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図面 (12)

課題

ウシの極めて長いCDR3を含む抗体を含むヒト化抗体およびその使用を提供する。

解決手段

細菌、ウイルス、またはバクテリオファージ等のベクターを含む宿主細胞を使用し、極めて長いCDR3配列を含む、BLV1H12、BLV5B8、BLV5D3、BLV8C11、BF4E9、BF1H1、またはF18と命名されたウシ由来の例示的な抗体可変領域配列の配列アライメントを含む。CDR3配列との使用に適している、VH-ULと命名されたウシ生殖系列重鎖可変領域(VH)配列、及びBLV1H12と命名されたウシ軽鎖可変領域配列を含む。

概要

背景

背景
抗体は、主に感染に対する防御のために、脊椎動物免疫系が外来物質抗原)に応答して形成する天然タンパク質である。1世紀以上もの間、抗体は、人工条件下において動物誘導され、疾患状態治療もしくは診断における使用のため、または生物学的研究のために回収されてきた。個々の抗体産生細胞はそれぞれ、組成既知の単一の型の抗体を産生するが、抗原接種に応答して動物血清から直接得られた抗体は、実際には、個々の抗体産生細胞の集合物から作られた同一でない分子の集合物(すなわち、ポリクローナル抗体)を含む。

一部のウシ抗体は、他の脊椎動物と比較して異常に長いVHCDR3配列を有する。例えば、IgMの約10%は「極めて長い」CDR3配列を含み、この配列は最長で61アミノ酸長であってもよい。これらの異常なCDR3は、複数のシステインを有する場合が多い。機能的なVH遺伝子は、V(D)J組換えと称されるプロセスを通じて生じ、ここではD領域がCDR3のかなりの割合をコードする。極めて長い配列をコードする特有のD領域がウシで同定された。極めて長いCDR3はウシゲノムにおいて部分的にコードされ、それらの抗体レパートリーについて、ヒトと比較して特有の特徴を提供する。Kaushik et al.(米国特許第6,740,747号(特許文献1)および第7,196,185号(特許文献2))は、プローブとして有用であると述べられている、ウシに特有のいくつかのウシ生殖系列D遺伝子配列、およびワクチンベクターとして有用であると述べられているVDJカセットを開示している。

概要

ウシの極めて長いCDR3を含む抗体を含むヒト化抗体およびその使用を提供する。細菌、ウイルス、またはバクテリオファージ等のベクターを含む宿主細胞を使用し、極めて長いCDR3配列を含む、BLV1H12、BLV5B8、BLV5D3、BLV8C11、BF4E9、BF1H1、またはF18と命名されたウシ由来の例示的な抗体可変領域配列の配列アライメントを含む。CDR3配列との使用に適している、VH-ULと命名されたウシ生殖系列重鎖可変領域(VH)配列、及びBLV1H12と命名されたウシ軽鎖可変領域配列を含む。

目的

極めて長いCDR3はウシゲノムにおいて部分的にコードされ、それらの抗体レパートリーについて、ヒトと比較して特有の特徴を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

本願の明細書に記載される発明。

技術分野

0001

関連特許出願の相互参照
本出願は、2012年1月9日に出願された米国仮特許出願第61/584,680号の恩典を主張し、これは全体として参照により本明細書に組み入れられる。

0002

分野
本開示は、極めて長いCDR3を含む抗体を含むヒト化抗体に関する。

背景技術

0003

背景
抗体は、主に感染に対する防御のために、脊椎動物免疫系が外来物質抗原)に応答して形成する天然タンパク質である。1世紀以上もの間、抗体は、人工条件下において動物誘導され、疾患状態治療もしくは診断における使用のため、または生物学的研究のために回収されてきた。個々の抗体産生細胞はそれぞれ、組成既知の単一の型の抗体を産生するが、抗原接種に応答して動物血清から直接得られた抗体は、実際には、個々の抗体産生細胞の集合物から作られた同一でない分子の集合物(すなわち、ポリクローナル抗体)を含む。

0004

一部のウシ抗体は、他の脊椎動物と比較して異常に長いVHCDR3配列を有する。例えば、IgMの約10%は「極めて長い」CDR3配列を含み、この配列は最長で61アミノ酸長であってもよい。これらの異常なCDR3は、複数のシステインを有する場合が多い。機能的なVH遺伝子は、V(D)J組換えと称されるプロセスを通じて生じ、ここではD領域がCDR3のかなりの割合をコードする。極めて長い配列をコードする特有のD領域がウシで同定された。極めて長いCDR3はウシゲノムにおいて部分的にコードされ、それらの抗体レパートリーについて、ヒトと比較して特有の特徴を提供する。Kaushik et al.(米国特許第6,740,747号(特許文献1)および第7,196,185号(特許文献2))は、プローブとして有用であると述べられている、ウシに特有のいくつかのウシ生殖系列D遺伝子配列、およびワクチンベクターとして有用であると述べられているVDJカセットを開示している。

先行技術

0005

米国特許第6,740,747号
米国特許第7,196,185号

0006

概要
本開示は、極めて長いCDR3を含む抗体を含むヒト化抗体、それを作製する方法、およびその使用を提供する。

0007

本開示は、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片を提供する。

0008

いくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、1つまたは複数のヒト可変領域フレームワーク配列を含む。

0009

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、35アミノ酸長以上、40アミノ酸長以上、45アミノ酸長以上、50アミノ酸長以上、55アミノ酸長以上、または60アミノ酸長以上である。

0010

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は35アミノ酸長以上である。

0011

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、3個以上のシステイン残基、4個以上のシステイン残基、5個以上のシステイン残基、6個以上のシステイン残基、7個以上のシステイン残基、8個以上のシステイン残基、9個以上のシステイン残基、10個以上のシステイン残基、11個以上のシステイン残基、または12個以上のシステイン残基を含む。

0012

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は3個以上のシステイン残基を含む。

0013

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片はシステインモチーフを含む。

0014

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、システインモチーフは、

からなる群より選択される。

0015

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、システインモチーフは、

からなる群より選択される。

0016

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は2〜6個のジスルフィド結合を含む。

0017

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3はSEQID NO: 40またはその誘導体を含む。

0018

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、SEQID NO: 1〜4のうちのいずれか1つのアミノ酸残基3〜6を含む。

0019

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は非ヒトDHまたはその誘導体を含む。

0020

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、非ヒトDHは、SEQID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、またはSEQ ID NO: 12である。

0021

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3はJH配列またはその誘導体を含む。

0022

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、JH配列は、SEQID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、またはSEQ ID NO: 17である。

0023

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、非ヒトもしくはヒトVH配列(例えば生殖系列VH)またはその誘導体;非ヒトDH配列またはその誘導体;および/あるいはJH配列またはその誘導体を含む。

0024

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、VH配列とDH配列との間に位置する2〜6個またはそれより多いアミノ酸残基を含む付加的なアミノ酸配列を含む。

0025

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、付加的なアミノ酸配列は、IR、IF、SEQID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、またはSEQ ID NO: 21からなる群より選択される。

0026

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、SEQID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、またはSEQ ID NO: 28に由来するかまたはこれらに基づく配列を含む。

0027

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は非ウシ配列または非抗体配列を含む。

0028

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、非抗体配列は合成配列である。

0029

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、非抗体配列は、サイトカイン配列、リンホカイン配列、ケモカイン配列、増殖因子配列、ホルモン配列、または毒素配列である。

0030

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、非抗体配列は、IL-8配列、IL-21配列、SDF-1(α) 配列、ソマトスタチン配列、クロロトキシン配列、Pro-TxII配列、またはジコノチド配列である。

0031

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、非抗体配列はSEQID NO: 475〜481のうちのいずれか1つである。

0032

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、非抗体配列は、極めて長いCDR3の少なくとも一部と置き換わっている。

0033

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、X1X2X3X4X5モチーフ
(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) である)
を含む。

0034

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、X1X2X3X4X5モチーフは、

である。

0035

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3はCX1X2X3X4X5モチーフを含む。

0036

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CX1X2X3X4X5モチーフは、

である。

0037

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、(XaXb)zモチーフ
(式中、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン(H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、かつzは1〜4である)
を含む。

0038

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、(XaXb)zモチーフは、

である。

0039

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、(XaXb)zモチーフはYXYXYXである。

0040

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、X1X2X3X4X5Xnモチーフ
(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、X5はグルタミン(Q) であり、かつnは27〜54である)
を含む。

0041

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、Xn(XaXb)zモチーフ
(式中、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン(H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、nは27〜54であり、かつzは1〜4である)
を含む。

0042

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、X1X2X3X4X5Xn(XaXb)zモチーフ
(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) であり、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン (Y)、フェニルアラニン (F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン (H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、nは27〜54であり、かつzは1〜4である)
を含む。

0043

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、X1X2X3X4X5モチーフはTTVHQ (SEQID NO: 153) またはTSVHQ (SEQ ID NO: 154)であり、かつ (XaXb)zモチーフはYXYXYXである。

0044

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、CX1X2X3X4X5モチーフ(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) である)、以下からなる群より選択されるシステインモチーフ:

、(XaXb)zモチーフ(式中、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン (Y)、フェニルアラニン (F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン (H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、かつzは1〜4である)を含む。

0045

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、CX1X2X3X4X5モチーフ(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) である);以下からなる群より選択されるシステインモチーフ:

;ならびに(XaXb)zモチーフ(式中、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン (Y)、フェニルアラニン (F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン (H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、かつzは1〜4である)を含む。

0046

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、リンカーである付加的な配列を含む。

0047

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、リンカーは、非抗体配列のC末端N末端、またはC末端およびN末端の両方に連結されている。

0048

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は反芻動物のCDR3である。

0049

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、反芻動物はウシである。

0050

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、ヒト重鎖可変領域フレームワーク配列を含む。

0051

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、ヒト重鎖生殖系列配列を含むか、またはヒト重鎖生殖系列配列に由来する。

0052

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、VH4ファミリーメンバー生殖系列配列であるヒト重鎖生殖系列配列を含む。

0053

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、VH4-34生殖系列配列を含む。

0054

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、VH4-34生殖系列配列に由来するヒト重鎖生殖系列配列を含む。

0055

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、VH4-34生殖系列配列は、Kabat番号付けに基づくGly31AspおよびTyr32Lys置換を含むCDR1を含む。

0056

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、VH4-34生殖系列配列は、Kabat番号付けに基づくGlu50Ser置換を含むCDR2を含む。

0057

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、VH4-34生殖系列配列は、Kabat番号付けに基づく、Ala23Thr、Val24Ala、Tyr25Ser、Gly27Phe、Phe29Leu、Gly31Asp、Tyr32Lys、Tyr33Ala、Trp34Val、およびSer35Gly置換を含むCDR1、ならびにIle48Leu、Glu50Ser、Asn52Asp、His53Thr、Ser54Gly、Ser56Asn、およびAsn58Gly置換を含むCDR2を含む。

0058

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、SEQID NO: 461、462、463、464、465、466、467、468、または469に記載されるアミノ酸配列を含む。

0059

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、SEQID NO: 470に記載されるアミノ酸配列を含む。

0060

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、SEQID NO: 461、462、463、464、465、466、467、468、または469に記載されるアミノ酸配列;およびSEQ ID NO: 470に記載されるアミノ酸配列を含む。

0061

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、SEQID NO: 461、462、463、464、465、466、467、468、または469に記載されるアミノ酸配列; SEQ ID NO: 470に記載されるアミノ酸配列;およびSEQ ID NO: 461、462、463、464、465、466、467、468、または469とSEQ ID NO: 470との間に位置するペプチド配列を含む。

0062

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ペプチド配列はウシ配列、非ウシ配列、抗体配列、または非抗体配列である。

0063

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、ヒト軽鎖可変領域フレームワーク配列を含む。

0064

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、λ軽鎖可変領域配列である軽鎖可変領域配列を含む。

0065

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、λ軽鎖可変領域配列はウシλ軽鎖可変領域配列であるか、またはウシλ軽鎖可変領域配列に由来する。

0066

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、λ軽鎖可変領域配列は、ヒトλ軽鎖可変領域配列であるか、またはヒトλ軽鎖可変領域配列に由来する。

0067

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、VL1-51生殖系列配列である。

0068

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒトλ軽鎖可変領域配列は、VL1-51生殖系列配列に由来する。

0069

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、VL1-51生殖系列配列は、Kabat番号付けに基づくIle29ValおよびAsn32Gly置換を含むCDR1を含む。

0070

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、VL1-51生殖系列配列は、DNNからGDTへの置換を含むCDR2を含む。

0071

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、VL1-51生殖系列配列は、DNNKRP (SEQID NO: 471) からGDTSRA (SEQ ID NO: 472) への置換を含むCDR2を含む。

0072

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、VL1-51生殖系列配列は、Kabat番号付けに基づくS2A、T5N、P8S、A12G、A13S、およびP14L置換を含む。

0073

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、VL1-51生殖系列配列は、Kabat番号付けに基づくS2A、T5N、P8S、A12G、A13S、およびP14L置換、ならびにDNNからGDTへの置換を含むCDR2を含む。

0074

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、SEQID NO: 440、441、442、443、または444に記載されるアミノ酸配列を含む。

0075

本開示は、本明細書に開示のヒト化抗体またはその結合断片をコードするポリヌクレオチドも提供する。

0076

本開示は、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片をコードするポリヌクレオチドも提供する。

0077

本開示は、極めて長いCDR3を含むヒト化可変領域をコードするポリヌクレオチドも提供する。

0078

本開示は、本明細書に開示のポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。

0079

本開示は、本明細書に開示のベクターを含む宿主細胞も提供する。

0080

本開示は、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片をコードする配列を含む複数のポリヌクレオチドを含む核酸ライブラリーも提供する。

0081

本開示は、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーも提供する。

0082

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、35アミノ酸長以上、40アミノ酸長以上、45アミノ酸長以上、50アミノ酸長以上、55アミノ酸長以上、または60アミノ酸長以上である。

0083

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は35アミノ酸長以上である。

0084

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、3個以上のシステイン残基、4個以上のシステイン残基、5個以上のシステイン残基、6個以上のシステイン残基、7個以上のシステイン残基、8個以上のシステイン残基、9個以上のシステイン残基、10個以上のシステイン残基、11個以上のシステイン残基、または12個以上のシステイン残基を含む。

0085

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は3個以上のシステイン残基を含む。

0086

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、抗体またはその結合断片はシステインモチーフを含む。

0087

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、システインモチーフは、

からなる群より選択される。

0088

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、システインモチーフは、

からなる群より選択される。

0089

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は2〜6個のジスルフィド結合を含む。

0090

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3はSEQID NO: 40またはその誘導体を含む。

0091

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、SEQID NO: 1〜4のうちのいずれか1つのアミノ酸残基3〜6を含む。

0092

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は非ヒトDHまたはその誘導体を含む。

0093

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、非ヒトDHは、SEQID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、またはSEQ ID NO: 12である。

0094

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3はJH配列またはその誘導体を含む。

0095

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、JH配列は、SEQID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、またはSEQ ID NO: 17である。

0096

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、非ヒトVH配列もしくはその誘導体;非ヒトDH配列もしくはその誘導体;および/またはJH配列もしくはその誘導体を含む。

0097

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、VH配列とDH配列との間に位置する2〜6個またはそれより多いアミノ酸残基を含む付加的なアミノ酸配列を含む。

0098

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、付加的なアミノ酸配列は、IR、IF、SEQID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、またはSEQ ID NO: 21からなる群より選択される。

0099

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、SEQID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、またはSEQ ID NO: 28に由来するかまたはこれらに基づく配列を含む。

0100

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は非ウシ配列または非抗体配列を含む。

0101

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、非抗体配列は合成配列である。

0102

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、非抗体配列は、サイトカイン配列、リンホカイン配列、ケモカイン配列、増殖因子配列、ホルモン配列、または毒素配列である。

0103

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、非抗体配列は、IL-8配列、IL-21配列、SDF-1(α) 配列、ソマトスタチン配列、クロロトキシン配列、Pro-TxII配列、またはジコノチド配列である。

0104

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、非抗体配列はSEQID NO: 475〜481のうちのいずれか1つである。

0105

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、X1X2X3X4X5モチーフ
(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) である)
を含む。

0106

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、X1X2X3X4X5モチーフは、

である。

0107

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3はCX1X2X3X4X5モチーフを含む。

0108

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CX1X2X3X4X5モチーフは、

である。

0109

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、(XaXb)zモチーフ
(式中、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン(H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、かつzは1〜4である)
を含む。

0110

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、(XaXb)zモチーフは、

である。

0111

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、(XaXb)zモチーフはYXYXYXである。

0112

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、X1X2X3X4X5Xnモチーフ
(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) であり、かつnは27〜54である)
を含む。

0113

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、Xn(XaXb)zモチーフ
(式中、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン(H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、nは27〜54であり、かつzは1〜4である)
を含む。

0114

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、X1X2X3X4X5Xn(XaXb)zモチーフ
(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、X5はグルタミン(Q) であり、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン (Y)、フェニルアラニン (F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン (H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、nは27〜54であり、かつzは1〜4である)
を含む。

0115

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、X1X2X3X4X5モチーフはTTVHQ (SEQID NO: 153) またはTSVHQ (SEQ ID NO: 154)であり、かつ (XaXb)zモチーフはYXYXYXである。

0116

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、CX1X2X3X4X5モチーフ(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) である)、以下からなる群より選択されるシステインモチーフ:

、ならびに(XaXb)zモチーフ(式中、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン (Y)、フェニルアラニン (F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン (H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、かつzは1〜4である)を含む。

0117

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、CX1X2X3X4X5モチーフ(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) である);以下からなる群より選択されるシステインモチーフ:

;ならびに(XaXb)zモチーフ(式中、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン (Y)、フェニルアラニン (F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン (H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、かつzは1〜4である)を含む。

0118

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は、リンカーである付加的な配列を含む。

0119

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、リンカーは、非抗体配列のC末端、N末端、またはC末端およびN末端の両方に連結されている。

0120

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、極めて長いCDR3は反芻動物のCDR3である。

0121

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、反芻動物はウシである。

0122

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、ヒト重鎖可変領域フレームワーク配列を含む。

0123

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、ヒト重鎖生殖系列配列を含むか、またはヒト重鎖生殖系列配列に由来する。

0124

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、VH4ファミリーメンバー生殖系列配列であるヒト重鎖生殖系列配列を含む。

0125

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片はVH4-34生殖系列配列を含む。

0126

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、VH4-34に由来するヒト重鎖生殖系列配列を含む。

0127

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、VH4-34生殖系列配列は、Kabat番号付けに基づくGly31AspおよびTyr32Lys置換を含むCDR1を含む。

0128

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、VH4-34生殖系列配列は、Kabat番号付けに基づくGlu50Ser置換を含むCDR2を含む。

0129

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、VH4-34生殖系列配列は、Kabat番号付けに基づく、Ala23Thr、Val24Ala、Tyr25Ser、Gly27Phe、Phe29Leu、Gly31Asp、Tyr32Lys、Tyr33Ala、Trp34Val、およびSer35Gly置換を含むCDR1、ならびにIle48Leu、Glu50Ser、Asn52Asp、His53Thr、Ser54Gly、Ser56Asn、およびAsn58Gly置換を含むCDR2を含む。

0130

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、SEQID NO: 470に記載されるアミノ酸配列を含む。

0131

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、SEQID NO: 461、462、463、464、465、466、467、468、または469に記載されるアミノ酸配列;およびSEQ ID NO: 470に記載されるアミノ酸配列を含む。

0132

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、SEQID NO: 461、462、463、464、465、466、467、468、または469に記載されるアミノ酸配列; SEQ ID NO: 470に記載されるアミノ酸配列;およびSEQ ID NO: 461、462、463、464、465、466、467、468、または469とSEQ ID NO: 470との間に位置するペプチド配列を含む。

0133

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ペプチド配列はウシ配列、非ウシ配列、抗体配列、または非抗体配列である。

0134

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、λ軽鎖可変領域配列を含む。

0135

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、λ軽鎖可変領域配列である軽鎖可変領域配列を含む。

0136

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、λ軽鎖可変領域配列はウシλ軽鎖可変領域配列である。

0137

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、λ軽鎖可変領域配列はヒトλ軽鎖可変領域配列である。

0138

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒトλ軽鎖可変領域配列はVL1-51である。

0139

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒトλ軽鎖可変領域配列はVL1-51に由来する。

0140

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、VL1-51生殖系列配列は、Kabat番号付けに基づくIle29ValおよびAsn32Gly置換を含むCDR1を含む。

0141

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、VL1-51生殖系列配列は、DNNからGDTへの置換を含むCDR2を含む。

0142

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、VL1-51生殖系列配列は、DNNKRP (SEQID NO: 471) からGDTSRA (SEQ ID NO: 472) への置換を含むCDR2を含む。

0143

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、VL1-51生殖系列配列は、Kabat番号付けに基づくS2A、T5N、P8S、A12G、A13S、およびP14L置換を含む。

0144

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、VL1-51生殖系列配列は、Kabat番号付けに基づくS2A、T5N、P8S、A12G、A13S、およびP14L置換、ならびにDNNからGDTへの置換を含むCDR2を含む。

0145

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、SEQID NO: 440、441、442、443、または444に記載されるアミノ酸配列を含む。

0146

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、ヒト化抗体またはその結合断片は、空間的にアドレス指定された形式で存在する。

0147

本開示は、ヒト以外の極めて長いCDR3をコードする核酸配列を、ヒト可変領域フレームワーク(FR) 配列をコードする核酸配列と遺伝的に組み合わせる段階を含む、抗体可変領域をヒト化する方法を提供する。

0148

本開示は、極めて長いCDR3をコードする核酸配列を、ヒト可変領域フレームワーク(FR) 配列をコードする核酸配列と組み合わせて、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体をコードする核酸を生成する段階;および極めて長いCDR3を含むヒト化抗体をコードする該核酸を発現させて、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体のライブラリーを作製する段階を含む、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体のライブラリーを作製する方法も提供する。

0149

本開示は、極めて長いCDR3をコードする核酸配列、ヒト可変領域フレームワーク(FR) 配列をコードする核酸配列、および非抗体配列をコードする核酸配列を組み合わせて、極めて長いCDR3および非抗体配列を含むヒト化抗体またはその結合断片をコードする核酸を生成する段階、ならびに極めて長いCDR3および非抗体配列を含むヒト化抗体またはその結合断片をコードする該核酸を発現させて、極めて長いCDR3および非抗体配列を含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーを作製する段階を含む、非抗体配列を含む極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーを作製する方法も提供する。いくつかの態様において、極めて長いCDR3は、ウシ配列、非ウシ配列、抗体配列、または非抗体配列を含む。

0150

本開示は、非ウシ配列または非抗体配列を含む極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーも提供する。

0151

本開示は、ヒト可変領域フレームワーク(FR) 配列と、極めて長いCDR3およびシステインモチーフをコードする核酸配列とを組み合わせる段階;該システインモチーフ中の1つまたは複数のシステイン残基間に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基をコードする核酸配列に、異なるアミノ酸残基をコードするヌクレオチドへと変える1つまたは複数のヌクレオチド改変を導入して、極めて長いCDR3と、システインドメイン中の1つまたは複数のシステイン残基間に1つまたは複数のヌクレオチド改変が導入されたシステインモチーフとを含むヒト化抗体またはその結合断片をコードする核酸を生成する段階;ならびに極めて長いCDR3と、システインドメイン中の1つまたは複数のシステイン残基間に1つまたは複数のヌクレオチド改変が導入されたシステインモチーフとを含むヒト化抗体またはその結合断片をコードする該核酸を発現させて、極めて長いCDR3と、システインドメイン中の1つまたは複数のシステイン残基間に1つまたは複数のアミノ酸改変が導入されたシステインモチーフとを含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーを作製する段階を含む、システインモチーフを含む極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーを作製する方法も提供する。

0152

本開示は、システインモチーフを含む極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーであって、該抗体またはその結合断片が、該システインモチーフ中のシステイン残基間に位置するアミノ酸残基の1つまたは複数の置換を含む、前記ライブラリーも提供する。

0153

本開示は、ヒト可変領域フレームワーク(FR) 配列をコードする核酸配列と、ウシの極めて長いCDR3をコードする核酸とを組み合わせる段階、ならびにヒト可変領域フレームワーク (FR) 配列をコードする該核酸およびウシの極めて長いCDR3をコードする該核酸を発現させて、ウシの極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーを作製する段階を含む、ウシの極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーを作製する方法も提供する。

0154

本開示は、CDR3骨格を含む抗体を含むヒト化抗体、それを作製する方法、およびその使用を提供する。

0155

本開示は、CDR3骨格を含むヒト化抗体またはその結合断片を提供する。

0156

いくつかの態様において、CDR3骨格は、1つまたは複数のヒト可変領域フレームワーク配列を含む。

0157

本開示は、ウシの極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーも提供する。

0158

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、X1X2X3X4X5モチーフ(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q)である)を含む。

0159

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、35アミノ酸長以上、40アミノ酸長以上、45アミノ酸長以上、50アミノ酸長以上、55アミノ酸長以上、または60アミノ酸長以上である。

0160

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、35アミノ酸長以上である。

0161

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、3個以上のシステイン残基、4個以上のシステイン残基、5個以上のシステイン残基、6個以上のシステイン残基、7個以上のシステイン残基、8個以上のシステイン残基、9個以上のシステイン残基、10個以上のシステイン残基、11個以上のシステイン残基、または12個以上のシステイン残基を含む。

0162

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、3個以上のシステイン残基を含む。

0163

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、システインモチーフを含む。

0164

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、システインモチーフは、

からなる群より選択される。

0165

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、システインモチーフは、

からなる群より選択される。

0166

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、2〜6個のジスルフィド結合を含む。

0167

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格中のX1X2X3X4X5モチーフは、

である。

0168

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、CX1X2X3X4X5モチーフを含む。

0169

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CX1X2X3X4X5モチーフは、

である。

0170

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、(XaXb)zモチーフ(式中、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン(H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、かつzは1〜4である)を含む。

0171

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、(XaXb)zモチーフは、

である。

0172

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、(XaXb)zモチーフはYXYXYXである。

0173

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、X1X2X3X4X5Xnモチーフ(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) であり、かつnは27〜54である)を含む。

0174

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、Xn(XaXb)zモチーフ(式中、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン(H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、nは27〜54であり、かつzは1〜4である)を含む。

0175

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、X1X2X3X4X5Xn(XaXb)zモチーフ(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、X5はグルタミン(Q) であり、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン (Y)、フェニルアラニン (F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン (H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、nは27〜54であり、かつzは1〜4である)を含む。

0176

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格中のX1X2X3X4X5モチーフはTTVHQ (SEQID NO: 153) またはTSVHQ (SEQ ID NO: 154)であり、かつ (XaXb)zモチーフはYXYXYXである。

0177

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、CX1X2X3X4X5モチーフ(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) である)、以下からなる群より選択されるシステインモチーフ:

、ならびに(XaXb)zモチーフ(式中、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン (Y)、フェニルアラニン (F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン (H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、かつzは1〜4である)を含む。

0178

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、CX1X2X3X4X5モチーフ(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) である);以下からなる群より選択されるシステインモチーフ:

;ならびに(XaXb)zモチーフ(式中、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン (Y)、フェニルアラニン (F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン (H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、かつzは1〜4である)を含む。

0179

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、SEQID NO: 40またはその誘導体を含む。

0180

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、SEQID NO: 1〜4のうちのいずれか1つのアミノ酸残基3〜6を含む。

0181

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、非ヒトDHまたはその誘導体を含む。

0182

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、非ヒトDHは、SEQID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、またはSEQ ID NO: 12である。

0183

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、JH配列またはその誘導体を含む。

0184

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、JH配列は、SEQID NO: 13、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、またはSEQ ID NO: 17である。

0185

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、非ヒトVH配列もしくはその誘導体;非ヒトDH配列もしくはその誘導体;および/またはJH配列もしくはその誘導体を含む。

0186

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、VH配列とDH配列との間に位置する2〜6個またはそれより多いアミノ酸残基を含む付加的なアミノ酸配列を含む。

0187

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、付加的なアミノ酸配列は、IR、IF、SEQID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、またはSEQ ID NO: 21からなる群より選択される。

0188

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、SEQID NO: 22、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、またはSEQ ID NO: 28に由来するかまたはこれらに基づく配列を含む。

0189

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、CDR3骨格は、反芻動物のCDR3骨格である。

0190

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、反芻動物はウシである。

0191

本開示は、本明細書に開示のCDR3骨格を含むライブラリーも提供する。

0192

本開示は、本明細書に開示のCDR3骨格をコードするポリヌクレオチドも提供する。

0193

本開示は、本明細書に開示のポリヌクレオチドのうちいずれかを含むベクターも提供する。

0194

本開示は、本明細書に開示のベクターのうちいずれかを含む宿主細胞も提供する。

0195

本開示は、も提供する。

0196

上記態様または下記態様のいずれかであるいくつかの態様において、細胞は、細菌、ウイルス、またはバクテリオファージである。

図面の簡単な説明

0197

本開示の前述の概要および以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読んだ場合に、より良く理解されるであろう。本開示を説明するために、現時点で好ましい態様を図面に示してある。しかしながら、本開示が、示された厳密な配置、例、および手段に限定されないことは理解されるべきである。
極めて長いCDR3配列を含む、BLV1H12、BLV5B8、BLV5D3、BLV8C11、BF4E9、BF1H1、またはF18と命名された、ウシ由来の例示的な抗体可変領域配列の配列アライメントを示す。
図2A〜Cは、極めて長いCDR3配列を示す。(最上部)生殖系列VHBUL、DH2、およびJHからの翻訳。文献で報告されている5つの極めて長いCDR H3は、全長で4〜8個のシステインを含み、互いにそれほど相同的ではないものの、これらのCDR H3の第1システインを「固定」してからアラインした場合には、DH2とのシステイン残基のいくらかの保存を見出すことができる。7つの配列のうち4つ(BLV1H12、BLV5D3、BLV8C11、およびBF4E9)は、DH2と同じ位置に4つのシステインを含むばかりでなく、付加的なシステインも有する。BLV5B8は、生殖系列DH2と共通したシステインを2つ有する。いくらかのシステイン保存を伴うこの限定された相同性から、DH2の変異によってこれらの配列が生じた可能性があることが示唆される。B-L1およびB-L2はウシ脾臓からの最初の配列であり、残りは、大規模シークエンシングのデータから選択された極めて長いCDR H3配列である。第1グループは、同定された中で最も長いCDR H3を含み、クローン的に関連していると考えられる。*は167回にわたって再現された配列を示しており、このことから、これが機能に関して強く選択されたことが示唆される。システインが8個の配列のうちのいくつかは、括弧内に表示の複数回にわたって再現されたために、機能に関して選択されたと考えられる。様々な長さの他の代表的な配列を、最後のグループに示す。CDR H3の境界を規定するフレームワークのシステイン残基およびトリプトファン残基に二重下線を引いてある。表2A〜C中に示される配列BLV1H12〜UL-77(最も左側の列)は、特定の生殖系列配列およびV/D/J結合配列に由来するアミノ酸残基のセグメントを区別するために、4つのセグメントに分割して示している。左側から右側に進んでいき、第1セグメントはVH生殖系列に由来し、本開示においてX1X2X3X4X5モチーフとして表される。第2セグメントはV-D結合部由来の配列を表し、本開示においてXnとして表される。第3セグメントは、DH2生殖系列に由来する一連のアミノ酸残基であり、第4セグメントは、JH1生殖系列領域に由来する一連のアミノ酸残基である。
図2A続きを示す図である。
図2Bの続きを示す図である。
BLV1H12、BLV5B8、BLV5D3、BLV8C11、BF4E9、BF1H1、またはF18と命名された、ウシ由来の例示的な極めて長いCDR3配列の配列アライメントを示す。
改変または極めて長いCDR3配列との使用に適している、VH-ULと命名された例示的なウシ生殖系列重鎖可変領域(VH) 配列を示す。
図5Aは、改変または極めて長いCDR3配列との使用に適している、4-39、4-59*03、4-34*09、および4-34*02と命名された例示的なヒト生殖系列重鎖可変領域配列を示す。
図5Bは、改変または極めて長いCDR3配列との使用に適している、4-39、4-59*03、4-34*09、および4-34*02と命名された例示的なヒト生殖系列重鎖可変領域配列のアライメントを示す。
改変または極めて長いCDR3配列(例えば、極めて長いCDR3配列を含む重鎖可変領域配列)との使用に適している、BLV1H12と命名された例示的なウシ軽鎖可変領域配列を示す。
図7Aは、改変または極めて長いCDR3配列との使用に適している、VI1-47、VI1-40*1、VI1-51*01、およびVI2-18*02と命名された例示的な軽鎖可変領域配列を示す。
図7Bは、改変または極めて長いCDR3配列との使用に適している、VI1-47、VI1-40*1、VI1-51*01、およびVI2-18*02と命名された例示的な軽鎖可変領域配列のアライメントを示す。

0198

詳細な説明
本開示は、極めて長いCDR3配列を含むヒト化抗体を、そのような抗体を作製するための材料(例えば、タンパク質配列遺伝子配列、細胞、ライブラリー)および方法(例えば、ヒト化方法、ライブラリー方法)と共に提供する。このようなヒト化抗体は、様々な疾患状態または障害の治療または予防に有用であり得る。

0199

本開示はまた、非常に長いCDR3配列を含むヒト化抗体を提供し、ここで該CDR3配列は35アミノ酸長以上(例えば、40以上、45以上、50以上、55以上、60以上)であり、かつ/または該CDR3配列は少なくとも3個以上のシステイン残基(例えば、3個以上のシステイン残基、4個以上のシステイン残基、5個以上のシステイン残基、6個以上のシステイン残基、7個以上のシステイン残基、8個以上のシステイン残基、9個以上のシステイン残基、10個以上のシステイン残基、11個以上のシステイン残基、または12個以上のシステイン残基)を有する。本明細書に記載されているこのような抗体は、例えば、膜貫通タンパク質(例えば、GPCRイオンチャネル輸送体細胞表面受容体)などのタンパク質標的を含む様々な標的と結合する(例えば、特異的または選択的に結合する)。

0200

本開示はまた、極めて長いCDR3配列を含むヒト化抗体を調製または作製するための方法および材料を提供する。このような材料には、タンパク質、遺伝子配列、細胞、およびライブラリーが含まれる。このような方法には、ヒト化の方法、およびライブラリーを作製しスクリーニングする方法が含まれる。

0201

本開示は、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片を提供する。いくつかの態様において、極めて長いCDR3は、35アミノ酸長以上、40アミノ酸長以上、45アミノ酸長以上、50アミノ酸長以上、55アミノ酸長以上、または60アミノ酸長以上でもよい。いくつかの態様において、極めて長いCDR3は、3個以上のシステイン残基、4個以上のシステイン残基、5個以上のシステイン残基、6個以上のシステイン残基、7個以上のシステイン残基、8個以上のシステイン残基、9個以上のシステイン残基、10個以上のシステイン残基、11個以上のシステイン残基、または12個以上のシステイン残基を含み得る。非常に長いCDR3はシステインモチーフを含んでもよく、これには例えば、システインモチーフが、

からなる群より選択される場合が含まれる。あるいは、極めて長いCDR3はシステインモチーフを含んでもよく、これには例えば、システインモチーフが、

からなる群より選択される場合が含まれる。

0202

本開示はまた、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片を提供し、この場合、該極めて長いCDR3は、X1X2X3X4X5モチーフ(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) である)を含む。いくつかの態様において、X1X2X3X4X5モチーフは、

であってもよい。

0203

本開示は、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片を提供し、この場合、該極めて長いCDR3は、(XaXb)zモチーフ(式中、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン(H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、かつzは1〜4である)を含む。いくつかの態様において、(XaXb)zモチーフは、

であってもよい。

0204

本開示は、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片を提供し、この場合、該極めて長いCDR3は、X1X2X3X4X5Xn(XaXb)zモチーフ(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) であり、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン (Y)、フェニルアラニン (F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン (H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、nは27〜54であり、かつzは1〜4である)を含む。

0205

本開示は、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片を提供し、この場合、該極めて長いCDR3は、CX1X2X3X4X5モチーフ(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) である)と、

からなる群より選択されるシステインモチーフと、 (XaXb)zモチーフ(式中、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン (Y)、フェニルアラニン (F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン (H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、かつzは1〜4である)とを含む。

0206

本開示は、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片を提供し、この場合、該極めて長いCDR3は、CX1X2X3X4X5モチーフ(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) である)と;

からなる群より選択されるシステインモチーフと; (XaXb)zモチーフ(式中、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン (Y)、フェニルアラニン (F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン (H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、かつzは1〜4である)とを含む。

0207

本開示はまた、極めて長いCDR3をコードする核酸配列を、ヒト可変領域フレームワーク(FR) 配列をコードする核酸配列と組み合わせて、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体をコードする核酸を生成する段階;および極めて長いCDR3を含むヒト化抗体をコードする該核酸を発現させて、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体のライブラリーを作製する段階を含む、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体のライブラリーを作製する方法を提供する。

0208

本開示はまた、極めて長いCDR3をコードする核酸配列、ヒト可変領域フレームワーク(FR) 配列をコードする核酸配列、および非抗体配列をコードする核酸配列を組み合わせて、極めて長いCDR3および非抗体配列を含むヒト化抗体またはその結合断片をコードする核酸を生成する段階、ならびに極めて長いCDR3および非抗体配列を含むヒト化抗体またはその結合断片をコードする該核酸を発現させて、極めて長いCDR3および非抗体配列を含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーを作製する段階を含む、非抗体配列を含む極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーを作製する方法を提供する。

0209

本開示はまた、非抗体配列を含む極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーを提供する。

0210

本開示はまた、ヒト可変領域フレームワーク(FR) 配列と、極めて長いCDR3およびシステインモチーフをコードする核酸配列とを組み合わせる段階;該システインモチーフ中の1つまたは複数のシステイン残基間に位置する1つまたは複数のアミノ酸残基をコードする核酸配列に、異なるアミノ酸残基をコードするヌクレオチドへと変える1つまたは複数のヌクレオチド改変を導入して、極めて長いCDR3と、システインドメイン中の1つまたは複数のシステイン残基間に1つまたは複数のヌクレオチド改変が導入されたシステインモチーフとを含むヒト化抗体またはその結合断片をコードする核酸を生成する段階;ならびに、極めて長いCDR3と、システインドメイン中の1つまたは複数のシステイン残基間に1つまたは複数のヌクレオチド改変が導入されたシステインモチーフとを含むヒト化抗体またはその結合断片をコードする該核酸を発現させて、極めて長いCDR3と、システインドメイン中の1つまたは複数のシステイン残基間に1つまたは複数のアミノ酸改変が導入されたシステインモチーフとを含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーを作製する段階を含む、システインモチーフを含む極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーを作製する方法を提供する。

0211

本開示はまた、システインモチーフを含む極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーを提供し、この場合、該抗体またはその結合断片は、該システインモチーフ中のシステイン残基間に位置するアミノ酸残基の1つまたは複数の置換を含む。

0212

本開示はまた、ヒト可変領域フレームワーク(FR) 配列をコードする核酸配列と、ウシの極めて長いCDR3をコードする核酸とを組み合わせる段階、ならびにヒト可変領域フレームワーク (FR) 配列をコードする該核酸およびウシの極めて長いCDR3をコードする該核酸を発現させて、ウシの極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーを作製する段階を含む、ウシの極めて長いCDR3を含むヒト化抗体またはその結合断片のライブラリーを作製する方法を提供する。

0213

本開示はまた、X1X2X3X4X5モチーフ(式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) である)を含むCDR3骨格を提供する。

0214

タンパク質
本開示は、極めて長いCDR3配列を含むヒト化抗体を提供する。

0215

1つの態様において、本開示は極めて長いCDR3を含むヒト化抗体を提供し、この場合、該CDR3は35アミノ酸長以上(例えば、40以上、45以上、50以上、55以上、60以上)である。このようなヒト化抗体は、極めて長いCDR3内に少なくとも3個以上(例えば、4個以上、6個以上、8個以上)のシステイン残基を含み得る。

0216

別の態様において、本開示は極めて長いCDR3を含むヒト化抗体を提供し、この場合、該CDR3は35アミノ酸長以上であり、非ヒト配列に由来するかまたはこれに基づく。極めて長いCDR3配列は、ウシ(ボスタウルス(Bos taurus))などの反芻動物を含む、極めて長いCDR3抗体を天然に産生する任意の種に由来し得る。

0217

別の態様において、本開示は極めて長いCDR3を含むヒト化抗体を提供し、この場合、該CDR3は35アミノ酸長以上であり、非抗体配列に由来する。非抗体配列は、ケモカイン、増殖因子、ペプチド、サイトカイン、細胞表面タンパク質血清タンパク質、毒素、細胞外基質タンパク質凝固因子分泌タンパク質等を含むがこれらに限定されない任意のタンパク質ファミリーに由来し得る。非抗体配列は、ヒト起源または非ヒト起源のものであってもよく、ペプチドまたはドメインなどの非抗体タンパク質の一部を含み得る。極めて長いCDR3の非抗体配列は、アミノ酸の改変(例えば、置換)、挿入、または欠失を含む、その天然配列からの変異を含み得る。非抗体配列との間の結合部に付加的なアミノ酸を遺伝子操作で作り、ヒト化抗体内の非抗体配列の適切な折りたたみを促進するかまたは強化することができる。

0218

別の態様において、本開示は極めて長いCDR3を含むヒト化抗体を提供し、この場合、該CDR3は35アミノ酸長以上であり、例えば、4個以上、6個以上、および8個以上といった、少なくとも3個以上のシステイン残基を含む。

0219

別の態様において、本開示は極めて長いCDR3を含むヒト化抗体を提供し、この場合、該CDR3は35アミノ酸長以上であり、少なくとも3個以上のシステイン残基を含み、かつ該極めて長いCDR3は多重特異性抗体の成分である。多重特異性抗体は二重特異性であってもよいし、またはより多くの結合価を含んでもよい。

0220

別の態様において、本開示は極めて長いCDR3を含むヒト化抗体を提供し、この場合、該CDR3は35アミノ酸長以上であり、少なくとも3個以上のシステイン残基を含み、部分的にヒトの該極めて長いCDR3は免疫複合物の成分である。

0221

別の態様において、本開示は極めて長いCDR3を含むヒト化抗体を提供し、この場合、該CDR3は35アミノ酸長以上であり、少なくとも3個以上のシステイン残基を含み、極めて長いCDR3を含む該ヒト化抗体は膜貫通タンパク質標的に結合する。このような膜貫通標的には、GPCR、イオンチャネル、輸送体、および細胞表面受容体が含まれ得るが、これらに限定されない。

0222

遺伝子配列
本開示は、極めて長いCDR配列を含むヒト化抗体をコードする遺伝子配列(例えば、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド)を提供する。

0223

本開示はまた、極めて長いCDR3をコードする遺伝子配列(例えば、遺伝子、核酸、ポリヌクレオチド)を提供する。

0224

1つの態様において、本開示は、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体をコードする遺伝子配列を提供し、この場合、該CDR3は35アミノ酸長以上(例えば、40以上、45以上、50以上、55以上、60以上)である。このようなヒト化抗体は、極めて長いCDR3内に少なくとも3個以上のシステイン残基(例えば、4個以上、6個以上、8個以上)を含み得る。

0225

別の態様において、本開示は、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体をコードする遺伝子配列を提供し、この場合、該CDR3は35アミノ酸長以上であり、非ヒト配列に由来するかまたはこれに基づく。極めて長いCDR3をコードする遺伝子配列は、ウシ(ボス・タウルス(Bos taurus))などの反芻動物を含む、極めて長いCDR3抗体を天然に産生する任意の種に由来し得る。

0226

別の態様において、本開示は、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体をコードする遺伝子配列を提供し、この場合、該CDR3は35アミノ酸長以上であり、非抗体タンパク質配列に由来する。非抗体タンパク質配列をコードする遺伝子配列は、ケモカイン、増殖因子、ペプチド、サイトカイン、細胞表面タンパク質、血清タンパク質、毒素、細胞外基質タンパク質、凝固因子、分泌タンパク質等を含むがこれらに限定されない任意のタンパク質ファミリーに由来し得る。非抗体タンパク質配列は、ヒト起源または非ヒト起源のものであってもよく、ペプチドまたはドメインなどの非抗体タンパク質の一部を含み得る。極めて長いCDR3の非抗体タンパク質配列は、アミノ酸の改変(例えば、置換)、挿入、または欠失を含む、その天然配列からの変異を含み得る。非抗体配列との間の結合部に付加的なアミノ酸を遺伝子操作により作り、ヒト化抗体内の非抗体配列の適切な折りたたみを促進するまたは強化することができる。

0227

別の態様において、本開示は極めて長いCDR3を含むヒト化抗体をコードする遺伝子配列を提供し、この場合、該CDR3は35アミノ酸長以上であり、例えば、4個以上、6個以上、および8個以上といった、少なくとも3個以上のシステイン残基を含む。

0228

別の態様において、本開示は極めて長いCDR3を含むヒト化抗体をコードする遺伝子配列を提供し、この場合、該CDR3は35アミノ酸長以上であり、少なくとも3個以上のシステイン残基を含み、かつ該極めて長いCDR3は多重特異性抗体の成分である。多重特異性抗体は二重特異性であってもよいし、またはより多くの結合価を含んでもよい。

0229

別の態様において、本開示は極めて長いCDR3を含むヒト化抗体をコードする遺伝子配列を提供し、この場合、該CDR3は35アミノ酸長以上であり、少なくとも3個以上のシステイン残基を含み、該極めて長いCDR3は免疫複合物の成分である。

0230

別の態様において、本開示は極めて長いCDR3を含むヒト化抗体をコードする遺伝子配列を提供し、この場合、該CDR3は35アミノ酸長以上であり、少なくとも3個以上のシステイン残基を含み、かつ極めて長いCDR3を含む該ヒト化抗体は膜貫通タンパク質標的に結合する。このような膜貫通標的には、GPCR、イオンチャネル、輸送体、および細胞表面受容体が含まれ得るが、これらに限定されない。

0231

ライブラリーおよびアレイ
本開示は、極めて長いCDR3配列を含むヒト化抗体の収集物、ライブラリー、およびアレイを提供する。

0232

1つの態様において、本開示は、極めて長いCDR3配列を含むヒト化抗体のライブラリーまたはアレイを提供し、この場合、該ライブラリーまたはアレイの少なくとも2つのメンバーは、極めて長いCDR3配列中のシステインの少なくとも1つの位置が異なる。極めて長いCDR3配列中のシステインの異なる数(例えば、4個以上、6個以上、および8個以上などの、少なくとも3個以上のシステイン残基)により、ならびに/または異なるジスルフィド結合形成、およびしたがって異なるループ構造により、構造多様性が強化され得る。

0233

別の態様において、本開示は、極めて長いCDR3配列を含むヒト化抗体のライブラリーまたはアレイを提供し、この場合、該ライブラリーまたはアレイの少なくとも2つのメンバーは、極めて長いCDR3中のシステイン間に位置する少なくとも1つのアミノ酸が異なる。この関連で、該ライブラリーまたはアレイのメンバーは、CDR3の同じ位置にシステインを含んでもよく、結果として同様の全体的な構造的折りたたみをもたらすが、異なるアミノ酸側鎖によって微細な違いが生じる。このようなライブラリーまたはアレイは、親和性成熟に有用であり得る。

0234

別の態様において、本開示は、極めて長いCDR3配列を含むヒト化抗体のライブラリーまたはアレイを提供し、この場合、該極めて長いCDR3配列の少なくとも2つは長さ(例えば、40以上、45以上、50以上、55以上、および60以上などの、35アミノ酸長以上)が異なる。アミノ酸およびシステイン含量は、ライブラリーまたはアレイのメンバー間で異なってもまたはそうでなくてもよい。極めて長いCDR3配列の異なる長さは、例えば長さが異なることによる立体的な違いに起因する場合を含め、特有の結合部位を提供し得る。

0235

別の態様において、本開示は、極めて長いCDR3配列を含むヒト化抗体のライブラリーまたはアレイを提供し、この場合、該ライブラリーの少なくとも2つメンバーは、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体を構築するために用いられるヒトフレームワークが異なる。

0236

別の態様において、本開示は、極めて長いCDR3配列を含むヒト化抗体のライブラリーまたはアレイを提供し、この場合、該ライブラリーまたはアレイの少なくとも2つメンバーは、極めて長いCDR3の一部を構成する非抗体タンパク質配列を有する点で異なる。このようなライブラリーまたはアレイは、ケモカイン、増殖因子、ペプチド、サイトカイン、細胞表面タンパク質、血清タンパク質、毒素、細胞外基質タンパク質、凝固因子、分泌タンパク質、ウイルスまたは細菌タンパク質等を含む、複数の非抗体タンパク質配列を含み得る。非抗体タンパク質配列は、ヒト起源または非ヒト起源のものであってもよく、ペプチドまたはドメインなどの非抗体タンパク質の一部からなり得る。極めて長いCDR3の非抗体タンパク質配列は、アミノ酸の改変(例えば、置換)、挿入、または欠失を含む、その天然配列からの変異を含み得る。極めて長いCDR3内の非抗体配列との間の結合部に付加的なアミノ酸を遺伝子操作により作り、ヒト化抗体内の非抗体配列の適切な折りたたみを促進するまたは強化することができる。

0237

本開示のライブラリーまたはアレイは、当技術分野で周知のいくつかの形式であってもよい。ライブラリーまたはアレイは、アドレス指定可能なライブラリーまたはアドレス指定可能なアレイであってもよい。ライブラリーまたはアレイはディスプレイ形式であってもよく、例えば、抗体配列は、ファージリボソームmRNA酵母、または哺乳動物細胞上に発現され得る。

0238

細胞
本開示は、極めて長いCDR3配列を含むヒト化抗体をコードする遺伝子配列を含む細胞を提供する。

0239

1つの態様において、本開示は、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体を発現する細胞を提供する。細胞は原核生物または真核生物であってもよく、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体は、細胞表面上に発現され得るか、または培地中に分泌され得る。細胞表面上に提示される場合、ヒト化抗体は好ましくは、C末端における膜貫通ドメインまたは脂質結合部位などの、プラスミド膜 (plasmid membrane) 中に挿入するためのモチーフを含む。細菌細胞に関しては、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体は、ペリプラズム中に分泌され得る。細胞が真核生物である場合には、細胞に、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体をコードする遺伝子配列を一過性トランスフェクトすることができる。あるいは、当技術分野で周知の方法により、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体をコードする遺伝子配列をトランスフェクトするかまたは形質導入することにより、安定した細胞株または安定したプールを作製することもできる。蛍光活性細胞選別(FACS) により、または薬物耐性をコードする遺伝子に関する選択により、細胞を選択することができる。極めて長いCDR3配列を含むヒト化抗体の産生に有用な細胞には、大腸菌(E. coli) のような原核細胞、酵母サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae) およびピキアパストリス(Pichia pastoris) のような真核細胞チャイニーズハムスター卵巣(CHO) 細胞、COS-1のようなサル細胞、またはHEK-293、HeLa、SP-1のようなヒト細胞が含まれる。

0240

ヒト化方法
本開示は、非ヒトCDR3に由来する極めて長いCDR3配列をヒトフレームワーク中へと遺伝子操作する段階を含む、極めて長いCDR3配列を含むヒト化抗体を作製する方法を提供する。ヒトフレームワークは、生殖系列起源のものであってもよく、または非生殖系列(例えば、変異したまたは親和性成熟した)配列に由来し得る。本明細書に開示されるものを含む、当業者に周知の遺伝子操作技法を用いて、ヒトフレームワークおよびヒト以外の極めて長いCDR3を含むハイブリッドDNA配列を作製することができる。7つのファミリーのうちの1つに由来するV領域遺伝子によってコードされ得るヒト抗体とは異なり、極めて長いCDR3配列を生じるウシ抗体は、ヒトVH4ファミリーと最も相同的であると見なされ得る単一のV領域ファミリーを使用するようである。極めて長いCDR3を含む抗体を生成するために、ウシに由来する極めて長いCDR3配列がヒト化される場合の好ましい態様では、VH4ファミリー由来のヒトV領域配列を、ウシ由来の極めて長いCDR3配列に遺伝的に融合させることができる。ヒト抗体遺伝子座における例示的なVH4生殖系列遺伝子配列を図5Aに示す(例えば、SEQID NO: 31〜34;および368〜371)。

0241

本開示はまた、ヒト以外の極めて長いCDR3 (ULCDR3) をコードする核酸配列を、ヒト可変領域フレームワーク(FR) 配列をコードする核酸配列と遺伝的に組み合わせる段階を含む、抗体可変領域をヒト化する方法を提供する。FR1、FR2、およびFR3を含むヒトフレームワーク配列を選択すること;CDR1配列を選択すること;CDR2配列を選択すること;極めて長いCDR3配列を選択すること;および該配列をFR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-ULCDR3として組み合わせることを含む、ヒト化抗体可変領域を作製する方法もまた提供する。FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3をコードする配列を含むヒト抗体可変領域配列を選択すること;ヒト以外の極めて長いCDR3 (ULCDR3) をコードする配列を選択すること;および段階 (a) のヒト配列を段階 (b) の非ヒト配列とインフレームで遺伝的に融合して、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-ULCDR3をコードする配列を作製することを含む、ヒト化抗体可変領域配列を作製する方法もまた提供する。

0242

1つの態様において、本開示は、例えば以下の段階によって達成され得るような、ヒトVH4フレームワーク配列の、ウシ由来の極めて長いCDR3への融合物を提供する。第一に、V領域遺伝子配列の第2システインを、該第2システインをコードするヌクレオチド配列と共に同定する。一般的に、第2システインは、フレームワークとCDR3の境界であって、該CDR3の2残基上流側(N末端側)を示す。第二に、同様にCDR3の2残基上流(N末端側)を示す、ウシ由来V領域配列中の第2システインを同定する。第三に、ヒトV領域をコードする遺伝子材料を、極めて長いCDR3をコードする遺伝子配列と組み合わせる。このようにして、遺伝子融合物を作製することができ、この場合、該極めて長いCDR3配列は、ヒトV領域配列のインフレームに配置する。好ましくは、極めて長いCDR3を含むヒト化抗体は、アミノ酸組成ができるだけヒトに近い。任意で、J領域配列を、ウシ由来配列からヒト配列に変異させることができる。同様に任意で、ヒト化重鎖をヒト軽鎖対形成させることができる。

0243

別の態様において、本開示は、ヒトの極めて長いCDR3重鎖と非ヒト軽鎖の対形成を提供する。

0244

別の態様において、本開示は、極めて長いCDR3を含むヒト化重鎖とヒト軽鎖の対形成を提供する。好ましくは、当該軽鎖は、ウシの極めて長いCDR3重鎖と対形成することが知られているウシ軽鎖と相同的である。例示的なウシ軽鎖を図7Aに示す(例えば、SEQID NO: 36〜39;および373〜376)。

0245

ライブラリー方法
本開示は、極めて長いCDR3配列を含むヒト化抗体を含むライブラリーを作製する方法を提供する。空間的にアドレス指定されたライブラリーの作製方法は、WO 2010/054007に記載されている。酵母、ファージ、大腸菌、または哺乳動物細胞においてライブラリーを作製する方法が、当技術分野で周知である。

0246

本開示はまた、極めて長いCDR3配列を含むヒト化抗体のライブラリーをスクリーニングする方法を提供する。

0247

定義
本明細書で互換的に用いられる「極めて長いCDR3」または「極めて長いCDR3配列」は、ヒト抗体配列に由来しないCDR3またはCDR3配列を含む。極めて長いCDR3は、35アミノ酸長以上であってもよく、例えば、40アミノ酸長以上、45アミノ酸長以上、50アミノ酸長以上、55アミノ酸長以上、または60アミノ酸長以上であってもよい。極めて長いCDR3の全長は、非抗体配列を含み得る。極めて長いCDR3は、例えば、インターロイキン配列、ホルモン配列、サイトカイン配列、毒素配列、リンホカイン配列、増殖因子配列、ケモカイン配列、毒素配列、またはそれらの組み合わせを含む、非抗体配列を含み得る。好ましくは、極めて長いCDR3は、重鎖CDR3(CDR3-H3またはCDRH3)である。好ましくは、極めて長いCDR3は、反芻動物(例えば、ウシ)配列に由来するかまたはこれに基づく配列である。極めて長いCDR3は、少なくとも3個以上のシステイン残基、例えば、4個以上のシステイン残基、6個以上のシステイン残基、8個以上のシステイン残基、10個以上のシステイン残基、または12個以上のシステイン残基(例えば、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、またはそれより多い)を含み得る。極めて長いCDR3は、以下のモチーフのうちの1つまたは複数を含み得る:システインモチーフ、X1X2X3X4X5モチーフ、CX1X2X3X4X5モチーフ、または (XaXb)zモチーフ。「システインモチーフ」は、4個以上のシステイン残基、5個以上のシステイン残基、6個以上のシステイン残基、7個以上のシステイン残基、8個以上のシステイン残基、9個以上のシステイン残基、10個以上のシステイン残基、11個以上のシステイン残基、または12個以上のシステイン残基をはじめとする3個以上のシステイン残基を含む、極めて長いCDR3中のアミノ酸残基のセグメントである。システインモチーフは、

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。あるいは、システインモチーフは、

からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み得る。システインモチーフは好ましくは、極めて長いCDR3内でX1X2X3X4X5モチーフと (XaXb)zモチーフの間に位置する。「X1X2X3X4X5モチーフ」は、極めて長いCDR3中の一連の連続した5アミノ酸残基であり、式中、X1はスレオニン(T)、グリシン(G)、アラニン(A)、セリン(S)、またはバリン(V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン(P)、イソロイシン(I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン(N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸(D) であり、X4はヒスチジン(H)、スレオニン (T)、アルギニン(R)、チロシン(Y)、フェニルアラニン(F)、またはロイシン(L) であり、かつX5はグルタミン(Q) である。いくつかの態様において、X1X2X3X4X5モチーフは、

であってもよい。「CX1X2X3X4X5モチーフ」は、極めて長いCDR3中の一連の連続した6アミノ酸残基であり、この場合、第1のアミノ酸残基はシステインであり、式中、X1はスレオニン (T)、グリシン (G)、アラニン (A)、セリン (S)、またはバリン (V) であり、X2はセリン (S)、スレオニン (T)、プロリン (P)、イソロイシン (I)、アラニン (A)、バリン (V)、またはアスパラギン (N) であり、X3はバリン (V)、アラニン (A)、スレオニン (T)、またはアスパラギン酸 (D) であり、X4はヒスチジン (H)、スレオニン (T)、アルギニン (R)、チロシン (Y)、フェニルアラニン (F)、またはロイシン (L) であり、かつX5はグルタミン (Q) である。いくつかの態様において、CX1X2X3X4X5モチーフは、

であってもよい。(XaXb)zモチーフは、極めて長いCDR3中の2アミノ酸残基の繰り返しの連続であり、式中、Xaは任意のアミノ酸残基であり、Xbは、チロシン (Y)、フェニルアラニン (F)、トリプトファン(W)、およびヒスチジン (H) からなる群より選択される芳香族アミノ酸であり、かつzは1〜4である。いくつかの態様において、(XaXb)zモチーフは、

を含み得る。いくつかの態様において、(XaXb)zモチーフはYXYXYXである。極めて長いCDR3は、SEQID NO: 40に由来するかまたはこれに基づくアミノ酸配列(例えば、SEQ ID NO: 1〜4のアミノ酸残基3〜6を参照されたい;例えば、図2A〜C中のVH生殖系列配列もまた参照されたい)を含み得る。極めて長いCDR3を含む可変領域は、SEQ ID NO: 1 (CTTVHQ)、SEQ ID NO:2 (CTSVHQ)、SEQ ID NO:3 (CSSVTQ)、またはSEQ ID NO: 4 (CTTVHP) であるアミノ酸配列を含み得る。このような配列は、ウシ生殖系列VH遺伝子配列(例えば、SEQ ID NO: 1)に由来し得るか、またはこれに基づき得る。極めて長いCDR3は、非ヒトDH遺伝子配列に由来するかまたはこれに基づく配列、例えば、SEQ ID NO: 5(例えば、Koti, et al. (2010) Mol. Immunol. 47: 2119-2128もまた参照されたい)、またはSEQ ID NO: 6、7、8、9、10、11、もしくは12などの別の配列(例えば、図2A〜C中のDH2生殖系列配列もまた参照されたい)を含み得る。極めて長いCDR3は、JH配列に由来するかまたはこれに基づく配列、例えば、SEQ ID NO: 13(例えば、Hosseini, et al. (2004) Int. Immunol. 16: 843-852もまた参照されたい)、またはSEQ ID NO: 14、15、16、もしくは17などの別の配列(例えば、図2A〜C中のJH1生殖系列配列もまた参照されたい)を含み得る。1つの態様において、極めて長いCDR3は、非ヒトVH配列に由来するかもしくはこれに基づく配列(例えば、SEQ ID NO: 1、2、3、または4;あるいは図2A〜C中のVH配列)、および/または非ヒトDH配列に由来するかもしくはこれに基づく配列(例えば、SEQ ID NO: 5、6、7、8、9、10、11、または12;あるいは図2A〜C中のDH配列)、および/またはJH配列に由来するかもしくはこれに基づく配列(例えば、SEQ ID NO: 13、14、15、16、または17;あるいは図2A〜C中のJH配列)、および任意で、例えばVH由来配列とDH由来配列との間にあるような、2〜6個もしくはそれより多いアミノ酸を含む付加的な配列(例えば、IR、IF、SEQ ID NO: 18、19、20、または21)を含み得る。別の態様において、極めて長いCDR3は、SEQ ID NO: 22、23、24、25、26、27、もしくは28に由来するかまたはこれらに基づく配列(例えば、図2A〜C中のSEQ ID NO: 276〜359もまた参照されたい)を含み得る。

0248

「単離された」生物学的分子、例えば、本明細書に開示される種々のポリペプチド、ポリヌクレオチド、および抗体などは、同定されており、かつその自然環境の少なくとも1つの成分から分離および/または回収された生物学的分子を指す。

0249

アンタゴニスト」は、ポリペプチドの活性(例えば、生物学的活性)を部分的にまたは完全に遮断する、阻害する、または中和する任意の分子を指す。「アンタゴニスト」には、そのポリペプチドをコードするmRNAの転写または翻訳を完全にまたは部分的に阻害する分子も包含される。好適なアンタゴニスト分子としては、例えば、アンタゴニスト抗体または抗体断片天然ポリペプチドの断片またはアミノ酸配列変異体;ペプチド;アンチセンスオリゴヌクレオチド小有機分子;およびポリペプチドアンタゴニストまたはアンタゴニスト抗体をコードする核酸が挙げられる。「1つ(an)」のアンタゴニストへの言及は、単一のアンタゴニストまたは2つ以上の異なるアンタゴニストの組み合わせを包含する。

0250

アゴニスト」は、ポリペプチドの生物学的活性を部分的にまたは完全に模倣する任意の分子を指す。「アゴニスト」には、そのポリペプチドをコードするmRNAの転写または翻訳を刺激する分子も包含される。好適なアゴニスト分子としては、例えば、アゴニスト抗体または抗体断片;天然ポリペプチド;天然ポリペプチドの断片またはアミノ酸配列変異体;ペプチド;アンチセンスオリゴヌクレオチド;小有機分子;およびポリペプチドアゴニストまたは抗体をコードする核酸が挙げられる。「1つ(an)」のアゴニストへの言及は、単一のアゴニストまたは2つ以上の異なるアゴニストの組み合わせを包含する。

0251

「単離された」抗体は、同定されておりかつその自然環境の成分から分離および/または回収された抗体を指す。その自然環境の混入成分は、抗体の診断または治療上の使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質溶質が含まれる。好ましい態様では、抗体は、(1)(例えば、ローリー法で測定して)95重量%超、好ましくは99重量%超の抗体にまで、(2)(例えば、スピニングカップシークエネーターの使用により)N末端または内部アミノ酸配列の少なくとも15残基を得るのに十分な程度にまで、あるいは(3)(例えば、クーマシー(Coomassie(商標))ブルーまたは好ましくは銀染色を用いて)還元または非還元条件下でのSDS-PAGEにより均一になるまで、精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイチューの抗体が含まれる。同様に、単離された抗体には、組換え細胞の周囲の培地中の抗体が含まれる。単離された抗体は、少なくとも1つの精製工程で調製され得る。

0252

「単離された」核酸分子は、同定されておりかつ抗体核酸の天然源において通常付随している少なくとも1つの混入核酸分子から分離された核酸分子を指す。単離された核酸分子は、天然に見出される形態または状況以外にある。したがって、単離された核酸分子は、それが天然の細胞内に存在するときの核酸分子とは区別される。しかしながら、単離された核酸分子は、例えば、その核酸分子が天然の細胞のものとは異なる染色体位置にある場合、抗体を発現する細胞内に含まれる核酸分子を包含する。

0253

Kabatにおけるような可変ドメイン残基番号付けまたはKabatにおけるようなアミノ酸位置番号付け、およびその変形は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)において、抗体の編集重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインのために用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線状アミノ酸配列は、可変ドメインのFRもしくはCDRの短縮またはFRもしくはCDRへの挿入に対応する、より少ないまたは追加的なアミノ酸を含むことができる。例えば、重鎖可変ドメインは、H2の残基52の後に単一のアミノ酸挿入物(例えば、Kabatに従う残基52a)および重鎖FR残基82の後に挿入残基(例えば、Kabatに従う残基82a、82b、および82cなど)を含むことができる。残基のKabat番号付けは、抗体の配列の相同領域で「標準」Kabat番号付け配列とアライメントすることによって、所与の抗体について決定することができる。

0254

「実質的に類似」または「実質的に同一」とは、2つの数値(概して、一方は本明細書に開示された抗体に関係しており、他方は参照/比較抗体に関係している)間の十分に高度の類似性を指し、そのため、当業者は、これら2つの数値間の差を、前記数値(例えば、Kd値)によって測定された生物学的特性において生物学的および/または統計的有意性がほとんどないまたはまったくないと考えるだろう。前記2つの数値間の差は、参照/比較抗体の値の関数として好ましくは約50%未満、好ましくは約40%未満、好ましくは約30%未満、好ましくは約20%未満、好ましくは約10%未満である。

0255

結合親和性」は一般的に、ある分子(例えば、抗体)とその結合パートナー(例えば、抗原)の単一の結合部位間の非共有結合相互作用の合計の強さを指す。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば、抗体と抗原)間の1:1相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。ある分子XのそのパートナーYに対する親和性は、一般に解離定数で表すことができる。親和性は、本明細書に記載したものを含めて、当技術分野で知られた一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般に、抗原にゆっくりと結合し、容易に解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は一般に、抗原により速く結合し、長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が当技術分野で知られており、それらのいずれも本開示の目的のために使用することができる。

0256

オン速度」または「結合の速度」または「結合速度」または「kon」は、表面プラズモン共鳴技術、例えばBiacore(例:Biacore A100、Biacore(商標)-2000、Biacore(商標)-3000;Biacore社, Piscataway, N.J.)カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, Biacore社)を用いて、供給業者の指示に従って測定することができる。

0257

「ベクター」は、それに連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの1つのタイプは「プラスミド」であり、それは、追加のDNAセグメントライゲートすることができる環状二本鎖DNAループを指す。別のタイプのベクターはファージベクターである。別のタイプのベクターは、追加のDNAセグメントをウイルスゲノムにライゲートすることができる、ウイルスベクターである。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製が可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらに機能的に連結された遺伝子の発現を指令することが可能である。このようなベクターを本明細書では「組換え発現ベクター」(または単に「組換えベクター」)と呼ぶ。一般的に、組換えDNA技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。したがって、プラスミドはベクターのよく用いられる形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」は、時に、互換的に用いることができる。

0258

「遺伝子」は、ポリペプチド、前駆体、またはRNA(例:rRNAtRNA)の生産に必要なコード配列を含む核酸(例:DNA)配列を指す。ポリペプチドは、完全長のコード配列によってコードされるか、あるいは完全長または断片の所望の活性もしくは機能的特性(例えば、酵素活性リガンド結合、シグナル伝達免疫原性など)が保持される限り、コード配列の任意の部分によってコードされてもよい。この用語はまた、その遺伝子が完全長mRNAの長さに対応するように、構造遺伝子のコード領域と、その5'末端および3'末端の両方で該コード領域に隣接して両端に約1kb以上にわたって位置する配列とを包含する。コード領域の5'側に位置して、mRNA上に存在する配列は、5'非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の3'側つまり下流に位置して、mRNA上に存在する配列は、3'非翻訳配列と呼ばれる。用語「遺伝子」は、遺伝子のcDNA形態とゲノム形態の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列で中断されるコード領域を含む。イントロンは核RNA(hnRNA)に転写される遺伝子のセグメントである;イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含むことができる。イントロンは、核もしくは一次転写産物から除去または「スプライスアウト」される;したがって、イントロンはメッセンジャーRNA(mRNA)転写産物には存在しない。mRNAは、翻訳時に、新生ポリペプチドのアミノ酸の配列または順序を指定するように機能する。イントロンを含むことに加えて、遺伝子のゲノム形態はまた、RNA転写産物上に存在する配列の5'および3'末端の両方に位置する配列を含むことができる。これらの配列は「フランキング」配列または領域と呼ばれる(これらのフランキング配列は、mRNA転写産物に存在する非翻訳配列の5'または3'側に位置する)。5'フランキング領域は、遺伝子の転写を制御するかまたはそれに影響を及ぼす、プロモーターおよびエンハンサーなどの調節配列を含むことができる。3'フランキング領域は、転写の終結、転写後切断およびポリアデニル化を指令する配列を含むことができる。

0259

本明細書で互換的に用いられる「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、DNAおよびRNAが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドリボヌクレオチド修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および/またはそれらの類似体、あるいはDNAもしくはRNAポリメラーゼにより、または合成反応により、ポリマー中に組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば標識との結合などによって、合成後にさらに修飾され得る。他のタイプの修飾には、例えば、以下が含まれる:「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの1個または複数の類似体による置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合(linkage)(例:メチルホスホネートホスホトリエステル、ホスホアミデートカルバメートなど)を有するものおよび荷電結合(例:ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)を有するもの、タンパク質(例:ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチドポリ-L-リジンなど)などのペンダント部分を含むもの、インターカレーター(例:アクリジンソラレンなど)を有するもの、キレート剤(例:金属、放射性金属ホウ素、酸化金属など)を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合(例:αアノマー核酸など)を有するもの、ならびにポリヌクレオチドの未修飾形態。さらに、糖において通常存在するヒドロキシル基はどれも、例えばホスホン酸基リン酸基で置換したり、標準的な保護基で保護したり、または追加のヌクレオチドへのさらなる連結を可能にするために活性化したり、あるいは固体もしくは半固体支持体に結合させたりすることができる。5'および3'末端のOHは、リン酸化したり、またはアミンもしくは1〜20個の炭素原子有機キャッピング基部分で置換したりすることができる。他のヒドロキシルはまた、標準的な保護基へと誘導体化することもできる。ポリヌクレオチドはまた、一般に当技術分野で知られているリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態、例えば、2'-O-メチル-、2'-O-アリル、2'-フルオロ-または2'-アジド-リボース、炭素環式糖類似体、α-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノースキシロースもしくはリキソースピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース非環式類似体および基本的なヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドなど、を含むことができる。1つまたは複数のホスホジエステル結合代替連結基で置き換えてもよい。こうした代替の連結基としては、限定するものではないが、リン酸基がP(O)S(「チオエート」)、P(S)S(「ジチオエート」)、(O)NR2(「アミデート」)、P(O)R、P(O)OR'、COまたはCH2(「ホルムアセタール」)で置き換えられた態様が挙げられ、ここで、各RまたはR'は、独立して、Hまたは、任意でエーテル(-O-)結合を含む置換もしくは非置換アルキル(1〜20C)、アリールアルケニルシクロアルキルシクロアルケニルもしくはアラルキルである。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。先の記述は、RNAおよびDNAを含めて、本明細書で言及するすべてのポリヌクレオチドに適用される。

0260

オリゴヌクレオチド」は、短い、一般に一本鎖の、一般に合成のポリヌクレオチドを指し、一般には、しかし必ずしもそうではないが、長さが約200ヌクレオチド未満である。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドに関する上記の説明は、オリゴヌクレオチドにも同様におよび完全に適用可能である。

0261

ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」は、プローブが、典型的には核酸の複雑な混合物中で、その標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、さまざまな状況において異なるであろう。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範な指針は、Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)に見出せる。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定したイオン強度pHで特定の配列の熱融解点(Tm)より約5〜10℃低くなるように選択される。Tmは、標的に相補的なプローブの50%が平衡状態標的配列にハイブリダイズする(規定のイオン強度、pH、および核酸濃度の下での)温度である(標的配列は過剰に存在するので、Tmでは、平衡状態でプローブの50%が占有される)。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成され得る。選択的または特異的なハイブリダイゼーションでは、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも2倍、好ましくはバックグラウンドのハイブリダイゼーションの10倍である。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの例示的な条件は、次のとおりであり得る:50%ホルムアミド、5×SSC、および1%SDS、42℃でインキュベーション、または5×SSC、1%SDS、65℃でインキュベーション、0.2×SSCおよび0.1%SDS中65℃で洗浄

0262

「組換え」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターに関して用いられる場合、その細胞、核酸、タンパク質もしくはベクターが異種の核酸またはタンパク質の導入、天然の核酸もしくはタンパク質の変更によって改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞に由来していることを示す。例えば、組換え細胞は、天然(非組換え)形態の細胞において見出されない遺伝子を発現するか、または過剰に発現されるかそうでなければ異常に発現される、例えば天然に存在しない断片もしくはスプライス変異体として発現される、天然の遺伝子を発現する。本明細書中で用語「組換え核酸」とは、一般的に、例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを用いた核酸の操作によって、もともとインビトロで形成された、通常は天然に見出されない形態での核酸を意味する。このようにして、さまざまな配列の機能的な連結が達成される。かくして、線状形態の単離された核酸、または通常は結合されないDNA分子をライゲートすることによってインビトロで形成された発現ベクターは、両方とも、本開示の目的では組換えと見なされる。組換え核酸が作られて、宿主細胞または生物に導入されると、それは、例えばインビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボ細胞機構を用いて、非組換え的に複製することが理解される;しかし、このような核酸は、いったん組換えにより生産されると、その後非組換え的に複製されるけれども、本明細書に開示された目的では依然として組換えと見なされる。同様に、「組換えタンパク質」は、例えば上で示した組換え核酸の発現を介して、組換え技術を用いて作られたタンパク質である。

0263

ペプチドまたはポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント(%)」は、配列をアライメントさせかつ最大の配列同一性パーセントを達成するために必要に応じてギャップを導入した後に、どのような保存的置換も配列同一性の一部として考慮しないで、特定のペプチドまたはポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合を指す。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアライメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法で、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGNまたはMegAlign (DNASTAR)ソフトウェアなどの公表されているコンピュータソフトウェアを用いて、達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要なアルゴリズムを含めて、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。

0264

「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」および「タンパク質断片」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用することができる。これらの用語は、天然型アミノ酸ポリマーおよび非天然型アミノ酸ポリマーに適用されるだけでなく、1個または複数のアミノ酸残基が対応する天然型アミノ酸の人工的な化学模倣体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

0265

「アミノ酸」は、天然および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝コードによりコードされたもの、ならびに後で修飾されるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、例えば、水素カルボキシル基アミノ基、およびR基に結合しているα炭素、を有する化合物、例えば、ホモセリンノルロイシンメチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたR基(例:ノルロイシン)または修飾されたペプチド骨格をもつことができるが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。

0266

「保存的に改変された変異体」は、アミノ酸配列と核酸配列の両方に適用され、「アミノ酸変異体」はアミノ酸配列に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体は、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一のまたは付随した(例えば、天然で連続した)配列を指す。遺伝子コード縮重のため、ほとんどのタンパク質は多数の機能的に同一の核酸によりコードされる。例えば、コドンGCAGCC、GCGおよびGCUはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがあるコドンによって特定されているあらゆる位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの別のものに変えることができる。このような核酸変異は「サイレント変異」であり、保存的に改変された変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のどの核酸配列も、その核酸のサイレント変異についても記載している。当業者には認識されるように、特定の状況では、核酸の各コドン(通常はメチオニンの唯一のコドンであるAUG、および通常はトリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く)は、機能的に同一の分子を生じるように改変することができる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸のサイレント変異は、発現産物に関して記載された配列に暗に示されているが、実際のプローブ配列に関してはそうではない。アミノ酸配列に関して、当業者には理解されるように、コードされた配列中の単一のアミノ酸または少数のアミノ酸を改変、付加または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加は、その改変があるアミノ酸の化学的に類似するアミノ酸による置換をもたらす場合を含めて、「保存的に改変された変異体」である。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野で周知である。このような保存的に改変された変異体は、本明細書に開示された多型変異体、種間のホモログ、および対立遺伝子に追加され、これらを排除するものではない。典型的には、保存的置換は以下を含む:1)アラニン(A)、グリシン(G);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リジン(K);5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W);7)セリン(S)、スレオニン(T);および8)システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい)。

0267

「抗体(Ab)」および「免疫グロブリン(Ig)」は、類似の構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対する結合特異性を示すことができるが、免疫グロブリンは、抗体と、一般には抗原特異性欠く他の抗体様分子の両方を含むことができる。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで、骨髄腫によって増大したレベルで産生される。

0268

「抗体」および「免疫グロブリン」は、最も広い意味において互換的に使用され、モノクローナル抗体(例えば、完全長のまたはインタクトなモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体(例えば、所望の生物学活性を示す限り二重特異性抗体)を含み、さらに(本明細書でより詳細に記載されている)特定の抗体断片をも含むことができる。抗体はヒト型ヒト化型および/または親和性成熟型であり得る。抗体は、天然であろうと部分的もしくは全体的に合成であろうと、例えば組換えにより生産されようと、免疫グロブリンおよび免疫グロブリン部分を指すことができ、抗原結合部位を形成するのに十分な免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部を含有する、その任意の部分を含む。かくして、抗体またはその一部は、免疫グロブリンの抗原結合部位に相同であるかまたは実質的に相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を含む。例えば、抗体は、2本の重鎖(HおよびH'で表される)と2本の軽鎖(LおよびL'で表される)を含む抗体を指すことができ、ここで、各重鎖は、完全長の免疫グロブリン重鎖または抗原結合部位を形成するのに十分なその一部(例えば、重鎖にはVH鎖、VH-CH1鎖およびVH-CH1-CH2-CH3鎖が含まれるが、これらに限定されない)とすることができ、各軽鎖は、完全長の軽鎖または抗原結合部位を形成するのに十分なその一部(例えば、軽鎖にはVL鎖およびVL-CL鎖が含まれるが、これらに限定されない)とすることができる。各重鎖(HおよびH')は一方もしくは可変軽(VL)鎖の全部または少なくとも一部を最小限に含む。抗体はまた、定常領域の全部または一部を含むことができる。例えば、完全長の抗体は、2本の全長重鎖(例えばVH-CH1-CH2-CH3またはVH-CH1-CH2-CH3-CH4)および2本の全長軽鎖(VL-CL)およびヒンジ領域を有する抗体であり、例えば、抗体分泌B細胞により産生された抗体および合成的に生産される同じドメインを有する抗体などである。さらに、「抗体」は、免疫グロブリンファミリーのタンパク質、または、対応する抗原に非共有結合で可逆的に特異的に結合することが可能な免疫グロブリンの断片を含むポリペプチドを指す。典型的な抗体の構造単位四量体を含む。各四量体はポリペプチド鎖の2つの同一の対から構成され、各対はジスルフィド結合を介して結合された1本の「軽」鎖(約25kD)と1本の「重」鎖(約50〜70kD)を有する。認識された免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類され、これらは順に、それぞれ、免疫グロブリンクラスIgG、IgM、IgAIgD、およびIgEを規定する。各鎖のN末端は、抗原認識を主に担う約100〜110またはそれより多いアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)という用語は、それぞれ、軽鎖および重鎖のこれらの領域を指す。

0269

「可変」とは、可変ドメイン(可変領域とも呼ばれる)の特定の部分が、抗体間で配列に大きな違いがあり、特定の抗体それぞれのその特定の抗原に対する結合および特異性に使用されるという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。それは、軽鎖および重鎖の可変ドメインの両方で相補性決定領域(CDR)または超可変領域(HVR)と呼ばれる3つのセグメントに集中している。CDRには、可変領域配列内で本明細書に示されるKabat、Chothia、およびIMGTと指定されたものが含まれる。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク(FR)と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、3つのCDRによって連結された、主にβシート形状をとる、4つのFR領域を含み、これらのCDRは、そのβシート構造を連結する、ある場合にはβシート構造の一部を形成する、ループを形成している。各鎖のCDRはFR領域によってごく接近して一緒に保持されて、他方の鎖に由来するCDRとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)を参照されたい)。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害性への抗体の関与など、さまざまなエフェクター機能を示す。

0270

抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる、それぞれが単一の抗原結合部位を有する、2つの同一の抗原結合断片、および残りの「Fc」断片(その名称は容易に結晶化する能力を反映している)を生成する。ペプシン処理は、2つの抗原結合部位を有しかつ依然として抗原を架橋することができるF(ab')2断片を生じる。

0271

「Fv」は、抗原認識および抗原結合部位を含む抗体断片を指す。二本鎖Fv種において、この領域は、非共有結合で会合した1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Fv(scFv)種では、軽鎖と重鎖が二本鎖Fv(scFv)種のそれと同様の「二量体」構造で会合できるように、1つの重鎖可変ドメインと1つの軽鎖可変ドメインが柔軟なペプチドリンカーによって共有結合で連結され得る。各可変ドメインの3つのCDRが相互作用してVH-VL二量体の表面に抗原結合部位を規定するのは、この構成においてである。まとまって、6つのCDRは抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(または抗原に特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえも、完全な結合部位よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識して結合する能力がある。

0272

また、Fab断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第1定常ドメイン(CH1)を含む。Fab'断片は、重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端数個の残基、例えば抗体ヒンジ部に由来する1個または複数のシステインなど、が付加していることにより、Fab断片とは異なる。Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するFab'についての本明細書での名称である。F(ab')2抗体断片は、もともとは、Fab'断片間にヒンジ部のシステインを有する、Fab'断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。

0273

脊椎動物種由来の抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)およびラムダ(λ)と呼ばれる、2つの明確に区別されるタイプの1つに割り当てることができる。

0274

免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てることができる。5つの主要な免疫グロブリンのクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、これらのいくつかはサブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元立体配置は、よく知られている。

0275

「抗体断片」はインタクトな抗体の一部分のみを含み、その際、該部分は、インタクトな抗体中に存在するときの該部分と通常関連している機能の少なくとも1つ、好ましくは大半または全部、を保持することが好ましい。抗体断片の例としては、以下が挙げられる:Fab、Fab'、F(ab')2、一本鎖Fv(scFv)、Fv、dsFv、ダイアボディ、FdおよびFd'断片、Fab断片、Fd断片、scFv断片、線状抗体、一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体(例えば、Methods in Molecular Biology, Vol 207: Recombinant Antibodies for Cancer Therapy Methods and Protocols (2003); Chapter 1; p 3-25, Kipriyanovを参照されたい)。他の既知の断片としては、限定するものではないが、scFab断片が挙げられる(Hust et al.,BMCBiotechnology (2007), 7:14)。一態様では、抗体断片はインタクトな抗体の抗原結合部位を含み、それゆえ抗原に結合する能力を保持している。別の態様では、抗体断片、例えばFc領域を含むものは、インタクトな抗体中に存在するときのFc領域と通常関連している生物学的機能の少なくとも1つ、例えばFcRn結合、抗体半減期調節、ADCC機能および補体結合など、を保持している。一態様では、抗体断片は、インタクトな抗体と実質的に同様のインビボ半減期を有する一価抗体である。例えば、このような抗体断片は、該断片にインビボ安定性を付与することができるFc配列に連結された抗原結合アームを含むことができる。別の例として、抗体断片または抗体部分は、完全長より短いが、抗原結合部位を形成するのに十分な抗体の可変領域の少なくとも一部(例えば、1つまたは複数のCDR)を含み、したがって完全長抗体の結合特異性および/または活性を保持している、完全長抗体の任意の部分を指す;抗体断片には、完全長抗体の酵素処理により生成された抗体誘導体、ならびに合成的に、例えば組換えにより、生産された誘導体が含まれる。

0276

「dsFv」は、VH-VL対を安定化する、人工的に作製された分子間ジスルフィド結合を有するFvを指す。

0277

「Fd断片」は、抗体重鎖の可変ドメイン(VH)と1つの定常領域ドメイン(CH1)を含有する抗体の断片を指す。

0278

「Fab断片」は、完全長免疫グロブリンのパパインによる消化から生じる完全長抗体の一部を含有する抗体断片、または合成的に、例えば組換えにより、生産される同じ構造を有する断片を指す。Fab断片は、軽鎖(VLおよびCL部分を含む)と、重鎖の可変ドメイン(VH)および重鎖の1つの定常領域ドメイン(CH1)を含有する別の鎖を含む;それは組換えにより生産することができる。

0279

「F(ab')2断片」は、pH4.0〜4.5での免疫グロブリンのペプシンによる消化から生じる抗体断片、または合成的に、例えば組換えにより、生産された同じ構造を有する抗体を指す。F(ab')2断片は、2つのFab断片を含むが、ここで各重鎖部分は、2つの断片を結合するジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む、いくつかの追加のアミノ酸を含有する;それは組換えにより生産することができる。

0280

「Fab'断片」は、F(ab')2断片の半分(1本の重鎖と1本の軽鎖)を含む断片を指す。

0281

「Fd'断片」は、F(ab')2断片の1つの重鎖部分を含む抗体の断片を指す。

0282

「Fv'断片」は、抗体分子のVHおよびVLドメインのみを含む断片を指す。

0283

「scFv断片」は、任意の順序でポリペプチドリンカーによって共有結合で連結された、可変軽鎖(VL)と可変重鎖(VH)を含む抗体断片を指す。リンカーは、2つの可変ドメインが実質的な干渉なしに架橋されるような長さである。例示的なリンカーは、溶解性を高めるために全体に分散された数個のGluまたはLys残基を有する(Gly-Ser)n残基である。

0284

ダイアボディは二量体のscFvである;ダイアボディは典型的にはscFvよりも短いペプチドリンカーを有し、それらは優先的に二量体化する。

0285

「hsFv」は、Fab断片中に通常存在する定常ドメインがヘテロ二量体コイルドコイルドメインで置換された抗体断片を指す(例えば、Arndt et al. (2001) J Mol Biol. 7:312:221-228を参照されたい)。

0286

「超可変領域」、「HVR」または「HV」、ならびに「相補性決定領域」または「CDR」は、配列が超可変性でありかつ/または構造的に規定されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指すことができる。一般に、抗体は6つの超可変領域またはCDR領域を含む;VHに3つ(H1、H2、H3)、およびVLに3つ(L1、L2、L3)。いくつかの超可変領域またはCDRの記述が使われており、本明細書に包含される。Kabatの相補性決定領域(Kabat CDR)は、配列の多様性に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。Chothiaは、代わりに、構造ループの位置を指す(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。AbMの超可変領域は、KabatのCDRとChothiaの構造ループ(Chothia「CDR」)との折衷案を表し、Oxford Molecular社のAbM抗体モデリングソフトウェアによって使用される。「contact」の超可変領域は、利用可能な複合体結晶構造の解析に基づいている。これらの超可変領域のそれぞれに由来する残基を以下に示す。

IMGTは、Lefrace et al., Nucl. Acids, Res. 37; D1006-D1012 (2009)に記載されているように、国際免疫遺伝学情報システム(the international ImMunoGeneTics Information System)を指し、例えば、抗体のIMGT指定CDRを含む。

0287

超可変領域は、以下のような「延長された超可変領域」を含むことができる:VL中の24-36または24-34(L1)、46-56または50-56(L2)および89-97(L3)、ならびにVH中の26-35(H1)、50-65または49-65(H2)および93-102、94-102または95-102(H3)。可変ドメイン残基は、これらの定義のそれぞれについて前出のKabatらに従って番号付けされる。

0288

「フレームワーク」または「FR」残基は、本明細書で定義した超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。「フレームワーク領域(FR)」は、βシート内に位置するフレームワーク残基を含む抗体可変領域ドメイン内のドメインである;FR領域は、それらのアミノ酸配列に関して、超可変領域よりも比較的保存されている。

0289

「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、例えば、その集団を構成する個々の抗体は、モノクローナル抗体の作製中に生じる可能性のある変異体(こうした変異体は一般に少量で存在する)を除いて、同一であり、かつ/または同じエピトープに結合する。このようなモノクローナル抗体には、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体が含まれるが、その標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られたものである。例えば、選択プロセスは、ハイブリドーマクローンファージクローンまたは組換えDNAクローンのプールなど、複数のクローンから唯一のクローンを選択することであり得る。当然のことながら、選択された標的結合配列は、例えば、標的に対する親和性を向上させる、標的結合配列をヒト化する、細胞培養におけるその生産を改善する、インビボでのその免疫原性を低減させる、多重特異性抗体を作製するなどのために、さらに改変することができ、改変された標的結合配列を含む抗体もまた、本開示のモノクローナル抗体である。異なる決定基(例えば、エピトープ)に対する異なる抗体を一般に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、概ね他の免疫グロブリンの混入がないという点で有利である。修飾語モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示しており、特定の方法による抗体の生産を要求するものと解釈されるべきでない。例えば、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば以下の方法を含む、さまざまな技術によって作製することができる:ハイブリドーマ法(例えば、Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981))、組換えDNA法(例えば、米国特許第4,816,567号参照)、ファージディスプレイ法(例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004); およびLee et al. J. Immunol. Methods284(1-2):119-132 (2004)参照)、ならびにヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の一部または全部を有する動物においてヒトまたはヒト様抗体を産生するための技術(例えば、WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); 米国特許第5,545,806号; 第5,569,825号; 第5,591 ,669号; 第5,545,807号; WO 1997/17852; 米国特許第5,545,807号; 第5,545,806号; 第5,569,825号; 第5,625,126号; 第5,633,425号; および第5,661,016号; Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); およびLonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995)参照)。

0290

非ヒト(例えば、マウス)抗体の「ヒト化」型または「ヒト遺伝子操作(human engineered)」型は、例えば、最小配列が非ヒト免疫グロブリンに由来するものを含む、ヒト免疫グロブリン配列で表されるアミノ酸を含むキメラ抗体である。例えば、ヒト化抗体は、いくつかの超可変領域残基とおそらくはいくつかのFR残基が非ヒト(例えば、げっ歯類)抗体の類似部位に由来する残基によって置換されたヒト抗体とすることができる。あるいは、ヒト化抗体またはヒト遺伝子操作抗体は、いくつかの残基がヒト抗体中の類似部位に由来する残基によって置換されている非ヒト(例えば、げっ歯類)抗体とすることもできる(例えば、米国特許第5,766,886号参照)。ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域に由来する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラットウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種(ドナー抗体)の超可変領域に由来する残基によって置換されているヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(FR)残基が、対応する非ヒト残基によって置換されている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基、例えば、ケモカイン、成長因子、ペプチド、サイトカイン、細胞表面タンパク質、血清タンパク質、毒素、細胞外マトリックス、凝固因子、または分泌タンパク質配列などの非抗体配列を含んでもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練するために行うことができる。ヒト化抗体は、改変された抗体可変ドメインを調製する方法を含めて、例えば米国特許第5,766,886号に記載されているようなヒト遺伝子操作抗体を含む。ヒト化抗体は、超可変ループのすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、かつFRのすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンのそれである、少なくとも1つの、典型的には2つの、可変ドメインの実質的にすべてを含むことができる。ヒト化抗体はまた、任意で、免疫グロブリンの定常領域(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含んでもよい。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照されたい。また、本明細書に引用されている以下の総説記事および参考文献を参照されたい:Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。

0291

ハイブリッド抗体」は、異なる抗原決定領域を有する抗体に由来する重鎖と軽鎖の対が一緒に組み立てられた免疫グロブリン分子を指し、その結果として得られる四量体によって、2つの異なるエピトープまたは2つの異なる抗原が認識され、かつ結合され得るようになる。

0292

キメラ」抗体(免疫グロブリン)は、特定の種に由来するかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同の重鎖および/または軽鎖の一部を有するが、該鎖の残部は、別の種に由来するかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同であり、ならびに所望の生物学的活性を示す限り、このような抗体の断片である(例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)を参照されたい)。ヒト化抗体はキメラ抗体のサブセットを指す。

0293

「一本鎖Fv」または「scFv」抗体断片は、抗体のVHおよびVLドメインを含むことができ、その際、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖として存在する。一般的に、scFvポリペプチドはさらに、scFvが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを、VHおよびVLドメイン間に含む。scFvの総説に関しては、例えば、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。

0294

「抗原」は、抗体が選択的に結合することができる所定の抗原を指す。標的抗原は、ポリペプチド、糖質、核酸、脂質、ハプテン、または他の天然に存在するもしくは合成の化合物であり得る。好ましくは、標的抗原はポリペプチドである。

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