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図面 (18)

課題

創傷治癒する間の瘢痕形成を低減させる方法の提供。

解決手段

瘢痕形成を低減させるための核酸分子治療的有効量をヒトへ投与することを含み、ここで核酸分子が、創傷の72時間前と創傷の24時間後との間に投与される。具体的な核酸分子RXI−109(結合組織増殖因子(CTGF)を標的とする)は、予防を前提として、創傷を治癒する間中、瘢痕形成を低減することが実証される。

概要

背景

発明の背景
相補的オリゴヌクレオチド配列は有望な治療剤であり、遺伝子の機能を解明する上での有用な研究用ツール(research tool)である。しかしながら、先行技術のオリゴヌクレオチド分子は、それらの臨床的開発を妨げる可能性があるいくつかの問題に悩まされており、これは、かかる組成物をin vivoで使用する遺伝子発現タンパク質合成を含む)の意図した効率的な阻害の達成をしばしば困難にする。

主要な問題は、これらの化合物の、細胞および組織への送達であった。従来の二本鎖RNAi化合物は、19〜29塩基長であって、およそ1.5×(10〜15)nmのサイズの高度に負に荷電した強固ならせんを形成する。このロッド型分子細胞膜を透過することができず、その結果として、in vitroおよびin vivoでの両方において極めて限定的な効力しか有さない。その結果として、従来の全てのRNAi化合物は、それらの組織分配および細胞取り込みを促進するために、何らかの種類の送達ビヒクルを必要とする。これは、RNAi技術の主要な限定要因であると考えられる。

先には、それらの細胞取り込み特性を改善するために、オリゴヌクレオチド化学修飾を適用する試みが存在している。1つのかかる修飾は、オリゴヌクレオチドへのコレステロール分子の付着であった。このアプローチについての最初の報告は、1989年のLetsingerらによるものであった。後に、ISIS Pharmaceuticals, Inc.(Carlsbad, CA)が、オリゴヌクレオチドへ、コレステロール分子を付着させる上でのより高度な技術を報告した(Manoharan, 1992)。

90年代後期におけるsiRNAの発見に関して、それらの送達プロフィールを増強するために、同様の型の修飾がこれらの分子へ試みられた。僅かに修飾された(Soutschek, 2004)および重度に修飾された(Wolfrum, 2007)siRNAへ抱合させたコレステロール分子が、文献に登場した。Yamadaら(2008)はまた、コレステロールを媒介したsiRNAの取り込みをさらに改善する高度なリンカー化学(linker chemistry)の使用について報告した。この努力にも拘わらず、これらの型の化合物の取り込みは、生体液の存在下において阻害され、これがin vivoでの遺伝子サイレンシングにおける効力を極めて限定させることになり、臨床の場でこれらの化合物の適用性を限定していると考えられる。

概要

創傷治癒する間の瘢痕形成を低減させる方法の提供。瘢痕形成を低減させるための核酸分子治療的有効量をヒトへ投与することを含み、ここで核酸分子が、創傷の72時間前と創傷の24時間後との間に投与される。具体的な核酸分子RXI−109(結合組織増殖因子(CTGF)を標的とする)は、予防を前提として、創傷を治癒する間中、瘢痕形成を低減することが実証される。なし

目的

本発明の側面は、瘢痕形成を低減するための創傷の予防的処置のための核酸分子を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
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請求項1

創傷治癒する間の瘢痕形成を低減させる方法であって、瘢痕形成を低減させるための核酸分子治療的有効量をヒトへ投与することを含み、ここで核酸分子が、創傷の72時間前と創傷の24時間後との間に投与される、前記方法。

請求項2

核酸が、化学修飾されたオリゴヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。

請求項3

瘢痕形成が、皮膚の瘢痕形成である、請求項1または2に記載の方法。

請求項4

瘢痕形成が、眼の瘢痕形成である、請求項1または2に記載の方法。

請求項5

核酸分子が、以下:トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ1、TGFβ2)、オステオポンチン結合組織増殖因子(CTGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、低酸素誘導因子−1α(HIF1α)、コラーゲンIおよび/またはIII、プロリル4−ヒドロキシラーゼ(P4H)、プロコラーゲンC−プロテアーゼ(PCP)、マトリックスメタロプロテイナーゼ2、9(MMP2、9)、インテグリン類、コネキシンヒスタミンH1受容体組織トランスグルタミナーゼ哺乳類ラパマイシン標的(mTOR)、HoxB13、VEGF、IL−6、SMADタンパク質リボソームタンパク質S6キナーゼ(RSP6)ならびにシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子に対して指向する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。

請求項6

核酸分子が、CTGFに対して指向する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

核酸分子が、一本鎖である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。

請求項8

核酸分子が、二本鎖である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。

請求項9

核酸分子が、RNAi作用機序を介して働く、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。

請求項10

核酸分子が、G.mC.A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU.A*mG*mA.TEG−Chl(配列番号1)のセンス鎖配列およびP.mU.fC.fU.A.G.mA.A.mA.G.G.fU.G.mC*A*A*A*mC*A*U(配列番号2)のアンチセンス鎖配列を含むRXI−109である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

核酸分子が、CTGFへ指向するsiRNAである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。

請求項12

核酸分子が、CTGFへ指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドASO)である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。

請求項13

治療的有効量が、創傷の1センチメートルあたり0.5〜20mgの間である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。

請求項14

核酸分子が、皮膚への送達用に製剤化された組成物中にある、請求項1〜3および5〜13のいずれか一項に記載の方法。

請求項15

核酸分子が、局所送達用に製剤化された組成物中にある、請求項1〜3および5〜13のいずれか一項に記載の方法。

請求項16

核酸分子が、皮内注射用に製剤化された組成物中にある、請求項1〜3および5〜13のいずれか一項に記載の方法。

請求項17

核酸分子が、目への送達用に製剤化された組成物中にある、請求項1、2および4〜13のいずれか一項に記載の方法。

請求項18

核酸分子が、局所送達用に製剤化された組成物中にある、請求項17に記載の方法。

請求項19

核酸分子が、硝子体内注射用または網膜下注射用に製剤化された組成物中にある、請求項17に記載の方法。

請求項20

少なくとも第2核酸分子をさらに含み、ここで第2核酸分子が、核酸分子とは異なる遺伝子に対して指向する、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。

請求項21

核酸分子が、ヌクレオチドから構成され、および、ヌクレオチドの少なくとも30%が、化学修飾されている、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。

請求項22

核酸分子が、少なくとも1つの修飾された主鎖連結部を有し、および、主鎖連結部のうち少なくとも2つが、ホスホチオアート連結部を含有する、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法。

請求項23

核酸分子が、ヌクレオチドから構成され、および、ヌクレオチドのうち少なくとも1つが、OMe、2’MOE(メトキシ)および2’フルオロから選択される2’化学修飾を含有する、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。

請求項24

創傷後24時間を超えてから、少なくとも第2用量の核酸分子を投与することをさらに含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。

請求項25

創傷後24時間を超えてから、少なくとももう2回の用量の核酸分子を投与することをさらに含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。

請求項26

創傷が、皮膚移植を含む、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。

請求項27

核酸分子が、移植ドナー部位へ投与される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。

請求項28

核酸分子が、移植レシピエント部位へ投与される、請求項1〜25のいずれか一項に記載の方法。

請求項29

瘢痕形成を低減させるための核酸分子の治療的有効量をヒトへ投与することを含む、創傷が治癒する間の瘢痕形成を低減させる方法であって、ここで核酸分子が、創傷の7日後と30日後との間に投与される、前記方法。

請求項30

1〜5回の追加用量をさらに含む、請求項29に記載の方法。

請求項31

追加用量が、毎週投与される、請求項30に記載の方法。

請求項32

追加用量が、2週間毎投与される、請求項30に記載の方法。

請求項33

追加用量が、毎月投与される、請求項30に記載の方法。

請求項34

追加用量が、毎週、2週間毎および/または毎月のいずれの組み合わせでも投与される、請求項30に記載の方法。

請求項35

治療的有効量が、創傷の1センチメートルあたり0.1〜20mgの間である、請求項1〜12および14〜34のいずれか一項に記載の方法。

請求項36

核酸分子が、以下:トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ1、TGFβ2)、オステオポンチン、結合組織増殖因子(CTGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、低酸素誘導因子−1α(HIF1α)、コラーゲンIおよび/またはIII、プロリル4−ヒドロキシラーゼ(P4H)、プロコラーゲンC−プロテアーゼ(PCP)、マトリックスメタロプロテイナーゼ2、9(MMP2、9)、インテグリン類、コネキシン、ヒスタミンH1受容体、組織トランスグルタミナーゼ、哺乳類ラパマイシン標的(mTOR)、HoxB13、VEGF、IL−6、SMADタンパク質、リボソームタンパク質S6キナーゼ(RSP6)およびシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子に対して指向する、請求項29〜35のいずれか一項に記載の方法。

請求項37

核酸分子が、CTGFに対して指向する、請求項36に記載の方法。

請求項38

核酸分子が、G.mC.A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU.A*mG*mA.TEG−Chl(配列番号1)のセンス鎖配列およびP.mU.fC.fU.A.G.mA.A.mA.G.G.fU.G.mC*A*A*A*mC*A*U(配列番号2)のアンチセンス鎖配列を含むRXI−109である、請求項37に記載の方法。

請求項39

瘢痕形成を低減させるための核酸分子の治療的有効量をヒトへ投与することを含む、ケロイド切除に続く瘢痕形成を低減させる方法であって、ここで核酸分子が、切除の72時間前と切除の24時間後との間に投与される、前記方法。

請求項40

核酸が、化学修飾されたオリゴヌクレオチドである、請求項39に記載の方法。

請求項41

核酸分子が、以下:トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ1、TGFβ2)、オステオポンチン、結合組織増殖因子(CTGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、低酸素誘導因子−1α(HIF1α)、コラーゲンIおよび/またはIII、プロリル4−ヒドロキシラーゼ(P4H)、プロコラーゲンC−プロテアーゼ(PCP)、マトリックスメタロプロテイナーゼ2、9(MMP2、9)、インテグリン類、コネキシン、ヒスタミンH1受容体、組織トランスグルタミナーゼ、哺乳類ラパマイシン標的(mTOR)、HoxB13、VEGF、IL−6、SMADタンパク質、リボソームタンパク質S6キナーゼ(RSP6)およびシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子に対して指向する、請求項39または40に記載の方法。

請求項42

核酸分子が、CTGFに対して指向する、請求項39〜41のいずれか一項に記載の方法。

請求項43

核酸分子が、一本鎖である、請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法。

請求項44

核酸分子が、二本鎖である、請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法。

請求項45

核酸分子が、RNAi作用機序を介して働く、請求項39〜44のいずれか一項に記載の方法。

請求項46

核酸分子が、G.mC.A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU.A*mG*mA.TEG−Chl(配列番号1)のセンス鎖配列およびP.mU.fC.fU.A.G.mA.A.mA.G.G.fU.G.mC*A*A*A*mC*A*U(配列番号2)のアンチセンス鎖配列を含むRXI−109である、請求項39〜45のいずれか一項の記載の方法。

請求項47

核酸分子が、CTGFへ指向するsiRNAである、請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法。

請求項48

核酸分子が、CTGFへ指向するアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)である、請求項39〜42のいずれか一項に記載の方法。

請求項49

治療的有効量が、瘢痕の1センチメートルあたり0.1〜20mgの間である、請求項39〜48のいずれか一項に記載の方法。

請求項50

核酸分子が、皮膚への送達用に製剤化された組成物中にある、請求項39〜49のいずれか一項に記載の方法。

請求項51

核酸分子が、局所送達用に製剤化された組成物中にある、請求項39〜49のいずれか一項に記載の方法。

請求項52

核酸分子が、皮内注射用に製剤化された組成物中にある、請求項39〜49のいずれか一項に記載の方法。

請求項53

少なくとも第2核酸分子をさらに含み、ここで第2核酸分子が、核酸分子とは異なる遺伝子に対して指向する、請求項39〜52のいずれか一項に記載の方法。

請求項54

核酸分子が、ヌクレオチドから構成され、および、ヌクレオチドのうち少なくとも30%が、化学修飾されている、請求項39〜53のいずれか一項に記載の方法。

請求項55

核酸分子が、少なくとも1つの修飾された主鎖連結部を有し、および、主鎖連結部のうち少なくとも2つが、ホスホロチオアート連結部を含有する、請求項39〜54のいずれか一項に記載の方法。

請求項56

核酸分子が、ヌクレオチドから構成され、および、ヌクレオチドのうち少なくとも1つが、OMe、2’MOE(メトキシ)および2’フルオロから選択される2’化学修飾を含有する、請求項39〜55のいずれか一項に記載の方法。

請求項57

第1用量に続き、少なくとも1回の追加用量を投与することをさらに含む、請求項39〜56のいずれか一項に記載の方法。

請求項58

複数回の追加用量を投与することをさらに含む、請求項56に記載の方法。

請求項59

追加用量が、第1用量に続き1日おきに投与される、請求項57または58に記載の方法。

請求項60

追加用量が、第1用量に続き週2回投与される、請求項57または58に記載の方法。

請求項61

追加用量が、第1用量に続き毎週投与される、請求項57または58に記載の方法。

請求項62

追加用量が、第1用量に続き2週間毎投与される、請求項57または58に記載の方法。

請求項63

追加用量が、第1用量に続き3週間毎投与される、請求項57または58に記載の方法。

請求項64

追加用量が、第1用量に続き毎月投与される、請求項57または58に記載の方法。

請求項65

追加用量が、毎日、週2回、毎週、2週間毎、3週間毎および/または毎月のいずれの組み合わせでも投与される、請求項57または58に記載の方法。

請求項66

ブースター用量が投与される、請求項57または58に記載の方法。

請求項67

ブースター用量が、毎月または2カ月毎投与される、請求項66に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願
本願は、2013年12月4日に出願された米国仮出願第US 61/911,991号、表題化学修飾されたオリゴヌクレオチドを利用する創傷治癒早期処置のための方法」、2013年12月4日に出願された米国仮出願第61/911,993号、表題「化学修飾されたオリゴヌクレオチドを利用する創傷治癒を加速させるための方法」、2014年9月11日に出願された米国仮出願第US 62/049,299号、表題「化学修飾されたオリゴヌクレオチドを利用する創傷治癒の処置のための方法」の35 U.S.C.§119(e)に基づく利益を主張し、各々の全開示は、それら全体を参考にして本明細書に組み込まれる。

0002

発明の分野
本発明は、創傷治癒する間の線維症の低減に関連する。本発明は、より具体的には、改善されたin vivo送達特性を持つ核酸分子、および、皮膚の瘢痕形成低減のためのそれらの使用に関する。

背景技術

0003

発明の背景
相補的オリゴヌクレオチド配列は有望な治療剤であり、遺伝子の機能を解明する上での有用な研究用ツール(research tool)である。しかしながら、先行技術のオリゴヌクレオチド分子は、それらの臨床的開発を妨げる可能性があるいくつかの問題に悩まされており、これは、かかる組成物をin vivoで使用する遺伝子発現タンパク質合成を含む)の意図した効率的な阻害の達成をしばしば困難にする。

0004

主要な問題は、これらの化合物の、細胞および組織への送達であった。従来の二本鎖RNAi化合物は、19〜29塩基長であって、およそ1.5×(10〜15)nmのサイズの高度に負に荷電した強固ならせんを形成する。このロッド型分子細胞膜を透過することができず、その結果として、in vitroおよびin vivoでの両方において極めて限定的な効力しか有さない。その結果として、従来の全てのRNAi化合物は、それらの組織分配および細胞取り込みを促進するために、何らかの種類の送達ビヒクルを必要とする。これは、RNAi技術の主要な限定要因であると考えられる。

0005

先には、それらの細胞取り込み特性を改善するために、オリゴヌクレオチドに化学修飾を適用する試みが存在している。1つのかかる修飾は、オリゴヌクレオチドへのコレステロール分子の付着であった。このアプローチについての最初の報告は、1989年のLetsingerらによるものであった。後に、ISIS Pharmaceuticals, Inc.(Carlsbad, CA)が、オリゴヌクレオチドへ、コレステロール分子を付着させる上でのより高度な技術を報告した(Manoharan, 1992)。

0006

90年代後期におけるsiRNAの発見に関して、それらの送達プロフィールを増強するために、同様の型の修飾がこれらの分子へ試みられた。僅かに修飾された(Soutschek, 2004)および重度に修飾された(Wolfrum, 2007)siRNAへ抱合させたコレステロール分子が、文献に登場した。Yamadaら(2008)はまた、コレステロールを媒介したsiRNAの取り込みをさらに改善する高度なリンカー化学(linker chemistry)の使用について報告した。この努力にも拘わらず、これらの型の化合物の取り込みは、生体液の存在下において阻害され、これがin vivoでの遺伝子サイレンシングにおける効力を極めて限定させることになり、臨床の場でこれらの化合物の適用性を限定していると考えられる。

0007

発明の概要
本発明の側面は、瘢痕形成を低減するための創傷の予防的処置のための核酸分子を提供する。本明細書において、具体的な核酸分子RXI−109(結合組織増殖因子(CTGF)を標的とする)は、予防を前提として、創傷が治癒する間の瘢痕形成を低減することが実証される。

0008

本発明の限定の各々は、本発明の多様な態様を包含し得る。したがって、いずれか1の要素または要素の組み合わせを伴う本発明の限定の各々は、本発明の各側面に含まれ得ると考えられる。本発明はその適用において、以下の説明に記載されるまたは図面に例示される、解釈の詳細および構成要素の配置に限定されない。本発明は他の態様も可能であり、多様なやり方において実践または実行されることが可能である。

0009

本発明の側面は、瘢痕形成を低減させるための核酸分子の治療的有効量をヒトへ投与することを含む、創傷が治癒する間の瘢痕形成を低減させる方法を含み、ここで核酸分子は、創傷の72時間前と創傷の24時間後との間に投与される。
いくつかの態様において、核酸は化学修飾されたオリゴヌクレオチドである。ある態様において、瘢痕形成は皮膚の瘢痕形成である。他の態様において、瘢痕形成は眼の瘢痕形成である。

0010

いくつかの態様において、核酸分子は、以下:トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ1、TGFβ2)、オステオポンチン、結合組織増殖因子(CTGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、低酸素誘導因子−1α(HIF1α)、コラーゲンIおよび/またはIII、プロリル4−ヒドロキシラーゼ(P4H)、プロコラーゲンC−プロテアーゼ(PCP)、マトリックスメタロプロテイナーゼ2、9(MMP2、9)、インテグリン類、コネキシンヒスタミンH1受容体、組織トランスグルタミナーゼ哺乳類ラパマイシン標的(mTOR)、HoxB13、VEGF、IL−6、SMADタンパク質リボソームタンパク質S6キナーゼ(RSP6)およびシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子に対して指向する。

0011

ある態様において、核酸分子はCTGFに対して指向する。
いくつかの態様において、核酸分子は一本鎖である。他の態様において、核酸分子は二本鎖である。ある態様において、核酸分子はRNAi作用機序を介して働く。
いくつかの態様において、核酸分子は、G.mC.A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU.A*mG*mA.TEG−Chl(配列番号1)のセンス鎖配列およびP.mU.fC.fU.A.G.mA.A.mA.G.G.fU.G.mC*A*A*A*mC*A*U(配列番号2)のアンチセンス鎖配列を含むRXI−109である。

0012

いくつかの態様において、核酸分子はCTGFに対して指向するsiRNAである。ある態様において、核酸分子はCTGFに対して指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドASO)である。
いくつかの態様において、治療的有効量は創傷の1センチメートルあたり0.5〜20mgの間である

0013

いくつかの態様において、核酸分子は、皮膚への送達用に製剤化された組成物中にある。ある態様において、核酸分子は、局所送達用に製剤化された組成物中にある。いくつかの態様において、核酸分子は、皮内注射用に製剤化された組成物中にある。いくつかの態様において、核酸分子は、目への送達用に製剤化された組成物中にある。いくつかの態様において、核酸分子は、目への局所送達用に製剤化された組成物中にある。ある態様において、核酸分子は、硝子体内注射用または網膜下注射用に製剤化された組成物中にある。

0014

いくつかの態様において、方法は少なくとも第2核酸分子をさらに含み、ここで第2核酸分子は、核酸分子とは異なる遺伝子に対して指向する。
いくつかの態様において、核酸分子はヌクレオチドから構成され、ヌクレオチドの少なくとも30%は化学修飾されている。
いくつかの態様において、核酸分子は、少なくとも1つの修飾された主鎖連結部を有し、主鎖連結部のうち少なくとも2つはホスホチオアート連結部を含有する。

0015

いくつかの態様において、核酸分子はヌクレオチドから構成され、ヌクレオチドのうち少なくとも1つは、OMe、2’MOE(メトキシ)および2’フルオロから選択される2’化学修飾を含有する。
いくつかの態様において、方法は、創傷後24時間を超えてから、少なくとも第2用量の核酸分子を投与することをさらに含む。いくつかの態様において、方法は、創傷後24時間を超えてから、少なくとももう2回の用量の核酸分子を投与することをさらに含む。いくつかの態様において、創傷は皮膚移植を含む。

0016

いくつかの態様において、核酸分子は移植ドナー部位へ投与される。いくつかの態様において、核酸分子は移植レシピエント部位へ投与される。
本発明の側面は、瘢痕形成を低減させるための核酸分子の治療的有効量をヒトへ投与することを含む、創傷が治癒する間の瘢痕形成を低減させる方法に関し、ここで核酸分子は、創傷の7日後と30日後との間に投与される。

0017

いくつかの態様において、方法は1〜5回の追加用量をさらに含む。いくつかの態様において、追加用量は毎週投与される。いくつかの態様において、追加用量は2週間毎投与される。いくつかの態様において、追加用量は毎月投与される。いくつかの態様において、追加用量は、毎週、2週間毎および/または毎月のいずれの組み合わせでも投与される。いくつかの態様において、治療的有効量は、創傷の1センチメートルあたり0.1〜20mgの間である。

0018

いくつかの態様において、核酸分子は、以下:トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ1、TGFβ2)、オステオポンチン、結合組織増殖因子(CTGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、低酸素誘導因子−1α(HIF1α)、コラーゲンIおよび/またはIII、プロリル4−ヒドロキシラーゼ(P4H)、プロコラーゲンC−プロテアーゼ(PCP)、マトリックスメタロプロテイナーゼ2、9(MMP2、9)、インテグリン類、コネキシン、ヒスタミンH1受容体、組織トランスグルタミナーゼ、哺乳類ラパマイシン標的(mTOR)、HoxB13、VEGF、IL−6、SMADタンパク質、リボソームタンパク質S6キナーゼ(RSP6)およびシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子に対して指向する。

0019

いくつかの態様において、核酸分子はCTGFに対して指向する。いくつかの態様において、核酸分子は、G.mC.A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU.A*mG*mA.TEG−Chl(配列番号1)のセンス鎖配列およびP.mU.fC.fU.A.G.mA.A.mA.G.G.fU.G.mC*A*A*A*mC*A*U(配列番号2)のアンチセンス鎖配列を含むRXI−109である。
本発明のさらなる側面は、瘢痕形成を低減させるための核酸分子の治療的有効量をヒトへ投与することを含む、ケロイド切除に続く瘢痕形成を低減させる方法に関し、ここで核酸分子は、切除に先立つ72時間と切除後24時間との間に投与される。

0020

いくつかの態様において、核酸は化学修飾されたオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、核酸分子は、以下:トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ1、TGFβ2)、オステオポンチン、結合組織増殖因子(CTGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、低酸素誘導因子−1α(HIF1α)、コラーゲンIおよび/またはIII、プロリル4−ヒドロキシラーゼ(P4H)、プロコラーゲンC−プロテアーゼ(PCP)、マトリックスメタロプロテイナーゼ2、9(MMP2、9)、インテグリン類、コネキシン、ヒスタミンH1受容体、組織トランスグルタミナーゼ、哺乳類ラパマイシン標的(mTOR)、HoxB13、VEGF、IL−6、SMADタンパク質、リボソームタンパク質S6キナーゼ(RSP6)およびシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子に対して指向する。

0021

いくつかの態様において、核酸分子はCTGFに対して指向する。いくつかの態様において、核酸分子は一本鎖である。いくつかの態様において、核酸分子は二本鎖である。いくつかの態様において、核酸分子はRNAi作用機序を介して働く。
いくつかの態様において、核酸分子は、G.mC.A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU.A*mG*mA.TEG−Chl(配列番号1)のセンス鎖配列およびP.mU.fC.fU.A.G.mA.A.mA.G.G.fU.G.mC*A*A*A*mC*A*U(配列番号2)のアンチセンス鎖配列を含むRXI−109である。

0022

いくつかの態様において、核酸分子はCTGFへ指向するsiRNAである。いくつかの態様において、核酸分子はCTGFへ指向するアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)である。いくつかの態様において、治療的有効量は、瘢痕の1センチメートルあたり0.1〜20mgの間である。
いくつかの態様において、核酸分子は、皮膚への送達用に製剤化された組成物中にある。いくつかの態様において、核酸分子は、局所送達用に製剤化された組成物中にある。いくつかの態様において、核酸分子は、皮内注射用に製剤化された組成物中にある。

0023

いくつかの態様において、方法は少なくとも第2核酸分子をさらに含み、ここで第2核酸分子は、核酸分子とは異なる遺伝子に対して指向する。いくつかの態様において、核酸分子はヌクレオチドから構成され、ヌクレオチドのうち少なくとも30%は化学修飾されている。いくつかの態様において、核酸分子は、少なくとも1つの修飾された主鎖連結部を有し、主鎖連結部のうち少なくとも2つはホスホロチオアート連結部を含有する。いくつかの態様において、核酸分子はヌクレオチドから構成され、ヌクレオチドのうち少なくとも1つは、OMe、2’MOE(メトキシ)および2’フルオロから選択される2’化学修飾を含有する。

0024

いくつかの態様において、方法は、第1用量に続き、少なくとも1回の追加用量を投与することをさらに含む。いくつかの態様において、複数回の追加用量が送達される。いくつかの態様において、追加用量は、第1用量に続き1日おきに投与される。いくつかの態様において、追加用量は、第1用量に続き週2回投与される。いくつかの態様において、追加用量は、第1用量に続き毎週投与される。いくつかの態様において、追加用量は、第1用量に続き2週間毎投与される。いくつかの態様において、追加用量は、第1用量に続き3週間毎投与される。いくつかの態様において、追加用量は、第1用量に続き毎月投与される。いくつかの態様において、追加用量は、毎日、週2回、毎週、2週間毎、3週間毎および/または毎月のいずれの組み合わせでも投与される。いくつかの態様において、ブースター用量は投与される。いくつかの態様において、ブースター用量は毎月または2カ月毎投与される。

0025

いくつかの側面において、本発明は、傷害に続く創傷治癒の速度を加速させるための、結合組織増殖因子(CTGF)をコードする遺伝子に対して指向するsiRNAの治療的有効量をヒトへ投与することによる、傷害に続く創傷治癒の速度を加速させるための方法である。
他の側面において、本発明は、傷害に続く創傷治癒の速度を加速させるための、結合組織増殖因子(CTGF)をコードする遺伝子に対して指向する核酸分子の治療的有効量をヒトへ投与することによる、傷害に続く創傷治癒の速度を加速させるための方法であり、ここで核酸分子は、傷害に先立つ72時間と傷害後48時間との間に投与される。

0026

さらに他の側面において、本発明は、傷害に続く創傷治癒の速度を加速させるための、結合組織増殖因子(CTGF)をコードする遺伝子に対して指向する核酸分子の治療的有効量を対象へ投与することによる、傷害に続く創傷治癒の速度を加速させるための方法であり、ここで核酸分子は、傷害に先立って、および、傷害後に、投与される。
傷害に続く創傷治癒の速度を加速させるための方法は、他の側面において提供される。方法は、傷害に続く創傷治癒の速度を加速させるための核酸分子の治療的有効量をヒトへ投与することを伴い、ここで核酸分子は、傷害に先立つ72時間と傷害後48時間との間に投与される。

0027

いくつかの態様において、核酸は化学修飾されたオリゴヌクレオチドである。ある態様において、瘢痕形成は、皮膚の瘢痕形成である。他の態様において、瘢痕形成は、眼の瘢痕形成である。
いくつかの態様において、核酸分子は、以下:トランスフォーミング増殖因子β(TGFβ1、TGFβ2)、オステオポンチン、結合組織増殖因子(CTGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、低酸素誘導因子−1α(HIF1α)、コラーゲンIおよび/またはIII、プロリル4−ヒドロキシラーゼ(P4H)、プロコラーゲンC−プロテアーゼ(PCP)、マトリックスメタロプロテイナーゼ2、9(MMP2、9)、インテグリン類、コネキシン、ヒスタミンH1受容体、組織トランスグルタミナーゼ、哺乳類ラパマイシン標的(mTOR)、HoxB13、VEGF、IL−6、SMADタンパク質、リボソームタンパク質S6キナーゼ(RSP6)およびシクロオキシゲナーゼ−2(COX−2)からなる群から選択されるタンパク質をコードする遺伝子に対して指向する。

0028

ある態様において、核酸分子はCTGFへ指向する。
いくつかの態様において、核酸分子は一本鎖である。他の態様において、核酸分子は二本鎖である。ある態様において、核酸分子はRNAi作用機序を介して働く。
いくつかの態様において、核酸分子は、G.mC.A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU.A*mG*mA.TEG−Chl(配列番号1)のセンス鎖配列およびP.mU.fC.fU.A.G.mA.A.mA.G.G.fU.G.mC*A*A*A*mC*A*U(配列番号2)のアンチセンス鎖配列を含むRXI−109である。いくつかの態様において、核酸分子はCTGFへ指向するsiRNAである。ある態様において、核酸分子はCTGFへ指向するアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)である。

0029

いくつかの態様において、治療的有効量は、創傷の1センチメートルあたり0.5〜20mgの間である。
いくつかの態様において、核酸分子は、皮膚への送達用に製剤化された組成物中にある。ある態様において、核酸分子は、局所送達用に製剤化された組成物中にある。いくつかの態様において、核酸分子は、皮内注射用に製剤化された組成物中にある。いくつかの態様において、核酸分子は、目への送達用に製剤化された組成物中にある。いくつかの態様において、核酸分子は、目への局所送達用に製剤化された組成物中にある。ある態様において、核酸分子は、硝子体内注射用または網膜下注射用に製剤化された組成物中にある。

0030

いくつかの態様において、方法は少なくとも第2核酸分子をさらに含み、ここで第2核酸分子は、核酸分子とは異なる遺伝子に対して指向する。
他の態様において、核酸分子はヌクレオチドから構成され、ヌクレオチドの少なくとも30%は化学修飾されている。ある態様において、核酸分子は、少なくとも1つの修飾された主鎖連結部を有し、主鎖連結部のうち少なくとも2つは、ホスホロチオアート連結部を含有する。いくつかの態様において、核酸分子はヌクレオチドから構成され、ヌクレオチドのうち少なくとも1つは、OMe、2’MOE(メトキシ)および2’フルオロから選択される2’化学修飾を含有する。

0031

ある態様において、方法は、創傷後48時間を超えてから、少なくとも第2用量の核酸分子を投与することをさらに含む。いくつかの態様において、方法は、創傷後48時間を超えてから、少なくとももう2回の用量の核酸分子を投与することをさらに含む。いくつかの態様において、創傷は皮膚移植を含む。
いくつかの態様において、核酸分子は移植ドナー部位へ投与される。いくつかの態様において、核酸分子は移植レシピエント部位へ投与される。

図面の簡単な説明

0032

図面の簡単な説明
添付の図面は、原寸で描画することを意図していない。図面において、多様な図において例示される各々同一またはほぼ同一の構成要素は、類似する数字で表わされる。明確化を目的として、全ての構成要素が全ての図面においてラベルされているわけではない。図面においては以下のとおりである:
図1は、RXI−109によるin vivoおよびin vitroでのリサーチを実証する。図1Aは、RXI−109のin vitroでの効力を実証する。
図1Bは、in vivo(ラット皮膚)での、RXI−109の2回の皮内注射後のCTGFサイレンシングを実証する。

0033

図2は、CTGFサイレンシングが、げっ歯類モデルにおいて早期創傷治癒を遅延させず、増強し得ることを実証する。図2Aは、ラットにおける予防的投薬を含む、大きな創傷を治癒する研究の概略を示す。図2Bは、in vivo(ラット皮膚)での、RXI−109の3回の皮内注射後のCTGFサイレンシングを実証する。
図2Cは、ラット皮膚におけるRXI−109の投与が、測定結果を持つ創傷によって決定された早期創傷閉鎖を遅延させないことを実証する。図2Dは、ラット皮膚におけるRXI−109の投与が、パーセント再上皮化組織学的測定結果によって決定された早期創傷閉鎖を遅延させないことを実証する。

0034

図3は、RXI−109フェーズ臨床試験の要約を示す。
図4は、RXI−109−1201フェーズ1臨床試験用の切開レイアウトの要約を示す。対象は、1対象ごとに、所定の無作為化パターンに従って、RXI−109またはプラシーボのいずれかの単回皮内注射を受けた。部位の半数がRXI−109で、もう半分がプラシーボで処置された。
図5は、切開から84日後の創傷エリアの、RXI−109−1201からの予備式組織学データを示す。切開部位の画像は、上の組織学データに示される。正常なおよび処置された皮膚サンプル生検は、組織学的評価用に、創傷から84日後に、対象から採られた。創傷エリアおよびCTGFレベルは、1サンプルごとに決定された。

0035

図6は、切開から84日後の、下方切開部位からの、1部位あたり3つの切片からの、創傷エリアの合計の予備の盲式組織学データを示す。正常なおよび処置された皮膚サンプルの生検は、組織学的評価用に、創傷から84日後に、対象から採られた。創傷エリアおよびCTGFレベルは、1サンプルごとに決定された。

0036

図7は、切開から84日後の、創傷エリア、CTGF染色およびa−SMA染色の、RXI−109−1201からの予備の盲式組織学データを示す(倍率20×)。正常なおよび処置された皮膚サンプルの生検は、組織学的評価用に、創傷から84日後に、対象から採られた。創傷エリアおよびCTGFレベルは、1サンプルごとに決定された。

0037

図8は、RXI−109−1201フェーズ1臨床試験用の切開レイアウトの要約を示す。対象は、1対象ごとに、所定の無作為化パターンに従って、2週間にわたり、RXI−109またはプラシーボのいずれかの3回皮内注射を受けた。部位の半数がRXI−109で、もう半分がプラシーボで処置された。
図9は、RXI−109−1201フェーズ1臨床試験からの、切開から18日後(第3回かつ最終回の用量から3日後)の対象の切開部位の画像を示す。提示されたデータは盲式であり、コードはブレークされていない。

0038

図10は、切開から18日後(第3回かつ最終回の用量から3日後)の対象の切開部位の画像、ならびに、RXI−109−1201フェーズ1臨床試験からの各切開部位からの対応する相対的CTGFのmRNAレベルを示す。提示されたデータは盲式であり、コードはブレークされていない。正常なおよび処置された皮膚サンプルの生検は、CTGFのmRNAレベルの評価用に、創傷から18日後に対象から採られた。CTGFおよびハウスキーピングmRNAレベルは、qPCR(taqman ProbesABI)を使用して決定された。

0039

図11は、RXI−109フェーズ2臨床試験:研究RXI−109−1301の要約を示す。研究RXI−109−1301は、以下:複数施設の、前向きの(Prospective)、無作為化の、二重盲式の、健常成人における既往手術に起因する下腹部上に横断する肥厚性瘢痕に対する瘢痕修正手術成果に対するRXI−109の有効性および安全性を評価する対象内対照フェーズ2a研究からなった。以下:対・ビヒクルの安全性&副作用、および、対・ビヒクルの写真比較を含む、複数のパラメータが評価された。

0040

図12は、RXI−109−1301フェーズ2臨床試験用の、修正された瘢痕断片レイアウトの要約を示す。対象は、2週間にわたり、1対象ごとに、所定の無作為化パターンに従って、RXI−109またはプラシーボのいずれかの3回の皮内注射を受けた(修正された瘢痕断片のうち中央断片は無処置のままであった)。修正された瘢痕断片(RまたはL)の一部分は、RXI−109で処置された一方、他の部分(RまたはL)はプラシーボで処置された。
図13は、盲式評価者による写真の1カ月中間分析を示す。評価者は、(a)どちら側(左または右)がより良好に見えるか、または、差異がないかで選択すること、(b)0(ファインライン(fine line)の瘢痕)から10(可能な限り最悪な瘢痕)までのVASスコアを提供すること、が求められた。

0041

図14は、盲式評価者による写真の1カ月中間分析を示す。
図15は、コホート1における対象からの、外科手術前のおよび修正から1カ月後の瘢痕断片の写真を示す。
図16は、コホート2における対象からの、外科手術前のおよび修正から1カ月後の瘢痕断片の写真を示す。

実施例

0042

詳細な説明
本発明の側面は、遺伝子サイレンシングに関与する方法および組成物に関する。本発明は、皮内注射または皮下投与を通じて、などのsd−rxRNA分子の皮膚への投与が、皮膚における遺伝子発現の効率的なサイレンシングをもたらすという驚くべき発見に、少なくとも部分的に基づく。さらに本発明の側面は、瘢痕形成が、創傷の72時間前と創傷の24時間後との間に治療的有効量の核酸分子を対象へ投与することによって、対象において低減され得るという驚くべき発見に、少なくとも部分的に基づく。sd−rxRNAは、易感染性の皮膚の処置において大きな潜在的可能性を秘めた治療用RNAi分子の新しいクラスを代表する。

0043

本明細書に使用される「核酸分子」は、これらに限定されないが:sd−rxRNA、rxRNAori、オリゴヌクレオチド、ASO、siRNA、shRNA、miRNA、ncRNA、cp−lasiRNA、aiRNA、BMT−101、RXI−109、EXC−001、一本鎖核酸分子二本鎖核酸分子、RNAおよびDNAを含む。いくつかの態様において、核酸分子は、化学修飾されたオリゴヌクレオチドなどの、化学修飾されたオリゴヌクレオチドである。
本明細書に使用される「創傷」は、これらに限定されないが、傷害、心的外傷、外科手術、易感染性の皮膚および熱傷(burn)を含む。

0044

sd−rxRNA分子
本発明の側面は、sd−rxRNAメートル分子に関する。本明細書に使用される「sd−rxRNA」または「sd−rxRNA分子」は、自己送達型RNA分子、例えば2009年9月22日に出願されたPCT公開第WO2010/033247号(出願第PCT/US2009/005247号)、表題「低減されたサイズの自己送達型RNAi化合物」、2014年8月5日に特許付与された米国特許第8,796,443号、表題「低減されたサイズの自己送達型RNAi分子」、2009年9月22日に出願されたPCT出願第PCT/US2009/005246号、表題「皮膚適応におけるRNA干渉」、および、2014年3月4日に特許付与された米国特許第8,644,189号、表題「皮膚適応におけるRNA干渉」に記載され、参考として組み込まれたものなど、を指す。

0045

簡単に述べると、sd−rxRNA(sd−rxRNAナノとも呼ばれる)は、最小長が16ヌクレオチドのガイド鎖および8〜18ヌクレオチド長パッセンジャー鎖を含む、単離された非対称二本鎖核酸分子であって、ここで二本鎖核酸分子は二本鎖領域および一本鎖領域を有し、一本鎖領域は4〜12ヌクレオチド長を有し、かつ、少なくとも3つのヌクレオチド主鎖修飾を有する。好ましい態様において、二本鎖核酸分子は、平滑である1末端を有するか、または、1つもしくは2つのヌクレオチド突出を含む。sd−rxRNA分子は、化学修飾を通じて、いくつかの例において疎水性抱合体の付着を通じて、最適化され得る。

0046

いくつかの態様において、sd−rxRNAは、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖を含む単離された二本鎖核酸分子を含み、ここで二本鎖である分子の領域は8〜15ヌクレオチド長であり、ここでガイド鎖は4〜12ヌクレオチド長の一本鎖領域を含有し、ここでガイド鎖の一本鎖領域は3、4、5、6、7、8、9、10、11または12個のホスホロチオアート修飾を含有し、およびここで、二本鎖核酸のヌクレオチドの少なくとも40%は修飾されている。

0047

本発明のポリヌクレオチドは、本明細書において、本発明の、単離された二本鎖またはデュプレックス核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、ナノ分子、ナノRNA、sd−rxRNAナノ、sd−rxRNAまたはRNA分子を指す。
sd−rxRNAは、従来のsiRNAと比較して、はるかに効果的に細胞によって取り込まれる。これらの分子は、標的遺伝子のサイレンシングにおいて高度に効率的であって、血清の存在下における高活性、効率的な自己送達、多様なリンカーとの適合性、および、毒性に関連する化学修飾の存在の減少または完全な欠如を含む、以前に記載されたRNAi分子を凌駕する大きな利点を与える。

0048

一本鎖ポリヌクレオチドとは対照的に、デュプレックスポリヌクレオチドは伝統的に細胞への送達が困難であったが、それは、これらが強固な構造および多数の負の電荷を有するために、その膜輸送が困難になっているからである。しかしながら、sd−rxRNAは、部分的に二本鎖であるにも拘わらず、in vivoで一本鎖として認識され、したがって、細胞膜を超えて効率的に送達されることが可能である。その結果、本発明のポリヌクレオチドは、多くの例において自己送達が可能である。よって、本発明のポリヌクレオチドは、従来のRNAi剤と同様の様式において製剤化されても、あるいは、細胞または対象へ単独で(または非送達型キャリアとともに)送達されてもよく、自己送達を可能にする。本発明の一態様において、分子の一部分が従来のRNAデュプレックスに類似し、分子の第2の部分が一本鎖である、自己送達型非対称二本鎖RNA分子が提供される。

0049

本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの側面において、二本鎖領域と5ヌクレオチドまたはそれより長い一本鎖領域とを含む非対称構造と、具体的な化学修飾パターンとの組み合わせを有し、親油性または疎水性の分子に抱合される。このクラスのRNAi様化合物は、in vitroおよびin vivoで優れた効力を有する。強固なデュプレックス領域のサイズの低減が、一本鎖領域へ適用されるホスホロチオアート修飾と組み合わせられると、観察される優れた効力に寄与すると考えられる。

0050

本発明は、sd−rxRNA分子が、皮内注射および皮下投与を含む種々の方法を通じて、in vivoで効率的に皮膚へ送達されるという驚くべき発見に、少なくとも部分的に基づく。その上、sd−rxRNA分子は、これらが標的化された皮膚の領域において、遺伝子サイレンシングを媒介するのに効率的である。

0051

sd−rxRNAを皮膚へ効果的に投与し、遺伝子発現をサイレンシングする方法は、2014年3月4日に特許付与された米国特許第8,664,189号、表題「皮膚への適応におけるRNA干渉」、2013年4月4日に出願された米国特許公開第US2014/0113950号、表題「皮膚および線維症への適応におけるRNA干渉」、2009年9月22日に出願されたPCT公開第WO 2010/033246号、表題「皮膚への適応におけるRNA干渉」、ならびに、2011年3月24日に出願されたPCT公開第WO2011/119887号、表題「皮膚および線維症への適応におけるRNA干渉」において実証されている。上で参考とされた特許および刊行物の各々は、それらの全体を参考として本明細書に組み込まれる。

0052

例えば、米国特許公開第US2014/0113950号中の図42は、in vivoでのRXi−109の皮内注射(ラット皮膚)の前の、RXI−109(CTGFを標的化するsd−rxRNA)の2回の皮内注射に続く、CTGFサイレンシングを実証する。提示されたデータは、ラット真皮における切除による創傷モデルを使用する研究からのものである。RXI−109の2回の皮内注射に続き、CTGF・対・非標的化対照のサイレンシングは少なくとも5日間持続した。CTGFのmRNAの低減は、用量依存的:同用量の非標的化対照と比較して、300および600μgに対し、夫々51および67%であった。方法:RXI−109または非標的化対照(NTC)が、第1および3日に、ラット背上の4部位の各々への皮内注射(200μL注射につき300または600μg)によって投与された。4mmの切除による創傷が、第2用量(第3日)の30分後に、各注射部位にてなされた。創傷部位を包含し、組織を取り囲む末端生検サンプルが第8日に収集された。RNAが単離され、qPCRによる遺伝子発現分析へ供された。データは、TATAボックス結合タンパク質(TBP)ハウスキーピング遺伝子のレベルに対し正規化され、1.0に設定されたPBSビヒクル対照に対してグラフ化される。エラーバーは、個々の生検サンプル間の標準偏差を表す。RXI−109で処置された群・対・同用量の非標的化対照群P値は、600μgでは**p<0.001であり、300μgでは*p<0.01であった。

0053

本明細書に開示されるsd−rxRNA分子が、米国特許公開第US2014/0113950号(その全体が参考として組み込まれる)に開示されるsd−rxRNA分子と同じ様式で皮膚へ投与され得ることが理解されるべきである。

0054

本発明の側面は、SPP1、CTFG、PTGS2、TGFB1およびTGFB2を含む遺伝子のサブセットを標的とする強力なsd−rxRNA分子などの強力なsd−rxRNA分子を同定するための細胞ベーススクリーニングの使用に関する。いくつかの態様において、標的遺伝子が選択され、その遺伝子内に最適な標的配列を同定するためのアルゴリズムが適用される。例えば多くの配列が、1遺伝子に対して選択され得る。いくつかの例において、同定された配列は、試験の第1ラウンド用のRNAi化合物として生成される。例えば、最適な予測配列に基づくRNAi化合物は、スクリーニングの第1ラウンド用のrxRNAori(「ori」)配列として、最初に生成され得る。強力なRNAi化合物の同定後に、これらは、sd−rxRNA分子として生成され得る。

0055

本発明に従って製剤化されたdsRNAはまた、rxRNAoriも含む。rxRNAoriは、2009年2月11日に出願されたPCT公開第WO2009/102427号(出願第PCT/US2009/000852号)、表題「修飾されたRNAiポリヌクレオチドおよびその使用」ならびに2011年2月17日に公開された米国特許公開第US 2011-0039914号、表題「修飾されたRNAiポリヌクレオチドおよびその使用」に記載され、参考として組み込まれた、RNA分子のクラスを指す。

0056

いくつかの態様において、rxRNAori分子は、標的遺伝子の発現を阻害するための、12〜35ヌクレオチド長の二本鎖RNA(dsRNA)コンストラクトを含み、これは以下を含む:5’末端および3’末端を有するセンス鎖、ここでセンス鎖は2’修飾リボース糖により高度に修飾され、ここでセンス鎖の中心部分における3〜6個のヌクレオチドは2’修飾リボース糖により修飾されておらず、および、5’末端および3’末端を有するアンチセンス鎖、これはセンス鎖および標的遺伝子のmRNAにハイブリダイズしており、ここでdsRNAは標的遺伝子の発現を、配列に依存的な様式で阻害する。

0057

rxRNAoriは、本明細書に記載の修飾をいずれも含有し得る。いくつかの態様において、rxRNAoriのヌクレオチドの少なくとも30%は修飾されている。例えば、rxRNAoriのヌクレオチドの少なくとも30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%が修飾されている。いくつかの態様において、sd−rxRNAのヌクレオチドの100%が修飾されている。いくつかの態様において、rxRNAoriのパッセンジャー鎖しか修飾を含有しない。

0058

いくつかの態様において、本発明のRNAi化合物は、デュプレックス領域(8〜15塩基長が効率的なRISC侵入に必要とされる)および4〜12ヌクレオチド長の一本鎖領域を含む非対称化合物を含み;13または14ヌクレオチドのデュプレックスを持つ。6または7ヌクレオチドの一本鎖領域が、いくつかの態様において好ましい。新しいRNAi化合物の一本鎖領域はまた、2〜12のホスホロチオアートのヌクレオチド間連結部(ホスホロチオアート修飾として言及される)をも含む。6〜8のホスホロチオアートヌクレオチド間連結部が、いくつかの態様において好ましい。加えて、本発明のRNAi化合物はまた、ユニークな化学修飾パターンをも含み、これは安定性を提供し、RISC侵入に適合する。これらの要因の組み合わせが、in vitroおよびin vivoでのRNAi試薬の送達に高度に有用である、予想外の特性をもたらした。

0059

安定性を提供し、かつ、RISC侵入に適合する、化学修飾されたパターンは、センス鎖またはパッセンジャー鎖ならびにアンチセンス鎖またはガイド鎖への修飾を含む。例えば、パッセンジャー鎖は、安定性を確実にし、かつ、活性に干渉しない、いずれの化学的実体によっても、修飾され得る。かかる修飾は、2’リボ修飾(O−メチル、2’F、2デオキシ等)およびホスホロチオアート修飾のような主鎖修飾を含む。パッセンジャー鎖における好ましい化学修飾パターンは、パッセンジャー鎖内のCおよびUヌクレオチドのOメチル修飾を含む。代わりに、パッセンジャー鎖は完全にOメチル修飾されてもよい。

0060

ガイド鎖はまた、例えば、RISC侵入に干渉せずに、安定性を確実にするいずれの化学修飾によっても修飾されてもよい。ガイド鎖における好ましい化学修飾パターンは、CおよびUヌクレオチドの大多数が2’F修飾され、かつ、5’末端がリン酸化されているものを含む。ガイド鎖における別の好ましい化学修飾パターンは、1位と11〜18位のC/Uとの2’Oメチル修飾および5’末端の化学的リン酸化を含む。ガイド鎖におけるさらに別の好ましい化学修飾パターンは、1位と11〜18位のC/Uとの2’Oメチル修飾および5’末端の化学的リン酸化ならびに2〜10位におけるC/Uの2’F修飾を含む。いくつかの態様において、パッセンジャー鎖および/またはガイド鎖は、少なくとも1つの5−メチルCまたはU修飾を含有する。

0061

いくつかの態様において、sd−rxRNA中のヌクレオチドのうち少なくとも30%が修飾されている。例えば、sd−rxRNA中のヌクレオチドのうち少なくとも30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%が修飾されている。いくつかの態様において、sd−rxRNA中のヌクレオチドの100%が修飾されている。
本発明のオリゴヌクレオチドの上記の化学修飾パターンは、良好な耐性を示し、非対称RNAi化合物の効力を実際に改善した。

0062

RNAiへの修飾の組み合わせは、ポリヌクレオチドにおいてともに使用されるとき、RNAiの受動的取り込みにおける最適な効力の達成をもたらし得る。記載された構成要素(ガイド鎖の安定化、ホスホロチオアートの伸長、センス鎖の安定化および疎水性抱合体)のいずれかの排除、またはいくつかの例において、サイズの増加は、準最適な効力をもたらし、いくつかの例において、効力の完全な喪失をもたらす。要素の組み合わせは、HeLa細胞などの細胞への受動的送達の後であっても十分に活性がある化合物の開発をもたらす。
下に提示される例におけるデータは、本発明のオリゴヌクレオチドの、in vitroおよびin vivoでの両方における、高い効力を実証する。

0063

sd−rxRNAは、いくつかの例において、新規の型の化学的性質(chemistries)を使用して化合物の疎水性を改善することにより、さらに改善され得る。例えば、1つの化学的性質は、疎水性塩基修飾の使用に関する。あらゆる位置におけるあらゆる塩基が、修飾が塩基の分配係数の増大をもたらす限りにおいて、修飾されてもよい。修飾の化学的性質のための好ましい位置は、ピリミジンの4位および5位である。これらの位置の主要な利点は、(a)合成の容易性、および、(b)RISC複合体のローディングおよび標的認識のために必須である、塩基対形成およびA型らせん(A form helix)形成への干渉がないこと、である。複数のデオキシウリジンが全体的な化合物の効力に干渉せずに存在するsd−rxRNA化合物のバージョンが使用された。加えて、組織分布および細胞取り込みにおける主要な改善は、疎水性抱合体の構造を最適化することにより得られ得る。好ましい態様のいくつかにおいて、ステロールの構造は、C17に付着された鎖(C17 attached chain)を変える(増大する/減少する)ように修飾される。この型の修飾は、in vivoでの細胞取り込みの大きな増大を、および、組織取り込み成功率(prosperities)の改善をもたらす。

0064

本発明の側面は、sd−rxRNAおよびrxRNAoriなどの二本鎖リボ核酸分子(dsRNA)に関する。本発明に関連するdsRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み得、ここでアンチセンス鎖は、表2、5、6、9、11、12、13、14、15、16、17および23内の配列から選択される配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドに相補的であり、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号から参考として組み込まれる。例えば、アンチセンス鎖は、少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24個の連続したヌクレオチドに相補的であり得るか、または、表2、5、6、9、11、12、13、14、15、16、17および23内の配列から選択される配列の25個のヌクレオチドに相補的であり得、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号から参考として組み込まれる。

0065

本発明に関連するdsRNAは、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み得、ここでセンス鎖および/またはアンチセンス鎖は、表1〜27内の配列から選択される配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドを含み、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号から参考として組み込まれる。例えば、センス鎖および/またはアンチセンス鎖は、少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23または24個の連続したヌクレオチドを含み得るか、または、表1〜27内の配列から選択される配列の25個のヌクレオチドを含み得、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号から参考として組み込まれる。

0066

本発明の側面は、CTGFに対して指向するdsRNAに関する。例えば、CTGFに対して指向するdsRNAのアンチセンス鎖は、表11、12および15内の配列から選択される配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドに相補的であり得、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号から参考として組み込まれる。CTGFに対して指向するdsRNAのセンス鎖および/またはアンチセンス鎖は、表10、11、12、15、20および24内の配列から選択される配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドを含み得、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号から参考として組み込まれる。

0067

いくつかの態様において、センス鎖は、配列番号2463、3429、2443、3445、2459、3493、2465、3475および3469からなる群から選択される配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドを含み、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号から参考として組み込まれる。ある態様において、センス鎖は、配列番号2463、3429、2443、3445、2459、3493、2465、3475および3469からなる群から選択される配列を含むか、または、これらからなり、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号から参考として組み込まれる。

0068

いくつかの態様において、アンチセンス鎖は、2464、3430、4203、3446、2460、3494、2466、3476および3470からなる群から選択される配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドを含み、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号から参考として組み込まれる。ある態様において、アンチセンス鎖は、2464、3430、4203、3446、2460、3494、2466、3476および3470からなる群から選択される配列を含むか、または、これらからなり、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号から参考として組み込まれる。

0069

好ましい態様において、センス鎖は(GCACCUUUCUAGA)(配列番号3)を含み、アンチセンス鎖は(UCUAGAAAGGUGCAAACAU)(配列番号4)を含み、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号における配列番号2463および2464夫々から参考として組み込まれる。配列番号3および配列番号4の配列は、本明細書に記載の修飾に従い様々な様式で修飾され得る。配列番号3に好ましい修飾パターンは、(G.mC.A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU.A*mG*mA.TEG−Chl)(配列番号1)に示され、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号における配列番号3429から参考として組み込まれる。

0070

配列番号4に好ましい修飾パターンは、(P.mU.fC.fU.A.G.mA.A.mA.G.G.fU.G.mC*A*A*A*mC*A*U)(配列番号2)に示され、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号における配列番号3430から参考として組み込まれる。(G.mC.A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU.A*mG*mA.TEG−Chl)(配列番号1)のセンス鎖および(P.mU.fC.fU.A.G.mA.A.mA.G.G.fU.G.mC*A*A*A*mC*A*U)(配列番号2)のアンチセンス鎖からなるsd−rxRNAはまた、RXi−109とも呼ばれ、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号に記載され、それらから参考として組み込まれる。TEG−Chlは、TEGリンカーを持つコレステロールを指し;mは2’OMeを指し;fは2’フルオロを指し;*はホスホロチオアート連結部を指し;および.は、ホスホジエステル連結部を指し;Pはリン酸化を表す。

0071

別の好ましい態様において、センス鎖は(UUGCACCUUUCUAA)(配列番号5)を含み、アンチセンス鎖は(UUAGAAAGGUGCAAACAAGG)(配列番号6)を含み、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号における配列番号2443および4203夫々から参考として組み込まれる。配列番号5および配列番号6の配列は、本明細書に記載の修飾に従い様々な様式で修飾され得る。配列番号5に好ましい修飾パターンは、(mU.mU.G.mC.A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU*mA*mA.TEG−Chl)(配列番号7)に示され、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号における配列番号3445から参考として組み込まれる。配列番号6に好ましい修飾パターンは、(P.mU.fU.A.G.A.mA.A.G.G.fU.G.fC.mA.mA*mA*fC*mA*mA*mG*G.)(配列番号8)に示され、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号における配列番号3446から参考として組み込まれる。

0072

別の好ましい態様において、センス鎖は(GUGACCAAAAGUA)(配列番号9)を含み、アンチセンス鎖は(UACUUUUGGUCACACUCUC)(配列番号10)を含み、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号における配列番号2459および2460夫々から参考として組み込まれる。配列番号9および配列番号10の配列は、本明細書に記載の修飾に従い様々な様式で修飾され得る。配列番号9に好ましい修飾パターンは、(G.mU.G.A.mC.mC.A.A.A.A.G*mU*mA.TEG−Chl)(配列番号11)に示され、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号における配列番号3493から参考として組み込まれる。配列番号10に好ましい修飾パターンは、(P.mU.A.fC.fU.fU.fU.fU.G.G.fU.mC.A.mC*A*mC*mU*mC*mU*C.)(配列番号12)に示され、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号における配列番号3494から参考として組み込まれる。

0073

別の好ましい態様において、センス鎖は(CCUUUCUAGUUGA)(配列番号13)を含み、アンチセンス鎖は(UCAACUAGAAAGGUGCAAA)(配列番号14)を含み、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号における配列番号2465および2466夫々から参考として組み込まれる。配列番号13および配列番号14の配列は、本明細書に記載の修飾に従い様々な様式で修飾され得る。配列番号13に好ましい修飾パターンは、(mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU.A.G.mU.mU*mG*mA.TEG−Chl)(配列番号15)に示され、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号における配列番号3469から参考として組み込まれる。配列番号14に好ましい修飾パターンは、(P.mU.fC.A.A.fC.fU.A.G.A.mA.A.G.G*fU*mG*fC*mA*mA*A.)(配列番号16)に示され、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号における配列番号3470から参考として組み込まれる。

0074

別の好ましい態様において、センス鎖は、配列番号1(G.mC.A.mC.mC.mU.mU.mU.mC.mU.A*mG*mA.TEG−Chl)を含み、アンチセンス鎖は、配列番号17(P.mU.fC.fU.A.G.mA.A.mA.G.G.fU.G.fC*mA*mA*mA*fC*mA*U.)を含み、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号における配列番号3475および3476夫々から参考として組み込まれる。

0075

CTGFに対して指向するrsRNAoriの好ましい態様は、配列番号1835、1847、1848および1849からなる群から選択される配列の少なくとも12個の連続したヌクレオチドを含み得、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号から参考として組み込まれる。いくつかの態様において、rsRNAoriのセンス鎖は、配列番号1835、1847、1848および1849を含むか、または、これらからなり、これは、PCT公開第WO 2011/119887号および米国特許公開第US2014/0113950号から参考として組み込まれる。
本発明の側面は、sd−rxRNAおよびrxRNAoriなどのdsRNAを含む組成物に関する。いくつかの態様において、組成物は、異なる遺伝子に対して指向する2以上のdsRNAを含む。

0076

いくつかの態様において、核酸分子はsiRNAである。「RNAi」は、用語「RNA干渉」のために文献中に使用される略称であるが、それは一般に、細胞中の標的遺伝子の発現が、標的遺伝子に相補的な配列を有する二本鎖RNA分子を加えることによって干渉される、細胞過程を指す。低分子干渉RNA(siRNA)化合物は典型的に、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の両方を含有する二本鎖RNAデュプレックスである。典型的なsiRNAのデュプレックス長は13〜30塩基対である。デュプレックスは、平滑末端であっても、突出を含有しても、実質的に(innature)非対称(例として一本鎖領域(単数または複数)を含有する)であってもよい。siRNAの化学修飾は、siRNAの安定性を増強し、免疫刺激を低減し、細胞透過特性を増大することが共通する。

0077

一本鎖siRNAはまた、文献にも記載される
いくつかの態様において、核酸分子はアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)である。ASOは一本鎖化合物であり、典型的には7〜25ヌクレオチド長であり、安定化修飾で装飾されている。典型的なASO(ギャップマー(gapmer)としても知られる)は、〜20ヌクレオチドの長さであり、5’および3’末端上に末端ブロッキング基(2’Oメトキシ)ならびに中央にDNAを含有する。加えて、ASOは典型的には、十分にホスホロチオアート化されている。

0078

本発明は、その適用に関して、以下の説明において記載されるかまたは図面において例示される構成および構成要素の配置の詳細に限定されない。本発明は、他の態様および多様な方法において実施されるかまたは行われることが可能である。また、本明細書に使用される用語および専門用語は、説明を目的とするものであり、限定するものとしてみなされるべきではない。本明細書における「含む(including)」、「含む(comprising)」または「有する(having)」、「含有する(containing)」、「伴う(involving)」およびそれらの変化形の使用は、その後に列挙される項目およびその均等物ならびに追加の項目を包含することを意味する。

0079

よって、本発明の側面は、ガイドアンチセンス)鎖およびパッセンジャーセンス)鎖を含む、単離された二本鎖核酸分子に関する。本明細書に使用される用語「二本鎖」は、ヌクレオモノマーの少なくとも一部が相補的であり、二本鎖領域を形成するように水素結合されている、1または2以上の核酸分子を指す。いくつかの態様において、ガイド鎖の長さは、16〜29ヌクレオチド長の範囲である。ある態様において、ガイド鎖は、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28または29ヌクレオチド長である。ガイド鎖は標的遺伝子に対して相補性を有する。ガイド鎖と標的遺伝子との間の相補性は、ガイド鎖のいずれの部分にわたっても存在することができる。本明細書に使用される相補性は、ガイド鎖が標的に対してRNAiを媒介できるように十分に相補的である限りにおいて、完全な相補性であっても、より不完全な相補性であってもよい。いくつかの態様において、相補性とは、ガイド鎖と標的との間の、25%、20%、15%、10%、5%、4%、3%、2%または1%未満のミスマッチを指す。

0080

完全な相補性とは、100%の相補性を指す。よって、本発明は、遺伝子変異系統多型、または、進化による分岐に起因して予測可能な配列の変化に耐性を示すことができるという利点を有する。例えば、標的配列と比較して挿入、欠失および単一の点変異を有するsiRNAもまた、阻害について有効であることが見出されている。さらに、siRNAの全ての部位が標的の認識について同等に寄与するわけではない。siRNAの中心におけるミスマッチは最も重要であり、本質的に(essentially)標的RNAの切断を無効化する。アンチセンス鎖に関して、中心の上流または切断部位の上流におけるミスマッチは、耐性を示すが、標的RNAの切断を著しく低減する。アンチセンス鎖に関して、中心または切断部位の下流におけるミスマッチ、好ましくは3’末端の付近、例えばアンチセンス鎖の3’末端から1、2、3、4、5または6ヌクレオチドに位置するものは、耐性を示し、標的RNAの切断をごく僅かしか低減しない。

0081

いかなる特定の理論によっても拘束されることを望まないが、いくつかの態様において、ガイド鎖は、少なくとも16ヌクレオチドの長さであり、RISC中でアルノートタンパク質をアンカーする。いくつかの態様において、ガイド鎖がRISC中へロードするとき、これは明確なシード領域を有し、標的mRNAの切断は、ガイド鎖の10〜11位にわたって行われる。いくつかの態様において、ガイド鎖の5’末端は、リン酸化されているかまたはリン酸化されることができる。本明細書に記載される核酸分子は、最短トリガーRNA(minimum trigger RNA)として言及される場合もある。

0082

いくつかの態様において、パッセンジャー鎖の長さは、8〜15ヌクレオチド長の範囲である。ある態様において、パッセンジャー鎖は、8、9、10、11、12、13、14または15ヌクレオチド長である。パッセンジャー鎖は、ガイド鎖に対して相補性を有する。パッセンジャー鎖とガイド鎖との間の相補性は、パッセンジャーまたはガイド鎖のいずれの部位にわたっても存在してもよい。いくつかの態様において、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間には、分子の二本鎖領域内に100%の相補性が存在する。

0083

本発明の側面は、最小二本鎖領域を有する二本鎖核酸分子に関する。いくつかの態様において、分子の二本鎖である領域は、8〜15ヌクレオチド長の範囲である。ある態様において、分子の二本鎖である領域は、8、9、10、11、12、13、14または15ヌクレオチド長である。ある態様において、二本鎖領域は、13または14ヌクレオチド長である。ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に100%の相補性が存在してもよく、または、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との間に1または2以上のミスマッチが存在してもよい。いくつかの態様において、二本鎖分子の一方の末端において、分子は、平滑末端であるかまたは1ヌクレオチドの突出を有する。分子の一本鎖領域は、いくつかの態様において、4〜12ヌクレオチド長である。例えば、一本鎖領域は、4、5、6、7、8、9、10、11または12ヌクレオチド長であってよい。しかしながら、ある態様において、一本鎖領域はまた、4ヌクレオチド長未満であっても、または、2ヌクレオチド長より長くてもよい。ある態様において、一本鎖領域は6ヌクレオチド長である。

0084

本発明に関連するRNAiコンストラクトは、−13kkal/mol未満の熱力学的安定性(ΔG)を有することができる。いくつかの態様において、熱力学的安定性(ΔG)は、−20kkal/mol未満である。いくつかの態様において、(ΔG)が−21kkal/mol未満となったとき、効力の喪失が存在する。いくつかの態様において、−13kkal/molより高い(ΔG)値は、本発明の側面に適合性である。いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、いくつかの態様において、相対的に高い(ΔG)値を有する分子は、相対的に高い濃度において活性になる場合があり、一方、相対的に低い(ΔG)値を有する分子は、相対的に低い濃度において活性になる場合がある。いくつかの態様において、(ΔG)値は、−9kkcal/molよりも高くてもよい。最小二本鎖領域を有する本発明に関連するRNAiコンストラクトにより媒介される遺伝子サイレンシング効果は予測できないが、それは、ほぼ同一の設計であるが熱力学的安定性がより低い分子は、不活性であることが示されているからである(Rana et al. 2004)。

0085

いかなる理論によっても拘束されることを望まないが、本明細書に記載される結果は、dsRNAまたはdsDNAの8〜10bpの伸長が、RISCのタンパク質構成要素またはRISCのコファクターにより構造的に認識されるであろうことを示唆する。さらに、タンパク質構成要素により感受され得るか、および/または、かかる構成要素と相互作用するために十分に安定であり得、その結果アルゴノートタンパク質中へロードされ得る、トリガー化合物(triggering compound)のためのフリーエネルギー要求が存在する。最適な熱力学が存在して、好ましくは少なくとも8ヌクレオチドである二本鎖部分が存在する場合、デュプレックスは認識され、RNAi機構中にロードされるであろう。

0086

いくつかの態様において、熱力学的安定性は、LNA塩基の使用を通して増大する。いくつかの態様において、追加の化学修飾が導入される。化学修飾の数個非限定例は、5’ホスファート、2’−O−メチル、2’−O−エチル、2’−フルオロ、リボチミジン、C−5プロピニル−dC(pdC)およびC−5プロピニル−dU(pdU);C−5プロピニル−C(pC)およびC−5プロピニル−U(pU);5−メチルC、5−メチルU、5−メチルdC、5−メチルdUメトキシ、(2,6−ジアミノプリン)、5’−ジメトキシトリチル−N4−エチル−2’−デオキシシチジンおよびMGB(副溝結合剤)を含む。同一分子内で1つより多くの化学修飾を組み合わせられ得ることが、理解されるべきである。

0087

本発明に関連する分子は、効力の増大および/または毒性の低減のために、最適化される。例えば、ガイドおよび/またはパッセンジャー鎖のヌクレオチドの長さ、および/または、ガイドおよび/またはパッセンジャー鎖におけるホスホロチオアート修飾の数は、いくつかの側面においてRNA分子の効力に影響を及ぼし、一方、2’−フルオロ(2’F)修飾を2’−O−メチル(2’OMe)修飾により置き換えることは、いくつかの側面において分子の毒性に影響を及ぼす。具体的には、分子の2’F含有物の低減は、分子の毒性を低下させると予測される。例のセクションは、2’F修飾が排除された分子を提示し、先に記載のRNAi化合物に対して、予測される毒性の低減に起因する利点を提供する。さらに、RNA分子中のホスホロチオアート修飾の数は、細胞内への分子の取り込み、例えば細胞内への分子の受動的取り込みの効率に影響を及ぼし得る。本明細書に記載される分子の好ましい態様は、2’F修飾を有さず、なお細胞取り込みおよび組織への浸透における同等の効力により特徴づけられる。かかる分子は、2’Fの大量使用により重度に修飾されたAccellおよびWolfrumにより記載される分子などの先行技術に対して、顕著な改善を表わす。

0088

いくつかの態様において、ガイド鎖は、およそ18〜19ヌクレオチドの長さであり、およそ2〜14のホスファート修飾を有する。例えば、ガイド鎖は、ホスファート修飾された2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または14より多くのヌクレオチドを含有し得る。ガイド鎖は、RISC侵入に干渉せずに安定性を増大させる1以上の修飾を含有してもよい。ホスホロチオアート修飾ヌクレオチドなどのホスファート修飾ヌクレオチドは、3’末端にあっても、5’末端にあっても、または、ガイド鎖全体に広がっていてもよい。いくつかの態様において、ガイド鎖の3’末端の10ヌクレオチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10のホスホロチオアート修飾ヌクレオチドを含有する。

0089

ガイド鎖はまた、2’Fおよび/または2’OMe修飾を含有し得るが、これは、分子全体を通して位置され得る。いくつかの態様において、ガイド鎖の1位のヌクレオチド(ガイド鎖の最も5’の位置におけるヌクレオチド)は、2’OMe修飾されているか、および/または、リン酸化されている。ガイド鎖中のCおよびUヌクレオチドは、2’F修飾され得る。例えば、19ntのガイド鎖の2〜10位(または異なる長さの鎖における対応する位置)におけるCおよびUヌクレオチドは、2’F修飾され得る。ガイド鎖中のCおよびUヌクレオチドもまた、2’OMe修飾され得る。

0090

例えば、19ntのガイド鎖の11〜18位(または異なる長さの鎖における対応する位置)におけるCおよびUヌクレオチドは、2’OMe修飾され得る。いくつかの態様において、ガイド鎖の最も3’末端におけるヌクレオチドは、未修飾である。ある態様において、ガイド鎖中のCおよびUの大部分は、2’F修飾されており、ガイド鎖の5’末端はリン酸化されている。他の態様において、1位、および、11〜18位におけるCまたはUは、2’OMe修飾されており、ガイド鎖の5’末端はリン酸化されている。他の態様において、1位、および、11〜18位におけるCまたはUは、2’OMe修飾されており、ガイド鎖の5’末端はリン酸化されており、2〜10位におけるCまたはUは2’F修飾されている。

0091

いくつかの側面において、最適なパッセンジャー鎖は、およそ11〜14ヌクレオチドの長さである。パッセンジャー鎖は、安定性を増大させる修飾を含有してもよい。パッセンジャー鎖における1以上のヌクレオチドは、2’OMe修飾され得る。いくつかの態様において、パッセンジャー鎖における1以上のCおよび/またはUヌクレオチドが2’OMe修飾されているか、または、パッセンジャー鎖におけるCおよびUヌクレオチドの全てが2’OMe修飾されている。ある態様において、パッセンジャー鎖における全てのヌクレオチドが2’OMe修飾されている。パッセンジャー鎖上の1以上のヌクレオチドはまた、ホスホロチオアート修飾などのホスファート修飾もなされ得る。パッセンジャー鎖はまた、2’リボ、2’Fおよび2デオキシ修飾、または、上のいずれの組み合わせをも含有し得る。例において実証されるように、ガイド鎖とパッセンジャー鎖との両方における化学修飾パターンは、良好な耐性を示し、化学修飾の組み合わせがRNA分子の効力および自己送達の増大をもたらすことが、本明細書に示される。

0092

本発明の側面は、RNAiについて先に使用されてきた分子と比較した場合、二本鎖領域に対して相対的に長い一本鎖領域を有するRNAiコンストラクトに関する。分子の一本鎖領域は、細胞取り込みまたは遺伝子サイレンシングを促進するために修飾されていてもよい。いくつかの態様において、一本鎖領域のホスホロチオアート修飾は、細胞取り込みおよび/または遺伝子サイレンシングに影響を及ぼす。ガイド鎖のホスホロチオアート修飾されている領域は、分子の一本鎖および二本鎖の両領域内にヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様において、一本鎖領域は、2〜12のホスホロチオアート修飾を含む。例えば、一本鎖領域は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11または12のホスホロチオアート修飾を含み得る。いくつかの例において、一本鎖領域は、6〜8のホスホロチオアート修飾を含む。

0093

本発明に関連する分子はまた、細胞取り込みのためにも最適化される。本明細書に記載されるRNA分子において、ガイド鎖および/またはパッセンジャー鎖は、抱合体に付着され得る。ある態様において、抱合体は疎水性である。疎水性の抱合体は、10より高い分配係数を有する低分子であり得る。抱合体は、コレステロールなどのステロール型分子であっても、または、C17に付着した長さが増大したポリ炭素鎖を有する分子であってもよく、抱合体の存在は、脂質トランスフェクション試薬の有無に関らずRNA分子が細胞に取り込まれる能力に影響を及ぼし得る。抱合体は、疎水性リンカーを通して、パッセンジャー鎖またはガイド鎖に付着され得る。

0094

いくつかの態様において、疎水性リンカーは5〜12Cの長さであり、および/または、ヒドロキシピロリジンベースとする。いくつかの態様において、疎水性抱合体はパッセンジャー鎖に付着し、パッセンジャー鎖および/またはガイド鎖のいずれかのCU残基は、修飾されている。いくつかの態様において、パッセンジャー鎖および/またはガイド鎖のCU残基の少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%または95%は、修飾されている。いくつかの側面において、本発明に関連する分子は、自己送達性(sd)である。本明細書において用いられる場合、「自己送達(self-delivery)」とは、分子が、トランスフェクション試薬などの追加の送達ビヒクルを必要とせずに細胞へ送達される能力を指す。

0095

本発明の側面は、RNAiにおける使用のために分子を選択することに関する。8〜15ヌクレオチドの二本鎖領域を有する分子は、RNAiにおける使用のために選択され得る。いくつかの態様において、分子は、その熱力学的安定性(ΔG)に基づいて選択される。いくつかの態様において、−13kkal/mol未満の(ΔG)を有する分子が選択されるであろう。例えば、(ΔG)値は、−13、−14、−15、−16、−17、−18、−19、−21、−22または−22kkal/mol未満であってもよい。他の態様において、(ΔG)値は、−13kkal/molより高くてもよい。例えば、(ΔG)値は、−12、−11、−10、−9、−8、−7または−7kkal/molより高くてもよい。ΔGは、当該技術分野において知られているいずれの方法をも使用して計算され得ることが理解されるべきである。いくつかの態様において、ΔGは、Mfoldインターネットサイト(http://mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/rna-form1.cgi)を通して利用可能なMfoldを使用して計算される。

0096

ΔGを計算するための方法は、以下の参考文献において記載され、それらから参考として組み込まれる:Zuker, M. (2003) Nucleic Acid Res., 31(13):3406-15;Mathews, D. H., Sabina, J., Zuker, M. and Turner, D. H. (1999) J. Mol. Biol. 288:911-940;Mathews, D. H., Disney, M. D., Childs, J. L., Schroeder, S. J., Zuker, M., and Turner, D. H. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101:7287-7292;Duan, S., Mathews, D. H., and Turner, D. H. (2006) Biochemistry 45:9819-9832;Wuchty, S., Fontana, W., Hofacker, I. L., and Schuster, P. (1999) Biopolymers 49:145-165。

0097

ある態様において、ポリヌクレオチドは、5’および/または3’末端の突出を含有する。ポリヌクレオチドの一端におけるヌクレオチド突出の数および/または配列は、ポリヌクレオチドの他端と同じであっても異なっていてもよい。ある態様において、突出ヌクレオチドの1以上は、ホスホロチオアートまたは2’−OMe修飾などの化学修飾を含有してもよい。

0098

ある態様において、ポリヌクレオチドは、未修飾である。他の態様において、少なくとも1つのヌクレオチドが修飾されている。さらなる態様において、修飾は、ガイド配列の5’末端から2つ目のヌクレオチドにおいて、2’−Hまたは2’−修飾されたリボース糖を含む。「2つ目のヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドの5’末端から2つ目のヌクレオチドとして定義される。

0099

本明細書に使用される「2’修飾されたリボース糖」は、2’−OH基を有さないリボース糖を含む。「2’修飾されたリボース糖」は、(未修飾の基準のDNAヌクレオチドにおいて見出される)2’−デオキシリボースを含まない。例えば、2’修飾されているリボース糖は、2’−O−アルキルヌクレオチド、2’−デオキシ−2’−フルオロヌクレオチド、2’−デオキシヌクレオチドまたはこれらの組み合わせであってもよい。
ある態様において、2’修飾されているヌクレオチドは、ピリミジンヌクレオチド(例としてC/U)である。2’−O−アルキルヌクレオチドの例は、2’−O−メチルヌクレオチドまたは2’−O−アリルヌクレオチドを含む。

0100

ある態様において、上述の5’末端修飾を持つ本発明のsd−rxRNAポリヌクレオチドは、特定された5’末端修飾がない類似のコンストラクトと比較したとき、有意に(例として、少なくとも約25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%またはそれを超えて)より低い「オフターゲット(off-target)」遺伝子サイレンシングを呈し、よって、RNAi試薬または治療の全体的な特異性を大きく改善する。
本明細書に使用される「オフ・ターゲット」遺伝子サイレンシングは、例えばアンチセンス(ガイド)配列と、意図しない標的mRNA配列との間の配列相同性に起因する、意図しない遺伝子サイレンシングを指す。

0101

本発明のこの側面に従うと、あるガイド鎖修飾は、RNAi活性を著しく低下させずに(またはRNAi活性を全く低下させずに)、さらに、ヌクレアーゼ安定性を増大させ、および/または、インターフェロン誘導を低下させる。
RNAiコンストラクトがヘアピンを伴ういくつかの態様において、5’ステム配列は、ポリヌクレオチドの5’末端上の2番目のヌクレオチドにて、2’−O−メチル修飾されたヌクレオチドなどの2’修飾されたリボース糖を含んでもよく、いくつかの態様においては、他の修飾ヌクレオチドを含まなくてもよい。かかる修飾を有するヘアピン構造は、該位置にて2’−O−メチル修飾がない類似のコンストラクトと比較して、標的特異性の増強またはオフ・ターゲットサイレンシングの低減を有してもよい。

0102

特定の5’ステム配列の修飾と3’ステム配列の修飾とのある組み合わせは、標的遺伝子の発現を阻害する能力の増強、血清安定性の増強、および/または、標的特異性の増大などにより部分的に表わされる、さらなる予想外の利点をもたらしてもよい。
ある態様において、ガイド鎖は、ガイド鎖の5’末端における2番目のヌクレオチドにて、2’−O−メチル修飾ヌクレオチドを含み、かつ、他の修飾ヌクレオチドを含まない。

0103

他の側面において、本発明のsd−rxRNA構造は、マイクロRNA機構によって、配列依存的な遺伝子サイレンシングを媒介する。本明細書に使用される用語「マイクロRNA」(「miRNA」)はまた、当該技術分野において、「小分子RNA(small temporal RNA)」(「stRNA」)としても言及され、遺伝子的に(例として、ウイルス哺乳動物または植物ゲノムにより)コードされる小さい(10〜50ヌクレオチドの)RNAであって、RNAサイレンシングを指向または媒介することができるものを指す。「miRNA障害」は、miRNAの異常な発現または活性により特徴づけられる疾患または障害を指すべきである。

0104

マイクロRNAは、マウス昆虫および哺乳動物において、発生またはがんなどの重要な経路において標的遺伝子を下方調節することに関与する。マイクロRNA機構を通した遺伝子サイレンシングは、miRNAとその標的メッセンジャーRNA(mRNA)との特異的であるがなお不完全な塩基対形成により、達成される。標的mRNA発現のマイクロRNA媒介性の下方調節において、多様な機構が使用されてもよい。

0105

miRNAは、およそ22ヌクレオチドの非コードRNAであって、植物および動物の発生の間中、転写後または翻訳後のレベルにて、遺伝子発現を調節し得る。miRNAの1つの共通の特徴は、それらがプレmiRNA(pre-miRNA)と称されるおよそ70ヌクレオチドの前駆体RNAステムループから、恐らくはRNaseIII型酵素であるダイサーまたはそのホモログによって、切り取られることである。天然に存在するmiRNAは、in vivoで内因性遺伝子により発現され、ヘアピンまたはステムループ前駆体(プレmiRNAまたはプリmiRNA(pri-miRNA))から、ダイサーまたは他のRNAseによりプロセッシングされる。miRNAは、in vivoで二本鎖デュプレックス(double-stranded duplex)として一過性に存在し得るが、一方の鎖のみが遺伝子サイレンシングを指揮するためにRISC複合体に取り込まれる。

0106

いくつかの態様において、細胞取り込みおよびmiRNA活性の阻害において有効なsd−rxRNA化合物のバージョンが記載される。化合物は本質的に、RISC侵入性のバージョンに類似するが、大きな鎖の化学修飾パターンが、切断を遮断してRISC作用の効果的な阻害剤として作用するように、最適化されている。例えば、化合物は、先に記載のPS含有物で完全にまたは殆どOメチル修飾されていてもよい。これらの型の化合物について、5’リン酸化は必要でない。二本鎖領域の存在は、細胞取り込みおよび効率的なRISCローディングを促進するので、好ましい。

0107

低分子RNAを配列特異的調節剤として使用する別の経路は、RNA干渉(RNAi)経路であり、これは、細胞における二本鎖RNA(dsRNA)の存在に対する、進化的に保存された応答である。dsRNAは、ダイサーにより、〜20塩基対(bp)デュプレックスの低分子干渉RNA(siRNA)へと切断される。これらの低分子RNAは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)と称される多タンパク質エフェクター複合体へと集合させられる。siRNAは次いで、完璧な相補性を持つ標的mRNAの切断をガイドする。

0108

バイオジェネシスタンパク質複合体および機能のいくつかの側面は、siRNA経路とmiRNA経路との間で共有される。対象となる一本鎖ポリヌクレオチドは、siRNA機構においてdsRNAを模倣しても、または、miRNA機構においてマイクロRNAを模倣してもよい。
ある態様において、修飾RNAiコンストラクトは、同じ配列を有する未修飾RNAiコンストラクトと比較して、改善された血清および/または脳脊髄液中の安定性を有してもよい。

0109

ある態様において、RNAiコンストラクトの構造は、ヒト、マウスおよび他のげっ歯類ならびに他の非ヒト哺乳動物からの初代細胞を含む哺乳動物の初代細胞などの初代細胞において、インターフェロン応答を誘導しない。ある態様において、RNAiコンストラクトはまた、無脊椎生物において標的遺伝子の発現を阻害するためにも使用されてもよい。
対象となるコンストラクトのin vivoでの安定性をさらに増大させるために、ヘアピン構造の3’末端は、保護基(単数または複数)により遮断されてもよい。例えば反転(inverted)ヌクレオチド、反転脱塩基部分またはアミノ末端修飾ヌクレオチドなどの保護基が使用されてもよい。反転ヌクレオチドは、反転デオキシヌクレオチドを含んでもよい。反転脱塩基部分は、3’,3’連結または5’,5’連結されたデオキシ脱塩基部分などの、反転デオキシ脱塩基部分を含んでもよい。

0110

本発明のRNAiコンストラクトは、標的遺伝子(単数または複数)によりコードされるいずれの標的タンパク質の合成をも阻害することができる。本発明は、細胞において、in vitroまたはin vivoのいずれかで、標的遺伝子の発現を阻害する方法を含む。したがって、本発明のRNAiコンストラクトは、標的遺伝子の過剰発現により特徴づけられる疾患を持つ患者を処置するのに有用である。
標的遺伝子は、細胞にとって内因性であっても外因性(例として、ウイルスにより、または、組み換えDNA技術を使用して、細胞に導入されたもの)であってもよい。かかる方法は、標的遺伝子の発現を阻害するために十分な量でのRNAの細胞内への導入を含んでもよい。例として、かかるRNA分子は、組成物が標的遺伝子の発現を阻害するように、標的遺伝子のヌクレオチド配列に対して相補的なガイド鎖を有してもよい。

0111

本発明はまた、対象となるヘアピンコンストラクトを発現するベクター、および、かかるベクターまたは対象となるヘアピンコンストラクトを含む細胞にも関する。細胞は、in vivoのまたは培養中の、ヒト細胞などの哺乳動物細胞であり得る。
本発明はさらに、対象となるRNAiコンストラクトと薬学的に許容し得るキャリアまたは希釈剤とを含む、組成物に関する。
本発明の別の側面は、哺乳動物細胞において標的遺伝子の発現を阻害するための方法を提供し、該方法は、哺乳動物細胞を、対象となるRNAiコンストラクトのいずれかと接触させることを含む。

0112

方法は、in vitroで、ex vivoで、または、in vivoで、例えば、培養中のヒト細胞などの培養中の哺乳動物細胞において行ってもよい。
標的細胞(例として哺乳動物細胞)は、脂質(例としてカチオン性脂質)またはリポソームなどの送達試薬の存在下において、接触させられてもよい。
本発明の別の側面は、哺乳動物細胞において標的遺伝子の発現を阻害するための方法を提供し、該方法は、哺乳動物細胞を、対象となるRNAiコンストラクトを発現するベクターと接触させることを含む。

0113

本発明の一側面において、約16〜約30ヌクレオチドの範囲のサイズである第1のポリヌクレオチドと、約26〜約46ヌクレオチドの範囲のサイズである第2のポリヌクレオチドとを含む、より長いデュプレックスポリヌクレオチドが提供され、ここで、第1のポリヌクレオチド(アンチセンス鎖)は、第2のポリヌクレオチド(センス鎖)および標的遺伝子の両方に対して相補的であり、両方のポリヌクレオチドは、デュプレックスを形成し、ここで、第1のポリヌクレオチドは、長さが6塩基より長い一本鎖領域を含有し、別の化学修飾パターンにより修飾されており、および/または、細胞送達を容易にする抱合体部分を含む。この態様において、パッセンジャー鎖のヌクレオチドの約40〜約90%、ガイド鎖のヌクレオチドの約40〜約90%、第1のポリヌクレオチドの一本鎖領域のヌクレオチドの約40〜約90%が、化学修飾ヌクレオチドである。

0114

一態様において、ポリヌクレオチドデュプレックス中の化学修飾ヌクレオチドは、上で詳細に議論されたものなどの、当該技術分野において知られているいずれの化学修飾ヌクレオチドであってもよい。特定の態様において、化学修飾ヌクレオチドは、2’F修飾ヌクレオチド、2’−O−メチル修飾されたものおよび2’デオキシヌクレオチドからなる群より選択される。別の特定の態様において、化学修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド塩基の「疎水性修飾」から生じる。別の特定の態様において、化学修飾ヌクレオチドはホスホロチオアートである。さらなる別の特定の態様において、化学修飾ヌクレオチドは、ホスホロチオアート、2’−O−メチル、2’デオキシ、疎水性修飾およびホスホロチオアートの組み合わせである。これらの群の修飾が、リボース環、主鎖およびヌクレオチドの修飾を指すなら、いくつかの修飾ヌクレオチドが、3つの修飾の型全ての組み合わせを持つことも実行可能である。

0115

別の態様において、化学修飾は、デュプレックスの多様な領域にわたって同一ではない。特定の態様において、第1のポリヌクレオチド(パッセンジャー鎖)は、多数の多様な化学修飾を、多様な部位において有する。このポリヌクレオチドについて、ヌクレオチドの90%までが化学修飾されていてもよく、および/または、導入されたミスマッチを有していてもよい。別の態様において、第1のまたは第2のポリヌクレオチドの化学修飾は、これらに限定されないが、5’位のウリジンおよびシトシンの修飾(4−ピリジル、2−ピリジル、インドリルフェニル(C6H5OH);トリプトファニル(C8H6N)CH2CH(NH2)CO)、イソブチルブチルアミノベンジル;フェニル;ナフチルなど)を含み、ここで、化学修飾は、ヌクレオチドの塩基対形成能力を変化させる場合がある。ガイド鎖について、本発明のこの側面の重要な特徴は、アンチセンスの5’末端に対する化学修飾の位置および配列である。例えば、ガイド鎖の5’末端の化学的リン酸化は通常、効力のために有益である。センス鎖のシード領域(5’末端に対して2〜7位)におけるO−メチル修飾は、一般に良好な耐性を示さないが、一方、2’Fおよびデオキシは、良好な耐性を示す。ガイド鎖の中間部分およびガイド鎖の3’末端は、適用される化学修飾の型において、より許容的である。デオキシ修飾は、ガイド鎖の3’末端においては、耐性を示さない。

0116

本発明のこの側面のユニークな特徴は、塩基に対する疎水性の修飾の使用を伴う。一態様において、疎水性修飾は好ましくは、ガイド鎖の5’末端付近に位置し、他の態様においては、それらはガイド鎖の中間に局在し、他の態様においては、それらはガイド鎖の3’末端に局在し、さらに別の態様において、それらは、ポリヌクレオチドの全長を通して分布する。同じ型のパターンが、デュプレックスのパッセンジャー鎖に適用可能である。

0117

分子の他方の部分は、一本鎖領域である。一本鎖領域は、6から40までのヌクレオチドの範囲であると予測される。
一態様において、第1のポリヌクレオチドの一本鎖領域は、40%〜90%の疎水性塩基修飾、40%〜90%のホスホロチオアート、40%〜90%のリボース部分の修飾、および、前述のもののあらゆる組み合わせからなる群より選択される修飾を含有する。

0118

ガイド鎖(第1のポリヌクレオチド)のRISC複合体中へのローディングの効率は、重度に修飾されたポリヌクレオチドについて変わる場合があるので、一態様においては、効率的なガイド鎖のローディングを促進するために、デュプレックスポリヌクレオチドは、ガイド鎖(第1のポリヌクレオチド)上のヌクレオチド9、11、12、13または14と、センス鎖(第2のポリヌクレオチド)上の反対のヌクレオチドとの間のミスマッチを含む。
より詳細な本発明の側面は、以下のセクションにおいて記載される。

0119

デュプレックスの特徴
本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、2つの別々の相補的な核酸鎖により形成されてもよい。デュプレックス形成は、標的遺伝子を含有する細胞の内側または外側のいずれかで生じ得る。
本明細書に使用される用語「デュプレックス(duplex)」は、相補的な配列に水素結合している二本鎖(double-stranded)核酸分子(単数または複数)の領域を含む。本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、標的遺伝子に対してセンスであるヌクレオチド配列、および、標的遺伝子に対してアンチセンスである相補配列を含んでもよい。センスおよびアンチセンスヌクレオチド配列は、標的遺伝子配列に対応し、例として、標的遺伝子配列と同一であるかまたは標的遺伝子の阻害をもたらすために十分に同一(例として、ほぼ少なくとも約98%同一、96%同一、94%、90%同一、85%同一または80%同一)である。

0120

ある態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖である、すなわち、分子のいずれの末端においても突出する一本鎖配列を有さない、すなわち、平滑末端である。他の態様において、個々の核酸分子は、異なる長さであってもよい。言い換えると、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖でない。例えば、2つの別々の核酸分子が使用されるとき、分子の一方、例えばアンチセンス配列を含む第1の分子は、それにハイブリダイズする第2の分子より長くてもよい(分子の一部を一本鎖とする)。同様に、単一の核酸分子が使用されるとき、分子のいずれかの末端の部分が一本鎖のままであり得る。

0121

一態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、ミスマッチおよび/またはループまたはバルジを含有するが、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約70%にわたって二本鎖である。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約80%にわたって二本鎖である。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約90%〜95%にわたって二本鎖である。別の態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約96%〜98%にわたって二本鎖である。ある態様において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくともまたは最大1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個までのミスマッチを含有する。

0122

修飾
本発明のヌクレオチドは、糖部分、ホスホジエステル連結部および/または塩基を含む、多様な位置において修飾されてもよい。
いくつかの態様において、ヌクレオチドの塩基部分は修飾されてもよい。例えば、ピリミジン塩基ピリミジン環の2、3、4、5、および/または6位において修飾されてもよい。いくつかの態様において、シトシンの環外アミンが修飾されてもよい。プリン塩基もまた修飾されてもよい。例えば、プリン塩基は、1、2、3、6、7または8位において修飾されてもよい。いくつかの態様において、アデニンの環外アミンが修飾されてもよい。いくつかのケースにおいて、塩基部分の環の窒素原子は、例えば炭素などの別の原子置換されてもよい。塩基部分への修飾は、いずれの好適な修飾でもあってもよい。修飾の例は当業者に知られている。いくつかの態様において、塩基の修飾は、アルキル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、または、その他のヘテロ環を含む。

0123

いくつかの態様において、ピリミジンは5位において修飾されてもよい。例えばピリミジンの5位は、アルキル基アルキニル基アルケニル基アシル基またはこれらの置換誘導体により修飾されてもよい。他の例において、ピリミジンの5位は、ヒドロキシル基またはアルコキシル基またはこれらの置換誘導体により修飾されてもよい。また、ピリミジンのN4位をアルキル化してもよい。さらに他の例において、ピリミジン5−6結合は飽和されていてもよく、ピリミジン環内の窒素原子は炭素原子により置換されてもよく、および/または、O2またはO4原子は、硫黄原子により置換されてもよい。他の修飾も可能であることが理解されるべきである。

0124

他の例において、プリンのN7位および/またはN2および/またはN3位は、アルキル基またはその置換誘導体により修飾されてもよい。さらなる例において、第3環はプリン二環系に縮合されてもよく、および/または、プリン環系内の窒素原子は炭素原子で置換されてもよい。他の修飾も可能であることが理解されるべきである。

0125

5位で修飾されたピリミジンの非限定的例は、米国特許第5591843号、米国特許第7,205,297号、米国特許第6,432,963号および米国特許第6,020,483号に開示されており;N4位で修飾されたピリミジンの非限定的例は、米国特許第5,580,731号に開示されており;8位で修飾されたプリンの非限定的例は、米国特許第6,355,787号および米国特許第5,580,972号に開示されており;N6位で修飾されたプリンの非限定的例は、米国特許第4,853,386号、米国特許第5,789,416号および米国特許第7,041,824号に開示されており;2位で修飾されたプリンの非限定的例は、米国特許第4,201,860号および米国特許第5,587,469号に開示されており;これらの全ては、参考として本明細書に組み込まれる。

0126

修飾塩基の非限定的例は、N4,N4−エタノシトシン、7−デアザキサントシン、7−デアザグアノシン、8−オキソ−N6−メチルアデニン、4−アセチルシトシン、5−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル5−フルオロウラシル5−ブロモウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシルジヒドロウラシルイノシン、N6−イソペンテニル−アデニン、1−メチルアデニン、1−メチルプソイドウラシル、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン5−メチルシトシン、N6−メチルアデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、プソイドウラシル、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル5−メチルウラシル、2−チオシトシンおよび2,6−ジアミノプリンを含む。いくつかの態様において、塩基部分はプリンまたはピリミジン以外のヘテロ環式塩基であってもよい。ヘテロ環式塩基は任意に修飾および/または置換されてもよい。

0127

糖部分は、天然の未修飾糖、例として単糖ペントース、例としてリボース、デオキシリボース)、修飾糖および糖アナログを含む。一般に、可能なヌクレオモノマーの修飾、特に糖部分のものは、例えば、1以上のヒドロキシル基のハロゲンヘテロ原子脂肪族基での置き換え、または、ヒドロキシル基の、エーテルアミンチオールなどとしての官能化を含む。

0128

修飾ヌクレオモノマーの特に有用な一群は、2’−O−メチルヌクレオチドである。かかる2’−O−メチルヌクレオチドは、「メチル化されている」として言及されてもよく、対応するヌクレオチドは、非メチル化ヌクレオチドからアルキル化により、または直接的にメチル化ヌクレオチド試薬から、作られる。修飾ヌクレオモノマーは、未修飾ヌクレオモノマーと組み合わせて使用されてもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチドは、メチル化および非メチル化ヌクレオモノマーの両方を含有してもよい。

0129

いくつかの例示的な修飾ヌクレオモノマーは、糖または骨格(backbone)が修飾されたリボヌクレオチドを含む。修飾リボヌクレオチドは、5’位で修飾されたウリジンまたはシチジン、例として5’−(2−アミノプロピルウリジンおよび5’−ブロモウリジン;8位で修飾されたアデノシンおよびグアノシン、例として8−ブロモグアノシン;デアザヌクレオチド、例として7−デアザ−アデノシン;ならびにN−アルキル化ヌクレオチド、例としてN6−メチルアデノシンなどの、天然に存在しない塩基を(天然に存在する塩基の代わりに)含有してもよい。また、糖修飾リボヌクレオチドは、H、アルコキシ(もしくはOR)、Rもしくはアルキル、ハロゲン、SH、SR、アミノ(NH2、NHR、NR2など)またはCN基で置き換えられた2’−OH基をも有していてもよく、ここで、Rは、低級アルキル、アルケニルまたはアルキニルである。

0130

修飾リボヌクレオチドはまた、修飾基、例としてホスホロチオアート基により置き換えられた、隣接するリボヌクレオチドに繋げられたホスホジエステル基をも有してもよい。より一般的には、多様なヌクレオチド修飾が組み合わされてもよい。
アンチセンス(ガイド)鎖は、標的遺伝子(単数または複数)の少なくとも一部に対して実質的に同一であってもよいが、少なくとも塩基対形成特性に関連して、配列は、有用であるため、例として標的遺伝子の表現型の発現を阻害するために、完全に同一である必要はない。一般により高い相同性は、より短いアンチセンス遺伝子の使用を埋め合わせるために使用され得る。いくつかのケースにおいて、アンチセンス鎖は、一般に、標的遺伝子に対して(アンチセンス方向において)実質的に同一であろう。

0131

2’−O−メチル修飾RNAの使用はまた、細胞ストレス応答を最少化することが望ましい状況においても有益であり得る。2’−O−メチルヌクレオモノマーを有するRNAは、未修飾RNAを認識すると考えられる細胞機構によって認識され得ない。2’−O−メチル化されたかまたは部分的に2’−O−メチル化されたRNAは、標的RNA阻害を維持しつつ、二本鎖核酸に対するインターフェロン応答を回避し得る。これは、例えば、インターフェロンまたは他の細胞ストレス応答を回避するために、インターフェロン応答を誘導する短いRNAi(例としてsiRNA)配列、および、インターフェロン応答を誘導し得るより長いRNAi配列の両方において、有用であり得る。

0132

全体として、修飾糖は、D−リボース、2’−O−アルキル(2’−O−メチルおよび2’−O−エチルを含む)、すなわち、2’−アルコキシ、2’−アミノ、2’−S−アルキル、2’−ハロ(2’−フルオロを含む)、2’−メトキシエトキシ、2’−アリルオキシ(−OCH2CH=CH2)、2’−プロパルギル、2’−プロピル、エチニルエテニルプロペニルならびにシアノなどを含む。一態様において、糖部分は、記載されるように(Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res. 18:4711 (1992))、ヘキソースであってもよく、オリゴヌクレオチド中に組み込まれてもよい。例示的なヌクレオモノマーは、例として米国特許第5,849,902号において見出され得、これは本明細書に参考として組み込まれる。

0133

具体的な官能基の定義および化学用語は、以下にさらに詳細に記載される。本発明の目的のために、化学元素はCAS versionのHandbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.の内表紙の元素周期表に従って同定され、具体的な官能基はこれに記載のようにして一般的に定義される。さらに、有機化学の一般原理ならびに具体的な官能部分および反応性は、Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999に記載され、この内容の全体は参考として本明細書に組み込まれる。

0134

本発明のある化合物は、特定の幾何学的形態または立体異性形態で存在してもよい。本発明は全てのかかる化合物を考慮し、これにはcis−およびtrans−異性体、R−およびS−鏡像異性体ジアステレオマー、(D)−異性体、(L)−異性体、これらのラセミ混合物、および、これらのその他の混合物を、本発明の範囲内であるとして含む。追加の不斉炭素原子が、アルキル基などの置換基中に存在してよい。全てのかかる異性体およびこれらの混合物は、本発明に含むことが意図される。

0135

種々の異性体比のいずれかを含有する異性体混合物は、本発明に従って利用されてもよい。例えば、2種の異性体のみが組み合わせられるとき、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、95:5、96:4、97:3、98:2、99:1または100:0の異性体比を含有する混合物は全て、本発明に考慮される。当業者は容易に、さらに複雑な異性体混合物について類似の比率が考慮されることを理解するであろう。

0136

例えば本発明の化合物の特定のエナンチオマーが所望される場合、これは不斉合成により、または、キラル補助基による誘導体化により調製されてもよく、ここで得られたジアステレオマー混合物は分離され、補助基が切断されて、純粋な所望のエナンチオマーが提供される。代わりに、分子がアミノなどの塩基性官能基を含有する場合またはカルボキシルなどの酸性官能基を含有する場合、ジアステレオマー塩が、適切な光学活性酸または塩基により形成され、次いでこうして形成されたジアステレオマーが、当該技術分野において周知の分別結晶化またはクロマトグラフィー手段により分割され、続いて純粋なエナンチオマーが回収される。

0137

ある態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、3’および5’終端(termini)を含む(環状オリゴヌクレオチドを除く)。一態様において、オリゴヌクレオチドの3’および5’終端は、例えば3’または5’結合を修飾することにより、ヌクレアーゼから実質的に保護され得る(例として米国特許第5,849,902号およびWO 98/13526)。例えば、オリゴヌクレオチドは「ブロック基(blocking group)」を含めることにより抵抗性になされ得る。本明細書に使用される用語「ブロック基」は、合成のための保護基または結合基のどちらかとしてオリゴヌクレオチドまたはヌクレオモノマーに付着され得る、置換基(例としてOH基以外のもの)を指す(例として、FITC、プロピル(CH2−CH2−CH3)、グリコール(−O−CH2−CH2−O−)ホスファート(PO32−)、ホスホン酸水素またはホスホロアミダイト)。「ブロック基」はまた、「末端ブロック基」または「エキソヌクレアーゼブロック基」をも含み、これらは、修飾ヌクレオチドおよび非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ抵抗性構造を含む、オリゴヌクレオチドの、3’および5’終端を保護する。

0138

例示の末端ブロック基は、キャップ構造(例として7−メチルグアノシンキャップ)、反転(inverted)ヌクレオモノマー、例として3’−3’または5’−5’末端反転を有するもの(例としてOrtiagao et al. 1992. Antisense Res. Dev. 2:129を参照)、メチルホスホナート、ホスホロアミダイト、非ヌクレオチド基(例として、非ヌクレオチドリンカーアミノリンカー、抱合体)などを含む。3’末端ヌクレオモノマーは、修飾糖部分を含み得る。3’末端ヌクレオモノマーは、オリゴヌクレオチドの3’−エキソヌクレアーゼ分解を防ぐブロック基により任意に置換され得る3’−Oを含む。例えば、3’−ヒドロキシルは、3’→3’ヌクレオチド間連結物を介してヌクレオチドにエステル化され得る。例えば、アルキルオキシラジカルは、メトキシ、エトキシまたはイソプロポキシであり得、好ましくはエトキシである。任意に、3’末端における3’→3’結合ヌクレオチドは、代替連結により連結され得る。ヌクレアーゼ分解を低減するために、最も5’の3’→5’連結部は、修飾連結部、例としてホスホロチオアートまたはP−アルキルオキシホスホトリエステル連結部であることができる。好ましくは、2つの最も5’の3’→5’連結物は、修飾連結部である。任意に、5’末端ヒドロキシ部分は、リン含有部分、例として、ホスファート、ホスホロチオアートまたはP−エトキシホスファートで、エステル化され得る。

0139

合成方法が、本明細書に記載のとおり、種々の保護基を利用することを、当業者は理解するであろう。本明細書で使用される用語「保護基」は、特定の官能部分、例としてO、SまたはNを一時的に遮断して、多官能性化合物における別の反応部位にて反応が選択的に行われ得ることを意味する。ある態様において、保護基は良好な収率で選択的に反応して、計画された反応に対して安定である、保護された基質を与える;保護基は、容易に利用可能で好ましくは非毒性の、他の官能基を攻撃しない試薬により、良好な収率で選択的に除去可能であるべきである;保護基は、容易に分離可能誘導体を(より好ましくは、新しい立体中心の生成なしに)形成する;および、保護基は、さらなる反応部位を回避するために最小数の付加的な官能性を有する。

0140

本明細書に詳述されるとおり、酸素硫黄窒素および炭素の保護基が利用されてもよい。ヒドロキシル保護基は以下を含む:メチル、メトキシルメチル(MOM)、メチルチオメチル(MTM)、t−ブチルチオメチル、(フェニルジメチルシリルメトキシメチル(SMOM)、ベンジルオキシメチル(BOM)、p−メトキシベンジルオキシメチル(PMBM)、(4−メトキシフェノキシ)メチル(p−AOM)、グアイアコルメチル(GUM)、t−ブトキシメチル、4−ペンテニルオキシメチル(POM)、シロキシメチル、2−メトキシエトキシメチル(MEM)、2,2,2−トリクロロエトキシメチルビス(2−クロロエトキシ)メチル、2−(トリメチルシリル)エトキシメチル(SEMOR)、テトラヒドロピラニルTHP)、3−ブロモテトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、1−メトキシシクロヘキシル、4−メトキシテトラヒドロピラニル(MTHP)、4−メトキシテトラヒドロチオピラニル、4−メトキシテトラヒドロチオピラニルS,S−ジオキシド、1−[(2−クロロ−4−メチル)フェニル]−4−メトキシピペリジン−4−イル(CTMP)、

0141

1,4−ジオキサン−2−イル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、2,3,3a,4,5,6,7,7a−オクタヒドロ−7,8,8−トリメチル−4,7−メタノベンゾフラン−2−イル、1−エトキシエチル、1−(2−クロロエトキシ)エチル、1−メチル−1−メトキシエチル、1−メチル−1−ベンジルオキシエチル、1−メチル−1−ベンジルオキシ−2−フルオロエチル、2,2,2−トリクロロエチル、2−トリメチルシリルエチル、2−(フェニルセレニル)エチル、t−ブチル、アリル、p−クロロフェニル、p−メトキシフェニル、2,4−ジニトロフェニルベンジル、p−メトキシベンジル、3,4−ジメトキシベンジル、o−ニトロベンジル、p−ニトロベンジル、p−ハロベンジル、2,6−ジクロロベンジル、p−シアノベンジル、p−フェニルベンジル、2−ピコリル、4−ピコリル、3−メチル−2−ピコリルN−オキシドジフェニルメチル、p,p’−ジニトロベンズヒドリル、5−ジベンゾスベリル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、p−メトキシフェニルジフェニルメチル、ジ(p−メトキシフェニル)フェニルメチル、トリ(p−メトキシフェニル)メチル、4−(4’−ブロモフェナシルオキシフェニル)ジフェニルメチル、

0142

4,4’,4’’−トリス(4,5−ジクロロフタルイミドフェニル)メチル、4,4’,4’’−トリス(レブノイルオキシフェニル)メチル、4,4’,4’’−トリス(ベンゾイルオキシフェニル)メチル、3−(イミダゾール−1−イル)ビス(4’,4’’−ジメトキシフェニル)メチル、1,1− ビス(4−メトキシフェニル)−1’−ピレニルメチル、9−アントリル、9−(9−フェニル)キサンテニル、9−(9−フェニル−10−オキソ)アントリル、1,3−ベンゾジチオラン−2−イル、ベンズイソチアゾリルS,S−ジオキシド、トリメチルシリル(TMS)、トリエチルシリル(TES)、トリイソプロピルシリル(TIPS)、ジメチルイソプロピルシリル(IPDMS)、ジエチルイソプロピルシリル(DEIPS)、ジメチルテキシルシリル(dimethylthexylsilyl)、t−ブチルジメチルシリル(TBDMS)、t−ブチルジフェニルシリル(TBDPS)、トリベンジルシリル、トリ−p−キシリルシリル、トリフェニルシリル、ジフェニルメチルシリル(DPMS)、t−ブチルメトキシフェニルシリル(TBMPS)、ホルマート、ベンゾイルホルマート、アセタート、クロロアセタート、ジクロロアセタート、トリクロロアセタート、トリフルオロアセタート、

0143

メトキシアセタート、トリフェニルメトキシアセタート、フェノキシアセタート、p−クロロフェノキシアセタート、3−フェニルプロピオナート、4−オキソペンタノアート(レブリナート)、4,4−(エチレンジチオペンタノアート(レブリノイルジチオアセタール)、ピバロアート、アダマントアート、クロトナート、4−メトキシクロトナート、ベンゾアート、p−フェニルベンゾアート、2,4,6−トリメチルベンゾアート(メシトアート)、アルキルメチルカーボナート、9−フルオレニルメチルカーボナート(Fmoc)、アルキルエチルカーボナート、アルキル2,2,2−トリクロロエチルカーボナート(Troc)、2−(トリメチルシリル)エチルカーボナート(TMSEC)、2−(フェニルスルホニル)エチルカーボナート(Psec)、2−(トリフェニルホスホニオ)エチルカーボナート(Peoc)、アルキルイソブチルカーボナート、アルキルビニルカーボナートアルキルアリルカーボナート、アルキルp−ニトロフェニルカーボナート、アルキルベンジルカーボナート、アルキルp−メトキシベンジルカーボナート、アルキル3,4−ジメトキシベンジルカーボナート、アルキルo−ニトロベンジルカーボナート、

0144

アルキルp−ニトロベンジルカーボナート、アルキルS−ベンジルチオカーボナート、4−エトキシ−1−ナフチルカーボナート、メチルジチオカーボナート、2−ヨードベンゾアート、4−アジドブチラート、4−ニトロ−4−メチルペンタノアート、o−(ジブロモメチル)ベンゾアート、2−フォルミルベンゼンスルホナート、2−(メチルチオメトキシ)エチル、4−(メチルチオメトキシ)ブチラート、2−(メチルチオメトキシメチル)ベンゾアート、2,6−ジクロロ−4−メチルフェノキシアセタート、2,6−ジクロロ−4−(1,1,3,3−テトラメチルブチル)フェノキシアセタート、2,4−ビス(1,1−ジメチルプロピル)フェノキシアセタート、クロロジフェニルアセタート、イソブチラートモノスクシノアート、(E)−2−メチル−2−ブテノアート、o−(メトキシカルボニル)ベンゾアート、α−ナフトアート、ニトラート、アルキルN,N,N’,N’−テトラメチルホスホロジアミダート、アルキルN−フェニルカルバマートボラート、ジメチルホスフィノチオイル、アルキル2,4−ジニトロフェニルスルフェナート(dinitrophenylsulfenate)、スルファートメタンスルホナートメシラート)、ベンジルスルホナートおよびトシラート(Ts)。

0145

1,2−または1,3−ジオールを保護するためには、保護基は以下を含む:メチレンアセタールエチリデンアセタール、1−t−ブチルエチリデンケタール、1−フェニルエチリデンケタール、(4−メトキシフェニル)エチリデンアセタール、2,2,2−トリクロロエチリデンアセタール、アセトニドシクロペンチリデンケタール、シクロヘキシリデンケタール、シクロヘプチリデンケタール、ベンジリデンアセタール、p−メトキシベンジリデンアセタール、2,4−ジメトキシベンジリデンケタール、3,4−ジメトキシベンジリデンアセタール、2−ニトロベンジリデンアセタール、メトキシメチレンアセタール、エトキシメチレンアセタール、ジメトキシメチレンオルトエステル、1−メトキシエチリデンオルトエステル、1−エトキシエチリデンオルトエステル、1,2−ジメトキシエチリデンオルトエステル、α−メトキシベンジリデンオルトエステル、1−(N,N−ジメチルアミノエチリデン誘導体、α−(N,N’−ジメチルアミノ)ベンジリデン誘導体

0146

2−オキサシクロペンチリデンオルトエステル、ジ−t−ブチルシリレン基(DTBS)、1,3−(1,1,3,3−テトライソプロピルジシロキサニリデン)誘導体(TIPDS)、テトラ−t−ブトキシジシロキサン−1,3−ジイリデン誘導体(TBDS)、環状カーボナート、環状ボロナート、エチルボロナートおよびフェニルボロナート。アミノ保護基は、以下を含む:メチルカルバマート、エチルカルバマート、9−フルオレニルメチルカルバマート(Fmoc)、9−(2−スルホ)フルオレニルメチル(fluoroenylmethyl)カルバマート、9−(2,7−ジブロモ)フルオレニルメチルカルバマート、2,7−ジ−t−ブチル−[9−(10,10−ジオキソ−10,10,10,10−テトラヒドロチオキサンチル)]メチルカルバマート(DBD−Tmoc)、4−メトキシフェナシルカルバマート(Phenoc)、2,2,2−トリクロロエチルカルバマート(Troc)、2−トリメチルシリルエチルカルバマート(Teoc)、

0147

2−フェニルエチルカルバマート(hZ)、1−(1−アダマンチル)−1−メチルエチルカルバマート(Adpoc)、1,1−ジメチル−2−ハロエチルカルバマート、1,1−ジメチル−2,2−ジブロモエチルカルバマート(DB−t−BOC)、1,1−ジメチル−2,2,2−トリクロロエチルカルバマート(TCBOC)、1−メチル−1−(4−ビフェニルイル)エチルカルバマート(Bpoc)、1−(3,5−ジ−t−ブチルフェニル)−1−メチルエチルカルバマート(t−Bumeoc)、2−(2’−および4’−ピリジル)エチルカルバマート(Pyoc)、2−(N,N−ジシクロヘキシルカルボキサミド)エチルカルバマート、t−ブチルカルバマート(BOC)、1−アダマンチルカルバマート(Adoc)、ビニルカルバマート(Voc)、アリルカルバマート(Alloc)、1−イソプロピルアリルカルバマート(Ipaoc)、シンナミルカルバマート(Coc)、4−ニトロシンナミルカルバマート(Noc)、8−キノリルカルバマート、N−ヒドロキシピペリジニルカルバマート、アルキルジチオカルバマート、ベンジルカルバマート(Cbz)、p−メトキシベンジルカルバマート(Moz)、p−ニトロベンジルカルバマート、p−ブロモベンジルカルバマート、p−クロロベンジルカルバマート、

0148

2,4−ジクロロベンジルカルバマート、4−メチルスルフィニルベンジルカルバマート(Msz)、9−アントリルメチルカルバマート、ジフェニルメチルカルバマート、2−メチルチオエチルカルバマート、2−メチルスルホニルエチルカルバマート、2−(p−トルエンスルホニル)エチルカルバマート、[2−(1,3−ジチアニル)]メチルカルバマート(Dmoc)、4−メチルチオフェニルカルバマート(Mtpc)、2,4−ジメチルチオフェニルカルバマート(Bmpc)、2−ホスホニオエチルカルバマート(Peoc)、2−トリフェニルホスホニオイソプロピルカルバマート(Ppoc)、1,1−ジメチル−2−シアノエチルカルバマート、m−クロロ−p−アシルオキシベンジルカルバマート、p−(ジヒドロキシボリル)ベンジルカルバマート、5−ベンズイソキサゾリルメチルカルバマート、2−(トリフルオロメチル)−6−クロモニルメチルカルバマート(Tcroc)、m−ニトロフェニルカルバマート、3,5−ジメトキシベンジルカルバマート、o−ニトロベンジルカルバマート、3,4−ジメトキシ−6−ニトロベンジルカルバマート、フェニル(o−ニトロフェニル)メチルカルバマート、フェノチアジニル−(10)−カルボニル誘導体、N’−p−トルエンスルホニルアミノカルボニル誘導体、N’−フェニルアミノチオカルボニル誘導体、t−アミルカルバマート、S−ベンジルチオカルバマート、p−シアノベンジルカルバマート、シクロブチルカルバマート、シクロヘキシルカルバマート、

0149

シクロペンチルカルバマート、シクロプロピルメチルカルバマート、p−デシルオキシベンジルカルバマート、2,2−ジメトキシカルボニルビニルカルバマート、o−(N,N−ジメチルカルボキサミド)ベンジルカルバマート、1,1−ジメチル−3−(N,N−ジメチルカルボキサミド)プロピルカルバマート、1,1−ジメチルプロピニルカルバマート、ジ(2−ピリジル)メチルカルバマート、2−フラニルメチルカルバマート、2−ヨードエチルカルバマート、イソボルニルカルバマート、イソブチルカルバマート、イソニコチニルカルバマート、p−(p’−メトキシフェニルアゾ)ベンジルカルバマート、1−メチルシクロブチルカルバマート、1−メチルシクロヘキシルカルバマート、1−メチル−1−シクロプロピルメチルカルバマート、1−メチル−1−(3,5−ジメトキシフェニル)エチルカルバマート、1−メチル−1−(p−フェニルアゾフェニル)エチルカルバマート、

0150

1−メチル−1−フェニルエチルカルバマート、1−メチル−1−(4−ピリジル)エチルカルバマート、フェニルカルバマート、p−(フェニルアゾ)ベンジルカルバマート、2,4,6−トリ−t−ブチルフェニルカルバマート、4−(トリメチルアンモニウム)ベンジルカルバマート、2,4,6−トリメチルベンジルカルバマート、ホルムアミドアセトアミドクロロアセトアミド、トリクロロアセトアミド、トリフルオロアセトアミドフェニルアセトアミド、3−フェニルプロパンアミドピコリンアミド、3−ピリジルカルボキサミド、N−ベンゾイルフェニルアラニル誘導体、ベンズアミド、p−フェニルベンズアミド、o−ニトロフェニルアセトアミド、o−ニトロフェノキシアセトアミド、アセトアセトアミド、(N’−ジチオベンジルオキシカルボニルアミノ)アセトアミド、3−(p−ヒドロキシフェニルプロパンアミド、3−(o−ニトロフェニル)プロパンアミド、2−メチル−2−(o−ニトロフェノキシ)プロパンアミド、2−メチル−2−(o−フェニルアゾフェノキシ)プロパンアミド、

0151

4−クロロブタンアミド、3−メチル−3−ニトロブタンアミド、o−ニトロシンナミド、N−アセチルメチオニン誘導体、o−ニトロベンズアミド、o−(ベンゾイルオキシメチル)ベンズアミド、4,5−ジフェニル−3−オキサゾリン−2−オンN−フタルイミド、 N−ジチアスクシンイミド(Dts)、N−2,3−ジフェニルマレイミド、N−2,5−ジメチルピロール、N−1,1,4,4−テトラメチルジシリルアザシクロペンタン付加物(STABASE)、5−置換1,3−ジメチル−1,3,5−トリアザシクロヘキサン−2−オン、5−置換1,3−ジベンジル−1,3,5−トリアザシクロヘキサン−2−オン、1−置換3,5−ジニトロ−4−ピリドン、N−メチルアミン、N−アリルアミン、N−[2−(トリメチルシリル)エトキシ]メチルアミン(SEM)、N−3−アセトキシプロピルアミン、N−(1−イソプロピル−4−ニトロ−2−オキソ−3−ピロリン−3−イル)アミン、第四級アンモニウム塩、N−ベンジルアミン、N−ジ(4−メトキシフェニル)メチルアミン、N−5−ジベンゾスベリルアミン、N−トリフェニルメチルアミン(Tr)、N−[(4−メトキシフェニル)ジフェニルメチル]アミン(MMTr)、N−9−フェニルフルオレニルアミン(PhF)、N−2,7−ジクロロ−9−フルオレニルメチレンアミン、

0152

N−フェロセニルメチルアミノ(Fcm)、N−2−ピコリルアミノN’−オキシド、N−1,1−ジメチルチオメチレンアミン、N−ベンジリデンアミン、N−p−メトキシベンジリデンアミン、N−ジフェニルメチレンアミン、N−[(2−ピリジル)メシチル]メチレンアミン、N−(N’,N’−ジメチルアミノメチレン)アミン、N,N’−イソプロピリデンジアミン、N−p−ニトロベンジリデンアミン、N−サリシリデンアミン、N−5−クロロサリシリデンアミン、N−(5−クロロ−2−ヒドロキシフェニル)フェニルメチレンアミン、N−シクロヘキシリデンアミン、N−(5,5−ジメチル−3−オキソ−1−シクロヘキセニル)アミン、N−ボラン誘導体、N−ジフェニルボリン酸誘導体、N−[フェニル(ぺンタカルボニルクロム−またはタングステン)カルボニル]アミン、N−銅キレート、N−亜鉛キレート、N−ニトロアミン、N−ニトロソアミン、アミンN−オキシド、ジフェニルホスフィンアミド(Dpp)、

0153

ジメチルチオホスフィンアミド(Mpt)、ジフェニルチオホスフィンアミド(Ppt)、ジアルキルホスホルアミダート、ジベンジルホスホルアミダート、ジフェニルホスホルアミダート、ベンゼンスルフェンアミド、o−ニトロベンゼンスルフェンアミド(Npys)、2,4−ジニトロベンゼンスルフェンアミド、ペンタクロロベンゼンスルフェンアミド、2−ニトロ−4−メトキシベンゼンスルフェンアミド、トリフェニルメチルスルフェンアミド、3−ニトロピリジンスルフェンアミド(Nps)、p−トルエンスルホンアミド(Ts)、ベンゼンスルホンアミド、2,3,6−トリメチル−4−メトキシベンゼンスルホンアミド(Mtr)、2,4,6−トリメトキシベンゼンスルホンアミド(Mtb)、2,6−ジメチル−4−メトキシベンゼンスルホンアミド(Pme)、2,3,5,6−テトラメチル−4−メトキシベンゼンスルホンアミド(Mte)、4−メトキシベンゼンスルホンアミド(Mbs)、2,4,6−トリメチルベンゼンスルホンアミド(Mts)、

0154

2,6−ジメトキシ−4−メチルベンゼンスルホンアミド(iMds)、2,2,5,7,8−ペンタメチルクロマン−6−スルホンアミド(Pmc)、メタンスルホンアミド(Ms)、β−トリメチルシリルエタンスルホンアミドSES)、9−アントラセンスルホンアミド、4−(4’,8’−ジメトキシナフチルメチル)ベンゼンスルホンアミド(DNMBS)、ベンジルスルホンアミド、トリフルオロメチルスルホンアミドおよびフェナシルスルホンアミド。例示の保護基は本明細書に詳述される。しかしながら本発明は、これらの保護基に限定されることを意図せず、むしろ、種々の追加の等価な保護基が上の基準を使用して容易に同定され、本発明の方法において利用され得る。加えて、種々の保護基についてはProtective Groups in Organic Synthesis, Third Ed. Greene, T.W. and Wuts, P.G., Eds., John Wiley & Sons, New York: 1999に記載されており、この内容の全体は本明細書に参考として組み込まれる。

0155

本明細書に記載のとおり、化合物は、あらゆる数の置換基または官能部分により置換されてよいことが理解される。一般に、用語「任意に」が先行するかどうかに関わらず、用語「置換された」およびこの発明の式中に含まれる置換基は、所与の構造中の水素ラジカルの、特定置換基のラジカルによる置き換えを指す。任意の所与の構造中の1つより多くの位置が、特定群から選択された1より多くの置換基により置換されてもよい場合、置換基は各位置において同一であっても異なっていてもよい。本明細書に使用される用語「置換された」は、有機化合物の全ての許容し得る置換基を含むと考えられる。広い見地からは、許容し得る置換基は、有機化合物の、非環式および環式分枝および非分枝炭素環式およびヘテロ環式芳香族および非芳香族置換基を含む。

0156

窒素などのヘテロ原子は、水素置換基および/またはヘテロ原子の原子価を満たす、本明細書に記載の有機化合物のいずれの許容し得る置換基を有してよい。その上、本発明は、いかなる様式においても、有機化合物の許容し得る置換基によって限定されることを意図しない。本発明により想定される置換基および変数の組み合わせは、好ましくは、例えば感染症または増殖性疾患などの処置に有用な安定な化合物の形成をもたらすものである。用語「安定な」とは、好ましくは、本明細書において、製造を可能とするのに十分な安定性を有し、検出されるのに十分な時間の間化合物の完全性を維持し、好ましくは本明細書に詳述される目的のために十分な時間有用であるような、化合物を指す。

0157

本明細書に使用される用語「脂肪族」は、飽和および不飽和両方の、直鎖(すなわち非分枝)、分枝、非環式、環式または多環式脂肪族炭化水素であって、任意に1以上の官能基により置換されているものを含む。当業者に理解されるとおり、本明細書において「脂肪族」は、これらに限定されないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルシクロアルケニルおよびシクロアルキニル部分を含むことを意図する。よって、本明細書に使用される用語「アルキル」は、直鎖、分枝および環式アルキル基を含む。類似の慣例がその他の一般的用語、例えば「アルケニル」、「アルキニル」などにも適用される。その上、本明細書に使用される用語「アルキル」、「アルケニル」、「アルキニル」などは、置換および非置換基の両方を包含する。ある態様において、本明細書で使用される場合「低級アルキル」は、1〜6個の炭素原子を有するアルキル基(環式、非環式、置換、非置換、分枝または非分枝)を示すために使用される。

0158

ある態様において、本発明に採用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、1〜20個の脂肪族炭素原子を含有する。ある態様において、本発明で採用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、1〜10個の脂肪族炭素原子を含有する。さらに他の態様において、本発明で採用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、1〜8個の脂肪族炭素原子を含有する。さらなる他の態様において、本発明で採用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、1〜6個の脂肪族炭素原子を含有する。さらに他の態様において、本発明で採用されるアルキル、アルケニルおよびアルキニル基は、1〜4個の脂肪族炭素原子を含有する。よって例示の脂肪族基は、これらに限定されないが、例えばメチル、エチル、n−プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、−CH2−シクロプロピル、ビニル、アリル、n−ブチル、sec−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、シクロブチル、−CH2−シクロブチル、n−ペンチル、sec−ペンチル、イソペンチル、tert−ペンチル、シクロペンチル、−CH2−シクロペンチル、n−ヘキシル、sec−ヘキシル、シクロヘキシル、−CH2−シクロヘキシル部分等を含み、これは重ねて、1以上の置換基を有してもよい。アルケニル基は、これらに限定されないが、例えばエテニル、プロペニル、ブテニル、1−メチル−2−ブテン−1−イルなどを含む。代表的なアルキニル基は、これらに限定されないが、エチニル、2−プロピニル(プロパルギル)、1−プロピニルなどを含む。

0159

本発明の化合物の、上記の脂肪族(およびその他の)部分の置換基のいくつかの例は、これらに限定されないが以下を含む:脂肪族;ヘテロ脂肪族アリールヘテロアリールアリールアルキルヘテロアリールアルキル;アルコキシ;アリールオキシ;ヘテロアルコキシ;ヘテロアリールオキシアルキルチオアリールチオヘテロアルキルチオ;ヘテロアリールチオ;−F;−Cl;−Br;−I;−OH;−NO2;−CN;−CF3;−CH2CF3;−CHCl2;−CH2OH;−CH2CH2OH;−CH2NH2;−CH2SO2CH3;−C(O)Rx;−CO2(Rx);−CON(Rx)2;−OC(O)Rx;−OCO2Rx;−OCON(Rx)2;−N(Rx)2;−S(O)2Rx;−NRx(CO)Rx;ここでRxの出現の各々は独立して、これらに限定されないが、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルを含み、ここで、上記および本明細書に記載の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル置換基のいずれもが、置換または非置換、分枝または非分枝、環式または非環式であってよく、およびここで、上記および本明細書に記載のアリールまたはヘテロアリール置換基のいずれもが、置換または非置換であってよい。一般に適用可能な置換基の追加の例は、本明細書に記載の具体的態様により説明される。

0160

本明細書に使用される用語「ヘテロ脂肪族」は、例えば炭素原子の代わりに、1以上の酸素、硫黄、窒素、リンまたはケイ素原子を含む脂肪族部分を指す。ヘテロ脂肪族部分は分枝または非分枝、環式または非環式であってよく、モルホリノピロリジニルなどの飽和および不飽和のヘテロ環を含んでもよい。ある態様において、ヘテロ脂肪族部分は、それ上にある1以上の水素原子の、下記を含むがこれらに限定はされない1以上の部分による独立した置き換えによって置換される:脂肪族;ヘテロ脂肪族;アリール;ヘテロアリール;アリールアルキル;ヘテロアリールアルキル;アルコキシ;アリールオキシ;ヘテロアルコキシ;ヘテロアリールオキシ;アルキルチオ;アリールチオ;ヘテロアルキルチオ;ヘテロアリールチオ;−F;−Cl;−Br;−I;−OH;−NO2;−CN;−CF3;−CH2CF3;−CHCl2;−CH2OH;−CH2CH2OH;−CH2NH2;−CH2SO2CH3;−C(O)Rx;−CO2(Rx);−CON(Rx)2;−OC(O)Rx;−OCO2Rx;−OCON(Rx)2;−N(Rx)2;−S(O)2Rx;−NRx(CO)Rx;ここでRxの出現の各々は独立して、これらに限定されないが、脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリール、ヘテロアリール、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキルを含み、ここで、上記および本明細書に記載の脂肪族、ヘテロ脂肪族、アリールアルキルまたはヘテロアリールアルキル置換基のいずれもが、置換または非置換、分枝または非分枝、環式または非環式であってよく、およびここで、上記および本明細書に記載のアリールまたはヘテロアリール置換基のいずれもが、置換または非置換であってよい。一般に適用可能な置換基の追加の例は、本明細書に記載の具体的態様により説明される。

0161

本明細書に使用される用語「ハロ」および「ハロゲン」は、フッ素塩素臭素およびヨウ素から選択される原子を指す。
用語「アルキル」は、飽和脂肪族基を含み、これは、直鎖アルキル基(例としてメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチルオクチル、ノニルデシルなど)、分枝鎖アルキル基(イソプロピル、tert−ブチル、イソブチルなど)、シクロアルキル(脂環式)基(シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル)、アルキル置換シクロアルキル基およびシクロアルキル置換アルキル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルキルは、6個以下(例として直鎖についてはC1〜C6、分枝鎖についてはC3〜C6)、より好ましくは4個以下の炭素原子をその骨格中に有する。同様に、好ましいシクロアルキルは、3〜8個の炭素原子をその環構造中に有し、より好ましくは5または6個の炭素を環構造中に有する。用語C1〜C6は、1〜6個の炭素原子を含むアルキル基を含有する。

0162

その上、他に特定されない限りにおいて、用語アルキルは、「非置換のアルキル」および「置換アルキル」の両方を含み、その後者は、炭化水素骨格の1以上の炭素上の水素を置き換える独立して選択される置換基を有する、アルキル部分を指す。かかる置換基は、例えば、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシアリールカルボニルオキシアルコキシカルボニルオキシアリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラートアルキルカルボニルアリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニルアルキルアミノカルボニルジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスファート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ(アルキルアミノジアルキルアミノアリールアミノジアリールアミノ、およびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノアルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)、アミジノイミノスルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、スルファート類、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を含む。シクロアルキルは、例として上記の置換基により、さらに置換されてもよい。「アルキルアリール」または「アリールアルキル」部分は、アリールで置換されたアルキル(例としてフェニルメチル(ベンジル))である。用語「アルキル」はまた、天然または非天然のアミノ酸の側鎖をも含む。用語「n−アルキル」は、直鎖(すなわち、非分枝)の非置換のアルキル基を意味する。

0163

用語「アルケニル」は、上記のアルキルと長さが類似し、これと置換が可能な不飽和脂肪族基であるが、少なくとも1つの二重結合を含むものを含む。例えば、用語「アルケニル」は、直鎖アルケニル基(例としてエチレニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルなど)、分枝鎖アルケニル基、シクロアルケニル(脂環式)基(シクロプロペニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル)、アルキルまたはアルケニル置換シクロアルケニル基およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルケニル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルケニル基は、6個以下の炭素原子をその骨格中に有する(例として直鎖についてはC2〜C6、分枝鎖についてC3〜C6)。同様に、シクロアルケニル基は、その環構造中に3〜8個の炭素原子、より好ましくは環構造中に5または6個の炭素を有してもよい。用語C2〜C6は、2〜6個の炭素原子を含むアルケニル基を含有する。

0164

その上、他に特定されない限りにおいて、用語アルケニルは、「非置換のアルケニル」および「置換アルケニル」の両方を含み、その後者は、炭化水素骨格の1以上の炭素上の水素を置き換える独立して選択される置換基を有する、アルケニル部分を指す。かかる置換基は、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスファート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、スルファート類、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を含む。

0165

用語「アルキニル」は、上記のアルキルと長さが類似し、これと置換が可能な不飽和脂肪族基であるが、少なくとも1つの三重結合を含むものを含む。例えば、用語「アルキニル」は、直鎖アルキニル基(例としてエチニル、プロピニル、ブチニルペンチニルヘキシニル、ヘプチニル、オクチニル、ノニニル、デシニルなど)、分枝鎖アルキニル基およびシクロアルキルまたはシクロアルケニル置換アルキニル基を含む。ある態様において、直鎖または分枝鎖アルキニル基は、6個以下の炭素原子をその骨格中に有する(例として直鎖についてはC2〜C6、分枝鎖についてC3〜C6)。用語C2〜C6は、2〜6個の炭素原子を含むアルキニル基を含有する。

0166

その上、他に特定されない限りにおいて、用語アルキニルは、「非置換のアルキニル」および「置換アルキニル」の両方を含み、その後者は、炭化水素骨格の1以上の炭素上の水素を置き換える独立して選択される置換基を有するアルキニル部分を指す。かかる置換基は、例えば、アルキル基、アルキニル基、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスファート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフヒドリル、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、スルファート類、アルキルスルフィニル、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分を含む。

0167

炭素の数が他に特定されない限りにおいて、「低級アルキル」は、本明細書に使用されるとおり、上で定義されるが、1〜5個の炭素原子をその骨格構造中に有するアルキル基を意味する。「低級アルケニル」および「低級アルキニル」は、例えば2〜5個の炭素原子の鎖長を有する。

0168

用語「アルコキシ」は、酸素原子共有結合している置換および非置換のアルキル、アルケニルおよびアルキニル基を含む。アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、イソプロピルオキシプロポキシ、ブトキシおよびペントキシ基を含む。置換アルコキシ基の例は、ハロゲン化アルコキシ基を含む。アルコキシ基は、アルケニル、アルキニル、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキルカルボニルオキシ、アリールカルボニルオキシ、アルコキシカルボニルオキシ、アリールオキシカルボニルオキシ、カルボキシラート、アルキルカルボニル、アリールカルボニル、アルコキシカルボニル、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、ジアルキルアミノカルボニル、アルキルチオカルボニル、アルコキシル、ホスファート、ホスホナート、ホスフィナート、シアノ、アミノ(アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノおよびアルキルアリールアミノを含む)、アシルアミノ(アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、カルバモイルおよびウレイドを含む)、アミジノ、イミノ、スルフフィドリル(sulffydryl)、アルキルチオ、アリールチオ、チオカルボキシラート、スルファート類、アルキルスルフミル(slkylsulfmyl)、スルホナート、スルファモイル、スルホンアミド、ニトロ、トリフルオロメチル、シアノ、アジド、ヘテロシクリル、アルキルアリールまたは芳香族もしくはヘテロ芳香族部分などの、独立して選択される基により置換されていてもよい。ハロゲン置換アルコキシ基の例は、これらに限定されないが、フルオロメトキシ、ジフルオロメトキシトリフルオロメトキシ、クロロメトキシ、ジクロロメトキシ、トリクロロメトキシなどを含む。

0169

用語「疎水性修飾」は、(1)塩基の全体的な疎水性が著しく増大し、(2)塩基が通常のワトソンクリック相互作用に類似するものを形成することができる様式で、修飾される塩基を含む。塩基修飾の例のいくつかは、これらに限定されないが、5位のウリジンおよびシチジン修飾、例えばフェニル、4−ピリジル、2−ピリジル、インドリルおよびイソブチル、フェニル(C6H5OH);トリプトファニル(C8H6N)CH2CH(NH2)CO)、イソブチル、ブチル、アミノベンジル;フェニル;ナフチルを含む。

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