」又は「形質転換」することができ、これは、組換えタンパク質コード配列などの外因性核酸を、宿主細胞へと移入又は導入する工程を指す。形質転換された細胞は、初代対象細胞及びその後代細胞を含む。

0040

一部のベクターでは、原核細胞及び真核細胞の両方における複製及び/又は発現を可能とする制御配列を援用することができる。当業者であれば、上記で記載した宿主細胞の全てをインキュベートし、それらを維持し、ベクターの複製を可能とするための条件をさらに理解するであろう。また、大スケールのベクターの産生のほか、ベクターによりコードされる核酸、及びそれらの同族のポリペプチド、タンパク質、又はペプチドの産生を可能とする技法及び条件も理解されており、公知である。

0041

発現系
上記で論じた組成物の少なくとも一部又は全部を含む、多数の発現系が存在する。原核細胞ベースの系及び/又は真核細胞ベースの系を、核酸配列、又はそれらのコグネイトのポリペプチド、タンパク質、及びペプチドを産生する実施形態を伴う使用のために援用することができる。多くのこのような系は、広く市販されている。

0042

いずれもが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,871,986号明細書、同第4,879,236号明細書において記載されているものなどであり、例えば、INVITROGEN(登録商標)社製のMAXBAC(登録商標)2.0及びCLONTECH(登録商標)社製のBACPACK(商標)BACULOVIRUS EXPRESSION SYSTEMの商標名で購入し得る、昆虫細胞バキュロウイルス系により、異種核酸セグメント高レベルタンパク質発現をもたらすことができる。

0043

開示される発現系に加えて、発現系の他の例は、合成エクジソン誘導性受容体を伴う、STRATAGENE(登録商標)社製のCOMPLETE CONTROL Inducible Mammalian Expression System、又は大腸菌(E. coli)発現系である、同社製のpET Expression Systemを含む。誘導的発現系の別の例は、全長CMVプロモーターを使用する誘導的哺乳動物発現系である、T-REX(商標)(テトラサイクリン調節型発現)Systemを擁する、INVITROGEN(登録商標)社から入手可能である。INVITROGEN(登録商標)社はまた、ピキアメタノリカ(Pichia methanolica)発現系と呼ばれる酵母発現系であって、メチロトローフ酵母であるピキア・メタノリカにおける、組換えタンパク質の高レベルな産生のためにデザインされた酵母発現系も提供している。当業者には、発現コンストラクトなどのベクターをどのように発現させて、核酸配列、又はそのコグネイトのポリペプチド、タンパク質、若しくはペプチドを産生するのかが公知であろう。

0044

II.タンパク質性組成物
置換バリアントは典型的に、タンパク質内の1又は2以上の部位における、1つのアミノ酸の、別のアミノ酸への交換を含有し、他の機能又は特性の喪失を伴うか又は伴わずに、ポリペプチドの1又は2以上の特性をモジュレートするようにデザインすることができる。置換は、保存的であること、すなわち、1つのアミノ酸を、形状及び電荷が類似するアミノ酸で置きかえることが可能である。当技術分野では、保存的置換が周知であり、例えば、アラニンからセリンへの変化;アルギニンからリシンへの変化;アスパラギンからグルタミン又はヒスチジンへの変化;アスパラギン酸からグルタミン酸への変化;システインからセリンへの変化;グルタミンからアスパラギンへの変化;グルタミン酸からアスパラギン酸への変化;グリシンからプロリンへの変化;ヒスチジンからアスパラギン又はグルタミンへの変化;イソロイシンからロイシン又はバリンへの変化;ロイシンからバリン又はイソロイシンへの変化;リシンからアルギニンへの変化;メチオニンからロイシン又はイソロイシンへの変化;フェニルアラニンからチロシン、ロイシン又はメチオニンへの変化;セリンからトレオニンへの変化;トレオニンからセリンへの変化;トリプトファンからチロシンへの変化;チロシンからトリプトファン又はフェニルアラニンへの変化;及びバリンからイソロイシン又はロイシンへの変化を含む。代替的に、置換は、ポリペプチドの機能又は活性が、影響を受けるように、非保存的な場合もある。非保存的変化は、極性アミノ酸又は帯電アミノ酸の、非極性アミノ酸又は非帯電アミノ酸への置換、及びこの逆など、残基の、化学的類縁でない残基への置換を伴うことが典型的である。

0045

タンパク質は、組換えの場合もあり、インビトロで合成する場合もある。代替的に、非組換えタンパク質又は組換えタンパク質は、細菌から単離することができる。また、このようなバリアントを含有する細菌は、組成物及び方法中に組み込まれることも想定される。結果として、タンパク質を単離する必要がなくなる。

0046

本明細書では、「機能的に同等なコドン」という用語を、アルギニン又はセリンの6つのコドンなど、同じアミノ酸をコードするコドンを指し、また、生物学的に同等なアミノ酸をコードするコドンも指すのに使用する(下記の表を参照されたい)。

0047

0048

また、アミノ酸及び核酸配列はそれぞれ、さらなるN末端アミノ酸若しくはC末端アミノ酸、又は5’側配列若しくは3’側配列などの、さらなる残基を含み、それでもなお、タンパク質発現に関する場合、配列が、タンパク質の生体活性の維持を含む、上記で示した基準を満たす限りにおいて、本質的に、本明細書で開示される配列のうちの1つにおいて示される通りであり得ることも理解されるであろう。末端配列の付加は、特に、例えば、コード領域の5’部分又は3’部分に隣接する多様な非コード配列を含む、核酸配列に適用される。

0049

以下は、同等であるか、又はなお改善された、第2世代の分子を創出する、タンパク質のアミノ酸変化に基づく議論である。例えば、抗体の抗原結合性領域若しくは基質分子上の結合性部位などの構造との相互作用的結合能の著明な喪失、又は抗原性ペプチド内若しくは抗原性タンパク質内の抗原性の喪失を伴わずに、例えば、タンパク質構造内の、ある特定のアミノ酸を、他のアミノ酸で置換することができる。そのタンパク質の生物学的に機能的な活性を規定するのは、タンパク質の相互作用能及び相互作用的性質であるので、ある特定のアミノ酸置換を、タンパク質配列内、及びその根底的なDNAコード配列内に施し、それにも関わらず、同様の特性を伴うタンパク質を産生することができる。こうして、本発明者らは、それらの生物学的有用性又は生体活性の著明な喪失を伴わずに、多様な変化を、遺伝子のDNA配列内に施し得ることを想定する。

0050

このような変化を施す場合、アミノ酸の疎水性指数を考慮することができる。当技術分野では、相互作用的生体機能のタンパク質への付与における、アミノ酸の疎水性指数の重要性が一般に理解されている(Kyte and Doolittle, 1982)。アミノ酸の相対的な疎水的性格は、結果として得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これにより、タンパク質と他の分子、例えば、酵素基質、受容体、DNA、抗体、抗原などとの相互作用が規定されることが受容されている。

0051

当技術分野ではまた、類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づき、効果的に施し得ることも理解される。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,554,101号明細書は、その隣接アミノ酸の親水性により統御される、タンパク質の局所的な最大平均親水性が、タンパク質の生物学的特性相関することについて言明している。アミノ酸を、同様の親水性値を有し、生物学的に同等であり、免疫学的に同等なタンパク質をなおももたらす、別のアミノ酸で置換し得ることが理解される。

0052

上記で概括した通り、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。前出の多様な特徴を考慮に入れる例示的な置換が周知であり、アルギニン及びリシン;グルタミン酸及びアスパラギン酸;セリン及びトレオニン;グルタミン及びアスパラギン;及びバリン、ロイシン及びイソロイシンを含む。

0053

組成物中には、1ml当たり約0.001mg〜約10mgの間の全ポリペプチド、ペプチド、及び/又はタンパク質が存在することが想定される。したがって、組成物中のタンパク質(融合タンパク質を含む)の濃度は、約、少なくとも約、又は多くとも約0.001、0.010、0.050、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0mg/ml以上(又はこれらの中で導出される任意の範囲)であり得る。このうち、約、少なくとも約、又は多くとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%は、DC受容体に結合する抗体又はDC受容体に結合する抗体を含む融合タンパク質であることが可能であり、本明細書で記載される、他のHPV抗原、リンカー領域又はアジュバントと組み合わせて使用することができる。

0054

ポリペプチド及びポリペプチドの産生
実施形態は、本明細書で記載される多様な態様における使用のための、ポリペプチド、ペプチド、及びタンパク質、並びにこれらの免疫原性断片を伴う。例えば、特異的抗体を、DC受容体への結合及びHPV抗原の提示についてアッセイするか、又はDC受容体への結合及びHPV抗原の提示に使用する。具体的な実施形態では、本明細書で記載されるタンパク質の全部又は一部はまた、従来の技法に従い、溶液中又は固体支持体上で合成することもできる。多様な自動式合成器が市販されており、公知のプロトコールに従い使用することができる。例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、Stewart and Young, 1984;Tam et al., 1983;Merrifield, 1986;及びBarany and Merrifield, 1979を参照されたい。代替的に、ペプチド又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、発現ベクターへと挿入し、適切な宿主細胞へと形質転換又はトランスフェクトし、発現に適する条件下で培養する、組換えDNA技術を援用することもできる。

0055

一実施形態は、タンパク質の産生及び/又は提示のための微生物を含む細胞への遺伝子移入の使用を含む。所望のタンパク質の遺伝子を、適切な宿主細胞内に移入した後で、適切な条件下で細胞を培養することができる。事実上任意のポリペプチドをコードする核酸を援用することができる。本明細書では、組換え発現ベクター、及びその中に含まれるエレメントの作製について論じる。代替的に、産生されるタンパク質は、タンパク質産生のために使用される細胞により通常合成される、内因性タンパク質であり得る。

0056

ある特定の態様では、DC受容体又はDC受容体断片は、断片配列の長さにわたり選択される配列に対して、少なくとも85%の同一性、少なくとも90%の同一性、少なくとも95%の同一性、又は少なくとも97〜99%の同一性であって、全ての値及びそれらの間の範囲を含む同一性を有するタンパク質の細胞外ドメインの実質的に全てを含む。

0057

免疫原性組成物中にはまた、HPV抗原、又はHPV抗原の免疫原性断片(例えば、E6又はE7)から構成される融合タンパク質も含まれる。HPV抗原は、任意の種類(例えば、16型又は18型)に由来し得る。例えば、HPV抗原は、単一のHPV型又はHPV型の組合せから選択することができる。HPV抗原又はHPV抗原の組合せは、HPV1型、HPV2型、HPV3型、HPV4型、HPV5型、HPV6型、HPV7型、HPV8型、HPV9型、HPV10型、HPV11型、HPV12型、HPV13型、HPV14型、HPV15型、HPV16型、HPV17型、HPV18型、HPV19型、HPV20型、HPV21型、HPV22型、HPV23型、HPV24型、HPV25型、HPV26型、HPV27型、HPV28型、HPV29型、HPV30型、HPV31型、HPV32型、HPV33型、HPV34型、HPV35型、HPV36型、HPV37型、HPV38型、HPV39型、HPV40型、HPV41型、HPV42型、HPV43型、HPV44型、HPV45型、HPV46型、HPV47型、HPV48型、HPV49型、HPV50型、HPV51型、HPV52型、HPV53型、HPV54型、HPV55型、HPV56型、HPV57型、HPV58型、HPV59型、HPV60型、HPV61型、HPV62型、HPV63型、HPV64型、HPV65型、HPV66型、HPV67型、HPV68型、HPV69型、HPV70型、HPV71型、HPV72型、HPV73型、HPV74型、HPV75型、HPV76型、HPV77型、HPV78型、HPV79型、HPV80型、HPV81型、HPV82型、HPV83型、HPV84型、HPV85型、HPV86型、HPV87型、HPV88型、HPV89型、HPV90型、HPV91型、HPV92型、HPV93型、HPV94型、HPV95型、HPV96型、HPV97型、HPV98型、HPV99型、HPV100型、HPV101型、HPV102型、HPV103型、HPV104型、HPV105型、HPV106型、HPV107型、HPV108型、HPV109型、HPV110型、HPV111型、HPV112型、HPV113型、HPV114型、HPV115型、HPV116型、HPV117型、HPV118型、HPV119型、又はHPV120型に由来し得る。代替的に、実施形態はまた、T細胞エピトープ又は精製タグ、例えば、β−ガラクトシダーゼグルタチオン−S−トランスフェラーゼ緑色蛍光タンパク質(GFP,green fluorescent protein)、FLAG、mycタグ、ポリヒスチジンなどのエピトープタグ、又はインフルエンザウイルスヘマグルチニンなどのウイルス表面タンパク質、又は破傷風トキソイドジフテリアトキソイド、CRM197などの細菌タンパク質の提示配列などの異種配列を伴う融合タンパク質としての、HPVタンパク質若しくはそれらの免疫原性断片又は抗DC受容体抗体若しくはそれらの断片の個々の融合タンパク質も含む。

0058

抗体及び抗体様分子
ある特定の態様では、1又は2以上の抗体又は抗体様分子(例えば、抗体のCDRドメインを含むポリペプチド)であって、DC受容体に対する特異性を有する抗体又は抗体様分子を、得るか又は産生することができる。これらの抗体は、本明細書で記載される多様な診断的適用又は治療的適用において使用することができる。

0059

本明細書で使用される「抗体」という用語は、IgGIgMIgAIgD及びIgEのほか、抗体のCDRドメインを含むポリペプチドであって、抗原結合活性を保持するポリペプチドなど、任意の免疫性結合剤を広く指すことを意図する。したがって、「抗体」という用語は、抗原結合性領域を有し、Fab’、Fab、F(ab’)2、単一ドメイン抗体(DAB)、Fv、scFv(一本鎖Fv)、及び抗体CDRを伴うポリペプチド、CDRを提示する足場ドメイン(例えば、アンチカリン)又はナノボディなどの抗体断片を含む、任意の抗体様分子を指すのに使用される。例えば、ナノボディは、ラクダ科動物IgG2若しくはIgG3、又はこのようなラクダ科動物Igに由来するCDR提示フレームに由来する抗原特異的VHH(例えば、組換えVHH)であり得る。当技術分野では、多様な抗体ベースコンストラクト及び断片を調製及び使用するための技法が周知である。当技術分野ではまた、抗体を調製し、特徴づけるための手段も周知である(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照されたい)。

0060

また、「ミニ抗体」又は「ミニボディ」も、実施形態を伴う使用のために想定される。ミニボディとは、ヒンジ領域によりsFvから隔てられたそれらのC末端においてオリゴマー化ドメインを含む、sFvポリペプチド鎖である(Pack, et al., 1992)。オリゴマー化ドメインは、さらなるジスルフィド結合によりさらに安定化され得る、自己会合型αへリックス、例えば、ロイシンジッパーを含む。オリゴマー化ドメインは、インビボにおけるポリペプチドの、機能的な結合性タンパク質へのフォールディングを容易とすると考えられる過程である、膜を隔てた有向フォールディングに適合的となるようにデザインする。一般に、ミニボディは、当技術分野で周知の組換え法を使用して産生する。例えば、Pack, et al., 1992;Cumberet al., 1992を参照されたい。

0061

実施形態ではまた、抗体様結合性ペプチド模倣剤も想定される。Liu et al., 2003は、軽装抗体(pared-down antibodies)として作用し、血清中半減期の延長のほか、それほど煩瑣ではない合成法といった、ある特定の利点を有するペプチドである、「抗体様結合性ペプチド模倣剤」(ABiP,antibody like binding peptidomimetics)について記載している。

0062

また、CDRなど、抗原結合性ペプチドのための代替的な足場利用可能であり、実施形態に従いDC受容体結合性分子を作製するのに使用することができる。一般に、当業者には、元の抗体に由来するCDRのうちの少なくとも1つをグラフトするためのタンパク質足場の種類をどのように決定するのかが公知である。より詳細には、選択されるには、このような足場は、以下の多数の基準:系統的保存が良好であること;三次元構造が公知であること(例えば、結晶構造解析、NMR分光法若しくは当業者に公知の他の任意の技法により);サイズが小さいこと;転写後修飾が少数であるか若しくは存在しないこと;並びに/又は産生、発現及び精製が容易であることを満たさなければならないことが公知である(Skerra, 2000)。

0063

このようなタンパク質足場の由来は、フィブロネクチン、並びに、優先的に、III型フィブロネクチンドメイン10、リポカリン、アンチカリン(Skerra, 2001)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)のプロテインAのドメインBに由来するプロテインZ、チオレドキシンA又は「アンキリンリピート」(Kohl et al., 2003)、「アルマジロリピート」、「ロイシンリッチリピート」及び「テトラトリコペプチドリピート」などの反復モチーフを伴うタンパク質の中から選択される構造であり得るがこれらに限定されない。例えば、アンチカリン誘導体又はリポカリン誘導体は、多様な標的分子に対するアフィニティー及び特異性を有する結合性タンパク質の種類であり、DC受容体結合性分子として使用することができる。このようなタンパク質は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第20100285564号明細書、同第20060058510号明細書、同第20060088908号明細書、同第20050106660号明細書、及び国際公開第2006/056464号パンフレットにおいて記載されている。

0064

ある特定の態様ではまた、例えば、サソリ昆虫、植物、軟体動物などに由来する毒素などの毒素、及び神経型NO合成酵素タンパク質阻害剤(PIN,protein inhibitors of neuronal NO synthase)に由来する足場も使用することができる。

0065

モノクローナル抗体(mAb,monoclonal antibody)は、ある特定の利点、例えば、再現性を有し、産生スケールが大きいことが認知されている。実施形態は、ヒト、マウス、サルラットハムスターウサギ及びニワトリに由来するモノクローナル抗体を含む。

0066

マウス、ラット、又は他の種に由来するキメラ抗体であって、ヒト定常領域ドメイン及び/又はヒト可変領域ドメインを保有するキメラ抗体、二重特異性抗体組換え抗体及び改変抗体並びにこれらの断片と同様に、また、「ヒト化」抗体も想定される。本明細書で使用される「ヒト化」免疫グロブリンという用語は、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト(通例、マウス又はラット)免疫グロブリンに由来する1又は2以上のCDRとを含む免疫グロブリンを指す。CDRを提供する非ヒト免疫グロブリンは、「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは、「アクセプター」と呼ばれる。「ヒト化抗体」とは、ヒト化軽鎖免疫グロブリン及びヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。一部の実施形態の抗体について記載するために、アフィニティーとして公知の、抗体分子がエピトープに結合する強度を測定することができる。抗体のアフィニティーは、結合定数(Ka,association constant)又は解離定数(Kd,dissociation constant)を測定することにより決定することができる。ある特定の実施形態では、有用であるとみなされる抗体の結合定数は、約、少なくとも約、又は多くとも約106、107、108、109若しくは1010M又はこれらの中で導出される任意の範囲であり得る。同様に、一部の実施形態では、抗体の解離定数は、約、少なくとも約、又は多くとも約10−6、10−7、10−8、10−9若しくは10−10M又はこれらの中で導出される任意の範囲であり得る。本明細書で論じられる抗体については、これらの値が報告されており、同じアッセイを使用して、このような抗体の結合特性を評価することができる。

0067

ある特定の実施形態では、DC受容体に特異的に結合するポリペプチドは、細胞表面上のDC受容体に結合し、強い免疫応答の発生を可能とするHPV抗原を提示することが可能である。さらに、一部の実施形態では、使用されるポリペプチドは、強い免疫応答を発生させることにより、HPVに対する防御的免疫をもたらし得るか、又はHPVのための治療手段をもたらす。

0068

1.抗体を作製するための方法
当技術分野では、抗体(例えば、モノクローナル抗体及び/又はモノクローナル抗体)を作製するための方法が公知である。略述すると、ポリクローナル抗体は、実施形態に従い、動物を、DC受容体ポリペプチド又はその部分で免疫感作し、抗血清を、その免疫感作された動物から回収することにより調製する。

0069

広範にわたる動物種を、抗血清の産生のために使用することができる。抗血清の産生のために使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット又はヤギであることが典型的である。動物の選択は、当業者に公知の、操作の容易さ、費用又は血清の所望量により決めることができる。抗体はまた、所望の免疫グロブリン重鎖配列及び免疫グロブリン軽鎖配列についてトランスジェニックである哺乳動物又は植物の作製、及びそれらから回収可能な形態における抗体の産生を介して、トランスジェニック法により産生することもできることが認識されるであろう。哺乳動物におけるトランスジェニック法による産生との関連で述べると、抗体は、ヤギ、ウシ、又は他の哺乳動物のミルク中で産生し、これらから回収することができる。例えば、米国特許第5,827,690号明細書、同第5,756,687号明細書、同第5,750,172号明細書、及び同第5,741,957号明細書を参照されたい。

0070

また当技術分野で周知の通り、特定の免疫原組成物免疫原性は、アジュバントとして公知の、免疫応答の非特異的刺激剤を使用することにより増強することができる。適切なアジュバントは、サイトカインケモカイン、共因子、毒素、マラリア原虫合成組成物又はこのようなアジュバントをコードするベクターなど、任意の許容可能な免疫刺激性化合物を含む。

0071

実施形態に従い使用し得るアジュバントは、IL−1、IL−2、IL−4、IL−7、IL−12、−インターフェロンGMCSP、BCG水酸化アルミニウム、thur−MDP及びnor−MDPなどのMDP化合物、CGP(MTP−PE)、リピドA、ポリIC、モンタナイド、GMCSF、並びにモノホスホリルリピドA(MPL,monophosphoryl lipid A)を含むがこれらに限定されない。また、2%のスクアレン/Tween 80エマルジョン中に、細菌から抽出された3つの成分である、MPL、トレハロースミコール酸TDM,trehalose dimycolate)及び細胞壁骨格(CWS,cell wall skeleton)を含有するRIBIも想定される。MHC抗原もなお、使用することができる。例示的なアジュバントは、完全フロイントアジュバント(死滅させた結核菌(Mycobacterium tuberculosis)を含有する、免疫応答の非特異的刺激剤)、不完全フロイントアジュバント及び/又は水酸化アルミニウムアジュバントを含み得る。

0072

アジュバントに加えて、T細胞免疫上方調節するか、又はサプレッサー細胞活性を下方調節することが示されている、生物学的応答修飾剤(BRM,biologic response modifier)を共投与することも所望され得る。このようなBRMは、シメチジンCIM,cimetidine;1200mg/d)(Smith/Kline社、PA);低用量のシクロホスファミド(CYP,cyclophosphamide;300mg/m2)(Johnson/Mead社、NJ)、−インターフェロン、IL−2、若しくはIL−12などのサイトカイン、又はB−7など、免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質をコードしている遺伝子を含むがこれらに限定されない。

0073

抗体の産生において使用される免疫原組成物の量は、免疫原の性質のほか、免疫感作のために使用される動物によっても変化する。皮下、筋内、皮内、皮内、静脈内、腫瘍内及び腹腔内を含むがこれらに限定されない、様々な経路を使用して、免疫原を投与することができる。抗体の産生は、免疫感作後の多様な時点において、免疫感作された動物の血液をサンプリングすることにより、モニタリングすることができる。

0074

mAbは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,196,265号明細書において例示されている技法など、周知の技法の使用を介して、たやすく調製することができる。この技法は、適切な動物を、選択された免疫原組成物、例えば、野生型組成物であれ、ミュータント組成物であれ、精製されるか又は部分的に精製されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はドメインで免疫感作するステップを伴うことが典型的である。免疫感作組成物は、抗体産生細胞刺激するのに有効な方式で投与する。

0075

モノクローナル抗体(mAb)を作製するための方法は一般に、ポリクローナル抗体を調製するための方法と同じ線に沿って始まる。一部の実施形態では、マウス及びラットなどの齧歯動物を、モノクローナル抗体の作製において使用する。一部の実施形態では、ウサギ細胞、ヒツジ細胞、又はカエル細胞を、モノクローナル抗体の作製において使用する。ラットの使用は、周知であり、ある特定の利点をもたらし得る(Goding, 1986, pp. 6061)。マウス(例えば、BALB/cマウス)は、日常的に使用され、一般に、高パーセントの安定的な融合体をもたらす。

0076

所望される場合、濾過遠心分離及びHPLC又はアフィニティークロマトグラフィーなど、多様なクロマトグラフィー法を使用して、いずれの手段により産生されたmAbも、さらに精製することができる。モノクローナル抗体の断片は、このようにして産生されたモノクローナル抗体から、ペプシン若しくはパパインなどの酵素による消化を含む方法、及び/又は化学的還元を介するジスルフィド結合の切断により得ることができる。代替的に、モノクローナル抗体断片は、自動式ペプチド合成器を使用して合成することもできる。

0077

また、分子クローニング法を使用して、モノクローナル抗体を作製し得ることも想定される。一実施形態では、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーを、免疫感作された動物の脾臓から単離されたRNAから調製し、抗原を発現する細胞と対照細胞とを使用するパニングにより、適切な抗体を発現するファージミドを選択する。従来のハイブリドーマ法に対するこの手法の利点は、約104倍の抗体を、単一のラウンドで産生し、スクリーニングし得ることであり、H鎖L鎖との組合せにより新たな特異性を作り出し、これにより、適切な抗体を見出す可能性をさらに増大させることである。

0078

別の実施形態は、例えば、Cre媒介型部位特異的組換えを使用して、修飾免疫グロブリン遺伝子座を含む細胞のゲノム配列から抗体を発現する細胞を産生する方法について記載する、米国特許第6,091,001号明細書において見出される、抗体の産生に関わる。方法はまず、抗体産生細胞に、lox部位と、修飾領域へと転換される、ゲノム配列の免疫グロブリン遺伝子座の領域に隣接する、第1のDNA配列と相同なターゲティング配列とを含む、相同性ターゲティングベクターをトランスフェクトするステップを伴い、部位特異的相同組換えを介して、第1のlox部位を、ゲノム配列へと挿入する。次いで、細胞に、Cre媒介型組換えに適する第2のlox部位であって、組み込まれたlox部位と、免疫グロブリン遺伝子座の領域を修飾領域へと転換する修飾配列とを伴う第2のlox部位を含む、loxターゲティングベクターをトランスフェクトする。この転換は、修飾配列が、lox部位の、Cre媒介型部位特異的組換えを介して、ゲノム配列へと挿入されるように、インビボにおいて、lox部位を、Creと相互作用させることにより実施する。

0079

代替的に、モノクローナル抗体断片は、自動式ペプチド合成器を使用して合成することもでき、全長遺伝子又は遺伝子断片の、大腸菌内の発現により合成することもできる。

0080

モノクローナル抗体は、特異性、アビディティー、半減期、免疫原性、結合による会合、結合の解離、又は意図される処置効果又は防御効果と比べた全体の機能的特性に関連する特性について、さらにスクリーニング又は最適化し得ることがさらに想定される。したがって、モノクローナル抗体は、本明細書で提示されるモノクローナル抗体又はヒト化抗体の、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又は6つのCDRのアミノ酸配列内に、1、2、3、4、5、6、又は7カ所以上の変化を有し得ることが想定される。抗体の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のVJ領域又はVDJ領域のCDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5、又はCDR6のうちの、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10位におけるアミノ酸は、保存的アミノ酸又は非保存的アミノ酸による挿入、欠失、又は置換を有し得ることが想定される。上記では、置換される場合もあり、置換を構成する場合もある、このようなアミノ酸について開示している。

0081

一部の実施形態では、全抗体の断片は、抗原に結合する機能を果たし得る。結合性断片の例は、(i)VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン及びCH1ドメインで構成された、Fab断片;(ii)VHドメイン及びCH1ドメインからなる、Fd断片;(iii)単一の抗体のVLドメイン及びVHドメインで構成された、Fv断片;(iv)VHドメイン又はVLドメインで構成された、dAb断片(Ward, 1989;McCafferty et al., 1990;Holt et al., 2003);(v)単離CDR領域;(vi)連結された2つのFab断片を含む二価断片である、F(ab’)2断片(vii)2つのドメインが会合して抗原結合性部位を形成することを可能とするペプチドリンカーにより、VHドメインとVLドメインが連結された、一本鎖Fv分子(scFv)(Bird et al., 1988);Huston et al., 1988);(viii)二重特異性の一本鎖Fv二量体(PCT特許出願第PCT/US92/09965号明細書);並びに(ix)遺伝子融合により構築された多価断片又は多特異性断片である、「ダイアボディ」(国際公開第94/13804号パンフレット;Holliger et al., 1993)である。Fv分子、scFv分子又はダイアボディ分子は、VHドメインとVLドメインとを連結するジスルフィド架橋の組込みにより安定化させることができる(Reiter et al., 1996)。また、CH3ドメインへと接合されたscFvを含むミニボディも作製することができる(Hu et al. 1996)。本段落内の引用は全て、参照により組み込まれる。

0082

抗体はまた、二重特異性抗体も含む。二重特異性抗体又は二重機能性抗体は、2つの異なる可変領域を、同じ分子内に組み合わせた、第2世代のモノクローナル抗体を形成する(Holliger & Winter, 1999)。それらの使用については、診断分野及び治療分野のいずれにおいても、それらが、新たなエフェクター機能動員する能力、又は腫瘍細胞表面上の複数の分子をターゲティングする能力からの裏付けがなされている。二重特異性抗体を使用する場合、これらは、様々な方式(Holliger et al, 1993)で製造され得る、従来の二重特異性抗体であって、例えば、化学的に調製されるか、又はハイブリッド体であるハイブリドーマから調製される二重特異性抗体の場合もあり、上述した二重特異性抗体断片のうちのいずれかの場合もある。これらの抗体は、化学的方法により得ることもでき(Glennie et al., 1987;Repp et al., 1995)、体細胞方法により得ることもできる(Staerz & Bevan, 1986)が、同様に、ヘテロ二量体化するように仕向け、これにより、求められる抗体の精製工程を容易とする遺伝子操作法により得ることもできる(Merchand et al., 1998)。二重特異性抗体の例は、異なる特異性を伴う2つの抗体の結合ドメインを使用し、短いフレキシブルなペプチドを介して直接連結し得るBiTE(商標)技術による二重特異性抗体を含む。BiTE(商標)技術では、2つの抗体を、短い単一のポリペプチド鎖上で組み合わせる。ダイアボディ及びscFvは、Fc領域を伴わずに、可変ドメインだけを使用して構築することができ、抗イディオタイプ抗体反応の影響を低減する可能性がある。本段落内の引用は全て、参照により組み込まれる。

0083

二重特異性抗体は、全IgGとして構築することもでき、二重特異性Fab’2として構築することもでき、Fab’PEGとして構築することもでき、ダイアボディとして構築することもでき、また、二重特異性scFvとして構築することもできる。さらに、当技術分野で公知の日常的な方法を使用して、四価抗体を形成するように、2つの二重特異性抗体を連結することもできる。

0084

また、二重特異性全抗体と対比される二重特異性ダイアボディも、大腸菌内でたやすく構築し、発現させ得るため、特に、有用であり得る。適切な結合特異性を有するダイアボディ(及び抗体断片など、他の多くのポリペプチド)は、ライブラリーによるファージディスプレイ(国際公開第94/13804号パンフレット)を使用してたやすく選択することができる。ダイアボディの一方のアームを、一定に、例えば、特異性をDC受容体に対して方向づけるように保つなら、他のアームを変化させ、適切な特異性を有する抗体を選択するライブラリーを作製することができる。二重特異性全抗体は、参照により本明細書に組み込まれる、Ridgeway et al., 1996で記載されている代替的な操作法により作製することができる。

0085

抗体及びポリペプチドコンジュゲート
実施形態は、DC受容体、ポリペプチド及びペプチドに対する抗体及び抗体様分子であって、少なくとも1つの薬剤へと連結されて、抗体コンジュゲート又はペイロードを形成する抗体及び抗体様分子を提供する。診断剤又は治療剤としての抗体分子の有効性を増大させるためには、少なくとも1つの所望される分子又は部分を連結するか、又は共有結合的に結合させるか、又は複合体化させることが常套的である。このような分子又は部分は、少なくとも1つのエフェクター分子又はレポーター分子であり得るがこれらに限定されない。エフェクター分子は、所望される活性、例えば、細胞傷害活性又は免疫刺激活性を有する分子を含む。抗体へと接合させたエフェクター分子の非限定的な例は、アジュバント、毒素、治療的酵素、抗生剤放射性標識されたヌクレオチドなどを含む。これに対し、レポーター分子は、アッセイを使用して検出され得る任意の部分と定義される。抗体へとコンジュゲートさせたレポーター分子の非限定的な例は、酵素、放射性標識、ハプテン蛍光標識リン光発光分子化学発光分子発色団発光分子、光アフィニティー分子有色粒子又はビオチンなどのリガンドを含む。以下の米国特許出願:米国特許出願第12/024,036号明細書;同第12/024,897号明細書;同第12/025,010号明細書;同第12/026,095号明細書;同第12/036,138号明細書;同第12/036,158号明細書;同第12/504,463号明細書;同第12/717,778号明細書;同第12/717,789号明細書;同第12/717,804号明細書;同第12/718,365号明細書;同第12/882,052号明細書;同第12/882,052号明細書;同第13/100,684号明細書;同第13/208,993号明細書;同第13/269,951号明細書;同第13/282,112号明細書;同第13/415,564号明細書;同第13/424,582号明細書;同第13/430,206号明細書;同第13/594,397号明細書;同第13/596,526号明細書;国際公開第2010/104749号パンフレット、同第13/465,371号明細書、同第13/397,932号明細書;PCT特許出願第PCT/US13/72217号明細書;及びPCT特許出願第PCT/US2013/05839号明細書は、それらが、抗体、抗体の部分、抗原、リンカー、このような抗体、抗原及びリンカーの特異的配列、アジュバント、融合タンパク質又は治療用組成物の他の成分、宿主細胞又は組成物、樹状細胞の供給源並びに樹状細胞及び樹状細胞の派生物及び樹状細胞に由来する派生物の培養/活性化、並びにこのような融合タンパク質を伴う使用法について開示する程度に応じて、参照により組み込まれる。

0086

抗体コンジュゲートのある特定の例は、抗体を検出用標識へと連結したコンジュゲートである。「検出用標識」とは、それらの特異的な機能特性及び/又は化学的特徴のために、検出することができ、それらの使用により、それらを接合させた抗体の検出及び/又は、所望される場合の、さらなる定量化が可能となる、化合物及び/又はエレメントである。

0087

抗体コンジュゲートは、主にインビトロにおける使用のためであることが意図される抗体コンジュゲートであって、抗体を、発色性基質と接触させると、有色生成物をもたらす二次結合性リガンド及び/又は酵素(酵素タグ)へと連結した抗体コンジュゲートを含む。適切な酵素の例は、ウレアーゼアルカリホスファターゼ、(西ワサビ水素ペルオキシダーゼ又はグルコースオキシダーゼを含むがこれらに限定されない。好ましい二次結合性リガンドは、ビオチン及び/又はアビジン並びにストレプトアビジン化合物である。このような標識の使用は、当業者に周知であり、例えば、各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第3,817,837号明細書;同第3,850,752号明細書;同第3,939,350号明細書;同第3,996,345号明細書;同第4,277,437号明細書;同第4,275,149号明細書;及び同第4,366,241号明細書において記載されている。

0088

また、アジド基を含有する分子も、低強度の紫外光により発生する、反応性ニトレン中間体を介して、タンパク質への共有結合を形成するのに使用することができる(Potter& Haley, 1983)。特に、プリンヌクレオチドの2−アジドアナログ及び8−アジドアナログは、粗細胞抽出物中のヌクレオチド結合性タンパク質を同定する部位指向光プローブとして使用されている(Owens & Haley, 1987;Atherton et al., 1985)。2−アジドヌクレオチド及び8−アジドヌクレオチドはまた、精製タンパク質のヌクレオチド結合性ドメインマッピングするのにも使用されており(Khatoon et al., 1989;King et al., 1989;及びDholakia et al., 1989)、抗体結合剤として使用することもできる。

0089

当技術分野では、抗体の、そのコンジュゲート部分への接合又はコンジュゲーションのための複数の方法が公知である。一部の接合法は、例えば、抗体へと接合させた、ジエチレントリアミン五酢酸無水物(DTPA,diethylenetriaminepentaacetic acid anhydride);エチレントリアミン四酢酸;N−クロロ−p−トルエンスルホンアミド;及び/又はテトラクロロ−3−6−ジフェニルグリコウリル−3などの有機キレート剤を援用する金属キレート錯体の使用を伴う(各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第4,472,509号明細書及び同第4,938,948号明細書)。モノクローナル抗体はまた、グルタルアルデヒド又は過ヨウ素酸などのカップリング剤の存在下で、酵素と反応させることもできる。フルオレセインマーカーを伴うコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下で、又はイソチオシアン酸との反応を介して調製する。米国特許第4,938,948号明細書(参照により本明細書に組み込まれる)では、モノクローナル抗体を使用して、乳腺腫瘍イメージングを達成するが、検出用イメージング部分は、メチル−p−ヒドロキシベンズイミデート又はN−スクシンイミジル−3−(4−ヒドロキシフェニルプロピオネートなどのリンカーを使用して、抗体へと結合させる。

0090

一部の実施形態では、抗体結合性部位を変化させない反応条件を使用して、スルフヒドリル基を、免疫グロブリンのFc領域内に選択的に導入することによる、免疫グロブリンの誘導体化が想定される。この方法に従い産生される抗体コンジュゲートは、寿命、特異性及び感受性の改善を呈示することが開示されている(参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,196,066号明細書)。文献ではまた、エフェクター分子又はレポーター分子の部位特異的接合であって、レポーター分子又はエフェクター分子を、Fc領域内の炭水化物残基へとコンジュゲートさせる部位特異的接合も開示されている(参照により本明細書に組み込まれる、O'Shannessy et al., 1987)。この手法は、目下のところ臨床評価かけられている、診断的及び治療的に有望な抗体をもたらすことが報告されている。

0091

2.樹状細胞特異的抗体
ある特定の態様では、HPV抗原を樹状細胞へとターゲティングするのに使用される抗体は、樹状細胞特異的抗体であり、樹状細胞の受容体又は樹状細胞が発現する受容体に結合する。当技術分野では、この目的で使用し得る抗体の一部が公知である。

0092

一部の実施形態では、抗DCIR抗体を使用して、HPV抗原を樹状細胞へとターゲティングする。1つの例は、抗樹状細胞免疫受容体モノクローナル抗体コンジュゲートを含み、コンジュゲートは、抗体へとロードされるか、又は抗体へと化学的にカップリングさせた抗原性ペプチドを含む。このような抗体は、米国特許出願第61/332,465号明細書において記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。

0093

他の実施形態では、抗CD40抗体を使用して、HPV抗原を樹状細胞へとターゲティングする。抗CD40抗体の、1つの抗原性ペプチドを連結したワクチン及び抗原送達ベクターとしての発現、分泌及び使用のための、組成物及び方法については、開示されている全ての方法が、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第2010/104761号パンフレットにおいて記載されている。一部の実施形態では、抗CD40抗体は、モノクローナル抗体である、12E12、11B6又は12B4に由来する、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。他の実施形態では、抗CD40抗体は、モノクローナル抗体である、12E12、11B6又は12B4に由来する重鎖CDR及び軽鎖CDRを含む。

0094

ある特定の態様では、抗LOX−1抗体を使用して、HPV抗原を樹状細胞へとターゲティングする。このような抗体の1つの例を使用して、免疫細胞上のLOX−1受容体をターゲティングし、LOX−1を発現する抗原提示細胞による抗原提示の有効性を増大させることができる。このようなLOX−1抗体の例については、その内容が、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第2008/103953号パンフレットにおいて記載されている。

0095

他の態様では、抗CLEC−6抗体を使用して、HPV抗原を樹状細胞へとターゲティングする。このような抗体の1つの例は、CLEC−6を発現する抗原提示細胞による抗原提示の有効性を増大させるのに使用される抗CLEC−6抗体を含む。このような抗体については、国際公開第2008/103947号パンフレットにおいて記載されており、その方法及び内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

0096

さらに他の実施形態では、抗Dectin−1抗体を使用して、HPV抗原を樹状細胞へとターゲティングする。Dectin−1を発現する抗原提示細胞による抗原提示の有効性を増大させる抗Dectin−1抗体については、その内容が、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第2008/118587号パンフレットにおいて記載されている。

0097

ある特定の態様では、ペプチドリンカーを使用して、樹状細胞特異的抗体と、提示されるHPV抗原とを連結する。ペプチドリンカーにより、グリコシル化部位を組み込むこともでき、二次構造を導入することもできる。加えて、これらのリンカーにより、融合タンパク質の発現の効率又は安定性が増大し、結果として、樹状細胞に対する抗原提示の効率も増大する。このようなリンカーは、SSVSPTTSVHPTPTSVPPTPTKSSP(配列番号6);PTSTPADSSTITPTATPTATPTIKG(配列番号29);TVTPTATATPSAIVTTITPTATTKP(配列番号30);QTPTNTISVTPTNNSTPTNNSNPKPNP(配列番号5);又はTNGSITVAATAPTVTPTVNATPSAA(配列番号31)を含み得る。これらの例及び他の例については、その内容が、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第2010/104747号パンフレットにおいて論じられている。

0098

他の実施形態では、ワクチンの有効性を増強するために、免疫アジュバントを、樹状細胞特異的抗体へと直接融合させる。ある特定の態様では、免疫アジュバントは、toll様受容体(TLR,toll-like receptor)アゴニストであり得る。TLRアゴニストは、サルモネラ菌(Salmonella enterica)又はコレラ菌(Vibrio cholerae)に由来するフラジェリンを含む。TLRアゴニストは、ある特定のTLRクラスに特異的(すなわち、TLR2アゴニスト、TLR5アゴニスト、TLR7アゴニスト又はTLR9アゴニスト)であることが可能であり、任意の組合せで提示される場合もあり、任意の修飾体として提示される場合もある。このような免疫アジュバントの例は、それらの全ての内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第13/208,993号明細書、同第13/415,564号明細書、及び国際公開第2012/021834号パンフレットにおいて記載されている。米国特許出願公開第2012/0039,916号明細書及び同第2012/023,102号明細書は、それらが異なるTLRアゴニストを開示する程度に応じて、参照により組み込まれる。

0099

一部の実施形態では、樹状細胞抗体及びHPV抗原を含む組成物及び融合タンパク質を使用して、HPV関連疾患又はHPV関連病態を処置する。一部の実施形態では、HPV関連疾患は、異形成、良性新生物、前悪性新生物、又はがん(悪性新生物)である。一部の実施形態では、異形成、良性新生物、前悪性新生物、又はがんの影響を受ける組織又は臓器は、子宮頸部、外陰部、膣、陰茎、肛門、中咽頭、頭頸部、喉頭又は肺である。一部の具体的な実施形態では、HPV関連疾患又はHPV関連病態は、子宮頸部上内皮新生物(CIN,cervical intraepithelial neoplasia)、外陰部上内皮新生物(VIN,vulvar intraepithelial neoplasia)、陰茎上内皮新生物(PIN,penile intraepithelial neoplasia)、及び/又は肛門上内皮新生物(AIN,anal intraepithelial neoplasia)である。さらに他の実施形態では、樹状細胞抗体及びHPV抗原を含む組成物及び融合タンパク質を使用して、HPV関連常性疣贅足底疣贅、扁平疣贅、肛門性器疣贅、肛門病変性器がん、疣贅状表皮発育異常症上皮性過形成口腔)、口腔パピローマ口腔咽頭がん、疣贅性嚢胞又は喉頭乳頭腫症を処置する。

0100

III.処置法
上記で論じた通り、組成物及びこれらの組成物を使用する方法により、HPVと関連する感染又は関連疾患を有するか、これらを有することが疑われる、又はこれらを発症する危険性がある対象を、処置する(例えば、HPV感染又はHPV関連疾患を予防するか、又はHPV又はHPV関連疾患に対する強い免疫応答を惹起若しくは強化する)ことができる。

0101

本明細書で使用される「免疫応答」という語句、又はその同義語である「免疫性応答」とは、レシピエント患者における、本発明のタンパク質、ペプチド、又はポリペプチドを指向する、体液性(抗体介在性応答)、細胞性抗原特異的T細胞又はそれらの分泌産物により媒介される)応答又は体液性応答及び細胞性応答の両方を指す。処置又は治療は、免疫原の投与により誘導される能動免疫応答の場合もあり、抗体/抗原融合タンパク質を含む免疫原性組成物又はタンパク質組成物である、融合タンパク質組成物、抗体/抗原融合タンパク質を含有する物質、又はプライミングされたT細胞の投与により施される受動療法の場合もある。

0102

本明細書及び付属の特許請求の範囲の目的では、「エピトープ」及び「抗原性決定基」という用語を、B細胞及び/又はT細胞が応答するか又は認識する抗原上の部位を指すのに互換的に使用する。B細胞エピトープは、連続アミノ酸又はタンパク質の三次フォールディングにより並置される非連続アミノ酸のいずれからも形成され得る。連続アミノ酸から形成されるエピトープは、変性溶媒へと曝露しても保持されることが典型的であるのに対し、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、変性溶媒で処理されると失われることが典型的である。エピトープは、固有の空間的コンフォメーション内に、少なくとも3アミノ酸であり、より一般には、少なくとも5アミノ酸又は8〜10のアミノ酸を含むことが典型的である。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法は、Epitope MappingProtocols (1996)において記載されている方法を含む。T細胞は、CD8細胞で、約9アミノ酸の連続エピトープを認識するか、又はCD4細胞で、約13〜15アミノ酸の連続エピトープを認識する。エピトープを認識するT細胞は、エピトープに応答する、プライミングされたT細胞による3H−チミジン取込み(Burke et al., 1994)、抗原依存性殺滅(細胞傷害性Tリンパ球アッセイ;参照により組み込まれる、Tigges et al., 1996)又はサイトカイン分泌を介して決定される、抗原依存性増殖を測定するインビトロアッセイにより同定することができる。

0103

細胞介在性免疫性応答の存在は、増殖アッセイ(CD4(+)T細胞)又はCTL(細胞傷害性Tリンパ球)アッセイにより決定することができる。体液性応答及び細胞性応答の、免疫原による防御効果又は治療効果への相対的寄与は、免疫感作された同系動物からIgG及びT細胞を個別に単離し、第2の対象における防御効果又は治療効果を測定することにより識別することができる。本明細書及び特許請求の範囲で使用される「抗体」又は「免疫グロブリン」という用語は、互換的に使用される。

0104

任意選択で、抗体又は好ましくは抗体の免疫性部分は、他のタンパク質へと化学的にコンジュゲートすることもでき、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。本明細書及び付属の特許請求の範囲の目的では、全てのこのような融合タンパク質が、抗体又は抗体の免疫性部分の定義内に含まれる。

0105

一実施形態では、方法は、HPV病原体により引き起こされるか、又はこれにより引き起こされることが疑われる疾患又は状態のための処置を含む。ある特定の態様では、実施形態は、HPV陽性の個体からもたらされる感染など、HPV感染の処置法を含む。一部の実施形態では、処置は、HPV抗原の存在下で投与する。さらに、一部の例では、処置は、ウイルス感染に対して一般に使用される他の薬剤の投与を含む。

0106

治療用組成物は、剤形に適合的な方式で、治療的に有効な量で投与する。投与される量は、処置される対象に依存する。投与に要請される有効成分の正確な量は、医療従事者の判断に依存する。また、初回投与及びブーストに適するレジメも可変的であるが、初回投与の後における後続の投与が典型的である。

0107

適用の方式は、広範にわたり変化し得る。ポリペプチド治療剤の投与のための従来の方法のうちのいずれもが適用可能である。これらは、生理学的に許容される固体ベース上、又は生理学的に許容される分散液中経口適用、注射などによる非経口適用を含むと考えられる。組成物の投与量は、投与経路に依存し、対象の体格及び健康に従い変化するであろう。

0108

ある特定の場合には、組成物を複数回にわたり投与する、例えば、2、3、4、5、6又は7回以上にわたり投与することが所望されるであろう。投与は、これらの中の全ての範囲を含む、1、2、3、4、5、6、7、8、〜5、6、7、8、9、10、11、12週間隔であり得る。

0109

組合せ治療
組成物及び関連の方法、特に、DC受容体に結合し、1若しくは2以上のHPV抗原又は1若しくは2以上のペプチドを患者/対象へと送達する抗体の投与はまた、従来の抗ウイルス治療又は抗がん治療若しくは抗がん薬の投与と組み合わせて使用することもできる。これらは、侵入阻害剤CCR受容体アンタゴニストヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、プロテアーゼ阻害剤インテグラーゼ阻害剤及び成熟阻害剤を含むがこれらに限定されない。抗がん治療は、化学療法放射線療法又は照射療法を含むがこれらに限定されない。

0110

組成物及び関連の方法、特に、DC受容体に結合し、1若しくは2以上のHPV抗原又は1若しくは2以上のペプチドを患者/対象へと送達する抗体の投与はまた、アビラテロン酢酸エステル、Abitrexate(メトトレキサート)、Abraxane(アルブミンで安定化されたパクリタキセルナノ粒子製剤)、ABVD、ABVE、ABVE-PC、AC、AC-T、Adcetris(ブレツキシマブ・ベドチン)、ADE、Ado−トラスツズマブエムタンシン、Adriamycin(ドキソルビシン塩酸塩)、Adrucil(フルオロウラシル)、アファニブマレイン酸塩、Afinitor(エベロリムス)、Aldara(イミキモド)、アルデスロイキンアレムツズマブ、Alimta(ペメトレキセド二ナトリウム)、Aloxi(パロノセトロン塩酸塩)、Ambochlorin(クロランブシル)、Amboclorin(クロランブシル)、アミノレブリン酸アナストロゾールアプレピタント、Aredia(パミドロネート二ナトリウム)、Arimidex(アナストロゾール)、Aromasin(エキセメスタン)、Arranon(ネララビン)、三酸化ヒ素、Arzerra(オファツムマブ)、黒脚病菌(Erwinia chrysanthemi)アスパラギナーゼ、Avastin(ベバシズマブ)、アキシチニブアザシチジン、BEACOPP、ベンダムスチン塩酸塩、BEP、ベバシズマブ、ベキサロテン、Bexxar(トシツモマブ及びI131ヨウ素トシツモマブ)、ブレオマイシンボルテゾミブ、Bosulif(ボスチニブ)、ボスチニブ、ブレンツキシマブ・ベドチン、カバジタキセル、カボゼンチニブ−S−リンゴ酸、CAF、Campath(アレムツズマブ)、Camptosar(イリノテカン塩酸塩)、カペシタビンCAPOX、カルボプラチン、カルボプラチン−TAXOL、カルフィルミブ、CeeNU(ロムスチン)、Cerubidine(ダウノルビシン塩酸塩)、Cervarix(HPV16型及びHPV18型の組換えL1タンパク質を含む、組換えHPV二価ワクチン)、セツキシマブ、クロランブシル、クロランブシル−プレドニゾン、CHOP、シスプラチン、Clafen(シクロホスファミド)、クロファラビン、Clofarex(クロファラビン)、Clolar(クロファラビン)、CMF、Cometriq(カボゼンチニブ−S−リンゴ酸)、COPP、COPP-ABV、Cosmegen(ダクチノマイシン)、クリゾチニブCVP、シクロホスファミド、Cyfos(イホスファミド)、シタラビン、シタラビン、リポソーム剤、Cytosar-U(シタラビン)、Cytoxan(シクロホスファミド)、ダブラフェニブ、ダカルバジン、Dacogen(デシタビン)、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン塩酸塩、デシタビン、デガレリクスデニロイキンディフチクス、デノスマブ、DepoCyt(シタラビンのリポソーム剤)、DepoFoam(シタラビンのリポソーム剤)、デキスラゾキサン塩酸塩ドセタキセル、Doxil(ドキソルビシン塩酸塩のリポソーム剤)、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩のリポソーム剤、Dox-SL(ドキソルビシン塩酸塩のリポソーム剤)、DTIC-Dome(ダカルバジン)、Efudex(フルオロウラシル)、Elitek(ラスブリカーゼ)、Ellence(エピルビシン塩酸塩)、Eloxatin(オキサリプラチン)、エルトロンボパグオラミン、Emend(アプレピタント)、エンザルタミド、エピルビシン塩酸塩、EPOCH、Erbitux(セツキシマブ)、エリブリンメシル酸塩、Erivedge(ビスモデギブ)、エルロチニブ塩酸塩、Erwinaze(黒脚病菌アスパラギナーゼ)、Etopophos(エトポシドリン酸塩)、エトポシド、エトポシドリン酸塩、Evacet(ドキソルビシン塩酸塩のリポソーム剤)、エベロリムス、Evista(ラロキシフェン塩酸塩)、エキセメスタン、Fareston(トレミフェン)、Faslodex(フルベストラント)、FEC、Femara(レトロゾール)、フィルグラスチム、Fludara(フルダラビンリン酸塩)、フルダラビンリン酸塩、Fluoroplex(フルオロウラシル)、フルオロウラシル、Folex(メトトレキサート)、Folex PFS(メトトレキサート)、FOLFIRI、FOLFIRI−ベバシズマブ、FOLFIRI−セツキシマブ、FOLFIRINOX、FOLFOX、Folotyn(プララトレキサート)、FU-LV、フルベストラント、Gardasil(HPV6型、HPV11型、HPV16型、及びHPV18型の組換えL1タンパク質を含む、組換えHPV四価ワクチン)、Gazyva(オビヌツズマブ)、ゲフィチニブゲムシタビン塩酸塩ゲムシタビン−シスプラチン、ゲムシタビン−オキサリプラチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、Gemzar(ゲムシタビン塩酸塩)、Gilotrif(アファチニブ二マレイン酸塩)、Gleevec(イマチニブメシル酸塩)、グルカルピダーゼ、ゴセレリン酢酸塩、Halaven(エリブリンメシル酸塩)、Herceptin(トラスツズマブ)、組換えHPV二価ワクチン、組換えHPV四価ワクチン、Hycamtin(トポテカン塩酸塩)、イブリツモマブチウキセタン、イブルチニブ、ICE、Iclusig(ポナチニブ塩酸塩)、Ifex(イホスファミド)、イホスファミド、Ifosfamidum(イホスファミド)、イマチニブメシル酸塩、Imbruvica(イブルチニブ)、イミキモド、Inlyta(アキシチニブ)、Intron A(組換えインターフェロンアルファ−2b)、ヨウ素131トシツモマブ及びトシツモマブ、イピリムマブ、Iressa(ゲフィチニブ)、イリノテカン塩酸塩、Istodax(ロミデプシン)、イキサベピロン、Ixempra(イキサベピロン)、Jakafi(ルキソリチニブリン酸塩)、Jevtana(カバジタキセル)、Kadcyla(Ado−トラスツズマブ・エムタンシン)、Keoxifene(ラロキシフェン塩酸塩)、Kepivance(パリフルミン)、Kyprolis(カルフィルゾミブ)、ラパチニブ二トシル酸塩レナリドミド、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、Leukeran(クロランブシル)、酢酸ロイプロリド、Levulan(アミノレブリン酸)、Linfolizin(クロランブシル)、LipoDox(ドキソルビシン塩酸塩のリポソーム剤)、シタラビンのリポソーム剤、ロムスチン、Lupron(酢酸ロイプロリド)、Lupron Depot(酢酸ロイプロリド)、Lupron Depot-Ped(酢酸ロイプロリド)、Lupron Depot-3 Month(酢酸ロイプロリド)、Lupron Depot-4 Month(酢酸ロイプロリド)、Marqibo(ビンクリスチン硫酸塩のリポソーム剤)、Matulane(プロカルバジン塩酸塩)、メクロレタミン塩酸塩、Megace(酢酸メゲストロール)、酢酸メゲストロール、Mekinist(トラメチニブ)、メルカプトプリンメスナ、Mesnex(メスナ)、Methazolastone(テモゾロミド)、メトトレキサート、メトトレキサートLPF(メトトレキサート)、Mexate(メトトレキサート)、Mexate-AQ(メトトレキサート)、マイトマイシンC、Mitozytrex(マイトマイシンC)、MOPP、Mozobil(プレリキフォル)、Mustargen(メクロレタミン塩酸塩)、Mutamycin(マイトマイシンC)、Mylosar(アザシチジン)、Mylotarg(ゲムツズマブオゾガマイシン)、パクリタキセルのナノ粒子剤(アルブミンで安定化されたパクリタキセルのナノ粒子製剤)、ナベルビンビノレルビン酒石酸塩)、ネララビン、Neosar(シクロホスファミド)、Neupogen(フィルグラスチム)、Nexavar(ソラフェニブトシル酸塩)、ニロチニブ、Nolvadex(タモキシフェンクエン酸塩)、Nplate(ロミプロスチム)、オビヌツズマブ、オファツムマブ、オマセタキシンメペスクシネート、Oncaspar(ペガスパルガーゼ)、Ontak(デニロイキンディフチトクス)、OEPA、OPPA、オキサリプラチン、パクリタキセル、アルブミンで安定化されたパクリタキセルのナノ粒子製剤、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パミドロネート二ナトリウム、パニツムマブ、Paraplat(カルボプラチン)、Paraplatin(カルボプラチン)、パゾパニブ塩酸塩、ペガスパルガーゼ、ペグインターフェロンアルファ−2b、PEG-Intron(ペグインターフェロンアルファ−2b)、ペメトレキセド二ナトリウム、Perjeta(ペルツズマブ)、ペルツズマブ、Platinol(シスプラチン)、Platinol-AQ(シスプラチン)、プレリキサフォル、ポマリドミド、Pomalyst(ポマリドミド)、ポナチニブ塩酸塩、プララトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、Proleukin(アルデスロイキン)、Prolia(デノスマブ)、Promacta(エルトロンボパグオラミン)、Provenge(シプリューセル−T)、Purinethol(メルカプトプリン)、ラジウム223二塩化物、ラロキシフェン塩酸塩、ラスブリカーゼ、R-CHOP、R-CVP、組換えHPV二価ワクチン、組換えHPV四価ワクチン、組換えインターフェロンアルファ−2b、レゴラフェニブ、Revlimid(レナリドミド)、Rheumatrex(メトトレキサート)、Rituxan(リツキシマブ)、リツキシマブ、ロミデプシン、ロミプロスチム、Rubidomycin(ダウノルビシン塩酸塩)、ルキソリチニブリン酸塩、Sclerosol IntrapleuralAerosol(滑石)、シプリューセル−T、ソラフェニブトシル酸塩、Sprycel(ダサチニブ)、STANFORD V、Sterile Talc Powder(滑石)、Steritalc(滑石)、Stivarga(レゴラフェニブ)、スニチニブリンゴ酸塩、Sutent(スニチニブリンゴ酸塩)、Sylatron(ペグインターフェロンアルファ−2b)、Synovir(サリドマイド)、Synribo(オマセタキシンメペスクシネート)、TAC、Tafinlar(ダブラフェニブ)、滑石、タモキシフェンクエン酸塩、TarabinePFS(シタラビン)、Tarceva(エルロチニブ塩酸塩)、Targretin(ベキサロテン)、Tasigna(ニロチニブ)、Taxol(パクリタキセル)、Taxotere(ドセタキセル)、Temodar(テモゾロミド)、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、Thalomid(サリドマイド)、Toposar(エトポシド)、トポテカン塩酸塩、トレミフェン、Torisel(テムシロリムス)、トシツモマブ及びI131ヨウ素トシツモマブ、Totect(デキスラゾキサン塩酸塩)、トラメチニブ、トラスツズマブ、Treanda(ベンダムスチン塩酸塩)、Trisenox(三酸化ヒ素)、Tykerb(ラパチニブ二トシル酸塩)、バンデタニブ、VAMP、Vectibix(パニツムマブ)、VeIP、Velban(ビンブラスチン硫酸塩)、Velcade(ボルテゾミブ)、Velsar(ビンブラスチン硫酸塩)、ベムラフェニブ、VePesid(エトポシド)、Viadur(酢酸ロイプロリド)、Vidaza(アザシチジン)、ビンブラスチン硫酸塩、Vincasar PFS(ビンクリスチン硫酸塩)、ビンクリスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩のリポソーム剤、ビノレルビン酒石酸塩、ビスモデギブ、Voraxaze(グルカルピダーゼ)、ボリノスタット、Votrient(パゾパニブ塩酸塩)、Wellcovorin(ロイコボリンカルシウム)、Xalkori(クリゾチニブ)、ゼローダ(カペシタビン)、XELOX、Xgeva(デノスマブ)、Xofigo(ラジウム223二塩化物)、Xtandi(エンザルタミド)、Yervoy(イピリムマブ)、Zaltrap(Ziv−アフリベルセプト)、Zelboraf(ベムラフェニブ)、Zevalin(イブリツモマブチウキセタン)、Zinecard(デキスラゾキサン塩酸塩)、Ziv−アフリベルセプト、Zoladex(ゴセレリン酢酸塩)、ゾレドロン酸、Zolinza(ボリノスタット)、Zometa(ゾレドロン酸)及びZytiga(アビラテロン酢酸エステル)を含むがこれらに限定されない、1又は2以上の抗がん薬の投与と組み合わせて使用することもできる。

0111

組成物及び関連の方法、特に、DC受容体に結合し、1若しくは2以上のHPV抗原又は1若しくは2以上のペプチドを患者/対象へと送達する抗体の投与はまた、X線ガンマ線、及び帯電粒子を含むがこれらに限定されない、照射療法の投与と組み合わせて使用することもできる。照射は、体外機器により送達することもでき(外照射療法)、体内のがん細胞近傍に配置された放射性物質から施すこともできる(内照射療法又は小線源療法)。内照射療法は、全身療法(例えば、放射性ヨウ素療法)であり得る。外照射療法は、三次元原体照射療法(3D−CRT,3-dimensional conformal radiation therapy)、強度変調照射療法(IMRT,intensity-modulated radiation therapy)、画像誘導照射療法(IGRT,image-guided radiation therapy)、トモセラピー定位放射線手術SRS,stereotactic radiosurgery)、体幹部定位照射療法(SBRT,stereotactic body radiation therapy)、陽子線療法又は他の帯電粒子ビーム(例えば、電子ビーム)を含み得るがこれらに限定されない。内照射療法又は小線源療法は、腫瘍組織内に配置された照射線源を使用し、外照射より高線量を送達しながら、正常組織に対して引き起こす損傷は小さくするのに使用し得る、間質小線源療法を含み得る。小線源療法は、低線量率の処置として施すこともでき、高線量率の処置として施すこともできる。さらなる実施形態では、小線源療法は、恒常的な場合もあり、一時的な場合もある。照射療法は、全身照射療法を含み得る。全身照射療法は、嚥下又は注射された放射性物質であって、放射性ヨウ素(131I)、イブリツモマブチウキセタン(Zevalin(登録商標))、131トシツモマブ(Bexxar(登録商標))、サマリウム−153−レキシドロナム(Quadramet(登録商標))及びストロンチウム−89塩化物(Metastron(登録商標))又は放射性物質へと結合させた任意のモノクローナル抗体の任意の単回投与複数回投与又は組合せ投与を含むがこれらに限定されない放射性物質を含み得る。異なる実施形態に従う照射線量は、処置される具体的な疾患、状態又はがんに合わせて調整することができる。一部の実施形態では、単回の線量又は総線量は、1〜10グレイGy,gray)、10〜20Gy、20〜40Gy、40〜60Gy、又は60〜80Gy、又は任意の値若しくはその中で導出される範囲であり得る。一部の実施形態では、照射療法又は照射線量は、分割することができる。一実施形態では、総線量は、1日当たりの線量又は1週間当たりの線量へと分割することができる。ある特定の実施形態では1日当たりの分割線量は、1.8〜2Gyであり得る。総線量は、0.1Gy〜10Gyの範囲で、1日当たりの線量又は1週間当たりの線量へと分割し得ることが想定される。

0112

一態様では、治療は、抗ウイルス治療又は抗がん治療と共に使用されることが想定される。代替的に、治療は、数分間〜数週間の範囲の間隔で、他の薬剤処置先行又は後続する場合もある。他の薬剤及び/又はタンパク質又はポリヌクレオチドが個別に投与される実施形態では一般に、治療用組成物が、組合せ効果の利点を対象へと及ぼすことがなおも可能であるように、各送達時点の間でそれほどの期間が経過しないことが確認されるであろう。このような場合、両方のモダリティーの投与が、互いから約12〜24時間以内になされ、より好ましくは、互いから約6〜12時間以内になされることが想定される。しかし、状況によっては、投与期間を著明に延長することも所望され、この場合は、それぞれの投与の間で、数日間(2、3、4、5、6又は7日間)〜数週間(1、2、3、4、5、6、7又は8週間)が経過する。

0113

さらに別の態様では、ワクチンは、プライム/ブースト戦略の一部として投与することができる。プライミングワクチン用量は、本明細書で記載される実施形態のうちのいずれかにおける、HPV抗原に融合したDC特異的抗体を使用して投与することができる。ワクチンブーストは、同じ種類又は異なる種類のワクチンである第2のワクチンの使用を介して投与することができる。別個のHPVワクチンの例は、Gardasil(商標)(HPV6型、HPV11型、HPV16型、及びHPV18型の組換えL1タンパク質を含む、組換えHPV四価ワクチン)又はCervarix(商標)(HPV16型及びHPV18型の組換えL1タンパク質を含む、組換えHPV二価ワクチン)を含む。このような異なるワクチンのさらなる例は、ネイキッドのDNAワクチン又は組換えウイルスを含む。第2のワクチンは、第1のワクチン中で使用し得るE6又はE7抗原とは別に、さらなるHPV抗原を含み得る。また、第2のワクチンは、直接連結されるか、又は独立に投与される、アジュバントを加えたE6タンパク質又はE7タンパク質など、HPVタンパク質を含み得ることも想定される。

0114

治療の多様な組合せ、例えば、抗ウイルス治療又は抗がん治療は、「A」であり、DC受容体に結合し、HPV抗原又はそのペプチド若しくはコンセンサスペプチドを送達する抗体を含む抗体ワクチンは、「B」である:
A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/Aを援用することができる。

0115

抗体組成物の、患者/対象への投与は、存在する場合は、組成物の毒性を考慮に入れて、このような化合物の投与のための一般的なプロトコールに従う。処置サイクルは、必要に応じて繰り返されることが予測される。また、補液など、多様な標準的治療を、記載される治療と組み合わせて適用し得ることも想定される。

0116

一般的な医薬組成物
一部の実施形態では、医薬組成物を、対象へと投与する。異なる態様は、有効量の組成物を対象へと投与するステップを伴い得る。一部の実施形態では、DC受容体に結合し、HPV抗原又はそのペプチド若しくはコンセンサスペプチドを送達する抗体を、患者へと投与して、1又は2以上のHPV型による感染に対して防御するか又はこの感染を処置することもでき、がんなど、1又は2以上のHPV関連疾患に対して防御するか又は処置することもできる。代替的に、1又は2以上のこのような抗体又はポリペプチド若しくはペプチドをコードする発現ベクターを、患者へと、予防的処置として施すこともできる。加えて、このような組成物は、抗生剤、抗ウイルス剤又は抗がん剤と組み合わせて投与することもできる。このような組成物は一般に、薬学的に許容される担体中又は水性媒体中溶存又は分散させる。

0117

「薬学的に許容される」又は「薬理学的に許容可能な」という語句は、動物又はヒトへと投与される場合に有害な反応、アレルギー反応、又は他の望ましくない反応をもたらさない分子実体及び組成物を指す。本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」は、任意の及び全ての溶媒、分散媒コーティング抗菌剤及び抗真菌剤等張剤及び吸収遅延剤などを含む。当技術分野では、このような媒体及び薬剤の、医薬活性物質のための使用が周知である。従来の媒体又は薬剤が、有効成分と適合的でない場合を除き、免疫原性組成物中及び治療用組成物中のその使用が想定される。また、他の抗感染剤及びワクチンなど、補助的な有効成分も、組成物へと組み込むことができる。

0118

活性化合物は、非経口投与用に製剤化することができ、例えば、経粘膜経路、静脈内経路、筋内経路、皮下経路、腫瘍内経路なお又は腹腔内経路を介する注射用に製剤化することができる。このような組成物は、溶液又は懸濁液として調製することもでき、また、注射前の液体添加時に溶液又は懸濁液を調製する使用に適する固体形態も調製することができ、また、調製物乳化させることもできることが典型的である。

0119

注射用の使用に適する医薬形態は、滅菌水溶液又は滅菌水性分散液;ゴマ油ラッカセイ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤;及び滅菌注射用溶液又は滅菌注射用分散液の即席調製のための滅菌粉末を含む。全ての場合において、形態は、滅菌でなければならず、それが容易に注射され得る程度に流体でなければならない。また、形態は、製造条件下及び保管条件下で安定でもあるものとし、細菌及び真菌などの微生物による汚染作用に対して保全されなければならない。

0120

タンパク質性組成物は、中性形態又は塩形態で製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、酸添加塩(タンパク質の遊離アミノ基により形成される)を含み、これらは、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸シュウ酸酒石酸マンデリン酸などの有機酸により形成される。遊離カルボキシル基により形成される塩はまた、例えば、ナトリウムカリウムアンモニウムカルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基から導出することもでき、イソプロピルアミントリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から導出することもできる。

0121

医薬組成物は、例えば、水、エタノールポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、これらの適切な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒を含み得る。適正な流体性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散液の場合は、要請される粒子サイズを維持することにより維持することができ、界面活性剤を使用することにより維持することもできる。微生物の作用の予防は、例えば、パラベンクロロブタノールフェノールソルビン酸チメロサールなど、多様な抗菌剤及び抗真菌剤によりもたらすことができる。多くの場合、医薬組成物は、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射用組成物持続吸収は、組成物中で、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することによりもたらすことができる。

0122

滅菌注射用溶液は、活性化合物を、要請される量で、適切な溶媒中に、要請に応じて、上記で列挙した他の多様な成分と共に組み込んだ後で、濾過滅菌又は同等な手順を施すことにより調製する。一般に、分散液は、多様な滅菌有効成分を、基本分散媒と、例えば、上記で列挙した成分に由来する、要請される他の成分とを含有する滅菌媒体へと組み込むことにより調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、そのあらかじめ滅菌濾過された溶液に由来する、任意のさらなる所望の成分を加えた有効成分の粉末をもたらす、真空乾燥法及び凍結乾燥法を含む。

0123

組成物の投与は、任意の一般的な経路を介することが典型的である。これは、経口投与経鼻投与、又は口腔内投与を含むがこれらに限定されない。代替的に、投与は、同所注射、皮内注射皮下注射、筋内注射、腹腔内注射、腫瘍内注射、鼻腔内注射、又は静脈内注射であり得る。ある特定の実施形態では、ワクチン組成物は、吸入することができる(例えば、参照により具体的に組み込まれる、米国特許第6,651,655号明細書)。このような組成物は通常、生理学的に許容される担体、緩衝剤又は他の賦形剤を含む、薬学的に許容される組成物として投与されるであろう。

0124

治療用組成物又は予防用組成物の有効量は、意図される目的に基づき決定する。「単位用量」又は「投与量」という用語は、対象における適切な使用のための、物理的に個別の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち、適切な経路及びレジメンと関連して、上記で論じた所望の応答をもたらすように計算された、所定量の組成物を含有する。処置の回数及び単位用量の両方に従う投与量は、所望される防御に依存する。

0125

組成物の正確な量はまた、医療従事者の判断にも依存し、各個体にも特有である。用量に影響を及ぼす因子は、対象の全身状態及び臨床状態、投与経路、意図される処置目的(治癒と対比される症状の緩和)、並びに特定の組成物の効力、安定性、及び毒性を含む。

0126

製剤化したら、溶液を、剤形と適合的な方式及び治療的又は予防的に有効となるような量で投与する。製剤は、上記で記載した注射用溶液の種類など、様々な剤形で容易に投与される。
[実施例]

0127

IV.実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明示する目的で組み入れられる。当業者は、以下の実施例で開示される技法が、本発明者により、本発明を実施するのに良好に機能することが発見され、これにより、その実施に好ましい方式を構成すると考え得る技法を表すことを認識されたい。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態において、多くの変化を施すことができ、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、なおも同様又は類似の結果を得ることができることを認識されたい。

0128

抗DC受容体(DCR,DC receptor)とHPVE6との組換え融合タンパク質及びE6融合タンパク質
HPV16及びHPV18に由来するE6配列及びE7配列に融合した抗DC受容体抗体を産生するための発現コンストラクトの開発のための、本発明者らによるスキームを図1に示す。スキームにより、HPV16及びHPV18に由来するE6及びE7をコードする抗原カセットであって、効率的に分泌され、H鎖のC末端に融合するとインタクトとなる抗原カセットの順序が同定される。これら4つの配列だけについても、64の可能な組合せが存在し、フレキシブルリンカー配列を散在させる場合は極めてより多くの組合せが存在する。本発明者らの戦略は、フレキシブルリンカーを前置させる各抗原単独、及びこれを前置させない各抗原単独[8つの初期コンストラクト]から出発し、次いで、さらなるカセットへの付加のために、発現が最も効率的なベクターを選択する段階的な手法である。構築及び試験の各サイクルには、1週間を要する。インビトロのヒト及びインビボの動物における前臨床研究に照らした、ワクチンの産生に適するレベルまでのスケールアップを含む最終産生CHO−S細胞株の確立には、さらに8週間を要する。

0129

抗体重鎖をコードする一過性発現ベクターは、インフレームのNhe I部位をC末端に有し、Spe I-Not Iカセットをコードする抗原又はフレキシブルリンカーが、ベクターのNheI部位とNot I部位との間に挿入される。ベクターのNhe I部位は、このライゲーションで失われるが、各カセットは、新たなC末端のインフレームNhe I部位をコードする。したがって、さらなる抗原又はリンカーのカセットを、繰り返し付加することができる。新たなコンストラクトの各々は、マッチする軽鎖ベクターと共に、293F細胞へと一過性にトランスフェクトし、72時間後、分泌されたワクチンを、プロテインAアフィニティー法により単離し、SDS.PAGEにより解析した。発現の良好なコンストラクトは、新たなカセットを付加するのに好ましいベクターである(図1)。

0130

本発明者らは、HPV16 E6配列及びHPV16 E7配列並びにHPV18 E6配列及びHPV18 E7配列を抗体重鎖のC末端に融合させた発現コンストラクトを設計した。HPV16 E6配列若しくはHPV18 E6配列又はHPV16 E7配列若しくはHPV18 E7配列を抗樹状細胞受容体抗体重鎖のC末端コドンへと直接融合させたコンストラクトを、マッチする軽鎖発現ベクターと共に、293F細胞へと共トランスフェクトしたところ、検出用ワクチンを分泌できなかった(図示しない)。しかし、フレキシブルリンカー配列(Flex v1)を組み込む同様のベクターは、ワクチンを分泌した(図2レーン1及び3)。さらにまた、HPV E6をFlex v1 HPV E7ベクターへと付加するコンストラクト、及びこれと逆のコンストラクトも、ワクチンを分泌した(図2、レーン2及び4)。このようなワクチンの発現の成功は、可変領域の配列に依存しない。こうして、Flex v1−HPV E6/E7配列を、抗CD40抗体−Flex v1−HPV16 E6−HPV16 E7又は抗CD40抗体−Flex v1−HPV18 E6−HPV16 E7、抗ランゲリン抗体−Flex v1−HPV16 E6−HPV16 E7又は抗ランゲリン抗体−Flex v1−HPV18 E6−HPV16 E7及び対照hIgG4−Flex v1−HPV16 E6−HPV16 E7又は対照hIgG4−Flex v1−HPV18 E6−HPV16 E7の、CHO−S細胞内の安定的な発現のために確立されたベクターへと移入した。

0131

抗CD40抗体−HPV16.E6/7は、健常ドナー末梢血中のDCに効率的に結合し得る。末梢血単核細胞(PBMC,peripheral blood mononuclear cell)は、健常個体の血液から得た。PBMCを、異なる量の抗CD40抗体−HPV16.E6/7又は対照IgG4−HPV16.E6/7タンパク質の存在下、上で15分間にわたりインキュベートした。細胞を十分に洗浄し、次いで、抗E6/7抗体で染色して、細胞表面結合タンパク質を検出した。図3において示される通り、抗CD40抗体−HPV16.E6/7は、ヒト血中DC(CD3−CD19−CD14−HLA−DR+CD11c+)に効率的に結合し得る。これに対し、IgG4−HPV16.E6/7は、同じDCに結合しなかった。また、抗CD40抗体−HPV18.E6/7も、健常ドナーの末梢血中のDCに結合した(データは図示しない)。

0132

抗CD40抗体−HPV16.E6/7は、HPV関連がん患者に由来するE6/7特異的メモリーCD4+T細胞及びE6/7特異的CD8+T細胞を効率的に活性化させ得る。次に、HPV陽性頭頸部がん患者に由来するPBMCを使用して、抗CD40抗体−HPV16.E6/7のインビトロにおける免疫原性について評価した。患者のPBMCに、組換えHPV16.E6/7タンパク質、抗CD40抗体−HPV16.E6/7、又はHPV16.E6/7タンパク質のペプチドプールをロードした。この実験では、各タンパク質中に同じモル濃度のE6/7を適用して、E6/7特異的IFNgを発現するCD4+T細胞応答及びCD8+T細胞応答のレベルを比較した。インビトロにおける培養の7日後、PBMCを、ブレフェルジンAの存在下にあるE6/7のペプチドプールで、5時間にわたり再刺激し、次いで、細胞を、IFNg発現について染色した。図4は、抗CD40抗体−HPV16.E6/7が、IFNg+CD4+T細胞応答及びIFNg+CD8+T細胞応答の誘発において、HPV16.E6/7より効率的であったことを示す。抗CD40抗体−HPV16.E6/7により誘発されるHPV16.E6/7特異的IFNg+CD4+T細胞応答のレベルは、陽性対照として使用されたペプチドプールにより誘発されるレベルと同様であった。したがって、抗DCRとE6/7を含むHPV抗原とから構成される、本発明者らの新たなワクチンモデルは、HPV関連がんを有する患者における、抗原特異的細胞性免疫応答を活性化させるのに非常に有効である。さらに、このようなHPV抗原(E6及びE7)特異的CD8+CTLは、腫瘍の進行を効率的に抑制することが期待され、その結果として、患者における腫瘍の除去をもたらし得るであろう。

0133

抗CD40抗体−HPV16.E6/7は、インビボにおいて、E6/7特異的なCD4+T細胞応答及びCD8+T細胞応答をプライミングし得る。抗CD40抗体−HPV16.E6/7ワクチンのインビボにおける免疫原性について調べるため、ヒトCD40トランスジェニックマウスを使用した。0日目に、5匹の動物を、ポリICを加えた30ugの抗CD40抗体−HPV16.E6/7で、s.c.免疫感作し、次いで、同じワクチンを2回にわたりブーストした。2回目のブースト後7日目に、CD4+T細胞及びCD8+T細胞を、脾臓から精製し、次いで、HPV16.E6/7ペプチドクラスター1〜5、免疫原なし、前立腺特異的抗原(PSA,prostate specific antigen)のペプチドプール、又はHPV16.E6/7のペプチドプールのうちの1つで再刺激した。図5は、抗CD40抗体−HPV16.E6/7が、ヒトCD40トランスジェニックマウスにおいて、HPV16 E6/7ペプチドクラスター2及び3に特異的なCD4+T細胞応答並びにクラスター5特異的CD8+T細胞応答を誘導することを示す。重要なことは、E6/7特異的CD8+T細胞応答のレベルが、E6/7特異的CD4+T細胞応答のレベルより高いことである。これは、抗CD40抗体−HPV16.E6/7ワクチンが、特に、HPV感染細胞及びHPV感染腫瘍細胞を死滅させ得るCD8+CTLを誘発するのに効率的であることを指し示す。図5の各ドットは、単一のマウスについて作成されたデータを表す。

0134

抗CD40抗体−HPV16.E6/7は、ヒトCD40トランスジェニックマウスにおけるTC−1腫瘍の進行を抑制し得る。ポリICを加えた抗CD40抗体−HPV16.E6/7ワクチンの有効性を、TC−1を負荷された(challenged)ヒトCD40トランスジェニックマウスにおいて調べた。0日目に、2群の動物(1群当たりのマウスを5匹とする、ヒトCD40+マウス及びヒトCD40−マウス)に、TC−1腫瘍細胞株を皮下に負荷した。6及び12日目に、動物を、ポリICを加えた抗CD40抗体−HPV.E6/7で免疫感作した。腫瘍の進行について評価し、図6に提示した。TC−1負荷後14日目までに、ヒトCD40+マウス及びヒトCD40−マウスのいずれも、類似サイズの腫瘍を発症した。ヒトCD40−動物では、TC−1腫瘍は、急速に進行し、負荷後25日目に、1000mm3に達した。しかし、ヒトCD40+マウスにおけるTC−1腫瘍の進行は、著明に遅延した。本発明者らのデータは、抗CD40抗体−HPV16.E6/7ワクチンが、ヒトCD40をターゲティングし、これにより、図5において示される通り、動物におけるTC−1腫瘍の進行を抑制する、E6/7特異的CD8+CTLを誘発することを裏付ける。

0135

ポリIC、モンタナイドを加えたポリIC、モンタナイドを加えたGM−CSF、及びモンタナイド単独の、抗CD40抗体−HPV.E6/7ワクチンの免疫原性に対する効果を、ヒトCD40トランスジェニックマウスにおいて調べた。各群内4匹ずつの動物を、30ugの抗CD40抗体−HPV.E6/7単独又は表示のアジュバントを伴う抗CD40抗体−HPV16.E6/7でs.c.免疫感作した(図7)。7日後、個々の動物に由来する血液を採取し、四量体で染色した。下記の図に示される通り、ポリICは、抗CD40抗体−HPV16.E6/7特異的CD8+T細胞応答を有効に促進することが可能であった。モンタナイド単独又はモンタナイドを加えたGM−CSFは、E6/7特異的CD8+T細胞応答をそれほど促進しなかった。

0136

下記の配列は、ヒト化12E12抗ヒトCD40VK2 VH2抗体に基づく(タンパク質配列は、成熟分泌タンパク質配列であることが予測され、DNA配列は、イニシエーターATG配列及びリーダーペプチド領域を含む)。代替的に、HPV18配列を、VK2鎖のC末端へとグラフトし、これを、VH2H鎖上のHPV16配列と組み合わせることにより、広範なスペクトルにわたるワクチンを産生することができる。

0137

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