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技術 メソセリン標的化キメラ抗原受容体およびその使用

出願人 メモリアルスローンケタリングキャンサーセンターザユナイテッドステイツオブアメリカ,アズリプレゼンテッドバイザセクレタリー,デパートメントオブヘルスアンドヒューマンサービシーズ
発明者 プラサッドエス.アドゥスミリマイケルサデレインディミターエス.ディミトロフヤンフェン
出願日 2019年11月11日 (1年0ヶ月経過) 出願番号 2019-203937
公開日 2020年3月12日 (8ヶ月経過) 公開番号 2020-036606
状態 未査定
技術分野 化合物または医薬の治療活性 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 微生物による化合物の製造 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 動物,微生物物質含有医薬 微生物、その培養処理 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 突然変異または遺伝子工学 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード プレコンディション 平衡のとれた アテニュエータ 親密性 比較閾値 一般的目的 伝達領域 例示的実施
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2020年3月12日)のものです。
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図面 (20)

課題

がんおよび病原体に向けた免疫応答を増強するための方法および組成物を提供すること。

解決手段

ヒトメソセリンを特異的に標的とするキメラ抗原受容体(CAR)およびこのようなCARを含む免疫応答性細胞に関する。ここで開示されるメソセリン標的化CARは、抗腫瘍活性を含めた免疫活性化特性を増強した。本発明は、例えば、細胞外抗原結合性ドメイン膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)であって、前記細胞外抗原結合性ドメインが、ヒトメソセリンと約1nM〜約25nMの結合アフィニティー(Kd)で特異的に結合する、キメラ抗原受容体(CAR)を提供する。

概要

背景

発明の背景
細胞ベース免疫療法は、がん治療のための治癒可能性を有する療法である。T細胞および他の免疫細胞は、選択された抗原に対して特異的なキメラ抗原受容体(CAR)と呼ばれる抗原の人工または合成受容体をコードする遺伝物質の導入によって、腫瘍抗原を標的とするよう修飾され得る。CARを使用する標的化T細胞療法は、いくつかの血液悪性腫瘍の治療において、最近、臨床上の成功を示した。しかし、CAR発現性T細胞療法を固形腫瘍トランスレーションすると、臨床上の利益を達成するためには克服しなければならないいくつかの障害を生じる。悪性細胞は、自身を免疫認識および排除から保護するために、免疫抑制性微小環境を生成するよう適応する。この腫瘍微小環境は、標的化T細胞療法などの免疫応答刺激を含む治療方法に対して課題をもたらす。固形腫瘍はまた、効率的なT細胞輸送を妨げ、アゴニスト共刺激リガンド発現を欠き、および/またはT細胞機能の負の制御因子を発現する解剖学コンパートメント内に制限され得る。したがって、固形腫瘍の排除の成功は、効率的な腫瘍浸潤および腫瘍誘発性免疫抑制を克服することを必要とする。さらに、固形腫瘍は、その標的化が、非腫瘍組織に対する最小のまたは許容できる毒性を伴って、強力なT細胞による腫瘍根絶を可能にするであろう、最適な免疫標的−抗原を選択するための課題をもたらす。したがって、がん、特に固形腫瘍を治療するためのCARを設計する新規治療戦略が必要であり、この戦略は、最小の毒性および免疫原性を伴って、強力な腫瘍根絶を誘導可能である(CAR免疫原性は、最適以下のCARに対するアナフィラキシー反応の状況において例示される、低減された有効性または急性毒性をもたらし得る)。

概要

がんおよび病原体に向けた免疫応答を増強するための方法および組成物を提供すること。ヒトメソセリンを特異的に標的とするキメラ抗原受容体(CAR)およびこのようなCARを含む免疫応答性細胞に関する。ここで開示されるメソセリン標的化CARは、抗腫瘍活性を含めた免疫活性化特性を増強した。本発明は、例えば、細胞外抗原結合性ドメイン膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)であって、前記細胞外抗原結合性ドメインが、ヒトメソセリンと約1nM〜約25nMの結合アフィニティー(Kd)で特異的に結合する、キメラ抗原受容体(CAR)を提供する。

目的

導入
ここで開示される主題は、がんおよび病原体に対する免疫応答を増強するための方法および組成物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

明細書に記載の発明。

技術分野

0001

関連出願の引用
本願は、2014年6月6日に出願した米国仮特許出願第62/008,851号に対する優先権を主張する。この出願はそれぞれ、その全体が、本明細書中に参考として援用され、そしてそのそれぞれに対して優先権を主張する。

0002

助成金情報
本発明は、米国国防総省からの助成金番号W81XWH−11−1−0783およびW81XWH−12−1−0230の下、政府支援を受けて行った。政府は、本発明において一定の権利を有する。

0003

導入
ここで開示される主題は、がんおよび病原体に対する免疫応答を増強するための方法および組成物を提供する。それは、ヒトメソセリンを特異的に標的とするキメラ抗原受容体(CAR)およびこのようなCARを含む免疫応答性細胞に関する。ここで開示されるメソセリン標的化CARは、CAR誘発性毒性および免疫原性を最小化する特徴を有しながら、抗腫瘍活性を含めた免疫活性化特性を増強した。

背景技術

0004

発明の背景
細胞ベース免疫療法は、がんの治療のための治癒可能性を有する療法である。T細胞および他の免疫細胞は、選択された抗原に対して特異的なキメラ抗原受容体(CAR)と呼ばれる抗原の人工または合成受容体をコードする遺伝物質の導入によって、腫瘍抗原を標的とするよう修飾され得る。CARを使用する標的化T細胞療法は、いくつかの血液悪性腫瘍の治療において、最近、臨床上の成功を示した。しかし、CAR発現性T細胞療法を固形腫瘍トランスレーションすると、臨床上の利益を達成するためには克服しなければならないいくつかの障害を生じる。悪性細胞は、自身を免疫認識および排除から保護するために、免疫抑制性微小環境を生成するよう適応する。この腫瘍微小環境は、標的化T細胞療法などの免疫応答の刺激を含む治療方法に対して課題をもたらす。固形腫瘍はまた、効率的なT細胞輸送を妨げ、アゴニスト共刺激リガンド発現を欠き、および/またはT細胞機能の負の制御因子を発現する解剖学コンパートメント内に制限され得る。したがって、固形腫瘍の排除の成功は、効率的な腫瘍浸潤および腫瘍誘発性免疫抑制を克服することを必要とする。さらに、固形腫瘍は、その標的化が、非腫瘍組織に対する最小のまたは許容できる毒性を伴って、強力なT細胞による腫瘍根絶を可能にするであろう、最適な免疫標的−抗原を選択するための課題をもたらす。したがって、がん、特に固形腫瘍を治療するためのCARを設計する新規治療戦略が必要であり、この戦略は、最小の毒性および免疫原性を伴って、強力な腫瘍根絶を誘導可能である(CAR免疫原性は、最適以下のCARに対するアナフィラキシー反応の状況において例示される、低減された有効性または急性毒性をもたらし得る)。

課題を解決するための手段

0005

ここで開示される主題は、概して、ヒトメソセリンを特異的に標的とするキメラ抗原受容体(CAR)、このようなCARを含む免疫応答性細胞、ならびにがん、病原体感染などを治療するためのこれらのCARおよび免疫応答性細胞の使用を提供する。

0006

ここで開示される主題は、CARを提供する。ある一つの限定されない例では、前記CARは、細胞外抗原結合性ドメイン膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、ここで、前記細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトメソセリンと約1nM〜約25nMの結合アフィニティーで特異的に結合する。ある特定の実施形態では、前記CARは、約1,000またはそれ超のメソセリン結合部位/細胞のメソセリン発現レベルのヒトメソセリンを認識する。

0007

一部の実施形態では、前記細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号1のアミノ酸1〜119を含む重鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、前記細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号5のアミノ酸1〜107を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、前記細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号3のアミノ酸1〜107を含む軽鎖可変領域を含む。一部の実施形態では、前記細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号11に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域CDR1、配列番号12に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域CDR2、および配列番号13に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域CDR3を含む。一部の実施形態では、前記細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号14に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域CDR1、配列番号15に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域CDR2、および配列番号16に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域CDR3を含む。ある特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、前記重鎖および軽鎖の両方を含み、必要に応じて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に、リンカー配列、例えば、リンカーペプチドを有する。例えば、ある特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、(i)配列番号1のアミノ酸1〜119を含む重鎖可変領域および(ii)配列番号5のアミノ酸1〜107を含む軽鎖可変領域を含み、必要に応じて、(iii)重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間にリンカー配列、例えば、リンカーペプチドを有する。一部の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、(i)配列番号1のアミノ酸1〜119を含む重鎖可変領域および(ii)配列番号3のアミノ酸1〜107を含む軽鎖可変領域を含み、必要に応じて、(iii)重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間にリンカー配列、例えば、リンカーペプチドを有する。例えば、ある特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、(i)配列番号11に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域CDR1、配列番号12に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域CDR2および配列番号13に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域CDR3ならびに(ii)配列番号14に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域CDR1、配列番号15に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域CDR2および配列番号16に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域CDR3を含み、必要に応じて、(iii)重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間にリンカー配列、例えば、リンカーペプチドを有する。特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、scFvである。特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、Fabであり、これは必要に応じて架橋されている。特定の限定されない実施形態では、細胞外結合性ドメインは、F(ab)2である。特定の限定されない実施形態では、前述の分子のいずれかは、細胞外抗原結合性ドメインを形成するように異種配列との融合タンパク質中に含まれ得る。

0008

ここで開示される主題と一致して、細胞外抗原結合性ドメインは、膜貫通ドメインと共有結合によって連結している。前記CARの細胞外抗原結合性ドメインは、前記細胞外抗原結合性ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間にリンカーを含み得る。前記細胞外抗原結合性ドメインは、前記細胞外抗原結合性ドメインの5’末端と共有結合によって連結しているリーダーを含み得る。一つの実施形態では、前記リーダーは、CD8ポリペプチドを含み得る。一部の実施形態では、前記CARの前記膜貫通ドメインは、CD8ポリペプチド、CD28ポリペプチド、CD3ζポリペプチド、CD4ポリペプチド、4−1BBポリペプチド、OX40ポリペプチド、ICOSポリペプチド、CTLA−4ポリペプチド、PD−1ポリペプチド、LAG−3ポリペプチド、2B4ポリペプチド、BTLAポリペプチド、合成ペプチド(免疫応答と関連しているタンパク質ベースとしない)またはそれらの組合せを含み得る。一実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8ポリペプチドを含む。一実施形態では、膜貫通ドメインは、CD28ポリペプチドを含む。

0009

ここで開示される主題と一致して、前記細胞内ドメインは、CD3ζポリペプチドを含む。一部の実施形態では、前記細胞内ドメインは、少なくとも1つの共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記少なくとも1つの共刺激シグナル伝達領域は、CD28ポリペプチド、4−1BBポリペプチド、OX40ポリペプチド、ICOSポリペプチド、PD−1ポリペプチド、CTLA−4ポリペプチド、LAG−3ポリペプチド、2B4ポリペプチド、BTLAポリペプチド、合成ペプチド(免疫応答と関連しているタンパク質をベースとしない)またはそれらの組合せを含む。一実施形態では、前記膜貫通ドメインは、CD8ポリペプチドを含み、前記細胞内ドメインは、CD3ζポリペプチドを含む。別の実施形態では、前記膜貫通ドメインは、CD28ポリペプチドを含み、前記細胞内ドメインは、CD3ζポリペプチドと、CD28ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。さらに別の実施形態では、前記膜貫通ドメインは、CD8ポリペプチドを含み、前記細胞内ドメインは、CD3ζポリペプチドと、4−1BBポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達ドメインとを含む。

0010

一実施形態では、前記CARはMzである。Mzは、CD8ポリペプチドを含む膜貫通ドメインと、CD3ζポリペプチドを含む細胞内ドメインとを含む。一実施形態では、前記CARはM28zである。M28zは、CD28ポリペプチドを含む膜貫通ドメインと、および、CD3ζポリペプチドと、CD28ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内ドメインとを含む。一実施形態では、前記CARはMBBzである。MBBzは、CD8ポリペプチドを含む膜貫通ドメインと、およびCD3ζポリペプチドと、4−1BBポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域とを含む細胞内ドメインを含む。

0011

ある特定の実施形態では、前記CARは組換え発現される。前記CARは、ベクターから発現され得る。一実施形態では、前記ベクターは、γ−レトロウイルスクター(γ−retroviral rector)である。

0012

ここで開示される主題はまた、上記のCARを含む、単離された免疫応答性細胞を提供する。ある特定の実施形態では、前記単離された免疫応答性細胞は、少なくとも1種の外因性共刺激リガンドをさらに含む。一部の実施形態では、前記少なくとも1種の共刺激リガンドは、4−1BBL、CD80、CD86、CD70、OX40L、CD48、TNFRSF14およびそれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、前記共刺激リガンドは、4−1BBLである。ある特定の実施形態では、前記単離された免疫応答性細胞は、少なくとも1種の外因性のサイトカインをさらに含む。一部の実施形態では、前記少なくとも1種のサイトカインは、IL−2、IL−3、IL−6、IL−7、IL−11、IL−12、IL−15、IL−17、IL−21およびそれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、前記サイトカインは、IL−12である。一部の実施形態では、前記単離された免疫応答性細胞は、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、制御性T細胞ヒト胚幹細胞およびリンパ球系細胞に分化し得る多能性幹細胞からなる群から選択される。一実施形態では、前記細胞はT細胞である。ある特定の実施形態では、前記免疫応答性細胞は、細胞あたり約1〜約4ベクターコピー数の前記CARを発現する。ある特定の実施形態では、前記単離された免疫応答性細胞は、ヒトメソセリンとは異なる抗原と結合する抗原認識受容体をさらに含む。前記抗原は、腫瘍または病原体抗原である。一部の実施形態では、前記腫瘍抗原は、炭酸脱水酵素IX(CAIX)、癌胎児性抗原CEA)、CD5、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD49f、CD56、CD74、CD123、CD133、CD138、サイトメガロウイルス(CMV)感染細胞の抗原(例えば、細胞表面抗原)、上皮糖タンパク質2(EGP2)、上皮糖タンパク質−40(EGP−40)、上皮細胞接着分子(EpCAM)、受容体チロシンプロテインキナーゼerb−B2、3、4、葉酸結合タンパク質(FBP)、胎児アセチルコリン受容体(AChR)、葉酸受容体−a、ガングリオシドG2(GD2)、ガングリオシドG3(GD3)、ヒト上皮成長因子受容体2(HER−2)、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)、インターロイキン−13受容体サブユニットアルファ−2(IL−13Rα2)、κ−軽鎖、キナーゼ挿入ドメイン受容体(KDR)、ルイスA(CA19.9)、ルイスY(LeY)、L1細胞接着分子(L1CAM)、黒色腫抗原ファミリーA,1(MAGE−AI)、ムチン16(Muc−16)、ムチン1(Muc−1)、NKG2Dリガンド、がん精巣抗原NY−ESO−1、癌胎児性抗原(h5T4)、前立腺幹細胞抗原(PSCA)、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、腫瘍関連糖タンパク質72(TAG−72)、血管内皮成長因子R2(VEGF−R2)、ウィルムス腫瘍タンパク質(WT−1)、1型チロシン−プロテインキナーゼ膜貫通型受容体(ROR1)およびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記免疫応答性細胞は、1種または複数種の接着分子を発現する。前記接着分子は、前記CARのアビディティーを高め得る。一部の実施形態では、前記接着分子は、CD2、VLA−4およびそれらの組合せからなる群から選択される。

0013

さらに、ここで開示される主題は、上記の免疫応答性細胞を使用する種々の方法を提供する。例えば、ここで開示される主題は、被験体における腫瘍量を低減する方法であって、被験体に、有効量の、ここで開示される免疫応答性細胞を投与し、それによって、被験体において腫瘍細胞死を誘導することを含む方法を提供する。一実施形態では、前記方法は、腫瘍細胞の数を低減する。別の実施形態では、前記方法は、腫瘍の大きさを低減する。さらに別の実施形態では、前記方法は、前記被験体において前記腫瘍を根絶する。一部の実施形態では、前記腫瘍は固形腫瘍である。一部の実施形態では、前記固形腫瘍は、中皮腫肺がん膵臓がん卵巣がん乳がん結腸がん、胸膜腫瘍、神経膠芽腫食道がん胃がん(gastric cancer)、滑膜肉腫胸腺癌子宮内膜癌、胃がん(stomach cancer)、胆管癌およびそれらの組合せからなる群から選択される。

0014

ここで開示される主題はまた、新生物を有する被験体の生存を増大または延長する方法を提供し、ここで、前記方法は、前記被験体に、有効量の、ここで開示される免疫応答性細胞を投与し、それによって、前記被験体の生存を増大または延長することを含む。ある特定の実施形態では、前記新生物は、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜がん、神経膠芽腫、食道がん、胃がん(gastric cancer)、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃がん(stomach cancer)、胆管癌およびそれらの組合せからなる群から選択される。本方法は、被験体における腫瘍量を低減または根絶し得る。

0015

さらに、ここで開示される主題はまた、被験体におけるがん細胞または病原体に応じた免疫活性化サイトカイン産生を増大する方法を提供し、ここで、この方法は、前記被験体に、ここで開示された免疫応答性細胞を投与することを含む。ある特定の実施形態では、前記免疫活性化サイトカインは、(GMCSF)、IFN−α、IFN−β、IFN−γ、TNF−α、IL−2、IL−3、IL−6、IL−11、IL−7、IL−12、IL−15、IL−21、インターフェロン制御因子7(IRF7)およびそれらの組合せからなる群から選択される。

0016

ここで開示される主題と一致して、上記の種々の方法は、少なくとも1種の免疫調節因子を投与することをさらに含み得る。ある特定の実施形態では、前記少なくとも1種の免疫調節因子は、免疫賦活因子チェックポイント免疫遮断剤放射線療法因子、化学療法剤およびそれらの組合せからなる群から選択される。一部の実施形態では、前記免疫賦活因子は、IL−12、アゴニスト共刺激モノクローナル抗体およびそれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、前記免疫賦活剤は、IL−12である。一部の実施形態では、前記アゴニスト共刺激モノクローナル抗体は、抗4−1BB抗体、抗OX40抗体、抗ICOS抗体およびそれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、前記アゴニスト共刺激モノクローナル抗体は、抗4−1BB抗体である。一部の実施形態では、前記チェックポイント免疫遮断剤が、抗PD−L1抗体、抗CTLA−4抗体、抗PD−1抗体、抗LAG3抗体、抗B7−H3抗体、抗TIM3抗体およびそれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、チェックポイント免疫遮断剤は、抗PD−L1抗体である。ある特定の実施形態では、被験体はヒトである。ある特定の実施形態では、免疫応答性細胞は、被験体に胸膜投与される。

0017

ここで開示される主題はまた、ヒトメソセリンと結合する免疫応答性細胞を製造するための方法を提供する。ある一つの限定されない例では、この方法は、前記免疫応答性細胞に、キメラ抗原受容体(CAR)コードする核酸配列を導入することを含み、このCARは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、ここで、前記細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトメソセリンと、約1nM〜約25nMの結合アフィニティーで特異的に結合する。特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、scFvである。特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、Fabであり、これは必要に応じて架橋されている。特定の限定されない実施形態では、細胞外結合性ドメインは、F(ab)2である。特定の限定されない実施形態では、前述の分子のいずれかが、細胞外抗原結合性ドメインを形成するように、異種配列との融合タンパク質中に含まれ得る。

0018

ここで開示される主題は、ここで開示されるCARをコードする核酸、および前記核酸を含むベクターをさらに提供する。一実施形態では、前記ベクターはγ−レトロウイルスベクターである。

0019

ここで開示される主題は、有効量の、個々で開示される免疫応答性細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物をさらに提供する。新生物を治療するための医薬組成物であって、有効量の、ここで開示される免疫応答性細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物もまた提供される。一部の実施形態では、前記新生物は、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜がん、神経膠芽腫、食道がん、胃がん(gastric cancer)、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃がん(stomach cancer)、胆管癌およびそれらの組合せからなる群から選択される。

0020

ここで開示される主題は、新生物、病原体感染、自己免疫障害炎症性疾患同種異系移植または移植片拒絶を治療または予防するためのキットであって、ここで開示される免疫応答性細胞を含むキットをさらに提供する。新生物、病原体感染、自己免疫障害、炎症性疾患、同種異系移植または移植片拒絶を治療または予防するためのキットであって、ここで開示されるCARを含む核酸を含むキットもまた提供される。一部の実施形態では、前記キットは、新生物、病原体感染、自己免疫障害、炎症性疾患、同種異系移植または移植片拒絶を有する被験体を治療するために前記免疫応答性細胞を使用するための指示書をさらに含む。

0021

ここで開示される主題は、被験体において炎症性疾患を予防または治療する方法をさらに提供する。ある一つの限定されない例では、この方法は、前記被験体に、ここで開示される免疫応答性細胞を投与することを含む。一実施形態では、前記免疫応答性細胞は、免疫阻害細胞である。一つの限定されない実施形態では、前記免疫阻害細胞は、制御性T細胞である。一実施形態では、前記炎症性疾患は膵炎である。一実施形態では、前記被験体はヒトである。一実施形態では、前記被験体は、臓器移植レシピエントである。一つの特定の実施形態では、前記被験体は、膵臓移植のレシピエントである。

0022

ここで開示される主題は、臓器移植のレシピエントである被験体において移植片拒絶を予防する方法をさらに提供する。ある一つの限定されない例では、この方法は、前記被験体に、ここで開示される免疫応答性細胞を投与することを含む。一実施形態では、前記免疫応答性細胞は、免疫阻害細胞である。ある一つの限定されない例では、前記免疫阻害細胞は、制御性T細胞である。一実施形態では、前記被験体はヒトである。一実施形態では、前記被験体は、膵臓移植のレシピエントである。

0023

以下の詳細な説明は、例として示しているが、記載された特定の実施形態に対して本発明を限定する意図ではなく、添付の図面と組み合わせて理解され得る。

図面の簡単な説明

0024

図1は、「第2世代」のCARを指す。
図2A〜図2Fは、メソセリン特異的構築物のin vitroのエフェクター機能を示す。(A)メソセリン特異的構築物の生成。抗メソセリン構築物は、CD3ζエンドドメインを単独で(Mz)またはCD28共刺激ドメインと組み合わせて(M28z)のいずれかで含有する。CD28共刺激によるPSMA指向性のCAR(P28z)が、実験中に陰性対照として含まれた。(B)CD4+およびCD8+T細胞サブセットの両方をCARで効率的に形質導入する。形質導入のパーセンテージは、フローサイトメトリーで測定したレポーター遺伝子発現に相当する。M28zおよびMz CARは、緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子発現を介して検出された。P28z CARを発現するT細胞を、低アフィニティー神経成長因子LNGFR)レポーター遺伝子発現によって検出した。形質導入されていない細胞を用いて、live/dead染色によって生きていない細胞を除外した後に陽性ゲートをセットした。CD4+およびCD8+のパーセンテージは、CAR+細胞についてゲートした後に報告される。(C)メソセリン特異的T細胞は、抗原特異的溶解を実証する。T細胞を、メソセリン過剰発現するように形質導入された51Cr−ロードのMSTO−211H標的細胞(MSTO MSLN+)とともに、示したエフェクター/標的比でインキュベートして、標的細胞溶解(クロム放出)を測定した。エラーバーは、3回の反復の平均のs.e.m.である。(D)CD28共刺激は、抗原特異的サイトカイン分泌を増強する。対照の形質導入のT細胞またはMzもしくはM28zで形質導入されたT細胞を、形質導入されていないMSTO−211H細胞(MSTO Empty)またはMSTO MSLN+細胞のいずれかで刺激し、サイトカインを、Luminexビーズアレイを用いて測定した。(E)CD28共刺激は、反復性抗原刺激の際に堅調なT細胞蓄積を促進する。T細胞は、MSTO EmptyまたはMSTO MSLN+腫瘍細胞とともに共存培養した(矢印は、新鮮照射された腫瘍細胞での再刺激を示す)。左側、外因性のIL−2の添加なしの抗原刺激。右側、外因性のIL−2添加(20IU/mL)。CAR+T細胞絶対数は、フローサイトメトリーで決定したGFP+のパーセンテージで補正した手技による血球計算器カウントを用いて示した時点で算出した。エラーバーは、3回の反復の平均のs.e.m.に相当する。(F)メソセリン特異的CARで形質導入されたT細胞は、連続抗原刺激の際に62Lエフェクター表現型を獲得する。各抗原刺激後のCAR+T細胞の連続多色フローサイトメトリー解析
図2A〜図2Fは、メソセリン特異的構築物のin vitroのエフェクター機能を示す。(A)メソセリン特異的構築物の生成。抗メソセリン構築物は、CD3ζエンドドメインを単独で(Mz)またはCD28共刺激ドメインと組み合わせて(M28z)のいずれかで含有する。CD28共刺激によるPSMA指向性のCAR(P28z)が、実験中に陰性対照として含まれた。(B)CD4+およびCD8+T細胞サブセットの両方をCARで効率的に形質導入する。形質導入のパーセンテージは、フローサイトメトリーで測定したレポーター遺伝子発現に相当する。M28zおよびMz CARは、緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子発現を介して検出された。P28z CARを発現するT細胞を、低アフィニティー神経成長因子(LNGFR)レポーター遺伝子発現によって検出した。形質導入されていない細胞を用いて、live/dead染色によって生きていない細胞を除外した後に陽性ゲートをセットした。CD4+およびCD8+のパーセンテージは、CAR+細胞についてゲートした後に報告される。(C)メソセリン特異的T細胞は、抗原特異的溶解を実証する。T細胞を、メソセリン過剰発現するように形質導入された51Cr−ロードのMSTO−211H標的細胞(MSTO MSLN+)とともに、示したエフェクター/標的比でインキュベートして、標的細胞溶解(クロム放出)を測定した。エラーバーは、3回の反復の平均のs.e.m.である。(D)CD28共刺激は、抗原特異的サイトカイン分泌を増強する。対照の形質導入のT細胞またはMzもしくはM28zで形質導入されたT細胞を、形質導入されていないMSTO−211H細胞(MSTO Empty)またはMSTO MSLN+細胞のいずれかで刺激し、サイトカインを、Luminexビーズアレイを用いて測定した。(E)CD28共刺激は、反復性の抗原刺激の際に堅調なT細胞蓄積を促進する。T細胞は、MSTO EmptyまたはMSTO MSLN+腫瘍細胞とともに共存培養した(矢印は、新鮮に照射された腫瘍細胞での再刺激を示す)。左側、外因性のIL−2の添加なしの抗原刺激。右側、外因性のIL−2添加(20IU/mL)。CAR+T細胞絶対数は、フローサイトメトリーで決定したGFP+のパーセンテージで補正した手技による血球計算器カウントを用いて示した時点で算出した。エラーバーは、3回の反復の平均のs.e.m.に相当する。(F)メソセリン特異的CARで形質導入されたT細胞は、連続抗原刺激の際に62Lエフェクター表現型を獲得する。各抗原刺激後のCAR+T細胞の連続多色フローサイトメトリー解析。
図2A〜図2Fは、メソセリン特異的構築物のin vitroのエフェクター機能を示す。(A)メソセリン特異的構築物の生成。抗メソセリン構築物は、CD3ζエンドドメインを単独で(Mz)またはCD28共刺激ドメインと組み合わせて(M28z)のいずれかで含有する。CD28共刺激によるPSMA指向性のCAR(P28z)が、実験中に陰性対照として含まれた。(B)CD4+およびCD8+T細胞サブセットの両方をCARで効率的に形質導入する。形質導入のパーセンテージは、フローサイトメトリーで測定したレポーター遺伝子発現に相当する。M28zおよびMz CARは、緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子発現を介して検出された。P28z CARを発現するT細胞を、低アフィニティー神経成長因子(LNGFR)レポーター遺伝子発現によって検出した。形質導入されていない細胞を用いて、live/dead染色によって生きていない細胞を除外した後に陽性ゲートをセットした。CD4+およびCD8+のパーセンテージは、CAR+細胞についてゲートした後に報告される。(C)メソセリン特異的T細胞は、抗原特異的溶解を実証する。T細胞を、メソセリン過剰発現するように形質導入された51Cr−ロードのMSTO−211H標的細胞(MSTO MSLN+)とともに、示したエフェクター/標的比でインキュベートして、標的細胞溶解(クロム放出)を測定した。エラーバーは、3回の反復の平均のs.e.m.である。(D)CD28共刺激は、抗原特異的サイトカイン分泌を増強する。対照の形質導入のT細胞またはMzもしくはM28zで形質導入されたT細胞を、形質導入されていないMSTO−211H細胞(MSTO Empty)またはMSTO MSLN+細胞のいずれかで刺激し、サイトカインを、Luminexビーズアレイを用いて測定した。(E)CD28共刺激は、反復性の抗原刺激の際に堅調なT細胞蓄積を促進する。T細胞は、MSTO EmptyまたはMSTO MSLN+腫瘍細胞とともに共存培養した(矢印は、新鮮に照射された腫瘍細胞での再刺激を示す)。左側、外因性のIL−2の添加なしの抗原刺激。右側、外因性のIL−2添加(20IU/mL)。CAR+T細胞絶対数は、フローサイトメトリーで決定したGFP+のパーセンテージで補正した手技による血球計算器カウントを用いて示した時点で算出した。エラーバーは、3回の反復の平均のs.e.m.に相当する。(F)メソセリン特異的CARで形質導入されたT細胞は、連続抗原刺激の際に62Lエフェクター表現型を獲得する。各抗原刺激後のCAR+T細胞の連続多色フローサイトメトリー解析。
図2A〜図2Fは、メソセリン特異的構築物のin vitroのエフェクター機能を示す。(A)メソセリン特異的構築物の生成。抗メソセリン構築物は、CD3ζエンドドメインを単独で(Mz)またはCD28共刺激ドメインと組み合わせて(M28z)のいずれかで含有する。CD28共刺激によるPSMA指向性のCAR(P28z)が、実験中に陰性対照として含まれた。(B)CD4+およびCD8+T細胞サブセットの両方をCARで効率的に形質導入する。形質導入のパーセンテージは、フローサイトメトリーで測定したレポーター遺伝子発現に相当する。M28zおよびMz CARは、緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子発現を介して検出された。P28z CARを発現するT細胞を、低アフィニティー神経成長因子(LNGFR)レポーター遺伝子発現によって検出した。形質導入されていない細胞を用いて、live/dead染色によって生きていない細胞を除外した後に陽性ゲートをセットした。CD4+およびCD8+のパーセンテージは、CAR+細胞についてゲートした後に報告される。(C)メソセリン特異的T細胞は、抗原特異的溶解を実証する。T細胞を、メソセリン過剰発現するように形質導入された51Cr−ロードのMSTO−211H標的細胞(MSTO MSLN+)とともに、示したエフェクター/標的比でインキュベートして、標的細胞溶解(クロム放出)を測定した。エラーバーは、3回の反復の平均のs.e.m.である。(D)CD28共刺激は、抗原特異的サイトカイン分泌を増強する。対照の形質導入のT細胞またはMzもしくはM28zで形質導入されたT細胞を、形質導入されていないMSTO−211H細胞(MSTO Empty)またはMSTO MSLN+細胞のいずれかで刺激し、サイトカインを、Luminexビーズアレイを用いて測定した。(E)CD28共刺激は、反復性の抗原刺激の際に堅調なT細胞蓄積を促進する。T細胞は、MSTO EmptyまたはMSTO MSLN+腫瘍細胞とともに共存培養した(矢印は、新鮮に照射された腫瘍細胞での再刺激を示す)。左側、外因性のIL−2の添加なしの抗原刺激。右側、外因性のIL−2添加(20IU/mL)。CAR+T細胞絶対数は、フローサイトメトリーで決定したGFP+のパーセンテージで補正した手技による血球計算器カウントを用いて示した時点で算出した。エラーバーは、3回の反復の平均のs.e.m.に相当する。(F)メソセリン特異的CARで形質導入されたT細胞は、連続抗原刺激の際に62Lエフェクター表現型を獲得する。各抗原刺激後のCAR+T細胞の連続多色フローサイトメトリー解析。
図3A〜図3Eは、M28z T細胞の胸膜内投与後の樹立されたMSLN+胸膜腫瘍の根絶を示す。(A)同所性悪性の胸膜の中皮腫のマウスモデルは、ヒト疾患再現する。腫瘍接種5週後に1×105個のMSTO MSLN+腫瘍細胞を注射されたマウスにおける顕微鏡病変核磁気画像および写真(それぞれ、上の左側および右側の画像)。全てのマウスが、胸膜および横隔膜の表面に沿って増殖し、かつ縦隔の構造を包み込む腫瘍を有する。底部、胸壁切片の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色であって、腫瘍による早期の胸壁浸潤(下の左側)、および持続したメソセリン発現(下の右側)が実証される。(B)胸膜腫瘍を保有するNOD/SCID/γcヌルマウス(NSG)マウスの連続的なin vivoの腫瘍生物発光イメージング(BLI)。MSTO MSLN+腫瘍細胞は、緑色蛍光タンパク質/ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質(GFP/Luc)を共発現して、イメージングを可能にする。胸膜内腫瘍の樹立後、マウスを、静脈内の3×106個のM28zTリンパ球、または胸膜内の3×105個のM28z Tリンパ球(10分の1の用量)のいずれかの養子免疫移入処置して、ヒトPSMA標的化キメラ抗原受容体P28zを保有する3×105個のT細胞を、陰性対照として胸膜に注射した。各々の群に由来する4つの代表的なマウスを示す。マウスを腹側および背側の両方でイメージングした。BLIシグナル強度は、光子/秒で示す。(C)100日間の期間にまたがって毎週動物1匹あたりで定量したBLI腫瘍シグナル。各々のラインは、1匹の動物に相当し、各々のドットは、所定の時点での動物1匹あたりの腹側および背側の獲得の平均光子カウントに相当する。(D)静脈内に投与されたM28z T細胞(n=4、青い破線)を比較するカプラン・マイヤー生存解析は、胸膜内に投与されたM28z+ T細胞と比較して生存が低下していた(n=7,青線)(92日対nd,p=0.02)。結果は、反復実験で確認した。(E)腫瘍接種後の動物の処置。
図3A〜図3Eは、M28z T細胞の胸膜内投与後の樹立されたMSLN+胸膜腫瘍の根絶を示す。(A)同所性の悪性の胸膜の中皮腫のマウスモデルは、ヒト疾患を再現する。腫瘍接種5週後に1×105個のMSTO MSLN+腫瘍細胞を注射されたマウスにおける顕微鏡的病変の核磁気画像および写真(それぞれ、上の左側および右側の画像)。全てのマウスが、胸膜および横隔膜の表面に沿って増殖し、かつ縦隔の構造を包み込む腫瘍を有する。底部、胸壁切片の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色であって、腫瘍による早期の胸壁浸潤(下の左側)、および持続したメソセリン発現(下の右側)が実証される。(B)胸膜腫瘍を保有するNOD/SCID/γcヌルマウス(NSG)マウスの連続的なin vivoの腫瘍生物発光イメージング(BLI)。MSTO MSLN+腫瘍細胞は、緑色蛍光タンパク質/ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質(GFP/Luc)を共発現して、イメージングを可能にする。胸膜内腫瘍の樹立後、マウスを、静脈内の3×106個のM28z Tリンパ球、または胸膜内の3×105個のM28z Tリンパ球(10分の1の用量)のいずれかの養子免疫移入で処置して、ヒトPSMA標的化キメラ抗原受容体P28zを保有する3×105個のT細胞を、陰性対照として胸膜に注射した。各々の群に由来する4つの代表的なマウスを示す。マウスを腹側および背側の両方でイメージングした。BLIシグナル強度は、光子/秒で示す。(C)100日間の期間にまたがって毎週、動物1匹あたりで定量したBLI腫瘍シグナル。各々のラインは、1匹の動物に相当し、各々のドットは、所定の時点での動物1匹あたりの腹側および背側の獲得の平均光子カウントに相当する。(D)静脈内に投与されたM28z T細胞(n=4、青い破線)を比較するカプラン・マイヤー生存解析は、胸膜内に投与されたM28z+ T細胞と比較して生存が低下していた(n=7,青線)(92日対nd,p=0.02)。結果は、反復実験で確認した。(E)腫瘍接種後の動物の処置。
図3A〜図3Eは、M28z T細胞の胸膜内投与後の樹立されたMSLN+胸膜腫瘍の根絶を示す。(A)同所性の悪性の胸膜の中皮腫のマウスモデルは、ヒト疾患を再現する。腫瘍接種5週後に1×105個のMSTO MSLN+腫瘍細胞を注射されたマウスにおける顕微鏡的病変の核磁気画像および写真(それぞれ、上の左側および右側の画像)。全てのマウスが、胸膜および横隔膜の表面に沿って増殖し、かつ縦隔の構造を包み込む腫瘍を有する。底部、胸壁切片の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色であって、腫瘍による早期の胸壁浸潤(下の左側)、および持続したメソセリン発現(下の右側)が実証される。(B)胸膜腫瘍を保有するNOD/SCID/γcヌルマウス(NSG)マウスの連続的なin vivoの腫瘍生物発光イメージング(BLI)。MSTO MSLN+腫瘍細胞は、緑色蛍光タンパク質/ホタルルシフェラーゼ融合タンパク質(GFP/Luc)を共発現して、イメージングを可能にする。胸膜内腫瘍の樹立後、マウスを、静脈内の3×106個のM28z Tリンパ球、または胸膜内の3×105個のM28z Tリンパ球(10分の1の用量)のいずれかの養子免疫移入で処置して、ヒトPSMA標的化キメラ抗原受容体P28zを保有する3×105個のT細胞を、陰性対照として胸膜に注射した。各々の群に由来する4つの代表的なマウスを示す。マウスを腹側および背側の両方でイメージングした。BLIシグナル強度は、光子/秒で示す。(C)100日間の期間にまたがって毎週、動物1匹あたりで定量したBLI腫瘍シグナル。各々のラインは、1匹の動物に相当し、各々のドットは、所定の時点での動物1匹あたりの腹側および背側の獲得の平均光子カウントに相当する。(D)静脈内に投与されたM28z T細胞(n=4、青い破線)を比較するカプラン・マイヤー生存解析は、胸膜内に投与されたM28z+ T細胞と比較して生存が低下していた(n=7,青線)(92日対nd,p=0.02)。結果は、反復実験で確認した。(E)腫瘍接種後の動物の処置。
図4A〜図4Fは、堅調な、腫瘍抗原依存性の、胸膜に投与されたM28z+T細胞のin vivoの蓄積を示す。(A)強化されたホタルルシフェラーゼ(effLuc)(上部に示されるベクター)およびM28z CARを用いて共形質導入された1×106個のT細胞の胸膜のまたは静脈内投与後、0〜10日目にMSTO MSLN+腫瘍保有NSGマウスにおける養子免疫移入されたT細胞の比較のin vivoにおけるT細胞BLIの比較。T細胞は、1×106個のMSTO MSLN+腫瘍細胞の胸膜内注射1週後に投与した。1群(n=3〜4)あたり1匹の代表的なマウスを示す。(B)10日間の期間の間のT細胞移入後の連続的BLIからのEffLuc−ルシフェラーゼシグナル強度。各々のラインは、3〜4匹のマウスの平均シグナルに相当し、各々のドットは、所定の時点での1群あたり動物1匹あたりの腹側および背側の獲得の平均光子カウントを示している。特に、胸膜に投与されたeffLuc+M28z T細胞は、静脈内に投与されたeffLuc+M28z T細胞(これは、胸膜腔の腫瘍内で最初の肺内滞留および遅延したシグナル発光を示す)と比較して増大および持続した蛍光を示す。(C)胸膜または静脈内のいずれかのM28z T細胞投与の3日後、代表的な動物から調製した腫瘍単一細胞懸濁物の多色フローサイトメトリー解析。細胞を、ヒトCD3の抗体で染色し、およびCAR陽性は、GFPレポーター発現によって決定し、さらなる分析は、CD4/CD8/CD62L/CD45RAを含んだ。(D)M28z T細胞の免疫組織化学。(E)腫瘍浸潤性M28z T細胞絶対数(countbrightビーズを用いる総細胞カウント)。示される棒グラフは、1群あたり3匹のマウスの平均±s.e.m.に相当し、胸膜投与7日後の堅調なM28z T細胞の蓄積を示す。同じ用量の静脈内T細胞で処置されたマウスは、胸膜腫瘍内の蓄積が少ないことが実証される。(F)胸膜投与3日および7日後、脾臓中の腫瘍浸潤性M28z T細胞絶対数。
図4A〜図4Fは、堅調な、腫瘍抗原依存性の、胸膜に投与されたM28z+T細胞のin vivoの蓄積を示す。(A)強化されたホタルルシフェラーゼ(effLuc)(上部に示されるベクター)およびM28z CARを用いて共形質導入された1×106個のT細胞の胸膜のまたは静脈内投与後、0〜10日目にMSTO MSLN+腫瘍保有NSGマウスにおける養子免疫移入されたT細胞の比較のin vivoにおけるT細胞BLIの比較。T細胞は、1×106個のMSTO MSLN+腫瘍細胞の胸膜内注射1週後に投与した。1群(n=3〜4)あたり1匹の代表的なマウスを示す。(B)10日間の期間の間のT細胞移入後の連続的BLIからのEffLuc−ルシフェラーゼシグナル強度。各々のラインは、3〜4匹のマウスの平均シグナルに相当し、各々のドットは、所定の時点での1群あたり動物1匹あたりの腹側および背側の獲得の平均光子カウントを示している。特に、胸膜に投与されたeffLuc+M28z T細胞は、静脈内に投与されたeffLuc+M28z T細胞(これは、胸膜腔の腫瘍内で最初の肺内滞留および遅延したシグナル発光を示す)と比較して増大および持続した蛍光を示す。(C)胸膜または静脈内のいずれかのM28z T細胞投与の3日後、代表的な動物から調製した腫瘍単一細胞懸濁物の多色フローサイトメトリー解析。細胞を、ヒトCD3の抗体で染色し、およびCAR陽性は、GFPレポーター発現によって決定し、さらなる分析は、CD4/CD8/CD62L/CD45RAを含んだ。(D)M28z T細胞の免疫組織化学。(E)腫瘍浸潤性M28z T細胞絶対数(countbrightビーズを用いる総細胞カウント)。示される棒グラフは、1群あたり3匹のマウスの平均±s.e.m.に相当し、胸膜投与7日後の堅調なM28z T細胞の蓄積を示す。同じ用量の静脈内T細胞で処置されたマウスは、胸膜腫瘍内の蓄積が少ないことが実証される。(F)胸膜投与3日および7日後、脾臓中の腫瘍浸潤性M28z T細胞絶対数。
図4A〜図4Fは、堅調な、腫瘍抗原依存性の、胸膜に投与されたM28z+T細胞のin vivoの蓄積を示す。(A)強化されたホタルルシフェラーゼ(effLuc)(上部に示されるベクター)およびM28z CARを用いて共形質導入された1×106個のT細胞の胸膜のまたは静脈内投与後、0〜10日目にMSTO MSLN+腫瘍保有NSGマウスにおける養子免疫移入されたT細胞の比較のin vivoにおけるT細胞BLIの比較。T細胞は、1×106個のMSTO MSLN+腫瘍細胞の胸膜内注射1週後に投与した。1群(n=3〜4)あたり1匹の代表的なマウスを示す。(B)10日間の期間の間のT細胞移入後の連続的BLIからのEffLuc−ルシフェラーゼシグナル強度。各々のラインは、3〜4匹のマウスの平均シグナルに相当し、各々のドットは、所定の時点での1群あたり動物1匹あたりの腹側および背側の獲得の平均光子カウントを示している。特に、胸膜に投与されたeffLuc+M28z T細胞は、静脈内に投与されたeffLuc+M28z T細胞(これは、胸膜腔の腫瘍内で最初の肺内滞留および遅延したシグナル発光を示す)と比較して増大および持続した蛍光を示す。(C)胸膜または静脈内のいずれかのM28z T細胞投与の3日後、代表的な動物から調製した腫瘍単一細胞懸濁物の多色フローサイトメトリー解析。細胞を、ヒトCD3の抗体で染色し、およびCAR陽性は、GFPレポーター発現によって決定し、さらなる分析は、CD4/CD8/CD62L/CD45RAを含んだ。(D)M28z T細胞の免疫組織化学。(E)腫瘍浸潤性M28z T細胞絶対数(countbrightビーズを用いる総細胞カウント)。示される棒グラフは、1群あたり3匹のマウスの平均±s.e.m.に相当し、胸膜投与7日後の堅調なM28z T細胞の蓄積を示す。同じ用量の静脈内T細胞で処置されたマウスは、胸膜腫瘍内の蓄積が少ないことが実証される。(F)胸膜投与3日および7日後、脾臓中の腫瘍浸潤性M28z T細胞絶対数。
図5A図5Cは、CD28共刺激が、CAR+T細胞をin vivoの永続性および有効性で増強することを示す。(A)CD28共刺激は、中央生存によって測定されるCAR+T細胞有効性を増強し、かつ単回T細胞投与後の腫瘍根絶を容易にする。1×105個のCAR+Mz、M28z、またはP28z(陰性対照)T細胞を、樹立された胸膜のMSTO MSLN+GFP/Luc+腫瘍を保有するマウスに対して胸膜に投与した。腫瘍負荷は、BLIで毎週測定した。左側、カプラン・マイヤー生存曲線。MzおよびM28z群の中央生存を比較する統計学有意差(1群あたり少なくとも9匹のマウス)を、ログランク検定を用いて決定した。右側、腫瘍負荷であって、1秒あたりの光子という単位を用いて各々の個々のマウスについてBLIで定量。(B)CD28共刺激は、CAR+T細胞持続性を増強する。1mLの末梢血あたりのCAR+T細胞絶対数は、3×106個のCAR+T細胞の胸膜投与40日および50日後に示される。示される棒グラフは、3匹のマウスの平均±s.e.m.に相当する。t検定を行い、かつ統計学的有意差は、多重補正のためのボンフェローニ補正を用いて決定した。*p<0.05。(C)持続するCAR+T細胞は主にCD4+である。左側、MzまたはM28z CAR T細胞のいずれかで処置したマウスの末梢血の代表的な多色フローサイトメトリー解析。ゲーティングストラテジーは、リンパ球ゲートおよびCD3+CD45+T細胞ゲートを、死んだ細胞の除去後に示す。各々のマウスについて、CD4+およびCD8+表現型解析は、生きている細胞、CD3+CD45+T細胞、およびGFP+(CAR+)T細胞についてゲーティング後に行った。右側、T細胞投与後の連続する時点で引いた末梢血の連続フローサイトメトリー解析を用いて決定したCD4:CD8比を示す棒グラフ。注入前のCD4:CD8比は、全てのin vivoの実験において約0.5であった。示される結果は、ある範囲のT細胞用量(3×106、1×106、および3×105個のCAR+)にまたがって同様である。平均のCD4+対CD8+比を比較するt検定(各時点でn=3)によって、Mz処置マウスにおいてT細胞注入の30、40および50日後の、ならびにM28z処置マウスについては30および40日での統計学的有意差(多重比較のためのボンフェローニ補正後)が実証された。
図5A図5Cは、CD28共刺激が、CAR+T細胞をin vivoの永続性および有効性で増強することを示す。(A)CD28共刺激は、中央生存によって測定されるCAR+T細胞有効性を増強し、かつ単回T細胞投与後の腫瘍根絶を容易にする。1×105個のCAR+Mz、M28z、またはP28z(陰性対照)T細胞を、樹立された胸膜のMSTO MSLN+GFP/Luc+腫瘍を保有するマウスに対して胸膜に投与した。腫瘍負荷は、BLIで毎週測定した。左側、カプラン・マイヤー生存曲線。MzおよびM28z群の中央生存を比較する統計学的有意差(1群あたり少なくとも9匹のマウス)を、ログランク検定を用いて決定した。右側、腫瘍負荷であって、1秒あたりの光子という単位を用いて各々の個々のマウスについてBLIで定量。(B)CD28共刺激は、CAR+T細胞持続性を増強する。1mLの末梢血あたりのCAR+T細胞絶対数は、3×106個のCAR+T細胞の胸膜投与40日および50日後に示される。示される棒グラフは、3匹のマウスの平均±s.e.m.に相当する。t検定を行い、かつ統計学的有意差は、多重補正のためのボンフェローニ補正を用いて決定した。*p<0.05。(C)持続するCAR+T細胞は主にCD4+である。左側、MzまたはM28z CAR T細胞のいずれかで処置したマウスの末梢血の代表的な多色フローサイトメトリー解析。ゲーティングストラテジーは、リンパ球ゲートおよびCD3+CD45+T細胞ゲートを、死んだ細胞の除去後に示す。各々のマウスについて、CD4+およびCD8+表現型解析は、生きている細胞、CD3+CD45+T細胞、およびGFP+(CAR+)T細胞についてゲーティング後に行った。右側、T細胞投与後の連続する時点で引いた末梢血の連続フローサイトメトリー解析を用いて決定したCD4:CD8比を示す棒グラフ。注入前のCD4:CD8比は、全てのin vivoの実験において約0.5であった。示される結果は、ある範囲のT細胞用量(3×106、1×106、および3×105個のCAR+)にまたがって同様である。平均のCD4+対CD8+比を比較するt検定(各時点でn=3)によって、Mz処置マウスにおいてT細胞注入の30、40および50日後の、ならびにM28z処置マウスについては30および40日での統計学的有意差(多重比較のためのボンフェローニ補正後)が実証された。
図5A図5Cは、CD28共刺激が、CAR+T細胞をin vivoの永続性および有効性で増強することを示す。(A)CD28共刺激は、中央生存によって測定されるCAR+T細胞有効性を増強し、かつ単回T細胞投与後の腫瘍根絶を容易にする。1×105個のCAR+Mz、M28z、またはP28z(陰性対照)T細胞を、樹立された胸膜のMSTO MSLN+GFP/Luc+腫瘍を保有するマウスに対して胸膜に投与した。腫瘍負荷は、BLIで毎週測定した。左側、カプラン・マイヤー生存曲線。MzおよびM28z群の中央生存を比較する統計学的有意差(1群あたり少なくとも9匹のマウス)を、ログランク検定を用いて決定した。右側、腫瘍負荷であって、1秒あたりの光子という単位を用いて各々の個々のマウスについてBLIで定量。(B)CD28共刺激は、CAR+T細胞持続性を増強する。1mLの末梢血あたりのCAR+T細胞絶対数は、3×106個のCAR+T細胞の胸膜投与40日および50日後に示される。示される棒グラフは、3匹のマウスの平均±s.e.m.に相当する。t検定を行い、かつ統計学的有意差は、多重補正のためのボンフェローニ補正を用いて決定した。*p<0.05。(C)持続するCAR+T細胞は主にCD4+である。左側、MzまたはM28z CAR T細胞のいずれかで処置したマウスの末梢血の代表的な多色フローサイトメトリー解析。ゲーティングストラテジーは、リンパ球ゲートおよびCD3+CD45+T細胞ゲートを、死んだ細胞の除去後に示す。各々のマウスについて、CD4+およびCD8+表現型解析は、生きている細胞、CD3+CD45+T細胞、およびGFP+(CAR+)T細胞についてゲーティング後に行った。右側、T細胞投与後の連続する時点で引いた末梢血の連続フローサイトメトリー解析を用いて決定したCD4:CD8比を示す棒グラフ。注入前のCD4:CD8比は、全てのin vivoの実験において約0.5であった。示される結果は、ある範囲のT細胞用量(3×106、1×106、および3×105個のCAR+)にまたがって同様である。平均のCD4+対CD8+比を比較するt検定(各時点でn=3)によって、Mz処置マウスにおいてT細胞注入の30、40および50日後の、ならびにM28z処置マウスについては30および40日での統計学的有意差(多重比較のためのボンフェローニ補正後)が実証された。
図6A〜図6Eは、CD4+CAR+T細胞が、CD28共刺激を用いて、遅れたが効率的な細胞傷害性を実証することを示す。(A)陰性選択ビーズソーティングによって、CD4+およびCD8+T細胞集団を分析する実験について98%を超える純度が達成された。(B)CD4+ M28z T細胞は、CD8+ M28z T細胞と比較して、遅れたが同様の抗腫瘍細胞傷害性を示す。メソセリン特異的または対照の形質導入されたCAR+T細胞を、示したエフェクター/標的比で、メソセリンを過剰発現するように形質導入された51CrロードのMSTO211H標的細胞(MSTO MSLN+)とともに、インキュベートして、標的細胞溶解(クロム放出)を測定した。エラーバーは、3回の反復の平均のs.e.m.である。*p<0.05は、CD8 M28zとCD4 M28z CAR+T細胞を比較する。(C)CD28共刺激は、最適のCD4+媒介性の細胞傷害性に必須である。CD4+およびCD8+のT細胞サブセットのビーズ精製後、メソセリン特異的または対照の形質導入されたCAR+T細胞を、示したエフェクター/標的比で、メソセリンを過剰発現するように形質導入された51CrロードされたMSTO211H標的細胞(MSTO MSLN+)とともにインキュベートして、標的細胞溶解(クロム放出)を測定した。*p<0.05は、CD4 M28zとCD4 Mz CAR+T細胞とを比較している。(D)サイトカインリッチ上清は、腫瘍細胞溶解を直接生じない。CD4+ M28zまたはCD4+ P28z(陰性対照として)とMSTO MSLN+またはMSTO empty標的細胞との18時間の共インキュベーション後に得られた上清を、新鮮にプレートした51Cr標識の標的とともに混合して、標的細胞溶解を、示した時点で測定した。CD4+M28z CAR T細胞は、抗原特異的溶解を実証した(陽性対照)。(E)CAR+T細胞分泌サイトカインは、CAR+媒介性の細胞傷害性を強化する。CD4+M28z CAR+T細胞のメソセリン特異的刺激後に得られた上清は、CD8M28zおよびCD4M28zの両方とMSTO MSLN+標的細胞との18時間共存培養において細胞傷害性を増強する。エラーバーは、3回の反復の平均のs.e.m.に相当する。*p<0.05は、CAR+T細胞と添加された上清の有無とを比較している。
図6A〜図6Eは、CD4+CAR+T細胞が、CD28共刺激を用いて、遅れたが効率的な細胞傷害性を実証することを示す。(A)陰性選択ビーズソーティングによって、CD4+およびCD8+T細胞集団を分析する実験について98%を超える純度が達成された。(B)CD4+ M28z T細胞は、CD8+ M28z T細胞と比較して、遅れたが同様の抗腫瘍細胞傷害性を示す。メソセリン特異的または対照の形質導入されたCAR+T細胞を、示したエフェクター/標的比で、メソセリンを過剰発現するように形質導入された51CrロードのMSTO211H標的細胞(MSTO MSLN+)とともに、インキュベートして、標的細胞溶解(クロム放出)を測定した。エラーバーは、3回の反復の平均のs.e.m.である。*p<0.05は、CD8 M28zとCD4 M28z CAR+T細胞を比較する。(C)CD28共刺激は、最適のCD4+媒介性の細胞傷害性に必須である。CD4+およびCD8+のT細胞サブセットのビーズ精製後、メソセリン特異的または対照の形質導入されたCAR+T細胞を、示したエフェクター/標的比で、メソセリンを過剰発現するように形質導入された51CrロードされたMSTO211H標的細胞(MSTO MSLN+)とともにインキュベートして、標的細胞溶解(クロム放出)を測定した。*p<0.05は、CD4 M28zとCD4 Mz CAR+T細胞とを比較している。(D)サイトカインリッチな上清は、腫瘍細胞溶解を直接生じない。CD4+ M28zまたはCD4+ P28z(陰性対照として)とMSTO MSLN+またはMSTO empty標的細胞との18時間の共インキュベーション後に得られた上清を、新鮮にプレートした51Cr標識の標的とともに混合して、標的細胞溶解を、示した時点で測定した。CD4+M28z CAR T細胞は、抗原特異的溶解を実証した(陽性対照)。(E)CAR+T細胞分泌サイトカインは、CAR+媒介性の細胞傷害性を強化する。CD4+M28z CAR+T細胞のメソセリン特異的刺激後に得られた上清は、CD8M28zおよびCD4M28zの両方とMSTO MSLN+標的細胞との18時間共存培養において細胞傷害性を増強する。エラーバーは、3回の反復の平均のs.e.m.に相当する。*p<0.05は、CAR+T細胞と添加された上清の有無とを比較している。
図6A〜図6Eは、CD4+CAR+T細胞が、CD28共刺激を用いて、遅れたが効率的な細胞傷害性を実証することを示す。(A)陰性選択ビーズソーティングによって、CD4+およびCD8+T細胞集団を分析する実験について98%を超える純度が達成された。(B)CD4+ M28z T細胞は、CD8+ M28z T細胞と比較して、遅れたが同様の抗腫瘍細胞傷害性を示す。メソセリン特異的または対照の形質導入されたCAR+T細胞を、示したエフェクター/標的比で、メソセリンを過剰発現するように形質導入された51CrロードのMSTO211H標的細胞(MSTO MSLN+)とともに、インキュベートして、標的細胞溶解(クロム放出)を測定した。エラーバーは、3回の反復の平均のs.e.m.である。*p<0.05は、CD8 M28zとCD4 M28z CAR+T細胞を比較する。(C)CD28共刺激は、最適のCD4+媒介性の細胞傷害性に必須である。CD4+およびCD8+のT細胞サブセットのビーズ精製後、メソセリン特異的または対照の形質導入されたCAR+T細胞を、示したエフェクター/標的比で、メソセリンを過剰発現するように形質導入された51CrロードされたMSTO211H標的細胞(MSTO MSLN+)とともにインキュベートして、標的細胞溶解(クロム放出)を測定した。*p<0.05は、CD4 M28zとCD4 Mz CAR+T細胞とを比較している。(D)サイトカインリッチな上清は、腫瘍細胞溶解を直接生じない。CD4+ M28zまたはCD4+ P28z(陰性対照として)とMSTO MSLN+またはMSTO empty標的細胞との18時間の共インキュベーション後に得られた上清を、新鮮にプレートした51Cr標識の標的とともに混合して、標的細胞溶解を、示した時点で測定した。CD4+M28z CAR T細胞は、抗原特異的溶解を実証した(陽性対照)。(E)CAR+T細胞分泌サイトカインは、CAR+媒介性の細胞傷害性を強化する。CD4+M28z CAR+T細胞のメソセリン特異的刺激後に得られた上清は、CD8M28zおよびCD4M28zの両方とMSTO MSLN+標的細胞との18時間共存培養において細胞傷害性を増強する。エラーバーは、3回の反復の平均のs.e.m.に相当する。*p<0.05は、CAR+T細胞と添加された上清の有無とを比較している。
図7A図7Dは、メソセリン特異的CAR+T細胞の細胞傷害性が、パーフォリングランザイムによって主に媒介されることを示す。(A)左側および中央では、Fasリガンドブロックの際のM28z形質導入T細胞に対して細胞傷害性の影響がないことが実証される。ソートされたCD4、CD8およびソートされていないCD4/8M28z+T細胞を、抗Fas−L mAb NOK−1またはIgGアイソタイプ対照mAb(各々10ug/ml)およびMSTO MSLN+の存在下で、18時間の51Cr放出アッセイ中で共存培養した。右側の図は、FasL媒介性の細胞死についての標的細胞の感受性を示す(詳細に関しては、方法のセクションを参照のこと)。*p<0.05。(B)腫瘍標的のT細胞溶解物を形質導入されたメソセリン特異的なCARは、細胞傷害性顆粒の放出に依存する。M28zまたはMz形質導入T細胞のソートされたCD4+、CD8+亜集団およびソートされていないバル集団の18時間の51Cr放出アッセイを、キレート剤エチレングリコール四酢酸(EGTA)の有無のもとで、MSTO MSLN+腫瘍細胞とともに、96ウェル組織培養プレート中で18時間共存培養した。*p<0.05。(C)CD4+CAR T細胞は、刺激の際にグランザイムBを発現し、ただしCD8+CAR T細胞と比較した場合、動態が遅延していた。グランザイムAおよびBに関する細胞内フローサイトメトリーは、休止期のPBMCPHA刺激のブラスト、およびMSTO MSLN+刺激の(2:1のエフェクター対標的の比)CAR形質導入の(M28z、Mz、およびP28zを陰性対照として)T細胞で行った。細胞を、4時間または18時間刺激して、クロム放出を細胞傷害性アッセイで評価した2つの時点と比較した。CD3+およびGFP+事象のためのゲーティングの後、グランザイム陽性の事象を、蛍光マイナスワン(fluorescence minus one)染色細胞を用いて決定した。抗体アイソタイプ対照は、全ての染色について陰性であった。左側、代表的なFACSドットは、CD4+およびCD8+の両方のT細胞サブセットについてプロットする。右側、行った全部で3つの総実験の1つの代表的な実験の棒グラフ。(D)M28z CAR T細胞は、Mz CAR T細胞よりも大量のグランザイムBを発現する。細胞を、(c)のように染色して、代表的なヒストグラムを、MSTO MSLN+刺激による刺激の18時間後に示す。
図7A図7Dは、メソセリン特異的CAR+T細胞の細胞傷害性が、パーフォリン/グランザイムによって主に媒介されることを示す。(A)左側および中央では、Fasリガンドブロックの際のM28z形質導入T細胞に対して細胞傷害性の影響がないことが実証される。ソートされたCD4、CD8およびソートされていないCD4/8M28z+T細胞を、抗Fas−L mAb NOK−1またはIgG1アイソタイプ対照mAb(各々10ug/ml)およびMSTO MSLN+の存在下で、18時間の51Cr放出アッセイ中で共存培養した。右側の図は、FasL媒介性の細胞死についての標的細胞の感受性を示す(詳細に関しては、方法のセクションを参照のこと)。*p<0.05。(B)腫瘍標的のT細胞溶解物を形質導入されたメソセリン特異的なCARは、細胞傷害性顆粒の放出に依存する。M28zまたはMz形質導入T細胞のソートされたCD4+、CD8+亜集団およびソートされていないバルク集団の18時間の51Cr放出アッセイを、キレート剤エチレングリコール四酢酸(EGTA)の有無のもとで、MSTO MSLN+腫瘍細胞とともに、96ウェル組織培養プレート中で18時間共存培養した。*p<0.05。(C)CD4+CAR T細胞は、刺激の際にグランザイムBを発現し、ただしCD8+CAR T細胞と比較した場合、動態が遅延していた。グランザイムAおよびBに関する細胞内フローサイトメトリーは、休止期のPBMC、PHA刺激のブラスト、およびMSTO MSLN+刺激の(2:1のエフェクター対標的の比)CAR形質導入の(M28z、Mz、およびP28zを陰性対照として)T細胞で行った。細胞を、4時間または18時間刺激して、クロム放出を細胞傷害性アッセイで評価した2つの時点と比較した。CD3+およびGFP+事象のためのゲーティングの後、グランザイム陽性の事象を、蛍光マイナスワン(fluorescence minus one)染色細胞を用いて決定した。抗体アイソタイプ対照は、全ての染色について陰性であった。左側、代表的なFACSドットは、CD4+およびCD8+の両方のT細胞サブセットについてプロットする。右側、行った全部で3つの総実験の1つの代表的な実験の棒グラフ。(D)M28z CAR T細胞は、Mz CAR T細胞よりも大量のグランザイムBを発現する。細胞を、(c)のように染色して、代表的なヒストグラムを、MSTO MSLN+刺激による刺激の18時間後に示す。
図7A図7Dは、メソセリン特異的CAR+T細胞の細胞傷害性が、パーフォリン/グランザイムによって主に媒介されることを示す。(A)左側および中央では、Fasリガンドブロックの際のM28z形質導入T細胞に対して細胞傷害性の影響がないことが実証される。ソートされたCD4、CD8およびソートされていないCD4/8M28z+T細胞を、抗Fas−L mAb NOK−1またはIgG1アイソタイプ対照mAb(各々10ug/ml)およびMSTO MSLN+の存在下で、18時間の51Cr放出アッセイ中で共存培養した。右側の図は、FasL媒介性の細胞死についての標的細胞の感受性を示す(詳細に関しては、方法のセクションを参照のこと)。*p<0.05。(B)腫瘍標的のT細胞溶解物を形質導入されたメソセリン特異的なCARは、細胞傷害性顆粒の放出に依存する。M28zまたはMz形質導入T細胞のソートされたCD4+、CD8+亜集団およびソートされていないバルク集団の18時間の51Cr放出アッセイを、キレート剤エチレングリコール四酢酸(EGTA)の有無のもとで、MSTO MSLN+腫瘍細胞とともに、96ウェル組織培養プレート中で18時間共存培養した。*p<0.05。(C)CD4+CAR T細胞は、刺激の際にグランザイムBを発現し、ただしCD8+CAR T細胞と比較した場合、動態が遅延していた。グランザイムAおよびBに関する細胞内フローサイトメトリーは、休止期のPBMC、PHA刺激のブラスト、およびMSTO MSLN+刺激の(2:1のエフェクター対標的の比)CAR形質導入の(M28z、Mz、およびP28zを陰性対照として)T細胞で行った。細胞を、4時間または18時間刺激して、クロム放出を細胞傷害性アッセイで評価した2つの時点と比較した。CD3+およびGFP+事象のためのゲーティングの後、グランザイム陽性の事象を、蛍光マイナスワン(fluorescence minus one)染色細胞を用いて決定した。抗体アイソタイプ対照は、全ての染色について陰性であった。左側、代表的なFACSドットは、CD4+およびCD8+の両方のT細胞サブセットについてプロットする。右側、行った全部で3つの総実験の1つの代表的な実験の棒グラフ。(D)M28z CAR T細胞は、Mz CAR T細胞よりも大量のグランザイムBを発現する。細胞を、(c)のように染色して、代表的なヒストグラムを、MSTO MSLN+刺激による刺激の18時間後に示す。
図7A図7Dは、メソセリン特異的CAR+T細胞の細胞傷害性が、パーフォリン/グランザイムによって主に媒介されることを示す。(A)左側および中央では、Fasリガンドブロックの際のM28z形質導入T細胞に対して細胞傷害性の影響がないことが実証される。ソートされたCD4、CD8およびソートされていないCD4/8M28z+T細胞を、抗Fas−L mAb NOK−1またはIgG1アイソタイプ対照mAb(各々10ug/ml)およびMSTO MSLN+の存在下で、18時間の51Cr放出アッセイ中で共存培養した。右側の図は、FasL媒介性の細胞死についての標的細胞の感受性を示す(詳細に関しては、方法のセクションを参照のこと)。*p<0.05。(B)腫瘍標的のT細胞溶解物を形質導入されたメソセリン特異的なCARは、細胞傷害性顆粒の放出に依存する。M28zまたはMz形質導入T細胞のソートされたCD4+、CD8+亜集団およびソートされていないバルク集団の18時間の51Cr放出アッセイを、キレート剤エチレングリコール四酢酸(EGTA)の有無のもとで、MSTO MSLN+腫瘍細胞とともに、96ウェル組織培養プレート中で18時間共存培養した。*p<0.05。(C)CD4+CAR T細胞は、刺激の際にグランザイムBを発現し、ただしCD8+CAR T細胞と比較した場合、動態が遅延していた。グランザイムAおよびBに関する細胞内フローサイトメトリーは、休止期のPBMC、PHA刺激のブラスト、およびMSTO MSLN+刺激の(2:1のエフェクター対標的の比)CAR形質導入の(M28z、Mz、およびP28zを陰性対照として)T細胞で行った。細胞を、4時間または18時間刺激して、クロム放出を細胞傷害性アッセイで評価した2つの時点と比較した。CD3+およびGFP+事象のためのゲーティングの後、グランザイム陽性の事象を、蛍光マイナスワン(fluorescence minus one)染色細胞を用いて決定した。抗体アイソタイプ対照は、全ての染色について陰性であった。左側、代表的なFACSドットは、CD4+およびCD8+の両方のT細胞サブセットについてプロットする。右側、行った全部で3つの総実験の1つの代表的な実験の棒グラフ。(D)M28z CAR T細胞は、Mz CAR T細胞よりも大量のグランザイムBを発現する。細胞を、(c)のように染色して、代表的なヒストグラムを、MSTO MSLN+刺激による刺激の18時間後に示す。
図7A図7Dは、メソセリン特異的CAR+T細胞の細胞傷害性が、パーフォリン/グランザイムによって主に媒介されることを示す。(A)左側および中央では、Fasリガンドブロックの際のM28z形質導入T細胞に対して細胞傷害性の影響がないことが実証される。ソートされたCD4、CD8およびソートされていないCD4/8M28z+T細胞を、抗Fas−L mAb NOK−1またはIgG1アイソタイプ対照mAb(各々10ug/ml)およびMSTO MSLN+の存在下で、18時間の51Cr放出アッセイ中で共存培養した。右側の図は、FasL媒介性の細胞死についての標的細胞の感受性を示す(詳細に関しては、方法のセクションを参照のこと)。*p<0.05。(B)腫瘍標的のT細胞溶解物を形質導入されたメソセリン特異的なCARは、細胞傷害性顆粒の放出に依存する。M28zまたはMz形質導入T細胞のソートされたCD4+、CD8+亜集団およびソートされていないバルク集団の18時間の51Cr放出アッセイを、キレート剤エチレングリコール四酢酸(EGTA)の有無のもとで、MSTO MSLN+腫瘍細胞とともに、96ウェル組織培養プレート中で18時間共存培養した。*p<0.05。(C)CD4+CAR T細胞は、刺激の際にグランザイムBを発現し、ただしCD8+CAR T細胞と比較した場合、動態が遅延していた。グランザイムAおよびBに関する細胞内フローサイトメトリーは、休止期のPBMC、PHA刺激のブラスト、およびMSTO MSLN+刺激の(2:1のエフェクター対標的の比)CAR形質導入の(M28z、Mz、およびP28zを陰性対照として)T細胞で行った。細胞を、4時間または18時間刺激して、クロム放出を細胞傷害性アッセイで評価した2つの時点と比較した。CD3+およびGFP+事象のためのゲーティングの後、グランザイム陽性の事象を、蛍光マイナスワン(fluorescence minus one)染色細胞を用いて決定した。抗体アイソタイプ対照は、全ての染色について陰性であった。左側、代表的なFACSドットは、CD4+およびCD8+の両方のT細胞サブセットについてプロットする。右側、行った全部で3つの総実験の1つの代表的な実験の棒グラフ。(D)M28z CAR T細胞は、Mz CAR T細胞よりも大量のグランザイムBを発現する。細胞を、(c)のように染色して、代表的なヒストグラムを、MSTO MSLN+刺激による刺激の18時間後に示す。
図8Aおよび図8Bは、メソセリン特異的なCAR+T細胞のCD28共刺激効果は、大部分がCD4+媒介性であることを示す。(A)M28z T細胞における強化されたサイトカイン分泌は、主にCD4+媒介性である。サイトカイン放出アッセイは、CD4+、CD8亜集団(以前に記載のとおり)またはソートされていないバルク集団について、ソートされたM28zおよびMz T細胞で行なった。5×104個のCAR+T細胞を、1ウェルあたり5×103標的細胞とともに、1ウェルあたり200μlの最終容積で、96ウェル丸底プレート中で、三連で、共存培養した。20時間後、共存培養上清を採集して、サイトカインアッセイを、多重ヒトサイトカイン検出アッセイを用いて行い、IL−2、GM−CSF、TNF−α、および、IFN−γ(Millipore Corp.)を検出した。データは、1サイトカンあたり3つのウェル中の平均±s.e.m.のサイトカインレベルに相当する。(B)外因性のIL−2なしのM28z CD4+T細胞の顕著なT細胞増殖能力。MSLN+またはMSLN−腫瘍単層を用いて4日ごとに共存培養されたT細胞のM28zまたはMz形質導入CD4+、CD8+亜集団またはソートされていないバルク集団のT細胞増殖。CAR+T細胞絶対数は、フローサイトメトリーで決定したGFP+のパーセンテージで補正した手技による血球計算器カウントを用いて示した時点で算出した。各々のドットは、3つのウェルにおける平均±s.e.m.に相当する。
図8Aおよび図8Bは、メソセリン特異的なCAR+T細胞のCD28共刺激効果は、大部分がCD4+媒介性であることを示す。(A)M28z T細胞における強化されたサイトカイン分泌は、主にCD4+媒介性である。サイトカイン放出アッセイは、CD4+、CD8亜集団(以前に記載のとおり)またはソートされていないバルク集団について、ソートされたM28zおよびMz T細胞で行なった。5×104個のCAR+T細胞を、1ウェルあたり5×103標的細胞とともに、1ウェルあたり200μlの最終容積で、96ウェル丸底プレート中で、三連で、共存培養した。20時間後、共存培養上清を採集して、サイトカインアッセイを、多重ヒトサイトカイン検出アッセイを用いて行い、IL−2、GM−CSF、TNF−α、および、IFN−γ(Millipore Corp.)を検出した。データは、1サイトカンあたり3つのウェル中の平均±s.e.m.のサイトカインレベルに相当する。(B)外因性のIL−2なしのM28z CD4+T細胞の顕著なT細胞増殖能力。MSLN+またはMSLN−腫瘍単層を用いて4日ごとに共存培養されたT細胞のM28zまたはMz形質導入CD4+、CD8+亜集団またはソートされていないバルク集団のT細胞増殖。CAR+T細胞絶対数は、フローサイトメトリーで決定したGFP+のパーセンテージで補正した手技による血球計算器カウントを用いて示した時点で算出した。各々のドットは、3つのウェルにおける平均±s.e.m.に相当する。
図9Aおよび図9Bは、CD4+ M28z CAR T細胞が、CD8+ M28z CAR T細胞に比較した場合、単独でin vivoで投与され、有効性の増強を媒介するときに、有効であることを示す。(A)NSGマウスの胸膜腔に接種された(0日目の接種時間)MSTO MSLN+ GFP/Luc+腫瘍の腫瘍負荷を追跡する、毎週行われるin vivoの生物発光イメージング。腫瘍注入の18日後、マウスは、3×105、1×105、または3×104個のCAR+T細胞のバルクのM28z(n=5)、ソートされたCD4+またはCD8+M28z(n=7)のいずれかを投与された。CAR P28zを標的化するヒトPSMAを発現する同数のT細胞を、対照群(n=4)に注射した。BLIシグナル強度は、光子/秒として示され、平均の腹側および背側のシグナルの平均に相当する。(B)(a)に記載されるT細胞処置マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。示されるP値は、ログランク統計学的検定を用いて示した。全ての用量で、CD4+ M28z CAR+T細胞は、CD8+ CAR+T細胞と比較して有効である。CD4+ CAR+T細胞抗腫瘍有効性は、ソートされていないCAR+T細胞に匹敵する。
図9Aおよび図9Bは、CD4+ M28z CAR T細胞が、CD8+ M28z CAR T細胞に比較した場合、単独でin vivoで投与され、有効性の増強を媒介するときに、有効であることを示す。(A)NSGマウスの胸膜腔に接種された(0日目の接種時間)MSTO MSLN+ GFP/Luc+腫瘍の腫瘍負荷を追跡する、毎週行われるin vivoの生物発光イメージング。腫瘍注入の18日後、マウスは、3×105、1×105、または3×104個のCAR+T細胞のバルクのM28z(n=5)、ソートされたCD4+またはCD8+M28z(n=7)のいずれかを投与された。CAR P28zを標的化するヒトPSMAを発現する同数のT細胞を、対照群(n=4)に注射した。BLIシグナル強度は、光子/秒として示され、平均の腹側および背側のシグナルの平均に相当する。(B)(a)に記載されるT細胞処置マウスのカプラン・マイヤー生存曲線。示されるP値は、ログランク統計学的検定を用いて示した。全ての用量で、CD4+ M28z CAR+T細胞は、CD8+ CAR+T細胞と比較して有効である。CD4+ CAR+T細胞抗腫瘍有効性は、ソートされていないCAR+T細胞に匹敵する。
図10A〜図10Eは、養子免疫移入された、メソセリン指向性T細胞の機能的な持続性が、主にCD4+媒介性であり、かつCD28共刺激によって強められることを示す。(A)T細胞を胸膜内に投与した202日後に屠殺した1匹の代表的なNSGマウス(n=3)から調製した脾臓単一細胞懸濁物の多色フローサイトメトリー解析。3×105個のM28z T細胞(データ示さず)の注入によって、樹立されたMSTO MSLN+胸膜内腫瘍の根絶の184日後。CAR+(CD3+GFP+)事象についてゲートした後のM28z T細胞亜集団では、CD4+T細胞優勢が示される。(B)MSTO MSLN+およびMSTO−211H−MSLN−腫瘍再チャレンジのNSGマウスのin vivoのBLI。1×105個のM28zまたはMz形質導入されたT細胞;1×106個のMSLN+またはMSLN− MSTO腫瘍細胞(マウスの腹腔に注射する場合)のいずれかの投与の後、胸膜腫瘍根絶87日後。示した時点で、luc+腫瘍細胞を生物発光イメージングによってモニターした。3匹のNSGマウスを、1つの処置群あたりにイメージングした。各々のラインは、各群のマウスの平均±s.e.m.に相当し、各々のドットは、腹側および背側の両方でマウス全体にまたがって測定した平均光子カウントを示している。MSTO MSLN+腹膜腫瘍を注射されたマウスで腫瘍再チャレンジの2週後、87日前に注射されたMzおよびM28z CAR+T細胞の両方とも、抗腫瘍有効性を実証した。M28z CAR+T細胞は、Mz CAR+T細胞と比較して腫瘍容積の低下にさらに有効であった。(CおよびD)。M28zまたはMzT細胞絶対数は、腫瘍再チャレンジ後に脾臓で蓄積した。示される棒グラフは、MSLN+(n=6)またはMSLN−(n=6)腫瘍のいずれかで再チャレンジされ、腫瘍再チャレンジの16日後に屠殺されたNSGマウスの脾臓からの形質導入されたT細胞の平均±s.e.m.に相当する。MSTO−211H−MSLN+で再チャレンジされたM28z T細胞処置マウスのみが、脾臓中でCAR+T細胞の堅調な蓄積を示した。T細胞亜集団はまた、フローサイトメトリー(詳細については、方法のセクションを参照のこと)によって定量し、M28z群に示されるT細胞のほとんどがCD4+T細胞であることが示された。(E)腫瘍接種後の動物の処置。
図10A〜図10Eは、養子免疫移入された、メソセリン指向性T細胞の機能的な持続性が、主にCD4+媒介性であり、かつCD28共刺激によって強められることを示す。(A)T細胞を胸膜内に投与した202日後に屠殺した1匹の代表的なNSGマウス(n=3)から調製した脾臓単一細胞懸濁物の多色フローサイトメトリー解析。3×105個のM28z T細胞(データ示さず)の注入によって、樹立されたMSTO MSLN+胸膜内腫瘍の根絶の184日後。CAR+(CD3+GFP+)事象についてゲートした後のM28z T細胞亜集団では、CD4+T細胞優勢が示される。(B)MSTO MSLN+およびMSTO−211H−MSLN−腫瘍再チャレンジのNSGマウスのin vivoのBLI。1×105個のM28zまたはMz形質導入されたT細胞;1×106個のMSLN+またはMSLN− MSTO腫瘍細胞(マウスの腹腔に注射する場合)のいずれかの投与の後、胸膜腫瘍根絶87日後。示した時点で、luc+腫瘍細胞を生物発光イメージングによってモニターした。3匹のNSGマウスを、1つの処置群あたりにイメージングした。各々のラインは、各群のマウスの平均±s.e.m.に相当し、各々のドットは、腹側および背側の両方でマウス全体にまたがって測定した平均光子カウントを示している。MSTO MSLN+腹膜腫瘍を注射されたマウスで腫瘍再チャレンジの2週後、87日前に注射されたMzおよびM28z CAR+T細胞の両方とも、抗腫瘍有効性を実証した。M28z CAR+T細胞は、Mz CAR+T細胞と比較して腫瘍容積の低下にさらに有効であった。(CおよびD)。M28zまたはMzT細胞絶対数は、腫瘍再チャレンジ後に脾臓で蓄積した。示される棒グラフは、MSLN+(n=6)またはMSLN−(n=6)腫瘍のいずれかで再チャレンジされ、腫瘍再チャレンジの16日後に屠殺されたNSGマウスの脾臓からの形質導入されたT細胞の平均±s.e.m.に相当する。MSTO−211H−MSLN+で再チャレンジされたM28z T細胞処置マウスのみが、脾臓中でCAR+T細胞の堅調な蓄積を示した。T細胞亜集団はまた、フローサイトメトリー(詳細については、方法のセクションを参照のこと)によって定量し、M28z群に示されるT細胞のほとんどがCD4+T細胞であることが示された。(E)腫瘍接種後の動物の処置。
図10A〜図10Eは、養子免疫移入された、メソセリン指向性T細胞の機能的な持続性が、主にCD4+媒介性であり、かつCD28共刺激によって強められることを示す。(A)T細胞を胸膜内に投与した202日後に屠殺した1匹の代表的なNSGマウス(n=3)から調製した脾臓単一細胞懸濁物の多色フローサイトメトリー解析。3×105個のM28z T細胞(データ示さず)の注入によって、樹立されたMSTO MSLN+胸膜内腫瘍の根絶の184日後。CAR+(CD3+GFP+)事象についてゲートした後のM28z T細胞亜集団では、CD4+T細胞優勢が示される。(B)MSTO MSLN+およびMSTO−211H−MSLN−腫瘍再チャレンジのNSGマウスのin vivoのBLI。1×105個のM28zまたはMz形質導入されたT細胞;1×106個のMSLN+またはMSLN− MSTO腫瘍細胞(マウスの腹腔に注射する場合)のいずれかの投与の後、胸膜腫瘍根絶87日後。示した時点で、luc+腫瘍細胞を生物発光イメージングによってモニターした。3匹のNSGマウスを、1つの処置群あたりにイメージングした。各々のラインは、各群のマウスの平均±s.e.m.に相当し、各々のドットは、腹側および背側の両方でマウス全体にまたがって測定した平均光子カウントを示している。MSTO MSLN+腹膜腫瘍を注射されたマウスで腫瘍再チャレンジの2週後、87日前に注射されたMzおよびM28z CAR+T細胞の両方とも、抗腫瘍有効性を実証した。M28z CAR+T細胞は、Mz CAR+T細胞と比較して腫瘍容積の低下にさらに有効であった。(CおよびD)。M28zまたはMzT細胞絶対数は、腫瘍再チャレンジ後に脾臓で蓄積した。示される棒グラフは、MSLN+(n=6)またはMSLN−(n=6)腫瘍のいずれかで再チャレンジされ、腫瘍再チャレンジの16日後に屠殺されたNSGマウスの脾臓からの形質導入されたT細胞の平均±s.e.m.に相当する。MSTO−211H−MSLN+で再チャレンジされたM28z T細胞処置マウスのみが、脾臓中でCAR+T細胞の堅調な蓄積を示した。T細胞亜集団はまた、フローサイトメトリー(詳細については、方法のセクションを参照のこと)によって定量し、M28z群に示されるT細胞のほとんどがCD4+T細胞であることが示された。(E)腫瘍接種後の動物の処置。
図11Aおよび図11Bは、FoxP3リッチな腫瘍微小環境におけるCD4+およびCD8+腫瘍/間質性浸潤が、長期生存を伴っていることを示す。(A)高CD8+T細胞の腫瘍浸潤は、FoxP3の存在下でさえ長期生存を伴う。1989〜2009年の間にメモリアルスローンケタリングがんセンター(Memorial Sloan−Kettering Cancer Center)で類上皮MPMと診断された患者が含まれた。利用可能な標品がある162例の患者の各々に関して、全てのH&Eスライド中央値9、範囲1〜43)を再見した。代表的なブロックは、各々の患者腫瘍ブロックから9つの代表的なコア(0.6mm)を取ること、および少なくとも6つの完全な腫瘍コアを確立することによって、組織マイクロアレイ(TMA)を構築するように選択した。5マイクロメートルの切片を、TMAから切断して、特異的な抗体(CD8:マウスモノクローナル、Dako、1:200希釈、FoxP3:マウスモノクローナル、Abcam、1:2,000希釈)によって染色した。CD8およびFoxP3強度の等級付けは、以下のように臨床データ盲検であった病理学者によって別々の機会で行った:各々の患者について、免疫細胞浸潤は、1(平均、1〜1.67)、2(平均、1.67〜2.33)、または3(平均、>2.33)というスコアで定義した。統計学的解析のために、1というスコアは、低いとみなし、ならびに2および3は高いとみなした。(B)高いCD4+T細胞の間質性浸潤は、FoxP3の存在下では長期生存を伴う。a.に記載のとおり、ヤギポリクローナル(Goat Polyclonal)、R&D Systemsを、1:100希釈で用いてCD4+細胞を染色する。
図11Aおよび図11Bは、FoxP3リッチな腫瘍微小環境におけるCD4+およびCD8+腫瘍/間質性浸潤が、長期生存を伴っていることを示す。(A)高CD8+T細胞の腫瘍浸潤は、FoxP3の存在下でさえ長期生存を伴う。1989〜2009年の間にメモリアルスローン・ケタリングがんセンター(Memorial Sloan−Kettering Cancer Center)で類上皮MPMと診断された患者が含まれた。利用可能な標品がある162例の患者の各々に関して、全てのH&Eスライド(中央値9、範囲1〜43)を再見した。代表的なブロックは、各々の患者腫瘍ブロックから9つの代表的なコア(0.6mm)を取ること、および少なくとも6つの完全な腫瘍コアを確立することによって、組織マイクロアレイ(TMA)を構築するように選択した。5マイクロメートルの切片を、TMAから切断して、特異的な抗体(CD8:マウスモノクローナル、Dako、1:200希釈、FoxP3:マウスモノクローナル、Abcam、1:2,000希釈)によって染色した。CD8およびFoxP3強度の等級付けは、以下のように臨床データに盲検であった病理学者によって別々の機会で行った:各々の患者について、免疫細胞浸潤は、1(平均、1〜1.67)、2(平均、1.67〜2.33)、または3(平均、>2.33)というスコアで定義した。統計学的解析のために、1というスコアは、低いとみなし、ならびに2および3は高いとみなした。(B)高いCD4+T細胞の間質性浸潤は、FoxP3の存在下では長期生存を伴う。a.に記載のとおり、ヤギポリクローナル(Goat Polyclonal)、R&D Systemsを、1:100希釈で用いてCD4+細胞を染色する。
図12は、MSLNスコアの分布三重陰性乳がん(TNBC)対非TNBCを示す。
図13A〜図13Fは、生存プロファイルを示す:MSLN+ TNBC対NSLN−TNBC。
図13A〜図13Fは、生存プロファイルを示す:MSLN+ TNBC対NSLN−TNBC。
図14は、ステージIのADC患者の血清における術前の可溶性MSLN関連性のペプチド(SMRP)レベルの測定を示す。
図15A〜図15Cは、マウスモデルの開発を示す。
図16は、肺転移性マウスモデルにおいて腫瘍負荷を低減するためのM28zの有効性を示す。
図17A〜図17Dは、高MSLN発現標的と比較して低MSLN発現標的の抗原特異的バイスタンダー殺傷に対するM28z T細胞を示す。
図18は、PD−L1発現性MSTO−211H(ヒト胸膜の中皮腫)細胞を示す。
図19は、MBBzの構造を示す。
図20A〜図20Cは、MSLN標的化CD28および4−1BB共刺激が、腫瘍分泌性の免疫抑制タンパク質の存在下においてCAR T細胞機能を強化したことを示す。
図21A〜図21Cは、MSLN標的化CD28および4−1BB共刺激が、腫瘍分泌性の免疫抑制タンパク質の存在下においてCAR T細胞機能を強化したことを示す。
図22は、MSLN+がん細胞に対するM28−IL12およびM28zの細胞傷害性を示す。
図23は、M28z誘発性のサイトカイン発現に対するIL−12の影響を示す。
図24A〜図24Eは、ここで開示される本発明の主題によるCARを示す。(A)SFG−M28zの構造を示す。(SFG−MBBzのBB構造を示す)。(C)SFG−M28z−4−1BBLの構造を示す。(D)SFG−4−1BBL−M28zの構造を示す。(E)SFG−M28z−IRES−Flexi−IL−12の構造を示す(ここでIRESは、NFATまたはインターフェロン応答性エレメントの制御下で代替的に発現され得る)。
図25は、SFG−M28z−EGFRtの構造を示す。
図26は、SFG−iC9−M28zの制限マップを示す。
図27A〜図27Cは、種々のレベルのM28zを発現するヒトT細胞を示す。
図28は、種々のレベルのヒトメソセリンを発現する標的細胞株を示す。
図29Aおよび図29Bは、種々のレベルのヒトメソセリンを発現する標的細胞に対するM28z+T細胞のサイトカイン産生を示す。
図29Aおよび図29Bは、種々のレベルのヒトメソセリンを発現する標的細胞に対するM28z+T細胞のサイトカイン産生を示す。
図30は、種々のレベルのヒトメソセリンを発現する標的細胞に対するM28z+T細胞の細胞傷害性を示す。
図31A〜図31Cは、種々のレベルのヒトメソセリン(MSLN)を発現する標的細胞に対するM28z+T細胞のサイトカイン産生および細胞傷害性を示す。(A)種々のレベルのMSLNを発現するMSTO−211H細胞。(B)種々のレベルのMSLNを発現するMSTO−211H細胞に対するCTL解析。(C)種々のレベルのMSLNを発現するMSTO−211H細胞に対するサイトカイン産生。
図32は、シスプラチン前処置が、本発明の開示のMSLN特異的CAR発現T細胞の有効性を促進したことを示す。
図32は、シスプラチン前処置が、本発明の開示のMSLN特異的CAR発現T細胞の有効性を促進したことを示す。
図33は、放射線療法が、本発明の開示のMSLN特異的CAR発現T細胞の有効性を促進したことを示す。胸部腫瘍を有するマウスにおける半胸郭放射線療法(HTRT)に対する曝露後72時間のin vitro(A)およびin vivo(B)におけるケモカインおよびサイトカイン分泌。
図34は、放射線療法が、本発明の全体的な開示のMSLN特異的CAR発現T細胞の有効性を促進したことを示す。CAR+T細胞投与前の半胸郭放射線療法は、T細胞BLIによってモニターした場合T細胞蓄積を増大し、収集された脾臓(T細胞56日)の分析では、T細胞単独を投与されたマウスと比較して、持続するT細胞の割合が高いことが示された。
図34は、放射線療法が、本発明の全体的な開示のMSLN特異的CAR発現T細胞の有効性を促進したことを示す。CAR+T細胞投与前の半胸郭放射線療法は、T細胞BLIによってモニターした場合T細胞蓄積を増大し、収集された脾臓(T細胞56日)の分析では、T細胞単独を投与されたマウスと比較して、持続するT細胞の割合が高いことが示された。
図35A〜図35Eは、MSLN CAR形質導入のT細胞の局所投与が、優れた腫瘍有効性を生じることを示す。(A)クロム放出アッセイで測定される、MSLN発現(ただしPSMA発現ではない)標的細胞の溶解によって示されるMSLN−CAR形質導入のT細胞の抗原特異的エフェクター機能。(BおよびD)胸膜腫瘍を保有するNOD/SCID/γcヌルマウスの腫瘍BLI。腫瘍保有マウスを、1×105(1×)または3×105(3×)個のM28z T細胞を胸膜内に(E:T、それぞれ1:3000または1000)と比較して、1×105(1×)または3×106(30×)個のM28z T細胞のいずれかを静脈内に(それぞれE:Tが1:3000または100)で用いて処置した。死亡は、アスタリスク(*)で示す。(CおよびE)カプラン・マイヤー生存解析で、静脈内投与(青い破線)と比較して、胸膜内投与での優れた有効性が実証される(青い実線)。中央生存は、M28zの胸膜内投与については達しなかった;静脈内投与の中央生存は、27日(1×)および86日(30×)であった。胸膜のP28zで処置した対照のマウス(黒い線)は、27〜42日の中央生存を有した(1群あたりn=4〜10)。生存曲線は、ログランク検定で分析した。**P<0.01;***P<0.001。
図35A〜図35Eは、MSLN CAR形質導入のT細胞の局所投与が、優れた腫瘍有効性を生じることを示す。(A)クロム放出アッセイで測定される、MSLN発現(ただしPSMA発現ではない)標的細胞の溶解によって示されるMSLN−CAR形質導入のT細胞の抗原特異的エフェクター機能。(BおよびD)胸膜腫瘍を保有するNOD/SCID/γcヌルマウスの腫瘍BLI。腫瘍保有マウスを、1×105(1×)または3×105(3×)個のM28z T細胞を胸膜内に(E:T、それぞれ1:3000または1000)と比較して、1×105(1×)または3×106(30×)個のM28z T細胞のいずれかを静脈内に(それぞれE:Tが1:3000または100)で用いて処置した。死亡は、アスタリスク(*)で示す。(CおよびE)カプラン・マイヤー生存解析で、静脈内投与(青い破線)と比較して、胸膜内投与での優れた有効性が実証される(青い実線)。中央生存は、M28zの胸膜内投与については達しなかった;静脈内投与の中央生存は、27日(1×)および86日(30×)であった。胸膜のP28zで処置した対照のマウス(黒い線)は、27〜42日の中央生存を有した(1群あたりn=4〜10)。生存曲線は、ログランク検定で分析した。**P<0.01;***P<0.001。
図36A〜図36Eは、胸膜内に投与されたM28z+T細胞が、CD4+およびCD8+サブセットの両方の早期の堅調な増殖を示すことを示す。(A)腫瘍保有マウスにおける連続的なT細胞BLI。静脈内に投与されたM28z+T細胞は、進行性の胸膜腫瘍において遅れたが等価の蓄積を示す。(B)連続的なT細胞 BLIからの平均のeffLuc−ルシフェラーゼシグナル強度。胸膜内に投与されたT細胞(青線)は、早期かつ持続した蓄積を示し、最大のT細胞シグナルは5日である。静脈内に投与されたT細胞は、蓄積の遅延を示し、最大のシグナルは7日目である。(C)E:T比は、6時間ならびに1、3および7日の腫瘍負荷と並行したM28z T細胞蓄積を反映し、これによってT細胞BLIの知見が確認される。静脈内投与は、T細胞蓄積の遅延、低いE:T比、およびCD8+T細胞浸潤の低下を示す。(D)7日目のFACS分析によって、静脈内投与後の脾臓における、低下したCD8+T細胞の腫瘍蓄積、ならびにCD4+およびCD8+T細胞の等しい分布と比較して、胸膜内投与後の腫瘍および脾臓内のCD4+およびCD8+T細胞サブセットの等しい蓄積が示される。(E)CD62L発現の低下が、胸膜内投与後のCD4+およびCD8+T細胞の両方で観察された。エラーバーは、±SEMを示す。スチューデントt検定によって、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
図36A〜図36Eは、胸膜内に投与されたM28z+T細胞が、CD4+およびCD8+サブセットの両方の早期の堅調な増殖を示すことを示す。(A)腫瘍保有マウスにおける連続的なT細胞BLI。静脈内に投与されたM28z+T細胞は、進行性の胸膜腫瘍において遅れたが等価の蓄積を示す。(B)連続的なT細胞 BLIからの平均のeffLuc−ルシフェラーゼシグナル強度。胸膜内に投与されたT細胞(青線)は、早期かつ持続した蓄積を示し、最大のT細胞シグナルは5日である。静脈内に投与されたT細胞は、蓄積の遅延を示し、最大のシグナルは7日目である。(C)E:T比は、6時間ならびに1、3および7日の腫瘍負荷と並行したM28z T細胞蓄積を反映し、これによってT細胞BLIの知見が確認される。静脈内投与は、T細胞蓄積の遅延、低いE:T比、およびCD8+T細胞浸潤の低下を示す。(D)7日目のFACS分析によって、静脈内投与後の脾臓における、低下したCD8+T細胞の腫瘍蓄積、ならびにCD4+およびCD8+T細胞の等しい分布と比較して、胸膜内投与後の腫瘍および脾臓内のCD4+およびCD8+T細胞サブセットの等しい蓄積が示される。(E)CD62L発現の低下が、胸膜内投与後のCD4+およびCD8+T細胞の両方で観察された。エラーバーは、±SEMを示す。スチューデントt検定によって、*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
図37A〜図37Cは、胸膜内に投与されたM28z+T細胞が、胸膜外腫瘍において、抗原特異的な方式で効果的な全身性輸送および蓄積を示すことを示す。(A)二重ルシフェラーゼイメージングによる連続的な腫瘍およびT細胞BLIであって、全身性の輸送および胸膜外腫瘍蓄積を実証している。右わき腹および胸膜腔にffluc+MSLN+腫瘍ならびに左わき腹にMSLN−腫瘍を樹立されたマウスに、ガウス−ルシフェラーゼ+M28z T細胞を胸膜内に投与した。T細胞投与前にわき腹および胸膜腔に腫瘍を有する代表的なマウス(左側)。T細胞投与15日後のT細胞BLI(中央)は、胸膜腔における残留T細胞およびMSLN+右わき腹腫瘍(中央)における蓄積を示す。1日後、腫瘍BLIは、MSLN−左わき腹腫瘍(右側)と比較して、MSLN+右わき腹腫瘍では負荷の低下を示す。(BおよびC)胸膜内に投与されたM28z+T細胞は、静脈内に投与されたT細胞と比較して、MSLN+腹膜内腫瘍において早期かつ堅調な蓄積を示す。(C)腫瘍保有マウスにおける腹腔のシグナル強度の倍数増大の定量は、静脈内投与と比較して、胸膜内投与でのT細胞蓄積の増強を示す(1群あたりn=3、エラーバーは±SEMに相当する)。
図37A〜図37Cは、胸膜内に投与されたM28z+T細胞が、胸膜外腫瘍において、抗原特異的な方式で効果的な全身性の輸送および蓄積を示すことを示す。(A)二重ルシフェラーゼイメージングによる連続的な腫瘍およびT細胞BLIであって、全身性の輸送および胸膜外腫瘍蓄積を実証している。右わき腹および胸膜腔にffluc+MSLN+腫瘍ならびに左わき腹にMSLN−腫瘍を樹立されたマウスに、ガウス−ルシフェラーゼ+M28z T細胞を胸膜内に投与した。T細胞投与前にわき腹および胸膜腔に腫瘍を有する代表的なマウス(左側)。T細胞投与15日後のT細胞BLI(中央)は、胸膜腔における残留T細胞およびMSLN+右わき腹腫瘍(中央)における蓄積を示す。1日後、腫瘍BLIは、MSLN−左わき腹腫瘍(右側)と比較して、MSLN+右わき腹腫瘍では負荷の低下を示す。(BおよびC)胸膜内に投与されたM28z+T細胞は、静脈内に投与されたT細胞と比較して、MSLN+腹膜内腫瘍において早期かつ堅調な蓄積を示す。(C)腫瘍保有マウスにおける腹腔のシグナル強度の倍数増大の定量は、静脈内投与と比較して、胸膜内投与でのT細胞蓄積の増強を示す(1群あたりn=3、エラーバーは±SEMに相当する)。
図38Aおよび図38Bは、胸膜内に投与されたM28z T細胞が、胸膜腫瘍を根絶し、かつ長期のCD4+優勢な持続性を確立することを示す。(A)CD28共刺激が、T細胞の単回投与後、腫瘍根絶を促進する。全部で、1×105個のCAR+Mz、M28z、またはP28z(陰性対照)T細胞を、樹立された腫瘍を保有するマウスに、胸膜内に投与した。(左側)腫瘍負荷。(右側)カプラン・マイヤー生存曲線。MzおよびM28z群(1群あたり少なくとも9匹のマウス)の中央生存は、63日であって、それぞれ、中央生存は達しなかった。生存曲線は、ログランク検定によって分析した。**P<0.01。(B)CD28共刺激は、CAR+T細胞持続性を増強する。3×106個のCAR+T細胞の胸膜内投与50日後のCAR+T細胞カウント絶対数(末梢血の1mLあたり)。エラーバーは、±SEMに相当し、スチューデントt検定によって*P<0.05。
図39は、MSLN+およびMSLN−腫瘍で再チャレンジしたマウスの腫瘍BLIに相当する。単回投与の3×105個のM28zまたはMz T細胞の投与後、胸膜腫瘍根絶の87日後、1×106個のMSLN+またはMSLN−腫瘍細胞を、腹腔に注射した。腫瘍再チャレンジ後、Mz T細胞は、腫瘍増殖を妨げ、一方で、M28z T細胞は、腫瘍退縮を促進する。
図40A〜図40Fは、CD4+ M28z T細胞が、予備活性化(preactivation)で強められるCD8+蓄積を増強することを示す。(A〜C)ソートされていないM28zおよびMzまたはビーズでソートしたCD4+およびCD8+T細胞をアッセイした。M28z CD4+T細胞は、(A)より高度なサイトカイン分泌(4〜14倍;スチューデントt検定によって***P<0.001)および(B)外因性のIL−2のない顕著なT細胞増殖を示す。(C)CD4+M28z活性化は、in vitroの反復性の抗原刺激の際に堅調なCD8+M28z T細胞蓄積を容易にする。(D)抗原活性化されたCD4+ M28z活性化は、in vivoで堅調なCD8+M28z T細胞蓄積を容易にする。単離されたCD8+effLuc M28z T細胞を、CD4+M28z(n=6)またはCD4+対照形質導入のT細胞(n=6)のいずれかとともにMSLN+胸膜腫瘍保有マウスに対して胸膜内に投与して、連続的にイメージングした。1匹の代表的なマウス(1群あたりn=6;左側)は、CD4+M28zの存在下で、増大したCD8+M28z T細胞蓄積を示す。(E)CD8+CAR+T細胞の平均蓄積を、示した間隔で計算した(P値は示したとおり、16〜72時間の倍数増大を算出、1群あたりn=6)。(F)M28z CD4+の予備活性化は、CD8+増殖を、CD4+の同時の活性化と比較して増強する。ビーズソートしたCD8+MzまたはM28z T細胞を、対応するMzもしくはM28z CD4+または予備活性化されたCD4+T細胞(アッセイ24時間前にMSLN+腫瘍細胞上で活性化される)のいずれかとともに共存培養した。M28z CD4+の予備活性化は、CD8+の蓄積を、CD8+およびCD4+共刺激が増強するよりも大きい程度まで増強する。
図40A〜図40Fは、CD4+ M28z T細胞が、予備活性化(preactivation)で強められるCD8+蓄積を増強することを示す。(A〜C)ソートされていないM28zおよびMzまたはビーズでソートしたCD4+およびCD8+T細胞をアッセイした。M28z CD4+T細胞は、(A)より高度なサイトカイン分泌(4〜14倍;スチューデントt検定によって***P<0.001)および(B)外因性のIL−2のない顕著なT細胞増殖を示す。(C)CD4+M28z活性化は、in vitroの反復性の抗原刺激の際に堅調なCD8+M28z T細胞蓄積を容易にする。(D)抗原活性化されたCD4+ M28z活性化は、in vivoで堅調なCD8+M28z T細胞蓄積を容易にする。単離されたCD8+effLuc M28z T細胞を、CD4+M28z(n=6)またはCD4+対照形質導入のT細胞(n=6)のいずれかとともにMSLN+胸膜腫瘍保有マウスに対して胸膜内に投与して、連続的にイメージングした。1匹の代表的なマウス(1群あたりn=6;左側)は、CD4+M28zの存在下で、増大したCD8+M28z T細胞蓄積を示す。(E)CD8+CAR+T細胞の平均蓄積を、示した間隔で計算した(P値は示したとおり、16〜72時間の倍数増大を算出、1群あたりn=6)。(F)M28z CD4+の予備活性化は、CD8+増殖を、CD4+の同時の活性化と比較して増強する。ビーズソートしたCD8+MzまたはM28z T細胞を、対応するMzもしくはM28z CD4+または予備活性化されたCD4+T細胞(アッセイ24時間前にMSLN+腫瘍細胞上で活性化される)のいずれかとともに共存培養した。M28z CD4+の予備活性化は、CD8+の蓄積を、CD8+およびCD4+共刺激が増強するよりも大きい程度まで増強する。
図41A〜図41Eは、CD4+MSLN CAR+T細胞が、グランザイム/パーフォリン依存性である効率的な細胞溶解機能を実証することを示す。(A)CD4+M28z T細胞は、遅いがCD8+M28z T細胞と同様の細胞傷害性を示す。(B)CD28共刺激は、CD4+媒介性の細胞傷害性を増強する。(C)刺激されたCD4+M28z CAR+T細胞から得られたサイトカインリッチな上清は、CD8M28zおよびCD4M28z T細胞の両方の細胞傷害性を増強する。(D)CAR T細胞溶解性機能は、細胞傷害性顆粒の放出に依存する。バルク、CD4、またはCD8 M28zおよびMz T細胞を、18時間、キレート剤エチレングリコール四酢酸(EGTA)の有無のもとで共存培養した。(A〜D)ビーズ精製されたCD4+またはCD8+MzおよびM28z T細胞の細胞傷害性。(E、左側)CD4+CAR T細胞は、グランザイムBを発現するが、CD8+CAR T細胞と比較して、反応速度は遅延している。グランザイムBの細胞内FACS分析は、休止期のPBMC、PHA刺激のブラスト、ならびにM28z、MzおよびP28z T細胞(MSLN+で4時間または18時間刺激された)で行った。(E、右側)CD28共刺激は、グランザイムB発現を増強する。ヒストグラムは、MSLN+刺激18時間後の発現を示す。エラーバーは、±SEMに相当し、スチューデントt検定によって*P<0.05である。
図41A〜図41Eは、CD4+MSLN CAR+T細胞が、グランザイム/パーフォリン依存性である効率的な細胞溶解機能を実証することを示す。(A)CD4+M28z T細胞は、遅いがCD8+M28z T細胞と同様の細胞傷害性を示す。(B)CD28共刺激は、CD4+媒介性の細胞傷害性を増強する。(C)刺激されたCD4+M28z CAR+T細胞から得られたサイトカインリッチな上清は、CD8M28zおよびCD4M28z T細胞の両方の細胞傷害性を増強する。(D)CAR T細胞溶解性機能は、細胞傷害性顆粒の放出に依存する。バルク、CD4、またはCD8 M28zおよびMz T細胞を、18時間、キレート剤エチレングリコール四酢酸(EGTA)の有無のもとで共存培養した。(A〜D)ビーズ精製されたCD4+またはCD8+MzおよびM28z T細胞の細胞傷害性。(E、左側)CD4+CAR T細胞は、グランザイムBを発現するが、CD8+CAR T細胞と比較して、反応速度は遅延している。グランザイムBの細胞内FACS分析は、休止期のPBMC、PHA刺激のブラスト、ならびにM28z、MzおよびP28z T細胞(MSLN+で4時間または18時間刺激された)で行った。(E、右側)CD28共刺激は、グランザイムB発現を増強する。ヒストグラムは、MSLN+刺激18時間後の発現を示す。エラーバーは、±SEMに相当し、スチューデントt検定によって*P<0.05である。
図42A〜図42Cは、胸膜内に投与されたCD4+M28z CAR T細胞が、in vivoで単独で投与されたとき有効であり;CD8+M28z T細胞と比較して有効性の増強を媒介し;および長期の機能的な持続性を確立することを示す。(A)腫瘍負荷の進行を追跡するBLI。腫瘍注射の18日後、マウスには、3×105(3×)、1×105(1×)、または3×104(0.3×)個のCAR+T細胞のバルクのM28z(n=5)、ビーズでソートしたCD4+、CD8+M28z(n=7)、またはP28z(n=4)のいずれかを投与した。(B)カプラン・マイヤー生存曲線。全ての用量で、CD4+M28z CAR+T細胞は、CD8+CAR+T細胞と比較して有効であった。CD4+CAR+T細胞の抗腫瘍有効性は、ソートされていないCAR+T細胞のものと匹敵した。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001(スチューデントt検定による)。生のデータおよびP値は、補充的な物質で提供される。(C)腫瘍を再チャレンジされたマウスの腫瘍BLI。単回投与の3×105(3×)ソートされていない(バルク)M28zまたはCD4+ソートのM28z T細胞の胸膜内投与の196日後、1×106個のMSLN+腫瘍細胞を、腹腔に注射した。持続するCD4+M28z T細胞は、腫瘍増殖を妨げた。
図42A〜図42Cは、胸膜内に投与されたCD4+M28z CAR T細胞が、in vivoで単独で投与されたとき有効であり;CD8+M28z T細胞と比較して有効性の増強を媒介し;および長期の機能的な持続性を確立することを示す。(A)腫瘍負荷の進行を追跡するBLI。腫瘍注射の18日後、マウスには、3×105(3×)、1×105(1×)、または3×104(0.3×)個のCAR+T細胞のバルクのM28z(n=5)、ビーズでソートしたCD4+、CD8+M28z(n=7)、またはP28z(n=4)のいずれかを投与した。(B)カプラン・マイヤー生存曲線。全ての用量で、CD4+M28z CAR+T細胞は、CD8+CAR+T細胞と比較して有効であった。CD4+CAR+T細胞の抗腫瘍有効性は、ソートされていないCAR+T細胞のものと匹敵した。*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001(スチューデントt検定による)。生のデータおよびP値は、補充的な物質で提供される。(C)腫瘍を再チャレンジされたマウスの腫瘍BLI。単回投与の3×105(3×)ソートされていない(バルク)M28zまたはCD4+ソートのM28z T細胞の胸膜内投与の196日後、1×106個のMSLN+腫瘍細胞を、腹腔に注射した。持続するCD4+M28z T細胞は、腫瘍増殖を妨げた。
図43Aおよび図43Bは、メソセリン標的化CAR T細胞が、抗原特異的エフェクター機能を実証することを示す。(B)CAR T細胞エフェクター機能のin vitroにおける解析のために用いられる腫瘍細胞株のFACS分析。(C)M28z CAR T細胞は、2〜5倍多い量のTh1サイトカインを分泌した。
図44は、ここでは共存培養の18時間後に示される、休止期のPBMC、PHA刺激のブラスト、およびM28z CAR T細胞(MSLN+で刺激された)で行われた、グランザイムAおよびBの細胞内FACS分析を示す。
図45Aおよび図45Bは、CAR T細胞の細胞溶解性機能が、標的抗原発現のレベルに比例することを示す。(A)低(灰色)または高(黒)レベルのいずれかのメソセリンを用いて形質導入されたMSTO−211H中皮腫の腫瘍細胞による表面メソセリン発現。アイソタイプの染色を参照のために含む。(B)T細胞およびメソセリン低または高標的のいずれかの、示したエフェクター対標的比での18時間共存培養後、クロム放出によって測定されたM28z CAR T細胞の細胞溶解性機能。
図45Aおよび図45Bは、CAR T細胞の細胞溶解性機能が、標的抗原発現のレベルに比例することを示す。(A)低(灰色)または高(黒)レベルのいずれかのメソセリンを用いて形質導入されたMSTO−211H中皮腫の腫瘍細胞による表面メソセリン発現。アイソタイプの染色を参照のために含む。(B)T細胞およびメソセリン低または高標的のいずれかの、示したエフェクター対標的比での18時間共存培養後、クロム放出によって測定されたM28z CAR T細胞の細胞溶解性機能。
図46Aおよび図46Bは、フローサイトメトリーのゲーティングストラテジーを示す。(A)ソートされたCD4およびCD8 CAR T細胞を用いるin vitroおよびin vivoの分析に関しては、全ての試料を、純度が95%を超えるまでソートした。(B)T細胞表現型解析は、適切な非形質導入対照を用いて(CAR陽性のゲートを決定するため)、ならびにCD62LおよびCD45RAについてゲートを設定するためのアイソタイプ対照を用いて行った。
図47A〜図47Eは、CD28または4−1BB共刺激によるキメラ抗原受容体(CAR)が、等価なエフェクターサイトカイン分泌および最初の抗原刺激の際のin vitroの増殖を呈することが示す。(A)第1および第2世代のCAR。(B)メソセリン(MSLN)標的化CARは、CD3ζエンドドメインを、単独で(Mz、第1世代CAR)またはCD28(M28z)もしくは4−1BB(MBBz)共刺激ドメインと組み合わせて(第2世代CAR)含有する。前立腺特異的膜抗原(PSMA)指向性CAR(CD28共刺激(P28z)による)およびPSMA発現標的(PSMA+)は、実験中に陰性対照として含まれる。CYT、細胞質ドメイン;LS、リーダー配列LTR、長末端反復;SA、スプライスアクセプター;SD、スプライスドナー;TM、膜貫通。(C〜E)CAR形質導入のT細胞の抗原特異的エフェクター機能。(C)クロム放出アッセイで測定した、MSLN発現標的(MSLN+)(ただしPSMA+標的ではない)の溶解。(D)4−1BBおよびCD28共刺激は、MSLN+細胞とのCAR T細胞の共存培養後、Luminexアッセイによって評価されるように、サイトカイン分泌を増強する。(E)M28zおよびMBBz CARは、MSLN+細胞での刺激後、堅調なT細胞蓄積を促進する。データは、3つの反復の平均±SEM(C、E)に相当するか、または個々のポイントとしてプロットされる(D)。***P<0.001、共刺激されたCAR T細胞(M28zまたはMBBz)と第1世代の受容体(Mz)とを、スチューデントt検定によって比較して;有意差は、多重比較のためのボンフェローニ補正を用いて決定した。
図47A〜図47Eは、CD28または4−1BB共刺激によるキメラ抗原受容体(CAR)が、等価なエフェクターサイトカイン分泌および最初の抗原刺激の際のin vitroの増殖を呈することが示す。(A)第1および第2世代のCAR。(B)メソセリン(MSLN)標的化CARは、CD3ζエンドドメインを、単独で(Mz、第1世代CAR)またはCD28(M28z)もしくは4−1BB(MBBz)共刺激ドメインと組み合わせて(第2世代CAR)含有する。前立腺特異的膜抗原(PSMA)指向性CAR(CD28共刺激(P28z)による)およびPSMA発現標的(PSMA+)は、実験中に陰性対照として含まれる。CYT、細胞質ドメイン;LS、リーダー配列;LTR、長末端反復;SA、スプライスアクセプター;SD、スプライスドナー;TM、膜貫通。(C〜E)CAR形質導入のT細胞の抗原特異的エフェクター機能。(C)クロム放出アッセイで測定した、MSLN発現標的(MSLN+)(ただしPSMA+標的ではない)の溶解。(D)4−1BBおよびCD28共刺激は、MSLN+細胞とのCAR T細胞の共存培養後、Luminexアッセイによって評価されるように、サイトカイン分泌を増強する。(E)M28zおよびMBBz CARは、MSLN+細胞での刺激後、堅調なT細胞蓄積を促進する。データは、3つの反復の平均±SEM(C、E)に相当するか、または個々のポイントとしてプロットされる(D)。***P<0.001、共刺激されたCAR T細胞(M28zまたはMBBz)と第1世代の受容体(Mz)とを、スチューデントt検定によって比較して;有意差は、多重比較のためのボンフェローニ補正を用いて決定した。
図47A〜図47Eは、CD28または4−1BB共刺激によるキメラ抗原受容体(CAR)が、等価なエフェクターサイトカイン分泌および最初の抗原刺激の際のin vitroの増殖を呈することが示す。(A)第1および第2世代のCAR。(B)メソセリン(MSLN)標的化CARは、CD3ζエンドドメインを、単独で(Mz、第1世代CAR)またはCD28(M28z)もしくは4−1BB(MBBz)共刺激ドメインと組み合わせて(第2世代CAR)含有する。前立腺特異的膜抗原(PSMA)指向性CAR(CD28共刺激(P28z)による)およびPSMA発現標的(PSMA+)は、実験中に陰性対照として含まれる。CYT、細胞質ドメイン;LS、リーダー配列;LTR、長末端反復;SA、スプライスアクセプター;SD、スプライスドナー;TM、膜貫通。(C〜E)CAR形質導入のT細胞の抗原特異的エフェクター機能。(C)クロム放出アッセイで測定した、MSLN発現標的(MSLN+)(ただしPSMA+標的ではない)の溶解。(D)4−1BBおよびCD28共刺激は、MSLN+細胞とのCAR T細胞の共存培養後、Luminexアッセイによって評価されるように、サイトカイン分泌を増強する。(E)M28zおよびMBBz CARは、MSLN+細胞での刺激後、堅調なT細胞蓄積を促進する。データは、3つの反復の平均±SEM(C、E)に相当するか、または個々のポイントとしてプロットされる(D)。***P<0.001、共刺激されたCAR T細胞(M28zまたはMBBz)と第1世代の受容体(Mz)とを、スチューデントt検定によって比較して;有意差は、多重比較のためのボンフェローニ補正を用いて決定した。
図48A〜図48Cは、M28zおよびMBBz CAR T細胞で処置されたマウスが、高用量では腫瘍根絶を示すが、低用量の処置では、M28zで高率の腫瘍再発を生じることが示す。(A)in vivoの生物発光イメージング(BLI)を用いて、NOD/SCID/γcヌルマウスにおいて腫瘍負荷(ホタルルシフェラーゼ+MSLN+)をモニターした。胸膜腫瘍が樹立されたマウスを、単回投与の1e5(E:T 1:3,000)、8e4(E:T1:3,750)、または5e4(E:T 1:6,000)M28zまたはMBBz CAR T細胞を用いて処置した。(†)という記号は、マウスの死亡を示す。同じドナーを用いる2つの同様の実験を、例示のために組み合わせる。(B)マウスを、4e4 CAR T細胞(E:T 1:7,500)で処理した。第1世代のMz CARおよび陰性対照のP28zが含まれる。(C)カプラン・マイヤー生存解析であって、4e4 Mz(n=13、赤)、M28z(n=15、青)、MBBz(n=8、緑)、およびP28z(n=3、黒)CAR T細胞の胸膜内投与のin vivoの有効性を比較する。T細胞投与後の中央生存の日数。生存曲線を、ログランク検定を用いて解析した。*P<0.05;**P<0.01。
図48A〜図48Cは、M28zおよびMBBz CAR T細胞で処置されたマウスが、高用量では腫瘍根絶を示すが、低用量の処置では、M28zで高率の腫瘍再発を生じることが示す。(A)in vivoの生物発光イメージング(BLI)を用いて、NOD/SCID/γcヌルマウスにおいて腫瘍負荷(ホタルルシフェラーゼ+MSLN+)をモニターした。胸膜腫瘍が樹立されたマウスを、単回投与の1e5(E:T 1:3,000)、8e4(E:T1:3,750)、または5e4(E:T 1:6,000)M28zまたはMBBz CAR T細胞を用いて処置した。(†)という記号は、マウスの死亡を示す。同じドナーを用いる2つの同様の実験を、例示のために組み合わせる。(B)マウスを、4e4 CAR T細胞(E:T 1:7,500)で処理した。第1世代のMz CARおよび陰性対照のP28zが含まれる。(C)カプラン・マイヤー生存解析であって、4e4 Mz(n=13、赤)、M28z(n=15、青)、MBBz(n=8、緑)、およびP28z(n=3、黒)CAR T細胞の胸膜内投与のin vivoの有効性を比較する。T細胞投与後の中央生存の日数。生存曲線を、ログランク検定を用いて解析した。*P<0.05;**P<0.01。
図49A〜図49Cは、M28zおよびMBBz処置のマウスが、同様の早期かつ長期のCAR T細胞蓄積を示し、かつ腫瘍が進行しているM28z処置のマウスが、持続性のCAR T細胞を含有することが示す。(A)CD28および4−1BB共刺激は、腫瘍内のCAR T細胞蓄積を等しい程度まで増強する。左側のパネルは、単回投与の8e4CAR T細胞の投与後の腫瘍BLIの結果を示す。6日後、T細胞を腫瘍から収集した;xは、T細胞カウントがデータポイントとして示されるマウスを示す。右側のパネルは、腫瘍組織グラムあたりのCAR T細胞絶対数を示す(*P<0.05)。スチューデントt検定を行い、統計学的有意差は、多重比較のためにボンフェローニ補正を用いて決定した。(B)CD28および4−1BB共刺激は、脾臓で測定した場合、CAR T細胞の持続性を等しい程度まで増強する。脾臓細胞あたりのCAR T細胞絶対数は、胸膜内投与のCAR T細胞(8e4)の73日後に示される。左側のパネルは、腫瘍BLIの結果を示す;xは、T細胞カウントがデータポイントとして示されるマウスを示す(*P<0.05)。スチューデントt検定を行い、統計学的有意差は、多重比較のためにボンフェローニ補正を用いて決定した。(C)低用量のM28z T細胞(4e4)で処置したマウスは、脾臓および腫瘍中の持続性のCAR T細胞を伴う腫瘍再発を示す。左側のパネルは、腫瘍BLIの結果を示す。xで示されるマウス由来の脾臓および腫瘍を、収集して、FACs解析(中央パネル)およびT細胞定量化右側パネル)のために用いた。
図49A〜図49Cは、M28zおよびMBBz処置のマウスが、同様の早期かつ長期のCAR T細胞蓄積を示し、かつ腫瘍が進行しているM28z処置のマウスが、持続性のCAR T細胞を含有することが示す。(A)CD28および4−1BB共刺激は、腫瘍内のCAR T細胞蓄積を等しい程度まで増強する。左側のパネルは、単回投与の8e4CAR T細胞の投与後の腫瘍BLIの結果を示す。6日後、T細胞を腫瘍から収集した;xは、T細胞カウントがデータポイントとして示されるマウスを示す。右側のパネルは、腫瘍組織1グラムあたりのCAR T細胞絶対数を示す(*P<0.05)。スチューデントt検定を行い、統計学的有意差は、多重比較のためにボンフェローニ補正を用いて決定した。(B)CD28および4−1BB共刺激は、脾臓で測定した場合、CAR T細胞の持続性を等しい程度まで増強する。脾臓細胞あたりのCAR T細胞絶対数は、胸膜内投与のCAR T細胞(8e4)の73日後に示される。左側のパネルは、腫瘍BLIの結果を示す;xは、T細胞カウントがデータポイントとして示されるマウスを示す(*P<0.05)。スチューデントt検定を行い、統計学的有意差は、多重比較のためにボンフェローニ補正を用いて決定した。(C)低用量のM28z T細胞(4e4)で処置したマウスは、脾臓および腫瘍中の持続性のCAR T細胞を伴う腫瘍再発を示す。左側のパネルは、腫瘍BLIの結果を示す。xで示されるマウス由来の脾臓および腫瘍を、収集して、FACs解析(中央パネル)およびT細胞定量化(右側パネル)のために用いた。
図50A〜図50Dは、CAR T細胞は、in vivoの抗原曝露後に消耗されるが、MBBz CAR T細胞は、優先的に、エフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を保持することを示す。(A)CAR T細胞の胸膜内投与の6日後、M28zおよびMBBz CAR T細胞を、腫瘍および脾臓から単離して、ex vivoの抗原刺激に供した。(B)ex vivo刺激の際のクロム放出アッセイによって、M28zにおける減少、ただし持続的なMBBz細胞溶解性機能が実証される(E:T比 1:5)(C)サイトカイン分泌測定は、CAR T細胞によるエフェクターサイトカイン分泌の低下を示すが、MBBz CAR T細胞は、分泌をさらによく保持できる。(D)収集されたCAR T細胞によるGzB、IFN−γ、およびIL−2発現のRT−PCR測定は、パネル(A)および(B)におけるタンパク質レベル測定とよく相関する。データは、in vitroの未刺激のM28z CAR T細胞のmRNA発現に対する倍数変化を示す。データは1条件あたり3つの個々のウェルの平均±SEMに相当する。スチューデントt検定を行って、統計学的有意差を、多重比較についてボンフェローニ補正を用いて決定した(*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001)。結果を、2つの実験の各々に関して用いられるマウスの2つの別のコホートで再現する。
図50A〜図50Dは、CAR T細胞は、in vivoの抗原曝露後に消耗されるが、MBBz CAR T細胞は、優先的に、エフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を保持することを示す。(A)CAR T細胞の胸膜内投与の6日後、M28zおよびMBBz CAR T細胞を、腫瘍および脾臓から単離して、ex vivoの抗原刺激に供した。(B)ex vivo刺激の際のクロム放出アッセイによって、M28zにおける減少、ただし持続的なMBBz細胞溶解性機能が実証される(E:T比 1:5)(C)サイトカイン分泌測定は、CAR T細胞によるエフェクターサイトカイン分泌の低下を示すが、MBBz CAR T細胞は、分泌をさらによく保持できる。(D)収集されたCAR T細胞によるGzB、IFN−γ、およびIL−2発現のRT−PCR測定は、パネル(A)および(B)におけるタンパク質レベル測定とよく相関する。データは、in vitroの未刺激のM28z CAR T細胞のmRNA発現に対する倍数変化を示す。データは1条件あたり3つの個々のウェルの平均±SEMに相当する。スチューデントt検定を行って、統計学的有意差を、多重比較についてボンフェローニ補正を用いて決定した(*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001)。結果を、2つの実験の各々に関して用いられるマウスの2つの別のコホートで再現する。
図50A〜図50Dは、CAR T細胞は、in vivoの抗原曝露後に消耗されるが、MBBz CAR T細胞は、優先的に、エフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を保持することを示す。(A)CAR T細胞の胸膜内投与の6日後、M28zおよびMBBz CAR T細胞を、腫瘍および脾臓から単離して、ex vivoの抗原刺激に供した。(B)ex vivo刺激の際のクロム放出アッセイによって、M28zにおける減少、ただし持続的なMBBz細胞溶解性機能が実証される(E:T比 1:5)(C)サイトカイン分泌測定は、CAR T細胞によるエフェクターサイトカイン分泌の低下を示すが、MBBz CAR T細胞は、分泌をさらによく保持できる。(D)収集されたCAR T細胞によるGzB、IFN−γ、およびIL−2発現のRT−PCR測定は、パネル(A)および(B)におけるタンパク質レベル測定とよく相関する。データは、in vitroの未刺激のM28z CAR T細胞のmRNA発現に対する倍数変化を示す。データは1条件あたり3つの個々のウェルの平均±SEMに相当する。スチューデントt検定を行って、統計学的有意差を、多重比較についてボンフェローニ補正を用いて決定した(*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001)。結果を、2つの実験の各々に関して用いられるマウスの2つの別のコホートで再現する。
図51A〜図51Eは、CAR T細胞がin vitroでの反復性の抗原刺激の際に消耗されるが、MBBz CAR T細胞は、優先的に、エフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を、in vitroでかつin vivoにおける腫瘍再チャレンジの際に保持することを示す。(A)M28zおよびMBBz CAR T細胞の両方とも、反復性の抗原刺激の際にin vitroで増殖能力を保持している。T細胞をまた、細胞傷害性について、クロム放出アッセイによって、およびサイトカイン分泌について、Luminexアッセイによって試験した(B〜D)。(B)(左側)CAR T細胞は、第1刺激で等しい殺傷を、および反復性の抗原刺激の際に細胞溶解性機能の喪失を示したが、MBBz CAR T細胞は、クロム放出アッセイによって測定した場合、細胞溶解性機能をさらによく保持できる。(C)CD107a発現によって測定される細胞傷害性顆粒放出(第3刺激で示される)は、クロム放出アッセイと関連する(B)。データは、未刺激のCAR T細胞のCD107aMFIに対する倍数変化の平均±SD(三連)を示す。(D)サイトカイン分泌測定は、同様に、反復性の抗原遭遇の際にCAR T細胞エフェクター機能の喪失を示す;ここでも、MBBz CAR T細胞は、それらの機能をさらによく保存できる。(E)等しく持続するが、MBBz CAR T細胞は、優れた機能的な持続性を示す。胸膜腫瘍根絶(単回投与の1e5 CAR T細胞の後)の28日後、1e6 MSLN+腫瘍細胞を、胸膜腔に注射した(腫瘍再チャレンジ)。MBBz CAR T細胞は、全てのマウスで腫瘍増殖を妨げたが、腫瘍増殖および死亡が、M28z CAR T細胞で最初に処置した4匹のマウスのうち2匹で観察された。スチューデントt検定を行い、統計学的有意差は、ボンフェローニ補正を用いて決定した(*P<0.05;***P<0.001)。データは、3つの反復の平均±SEMを示すか、または個々のポイントとしてプロットする。
図51A〜図51Eは、CAR T細胞がin vitroでの反復性の抗原刺激の際に消耗されるが、MBBz CAR T細胞は、優先的に、エフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を、in vitroでかつin vivoにおける腫瘍再チャレンジの際に保持することを示す。(A)M28zおよびMBBz CAR T細胞の両方とも、反復性の抗原刺激の際にin vitroで増殖能力を保持している。T細胞をまた、細胞傷害性について、クロム放出アッセイによって、およびサイトカイン分泌について、Luminexアッセイによって試験した(B〜D)。(B)(左側)CAR T細胞は、第1刺激で等しい殺傷を、および反復性の抗原刺激の際に細胞溶解性機能の喪失を示したが、MBBz CAR T細胞は、クロム放出アッセイによって測定した場合、細胞溶解性機能をさらによく保持できる。(C)CD107a発現によって測定される細胞傷害性顆粒放出(第3刺激で示される)は、クロム放出アッセイと関連する(B)。データは、未刺激のCAR T細胞のCD107a MFIに対する倍数変化の平均±SD(三連)を示す。(D)サイトカイン分泌測定は、同様に、反復性の抗原遭遇の際にCAR T細胞エフェクター機能の喪失を示す;ここでも、MBBz CAR T細胞は、それらの機能をさらによく保存できる。(E)等しく持続するが、MBBz CAR T細胞は、優れた機能的な持続性を示す。胸膜腫瘍根絶(単回投与の1e5 CAR T細胞の後)の28日後、1e6 MSLN+腫瘍細胞を、胸膜腔に注射した(腫瘍再チャレンジ)。MBBz CAR T細胞は、全てのマウスで腫瘍増殖を妨げたが、腫瘍増殖および死亡が、M28z CAR T細胞で最初に処置した4匹のマウスのうち2匹で観察された。スチューデントt検定を行い、統計学的有意差は、ボンフェローニ補正を用いて決定した(*P<0.05;***P<0.001)。データは、3つの反復の平均±SEMを示すか、または個々のポイントとしてプロットする。
図51A〜図51Eは、CAR T細胞がin vitroでの反復性の抗原刺激の際に消耗されるが、MBBz CAR T細胞は、優先的に、エフェクターサイトカイン分泌および細胞傷害性を、in vitroでかつin vivoにおける腫瘍再チャレンジの際に保持することを示す。(A)M28zおよびMBBz CAR T細胞の両方とも、反復性の抗原刺激の際にin vitroで増殖能力を保持している。T細胞をまた、細胞傷害性について、クロム放出アッセイによって、およびサイトカイン分泌について、Luminexアッセイによって試験した(B〜D)。(B)(左側)CAR T細胞は、第1刺激で等しい殺傷を、および反復性の抗原刺激の際に細胞溶解性機能の喪失を示したが、MBBz CAR T細胞は、クロム放出アッセイによって測定した場合、細胞溶解性機能をさらによく保持できる。(C)CD107a発現によって測定される細胞傷害性顆粒放出(第3刺激で示される)は、クロム放出アッセイと関連する(B)。データは、未刺激のCAR T細胞のCD107a MFIに対する倍数変化の平均±SD(三連)を示す。(D)サイトカイン分泌測定は、同様に、反復性の抗原遭遇の際にCAR T細胞エフェクター機能の喪失を示す;ここでも、MBBz CAR T細胞は、それらの機能をさらによく保存できる。(E)等しく持続するが、MBBz CAR T細胞は、優れた機能的な持続性を示す。胸膜腫瘍根絶(単回投与の1e5 CAR T細胞の後)の28日後、1e6 MSLN+腫瘍細胞を、胸膜腔に注射した(腫瘍再チャレンジ)。MBBz CAR T細胞は、全てのマウスで腫瘍増殖を妨げたが、腫瘍増殖および死亡が、M28z CAR T細胞で最初に処置した4匹のマウスのうち2匹で観察された。スチューデントt検定を行い、統計学的有意差は、ボンフェローニ補正を用いて決定した(*P<0.05;***P<0.001)。データは、3つの反復の平均±SEMを示すか、または個々のポイントとしてプロットする。
図52A〜図52Fは、PD−1受容体を示し、そのリガンドはin vivoで上方制御される。(A)腫瘍浸潤性のM28zおよびMBBz CAR T細胞は、それらの投与6日後に阻害性受容体を発現するが、MBBz CAR T細胞は、低レベルのPD−1を発現する。(B)胸膜内投与6日後の腫瘍浸潤性CAR T細胞(TIL)のPD−1受容体発現の平均蛍光強度(MFI)。(C)胸膜内投与6日後の腫瘍浸潤性CAR T細胞のCD4およびCD8サブセットにおけるPD−1のmRNAの相対的発現。データは、未刺激のM28z T細胞のPD−1のmRNA発現に対する倍数変化で示す。(D)進行性腫瘍から単離された腫瘍浸潤性M28z CAR T細胞は、阻害性受容体PD−1、Tim−3、およびLag−3を発現する。(E)M28z CAR T細胞で処置されたマウスから収集した単独細胞の腫瘍懸濁物は、高レベルのPD−1結合性リガンドを発現する。(F)in vitro培養の中皮腫の腫瘍細胞は、PD−1受容体に関するリガンド(PD−L1、PD−L2)を発現し、発現はさらに、IFN−γおよびTNF−αとともに24時間インキュベーションした後に上方制御される。
図52A〜図52Fは、PD−1受容体を示し、そのリガンドはin vivoで上方制御される。(A)腫瘍浸潤性のM28zおよびMBBz CAR T細胞は、それらの投与6日後に阻害性受容体を発現するが、MBBz CAR T細胞は、低レベルのPD−1を発現する。(B)胸膜内投与6日後の腫瘍浸潤性CAR T細胞(TIL)のPD−1受容体発現の平均蛍光強度(MFI)。(C)胸膜内投与6日後の腫瘍浸潤性CAR T細胞のCD4およびCD8サブセットにおけるPD−1のmRNAの相対的発現。データは、未刺激のM28z T細胞のPD−1のmRNA発現に対する倍数変化で示す。(D)進行性腫瘍から単離された腫瘍浸潤性M28z CAR T細胞は、阻害性受容体PD−1、Tim−3、およびLag−3を発現する。(E)M28z CAR T細胞で処置されたマウスから収集した単独細胞の腫瘍懸濁物は、高レベルのPD−1結合性リガンドを発現する。(F)in vitro培養の中皮腫の腫瘍細胞は、PD−1受容体に関するリガンド(PD−L1、PD−L2)を発現し、発現はさらに、IFN−γおよびTNF−αとともに24時間インキュベーションした後に上方制御される。
図52A〜図52Fは、PD−1受容体を示し、そのリガンドはin vivoで上方制御される。(A)腫瘍浸潤性のM28zおよびMBBz CAR T細胞は、それらの投与6日後に阻害性受容体を発現するが、MBBz CAR T細胞は、低レベルのPD−1を発現する。(B)胸膜内投与6日後の腫瘍浸潤性CAR T細胞(TIL)のPD−1受容体発現の平均蛍光強度(MFI)。(C)胸膜内投与6日後の腫瘍浸潤性CAR T細胞のCD4およびCD8サブセットにおけるPD−1のmRNAの相対的発現。データは、未刺激のM28z T細胞のPD−1のmRNA発現に対する倍数変化で示す。(D)進行性腫瘍から単離された腫瘍浸潤性M28z CAR T細胞は、阻害性受容体PD−1、Tim−3、およびLag−3を発現する。(E)M28z CAR T細胞で処置されたマウスから収集した単独細胞の腫瘍懸濁物は、高レベルのPD−1結合性リガンドを発現する。(F)in vitro培養の中皮腫の腫瘍細胞は、PD−1受容体に関するリガンド(PD−L1、PD−L2)を発現し、発現はさらに、IFN−γおよびTNF−αとともに24時間インキュベーションした後に上方制御される。
図53A〜図53Dは、PD−L1がCAR T細胞エフェクター機能を阻害することを示す。(A)3T3線維芽細胞を形質導入して、メソセリン単独を発現するか(MSLN+、左側)またはPD−L1に加えてMSLNを共発現する(MSLN+PD−L1+、右側)。(B〜D)M28zおよびMBBz CAR T細胞エフェクター機能を、3T3 MSLN+またはMSLN+PD−L1+標的で刺激した後に評価した。PD−L1は、反復性の抗原刺激の際にM28zおよびMBBz CAR T細胞蓄積(B)、MSLN+PD−L1+腫瘍細胞での2回の刺激後の細胞溶解性機能(C)、ならびに第1刺激の際のTh1エフェクターサイトカイン分泌(D)を阻害する。データは、3回の反復の平均±SEMを示すか、または個々のポイントとしてプロットする。
図53A〜図53Dは、PD−L1がCAR T細胞エフェクター機能を阻害することを示す。(A)3T3線維芽細胞を形質導入して、メソセリン単独を発現するか(MSLN+、左側)またはPD−L1に加えてMSLNを共発現する(MSLN+PD−L1+、右側)。(B〜D)M28zおよびMBBz CAR T細胞エフェクター機能を、3T3 MSLN+またはMSLN+PD−L1+標的で刺激した後に評価した。PD−L1は、反復性の抗原刺激の際にM28zおよびMBBz CAR T細胞蓄積(B)、MSLN+PD−L1+腫瘍細胞での2回の刺激後の細胞溶解性機能(C)、ならびに第1刺激の際のTh1エフェクターサイトカイン分泌(D)を阻害する。データは、3回の反復の平均±SEMを示すか、または個々のポイントとしてプロットする。
図54は、Mz、M28z、およびMBBz CARを発現するためのヒトT細胞の効率的なレトロウイルス形質導入を示す。(上部)示されるのは、遺伝子導入4日後の代表的なFACS分析である。蛍光マイナスワン染色を用いて、live/dead染色によって生きていない細胞を除外した後に陽性ゲートをセットした。全ての実験では、50%〜70%のCAR形質導入効率を有するT細胞を用い;T細胞群の間の形質導入パーセンテージは、お互いの5%内であった。(下側)CD4+およびCD8+の両方のT細胞サブセットを効率的に形質導入した。CAR T細胞のゲーティング後のCD4+およびCD8+のパーセンテージを示す。
図55は、MBBz CAR T細胞が、M28z CAR T細胞と比較してより消耗された、より強力な表現型を発現することを示す。4−1BBおよびCD28共刺激T細胞を、反復性の抗原刺激で増殖させ、mRNAを抽出して第3刺激20時間後RT−PCR解析に供した。データは、CD4+未形質導入のT細胞のmRNA発現に対する倍数変化で示される。MBBz CAR T細胞は、より高レベルのEOMES(Eomesodermin)およびTBX21(T−bet)、ならびに低レベルのPDCD1(PD−1)およびFOXP3(Foxp3)を発現する。全ての比較はP<0.001で有意であった。結果は、異なるドナーを用いる3つの別の実験で同様であった。
図56は、M28zおよびMBBz CAR T細胞は、他の阻害性受容体とともにPD−1を共発現することを示す。腫瘍浸潤性のM28zおよびMBBz CAR T細胞は、胸膜腫瘍保有マウスに対する胸膜内投与6日後に収集した。細胞を、PD−1の抗体およびLag−3(左側)またはTim−3(右側)のいずれかを用いて同時染色して、フローサイトメトリーによって分析した。アイソタイプ染色対照(上部)を用いて陽性のゲートを確立した。
図56は、M28zおよびMBBz CAR T細胞は、他の阻害性受容体とともにPD−1を共発現することを示す。腫瘍浸潤性のM28zおよびMBBz CAR T細胞は、胸膜腫瘍保有マウスに対する胸膜内投与6日後に収集した。細胞を、PD−1の抗体およびLag−3(左側)またはTim−3(右側)のいずれかを用いて同時染色して、フローサイトメトリーによって分析した。アイソタイプ染色対照(上部)を用いて陽性のゲートを確立した。
図57は、種々のがんおよび正常細胞でのMSLN発現を示す。
図57は、種々のがんおよび正常細胞でのMSLN発現を示す。
図58は、種々のがんおよび正常細胞での1細胞あたりのMSLN分子の定量を示す。
図59は、種々のがんおよび正常細胞でのmRNA MSLN発現レベルを示す。
図60は、種々のがんおよび正常細胞でのM28z CAR T細胞の細胞傷害性を示す。
図61は、外因性のIL−2の存在下での反復性の抗原刺激後のCAR T細胞蓄積を示す。
図62は、外因性のIL−2の非存在下での反復性の抗原刺激後のCAR T細胞蓄積を示す。
図63A〜図63Cは、肺がんモデルにおけるM28z CAR T細胞のin vivoの有効性を示す。(A)試験設計。(B)生物発光による腫瘍増殖解析(BLI)。(C)生存解析。
図63A〜図63Cは、肺がんモデルにおけるM28z CAR T細胞のin vivoの有効性を示す。(A)試験設計。(B)生物発光による腫瘍増殖解析(BLI)。(C)生存解析。
図64A〜図64Dは、肺がんモデルにおけるM28z CAR T細胞のin vivoの蓄積を示す。(A)試験設計。(B〜D)BLIによるT細胞蓄積解析。
図64A〜図64Dは、肺がんモデルにおけるM28z CAR T細胞のin vivoの蓄積を示す。(A)試験設計。(B〜D)BLIによるT細胞蓄積解析。

0025

発明の詳細な説明
ここで開示される主題は、概して、メソセリン標的化キメラ抗原受容体(CAR)を提供する。1つの限定されない例では、CARは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトメソセリンと、約1nM〜約25nMの結合アフィニティー(Kd)で特異的に結合する。ここで開示される主題はまた、メソセリン標的化CARを発現する免疫応答性細胞(例えば、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、制御性T細胞、ヒト胚幹細胞およびリンパ球系細胞に分化し得る多能性幹細胞)ならびに新生物および他の病理を治療するためのこのような免疫応答性細胞を使用する方法を提供する。悪性細胞は、免疫認識および排除から自身を保護する一連機序発達させる。本アプローチは、腫瘍根絶のために腫瘍微小環境内に免疫原性を提供し、従来の養子T細胞療法を上回る大幅な進歩に相当する。

0026

I.定義
特に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される用語の多くの一般的な定義を当業者に提供する:Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988);The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991);およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において、以下の用語は、特に別に明記されない限り、以下のそれらに帰する意味を有する。

0027

本明細書において、用語「約」または「およそ」は、当業者によって決定されるような特定の値の許容される誤差範囲内を意味し、これは、幾分かは、値が測定されるか、または決定される方法、すなわち、測定系の制限に応じて変わる。例えば、「約」は、当技術分野における実施あたり、3または3を超える標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大20%、好ましくは最大10%、より好ましくは最大5%、より好ましくはさらに最大1%の範囲を意味し得る。あるいは、特に、生物学的系またはプロセスに関して、この用語は、値の1桁以内、好ましくは5倍以内、より好ましくは2倍以内を意味し得る。

0028

本明細書において、用語「細胞集団」は、同様のまたは異なる表現型を発現する少なくとも2つの細胞の群を指す。限定されない例では、細胞集団は、同様のまたは異なる表現型を発現する、少なくとも約10、少なくとも約100、少なくとも約200、少なくとも約300、少なくとも約400、少なくとも約500、少なくとも約600、少なくとも約700、少なくとも約800、少なくとも約900、少なくとも約1000個の細胞を含み得る。

0029

本明細書において、用語「抗体」は、インタクト抗体分子だけでなく、免疫原結合能力を保持する抗体分子の断片も意味する。このような断片はまた、当技術分野で周知であり、in vitroおよびin vivoの両方で常用されている。したがって、本明細書において、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子だけでなく、周知の活性断片F(ab’)2およびFabも意味する。インタクトな抗体のFe断片を欠くF(ab’)2およびFab断片は、循環からより迅速に消え、より少ない、インタクトな抗体の非特異的組織結合を有し得る(Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316-325 (1983))。本発明の抗体は、全天然抗体、二重特異性抗体キメラ抗体、Fab、Fab’、一本鎖領域断片(scFv)、融合ポリペプチドおよび非従来型抗体を含む。

0030

本明細書において、用語「一本鎖可変断片」または「scFv」は、VH::VLヘテロ二量体を形成するように共有結合によって連結している免疫グロブリン(例えば、マウスまたはヒト)の重鎖(VH)および軽鎖(VL)の可変領域の融合タンパク質である。重鎖(VH)および軽鎖(VL)は、直接連結しているか、またはVHのN末端とVLのC末端、もしくはVHのC末端とVLのN末端をつなぐペプチドをコードするリンカー(例えば、10、15、20、25個のアミノ酸)によって連結されている。リンカーは、普通、可動性のためにグリシン、ならびに溶解度のためにセリンまたはトレオニンに富んでいる。リンカーは、細胞外抗原結合性ドメインの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を連結し得る。1つの限定されない例では、リンカーは、以下に提供されるような配列番号17に示される配列を有するアミノ酸を含む。
GGGGSGGGGSGGGGS[配列番号17]。

0031

一実施形態では、配列番号17のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号18に示されている:
GGAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGCAGTGGAGGTGGTGGGTCA[配列番号18]。

0032

別の実施形態では、配列番号17のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号19に示されている。
GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCA[配列番号19]。

0033

定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、scFvタンパク質は、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。一本鎖Fvポリペプチド抗体は、Huston, et al.(Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883, 1988)によって記載されるようなVHおよびVLをコードする配列を含む核酸から発現され得る。米国特許第5,091,513号、同第5,132,405号および同第4,956,778号ならびに米国特許公開第20050196754号および同第20050196754号も参照のこと。阻害活性を有するアンタゴニストscFvが記載されている(例えば、Zhao et al., Hyrbidoma (Larchmt) 2008 27(6):455-51;Peter et al., J Cachexia Sarcopenia Muscle 2012 August 12;Shieh et al., J Imunol 2009 183(4):2277-85;Giomarelli et al., Thromb Haemost 2007 97(6):955-63;Fife eta., J Clin Invst 2006 116(8):2252-61;Brocks et al., Immunotechnology 1997 3(3):173-84;Moosmayer et al., Ther Immunol 1995 2(10:31-40)を参照のこと。刺激活性を有するアゴニストscFvが記載されている(例えば、Peter et al., J Bioi Chern 2003 25278(38):36740-7;Xie et al., Nat Biotech 1997 15(8):768-71;Ledbetter et al., Crit Rev Immunol 1997 17(5-6):427-55;Ho et al., BioChim Biophys Acta 2003 1638(3):257-66を参照のこと)。

0034

本明細書において、「F(ab)」は、抗原と結合するが、一価であり、Fc部分を有さない抗体構造の断片を指し、例えば、酵素パパインによって消化された抗体は、2つのF(ab)断片およびFc断片(例えば、重(H)鎖定常領域;抗原と結合しないFc領域)をもたらす。

0035

本明細書において、「F(ab’)2」は、全IgG抗体ペプシン消化によって生じた抗体断片を指し、この断片は、2つの抗原結合(ab’)(二価)領域を有し、各(ab’)領域は、2つの別個のアミノ酸鎖を含み、H鎖および軽(L)鎖の一部は、抗原を結合するためにS−S結合によって連結しており、残りのH鎖部分が一緒に連結している。「F(ab’)2」断片は、2つの個別のFab’断片に分けることができる。

0036

本明細書において、用語「ベクター」は、適切な制御エレメント会合すると複製可能であり、遺伝子配列細胞中に導入できる、プラスミドファージトランスポゾンコスミド染色体ウイルスビリオンなどの任意の遺伝要素を指す。したがって、この用語は、クローニングおよび発現媒体ならびにウイルスベクターおよびプラスミドベクターを含む。

0037

本明細書において、用語「発現ベクター」は、特定の宿主生物中に、所望のコード配列および作動可能に連結されたコード配列の発現のために必要な適当な核酸配列を含有する組換え核酸配列、すなわち、組換えDNA分子を指す。原核生物における発現のために必要な核酸配列は、普通、プロモーターオペレーター(必要に応じて)およびリボソーム結合部位を含み、他の配列と一緒であることが多い。真核細胞は、プロモーター、エンハンサーならびに終結およびポリアデニル化シグナルを利用することがわかっている。

0038

本明細書において、用語「アフィニティー」は、結合力尺度を意味する。理論に捉われるものではないが、アフィニティーは、抗体結合部位および抗原決定基の間の立体化学的かみ合いの親密性、それらの間の接触面積の大きさならびに荷電基および疎水基の分布に応じて変わる。アフィニティーは、用語「アビディティー」も含み、これは、可逆性複合体の形成後の抗原−抗体結合の力を指す。アフィニティーを算出するための結合実験の使用を含む、抗体の抗原に対するアフィニティーを算出するための方法は、当技術分野で公知である。機能アッセイ(例えば、フローサイトメトリーアッセイ)における抗体活性もまた、抗体アフィニティーを反映する。抗体およびアフィニティーは、表現型によって特徴付けられ、機能アッセイ(例えば、フローサイトメトリーアッセイ)を使用して比較され得る。

0039

本発明の方法において有用な核酸分子として、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードする任意の核酸分子が挙げられる。このような核酸分子は、内因性核酸配列と100%同一であることを必要としないが、通常、実質的な同一性を示す。内因性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、通常、二本鎖核酸分子の少なくとも一方の鎖とハイブリダイズ可能である。「ハイブリダイズする」は、ストリンジェンシーの種々の条件下で、相補的ポリヌクレオチド配列(例えば、本明細書において記載される遺伝子)またはその一部の間で、対を形成して、二本鎖分子を形成することを意味する(例えば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) MethodsEnzymol. 152:399;Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照のこと)。

0040

例えば、ストリンジェント塩濃度は、通常、約750mM NaClおよび75mMクエン酸三ナトリウム未満、好ましくは約500mM NaClおよび50mMクエン酸三ナトリウム未満、より好ましくは約250mM NaClおよび25mMクエン酸三ナトリウム未満となる。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、有機溶媒、例えば、ホルムアミド不在下で得ることができ、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、少なくとも約35%のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約50%のホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約30℃、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含む。ハイブリダイゼーション時間、界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の濃度などのさらなるパラメータを変えることならびにキャリアーDNAを含めることまたは排除することは、当業者に周知である。必要に応じて、これらの種々の条件を組み合わせることによって種々のレベルのストリンジェンシーが達成される。好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、750mM NaCl、75mMクエン酸三ナトリウムおよび1%SDS中、30℃で起こる。より好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、500mM NaCl、50mMクエン酸三ナトリウム、1%SDS、35%ホルムアミドおよび100μg/ml変性サケ精子DNA(ssDNA)中、37℃で起こる。最も好ましい実施形態では、ハイブリダイゼーションは、250mM NaCl、25mMクエン酸三ナトリウム、1%SDS、50%ホルムアミドおよび200μg/ml ssDNA中、42℃で起こる。これらの条件に対する有用な変動は、当業者にとって容易に明らかであろう。

0041

ほとんどの適用について、ハイブリダイゼーションに続く洗浄ステップもまた、ストリンジェンシーを変える。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度によって、および温度によって規定され得る。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させることによって、または温度を増大することによって増大することができる。例えば、洗浄ステップのストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約30mM NaClおよび3mMクエン酸三ナトリウム未満、最も好ましくは約15mM NaClおよび1.5mMクエン酸三ナトリウム未満となる。洗浄ステップのストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約25℃、より好ましくは少なくとも約42℃、さらにより好ましくは少なくとも約68℃の温度を含むであろう。好ましい実施形態では、洗浄ステップは、30mM NaCl、3mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1%SDS中、25℃で起こる。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1%SDS中、42℃で起こる。より好ましい実施形態では、洗浄ステップは、15mM NaCl、1.5mMクエン酸三ナトリウムおよび0.1%SDS中、68℃で起こる。これらの条件に対するさらなる変動は、当業者には容易に明らかであろう。ハイブリダイゼーション技術は、当業者に周知であり、例えば、Benton and Davis (Science 196:180, 1977);Grunstein and Rogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975);Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001);Berger and Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York);およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されている。

0042

「実質的に同一の」は、参照アミノ酸配列(例えば、本明細書に記載されるアミノ酸配列のいずれか1種)または核酸配列(例えば、本明細書において記載される核酸配列のいずれか1種)に対して少なくとも50%の同一性を示す、ポリペプチドまたは核酸分子を意味する。好ましくは、このような配列は、比較のために使用される配列に対してアミノ酸レベルまたは核酸で、少なくとも60%、より好ましくは80%または85%、より好ましくは90%、95%またはさらには99%同一である。

0043

配列同一性は、通常、配列解析ソフトウェア(例えば、Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、1710 University Avenue、Madison、Wis.53705の配列解析ソフトウェアパッケージ、BLAST、BESTFIT、GAPまたはPILEUP/PRETTYBOXプログラム)を使用して測定される。このようなソフトウェアは、種々の置換欠失および/または他の修飾に相同性の程度を割り当てることによって同一または同様の配列をマッチさせる。同一性の程度を決定する例示的アプローチでは、BLASTプログラムが使用され得、密接に関連する配列を示すe−3からe−100の間の確率スコアを有する。

0044

本明細書において、用語「類似体」は、参照ポリペプチドまたは核酸分子の機能を有する構造的に関連するポリペプチドまたは核酸分子を指す。

0045

本明細書において、用語「リガンド」は、受容体と結合する分子を指す。特に、リガンドは、別の細胞上の受容体と結合し、細胞対細胞認識および/または相互作用を可能にする。

0046

本明細書において、用語「疾患」は、細胞、組織または臓器の正常な機能に損傷を与える、またはそれに干渉する任意の状態または障害を指す。疾患の例として、細胞の新生物または病原体感染が挙げられる。

0047

本明細書において、用語「有効量」は、治療効果を有するのに十分な量を指す。一実施形態では、「有効量」は、新生物の継続した増殖、成長または転移(例えば、浸潤または遊走)を停止、寛解または阻害するのに十分な量である。

0048

本明細書において、用語「内因性」は、細胞または組織において通常発現される核酸分子またはポリペプチドを指す。

0049

本明細書において、用語「外因性」は、細胞中に内因的に存在しないか、または過剰発現された場合に得られる機能効果を達成するのに十分なレベルで存在しない核酸分子またはポリペプチドを指す。したがって、用語「外因性」は、外来、異種および過剰発現された核酸分子およびポリペプチドなどの、細胞において発現される任意の組換え核酸分子またはポリペプチドを包含する。

0050

本明細書において、用語「異種核酸分子またはポリペプチド」は、細胞または細胞から得られた試料中に通常は存在しない核酸分子(例えば、cDNA、DNAまたはRNA分子)またはポリペプチドを指す。この核酸は、別の生物に由来するものであり得るか、または例えば、細胞もしくは試料において通常は発現されないmRNA分子であり得る。

0051

本明細書において、用語「免疫応答性細胞」は、免疫応答において機能する細胞またはその前駆体もしくは後代を指す。

0052

本明細書において、用語「調節する」は、正または負に変更することを指す。例示的調節として、約1%、約2%、約5%、約10%、約25%、約50%、約75%または約100%の変化が挙げられる。

0053

本明細書において、用語「増大する」は、これらに限定されないが、約5%、約10%、約25%、約30%、約50%、約75%または約100%正に変更することを含め、少なくとも約5%正に変更することを指す。

0054

本明細書において、用語「低減する」は、これらに限定されないが、約5%、約10%、約25%、約30%、約50%、約75%または約100%負に変更することを含め、少なくとも約5%負に変更することを指す。

0055

本明細書において、用語「単離された細胞」は、細胞に天然に付随する分子成分および/または細胞成分から分離されている細胞を指す。

0056

本明細書において、用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」は、その天然状態において見られるような、それに通常付随する成分を、変動する程度に含まない材料を指す。「単離する」は、元の供給源または周囲からの分離の程度を示す。「精製する」は、単離よりも高い分離の程度を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、任意の不純物が、タンパク質の生物学的特性に実質的に影響を及ぼさず、他の有害な結果を引き起こさないよう、他の材料を十分に含まない。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えDNA技術によって製造された場合には、細胞性材料ウイルス材料もしくは培養培地、または化学的に合成された場合には、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない場合に精製されている。純度および均一性は、通常、分析的化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高性能液体クロマトグラフィーを使用して決定される。用語「精製された」は、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲルにおいて本質的に1つのバンドを生じさせることを示し得る。修飾、例えば、リン酸化またはグリコシル化に付され得るタンパク質については、種々の修飾が種々の単離されたタンパク質を生じさせ得、これは、別個に精製され得る。

0057

本明細書において、用語「病原体」は、疾患を引き起こすことが可能なウイルス、細菌、真菌寄生生物または原虫を指す。

0058

例示的ウイルスとして、これらに限定されないが、Retroviridae(例えば、HIV−1(HDTV−III、LAVEもしくはHTLV−III/LAVとも称される、またはHIV−III、およびHIV−LPなどの他の分離菌などのヒト免疫不全ウイルス;Picornaviridae(例えば、ポリオウイルスA型肝炎ウイルスエンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルスエコーウイルス);Calciviridae(例えば、胃腸炎を引きおこす株);Togaviridae(例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス);Flaviviridae(例えば、デングウイルス脳炎ウイルス黄熱病ウイルス);Coronaviridae(例えば、コロナウイルス);Rhabdoviridae(例えば、水泡口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス);Filoviridae(例えば、エボラウイルス);Paramyxoviridae(例えば、パラインフルエンザウイルスムンプスウイルス麻疹ウイルス呼吸器合胞体ウイルス);Orthomyxoviridae(例えば、インフルエンザウイルス);Bungaviridae(例えば、ハンタンウイルス、ブンガ(bunga)ウイルス、フレボウイルスおよびナイラ(Naira)ウイルス);Arena viridae(出血熱ウイルス);Reoviridae(例えば、レオウイルスオルビウイルスおよびロタウイルス);Birnaviridae;Hepadnaviridae(B型肝炎ウイルス);Parvoviridae(パルボウイルス);Papovaviridae(パピローマウイルスポリオーマウイルス);Adenoviridae(ほとんどのアデノウイルス);Herpesviridae(単純ヘルペスウイルス(HSV)1および2、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ヘルペスウイルス;Poxviridae(痘瘡ウイルスワクシニアウイルスポックスウイルス);およびIridoviridae(例えば、アフリカブタ熱ウイルス);および未分類ウイルス(例えば、デルタ肝炎の病原体(B型肝炎ウイルスの欠損型サテライトであると考えられる)、非A、非B型肝炎の病原体(クラス1=内部伝染した;クラス2=非経口的に伝染した(すなわち、C型肝炎);ノーウォークおよび関連ウイルスならびにアストロウイルス)が挙げられる。

0059

例示的細菌として、これらに限定されないが、Pasteurella、Staphylococci、Streptococcus、Escherichia coli、Pseudomonasの種およびSalmonellaの種が挙げられる。感染性細菌の具体例として、これらに限定されないが、Helicobacter pyloris、Borelia burgdorferi、Legionella pneumophilia、Mycobacteria sps(例えば、M. tuberculosis、M. avium、M. intracellulare、M. kansaii、M. gordonae)、Staphylococcus aureus、Neisseria gonorrhoeae、Neisseria meningitidis、Listeria monocytogenes、Streptococcus pyogenes(A群Streptococcus)、Streptococcus agalactiae (B群Streptococcus)、Streptococcus(緑色群)、Streptococcus faecalis、Streptococcus bovis、Streptococcus(嫌気性種)、Streptococcus pneumoniae、病原性Campylobacter sp.、Enterococcus sp.、Haemophilus influenzae、Bacillus antracis、corynebacterium diphtheriae、corynebacterium sp.、Erysipelothrix rhusiopathiae、Clostridium perfringers、Clostridium tetani、Enterobacter aerogenes、Klebsiella pneumoniae、Pasturella multocida、Bacteroides sp.、Fusobacterium nucleatum、Streptobacillus moniliformis、Treponema pallidium、Treponema pertenue、Leptospira、RickettsiaおよびActinomyces israelliが挙げられる。

0060

本明細書において、用語「受容体」は、1種または複数種のリガンドと選択的に結合する細胞膜上に存在するポリペプチドまたはその一部を指すものとする。

0061

本明細書において、用語「認識する」は、標的と選択的に結合することを意味する。ウイルスを認識するT細胞は、通常、ウイルスによって発現された抗原と結合する受容体を発現する。

0062

本明細書において、用語「参照」または「対照」は、比較の標準を意味する。例えば、CARおよびscFvを発現する細胞によるscFv抗原結合のレベルが、CARのみを発現する対応する細胞におけるscFv抗原結合のレベルと比較され得る。

0063

本明細書において、用語「分泌された」は、小胞体ゴルジ体による分泌経路によって、および細胞の細胞膜で一過性に融合し、細胞の外側にタンパク質を放出する小胞として細胞から放出されるポリペプチドを意味する。

0064

本明細書において、用語「特異的に結合する」または「と特異的に結合する」または「特異的に標的とする」は、目的の生体分子(例えば、ポリペプチド)を認識し、結合するが、本発明のポリペプチドを天然に含む試料、例えば、生体試料中の他の分子を実質的に認識および結合しないポリペプチドまたはその断片を意味する。

0065

本明細書において、用語「治療すること」または「治療」は、治療されている個体または細胞の疾患経過を変更しようとする臨床的介入を指し、予防または臨床病理の経過の間のいずれかのために実施され得る。治療の治療効果として、限定するものではないが、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接病理学帰結の減少、転移の予防、疾患進行速度の低減、疾患状態の寛解または緩和および緩解または予後の改善が挙げられる。疾患または障害の進行を予防することによって、治療は、罹患した、もしくは診断を受けた被験体または障害を有すると疑われる被験体において、障害による増悪を予防することができるが、また、治療は、障害のリスクにあるか、または障害を有すると疑われる被験体において、障害または障害の症状の発生を予防し得る。

0066

本明細書において、用語「被験体」は、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類げっ歯類など(例えば、特定の治療のレシピエントであるべき、または細胞が回収される)を含めた、任意の動物(例えば、哺乳動物)を指す。

0067

II.キメラ抗原受容体(CAR)

0068

キメラ抗原受容体(CAR)は、免疫エフェクター細胞に目的の特異性を移植または付与する操作された受容体である。CARは、T細胞にモノクローナル抗体の特異性を移植するために使用され得、それらのコード配列の導入は、レトロウイルスベクターによって促進される。

0069

3世代のCARがある。「第1世代」CARは、通常、膜貫通ドメインと融合している、T細胞受容体鎖の細胞質/細胞内ドメインと融合している細胞外抗原結合性ドメイン(例えば、一本鎖可変断片(scFv))からなる。「第1世代」CARは、通常、内因性TCRからのシグナルの主な伝達物質であるCD3ξ鎖由来の細胞内ドメインを有する。「第1世代」CARは、de novo抗原認識を提供し、HLA媒介性抗原提示とは独立した、単一融合分子におけるそれらのCD3ζ鎖シグナル伝達ドメインによるCD4+およびCD8+T細胞両方の活性化を引き起こし得る。「第2世代」CARは、種々の共刺激分子(例えば、CD28、4−1BB、ICOS、OX40)に由来する細胞内ドメインを、CARの細胞質テールに付加して、T細胞に対するさらなるシグナルを提供する。「第2世代」CARは、共刺激(例えば、CD28または4−1BB)および活性化(CD3ζ)の両方を提供するものを含む。前臨床研究によって、「第2世代」CARは、T細胞の抗腫瘍活性を改善し得ることが示された。例えば、慢性リンパ芽球性白血病(CLL)および急性リンパ芽球性白血病(ALL)を有する患者におけるCD19分子を標的とする臨床治験において、「第2世代」CARによって修飾されたT細胞の頑強な有効性が実証された。「第3世代」CARは、複数の共刺激(例えば、CD28および4−1BB)および活性化(CD3ζ)を提供するものを含む。

0070

ここで開示される主題に一致して、CARは、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含み、細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトメソセリンと、約1nM〜約25nMの解離定数(Kd)で結合する。特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、scFvである。特定の限定されない実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、Fabであり、これは必要に応じて架橋されている。特定の限定されない実施形態では、細胞外結合性ドメインは、F(ab)2である。特定の限定されない実施形態では、前述の分子のいずれかが、細胞外抗原結合性ドメインを形成するように異種配列との融合タンパク質中に含まれ得る。

0071

メソセリン(MSLN)は、固形がんにおいて高度に発現される28〜33免疫原性細胞表面抗原27、28である。MSLNは、細胞増殖34、接着35、36、浸潤37〜39、細胞シグナル伝達35および転移40に関与している。研究によって、MSLN発現性腫瘍によって分泌された血清可溶性MSLN関連ペプチド(SMRP)は、ヒト32、33、41〜47およびマウスの両方において測定され得ることが実証され、療法応答および予後と相関すると示されている。正常組織では、MSLNは、胸膜、心膜および腹膜においてのみ、低レベルで発現される28、48。患者では、抗MSLN組換え免疫毒素SS1Pは、in vivo特異性および相当な抗腫瘍活性を示した49、50。膵臓がんワクチン治験では、生存優位性を有する患者は、ワクチン誘導性遅延型過敏症応答を伴う、MSLNに対する一貫したCD8+T細胞応答を有していた51。MSLN由来の特異的T細胞エピトープは、ヒトT細胞を活性化して、MSLNを発現するヒト腫瘍を効率的に溶解すると示された52。したがって、MSLNを標的とする養子免疫療法は、MSLN発現腫瘍を標的とし得るという強力な裏付けとなる証拠がある。

0072

ある特定の限定されない実施形態では、MSLNは、NCBI参照番号:AAV87530.1(配列番号43)を有する配列を有するヒトメソセリンまたはその断片である。

0073

配列番号43は、以下に提供される:

0074

ある特定の限定されない実施形態では、CARの細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトMSLNに対して高結合特異性ならびに高結合アフィニティーを有する。例えば、このような実施形態では、CARの細胞外抗原結合性ドメイン(例えば、scFvまたはその類似体において具体化される)は、ヒトMSLNと約25nMまたはそれ未満の解離定数(Kd)で結合する。一部の実施形態では、Kdは、約24nM、約23nM、約22nM、約21nMまたは約20nMもしくはそれ未満である。他の実施形態では、Kdは、約15nMまたはそれ未満、例えば、約14nM、約13nM、約12nMまたは約11nMなどである。他の実施形態では、Kdは、約10nMまたはそれ未満、例えば、約9nM、約8nM、約7nMまたは約6nMなどである。他の実施形態では、Kdは、約5nMまたはそれ未満、例えば、約4nM、約3nM、約2.5nM、約2nMまたは約1nMもしくはそれ未満などである。一部の実施形態では、Kdは、約1〜約20nM、例えば、約2.5〜約15nMまたは約5〜約10nMなどである。一部の実施形態では、Kdは、約1nM〜約25nM、約1nM〜約20nM、約1nM〜約15nM、約1nM〜約10nM、約5nM〜約10nM、約1nM〜約5nMまたは約1nM〜約2nMである。ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる米国特許第8,357,783号に記載される、ヒト抗メソセリン抗体またはその抗原結合部分を含む。一部の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトメソセリン、例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるFeng (2009)に開示されるような抗体m912と結合する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に由来する。抗体m912は、組換えメソセリンに対するパニングによってヒトFabライブラリーから単離された。他の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、Fab(例えば、ヒトまたはマウスFabライブラリー)に由来する。

0075

ここで開示されるCARの細胞外抗原結合性ドメイン(例えば、scFvまたはその類似体における実施形態)の、ヒトMSLNとの結合は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法ELISA)、ラジオイムノアッセイRIA)、FACS分析、生物検定法(例えば、成長阻害)またはウエスタンブロットアッセイによって確認できる。これらのアッセイの各々は、一般に、目的の複合体に特異的な標識された試薬(例えば、抗体またはscFv)を使用することによって特に目的とするタンパク質−抗体複合体の存在を検出する。例えば、scFvは、ラジオイムノアッセイ(RIA)において放射活性標識され、使用され得る(例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986を参照のこと)。放射活性同位元素は、γカウンターもしくはシンチレーションカウンターの使用またはオートラジオグラフィーによってなどの手段によって検出できる。ある特定の実施形態では、MSLN標的化細胞外抗原結合性ドメインは、蛍光マーカーを用いて標識される。蛍光マーカーの限定されない例として、緑色蛍光タンパク質(GFP)、青色蛍光タンパク質(例えば、EBFP、EBFP2、AzuriteおよびmKalama1)、シアン蛍光タンパク質(例えば、ECFP、CeruleanおよびCyPet)および黄色蛍光タンパク質(例えば、YFP、Citrine、VenusおよびYPet)が挙げられる。一実施形態では、MSLN標的化ヒトscFvは、GFPを用いて標識される。

0076

ある特定の限定されない実施形態では、ここで開示されるCARの細胞外抗原結合性ドメインは、約1,000またはそれ超のMSLN結合部位/細胞のMSLNレベルのヒトMSLNを認識するか、またはそれと結合する。ある特定の実施形態では、ここで開示されるCARの細胞外抗原結合性ドメインは、約1,000〜約50,000のMSLN結合部位/細胞のMSLNレベルのヒトMSLNを認識するか、またはそれと結合する。一部の実施形態では、ここで開示されるCARの細胞外抗原結合性ドメインは、1,000未満のMSLN結合部位/細胞のMSLN発現レベルのヒトMSLN、例えば、正常組織、例えば、正常胸膜、心膜および腹膜組織において発現されたヒトMSLNを認識せず、それと結合しない。ある特定の実施形態では、ここで開示されるCARの細胞外抗原結合性ドメインは、50,000超のMSLN結合部位/細胞のMSLN発現レベルのヒトMSLNを認識せず、それと結合しない。一実施形態では、ここで開示されるCAR中に含まれるヒトscFVは、約1,000〜約50,000のMSLN結合部位/細胞のMSLN発現レベルのヒトMSLNを認識するか、またはそれと結合する。一実施形態では、ここで開示されるCAR中に含まれるヒトscFVは、50,000超または1,000未満のMSLN結合部位/細胞のMSLN発現レベルのヒトMSLNを認識せず、それと結合しない。

0077

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、以下に提供されるような配列番号1に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域を含む。

0078

配列番号1のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、以下に提供されるような配列番号2に示される。

0079

一部の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、以下に提供されるような配列番号3に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む。

0080

配列番号3のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、以下に提供されるような配列番号4に示されている。

0081

一部の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、以下に提供されるような配列番号5に示される配列を有するアミノ酸を含む軽鎖可変領域を含む。

0082

ある特定の実施形態では、ここで開示されるCARの細胞外抗原結合性ドメインは、一本鎖可変断片(scFv)を含む。1つの特定の実施形態では、ここで開示されるCARの細胞外抗原結合性ドメインは、ヒトscFVを含む。一実施形態では、ヒトscFVは、配列番号1のアミノ酸1〜119を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、ヒトscFVは、以下に提供されるような配列番号6に示される配列を有するアミノ酸を含む重鎖可変領域を含む。

0083

一実施形態では、ヒトscFVは、配列番号3のアミノ酸1〜107を含む軽鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒトscFVは、配列番号5のアミノ酸1〜107を含む軽鎖可変領域を含む。

0084

ある特定の実施形態では、ヒトscFVは、以下に提供されるような配列番号7に示される配列を有するアミノ酸を含む。

0085

一実施形態では、配列番号7のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、以下に提供されるような配列番号8に示されている。

0086

別の実施形態では、配列番号7のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、以下に提供されるような配列番号9に示されている。配列番号9に示されるような核酸配列は、コドン使用について合成的に最適化され、これは、CARの発現を増大し得る。

0087

さらに別の実施形態では、配列番号7のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、以下に提供されるような配列番号10に示されている。配列番号10に示されるような核酸配列は、コドン使用について合成的に最適化され、これは、CARの発現を増大し得る。

0088

ある特定の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号11に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域CDR1、配列番号12に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域CDR2および配列番号13に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む重鎖可変領域CDR3を含む。一部の実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、配列番号14に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域CDR1、配列番号15に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域CDR2および配列番号16に示される配列を有するアミノ酸またはその保存的修飾物を含む軽鎖可変領域CDR3を含む。1つの限定されない例示的実施形態では、細胞外抗原結合性ドメインは、参照により本明細書に組み込まれるFeng et al., Mol. Cancer Therapy (2009);8(5):1113-1118に開示されるような、完全ヒト抗MSLN抗体m912に由来するヒトscFvである。

0089

配列番号11〜16は、以下に提供されている:

0090

本明細書において、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含むここで開示されるCAR(例えば、細胞外抗原結合性ドメイン)の結合特徴に大幅に影響を及ぼさず、変更しないアミノ酸修飾を指す。このような保存的修飾物として、アミノ酸置換、付加および欠失が挙げられる。修飾は、部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発などの当技術分野で公知の標準技術によって、ここで開示される主題のヒトscFv中に導入され得る。アミノ酸は、電荷および極性などのそれらの物理化学的特性に従って、群に分類され得る。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が同一群内のアミノ酸と置き換えられているものである。例えば、アミノ酸は、電荷によって分類され得、正荷電を有するアミノ酸として、リシンアルギニンヒスチジンが挙げられ、負電荷を有するアミノ酸として、アスパラギン酸グルタミン酸が挙げられ、中性電荷アミノ酸として、アラニンアスパラギンシステイングルタミン、グリシン、イソロイシンロイシンメチオニンフェニルアラニンプロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンが挙げられる。さらに、アミノ酸は、極性によって分類され得る:極性アミノ酸として、アルギニン(塩基性極性)、アスパラギン、アスパラギン酸(酸性極性)、グルタミン酸(酸性極性)、グルタミン、ヒスチジン(塩基性極性)、リシン(塩基性極性)、セリン、トレオニンおよびチロシンが挙げられ;非極性アミノ酸として、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリンが挙げられる。したがって、CDR領域内の1個または複数のアミノ酸残基が同一群に由来する他のアミノ酸残基で置き換えられ得、変更された抗体は、本明細書に記載される機能アッセイを使用して、保持された機能(すなわち、上記の(c)から(l)に示される機能)について試験され得る。ある特定の実施形態では、特定の配列またはCDR領域内の1個以下、2個以下、3個以下、4個以下、5個以下の残基が変更される。

0091

ある特定の限定されない実施形態では、CARの細胞外抗原結合性ドメインは、細胞外抗原結合性ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域をつなげるリンカーを含み得る。本明細書において、用語「リンカー」は、互いにつなげられるように2つまたはそれ超のポリペプチドまたは核酸を共有結合する官能基(例えば、化学物質またはポリペプチド)を指す。本明細書において、「ペプチドリンカー」は、2つのタンパク質を一緒にカップリングするために(例えば、VHおよびVLドメインをカップリングするために)使用される1個または複数のアミノ酸を指す。1つの限定されない例では、リンカーは、以下に提供されるような配列番号17に示される配列を有するアミノ酸を含む。
GGGGSGGGGSGGGGS[配列番号17]

0092

一実施形態では、配列番号17のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号18に示されている。
GGAGGTGGAGGCTCAGGAGGAGGAGGCAGTGGAGGTGGTGGGTCA[配列番号18]

0093

別の実施形態では、配列番号17のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号19に示されている。
GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCA[配列番号19]

0094

さらに、細胞外抗原結合性ドメインは、新生タンパク質を小胞体に向けるリーダーまたはシグナルペプチドを含み得る。CARが、グリコシル化され、細胞膜に固定されるべきである場合には、シグナルペプチドまたはリーダーが必須であり得る。シグナル配列またはリーダーは、その移行を分泌経路に向ける、新規に合成されたタンパク質のN末端に存在するペプチド配列(約5、約10、約15、約20、約25または約30個のアミノ酸長)であり得る。限定されない例では、リーダーは、細胞外抗原結合性ドメインの5’末端に共有結合によって連結される。一実施形態では、リーダーは、以下に提供されるような配列番号20に示される配列を有するアミノ酸を含むCD8ポリペプチドを含む。
MALPVTALLLPLALLLHAARP[配列番号20]

0095

配列番号20のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、以下に提供される配列番号21に示されている:
ATGGCCCTGCCAGTAACGGCTCTGCTGCTGCCACTTGCTCTGCTCCTCCATGCAGCCAGGCC [配列番号21]

0096

ある特定の限定されない実施形態では、CARの膜貫通ドメインは、膜の少なくとも一部に広がる疎水性アルファヘリックスを含む。種々の膜貫通ドメインが、種々の受容体安定性をもたらす。抗原認識後、受容体はクラスター形成し、シグナルが細胞に伝達される。ここで開示される主題に一致して、CARの膜貫通ドメインは、CD8ポリペプチド、CD28ポリペプチド、CD3ζポリペプチド、CD4ポリペプチド、4−1BBポリペプチド、OX40ポリペプチド、ICOSポリペプチド、CTLA−4ポリペプチド、PD−1ポリペプチド、LAG−3ポリペプチド、2B4ポリペプチド、BTLAポリペプチド、合成ペプチド(免疫応答と関連しているタンパク質をベースとしない)またはそれらの組合せを含み得る。

0097

一実施形態では、膜貫通ドメインは、CD8ポリペプチドを含む。CD8ポリペプチドは、以下に提供されるようなNCBI参照番号:NP_001139345.1(配列番号22)を有する配列に対して、少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%もしくは約100%相同である(本明細書において相同性は、BLASTまたはFASTAなどの標準ソフトウェアを使用して決定され得る)アミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および/または必要に応じて、最大1つもしくは最大2つもしくは最大3つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、CD8ポリペプチドは、少なくとも20個、または少なくとも30個、または少なくとも40個、または少なくとも50個および最大235個のアミノ酸長である配列番号22の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、CD8ポリペプチドは、配列番号22のアミノ酸1〜235、1〜50、50〜100、100〜150、150〜200または200〜235のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ここで開示される主題のCARは、Mzであり、その膜貫通ドメインは、CD8ポリペプチドを含む。別の実施形態では、ここで開示される主題のCARは、MBBzであり、その膜貫通ドメインは、CD8ポリペプチドを含む。限定されない一実施形態では、ここで開示されるCARは、配列番号22のアミノ酸137〜209を有するCD8ポリペプチドを含む膜貫通ドメインを含む。

0098

ここで開示される主題に一致して、「CD8核酸分子」は、CD8ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

0099

一実施形態では、ここで開示されるCARの膜貫通ドメインは、CD28ポリペプチドを含む。CD28ポリペプチドは、NCBI参照番号:P10747またはNP_006130(配列番号23)を有する配列に対して、少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%もしくは100%相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および/または必要に応じて、最大1つもしくは最大2つもしくは最大3つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、CD28ポリペプチドは、少なくとも20個、または少なくとも30個、または少なくとも40個、または少なくとも50個、および最大220個のアミノ酸長である配列番号23の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、CD28ポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸1〜220、1〜50、50〜100、100〜150、150〜200または200〜220のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ここで開示される主題のCARは、M28zであり、これは、CD28ポリペプチドを含む膜貫通ドメインおよびCD28ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内ドメインを含む。一実施形態では、M28zの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン中に含まれるCD28ポリペプチドは、配列番号23のアミノ酸117〜220のアミノ酸配列を有する。

0100

配列番号23は、以下に提供されている:

0101

ここで開示される主題に一致して、「CD28核酸分子」は、CD28ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。一実施形態では、M28zの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン(例えば、共刺激シグナル伝達領域)中に含まれるCD28ポリペプチドをコードするCD28核酸分子は、以下に提供されるような配列番号24に示されるようなヌクレオチド配列を含む。

0102

ある特定の限定されない実施形態では、CARはまた、抗原結合性ドメインを膜貫通ドメインと連結するスペーサー領域を含み得る。スペーサー領域は、抗原結合性ドメインが抗原認識を容易にするために種々の方向に向くことを可能にするのに十分可動性であり得る。スペーサー領域は、IgG1由来のヒンジ領域または免疫グロブリンのCH2CH3領域およびCD3の部分であり得る。

0103

ある特定の限定されない実施形態では、CARの細胞内ドメインは、細胞(例えば、リンパ球系系統の細胞、例えば、T細胞)を活性化または刺激し得るCD3ζポリペプチドを含み得る。CD3ζは、3つのITAMを含み、抗原が結合した後、活性化シグナルを細胞(例えば、リンパ球系系統の細胞、例えば、T細胞)に伝達する。CD3ζポリペプチドは、NCBI参照番号:NP_932170を有する配列(配列番号25)に対して、少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%もしくは約100%相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および/または必要に応じて、最大1つもしくは最大2つもしくは最大3つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、CD3ζポリペプチドは、少なくとも20個、または少なくとも30個、または少なくとも40個、または少なくとも50個、および最大164個のアミノ酸長である配列番号25の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、CD3ζポリペプチドは、配列番号25のアミノ酸1〜164、1〜50、50〜100、100〜150または150〜164のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、CD3ζポリペプチドは、配列番号25のアミノ酸52〜164のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ここで開示される主題のCARは、Mzであり、その細胞内ドメインは、配列番号25のアミノ酸52〜164のアミノ酸配列を有するCD3ζポリペプチドを含む。一実施形態では、ここで開示される主題のCARは、M28zであり、その細胞内ドメインは、配列番号25のアミノ酸52〜164のアミノ酸配列を有するCD3ζポリペプチドを含む。一実施形態では、ここで開示される主題のCARは、MBBzであり、その細胞内ドメインは、配列番号25のアミノ酸52〜164のアミノ酸配列を有するCD3ζポリペプチドを含む。

0104

配列番号25は、以下に提供されている:

0105

ここで開示される主題に一致して、「CD3ζ核酸分子」は、CD3ζポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。一実施形態では、ここで開示されるCAR(例えば、Mz、M28zまたはMBBz)の細胞内ドメイン中に含まれるCD3ζポリペプチドをコードするCD3ζ核酸分子は、以下に提供されるような配列番号26に示されるようなヌクレオチド配列を含む。

0106

ある特定の限定されない実施形態では、CARの細胞内ドメインは、少なくとも1つの共刺激分子を含む少なくとも1つの共刺激シグナル伝達領域をさらに含み、これは、最適なリンパ球活性化を提供し得る。本明細書において、「共刺激分子」は、抗原に対するリンパ球の効率的な応答に必要である抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子を指す。少なくとも1つの共刺激シグナル伝達領域は、CD28ポリペプチド、4−1BBポリペプチド、OX40ポリペプチド、ICOSポリペプチド、PD−1ポリペプチド、CTLA−4ポリペプチド、LAG−3ポリペプチド、2B4ポリペプチド、BTLAポリペプチド、合成ペプチド(免疫応答と関連しているタンパク質をベースとしない)またはそれらの組合せを含み得る。共刺激分子は、共刺激リガンドと結合し得、これは、その受容体との結合の際に、抗原がそのCAR分子と結合するときに提供される刺激を生じさせる共刺激応答、すなわち、細胞内応答をもたらす、細胞表面に発現されるタンパク質である。共刺激リガンドとして、これらに限定されないが、CD80、CD86、CD70、OX40L、4−1BBL、CD48、TNFRSF14およびPD−L1が挙げられる。一例として、4−1BBリガンド(すなわち、4−1BBL)は、CARシグナルと組み合わせて、CAR+T細胞のエフェクター細胞機能を誘導する細胞内シグナルを提供するために、4−1BB(「CD137」としても知られる)と結合し得る。4−1BB、ICOSまたはDAP−10を含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内ドメインを含むCARは、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、U.S.7,446,190に開示されている(例えば、4−1BBをコードするヌクレオチド配列は、配列番号15に示されており、ICOSをコードするヌクレオチド配列は、配列番号16に示されており、DAP−10をコードするヌクレオチド配列は、U.S.7,446,190において配列番号17に示されている)。一部の実施形態では、CARの細胞内ドメインは、2種の共刺激分子:CD28および4−1BB(Sadelain, et al., Cancer Discovery, OF1-11, (2013)を参照のこと)またはCD28およびOX40を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。

0107

4−1BBは、腫瘍壊死因子(TNF)リガンドとして作用し得、刺激活性を有し得る。4−1BBポリペプチドは、NCBI参照番号:P41273もしくはNP_001552(配列番号27)を有する配列に対して少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%もしくは100%相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および/または必要に応じて、最大1つもしくは最大2つもしくは最大3つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、4−1BBポリペプチドは、少なくとも20個、または少なくとも30個、または少なくとも40個、または少なくとも50個、および最大255個のアミノ酸長である配列番号27の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、4−1BBポリペプチドは、配列番号27のアミノ酸1〜255、1〜50、50〜100、100〜150、150〜200または200〜255のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ここで開示される主題のCARは、MBBzであり、その細胞内ドメインは、4−1BBポリペプチドを含む。

0108

配列番号27は、以下に提供されている:

0109

ここで開示される主題に一致して、「4−1BB核酸分子」は、4−1BBポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

0110

OX40ポリペプチドは、NCBI参照番号:P43489もしくはNP_003318(配列番号28)を有する配列に対して少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%もしくは100%相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および/または必要に応じて、最大1つもしくは最大2つもしくは最大3つの保存的アミノ酸置換を含み得る。

0111

配列番号28は、以下に提供されている:

0112

ここで開示される主題に一致して、「OX40核酸分子」は、OX40ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

0113

ICOSポリペプチドは、NCBI参照番号:NP_036224(配列番号29)を有する配列に対して、少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%もしくは100%相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および/または必要に応じて、最大1つもしくは最大2つもしくは最大3つの保存的アミノ酸置換を含み得る。

0114

配列番号29は、以下に提供されている:

0115

ここで開示される主題に一致して、「ICOS核酸分子」は、ICOSポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

0116

CTLA−4は、その対応するリガンドによって(それぞれ、CD80およびCD86;B7−1およびB7−2)会合される場合に、活性化T細胞阻害またはアネルギーを媒介する、活性化T細胞によって発現される阻害性受容体である。前臨床および臨床研究の両方において、全身抗体注入によるCTLA−4遮断は、内因性抗腫瘍応答を増強したが、臨床状況では、相当な予期せぬ毒性を有していた。

0117

CTLA−4は、細胞外Vドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質テールを含有する。種々のアイソフォームをコードする代替のスプライス変異体が特徴付けられている。膜結合アイソフォームは、ジスルフィド結合によって相互接続されたホモ二量体として機能するが、可溶性アイソフォームは、単量体として機能する。細胞内ドメインは、内因性触媒活性を有さず、PI3K、PP2AおよびSHP−2と結合できる1つのYVKMモチーフならびにSH3含有タンパク質と結合できる1つのプロリンリッチモチーフを含有する点で、CD28のものと同様である。T細胞応答の阻害におけるCTLA−4の1つの役割は、直接的に、CD3およびLATなどのTCR−近位シグナル伝達タンパク質のSHP−2およびPP2A脱リン酸化によると思われる。CTLA−4はまた、CD80/86結合についてCD28と競合することによってシグナル伝達に間接的に影響を及ぼし得る。CTLA−4は、PI3K、CD80、AP2M1およびPPP2R5Aと結合および/または相互作用することが示されている。

0118

ここで開示される主題に一致して、CTLA−4ポリペプチドは、配列番号30に対して、少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%もしくは約100%相同である(本明細書において相同性は、BLASTまたはFASTAなどの標準ソフトウェアを使用して決定され得る)アミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および/または必要に応じて、最大1つもしくは最大2つもしくは最大3つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、CTLA−4ポリペプチドは、少なくとも20個、または少なくとも30個、または少なくとも40個、または少なくとも50個、および最大223個のアミノ酸長である配列番号30の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、CTLA−4ポリペプチドは、配列番号30のアミノ酸1〜223、1〜50、50〜100、100〜140、141〜161、162〜182、183〜223、141〜223、162〜223または183〜223のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、CTLA−4ポリペプチドは、配列番号30のアミノ酸183〜223のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、CARの細胞内ドメインは、配列番号30のアミノ酸183〜223のアミノ酸配列を有するCTLA−4ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、CARの膜貫通ドメインは、配列番号30のアミノ酸162〜182のアミノ酸配列を有するCTLA−4ポリペプチドを含む。

0119

配列番号30は、以下に提供されている:

0120

ここで開示される主題に一致して、「CTLA−4核酸分子」は、CTLA−4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

0121

PD−1は、内因性マクロファージおよび樹状細胞上に発現されるその対応するリガンドPD−L1およびPD−L2との会合の際の活性化T細胞の負の免疫制御因子である。PD−1は、268個のアミノ酸のI型膜タンパク質である。PD−1は、2種のリガンド、PD−L1およびPD−L2を有し、それらは、B7ファミリーのメンバーである。タンパク質の構造は、細胞外IgVドメインと、それに続く、膜貫通領域および細胞内テールを含む。細胞内テールは、PD−1が、TCRシグナルを負に制御する、免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフおよび免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ中に位置する2つのリン酸化部位を含有する。SHP−IおよびSHP−2脱リン酸化酵素は、リガンド結合の際にPD−1の細胞質テールと結合する。PD−L1の上方制御は、腫瘍細胞が宿主免疫系を逃れ得る1つの機序である。前臨床および臨床治験では、アンタゴニスト抗体によるPD−1遮断が、宿主内因性免疫系によって媒介される抗腫瘍応答を誘導した。

0122

ここで開示される主題に一致して、PD−1ポリペプチドは、配列番号31に対して少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%もしくは約100%相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および/または必要に応じて、最大1つもしくは最大2つもしくは最大3つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、PD−1ポリペプチドは、少なくとも20個、または少なくとも30個、または少なくとも40個、または少なくとも50個、および最大288個のアミノ酸長である配列番号31の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、PD−1ポリペプチドは、配列番号31のアミノ酸1〜288、1〜50、50〜100、100〜144、145〜170、171〜191、192〜288、145〜288、171〜288または192〜288のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、PD−1ポリペプチドは、配列番号31のアミノ酸192〜288のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、CARの細胞内ドメインは、配列番号31のアミノ酸192〜288のアミノ酸配列を有するPD−1ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、CARの膜貫通ドメインは、配列番号31のアミノ酸171〜191のアミノ酸配列を有するPD−1ポリペプチドを含む。

0123

配列番号31は、以下に提供されている:

0124

ここで開示される主題に一致して、「PD−1核酸分子」は、PD−1ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

0125

リンパ球−活性化タンパク質3(LAG−3)は、免疫細胞の負の免疫制御因子である。LAG−3は、免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーに属し、4つの細胞外Ig様ドメインを含有する。LAG3遺伝子は、8つのエキソンを含有する。配列データ、エキソン/イントロン組織化および染色体局在性はすべて、LAG3のCD4に対する密接な関係を示す。LAG3は、CD223(分化223のクラスター)とも呼ばれている。

0126

ここで開示される主題に一致して、LAG−3ポリペプチドは、配列番号32に対して、少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%もしくは約100%相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および/または必要に応じて、最大1つもしくは最大2つもしくは最大3つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、LAG−3ポリペプチドは、少なくとも20個、または少なくとも30個、または少なくとも40個、または少なくとも50個、および最大525個のアミノ酸長である配列番号32の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、LAG−3ポリペプチドは、配列番号32のアミノ酸1〜525、1〜50、50〜100、100〜150、150〜200、200〜250、250〜300、300〜350、350〜400、400〜420、421〜450、451〜471、472〜525、421〜525、451〜525または472〜525のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、LAG−3ポリペプチドは、配列番号32のアミノ酸472〜525のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、CARの細胞内ドメインは、配列番号32のアミノ酸472〜525のアミノ酸配列を有するLAG−3ポリペプチドを含む共刺激領域を含む。ある特定の実施形態では、CARの膜貫通ドメインは、配列番号32のアミノ酸451〜471のアミノ酸配列を有するLAG−3ポリペプチドを含む。

0127

配列番号32は、以下に提供されている:

0128

ここで開示される主題に一致して、「LAG−3核酸分子」は、LAG−3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

0129

ナチュラルキラー細胞受容体2B4(2B4)は、NK細胞およびT細胞のサブセットで非MHC拘束性細胞死滅を媒介する。今日まで、2B4の機能は、依然として研究中であり、2B4−Sアイソフォームは、活性化受容体であると考えられ、2B4−Lアイソフォームは、免疫細胞の負の免疫制御因子であると考えられる。2B4は、結合の際に、その高アフィニティーリガンド、CD48を会合するようになる。2B4は、チロシンベースのスイッチモチーフ、タンパク質が種々の脱リン酸化酵素と会合することを可能にする分子スイッチを含有する。2B4は、CD244(分化244のクラスター)とも呼ばれている。

0130

ここで開示される主題に一致して、2B4ポリペプチドは、配列番号33に対して、少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%もしくは約100%相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および/または必要に応じて、最大1つもしくは最大2つもしくは最大3つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、2B4ポリペプチドは、少なくとも20個、または少なくとも30個、または少なくとも40個、または少なくとも50個、および最大370個のアミノ酸長である配列番号33の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、2B4ポリペプチドは、配列番号33のアミノ酸1〜370、1〜50、50〜100、100〜150、150〜215、216〜229、230〜250、251〜370、216〜370、230〜370または251〜370のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、2B4ポリペプチドは、配列番号33のアミノ酸251〜370のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、CARの細胞内ドメインは、配列番号33のアミノ酸251〜370のアミノ酸配列を有する2B4ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、CARの膜貫通ドメインは、配列番号33のアミノ酸230〜250のアミノ酸配列を有する2B4ポリペプチドを含む。

0131

配列番号33は、以下に提供されている:

0132

ここで開示される主題に一致して、「2B4核酸分子」は、2B4ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

0133

BおよびTリンパ球アテニュエータ(BTLA)発現は、T細胞の活性化の際に誘導され、BTLAは、Th1細胞では発現されたままであるが、Th2細胞では発現されない。PD1およびCTLA4同様、BTLAは、B7相同体、B7H4と相互作用する。しかし、PD−1およびCTLA−4とは異なり、BTLAは、細胞表面受容体のB7ファミリーだけではなく腫瘍壊死ファミリー受容体(TNF−R)との相互作用によるT細胞阻害を示す。BTLAは、ヘルペスウイルスエントリーメディエーターHVEM)としても知られている、腫瘍壊死因子(受容体)スーパーファミリー、メンバー14(TNFRSF14)のリガンドである。BTLA−HVEM複合体は、T細胞免疫応答を負に制御する。BTLA活性化は、ヒトCD8+がん特異的T細胞の機能を阻害することが示されている。BTLAは、CD272(分化272のクラスター)とも呼ばれている。

0134

ここで開示される主題に一致して、BTLAポリペプチドは、配列番号34に対して、少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%もしくは約100%相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および/または必要に応じて、最大1つもしくは最大2つもしくは最大3つの保存的アミノ酸置換を含み得る。限定されない実施形態では、BTLAポリペプチドは、少なくとも20個、または少なくとも30個、または少なくとも40個、または少なくとも50個、および最大289個のアミノ酸長である配列番号34の連続部分であるアミノ酸配列を有し得る。あるいは、またはさらに、限定されない種々の実施形態では、BTLAポリペプチドは、配列番号34のアミノ酸1〜289、1〜50、50〜100、100〜134、135〜157、158〜178、179〜289、135〜289、158〜289または179〜289のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、BTLAポリペプチドは、配列番号34のアミノ酸179〜289のアミノ酸配列を有する。ある特定の実施形態では、CARの細胞内ドメインは、配列番号34のアミノ酸179〜289のアミノ酸配列を有するBTLAポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。ある特定の実施形態では、CARの膜貫通ドメインは、配列番号34のアミノ酸158〜178のアミノ酸配列を有するBTLAポリペプチドを含む。

0135

配列番号34は、以下に提供されている:

0136

ここで開示される主題に一致して、「BTLA核酸分子」は、BTLAポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

0137

一実施形態では、CARは、Mzであり、これは、ヒトメソセリンと特異的に結合する細胞外抗原結合性ドメインを含む細胞外抗原結合領域、CD8ポリペプチドを含む膜貫通ドメインおよびCD3ζポリペプチドを含む細胞内ドメインを含む(例えば、図2を参照のこと)。Mzはまた、細胞外抗原結合性ドメインの5’末端と共有結合によって連結しているリーダーを含む。リーダーは、配列番号20に示される配列を有するアミノ酸を含むCD8ポリペプチドを含む。

0138

一実施形態では、CARは、M28zであり、これはヒトメソセリンと特異的に結合する細胞外抗原結合領域、CD28ポリペプチドを含む膜貫通ドメインおよびCD3ζポリペプチドを含む細胞内ドメインおよびCD28ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む(例えば、図2を参照のこと)。M28zはまた、細胞外抗原結合性ドメインの5’末端と共有結合によって連結しているリーダーを含む。リーダーは、配列番号20に示される配列を有するアミノ酸を含むCD8ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、CARは、M28zおよびIL−12である共刺激リガンド、例えば、図24Eに示されるようなM28z+IL−12を含む。IL−12は、M28zの細胞内ドメインの3’末端に共有結合によって連結され得る。一部の実施形態では、CARは、M28zおよび4−1BBLである共刺激リガンド、例えば、図24Cおよび24Dに示されるようなM28z+4−1BBLを含む。4−1BBLは、図24Dに示されるように、M28zの細胞外抗原結合性ドメインの5’末端に共有結合によって連結され得る。あるいは、4−1BBLは、図24Cに示されるように、M28zの細胞内ドメインの3’末端に共有結合によって連結され得る。

0139

一実施形態では、CARは、MBBzであり、これは、ヒトメソセリンと特異的に結合する細胞外抗原結合領域、CD8ポリペプチドを含む膜貫通ドメインおよびCD3ζポリペプチドを含む細胞内ドメインおよび4−1BBポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む(例えば、図19および24Bを参照のこと)。MBBzはまた、細胞外抗原結合性ドメインの5’末端に共有結合によって連結しているリーダーを含む。リーダーは、配列番号20に示される配列を有するアミノ酸を含むCD8ポリペプチドを含む。

0140

一部の実施形態では、ここで開示される主題のCARは、ヒト細胞において核酸配列を発現させるために誘導プロモーターをさらに含み得る。CAR遺伝子の発現において使用するためのプロモーターは、ユビキチンC(UbiC)プロモーターなどの構成プロモーターであり得る。

0141

MSLN特異的CARは、in vitroおよびin vivo状況の両方で、卵巣がん、悪性胸膜中皮腫(MPM)および三重陰性乳がん(TNBC)に対する有効性を示している54〜58。2つの第I相臨床治験は、抗MSLN CARが形質導入されたT細胞を使用した。NCI第I相臨床治験(NCT01583686)は、MSLNを発現する転移性または切除不能がんを、骨髄破壊化学療法および/またはアルデスロイキン(IL−2類似体)と組み合わせてCAR T細胞を用いて治療して、CAR T細胞持続を増強する。ペンシルベニア大学(University of Pennsylvania)第I相臨床治験(NCT01355965)は、中皮腫患者に、1〜3用量のRNAがトランスフェクトされたMSLN標的化CAR T細胞を与える。後者の研究では、3回目の治療された患者においてヒト抗マウス抗体(HAMA)応答が観察された(Cancer Immunol Res Apr 7, 2013)。NCIおよびU Penn臨床治験におけるMSLN CARとは異なり、一実施形態では、ここで開示されるMSLN標的化CARは、ヒトFab53に由来し、したがって、マウス抗体に由来するCARと比較して、かなり低下した免疫原性のリスクをもたらす(マウス抗体に由来するCARの潜在的免疫原性は、mRNACARの安全性の問題であり得ると報告する(Maus et al., Cancer Immunol Res (2003);1(1):26-31を参照のこと)を参照のこと)。ここで開示されるMSLN標的化CARは、CD4+およびCD8+T細胞両方を形質導入し得、したがって、CARを用いる患者のT細胞の形質導入は、ヘルパーおよびCTL応答の両方を生じさせ、その結果、持続した抗腫瘍応答をもたらす。

0142

III.免疫応答性細胞

0143

ここで開示される主題は、細胞外抗原結合性ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むCARを発現する免疫応答性細胞を提供し、細胞外抗原結合性ドメインは、上記のように、ヒトメソセリンと特異的に結合する。ここで開示される主題はまた、例えば、免疫応答の増強を必要とする疾患の治療のためにこのような細胞を使用する方法を提供する。ここで開示される主題の免疫応答性細胞は、リンパ球系系統の細胞であり得る。B、Tおよびナチュラルキラー(NK)細胞を含めたリンパ球系系統は、抗体の製造、細胞免疫系の制御、血液中の外来病原体の検出、宿主に対して外来の細胞の検出などを提供する。リンパ球系系統の細胞の限定されない例として、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)、制御性T細胞、胚幹細胞および多能性幹細胞が挙げられる(例えば、リンパ球系細胞に分化し得るもの)が挙げられる。T細胞は、胸腺において成熟し、細胞性免疫に主に責任を負うリンパ球であり得る。T細胞は、適応免疫系に関与している。ここで開示される主題のT細胞は、これらに限定されないが、Tヘルパー細胞細胞傷害性T細胞メモリーT細胞(セントラルメモリーT細胞、幹細胞様メモリーT細胞(または様メモリーT細胞)および2種類のエフェクターメモリーT細胞:例えば、TEM細胞およびTEMRA細胞を含む)、制御性T細胞(サプレッサーT細胞としても知られる)、ナチュラルキラーT細胞粘膜関連インバリアントT細胞およびγδ T細胞を含めた、任意の種類のT細胞であり得る。一部の実施形態では、CARを発現するT細胞は、Foxp3を発現して、T制御性表現型を達成および維持する。ナチュラルキラー(NK)細胞は、細胞性免疫の一部であり、自然免疫応答中に作用するリンパ球であり得る。NK細胞は、標的細胞に対するそれらの細胞傷害性効果を発揮するために、事前の活性化を必要としない。細胞傷害性T細胞(CTLまたはキラーT細胞)は、感染した体細胞または腫瘍細胞の死を誘導可能なTリンパ球のサブセットである。

0144

ここで開示される主題の免疫応答性細胞は、新生物を治療または予防するための、ヒトメソセリンと特異的に結合する、細胞外抗原結合性ドメイン(例えば、ヒトscFV、必要に応じて架橋されている、FabまたはF(ab)2)を発現し得る。このような免疫応答性細胞は、固形腫瘍(例えば、中皮腫、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、結腸がん、胸膜腫瘍、神経膠芽腫、食道がん、胃がん(gastric cancer)、滑膜肉腫、胸腺癌、子宮内膜癌、胃がん(stomach cancer)および/または胆管癌)を治療または予防するために、それを必要とする被験体(例えば、ヒト被験体)に投与され得る。一実施形態では、免疫応答性細胞は、T細胞である。T細胞は、CD4+T細胞またはCD8+T細胞であり得る。一実施形態では、T細胞は、CD4+T細胞である。

0145

ここで開示される免疫応答性細胞は、免疫応答性細胞が、メソセリン特異的CARおよび少なくとも1種の外因性共刺激リガンドを外因性に共発現するように、または共発現するように誘導されるように、少なくとも1種の外因性共刺激リガンドをさらに含み得る。メソセリン特異的CARおよび少なくとも1種の共刺激リガンド間の相互作用は、免疫応答性細胞(例えば、T細胞)の完全活性化にとって重要な非抗原特異的シグナルを提供する。共刺激リガンドとして、限定するものではないが、腫瘍壊死因子(TNF)スーパーファミリーのメンバーおよび免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーリガンドが挙げられる。TNFは、全身性炎症に関与しているサイトカインであり、急性期反応を刺激する。その主な役割は、免疫細胞の制御にある。TNFスーパーファミリーのメンバーは、いくつかの共通の特徴を共有する。TNFスーパーファミリーメンバーの大部分は、短い細胞質セグメントおよび比較的長い細胞外領域を含有するII型膜貫通タンパク質(細胞外C末端)として合成される。TNFスーパーファミリーメンバーとして、限定するものではないが、神経成長因子(NGF)、CD40L(CD40L)/CD154、CD137L/4−1BBL、TNF−α、CD134L/OX40L/CD252、CD27L/CD70、Fasリガンド(FasL)、CD30L/CD153、腫瘍壊死因子ベータ(TNFβ)/リンホトキシン−アルファ(LTα)、リンホトキシン−ベータ(LTβ)、CD257/B細胞活性化因子(BAFF)/Blys/THANK/Tall−1、グルココルチコイド誘導性TNF受容体リガンドGITRL)およびTNF関連アポトーシス誘導性リガンド(TRAIL)、LIGHT(TNFSF14)が挙げられる。免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーは、細胞の認識、結合または接着プロセスに関与している、細胞表面の可溶性タンパク質の大きな群である。これらのタンパク質は、免疫グロブリンと構造的特徴を共有する−それらは免疫グロブリンドメインフォールディング)を有する。免疫グロブリンスーパーファミリーリガンドとして、限定するものではないが、CD80およびCD86、CD28の両リガンド、PD−1とリガンド結合するPD−L1/(B7−H1)が挙げられる。

0146

一部の実施形態では、少なくとも1つの共刺激リガンドは、4−1BBL、CD80、CD86、CD70、OX40L、CD48、TNFRSF14、PD−L1およびそれらの組合せからなる群から選択される。一実施形態では、共刺激リガンドは、4−1BBLである。限定されない一実施形態では、免疫応答性細胞は、M28zおよび4−1BBLを共発現する、例えば、図24Cおよび24Dに示されるようなM28z+4−1BBL。4−1BBLは、図24Dに示されるように、M28zの細胞外抗原結合性ドメインの5’末端に共有結合によって連結され得る。あるいは、4−1BBLは、図24Cに示されるように、M28zの細胞内ドメインの3’末端に共有結合によって連結され得る。

0147

OX40Lポリペプチドは、NCBI参照番号:BAB18304もしくはNP_003317(配列番号35)を有する配列に対して、少なくとも約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%もしくは100%相同であるアミノ酸配列もしくはその断片を有し得る、および/または必要に応じて、最大1つもしくは最大2つもしくは最大3つの保存的アミノ酸置換を含み得る。

0148

配列番号35は、以下に提供されている:

0149

ここで開示される主題に一致して、「OX40L核酸分子」は、OX40Lポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを指す。

0150

さらに、ここで開示される免疫応答性細胞は、免疫応答性細胞が、メソセリン特異的CARおよび少なくとも1種のサイトカインを外因性に共発現するように、または共発現するように誘導されるように、少なくとも1種の外因性サイトカインをさらに含み得る。一部の実施形態では、少なくとも1種のサイトカインは、IL−2、IL−3、IL−6、IL−7、IL−11、IL−12、IL−15、IL−17およびIL−21からなる群から選択される。一実施形態では、サイトカインは、IL−12である。限定されない一実施形態では、免疫応答性細胞は、M28zおよびIL−12を共発現する、例えば、図24Eに示されるようなM28z+IL−12。IL−12は、M28zの細胞内ドメインの3’末端に共有結合によって連結され得る。

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