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課題

組み換え宿主細胞発現された場合に、改良されたオメガヒドロキシル化脂肪酸誘導体の産生をもたらすオメガ−ヒドロキシラーゼ関連融合ポリペプチドの提供。

解決手段

ある特定のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、且つ796、141、231、27、82、178、309、407、415、516及び666からなる群より選択されるアミノ酸位置において少なくとも1つの突然変異を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換触媒作用を及ぼす、前記CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

概要

背景

シトクロムP450モノオキシゲナーゼ(P450)は多様な種類の酵素である。これらはファミリーサブファミリー分類される。これらが40%以上のアミノ酸同一性共有する場合、それらは同一のファミリーに属する。これらが55%以上のアミノ酸同一性を共有する場合、それらは同一のサブファミリーに属する。P450は基質として脂肪酸を用い、ヒドロキシル化反応触媒作用を及ぼす。細菌は、アルカン分解及び脂肪酸改変関与するいくつかのP450系を有し、1000を超える微生物P450がこれまで知られている。1つの特定のP450サブファミリーはcyp153Aとして知られており、最初のものは2001年にアシネトバクターカルコセチカス(Acinetobacter calcoaceticus)からクローンとして作製された。それ以来、類似の酵素が、スフィンゴモナス属の種(Sphingomonas sp.)であるHXN200、マイコバクテリウム属の種(Mycobacterium sp.)であるHXN1500、及びアルカニボラックス・ボルクメンシス(Alcanivorax borkumensis)(Van Bogaert et al.(2011)FEBSJournal 278:206−221(非特許文献1))等の他のアルカン利用種においても同定されている。細菌のCYP153Aサブファミリー由来のいくつかのP450は、高い末端位置選択性を有するアルカンオメガヒドロキシラーゼ(ω−ヒドロキシラーゼ、ω−オキシゲナーゼとも呼ばれる)である。CYP153Aはまた、第1級アルコール、ω−ヒドロキシル化脂肪酸、及び2官能脂肪酸誘導体(例、α,ω−ジカルボン酸及びα,ω−ジオール)等の工業的に関連するオメガ−ヒドロキシル化(ω−ヒドロキシル化)脂肪族化合物の合成にも関連している(Honda Malca et al.(2012)Chem.Commun.48:5115−5117(非特許文献2))。

概要

組み換え宿主細胞発現された場合に、改良されたオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体の産生をもたらすオメガ−ヒドロキシラーゼ関連融合ポリペプチドの提供。ある特定のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、且つ796、141、231、27、82、178、309、407、415、516及び666からなる群より選択されるアミノ酸位置において少なくとも1つの突然変異を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、前記CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。なし

目的

Van Bogaert et al.(2011)FEBSJournal 278:206−221
Honda Malca et al.(2012)Chem.Commun.48:5115−5117





本開示は、宿主細胞においてオメガ−ヒドロキシル化及び2官能性脂肪酸誘導体を産生することができるオメガ−ヒドロキシラーゼ関連融合ポリペプチド及びそのバリアントを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、且つ796、141、231、27、82、178、309、407、415、516及び666からなる群より選択されるアミノ酸位置において少なくとも1つの突然変異を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸オメガヒドロキシル化脂肪酸への転換触媒作用を及ぼす、前記CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項2

ハイブリッドcyp153A−RedRhF融合タンパク質バリアントである、請求項1に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項3

前記突然変異が、A796V、V141I、V141T、V141Q、V141G、V141M、V141L、A231T、R27L、R82D、R178N、N309R、N407A、V415R、T516V、P666A及びP666Dからなる群より選択される、請求項1に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項4

前記突然変異が、A796V、V141I、V141T及びA231Tからなる群より選択される、請求項3に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項5

組み換え宿主細胞での前記CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現が、配列番号6のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸の力価と比較してより高いオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸の力価をもたらす、請求項4に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項6

配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、及び配列番号46のいずれか1つを含む、請求項3に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項7

V141I及びA231Tに突然変異を有する、請求項3に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項8

配列番号32を含む、請求項7に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項9

脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、請求項8に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項10

R27L、R82D、V141M、R178N及びN407Aに突然変異を有する、請求項3に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項11

配列番号34を含む、請求項10に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項12

脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、請求項11に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項13

P666Aに突然変異を有する、請求項3に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項14

配列番号36を含む、請求項13に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項15

脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、請求項14に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項16

A796Vに突然変異を有する、請求項3に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項17

配列番号38を含む、請求項16に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項18

脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、請求項17に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項19

A796V、P666D及びT516Vに突然変異を有する、請求項3に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項20

配列番号40を含む、請求項19に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項21

脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、請求項20に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項22

V141I、A231T及びA796Vに突然変異を有する、請求項3に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項23

配列番号42を含む、請求項22に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項24

脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、請求項23に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項25

R27L、R82D、V141M、R178N、N407A及びA796Vに突然変異を有する、請求項3に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項26

配列番号44を含む、請求項25に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項27

脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、請求項26に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項28

V141T、A231T及びA796Vに突然変異を有する、請求項3に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項29

配列番号46を含む、請求項28に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項30

脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、請求項29に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項31

請求項1〜29のいずれか1項に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する組み換え宿主細胞。

請求項32

さらに、EC3.1.2.−、EC3.1.1.5またはEC3.1.2.14のチオエステラーゼポリペプチドを発現する、請求項31に記載の組み換え宿主細胞。

請求項33

炭素源含有培地において培養された場合において、対応するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する宿主細胞により産生されるオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸組成物の力価より、少なくとも10%大きい、少なくとも15%大きい、少なくとも20%大きい、少なくとも25%大きい、または少なくとも30%大きい力価を有するオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸組成物を産生する、請求項32に記載の組み換え宿主細胞。

請求項34

前記オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸を細胞内で産生する、請求項33に記載の組み換え宿主細胞。

請求項35

前記オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸を細胞外で産生する、請求項34に記載の組み換え宿主細胞。

請求項36

請求項31〜35のいずれか1項に記載の組み換え宿主細胞を含む細胞培養物

請求項37

前記オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸が、C12、C16及びC16:1オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸のうちの1種類以上を含む、請求項36に記載の細胞培養物。

請求項38

前記オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸が不飽和オメガ−ヒドロキシル化C16:1脂肪酸を含む、請求項37に記載の細胞培養物。

請求項39

前記オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸が飽和オメガ−ヒドロキシル化C12脂肪酸を含む、請求項37に記載の細胞培養物。

請求項40

i.請求項31に記載の宿主細胞を炭素源を用いて培養すること、ii.オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸を採取することを含む、力価が増加したオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸を産生する方法。

請求項41

前記オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸が飽和オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸である、請求項40に記載の方法。

請求項42

前記オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸が不飽和オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸である、請求項40に記載の方法。

請求項43

再生可能原料からの炭素源の存在下、発酵ブロス中で増殖させた場合にインビボでオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体を産生するための組み換え微生物であって、(i)EC3.1.2.−、EC3.1.1.5またはEC3.1.2.14のチオエステラーゼ、及び(ii)CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを含むポリペプチドをコードする少なくとも2つの核酸配列を発現するように操作された経路を含む、前記組み換え微生物。

請求項44

前記CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが自己充足型(self−sufficient)CYP153A−RedRhFハイブリッド融合タンパク質バリアントである、請求項1に記載の組み換え微生物。

請求項45

前記CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、及び配列番号46のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する、請求項1に記載の組み換え微生物。

請求項46

配列番号38に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、且つ747、12、327、14、61、28、13、771、119、10、11、28、745、9、770、413、784、749、231、233、757及び703からなる群より選択されるアミノ酸位置において少なくとも1つの突然変異を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、前記CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

請求項47

前記突然変異が、D747N、Q12W、Q12T、Q12R、P327D、R14F、N61L、Q28M、S13K、V771F、K119R、D10Y、I11L、Q28T、P745R、D9N、D9K、T770G、Y413R、M784I、E749L、A231Y、S233L、E757A及びL703Gからなる群より選択される、請求項1に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2014年6月16日に出願された米国仮特許出願第62/012,970号の利益を主張し、その開示全体を参照により本明細書に組み込む。

0002

配列表
本出願は、ASCIIフォーマット電子的に提出された配列表を含んでおり、その全体を参照によりここに組み込む。2015年6月16日に作成された当該ASCIIの写しは、LS00054PCT_SL.txtと名付けられ、サイズは484,554バイトである。

0003

分野
本開示は、組み換え宿主細胞発現された場合に、改良されたオメガヒドロキシル化脂肪酸誘導体の産生をもたらすオメガ−ヒドロキシラーゼ関連融合ポリペプチドに関する。さらに本開示は、オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体の産生のためのオメガ−ヒドロキシラーゼ関連融合ポリペプチドを発現させるための微生物に関する。

背景技術

0004

シトクロムP450モノオキシゲナーゼ(P450)は多様な種類の酵素である。これらはファミリーサブファミリー分類される。これらが40%以上のアミノ酸同一性共有する場合、それらは同一のファミリーに属する。これらが55%以上のアミノ酸同一性を共有する場合、それらは同一のサブファミリーに属する。P450は基質として脂肪酸を用い、ヒドロキシル化反応触媒作用を及ぼす。細菌は、アルカン分解及び脂肪酸改変関与するいくつかのP450系を有し、1000を超える微生物P450がこれまで知られている。1つの特定のP450サブファミリーはcyp153Aとして知られており、最初のものは2001年にアシネトバクターカルコセチカス(Acinetobacter calcoaceticus)からクローンとして作製された。それ以来、類似の酵素が、スフィンゴモナス属の種(Sphingomonas sp.)であるHXN200、マイコバクテリウム属の種(Mycobacterium sp.)であるHXN1500、及びアルカニボラックス・ボルクメンシス(Alcanivorax borkumensis)(Van Bogaert et al.(2011)FEBSJournal 278:206−221(非特許文献1))等の他のアルカン利用種においても同定されている。細菌のCYP153Aサブファミリー由来のいくつかのP450は、高い末端位置選択性を有するアルカンオメガ−ヒドロキシラーゼ(ω−ヒドロキシラーゼ、ω−オキシゲナーゼとも呼ばれる)である。CYP153Aはまた、第1級アルコール、ω−ヒドロキシル化脂肪酸、及び2官能脂肪酸誘導体(例、α,ω−ジカルボン酸及びα,ω−ジオール)等の工業的に関連するオメガ−ヒドロキシル化(ω−ヒドロキシル化)脂肪族化合物の合成にも関連している(Honda Malca et al.(2012)Chem.Commun.48:5115−5117(非特許文献2))。

先行技術

0005

Van Bogaert et al.(2011)FEBSJournal 278:206−221
Honda Malca et al.(2012)Chem.Commun.48:5115−5117

0006

本開示は、宿主細胞においてオメガ−ヒドロキシル化及び2官能性脂肪酸誘導体を産生することができるオメガ−ヒドロキシラーゼ関連融合ポリペプチド及びそのバリアントを提供する。さらに具体的には、本開示は、ω−ヒドロキシル化脂肪酸、ω−ヒドロキシル化脂肪酸エステル、α,ω−二酸、α,ω−ジエステル、α,ω−ジオール、及びこれら由来のマクロラクトン等の化学物質を含む、オメガ−ヒドロキシル化(ω−ヒドロキシル化)及び2官能性脂肪酸誘導体並びにその組成物を産生するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。また、特定のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合核酸及びタンパク質配列、並びにこのような操作されたCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを包含する組み換え宿主細胞及び細胞培養物も提供する。本開示はまた、ω−ヒドロキシル化及び/または2官能性脂肪酸誘導体またはその組成物を作製するために、組み換えCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント発現宿主細胞を用いる方法も提供する。

0007

本開示の1つの態様は、脂肪酸のω−ヒドロキシル化(ω−OH)脂肪酸または脂肪酸誘導体への転換触媒として作用するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドであって、配列番号6のポリペプチド配列に対して少なくとも約90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを提供する。さらに、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド及びそのバリアントを発現する方法も挙げられる。1つの態様において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドが、配列番号6に対して少なくとも約90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有し、且つ組み換え宿主細胞におけるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現が、野生型CYP153Aの発現により産生される力価に比べて、ω−OH脂肪酸またはω−OH脂肪酸誘導体或いはその組成物においてより高い力価をもたらす。1つの態様において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現に有効な条件下、炭素源含有培地で培養された場合に、組み換え宿主細胞は、対応する野生型CYP153Aを発現する宿主細胞により産生されるω−OH脂肪酸またはω−OH脂肪酸誘導体或いはその組成物の力価より、少なくとも約10%超過の力価を有するω−OH脂肪酸またはω−OH脂肪酸誘導体或いはその組成物を産生する。別の態様では、ω−OH脂肪酸またはω−OH脂肪酸誘導体或いはその組成物は細胞外で産生される。

0008

本開示の別の態様は、配列番号6に対して少なくとも約90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、且つ796、141、231、27、82、178、309、407、415、516及び/または666の位置を含むアミノ酸位置において少なくとも1つの突然変異を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸のω−OH脂肪酸への転換に触媒として作用するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、下記:アラニン(A)がバリン(V)で置換されている(即ち、それと交換されている)位置A796V;バリンがイソロイシン(I)で置換されている位置V141I;バリン(V)がグルタミン(Q)で置換されている位置V141Q;バリン(V)がグリシン(G)で置換されている位置V141G;バリン(V)がメチオニン(M)で置換されている位置V141M;バリン(V)がロイシン(L)で置換されている位置V141L;バリン(V)がスレオニン(T)で置換されている位置V141T;アラニン(A)がスレオニン(T)で置換されている位置A231T;アルギニン(R)がリシン(L)で置換されている位置R27L;アルギニン(R)がアスパラギン酸(D)で置換されている位置R82D;アルギニン(R)がアスパラギン(N)で置換されている位置R178N;アスパラギン(N)がアルギニン(R)で置換されている位置N309R;アスパラギン(N)がアラニン(A)で置換されている位置N407A;バリン(V)がアルギニン(R)で置換されている位置V415R;スレオニン(T)がバリン(V)で置換されている位置T516V;プロリン(P)がアラニン(A)で置換されている位置P666A;及びプロリン(P)がアスパラギン酸(D)で置換されている位置P666Dを含む位置のいずれか1つまたはそれ以上に突然変異を有する。CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの例として、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28または配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、及び配列番号46が挙げられる。1つの実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントはハイブリッドcyp153A−RedRhF−タイプ融合タンパク質バリアントである。別の実施形態では、組み換え宿主細胞におけるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、対応する宿主細胞におけるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−OH脂肪酸またはω−OH脂肪酸誘導体或いはその組成物の力価と比較して、ω−OH脂肪酸またはω−OH脂肪酸誘導体或いはその組成物においてより高い力価をもたらす。別の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、A796Vを含むアミノ酸位置796に突然変異を有する。別の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、A231T等のアミノ酸位置231に突然変異を有する。別の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、V141I及び/またはV141T等のアミノ酸位置141に突然変異を有する。ここで、組み換え宿主細胞における突然変異A796V、V141I、V141T及び/またはA231Tを有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現は、それぞれ、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−OH C12またはC16脂肪酸の力価と比較して、ω−OH C12またはC16脂肪酸においてより高い力価をもたらす。

0009

本開示は、さらに前記のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント(上記)を発現する組み換え宿主細胞を有する細胞培養物を企図する。ω−OH脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物は、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19及びC20 ω−OH脂肪酸または脂肪酸誘導体のうちの1種類以上を含むことができる。ω−OH脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物は飽和または不飽和のω−OH脂肪酸または脂肪酸誘導体を含むことができる。別の実施形態において、ω−OH脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物は、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及びC20:1不飽和ω−OH脂肪酸または脂肪酸誘導体のうちの1種類以上を含むことができる。別の実施形態において、ω−OH脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物はω−OH C12及び/またはC16及び/またはC16:1脂肪酸または脂肪酸誘導体を含むことができる。

0010

本開示の別の態様は、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント(上記)を発現する宿主細胞を炭素源を用いて培養すること、及びω−OH脂肪酸またはω−OH脂肪酸誘導体を採取することを含む、力価が向上したω−OH脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物を産生する方法を提供する。1つの態様において、ω−OH脂肪酸またはω−OH脂肪酸誘導体は、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド発現宿主細胞により産出されるω−OH脂肪酸またはω−OH脂肪酸誘導体の力価より、少なくとも約20%〜30%大きい。別の態様では、ω−OH脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物は、炭素源から約15g/L〜約25g/Lの力価で産出される。

0011

本開示の別の態様は、V141IまたはA231Tに突然変異を有する配列番号32に対して、少なくとも約90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸を、ω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物に転換するのに触媒作用を及ぼすCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。本開示の別の態様は、R27L、R82D、V141M、R178N及びN407Aに突然変異を有する配列番号34に対して、少なくとも約90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸を、ω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物に転換するのに触媒作用を及ぼすCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。本開示の別の態様は、P666Aに突然変異を有する配列番号36に対して、少なくとも約90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸を、ω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物に転換するのに触媒作用を及ぼすCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。本開示の別の態様は、A796Vに突然変異を有する配列番号38に対して、少なくとも約90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸を、ω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物に転換するのに触媒作用を及ぼすCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。本開示の別の態様は、A796V、P666D及びT516Vに突然変異を有する配列番号40に対して、少なくとも約90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸を、ω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物に転換するのに触媒作用を及ぼすCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。本開示の別の態様は、V141I、A231T及びA796Vに突然変異を有する配列番号42に対して、少なくとも約90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸を、ω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物に転換するのに触媒作用を及ぼすCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。本開示の別の態様は、R27L、R82D、V141M、R178N、N407A及びA796Vに突然変異を有する配列番号44に対して、少なくとも約90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸を、ω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物に転換するのに触媒作用を及ぼすCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。本開示の別の態様は、V141T、A231T及びA796Vに突然変異を有する配列番号46に対して、少なくとも約90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸を、ω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物に転換するのに触媒作用を及ぼすCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。

0012

本開示は、前記のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント(上記)を発現する組み換え宿主細胞をさらに企図する。1つの実施形態において、組み換え宿主細胞は、前記のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント(上記)、及びEC 3.1.2.−またはEC 3.1.1.5またはEC 3.1.2.14のチオエステラーゼポリペプチドを発現し、この組み換え宿主細胞は、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現するために有効な条件下で炭素源含有培地において培養された場合において、対応するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する宿主細胞により産生されるω−OH脂肪酸またはその組成物の力価より、少なくとも10%大きい、少なくとも15%大きい、少なくとも20%大きい、少なくとも25%大きい、または少なくとも30%大きい力価を有するω−OH脂肪酸またはその組成物を産生する。1つの実施形態において、ω−OH脂肪酸またはその組成物は、約15g/L〜約25g/Lの力価で産生されることができる。別の態様では、ω−OH脂肪酸またはその組成物は、細胞外で産生される。

0013

1つの態様において、本開示は、再生可能原料からの炭素源の存在下、発酵ブロス中で増殖させた場合にインビボでω−OH脂肪酸または脂肪酸誘導体を産生するための組み換え微生物を包含し、この組み換え微生物は、EC 3.1.2.−またはEC 3.1.1.5またはEC 3.1.2.14のチオエステラーゼ、及びCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを含むポリペプチドをコードする少なくとも2種類の核酸配列を発現するように操作された経路を含み、このCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、及び配列番号46のいずれか1つに対して少なくとも90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する。1つの実施形態では、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは自己充足型(self−sufficient)CYP153A−RedRhFハイブリッド融合タンパク質バリアントである。

0014

本開示の別の態様は、前記の組み換え宿主細胞(上記)を含む細胞培養物を提供し、この細胞培養物は、ω−OH脂肪酸またはその組成物を産生する。1つの実施形態では、細胞培養物は、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物のうちの1種類以上を含むω−OH脂肪酸を産生する。1つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−OH C16:1脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−OH C16脂肪酸またはその組成物を産生する。1つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−OH C12:1脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−OH C12脂肪酸またはその組成物を産生する。1つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−OH C14:1脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−OH C14脂肪酸またはその組成物を産生する。1つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−OH C18:1脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−OH C18脂肪酸またはその組成物を産生する。1つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−OH C10:1脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−OH C10脂肪酸またはその組成物を産生する。1つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−OH C8:1脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−OH C8脂肪酸またはその組成物を産生する。1つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−OH C20:1脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−OH C20脂肪酸またはその組成物を産生する。さらに別の実施形態において、追加の飽和または不飽和ω−OH脂肪酸またはその組成物が組み換え宿主細胞により産生される。

0015

本開示のなお別の態様は、宿主細胞(上記)を炭素源を用いて培養し、ω−OH脂肪酸またはその組成物を採取することを含む、力価の増加したω−OH脂肪酸を産生する方法を提供する。本方法は、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物であるω−OH脂肪酸を採取することを企図している。1つの実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、不飽和ω−OH C16:1脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、飽和ω−OH C16脂肪酸またはその組成物である。1つの実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、不飽和ω−OH C12:1脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、飽和ω−OH C12脂肪酸またはその組成物である。1つの実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、不飽和ω−OH C14:1脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、飽和ω−OH C14脂肪酸またはその組成物である。1つの実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、不飽和ω−OH C18:1脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、飽和ω−OH C18脂肪酸またはその組成物である。1つの実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、不飽和ω−OH C10:1脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、飽和ω−OH C10脂肪酸またはその組成物である。1つの実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、不飽和ω−OH C8:1脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、飽和ω−OH C8脂肪酸またはその組成物である。1つの実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、不飽和ω−OH C20:1脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、飽和ω−OH C20脂肪酸またはその組成物である。さらに別の実施形態において、追加の飽和または不飽和ω−OH脂肪酸またはその組成物がここに記載された方法により産生される。

0016

本開示の別の態様は、配列番号38に対して少なくとも約90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、且つ9、10、11、12、13、14、27、28、56、61、111、119、140、149、154、157、162、164、204、231、233、244、254、271、273、302、309、327、407、413、477、480、481、527、544、546、557、567、591、648、649、703、706、707、708、709、710、719、720、736、741、745、747、749、757、770、771、784の位置を含むアミノ酸位置において少なくとも1つの突然変異を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸のω−OH脂肪酸またはその組成物への転換に触媒として作用するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、下記:アスパラギン酸塩(D)がアスパラギン(N)で置換されている(即ち、それと交換されている)位置D9N;アスパラギン酸塩(D)がリシン(K)で置換されている位置D9K;アスパラギン酸(D)がチロシン(Y)で置換されている位置D10Y;イソロイシン(I)がロイシン(L)で置換されている位置I11L;グルタミン(Q)がトリプトファン(W)で置換されている位置Q12W;グルタミン(Q)がアルギニン(R)で置換されている位置Q12R;グルタミン(Q)がスレオニン(T)で置換されている位置Q12T;セリン(S)がリシン(K)で置換されている位置S13K;アルギニン(R)がフェニルアラニン(F)で置換されている位置R14F;アルギニン(R)がロイシン(L)で置換されている位置R27L;グルタミン(Q)がメチオニン(M)で置換されている位置Q28M;グルタミン(Q)がスレオニン(T)で置換されている位置Q28T;プロリン(P)がグルタミン(Q)で置換されている位置P56Q;アスパラギン(N)がロイシン(L)で置換されている位置N61L;フェニルアラニン(F)がアラニン(A)で置換されている位置F111A;リシン(K)がアルギニン(R)で置換されている位置K119R;セリン(S)がアスパラギン(N)で置換されている位置S140N;プロリン(P)がグリシン(G)で置換されている位置P149G;プロリン(P)がアルギニン(R)で置換されている位置P149R;バリン(V)がグリシン(G)で置換されている位置V154G;セリン(S)がアルギニン(R)で置換されている位置S157R;バリン(V)がシステイン(C)で置換されている位置V162C;アラニン(A)がアスパラギン(N)で置換されている位置A164N;グルシン(G)がバリン(V)で置換されている位置G204V;アラニン(A)がトリプトファン(W)で置換されている位置A231W;アラニン(A)がチロシン(Y)で置換されている位置A231Y;アラニン(A)がバリン(V)で置換されている位置A231V;セリン(S)がロイシン(L)で置換されている位置S233L;セリン(S)がバリン(V)で置換されている位置S233V;アラニン(A)がアルギニン(R)で置換されている位置A244R;アルギニン(R)がグリシン(G)で置換されている位置R254G;グルタミン酸塩(E)がアスパラギン酸塩(D)で置換されている位置E271D;プロリン(P)がメチオニン(M)で置換されている位置P273M;スレオニン(T)がメチオニン(M)で置換されている位置T302M;アスパラギン(N)がセリン(S)で置換されている位置N309S;プロリン(P)がアスパラギン酸塩(D)で置換されている位置P327D;アスパラギン(N)がグリシン(G)で置換されている位置N407G;チロシン(Y)がアルギニン(R)で置換されている位置Y413R;プロリン(P)がグリシン(G)で置換されている位置P477G;イソロイシン(I)がグリシン(G)で置換されている位置I480G;グリシン(G)がイソロイシン(I)で置換されている位置G481I;アスパラギン酸塩(D)がグルタミン酸塩(E)で置換されている位置D527E;アスパラギン酸塩(D)がアスパラギン(N)で置換されている位置D544N;プロリン(P)がグリシン(G)で置換されている位置P546G;グルタミン酸塩(E)がアルギニン(R)で置換されている位置E557R;グルタミン酸塩(E)がトリプトファン(W)で置換されている位置E557W;グルタミン酸塩(E)がセリン(S)で置換されている位置E567S;グルタミン酸塩(E)がグルタミン(Q)で置換されている位置E591Q;バリン(V)がロイシン(L)で置換されている位置V648L;セリン(S)がイソロイシン(I)で置換されている位置S649I;ロイシン(L)がグリシン(G)で置換されている位置L703G;ロイシン(L)がグルタミン酸塩(E)で置換されている位置L706E;ロイシン(L)がセリン(S)で置換されている位置L706S;ロイシン(L)がヒスチジン(H)で置換されている位置L706H;アスパラギン酸塩(D)がグルタミン酸塩(E)で置換されている位置D707E;プロリン(P)がセリン(S)で置換されている位置P708S;アスパラギン酸塩(D)がロイシン(L)で置換されている位置D709L;バリン(V)がシステイン(C)で置換されている位置V710C;バリン(V)がアルギニン(R)で置換されている位置V710R;バリン(V)がグルタミン(Q)で置換されている位置V710Q;アルギニン(R)がトリプトファン(W)で置換されている位置R719W;アスパラギン酸塩(D)がバリン(V)で置換されている位置D720V;アラニン(A)がバリン(V)で置換されている位置A736V;アスパラギン(N)がグリシン(G)で置換されている位置N741G;プロリン(P)がリシン(K)で置換されている位置P745K;プロリン(P)がアルギニン(R)で置換されている位置P745R;アスパラギン酸塩(D)がアスパラギン(N)で置換されている位置D747N;グルタミン酸塩(E)がロイシン(L)で置換されている位置E749L;グルタミン酸塩(E)がメチオニン(M)で置換されている位置E749M;グルタミン酸塩(E)がアラニン(A)で置換されている位置E757A;スレオニン(T)がグリシン(G)で置換されている位置T770G;バリン(V)がフェニルアラニン(F)で置換されている位置V771F;及びメチオニン(M)がイソロイシン(I)で置換されている位置M784Iを含む位置のいずれか1つ以上に突然変異を有する。1つの実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントはハイブリッドcyp153A−RedRhF−タイプ融合タンパク質バリアントである。別の実施形態では、組み換え宿主細胞におけるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、対応する宿主細胞におけるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−OH脂肪酸の力価と比較して、ω−OH脂肪酸のより高い力価をもたらす。別の実施形態において、ω−OH脂肪酸はω−OH脂肪酸組成物である。

0017

本開示の別の態様は、配列番号38に対して少なくとも約90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の配列同一性を有し、且つ747、12、327、14、61、28、13、771、119、10、11、28、745、9、770、413、784、749、233、757、及び703の位置を含むアミノ酸位置において少なくとも1つの突然変異を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸のω−OH脂肪酸への転換に触媒として作用するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、下記:アスパラギン酸塩(D)がアスパラギン(N)で置換されている位置D747N;グルタミン(Q)がトリプトファン(W)で置換されている位置Q12W;グルタミン(Q)がアルギニン(R)で置換されている位置Q12R;グルタミン(Q)がスレオニン(T)で置換されている位置Q12T;プロリン(P)がアスパラギン酸塩(D)で置換されている位置P327D;アルギニン(R)がフェニルアラニン(F)で置換されている位置R14F;アスパラギン(N)がロイシン(L)で置換されている位置N61L;グルタミン(Q)がメチオニン(M)で置換されている位置Q28M;セリン(S)がリシン(K)で置換されている位置S13K;バリン(V)がフェニルアラニン(F)で置換されている位置V771F;リシン(K)がアルギニン(R)で置換されている位置K119R;アスパラギン酸(D)がチロシン(Y)で置換されている位置D10Y;イソロイシン(I)がロイシン(L)で置換されている位置I11L;グルタミン(Q)がスレオニン(T)で置換されている位置Q28T;プロリン(P)がアルギニン(R)で置換されている位置P745R;アスパラギン酸塩(D)がアスパラギン(N)で置換されている位置D9N;アスパラギン酸塩(D)がリシン(K)で置換されている位置D9K;スレオニン(T)がグリシン(G)で置換されている位置T770G;チロシン(Y)がアルギニン(R)で置換されている位置Y413R;メチオニン(M)がイソロイシン(I)で置換されている位置M784I;グルタミン酸塩(E)がロイシン(L)で置換されている位置E749L;セリン(S)がロイシン(L)で置換されている位置S233L;グルタミン酸塩(E)がアラニン(A)で置換されている位置E757A;及びロイシン(L)がグリシン(G)で置換されている位置L703Gを含む位置のいずれか1つ以上に突然変異を有する。1つの実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントはハイブリッドcyp153A−RedRhF−タイプ融合タンパク質バリアントである。別の実施形態では、組み換え宿主細胞におけるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、対応する宿主細胞におけるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−OH脂肪酸の力価と比較して、ω−OH脂肪酸のより高い力価をもたらす。別の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント(及び対応するポリヌクレオチド配列)は配列番号47〜96を含む。別の実施形態において、ω−OH脂肪酸はω−OH脂肪酸組成物である。

0018

1つの態様において、本開示は、再生可能原料からの炭素源の存在下、発酵ブロス中で増殖させた場合にインビボでω−OH脂肪酸またはω−OH脂肪酸誘導体を産生するための組み換え微生物または組み換え宿主細胞を包含し、この微生物は、EC 3.1.2.−またはEC 3.1.1.5またはEC 3.1.2.14のチオエステラーゼ、及びCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを含むポリペプチドをコードする少なくとも2種類の核酸配列を発現するように操作された経路を有し、このCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68、配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、及び配列番号96のいずれか1つに対して少なくとも90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有する。1つの実施形態では、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは自己充足型CYP153A−RedRhFハイブリッド融合タンパク質バリアントである。

0019

本開示の別の態様は、前記の組み換え宿主細胞(上記)を含む細胞培養物を提供し、この細胞培養物は、ω−OH脂肪酸またはその組成物を産生する。1つの実施形態において、細胞培養物は、C6、C7、O8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物のうちの1種類以上を含むω−OH脂肪酸を産生する。1つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−OH C16:1脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−OH C16脂肪酸またはその組成物を産生する。1つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−OH C12:1脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−OH C12脂肪酸またはその組成物を産生する。1つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−OH C14:1脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−OH C14脂肪酸またはその組成物を産生する。1つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−OH C18:1脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−OH C18脂肪酸またはその組成物を産生する。1つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−OH C10:1脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−OH C10脂肪酸またはその組成物を産生する。1つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−OH C8:1脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−OH C8脂肪酸またはその組成物を産生する。1つの実施形態において、細胞培養物は、不飽和ω−OH C20:1脂肪酸またはその組成物を産生する。別の実施形態において、細胞培養物は、飽和ω−OH C20脂肪酸またはその組成物を産生する。さらに別の実施形態において、追加の飽和または不飽和ω−OH脂肪酸またはその組成物は組み換え宿主細胞により産生される。

0020

本開示のなお別の態様は、宿主細胞(上記)を炭素源を用いて培養し、ω−OH脂肪酸またはその組成物を採取することを含む、力価の増加したω−OH脂肪酸を産生する方法を提供する。特に、本方法は、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸または脂肪酸誘導体或いはその組成物を産生することを包含する。1つの実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、不飽和ω−OH C16:1脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、飽和ω−OH C16脂肪酸またはその組成物である。1つの実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、不飽和ω−OH C12:1脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、飽和ω−OH C12脂肪酸またはその組成物である。1つの実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、不飽和ω−OH C14:1脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、飽和ω−OH C14脂肪酸またはその組成物である。1つの実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、不飽和ω−OH C18:1脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、飽和ω−OH C18脂肪酸またはその組成物である。1つの実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、不飽和ω−OH C10:1脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、飽和ω−OH C10脂肪酸またはその組成物である。1つの実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、不飽和ω−OH C8:1脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、飽和ω−OH C8脂肪酸またはその組成物である。1つの実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、不飽和ω−OH C20:1脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、飽和ω−OH C20脂肪酸またはその組成物である。1つの実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、不飽和ω−OH C22:1脂肪酸またはその組成物である。別の実施形態において、採取したω−OH脂肪酸は、飽和ω−OH C22脂肪酸またはその組成物である。
[本発明1001]
配列番号6に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、且つ796、141、231、27、82、178、309、407、415、516及び666からなる群より選択されるアミノ酸位置において少なくとも1つの突然変異を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、前記CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1002]
ハイブリッドcyp153A−RedRhF融合タンパク質バリアントである、本発明1001のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1003]
前記突然変異が、A796V、V141I、V141T、V141Q、V141G、V141M、V141L、A231T、R27L、R82D、R178N、N309R、N407A、V415R、T516V、P666A及びP666Dからなる群より選択される、本発明1001のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1004]
前記突然変異が、A796V、V141I、V141T及びA231Tからなる群より選択される、本発明1003のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1005]
組み換え宿主細胞での前記CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現が、配列番号6のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸の力価と比較してより高いオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸の力価をもたらす、本発明1004のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1006]
配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、及び配列番号46のいずれか1つを含む、本発明1003のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1007]
V141I及びA231Tに突然変異を有する、本発明1003のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1008]
配列番号32を含む、本発明1007のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1009]
脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、本発明1008のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1010]
R27L、R82D、V141M、R178N及びN407Aに突然変異を有する、本発明1003のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1011]
配列番号34を含む、本発明1010のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1012]
脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、本発明1011のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1013]
P666Aに突然変異を有する、本発明1003のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1014]
配列番号36を含む、本発明1013のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1015]
脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、本発明1014のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1016]
A796Vに突然変異を有する、本発明1003のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1017]
配列番号38を含む、本発明1016のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1018]
脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、本発明1017のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1019]
A796V、P666D及びT516Vに突然変異を有する、本発明1003のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1020]
配列番号40を含む、本発明1019のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1021]
脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、本発明1020のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1022]
V141I、A231T及びA796Vに突然変異を有する、本発明1003のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1023]
配列番号42を含む、本発明1022のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1024]
脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、本発明1023のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1025]
R27L、R82D、V141M、R178N、N407A及びA796Vに突然変異を有する、本発明1003のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1026]
配列番号44を含む、本発明1025のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1027]
脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、本発明1026のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1028]
V141T、A231T及びA796Vに突然変異を有する、本発明1003のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1029]
配列番号46を含む、本発明1028のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1030]
脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、本発明1029のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1031]
本発明1001〜1029のいずれかのCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する組み換え宿主細胞。
[本発明1032]
さらに、EC 3.1.2.−、EC 3.1.1.5またはEC 3.1.2.14のチオエステラーゼポリペプチドを発現する、本発明1031の組み換え宿主細胞。
[本発明1033]
炭素源含有培地において培養された場合において、対応するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する宿主細胞により産生されるオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸組成物の力価より、少なくとも10%大きい、少なくとも15%大きい、少なくとも20%大きい、少なくとも25%大きい、または少なくとも30%大きい力価を有するオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸組成物を産生する、本発明1032の組み換え宿主細胞。
[本発明1034]
前記オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸を細胞内で産生する、本発明1033の組み換え宿主細胞。
[本発明1035]
前記オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸を細胞外で産生する、本発明1034の組み換え宿主細胞。
[本発明1036]
本発明1031〜1035のいずれかの組み換え宿主細胞を含む細胞培養物。
[本発明1037]
前記オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸が、C12、C16及びC16:1オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸のうちの1種類以上を含む、本発明1036の細胞培養物。
[本発明1038]
前記オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸が不飽和オメガ−ヒドロキシル化C16:1脂肪酸を含む、本発明1037の細胞培養物。
[本発明1039]
前記オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸が飽和オメガ−ヒドロキシル化C12脂肪酸を含む、本発明1037の細胞培養物。
[本発明1040]
i.本発明1031の宿主細胞を炭素源を用いて培養すること、
ii.オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸を採取すること
を含む、力価が増加したオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸を産生する方法。
[本発明1041]
前記オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸が飽和オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸である、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸が不飽和オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸である、本発明1040の方法。
[本発明1043]
再生可能原料からの炭素源の存在下、発酵ブロス中で増殖させた場合にインビボでオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体を産生するための組み換え微生物であって、
(i)EC 3.1.2.−、EC 3.1.1.5またはEC 3.1.2.14のチオエステラーゼ、及び
(ii)CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント
を含むポリペプチドをコードする少なくとも2つの核酸配列を発現するように操作された経路を含む、前記組み換え微生物。
[本発明1044]
前記CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが自己充足型(self−sufficient)CYP153A−RedRhFハイブリッド融合タンパク質バリアントである、本発明1001の組み換え微生物。
[本発明1045]
前記CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントが配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28、配列番号30、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、及び配列番号46のいずれか1つに対して少なくとも90%の配列同一性を有する、本発明1001の組み換え微生物。
[本発明1046]
配列番号38に対して少なくとも90%の配列同一性を有し、且つ747、12、327、14、61、28、13、771、119、10、11、28、745、9、770、413、784、749、231、233、757及び703からなる群より選択されるアミノ酸位置において少なくとも1つの突然変異を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸のオメガ−ヒドロキシル化脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、前記CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。
[本発明1047]
前記突然変異が、D747N、Q12W、Q12T、Q12R、P327D、R14F、N61L、Q28M、S13K、V771F、K119R、D10Y、I11L、Q28T、P745R、D9N、D9K、T770G、Y413R、M784I、E749L、A231Y、S233L、E757A及びL703Gからなる群より選択される、本発明1001のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント。

図面の簡単な説明

0021

本開示は、いくつかの好ましい実施形態を示す役割を担う添付の図面を併用して読んだ時に、最も良く理解される。しかしながら、本開示が、図面に記載された具体的な実施形態に限定されないことが理解される。

0022

組み換え微生物においてCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント及びチオエステラーゼポリペプチドの発現の結果として、例えば、ω−ヒドロキシル化C12脂肪酸(ω−OH C12FFA)及び/またはω−ヒドロキシル化C16:1脂肪酸(ω−OH C16:1 FFA)等のω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体を産生するための生合成経路の例を模式的に概観するものである。FABは微生物中の脂肪酸生合成を示し;fatB1は、アンベルリアカリフォルニカ(Umbellularia californica)(カリフォルニア湾)由来の中鎖アシル−ACPチオエステラーゼを示し;そしてfatA3はシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来の長鎖アシル−ACPチオエステラーゼを示す。
CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現の結果としてω−ヒドロキシル化脂肪酸を産生する例を示している。バリアントによるω−ヒドロキシル化(ω−OH)脂肪酸の産生を示すために、部位飽和突然変異誘発を用いた。描かれたグラフは、cypl53A(G307A、A796V)−Red450RhFのアミノ酸位置141及び309の部位飽和突然変異誘発のベストヒットを示す。図は、総脂肪酸種(総FAS)(暗灰色バー参照);ω−ヒドロキシヘキサデセン酸(ω−OH C16:1)(薄い灰色バー参照);及び%ω−ヒドロキシ脂肪酸(%ω−OH FFA)(矢印参照)を示している。

0023

詳細な説明
総括
我々の石油化学製品依存を削減する1つの方法は、小規模産生宿主として機能する環境に優しい微生物を介してω−OH脂肪酸誘導体等の脂肪酸誘導体の産生をすることである。このような細胞宿主(即ち、組み換え宿主細胞または微生物)は、ω−OH脂肪酸誘導体及び2官能性脂肪酸誘導体を、再生可能な原料(例えば、発酵性糖質バイオマスセルロースグリセロール、CO、CO2など)等の再生可能資源から産生するように操作される。これらのω−OH脂肪酸誘導体は、特殊化製品ポリマー及び香料等の工業製品原材料である。

0024

本開示は、組み換え宿主細胞で発現される場合に、ω−OH脂肪酸誘導体組成物をより高い力価、収率及び/または生産性で得ることができるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド及びそのバリアントを包含するω−ヒドロキシラーゼ関連融合ポリペプチドに関する。本明細書では、向上したω−OH脂肪酸誘導体の生合成は、宿主細胞を、それらがCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドまたはそのバリアントを発現するように形質転換することにより行われる。これらのポリペプチドは、脂肪酸の、例えば、ω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸または脂肪酸誘導体などのω−OH脂肪酸への反応に触媒作用を及ぼす。本開示は、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド及びそのバリアントを発現する組み換え宿主細胞または産生菌株を包含する。1態様において、本開示はP450サブファミリーcyp153Aに関する。

0025

定義
本明細書及び特許請求の範囲に使用されるとき、単数形「a」、「an」及び「the」は、本文が特に明らかに断らない限り複数の指示対象も含む。従って、例えば、「宿主細胞」への言及は2つ以上のこのような宿主細胞を含み、「脂肪酸エステル」への言及は1つ以上のこのような脂肪酸エステルまたはエステルの混合物を含み、「核酸配列」への言及は1つ以上の核酸配列を含み、「酵素」への言及は1つ以上の酵素を含む、などである。

0026

「酵素分類(EC)番号」という用語は、特定の酵素活性を表す番号を言う。EC番号は、酵素命名システムの下、酵素が触媒作用を示す反応に従って酵素を分類する。EC番号は酵素触媒反応を特定する。例えば、異なる生物からの異なる酵素が同じ反応に触媒作用を示す場合、それらは同じEC番号を有する。さらに、異なるタンパク質の折り畳みが同一反応に触媒作用を示すのなら、それらは同一のEC番号に割り当てられるであろう(例、非相同同機能酵素、即ちNISE)。EC番号は、国際生化学分子生物連合(IUBMB)の命名委員会(その記述ワールドワイドウェブのIUBMB酵素命名ウェブサイト入手できる)により確立されている。例えば、ω−ヒドロキシラーゼまたはω−オキシゲナーゼ酵素活性を含むチトクロームP450モノオキシゲナーゼ(P450)酵素活性は、EC1.14.15.3に分類される。P450酵素ファミリーに入る酵素の機能は、様々な種の大部分の原核生物において保存されている。従って、異なる微生物種は、EC1.14.15.3に分類された同じ酵素活性を示すことができる。EC1.14.15.3により特徴付けられる酵素活性の例は、本明細書に記載のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド及びそのバリアント(上記)の酵素活性である。

0027

用語「オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸」または「ω−ヒドロキシル化脂肪酸」または「ω−ヒドロキシ脂肪酸」または「ω−ヒドロキシル脂肪酸」または「ω−OH脂肪酸」または「ωOH脂肪酸」は、本明細書では区別なく使用され、そして脂肪酸代謝から生じ、少なくとも1つのOH基をオメガ(ω)位に有する脂肪酸を指す。このようなω−ヒドロキシル化脂肪酸の例としては、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸を挙げることができる。1つの実施形態において、このようなω−ヒドロキシル化脂肪酸は、ω−OH C8:0脂肪酸、ω−OH C10:0脂肪酸、ω−OH C12:0脂肪酸、ω−OH C14:0脂肪酸、ω−OH C16:0脂肪酸、ω−OH C18:0脂肪酸、ω−OH C20:0脂肪酸、ω−OH C8:1脂肪酸、ω−OH C10:1脂肪酸、ω−OH C12:1脂肪酸、ω−OH C14:1脂肪酸、ω−OH C16:1脂肪酸、ω−OH C18:1脂肪酸、ω−OH C20:1脂肪酸などである。微生物では、ω−ヒドロキシル化脂肪酸は、ω−ヒドロキシル化脂肪酸エステル等のω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体、並びにα,ω−二酸、α,ω−ジエステル、及びα,ω−ジオール等の2官能性脂肪酸誘導体を産生するのに使用され得る。この意味で、用語「オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体」及び「ω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体」及び「ω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体」及び「ω−ヒドロキシル脂肪酸誘導体」及び「α,ω−2官能性脂肪酸誘導体」及び「ω−OH脂肪酸誘導体」は、脂肪酸代謝から生じ、且つ少なくとも1つのOH基をオメガ(ω)位に有するかまたは少なくとも1つのOH基をオメガ(ω)位に有する中間体から誘導された化学物質を言う。ここで、「オメガ(ω)位」は、脂肪酸誘導体の第1官能基に関して反対側の端部の末端炭素原子を言う。このようなω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体としては、限定されるものではないが、α,ω−二酸、α,ω−ジエステル、及びα,ω−ジオール、並びにこれらから誘導された化学薬品(例、マクロラクトン)が挙げられる。

0028

本明細書で言及される「ω−ヒドロキシル化脂肪酸組成物」または「ω−OH脂肪酸組成物」は組み換え宿主細胞により産生され、一般に、様々な鎖長及び/または飽和及び/または分岐特徴を有するある特定の種類のω−ヒドロキシル化脂肪酸の混合物を含むものである。同様に、「ω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体組成物」は、組み換え宿主細胞により産生され、一般に、様々な鎖長及び/または飽和及び/または分岐特徴を有するある特定の種類のω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体(例、様々な鎖長及び/または飽和及び/または分岐特徴を有するω−ヒドロキシル化脂肪酸、様々な鎖長及び/または飽和及び/または分岐特徴を有するω−ヒドロキシル化脂肪酸エステル、様々な鎖長及び/または飽和及び/または分岐特徴を有するα,ω−二酸、様々な鎖長及び/または飽和及び/または分岐特徴を有するα,ω−ジエステル、様々な鎖長及び/または飽和及び/または分岐特徴を有するα,ω−ジオール、など)の混合物を含むものである。いくつかの場合において、ω−OH脂肪酸誘導体組成物は、ほとんど1種類のω−OH脂肪酸誘導体、例えば1,12−ドデセンジオール、または1,14−テトラデカンジオール、または16−ヒドロキシヘキサデカン酸メチルエステル、または16−ヒドロキシヘキサデセン酸、または15−ヒドロキシペンタデカン酸、または15−ヒドロキシペンタデセン酸、または18−ヒドロキシオクタセン酸、またはこれらの脂肪酸誘導体のいずれかのメチルエステル、またはその他を含むものである。さらに他の場合において、ω−OH脂肪酸誘導体組成物は、特別に設計された組成物(例、同一組成物中における、約20%の12−ヒドロキシドデカン酸及び約80%の1,14−14−ヒドロキシテトラデカン酸が、このようなサンプルを提供するであろう)を提供するために、1種類を超えるω−OH脂肪酸誘導体の混合物を含むものである。

0029

用語「受託番号」または「NCBI受託番号」または「GenBank受託番号」は、特定の核酸配列を表す番号を指している。この記載で考察される配列受託番号は、アメリカ合衆国の国立衛生研究所で保持されているNCBI(全米バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information))により提供されるデータベース、及びユニプロット知識ベース(UniProtKB)及びスイスバイオインフォマテクス研究所により提供されるスイスプロットデータベースにより与えられたデータベースから得られた(UniProtKB受託番号とも呼ばれる)。

0030

本明細書で使用されるとき、用語「ヌクレオチド」は、ヘテロ環塩基、糖、及び1個以上のホスフェート基からなるポリヌクレオチドモノマー単位を指す。天然塩基グアニン、(G)、アデニン、(A)、シトシン、(C)、チミン、(T)、及びウラシル、(U))は一般にプリンまたはピリミジンの誘導体であるが、天然及び非天然塩基類似体も含まれることは理解されるべきである。天然糖は、ペントース(5個の炭素の糖)デオキシリボース(DNAを形成する)またはリボース(RNAを形成する)であるが、天然及び非天然糖類似体も含まれることは理解されるべきである。核酸は、一般にホスフェート結合を介して繋がって、核酸またはポリヌクレオチドを形成するが、多くの他の結合が当該技術では知られている(例、ホスホロチオエートボラノホスフェート、など)。

0031

用語「ポリヌクレオチド」は、1本鎖、或いは2本鎖であることができ、非天然のまたは変更されたヌクレオチドを含み得る、リボヌクレオチド(RNA)またはデオキシリボヌクレオチド(DNA)のポリマーを指す。用語「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」、及び「ヌクレオチド配列」は、本明細書では区別すること無く使用され、いかなる長さのヌクレオチドのポリマー形態、RNAまたはDNAのどちらかを指す。これらの用語は、分子一次構造を指し、それ故、1本鎖及び2本鎖のDNA及び1本鎖及び2本鎖のRNAを含む。これらの用語は、同等のものとして、ヌクレオチド類似体から作られたRNAまたはDNAの類似体、及び、限定されないけれども、メチル化及び/またはキャップされたポリヌクレオチド等の修飾ポリヌクレオチドを含んでいる。ポリヌクレオチドは、これらに限定されるものではないが、プラスミドウイルス染色体EST、cDNAmRNA、及びrRNA等のどのような形態でもあり得る。

0032

本明細書で使用されるとき、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は区別なく使用され、アミノ酸残基のポリマーを指す。用語「組み換えポリペプチド」は、組み換え技術により製造されるポリペプチドを指し、この組み換え技術では、一般に、発現したタンパク質をコードするDNAまたはRNAは、順に、宿主細胞を形質転換してポリペプチドを産生するために使用される好適な発現ベクターに挿入される。同様に、用語「組み換えポリペプチド」または「組み換え核酸」または「組み換えDNA」は当業者に公知の組み換え技術により産生される。

0033

用語「相同体」及び「相同の」は、対応するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列と少なくとも約50パーセント(%)同一である配列を含む同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。好ましくは、相同のポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、対応するアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列と、少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも約99%の相同性を有するポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有する。本明細書で使用されるとき、配列の「相同性」及び配列「同一性」という用語は区別することなく使用される。当業者は2個以上の配列の間の相同性を決定する方法を良く知っている。簡潔に言うと、2個の配列間の「相同性」の計算は以下のように行うことができる。配列は最適な比較目的のために整列される(例、ギャップは、最適なアラインメントのために第1と第2の一方または両方のアミノ酸または核酸の配列に設けられ、非相同配列を比較目的のために無視することができる)。1つの好ましい実施形態において、比較目的のために整列される第1の配列の長さは、第2の配列の長さの、少なくとも約30%、好ましくは少なくとも約40%、より好ましくは少なくとも約50%、さらに好ましくは少なくとも約60%、そして、さらに好ましくは少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%または約100%である。第1と第2の配列における対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドは、その後比較される。第1の配列の位置が、第2の配列の対応する位置のものと同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められた場合、これらの分子はその位置で同一である。2個の配列間のパーセント相同性は、配列で共有された同一位置の数の関数である。この関数は、2つの配列の最適アラインメントに求められるギャップの数及び各ギャップの長さが考慮される。配列の比較及び2個の配列の間のパーセント相同性の決定は、数学アルゴリズム、例えばBLAST(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol,215(3):403−410)を用いて行うことができる。2個のアミノ酸配列間のパーセント相同性は、Blossum62マトリックスまたはPAM250マトリックスを用い且つ16、14、12、10、8、6または4のギャップ重み及び1、2、3、4、5または6の長さ重みを用いて、GCソフトウエアパッケージ内のGAPプログラムに取り込まれているNeedlemanとWunschアルゴリズムを用いて決定することができる(Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:444−453)。2個のヌクレオチド配列間のパーセント相同性はまた、NWSgapdna.CMPマトリックス及び40、50、60、70または80のギャップ重み及び1、2、3、4、5または6の長さ重みを用い、GCGソフトウエアパッケージ内のGAPプログラムを用いて決定することができる。当業者は、初期の相同性計算を行い、それに従ってアルゴリズムパラメータを調節することができる。好ましいセットのパラメータ(及び分子が特許請求の範囲の相同性限定内にあるかどうかを決定するためにどのパラメータを適用すべきかについて実行者不確かな場合に使用されるべきもの)は、12のギャップペナルティ、4のギャップ拡大ペナルティ及び5のフレームシフトギャップペナルティでマトリックスを記録するBlossum62である。さらなる配列アラインメントの方法は生物工学の分野において知られている(例えば、Rosenberg(2005)BMCBioinformatics 6:278;Altschul et al.(2005)FEBSJ. 272(20):5101−5109を参照)。

0034

用語「低いストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、高いストリンジェンシーまたは極めて高いストリンジェンシー下でハイブリダイズする」は、ハイブリダイゼーション及び洗浄の条件を表している。ハイブリダイゼーション反応を行うガイダンスはCurrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1−6.3.6.に見ることができる。水溶液法及び非水溶液法は上記文献に記載されており、いずれの方法も使用することができる。ここで示される特定のハイブリダイゼーション条件は下記のとおりである:(1)低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件:6X塩化ナトリウムクエン酸ナトリウムSSC)を約45℃で、次いで0.2XSSC、0.1%SDS中で少なくとも50℃にて2回洗浄(洗浄温度は低いストリンジェンシー条件では55℃に増大することができる);(2)中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件:6XSSCを約45℃で、次いで0.2XSSC、0.1%SDS中で60℃にて1回以上の洗浄;(3)高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件:6XSSCを約45℃で、次いで0.2XSSC、0.1%SDS中で65℃にて1回以上の洗浄;及び(4)極めて高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件:0.5Mリン酸ナトリウム、7%SDSを65℃で、次いで0.2XSSC、1%SDS中で65℃にて1回以上の洗浄。極めて高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件(4)は、特に断らない限り好ましい条件である。

0035

内因性」ポリペプチドとは、親細胞(または宿主細胞)のゲノムによってコードされるポリペプチドのことを指す。「外因性」ポリペプチドとは、親細胞のゲノムによってコードされないポリペプチドのことを指す。バリアント、即ち、突然変異ポリペプチドは、外因性ポリペプチドの一例である。従って、非天然核酸分子は、細胞に一度導入されると外因性であると考えられる。天然核酸分子はまた、特定の細胞に対して外因性であるともいえる。例えば、細胞Xから単離された全コード配列は、たとえXとYが同じ細胞のタイプであっても、コード配列が細胞Yに導入されたら細胞Yに対して外因性核酸である。

0036

用語「過剰発現した」は、遺伝子が、その遺伝子の内因性転写速度に比べて大きい速度で転写させられることを意味する。いくつかの例において、過剰発現は、遺伝子の内因性転写速度に比べて、その遺伝子において増大した転写速度も含む。過剰発現を試験する方法は当該技術で周知であり、例えば、転写RNAレベルは、rtPCRを用いて評価することができ、タンパク質レベルをSDS PAGEゲル分析を用いて評価することができる。

0037

用語「異種性の」は、異なる生物(organism)、異なる細胞のタイプまたは異なる種から誘導されることを意味する。本明細書で用いられるとき、これは、特定の生物に天然には存在しない、ヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列、ポリペプチド配列またはタンパク質配列を指す。例えば、シアノバクテリア原産のポリヌクレオチド配列は、組み換え法により大腸菌(E.coli)の宿主細胞に導入することができ、その時シアノバクテリアからのポリヌクレオチドは大腸菌細胞(例、組み換え細胞)と異種性である。用語「異種性の」はまた、非天然状態の組み換え宿主細胞で存在するヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列、ポリペプチド配列またはタンパク質配列に関しても使用することができる。例えば、「異種性の」ヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列、ポリペプチド配列またはタンパク質配列は、対応する野生型の宿主細胞に天然に存在する対応する野生型の配列を基準に改変されたものであり得る(例、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルまたは配列における改変)。

0038

本明細書で使用されるとき、ポリペプチドの用語「断片」は、完全長ポリペプチドまたはタンパク質のより短い部分を言い、そのサイズは、2個のアミノ酸残基から、アミノ酸配列全体から1個のアミノ酸残基を差し引いたものまでの範囲にわたる。本開示のある特定の実施形態において、断片とは、ポリペプチドまたはタンパク質のドメイン(例えば、基質結合ドメインまたは触媒ドメイン)のアミノ酸配列全体を指す。

0039

用語「突然変異生成」は、生物の遺伝情報を安定的な様式で変化させる工程を指す。タンパク質をコードする核酸配列の突然変異生成により、突然変異タンパク質が産生される。突然変異生成は、またタンパク質活性の改変をもたらす非コード性核酸配列の変化も意味する。

0040

本明細書で使用されるとき、「突然変異」は、遺伝子の核酸位置またはポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸位置における永久変化を言う。突然変異は置換、付加、挿入及び欠失を含む。例えば、アミノ酸位置の突然変異はアミノ酸の1つのタイプをアミノ酸の別のタイプに置換することであり得る(例えば、セリン(S)をアラニン(A)と置換することができる;リシン(L)をスレオニン(T)と置換することができる;など)。そのため、ポリペプチドまたはタンパク質は、1個のアミノ酸が別のアミノ酸で置換されている1つ以上の突然変異を有することができる。

0041

本明細書で使用されるとき、「遺伝子」は、RNA産物またはタンパク質産物をコードする核酸配列、並びにそのRNAまたはタンパク質の発現に影響を及ぼす、機能的に連結された核酸配列(例えば、このような配列には、プロモーター配列またはエンハンサー配列が含まれるが、これに限定されない)、またはRNAもしくはタンパク質の発現に影響を及ぼす配列をコードする、機能的に連結された核酸配列(例えば、このような配列には、リボソーム結合部位または翻訳制御配列が含まれるが、これに限定されない)を言う。

0042

発現制御配列当技術分野において公知であり、例えば、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現をもたらす、プロモーターエンハンサーポリアデニル化シグナル転写終結因子、配列内リボソーム進入部位(IRES)等を含んでいる。発現制御配列は、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する(Maniatis et al.(1987)Science,236:1237−1245)。発現制御配列の例は、例えば、Goeddel,Gene Expression Technologyten Methodsin Enzymology,Vol.185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990)に記載されている。本開示の方法において、発現制御配列は、ポリヌクレオチド配列と機能的に連結されている。「機能的に連結された」という用語は、適切な分子(例えば、転写活性化タンパク質)が発現制御配列に結合した際に遺伝子発現を可能にするように、ポリヌクレオチド配列と発現制御配列が接続されていることを意味する。機能的に連結されたプロモーターは、転写及び翻訳の方向に関して、選択されたポリヌクレオチド配列の上流に位置する。機能的に連結されたエンハンサーは、選択されたポリヌクレオチドの上流、内部または下流に位置することができる。

0043

本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、別の核酸、即ちそれに連結されたポリヌクレオチド配列を輸送しうる核酸分子を言う。有用なベクターの1種は、エピソーム(即ち、染色体外での複製が可能な核酸)である。有用なベクターは、それに連結された核酸の自律複製及び/または発現を可能にするものである。機能的に連結された遺伝子の発現を導くことができるベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組み換えDNA手法において有用な発現ベクターは、ベクター形態では染色体に結合していない環状二本鎖DNAループを一般的に指す「プラスミド」の形態にあることが多い。他の有用な発現ベクターは線状形態で提供される。同等の機能の役割を果たし、後に当技術分野に知られることとなった他の形態の発現ベクターもまた含まれる。いくつかの実施形態において、組み換えベクターは、ポリヌクレオチド配列に機能的に連結したプロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは、発生段階調節性プロモーターオルガネラ特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、構成性プロモーター、または細胞特異的プロモーターである。組み換えベクターは一般に、以下から選択される少なくとも1つの配列を含む:ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた発現制御配列;ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた選択マーカー;ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついたマーカー配列;ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた精製部分;ポリヌクレオチド配列と機能的に結びついた分泌配列;及びポリヌクレオチド配列と機能的に結びついたターゲティング配列。ある特定の実施形態において、ヌクレオチド配列は宿主細胞のゲノムDNAに安定的に組み込まれており、ヌクレオチド配列の発現は、調節プロモーター領域の制御下にある。本明細書で使用される発現ベクターは、本明細書に記載の特定のポリヌクレオチド配列を、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現に適した形態で含む。発現ベクターの設計が、形質転換させようとする宿主細胞の選択、所望のポリペプチドの発現レベル等の要因に依存しうることが、当業者に理解されるであろう。本明細書に記載された発現ベクターは、本明細書に記載されたポリヌクレオチド配列によってコードされる、融合ポリペプチドを含むポリペプチドを産生させるために宿主細胞に導入することができる。原核生物、例えば大腸菌におけるポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、融合または非融合ポリペプチドの発現を導く構成性または誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて実施されることが最も多い。融合ベクターは、その中にコードされたポリペプチド、通常は組み換えポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に、多くのアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、一般に、以下を含む3つの目的のうちの1以上に役立つ:組み換えポリペプチドの発現を増大させること;組み換えポリペプチドの溶解性を増大させること;及びアフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって、組み換えポリペプチドの精製を補助すること。融合発現ベクターでは、しばしば、融合部分と組み換えポリペプチドの接合部にタンパク質開裂部位が導入される。これにより、融合ポリペプチドの精製後に、融合部分からの組み換えポリペプチドの分離が可能となる。ある特定の実施形態において、本開示のポリヌクレオチド配列は、バクテリオファージT5由来のプロモーターと機能的に連結されている。

0044

ある特定の実施形態において、宿主細胞は酵母細胞であり、発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母S.セレビジエにおける発現のためのベクターの例としては、pYepSec1(Baldari et al.(1987)EMBOJ.6:229−234);pMFa(Kurjan et al.(1982)Cell 30:933−943);pJRY88(Schultz et al.(1987)Gene 54:113−123);pYES2(Invitrogen Corp.,San Diego,CA);及びpicZ(Invitrogen Corp.,San Diego,CA)が挙げられる。他の実施形態において、宿主細胞は昆虫細胞であり、発現ベクターはバキュロウイルス発現ベクターである。培養昆虫細胞(例えば、Sf9細胞)におけるタンパク質の発現のために利用し得るバキュロウイルスベクターとしては、例えば、pAc系列(Smith et al.(1983)Mol.Cell.Biol.,3:2156−2165)及びpVL系列(Lucklow et al.(1989)Virology,170:31−39)が挙げられる。さらに別の実施形態において、本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞において発現させることができる。原核細胞及び真核細胞の両方に他の適した発現系が当技術分野において周知である;例えば、Sambrook et al.,"Molecular Cloning:A Laboratory Manual,"second edition,Cold Spring Harbor Laboratory,(1989)を参照。

0045

本明細書で使用されるとき、用語「CoA」または「アシル-CoA」は、アルキル鎖カルボニル炭素補酵素A(CoA)の4'−ホスホパンチオニル部分のスルフヒドリル基との間に形成され、式R−C(O)S−CoA(式中、Rは少なくとも4個の炭素原子を有する任意のアルキル基である)を有するアシルチオエステルを言う。

0046

用語「ACP」はアシルキャリアータンパク質を意味する。ACPは、脂肪酸生合成の間にアシル中間体の高度保存キャリアーで、その成長鎖が4'−ホスホパンテテイン(phosphopantetheine)部分の末端チオールチオールエステルとして合成中に結合される。タンパク質は、2つの形態、即ち、apo−ACP(脂肪酸の生合成において不活性)、及びACPまたはholo−ACP(脂肪酸の生合成において活性)で存在する。用語「ACP」及び「holo−ACP」は、本明細書では区別なく使用され、タンパク質の活性形態を言う。ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼと呼ばれる酵素は、不活性apo−ACPの活性holo−ACPへの転換において関与する。より具体的には、ACPは、不活性apo−ACP形態で発現され、そして4'−ホスホパンテテイン部分は、holo−ACPを産生するために、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼであるholo−アシルキャリアータンパク質シンターゼ(ACPS)の作用によりACP上の保存セリン残基に翻訳後結合されなければならない。

0047

本明細書で使用されるとき、用語「アシル−ACP」は、アルキル鎖のカルボニル炭素とアシルキャリアータンパク質(ACP)のホスホパンテテイニル部分のスルフヒドリル基との間に形成されるアシルチオエステルを言う。いくつかの実施形態において、ACPは完全飽和のアシル−ACPの合成における中間体である。他の実施形態において、ACPは不飽和のアシル−ACPの合成における中間体である。いくつかの実施形態において、炭素鎖が、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25または26個の炭素を有する。

0048

本明細書で使用されるとき、用語「脂肪酸誘導体」は「脂肪酸」または「脂肪酸誘導体」を意味し、「脂肪酸または脂肪酸誘導体」と呼ぶことができる。用語「脂肪酸」は、式RCOOH(式中、Rは脂肪族基、好ましくはアルキル基を表す)を有するカルボン酸を意味する。Rは、約4〜約22個の炭素原子を含むことができる。脂肪酸は、飽和、モノ不飽和、またはポリ不飽和であり得る。「脂肪酸誘導体」は部分的に産生宿主生物(例、組み換え宿主細胞または微生物)の脂肪酸生合成経路から作製された産物である。「脂肪酸誘導体」はACP、アシル−ACP、またはアシル−ACP誘導体から部分的に作製された産物を含む。脂肪酸誘導体の例としては、例えばアシル−CoA、脂肪酸、脂肪アルデヒド短鎖及び長鎖アルコール脂肪アルコール炭化水素、エステル(例、ワックス、脂肪酸エステルまたは脂肪エステル)、末端オレフィン内部オレフィンケトン、並びにω−OH脂肪酸及びそのω−OH脂肪酸誘導体(α,ω−二酸を含む)、及び他の2官能性化合物を挙げることができる。

0049

本明細書で使用されるとき、用語「脂肪酸生合成経路」は、脂肪酸及び脂肪酸誘導体を産生する生合成経路を意味する。脂肪酸生合成経路は、所望の特性を有する脂肪酸誘導体を産生するための、付加的な酵素を含み得る。

0050

脂肪酸のR基は、直鎖または分岐鎖であり得る。分岐鎖は、1個を超える分岐点を有することができ、環状分岐も含む。いくつかの実施形態において、分岐脂肪酸は、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25またはC26分岐脂肪酸である。他の実施形態において、分岐脂肪酸は、C6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、またはC20分岐脂肪酸である。ある特定の実施形態において、分岐脂肪酸のヒドロキシ(OH)基は、オメガ(ω)位置にある。ある特定の実施形態において、分岐脂肪酸はイソ−脂肪酸またはアンテイソ−脂肪酸である。例示的な実施形態において、分岐脂肪酸は、イソ−C7:0−、イソ−C8:0−、イソ−C9:0−、イソ−C10:0−、イソ−C11:0−、イソ−C12:0−、イソ−C13:0−、イソ−C14:0−、イソ−C15:0−、イソ−C16:0−、イソ−C17:0−、イソ−C18:0−、イソ−C19:0−、イソ−C20:0、アンテイソ−C7:0−、アンテイソ−C9:0−、アンテイソ−C11:0−、アンテイソ−C13:0−、アンテイソ−C15:0−、アンテイソ−C17:0−、及びアンテイソ−C19:0分岐脂肪酸から選択される。

0051

脂肪酸のR基は、飽和または不飽和であり得る。不飽和の場合、分岐鎖は、R基は1個以上の不飽和点を有することができる。いくつかの実施形態において、不飽和脂肪酸は、モノ不飽和脂肪酸である。ある特定の実施形態において、不飽和脂肪酸は、C8:1−、C9:1−、C10:1−、C11:1−、C12:1−、C13:1−、C14:1−、C15:1−、C16:1−、C17:1−、C18:1−、C19:1−、C20:1−、C21:1−、C22:1−、C23:1−、C24:1−、C25:1−またはC26:1不飽和脂肪酸である。ある特定の実施形態において、不飽和脂肪酸は、C8:1、C10:1、C12:1、C14:1、C16:1、C18:1、またはC20:1である。さらなる他の実施形態において、不飽和脂肪酸はオメガ−7位において不飽和である。ある特定の実施形態において、不飽和脂肪酸はシス二重結合を有する。

0052

本明細書で用いられるとき、「組み換え宿主細胞」または「操作された宿主細胞」は、宿主細胞、例えば、ω−ヒドロキシル化脂肪酸及び2官能性脂肪酸誘導体を含むω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体を産生するように改変されている微生物である。いくつかの実施形態において、組み換え宿主細胞は、1つ以上のポリヌクレオチドを含み、それぞれのポリヌクレオチドは、ω−ヒドロキシラーゼ生合成酵素活性を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドまたはそのバリアントをコードしており、且つこの組み換え宿主細胞は、ポリヌクレオチドを発現するのに有効な条件下で炭素源の存在下で培養された場合、ω−ヒドロキシル化脂肪酸及び/またはω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体またはその組成物を産生する。

0053

本明細書で用いられるとき、用語「クローン」は、一般に、単一の共通祖先に由来し且つ単一の共通祖先と遺伝的に実質的に同一である細胞または細胞グループ、例えば単一の細菌細胞から現れたクローン細菌コロニーの細菌を言う。

0054

本明細書で用いられるとき、用語「培養物」は、一般に生菌を含む液体培地を言う。1つの実施形態において、培養物は、制御された条件であらかじめ定められた培地で複製される細胞を含み、例えば、選択された炭素源及び/または窒素を含む液体培地で成長した組み換え宿主細胞の培養物である。

0055

用語「培養すること(culturing)」または「培養(cultivation)」は、液体または固体培地において適当な条件下で細胞の集団(例、微生物細胞)成長させることを言う。特定の実施形態において、培養することは、基質の最終産物への発酵生物変換を言う。培養培地は周知であり、培養培地の個々の成分は販売元から(例えば、DIFCO培地及びBBL培地として)入手可能である。1つの非限定例において、水性栄養培地は、窒素、塩及び炭素の複合的な供給源を含む「富栄養培地」、例えば、このような培地当たり10g/Lのペプトン及び10g/Lの酵母エキスを含むYP培地である。加えて、宿主細胞は、例えば米国特許第5,000,000号;第5,028,539号;第5,424,202号;第5,482,846号;第5,602,030号;及びWO2010127318に記載された方法に従い、炭素を効率的に同化し、セルロース系材料を炭素源として用いて操作され得る。さらに、いくつかの実施形態において、宿主細胞は、スクロースを炭素源として用いることができるようにインベルターゼを発現するよう操作される。

0056

本明細書で用いられるとき、用語「当該異種性ヌクレオチド配列を発現するために有効な条件下」は、宿主細胞が所望の脂肪酸誘導体(例、ω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体)を産生することを可能にする任意の条件を意味する。適した条件としては、例えば、発酵条件が挙げられる。

0057

本明細書で用いられるとき、組み換え宿主細胞における、タンパク質(例、酵素)の「改変された」または「レベルが変化した」活性度は、親または天然の宿主細胞を基準に決定された活性度の1つ以上の特性が異なることを言う。活性度の典型的な相違は、改変された活性度を有する組み換え宿主細胞と対応する野生型宿主細胞との間で決定される(例、野生型宿主細胞に対する組み換え宿主細胞の培養物の比較)。改変活性度は、例えば、組み換え宿主細胞により発現されたタンパク質の量の改変(例、タンパク質をコードするDNA配列コピー数の増加または減少、タンパク質をコードするmRNA転写産物の数の増加または減少、及び/またはmRNAからのタンパク質のそのタンパク質翻訳の量の増加または減少の結果として);タンパク質の構造の変化(例、1次構造への変化、例えば、基質特異性の変化、観察される動的パラメータの変化をもたらすタンパク質のコード配列への変化);及びタンパク質安定性の変化(例、タンパク質の分解の増加または減少)の結果であり得る。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、本明細書に記載されたポリペプチドのいずれかの突然変異体またはバリアントである。ある特定の例では、本明細書に記載されたポリペプチドのコード配列は、特定の宿主細胞での発現についてコドン最適化されている。例えば、大腸菌での発現のため、1つ以上のコドンが最適化され得る(Grosjean et al.(1982)Gene 18:199−209)。

0058

本明細書で用いられる用語「調節配列」は、一般に、タンパク質の発現を最終的に制御するこのタンパク質をコードするDNA配列と操作可能に連結したDNAの塩基の配列を言う。調節配列の例としては、RNAプロモーター配列、転写因子結合配列転写終結配列、転写のモジュレーター(エンハンサーエレメント等)、RNA安定性に影響を及ぼすヌクレオチド配列、及び翻訳調節配列(例、リボソーム結合部位(例、原核生物におけるShine−Dalgarno配列、または真核生物におけるKozak配列)、開始コドン終止コドンなど)が挙げられ、これらに限定するものではない。

0059

本明細書で用いられるとき、「当該ヌクレオチド配列の発現は野生型ヌクレオチド配列を基準に改変される」という表現は、内因性ヌクレオチド配列の発現及び/または活性度のレベルにおける増加または減少、或いは異種性または非天然ポリペプチドコードヌクレオチド配列の発現及び/または活性度のレベルにおける増加または減少を意味する。

0060

本明細書で用いられるとき、「CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド配列バリアントの活性度は、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド配列(即ち、ポリペプチド鋳型)の活性度を基準に改変される」という表現は、発現したポリペプチド配列鋳型と比較した発現したポリペプチド配列バリアントの活性度レベルの増加または減少を意味する。ポリペプチド鋳型は核酸鋳型(即ち、DNA鋳型配列)によりコードされる。ポリペプチド配列鋳型の例は、cyp153がレダクターゼドメインと融合したハイブリッドcyp153A−RedRhf融合タンパク質配列である。ポリペプチド配列鋳型の別の例は、配列番号6である。ポリペプチド配列鋳型の別の例は、配列番号38である。ポリペプチド配列はどれもバリアントを含む鋳型として機能し得る。

0061

本明細書で用いられるとき、ポリヌクレオチドに関する用語「発現する」は、ポリヌクレオチドを機能化することである。ポリペプチド(またはタンパク質)をコードするポリヌクレオチドは、発現されると、転写され、翻訳されてそのポリペプチド(またはタンパク質)を産生する。本明細書で用いられるとき、用語「過剰発現する」は、細胞内のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、同条件で対応する野生型細胞で通常発現されるより高濃度で、発現する(または発現させる)ことを意味する。別の実施形態では、用語「過剰発現する」は、細胞内のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、同条件で対応する鋳型ポリヌクレオチドまたは鋳型ポリペプチド配列を発現する対応する細胞において通常発現されるよりも、高濃度で発現する(または発現させる)ことを意味する。鋳型ポリペプチド配列の例はCYP153A−RedRhf−ハイブリッド融合ポリペプチドである。

0062

用語「変化したレベルの発現」及び「改変したレベルの発現」は区別なく使用され、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは脂肪酸誘導体が、操作された宿主細胞においては、同条件で対応する野生型細胞における濃度と比較して、異なる濃度で存在することを意味する。

0063

本明細書で用いられるとき、用語「力価」は宿主細胞培養物単位体積当たりで産生されるω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体の量を言う。本明細書で記載される組成物及び方法のどの態様においても、ω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体は、約25mg/L、約50mg/L、約75mg/L、約100mg/L、約125mg/L、約150mg/L、約175mg/L、約200mg/L、約225mg/L、約250mg/L、約275mg/L、約300mg/L、約325mg/L、約350mg/L、約375mg/L、約400mg/L、約425mg/L、約450mg/L、約475mg/L、約500mg/L、約525mg/L、約550mg/L、約575mg/L、約600mg/L、約625mg/L、約650mg/L、約675mg/L、約700mg/L、約725mg/L、約750mg/L、約775mg/L、約800mg/L、約825mg/L、約850mg/L、約875mg/L、約900mg/L、約925mg/L、約950mg/L、約975mg/L、約1000mg/L、約1050mg/L、約1075mg/L、約1100mg/L、約1125mg/L、約1150mg/L、約1175mg/L、約1200mg/L、約1225mg/L、約1250mg/L、約1275mg/L、約1300mg/L、約1325mg/L、約1350mg/L、約1375mg/L、約1400mg/L、約1425mg/L、約1450mg/L、約1475mg/L、約1500mg/L、約1525mg/L、約1550mg/L、約1575mg/L、約1600mg/L、約1625mg/L、約1650mg/L、約1675mg/L、約1700mg/L、約1725mg/L、約1750mg/L、約1775mg/L、約1800mg/L、約1825mg/L、約1850mg/L、約1875mg/L、約1900mg/L、約1925mg/L、約1950mg/L、約1975mg/L、約2000mg/L(2g/L)、3g/L、5g/L、l0g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、l00g/L、またはこれらの値のいずれか2つによって囲まれる範囲の力価で産生される。他の実施形態では、ω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体は、l00g/Lを超える、200g/Lを超える、300g/Lを超える、或いは、それより高い、例えば500g/L、700g/L、1000g/L、1200g/L、1500g/L、または2000g/Lの力価で産生される。1つの実施形態において、本開示の方法に従う組み換え宿主細胞により産生されたω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体の力価は、5g/L〜200g/L、10g/L〜150g/L、20g/L〜120g/L、25g/L〜110g/L、及び30g/L〜100g/Lである。

0064

本明細書で用いられるとき、用語「宿主細胞により産生されるω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体の収率」は、宿主細胞において入力炭素源が産物(即ち、ω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体)に転換される効率を言う。本開示の方法に従うω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体を産生するように操作される宿主細胞は、少なくとも3%、少なくとも4%、少なくとも5%、少なくとも6%、少なくとも7%、少なくとも8%、少なくとも9%、少なくとも10%、少なくとも11%、少なくとも12%、少なくとも13%、少なくとも14%、少なくとも15%、少なくとも16%、少なくとも17%、少なくとも18%、少なくとも19%、少なくとも20%、少なくとも21%、少なくとも22%、少なくとも23%、少なくとも24%、少なくとも25%、少なくとも26%、少なくとも27%、少なくとも28%、少なくとも29%、または少なくとも30%、或いはこれらの値のいずれか2つに囲まれた範囲の収率を有する。他の実施形態において、ω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体は、30%を超える、40%を超える、50%を超える、60%を超える、70%を超える、80%を超える、90%を超える、またはこれを超える収率で産生される。或いは、またはさらに、収率は、約30%以下、約27%以下、約25%以下、または約22%以下である。従って、収率は、上記端点のいずれか2つに囲まれることもできる。例えば、本開示の方法に従う組み換え宿主細胞により産生されるω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体の収率は、5%〜15%、10%〜25%、10%〜22%、15%〜27%、18%〜22%、20%〜28%、20%〜30%、25%〜40%、或いはより大きくあり得る。本開示の方法に従う組み換え宿主細胞により産生されるω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体の好ましい収率の例は、10%〜30%である。本開示の方法に従う組み換え宿主細胞により産生されるω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体の好ましい収率の別の例は、10%〜40%である。本開示の方法に従う組み換え宿主細胞により産生されるω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体の好ましい収率の別の例は、10%〜50%である。

0065

本明細書で用いられるとき、用語「生産性」は、単位時間当たり、宿主細胞培養物の単位体積当たりに産生されるω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体の量を言う。本明細書に記載された組成物及び方法のどの態様においても、組み換え宿主細胞で産生されるω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体の生産性は、少なくとも100mg/L/時間、少なくとも200mg/L/時間0、少なくとも300mg/L/時間、少なくとも400mg/L/時間、少なくとも500mg/L/時間、少なくとも600mg/L/時間、少なくとも700mg/L/時間、少なくとも800mg/L/時間、少なくとも900mg/L/時間、少なくとも1000mg/L/時間、少なくとも1100mg/L/時間、少なくとも1200mg/L/時間、少なくとも1300mg/L/時間、少なくとも1400mg/L/時間、少なくとも1500mg/L/時間、少なくとも1600mg/L/時間、少なくとも1700mg/L/時間、少なくとも1800mg/L/時間、少なくとも1900mg/L/時間、少なくとも2000mg/L/時間、少なくとも2100mg/L/時間、少なくとも2200mg/L/時間、少なくとも2300mg/L/時間、少なくとも2400mg/L/時間、または少なくとも2500mg/L/時間である。加えて、生産性は、2500mg/L/時間以下、2000mg/L/OD600以下、1500mg/L/OD600以下、120mg/L/時間以下、1000mg/L/時間以下、800mg/L/時間以下、または600mg/L/時間以下であり得る。従って、生産性は、上記端点のいずれか2つに囲まれることもできる。例えば、生産性は、3〜30mg/L/時間、6〜20mg/L/時間、または15〜30mg/L/時間であり得る。本開示の方法に従い組み換え宿主細胞で産生されるω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体の好ましい生産性は500mg/L/時間〜2500mg/L/時間、或いは700mg/L/時間〜2000mg/L/時間から選択される。

0066

用語「総脂肪種(FAS)」及び「総脂肪酸産物」は、国際特許出願公開WO2008/119082号に記載されているGC−FIDにより評価されるサンプルに存在するω−OH脂肪酸及び脂肪酸の総量に関して本明細書中では区別なく使用され得る。

0067

本明細書で用いられるとき、用語「グルコース利用速度」は、グラム/リットル/時間(g/L/hr)として報告される、単位時間当たりの培養物により使用されるグルコース量を意味する。

0068

独立して使用されるか、または供給源と関連して使用される、「再生可能原料からの炭素源」という用語は、油脂化学物質(即ち、プラント及び動物からの精製油、例えば、脂肪酸、脂肪酸エステル、TAG、ヒドロキシ脂肪酸など)及び石油化学物質(即ち、石油から誘導される化学製品、例えば、アルカン、アルケンなど)を除く炭素の由来となる任意の生物材料再生原料及び/またはバイオマス及び/または廃棄物を含む)を包含する。従って、本明細書で使用されるとき、用語「再生可能原料からの炭素源」では、油脂化学物質及び石油化学物質由来の炭素は除外される。いくつかの実施形態において、炭素源は、糖、即ち炭水化物(例、モノサッカライドジサッカライド、またはポリサッカライド)を含んでいる。いくつかの実施形態において、炭素源は、グルコース及び/またはスクロースである。他の実施形態において、炭素源は、再生可能原料、例えばトウモロコシサトウキビまたはリグノセルロース系バイオマスからの炭水化物;または廃棄物、例えばグリセロール、煙道ガス合成ガス;または有機材料、例えばバイオマスまたは天然ガス改良品、に由来し;或いは光合成で固定される二酸化炭素である。他の実施形態において、バイオマスは炭素源に加工され、生物変換に好適である。さらに他の実施形態において、バイオマスは炭素源へのさらなる加工の必要はなく、炭素源として直接使用することができる。このようなバイオマスの例示的な源は、植物または草木、例えばスイッチグラスである。別の例示的な炭素源は、代謝廃棄物、例えば動物性物質(例、牛糞肥料)を含む。さらなる例示的な炭素源は、藻及び他の海草を含む。別の炭素源(バイオマスを含む)は、工業、農業林業及び家庭からの廃棄物、例えば発酵廃液発酵バイオマス、グリセロール/グリセリンエンシレージ、わら、材木下水生ごみ一般廃棄物、セルロース系都市廃棄物及び食べ残しを含むが、これらに限定されない。

0069

本明細書で用いられるとき、ω−OH脂肪酸及びその誘導体等の産物についての、「単離された」との用語は、細胞成分、細胞培地、または化学もしくは合成前駆体から分離される産物を言う。本明細書に記載された方法により製造される脂肪酸及びその誘導体(例、ω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体)は、発酵ブロス、並びに細胞質に比較的混合しないで存在し得る。このため、脂肪酸及びその誘導体は、細胞内または細胞外で有機相に集まることができる。

0070

本明細書で用いられるとき、用語「精製する」、「精製された」、または「精製」は、例えば単離または分離による、分子のその環境からの除去または単離を意味する。「実質的に精製された」分子は、それらに付随する他の構成成分を少なくとも約60%含まない(例えば、少なくとも約70%含まない、少なくとも約75%含まない、少なくとも約85%含まない、少なくとも約90%含まない、少なくとも約95%含まない、少なくとも約97%含まない、少なくとも約99%含まない)。本明細書で使用されるとき、これらの用語はまた、試料からの混入物の除去も指す。例えば、混入物の除去により、試料中のω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体などのような脂肪酸誘導体のパーセンテージを増加させることができる。例えば、脂肪酸誘導体を組み換え宿主細胞において産生した場合、脂肪酸誘導体は、宿主細胞タンパク質または他の宿主細胞材料の除去によって精製することができる。精製後に、試料中の脂肪酸誘導体のパーセンテージは増加する。「精製する」、「精製された」、及び「精製」という用語は、完全な純粋を必要としない相対的な用語である。従って、例えば、脂肪酸誘導体が組み換え宿主細胞において産生される場合、精製された脂肪酸誘導体は、他の細胞構成成分(例えば、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、または他の炭化水素)から実質的に分離された脂肪酸誘導体である。

0071

オメガ−ヒドロキシル化脂肪酸及び脂肪酸誘導体の産生
本開示は、宿主細胞でのω−OH脂肪酸及びω−OH脂肪酸誘導体の産生を提供する。ω−OH脂肪酸の産生は、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現の結果として向上させることができる。CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、ω−OH脂肪酸誘導体及び組成物を高い力価で産生する。本明細書において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、ω−OH脂肪酸誘導体の産生のための生合成経路に関与する;それは単独でまたは他の酵素と組み合わせて使用することができる。例えば、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、チオエステラーゼ(即ち、天然で、または異種発現した)酵素がアシル−ACPを脂肪酸に転換する操作生合成経路で使用することができる。CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、それから脂肪酸をω−OH脂肪酸に転換することができる(図1参照)。経路での追加の酵素は、ω−OH脂肪酸を他の2官能性脂肪酸誘導体(例、α,ω−二酸)に転換することができる。

0072

さらに具体的には、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドは、配列番号6に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するポリペプチド配列であり、そしてω−OH脂肪酸及びω−OH脂肪酸誘導体の産生のための改良された酵素活性度を有するバリアントを作り出すために、突然変異を導入するための鋳型配列として機能する。CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドは自己充足型であり、脂肪酸のω−OH脂肪酸への反応に触媒作用を及ぼすω−ヒドロキシラーゼ酵素活性を有する。CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの例としては、ハイブリッドcypl53A−RedRhF−タイプ融合ポリペプチドが挙げられる。1つの実施形態において、用語CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、そのアミノ酸配列に少なくとも1つの突然変異を有する改変CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドであって、このアミノ酸配列は、796、141、231、27、82、178、309、407、415、516及び666またはこれらの組み合わせのアミノ酸位置に突然変異を含むものであるが、これらに限定されるものではない。組み換え宿主細胞におけるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現は、対応する宿主細胞におけるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現の場合と比較して、ω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体またはその組成物の力価、収率及び/または生産性を向上させる。

0073

CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの例は、位置796に突然変異を有し、アラニンがバリンで置換された配列番号38である。このCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号38に対して少なくとも70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性を有するポリペプチド配列を有し、そして追加の突然変異及び追加のバリアントを作り出すために鋳型配列の役目をさらに果たしている。同様に、このCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは自己充足型であり、脂肪酸のω−OH脂肪酸への反応に触媒作用を及ぼすω−ヒドロキシラーゼ酵素活性を有する。1つの実施形態において、用語CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、そのアミノ酸配列に少なくとも1つの突然変異を有する修飾CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドであって、このアミノ酸配列は、747、12、327、14、61、28、13、771、119、10、11、28、745、9、770、413、784、749、231、233、757及び703またはこれらの組み合わせのアミノ酸位置に突然変異を含むものであるが、これらに限定されるものではない。組み換え宿主細胞におけるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現は、対応する宿主細胞におけるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド(配列番号6)の発現の場合と比較して、ω−OH脂肪酸及び/またはω−OH脂肪酸誘導体の力価、収率及び/または生産性を向上させる。

0074

細胞がCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを用いて形質転換された場合、それはCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する細胞である(例、組み換え細胞)。1つの実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する細胞により産生されるω−OH脂肪酸の力価及び/または収率は、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞の少なくとも2倍である。大腸菌(Escherichia coli)のような宿主において、ω−OH脂肪酸は、天然または異種発現した酵素により2官能性脂肪酸誘導体に転換され得る。別の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する細胞によって産生されるω−OH脂肪酸またはその誘導体の力価及び/または収率は、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものの、少なくとも約1倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、または少なくとも約10倍の大きさである。1つの実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現する細胞によって産生されるω−OH脂肪酸またはその誘導体の力価及び/または収率は、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものより、少なくとも約1%、少なくとも約2%、少なくとも約3%、少なくとも約4%、少なくとも約5%、少なくとも約6%、少なくとも約7%、少なくとも約8%、少なくとも約9%、または少なくとも約10%大きい。別の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現により組み換え細胞で産生されるω−OH脂肪酸またはその誘導体の力価及び/または収率は、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものより、少なくとも約20%〜少なくとも約80%大きい。いくつかの実施形態において、細胞により産出されるω−OH脂肪酸の力価及び/または収率は、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを発現する対応する細胞のものより、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約100%大きい。

0075

従って、本開示は、ω−OH脂肪酸またはその誘導体を産生するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現するように操作されている組み換え宿主細胞を提供する。ω−OH脂肪酸の生合成は、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド発現宿主細胞、即ち、配列番号6(すなわち鋳型ポリペプチド)に基づくCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドまたは同じ酵素機能を有する他のポリペプチドを発現する宿主細胞と比較して向上している。様々な異なる宿主細胞は、ω−OH脂肪酸及びω−OH脂肪酸誘導体またはその組成物の向上した産生に好適な組み換え宿主細胞をもたらす、本明細書に記載されたもののようなCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを発現するように改変することができる。産生されるω−OH脂肪酸の例としては、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸を挙げることができる。1つの実施形態において、このようなω−OH脂肪酸は、ω−OH C8:0脂肪酸、ω−OH C10:0脂肪酸、ω−OH C12:0脂肪酸、ω−OH C14:0脂肪酸、ω−OH C16:0脂肪酸、ω−OH C18:0脂肪酸、ω−OH C20:0脂肪酸、ω−OH C8:1脂肪酸、ω−OH C10:1脂肪酸、ω−OH C12:1脂肪酸、ω−OH C14:1脂肪酸、ω−OH C16:1脂肪酸、ω−OH C18:1脂肪酸、ω−OH C20:1脂肪酸等である。様々な細胞は、本明細書に記載された組み換え宿主細胞に使用に好適なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝物質源を提供することができることが理解される。

0076

経路操作及び酵素活性
脂肪酸の合成は細菌生合成機構のうち最も保存されたシステムの1つである。脂肪酸シンターゼ(FAS)多酵素複合体は、全ての細菌及び真核生物において存在する。FAS関連遺伝子のほとんどは、細胞の成長及び生存に欠かせないものである。真核生物及び細菌FASは、実質的に同じ生化学形質転換を推進する。真核生物において、FASはFAS Iと称され、その触媒ドメインのほとんどは1つのポリペプチド鎖(分離できない)によりコードされる。細菌等の原核生物においては、FASはFASIIと称され、その個々の酵素及びキャリアータンパク質は、別個の(分離できる)タンパク質をコードする分離遺伝子によりコードされる。このため、FASIIは有意な多様性及び明確な特性を有する複合系である。

0077

FAS経路において酵素と共にアシルキャリアータンパク質(ACP)が、天然の生物で産生される脂肪酸の長さ、飽和の程度及び分岐を制御する。この経路におけるステップは、脂肪酸生合成(FAB)及びアセチル−CoAカルボキシラーゼACC遺伝子ファミリーの酵素により触媒される。例えば、FAS経路に含まれ得る酵素には、AccABCDFabD、FabH、FabG、FabA、FabZ、FabI、FabK、FabL、FabM、FabB、及びFabFが含まれる。所望の産物に応じて、これらの遺伝子の1つ以上が減衰され、または過剰発現され得る。このため、原核生物は、グルコースまたは他の炭素源等の再生可能な原料からの脂肪酸誘導体の産生を増大させるように操作されている。本明細書において、主要な目標は、細菌株を、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)及び脂肪アルコール(FALC)を含む脂肪酸誘導体の産生のための微生物工場に変換するために、脂肪酸誘導体の産生を調節する重要な制御酵素の活性を高めることである(例えば、米国特許第8,283,143号を参照。これは本明細書に参照により組み入れられる)。

0078

本開示は、ω−OH脂肪酸またはω−OH脂肪酸誘導体等の所望の化合物の産生のため酵素経路を改変するために、酵素機能のポリペプチドをコードするCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリヌクレオチドを特定する。本明細書において酵素受託番号(EC番号)によって特定されるこれらのポリペプチドは、ω−OH脂肪酸及びω−OH脂肪酸誘導体(例、α,ω—二酸)等の他の2官能性分子の産生を導く脂肪酸経路を操作するために有用である(図1参照)。

0079

1つの実施形態において、グルコース等の再生可能な原料から誘導される炭素源を用いてω−OH脂肪酸誘導体を生成する経路は、図1に描かれている。炭水化物(例、グルコース)は天然の生物によりアシル−ACP等のアシル−チオエステルに変換される(図1のステップ1参照)。脂肪酸分解酵素活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、任意で、所望の産物に応じて減衰させることができる(実施例、以下を参照)。そのようなポリペプチドの非限定的な例としては、アシル−CoAシンテターゼ(FadD)及びアシル−CoAデヒドロゲナーゼ(FadE)が挙げられる。表1は、当技術分野において公知の方法に従って任意で減衰させることができる、様々な脂肪酸分解酵素を含む代謝経路内にある酵素活性の包括リスト(以下)を提示する(例えば、上記米国特許第8,283,143号を参照)。

0080

例えば、FadR(下記の表1を参照)は、脂肪酸分解経路及び脂肪酸生合成経路に関与する重要な調節因子である(Cronan et al.,Mol. Microbiol.,29(4):937−943(1998))。大腸菌の酵素FadD(下記の表1参照)及び脂肪酸輸送タンパク質FadLは、脂肪酸取り込み系の構成成分である。FadLは細菌細胞内への脂肪酸の輸送を媒介し、FadDはアシル−CoAエステルの形成を媒介する。他の炭素源が利用できない場合には、外因性脂肪酸は細菌により取り込まれてアシル−CoAエステルに変換され、これが転写因子FadRと結合し、脂肪酸の輸送(FadL)、活性化(FadD)、及びβ−酸化(FadA、FadB及びFadE)を担うタンパク質をコードするfad遺伝子の発現を抑制することができる。代替の炭素源が利用できる場合には、細菌は脂肪酸をアシル−ACPとして合成し、それらはリン脂質合成には用いられるが、β-酸化の基質ではない。従って、アシル−CoA及びアシル−ACPはいずれも、異なる最終産物をもたらし得る、脂肪酸の独立した供給源である(Caviglia et al.,J Biol.Chem.,279(12):1163−1169(2004))。

0081

(表1)酵素活性

0082

図1は、アシル−ACP等のアシルチオエステルを前駆中間体としてのC12またはC16:1脂肪酸(FFA)に転換することができる例示的な経路を示す。図1のステップ1では、チオエステラーゼを用いてアシル−ACPがFFAに転換される。ある特定の実施形態において、チオエステラーゼをコードする遺伝子は、tesA、'tesA、tesB、fatB1、fatB2、fatB3、fatA1、またはfatAである(このステップに触媒作用を及ぼすのに使用され得るチオエステラーゼの酵素活性を有するポリペプチドを示す上記表1も参照)。ステップ2では、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドまたはそのバリアントが、脂肪酸からω−OH脂肪酸(ω−OH FFA)を形成するために使用される。他の2官能性分子は、例えば、α,ω−二酸または他のω−OH脂肪酸誘導体が、経路内の下流で産生され得るが、それは経路に存在する酵素機能性に依存する。

0083

CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチド
ω−ヒドロキシラーゼ(またはω−オキシゲナーゼ)は、ある特定の非ヘム二鉄オキシゲナーゼ(例えば、シュードモナスプチダ(Pseudomonas putida)GPo1由来のalkB)及びある種のヘム型P450オキシゲナーゼ(例えば、マリノバクター・アクエオレイ(Marinobacter aquaeolei)由来のcyp153A等のω−ヒドロキシラーゼ)を含む。P450は、偏在性分布している酵素であり、高度の複雑性を有し、幅広い領域にわたって活性を示す。それらは、広範囲の様々の基質を転換し、様々の化学的反応を触媒する、遺伝子のスーパーファミリーによってコードされるタンパク質である。Cyp153Aは、ω位に高い選択性を持って炭化水素鎖をヒドロキシル化する可溶性菌シトクロムP450のサブファミリーである(van Beilen et al.(2006)Appl.Environ.Microbiol.72:59−65)。cyp153Aファミリーのメンバーは、インビトロでアルカン、脂肪酸または脂肪アルコールのω位を選択的にヒドロキシル化することが示されており、例えば、マイコバクテリウム属の種HXN−1500由来のcyp153A6(Funhoff et al.(2006)J.Bacteriol.188:5220−5227)、マイコバクテリウム・マリヌム(Mycobacterium marinum)由来のcyp153A16、及びポラロモナス属の種(Polaromonas sp.)JS666由来のcyp153A(Scheps et al.(2011)Org.Biomol.Chem.9:6727−6733)並びにマリノバクター・アクアエオレイ由来のcyp153A(Honda−Malca et al.(2012)Chem.Commun.48:5115−5117)が挙げられる。下記の表2A及び2Bは、ω−OH脂肪酸及びω−OH脂肪酸誘導体の産生に使用され得るω−ヒドロキシラーゼ酵素活性を有する酵素及びレドックスパートナーの例を示す。

0084

(表2A)ω−ヒドロキシラーゼ酵素活性の例(P450)(EC 1.14.15.3)

0085

(表2B)ω−ヒドロキシラーゼ酵素活性(P450)(EC 1.14.15.3)のレドックスパートナーの例

0086

全てのチトクロームP450がそうであるように、Cyp153A ω−ヒドロキシラーゼはその触媒活性のために電子を必要とするが、これらはフェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼ等の特定の酸化還元タンパク質を介して与えられる。これらはcyp153Aと相互作用する別個のタンパク質である。自己充足型ハイブリッド(キメラ性)cyp153Aオキシゲナーゼ(即ち、活性のために別個のフェレドキシン及びフェレドキシンレダクターゼタンパク質を必要としないオキシゲナーゼ)は、以前に、アルカニボラックス・ボルクメンシスSK2由来のcyp153A(Kubota et al.(2005)Biosci.Biotechnol.Biochem.69:2421−2430;Fujita et al.(2009)Biosci.Biotechnol.Biochem.73:1825−1830)を、フラビンモノヌクレオチドFMN結合部位及びNADPH結合部位並びに[2FeS]フェレドキシン中心を含むP450RhF由来のレダクターゼドメイン(Hunter et al.(2005)FEBSLett.579:2215−2220)と融合させることによって作り出されている。P450RhFはクラス−I P450融合PFORに属する(DeMot and Parret(2003)TrendsMicrobiol.10:502)。このハイブリッドcyp153A−RedRhF融合タンパク質は、インビトロ生体内変換において、ω位にあるオクタンをヒドロキシル化すること、及びシクロヘキサンまたはブチルベンゼン等の他の化合物もヒドロキシル化することが示されている。他の自己充足型ハイブリッド(キメラの)cyp153Aオキシゲナーゼは、マリノバクター・アクアエオレイからのcyp153Aを、P450RhF及びP450−BM3(Scheps et al.(2013)Microb.Biotechnol.6:694−707)からのレダクターゼドメインと融合することにより作り出されている。天然P450−レダクターゼ融合タンパク質の例を、下記の表2C及び表2Dに示す。

0087

(表2C)自己充足型ω−1、ω−2、ω−3−ヒドロキシラーゼ(EC 1.14.14.1)融合タンパク質の例

0088

(表2D)自己充足型クラス−I P450融合PFOR融合タンパク質の例

0089

炭化水素のω−位に対するそれらの選択性を考慮すると、cyp153Aファミリーのオキシゲナーゼは、再生可能な炭素源からα,ω−二官能性脂肪酸誘導体を産生するのに適した候補の中の優れた例であるように思われる。これにより、これらの有益な化合物を産生する商業的に実現可能な工程が可能になると考えられる。しかしながら、他のシトクロムP450と同様に、cyp153Aファミリータンパク質はこれまでのところ、ほとんどは、脂肪酸誘導体または炭化水素が外因的に添加される、精製された酵素または粗製細胞溶解物を用いるインビトロ実験、或いは休止細胞での生体内変換に、適用されてきた(Kubota et al.,Fujita et al.,Honda−Malca et al.,Scheps et al.,上記)。しかしながら、ハイブリッド融合体を使用するインビトロ手順または休止細胞での生体内変換は、ω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体の大規模で且つ費用効率の高い産生にはつながらない。当技術分野において広く受け入れられている知見は、多くのシトクロムP450及びalkB型ω−ヒドロキシラーゼを組み換え微生物において機能的に発現させることは容易でないということである。なぜなら、酵素はしばしば不活性であり、それらの化学的現象解明することが困難であったためである。実際、これまでに試みられた脂肪酸誘導体以外の再生可能な炭素源を用いる唯一のインビボ研究では、alkB ω−ヒドロキシラーゼが使用されているが、高密度細胞発酵においてω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体が低い力価でしか得られていない(WO2013/024114A2号)。

0090

本開示は、再生可能な炭素源からω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体をインビボで効率的に産生することができるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合タンパク質バリアントを提供する。より具体的には、位置307のグリシン(G)がアラニン(A)に置換されているCYP153A(G307A)P450触媒ドメインのハイブリッド融合タンパク質をコードする、マリノバクター・アクアエオレイ由来の遺伝子を、ロドコッカス属の種(Rhodococcus sp.)NCIMB9784由来のP450RhFのc−末端FMN及びFe/Sを含有するレダクターゼドメインをコードする遺伝子と融合させた。得られるポリペプチドは、対応する核酸配列(配列番号5)を有するCYP153A−RedRhFハイブリッド融合ポリペプチド(配列番号6)である。このCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合タンパク質を、グルコース等の単純な炭素源で大腸菌細胞において発現させたところ、脂肪酸誘導体がω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体に効率的に転換された(下記の実施例1を参照)。同様のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドを形成するために用い得る、適したω−ヒドロキシラーゼ(EC 1.14.15.3)及びそれらのレドックスパートナーの他の例は、表2A及び2B(上記)に列記されている。

0091

CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント
本開示は、宿主細胞において発現させた場合にω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体組成物の高い力価、収量及び/または生産性をもたらすCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを特定している。本開示の非限定的な例においては(下記の実施例1〜7を参照)、CYP153A(G307A)−RedRhFハイブリッド融合ポリペプチド(上記)を鋳型として用い、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを効率的に操作して、より多くの量のω−OH脂肪酸およびω−OH脂肪酸誘導体を産生した。例えば、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、インビボで、グルコース等の単純な炭素源から、ドデカン酸等の化合物を12−ヒドロキシドデカン酸に効率的に転換することができる。例えば、再生可能な原料に由来するような任意の単純な炭素源が適している。操作されたCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント(即ち、操作されたCYP153A−RedRhFハイブリッド融合ポリペプチドバリアントによって例示されている)は、再生可能な原料由来のグルコース等の炭素源を用いて宿主細胞(例、大腸菌)においてチオエステラーゼと共発現させた場合に、インビボで脂肪酸を特定の望ましい化合物(ω−OH脂肪酸を含む)に効率的に転換させ得ることが示された(以下の実施例参照)。本開示に従って、突然変異させた遺伝子、例えばCYP153Aタンパク質をコードする遺伝子を、c末端レダクターゼドメインをコードする突然変異遺伝子と連結させることによって、他のハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを操作することができる(上記表2Aから2Dまでを参照)。例えば、両方の遺伝子(P5450及びレダクターゼドメイン)を突然変異させる、または一方の遺伝子(P450またはレダクターゼドメイン)を突然変異させる変形も、本明細書に包含される。これらの教示に従い、類似の融合タンパク質バリアントをω−ヒドロキシラーゼの他のタイプから作り出すことができる。

0092

従って、本開示は、宿主細胞で発現された場合、ω−ヒドロキシル化脂肪酸誘導体組成物の高い力価、収量、及び/または生産性をもたらす、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントに関する。CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、CYP153Aドメインまたはレダクターゼドメインまたはその両方に、1つ以上の突然変異を有する。1つの実施形態において、本開示は、配列番号6に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の配列同一性を有し、且つ位置27、82、141、178、231、309、407、415、516、666、及び/または796を含むアミノ酸位置に1つ以上の突然変異を有する、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントであって、脂肪酸からω−OH脂肪酸への転換に触媒作用を及ぼす、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを提供する。より具体的には、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、以下を含む突然変異を1つ以上有する:例えば、アルギニン(R)がリジン(L)で置換されているR27L;アルギニン(R)がアスパラギン酸(D)で置換されている位置R82D;バリンがイソロイシン(I)で置換されている位置V141I;バリン(V)がグルタミン(Q)で置換されている位置V141Q;バリン(V)がグリシン(G)で置換されている位置V141G;バリン(V)がメチオニン(M)で置換されている位置V141M;バリン(V)がロイシン(L)で置換されている位置V141L;バリン(V)がスレオニン(T)で置換されている位置V141T;アルギニン(R)がアスパラギン(N)で置換されている位置R178N;アラニン(A)がスレオニン(T)で置換されている位置A231T;アスパラギン(N)がアルギニン(R)で置換されている位置N309R;アスパラギン(N)がアラニン(A)で置換されている位置N407A;バリン(V)がアルギニン(R)で置換されている位置V415R;スレオニン(T)がバリン(V)で置換されている位置T516V;プロリン(P)がアラニン(A)で置換されている位置P666A;プロリン(P)がアスパラギン酸(D)で置換されている位置P666D;及び、アラニン(A)がバリン(V)で置換されている位置A796V。CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの例としては、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28もしくは配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、及び配列番号46が挙げられる。1つの実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、ハイブリッドcyp153A−RedRhF型の融合タンパク質バリアントである。別の実施形態において、組み換え宿主細胞内のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、対応する宿主細胞内のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−OH脂肪酸またはその組成物の力価よりも高い力価を有するω−OH脂肪酸またはその組成物をもたらす。もう1つの実施形態において、組み換え宿主細胞内のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、V141I及び/またはV141Tを含むアミノ酸位置141に突然変異を有する。本明細書では、組み換え宿主細胞で突然変異V141I及び/またはV141Tを有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントの発現は、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドの発現により産生されるω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸の力価と比較して、それぞれ、ω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸においてより高い力価をもたらす。1つの実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、突然変異V141I及びA231T(配列番号32)を有し、且つチオエステラーゼの酵素機能を有する宿主細胞で発現された場合にω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸を増加した量で産生する。別の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、突然変異R27L、R82D、V141M、R178N及びN407A(配列番号34)を有し、且つチオエステラーゼの酵素機能を有する宿主細胞で発現された場合にω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸をより増加した量で産生する。別の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、突然変異P666A(配列番号36)を有し、且つチオエステラーゼの酵素機能を有する宿主細胞で発現された場合にω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸をより増加した量で産生する。別の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、突然変異A796V(配列番号38)を有し、且つチオエステラーゼの酵素機能を有する宿主細胞で発現された場合にω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸をより増加した量で産生する。別の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、突然変異A796V、P666D及びT516V(配列番号40)を有し、且つチオエステラーゼの酵素機能を有する宿主細胞で発現された場合にω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸をより増加した量で産生する。別の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、突然変異V141I、A231T及びA796V(配列番号42)を有し、且つチオエステラーゼの酵素機能を有する宿主細胞で発現された場合にω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸をより増加した量で産生する。別の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、突然変異R27L、R82D、V141M、R178N、
N407A及びA796V(配列番号44)を有し、且つチオエステラーゼの酵素機能を有する宿主細胞で発現された場合にω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸をより増加した量で産生する。別の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、突然変異V141T、A231T及びA796V(配列番号46)を有し、且つチオエステラーゼの酵素機能を有する宿主細胞で発現された場合にω−OH C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸をより増加した量で産生する。1つの実施形態において、配列番号6と比較して、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44及び配列番号46のバリアントは、より増加した量のω−OH脂肪酸または脂肪酸誘導体を産生した。1つの実施形態において、これらのω−OH脂肪酸は、ω−OH C8:0脂肪酸、ω−OH C10:0脂肪酸、ω−OH C12:0脂肪酸、ω−OH C14:0脂肪酸、ω−OH C16:0脂肪酸、ω−OH C18:0脂肪酸、ω−OH C20:0脂肪酸、ω−OH C8:1脂肪酸、ω−OH C10:1脂肪酸、ω−OH C12:1脂肪酸、ω−OH C14:1脂肪酸、ω−OH C16:1脂肪酸、ω−OH C18:1脂肪酸、ω−OH C20:1脂肪酸等である。

0093

本開示は、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合関連ポリヌクレオチド及びポリペプチドバリアントを特定する。CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントとしては、配列番号8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44及び46が挙げられる。CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合核酸バリアント(DNA配列)としては、配列番号7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45及び47が挙げられる。しかしながら、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリヌクレオチドバリアントに対して絶対配列同一性は必要としないことが認識されるであろう。例えば、特定のポリヌクレオチド配列を変化させて、コードされたポリペプチドを活性化についてスクリーニングすることができる。このような変化には、典型的には、例えばコドン最適化等による保存的突然変異及びサイレント突然変異が含まれる。改変されたまたは突然変異を受けた(即ち、突然変異)ポリヌクレオチド及びコードされるバリアントポリペプチドは、当技術分野において公知の方法を用いて、触媒活性の増大、安定性の増大、または阻害の低下(例、フィードバック阻害の低下)を含むがこれらに限定されない、野生型または鋳型ポリペプチドと比較して改善された機能等の所望の機能を得るためにスクリーニングすることができる。本開示では、本明細書に記載の脂肪酸生合成経路の様々なステップ(即ち反応)に関与する酵素活性を酵素分類(EC)番号に従って特定し、そのようなEC番号によって分類される例示的な(例えば、特定の酵素として機能し且つ特定の酵素活性を示す)ポリペプチド、及びこのようなポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチドを提供している。本明細書において配列識別子番号(配列番号;上記)により特定されるこのような例示的なポリペプチド及びポリヌクレオチドは、図1に示されたもののような宿主細胞における脂肪酸経路を操作するために有用である。しかしながら、本明細書に記載のポリペプチド及びポリヌクレオチドは例示的であって、このためこれらに限定されないことが理解される必要がある。本明細書に記載の例示的なポリペプチドの相同体の配列は、データベース、例えば、いずれもワールド・ワイド・ウェブ上で利用可能である、National Center for Biotechnology Information(NCBI)によって提供されているEntrezデータベース、Swiss Institute of Bioinformaticsによって提供されているExPasyデータベース、Technical University of Braunschweigによって提供されているBRENDAデータベース、並びにBioinformatics Center of Kyoto University及びUniversity of Tokyoによって提供されているKEGGデータベースを用いて、当業者には入手可能である。

0094

1つの実施形態において、本開示を実施するために使用されるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28または配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、及び配列番号46に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、アラニン(A)がグリシン(G)で置換されている、マリノバクター・アクアエオレイ由来のCYP153A(G307A)ポリペプチドに由来し、ロドコッカス属の種NCIMB9784由来のP450RhFのレダクターゼドメインと融合している。シトクロムP450RhFは自己充足型であり、高度な基質多様性(substrate promiscuity)を示し、広範な官能基を触媒する。他の実施形態において、本開示の実施に用いるためのCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号6、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28もしくは配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44または配列番号46に対して、少なくとも約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも99%の配列同一性を有し、さらに本明細書に記載されているような有用な特徴及び/または特性をもたらす1つ以上の置換を含んでいてもよい。他の実施形態において、本開示の実施するために用いられるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号8、配列番号10、配列番号12、配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24、配列番号26、配列番号28もしくは配列番号30、配列番号32、配列番号34、配列番号36、配列番号38、配列番号40、配列番号42、配列番号44、または配列番号46に対して、少なくとも約100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、または90%の配列同一性を有する。さらに他の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントのP450触媒ドメインは、マリノバクター・アクアエオレイ以外の生物に由来する。このような他の生物としては、以下を非限定的に含む:アシネトバクター属の種、マイコバクテリウム・マリヌム、ポラロモナス属の種、アルカニボラックス・ボルクメンシス、バーククホルデリア・フンラム(Burkholderia fungorum)、カウロバクタークレセンタス(Caulobacter crescentus)、ヒポモナス・ネプチュニウム(Hyphomonas neptunium)、ロドシュードモナス・パルストリス(Rhodopseudomonas palustris)、スフィンゴモナス属の種、マイコバクテリウム属の種。さらに他の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントのレダクターゼドメインは、ロドコッカス属の種に由来する。そのような他の生物は、以下を非限定的に含む:ロドコッカスエクイ(Rhodococcus equi)、アシネトバクター・ラジオレシテンス(Acinetobacter radioresistens)、鼻疽菌(Burkholderia mallei)、鼻疽菌、ラストニアユートロファ(Ralstonia eutropha)、カプリアビダスメタデュランス(Cupriavidus metallidurans)。

0095

関連する実施形態において、本開示は、配列番号5、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、または配列番号47に対して、少なくとも約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントを包含する。いくつかの実施形態において、核酸配列は、本明細書に記載の改良された特徴及び/または特性をもたらす1つ以上の置換を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントをコードする。さらに別の関連した実施形態において、本開示の実施に用いるためのCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45または配列番号47に対して少なくとも約100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%または90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。別の態様において、本開示は、配列番号7、配列番号9、配列番号11、配列番号13、配列番号15、配列番号17、配列番号19、配列番号21、配列番号23、配列番号25、配列番号27、配列番号29、配列番号31、配列番号33、配列番号35、配列番号37、配列番号39、配列番号41、配列番号43、配列番号45、または配列番号47に対応する核酸配列の実質的に全長に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を包含するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントに関する。いくつかの実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、マリノバクター・アクアエオレイに由来する。他の実施形態において、P450ハイブリッド融合ポリペプチドは、アシネトバクター属の種、マイコバクテリウム・マリヌム、ポラロモナス属の種、アルカニボラックス・ボルクメンシス、バーククホルデリア・フンゴラム、カウロバクター・クレセンタス、ヒポモナス・ネプチュニウム、ロドシュードモナス・パルストリス、スフィンゴモナス属の種、及びマイコバクテリウム属の種に由来する。

0096

追加のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント
本開示は、バリアントが鋳型として使用された、追加のCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合関連ポリヌクレオチド及びポリペプチドバリアントを特定する。CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアント鋳型は、CYP153A(G307A)−RedRhF融合ポリペプチドを基礎とし、そして、さらに突然変異A796V(配列番号38)を含む。cyp153A−Red450RhF融合タンパク質の完全飽和ライブラリー構築され、スクリーニングされてcyp153A(G307A)−Red450RhF(A796V)(配列番号38)に対する改善を示すバリアントが得られた(実施例7参照)。突然変異G307A及びA796Vは、cyp153Aのω−ヒドロキシラーゼ活性を改良する有益な突然変異である(配列番号38参照)。得られるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは表11に示される(以下)。これらのCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号38と比較して、ω−ヒドロキシ脂肪酸(ω−OHFFA力価)をより増加した量で産生し、そして配列番号48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94及び96を包含している。これらのCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1及び/またはC20:1脂肪酸及び/または脂肪酸誘導体を含むω−OH脂肪酸をより増加した量で産生することができる。

0097

CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合核酸バリアント(DNA配列)は、配列番号47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93及び95を包含する。しかしながら、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリヌクレオチドバリアントに対する絶対的な配列同一性は必要とされないことは理解されるであろう。例えば、特定のポリヌクレオチド配列を変化させて、コードされたポリペプチドを活性化についてスクリーニングすることができる。このような変化には、典型的には、例えばコドン最適化等による保存的突然変異及びサイレント突然変異が含まれる。改変されたまたは突然変異を受けた(即ち、突然変異)ポリヌクレオチド及びコードされたバリアントポリペプチドは、当技術分野において公知の方法を用いて、触媒活性の増大、安定性の増大、または阻害の低下(例、フィードバック阻害の低下)を含むがこれらに限定されない、野生型または鋳型ポリペプチドと比較して改善された機能等の所望の機能を得るためにスクリーニングすることができる。本開示では、本明細書に記載の脂肪酸生合成経路の様々なステップ(即ち反応)に関与する酵素活性を酵素分類(EC)番号に従って特定し、そのようなEC番号によって分類される例示的なポリペプチド(例えば、特定の酵素として機能し且つ特定の酵素活性を示すもの)、及びこのようなポリペプチドをコードする例示的なポリヌクレオチドを提供している。本明細書において配列識別子番号(配列番号;上記)により特定されるこのような例示的なポリペプチド及びポリヌクレオチドは、図1に示されたもの等の宿主細胞において脂肪酸経路を操作するために有用である。しかしながら、本明細書に記載のポリペプチド及びポリヌクレオチドは例示的であるので、これらに限定されないことが理解される必要がある。本明細書に記載の典型的なポリペプチドの相同体の配列は、データベース、例えば、いずれもワールド・ワイド・ウェブ上で利用可能である、National Center for Biotechnology Information(NCBI)によって提供されているEntrezデータベース、Swiss Institute of Bioinformaticsによって提供されているExPasyデータベース、Technical University of Braunschweigによって提供されているBRENDAデータベース、並びにBioinformatics Center of Kyoto University及びUniversity of Tokyoによって提供されているKEGGデータベースを用いて、当業者には入手可能である。

0098

1つの実施形態において、本開示を実施するために使用されるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68もしくは配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、及び配列番号96に対して少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、グリシン(G)がアラニン(A)で置換されている、マリノバクター・アクアエオレイ由来のCYP153A(G307A)ポリペプチドに由来し、ロドコッカス属の種であるNCIMB9784由来のP450RhFのレダクターゼドメインと融合し、そしてアラニン(A)がバリン(V)で置換されているA796Vの追加の突然変異を含んでいる。シトクロムP450RhFは自己充足型であり、高度な基質多様性(substrate promiscuity)を示し、広範な官能基を触媒する。他の実施形態において、本開示の実施に用いるためのCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号38、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68もしくは配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、または配列番号96に対して、少なくとも約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも99%の配列同一性を有し、さらに本明細書に記載されているような有用な特徴及び/または特性をもたらす1つ以上の置換を含んでいてもよい。他の実施形態において、本開示の実施するために用いられるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、配列番号48、配列番号50、配列番号52、配列番号54、配列番号56、配列番号58、配列番号60、配列番号62、配列番号64、配列番号66、配列番号68もしくは配列番号70、配列番号72、配列番号74、配列番号76、配列番号78、配列番号80、配列番号82、配列番号84、配列番号86、配列番号88、配列番号90、配列番号92、配列番号94、または配列番号96に対して、少なくとも約100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、または90%の配列同一性を有する。さらに他の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントのP450触媒ドメインは、マリノバクター・アクアエオレイ以外の生物に由来する。このような他の生物としては、以下を非限定的に含む:アシネトバクター属の種、マイコバクテリウム・マリヌム、ポラロモナス属の種、アルカニボラックス・ボルクメンシス、バーククホルデリア・フンゴラム、カウロバクター・クレセンタス、ヒポモナス・ネプチュニウム、ロドシュードモナス・パルストリス、スフィンゴモナス属の種、マイコバクテリウム属の種。さらに他の実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントのレダクターゼドメインは、ロドコッカス属の種以外の生物に由来する。そのような他の生物は、以下を非限定的に含む:ロドコッカス・エクイ、アシネトバクター・ラジオレシステンス、鼻疽菌、鼻疽菌、ラストニア・ユートロファ、カプリアビダス・メタリデュランス。

0099

関連する実施形態において、本開示は、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、または配列番号95に対して、少なくとも約75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または少なくとも99%の配列同一性を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリヌクレオチドバリアントを包含する。いくつかの実施形態において、核酸配列は、本明細書に記載されている有用な特徴及び/または特性をもたらす1つ以上の置換を有するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリヌクレオチドバリアントをコードする。さらに別の関連する実施形態において、本開示の実施に用いるためのCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリヌクレオチドバリアントは、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、または配列番号95に対して、少なくとも約100%、99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、または90%の配列同一性を有するヌクレオチド配列によりコードされる。別の態様において、本開示は、配列番号47、配列番号49、配列番号51、配列番号53、配列番号55、配列番号57、配列番号59、配列番号61、配列番号63、配列番号65、配列番号67、配列番号69、配列番号71、配列番号73、配列番号75、配列番号77、配列番号79、配列番号81、配列番号83、配列番号85、配列番号87、配列番号89、配列番号91、配列番号93、または配列番号95に対応する核酸配列の全長に実質的に亘ってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を包含するCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントに関する。いくつかの実施形態において、CYP153A−レダクターゼハイブリッド融合ポリペプチドバリアントは、マリノバクター・アクアエオレイ種に由来する。他の実施形態において、P450ハイブリッド融合ポリペプチドは、アシネトバクター属の種、マイコバクテリウム・マリヌム、ポラロモナス属の種、アルカニボラックス・ボルクメンシス、バーククホルデリア・フンゴラム、カウロバクター・クレセンタス、ヒポモナス・ネプチュニウム、ロドシュードモナス・パルストリス、スフィンゴモナス属の種、及びマイコバクテリウム属の種に由来する。

0100

配列
以下の表に示したバリアントはハイブリッドチトクロームP450 cyp153A16(G307A)−RedRhF融合タンパク質を基礎とする。

ハイブリッドチトクロームP450 Cyp153A16(G307A)−RedRhF融合タンパク質を基礎とするバリアントを有する配列表

0101

以下の表に示したバリアントはハイブリッドチトクロームP450 cyp153A(G307A)−Red450RhF(A796V)融合タンパク質を基礎とする。

ハイブリッドチトクロームP450 cyp153A(G307A)−Red450RhF(A796V)を基礎とするバリアントを有する配列表

0102

変異及び突然変異
本明細書で使用されるバリアントポリペプチドは、野生型または鋳型ポリペプチドとは少なくとも1つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを言う。例えば、バリアント(例、突然変異体)は、以下の1つ以上の保存的アミノ酸置換、これらに限定されるものではないが、例えば、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシン等の脂肪族アミノ酸の、別の脂肪族アミノ酸による置換;セリンのスレオニンによる置換;スレオニンのセリンによる置換;例えばアスパラギン酸及びグルタミン酸等の酸性残基の、別の酸性残基による置換;アスパラギン及びグルタミン等のアミド基を有する残基の別のアミド基を有する残基による置換;リジン及びアルギニン等の塩基性残基の、別の塩基性残基との交換;並びに、フェニルアラニン及びチロシン等の芳香族残基の、別の芳香族残基による置換のうちの、1つ以上を有することができる。いくつかの実施形態において、バリアントポリペプチドは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、99、またはそれを超えるアミノ酸置換、付加、挿入または欠失を有する。バリアントまたは突然変異体として機能するポリペプチドの好ましい断片のいくつかは、対応する野生型ポリペプチド生物学的機能(例、酵素活性)の一部またはすべてを保持している。いくつかの実施形態において、断片は、対応する野生型ポリペプチドまたは鋳型ポリペプチドの生物学的機能の少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも98%、またはそれ以上を保持している。他の実施形態において、断片または突然変異体は、対応する野生型ポリペプチドまたは鋳型ポリペプチドの生物学的機能の約100%を保持している。他の実施形態において、いくつかの断片は、対応する野生型ポリペプチドまたは鋳型ポリペプチドと比較して増大した生物学的機能を示す。生物活性に影響を与えること無く、どのアミノ酸残基を置換し、挿入し、または欠失させることができるかを判定するための手引きは、当技術分野において周知のコンピュータプログラム、例えば、LASERGENEソフトウェア(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)を用いて知ることができる。いくつかの実施形態において、断片は、対応する野生型ポリペプチドまたは鋳型ポリペプチドと比較して増大した生物学的機能を示す。例えば、断片は、対応する野生型ポリペプチドまたは鋳型ポリペプチドと比較して、酵素活性の点で少なくとも10%、少なくとも25%、少なくとも50%、少なくとも75%または少なくとも90%の改善を示しうる。他の実施形態において、断片は、対応する野生型ポリペプチドまたは鋳型ポリペプチドと比較して、酵素活性の点で少なくとも100%、少なくとも200%、または少なくとも500%の改善を示す。

0103

本明細書に記載されるポリペプチドが、ポリペプチドの機能に実質的な影響を及ぼさないさらなる保存的または非必須のアミノ酸置換を有してもよいことが理解される。当技術分野において公知のように、ある特定の置換が許容される(即ち、ω−ヒドロキシラーゼ酵素活性等の所望の生物学的機能に有害な影響を及ぼさない)か否かを判定することができる(Bowie et al.(1990)Science,247:1306−1310参照)。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖(例、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、ベータ分枝側鎖(例、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸が含まれる。

0104

バリアントは、天然に存在してもよく、またはインビトロで作り出してもよい。特に、このようなバリアントは、部位指定突然変異誘発、ランダム化学的突然変異誘発、エキソヌクレアーゼIII欠失手順、または標準的なクローニング手法等の遺伝子工学技術を用いて作製することができる。或いは、このようなバリアント、突然変異体、断片、類似体または誘導体を、化学合成または改変手順を用いて作製することもできる。バリアントの作製方法は当技術分野において周知である。例えば、バリアントは、ランダム突然変異誘発及び部位指定突然変異誘発を用いることによって調製することができる。ランダム突然変異誘発及び部位指定突然変異誘発は、当技術分野において広く知られている(例えば、Arnold(1993)Curr.Opin.Biotech.4:450−455参照)。ランダム突然変異誘発は、エラープローンPCR(例えば、Leung et al.(1989),Technique,1:11−15;及びCaldwell et al.(1992)PCR MethodsApplic,2:28−33参照)を用いて達成することができる。エラープローンPCRでは、PCR産物の全長に沿って高い点突然変異率が得られるように、DNAポリメラーゼの複製忠実度(copying fidelity)が低くなる条件下で実際のPCRを行う。簡潔に述べると、このような手法では、突然変異誘発させる核酸(例えば、P450タンパク質またはP450ハイブリッド融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列)を、PCR産物の全長にわたって高い点突然変異率を得るために、PCRプライマー、反応緩衝液、MgCl2、MnCl2、Taqポリメラーゼ、及び適当な濃度のdNTPと混合する。例えば、反応は、20fmolの突然変異誘発させる核酸、30pmolの各PCRプライマー、50mMKCl、10mM Tris HCl(pH 8.3)、0.01%ゼラチン、7mM MgCl2、0.5mM MnCl2、5単位のTaqポリメラーゼ、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、1mM dCTP、及び1mM dTTPを含む反応緩衝液を用いて行うことができる。PCRは、94℃で1分、45℃で1分、及び72℃で1分を30サイクル行うことができる。しかしながら、これらのパラメータを適宜変更し得ることは当業者に理解されるであろう。その後、突然変異誘発した核酸を適切なベクター中にクローニングし、突然変異誘発した核酸によってコードされるポリペプチドの活性を評価する。部位指定突然変異誘発は、クローニングされた対象のDNA中に部位特異的突然変異を発生させるためにオリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を用いて達成することができる。オリゴヌクレオチド突然変異誘発は当技術分野において記載されている(例えば、Reidhaar−Olson et al.(1988)Science,241:53−57参照)。簡潔に言うと、このような手順では、クローニングされたDNA中に導入しようとする1つ以上の突然変異を有する複数の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成し、突然変異誘発させるクローニングされたDNA(例、P450ポリペプチドまたはP450ハイブリッド融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列)中に挿入する。突然変異誘発されたDNAを含有するクローンを回収し、これらがコードするポリペプチドの活性を評価する。

0105

バリアントを作り出す別の方法は、アセンブリPCRである。アセンブリPCRでは、小さなDNA断片の混合物からのPCR産物のアセンブリが行われる。同一のバイアル内で多数の異なるPCR反応並行して起こり、ある反応の産物が別の反応の産物をプライミングする(米国特許第5,965,408号参照)。バリアントを作製するなお別の1つの方法は、セクシャルPCR突然変異誘発である。セクシャルPCR突然変異誘発では、DNA分子ランダム断片化の結果として、異なってはいるが類似性の高いDNA配列のDNA分子間で、配列相同性に基づき、強制的な相同組み換えがインビトロで起こる。これに続いて、PCR反応におけるプライマー伸長により組み換え(crossover)の固定が行われる。セクシャルPCR突然変異誘発は、当技術分野で公知の刊行物に記載されている(例、Stemmer,(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,91:10747−10751参照)。バリアントは、インビボ突然変異誘発によって作製することもできる。いくつかの態様においては、DNA修復経路の1つ以上に突然変異を有する大腸菌株等の細菌株において配列を伝搬させることにより、核酸配列中にランダム突然変異を生じさせる。このような突然変異誘発因子(mutator)菌株は、野生型菌株よりも高いランダム突然変異率を有する。これらの菌株の1つでDNA配列(例、P450ハイブリッド融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列)を伝搬させることにより、最終的にDNA内にランダム突然変異を生じさせる。インビボ突然変異誘発において好適に使用される突然変異誘発因子菌株は、当技術分野の刊行物に記載されている(例えば、国際特許出願公開WO1991/016427号参照)。また、バリアントはカセット突然変異誘発を用いて作製することもできる。カセット突然変異誘発では、二本鎖DNA分子の小さな領域を、生来の配列とは異なる合成オリゴヌクレオチドカセットで置き換える。オリゴヌクレオチドは、多くの場合、完全及び/または部分的にランダム化された生来の配列を含有する。また、リカーシブアンサンブル(recursive ensemble)突然変異誘発を、バリアントの作製に用いることもできる。リカーシブ・アンサンブル突然変異誘発は、メンバーのアミノ酸配列が異なる、表現型が関連する突然変異体の多様な集団を作製するために開発されたタンパク質工学(即ち、タンパク質突然変異誘発)のアルゴリズムである。この方法では、フィードバック機構を用いて、連続的に繰り返されるコンビナトリアルカセット突然変異誘発を制御する(例えば、Arkin et al,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,89:7811−7815参照)。いくつかの実施形態においては、エクスポネンシャル・アンサンブル突然変異誘発を用いてバリアントが作製される。エクスポネンシャル・アンサンブル突然変異誘発は、特有で機能的な突然変異体を高いパーセンテージで有するコンビナトリアルライブラリーを作製するための工程であり、この工程では、少数の残基群を並行してランダム化して、変更された各位置で機能的タンパク質をもたらすアミノ酸を同定する(例えば、Delegrave et al.(1993)Biotech.Res,11:1548−1552参照)。いくつかの実施形態においては、シャフリング手順を用いてバリアントが作製され、この手順では、別個のポリペプチドをコードする複数の核酸の部分を相互に融合させて、キメラポリペプチドをコードするキメラ核酸配列を作り出す(例えば、米国特許第5,965,408号及びび第5,939,250号に記載されている)。

0106

宿主細胞
組み換え宿主細胞によるω−OH脂肪酸組成物の産生を増加させる戦略には、産生宿主におけるCYP153A−レダクターゼハイブリッド融合遺伝子及びチオエステラーゼ遺伝子の発現による脂肪酸生合成経路の通過フラックスの増大が含まれる。本明細書で用いられるとき、組み換え宿主細胞または操作された宿主細胞という用語は、例えば、新たな遺伝因子の意図的導入、及び/または宿主細胞内に天然に存在する遺伝因子の意図的改変によって、対応する野生型宿主細胞に比べて遺伝子構成が変更された宿主細胞を指す。このような組み換え宿主細胞の子孫も、これらの新しい及び/または改変された遺伝因子を含有する。本明細書に記載の本開示の任意の態様において、宿主細胞は、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞(例、カンジダ属の種(Candida sp.)等の糸状菌、またはサッカロミセス属の種等の出芽酵母)、藻類細胞及び細菌細胞より選択され得る。1つの実施形態において、組み換え宿主細胞は、組み換え微生物である。微生物である宿主細胞の例としては、エシェリキア属(Escherichia)、バチルス属(Bacillus)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ジモモナス属(Zymomonas)、ロドコッカス属、シュードモナス属(Pseudomonas)、アスペルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、ニューロスポラ属(Neurospora)、フザリウム属(Fusarium)、フミコラ属(Humicola)、リゾムコール属(Rhizomucor)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ピチア属(Pichia)、ムコール属(Mucor)、ミセリオプトラ属(Myceliophtora)、ペニシリウム属(Penicillium)、ファネロカエテ属(Phanerochaete)、プレウロタス属(Pleurotus)、トラメテス属(Trametes)、クリソスポリウム属(Chrysosporium)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ステノトロホモナス属(Stenotrophamonas)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ヤロウイア属(Yarrowia)、またはストレプトミセス属(Streptomyces)に由来する細胞を挙げることができるが、これらに限定的されるものではない。いくつかの実施形態において、宿主細胞はグラム陽性細菌細胞である。他の実施形態において、宿主細胞はグラム陰性細菌細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は大腸菌細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞は大腸菌B細胞、大腸菌C細胞、大腸菌K細胞、または大腸菌 W細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は、バチルスレンタス(Bacillus lentus)細胞、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)細胞、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)細胞、リケニホルミス菌(Bacillus lichenoformis)細胞、バチルス・アルカロフィラス(Bacillus alkalophilus)細胞、バチルス・コアギュランス(Bacillus coagulans)細胞、バチルス・シルクランス(Bacillus circulans)細胞、バチルス・プミリス(Bacillus pumilis)細胞、バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)細胞、バチルス・クラウジイ(Bacillus clausii)細胞、バチルス・メガリウム(Bacillus megaterium)細胞、枯草菌(Bacillus subtilis)細胞、またはバチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は、トリコデルマ・コニンギイ(Trichoderma koningii)細胞、トリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)細胞、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)細胞、トリコデルマ・ロンギブキアタム(Trichoderma longibrachiatum)細胞、アスペルギルスアワモリ(Aspergillus awamori)細胞、アスペルギルス・フミガタス(Aspergillus fumigates)細胞、アスペルギルス・フェティデュス(Aspergillus foetidus)細胞、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)細胞、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)細胞、アスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)細胞、フミコラインソレンス(Humicola insolens)細胞、フミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginose)細胞、ロドコッカス・オパクス(Rhodococcus opacus)細胞、リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)細胞、またはムコール・ミエヘイ(Mucor michei)細胞である。さらに他の実施形態において、宿主細胞は、ストレプトミセスリビダンス(Streptomyces lividans)細胞またはストレプトミセス・ムリナス(Streptomyces murinus)細胞である。さらに他の実施形態において、宿主細胞はアクチノミセス属(Actinomycetes)細胞である。いくつかの実施形態において、宿主細胞はサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)細胞である。

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