図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2020年3月12日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (8)

課題

酸性環境下で活性が高く、中性付近で活性が低いβ−ラクタマーゼを提供する。

解決手段

pH5.5〜6.5のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がpH7.0におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも1.4倍以上高い、β−ラクタマーゼ変異体

概要

背景

β−ラクタマーゼは、β−ラクタム系抗生物質加水分解する酵素である。近年、β−ラクタマーゼをプロドラッグ療法に適用する検討が行われている。例えば、非特許文献1には、β−ラクタマーゼを結合した癌抗原特異的抗体により、β−ラクタム環が結合した無毒性のプロドラッグを毒性のある抗癌剤に変換し、癌細胞成長阻害したことが報告されている。

このようなプロドラッグ療法において、β−ラクタマーゼによるプロドラッグの変換は、血液中や正常組織中では生じないことが求められる。また、β−ラクタマーゼを結合した癌抗原特異的抗体は、癌組織以外の領域ではすばやく除去される必要がある。しかしながら、従来、これらの要求を十分に満たすことは困難であった。

概要

酸性環境下で活性が高く、中性付近で活性が低いβ−ラクタマーゼを提供する。pH5.5〜6.5のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がpH7.0におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも1.4倍以上高い、β−ラクタマーゼ変異体。なし

目的

本発明は、酸性環境下で活性が高く、中性付近で活性が低いβ−ラクタマーゼを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

pH5.5〜6.5のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がpH7.0におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも1.4倍以上高い、β−ラクタマーゼ変異体

請求項2

列番号1に記載のアミノ酸配列において、第158番目スレオニンに相当するアミノ酸が、イソロイシンアスパラギン酸グルタミン酸ロイシンアスパラギングルタミン又はチロシン置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第160番目のロイシンに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第158番目のスレオニンに相当するアミノ酸が、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、アスパラギン、グルタミン又はチロシンに置換され、第158番目に相当するアミノ酸を除く1又は複数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ5.5〜6.5のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がpH7.0におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも1.4倍以上高いタンパク質、又は配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第160番目のロイシンに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換され、第160番目に相当するアミノ酸を除く1又は複数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ5.5〜6.5のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がpH7.0におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも1.4倍以上高いタンパク質である、請求項1に記載のβ−ラクタマーゼ変異体。

請求項3

配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第77番目のアラニンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第86番目のグルタミンに相当するアミノ酸のリジンへの置換、第47番目のロイシンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第149番目のフェニルアラニンに相当するアミノ酸のチロシンへの置換、第151番目のヒスチジンに相当するアミノ酸のチロシンへの置換、第225番目のアラニンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第265番目のグルタミンに相当するアミノ酸のヒスチジンへの置換、第274番目のグルタミンに相当するアミノ酸のグルタミン酸への置換からなる群より選択される1又は複数個のアミノ酸置換を更に含む、請求項1又は2に記載のβ−ラクタマーゼ変異体。

請求項4

請求項1〜3のいずれか一項に記載のβ−ラクタマーゼ変異体と、β−ラクタム環が結合した抗癌剤とを含む、癌治療用キット

技術分野

0001

本発明は、β−ラクタマーゼ変異体に関する。本発明は、より詳細には、β−ラクタマーゼ変異体及び癌治療用キットに関する。

背景技術

0002

β−ラクタマーゼは、β−ラクタム系抗生物質加水分解する酵素である。近年、β−ラクタマーゼをプロドラッグ療法に適用する検討が行われている。例えば、非特許文献1には、β−ラクタマーゼを結合した癌抗原特異的抗体により、β−ラクタム環が結合した無毒性のプロドラッグを毒性のある抗癌剤に変換し、癌細胞成長阻害したことが報告されている。

0003

このようなプロドラッグ療法において、β−ラクタマーゼによるプロドラッグの変換は、血液中や正常組織中では生じないことが求められる。また、β−ラクタマーゼを結合した癌抗原特異的抗体は、癌組織以外の領域ではすばやく除去される必要がある。しかしながら、従来、これらの要求を十分に満たすことは困難であった。

先行技術

0004

D. L. Meyer, et al., Site-specific Prodrug Activation by Antibody-β-Lactamase Conjugates: Regression and Long-Term Growth Inhibition of Human Colon Carcinoma Xenograft Models, CANCERRESEARCH 53, 3956-3963, 1993.

発明が解決しようとする課題

0005

血液中や正常組織のpHは中性付近であり、癌組織の細胞外環境はpH6.0程度の酸性であることが知られている。発明者らは、酸性環境下で活性が高く、中性付近で活性が低いβ−ラクタマーゼを作出することができれば、このpH依存性により、血液中や正常組織中ではβ−ラクタマーゼの作用を抑制することができ、β−ラクタマーゼを利用したプロドラッグ療法の安全性を高めることができると着想した。

0006

従来、数多くのβ−ラクタマーゼ変異体が報告されているものの、酸性環境下で活性が高く、中性付近で活性が低いβ−ラクタマーゼは知られていない。そこで、本発明は、酸性環境下で活性が高く、中性付近で活性が低いβ−ラクタマーゼを提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0007

本発明は以下の態様を含む。
[1]pH5.5〜6.5のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がpH7.0におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも1.4倍以上高い、β−ラクタマーゼ変異体。
[2]配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第158番目スレオニンに相当するアミノ酸が、イソロイシンアスパラギン酸グルタミン酸ロイシンアスパラギングルタミン又はチロシン置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質
配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第160番目のロイシンに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第158番目のスレオニンに相当するアミノ酸が、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、アスパラギン、グルタミン又はチロシンに置換され、第158番目に相当するアミノ酸を除く1又は複数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ5.5〜6.5のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がpH7.0におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも1.4倍以上高いタンパク質、又は
配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第160番目のロイシンに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換され、第160番目に相当するアミノ酸を除く1又は複数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ5.5〜6.5のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がpH7.0におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも1.4倍以上高いタンパク質である、[1]に記載のβ−ラクタマーゼ変異体。
[3]配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第77番目のアラニンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第86番目のグルタミンに相当するアミノ酸のリジンへの置換、第47番目のロイシンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第149番目のフェニルアラニンに相当するアミノ酸のチロシンへの置換、第151番目のヒスチジンに相当するアミノ酸のチロシンへの置換、第225番目のアラニンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第265番目のグルタミンに相当するアミノ酸のヒスチジンへの置換、第274番目のグルタミンに相当するアミノ酸のグルタミン酸への置換からなる群より選択される1又は複数個のアミノ酸置換を更に含む、[1]又は[2]に記載のβ−ラクタマーゼ変異体。
[4][1]〜[3]のいずれかに記載のβ−ラクタマーゼ変異体と、β−ラクタム環が結合した抗癌剤とを含む、癌治療用キット。

発明の効果

0008

本発明によれば、酸性環境下で活性が高く、中性付近で活性が低いβ−ラクタマーゼを提供することができる。

図面の簡単な説明

0009

(a)及び(b)は、実験例1におけるインビボアッセイの代表的な結果を示す写真である。
(a)及び(b)は、実験例2におけるインビトロアッセイの結果を示すグラフである。
(a)〜(f)は、実験例3におけるインビトロアッセイの結果を示すグラフである。
(a)〜(f)は、実験例3におけるインビトロアッセイの結果を示すグラフである。
(a)〜(f)は、実験例3におけるインビトロアッセイの結果を示すグラフである。
実験例4におけるインビトロアッセイの結果を示すグラフである。
実験例4におけるインビボアッセイの代表的な結果を示す写真である。
(a)〜(i)は、実験例6におけるインビトロアッセイの結果を示すグラフである。

0010

[β−ラクタマーゼ変異体]
1実施形態において、本発明は、pH5.5〜6.5のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がpH7.0におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも1.4倍以上高い、β−ラクタマーゼ変異体を提供する。

0011

実施例において後述するように、発明者らは、酸性環境下で活性が高く、中性付近で活性が低いβ−ラクタマーゼを提供することができる、β−ラクタマーゼ変異体を作出することに成功した。本実施形態のβ−ラクタマーゼ変異体によれば、血液中や正常組織中ではβ−ラクタマーゼの作用を抑制することができるため、例えば、β−ラクタマーゼを利用した癌のプロドラッグ療法の安全性を高めることができる。

0012

本実施形態のβ−ラクタマーゼ変異体は、野生型のβ−ラクタマーゼに対してアミノ酸変異を有している。ここで、野生型のβ−ラクタマーゼとしては、例えば、大腸菌由来TEM−1遺伝子(NCBIアクセッション番号:NC_005327)にコードされるβ−ラクタマーゼが挙げられる。配列番号1に、野生型のTEM−1タンパク質のアミノ酸配列を示す。

0013

実施例において後述するように、具体的なβ−ラクタマーゼ変異体としては、例えば、配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第158番目のスレオニンに相当するアミノ酸が、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、アスパラギン、グルタミン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。あるいは、配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第160番目のロイシンに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。

0014

以下、第158番目のスレオニンに相当するアミノ酸がイソロイシンに置換されたTEM−1タンパク質を、「TEM−1(T158I)変異体タンパク質」という場合がある。同様に、第158番目のスレオニンに相当するアミノ酸がアスパラギン酸に置換されたTEM−1タンパク質を、「TEM−1(T158D)変異体タンパク質」という場合がある。同様に、第160番目のロイシンに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換されたTEM−1タンパク質を、「TEM−1(L160E)変異体タンパク質」という場合がある。以下、他の変異体についても同様である。

0015

野生型のβ−ラクタマーゼは大腸菌由来のTEM−1タンパク質に限られない。本実施形態のβ−ラクタマーゼ変異体において、「配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第158番目のスレオニンに相当するアミノ酸」とは、野生型のTEM−1タンパク質の第158番目のスレオニンと、その機能の発揮に同等の貢献をしているアミノ酸を意味する。

0016

例えば、基準のアミノ酸配列、すなわち、配列番号1のアミノ酸配列と、比較対象のβ−ラクタマーゼのアミノ酸配列を、一次構造(アミノ酸配列)の部分的な相同性を考慮しつつ、最適な比較ができるように並べた場合に(ここで、必要に応じてギャップを導入し、アライメントを最適化してもよい。)、基準のアミノ酸配列中の特定のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸を「相当するアミノ酸」として特定することができる。

0017

また、一次構造同士の比較に代えて、又はこれに加えて、立体構造三次元構造)同士の比較によって「相当するアミノ酸」を特定することもできる。立体構造情報を利用することによって信頼性の高い比較結果が得られる。この場合は、複数のタンパク質の立体構造の原子座標を比較しながらアライメントを行っていく手法を採用できる。タンパク質の立体構造情報は例えばProtein Data Bank Japan(https://pdbj.org/)より取得することができる。

0018

また、上述した、配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第158番目のスレオニンに相当するアミノ酸が、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、アスパラギン、グルタミン又はチロシンに置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であるβ−ラクタマーゼ変異体、及び、配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第160番目のロイシンに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換されたアミノ酸配列からなるタンパク質であるβ−ラクタマーゼ変異体は、pH5.5〜6.5のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がpH7.0におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも1.4倍以上高いタンパク質である限り、更に変異を有していてもよい。

0019

例えば、本実施形態のβ−ラクタマーゼ変異体は、配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第158番目のスレオニンに相当するアミノ酸が、イソロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ロイシン、アスパラギン、グルタミン又はチロシンに置換され、第158番目に相当するアミノ酸を除く1又は複数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ5.5〜6.5のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がpH7.0におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも1.4倍以上高いタンパク質であってもよい。

0020

あるいは、本実施形態のβ−ラクタマーゼ変異体は、配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第160番目のロイシンに相当するアミノ酸がグルタミン酸に置換され、第160番目に相当するアミノ酸を除く1又は複数個のアミノ酸が、欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ5.5〜6.5のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がpH7.0におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも1.4倍以上高いタンパク質であってもよい。

0021

ここで、1又は複数個とは、例えば1〜20個であってもよく、例えば1〜15個であってもよく、例えば1〜10個であってもよく、例えば1〜8個であってもよく、例えば1〜5個であってもよく、例えば1〜3個であってもよい。

0022

実施例において後述するように、本実施形態のβ−ラクタマーゼ変異体は、pH5.5〜6.5のいずれかにおけるβ−ラクタマーゼ活性がpH7.0におけるβ−ラクタマーゼ活性よりも1.4倍以上高いタンパク質である限り、上述したアミノ酸変異に加えて、更なるアミノ酸置換を含んでいてもよい。

0023

具体的には、本実施形態のβ−ラクタマーゼ変異体は、上述したアミノ酸変異に加えて、配列番号1に記載のアミノ酸配列において、第77番目のアラニンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第86番目のグルタミンに相当するアミノ酸のリジンへの置換、第47番目のロイシンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第149番目のフェニルアラニンに相当するアミノ酸のチロシンへの置換、第151番目のヒスチジンに相当するアミノ酸のチロシンへの置換、第225番目のアラニンに相当するアミノ酸のバリンへの置換、第265番目のグルタミンに相当するアミノ酸のヒスチジンへの置換、第274番目のグルタミンに相当するアミノ酸のグルタミン酸への置換からなる群より選択される1又は複数個のアミノ酸置換を更に含んでいてもよい。

0024

[癌治療用キット]
1実施形態において、本発明は、上述したβ−ラクタマーゼ変異体と、β−ラクタム環が結合した抗癌剤とを含む、癌治療用キットを提供する。

0025

本実施形態の癌治療用キットは、β−ラクタム環が結合した無毒性のプロドラッグを毒性のある抗癌剤に変換し、癌細胞の成長を特異的に阻害するプロドラッグ療法に好適である。本実施形態の癌治療用キットによれば、pHが中性である血液中や正常組織中では、β−ラクタマーゼの作用を抑制することができるため、β−ラクタマーゼを利用したプロドラッグ療法の安全性を高めることができる。

0026

本実施形態の癌治療用キットにおいて、β−ラクタマーゼ変異体は癌抗原特異的結合物質に結合されていてもよい。ここで、特異的結合物質としては、抗体、抗体断片アプタマー等が挙げられる。抗体断片としては、Fv、Fab、scFv等が挙げられる。アプタマーとしては、核酸アプタマーペプチドアプタマー等が挙げられる。

0027

β−ラクタマーゼ変異体に癌抗原特異的結合物質が結合することにより、β−ラクタマーゼ変異体を癌細胞特異的送達することが可能となる。また、β−ラクタマーゼ変異体に癌抗原特異的結合物質が結合することにより、生体投与した場合の抗原性を低減することができる。

0028

β−ラクタマーゼ変異体には、生体適合性ポリマーが結合していてもよい。生体適合性ポリマーが結合することにより、生体に投与した場合の抗原性を低減することができ、また、体内動態を調節することができる。生体適合性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール等のポリエーテルポリアミノ酸多糖類等が挙げられる。

0029

β−ラクタム環が結合した抗癌剤としては、β−ラクタム環が結合することにより無毒性化されたプロドラッグが挙げられる。このようなプロドラッグにβ−ラクタマーゼを作用させてβ−ラクタム環を開裂させることにより、毒性のある抗癌剤に変換することができる。

0030

β−ラクタム環が結合した具体的な抗癌剤としては、例えば、下記化学式(1)に示す、ビンブラスチン誘導体であるDAVLBHYDとセファロスポリンとの結合体(LY266070(CAS番号:137848−36−3)、例えば、上記非特許文献1を参照)、下記化学式(2)に示す、ドキソルビシンとセファロスポリンとの結合体(LY300663、例えば、D. L. Meyer et al., Site-specific Prodrug Activation by Antibody-β-Lactamase Conjugates: Preclinical Investigation of the Efficacy and Toxicity of Doxorubicin Delivered by Antibody Directed Catalysis, Bioconjugate Chemistry 6, 440-446, 1995. を参照。)、下記化学式(3)〜(7)に示す、ナイトロジェンマスタードとセファロスポリンとの結合体(例えば、R. P. Alexander et al.,CEPHALOSPORINNITROGEN MUSTARD CARBAMATE PRODRUGS FOR "ADEPT", Tetrahedron Letters 32, 3269-3272, 1991. を参照。)、下記化学式(8)に示す、メルファランとセファロスポリンとの結合体(例えば、D. E. Kerr et al., Development and Activities of a New Melphalan Prodrug Designed for Tumor-Selective Activation, Bioconjugate Chemistry 9, 255-259, 1998. を参照。)、下記化学式(9)に示す、タキソールとセファロスポリンとの結合体(例えば、M. L. Rodrigues et al., Synthesis and beta-lactamase-mediated activation of a cephalosporin-taxol prodrug, Chemistry & Biology 2, 223-227, 1995. を参照。)、下記化学式(10)に示す、マイトマイシンCとセファロスポリンとの結合体(例えば、V. M. Vrudhula et al., Immunologically Specific Activation of a Cephalosporin Derivative of Mitomycin C by Monoclonal Actibody beta-Lactamase Conjugates, Journal of Medicinal Chemistry 40, 2788-2792, 1997. を参照。)等が挙げられる。

0031

0032

0033

0034

0035

0036

0037

0038

0039

0040

0041

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

0042

[材料及び方法]
(TEM−1変異体の作製及びプラスミド
β−ラクタマーゼ遺伝子として、大腸菌由来のTEM−1遺伝子(NCBIアクセッション番号:NC_005327)を使用した。TEM−1タンパク質のアミノ酸配列を配列番号1に示し、TEM−1遺伝子の塩基配列を配列番号2に示す。TEM−1遺伝子へのランダム変異の導入は、市販のキット(名称「GeneMorph II Random Mutagenesis kit」、アジレンテクノロジーズ)を用いて行った。変異を導入したTEM−1遺伝子を、大腸菌(名称「MegaX DH10B T1」、サーモフィッシャーサイエンティフィック社)に導入して変異体ライブラリを作製した。部位特異的変異導入は、市販のキット(名称「PrimeSTAR Mutagenesis kit」、タカラバイオ社)を用いて行った。

0043

TEM−1遺伝子は、pET26b(+)ベクター(ノバジェン社)を改変して得られた、カナマイシン耐性遺伝子の代わりにクロラムフェニコール耐性遺伝子を有する発現ベクターを用いて、T7プロモーターの制御下で発現させた。この発現ベクターを、β−ラクタマーゼ変異体のスクリーニング及びβ−ラクタマーゼ変異体の調製に使用した。発現したTEM−1タンパク質は、23アミノ酸からなるシグナルペプチドを有しており、C末端に7アミノ酸からなるリンカー(GSSSSS、配列番号3)、TEVプロテアーゼ認識配列、6×ヒスチジンタグをこの順に有していた。

0044

(TEM−1遺伝子変異体ライブラリのスクリーニング)
TEM−1遺伝子変異体ライブラリを、pCDF−IYN3プラスミドを有する大腸菌B−95.ΔA株に導入した。pCDF−IYN3プラスミドはカナマイシン耐性遺伝子を発現可能に保持する。

0045

pH5.8の増殖培地は、LBブロス終濃度0.1mMのイソプロピル−β−D−1−チオガラクトピラノシドIPTG)、終濃度1mMの3−ニトロ−L−チロシン(渡辺化学工業)、終濃度100μg/mLのカルベニシリン、終濃度30μg/mLのカナマイシンを含んでおり、終濃度100mMのMESによりpH5.8に調製した。pH7.0の増殖培地は、MESを添加しなかった点以外はpH5.8の培地と同様にして調製した。3−ニトロ−L−チロシンは、上記の条件では、TEM−1変異体のUAコドンに取り込まれる。しかしながら、結局、インフレームにUAGコドンを有する変異体は取得されなかった。

0046

(インビボアッセイ)
第158番目のアミノ酸に近接した位置にアミノ酸変異を有するTEM−1タンパク質変異体のインビボにおける活性は、当該変異体の遺伝子を、pCDF−IYN3プラスミドを有しない大腸菌B−95.ΔA株に導入して試験した。

0047

インビボにおける活性の検討に用いたLBプレートは、カナマイシン及び3−ニトロ−L−チロシンを含まない点以外は、TEM−1遺伝子変異体ライブラリのスクリーニングに用いたものと同様にして調製した。

0048

野生型のTEM−1タンパク質、TEM−1(T158I)変異体タンパク質及びTEM(L160E)変異体タンパク質のインビボにおける活性の比較は、これらをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した大腸菌DH5α株を、後述する終濃度のカルベニシリンを含み、pHの異なるLBプレート上で培養することにより行った。大腸菌の培養は37℃で行った。

0049

(TEM−1変異体タンパク質の精製)
pETベクターからTEM−1タンパク質を発現する大腸菌B−95.ΔAを、100mLの2×YT培地で25℃で24時間培養した。続いて、大腸菌を、終濃度20mMのイミダゾールを含むリン酸緩衝液PBS、タカラバイオ社)中で破砕し、得られた上清カラム(名称「Ni Sepharose 6 Fast Flow」、GEヘルスケア社)に供し、終濃度250mMのイミダゾールを含むPBSで溶出した。

0050

続いて、TEM−1タンパク質をPBSに対して一晩透析し、この間にTEVプロテアーゼで分解した。その後、再度カラム(名称「Ni Sepharose 6 Fast Flow」、GEヘルスケア社)に供し、フロースルー画分を回収した。

0051

続いて、TEM−1タンパク質を更に精製するために、AKTAクロマトグラフィーシステム(GEヘルスケア社)を用いて、カラム(名称「HiLoad 16/60 superdex75」、GEヘルスケア社)を用いたクロマトグラフィーを行った。溶離液にはPBSを使用した。精製した試料は50%(v/v)グリセロールを含むPBS中で−25℃で保存した。

0052

(インビトロアッセイ)
TEM−1タンパク質のインビトロにおける活性は、市販のキット(名称「Beta Lactamase activity assay kit」、アブカム社)及びニトロセフィンを用いて解析した。反応液として、終濃度50mMのリン酸バッファーを用い、pHを5.8又は7.0に調整した。

0053

TEM−1タンパク質は、1%(w/v)ウシ血清アルブミンBSA)を含む50mMリン酸バッファーで希釈した。この結果、各反応液中のBSAの濃度は0.02%となった。波長490nmにおける吸光度スペクトルメーター(名称「SpectraMax i3x」、モレキュラーデバイス社)を用いて測定した。

0054

反応のタイムコースを取得する場合には、終濃度40μMのニトロセフィンの存在下で、TEM−1タンパク質を終濃度600pM含む反応液を使用した。反応速度論的パラメータを測定する場合には、野生型のTEM−1タンパク質を150pM含む反応液、又はTEM−1タンパク質変異体を600pM含む反応液を使用した。基質であるニトロセフィンの濃度は10〜40μMで変化させた。ニトロセフィンはジメチルスルホキシドDMSO)で希釈した。反応液中のDMSOの濃度は2%であった。すべての反応は37℃で行った。

0055

[実験例1]
(TEM−1遺伝子変異体ライブラリのスクリーニング)
大腸菌由来のβ−ラクタマーゼであるTEM−1タンパク質は、23アミノ酸からなるシグナルペプチドを含めて286アミノ酸からなる。発明者らは、TEM−1遺伝子のランダムな位置に変異を導入したTEM−1遺伝子変異体ライブラリを作製した。変異の導入率は1遺伝子あたり1塩基置換程度であった。

0056

作製したTEM−1遺伝子変異体ライブラリで大腸菌を形質転換し、非選択性増殖培地プレートで106〜107個の独立したコロニーを得た。続いて、これらの大腸菌を、pH5.8に調製した、カルベニシリン含有培地プレート上に播種した結果、1,056個のコロニーが得られた。続いて、これらのコロニーをpH7.0の同様の培地プレートに播種した結果、32クローンがpH7.0の培地プレート上では生育できないことが明らかとなった。

0057

pH7.0の培地プレート上で生育できなかった32クローンのうち、8クローンにおけるTEM−1タンパク質のそれぞれが1アミノ酸置換を有していた。そして、T158I変異のみが1クローン以上(4クローン)に見出された。

0058

図1(a)及び(b)は、TEM−1タンパク質を発現する大腸菌を、10、25、50、100μg/mLのカルベニシリンを含む、pH5.8及びpH7.0の培地プレートにそれぞれ播種した代表的な結果を示す写真である。大腸菌は、それぞれ独立した3クローンを10倍ずつ希釈して写真の右側から左側に向かって播種した。図1(a)は、TEM−1(T158I)変異体タンパク質を発現する大腸菌の結果であり、図1(b)は、野生型のTEM−1タンパク質を発現する大腸菌の結果である。図1(a)及び(b)中、「Cb」はカルベニシリンを示す。

0059

図1(a)に示すように、TEM−1(T158I)変異体タンパク質を発現する大腸菌は、pH5.8では生育できるが、pH7.0では生育できなかった。これに対し、図1(b)に示すように、野生型のTEM−1タンパク質を発現する大腸菌は、pH5.8でもpH7.0でも同程度のカルベニシリン耐性を示すことが明らかとなった。また、TEM−1(T158I)変異体タンパク質のインビボにおける活性は、野生型のTEM−1タンパク質の活性よりも低いことが明らかとなった。

0060

[実験例2]
(インビトロアッセイ)
続いて、野生型のTEM−1タンパク質及びTEM−1(T158I)変異体タンパク質をそれぞれ精製し、それらの活性をインビトロで解析した。具体的には、各TEM−1タンパク質のβ−ラクタム環を分解する活性を、ニトロセフィンを基質に用いて検討した。なお、ニトロセフィンは、発色性のセファロスポリンである。

0061

図2(a)及び(b)は、pH5.8及びpH7.0において、各TEM−1タンパク質でニトロセフィンを分解し、波長490nmにおける吸光継時的に測定した結果を示すグラフである。図2(a)は、野生型のTEM−1タンパク質の結果であり、図1(b)は、TEM−1(T158I)変異体タンパク質の結果である。

0062

その結果、野生型のTEM−1タンパク質は、pH5.8及びpH7.0の双方において、同様の反応速度を示した。一方、TEM−1(T158I)変異体タンパク質は、pH7.0では、pH5.8よりも顕著に低い反応速度を示した。

0063

また、TEM−1(T158I)変異体タンパク質の初期反応速度は、野生型のTEM−1タンパク質の初期反応速度よりも顕著に低いことが明らかとなった。これらの結果は、実験例1において上述したインビボにおける結果と基本的に一致した。

0064

[実験例3]
(TEM−1変異体タンパク質の作製1)
TEM−1タンパク質の第158番目のアミノ酸を様々なアミノ酸で置換した18種類の変異体タンパク質を作製し、実験例2と同様のインビトロアッセイをそれぞれ行った。

0065

図3(a)〜(f)、図4(a)〜(f)、図5(a)〜(f)は、pH5.8及びpH7.0において、各TEM−1変異体タンパク質でニトロセフィンを分解し、波長490nmにおける吸光を経時的に測定した結果を示すグラフである。

0066

その結果、TEM−1タンパク質の第158番目のアミノ酸が、グリシン(G)、アラニン(A)、バリン(V)、セリン(S)、メチオニン(M)及びフェニルアラニン(F)である変異体タンパク質は、pH5.8及びpH7.0において、ほとんど同程度の活性を有することが明らかとなった。一方、TEM−1タンパク質の第158番目のアミノ酸が、アスパラギン酸(D)、アスパラギン(N)及びグルタミン(Q)である変異体タンパク質は、pH5.8において、pH7.0よりも高い活性を示すことが明らかとなった。また、その他の変異体タンパク質では、pHによらずβ−ラクタマーゼ活性の障害が認められた。

0067

以上の結果から、TEM−1(T158I)変異体タンパク質以外にも、pH7.0で活性の低下を示すTEM−1変異体タンパク質が存在することが明らかとなった。

0068

[実験例4]
(TEM−1変異体タンパク質の作製2)
発明者らは、TEM−1タンパク質のβ−ラクタマーゼ活性に影響を与える可能性があるアミノ酸残基として、TEM−1タンパク質の立体構造に基づいて、第66番目のメチオニン、第69番目のスレオニン、第70番目のフェニルアラニン、第73番目のロイシン、第146番目のロイシン、第150番目のロイシン、第159番目のアルギニン、第160番目のロイシン、第184番目のメチオニンを選択し、これらをそれぞれ別のアミノ酸に置換した171種類の変異体タンパク質をそれぞれ作製した。

0069

続いて、作製した各変異体タンパク質を発現する大腸菌を、pH5.8及びpH7.0の培地プレートにそれぞれ播種するインビボアッセイを行い、カルベニシリンに対する耐性を検討した。

0070

下記表1にインビボアッセイの結果を示す。表1中、「NA」はその位置の本来のアミノ酸であることを示し、「◎」はpH5.8で活性が高くpH7.0で活性が低かったことを示し、「○」は野生型TEM−1タンパク質と同様の活性であったことを示し、「×」はβ−ラクタマーゼ活性が消失したことを示す。

0071

0072

その結果、TEM−1タンパク質の第160番目のロイシン以外の位置におけるアミノ酸置換のほとんどは、TEM−1タンパク質のβ−ラクタマーゼ活性を失わせることが明らかとなった。

0073

しかしながら、第160番目のロイシンにおいては、19個のあり得るアミノ酸置換のうちの9個でpH5.8におけるカルベニシリンに対する耐性が維持された。

0074

続いて、pH5.8でβ−ラクタマーゼ活性を示したTEM−1変異体タンパク質について、実験例2と同様のインビトロアッセイにより、詳細な検討を行った。その結果、TEM−1(L160E)変異体タンパク質が、pH5.8でpH7.0よりも高いβ−ラクタマーゼ活性を示すことが明らかとなった。

0075

図6は、pH5.8及びpH7.0において、TEM−1(L160E)変異体タンパク質でニトロセフィンを分解し、波長490nmにおける吸光を継時的に測定した結果を示すグラフである。

0076

また、図7は、TEM−1(L160E)変異体タンパク質を発現する大腸菌を、10、25、50、100μg/mLのカルベニシリンを含む、pH5.8及びpH7.0の培地プレートにそれぞれ播種した代表的な結果を示す写真である。大腸菌は、それぞれ独立した3クローンを10倍ずつ希釈して写真の右側から左側に向かって播種した。図7中、「Cb」はカルベニシリンを示す。

0077

その結果、インビトロアッセイの結果と一致して、TEM−1(L160E)変異体タンパク質を発現する大腸菌は、pH5.8の培地プレートでは生育し、pH7.0の培地プレートでは生育しないことが明らかとなった。また、実験例1、図1(a)及び(b)との比較から、TEM−1(L160E)変異体タンパク質のインビボにおける活性は、野生型のTEM−1タンパク質の活性と同等であり、TEM−1(T158I)変異体タンパク質よりも顕著に高いことが明らかとなった。

0078

[実験例5]
(TEM−1変異体タンパク質の反応速度論的解析)
ニトロセフィンを基質として、異なるpHにおいて、野生型のTEM−1タンパク質、TEM−1(T158I)変異体タンパク質、TEM−1(L160E)変異体タンパク質の反応速度論的パラメータをそれぞれ測定した。下記表2〜4に、各TEM−1タンパク質の反応速度論的パラメータの測定結果を示す。

0079

0080

0081

0082

その結果、野生型TEM−1タンパク質のkcat及びKmはpHにより大きく変化したが、kcat/Kmで表される反応効率は、pH7.0からpH5.8の間でほとんど変化しないことが明らかとなった。

0083

また、TEM−1(T158I)変異体タンパク質及びTEM−1(L160E)変異体タンパク質についても、kcat及びKmがpHにより大きく変化する傾向が認められた。しかしながら、TEM−1(T158I)変異体タンパク質及びTEM−1(L160E)変異体タンパク質のkcat/Kmは、pH7.0からpH5.8に向かって増加していく傾向が認められた。

0084

TEM−1(T158I)変異体タンパク質のpH6.2におけるkcat/Kmは、pH7.0におけるkcat/Kmの1.4倍以上であった。また、TEM−1(L160E)変異体タンパク質のpH5.8におけるkcat/Kmは、pH7.0におけるkcat/Kmの3倍以上であった。

0085

上述したように、インビボでは、TEM−1(L160E)変異体タンパク質の活性はTEM−1(T158I)変異体タンパク質の活性よりも高かった。しかしながら、インビトロで測定した、TEM−1(T158I)変異体タンパク質及びTEM−1(L160E)変異体タンパク質の反応速度論的パラメータはあまり変わらなかった。この結果は、これらの変異体タンパク質の細胞における安定性又は細胞外における安定性の違いによるものと考えられた。

0086

[実験例6]
(TEM−1変異体タンパク質の作製3)
TEM−1(T158I)変異体タンパク質に、他の変異を更に加えたTEM−1変異体タンパク質を作製した。続いて、作製したTEM−1変異体タンパク質について、実験例2と同様のインビトロアッセイにより、詳細な検討を行った。

0087

図8(a)〜(i)は、pH5.8及びpH7.0において、各TEM−1変異体タンパク質でニトロセフィンを分解し、波長490nmにおける吸光を継時的に測定した代表的な結果を示すグラフである。

0088

図8(a)はTEM−1(T158I,A77V)変異体タンパク質の結果を示し、図8(b)はTEM−1(T158I,Q86K)変異体タンパク質の結果を示し、図8(c)はTEM−1(T158I,H151Y)変異体タンパク質の結果を示し、図8(d)はTEM−1(T158I,F149Y)変異体タンパク質の結果を示し、図8(e)はTEM−1(T158I,A225V)変異体タンパク質の結果を示し、図8(f)はTEM−1(T158I,Q265H)変異体タンパク質の結果を示し、図8(g)はTEM−1(T158I,Q274E)変異体タンパク質の結果を示し、図8(h)はTEM−1(T158I,L47V,Q274E)変異体タンパク質の結果を示し、図8(i)はTEM−1(T158I,Q265H,Q274E)変異体タンパク質の結果を示す。

実施例

0089

その結果、これらのTEM−1変異体タンパク質は、pH5.8でpH7.0よりも高いβ−ラクタマーゼ活性を示すことが明らかとなった。

0090

本発明によれば、酸性環境下で活性が高く、中性付近で活性が低いβ−ラクタマーゼを提供することができる。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ