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課題

グリコール酸オキシダーゼHAO1)遺伝子の発現および/または活性の調節に応答する特性、疾患および状態の研究、診断および処置のための化合物組成物、および方法の提供。

解決手段

15〜80の長さのヌクレオチドオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNAの発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って特定の配列から選択される標的HAO1mRNA配列に十分に相補的である、核酸。

概要

背景

原発性高シュウ酸尿症1型(「PH1」)は、肝臓に特異的な酵素アラニングリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ欠損により引き起こされる、希な常染色体劣性遺伝先天性グリオキシル酸代謝異常である。この障害は、シュウ酸塩過剰産生および尿中への過剰排出の原因となり、再発性尿路結石症および腎石灰化症を引き起こす。進行性病変に起因して糸球体濾過量が低下するので、シュウ酸塩が蓄積し、全身性シュウ酸症を引き起こす。診断は、臨床および超音波所見尿中シュウ酸塩評価、酵素学ならびに/またはDNA分析に基づく。初期保守的治療腎機能の維持を目標としていたが、慢性腎疾患ステージ4および5において、肝臓−腎臓移植を併用し、これまでに最良の結果が得られている(Cochat et al.Nephrol Dial Transplant 27:1729−36)。

PH1は、原発性高シュウ酸尿症の最も一般的な形態であり、欧州では人口100万人あたり1〜3症例の推定有病率、および年間の出生児数120,000人あたりおよそ1症例の罹患率を有する(Cochat et al.Nephrol Dial Transplant 10(Suppl 8):3−7;van Woerden et al.Nephrol Dial Transplant 18:273−9)。それは、欧州、米国、および日本からの登録数によれば、小児末期腎疾患ESRD)症例の1〜2%を占める(Harambat et al.Clin J Am Soc Nephrol 7:458−65)が、近親婚が一般的な国では、より有病率が高くなるようである(一部のフリカおよび中東諸国では、10%以上の有病率を有する;Kamoun and Lakhoua Pediatr Nephrol 10:479−82;Cochat and Rumsby N Engl J Med 369(7):649−58を参照のこと)。

グリコール酸オキシダーゼHAO1、すなわち「ヒドロキシ酸オキシダーゼ1」遺伝子の産物)は、肝臓および膵臓ミトコンドリアペルオキシソームグリシン代謝経路において、グリコール酸塩グリオキシル酸塩に変換させることに関与する酵素である。グリコール酸塩は、グリシン代謝経路の無害中間体であるが、グリオキシル酸塩の蓄積(例えば、AGT1変異による)はシュウ酸塩の蓄積を亢進させ、最終的にPH1疾患をもたらす。

25〜35の長さのヌクレオチド鎖を有する二本鎖RNAdsRNA)剤が、哺乳類細胞での標的遺伝子発現の効果的な阻害剤として記述されている(Rossi et al.,米国特許第8,084,599号および米国特許公開公報第2005/0277610号)。このような長さのdsRNA剤は、RNA干渉(RNAi)経路のDicer酵素によって処理されると考えられており、このような薬剤は「Dicer基質siRNA」(「DsiRNA」)剤と呼ばれている。DsiRNA剤のさらなる改変構造は従来より記述されている(Rossi et al.,米国特許公開公報第2007/0265220号)。効果的なDicer基質の伸長形態についても、近年記述されている(Brown,米国特許第8,349,809号および米国特許第8,513,207号)。

概要

グリコール酸オキシダーゼ(HAO1)遺伝子の発現および/または活性の調節に応答する特性、疾患および状態の研究、診断および処置のための化合物組成物、および方法の提供。15〜80の長さのヌクレオチドオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNAの発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って特定の配列から選択される標的HAO1mRNA配列に十分に相補的である、核酸。

目的

本発明は、15〜80の長さのヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド鎖を有する核酸であって、オリゴヌクレオチド鎖が、核酸が哺乳類細胞の中に導入される際に、HAO1標的mRNA発現を低減させるために、オリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、核酸を提供する

効果

実績

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請求項1

15〜80の長さのヌクレオチドオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304から選択される標的HAO1mRNA配列に十分に相補的である、核酸。

請求項2

19〜80の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNAの発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304から選択される標的HAO1mRNA配列に十分に相補的である、核酸。

請求項3

前記オリゴヌクレオチド鎖が19〜35の長さのヌクレオチドである、請求項1または請求項2に記載の核酸。

請求項4

RNAを含む第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を含む二本鎖核酸dsNA)であって、前記dsNAの前記第1の鎖が15〜66の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が19〜66の長さのヌクレオチドであり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNAの発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304から選択される標的HAO1mRNA配列に十分に相補的である、二本鎖核酸。

請求項5

第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を含む二本鎖核酸(dsNA)であって、前記dsNAの前記第1の鎖が15〜66の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が19〜66の長さのヌクレオチドであり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNAの発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304から選択される標的HAO1mRNA配列に十分に相補的である、二本鎖核酸。

請求項6

第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を含む二本鎖核酸(dsNA)であって、前記dsNAの前記第1の鎖が15〜66の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が19〜66の長さのヌクレオチドであり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、HAO1標的mRNAの発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304から選択される標的HAO1mRNA配列に十分に相補的であり、かつ配列番号1921〜2304から選択される該HAO1mRNA配列の該5’末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が前記配列の位置9および10の間の部位で前記mRNAを切断する、二本鎖核酸。

請求項7

(a)センス領域およびアンチセンス領域であって、前記センス領域および前記アンチセンス領域が25〜66塩基対からなる二本鎖領域を共に形成し、前記アンチセンス領域が配列番号1921〜2304から選択される配列に相補的である配列を含む、センス領域およびアンチセンス領域;ならびに(b)0〜2つの3’オーバーハング領域であって、各オーバーハング領域が6以下の長さのヌクレオチドである3’オーバーハング領域からなるdsNA分子であって、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、配列番号1921〜2304から選択される該HAO1mRNA配列の該5’末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が前記配列の位置9および10の間の部位で前記mRNAを切断する、dsNA分子。

請求項8

第1の核酸鎖および第2の核酸鎖ならびに少なくとも25塩基対の二本鎖領域を含む二本鎖核酸(dsNA)であって、前記dsNAの前記第1の鎖が25〜65の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が26〜66の長さのヌクレオチドであり、かつその3’末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的遺伝子発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304から選択される標的HAO1mRNA配列に十分に相補的である、二本鎖核酸。

請求項9

第1の核酸鎖および第2の核酸鎖ならびに少なくとも25塩基対の二本鎖領域を含む二本鎖核酸(dsNA)であって、前記dsNAの前記第1の鎖が25〜65の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が26〜66の長さのヌクレオチドであり、かつその3’末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の該3’末端および前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の該5’末端が平滑末端を形成し、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1mRNA発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304からなる群から選択される標的HAO1配列と十分に相補的である、二本鎖核酸。

請求項10

前記第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドである、請求項4〜9または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項11

前記第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドである、請求項4〜10または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項12

少なくとも25の塩基対;19〜21の塩基対および21〜25の塩基対からなる群から選択される二本鎖領域を含む、請求項4〜7または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項13

前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、その3’末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを含む、請求項4〜12または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項14

前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、その3’末端に5〜35の一本鎖ヌクレオチドを含む、請求項4〜12または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項15

前記一本鎖ヌクレオチドが改変ヌクレオチドを含む、請求項14に記載のdsNA。

請求項16

前記一本鎖ヌクレオチドが、2’−O−メチル、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−架橋、4’−(CH2)2−O−2’−架橋、2’−LNA、2’−アミノおよび2’−O−(N−メチルカルバマート)からなる群から選択される改変ヌクレオチドを含む、請求項14に記載のdsNA。

請求項17

前記一本鎖ヌクレオチドがリボヌクレオチドを含む、請求項14に記載のdsNA。

請求項18

前記一本鎖ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドを含む、請求項14に記載のdsNA。

請求項19

該第1の鎖の該3’末端および該第2の鎖の該5’末端が、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはその両方を含むポリヌクレオチド配列により結合され、任意に該ポリヌクレオチド配列がテトラループ配列を含む、請求項1〜18または請求項56のいずれか1項に記載の核酸またはdsNA。

請求項20

前記第1の鎖が25〜35の長さのヌクレオチドである、請求項4〜19または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項21

前記第2の鎖が25〜35の長さのヌクレオチドである、請求項4〜19または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項22

前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の最大27の長さのヌクレオチドに沿って標的HAO1cDNA配列GenBank寄託番号第NM_017545.2号に相補的である、請求項4〜21または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項23

該第1のオリゴヌクレオチド鎖の該3’末端での該第1のヌクレオチド(位置1)から開始して、位置1、2および/または3が改変ヌクレオチドで置換される、請求項4〜22または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項24

前記第1の鎖の前記3’末端および前記第2の鎖の前記5’末端が平滑末端を形成する、請求項4〜23または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項25

前記第1の鎖が25の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が27の長さのヌクレオチドである、請求項4〜24または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項26

配列番号1921〜2304から選択されるHAO1mRNA配列の該5’末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が前記配列の位置9および10の間の部位で前記mRNAを切断し、それによって前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減する、請求項4〜5、7〜25または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項27

前記第2の鎖が、配列番号385〜768からなる群から選択される配列を含む、請求項4〜26または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項28

前記第1の鎖が、配列番号1〜384からなる群から選択される配列を含む、請求項4〜27または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項29

表2から選択される一対の第1の鎖/第2の鎖配列を含む、請求項4〜28または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項30

前記第1の鎖の前記3’末端の前記改変ヌクレオチド残基が、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド(acyclonucleotide)および蛍光分子からなる群から選択される、請求項15に記載のdsNA。

請求項31

前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の前記3’末端の位置1がデオキシリボヌクレオチドである、請求項30に記載のdsNA。

請求項32

前記第2の鎖の前記3’末端の前記1〜5または5〜35の一本鎖ヌクレオチドの前記ヌクレオチドが、改変ヌクレオチドを含む、請求項7、8または13〜31のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項33

前記第2の鎖の前記3’末端の前記1〜5または5〜35の一本鎖ヌクレオチドの前記改変ヌクレオチドが、2’−O−メチルリボヌクレオチドである、請求項32に記載のdsNA。

請求項34

前記第2の鎖の前記3’末端の前記1〜5または5〜35の一本鎖ヌクレオチドの全てのヌクレオチドが、改変ヌクレオチドである、請求項32または33に記載のdsNA。

請求項35

前記dsNAが改変ヌクレオチドを含む、請求項4〜34のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項36

前記改変ヌクレオチド残基が、2’−O−メチル、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−架橋、4’−(CH2)2−O−2’−架橋、2’−LNA、2’−アミノおよび2’−O−(N−メチルカルバマート(methlycarbamate))からなる群から選択される、請求項35に記載のdsNA。

請求項37

前記第2の鎖の前記3’末端の前記1〜5または5〜35の一本鎖ヌクレオチドが、1〜3の長さのヌクレオチドである、請求項7、8または13〜36のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項38

前記第2の鎖の前記3’末端の前記1〜5または5〜35の一本鎖ヌクレオチドが、1〜2の長さのヌクレオチドである、請求項7、8または13〜37のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項39

前記第2の鎖の前記3’末端の前記1〜5または5〜35の一本鎖ヌクレオチドが、2の長さのヌクレオチドであり、かつ2’−O−メチル改変リボヌクレオチドを含む、請求項7、8または13〜38のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項40

前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、AS−M1〜AS−M96、AS−M210、AS−M1*〜AS−M96*およびAS−M210*からなる群から選択される改変パターンを含む、請求項4〜39または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項41

前記第1のオリゴヌクレオチド鎖が、SM1〜SM119およびSM250からなる群から選択される改変パターンを含む、請求項4〜40または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項42

前記第1の鎖および前記第2の鎖のそれぞれが、少なくとも26かつ最大30の長さのヌクレオチドを有する、請求項4〜41または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項43

前記dsNAがDicerにより前記細胞中内因的に切断される、請求項4〜42または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項44

前記標的遺伝子の発現を低減するために十分な前記単離核酸の量が、前記細胞の前記環境中で1ナノモル濃度以下、200ピコモル濃度以下、100ピコモル濃度以下、50ピコモル濃度以下、20ピコモル濃度以下、10ピコモル濃度以下、5ピコモル濃度以下、2ピコモル濃度以下および1ピコモル濃度以下からなる群から選択される、請求項1〜43または請求項56のいずれか1項に記載の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体。

請求項45

前記dsNAが、1ナノモル濃度以下の細胞の該環境中での有効濃度においてinvitroの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的HAO1mRNAの発現の低減において同一の前記標的HAO1mRNAの少なくとも19の該ヌクレオチドを対象とする21マーsiRNAよりも大きな効力を有する、請求項7〜44または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項46

前記dsNAが、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に少なくとも10%、少なくとも50%、少なくとも80〜90%、少なくとも95%、少なくとも98%、および少なくとも99%からなる群から選択される量(%により表される)でHAO1標的mRNA発現を低減するように、該標的HAO1mRNA配列に十分に相補的である、請求項1〜45または請求項56のいずれか1項に記載の核酸またはdsNA。

請求項47

該第1の鎖および第2の鎖が化学的リンカーにより結合される、請求項4〜46または56のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項48

前記第1の鎖の前記3’末端および前記第2の鎖の前記5’末端が化学的なリンカーにより結合される、請求項4〜47または56のいずれか1項に記載の二本鎖核酸。

請求項49

前記第2の鎖または第1の鎖のヌクレオチドが、Dicer開裂配向方向付ける改変ヌクレオチドで置換される、請求項4〜48または56のいずれか1項に記載の二本鎖核酸。

請求項50

デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、3’−デオキシアデノシンコルジセピン)、3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデオキシイノシン(ddI)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシジン(3TC)、2’,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシチミジン(d4T)、3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシチジン(3TC)のヌクレオチド一リン酸塩と2’,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシチミジン(d4T)のヌクレオチド一リン酸塩、4−チオウラシル5−ブロモウラシル、5−ヨードウラシル、5−(3−アミノアリル)−ウラシル、2’−O−アルキルリボヌクレオチド、2’−O−メチルリボヌクレオチド、2’−アミノリボヌクレオチド、2’−フルオロリボヌクレオチド、およびロックド核酸からなる群から選択される改変ヌクレオチドを含む、請求項1〜49または請求項56のいずれか1項に記載の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体。

請求項51

ホスホン酸塩ホスホロチオエートおよびホスホトリエステルからなる群から選択されるリン酸塩骨格改変を含む、請求項1〜50のいずれか1項に記載の単離核酸。

請求項52

モルフォリノ核酸およびペプチド核酸(PNA)からなる群から選択される改変を含む、請求項1〜51のいずれか1項に記載の単離核酸。

請求項53

前記dsNA、核酸またはハイブリッド形成複合体が、ダイナミックポリコンジュゲートDPC)に付着する、請求項1〜52または56のいずれか1項に記載の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体。

請求項54

前記dsNA、核酸またはハイブリッド形成複合体が、DPCと共に投与され、該dsNAおよびDPCが任意に付着していない、請求項1〜53または56のいずれか1項に記載の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体。

請求項55

前記dsNA、核酸またはハイブリッド形成複合体が、GalNAc部分、コレステロールおよびコレステロール標的化リガンドからなる群から選択される部分に付着する、請求項1〜54または56のいずれか1項に記載の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体。

請求項56

組成物であって、第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を含むdsNAであって、前記dsNAの前記第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNAの発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304から選択される標的HAO1mRNA配列に十分に相補的である、dsNA;第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を含むdsNAであって、前記dsNAの前記第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、HAO1標的mRNAの発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304から選択される標的HAO1mRNA配列に十分に相補的であり、かつ配列番号1921〜2304から選択される該HAO1mRNA配列の該5’末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が前記配列の位置9および10の間の部位で前記mRNAを切断する、dsNA;(a)センス領域およびアンチセンス領域であって、前記センス領域および前記アンチセンス領域が25〜35塩基対からなる二本鎖領域を共に形成し、前記アンチセンス領域が配列番号1921〜2304から選択される配列に相補的である配列を含む、センス領域およびアンチセンス領域;ならびに(b)0〜2つの3’オーバーハング領域であって、各オーバーハング領域が6以下の長さのヌクレオチドである3’オーバーハング領域からなるdsNA分子であって、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、配列番号1921〜2304から選択される該HAO1mRNA配列の該5’末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が前記配列の位置9および10の間の部位で前記mRNAを切断する、dsNA分子;第1の核酸鎖および第2の核酸鎖ならびに少なくとも25塩基対の二本鎖領域を含むdsNAであって、前記dsNAの前記第1の鎖が25〜34の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が26〜35の長さのヌクレオチドであり、かつその3’末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的遺伝子発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304から選択される標的HAO1mRNA配列に十分に相補的である、dsNA;第1の核酸鎖および第2の核酸鎖ならびに少なくとも25塩基対の二本鎖領域を含むdsNAであって、前記dsNAの前記第1の鎖が25〜34の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が26〜35の長さのヌクレオチドであり、かつその3’末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを含み、前記第1のオリゴヌクレオチド鎖の該3’末端および前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の該5’末端が平滑末端を形成し、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1mRNA発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304からなる群から選択される標的HAO1配列と十分に相補的である、dsNA;19〜35の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNAの発現を低減するように、前記オリゴヌクレオチド鎖が前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304から選択される標的HAO1mRNA配列に十分に相補的である、核酸;15〜35の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を含む核酸であって、前記オリゴヌクレオチド鎖が、前記オリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号1921〜2304からなる群から選択される標的HAO1mRNA配列とハイブリッド形成可能である、核酸;RNAを含む第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を含むdsNAであって、前記dsNAの前記第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号1921〜2304からなる群から選択される標的HAO1mRNA配列とハイブリッド形成可能である、dsNA;RNAを含む第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を含むdsNAであって、前記dsNAの前記第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、前記第2の鎖が少なくとも35の長さのヌクレオチドであり、任意に配列番号385〜768の少なくとも25の長さのヌクレオチドの配列を含み、前記二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNAの発現を低減するように、前記第2のオリゴヌクレオチド鎖が前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304から選択される標的HAO1mRNA配列に十分に相補的である、dsNA;5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、前記第1の鎖が25〜53の長さのヌクレオチド残基であり、該第1の鎖の該5’末端での該第1のヌクレオチド(位置1)から開始して、前記第1の鎖の位置1〜23が、リボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり;前記第2の鎖が27〜53の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するために該リボヌクレオチドまたは前記第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する、23の連続したリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドを含み;該第1の鎖の該5’末端および該第2の鎖の該3’末端が、平滑末端、1〜6ヌクレオチドの5’オーバーハングおよび1〜6ヌクレオチドの3’オーバーハングからなる群から選択される構造を形成し;前記第1の鎖の該3’末端および前記第2の鎖の該5’末端が、平滑末端、1〜6ヌクレオチドの5’オーバーハングおよび1〜6ヌクレオチドの3’オーバーハングからなる群から選択される構造を形成し;前記第1の鎖の該3’末端ヌクレオチド残基の位置24のうち少なくとも1つが、該第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと任意に塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり;該第2の鎖が、該二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するように、該第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304から選択される標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、該第2の鎖が27〜53の長さのヌクレオチド残基であり、該第2の鎖の該5’末端での該第1のヌクレオチド(位置1)から開始して、該第2の鎖の位置1〜23が、リボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり;該第1の鎖が25〜53の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するために該第2の鎖の位置1〜23の該リボヌクレオチドと十分に塩基対を形成する、23の連続したリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドを含み;該第2の鎖の該3’末端ヌクレオチド残基の位置24のうち少なくとも1つが、該第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドと任意に塩基対を形成する、デオキシリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり;該第2の鎖が、該二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するように、該第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304から選択される標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、該5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、該3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、該第1の鎖(または該第2の鎖)が25〜30の長さのヌクレオチド残基であり、該5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、該第1の鎖(または該第2の鎖)の位置1〜23が、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;該第2の鎖(または該第1の鎖)が36〜66の長さのヌクレオチド残基であり、該3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために該第1の鎖の位置1〜23と対を形成する該位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;該第2の鎖(または該第1の鎖)の少なくとも該3’末端ヌクレオチドが該第1の鎖(または該第2の鎖)と対になっておらず、最大6の連続した3’末端ヌクレオチドが該第1の鎖(または該第2の鎖)と対になっておらず、それによって1〜6ヌクレオチドの3’一本鎖オーバーハングを形成し;該第2の鎖(または該第1の鎖)の該5’末端が、該第1の鎖(または該第2の鎖)と対になっていない10〜30の連続したヌクレオチドを含み、それによって10〜30ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;該第1の鎖および第2の鎖が最大の相補性アライメントされる場合、少なくとも該第1の鎖(または該第2の鎖)の5’末端および3’末端ヌクレオチドが、該第2の鎖(または該第1の鎖)のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって該第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;該第2の鎖が、該二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するように、該第2の鎖の少なくとも19の長さのリボヌクレオチドに沿って標的RNAと十分に相補的である、dsNA;5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、該5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、該3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、該第1の鎖が25〜35の長さのヌクレオチド残基であり、該5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、該第2の鎖の位置1〜25が少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;該第2の鎖が30〜66の長さのヌクレオチド残基であり、該3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために該第1の鎖の位置1〜25と対を形成する該位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;該第2の鎖の該5’末端が、該第1の鎖と対になっていない5〜35の連続したヌクレオチドを含み、それによって5〜35ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;該第1の鎖および第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも該第1の鎖の5’末端および3’末端ヌクレオチドが、該第2の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって該第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;該第2の鎖が、該二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するように、該第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304から選択される標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、該5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、該3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、該第2の鎖が19〜30の長さのヌクレオチド残基であり、任意に25〜30の長さのヌクレオチド残基であり、該5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、該第2の鎖の位置1〜17(任意に位置1〜23)が、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;該第1の鎖が24〜66の長さのヌクレオチド残基(任意に30〜66の長さのヌクレオチド残基)であり、該3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために該第2の鎖の位置1〜17(任意に位置1〜23)と対を形成する該位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;該第1の鎖の該3’末端および該第2の鎖の該5’末端が、平滑末端、3’オーバーハングおよび5’オーバーハングからなる群から選択される構造を含み、任意に該オーバーハングは1〜6の長さのヌクレオチドであり;該第1の鎖の該5’末端が、該第2の鎖と対になっていない5〜35の連続したヌクレオチドを含み、それによって5〜35ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;該第1の鎖および第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも該第2の鎖の5’末端および3’末端ヌクレオチドが、該第1の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって該第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;該第2の鎖が、該二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するように、該第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304から選択される標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;第1の鎖および第2の鎖を含むdsNAであって、該第1の鎖および該第2の鎖が19〜25の長さのヌクレオチドの二本鎖領域を形成し、該第1の鎖が、該第1の鎖−第2の鎖の二本鎖領域を超えて伸長し、かつテトラループを含む3’領域を含み、該dsNAが該第1の鎖の該3’末端と該第2の鎖の該5’末端との間に不連続性をさらに含み、該第1の鎖または第2の鎖が、該dsNAが哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するように、該第1の鎖または第2の鎖の少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号1921〜2304から選択される標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を含むdsNAであって、該5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、該3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、該第1のオリゴヌクレオチド鎖が25〜53の長さのヌクレオチドであり、該第2のオリゴヌクレオチド鎖が25〜53の長さのヌクレオチドであり、該dsNAが、該dsNAのdicer開裂を実質的に防止するのに十分なほど多く改変され、任意に該dsNAが、哺乳類細胞中でLDHmRNA発現を低減できる1つ以上の19〜23の長さのヌクレオチド鎖dsNAを得るために、非dicerヌクレアーゼによって切断される、dsNA;外来核酸配列および配列番号1921〜2304からなる群から選択される標的HAO1mRNA配列を持つ細胞内のinvivoハイブリッド形成複合体;ならびに外来核酸配列および配列番号1921〜2304からなる群から選択される標的HAO1mRNA配列を持つ細胞内のinvitroハイブリッド形成複合体からなる群から選択される組成物。

請求項57

少なくとも25塩基対の二本鎖領域を有し、前記dsNAが、1ナノモル濃度以下の細胞の該環境中での有効濃度においてinvitroの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的HAO1mRNAの発現の低減において同一の前記標的HAO1mRNAの少なくとも19の該ヌクレオチドを対象とする21マーsiRNAよりも大きな効力を有する、請求項56に記載のdsNA。

請求項58

少なくとも25塩基対の二本鎖領域を有し、前記dsNAが、1ナノモル濃度、200ピコモル濃度、100ピコモル濃度、50ピコモル濃度、20ピコモル濃度、10ピコモル濃度、5ピコモル濃度、2ピコモル濃度および1ピコモル濃度からなる群から選択される濃度でinvitroの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的HAO1mRNAの発現の低減において同一の前記標的HAO1mRNAの少なくとも19の該ヌクレオチドを対象とする21マーsiRNAよりも大きな効力を有する、請求項56または57に記載のdsNA。

請求項59

前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15または19のヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドに沿って該標的HAO1mRNA配列に対して、前記第2のオリゴヌクレオチドの前記15または19の連続したヌクレオチドが、前記標的HAO1mRNA配列と最大の相補性でアライメントされる場合、4以下のミスマッチ核酸残基を有する、請求項4〜58のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項60

前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15または19のヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドに沿って該標的HAO1mRNA配列に対して、前記第2のオリゴヌクレオチドの前記15または19の連続したヌクレオチドが、前記標的HAO1mRNA配列と最大の相補性でアライメントされる場合、3以下のミスマッチ核酸残基を有する、請求項4〜59のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項61

前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15または19のヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドに沿って該標的HAO1mRNA配列に対して、前記第2のオリゴヌクレオチドの前記15または19の連続したヌクレオチドが、前記標的HAO1mRNA配列と最大の相補性でアライメントされる場合、2以下のミスマッチ核酸残基を有する、請求項4〜60のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項62

前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15または19のヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドに沿って該標的HAO1mRNA配列に対して、前記第2のオリゴヌクレオチドの前記15または19の連続したヌクレオチドが、前記標的HAO1mRNA配列と最大の相補性でアライメントされる場合、1つのミスマッチ核酸残基を有する、請求項4〜61のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項63

前記第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15または19のヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドが、前記第2のオリゴヌクレオチドの前記15または19の連続したヌクレオチドが、前記標的HAO1mRNA配列と最大の相補性でアライメントされる場合、該標的HAO1mRNA配列と完全に相補的である、請求項4〜62のいずれか1項に記載のdsNA。

請求項64

哺乳類細胞中で標的HAO1遺伝子の発現を低減する方法であって、invitroで哺乳類細胞を、前記細胞中で標的HAO1mRNAの発現を低減するのに十分な量の請求項1〜63のいずれか1項に記載の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体と接触させることを含む、方法。

請求項65

標的HAO1mRNA発現が、少なくとも10%、少なくとも50%および少なくとも80〜90%からなる群から選択される量(%により表される)で減少する、請求項64に記載の方法。

請求項66

HAO1mRNAレベルが、前記細胞を前記dsNAと接触させてから少なくとも8日後において、少なくとも90%の量(%により表される)で減少する、請求項64または65に記載の方法。

請求項67

HAO1mRNAレベルが、前記細胞を前記dsNAと接触させてから少なくとも10日後において、少なくとも70%の量(%により表される)で減少する、請求項64〜66のいずれか1項に記載の方法。

請求項68

哺乳類中で標的HAO1mRNAの発現を低減する方法であって、該哺乳類中で標的HAO1mRNAの発現を低減するために十分な量の請求項1〜63のいずれか1項に記載の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体を哺乳類に投与することを含む、方法。

請求項69

前記単離核酸が脂質ナノ粒子(LNP)中で製剤化される、請求項68に記載の方法。

請求項70

前記単離核酸が、1マイクログラム〜5ミリグラム/kg前記哺乳類/日、100マイクログラム〜0.5ミリグラム/kg、0.001〜0.25ミリグラム/kg、0.01〜20マイクログラム/kg、0.01〜10マイクログラム/kg、0.10〜5マイクログラム/kg、および0.1〜2.5マイクログラム/kgからなる群から選択される用量で投与される、請求項68〜69のいずれか1項に記載の方法。

請求項71

前記核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体が、1ナノモル濃度以下の細胞の該環境中での有効濃度においてinvitroの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的HAO1mRNAの発現の低減において同一の前記標的HAO1mRNAの少なくとも19の該ヌクレオチドを対象とする21マーsiRNAよりも大きな効力を有する、請求項68〜70のいずれか1項に記載の方法。

請求項72

HAO1mRNAレベルが、前記単離dsNAを前記哺乳類に投与してから少なくとも3日後において、少なくとも70%の量(%により表される)で前記哺乳類の組織中で減少する、請求項68〜71のいずれか1項に記載の方法。

請求項73

前記組織が肝臓組織である、請求項72に記載の方法。

請求項74

前記投与するステップが、静脈内注射筋肉内注射腹腔内注射点滴皮下注射経皮注射、エアロゾル直腸送達送達、局所送達、経口送達および吸入送達からなる群から選択される様式を含む、請求項68〜73のいずれか1項に記載の方法。

請求項75

対象の疾患または障害治療または予防する方法であって、前記対象の前記疾患または障害を治療または予防するのに十分な量の請求項1〜63のいずれか1項に記載の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体を前記対象に投与することを含む、方法。

請求項76

前記疾患または障害が原発性高シュウ酸尿症1型(PH1)である、請求項75に記載の方法。

請求項77

前記対象がヒトである、請求項75または76に記載の方法。

請求項78

請求項1〜63のいずれか1項に記載の該核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体を含む製剤であって、前記核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体が、少なくとも10%、少なくとも50%および少なくとも80〜90%からなる群から選択される量(%により表される)で哺乳類細胞内にinvitroで導入される際に、前記核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体が、標的HAO1mRNAレベルを低減するために有効な量で存在する、製剤。

請求項79

前記有効量が、前記細胞の該環境中で1ナノモル濃度以下、200ピコモル濃度以下、100ピコモル濃度以下、50ピコモル濃度以下、20ピコモル濃度以下、10ピコモル濃度以下、5ピコモル濃度以下、2ピコモル濃度以下および1ピコモル濃度以下からなる群から選択される、請求項78に記載の製剤。

請求項80

請求項1〜63のいずれか1項に記載の該核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体を含む製剤であって、前記核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体が、少なくとも10%、少なくとも50%および少なくとも80〜90%からなる群から選択される量(%により表される)で哺乳類対象の細胞内に導入される際に、前記核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体が、標的HAO1mRNAレベルを低減するために有効な量で存在する、製剤。

請求項81

前記有効量が、1マイクログラム〜5ミリグラム/kg前記対象/日、100マイクログラム〜0.5ミリグラム/kg、0.001〜0.25ミリグラム/kg、0.01〜20マイクログラム/kg、0.01〜10マイクログラム/kg、0.10〜5マイクログラム/kg、および0.1〜2.5マイクログラム/kgからなる群から選択される用量である、請求項80に記載の製剤。

請求項82

前記核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体が、1ナノモル濃度以下の細胞の該環境中での有効濃度においてinvitroの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的HAO1mRNAレベルの低減において同一の前記標的HAO1mRNAの少なくとも19の該ヌクレオチドを対象とする21マーsiRNAよりも大きな効力を有する、請求項78〜81のいずれか1項に記載の製剤。

請求項83

請求項1〜63のいずれか1項に記載の該核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体を含む哺乳類細胞。

請求項84

請求項1〜63のいずれか1項に記載の該核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物

請求項85

請求項1〜63のいずれか1項に記載の該核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体およびその使用のための説明書を含むキット

請求項86

請求項1〜63のいずれか1項に記載の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体から本質的になるHAO1阻害活性を有する組成物。

技術分野

0001

関連出願
本願は、米国特許法第119条(e)の下で、2013年12月27日に出願の「Methodsand Compositions for the Specific Inhibition of Glycolate Oxidase (HAO 1) by Double−Stranded RNA」(二本鎖RNAによるグリコール酸オキシダーゼ(HAO1)の特異的阻害に関する方法および組成物)という表題の米国特許仮出願番号第61/921,181号、および2014年2月10日に出願の「Methods and Compositions for the Specific Inhibition of Glycolate Oxidase (HAO 1) by Double−Stranded RNA」(二本鎖RNAによるグリコール酸オキシダーゼ(HAO1)の特異的阻害に関する方法および組成物)という表題の米国特許仮出願番号第61/937,838号に対する優先権、および利益を主張する。上述の特許出願全体は、この参照により本明細書に援用される。

0002

発明の分野
本発明は、グリコール酸オキシダーゼ(HAO1)遺伝子の発現および/または活性の調節に応答する特性、疾患および状態の研究、診断および処置のための化合物、組成物、および方法に関する。

0003

配列の提出
本願は、電子形式配列表と共に出願されている。配列表は、「301937_94015WO_seq_listing」という表題であり、2014年12月23日に作成されたもので、サイズは2.87MBである。配列表の電子形式における情報は本願の一部であり、その全体が参照により本明細書に援用される。

背景技術

0004

原発性高シュウ酸尿症1型(「PH1」)は、肝臓に特異的な酵素アラニングリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ欠損により引き起こされる、希な常染色体劣性遺伝先天性グリオキシル酸代謝異常である。この障害は、シュウ酸塩過剰産生および尿中への過剰排出の原因となり、再発性尿路結石症および腎石灰化症を引き起こす。進行性病変に起因して糸球体濾過量が低下するので、シュウ酸塩が蓄積し、全身性シュウ酸症を引き起こす。診断は、臨床および超音波所見尿中シュウ酸塩評価、酵素学ならびに/またはDNA分析に基づく。初期保守的治療腎機能の維持を目標としていたが、慢性腎疾患ステージ4および5において、肝臓−腎臓移植を併用し、これまでに最良の結果が得られている(Cochat et al.Nephrol Dial Transplant 27:1729−36)。

0005

PH1は、原発性高シュウ酸尿症の最も一般的な形態であり、欧州では人口100万人あたり1〜3症例の推定有病率、および年間の出生児数120,000人あたりおよそ1症例の罹患率を有する(Cochat et al.Nephrol Dial Transplant 10(Suppl 8):3−7;van Woerden et al.Nephrol Dial Transplant 18:273−9)。それは、欧州、米国、および日本からの登録数によれば、小児末期腎疾患ESRD)症例の1〜2%を占める(Harambat et al.Clin J Am Soc Nephrol 7:458−65)が、近親婚が一般的な国では、より有病率が高くなるようである(一部のフリカおよび中東諸国では、10%以上の有病率を有する;Kamoun and Lakhoua Pediatr Nephrol 10:479−82;Cochat and Rumsby N Engl J Med 369(7):649−58を参照のこと)。

0006

グリコール酸オキシダーゼ(HAO1、すなわち「ヒドロキシ酸オキシダーゼ1」遺伝子の産物)は、肝臓および膵臓ミトコンドリアペルオキシソームグリシン代謝経路において、グリコール酸塩グリオキシル酸塩に変換させることに関与する酵素である。グリコール酸塩は、グリシン代謝経路の無害中間体であるが、グリオキシル酸塩の蓄積(例えば、AGT1変異による)はシュウ酸塩の蓄積を亢進させ、最終的にPH1疾患をもたらす。

0007

25〜35の長さのヌクレオチド鎖を有する二本鎖RNA(dsRNA)剤が、哺乳類細胞での標的遺伝子発現の効果的な阻害剤として記述されている(Rossi et al.,米国特許第8,084,599号および米国特許公開公報第2005/0277610号)。このような長さのdsRNA剤は、RNA干渉(RNAi)経路のDicer酵素によって処理されると考えられており、このような薬剤は「Dicer基質siRNA」(「DsiRNA」)剤と呼ばれている。DsiRNA剤のさらなる改変構造は従来より記述されている(Rossi et al.,米国特許公開公報第2007/0265220号)。効果的なDicer基質の伸長形態についても、近年記述されている(Brown,米国特許第8,349,809号および米国特許第8,513,207号)。

0008

本発明は、dsRNAに基づくノックダウン療法の魅力的な標的としてのHAO1の同定に、少なくとも部分的に基づく。特に、HAO1標的として、その発現を低減させる核酸剤が、本明細書で提供される。このような組成物は、二本鎖RNA(「dsRNA」)などの核酸、およびそれらを調製する方法を含む。本発明の核酸は、in vitroまたは哺乳類の対象中のいずれかで、細胞内の標的グリコール酸オキシダーゼ遺伝子の発現を低減できる。

0009

1つの態様では、本発明は、15〜80の長さのヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド鎖を有する核酸であって、オリゴヌクレオチド鎖が、核酸が哺乳類細胞の中に導入される際に、HAO1標的mRNA発現を低減させるために、オリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、核酸を提供する。

0010

本発明の別の態様は、19〜80の長さのヌクレオチドであるオリゴヌクレオチド鎖を有する核酸であって、オリゴヌクレオチド鎖が、核酸が哺乳類細胞の中に導入される際に、HAO1標的mRNA発現を低減させるために、オリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、核酸を提供する。

0011

1つの実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖は、19〜35の長さのヌクレオチドである。

0012

本発明の追加的な態様は、RNAを含む第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を有する二本鎖核酸(dsNA)であって、dsNAの第1の鎖が15〜66の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が19〜66の長さのヌクレオチドであり、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、核酸を提供する。

0013

本発明の別の態様は、第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を有する二本鎖核酸(dsNA)であって、dsNAの第1の鎖が15〜66の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が19〜66の長さのヌクレオチドであり、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、核酸を提供する。

0014

本発明のさらなる態様は、第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を有する二本鎖核酸(dsNA)であって、dsNAの第1の鎖が15〜66の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が19〜66の長さのヌクレオチドであり、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的であり、かつ配列番号1921〜2304のHAO1mRNA配列の5’末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が配列の位置9および10の間の部位でmRNAを切断する、核酸を提供する。

0015

本発明の別の態様は、(a)センス領域およびアンチセンス領域であって、センス領域およびアンチセンス領域が25〜66塩基対からなる二本鎖領域を共に形成し、アンチセンス領域が配列番号1921〜2304の配列に相補的である配列を含む、センス領域およびアンチセンス領域;ならびに(b)0〜2つの3’オーバーハング領域であって、各オーバーハング領域が6以下の長さのヌクレオチドである、3’オーバーハング領域からなるdsNA分子であって、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、配列番号1921〜2304のHAO1mRNA配列の5’末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が配列の位置9および10の間の部位でmRNAを切断する、dsNA分子を提供する。

0016

本発明の追加的な態様は、第1の核酸鎖および第2の核酸鎖、ならびに少なくとも25の塩基対の二本鎖領域を有する二本鎖核酸(dsNA)であって、dsNAの第1の鎖が25〜65の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が26〜66の長さのヌクレオチドであり、かつその3’末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを含み、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的遺伝子発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNAを提供する。

0017

本発明の別の態様は、第1の核酸鎖および第2の核酸鎖、ならびに少なくとも25の塩基対の二本鎖領域を有する二本鎖核酸(dsNA)であって、dsNAの第1の鎖が25〜65の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が26〜66の長さのヌクレオチドであり、かつその3’末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを含み、第1のオリゴヌクレオチド鎖の3’末端および第2のオリゴヌクレオチド鎖の5’末端が平滑末端を形成し、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1配列と十分に相補的である、dsNAを提供する。

0018

1つの実施形態では、第1の鎖は、15〜35の長さのヌクレオチドである。

0019

別の実施形態では、第2の鎖は、19〜35の長さのヌクレオチドである。

0020

追加的な実施形態では、dsNAは、少なくとも25の塩基対;19〜21の塩基対または21〜25の塩基対の二本鎖領域を有する。

0021

任意に、第2のオリゴヌクレオチド鎖は、その3’末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを含む。

0022

1つの実施形態では、第2のオリゴヌクレオチド鎖は、その3’末端に5〜35の一本鎖ヌクレオチドを含む。

0023

別の実施形態では、一本鎖ヌクレオチドは、改変ヌクレオチドを含む。任意に、一本鎖ヌクレオチドは、2’−O−メチル、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−架橋、4’−(CH2)2−O−2’−架橋、2’−LNA、2’−アミノおよび/または2’−O−(N−メチルカルバマート)改変ヌクレオチドを含む。

0024

ある特定の実施形態では、一本鎖ヌクレオチドは、リボヌクレオチドを含む。任意に、一本鎖ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドを含む。

0025

ある特定の実施形態では、本発明のdsNAまたはハイブリッド形成複合体の第1の鎖の3’末端および第2の鎖の5’末端は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはその両方を含むポリヌクレオチド配列により結合され、任意にポリヌクレオチド配列は、テトラループ配列を含む。

0026

1つの実施形態では、第1の鎖は、25〜35の長さのヌクレオチドである。任意に、第2の鎖は、25〜35の長さのヌクレオチドである。

0027

1つの実施形態では、第2のオリゴヌクレオチド鎖は、第2のオリゴヌクレオチド鎖の最大27の長さのヌクレオチドに沿って標的HAO1cDNA配列GenBank寄託番号第NM_017545.2号に相補的である。

0028

別の実施形態では、第1のオリゴヌクレオチド鎖の3’末端での第1のヌクレオチド(位置1)から開始して、位置1、2および/または3が、改変ヌクレオチドに置換される。

0029

任意に、第1の鎖および第2の鎖の5’末端は、平滑末端を形成する。

0030

1つの実施形態では、第1の鎖は25の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖は27の長さのヌクレオチドである。

0031

別の実施形態では、配列番号1921〜2304のHAO1mRNA配列の5’末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が配列の位置9および10の間の部位でmRNAを切断し、それによって二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減する。

0032

1つの実施形態では、第2の鎖は、配列番号385〜768の配列を含む。追加的な実施形態では、第1の鎖は、配列番号1〜384の配列を含む。

0033

別の実施形態では、本発明のdsNAは、表2の一対の第1の鎖/第2の鎖配列を有する。

0034

任意に、第1の鎖の3’末端の改変ヌクレオチド残基は、デオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチドまたは蛍光分子である。

0035

1つの実施形態では、第1のオリゴヌクレオチド鎖の3’末端の位置1は、デオキシリボヌクレオチドである。

0036

別の実施形態では、第2の鎖の3’末端の1〜5または5〜35の一本鎖ヌクレオチドのヌクレオチドは、改変ヌクレオチドを含む。

0037

1つの実施形態では、第2の鎖の3’末端の1〜5または5〜35の一本鎖ヌクレオチドの改変ヌクレオチドは、2’−O−メチルリボヌクレオチドである。

0038

追加的な実施形態では、第2の鎖の3’末端の1〜5または5〜35の一本鎖ヌクレオチドの全てのヌクレオチドは、改変ヌクレオチドである。

0039

別の実施形態では、dsNAは、改変ヌクレオチドを含む。任意に、改変ヌクレオチド残基は、2’−O−メチル、2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−架橋、4’−(CH2)2−O−2’−架橋、2’−LNA、2’−アミノまたは2’−O−(N−メチルカルバマート)である。

0040

1つの実施形態では、第2の鎖の3’末端の1〜5または5〜35の一本鎖ヌクレオチドは、1〜3の長さのヌクレオチドであり、任意に1〜2の長さのヌクレオチドである。

0041

別の実施形態では、第2の鎖の3’末端の1〜5または5〜35の一本鎖ヌクレオチドは、2つの長さのヌクレオチドであり、2’−O−メチル改変リボヌクレオチドを含む。

0042

1つの実施形態では、第2のオリゴヌクレオチド鎖は、AS−M1〜AS−M96およびAS−M1*〜AS−M96*の改変パターンを含む。

0043

別の実施形態では、第1のオリゴヌクレオチド鎖は、SM1〜SM119の改変パターンを含む。

0044

追加的な実施形態では、第1の鎖および第2の鎖のそれぞれは、少なくとも26かつ最大30の長さのヌクレオチドを有する。

0045

1つの実施形態では、dsNAは、Dicerにより細胞中内因的に切断される。

0046

別の実施形態では、標的遺伝子の発現を低減するために十分な核酸の量は、細胞環境において1ナノモル濃度以下、200ピコモル濃度以下、100ピコモル濃度以下、50ピコモル濃度以下、20ピコモル濃度以下、10ピコモル濃度以下、5ピコモル濃度以下、2ピコモル濃度以下および1ピコモル濃度以下である。

0047

1つの実施形態では、dsNAは、1ナノモル濃度以下の細胞の環境中での有効濃度においてin vitroの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的HAO1mRNAの発現の低減において同一の標的HAO1mRNAの少なくとも19のヌクレオチドを対象とする21マーsiRNAよりも大きな効力を有する。

0048

追加的な実施形態では、核酸またはdsNAは、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、少なくとも10%、少なくとも50%、少なくとも80〜90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の量(%により表される)でHAO1標的mRNA発現を低減するため、標的HAO1mRNA配列に十分に相補的である。

0049

1つの実施形態では、第1の鎖および第2の鎖は、化学的リンカーにより結合される。

0050

別の実施形態では、第1の鎖の3’末端および第2の鎖の5’末端は、化学的なリンカーにより結合される。

0051

追加的な実施形態では、第2の鎖または第1の鎖のヌクレオチドは、Dicer開裂の方向を指示する改変ヌクレオチドで置換される。

0052

1つの実施形態では、核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体は、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、アシクロヌクレオチド、3’−デオキシアデノシンコルジセピン)、3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデオキシイノシン(ddI)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシジン(3TC)、2’,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシチミジン(d4T)、3’−アジド−3’−デオキシチミジン(AZT)、2’,3’−ジデオキシ−3’−チアシチジン(3TC)のヌクレオチド一リン酸塩と2’,3’−ジデヒドロ−2’,3’−ジデオキシチミジン(d4T)のヌクレオチド一リン酸塩、4−チオウラシル5−ブロモウラシル、5−ヨードウラシル、5−(3−アミノアリル)−ウラシル、2’−O−アルキルリボヌクレオチド、2’−O−メチルリボヌクレオチド、2’−アミノリボヌクレオチド、2’−フルオロリボヌクレオチド、またはロックド核酸改変ヌクレオチドを有する。

0053

別の実施形態では、核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体は、ホスホン酸塩ホスホロチオエートまたはホスホトリエステルリン酸塩骨格改変を含む。

0054

1つの実施形態では、核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体は、モルフォリノ核酸またはペプチド核酸(PNA)を含む。

0055

追加的な実施形態では、核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体は、dynamic polyconjugate(DPC)に付着する。

0056

1つの実施形態では、核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体はDPCと共に投与され、dsNAおよびDPCは、任意に付着していない。

0057

別の実施形態では、核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体は、GalNAc部分、コレステロールおよび/またはコレステロール標的化リガンドに付着する。

0058

本発明の別の態様は、以下の組成物を提供する:
第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を有するdsNAであって、dsNAの第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を有するdsNAであって、dsNAの第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的であり、かつ配列番号1921〜2304のHAO1mRNA配列の5’末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が配列の位置9および10の間の部位でmRNAを切断する、dsNA;
(a)センス領域およびアンチセンス領域であって、センス領域およびアンチセンス領域が25〜35塩基対からなる二本鎖領域を共に形成し、アンチセンス領域が配列番号1921〜2304の配列に相補的である配列を含む、センス領域およびアンチセンス領域;ならびに(b)0〜2つの3’オーバーハング領域であって、各オーバーハング領域が6以下の長さのヌクレオチドである、3’オーバーハング領域からなるdsNA分子であって、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に、配列番号1921〜2304のHAO1mRNA配列の5’末端(位置1)から開始して、哺乳類のAgo2が配列の位置9および10の間の部位でmRNAを切断する、dsNA分子;
第1の核酸鎖および第2の核酸鎖、ならびに少なくとも25の塩基対の二本鎖領域を有するdsNAであって、dsNAの第1の鎖が25〜34の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が26〜35の長さのヌクレオチドであり、かつその3’末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを含み、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的遺伝子発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
第1の核酸鎖および第2の核酸鎖、ならびに少なくとも25の塩基対の二本鎖領域を有するdsNAであって、dsNAの第1の鎖が25〜34の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が26〜35の長さのヌクレオチドであり、かつその3’末端に1〜5の一本鎖ヌクレオチドを含み、第1のオリゴヌクレオチド鎖の3’末端および第2のオリゴヌクレオチド鎖の5’末端が平滑末端を形成し、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1配列と十分に相補的である、dsNA;
19〜35の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を有する核酸であって、オリゴヌクレオチド鎖が、核酸が哺乳類細胞の中に導入される際に、HAO1標的mRNA発現を低減させるために、オリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも19の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、核酸;
15〜35の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチド鎖を有する核酸であって、オリゴヌクレオチド鎖が、オリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列とハイブリッド形成可能である、核酸;
RNAを有する第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を有するdsNAであって、dsNAの第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が19〜35の長さのヌクレオチドであり、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列とハイブリッド形成可能である、dsNA;
RNAを有する第1の核酸鎖および第2の核酸鎖を有するdsNAであって、dsNAの第1の鎖が15〜35の長さのヌクレオチドであり、第2の鎖が少なくとも35の長さのヌクレオチドであり、任意に配列番号385〜768の少なくとも25の長さのヌクレオチドの配列を含み、第2のオリゴヌクレオチド鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有するdsNAであって、第1の鎖が25〜53の長さのヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5’末端での第1のヌクレオチド(位置1)から開始して、第1の鎖の位置1〜23が、リボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり;第2の鎖が27〜53の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するためにリボヌクレオチドまたは第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する、23の連続したリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドを含み;第1の鎖の5’末端および第2の鎖の3’末端が、平滑末端、1〜6ヌクレオチドの5’オーバーハングおよび1〜6ヌクレオチドの3’オーバーハングの構造を形成し;第1の鎖の3’末端および第2の鎖の5’末端が、平滑末端、1〜6ヌクレオチドの5’オーバーハングおよび1〜6ヌクレオチドの3’オーバーハングの構造を形成し;第1の鎖の3’末端ヌクレオチド残基の位置24のうち少なくとも1つが、第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと任意に塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有するdsNAであって、第2の鎖が27〜53の長さのヌクレオチド残基であり、第2の鎖の5’末端での第1のヌクレオチド(位置1)から開始して、第2の鎖の位置1〜23が、リボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり;第1の鎖が25〜53の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと十分に塩基対を形成する、23の連続したリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドを含み;第2の鎖の3’末端ヌクレオチド残基の位置24のうち少なくとも1つが、第1の鎖のデオキシリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドと任意に塩基対を形成する、デオキシリボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドであり;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有するdsNAであって、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、第1の鎖(または第2の鎖)が25〜30の長さのヌクレオチド残基であり、5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、第1の鎖(または第2の鎖)の位置1〜23が、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第2の鎖(または第1の鎖)が36〜66の長さのヌクレオチド残基であり、3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23と対を形成する位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第2の鎖(または第1の鎖)の少なくとも3’末端ヌクレオチドが第1の鎖(または第2の鎖)と対になっておらず、最大6の連続した3’末端ヌクレオチドが第1の鎖(または第2の鎖)と対になっておらず、それによって1〜6ヌクレオチドの3’一本鎖オーバーハングを形成し;第2の鎖(または第1の鎖)の5’末端が、第1の鎖(または第2の鎖)と対になっていない10〜30の連続したヌクレオチドを含み、それによって10〜30ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;第1の鎖および第2の鎖が最大の相補性アライメントされる場合、少なくとも第1の鎖(または第2の鎖)の5’末端および3’末端ヌクレオチドが、第2の鎖(または第1の鎖)のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するため、第2の鎖のうち少なくとも19の長さのリボヌクレオチドに沿って標的RNAと十分に相補的である、dsNA;
5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有するdsNAであって、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、第1の鎖が25〜35の長さのヌクレオチド残基であり、5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、第2の鎖の位置1〜25が少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第2の鎖が30〜66の長さのヌクレオチド残基であり、3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜25と対を形成する位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第2の鎖の5’末端が、第1の鎖と対になっていない5〜35の連続したヌクレオチドを含み、それによって5〜35ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;第1の鎖および第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第1の鎖の5’末端および3’末端ヌクレオチドが、第2の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有するdsNAであって、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、第2の鎖が19〜30の長さのヌクレオチド残基であり、任意に25〜30の長さのヌクレオチド残基であり、5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、第2の鎖の位置1〜17(任意に位置1〜23)が、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第1の鎖が24〜66の長さのヌクレオチド残基(任意に30〜66の長さのヌクレオチド残基)であり、3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第2の鎖の位置1〜17(任意に位置1〜23)と対を形成する位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第1の鎖の3’末端および第2の鎖の5’末端が、平滑末端、3’オーバーハングおよび5’オーバーハングの構造を含み、任意にオーバーハングは1〜6の長さのヌクレオチドであり;第1の鎖の5’末端が、第2の鎖と対になっていない5〜35の連続したヌクレオチドを含み、それによって5〜35ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;第1の鎖および第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第2の鎖の5’末端および3’末端ヌクレオチドが、第1の鎖のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際にHAO1標的mRNA発現を低減するため、第2のオリゴヌクレオチド鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
第1の鎖および第2の鎖を有するdsNAであって、第1の鎖および第2の鎖が19〜25の長さのヌクレオチドの二本鎖領域を形成し、第1の鎖が、第1の鎖−第2の鎖の二本鎖領域を超えて伸長し、かつテトラループを含む3’領域を含み、dsNAが第1の鎖の3’末端と第2の鎖の5’末端との間に不連続性をさらに含み、第1の鎖または第2の鎖が、dsNAが哺乳類細胞の中に導入される際に、HAO1標的mRNA発現を低減させるために、第1の鎖または第2の鎖のうち少なくとも15の長さのヌクレオチドに沿って、配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列と十分に相補的である、dsNA;
5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有するdsNAであって、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、第1のオリゴヌクレオチド鎖が25〜53の長さのヌクレオチドであり、第2のオリゴヌクレオチド鎖が25〜53の長さのヌクレオチドであり、dsNAが、dsNAのdicer開裂を実質的に防止するのに十分なほど多く改変され、任意にdsNAが、哺乳類細胞中でLDHmRNA発現を低減できる1つ以上の19〜23の長さのヌクレオチド鎖dsNAを得るために、非dicerヌクレアーゼによって切断される、dsNA;
外来核酸配列および配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列を持つ細胞内のin vivoハイブリッド形成複合体;ならびに
外来核酸配列および配列番号1921〜2304の標的HAO1mRNA配列を持つ細胞内のin vitroハイブリッド形成複合体。

0059

1つの実施形態では、本発明のdsNAは、少なくとも25の塩基対の二本鎖領域を有し、dsNAが、1ナノモル濃度以下の細胞の環境中での有効濃度においてin vitroの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的HAO1mRNAの発現の低減において同一の標的HAO1mRNAの少なくとも19のヌクレオチドを対象とする21マーsiRNAよりも大きな効力を有する。

0060

別の実施形態では、本発明のdsNAは、少なくとも25の塩基対の二本鎖領域を有し、dsNAが、1ナノモル濃度、200ピコモル濃度、100ピコモル濃度、50ピコモル濃度、20ピコモル濃度、10ピコモル濃度、5ピコモル濃度、2ピコモル濃度および1ピコモル濃度でin vitroの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的HAO1mRNAの発現の低減において同一の標的HAO1mRNAの少なくとも19のヌクレオチドを対象とする21マーsiRNAよりも大きな効力を有する。

0061

追加的な実施形態では、本発明のdsNAは、第2のオリゴヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドが、標的HAO1mRNA配列と最大の相補性でアライメントされる場合、第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15または19ヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドに沿って、標的HAO1mRNA配列に対して4以下のミスマッチ核酸残基を有する。

0062

別の実施形態では、本発明のdsNAは、第2のオリゴヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドが、標的HAO1mRNA配列と最大の相補性でアライメントされる場合、第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15または19ヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドに沿って、標的HAO1mRNA配列に対して3以下のミスマッチ核酸残基を有する。

0063

任意に、本発明のdsNAは、第2のオリゴヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドが、標的HAO1mRNA配列と最大の相補性でアライメントされる場合、第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15または19ヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドに沿って、標的HAO1mRNA配列に対して2以下のミスマッチ核酸残基を有する。

0064

ある特定の実施形態では、本発明のdsNAは、第2のオリゴヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドが、標的HAO1mRNA配列と最大の相補性でアライメントされる場合、第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15または19ヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドに沿って、標的HAO1mRNA配列に対して1つのミスマッチ核酸残基を有する。

0065

1つの実施形態では、第2のオリゴヌクレオチド鎖の少なくとも15または19ヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドは、第2のオリゴヌクレオチドの15または19の連続したヌクレオチドが、標的HAO1mRNA配列と最大の相補性でアライメントされる場合、標的HAO1mRNA配列と完全に相補的である。

0066

任意に、本発明の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体は単離される。

0067

本発明の別の態様は、哺乳類細胞中で標的HAO1遺伝子の発現を低減する方法であって、in vitroで哺乳類細胞を、細胞中で標的HAO1mRNAの発現を低減するのに十分な量の本発明の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体と接触させることを含む方法を提供する。

0068

任意に、標的HAO1mRNA発現は、少なくとも10%、少なくとも50%および少なくとも80〜90%の量(%により表される)で減少する。

0069

1つの実施形態では、HAO1mRNAレベルは、細胞がdsNAと接触してから少なくとも8日後において、少なくとも90%の量(%により表される)で減少する。

0070

別の実施形態では、HAO1mRNAレベルは、細胞がdsNAと接触してから少なくとも10日後において、少なくとも70%の量(%により表される)で減少する。

0071

本発明のさらなる態様は、哺乳類中の標的HAO1mRNAの発現を低減する方法であって、哺乳類において標的HAO1mRNAの発現を低減するのに十分な量で本発明の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体を哺乳類に投与することを有する方法を提供する。

0072

1つの実施形態では、核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体は、脂質ナノ粒子(LNP)中で製剤化される。

0073

別の実施形態では、核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体は、1マイクログラム〜5ミリグラム/哺乳類キログラム/日、100マイクログラム〜0.5ミリグラム/キログラム、0.001〜0.25ミリグラム/キログラム、0.01〜20マイクログラム/キログラム、0.01〜10マイクログラム/キログラム、0.10〜5マイクログラム/キログラム、および0.1〜2.5マイクログラム/キログラムの投与量で投与される。

0074

ある特定の実施形態では、核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体は、1ナノモル濃度以下の細胞の環境中での有効濃度においてin vitroの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的HAO1mRNAの発現の低減において同一の標的HAO1mRNAの少なくとも19のヌクレオチドを対象とする21マーsiRNAよりも大きな効力を有する。

0075

1つの実施形態では、HAO1mRNAレベルは、dsNAが哺乳類に投与されてから少なくとも3日後において、少なくとも70%の量(%により表される)で哺乳類の組織中において減少する。

0076

任意に、組織は肝臓組織である。

0077

ある特定の実施形態では、投与ステップには、静脈内注射筋肉内注射腹腔内注射点滴皮下注射経皮エアロゾル、腸、局所、経口または吸入送達が含まれる。

0078

本発明の別の態様は、対象の疾患または障害を治療または予防する方法であって、対象の疾患または障害を治療または予防するのに十分な量で、本発明の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体のある量を対象に投与することを含む方法を提供する。

0079

1つの実施形態では、疾患または障害は、原発性高シュウ酸尿症1型(PH1)である。

0080

任意に、対象はヒトである。

0081

本発明のさらなる態様は、本発明の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体を含む製剤であって、核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体が、少なくとも10%、少なくとも50%および少なくとも80〜90%の量(%により表される)で哺乳類細胞内にin vitroで導入される際に、核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体が、標的HAO1mRNAレベルを低減するために有効な量で存在する、製剤を提供する。

0082

1つの実施形態では、有効量は、細胞の環境中で1ナノモル濃度以下、200ピコモル濃度以下、100ピコモル濃度以下、50ピコモル濃度以下、20ピコモル濃度以下、10ピコモル濃度以下、5ピコモル濃度以下、2ピコモル濃度以下および1ピコモル濃度以下である。

0083

別の実施形態では、核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体が、哺乳類対象の細胞に導入される際に、少なくとも10%、少なくとも50%および少なくとも80〜90%の量(%により表される)で核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体が、標的HAO1mRNAレベルを低減するために有効な量で存在する。

0084

任意に、有効量は、1マイクログラム〜5ミリグラム/キログラム対象/日、100マイクログラム〜0.5ミリグラム/キログラム、0.001〜0.25ミリグラム/キログラム、0.01〜20マイクログラム/キログラム、0.01〜10マイクログラム/キログラム、0.10〜5マイクログラム/キログラム、または0.1〜2.5マイクログラム/キログラムの投与量である。

0085

別の実施形態では、核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体は、1ナノモル濃度以下の細胞の環境中での有効濃度においてin vitroの哺乳類細胞中でアッセイされる際に、標的HAO1mRNAレベルの低減において同一の標的HAO1mRNAの少なくとも19のヌクレオチドを対象とする21マーsiRNAよりも大きな効力を有する。

0086

本発明のさらなる態様は、本発明の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体を含む哺乳類細胞を提供する。

0087

本発明の別の態様は、本発明の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。

0088

本発明の追加的な態様は、本発明の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体およびその使用のための説明書を含むキットを提供する。

0089

本発明のさらなる態様は、本発明の核酸、dsNAまたはハイブリッド形成複合体から本質的になる、HAO1阻害活性を有する組成物を提供する。

図面の簡単な説明

0090

明細書中で「HAO1−1171」標的部位を指す、グリコール酸オキシダーゼRNA中の部位を標的とする本発明の例示的なDsiRNA剤の構造を示す。大文字=非改変RNA、小文字=DNA、太字ミスマッチ塩基対ヌクレオチド;矢頭は予想されるDicer酵素開裂部位を示し;破線は標的化グリコール酸オキシダーゼ配列内の予想されるArgonaute2(Ago2)開裂部位に相当するセンス鎖(上鎖)配列を示す。
ヒト(HeLa)およびマウス(Hepa1−6)細胞中の、それぞれヒトグリコール酸オキシダーゼ(図2Aおよび2Bは、ヒト−マウス共通DsiRNAの結果を示す一方、図2Cおよび2Dは、ヒト特有DsiRNAの結果を示す)およびマウスグリコール酸オキシダーゼ(図2Cおよび2D)のDsiRNA媒介ノックダウンを示す、第1次スクリーニングデータ提示している。ヒトHeLa細胞中の活性を、Psi−Check−HsHAO1プラスミドレポーターアッセイを使用し、ウミシイタケルシフェラーゼ産生のノックダウンをモニタリングして評価した。マウス細胞で試験した各DsiRNAについては、2つの独立したqPCRアンプリコンをアッセイした(アンプリコン「476−611」および「1775−1888」)。
示したDsiRNAについて観察されたヒトおよびマウスのグリコール酸オキシダーゼ阻害効果ヒストグラムを示す。「P1」はフェーズ1(第1次スクリーニング)を示し、「P2」はフェーズ2を示す。フェーズ1において、DsiRNAを、HeLa細胞(ヒト細胞アッセイ;図3Aおよび3B)またはマウス細胞(Hepa1−6細胞アッセイ図3C〜3F)の環境中1nMで試験した。フェーズ2において、DsiRNAを、HeLa細胞またはマウスのHepa1−6細胞の環境中、1nMおよび0.1nMにて試験した(二重アッセイ)。個々のバーは、三重に観察されたヒト(図3Aおよび3B)またはマウス(図3C〜3F)の平均のグリコール酸オキシダーゼレベルを表し、標準誤差とともに示している。マウスグリコール酸オキシダーゼレベルをHPRTおよびRpl23レベルに対して正規化した。
最初のin vivoマウス実験フローチャートを示し、グリコール酸塩負荷を含めた。
LNP(ここではLNP EnCore 2345)中で製剤化した0.1mg/kgまたは1mg/kgの示されたHAO1標的化DsiRNAを投与した動物の、マウスの肝臓におけるHAO1ノックダウンを示す。
1mg/kg量のおよびさらに0.1mg/kg量においてもHAO1標的化DsiRNAであるHAO1−1171で処理したマウスの肝臓組織において、HAO1mRNAノックダウンの強力なレベルを観察し、強力な有効性持続時間を観察した(1mg/kgおよび0.1mg/kg動物の両方で、投与後120時間において90%以上のレベルのノックダウンを観察した)ことを示す。
0.1nM(二重アッセイ)および1nMで試験したヒトHeLa細胞(図7Bおよび7C)ならびに0.03nM、0.1nM(二重アッセイ)および1nMで試験した8つの二本鎖サブセットのマウスHepa1−6細胞(図7Dおよび7E)における、4つの異なるガイドアンチセンス)鎖の2’−O−メチル改変パターン(図7Aで示すように、それぞれ「M17」、「M35」、「M48」および「M8」、ならびに図7B〜7Eについては、パッセンジャー鎖の改変パターン(ここでは「M107」)−ガイド鎖の改変パターン、例えば「M107−M17」、「M107−M35」、「M107−M48」または「M107−M8」として改変パターンを列挙していることに留意する)に対する24の独立したHAO1標的化DsiRNA配列の有効性データを示す改変パターンの略図およびヒストグラムを提示している。
0.1nM(二重アッセイ)および1nMで試験したヒトHeLa細胞(図8Bおよび8C)ならびに0.03nM、0.1nM(二重アッセイ)および1nMで試験した8つの二本鎖サブセットのマウスHepa1−6細胞(図8Dおよび8E)における、4つの異なるパッセンジャーセンス)鎖の2’−O−メチル改変パターン(図8Aで示すように、それぞれ「M107」、「M14」、「M24」および「M250」、ならびに図8B〜8Eについては、パッセンジャー鎖の改変パターン−ガイド鎖の改変パターン(ここでは「M48」)、例えば「M107−M48」、「M14−M48」、「M24−M48」または「M250−M48」として改変パターンを列挙していることに留意する)に対する24の独立したHAO1標的化DsiRNA配列の有効性データを示す改変パターンの略図およびヒストグラムを提示している。
0.1nM(二重アッセイ)および1nMで試験したヒトHeLa細胞(図9E〜9H)またはHEK293−pcDNAHAO1細胞(図9I〜9L)において、ウミシイタケルシフェラーゼ産生のノックダウンをモニタリングするPsi−Check−HsHAO1プラスミドレポーターアッセイ(図9E〜9H)、またはHAO1で安定にトランスフェクトしたHEK293細胞(HEK293−pcDNA HAO1細胞;図9I〜9L)のいずれかを用いて、示されたパッセンジャー(センス)鎖およびガイド(アンチセンス)鎖の2’−O−メチル改変パターン(パッセンジャー鎖の改変パターン−ガイド鎖の改変パターンとして改変パターンを列挙していることに留意する)に対する24の独立したHAO1標的化DsiRNA配列の有効性データを示す改変パターンの略図およびヒストグラムを提示している。
0.1nM(二重アッセイ)および1nMでアッセイした、HAO1で安定にトランスフェクトしたHEK293細胞(HEK293−pcDNA HAO1細胞)において、示されたパッセンジャー(センス)鎖およびガイド(アンチセンス)鎖の2’−O−メチル改変パターン(上記のように、パッセンジャー鎖の改変パターン−ガイド鎖の改変パターンとして改変パターンを列挙していることに留意する)に対する4つの独立したHAO1標的化DsiRNA配列の有効性データを示す改変パターンの略図およびヒストグラムを提示している。
HAO1−1171、HAO1−1315、HAO1−1378およびHAO1−1501DsiRNAの改変パターンおよび配列、ならびに0.1nM、0.01nMおよび0.001nMのHAO1標的化DsiRNA濃度で、HAO1で安定にトランスフェクトしたHEK293細胞(HEK293−pcDNA HAO1細胞)においてアッセイした場合の、関連する阻害有効性の結果(ヒストグラムおよびIC50曲線)を提示している。
示すとおりの、広範囲に改変したHAO1−1171およびHAO1−1376DsiRNAの改変パターンおよび配列(図12A〜12D)、ならびに0.1nM、0.01nMおよび0.001nMのHAO1標的化DsiRNA濃度で、HAO1で安定にトランスフェクトしたHEK293細胞(HEK293−pcDNA HAO1細胞)においてアッセイした場合の、関連する阻害有効性の結果(図12Eおよび12Fのヒストグラム)を提示している。
マウス(図13A〜13K)および非ヒト霊長類図13L)の両方における、LNPで製剤化したHAO1標的化二本鎖の広範囲な改変形態のin vivo有効性(阻害の動態および持続時間を含む)を実証する。

0091

本発明は、in vivoまたはin vitroにてグリコール酸オキシダーゼ(HAO1)遺伝子のレベルおよび/または発現を低減することが可能な、核酸、例えば二本鎖RNA(「dsRNA」)を含む組成物、ならびにそれらを調製する方法を目的とする。dsRNAの鎖の1つは、標的とするHAO1転写産物破壊および/または翻訳阻害を対象とし得る19〜35ヌクレオチドの範囲の長さを持つヌクレオチド配列の領域を含む。

0092

定義
他に定義しない限り、本明細書で使用するところの全ての技術的かつ科学的語句は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を持つ。以下の参照は、本発明で使用される多くの語句の一般的な定義を当業者に提供する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed.,1988);The Glossay of Genetics,5th Ed.,R.Rieger et al.(eds.),Springer Verlag (1991); and Hale & Maham,The Harper Collins Dictionay of Biology(1991)。本明細書で使用するように、以下の語句は、他で特定しない限り、以下のそれらに帰する意味を持つ。

0093

本発明は、グリコール酸オキシダーゼ発現を調節(例えば阻害)可能な1つ以上のDsiRNA分子を特徴とする。本発明のDsiRNAは任意に、グリコール酸オキシダーゼ誤調節に関連した疾患または障害(例えば、原発性高シュウ酸尿症1型(PH1)または肝臓、腎臓などの他の疾患もしくは障害)の維持または発展に関連した他の遺伝子および/または遺伝子産物モジュレータと組み合わせて使用可能である。本発明のDsiRNA剤は、GenBank寄託番号第NM_017545.2号(ヒトHAO1)および第NM_010403.2号(マウスHAO1)によって表されるcDNA配列に対応するもののようなグリコール酸オキシダーゼ(ヒドロキシ酸オキシダーゼ1、すなわちHAO1)RNAを調節し、それらは本明細書で一般的に「グリコール酸オキシダーゼ」または「ヒドロキシ酸オキシダーゼ1」と呼ばれる。

0094

本発明の種々の態様および実施形態の以下の記述が、本明細書中で一般的にグリコール酸オキシダーゼと呼ばれる例示的なグリコール酸オキシダーゼRNAに関して提供される。しかしながら、このような記載は単なる例示を意味するのみであり、本発明の種々の態様および実施形態はまた、変異体グリコール酸オキシダーゼRNAまたはさらなるグリコール酸オキシダーゼスプライスバリアントのような、代替的なグリコール酸オキシダーゼRNAも対象とする。また、特定の態様および実施形態はグリコール酸オキシダーゼ経路に関与する他の遺伝子をも対象とし、その誤調節がグリコール酸オキシダーゼの誤調節に関連して作用する(例えばグリコール酸オキシダーゼの調節に影響されるか、またはグリコール酸オキシダーゼの調節に影響を与える)ことにより治療のために標的化され得る表現型効果(例えば、グリオキシル酸塩および/またはシュウ酸塩の過剰産生)を産出する遺伝子を含む。DAOおよびAGTは、グリコール酸オキシダーゼと相互作用する遺伝子の例である。グリコール酸オキシダーゼと共に作用する経路のそれらを含む、このような追加の遺伝子は、グリコール酸オキシダーゼ−標的化dsRNAの利用に関して本明細書で記述されたdsRNAおよび方法を用いて標的とされ得る。したがって、他の遺伝子の阻害もしくはおよびこのような阻害の効果、または上方制御およびこのような上方制御の効果を、本明細書で記述したように実施できる。

0095

語句「グリコール酸オキシダーゼ」は、グリコール酸オキシダーゼタンパク質ペプチド、またはポリペプチドをコードする核酸配列を意味する(例えば、グリコール酸オキシダーゼ(HAO1)Genbank寄託番号第NM_017545.2号および第NM_010403.2号の配列のような、グリコール酸オキシダーゼ転写産物)。ある特定の実施形態では、語句「グリコール酸オキシダーゼ」はまた、他のグリコール酸オキシダーゼアイソフォーム、変異体グリコール酸オキシダーゼ遺伝子、グリコール酸オキシダーゼ遺伝子のスプライスバリアント、およびグリコール酸オキシダーゼ遺伝子多型などの、他のグリコール酸オキシダーゼコード配列を含むことも意味する。語句「グリコール酸オキシダーゼ」は、グリコール酸オキシダーゼ遺伝子/転写産物のポリペプチド遺伝子産物、例えば、グリコール酸オキシダーゼ(HAO1)Genbank寄託番号第NP_060015.1号および第NP_034533.1号によってコードされたものなどの、グリコール酸オキシダーゼタンパク質、ペプチド、またはポリペプチド指すためにも使用される。

0096

本明細書で使用するところの、「グリコール酸オキシダーゼ関連疾患または障害」は、変化したグリコール酸オキシダーゼ発現、レベルおよび/または活性に関連すると当業者に知られている疾患または障害を意味する。とりわけ、「グリコール酸オキシダーゼ−関連疾患または障害」または「HAO1−関連疾患または障害」は、限定されないが原発性高シュウ酸尿症(PH1)を含む、腎臓、肝臓、皮膚、骨、目および他の臓器の疾患または障害を含む。

0097

ある特定の実施形態では、グリコール酸オキシダーゼ標的配列のdsRNA−媒介阻害を評価する。このような実施形態では、グリコール酸オキシダーゼRNAレベルは、任意に、このような抗−グリコール酸オキシダーゼdsRNAが存在しないものに対する本発明の抗−グリコール酸オキシダーゼdsRNAの存在下でのグリコール酸オキシダーゼレベルの比較を介して、本技術分野で認識された方法(例えばRT−PCR、ノザンブロット、発現アレイなど)によって評価可能である。ある特定の実施形態では、抗−グリコール酸オキシダーゼdsRNAの存在下でのグリコール酸オキシダーゼレベルを、ビヒクルのみの存在下、関連のない標的RNAを対象とするdsRNAの存在下、または処置を全く行っていない状態で、観察したものと比較する。

0098

また、グリコール酸オキシダーゼタンパク質のレベルを評価可能であること、ならびにグリコール酸オキシダーゼタンパク質のレベルが、異なる条件下で、グリコール酸オキシダーゼRNAレベルおよび/またはdsRNAが、グリコール酸オキシダーゼ発現を阻害する程度まで直接的もしくは間接的に関連することが認識されており、したがってグリコール酸オキシダーゼタンパク質レベルを評価する本技術分野で認識されている方法(例えばウェスタンブロット免疫沈降、他の抗体に基づく方法など)もまた、本発明のdsRNAの阻害効果を試験するために使用できる。

0099

選択された対照と比較して、本発明の抗グリコール酸オキシダーゼdsRNAがある系(例えば、無細胞のin vitro系)、細胞、組織または生命体に投与された時にグリコール酸オキシダーゼRNA(またはグリコール酸オキシダーゼタンパク質が評価される場合、グリコール酸オキシダーゼタンパク質レベル)における統計学的に有意な減少が見られた場合に、本発明の抗グリコール酸オキシダーゼdsRNAが「グリコール酸オキシダーゼ阻害活性」を有すると見なされる。実験値分布と実施された再現アッセイ数が、どのレベルのグリコール酸オキシダーゼRNAの減少(%または絶対値のいずれかとして)が(本技術分野で公知の統計学的有意差を決定する標準の方法によって評価されるように)統計学的に有意と判断されるかのパラメータを決定づける傾向にある。しかしながら、ある特定の実施形態では、「グリコール酸オキシダーゼ阻害活性」は、系、細胞、組織もしくは生命体におけるグリコール酸オキシダーゼのレベルの減少の%または絶対レベルに基づいて定義される。例えば、ある特定の実施形態では、本発明のdsRNAの存在下で、好適な対照に対して見られるグリコール酸オキシダーゼレベルと比較して、グリコール酸オキシダーゼRNAの少なくとも5%の減少または少なくとも10%の減少が観察される場合に、本発明のdsRNAは、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有すると見なされる。(例えば、ある特定の実施形態では、対照と比較して、グリコール酸オキシダーゼレベルの5%または10%の減少が観察される場合に、組織および/または対象のin vivoでのグリコール酸オキシダーゼレベルが、本発明のdsRNA剤によって阻害されると見なすことができる。)特定の他の実施形態では、本発明のdsRNAは、グリコール酸オキシダーゼRNAレベルが、選択された対照と比較して少なくとも15%、選択された対照と比較して少なくとも20%、選択された対照と比較して少なくとも25%、選択された対照と比較して少なくとも30%、選択された対照と比較して少なくとも35%、選択された対照と比較して少なくとも40%、選択された対照と比較して少なくとも45%、選択された対照と比較して少なくとも50%、選択された対照と比較して少なくとも55%、選択された対照と比較して少なくとも60%、選択された対照と比較して少なくとも65%、選択された対照と比較して少なくとも70%、選択された対照と比較して少なくとも75%、選択された対照と比較して少なくとも80%、選択された対照と比較して少なくとも85%、選択された対照と比較して少なくとも90%、選択された対照と比較して少なくとも95%、選択された対照と比較して少なくとも96%、選択された対照と比較して少なくとも97%、選択された対照と比較して少なくとも98%、または選択された対照と比較して少なくとも99%減少することが観察される場合に、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性を持つと見なされる。いくつかの実施形態では、グリコール酸オキシダーゼの完全阻害が、dsRNAがグリコール酸オキシダーゼ阻害活性をもつと見なされるために必要とされる。特定のモデル(例えば細胞培養液)において、dsRNAは、好適な対照と比較してグリコール酸オキシダーゼレベルの少なくとも50%減少が観察される場合に、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有すると見なされる。特定の他の実施形態では、dsRNAは、好適な対照と比較してグリコール酸オキシダーゼレベルの少なくとも80%減少が観察される場合に、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有すると見なされる。

0100

特定の例として、以下の実施例2において、一連のDsiRNA標的化グリコール酸オキシダーゼをin vitroにてヒトHeLaまたはマウスHepa1−6細胞中のグリコール酸オキシダーゼmRNAレベルを減少させる能力に関して、このような細胞の環境下およびトランスフェクション試薬(Lipofectamine(商標)RNAiMAX、Invitrogen)の存在下で1nM濃度にて、試験した。以下の実施例2では、アッセイした条件下でグリコール酸オキシダーゼmRNAレベルの少なくとも50%の減少に効果があると観察されたDsiRNAに対してグリコール酸オキシダーゼ阻害活性があると見なした。またグリコール酸オキシダーゼ阻害活性は、以下の実施例2に対して使用したものと比較して、より厳しいか、より厳しくないいずれかの条件下の、すなわち同一または同様のアッセイおよび条件が使用された場合のdsRNAにも起因し得ると考えられる。例えば、ある特定の実施形態では、試験した本発明のdsRNAは、好適な対照と比較したグリコール酸オキシダーゼmRNAレベルの、少なくとも10%の減少、少なくとも20%の減少、少なくとも30%の減少、少なくとも40%の減少、少なくとも50%の減少、少なくとも60%の減少、少なくとも70%の減少、少なくとも75%の減少、少なくとも80%の減少、少なくとも85%の減少、少なくとも90%の減少、または少なくとも95%の減少がin vitroにて哺乳類細胞内で、細胞環境下で1nM以下のdsRNA濃度で観察された場合に、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有すると見なされる。

0101

本発明の二本鎖RNAがグリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有するかどうかを決定するための他の評価項目の利用も考慮される。特に、1つの実施形態では、グリコール酸オキシダーゼmRNAレベルを評価することに加えて、またはこの評価に代えて、試験したdsRNAのグリコール酸オキシダーゼタンパク質レベルを減少させる能力を(例えば、in vitroまたはin vivoにて、哺乳類細胞を接触させてから48時間後に)評価し、好適な対照と比較して、グリコール酸オキシダーゼタンパク質レベルの少なくとも10%の減少、少なくとも20%の減少、少なくとも30%の減少、少なくとも40%の減少、少なくとも50%の減少、少なくとも60%の減少、少なくとも70%の減少、少なくとも75%の減少、少なくとも80%の減少、少なくとも85%の減少、少なくとも90%の減少、または少なくとも95%の減少がin vitroまたはin vivoにて、アッセイした二本鎖RNAに接触させた哺乳類細胞内で観察される場合に、試験したdsRNAがグリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有すると見なされる。さらに考慮される評価項目には、例えばグリコール酸オキシダーゼレベルの減少に関する表現型の評価−例えば、全身でのグリオキシル酸塩誘導沈着(例えば、シュウ酸カルシウムの沈着)レベルの上昇に関する表現型の減少が含まれる。

0102

また、投与される濃度および投与後の持続時間にしたがって調整したグリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有するdsRNAを構成するものの評価により、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性を時間(持続時間)および、濃度範囲(効力)に関して評価することもできる。したがって、ある特定の実施形態では、グリコール酸オキシダーゼ活性の少なくとも50%の減少が、dsRNAの細胞または臓器への投与後2時間、5時間、10時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日以上の持続期間で観察/持続される場合に、本発明のdsRNAをグリコール酸オキシダーゼ阻害活性を有すると見なす。さらなる実施形態では、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性(例えばある特定の実施形態では、少なくとも50%のグリコール酸オキシダーゼ阻害)が、1nM以下、500pM以下、200pM以下、100pM以下、50pM以下、20pM以下、10pM以下、5pM以下、2pM以下、または1pM以下の濃度にて細胞の環境中で、例えば、本明細書で記述したようなグリコール酸オキシダーゼ阻害活性に関するin vitroアッセイ内で観察された場合、本発明のdsRNAを強力なグリコール酸オキシダーゼ阻害剤であると見なす。ある特定の実施形態では、本発明の強力なグリコール酸オキシダーゼ阻害dsRNAは、有効な送達ビヒクル(例えば有効な脂質ナノ粒子製剤)で対象に投与する場合10mg/kg以下の製剤化濃度でグリコール酸オキシダーゼ阻害活性(ある特定の実施形態では、少なくとも20%グリコール酸オキシダーゼレベルを減少させる)を有し得るdsRNAであると定義される。好ましくは、本発明の強力なグリコール酸オキシダーゼ阻害dsRNAは、効果的な伝達ビヒクルで対象に投与された場合5mg/kg以下の製剤化濃度でグリコール酸オキシダーゼ阻害活性(例えばある特定の実施形態では、少なくとも50%のグリコール酸オキシダーゼレベルの減少)を有し得るものとして定義される。より好ましくは、本発明の強力なグリコール酸オキシダーゼ阻害dsRNAは、効果的な伝達ビヒクルで対象に投与された場合5mg/kg以下の製剤化濃度にてグリコール酸オキシダーゼ阻害活性(例えばある特定の実施形態では、少なくとも50%のグリコール酸オキシダーゼレベルの減少)を有し得るものとして定義される。任意に、本発明の強力なグリコール酸オキシダーゼ阻害dsRNAは、効果的な伝達ビヒクルで対象に投与された場合2mg/kg以下、またはさらには1mg/kg以下の製剤化濃度にてグリコール酸オキシダーゼ阻害活性(例えばある特定の実施形態では、少なくとも50%のグリコール酸オキシダーゼレベルの減少)を有し得るものとして定義される。

0103

ある特定の実施形態では、本発明のdsRNAの効力を、特定のレベルの標的遺伝子ノックダウンを達成するために必要な、標的細胞細胞質内に存在するdsRNAのコピー数を参照して決定する。例えば、ある特定の実施形態では、強力なdsRNAは、細胞あたり1000以下のRISC−ロードアンチセンス鎖コピー数にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的mRNAの50%以上のノックダウンを引き起こし得るdsRNAである。より好ましくは、強力なdsRNAは、細胞あたり500以下のRISC−ロードアンチセンス鎖コピー数にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的mRNAの50%以上のノックダウンを引き起こし得るdsRNAである。任意に、強力なdsRNAは、細胞あたり300以下のRISC−ロードアンチセンス鎖のコピー数にて標的細胞の細胞質内に存在した場合に、標的mRNAの50%以上のノックダウンを引き起こし得るdsRNAである。

0104

さらなる実施形態では、本発明のDsiRNAの効力は、同一の標的遺伝子内の同一の標的配列を対象とした19〜23マーdsRNAを参照して定義可能である。例えば、対応する19〜23マーdsRNAに対して増強した効力を有する本発明のDsiRNAは、効力差の検出を許容するのに十分低い濃度(例えば、本明細書で記述したようなin vitroアッセイ中、細胞の環境中1nM以下の、細胞の環境中100pM以下、細胞の環境中10pM以下、細胞の環境中1nM以下のトランスフェクション濃度;とりわけ効力差は、用量応答曲線を作成してDsiRNA/dsRNAに関連したIC50値を同定する目的のための濃度範囲−例えば0.1pM〜10nM−にわたり、このようなアッセイを実施することを介して最もよく検出可能であると認識されている)にて本明細書で記述したin vitroアッセイでアッセイした場合に、対応する19〜23マーdsRNAと比較して、さらに5%以上、さらに10%以上、さらに20%以上、さらに30%以上、さらに40%以上、またはさらに50%以上標的遺伝子を減少させるDsiRNAであり得る。

0105

グリコール酸オキシダーゼ阻害レベルおよび/またはグリコール酸オキシダーゼレベルはまた間接的に評価してもよく、例えば、対象中の原発性高シュウ酸尿症1型表現型の低減の測定を、グリコール酸オキシダーゼレベルおよび/または本発明の二本鎖核酸のグリコール酸オキシダーゼ阻害効果を評価するために使用してよい。

0106

ある特定の実施形態では、語句「から本質的になる」は、本発明の抗−グリコール酸オキシダーゼdsRNAに関連して使用される。いくつかのこのような実施形態では、「から本質的になる」は、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性の少なくとも特定のレベル(例えば、少なくとも50%のグリコール酸オキシダーゼ阻害活性)を有する本発明のdsRNAを含み、かつ、dsRNAのグリコール酸オキシダーゼ阻害活性に有意に影響を与えない1つ以上のさらなる構成要素および/または改変をも含む、組成物を意味する。例えば、ある特定の実施形態では、本発明のdsRNAの改変および/または組成物中のdsRNA−関連構成要素が、本発明のdsRNA単独と比較して3%超、5%超、10%超、15%超、20%超、25%超、30%超、35%超、40%超、45%超、または50%超まで(任意にグリコール酸オキシダーゼ阻害活性の効力または持続期間を含む)グリコール酸オキシダーゼ阻害活性を変えない場合、組成物は、本発明のdsRNA「から本質的になる」。ある特定の実施形態では、グリコール酸オキシダーゼ阻害活性のより劇的な減少(例えば、効果、持続期間および/または効力において80%減少、90%減少など)がさらなる構成要素または改変の存在下で発生したとしても、まだグリコール酸オキシダーゼ阻害活性がさらなる構成要素および/または改変の存在下で有意に上昇しない(例えば観察されるグリコール酸オキシダーゼ阻害活性のレベルが、本発明の単離されたdsRNAに対して観察されるレベルの10%以内である)場合、組成物は本発明のdsRNAから本質的になると見なされる。

0107

本明細書で使用するところの語句「核酸」は、一本鎖または二本鎖形状のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、または改変ヌクレオチド、およびそれらのポリマーを意味する。本語句は公知のヌクレオチド類似体または改変された骨格残基あるいは結合を含む核酸を網羅し、それらは合成の、天然に存在する、また天然に存在しない核酸であり、参照核酸と同様の結合特性を持ち、かつ参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される。このような類似体の例には、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホルアミデートメチルホスホン酸塩、キラル−メチルホスホン酸塩、2−O−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸(PNA)およびアンロックド核酸(UNA、例えばJensen et al. Nucleic AcidsSymposium Series 52: 133−4参照)、ならびにそれらの誘導体が含まれる。

0108

本明細書で使用するところの「ヌクレオチド」は、本技術分野で認識されているように天然塩基(標準)、および本技術分野でよく知られている改変塩基を持つヌクレオチドを含んで使用される。このような塩基は一般的に、ヌクレオチド糖部分の1’位に位置している。ヌクレオチドは一般的に、塩基、糖およびリン酸基を含む。ヌクレオチドは非改変であるか、糖、リン酸および/または塩基部分にて改変され得る(またヌクレオチド類似体、改変ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド非標準ヌクレオチドおよびその他としても互換的に指す;例えば、Usman and McSwiggen、上記;Eckstein,et al.,国際特許公開公報第92/07065号;Usman et al,国際特許公開公報第WO 93/15187号;Uhlman & Peyman参照、これら全ては参照により本明細書に援用される)。Limbach,et al,Nucleic AcidsRes.22:2183,1994によって要約されたような、本技術分野で公知の改変核酸塩基の種々の例が存在する。核酸分子内に導入可能な塩基改変の非限定例のいくつかとして、ヒポキサンチンプリンピリジン−4−オン、ピリジン−2−オン、フェニルシュードウシル、2,4,6−トリメトキシベンゼン、3−メチルウラシルジヒドロウリジンナフチルアミノフェニル、5−アルキルシチジン類(例えば5−メチルシチジン)、5−アルキルウリジン類(例えばリボチミジン)、5−ハロウリジン(例えば5−ブロモウリジン)または6−アザピリミジン類または6−アルキルピリミジン類(例えば6−メチルウリジン)、プロピン、およびその他(Burgin, et al.,Biochemistry 35:14090,1996;Uhlman & Peyman,上記)が挙げられる。本態様において、「改変塩基」は、1’位でのアデニングアニンシトシンおよびウラシルまたはそれらの等価物以外のヌクレオチド塩基を意味する。

0109

本明細書で使用するところの「改変ヌクレオチド」は、ヌクレオシドヌクレオ塩基ペントース環、またはリン酸基への1つ以上の改変を持つヌクレオチドを意味する。例えば、改変ヌクレオチドはアデノシン一リン酸グアノシン一リン酸ウリジン一リン酸、およびシチジン一リン酸を含むリボヌクレオチド類ならびにデオキシアデノシン一リン酸デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸、およびデオキシシチジン一リン酸を含むデオキシリボヌクレオチド類を除外する。改変には、メチルトランスフェラーゼのようなヌクレオチドを改変する酵素による改変に由来する天然に発生するものが含まれる。改変ヌクレオチドにはまた、合成または天然に発生しないヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチドにおける合成のまたは天然に存在しない改変には、2’改変、例えば2’−メトキシエトキシ、2’−フルオロ、2’−アリル、2’−O−[2−(メチルアミノ)−2−オキソエチル]、4’−チオ、4’−CH2−O−2’−架橋、4’−(CH2)2−O−2’−架橋、2’−LNAまたは他の二環もしくは「架橋型ヌクレオシド類似体、および2’−O−(N−メチルカルバメート)または塩基類似体を含むものが含まれる。本開示のために記述されたような2’−改変ヌクレオチドに関しては、「アミノ」によっては2’−NH2または2’−O−NH2が意味され、これらは改変されてよく、または改変されなくてよい。このような改変基は、例えば、Eckstein et al.,米国特許公開公報第5,672,695号およびMatulic−Adamic et al.,米国特許第6,248,878号にて記述されている。本発明の「改変ヌクレオチド」はまた、上述のヌクレオチド類似体を含むことができる。

0110

本明細書の核酸分子に関して、改変は、二本鎖リボ核酸(dsRNA)の1つまたは両方の鎖上のパターンで、これらの薬剤上に存在してもよい。本明細書で使用するところの「交互位置」は、全ての他のヌクレオチドが改変ヌクレオチドであるか、または定義された長さのdsRNAの鎖にわたる各改変ヌクレオチド間で改変されていないヌクレオチド(例えば、改変されていないリボヌクレオチド)が存在する(例えば5’−MNMNMN−3’、3’−MNMNMN−5’、式中Mは改変ヌクレオチドであり、Nは改変されていないヌクレオチドである)パターンを意味する。改変パターンは、例えば本明細書で記述したような、位置ナンバリングの慣例にしたがって、5’または3’末端のいずれかの第1のヌクレオチド位置から開始する(ある特定の実施形態では、位置1は、本発明のDsiRNA剤の推定されるDicer開裂事象の後の鎖の終末残基に関して指定される。したがって位置1は毎回本発明の前処理剤の3’末端または5’末端残基を構成するものではない)。交互位置での改変ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長を移動してよいが、ある特定の実施形態では、それぞれ、少なくとも2、3、4、5、6または7つの改変ヌクレオチドを含む、少なくとも4、6、8、10、12、14のヌクレオチドが含まれる。本明細書で使用するところの、「位置の交互対」は、2つの連続した改変ヌクレオチドが、dsRNAの鎖の定義された長さにわたり、2つの連続した改変されていないヌクレオチドによって分離されるパターンを意味する(例えば、5’−MMNNMMNNMMNN−3’、3’−MMNNMMNNMMNN−5’、式中Mは改変ヌクレオチドであり、Nは改変されていないヌクレオチドである)。改変パターンは、本明細書で記述したもののような、位置ナンバリングの慣例にしたがって、5’または3’末端いずれかでの、第1のヌクレオチド位置から開始する。交互位置における改変ヌクレオチドのパターンは、鎖の全長を移動してよいが、好ましくは、それぞれ、少なくとも4、6、8、10、12または14の改変ヌクレオチドを含む、少なくとも8、12、16、20、24、28のヌクレオチドが含まれる。上記改変パターンは例示であり、本発明の範囲における限定は意図されないことが強調される。

0111

本明細書で使用するところの「塩基類似体」は、核酸二本鎖に組み込むことが可能な改変ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部位の1’位(または核酸二本鎖内に組み込むことが可能なヌクレオチド糖部位置換中の等価の位置)に位置するヘテロ環状部位を意味する。本発明のdsRNAにおいて、塩基類似体は一般的に、塩基グアニン(G)、シトシン(C)、アデニン(A)、チミン(T)およびウラシル(U)を除く、プリンまたはピリミジン塩基のいずれかである。塩基類似体は、dsRNA中他の塩基または塩基類似体と二本鎖となり得る。塩基類似体には、本発明の化合物および方法にて有用なもの、例えば、参考文献によって本明細書に組み込まれている、Bennerに付与された米国特許第5,432,272号および第6,001,983号、およびManohARanに付与された米国特許公開公報第20080213891号に開示されたものが含まれる。塩基の非限定例には、ハイポキサンチン(I)、キサンチン(X)、3β−D−リボフラノシル−(2,6−ジアミノピリミジン)(K)、3−β−D−リボフラノシル−(1−メチル−ピラゾロ[4,3−d]ピリミジン−5,7(4H,6H)−ジオン)(P)、イソ−シトシン(iso−C)、イソ−グアニン(iso−G)、1−β−D−リボフラノシル−(5−ニトロインドール)、1−β−D−リボフラノシル−(3−ニトピロール)、5−ブロモウラシル、2−アミノプリン、4−チオ−dT、7−(2−チエニル)−イミダゾ[4,5−b]ピリジン(Ds)およびピロール−2−カルボアルデヒド(Pa)、2−アミノ−6−(2−チエニル)プリン(S)、2−オキソピリジン(Y)、ジフルオロトリル、4−フルオロ−6−メチルベンズイミダゾール、4−メチルベンゾイミダゾール、3−メチルイソカルボスチリル、5−メチルイソカルボスチリリルおよび3−メチル−7−プロピニルイソカルボスチリリル、7−アザインドリル、6−メチル−7−アザインドリル、イミジゾピリジニル、9−メチル−イミジゾピリジニル、ピローロピリジニル、イソカルボスチリリル、7−プロピニルイソカルボシチリリル、プロピニル−7−アザインドリル、2,4,5−トリメチルフェニル、4−メチルインドリル、4,6−ジメチルインドリル、フェニル、ナフタレニルアントラニル、フェナントラセニル、ピレニルスチルベンジル、テトラセニル、ペンタセニルおよびそれらの構造誘導体(Schweitzer et al.,J.Org.Chem.,59:7238−7242(1994);Berger et al.,Nucleic Acids Research,28(15):2911−2914(2000);Moran et al.,J.Am.Chem.Soc.,119:2056−2057(1997);Morales et al.,J.Am.Chem.Soc.,121:2323−2324(1999);Guckian et al.,J.Am.Chem.Soc.,118:8182−8183(1996);Morales et al.,J.Am.Chem.Soc.,122(6):1001−1007(2000);McMinn et al.,J.Am.Chem.Soc.,121:11585−11586(1999);Guckian et al.,J.Org.Chem.,63:9652−9656(1998);Moran et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,94:10506−10511(1997);Das et al.,J.Chem.Soc.,Perkin Trans.,1:197−206(2002);Shibata et al.,J.Chem.Soc.,Perkin Trans.,1:1605−1611(2001);Wu et al.,J.Am.Chem.Soc.,122(32):7621−7632(2000);O’Neill et al.,J.Org.Chem.,67:5869−5875(2002);Chaudhuri et al.,J.Am.Chem.Soc.,117:10434−10442(1995);および米国特許第6,218,108号)が含まれる。塩基類似体はまたユニバーサル塩基であってよい。

0112

本明細書で使用するところの「ユニバーサル塩基」は、核酸二本鎖中に存在する場合に、二本鎖ヘリックス構造(例えばリン酸塩骨格の構造)を変化させずに、1超の型の塩基と反対に位置可能な、改変ヌクレオチド中のヌクレオチド糖部位の1’位、またはヌクレオチド糖部位置換基中の等価位置に位置するヘテロ環状部位を意味する。さらに、ユニバーサル塩基は、標的核酸に対する二本鎖に属する、一本鎖の核酸の能力を破壊しない。標的核酸である二本鎖にユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸の能力を、当業者に理解される方法(例えば、UV吸収、円偏光二色性ゲルシフト、一本鎖ヌクレアーゼ感受性など)によってアッセイ可能である。さらに、二本鎖形成が観察された条件は、二本鎖安定性または形成を決定するために変化してよく、例えば融解温度(Tm)は、核酸二本鎖の安定性と相関するので、温度を変化させてもよい。標的核酸と正確に相補的である参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、相補的核酸で形成された核酸二本鎖よりも低いTmを有する標的核酸と共に二本鎖を形成する。しかしながら、ユニバーサル塩基が単一ミスマッチを産生するために塩基で置換された参照一本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含む一本鎖核酸は、ミスマッチした塩基を持つ核酸で形成された二本鎖よりも、高いTmを有する標的核酸を備える二本鎖を形成する。

0113

いくつかのユニバーサル塩基は、塩基対形成条件下、ユニバーサル塩基と、全ての塩基グアニン(G)、シトシン(C)、アデニン(A)、チミン(T)およびウラシル(U)との間で水素結合を形成することによって塩基対化可能である。ユニバーサル塩基は、単一相補塩基とのみ塩基対を形成する塩基ではない。二本鎖内で、ユニバーサル塩基は、水素結合を形成しなくてよく、また二本鎖の反対の鎖上の塩基と反対の各G、C、A、TおよびUと1つの水素結合または1つ超の水素結合を形成してよい。好ましくは、ユニバーサル塩基は、二本鎖の反対の鎖上の塩基と反対の塩基と相互作用しない。二本鎖において、ユニバーサル塩基間の塩基対化は、リン酸骨格の二本ヘリックス構造を変えずに発生する。ユニバーサル塩基はまた、スタッキング相互作用によって、同一の核酸鎖上の隣接ヌクレオチド中の塩基と相互作用してもよい。このようなスタッキング相互作用は、とりわけ、ユニバーサル塩基が、二本鎖の反対の鎖上の塩基と反対に位置する塩基と任意の水素結合を形成しない条件下で、二本鎖を安定化させる。ユニバーサル−結合ヌクレオチドの非限定例には、イノシン、1−β−D−リボフラノシル−5−ニトロインドール、および/または1−β−D−リボフラノシル−3−ニトロピロールが含まれる(Quayらに付与された米国特許出願番号第20070254362号、VanAerschot et al.,An acyclic 5−nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside.Nucleic AcidsRes.1995 Nov 11;23(21):4363−70;Loakes et al.,3−Nitropyrrole and 5−nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing andPCR.Nucleic Acids Res.1995 Jul 11;23(13):2361−6;Loakes and Brown,5−Nitroindole as an universal base analogue.Nucleic Acids Res.1994 Oct 11;22(20):4039−43)。

0114

本明細書で使用するところの「ループ」は、特定の一本鎖ヌクレオチド領域に隣接する相補領域が、相補領域間の一本鎖ヌクレオチド領域が、二本鎖形成またはワトソンクリック塩基対化から除外される方法でハイブリッド形成する、核酸の一本鎖によって形成される構造を意味する。ループは、任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例には、ヘパリンステムループまたは伸長ループのような構造中に存在する、対になっていないヌクレオチドが含まれる。

0115

本明細書で使用するところの、dsRNAの文脈中の「伸長ループ」は、一本鎖ループ、および加えて、1、2、3、4、5、6または最大20の塩基対またはループに隣接する二本鎖を意味する。伸長ループ中、5’側上のループに隣接するヌクレオチドは、3’側上でループに隣接するヌクレオチドと二本鎖を形成する。伸長ループはヘアピンまたはステムループを形成してよい。

0116

本明細書で使用するところの、dsRNAの文脈中の「テトラループ」は、隣接するワトソン−クリックハイブリッド形成ヌクレオチドの安定性に寄与する、安定二次構造を形成する4つのヌクレオチドからなるループ(一本鎖領域)を意味する。理論に限定されるものではないが、テトラループは、スタッキング相互作用によって、隣接するワトソン−クリック塩基対を安定化させてよい。加えて、テトラループ中の4つのヌクレオチド間の相互作用には、非ワトソン−クリック塩基対化、スタッキング相互作用、水素結合、および接触相互作用が含まれるが、これらに限定されるものではない(Cheong et al.,Nature 1990 Aug 16;346(6285):680−2;Heus and PARdi,Science 1991 Jul 12;253(5016):191−4)。テトラループは、4つの無作為塩基からなる単一モデルループ配列から推測されるものよりも高い隣接二本鎖融解温度(Tm)における増加をもたらす。例えば、テトラループは、長さにして少なくとも2塩基対の二本鎖を含むヘアピンに、10mM NaHPO4中、少なくとも55℃の融解温度をもたらし得る。テトラループには、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、改変ヌクレオチドおよびそれらの混合物が含まれてよい。RNAテトラループの例には、テトラループのUNCファミリー(例えばUUCG)、テトラループのGNRAファミリー(例えばGAAA)、およびCUUGテトラループが含まれる(Woese et al.,Proc Natl Acad Sci USA.1990 Nov;87(21):8467−71;Antao et al.,Nucleic Acids Res.1991 Nov 11;19(21):5901−5)。DNAテトラループの例には、テトラフープのd(GNNA)ファミリー(例えば、d(GTTA)、テトラループのd(GNRA))ファミリー、テトラループのd(GNAB)ファミリー、テトラループのd(CNNG)ファミリー、テトラフープのd(TNCG)ファミリー(例えばd(TTCG))が含まれる。(Nakano et al.Biochemistry,41(48),14281−14292,2002.;SHINJI et al.Nippon Kagakkai Koen Yokoshu VOL.78th;NO.2;PAGE.731(2000).)。

0117

本明細書で使用するところの語句「siRNA」は、各鎖が、RNA、RNA類似体(類)またはRNAおよびDNAを含む二本鎖核酸を意味する。siRNAは、19〜23ヌクレオチドを含み、または21ヌクレオチドを含む。siRNAは、概して、siRNA中の二本鎖領域が17〜21ヌクレオチド、または19ヌクレオチドを含むように、各鎖の3’末端上に2bpオーバーハングを有する。概して、siRNAのアンチセンス鎖は、グリコール酸オキシダーゼ遺伝子/RNAの標的配列と十分に相補的である。

0118

ある特定の実施形態では、本発明の抗−グリコール酸オキシダーゼDiRNAは、少なくとも25ヌクレオチドの鎖長を有する。したがって、ある特定の実施形態では、抗−グリコール酸オキシダーゼDsiRNAは、1つのオリゴヌクレオチド配列、長さにして少なくとも25ヌクレオチドであり、長くても35、または最大50以上のヌクレオチドである、第1の配列を含む。このRNA配列は、長さにして26〜35、26〜34、26〜33、26〜32、26〜31、26〜30、26〜29ヌクレオチドであり得る。本配列は、長さにして27または28ヌクレオチドであり得、長さにして27ヌクレオチドであり得る。DsiRNA剤の第2の配列は、真核細胞の細胞質内のような生物学的条件下で第1の配列にアニールする配列であり得る。一般的に、第2のオリゴヌクレオチド配列は、第1のオリゴヌクレオチドと少なくとも19の相補塩基対を持ち、より典型的には、第2のオリゴヌクレオチド配列は、第1のオリゴヌクレオチド配列と、21以上の相補塩基対を持ち、または25以上の相補塩基対を持つ。1つの実施形態では、第2の配列は、第1の配列と同一の長さであり、DsiRNA剤は平滑末端である。別の実施形態では、DsiRNA剤の末端は1つ以上のオーバーハングを有する。

0119

ある特定の実施形態では、DsiRNA剤の第1および第2のオリゴヌクレオチド配列は、化学的に合成可能で、典型的に化学的に合成される別のオリゴヌクレオチド鎖上に存在する。いくつかの実施形態では、両方の鎖は、長さにして26〜35ヌクレオチドである。他の実施形態では、両方の鎖は、長さにして、25〜30または26〜30である。1つの実施形態では、両方の鎖は、長さにして27ヌクレオチドであり、完全に相補的であり、平滑末端を有する。本発明のある特定の実施形態では、抗−グリコール酸オキシダーゼDsiRNAの第1および第2の配列は、別のRNAオリゴヌクレオチド(鎖)上に存在する。1つの実施形態では、1つまたは両方のオリゴヌクレオチド鎖は、Dicerに対する基質として働くことが可能である。他の実施形態では、少なくとも1つの改変が、遺伝子発現を阻害することにおいて、二本鎖RNA構造の有効性を最大化する方向で、Dicerが二本鎖RNA構造に結合することを促進して存在する。本発明のある特定の実施形態では、抗−グリコール酸オキシダーゼDsiRNA剤は、第1の鎖(センス鎖)の3’末端で平滑末端を有し、第2の鎖(アンチセンス鎖)の3’末端で3’オーバーハングを有する抗−グリコール酸オキシダーゼDsiRNAと、異なる長さの2つのオリゴヌクレオチド鎖からなる。DsiRNAはまた、1つ以上のデオキシリボ核酸(DNA)塩基置換基を含んでもよい。

0120

2つの別のオリゴヌクレオチドを含む好適なDsiRNA組成物は、化学結合基によって、それらのアニーリング領域外で化学的に連結可能である。多くの好適な化学連結基が、本技術分野で公知であり、使用可能である。好適な基は、DsiRNAにおけるDicer活性を妨げず、標的遺伝子から転写されたRNAの指向性破壊と干渉しない。あるいは、2つの別のオリゴヌクレオチドは、ヘアピン構造が、DsiRNA組成物を作製している2つのオリゴヌクレオチドのアニーリングに際して産生されるように、第3のオリゴヌクレオチドによって連結可能である。ヘアピン構造は、DsiRNA上のDicer活性を妨げず、標的RNAの指向性破壊と干渉しない。

0121

dsRNA分子は、アンチセンス鎖の全ての残基が、標的分子内の残基に相補的であるようにデザイン可能である。あるいは、置換を、分子の安定性を増大させ、かつ/または処理活性を増強するために、分子内で実施可能である。置換は、鎖内にて実施可能であり、または鎖の末端での残基にて実施可能である。ある特定の実施形態では、置換および/または改変は、DsiRNA剤内の特定の残基にて実施される。このような置換および/または改変には、例えばDsiRNA剤のセンス鎖の3’末端位置からナンバリングした場合、位置1、2および3の残基の1つ以上でのデオキシ−改変、ならびにDsiRNA剤のアンチセンス鎖の3’末端残基での、2’−O−アルキル(例えば2’−O−メチル)改変の導入が含まれ、このような改変はまた、アンチセンス鎖の3’末端のオーバーハング位置、および活性siRNA剤を形成するために処理されるDsiRNA剤の領域内に含まれるDsiRNAのアンチセンス鎖の交互残基にて実施される。以上の改変は、例示的なものとして提供され、任意の様式にて限定されるよう意図するものではない。本発明の抗−グリコール酸オキシダーゼDsiRNA剤において実施可能な改変および置換のさらなる記述を含む、好ましいDsiRNA剤の構造のさらなる考慮を以下で見ることが可能である。

0122

第1の配列が、本明細書の第2の配列に関して「実質的に相補的である」配列を指す場合、2つの配列は完全に相補的であってよく、またはそれらの最終的な適用に最も関連する条件下でハイブリッド形成する能力を維持したまま、それら2つの配列は、ハイブリッド形成に際して、1つ以上、しかしながら一般的に4、3または2以下のミスマッチ塩基を形成してよい。しかしながら、2つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリッド形成に際して、1つ以上の一本鎖オーバーハングを形成するようにデザインされる場合、このようなオーバーハングは、相補性の決定に関して、ミスマッチとして見なされるものではない。例えば、1つの21の長さのオリゴヌクレオチドおよび別の23の長さのオリゴヌクレオチドを含むdsRNAであって、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドと完全に相補的な21のオリゴヌクレオチドを含むdsRNAが、本発明の目的となる「完全に相補的である」ことをさらに意味してもよい。

0123

本明細書で使用する、語句「二本鎖RNA」または「dsRNA」は、上記で定義したような、2つの逆平行および実質的に相補的な核酸鎖を含む二本鎖構造を持つ、リボ核酸分子の複合体を意味する。二本鎖構造を形成する2つの鎖は、1つの大きなRNA分子の異なる部分であってよく、または別々のRNA分子であってよい。別々のRNA分子の場合、このようなdsRNAは、多くの場合siRNA(「短い干渉RNA」)またはDsiRNA(「Dicer基質siRNA」)を指す。2つの鎖が1つの大きな分子の一部分であり、したがって二本鎖構造を形成する1つの鎖の3’末端と、別の他の鎖の5’末端間のヌクレオチドの連鎖によって連結される場合、連結しているRNA鎖は、「ヘアピンループ」、「短ヘアピンRNA」または「shRNA」を指す。2つの鎖が、二本鎖構造を形成する1つの鎖の3’末端と、別の他の鎖の5’末端との間のヌクレオチドの連鎖以外の方法によって共有的に連結する場合、連結している構造は、「リンカー」を指す。RNA鎖は、同一または異なる数のヌクレオチドを有していてもよい。塩基対の最大数は、dsRNAの最も短い鎖中のヌクレオチドの数マイナス二本鎖中に存在する任意のオーバーハングである。二本鎖構造に加えて、dsRNAは、1つ以上のヌクレオチドオーバーハングを含んでよい。加えて、本明細書で使用するところの「dsRNA」は、多重ヌクレオチドにおける実質的改変を含み、かつ本明細書で開示されたか、本技術分野で公知の全ての型の改変を含む、リボヌクレオチド、ヌクレオシド間結合末端基キャップおよび共役部位への化学的改変が含まれ得る。siRNA−またはDsiRNA−型分子内で使用されるような、任意のこのような改変は、本明細書および特許請求の範囲のための「dsRNA」によって包含される。

0124

語句「二本鎖領域」は、ワトソン−クリック塩基対化、もしくは相補的であるか、もしくは実質的に相補的であるオリゴヌクレオチド鎖間の二本鎖を許容する他の様式のいずれかによって、互いに塩基対を形成する2つの相補的であるか、または本質的に相補的なオリゴヌクレオチド中の領域を意味する。例えば、21ヌクレオチドユニットを有するオリゴヌクレオチド鎖は、別の21ヌクレオチドユニットのオリゴヌクレオチドと塩基対化可能であり、さらには、「二本鎖領域」が19塩基対からなるように、各鎖上の19塩基のみが、相補的であるか、または実質的に相補的である。残りの塩基対は、例えば、5’および3’オーバーハングとして存在してもよい。さらに、二本鎖領域内で、100%相補性は必要ではなく、実質的な相補性が二本鎖領域内で許容可能である。実質的な相補性は、生物学的条件下でアニーリング可能であるような、鎖間の相補性を意味する。2つの鎖が、生物学的条件下でアニーリング可能であるかどうかを実験的に決定するための技術は、当業者によく知られている。あるいは、2つの鎖を、互いにアニールするかどうかを決定するために、合成でき、かつ生物学的条件下で共に添加できる。

0125

多数の塩基にわたり塩基対を形成する一本鎖核酸が、「ハイブリッドする」と呼ばれる。ハイブリッド形成は、概して、生理学的または生物学的に関連のある条件(例えば、細胞内:pH7.2、140mMカリウムイオン細胞外pH7.4、145mMナトリウムイオン)下で決定される。ハイブリッド形成条件は一般的に、一価カチオンと生物学的に許容可能な緩衝液とを含み、二価カチオン、複合体アニオン、例えばグルタミン酸カリウム由来のグルタミン酸スクロースのような非荷電種、および試料中の水の活性を減少させるための不活性ポリマー、例えばPEGを含んでよく、または含まなくてよい。このような条件には、塩基対が形成される条件が含まれる。

0126

ハイブリッド形成は、二本鎖を形成している一本鎖核酸を乖離させるために必要な温度、すなわち(融解温度;Tm)によって測定される。ハイブリッド形成条件はまた、塩基対が形成され得る条件下であり得る。種々の厳密性条件を使用して、ハイブリッド形成を決定可能である(例えばWahl,G.M.and S.L.Berger(1987)MethodsEnzymol.152:399;Kimmel.A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507を参照のこと)。厳密性温度条件は通常、少なくとも約30℃の、より好ましくは少なくとも約37℃、最も好ましくは少なくとも約42℃の温度を含む。長さにして50塩基対未満であると予想されるハイブリッドに対するハイブリッド形成温度は、ハイブリッドの融解温度(Tm)よりも5〜10℃低くあるべきであり、ここでTmは、以下の等式にしたがって決定される。長さにして18塩基対以下のハイブリッドでは、Tm(℃)=2(A+T塩基の#)+4(G+C塩基の#)。長さにして18〜49塩基対のハイブリッドにでは、Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)−(600/N)、式中Nはハイブリッド中の塩基数であり、[Na+]はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である(1×SSC=0.165Mでの[Na+])。例えば、ハイブリッド形成決定緩衝液を表1に示す。

0127

ハイブリッド形成条件における有用な変化が、当業者に簡単に理解されるであろう。ハイブリッド形成技術は、当業者によく知られており、例えば、Benton and Davis(Science 196:180,1977);Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975);Ausubel et al.(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York, 2001);Berger and Kimmel(Antisense to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York);およびSambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New Yorkにて記述されている。

0128

本明細書で使用するところの、「オリゴヌクレオチド鎖」は、一本鎖核酸分子である。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、改変ヌクレオチド(例えば2’改変、合成塩基類似体などを持つヌクレオチド)またはそれらの混合物を含んでよい。このような改変オリゴヌクレオチドは、例えば細胞取込の増強、およびヌクレアーゼの存在下での安定性の増大のような特性のために、天然の形態に対して好ましい。

0129

本明細書で使用するところの語句「リボヌクレオチド」は、天然および合成の、非改変および改変リボヌクレオチドを包含する。改変には、オリゴヌクレオチド中の糖部分に対する、塩基部分に対する、および/またはリボヌクレオチド間の結合に対する変化が含まれる。本明細書で使用するところの語句「リボヌクレオチド」はとりわけ、2’リボース環位置にて、単一プロトン基を有するヌクレオチドである、デオキシリボヌクレオチドを除外する。

0130

本明細書で使用するところの語句「デオキシリボヌクレオチド」は、天然および合成の、非改変および改変デオキシリボヌクレオチドを包含する。改変には、オリゴヌクレオチド中の、糖部分に対する、塩基部分に対する、および/またはデオキシリボヌクレオチド間の結合に対する変化が含まれる。本明細書で使用するところの語句「デオキシリボヌクレオチド」にはまた、dsRNA剤のDicer開裂を許容しない改変リボヌクレオチド、例えば、このような残基の結合においてDicer開裂が発生することを許容しない、2’−O−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエート−改変リボヌクレオチド残基なども含まれる。

0131

本明細書で使用するところの語句「PS−NA」は、ホスホロチオエート−改変ヌクレオチド残基を意味する。語句「PS−NA」はしたがって、ホスホロチオエート−改変リボヌクレオチド(「PS−RNA」」)およびホスホロチオエート−改変デオキシリボヌクレオチド(「PS−DNA」)の両方を包含する。

0132

本明細書で使用するところの「Dicer」は、dsRNAもしくはdsRNA−含有分子、例えば二本鎖RNA(dsRNA)またはプレミクロRNA(miRNA)を、通常3’末端に2塩基オーバーハングを持つ、二本鎖核酸断片19〜25ヌクレオチド長に開裂する、RNaseIIIファミリーのエンドリボヌクレアーゼを意味する。本発明の特定のdsRNA(例えば「DsiRNA」)に関して、本発明の薬剤のdsRNA領域によって形成される二本鎖は、Dicerによって認識され、二本鎖の少なくとも1つの鎖上Dicer基質である。Dicerは、RNA干渉経路中の第一段階触媒し、結果として、標的RNAの分解をもたらす。ヒトDicerのタンパク質配列が、参考文献によって本明細書で組み込まれた寄託番号第NP_085124号の下、NCBIデータベースにて提供される。

0133

Dicer「開裂」は、以下のように決定できる(例えば、Collingwood et al.,Oligonucleotides 18:187-200(2008)を参照のこと)。Dicer開裂アッセイにおいて、RNA二本鎖(100pmol)を、1ユニット組換え体ヒトDicer(Stratagene、La Jolla,CA)あり、またはなしで、20μLの20mM Tris pH8.0、200mM NaCl、2.5mM MgCl2中、37℃にて18〜24時間インキュベートする。試料を、Performa SR96−ウェルプレート(Edge Biosystemsメリーランド州ゲイザースバーグ)を用いて脱塩する。Dicerでの二本鎖RNAの処理前および処理後の電子噴霧イオン化液クロマトグラフィー質量分析ESI−LCMS)を、ThermoFinnigan TSQ7000、Xcaliburデータシステム、ProMassデータ処理ソフトウェアおよびParadigm MS4HPLC(Michrom BioResources,カリフォルニアオーバーン)からなるOligoHTCSシステム(Navatia,Princeton,NJ:Hail et al.,2004)を用いて実施する。本アッセイにおいて、Dicer開裂が、少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%または100%のDicer基質dsRNA(すなわち25〜30bp、dsRNA、好ましくは26〜30bp dsRNA)が、より短いdsRNA(例えば、19〜23bp dsRNA、好ましくは21〜23bp dsRNA)に開裂される場で発生する。

0134

本明細書で使用するところの「Dicer開裂部位」は、DicerがdsRNA(例えば、本発明のDsiRNA剤のdsRNA領域)を開裂する部位を意味する。Dicerは、概してdsRNAのセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を開裂する、2つのRNaseIIIドメインを含む。RNaseIIIドメインとPAZドメインとの間の平均距離が、産出する短い二本鎖核酸断片の長さを決定し、この距離は変動可能である(Macrae et al.(2006)Science 311:195−8)。図1で示すように、Dicerは、アンチセンス鎖の3’末端から除去された21番目と22番目とのヌクレオチド間の部位にて、およびセンス鎖の5’末端より除去された21番目と22番目とのヌクレオチド間の対応する部位で、2ヌクレオチド3’オーバーハングを持つアンチセンス鎖を有する、本発明の特定の二本鎖リボ核酸を開裂すると考えられる。図1にて描写したものと異なる、dsRNA分子に対する、考えられる、かつ/または一般的なDicer開裂部位は、Macraeらにて記述されたものを含む、本技術分野で認識される方法を介して同様に同定されてもよい。図1で描写したDicer開裂事象が、21ヌクレオチドsiRNAを産出する一方で、dsRNA(例えばDsiRNA)のDicer開裂が結果として、長さにして19〜23ヌクレオチドのDicer−処理したsiRNA長の産出となり得ることが留意される。実際、ある特定の実施形態では、二本鎖DNA領域は、21マーではなく、概して好ましくない19マーまたは20マーsiRNAの一般的なDicer切除指向するために、dsRNA内に含まれてよい。

0135

本明細書で使用するところの、「オーバーハング」は、dsRNAの5’末端または3’末端にて1つ以上の遊離末端を有する二本鎖の文脈において、対になっていないヌクレオチドを意味する。ある特定の実施形態では、オーバーハングは、アンチセンス鎖またはセンス鎖上の3’または5’オーバーハングである。いくつかの実施形態では、オーバーハングは、1〜6ヌクレオチド、任意に1〜5、1〜4、1〜3、1〜2、2〜6、2〜5、2〜4、2〜3、3〜6、3〜5、3〜4、4〜6、4〜5、5〜6ヌクレオチド、または1、2、3、4、5または6ヌクレオチドの長さを持つ3’オーバーハングである。「平滑末端化」または「平滑末端」は、dsRNAの末端に対でないヌクレオチドがない、すなわちヌクレオチドのオーバーハングがないことを意味する。明確にすると、siRNAの3’末端または5’末端に結合した化学的キャップまたは非ヌクレオチド化学的部分は、siRNAがオーバーハングを有しているかまたは平滑末端化されているかどうかを判定する際に考慮されるものではない。ある特定の実施形態では、本発明は、細胞または哺乳類中のグリコール酸オキシダーゼ標的遺伝子の発現を阻害するdsRNA分子であって、dsRNAがグリコール酸オキシダーゼ標的遺伝子の発現において形成されるmRNAの少なくとも一部に相補的である相補領域を含むアンチセンス鎖を含み、かつ上記相補領域が35未満の長さのヌクレオチド、任意に19〜24の長さのヌクレオチドまたは25〜30の長さのヌクレオチドであり、かつdsRNAが、グリコール酸オキシダーゼ標的遺伝子を発現する細胞と接触すると、グリコール酸オキシダーゼ標的遺伝子の発現を少なくとも10%、25%、または40%阻害する、dsRNA分子を提供する。

0136

本発明のdsRNAは、二本鎖構造を形成するためにハイブリッド形成するのに十分に相補的である2つのRNA鎖を含む。dsRNAの1つの鎖(アンチセンス鎖)は、グリコール酸オキシダーゼ標的遺伝子の発現の間に形成されたmRNAの配列から誘導された、標的配列に実質的に相補的な、一般的には完全に相補的な相補性の領域を含み、他の鎖(センス鎖)は、アンチセンス鎖に相補的な領域を含み、それによって2つの鎖は、好適な条件下で混合した時に、ハイブリッド形成し、二本鎖構造を形成する。一般的に、二本鎖構造は、長さにして15〜80、または15〜53、または15〜35、任意に25〜30、26〜30、18〜25、19〜24または19〜21塩基対である。同様に、標的配列に相補的な領域は、長さにして、15〜35、任意に18〜30、25〜30、19〜24または19〜21ヌクレオチドである。本発明のdsRNAはさらに、1つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含んでよい。(一般的に長さにして少なくとも25塩基対の)DsiRNAおよびsiRNA(ある特定の実施形態では、siRNAの二本鎖構造は、20〜23、任意に特に21塩基対)を含む、長さにして15〜35塩基対の二本鎖構造を含むdsRNAが、RNA干渉を誘導することにおいて効果的であり得ることが同定されてきた(Elbashir et al.,EMBO 20:6877−6888)。また、20塩基対より短い(例えば15、16、17、18または19塩基対二本鎖)を有するdsRNAも同様に効果的であり得ることが同定されてきた。ある特定の実施形態では、本発明のdsRNAは、19以上の長さのヌクレオチドのうち少なくとも1つの鎖を含み得る。ある特定の実施形態では、以下の表4、6、8または10の配列の1つに相補的な配列マイナス1つまたは両方の末端上の数個のヌクレオチドを含む、より短いdsRNAが、上記および表2、3、5、7および9にて記述したdsRNAと比較して同様に効果的であり得ることが合理的に予測できる。したがって、表4、6、8または10の配列の1つに十分に相補的な、少なくとも15、16、17、18、19、20またはそれ以上の隣接ヌクレオチドの部分配列を含み、完全配列を含むdsRNAから最高5、10、15、20、25または30%阻害まで、本発明で記述したアッセイにて、グリコール酸オキシダーゼ標的遺伝子の発現を阻害するそれらの能力において異なるdsRNAが、本発明によって考慮される。1つの実施形態では、dsRNAの少なくとも1つの末端が、1〜5、任意に1〜4、ある特定の実施形態では、1または2ヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。少なくとも1つのヌクレオチドオーバーハングを有する特定のdsRNA構造は、dsRNA分子の両方の間端にて、塩基対形成平滑末端を有する同等のものと比較して、優れた阻害特性を有する。

0137

本明細書で使用するところの語句「RNA処理」は、siRNA、miRNAまたはRNaseH経路の構成要素(例えばDrosha、Dicer、Argonaute2または他のRISCエンドリボヌクレアーゼおよびRNaseH)によって実施される処理活性を意味し、以下でより詳細に記述されている(以下「RNA処理」項目を参照のこと)。本語句は、RNAの5’キャッピングの転写後工程と、非−RISCまたは非−RNase H−媒介工程を介したRNAの分解とから明確に区別される。このようなRNAの「分解」は、種々の形態、例えば脱アデニル化(3’ポリ(A)テールの除去)、および/または1つ以上の種々のエンド−もしくはエキソ−ヌクレアーゼ(例えばRNaseIII、RNaseP、RNaseT1、RNaseA(1、2、3、4/5)、オリゴヌクレオチダーゼなど)によるRNAの本体の一部または全てのヌクレアーゼ消化、を取り得る。

0138

相同配列」は、遺伝子、遺伝子転写産物および/または非コードポリヌクレオチドのような、1つ以上のポリヌクレオチド配列によって共有されるヌクレオチド配列を意味する。例えば、相同配列は、サイトカインおよびそれと対応する受容体のような、遺伝子ファミリーの異なるメンバー、異なるタンパク質エピトープ、異なるタンパク質アイソフォームまたは完全に相違する遺伝子のような、関連するが異なるタンパク質をコードしている2つ以上の遺伝子によって共有されるヌクレオチド配列であり得る。相同配列は、非コードDNAまたはRNA、制御配列イントロン、および転写制御または調節の部位のような、2つ以上の非コードポリヌクレオチドによって共有されるヌクレオチド配列であり得る。相同配列はまた、1つ超のポリヌクレオチド配列によって共有される保存配列領域を含み得る。相同性は、部分相同配列(例えば99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%など)もまた本発明で考慮されるので、完全相同性(例えば100%)である必要はない。実際、本発明のdsRNA剤のデザインおよび利用は、本明細書で記述したdsRNA剤と完全な相補性を有するグリコール酸オキシダーゼの標的RNAに対してのみでなく、上記dsRNA剤に対して例えば99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%などのみ相補的である配列を有するグリコール酸オキシダーゼRNAに対しての、このようなdsRNA剤を利用する可能性も考慮する。同様に、本明細書で記述された本発明のdsRNA剤は、上記dsRNA剤と標的グリコール酸オキシダーゼRNA例えばグリコール酸オキシダーゼの特定の対立バリアント(例えば増強された治療的対象の対立遺伝子)との間の相補性の程度増強するために、当業者によって簡単に変更され得る。実際、標的グリコール酸オキシダーゼ配列に関する挿入、欠損および単一点変異を持つdsRNA剤配列がまた、阻害に対して効果的であり得る。あるいは、ヌクレオチド類似体置換または挿入を持つdsRNA剤配列が阻害に対して効果的であり得る。

0139

配列同一性は、本技術分野で公知の配列比較およびアライメントアルゴリズムによって決定してよい。2つの核酸配列の(または2つのアミノ酸配列の)パーセント同一性を決定するために、配列を比較の目的でアライメントさせる(例えばギャップを、最適配列のために、第1の配列または第2の配列中に導入可能である)。次に、対応するヌクレオチド(またはアミノ酸)位置でのヌクレオチド(またはアミノ酸残基)を比較する。第1の配列中の位置が、第2の配列中の対応する位置と同一の残基によって占有される場合、分子はその位置で同一である。2つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有された同一の位置の数の関数であり(すなわち%相同性=同一位置の#/位置×100の合計#)、任意に、導入されたギャップの数および/または導入されたギャップの長さに対するスコアペナルティー課す

0140

配列の比較と、2つの配列間の配列パーセント同一性の決定とを、数学的アルゴリズムを用いて実施可能である。1つの実施形態では、アライメントは、十分な同一性をもってアライメントさせたアライメントの特定の部分にわたり、しかし低度の同一性を持つ部分にはわたらず(すなわち局所アライメント)産出された。配列の比較のために使用した局所アライメントアルゴリズムの好ましい、非限定例は、Karlin and Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873−77にてのように改変された、Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264−68のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、Altshul,et al.(1990)J.Mol.Biol.215:403−10のBLASTプログラムバージョン2.0)内に組み込まれる。

0141

別の実施形態では、適切なギャップを導入することによってアライメントが最適化されるギャップアライメントは、パーセント同一性が、アライメントした配列(すなわちギャップアライメント)の長さにわたり決定される。比較の目的のためギャップアライメントを得るために、ギャップBLASTを、Altschul et al.,(1997)Nucleic AcidsRes.25(17):3389−3402にて記述したように使用可能である。別の実施形態では、適切なギャップを導入することによってアライメントが最適化されるグローバルアライメントが、パーセント同一性が、アライメントした配列の全長(すなわちグローバルアライメント)にわたり決定される。配列のグローバル比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい、非限定例は、Myers and Miller,CABIOS(1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部である、ALIGNプログラム(バージョン2.0)内に組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを利用する時に、PAM120ウェイト基表、12のギャップ長ペナルティー、および4のギャップペナルティーを使用可能である。

0142

dsRNAアンチセンス鎖およびグリコール酸オキシダーゼRNA配列の一部の間の80%超の配列同一性、例えば、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%の配列同一性が好ましい。あるいは、dsRNAは、グリコール酸オキシダーゼRNAの一部とハイブリッド形成可能なヌクレオチド配列(またはオリゴヌクレオチド配列)として機能的に定義してよい(例えば、400mM NaCl、40mMPIPESpH6.4、1mMEDTA、12〜16時間の50℃または70℃ハイブリッド形成と続く洗浄)。さらなる好ましいハイブリッド形成条件には、1×SSC中70℃、または1×SSC中50℃、50%ホルムアミドでのハイブリッド形成と、続く0.3×SSC中70℃での洗浄、または4×SSC中70℃もしくは4×SSC中50℃、50%ホルムアミドでのハイブリッド形成と、続く1×SSC中67℃での洗浄が含まれる。長さにして50塩基対未満であると予測されるハイブリッドでのハイブリッド形成温度は、当該ハイブリッドの融解温度(Tm)より5〜10℃低いべきであり、Tmは以下の等式にしたがって決定される。長さにして18塩基対より少ないハイブリッドでは、Tm(℃)=2(A+T塩基の#)+4(G+C塩基の#)。長さにして18〜49塩基対のハイブリッドでは、Tm(℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)−(600/N)、式中Nはハイブリッド中の塩基数であり、[Na+]はハイブリッド形成緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である(1×SSC=0.165Mでの[Na+])。ポリヌクレオチドハイブリッド形成に対する厳密性条件のさらなる例が、Sambrook,J.,E.F.Fritsch,and T.Maniatis,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,9および11章、およびCurrent Protocols in Molecular Biology,1995,F.M.Ausubel et al.,eds.,John Wiley & Sons,Inc.,項目2.10および6.3〜6.4にて提供される。等しいヌクレオチド配列の長さは、少なくとも10、12、15、17、20、22、25、27または30塩基であってよい。

0143

「保存配列領域」は、世代間で、または1つの生物系、対象もしくは生命体から別の生物系、対象もしくは生命体までで有意に変化しないポリヌクレオチドの1つ以上の領域のヌクレオチド配列を意味する。ポリヌクレオチドは、コードおよび非コードのDNAおよびRNA両方を含み得る。

0144

「センス領域」は、dsRNA分子のアンチセンス領域に相補性を持つdsRNA分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、dsRNA分子のセンス領域は、標的核酸配列と相同性を持つ核酸配列を含み得る。

0145

「アンチセンス領域」は、標的核酸配列に相補性を持つdsRNA分子のヌクレオチド配列を意味する。さらに、dsRNA分子のアンチセンス領域は、dsRNA分子のセンス領域に相補性を持つ核酸配列を含む。

0146

本明細書で使用するところの「アンチセンス鎖」は、標的RNAの配列に相補的な配列を持つ一本鎖核酸分子を意味する。アンチセンス鎖が、塩基類似体を有する改変ヌクレオチドを含む場合、その全長にわたり相同的である必要はないが、少なくとも標的RNAにハイブリッドしなければならない。

0147

本明細書で使用するところの「センス鎖」は、アンチセンス鎖の配列に相補的な配列を持つ一本鎖核酸分子を意味する。アンチセンス鎖が、塩基類似体を有する改変ヌクレオチドを含む場合、センス鎖は、アンチセンス鎖の全長にわたり相補的である必要はないが、アンチセンス鎖と少なくとも二本鎖を形成しなければならない。

0148

本明細書で使用するところの「ガイド鎖」は、dsRNAまたはdsRNA−含有分子の一本鎖核酸分子を意味し、結果としてRNA干渉をもたらす標的RNAの配列と十分に相補的である配列を持つ。DicerによるdsRNAまたはdsRNA−含有分子の開裂後、ガイド鎖の断片が、RISCに結合したままとなり、RISC複合体の一成分として標的RNAに結合し、RISCによって標的RNAの開裂を促進する。本明細書で使用するように、ガイド鎖は、連続一本鎖核酸を意味する必要はなく、好ましくはDicerによる開裂の部位で、不連続性を含んでよい。ガイド鎖はアンチセンス鎖である。

0149

本明細書で使用するところの「パッセンジャー鎖」は、dsRNAまたはdsRNA−含有分子のオリゴヌクレオチド鎖を意味し、ガイド鎖の配列と相補的である配列を持つ。本明細書で使用するように、パッセンジャー鎖は、連続一本鎖核酸を意味する必要はなく、好ましくはDicerにより開裂する部位で、不連続性を含んでよい。パッセンジャー鎖はセンス鎖である。

0150

「標的核酸」は、その発現、レベルまたは活性が調整されるべきである核酸配列を意味する。標的核酸は、DNAまたはRNAであり得る。グリコール酸オキシダーゼを標的とする薬剤に関して、ある特定の実施形態では、標的核酸はグリコール酸オキシダーゼ(HAO1)RNA、例えばある特定の実施形態ではグリコール酸オキシダーゼ(HAO1)mRNAである。グリコール酸オキシダーゼRNA標的部位はまた、対応するcDNA配列によって互換的に参照され得る。グリコール酸オキシダーゼのレベルはまた、グリコール酸オキシダーゼの上流エフェクターの標的化を介して標的化されてよく、または調整されたもしくは誤調節されたグリコール酸オキシダーゼの効果がまた、グリコール酸オキシダーゼシグナル伝達経路中のグリコール酸オキシダーゼの下流の分子の標的化によって調整されてもよい。

0151

「相同性」は、核酸が、従来のワトソン−クリック、または他の従来にはない型のいずれかによって、他の核酸配列と水素結合を形成可能であることを意味する。本発明の核酸分子に関して、その相補的な配列を備える核酸分子に対する結合自由エネルギーは、核酸の関連ある機能、例えばRNAi活性を進行できるために十分なエネルギーである。核酸分子に対する結合自由エネルギーの決定が、本技術分野でよく知られている(例えば、Turner et al.,1987,CSH Symp.Quant.Biol.LII pp.123−133;Frier et al.,1986,Proc.Nat.Acad.Sci. USA 83:9373−9377;Turner et al.,1987,J.Am. Chem.Soc.109:3783−3785を参照のこと)。パーセント相補性は、第2の核酸配列と水素結合(例えばワトソン−クリック塩基対化)を形成可能な核酸分子中近接残基の割合を示唆する(例えば10ヌクレオチドを持つ第2の核酸配列に対して塩基対形成する第1のオリゴヌクレオチド中の合計10ヌクレオチドのうち5、6、7、8、9または10ヌクレオチドが、それぞれ50%、60%、70%、80%、90%および100%相同性を表す)。「完全に相補的」は、核酸配列の近接残基の全てが、第2の核酸配列中の同一の数の近接残基と水素結合することを意味する。1つの実施形態では、本発明のdsRNA分子は、1つ以上の標的核酸分子またはそれらの一部に対して相補的である、19〜30(例えば19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30以上)のヌクレオチドを含む。

0152

本明細書で使用するように、標的RNAまたはcDNA配列(例えばグリコール酸オキシダーゼ(HAO1)mRNA)に「十分に相補的な」配列を有するdsNA、例えばDsiRNAまたはsiRNAは、dsNAが、RNAi機構(例えばRISC複合体)または工程によって、標的RNA(cDNA配列が列挙される場合、列挙されたcDNA配列に相当するRNA配列)の破壊を引き起こすのに十分な配列を持つことを意味する。例えば、RNAi機構または工程によって、標的RNAの破壊を引き起こすための、標的RNAまたはcDNA配列に「十分に相補的な」dsNAは、dsNA活性の適切なアッセイ(例えば、以下実施例2にて記述したようなin vitroアッセイ)中の、標的RNAのレベルにおいて検出可能な減少を引き起こすdsNAとして同定可能であり、またはさらなる実施例において、RNAi機構または工程によって、標的RNAの破壊を引き起こすための標的RNAまたはcDNA配列に十分に相補的なdsNAを、dsNA活性の適切なアッセイ中の標的RNAのレベルにおいて、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%の減少を産出するdsNAとして同定可能である。追加の実施例において、RNAi機構または工程によって標的RNAの破壊を引き起こすための、標的RNAまたはcDNA配列に十分に相補的なdsNAは、細胞または生命体における標的RNAまたはタンパク質レベルに関する特定レベルの阻害活性持続時間の評価に基づいて同定可能である。例えば、RNAi機構または工程によって標的RNAの破壊を引き起こすための、標的RNAまたはcDNA配列に十分に相補的なdsNAは、細胞または生命体へのdsNAの投与から少なくとも48時間後において少なくとも20%まで、標的mRNAレベルを減少可能なdsNAとして同定可能である。好ましくは、RNAi機構または工程によって標的RNAの破壊を引き起こすための、標的RNAまたはcDNA配列に十分に相補的なdsNAは、細胞または生命体へのdsNAの投与から少なくとも72時間後において少なくとも40%まで、細胞または生命体へのdsNAの投与から少なくとも4、5または7日後において少なくとも40%まで、細胞または生命体へのdsNAの投与から少なくとも48時間後において少なくとも50%まで、細胞または生命体へのdsNAの投与から少なくとも72時間後において少なくとも50%まで、細胞または生命体へのdsNAの投与から少なくとも4、5または7日後において少なくとも50%まで、細胞または生命体へのdsNAの投与から少なくとも48時間後において少なくとも80%まで、細胞または生命体へのdsNAの投与から少なくとも72時間後において少なくとも80%まで、または細胞または生命体へのdsNAの投与から少なくとも4、5または7日後において少なくとも80%まで、標的mRNAレベルを減少可能なdsNAとして同定可能である。

0153

ある特定の実施形態では、本発明の核酸(例えば、DsiRNAまたはsiRNA)は、標的RNAまたはcDNA配列に対して「ハイブリッド形成するのに十分に相補的な」配列を有し、それによって標的RNAに対する阻害効果を得る。ハイブリッド形成、および2つの配列のハイブリッド形成を可能にするために、1つの核酸が別の核酸に十分に相補的であるか否かを決定するのに使用可能な条件を、以下でより詳細に記載する。

0154

当業者には明らかであるように、「十分に相補的な」(例えば「100%相補的な」と対比される)は、dsNAがRNAi機構(例えば、RISC複合体)または工程により標的RNAの破壊を起こすのに十分な相補性を有することを条件として、本発明のdsNAと標的RNAまたはcDNA配列(例えばグリコール酸オキシダーゼ(HAO1)mRNA)との間に1つ以上のミスマッチが存在することを許容する。ある特定の実施形態では、「十分に相補的な」本発明のdsNAは、dsNA配列および標的RNAまたはcDNA配列の間に1、2、3または4つ以上ものミスマッチを有することができる(例えば、このようなある特定の実施形態では、dsRNAのアンチセンス鎖は、最大の相補性で標的RNAまたはcDNA配列とアライメントされる際、1、2、3、4、5または6つ以上ものミスマッチを有する)。さらに、本発明の特定のdsRNA内のこのようなミスマッチの好ましい位置は、以下により詳細に考慮されている。

0155

1つの実施形態では、グリコール酸オキシダーゼ遺伝子発現を下方制御または低減させる本発明のdsRNA分子を、対象または生命体内のグリコール酸オキシダーゼ−関連疾患または障害(例えば、PH1)を治療、予防または減少させるために使用する。

0156

本発明の1つの実施形態では、本発明のDsiRNA分子の各配列は、独立して、長さにして25〜35ヌクレオチド、特定の実施形態では、長さにして25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35ヌクレオチドである。別の実施形態では、本発明のDsiRNA二本鎖は独立して、25〜30塩基対(例えば25、26、27、28、29または30)を含む。別の実施形態では、本発明のDsiRNA分子の1つ以上の鎖は、標的(グリコール酸オキシダーゼ)核酸分子に相補的である、19〜35ヌクレオチド(例えば、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35)を独立して含む。ある特定の実施形態では、本発明のDsiRNA分子は、長さにして25〜66ヌクレオチド、任意に25〜49ヌクレオチド(例えば長さにして25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48または49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66ヌクレオチド、任意に全てのこのようなヌクレオチドは、反対の鎖の同種ヌクレオチドと塩基対を形成する)の長さの二本鎖ヌクレオチドを有する。関連する実施形態では、本発明のdsNAは、独立して19〜66の長さのヌクレオチド、任意に25〜53の長さのヌクレオチド、例えば、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48または49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66の長さのヌクレオチドである鎖の長さを有する。ある特定の実施形態では、1つの鎖の長さは、19〜35の長さのヌクレオチドであるが、もう一方の鎖の長さは、30〜66の長さのヌクレオチドであり、少なくとも1つの鎖が、もう一方の鎖に対して少なくとも5の長さのヌクレオチドを持つ5’オーバーハングを有する。特定の関連する実施形態では、第1の鎖の3’末端および第2の鎖の5’末端は、平滑末端または1〜6ヌクレオチドの3’オーバーハングである構造を形成するが、第1の鎖の5’末端は、第2の鎖の3’末端に対して5〜35ヌクレオチドのオーバーハングを形成する。任意に、5〜35ヌクレオチドのオーバーハングのうち1〜全てのヌクレオチドが、改変ヌクレオチド(任意に、デオキシリボヌクレオチドおよび/または改変リボヌクレオチド)である。

0157

いくつかの実施形態では、本発明のdsNAは、少なくとも8の隣接リボヌクレオチドを有する第1の鎖または第2の鎖を有する。ある特定の実施形態では、本発明のdsNAは、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23以上(例えば、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、26以上、最大で鎖の全長)リボヌクレオチドを有し、任意に改変リボヌクレオチド(2’−O−メチルリボヌクレオチド、ホスホロチオエート結合など)を含む。ある特定の実施形態では、リボヌクレオチドまたは改変リボヌクレオチドは隣接している。

0158

本発明のある特定の実施形態では、例えば、米国特許公開公報第2011/0288147号に記載されているような、テトラループおよび改変ヌクレオチド含有dsNAを企図する。そのようなある実施形態では、本発明のdsNAは、第1の鎖および第2の鎖を有し、第1の鎖および第2の鎖が19〜25の長さのヌクレオチドの二本鎖領域を形成し、第1の鎖が、第1の鎖−第2の鎖の二本鎖領域を超えて伸長し、かつテトラループを含む3’領域を含み、dsNAが第1の鎖の3’末端と第2の鎖の5’末端との間に不連続性を含む。任意に、不連続性は、テトラループ含有dsNAの予想されるdicer開裂部位に位置する。本発明の他の二本鎖オリゴヌクレオチドのいずれかに関して、本発明のテトラループ含有二本鎖は、本明細書で開示される、またはさもなければ本技術分野で既知の改変、例えば、2’−O−メチル、2’−フルオロ、逆塩基、GalNAc部分などを含む任意の範囲を有することができることが企図される。

0159

ある特定の実施形態では、dsNAは第1の鎖および第2の鎖を有し、各鎖が独立して5’末端および3’末端を有し、独立して25〜53の長さのヌクレオチドを持つそれぞれの鎖の長さを有して、十分なほど多く改変され、例えば、1つおよび/または両方の鎖の少なくとも10%以上、少なくとも20%以上、少なくとも30%以上、少なくとも40%以上、少なくとも50%以上、少なくとも60%以上、少なくとも70%以上、少なくとも80%以上、少なくとも90%以上、少なくとも95%以上の残基が改変されて、dsNAのdicer開裂を防止するようにする(任意に、改変残基は、dsNAの1つまたは全ての予測されるdicer開裂部位に、および/またはその部位に隣接して生成される)。このような非dicer開裂dsNAは、グリコール酸オキシダーゼ(HAO1)阻害活性を保持し、任意に非dicerヌクレアーゼにより切断されて、哺乳類細胞中でグリコール酸オキシダーゼ(HAO1)を阻害できる、例えば15〜30の長さ、またはある特定の実施形態では19〜23の長さのヌクレオチド鎖dsNAを得る。特定の関連する実施形態では、このようなdsNAのdicer開裂をブロックするために十分に広範囲な改変を有するdsNAは、非DicerヌクレアーゼによるこのようなdsNAの開裂を可能にする、および/または促進させる非改変ヌクレオチド残基(例えば、改変パターン中に「ギャップ」または「ウィンドウ」を形成する1または2以上の連続したヌクレオチド)の領域を任意に有する。他の実施形態では、本発明のDicer開裂dsNAは、改変中にこのような「ウィンドウ」または「ギャップ」を有する広範囲な改変パターンを含み、Dicer開裂がこのような部位で(このようなdsNA内の大幅に改変された領域と比較して)選択的に生成されるようにすることができる。

0160

本発明のある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチド(任意に、遊離アンチセンスオリゴヌクレオチドとして、または二本鎖もしくは他の多重鎖構造のオリゴヌクレオチドとして)が提供され、このオリゴヌクレオチドは、本明細書内の他の箇所に記載されているようにHAO1標的と相補的な配列を含み、15〜80の長さのヌクレオチド、例えば、ある特定の実施形態では、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79または80の長さのヌクレオチドである。

0161

本発明のある特定の追加的な実施形態では、本発明のDsiRNA分子の各オリゴヌクレオチドは、独立して25〜53の長さのヌクレオチド、特定の実施形態では、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52または53の長さのヌクレオチドである。30の長さのヌクレオチドを超える鎖を有するDsiRNAに関して、使用可能な構造としては、1つの鎖のみが30の長さのヌクレオチドを超えるようなもの(例えば、米国特許第8,349,809号を参照のこと)、または両方の鎖が30の長さのヌクレオチドを超えるようなもの(例えば、国際公開第2010/080129号を参照のこと)が挙げられる。安定化改変(例えば、dNTP塩基対、2’−Fなどを含む、2’−O−メチル、ホスホロチオエート、デオキシリボヌクレオチド)を本発明の任意の二本鎖核酸内に組み込むことができ、特に、30の長さのヌクレオチドを超える1つまたは両方の鎖を有するDsiRNA内で特に、任意には大量に使用することができる。本発明の二本鎖核酸のガイド鎖は、標的RNA(例えば、mRNA)に相補的な、例えば15、16、17、18または19ヌクレオチドの配列を有していなければならないが、ガイド鎖の追加の配列は標的RNAに相補的である必要はない。30ヌクレオチドを超える少なくとも1つの鎖の長さを有する二本鎖核酸の末端構造はまた、変動可能でありながら機能的dsNAを生成し続け、このdsNAでは例えば、ガイド鎖の5’末端およびパッセンジャー鎖の3’末端が、5’オーバーハング、平滑末端または3’オーバーハングを形成し得(ある特定のdsNA、例えば「一本鎖伸長」dsNAについては、このような5’または3’オーバーハングの長さは、1〜4、1〜5、1〜6、1〜10、1〜15、1〜20あるいは1〜25以上のヌクレオチドであり得る);同様に、ガイド鎖の3’末端およびパッセンジャー鎖の5’末端が、5’オーバーハング、平滑末端または3’オーバーハングを形成し得る(ある特定のdsNA、例えば「一本鎖伸長」dsNAについては、このような5’または3’オーバーハングの長さは、1〜4、1〜5、1〜6、1〜10、1〜15、1〜20あるいは1〜25以上のヌクレオチドであり得る)。ある特定の実施形態では、パッセンジャー鎖の5’末端は、ガイド鎖の3’末端に対して5’オーバーハングを含み、その結果、1〜15以上のヌクレオチド一本鎖の伸長が存在する。任意に、本発明のdsNAのこのような一本鎖伸長は(パッセンジャー鎖上またはガイド鎖上に存在しようとも)、例えば、ホスホロチオエート(PS)、2’−F、2’−O−メチルおよび/または本明細書で企図される、もしくは本技術分野において既知の、例えばGalNAc部分、逆脱塩基残基などとの複合体化を含む、他の改変形態で改変され得る。いくつかの実施形態では、本発明の一本鎖伸長二本鎖のガイド鎖は、35〜50の長さのヌクレオチドであるが、二本鎖は、7〜20の長さのヌクレオチドである一本鎖伸長を提示する。ある特定の実施形態では、二本鎖のガイド鎖は、37〜42の長さのヌクレオチドであり、二本鎖は、およそ5〜15の長さの一本鎖ヌクレオチド(任意に、6、7、8、9、10、11、12、13、または14の長さのヌクレオチド)であるパッセンジャー鎖の5’一本鎖オーバーハングを有する。関連する実施形態では、二本鎖のパッセンジャー鎖は、約25〜約30の長さのヌクレオチドである。ある特定の実施形態では、二本鎖の伸長領域は、例えば、2’−O−メチル、2’−フルオロ、GalNAc部分、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合、逆脱塩基残基などのうちの1つ以上で、任意に広範囲に改変され得る。ある特定の実施形態では、パッセンジャー鎖の長さが31〜49ヌクレオチドである一方で、ガイド鎖の長さは31〜53ヌクレオチドであって、任意にガイド鎖の5’末端が、パッセンジャー鎖の3’末端と平滑末端(任意に、塩基対平滑末端)を形成する一方で、任意にガイド鎖の3’末端およびパッセンジャー鎖の5’末端が、1〜4の長さのヌクレオチドを持つ3’オーバーハングを形成する。例示的な「伸長」Dicer基質構造は、例えば米国特許公開公報第2010/0173974号、米国特許第8,513,207号および米国特許第8,349,809号に記載され、その両方が参照により本明細書に援用される。ある特定の実施形態では、本発明のdsNA分子の1つ以上の鎖は、独立して標的(グリコール酸オキシダーゼ)核酸分子に相補的な19〜35ヌクレオチド(例えば、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35)を含む。ある特定の実施形態では、本発明のDsiRNA分子は、25〜49の長さのヌクレオチド(例えば、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48または49の長さのヌクレオチド;任意に、全てのこのようなヌクレオチドは、反対の鎖の同種ヌクレオチドと塩基対を形成する)の二本鎖ヌクレオチドの長さを有する。

0162

本発明のさらなる実施形態では、本発明のDsiRNA分子の各オリゴヌクレオチドは、独立して19〜66の長さのヌクレオチド、特定の実施形態では、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65または66の長さのヌクレオチドである。30の長さのヌクレオチドを超える鎖を有するdsNAに関して、使用可能な構造としては、1つの鎖のみが30の長さのヌクレオチドを超えるようなもの(例えば、米国特許第8,349,809号を参照のこと、ここで、例示的な二本鎖核酸は、5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有し、5’末端の各々が5’末端ヌクレオチドを有し、3’末端の各々が3’末端ヌクレオチドを有し、第1の鎖(または第2の鎖)が25〜30の長さのヌクレオチド残基であり、5’末端ヌクレオチド(位置1)から開始して、第1の鎖(または第2の鎖)の位置1〜23が、少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第2の鎖(または第1の鎖)が36〜66の長さのヌクレオチド残基であり、3’末端ヌクレオチドから開始して、二本鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23と対を形成する位置に少なくとも8のリボヌクレオチドを含み;第2の鎖(または第1の鎖)の少なくとも3’末端ヌクレオチドが第1の鎖(または第2の鎖)と対になっておらず、最大6の連続した3’末端ヌクレオチドが第1の鎖(または第2の鎖)と対になっておらず、それによって1〜6ヌクレオチドの3’一本鎖オーバーハングを形成し;第2の鎖(または第1の鎖)の5’末端が、第1の鎖(または第2の鎖)と対になっていない10〜30の連続したヌクレオチドを含み、それによって10〜30ヌクレオチドの一本鎖5’オーバーハングを形成し;第1の鎖および第2の鎖が最大の相補性でアライメントされる場合、少なくとも第1の鎖(または第2の鎖)の5’末端および3’末端ヌクレオチドが、第2の鎖(または第1の鎖)のヌクレオチドと塩基対を形成し、それによって第1の鎖と第2の鎖との間で実質的に二本鎖の領域を形成し;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するため、第2の鎖のうち少なくとも19の長さのリボヌクレオチドに沿って標的RNAと十分に相補的である)、または両方の鎖が30の長さのヌクレオチドを超えるようなもの(例えば、米国特許第8,513,207号を参照のこと、ここで、例示的な二本鎖核酸(dsNA)は、5’末端および3’末端を有する第1のオリゴヌクレオチド鎖ならびに5’末端および3’末端を有する第2のオリゴヌクレオチド鎖を有し、第1の鎖が31〜49の長さのヌクレオチド残基であり、第1の鎖の5’末端での第1のヌクレオチド(位置1)から開始して、第1の鎖の位置1〜23がリボヌクレオチドであり;第2の鎖が31〜53の長さのヌクレオチド残基であり、かつ二本鎖を形成するために第1の鎖の位置1〜23のリボヌクレオチドと塩基対を形成する、23の連続したリボヌクレオチドを含み;第1の鎖の5’末端および第2の鎖の3’末端が、平滑末端または1〜4ヌクレオチドの3’オーバーハングを形成し;第1の鎖の3’末端および第2の鎖の5’末端が、二本鎖平滑末端、5’オーバーハングまたは3’オーバーハングを形成し;任意に第1の鎖の3’末端ヌクレオチド残基の位置24のうち少なくとも1つが、任意に第2の鎖のデオキシリボヌクレオチドと塩基対を形成するデオキシリボヌクレオチドであり;第2の鎖が、二本鎖核酸が哺乳類細胞内に導入される際に標的遺伝子発現を低減するため、第2の鎖のうち少なくとも19の長さのリボヌクレオチドに沿って標的RNAと十分に相補的である)が挙げられる。

0163

ある特定の実施形態では、本発明の活性dsNAは、2〜50(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50)以上の長さのヌクレオチドを持つ第2の鎖(任意に、ガイド鎖)に対して、第1の鎖(任意に、パッセンジャー鎖)の5’オーバーハングを有し得る。関連する実施形態では、このようなdsNAの第1の鎖および第2の鎖により形成された二本鎖領域は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上の長さの塩基対である。第1の鎖の5’オーバーハング「伸長」領域は、1つ以上の残基にて(任意に、交互残基、全ての残基、または任意の他の種類の残基にて)任意に改変される。

0164

ある特定の実施形態では、本発明の活性dsNAは、2〜50(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50)以上の長さのヌクレオチドを持つ第2の鎖(任意に、ガイド鎖)に対して、第1の鎖(任意に、パッセンジャー鎖)の3’オーバーハングを有し得る。関連する実施形態では、このようなdsNAの第1の鎖および第2の鎖により形成された二本鎖領域は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上の長さの塩基対である。第1の鎖の3’オーバーハング「伸長」領域は、1つ以上の残基にて(任意に、交互残基、全ての残基、または任意の他の種類の残基にて)任意に改変される。

0165

追加的な実施形態では、本発明の活性dsNAは、2〜50(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50)以上の長さのヌクレオチドを持つ第1の鎖(任意に、パッセンジャー鎖)に対して、第2の鎖(任意に、ガイド鎖)の5’オーバーハングを有し得る。関連する実施形態では、このようなdsNAの第1の鎖および第2の鎖により形成された二本鎖領域は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上の長さの塩基対である。第2の鎖の5’オーバーハング「伸長」領域は、1つ以上の残基にて(任意に、交互残基、全ての残基、または任意の他の種類の残基にて)任意に改変される。

0166

さらなる実施形態では、本発明の活性dsNAは、2〜50(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50)以上の長さのヌクレオチドを持つ第1の鎖(任意に、パッセンジャー鎖)に対して、第2の鎖(任意に、ガイド鎖)の3’オーバーハングを有し得る。関連する実施形態では、このようなdsNAの第1の鎖および第2の鎖により形成された二本鎖領域は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25以上の長さの塩基対である。第2の鎖の3’オーバーハング「伸長」領域は、1つ以上の残基にて(任意に、交互残基、全ての残基、または任意の他の種類の残基にて)任意に改変される。

0167

本発明の別の実施形態では、本発明のDsiRNA分子の各配列は、独立して25〜35の長さのヌクレオチド、特定の実施形態では、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35の長さのヌクレオチドである。別の実施形態では、本発明のDsiRNA二本鎖は、独立して25〜30の塩基対(例えば、25、26、27、28、29、または30)を含む。別の実施形態では、本発明のDsiRNA分子の1つ以上の鎖は、独立して標的(HAO1)核酸分子に相補的な19〜35ヌクレオチド(例えば、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34または35)を含む。ある特定の実施形態では、本発明のDsiRNA分子は、25〜34の長さのヌクレオチド(例えば、25、26、27、28、29、30、31、32、33または34の長さのヌクレオチド;任意に、全てのこのようなヌクレオチドは、反対の鎖の同種ヌクレオチドと塩基対を形成する)の二本鎖ヌクレオチドの長さを有する。(本発明の例示的なDsiRNA分子は、図1および以下に示す)。

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