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技術 水疱性表皮剥離症緩和または改善用間葉系幹細胞−ハイドロゲル−生分解性または間葉系幹細胞−ハイドロゲル−非分解性支持体組成物

出願人 アンテロジェンシーオー.,エルティーディー.
発明者 イ、ソンクキム、ミヒョン
出願日 2019年11月5日 (1年1ヶ月経過) 出願番号 2019-201015
公開日 2020年3月5日 (9ヶ月経過) 公開番号 2020-033377
状態 未査定
技術分野 化合物または医薬の治療活性 医薬品製剤 動物,微生物物質含有医薬 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬
主要キーワード ソフトシリコン 結果グラフ 一実施様態 ハイドロゲルシート 組合体 フォームタイプ 支持体組成物 物理的力
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図面 (18)

課題

水泡性表皮剥離症に使われていた従来のドレッシング剤に比べて、皮膚再生および再上皮化能力が顕著に優れて有利な効果を表すシート、およびその製造方法を提供する。

解決手段

間葉系幹細胞ハイドロゲル生分解性または、非分解性支持体を含有するシートは、蛋白質分解酵素を利用した単離過程なく、高活性幹細胞がそのまま水泡性表皮剥離症患者患部に適用され、培養段階において、間葉系幹細胞から分泌されるコラーゲンラミニン、ピブロクティン、エラスチンのような細胞外気質が完全にハイドロゲルに貼布されて存在することで、皮膚再生および再上皮化能力が顕著に優れて有利な効果を表す。

概要

背景

水疱性表皮剥離症(epidermolysis bullosa)とは、表皮と表皮-真皮境界部及び上部乳頭真皮を構成するタンパク質を作る遺伝子の変異によって、軽い外傷にも易しく水疱が発生されて肌と粘膜に痛症が生じる稀な遺伝性疾患である。水疱性表皮剥離症患者の場合二つの層を取ってくれる結合タンパク質がなくて層に小さな摩擦が生じれば水疱を形成して3度火傷が起きた時に相応する痛症を経験すると言う。単純水疱性表皮剥離症(epidermolysis bullosa simplex、EBS)、接合部型水疱性表皮剥離症(junctional epidermolysis bullosa、JEB)、異栄養性水疱性表皮剥離症(dystrophic epidermolysis bullosa、DEB)などがあり、大部分の患者が単純水疱性表皮剥離症であるものとして知られている。肌に生成されるケラチン突然変異病気を誘発する主な原因と知られているし、単純性水疱性表皮剥離症(Epidermolysis Bullosa simplex:EB simplex)は、常染色体優性型遺伝、接合部型水疱性表皮剥離症(Junctional Epidermolysis Bullosa:JEB)は、常染色体劣性型遺伝、異栄養性水疱性表皮剥離症(Dystrophic Epidermolysis Bullosa:DEB)は、優性型と劣性型の二つの形態があるものとして知られている。

現在まで肌で生産されるケラチン混合物を変形させる方法、骨髄移植などの方法が研究されてはいるがまだ疾患の完治方法はなくて、症状や合剥症の緩和のための対症療法が主な治療方法である。そのうち、既にできた水疱が感染されることを阻むことが一番重要であり、少しの圧力や摩擦によっても水疱がよく生じるため触らないように気を付けなければならないし、水疱が生じた場合は痛症を軽減させて、不便感を最小化しながら、過度体液損失を予防して感染を予防することが重要なものとして知られているし、ドレッシングするうちに痛症軽減のために痛み止めを使ったりする。

水疱性表皮剥離症患者の場合水疱感染の防止などのためにドレッシングをすることが勧奨されている。例えば、EB simplexの場合ソフトシリコン(soft silicone)タイプのドレッシング材、リビド-コロイド(lipido-colloid)タイプのドレッシング材、フォーム(foam)タイプのドレッシング材、ハイドロゲルタイプのドレッシング材、シートハイドロゲルタイプのドレッシング材、生合成セルロースタイプのドレッシング材、境界型(bordered)タイプのドレッシング材、パウダータイプのドレッシング材が、EBSDowling Mearaである場合リビド-コロイドタイプのドレッシング材、ポリマー型メンブレンタイプのドレッシング材、ハイドロファイバータイプのドレッシング材が、接合部型EBである場合ハイドロゲル含浸ガーゼタイプのドレッシング材、ハイドロファイバータイプのドレッシング材、リビド-コロイドタイプのドレッシング材、ソフトシリコンタイプのドレッシング材、ポリマー型メンブレンタイプのドレッシング材、ソフトシリコンフォームタイプのドレッシング材、スーパー-吸着剤を有するソフトシリコンフォームタイブのドレッシング材が、異栄養性EBである場合ソフトシリコンタイプのドレッシング材、リビド-コロイドタイプのドレッシング材、ソフトシリコンを有するフォームタイプのドレッシング材、スーパー-吸着剤を有するソフトシリコンフォームタイプのドレッシング材、フォームタイプのドレッシング材、ポリマー型メンブレンタイプのドレッシング材、スーパー-吸着型ドレッシング材、境界型ドレッシング材が推薦されている(Denyer J、Pillay E. Best practice guidelines for skin and wound care in epidermolysis bullosa. International Consensus. DEBRA、 2012.参照)。

傷治療用ドレッシングと関連しては、親水性基を導入して生体適合性増進させて傷部位での分泌物の吸収を促進するポリウレタンフォーム形態の傷治療用ドレッシング材に対する特許(大韓民国登録特許第345,034号)、薬物層を含むポリウレタンフォームドレッシング材に対する特許(大韓民国登録特許第1,022,884号)などが存在する。

しかし、従来使われているドレッシング材の場合、水疱性表皮剥離症患者の患部に適用した時に刺激性がより緩和されることができるという点、または水疱部位からの湧出物の吸収を容易にできるという長所がある製品はあるが、水疱性表皮剥離症患者の患部に適用した時に刺激性がないながらも肌再生効果を共に示すドレッシング材に対する技術は知られたことがない。

一方、コラーゲンタイプVII(collagen type VII)または、コラーゲンアルファ-1 chainは、COL7A1遺伝子によってコーディングされるタンパク質として、この遺伝子に突然変異がある場合異栄養性水疱性表皮剥離症と関連していると知られていて、変異がないと言ってもコラーゲンタイプVIIに対する自己免疫反応後天性水疱性表皮剥離症と呼ばれる疾患を起こすことがあると報告された。また、コラーゲンタイプVIIはラミニン-5及びフィブロネクチン相互作用するものとして知られている。また、校正されたラミニン-5遺伝子を盛っている幹細胞を、植皮を通じて接合部型水疱性表皮剥離症患者の大腿部患部に移植して、水疱が生じない臨床的効果を達成した研究例がイタリアで発表された。したがって、水疱性表皮剥離症の緩和乃至改善のためにはコラーゲンタイプVII及びラミニン-5が非常に重要な役割をするという点が分かる。

本発明は、培養した間葉系幹細胞をハイドロゲルに懸濁して生分解性または非分解性支持体に付着した後に培養する高活性の生きている間葉系幹細胞を含む、水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物及びシート、そして、これの製造方法を提供することを目的として、特に、コラーゲンタイプVII及びラミニン-5の発現を増加させ、水疱性表皮剥離症患部に適用した時に臨床的に有意味な効果を発現することができる組成物、シート及びこれの製造方法を提供することを目的とする。

概要

水泡性表皮剥離症に使われていた従来のドレッシング剤に比べて、皮膚再生および再上皮化能力が顕著に優れて有利な効果を表すシート、およびその製造方法を提供する。間葉系幹細胞−ハイドロゲル生分解性または、非分解性支持体を含有するシートは、蛋白質分解酵素を利用した単離過程なく、高活性の幹細胞がそのまま水泡性表皮剥離症患者の患部に適用され、培養段階において、間葉系幹細胞から分泌されるコラーゲン、ラミニン、ピブロクティン、エラスチンのような細胞外気質が完全にハイドロゲルに貼布されて存在することで、皮膚再生および再上皮化能力が顕著に優れて有利な効果を表す。

目的

本発明は、培養した間葉系幹細胞をハイドロゲルに懸濁して生分解性または非分解性支持体に付着した後に培養する高活性の生きている間葉系幹細胞を含む、水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物及びシート、そして、これの製造方法を提供する

効果

実績

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請求項1

(a)間葉系幹細胞を、ハイドロゲルを利用して、(i)生分解性支持体及び非分解性支持体でなされたグループから選択される1種以上の支持体;または、(ii)2種以上の非分解性支持体;または、(iii)1種以上の生分解性支持体及び1種以上の非分解性支持体の組合体に付着させ、間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体を取得する段階;及び(b)段階(a)で修得された間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体を増殖培地で培養する段階を含んで、ここで増殖培地はFBS(fetal bovine serum)、及びbFGF(basicfibroblast growth factor)、EGF(epidermal growth factor)、TGF-beta1(transforming growth factor beta-1)、PDGF(platelet-derived growth factor)、VEGF(Vascular endothelial growth factor)、HGF(hepatocyte growth factor)及びIFG-1(insulin-like growth factor)でなされたグループから選択される1種以上の因子を含む培地であり、ハイドロゲルはフィブリン糊ヒアルロン酸ゼラチンコラーゲンアルギン酸セルロース及びペクチンでなされたグループから選択される何れか一つ以上であり、生分解性支持体はPGA(poly-gamma-glutamic acid)、PLA(poly lactic acid)、バイクリルメッシュ、人の羊膜の羊膜、豚コラーゲンキチンキトサンフィブロネクチン及びデキストランでなされたグループから選択されて、非分解性支持体は滅菌された不織布繊維、PET(polyethylene terephthalate)フィルム、PE(polyethylene)フィルム、PP(polypropylene)フィルム、ポリウレタンフィルムネット型ポリウレタンフィルム及び断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)でなされたグループから選択される、水疱性表皮剥離緩和または改善用シートの製造方法。

請求項2

シートはコラーゲンタイプVIIまたはラミニン-5を含むことを特徴とする、請求項1に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。

請求項3

フィブリン糊は0.5乃至45mg/mL濃度フィブリノーゲンを含むことを特徴とする、水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。

請求項4

フィブリン糊は0.5乃至10mg/mL濃度のフィブリノーゲンを含むことを特徴とする、請求項1に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。

請求項5

前記段階(b)で、物理的刺激低酸素刺激マイトジェン刺激及び炎症因子刺激でなされたグループから選択される一つ以上の刺激を追加的に遂行して細胞活性化させる段階(c)を追加で含むことを特徴とする、請求項1に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。

請求項6

前記段階(b)で、間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体を1乃至20w/v%DMSO及び1乃至80w/v%人間血清アルブミンを含む凍結保管剤に入れて冷凍保管する段階(d)を追加で含んで、ここで冷凍保管後解凍した時に間葉系幹細胞の生存率が90%以上である、請求項1に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。

請求項7

12ヶ月以上冷凍保管後解凍した時に間葉系幹細胞の生存率が90%以上である、請求項1に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。

請求項8

段階(a)で、ハイドロゲル支持体1cm2当たり1,000乃至10,000個の間葉系幹細胞を塗布する、請求項1に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。

請求項9

段階(b)で、ハイドロゲル支持体1cm2当たり20,000乃至400,000個の間葉系幹細胞になるように増殖させる、請求項1に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。

請求項10

前記水疱性表皮剥離症は、水疱性表皮剥離症、水疱性細胞分離、水疱性棘細胞症、後天性水疱性表皮剥離症、遺伝性水疱性表皮剥離症、致死性水疱性表皮剥離症、遅延性遺伝性表皮剥離症、増殖性水疱性表皮剥離症、角質溶解症、局限性水疱性表皮剥離症、非傷跡性水疱性表皮剥離症、多発形成異常性水疱性表皮剥離症、傷跡性表皮剥離症、単純表皮溶解症、ウェーバーコケイン病、ダウリング・メアラシンドローム(Dowling-Meara Syndrome)、ゴ−ルドスェイド疾患(Goldscheider's disease)、アロポー-ジーメンス疾患(Hallopeau-Siemens disease)、ハイリックスバウアーシンドローム(Heinrichsbauer syndrome)、ヘルリッツシンドローム(Herlitz syndrome)及びケブネル疾患(Kobner's disease)でなされたグループから選択されることを特徴とする、請求項1に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。

請求項11

間葉系幹細胞は脂肪骨髄、肌、血管、筋肉、脳、血液、胎盤歯髄及び臍帯血でなされたグループから選択される何れか一つから分離されるものである、請求項1乃至請求項10のうちで何れか一つに記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法。

請求項12

間葉系幹細胞及びハイドロゲルを含んで;生分解性支持体及び非分解性支持体でなされたグループから選択される1種以上の支持体;2種以上の非分解性支持体;または1種以上の生分解性支持体及び非分解性支持体の組合体を含むが、ここで、ハイドロゲルはフィブリン糊、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロース及びペクチンでなされたグループから選択されて、生分解性支持体はPGA(poly-gamma-glutamic acid)、PLA(poly lactic acid)、バイクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜、豚コラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランでなされたグループから選択されて、非分解性支持体は滅菌された不織布繊維、PET(polyethylene terephthalate)フィルム、PE(polyethylene)フィルム、PP(polypropylene)フィルム、ポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム及び断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)でなされたグループから選択される、水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物

請求項13

組成物はコラーゲンタイプVIIまたはラミニン-5を含むことを特徴とする、請求項12に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物。

請求項14

フィブリン糊は0.5乃至45mg/mL濃度のフィブリノーゲンを含むことを特徴とする、請求項12に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物。

請求項15

フィブリン糊は0.5乃至10mg/mL濃度のフィブリノーゲンを含むことを特徴とする、請求項12に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物。

請求項16

ハイドロゲル支持体1cm2当たり20,000乃至400,000個の間葉系幹細胞を含む、請求項12に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物。

請求項17

前記水疱性表皮剥離症は、水疱性表皮剥離症、水疱性棘細胞分離、水疱性棘細胞症、後天性水疱性表皮剥離症、遺伝性水疱性表皮剥離症、致死性水疱性表皮剥離症、遅延性遺伝性表皮剥離症、増殖性水疱性表皮剥離症、角質溶解症、局限性水疱性表皮剥離症、非傷跡性水疱性表皮剥離症、多発形成異常性水疱性表皮剥離症、傷跡性表皮剥離症、単純表皮溶解症、ウェーバー・コケイン病、ダウリング・メアラシンドローム(Dowling-Meara Syndrome)、ゴ−ルドスェイド疾患(Goldscheider's disease)、アロポー-ジーメンス疾患(Hallopeau-Siemens disease)、ハインリックスバウアーシンドローム(Heinrichsbauer syndrome)、ヘルリッツシンドローム(Herlitz syndrome)及びケブネル疾患(Kobner's disease)でなされたグループから選択されることを特徴とする、請求項12に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物。

請求項18

12ヶ月以上冷凍保管後解凍した時に間葉系幹細胞の生存率が90%以上である、請求項12に記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物。

請求項19

間葉系幹細胞は脂肪、骨髄、肌、血管、筋肉、脳、血液、胎盤、歯髄及び臍帯血でなされたグループから選択される何れか一つから分離されるものである、請求項12乃至請求項18のうちで何れか一つに記載の水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物。

請求項20

請求項12乃至請求項18のうちで何れか一つによる組成物を有効成分で含む、水疱性表皮剥離症緩和または改善用シート。

技術分野

0001

本発明は、間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体または間葉系幹細胞-ハイドロゲル-非分解性支持体を含む水疱性表皮剥離症(epidermolysis bullosa)緩和または改善用組成物シート(sheet)及びこれの製造方法に関するものとして、特に、本発明の幹細胞を含むシート型組成物は、水疱性表皮剥離症緩和または改善用ドレッシング材で非常に有用である。

背景技術

0002

水疱性表皮剥離症(epidermolysis bullosa)とは、表皮と表皮-真皮境界部及び上部乳頭真皮を構成するタンパク質を作る遺伝子の変異によって、軽い外傷にも易しく水疱が発生されて肌と粘膜に痛症が生じる稀な遺伝性疾患である。水疱性表皮剥離症患者の場合二つの層を取ってくれる結合タンパク質がなくて層に小さな摩擦が生じれば水疱を形成して3度火傷が起きた時に相応する痛症を経験すると言う。単純水疱性表皮剥離症(epidermolysis bullosa simplex、EBS)、接合部型水疱性表皮剥離症(junctional epidermolysis bullosa、JEB)、異栄養性水疱性表皮剥離症(dystrophic epidermolysis bullosa、DEB)などがあり、大部分の患者が単純水疱性表皮剥離症であるものとして知られている。肌に生成されるケラチン突然変異病気を誘発する主な原因と知られているし、単純性水疱性表皮剥離症(Epidermolysis Bullosa simplex:EB simplex)は、常染色体優性型遺伝、接合部型水疱性表皮剥離症(Junctional Epidermolysis Bullosa:JEB)は、常染色体劣性型遺伝、異栄養性水疱性表皮剥離症(Dystrophic Epidermolysis Bullosa:DEB)は、優性型と劣性型の二つの形態があるものとして知られている。

0003

現在まで肌で生産されるケラチン混合物を変形させる方法、骨髄移植などの方法が研究されてはいるがまだ疾患の完治方法はなくて、症状や合剥症の緩和のための対症療法が主な治療方法である。そのうち、既にできた水疱が感染されることを阻むことが一番重要であり、少しの圧力や摩擦によっても水疱がよく生じるため触らないように気を付けなければならないし、水疱が生じた場合は痛症を軽減させて、不便感を最小化しながら、過度体液損失を予防して感染を予防することが重要なものとして知られているし、ドレッシングするうちに痛症軽減のために痛み止めを使ったりする。

0004

水疱性表皮剥離症患者の場合水疱感染の防止などのためにドレッシングをすることが勧奨されている。例えば、EB simplexの場合ソフトシリコン(soft silicone)タイプのドレッシング材、リビド-コロイド(lipido-colloid)タイプのドレッシング材、フォーム(foam)タイプのドレッシング材、ハイドロゲルタイプのドレッシング材、シートハイドロゲルタイプのドレッシング材、生合成セルロースタイプのドレッシング材、境界型(bordered)タイプのドレッシング材、パウダータイプのドレッシング材が、EBSDowling Mearaである場合リビド-コロイドタイプのドレッシング材、ポリマー型メンブレンタイプのドレッシング材、ハイドロファイバータイプのドレッシング材が、接合部型EBである場合ハイドロゲル含浸ガーゼタイプのドレッシング材、ハイドロファイバータイプのドレッシング材、リビド-コロイドタイプのドレッシング材、ソフトシリコンタイプのドレッシング材、ポリマー型メンブレンタイプのドレッシング材、ソフトシリコンフォームタイプのドレッシング材、スーパー-吸着剤を有するソフトシリコンフォームタイブのドレッシング材が、異栄養性EBである場合ソフトシリコンタイプのドレッシング材、リビド-コロイドタイプのドレッシング材、ソフトシリコンを有するフォームタイプのドレッシング材、スーパー-吸着剤を有するソフトシリコンフォームタイプのドレッシング材、フォームタイプのドレッシング材、ポリマー型メンブレンタイプのドレッシング材、スーパー-吸着型ドレッシング材、境界型ドレッシング材が推薦されている(Denyer J、Pillay E. Best practice guidelines for skin and wound care in epidermolysis bullosa. International Consensus. DEBRA、 2012.参照)。

0005

傷治療用ドレッシングと関連しては、親水性基を導入して生体適合性増進させて傷部位での分泌物の吸収を促進するポリウレタンフォーム形態の傷治療用ドレッシング材に対する特許(大韓民国登録特許第345,034号)、薬物層を含むポリウレタンフォームドレッシング材に対する特許(大韓民国登録特許第1,022,884号)などが存在する。

0006

しかし、従来使われているドレッシング材の場合、水疱性表皮剥離症患者の患部に適用した時に刺激性がより緩和されることができるという点、または水疱部位からの湧出物の吸収を容易にできるという長所がある製品はあるが、水疱性表皮剥離症患者の患部に適用した時に刺激性がないながらも肌再生効果を共に示すドレッシング材に対する技術は知られたことがない。

0007

一方、コラーゲンタイプVII(collagen type VII)または、コラーゲンアルファ-1 chainは、COL7A1遺伝子によってコーディングされるタンパク質として、この遺伝子に突然変異がある場合異栄養性水疱性表皮剥離症と関連していると知られていて、変異がないと言ってもコラーゲンタイプVIIに対する自己免疫反応後天性水疱性表皮剥離症と呼ばれる疾患を起こすことがあると報告された。また、コラーゲンタイプVIIはラミニン-5及びフィブロネクチン相互作用するものとして知られている。また、校正されたラミニン-5遺伝子を盛っている幹細胞を、植皮を通じて接合部型水疱性表皮剥離症患者の大腿部患部に移植して、水疱が生じない臨床的効果を達成した研究例がイタリアで発表された。したがって、水疱性表皮剥離症の緩和乃至改善のためにはコラーゲンタイプVII及びラミニン-5が非常に重要な役割をするという点が分かる。

0008

本発明は、培養した間葉系幹細胞をハイドロゲルに懸濁して生分解性または非分解性支持体に付着した後に培養する高活性の生きている間葉系幹細胞を含む、水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物及びシート、そして、これの製造方法を提供することを目的として、特に、コラーゲンタイプVII及びラミニン-5の発現を増加させ、水疱性表皮剥離症患部に適用した時に臨床的に有意味な効果を発現することができる組成物、シート及びこれの製造方法を提供することを目的とする。

発明が解決しようとする課題

0009

本発明は、人間の脂肪骨髄、肌、血管、筋肉、脳、血液、胎盤歯髄及び臍帯血でなされたグループから選択される何れか一つから分離した間葉系幹細胞を水疱性表皮剥離症患部に適用するためのドレッシング材で利用するためのものであり、臨床的に有効な治療効果を得るために高活性の間葉系幹細胞を含む水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物またはシート、及びこれの製造方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0010

前記目的を達成するために、本発明では間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体または非分解性支持体、より具体的に間葉系幹細胞-ハイドロゲル-非分解性支持体を含む水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物、シート及びこれの製造方法を提供する。

0011

本発明による水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物で、間葉系幹細胞は、CD29、CD44、CD73、CD90及びCD105に対して陽性であり、CD34及びCD45に対して陰性である自己または同種来由細胞である。

0012

本発明による一様態で、支持体としては、PGA(poly-gamma-glutamic acid)、PLA(poly lactic acid)、PGA/PLA、バイクリルメッシュ、人の羊膜の羊膜、豚コラーゲンキチンキトサン、フィブロネクチン及びデキストランでなされたグループから選択される生分解性高分子支持体を使用するか、または滅菌された不織布繊維、PET(polyethylene terephthalate)フィルム、PE(polyethylene)フィルム、PP(polypropylene)フィルム及びポリウレタンフィルムネット型ポリウレタンフィルム、または、断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)フィルムのような非分解性支持体、またはこれらの組合体、例えば、PGA/不織布繊維、PLA/不織布繊維、PGA/PLA/不織布繊維を使用することができる。

0013

本発明による一様態で、ハイドロゲルはフィブリン糊ヒアルロン酸、またはこれの誘導体ゼラチンコラーゲンアルギン酸、セルロース及びペクチンでなされたグループから選択されることができるし、この時フィブリン糊を形成するフィブリノーゲンの濃度は、0.5乃至60mg/mLであることがあって、具体的に0.5乃至45mg/mLであることがあって、より具体的に0.5乃至30mg/mLであることがあって、さらに具体的に0.5乃至20mg/mLであることがあって、さらに具体的に0.5乃至10mg/mLであることがある。

0014

本発明による一様態で、水疱性表皮剥離症緩和、または改善用シートを製造するために幹細胞をハイドロゲルと混合して支持体1cm2当たり1,000乃至10,000個で均一に塗布し、FBS及びbFGF、またはEGFを含む培地で培養し、支持体1cm2当たり幹細胞20,000個以上、より具体的に20,000個乃至400,000個になるように増殖させる段階を含む。

発明の効果

0015

本発明による間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体、または非分解性支持体を含む水疱性表皮剥離症緩和、または改善用組成物またはシートは、特に、コラーゲンタイプVII及びラミニン-5の発現を増加させ、水疱性表皮剥離症患部に適用した時に臨床的に有意味な効果を発現することができるという長所を有する。

0016

また、本発明による高活性の間葉系幹細胞を含む組成物、またはシートは、タンパク質分解酵素を利用した単離(選別)過程なしに高活性の幹細胞がそのまま水疱性表皮剥離症患者の患部に適用されることができるし、培養段階で間葉系幹細胞から分泌されるコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチンのような細胞外基質が完全にハイドロゲルに貼布されて存在することで、従来の治療剤に比べて水疱性表皮剥離症患者の患部に適用した時に肌再生及び再上皮化能力が著しく優秀であるという有利な効果を示す。

0017

より具体的に本発明による間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体は、無血清培地でも繊維芽細胞形態を維持したし、1週が経過した後90%以上生存するものとして現われて、従来の幹細胞治療剤に比べて生存期間が著しく増加したし、凍結保管後に解凍した時シートの形態及び強度がそのまま維持されたし、シート内の細胞も95%以上生存したものとして現われて、主有効成分である細胞の損傷なしに-80℃で長期間冷凍保管が可能であり、長期間凍結保管した時1年以上経過した時点でも解凍時に細胞が95%以上生存したものとして現われた。また、細胞成長及び血管形成を促進する多様な成長因子サイトカイン持続的に分泌され、コラーゲンタイプVII及びラミニン-5を含む、多様な種類の細胞外基質を多量分泌するだけでなく、分泌された細胞外基質がハイドロゲル内に泊まっていて患部に適用した時に多様な基質を提供することで、水疱性表皮剥離症治癒を容易にすることができて、免疫反応を誘発しないし、むしろ患部に炎症が発生しても兔疫細胞によって多量分泌されて免疫反応性を増加させる役割をするTNF-alphaの分泌量を著しく減少させて炎症を緩和させることで、水疱性表皮剥離症患者で現われる水疱及び炎症の治癒を助けることができるし、特に、コラーゲンタイプVIIの発現が著しく増加するので、組織再生及び再上皮化を促進させる長所がある。

図面の簡単な説明

0018

aは、フィブリノーゲン原液及び段階別に希釈された溶液で作られたフィブリンゲルと混合して培養した人間脂肪由来の間葉系幹細胞の形態をAO/EtBrで染色して観察した蛍光顕微鏡写真である(400倍率)。フィブリノーゲンの希釈倍数及びトロンビンが含まれた細胞懸濁液と1:1混合されて最終フィブリン糊を形成した時の濃度はカッコして表記した。bは、フィブリノーゲン原液及び段階別に希釈された溶液で作られたフィブリンゲルと混合して培養した人間脂肪由来の間葉系幹細胞にWST-1を添加して測定した吸光度グラフである。
人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シート凍結の前後を比べた写真である。aは、シート内の細胞写真であり、人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体または非分解性支持体シートを、5日培養後シート内細胞をAO/EtBr染色後蛍光顕微鏡で観察した写真である。bは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体または非分解性支持体シートを-80℃で凍結保管した後解凍してシート内の細胞をAO/EtBrで染色して蛍光顕微鏡で観察した写真である。
人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体、または非分解性支持体シートの長期保管安全性を評価するためにシートを-80℃で凍結保管した後1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、12ヶ月に解凍した後シート内細胞の生存率を示したグラフである。
aは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体シート、または非分解性支持体シートから分泌されるVEGFとHGFの量をELISAで定量して示したグラフである。bは人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体シート、または非分解性支持体シートから分泌される血管形成促進因子を、サイトカインアレイキットを利用して分析した結果である。
aは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体シートまたは非分解性支持体シートを同種の末梢血液単核細胞共同培養した後末梢血液単核細胞から分泌されるTNF-αの量をELISAで定量して示したグラフである。bは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体シート、または非分解性支持体シートを同種の活性化された末梢血液単核細胞に添加して共同培養した後末梢血液単核細胞から分泌されるTNF-αの量をELISAで定量した後TNF-αの分泌抑制率(%)に換算して示したグラフである。
aは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞と繊維芽細胞での発現される細胞外基質タンパク質のうちでコラーゲンタイプVII及びラミニンの発現量を、Western blot技法を通じて確認した結果である。bは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞で発現される細胞外基質タンパク質のうちコラーゲンタイプVIIの発現量を、ELISA技法を通じて確認した結果グラフである。cは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞での細胞外基質タンパク質であるコラーゲンタイプVII及びコラーゲンタイプIの発現を免疫蛍光染色した後蛍光顕微鏡で観察した写真である。
aは、本発明によるシートから分泌される細胞外基質タンパク質であるコラーゲンタイプVII、コラーゲンタイプIの量を示したグラフである。bは、本発明によるシート内の含まれた細胞外基質タンパク質であるコラーゲンタイプVII、コラーゲンタイプI、コラーゲンタイプV、ラミニン5、フィブロネクチン、ラミニンなどの発現を免疫蛍光染色後蛍光顕微鏡で観察した写真である。
本発明によるシートと断層培養した人間脂肪由来の間葉系幹細胞から分泌される細胞外基質タンパク質であるコラーゲンタイプVIIの量を比べて示したグラフである。
人間脂肪由来の間葉系幹細胞が傷部位で分泌される炎症性サイトカインであるTGF-β2、TNF-αに露出された時コラーゲンタイプVIIの発現が急激に増加することを見せてくれる結果である。
本発明によるシートを水疱性表皮剥離症患者に付着前と付着後1週間の間隔で総4週間傷面積の大きさの変化を示したグラフである。

実施例

0019

前記目的を達成するために、本発明では間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体を含む水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物、シート及びこれの製造方法を提供する。

0020

以下、本発明に対してより詳しく説明する。
本発明は、(a)間葉系幹細胞を、ハイドロゲルを利用して、(i)生分解性支持体及び非分解性支持体でなされたグループから選択される1種以上の支持体;

0021

または、(ii)2種以上の非分解性支持体;または(iii)1種以上の生分解性支持体及び1種以上の非分解性支持体の組合体に付着させて間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体を修得する段階;及び(b)段階(a)で修得された間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体を増殖培地で培養する段階を含んで、ここで増殖培地はFBS(fetal bovine serum)、及びbFGF(basicfibroblast growth factor)、EGF(epidermal growth factor)、TGF-beta1(transforming growth factor beta-1)、PDGF(platelet-derived growth factor)、VEGF(Vascular endothelial growth factor)、HGF(hepatocyte growth factor)及びIFG-1(insulin-like growth factor)でなされたグループから選択される1種以上の因子を含む培地であり、ハイドロゲルはフィブリン糊、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロース及びペクチンでなされたグループから選択される何れか一つ以上であり、生分解性支持体はPGA(poly-gamma-glutamic acid)、PLA(poly lactic acid)、バイクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜、豚コラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランでなされたグループから選択され、非分解性支持体は滅菌された不織布繊維、PET(polyethylene terephthalate)フィルム、PE(polyethylene)フィルム、PP(polypropylene)フィルム及びポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム及び断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(polyurethane)でなされたグループから選択される、水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法に関するものである。

0022

本発明は、より具体的に(a1)間葉系幹細胞を増殖培地で2継代以上培養する段階;(a2)培養した間葉系幹細胞を、ハイドロゲルを利用して、(i)生分解性支持体及び非分解性支持体でなされたグループから選択される1種以上の支持体;または、(ii)2種以上の非分解性支持体;または(iii)1種以上の生分解性支持体及び1種以上の非分解性支持体の組合体に付着させて間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体を修得する段階;及び(b)段階(a2)で修得された間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体を増殖培地で培養する段階を含んで、ここで増殖培地は、FBS(fetal bovine serum)、及びbFGF(basicfibroblast growth factor)、EGF(epidermal growth factor)、TGF-beta1(transforming growth factor beta-1)、PDGF(platelet-derived growth factor)、VEGF(Vascular endothelial growth factor)、HGF(hepatocyte growth factor)及びIFG-1(insulin-like growth factor)でなされたグループから選択される1種以上の因子を含む培地であり、ハイドロゲルはフィブリン糊、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロース及びペクチンでなされたグループから選択される何れか一つ以上であり、生分解性支持体はPGA(poly-gamma-glutamic acid)、PLA(poly lactic acid)、バイクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜、豚コラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランでなされたグループから選択されて、非分解性支持体は滅菌された不織布繊維、PET(polyethylene terephthalate)フィルム、PE(polyethylene)フィルム、PP(polypropylene)フィルム及びポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム及び断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(polyurethane)でなされたグループから選択される、水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートの製造方法に関するものである。

0023

本発明による一様態で、前記増殖培地に含まれる因子はより具体的にbFGF(Basic Fibroblast Growth Factor)、EGF(Epidermal Growth Factor)、またはこれらの組合であることがある。

0024

本発明による一様態で、間葉系幹細胞はCD29、CD44、CD73、CD90及びCD105に対して陽性であり、CD34及びCD45に対して陰性である自己または同種来由の細胞である。

0025

本発明による一様態で、水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートを製造するために幹細胞をハイドロゲルと混合して支持体1cm2当たり1,000乃至10,000個で均一に塗布し、FBS、bFGF及びEGFでなされたグループから選択される一つ以上が含まれる培地で培養して支持体1cm2当たり幹細胞20,000個以上、より具体的に20,000個乃至400,000個になるように増殖させる段階を含む。

0026

本発明による一様態で、前記段階(c)で、物理的刺激低酸素刺激マイトジェン刺激、及びIFN-gammaのような炎症因子刺激でなされたグループから選択される一つ以上の刺激を追加的に遂行して細胞を活性化させる段階(c)を追加で含むことができる。特に、水疱性表皮剥離症で損傷された組織の場合、血管が破壊されるか、または機能が低下されて酸素供給が円滑ではなくて、慢性炎症が存在することができるため損傷された組織に投与された幹細胞は、低酸素ストレス及び炎症因子によって活性化されて成長因子及びサイトカイン分泌が急激に増加される。したがって、支持体シート製造段階で低酸素ストレス、マイトジェンまたは炎症因子を処理して高濃度の成長因子とサイトカインを分泌する高活性の幹細胞を含む組成物、シートを製造することができる。

0027

本発明による一様態で、ハイドロゲルとしてはフィブリン糊、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロースまたはペクチンを使用することができるが、これに制限されるものではない。ハイドロゲルとしてフィブリン糊を使用する場合、フィブリン糊を形成するフィブリノーゲンの濃度は0.5乃至60mg/mLであることがあって、具体的に0.5乃至45mg/mLであることがあって、より具体的に0.5乃至30mg/mL濃度、さらに具体的に0.5乃至20mg/mLの濃度、さらに具体的に0.5乃至10mg/mL濃度、さらに具体的に0.5乃至5mg/mL濃度のフィブリノーゲンを含むことを特徴として、1乃至50I.U./mL濃度、具体的に1乃至30I.U./mL濃度、さらに具体的に5乃至20I.U./mL濃度のトロンビンを含むことができる。

0028

本発明による一様態で、ハイドロゲル自体だけでも幹細胞-ハイドロゲルシートの製造が可能であるが、ハイドロゲルは強度が低くて機械的/物理的力によって易しく破れることがあって、シートの大きさが制限されて使用時に細心な注意が要求される短所があるが、生分解性支持体または非分解性支持体に間葉系幹細胞-ハイドロゲルを付着させる場合支持体が間葉系幹細胞-ハイドロゲルの強度を高めて操作がより容易になることができる。

0029

本発明による一様態で、生分解性支持体としてはPGA(poly-gamma-glutamic acid)、PLA(poly lactic acid)、バイクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜及び豚コラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランでなされたグループから選択される1種、または2種以上の組合を使用することができるし、非分解性支持体では滅菌された不織布繊維、PET(polyethylene terephthalate)フィルム、ポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム及び断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)、PE(polyethylene)フィルム及びPP(polypropylene)フィルムでなされたグループから選択される1種、または2種以上の組合を使用することができるが、これに制限されるものではない。

0030

本発明による一様態で、2種以上の非分解性支持体の組合を使用することができるが、これに制限されるものではない。

0031

本発明による一様態で、1種以上の生分解性支持体及び非分解性支持体の組合体を支持体で使用することができるし、例えば、ポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルムまたは断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)フィルム、PLA/不織布繊維またはPGA/PLA/不織布繊維の形態で使用することができるが、これに制限されるものではない。

0032

本発明による一様態で、前記段階(b)で、間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体を1乃至20w/v%DMSO及び1乃至80w/v%人間血清アルブミンを含む凍結保管剤に入れて冷凍保管する段階(d)を追加で含むことができるし、ここで冷凍保管後解凍した時に間葉系幹細胞の生存率は70%以上であることを特徴とする。

0033

本発明による一様態で、本発明による間葉系幹細胞-ハイドロゲル-支持体組成物は冷凍保管後解凍した時1週間後、1ヶ月後、2ヶ月後、3ヶ月後、4ヶ月後、5ヶ月後、6ヶ月後、7ヶ月後、8ヶ月後、9ヶ月後、10ヶ月後、11ヶ月後、12ヶ月後間葉系幹細胞の生存率が70%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上であり、より具体的に12ヶ月後90%以上、95%以上の生存率を示すことができる。

0034

本発明によるまた他の一様態で、間葉系幹細胞及びハイドロゲルを含んで;生分解性支持体及び非分解性支持体でなされたグループから選択される1種以上の支持体、または1種以上の生分解性支持体及び非分解性支持体の組合体を含む、水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物が提供される。

0035

本発明による一様態で、ハイドロゲルはフィブリン糊、ヒアルロン酸、ゼラチン、コラーゲン、アルギン酸、セルロース及びペクチンでなされたグループから選択される何れか一つ以上であることがあるが、これに制限されるものではない。ハイドロゲルとしてフィブリン糊を使用する場合、フィブリン糊を形成するフィブリノーゲンの濃度は0.5乃至60mg/mLであることがあって、具体的に0.5乃至45mg/mLであることがあって、より具体的に0.5乃至30mg/mL濃度、さらに具体的に0.5乃至20mg/mLの濃度、さらに具体的に0.5乃至10mg/mL濃度、さらに具体的に0.5乃至5mg/mL濃度のフィブリノーゲンを含むことを特徴として、1乃至50I.U./mL濃度、具体的に1乃至30I.U./mL濃度、より具体的に5乃至20I.U./mL濃度のトロンビンを含むことができる。

0036

本発明による一様態で、生分解性支持体としてはPGA(poly-gamma-glutamic acid)、PLA(poly lactic acid)、バイクリルメッシュ、人の羊膜、牛の羊膜及び豚コラーゲン、キチン、キトサン、フィブロネクチン及びデキストランでなされたグループから選択される1種、または2種以上の組合を使用することができるし、非分解性支持体としては滅菌された不織布繊維、PET(polyethylene terephthalate)フィルム、PE(polyethylene)フィルム、PP(polypropylene)フィルム及びポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム、及び断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)でなされたグループから選択される1種、または2種以上の組合を使用することができるが、これに制限されるものではない。

0037

本発明による一様態で、2種以上の非分解性支持体の組合を使用することができるが、これに制限されるものではない。

0038

本発明による一様態で、1種以上の生分解性支持体及び非分解性支持体の組合体を支持体で使用することができるし、例えば、ポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム、または断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)、PLA/不織布繊維またはPGA/PLA/不織布繊維の形態で使用することができるが、これに制限されるものではない。

0039

本発明によるまた他の一様態で、前記組成物を有効成分として含む、水疱性表皮剥離症緩和または改善用シートが提供される。

0040

本発明による一様態で、水疱性表皮剥離症は、水疱性表皮剥離症、水疱性細胞分離、水疱性棘細胞症、後天性水疱性表皮剥離症、遺伝性水疱性表皮剥離症、致死性水疱性表皮剥離症、遅延性遺伝性表皮剥離症、増殖性水疱性表皮剥離症、角質溶解症、局限性水疱性表皮剥離症、非傷跡性水疱性表皮剥離症、多発形成異常性水疱性表皮剥離症、傷跡性表皮剥離症、単純表皮溶解症、ウェーバーコケイン病、ダウリング・メアラシンドローム(Dowling-Meara Syndrome)、ゴ−ルドスェイド疾患(Goldscheider's disease)、アロポー-ジーメンス疾患(Hallopeau-Siemens disease)、ハイリックスバウアーシンドローム(Heinrichsbauer syndrome)、ヘルリッツシンドローム(Herlitz syndrome)及びケブネル疾患(Kobner's disease)でなされたグループから選択されることができる。

0041

本発明の一様態で、前記間葉系幹細胞は脂肪、骨髄または臍帯血から分離されたものであることができる。

0042

本発明による一様態でより具体的に前記方法は:
(a1)間葉系幹細胞をFBS(Fetal Bovine Serum)、成長因子であるbFGF(Basic Fibroblast Growth Factor)またはEGF(Epidermal Growth Factor)を含む増殖培地で2継代以上培養する段階;
(a2)培養した間葉系幹細胞を、ハイドロゲルを利用して生分解性または非分解性支持体、またはこれらの組合体に付着する段階;
(b)前記段階(a2)の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体をFBS、成長因子であるbFGFまたはEGFを含む培地で略5日間培養してシートを製造する段階;
(c)前記段階(b)の培養時物理的刺激、低酸素刺激、マイトジェン刺激、炎症因子刺激を追加的に遂行して細胞を活性化させる段階;
(d)前記段階(b)または段階(c)の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートにFBSと成長因子であるbFGFまたはEGFが除去された培地で洗滌する段階;
(e)(b)の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートを10%DMSO及び5%人間血清アルブミンで構成された凍結保管剤に入れて冷凍保管する段階;
(f)凍結保管された間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートを解凍して生理食塩水で洗滌して凍結保管剤をとり除く段階;及び
(g)水疱性表皮剥離症患者の患部でドレッシングが必要な患部の大きさによって切った後適用対象部位に付着する段階を含んで、
(h)前記シートを他のドレッシングで覆ってやる段階を追加で含むことができる。

0043

前記方法をより具体的によく見れば次のようである。
段階a1)では、人間脂肪組職から分離された間葉系幹細胞を使用することができるし、この時人間脂肪組職から間葉系幹細胞を分離して2継代以上培養する方法は、従来技術(韓国登録特許1,328,604)によるものとして増殖培地を使って細胞を培養することで、多量の間葉系幹細胞を短時間内に効果的に得ることができる。従来技術によって2継代以上培養した人間脂肪由来の間葉系幹細胞はプラスチック培養容器に付着して繊維芽細胞形態を維持し、CD10、CD13、CD29、CD44、CD59、CD71、CD90、CD105及びOct4に対して陽性であり、CD34、CD45、CD104、CD106及びStro-1には陰性を示す。また、幹細胞として体外で脂肪細胞骨細胞軟骨細胞筋肉細胞神経細胞分化することができる能力を有する。また、VEGF、HGF、TGF-β1、NGF、IGFのような多様な成長因子を分泌し、免疫調節能力を保有していて多様な疾患治療に適用する技術が開発されている。

0044

前記a2)段階では、a1)で2継代以上培養した脂肪由来の間葉系幹細胞をトリプシンまたはディスパーゼ処理して単一細胞で作ってハイドロゲルに懸濁した後生分解性または非分解性支持体繊維に略5,000個/cm2濃度で均一に振り撤いて付着させた。以後、10%FBS及びEGFまたはbFGFが含まれた増殖培地を利用して3〜7日間培養した。本発明の実施例で使ったハイドロゲルは、フィブリンゲルであるが、これに限定されなくて以外にもコラーゲン、ヒアルロン酸、ゼラチン、アルギン酸、セルロース、ペクチンを含むことができる。

0045

また、本発明の実施例で使った生分解性支持体はバイクリルメッシュまたは牛の羊膜を、非分解性支持体としては滅菌されたガーゼ、ポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム、断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)、PETフィルムや、これもこれに限定されないで、PGA/不織布繊維、PGA/PLA/不織布繊維、人の羊膜、コラーゲン膜などを使用することができる。

0046

本発明においてハイドロゲルは一次的には生分解性または非分解性支持体繊維またはポリウレタンフィルム、ネット型ポリウレタンフィルム、断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)、PETフィルム、PEフィルムPPフィルムに間葉系幹細胞を付着させる機能を遂行して、二次的には付着性細胞である間葉系幹細胞に基質を提供して細胞が基質に付着して安定的に生存することができる環境を提供する。また、ハイドロゲルは無数に多い3次元網目構造(pore)を含んでいて培養液に含まれたFBS、bFGFまたはEGFが網目構造を通過して細胞に作用して増殖することができる環境を提供する。ハイドロゲルは製造する濃度によって網目構造の大きさ、硬度、分解速度が異なるため細胞の形態及び増殖速度に主な影響を及ぼすようになる。本発明の実施例では最終0.5-10mg/mLのフィブリンゲルを使用することで間葉系幹細胞の増殖速度を高めたし、反面適切なゲルの硬度が維持されるようにした。

0047

前記b)段階で間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートで間葉系幹細胞は早く増殖して3〜7日間4倍以上増加してcm2当たり20,000個以上の細胞を含むことができる。

0048

本発明で、ハイドロゲル内で増殖した細胞は、脂肪由来の間葉系幹細胞の特性であるCD29、CD44、CD73、CD90、CD105を発現して、VEGF、HGFを含んだ多様な成長因子を分泌することができる。また、兔疫細胞から分泌される代表的な炎症性因子であるTNF-αとIFN-γ抑制能力も保有している。すなわち、ハイドロゲル内で培養された細胞は間葉系幹細胞の特性を維持することを特徴とする。

0049

また、前記b)段階では低酸素ストレス、マイトジェン(mitogen)処理、炎症因子(IFN-γ)処理を混用することができる。水疱性表皮剥離症によって損傷された組織は血管が破壊されるか、または機能が低下されて酸素供給が円滑ではなくて慢性的な炎症が存在するため損傷された組織に投与された幹細胞は低酸素ストレス及び炎症因子によって活性化されて成長因子及びサイトカイン分泌が急激に増加される。

0050

前で説明したように本発明は、脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シート製造段階で低酸素ストレス、マイトジェンまたは炎症因子を処理して高濃度の成長因子とサイトカインを分泌する高活性の幹細胞を含むシートの製造方法を提供している。

0051

また、本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートは高活性の幹細胞がタンパク質分解酵素を利用した単離過程なしにそのまま水疱性表皮剥離症患者の患部に適用されることができるため治療能力がすぐれる。また、タンパク質分解酵素を利用した単離過程がないため培養する段階で間葉系幹細胞から分泌されるコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エラスチンのような細胞外基質が完全にハイドロゲルに貼布されて存在して水疱性表皮剥離症緩和または改善効果をさらに増進させることができる。

0052

前で説明したように本発明の前記a2)段階でハイドロゲル自体だけでも幹細胞-ハイドロゲルシートの製造が可能である。しかし、ハイドロゲルは強度が低くて機械的/物理的力によって易しく破れるためシートの大きさが制限的で使用時に細心な注意が要求される。反面、本発明によって幹細胞-ハイドロゲルを生分解性または非分解性支持体に付着するようになれば、支持体が幹細胞-ハイドロゲルの強度を高めて操作が容易であるようにした。また、シートの厚さは0.1〜2mmで製造して患部に適用時シートが破れることを防止し、シート内の十分な細胞数が含まれるようにして治療効果を高めることができることを糾明した。

0053

本発明のd)段階は脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートは生理食塩水で2〜3回洗滌して動物由来成分であるFBSをとり除いてより完全にとり除くために無血清DMEM培地で洗滌することができる。前記過程でFBSが除去されてシートを人体に塗布する時動物由来成分によって発生することができる副作用を最小化した。

0054

本発明は、また脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートを凍結保管する方法を含む。クライオバックにシートが充分に沈むように10%DMSOと5%人間血清アルブミン溶液で構成された凍結保管剤を入れてシーリングした後-80℃で保管することができる。一般にタンパク質酵素処理して単離された細胞、人工肌(表皮細胞または真皮細胞または二つの細胞すべてで構成された人工肌)は、-80℃で凍結保管する場合細胞が損傷されて傷に適用する時治療効果が減少されるものとして知られている(Tissue eng 4(4):1403〜414、1988)。

0055

しかし、本発明によって製造した間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートはハイドロゲルが幹細胞を取り囲んでいて外部衝撃及びストレスから細胞を保護して-80℃でも細胞の損傷なしに長期間保管が可能にさせた。

0056

本発明による一実施様態で、水疱性表皮剥離症の緩和または改善効果を増進させることに有用な有効量の1種以上の成長因子、サイトカイン、ホルモンまたは細胞外マトリックス化合物またはタンパク質を本発明による組成物と共に投与することができるし、具体的にGCSFIL6、IL8、IL10、MCP1、MCP2、組織因子、bFGF、KGF、VEGF、PLGF、MMP1、MMP9、TIMP1、TIMP2、TGF-β1、HGFなどをその例で挙げることができるが、これで制限されるものではない。

0057

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳しく説明する。但し、これら実施例は本発明の例示であるだけで、本発明の範囲がこれらだけで限定されるものではない。

0058

実施例1:人間脂肪由来の間葉系幹細胞の培養方法
脂肪組織は普通脂肪吸入術で得ることができるが、これに限定されない。脂肪吸入によって得られた脂肪組織から次のように脂肪由来の間葉系幹細胞を分離した:血液をとり除くために脂肪組織を洗滌した後脂肪組織と同じ嵩のコラゲナーゼ溶液を入れて37℃水浴で反応させた。

0059

遠心分離後、上層液である脂肪層をとり除いて下の層であるコラゲナーゼ溶液を搖れないように気を付けて分離し、基質培地を入れて懸濁させた後、20℃、1500rpmで5分間遠心分離した。この時、下に沈むのがストロマ-血管分画で、上層液をとり除いた。ストロマ-血管分画を基質培地に懸濁させて培養容器に接種し、37℃、5%CO2インキュベーターで24時間の間に培養した。

0060

培養液除去後リン酸塩緩衝溶液で洗滌して、基質培地、または基質培地に塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)が1ng/mL濃度で含まれた増殖培地、または基質培地に表皮細胞成長因子(EGF)が5ng/mL濃度で含まれた培地を利用して増殖させた。脂肪由来の間葉系幹細胞が培養容器の80〜90%程度育てればトリプシン処理して単一細胞で分離して修得した。

0061

実施例2:ハイドロゲルとしてフィブリン糊の濃度決定
凍結乾燥されたトロンビンは、塩化カルシウム溶液1mLを添加して400〜600I.U.になるようにした。または、凍結されたトロンビンを解凍して同一濃度になるように調節した後使用した。凍結乾燥したフィブリノーゲンにアプロチニン溶液1mLを添加するかまたは凍結されたフィブリノーゲンを解凍して原液で準備した後1:5、1:10、1:20、1:40になるように段階別希釈した。前記実施例1で2継代以上培養した細胞を収集して懸濁した後トロンビンを40〜50:1の割合(v/v)で交ぜた後段階別に希釈したフィブリノーゲンと1:1混合してフィブリンゲルが形成されるようにした。ゲルが完全に固ければ10%FBS、1ng/mL bFGFが含まれた培養培地を添加した後37℃、5%CO2インキュベーターで5日間培養した。培養2日目と5日目細胞-フィブリンゲル混合物を取って薄く切片を作った後10μg/mLアクリジンオレンジ/エチジウムブロマイド(AO/EtBr)で染色して蛍光顕微鏡を利用して細胞形態と生存率を測定した。また、培養5日目WST-1を添加して細胞増殖程度を測定した。

0062

図1aは、原液または希釈されたフィブリノーゲン溶液で製造したフィブリンゲル内で幹細胞の形態と数を見せてくれる顕微鏡写真である。フィブリノーゲン原液で作られたフィブリンゲル内では5日目まで大部分の細胞が球形の細胞形態をそのまま維持し、ほとんど増殖することができなかった。一方、希釈倍数が増加するほど細胞は早く繊維芽細胞形態を形成したし、さらにたくさん増殖した。原液フィブリノーゲンで製造したフィブリンゲル内では一部死んだ細胞が観察されたが、希釈したフィブリノーゲンで製造したフィブリンゲル内では死んだ細胞が観察されなかった。すなわち、高濃度フィブリンゲルは脂肪由来の間葉系幹細胞に対する細胞毒性が弱く存在するが1:5〜1:40で希釈した濃度のフィブリンゲルは、細胞毒性がないことを見せてくれるものである。

0063

図1bは、フィブリノーゲンゲルによる幹細胞の増殖能力を、WST-1を利用して定量的に測定して示したグラフで希釈倍数が増加するほど吸光度が増加した。すなわち、フィブリノーゲンを20倍または40倍希釈して作ったフィブリンゲルで幹細胞が一番よく増殖することを分かる。

0064

実施例3:人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シート製造
前記実施例1で2継代以上培養した間葉系幹細胞を収集して増殖培地で懸濁した。前記実施例2の結果に基礎してトロンビンを最終8〜15I.U.になるように細胞懸濁液に添加した。

0065

支持体として、略5x5cm大きさの四角形模様の生分解性支持体であるバイクリルメッシュ、牛の羊膜または非分解性支持体であるガーゼ、断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)及びPETフィルムに略3〜6.5mg/mL濃度のフィブリノーゲンを塗布して均一に塗布した。その後、トロンビンが含まれた細胞懸濁液を支持体にcm2当たり略5,000個になるように塗布した後細胞-フィブリンゲルが支持体に均一に形成されて付着されるようにした。フィブリンゲルが完全に固ければ増殖培地を添加して37℃、5%CO2インキュベーターで3〜7日間培養した。

0066

図2aは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞をフィブリンハイドロゲルと混合して非分解性支持体である断面にソフトシリコンコーティングされたポリウレタン(Polyurethane)及びPETフィルムに付着させた後培養して製造されたシートをAO/EtBr染色後蛍光顕微鏡で観察した写真である。図2bはシートを-80゜Cで凍結保管されたシートを解凍して顕微鏡またはAO/EtBr染色後蛍光顕微鏡で観察した写真である。図2bで見せてくれるように凍結保管後解凍後にも凍結前と類似な繊維芽細胞形態の細胞がハイドロゲルによって支持体に付着されて増殖されたことが観察された。シートcm2当たり略20,000〜400,000個の細胞が均質分布したし100%生存した。

0067

実施例4:人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートの凍結保管
前記実施例3で製造した人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートを洗滌して細胞培養液をとり除いた後凍結保管剤(10%DMSO及び人間血清アルブミン溶液)が入っているクライオバックに入れて-80℃で凍結保管した。略1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、12ヶ月後各時期別に前記クライオバックを取り出して37℃恒温水槽に浸した後振って凍結保管剤を溶かして注いで捨てた。生理食塩水を添加した後上-下で振ってくれて注いで捨てた。凍結保管剤を完全にとり除いた後AO/EtBrで染色して生存率を測定した。

0068

その結果、図3bで見せてくれるように前記発明によって製造したシート内で脂肪由来の間葉系幹細胞は12ヶ月まで95%以上生存した。

0069

すなわち、本発明によって製造された人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートは主有効成分である細胞の損傷なく-80℃で長期間冷凍保管が可能であることを見せてくれている。

0070

実施例5:人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体の成長因子分泌
実施例3の人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートまたは実施例4の凍結保管されたシートを解凍してPBSで洗滌した後0.8x0.8cmで切った後24-wellプレートに2枚ずつ入れてDMEM1mLを添加した。37℃、5%CO2インキュベーターで72時間培養した後上層液を収集した後、間葉系幹細胞で分泌する代表的な成長因子であるVEGF、HGFの量を、ELISA法を利用して測定した。その結果、図4aで見せてくれるように、前記シートはHGF及びVEGFを分泌した。

0071

また他の実施例で、前記収集した上層液を血管形成と関連されるサイトカインアレイキットを利用して分析した。その結果、図4bで見せてくれるように、前記シートは血管形成を促進するHGF、VEGFを含めた成長因子とサープリン(Serprin)E1(PAI-1)とF1(PDEF)、TIMP-1、CXCL8(IL-8)、FGF-2、DPPIV(CD26)のような多様なサイトカインを多量分泌した。すなわち、本発明によって製造したハイドロゲル及び生分解性または非分解性支持体を利用して培養した間葉系幹細胞を患部に適用すれば、細胞増殖及び血管形成を促進する多様な成長因子とサイトカインを持続的に分泌することで周辺組織細胞を活性化させて水疱性表皮剥離症を緩和または改善させる効果を示すことができるという点が分かった。

0072

実施例6:同種の人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体の免疫調節機能
実施例3の人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートまたは実施例4の凍結保管されたシートを解凍して適当な大きさで切った後24-wellプレートに1枚ずつ入れた。そして、組織適合性抗原(Human Leukocyte Antigen:HLA)が他の供与者から得た末梢血液単核細胞(peripheral Blood Mononuclear Cell:PBMC)5x105個を24-wellプレートに添加した。陽性対照群としては末梢血液単核細胞にマイトジェン(mitogen)であるPHA(phyto-hemagglutinin)を添加して末梢血液単核細胞の免疫反応を誘発した。反応スタート後3日目上等液を収集して分泌されたTNF-αの量を、ELISA方法を利用して測定した。

0073

図5aは、同種の人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体の免疫反応誘導能を見せてくれる図面であり、ここに現われたように陽性対照群である末梢血液単核細胞はPHAによって活性化される反面、前記実施例3または4によって製造した同種人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体との反応ではTNF-αがほとんど分泌されなかった。すなわち、同種の人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体は免疫反応を誘発しないことが確認された。

0074

また他の実験例で、末梢血液単核細胞5x105個を24-wellプレートに入れてPHAで活性化させて免疫反応を誘発し、前記実施例3または4によって製造した同種の人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートを適当な大きさで切った後プレートに1枚ずつ添加した。反応3日目上等液を収集してTNF-αの分泌量を測定した。

0075

その結果、図5bで見せてくれるようにPHAで活性化された末梢血液単核細胞で同種人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートはTNF-αの分泌量を60%以上減少させた。すなわち、同種人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートは免疫反応を誘発しないし、また、過度な免疫反応が発生した時は兔疫細胞によって多量分泌されて免疫反応性を増加させる役割をするTNF-αの分泌量を著しく減少させる役割をする。したがって、脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体シートを水疱性表皮剥離症患部に覆ってやれば持続される炎症を緩和させて再上皮化を促進することができる。

0076

実施例7:人間脂肪由来の間葉系幹細胞のECM分泌能
前記実施例1で修得した細胞からタンパク質を抽出して水疱性表皮剥離症の原因タンパク質であるコラーゲンタイプVIIとラミニン5の発現量をWestern blot技法で測定した後繊維芽細胞での発現量と比べた。また、本発明で製造したシートの原料になる人間脂肪由来の間葉系幹細胞で発現量と分泌量をELISA技法で測定した。

0077

図6aは、本発明で製造したシートの原料になる人間脂肪由来の間葉系幹細胞は繊維芽細胞と比べてコラーゲンタイプVIIとラミニン5の発現量が高いことを見せてくれている。図6bは、人間脂肪由来の間葉系幹細胞が発現するコラーゲンタイプVIIの量と分泌されるコラーゲンタイプVIIの量を定量分析した結果である。

0078

また、他の実施例で前記実施例1で製造した脂肪由来の間葉系幹細胞を固定後コラーゲンタイプVIIまたはコラーゲンタイプI特異抗体を含むPBSを添加した後37℃で1時間の間に反応させた後、洗滌した後にマウンティングして蛍光顕微鏡で観察した。

0079

図6cは、脂肪由来の間葉系幹細胞の細胞外基質タンパク質の分泌能を見せてくれる写真で(x400)、ここに現われたように本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体は全体的にコラーゲンタイプVII、コラーゲンタイプIに陽性反応を示した。

0080

実施例8:人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体のECM分泌及び発現評価
前記実施例3または4で製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体をFBSが添加されないDMEMで3日間培養後培養液を収集してELISA技法でECM分泌能及び発現率を測定した。

0081

その結果、図7aで見せてくれるように、本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体はコラーゲンタイプVII及びIを分泌した。

0082

また他の実施例で、前記実施例3または4で製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体の凍結切片を作った後固定して、細胞外基質タンパク質特異抗体を添加した後37℃で1時間の間に反応させた後、洗滌した後マウンティングして蛍光顕微鏡で観察した。

0083

その結果、図7bで見せてくれるように、本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体は、コラーゲンタイプVII、コラーゲンタイプI、コラーゲンタイプV、ラミニン5、フィブロネクチン及びラミニンに陽性反応を示した。すなわち、本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体を構成する細胞は多様な種類の細胞外基質タンパク質を多量分泌するだけでなく、分泌された細胞外基質タンパク質がハイドロゲル内に泊まっていて体内に移植した時に多様な基質を提供することで、水疱性表皮剥離症を緩和または改善させる効果を示すことができる。

0084

実施例9:人間脂肪由来の間葉系幹細胞と人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体のコラーゲンタイプVII発現
図8は、既存の培養法によって断層培養した脂肪由来の間葉系幹細胞とシート内脂肪由来の間葉系幹細胞の細胞外基質タンパク質の分泌能を見せてくれる結果であり、本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体は既存の断層培養した細胞と比べてコラーゲンタイプVIIを6.8倍さらにたくさん分泌した。

0085

以上の結果、脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体を水疱性表皮剥離症患者の患部に貼付すれば、脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体が肌損傷部位に多様な細胞外基質タンパク質を供給して組織再生及び再上皮化を促進することができる。

0086

実施例10:炎症性物質による人間脂肪由来の間葉系幹細胞でのコラーゲンタイプVIIの発現評価
前記実施例1で修得した細胞を12-wellプレートに5,500/cm2で添加して24時間後TGF-β2とTNF-αを添加して48時間の間に追加培養した。細胞を収集した後RNAを抽出して水疱性表皮剥離症の原因遺伝子であるコラーゲンタイプVIIの発現量をRT−PCT技法で測定後に発現変化を比べた。

0087

その結果、図9で見せてくれるように、シートの主成分である脂肪由来の間葉系幹細胞にTGF-β2とTNF-αを処理すれば、コラーゲンタイプVIIの発現が略8倍増加した。

0088

以上の結果、本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体を水疱性表皮剥離症患者の患部に貼付すれば、慢性的な肌損傷部位に存在する炎症性物質らによって脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体のコラーゲンタイプVII発現量が増加して組織再生及び再上皮化を促進することができる。

0089

実施例11:人間脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体の水疱性表皮剥離症治療
前記実施例4で製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体の治療効果を評価するために水疱性表皮剥離症患者を対象で臨床試験を実施した。

0090

本患者は、24女性患者で水疱性表皮剥離症診断を受けたが、別途治療法がなくて継続的な再発と炎症によって病状好転がなかった。前記実施例4で製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体を対象者の患部に貼付したし、1週間間隔で写真観察を通じて傷治療効果を評価した。

0091

図10は、脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体を貼付した後傷面積を示すグラフであり、本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体貼付後に時間が経つによって傷面積が減少したし、貼付4週後に貼付前と比べた時に比べて64.4%減少する効果を示した。

0092

すなわち、本発明によって製造した脂肪由来の間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性または非分解性支持体は多様な種類の細胞外基質を多量分泌するだけでなく、分泌された細胞外基質がハイドロゲル内に泊まっていて体内に移植した時に多様な基質を提供することで、水疱性表皮剥離症を緩和または改善させる効果を示すことができるという点が分かる。

0093

本発明による間葉系幹細胞-ハイドロゲル-生分解性支持体または非分解性支持体を含む水疱性表皮剥離症緩和または改善用組成物またはシートは、特に、コラーゲンタイプVII及びラミニン-5の発現を増加させて、水疱性表皮剥離症患部に適用した時に臨床的に有意味な効果を発現することができるという長所を示して、したがって、水疱性表皮剥離症患者の症状緩和または改善用で有用に使われることができる。

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