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課題

個体における大腸新生物発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする方法の提供。

解決手段

そのDNAメチル化レベルの変化がアデノーマ又は腺癌などの大腸新生物の発症及び/又は進行を示す核酸分子を対象とする。DNAメチル化状態は、結腸直腸腺癌などの結腸直腸新生物の診断及び/又はモニタリングに関する適用を含むが、これらに限定されない一定範囲の適用に有用である。したがって、関連する態様では、1つ又は複数の核酸分子のDNAメチル化のモジュレーションについてスクリーニングすることにより新生物の発症、発症の素因及び/又は進行についてスクリーニングする方法を対象とする。

概要

背景

結腸直腸がんには、結腸直腸及び虫垂における癌性増殖が含まれる。年あたり世界中で655,000人が死亡しており、結腸直腸がんは合衆国では4番目に一般的な種類のがんであり、西洋世界ではがん関連死の3番目の主因である。結腸直腸がんは結腸において腺腫性ポリープから生じる。これらのキノコ形腫瘍は通常は良性であるが、一部は時間をかけてがんに成長する。限局性結腸がんは結腸内視鏡検査により診断される。

結腸の壁内に限定される浸潤がんTNM分類I及びII)は手術により治療可能である。上記浸潤がんは、処置されなければ、領域リンパ節まで広がり分類III)、そこでは73%までが手術及び化学療法により治療可能である。遠隔部位転移するがん(分類IV)は通常では治療可能ではないが、化学療法は生存延長することができ、ごくまれに、手術と化学療法を組み合わせると患者治癒することがあった(Markowitz and Bertagnolli、2009年、N.Engl.J.Med.361(25):2449〜60頁)。直腸がんには放射線が使用される。

結腸直腸がんにはアデノーマ先行する。アデノーマは、腺組織由来する又は明確に限定された構造を示す上皮起源良性腫瘍又は新生物である。一部のアデノーマは線維組織線維腺腫)及び上皮構造などの認識可能な組織要素を示すが、気管支腺腫などの他のアデノーマは、臨床症候群を生じることもある活性化合物を生成する。

アデノーマは進行して浸潤新生物になることがあり、その場合は、腺癌と呼ばれる。したがって、腺癌は、身体の多くの器官構成部分である線維構造から生じる悪性上皮腫瘍と定義される。用語腺癌は、腺増殖パターンを示す腫瘍にも適用される。これらの腫瘍は、上記腫瘍が生成する物質、たとえば、粘液分泌及び漿液性腺癌に従って、又はパターンへのその細胞微細配置、たとえば、乳頭状及び濾胞腺癌に従って、細分類され得る。これらのカルシノーマは、固形の場合もあれば嚢胞性嚢胞腺癌)の場合もある。それぞれの器官は、種々の組織学的種類を示す腫瘍を生じることがあり、たとえば、卵巣粘液性腺癌も嚢胞腺癌も生じることがある。

アデノーマは器官が異なれば振る舞いも異なる。一般に、カルシノーマがアデノーマ内に存在する(すなわち、がんの病巣良性病変内で発生している)全体的可能性はおよそ5%である。しかし、これはアデノーマのサイズと関係がある。たとえば、大腸(具体的には結腸及び直腸)では、アデノーマ内でのがんの発生は、1センチメートル未満のアデノーマではまれである。大きさが4センチメートルを超えており、絨毛状変化又は高度異形成などのある種の組織学的変化を示すアデノーマではそのような発生は40〜50%と推定される。異形成の程度が高いアデノーマほど、カルシノーマの発生率が高くなる。所与結腸直腸アデノーマでは、上記器官中の現在のがんの存在又は将来のがん発生の予測因子には、管状から絨毛状形態への変化のサイズ(特に9mmを超える)程度、高度異形成の存在及び「鋸歯状アデノーマ」として記載される形態学的変化が含まれる。所与の個体では、加齢、結腸直腸アデノーマ若しくはがんの家族内発症雄性又はアデノーマの多重度という追加の特長が、上記器官におけるがんリスクの将来の増加、いわゆるがんのリスク因子予想する。アデノーマの存在及びそのサイズを除いて、これらの特長はどれ1つとして客観的に定義されておらず、数とサイズ以外の特長はすべて観察者誤差及び問題の特長の正確な定義に関して混同に陥りやすい。そのような因子は評価し定義するのが困難になることがあるために、がんの現在又は将来のリスクの予測因子としてのその価値は不正確である。

散発性アデノーマが発症してしまうと、新しいアデノーマが発生する可能性は26か月以内でおよそ30%である。

結腸直腸がんの症状は、大腸における腫瘍の位置及び腫瘍が転移してしまったかどうかに依拠する。不運にも、症状の多くは他の疾患でも同様に起こり得るもので、したがって、症状は結腸直腸がんの決定的診断には役立たない場合がある。

局所症状は、腫瘍が肛門近くに位置している場合は可能性が高くなる。排便習慣の変化(別の原因の非存在下での初発便秘又は下痢)、不完全排便感及び糞便径の減少が生じる場合がある。テネスムス及び糞便形状の変化は両方とも直腸がんに特徴的である。粘液の存在の増加と同じように、糞便中明赤色血液の排泄を含む下部消化管出血は、結腸直腸がんを示している場合がある。外見タール様の黒色便であるメレナは、通常は上部消化管出血において(たとえば、十二指腸潰瘍から)起こるが、疾患が大腸の起始部に位置する場合には結腸直腸がんにおいて遭遇することもある。

腸の全菅腔を満たすほど大きい腫瘍は、腸閉塞を引き起こし得る。このような状況は、便秘、腹痛腹部膨満及び嘔吐により特徴付けられる。このために、閉塞性及び膨張した腸穿孔をもたらし腹膜炎を引き起こすこともある。

上記疾患がさらに進行すると結腸直腸がんのある種の局所的効果が生じる。腹部に触れると大きな腫瘍のほうが気づかれやすく、医師又は身体検査により気がつかれ得る。上記疾患は他の器官を浸潤し得、尿又は排泄物中に血液又は空気を引き起こし得る。

腫瘍が慢性的潜血を引き起こした場合、鉄欠乏性貧血が起こり得る。これは、疲労、動悸として経験され、蒼白として気づかれ得る。結腸直腸がんは、一般には食欲減退のせいで体重が低下することもある。

さらに普通でない全身症状未解明の熱及びいくつかの腫瘍随伴症候群のうちの1つである。もっとも一般的な腫瘍随伴症候群は、血栓症、通常は深在静脈血栓症である。

結腸直腸がんはもっとも一般的に肝臓まで広がる。これは気がつかれないまま進行することがあるが、肝臓中の大きな沈着物黄疸及び腹痛を引き起こし得る(伸長に起因する)。腫瘍沈着物が胆管遮断する場合、黄疸は蒼白色の糞便などの胆管閉塞という他の特長を伴うことがある。

結腸直腸がんは発症するのに何年もかかることがあり、結腸直腸がんの初期検出は予後を大いに改善する。結腸直腸がんスクリーニング法を実行する控えめな努力でさえ、がん死亡を低下させることが可能である。これにもかかわらず、結腸直腸がんスクリーニング率は依然として低い。現在、この目的のために利用可能であるいくつかの異なる検査が存在する:
・直腸指診:医師は潤滑剤を付け手袋をした指を直腸に挿入し、指の感覚で異常な領域を探す。直腸指診は直腸の末端部分において感じ取れるほどの大きさの腫瘍を検出するのみであるが、最初のスクリーニング検査として有用である。
・糞便潜血検査:糞便中の血液を調べる検査。糞便中の潜血を検出するためには2種類の検査、すなわち、グアヤクベース化学的検査)の検査と免疫化学的検査を使用することが可能である。免疫化学的検査の感度は、特異性容認できないほど減少することなく、化学的検査よりも優れている(Weitzel JN(December 1999年)。「遺伝的癌リスク評価 まとめ(Genetic cancer risk assessment. Putting it all together)」。Cancer 86(11 suppl):2483〜92頁)。
・内視鏡検査:
S字結腸鏡検査照明付きプローブ(lit probe)(S字結腸鏡検査)が直腸及び結腸下部内に挿入されて、ポリープ及び他の異常について検査する。
*結腸内視鏡検査:結腸内視鏡と呼ばれる照明付きプローブが直腸及び全結腸内に挿入されて、がんにより引き起こされることがあるポリープ及び他の異常を探す。結腸内視鏡検査には、その処置中にポリープが見つかった場合には、ポリープを直ちに除去することができるという利点がある。組織生検のために採取することもできる。
・二重造影注腸(DCBE):先ず、一晩置いた調製物を取って結腸を洗浄する。硫酸バリウムを含有する浣腸液を投与し、次に結腸に空気を吹き込み、膨張させる。その結果、結腸の内層全体にバリウム薄層ができ、これはX線フィルム上で可視になる。がん又は前がん性ポリープはこのようにして検出することが可能である。この技法では(より一般的ではない)平坦なポリープは見逃されることがある。
バーチャル結腸鏡検査は、二重造影注腸におけるX線フィルム(上記)を特殊なコンピュータ断層撮影スキャンで置き換えており、放射線科医解釈することができるように特殊なワークステーションソフトウェアを必要とする。この技法は、ポリープに対する感度では結腸内視鏡検査に近づいている。しかし、それでも見つかるどんなポリープも標準結腸内視鏡検査により除去しなければならない。
標準コンピュータ体軸断層撮影は、がんの広がりの程度を決定するのに使用することができるX線法であるが、スクリーニングのために使用できるほどの感度はない。一部のがんは、他の理由で実施されるCATスキャンに見つけられる。
血液検査:ある種のタンパク質レベルの上昇について患者の血液を測定することにより、腫瘍量を示すことが可能になる。特に、血液中癌胎児性抗原CEA)レベルが高ければ腺癌が転移していることを示すことができる。これらの検査は偽陽性又は偽陰性であることが多く、スクリーニングには推奨されないが、疾患再発を評価するには有用になり得る。CA19−9及びCA242バイオマーカーは、e−セレクチン関連転移リスクを示し、治療進展を追跡するのに役立ち、疾患再発を評価することができる。最近、セプチン9遺伝子のメチル化された配列の血漿中での検出のためのアッセイも利用できるようになって結腸直腸がんの診断に役立っている。
ポジトロン放射形断層撮影(PET)は、3次元走査技術であり、放射性糖が患者に注入され、上記糖は代謝活性が高い組織に集まり、上記糖からの放射線の放出を測定することにより画像が形成される。がん細胞は非常に高い代謝率を有する場合が多いので、これを使用して良性と悪性腫瘍を区別することが可能である。PETはスクリーニングには使用されず、結腸直腸がん症例の定常精密検査には(まだ)用いられない。
・糞便DNA検査は、結腸直長がんについてのスクリーニングにおける先端技術である。前悪性アデノーマ及びがんはDNAマーカーをその細胞から放ち、このマーカー消化過程中分解されず糞便中で安定なままである。捕獲とそれに続くPCRにより、上記DNAをアッセイのための検出可能レベルにまで増幅させる。
リスクマーカーとしての高いC反応性タンパク質レベル

概要

個体における大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする方法の提供。そのDNAメチル化レベルの変化がアデノーマ又は腺癌などの大腸新生物の発症及び/又は進行を示す核酸分子を対象とする。DNAメチル化状態は、結腸直腸腺癌などの結腸直腸新生物の診断及び/又はモニタリングに関する適用を含むが、これらに限定されない一定範囲の適用に有用である。したがって、関連する態様では、1つ又は複数の核酸分子のDNAメチル化のモジュレーションについてスクリーニングすることにより新生物の発症、発症の素因及び/又は進行についてスクリーニングする方法を対象とする。なし

目的

本発明の関連する態様は、
(i)上文に記載される新生物マーカーDNAのうちのいずれか1つ若しくは複数に対応するヌクレオチド配列又はその配列に少なくとも80%の同一性を示す配列を含む核酸分子或いは上記核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント又は相同体、又は
(ii)中程度の厳密性条件下で(i)の配列のうちのいずれか1つ若しくは複数にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む核酸分子又は上記核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくは相同体、又は
(iii)中程度の厳密性条件下で(i)の配列のうちのいずれか1つ若しくは複数にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む核酸プローブ若しくはオリゴヌクレオチド又は上記核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくは相同体、又は
(iv)(i)の核酸分子又はその核酸分子の誘導体、断片若しくは相同体によりコードされるタンパク質のうちのいずれか1つ若しくは複数に結合することができるプローブ
のうちの複数を含む分子アレイであって、
(i)の上記マーカー遺伝子若しくは(iv)のタンパク質の発現レベルが大腸に由来する細胞若しくは細胞亜集団新生物状態を示している、
分子アレイを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

個体における大腸新生物発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又は新生物の進行をモニターする方法であって、前記個体由来生体試料において(i)Hg19座標のうちのいずれか1つ又は複数及び転写開始部位の2kb上流により定義される領域、(ii)のうちのいずれか1つ又は複数の、2kb上流を含む、遺伝子領域から選択されるDNA領域メチル化状態を評価することを含み、対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域のメチル化のより高いレベルは大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示している、方法。

請求項2

前記1つ又は複数のDNA領域が(i)Hg19座標のうちのいずれか1つ又は複数及び転写開始部位の2kb上流により定義される領域、(ii)のうちのいずれか1つ又は複数の、2kb上流を含む、遺伝子領域から選択される、請求項1に記載の方法。

請求項3

個体における大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又は新生物の進行をモニターする方法であって、前記個体由来の生体試料においてHg19座標により定義されるDNA領域、から選択される1つ又は複数のDNA領域のメチル化状態を評価することを含み、対照レベルと比べて前記DNA領域のメチル化のより高いレベルは大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示している、方法。

請求項4

前記DNA領域がHg19座標により定義されるDNA領域、から選択される、請求項3に記載の方法。

請求項5

前記DNA領域がHg19座標により定義されるDNA領域、から選択される、請求項4に記載の方法。

請求項6

前記新生物細胞アデノーマ又は腺癌である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。

請求項7

前記対照レベルが非新生物レベルである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。

請求項8

前記新生物が結腸直腸新生物である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。

請求項9

前記生体試料が糞便試料浣腸洗浄水外科切除組織生検又は血液試料である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。

請求項10

前記発現レベルゲノムDNAの変化についてスクリーニングすることにより評価される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

ゲノムDNAの前記変化がDNAメチル化の変化である、請求項10に記載の方法。

請求項12

前記個体由来の生体試料においてから選択される1つ若しくは複数のシトシン残基又は反対DNA鎖上のn+1位の対応するシトシンのメチル化を評価することを含む方法であって、対照試料における対応する残基のメチル化レベルと比べた前記残基のうちの1つ又は複数のより高いメチル化レベルが大腸新生物又は新生物状態の発症の素因を示している、請求項11に記載の方法。

請求項13

前記1つ又は複数のシトシン残基がから選択される、請求項12に記載の方法。

請求項14

前記発現レベルが、前記遺伝子が会合しているクロマチンタンパク質の変化についてスクリーニングすることにより評価される、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。

請求項15

個体における大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又は大腸新生物をモニターする方法であって、前記個体由来の生体試料において(i)Hg19座標のうちのいずれか1つ又は複数及び転写開始部位の2kb上流により定義される領域、(ii)のうちのいずれか1つ又は複数の2kb上流を含む遺伝子領域から選択されるDNA領域の発現のレベルを評価することを含み、対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の発現のより低いレベルは大腸新生物又は新生物状態の発症の素因を示している、方法。

請求項16

前記1つ又は複数の遺伝子又は転写物が(i)Hg19座標のうちのいずれか1つ又は複数及び転写開始部位の2kb上流により定義される領域、(ii)のうちのいずれか1つ又は複数の2kb上流を含む遺伝子領域から選択される、請求項15に記載の方法。

請求項17

前記発現レベルが、mRNA発現又はタンパク質発現である、請求項15又は16に記載の方法。

請求項18

前記個体がヒトである、請求項1〜17のいずれか一項に記載の方法。

請求項19

アレイが(i)請求項1〜5のいずれか1つに収載されるDNA領域のうちのいずれか1つ若しくは複数に対応するヌクレオチド配列又はその配列に少なくとも80%の同一性を示す配列を含む核酸分子或いは前記核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント又は相同体、又は(ii)中程度の厳密性条件下で(i)の配列のうちのいずれか1つ若しくは複数にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む核酸分子又は前記核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくは相同体、又は(iii)中程度の厳密性条件下で(i)の配列のうちのいずれか1つ若しくは複数にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む核酸プローブ若しくはオリゴヌクレオチド又は前記核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくは相同体、又は(iv)(i)の核酸分子又はその誘導体、断片若しくは相同体によりコードされるタンパク質のうちのいずれか1つ若しくは複数に結合することができるプローブのうちの複数を含み、(i)の前記マーカー遺伝子若しくは(iv)のタンパク質の発現レベルが大腸に由来する細胞若しくは細胞亜集団の新生物状態を示している、分子アレイ

技術分野

0001

本発明は一般的には、そのDNAメチル化レベルの変化が新生物発症又は新生物の発症の素因を示す核酸分子に関する。より詳細には、本発明は、そのDNAメチル化レベルの変化がアデノーマ又は腺癌などの大腸新生物の発症及び/又は進行を示す核酸分子を対象とする。本発明のDNAメチル化状態は、結腸直腸腺癌などの結腸直腸新生物の診断及び/又はモニタリングに関連する適用を含むが、これらの限定されない一定範囲の適用に有用である。したがって、関連する態様では、本発明は、1つ又は複数の核酸分子のDNAメチル化のモジュレーションについてスクリーニングすることにより新生物の発症、発症の素因及び/又は進行についてスクリーニングする方法を対象とする。

背景技術

0002

結腸直腸がんには、結腸直腸及び虫垂における癌性増殖が含まれる。年あたり世界中で655,000人が死亡しており、結腸直腸がんは合衆国では4番目に一般的な種類のがんであり、西洋世界ではがん関連死の3番目の主因である。結腸直腸がんは結腸において腺腫性ポリープから生じる。これらのキノコ形腫瘍は通常は良性であるが、一部は時間をかけてがんに成長する。限局性結腸がんは結腸内視鏡検査により診断される。

0003

結腸の壁内に限定される浸潤がんTNM分類I及びII)は手術により治療可能である。上記浸潤がんは、処置されなければ、領域リンパ節まで広がり分類III)、そこでは73%までが手術及び化学療法により治療可能である。遠隔部位転移するがん(分類IV)は通常では治療可能ではないが、化学療法は生存延長することができ、ごくまれに、手術と化学療法を組み合わせると患者治癒することがあった(Markowitz and Bertagnolli、2009年、N.Engl.J.Med.361(25):2449〜60頁)。直腸がんには放射線が使用される。

0004

結腸直腸がんにはアデノーマが先行する。アデノーマは、腺組織由来する又は明確に限定された構造を示す上皮起源良性腫瘍又は新生物である。一部のアデノーマは線維組織線維腺腫)及び上皮構造などの認識可能な組織要素を示すが、気管支腺腫などの他のアデノーマは、臨床症候群を生じることもある活性化合物を生成する。

0005

アデノーマは進行して浸潤新生物になることがあり、その場合は、腺癌と呼ばれる。したがって、腺癌は、身体の多くの器官構成部分である線維構造から生じる悪性上皮腫瘍と定義される。用語腺癌は、腺増殖パターンを示す腫瘍にも適用される。これらの腫瘍は、上記腫瘍が生成する物質、たとえば、粘液分泌及び漿液性腺癌に従って、又はパターンへのその細胞微細配置、たとえば、乳頭状及び濾胞腺癌に従って、細分類され得る。これらのカルシノーマは、固形の場合もあれば嚢胞性嚢胞腺癌)の場合もある。それぞれの器官は、種々の組織学的種類を示す腫瘍を生じることがあり、たとえば、卵巣粘液性腺癌も嚢胞腺癌も生じることがある。

0006

アデノーマは器官が異なれば振る舞いも異なる。一般に、カルシノーマがアデノーマ内に存在する(すなわち、がんの病巣良性病変内で発生している)全体的可能性はおよそ5%である。しかし、これはアデノーマのサイズと関係がある。たとえば、大腸(具体的には結腸及び直腸)では、アデノーマ内でのがんの発生は、1センチメートル未満のアデノーマではまれである。大きさが4センチメートルを超えており、絨毛状変化又は高度異形成などのある種の組織学的変化を示すアデノーマではそのような発生は40〜50%と推定される。異形成の程度が高いアデノーマほど、カルシノーマの発生率が高くなる。所与の結腸直腸アデノーマでは、上記器官中の現在のがんの存在又は将来のがん発生の予測因子には、管状から絨毛状形態への変化のサイズ(特に9mmを超える)程度、高度異形成の存在及び「鋸歯状アデノーマ」として記載される形態学的変化が含まれる。所与の個体では、加齢、結腸直腸アデノーマ若しくはがんの家族内発症、雄性又はアデノーマの多重度という追加の特長が、上記器官におけるがんリスクの将来の増加、いわゆるがんのリスク因子予想する。アデノーマの存在及びそのサイズを除いて、これらの特長はどれ1つとして客観的に定義されておらず、数とサイズ以外の特長はすべて観察者誤差及び問題の特長の正確な定義に関して混同に陥りやすい。そのような因子は評価し定義するのが困難になることがあるために、がんの現在又は将来のリスクの予測因子としてのその価値は不正確である。

0007

散発性アデノーマが発症してしまうと、新しいアデノーマが発生する可能性は26か月以内でおよそ30%である。

0008

結腸直腸がんの症状は、大腸における腫瘍の位置及び腫瘍が転移してしまったかどうかに依拠する。不運にも、症状の多くは他の疾患でも同様に起こり得るもので、したがって、症状は結腸直腸がんの決定的診断には役立たない場合がある。

0009

局所症状は、腫瘍が肛門近くに位置している場合は可能性が高くなる。排便習慣の変化(別の原因の非存在下での初発便秘又は下痢)、不完全排便感及び糞便径の減少が生じる場合がある。テネスムス及び糞便形状の変化は両方とも直腸がんに特徴的である。粘液の存在の増加と同じように、糞便中明赤色血液の排泄を含む下部消化管出血は、結腸直腸がんを示している場合がある。外見タール様の黒色便であるメレナは、通常は上部消化管出血において(たとえば、十二指腸潰瘍から)起こるが、疾患が大腸の起始部に位置する場合には結腸直腸がんにおいて遭遇することもある。

0010

腸の全菅腔を満たすほど大きい腫瘍は、腸閉塞を引き起こし得る。このような状況は、便秘、腹痛腹部膨満及び嘔吐により特徴付けられる。このために、閉塞性及び膨張した腸穿孔をもたらし腹膜炎を引き起こすこともある。

0011

上記疾患がさらに進行すると結腸直腸がんのある種の局所的効果が生じる。腹部に触れると大きな腫瘍のほうが気づかれやすく、医師又は身体検査により気がつかれ得る。上記疾患は他の器官を浸潤し得、尿又は排泄物中に血液又は空気を引き起こし得る。

0012

腫瘍が慢性的潜血を引き起こした場合、鉄欠乏性貧血が起こり得る。これは、疲労、動悸として経験され、蒼白として気づかれ得る。結腸直腸がんは、一般には食欲減退のせいで体重が低下することもある。

0013

さらに普通でない全身症状未解明の熱及びいくつかの腫瘍随伴症候群のうちの1つである。もっとも一般的な腫瘍随伴症候群は、血栓症、通常は深在静脈血栓症である。

0014

結腸直腸がんはもっとも一般的に肝臓まで広がる。これは気がつかれないまま進行することがあるが、肝臓中の大きな沈着物黄疸及び腹痛を引き起こし得る(伸長に起因する)。腫瘍沈着物が胆管遮断する場合、黄疸は蒼白色の糞便などの胆管閉塞という他の特長を伴うことがある。

0015

結腸直腸がんは発症するのに何年もかかることがあり、結腸直腸がんの初期検出は予後を大いに改善する。結腸直腸がんスクリーニング法を実行する控えめな努力でさえ、がん死亡を低下させることが可能である。これにもかかわらず、結腸直腸がんスクリーニング率は依然として低い。現在、この目的のために利用可能であるいくつかの異なる検査が存在する:
・直腸指診:医師は潤滑剤を付け手袋をした指を直腸に挿入し、指の感覚で異常な領域を探す。直腸指診は直腸の末端部分において感じ取れるほどの大きさの腫瘍を検出するのみであるが、最初のスクリーニング検査として有用である。
・糞便潜血検査:糞便中の血液を調べる検査。糞便中の潜血を検出するためには2種類の検査、すなわち、グアヤクベース化学的検査)の検査と免疫化学的検査を使用することが可能である。免疫化学的検査の感度は、特異性容認できないほど減少することなく、化学的検査よりも優れている(Weitzel JN(December 1999年)。「遺伝的癌リスク評価 まとめ(Genetic cancer risk assessment. Putting it all together)」。Cancer 86(11 suppl):2483〜92頁)。
・内視鏡検査:
S字結腸鏡検査照明付きプローブ(lit probe)(S字結腸鏡検査)が直腸及び結腸下部内に挿入されて、ポリープ及び他の異常について検査する。
*結腸内視鏡検査:結腸内視鏡と呼ばれる照明付きプローブが直腸及び全結腸内に挿入されて、がんにより引き起こされることがあるポリープ及び他の異常を探す。結腸内視鏡検査には、その処置中にポリープが見つかった場合には、ポリープを直ちに除去することができるという利点がある。組織生検のために採取することもできる。
・二重造影注腸(DCBE):先ず、一晩置いた調製物を取って結腸を洗浄する。硫酸バリウムを含有する浣腸液を投与し、次に結腸に空気を吹き込み、膨張させる。その結果、結腸の内層全体にバリウム薄層ができ、これはX線フィルム上で可視になる。がん又は前がん性ポリープはこのようにして検出することが可能である。この技法では(より一般的ではない)平坦なポリープは見逃されることがある。
バーチャル結腸鏡検査は、二重造影注腸におけるX線フィルム(上記)を特殊なコンピュータ断層撮影スキャンで置き換えており、放射線科医解釈することができるように特殊なワークステーションソフトウェアを必要とする。この技法は、ポリープに対する感度では結腸内視鏡検査に近づいている。しかし、それでも見つかるどんなポリープも標準結腸内視鏡検査により除去しなければならない。
標準コンピュータ体軸断層撮影は、がんの広がりの程度を決定するのに使用することができるX線法であるが、スクリーニングのために使用できるほどの感度はない。一部のがんは、他の理由で実施されるCATスキャンに見つけられる。
血液検査:ある種のタンパク質レベルの上昇について患者の血液を測定することにより、腫瘍量を示すことが可能になる。特に、血液中癌胎児性抗原CEA)レベルが高ければ腺癌が転移していることを示すことができる。これらの検査は偽陽性又は偽陰性であることが多く、スクリーニングには推奨されないが、疾患再発を評価するには有用になり得る。CA19−9及びCA242バイオマーカーは、e−セレクチン関連転移リスクを示し、治療進展を追跡するのに役立ち、疾患再発を評価することができる。最近、セプチン9遺伝子のメチル化された配列の血漿中での検出のためのアッセイも利用できるようになって結腸直腸がんの診断に役立っている。
ポジトロン放射形断層撮影(PET)は、3次元走査技術であり、放射性糖が患者に注入され、上記糖は代謝活性が高い組織に集まり、上記糖からの放射線の放出を測定することにより画像が形成される。がん細胞は非常に高い代謝率を有する場合が多いので、これを使用して良性と悪性腫瘍を区別することが可能である。PETはスクリーニングには使用されず、結腸直腸がん症例の定常精密検査には(まだ)用いられない。
・糞便DNA検査は、結腸直長がんについてのスクリーニングにおける先端技術である。前悪性アデノーマ及びがんはDNAマーカーをその細胞から放ち、このマーカー消化過程中分解されず糞便中で安定なままである。捕獲とそれに続くPCRにより、上記DNAをアッセイのための検出可能レベルにまで増幅させる。
リスクマーカーとしての高いC反応性タンパク質レベル

発明が解決しようとする課題

0016

これらの検査法が存在するが、診断は依然として問題がある。さらに感度の良い検査の大半は極めて侵襲的で高価であり、したがって患者による取り込みが低い。したがって、アデノーマ又はカルシノーマを発症している可能性の高い人に結腸内視鏡検査を受診するよう指示できるようになるようなもっと簡便でもっと情報価値のある診断プロトコール又は診断に役立つものを開発する必要性が現在も持続して存在する。簡便で正確なスクリーニング検査があれば、はるかに広く適用可能なスクリーニングシステムを提供できるようになると考えられる。

0017

本発明へとつながる研究において、ある種の遺伝子のメチル化の変化が、アデノーマ及び腺癌などの大腸の新生物の発生を示すことが確定された。さらに、高度メチル化される特定のゲノムDNAシトシンヌクレオチドが同定されたことにより、診断という状況での常用のための非常に簡便で特異的な増幅反応の開発が可能になった。したがって、これらの差次的にメチル化された遺伝子のパネルのうちの1つ又は複数についてのスクリーニングに基づいて診断を下すことが可能である。したがって、発明者らは、腺癌及びアデノーマ発生の診断及び/又はこれらの種類の新生物の発生により特徴付けられる状態のモニタリングを促進する遺伝子のパネルを特定した。

課題を解決するための手段

0018

本明細書及びこれに続く特許請求の範囲全体を通して、文脈が他の方法で要求していなければ、単語「含む(comprise)」並びに「comprises」及び「comprising」などの変化は、述べられている整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含むが、他のいかなる整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を排除しないことを意味すると解釈されることになる。

0019

本明細書で使用されるように、用語「に由来する」は、特定の整数又は整数の群が明記されている種に由来しているが、必ずしも明記された供給源から直接入手されたわけではないことを示すと解釈されるものとする。さらに、本明細書で使用されるように、単数形の「a」、「an」及び「the」は、文脈が他の方法で明白に指示していなければ、複数の指示対象を含む。

0020

本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、他の方法で定義されていなければ、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。

0021

主題の明細書は、文献目録の後で本明細書に提示されるプログラムPatentInバージョン3.5を使用して準備されたヌクレオチド配列情報を含有する。それぞれのヌクレオチド配列は、数字指標<210>、続いて配列識別子(たとえば、<210>1、<210>2、等)により配列表において特定される。配列(DNA、等)の長さ、種類、及び配列ごとの供給源生物は、それぞれ数字指標フィールド<211>、<212>及び<213>に提供される情報により示される。明細書において言及されるヌクレオチド配列は、指標配列番号、続いて配列識別子(たとえば、配列番号1、配列番号2、等)により特定される。明細書において言及される配列識別子は、配列識別子(たとえば、<400>1、<400>2、等)が後に続く、配列表における数字指標フィールド<400>に提供される情報と相互関係がある。すなわち、明細書において詳述される配列番号1は、配列表において<400>1として示される配列と相互関係がある。

0022

本発明の一態様は、個体における大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又は大腸新生物をモニターする方法であって、
上記個体由来生体試料において
(i)Hg19座標のうちのいずれか1つ又は複数及び転写開始部位の2kb上流により定義される領域、




(ii)




のうちのいずれか1つ又は複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
から選択されるDNA領域メチル化状態を評価することを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域のメチル化のより高いレベルは大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示している、
方法を対象とする。

0023

別の態様では、個体における大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又は大腸新生物をモニターする方法であって、
上記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標のうちのいずれか1つ又は複数及び転写開始部位の2kb上流により定義される領域、




(ii)




のうちのいずれか1つ又は複数の、2kb上流を含む、遺伝子領域
から選択されるDNA領域のメチル化状態を評価することを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域のメチル化のより高いレベルは大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示している、
方法が提供される。

0024

特定の有用性を示すと確定された小領域(subregion)は、上記小領域が見出される遺伝子及び染色体領域を参照して下に収載されている。

0025

さらに別の実施形態では、個体における大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又は大腸新生物をモニターする方法であって、
上記個体由来の生体試料において


















から選択される1つ又は複数のシトシン残基、又は反対のDNA鎖上のn+1位の対応するシトシンのメチル化を評価することを含み、対照試料における対応する残基のメチル化レベルと比べて上記残基のうちの1つ又は複数のメチル化のより高いレベルは大腸新生物又は新生物状態の発症の素因を示している、
方法が提供される。

0026

さらに別の態様では、本発明は、個体における大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又は大腸新生物をモニターする方法であって、
上記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標のうちのいずれか1つ又は複数及び転写開始部位の2kb上流により定義される領域、




(ii)




のうちのいずれか1つ又は複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
から選択されるDNA領域の発現レベルを評価することを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の発現のより低いレベルは大腸新生物又は新生物状態の発症の素因を示している、
方法を対象とする。

0027

本発明の関連する態様は、
(i)上文に記載される新生物マーカーDNAのうちのいずれか1つ若しくは複数に対応するヌクレオチド配列又はその配列に少なくとも80%の同一性を示す配列を含む核酸分子或いは上記核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント又は相同体、又は
(ii)中程度の厳密性条件下で(i)の配列のうちのいずれか1つ若しくは複数にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む核酸分子又は上記核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくは相同体、又は
(iii)中程度の厳密性条件下で(i)の配列のうちのいずれか1つ若しくは複数にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列を含む核酸プローブ若しくはオリゴヌクレオチド又は上記核酸分子の機能的誘導体、断片、バリアント若しくは相同体、又は
(iv)(i)の核酸分子又はその核酸分子の誘導体、断片若しくは相同体によりコードされるタンパク質のうちのいずれか1つ若しくは複数に結合することができるプローブ
のうちの複数を含む分子アレイであって、
(i)の上記マーカー遺伝子若しくは(iv)のタンパク質の発現レベルが大腸に由来する細胞若しくは細胞亜集団の新生物状態を示している、
分子アレイを提供する。

図面の簡単な説明

0028

図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
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図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
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図1及び図2は、それぞれ表3及び4に示される遺伝子の差次的メチル化プロットを描いている。タイル領域の染色体座標はX軸に示されている。TaqI及びMspI制限部位の位置は破線の垂直線により示されている。Y軸上にはハイブリダイゼーション強度が示されている(log2スケール)。上欄では、それぞれのプローブ位置は、正常及びがんDNAのメチル化された割合(それぞれGN及びGT)並びにその非メチル化割合(それぞれAN及びAT)のシグナルで表されている。がんと正常間の差次的メチル化を表す「二重差」(GT−GN)−(AT−AN)は、最高の17%クオリティスコアのプローブは黒DDとして、上位43%におけるプローブは灰色DDとして及びさらに低いクオリティスコアのプローブ又はTaqI若しくはMspI制限部位から300bp向こうにあるプローブは灰色点として示されている。すべてのDDプローブポイントは、明確にするため丸で囲まれている。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコン亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
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図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
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図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。
図3〜図27は、24の遺伝子由来の1つ若しくは複数のアンプリコンの亜硫酸水素塩配列分析から得られるDNAメチル化のプロファイルを示している。それぞれの図では、上のボックスは、遺伝子(Hg19配列)の及び個々のアンプリコンの染色体座標を示している。DNAメチル化プロットは、配列分析により決定されるそれぞれのCpG部位でのメチル化されたシトシンの割合(Y軸)を示している。アンプリコン内のそれぞれのCpG部位の位置はX軸に示されている。個々の灰色点は、10のがんDNAについてのそれぞれのCpG部位でのメチル化割合を表し、上記10の試料の平均メチル化は連続する灰色線により、四分位範囲は斜線部分により示されている。同様に、正常なDNA試料のメチル化割合は黒点により示され、平均メチル化及び四分位範囲はそれぞれ黒線及び黒斜線部分により示されている。血液DNAにおけるメチル化割合は明灰色破線により示されている(これは正常組織DNAについてのメチル化データにより不明瞭になることが多い)。図は、亜硫酸水素塩修飾に先立って、PCRアンプリコンごとの配列領域も含む。いくつかの場合、遺伝子転写の方向に対して下部鎖に設計されており、これらはBSと呼ばれる。図の下のピクトグラムは、遺伝子の染色体位置並びに遺伝子転写物の位置及びエクソン構造、Affymetrix U133 Plusプローブセットの位置とCpGアイランドの位置、並びに異なる増幅された領域の位置を示すマップを示している。

実施例

0029

本発明は、一部は大腸新生物を特徴付けるDNAメチル化状態の解明に基づいている。この所見のせいで、対照レベルと比べたある種の遺伝子のメチル化の増加に基づいて、大腸新生物の発症又は発症の素因についてスクリーニングする又は大腸新生物をモニターする常用手段の開発は今や促進されている。

0030

本発明に従って、問題の細胞が新生物であるか否かに応じて、ある種の遺伝子は、メチル化のレベルの差次的変化の点からモジュレートしていることが確定された。問題の遺伝子は、その名称とその染色体座標を参照することの両方により本明細書では記載されることは理解されるべきである。Nimblegenプロモータータイリングアレイタイリング領域の染色体座標は、ヒトゲノムデータベースバージョンHg18(本明細書では「Hg18座標」と呼ばれ、表3及び4に詳述されている)と一致している。ゲノム名称に対応する染色体座標が収載されている限り、これら染色体座標は2009年2月に公表されたヒトゲノムデータベースバージョンHg19(本明細書では「Hg19座標」と呼ばれる)と一致している。

0031

したがって、本発明の一態様は、個体における大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又は大腸新生物をモニターする方法であって、
上記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標のうちのいずれか1つ又は複数及び転写開始部位の2kb上流により定義される領域、




(ii)




のうちのいずれか1つ又は複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
から選択されるDNA領域のメチル化状態を評価することを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域のメチル化のより高いレベルは大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示している、
方法を対象とする。

0032

「大腸」への言及は、大腸の8つの解剖学的領域であって、回腸末端領域の後で始まり、これらの領域が
(i)盲腸
(ii)上行結腸
(iii)横行結腸
(iv)下行結腸
(v)S状結腸
(vi)直腸
(vii)弯曲部、及び
(viii)右結腸曲
である領域のうちの1つに由来する細胞への言及として理解されるべきである。

0033

「新生物」への言及は、病変、腫瘍又は他の被包性若しくは非被包性腫瘤又は新生物細胞を含む他の形態の成長への言及として理解されるべきである。「新生物細胞」は、異常な成長を示す細胞への言及として理解されるべきである。用語「成長」はそのもっとも広い意味で理解されるべきであり、増殖への言及を含む。この点に関して、異常な細胞成長の例は、細胞の制御されない増殖である。別の例は、細胞における失敗したアポトーシスであり、したがって細胞の通常の寿命の延長である。新生物細胞は良性細胞のこともあれば悪性細胞であることもある。好ましい実施形態では、対象の新生物はアデノーマ又は腺癌である。本発明をどれか1つの理論又は作用機序に限定せずに、アデノーマは一般には、上皮組織由来である又は明確に限定された上皮構造を示す上皮起源の良性腫瘍である。これらの構造物は腺外見を帯びることもある。アデノーマは、良性アデノーマ又は良性新生物病変の悪性腺癌への進行とともに起こるなどの、その内部に悪性細胞集団を含むことがある。

0034

好ましくは、上記新生物細胞はアデノーマ又は腺癌であり、さらに好ましくは、結腸直腸アデノーマ又は腺癌である。

0035

「DNA領域」への言及は、ゲノムDNAの特定のセクションへの言及として理解されるべきである。これらのDNA領域は、遺伝子名又は染色体座標のセットに言及することにより特定される。遺伝子名も染色体座標も当業者には周知であり、理解されていると考えられる。上文に詳述されているように、Nimblegenプロモータータイリングアレイにおいてアッセイされる領域の染色体座標は、上記ゲノムのHg18バージョンに一致し、関連する遺伝子記号を記載する染色体座標は上記ゲノムのHg19バージョンに一致する。一般に、遺伝子は、それを介してその配列も染色体位置も常に得られる遺伝子名を参照することにより、又はそれを介してその遺伝子名もその配列も常に得られる遺伝子の染色体座標を参照することにより常に同定することが可能である。

0036

上で詳述される遺伝子/DNA領域のそれぞれへの言及は、あらゆる形態のこれらの分子への及びその断片又はバリアントへの言及として理解されるべきである。当業者には認識されていると考えられるように、一部の遺伝子は、個体又は一塩基多型間で対立遺伝子変異を示すことが知られている。SNPは、変化するサイズの挿入及び欠失並びに、ジヌクレオチド及びトリヌクレオチド反復などの単純な配列反復を包含する。バリアントには、少なくとも90%、95%、98%、99%配列同一性共有する、すなわち、本明細書に記載されるDNA領域に対して1つ又は複数の欠失、付加、置換逆方向配列等を有する同じ領域由来の核酸配列が含まれる。したがって、本発明は、現在の診断適用の点から、実際の核酸配列間の小さな遺伝子変異が個体間に存在し得るという事実にもかかわらず、同じ結果を達成するようなバリアントにまで及ぶと解釈されるべきである。したがって、本発明は、任意の他の突然変異多型、又は対立遺伝子変異から生じるあらゆる形態のDNAにまで及ぶと解釈されるべきである。

0037

試験の対象である「個体」はいかなるヒト又は非ヒト哺乳動物であってもよいことは理解されるべきである。非ヒト哺乳動物の例には、霊長類家畜動物(たとえば、ウマウシヒツジブタロバ、等)、実験室試験動物(たとえば、マウスラットウサギモルモット)、コンパニオンアニマル(たとえば、イヌネコ)及び捕獲野生動物(たとえば、シカキツネ)が含まれる。
好ましくは、哺乳動物はヒトである。

0038

同定されている遺伝子のパネルは、対応する非新生物細胞と比べて大腸新生物細胞におけるメチル化が増加していることを実証している。この増加したメチル化は、いくつかの場合は、DNA領域内の少数の特定のCpG部位に局在化しており、他の場合は、増加したメチル化は広範囲のCpG部位にわたって観察される。しかし、すべての遺伝子由来の特定の領域はメチル化の増加を示しており、したがって、有用な診断マーカーであるが、これらの遺伝子のいくつかは、上昇したメチル化がより高い割合の新生物において観察されるという理由、又は新生物組織と正常な結腸組織若しくは末梢血白血球との間にDNAメチル化のレベルにより大きな差が観察されるという理由のどちらか又は両方のせいで、特に良好な感受性及び特異性を与える。

0039

この実施形態に従って、個体における大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又は大腸新生物をモニターする方法であって、
上記個体由来の生体試料において
(i)Hg19座標のうちのいずれか1つ又は複数及び転写開始部位の2kb上流により定義される領域、




(ii)




のうちのいずれか1つ又は複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
から選択されるDNA領域のメチル化状態を評価することを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域のメチル化のより高いレベルは大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示している、
方法が提供される。

0040

これらの態様に従って、さらに別の実施形態では、上記対照レベルは非新生物レベルである。

0041

本発明のこれらの態様に従えば、上記大腸組織は、好ましくは結腸直腸組織である。

0042

さらに別の実施形態では、新生物はカルシノーマなどの悪性である。

0043

追加の実施形態では、新生物はアデノーマなどの非悪性である。

0044

本発明をどれか1つの理論又は作用機序に限定せずに、これらのDNA領域にわたるメチル化レベルを測定することは、大腸新生物状態の診断に役立つが、別々の小領域は、これらの小領域が結腸直腸がんなどの大腸新生物において高度メチル化されている場合が多い高密度CpGジヌクレオチドを含有するので、この点に関して特に有用であることが確定されている。このために、大腸新生物という状況でのその発現レベルという点から下方調節されていることがすでに知られている追加の15のDNA領域という状況では、実際、特に高密度の高度メチル化されたCpGジヌクレオチドを示す別々の小領域が存在することも確定されている。この所見のおかげでこれらの小領域は分析のための特に有用な標的になる。なぜならば、分析を必要とするDNAの領域がもっと短くさらに明確に限定されるせいで、さらに、これらの領域からの結果は、高度メチル化の存在又は非存在との関係において、分析がDNA領域全体にわたって実施される場合に得られるよりも著しく決定的な結果を与えることになるという事実のせいで、この所見によりスクリーニング過程が簡略化されるためである。したがって、この所見により、スクリーニング過程は簡略化されるし、大腸新生物診断の感度及び特異性も増加する。

0045

特定の有用性を示すことが確定している小領域は、その小領域が見出される遺伝子及び染色体領域を参照して、以下に収載されている。

0046

この実施形態に従えば、したがって、個体における大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又は大腸新生物をモニターする方法であって、上記個体由来の生体試料において、Hg19座標により定義される領域




から選択される1つ又は複数のDNA領域のメチル化状態を評価することを含み、
対照レベルと比べて上記DNA領域のメチル化のより高いレベルは大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示している、
方法が提供される。

0047

別の実施形態では、上記新生物細胞はアデノーマ又は腺癌であり、さらに好ましくは、結腸直腸アデノーマ又は腺癌である。

0048

一特定の実施形態では、したがって、個体における大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又は大腸新生物をモニター又はモニターする方法であって、上記個体由来の生体試料において、Hg19座標により定義される領域




から選択される1つ又は複数のDNA領域のメチル化状態を評価することを含み、
対照レベルと比べて上記DNA領域のメチル化のより高いレベルは大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示している、
方法が提供される。

0049

さらに別の実施形態では、上記DNA領域は、Hg19座標により定義される領域




から選択される。

0050

別の実施形態では、上記新生物細胞はアデノーマ又は腺癌であり、さらに好ましくは、結腸直腸アデノーマ又は腺癌である。

0051

本発明をどれか1つの理論又は作用機序に限定せずに、DNAメチル化は細菌、植物、及び動物において普遍的である。DNAメチル化は、細胞分裂ラウンドにわたり安定しているDNAの化学修飾一種であるが、生物の根底にあるDNA配列の変化を伴わない。クロマチン及びDNA修飾は、エピジェネティクスの2つの重要な特長であり、細胞分化の過程に関与しており、細胞に同じゲノム物質を含有しているのにもかかわらず異なる特徴を安定的に維持させる。真核生物では、DNAメチル化はシトシンピリミジン環の番号5炭素でのみ起こる。哺乳動物では、DNAメチル化はCpGジヌクレオチドのシトシンの番号5炭素で大部分起こる。CpGジヌクレオチドはおよそ1%のヒトゲノムを構成する。

0052

すべてのCpGの70〜80%はメチル化されている。CpGは、多くの遺伝子の5’調節領域に存在しメチル化されていないことが多い「CpGアイランド」と呼ばれるクラスターグループ化されていることがある。がんなどの多くの疾患過程では、遺伝子プロモーター及び/又はCpGアイランドは、遺伝性転写サイレンシング付随する異常な高度メチル化を獲得する。DNAメチル化は遺伝子の転写に2つの方法で影響を与え得る。第一に、DNAのメチル化は、それ自体が転写タンパク質の遺伝子への結合を物理的に阻害し、したがって転写を遮断することがある。第二に、メチル化されたDNAには、メチル−CpG−結合ドメインタンパク質(MBD)として知られるタンパク質が結合し得る。次に、MBDタンパク質は、ヒストンデアセチラーゼ、及びヒストンを修飾しそれによりサイレントクロマチンと呼ばれる緻密で不活性なクロマチンを形成することができる他のクロマチン再構築タンパク質などの追加のタンパク質を遺伝子座動員する。DNAメチル化とクロマチン構造間のこの連関は非常に重要である。特に、メチル−CpG−結合タンパク質2(MeCP2)の喪失レット症候群に関与しており、メチル−CpG−結合ドメインタンパク質2(MBD2)はがんにおいて高度メチル化された遺伝子の転写サイレンシングを媒介する。

0053

ヒトでは、DNAメチル化のプロセスは、3種の酵素DNAメチルトランスフェラーゼ1、3a及び3b(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)により実行される。DNMT3a及びDNMT3bは、発生の初期にDNAメチル化パターンを設定する新規メチルトランスフェラーゼであると考えられている。DNMT1は、DNA複製中DNAメチル化パターンを鎖にコピーすることに関与している提唱されたメインテナンスメチルトランスフェラーゼである。DNMT3Lは、その他のDNMT3に相同であるが触媒活性がないタンパク質である。代わりに、DNMT3Lは、DNAに結合する新規のメチルトランスフェラーゼの能力を増加させて、その活性を刺激することにより新規のメチルトランスフェラーゼを補助する。最後に、DNMT2は「の」DNAメチルトランスフェラーゼ相同体として同定されており、すべてのDNAメチルトランスフェラーゼに共通の10個の配列モチーフすべてを含有するが、DNMT2はDNAをメチル化しないことがあるが、代わりに、すべての小型RNAをメチル化することが明らかにされている。

0054

したがって、「メチル化状態」は、DNA領域内の特定のヌクレオチド(単数又は複数)でのメチル化の存在、非存在及び/又は量への言及として理解されるべきである。特定のDNA配列のメチル化状態(たとえば、本明細書に記載されるDNA領域)は、上記配列におけるすべての塩基のメチル化状態を示すことができる、又は上記配列内の塩基対サブセットの(たとえば、シトシンの)メチル化状態(又は1つ若しくは複数の特定の制限酵素認識配列のメチル化状態)を示すことができる、又は上記配列のどこでメチル化が起きているかについての正確な情報を与えることなく、上記配列内の領域メチル化密度に関する情報を示すことができる。メチル化状態は、任意選択で、「メチル化値」により表す又は示すことができる。メチル化値は、たとえば、メチル化依存性制限酵素での制限消化に続いて存在する無傷のDNAの量を定量化することにより生み出すことができる。この例では、DNA中の特定の配列が定量的PCRを使用して定量化される場合は、の処理をされた対照にほぼ等しい鋳型DNAの量は、上記配列が高度にメチル化されていないことを示し、偽の処理をされた試料において存在するよりも鋳型の量が実質的に少ないことは上記配列でのメチル化されたDNAの存在を示している。したがって、たとえば、上記の例由来の値、すなわち、メチル化値はメチル化状態を表し、したがって、メチル化状態の定量的指標として使用することが可能である。試料中の配列のメチル化状態を閾値と比較することが望ましい場合、このことは特に有用である。

0055

本発明の方法は、生体試料の特定のDNA領域のメチル化レベルとこれらのDNA領域の対照メチル化レベルとの比較に基づいている。「対照レベル」とは「正常レベル」であり、新生物ではない又はアッセイのためにDNAを単離し得る別の生体試料における対応する大腸細胞又は細胞集団のDNA領域のメチル化レベルである。

0056

正常な(又は「非新生物の」)メチル化レベルは、検査の対象である同一個体由来の非新生物組織を使用して決定し得る。しかし、これは関係する個体に対して極めて侵襲的になり得ることは認識されると考えられ、したがって、問題の患者以外の個体から得られる個々の又は集団の結果を反映する標準結果に対して検査結果解析するほうが都合がよい可能性がある。この後者の形態の分析は、実際、好ましい分析方法である。なぜならば、この方法は対象の試験試料である単一の生体試料の収集及び分析を必要とするキットの設計を可能にするからである。正常なメチル化レベルを与える標準結果は、当業者には周知と考えられる任意の適切な手段により計算し得る。たとえば、正常組織の集団は、本発明の遺伝子のメチル化レベルの点から評価し、それにより将来の試験試料すべてを分析する際の基準となる標準値又は値の範囲を与えることができる。正常レベルは、特定のコホートの対象から及びそのコホート由来の試験試料に関して使用するために決定し得ることも理解されるべきである。したがって、年齢性別民族性又は健康状態などの特徴の点で異なるコホートに対応するいくつかの標準値又は範囲を決定し得る。上記「正常レベル」は、別々のレベル又はある範囲のレベルでもよい。正常レベルと比べた対象遺伝子のメチル化レベルの増加は、組織が新生物であることを示している。

0057

用語「メチル化」は、核酸、たとえば、ゲノムDNAの領域においてDNAメチルトランスフェラーゼ酵素の作用によりシトシン塩基(単数又は複数)に付加されたメチル基の存在を意味すると解釈するものとする。本明細書に記載されるように、核酸のメチル化のレベル又は程度を決定するための当業者に公知の方法がいくつか存在する。

0058

「より高いレベル」は、診断された対象中に、対照試料中よりも多くの数のメチル化されたCpGジヌクレオチドが存在する、すなわち、特定のCpG部位でメチル化されたDNA分子の割合がより高い又は対象中にメチル化された個別のCpG部位の数が多いことを意味する。用語「増強された」又は「増加された」は用語「より高い」と互換的に使用されると理解されるべきである。本発明は、対象における新生物の診断に役立つと見なされるメチル化された残基の正確な数により限定されるべきではない。なぜならば、患者試料間のある程度の変動が存在することになるからである。本発明は、メチル化された残基の位置決めによって限定されることもない。

0059

にもかかわらず、これらの小領域内で高度メチル化を受けるいくつかの特定のシトシン残基も同定されている。別の実施形態では、したがって、これらの残基又は反対のDNA鎖上のn+1位の対応するシトシンのうちの1つ又は複数のメチル化状態を評価することに特に向けられるスクリーニング法を用いることが可能である。

0060

このために、この点に関して同定されているシトシン残基が下に収載されている。これらの個々の残基はHg19を参照することにより番号付けがされており、これは上文に収載されている特定の小領域の番号付けにも一致しており、小領域ごと座標番号付けが配列表に与えられている対応する小領域配列に適用される場合には、さらに同定することが可能であることは、当業者であれば認識するはずである。これらの残基は、小領域DNAという状況で同定されていることは理解されるべきである。しかし、ここには、小領域それ自体の外側であるが上記小領域が由来するさらに大きなDNA領域内で高度メチル化されている他の残基が存在する。したがって、これらの特定化された残基は、本明細書で開示されているDNA領域及び小領域という状況内で高度メチル化を受ける個々のシトシン残基の特に有用なサブセットを表す。これらの個々の残基は、上記残基が存在するDNA領域に従って下にグループ分けされている。これらのDNA領域は、Hg19染色体座標と遺伝子領域名の両方を参照することにより同定される。

0061

この実施形態に従えば、したがって、個体における大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又は大腸新生物をモニターする方法であって、上記個体由来の生体試料において、


















若しくは反対のDNA鎖上のn+1位の対応するシトシンから選択される1つ又は複数のシトシン残基のメチル化を評価することを含み、
対照試料における対応する残基のメチル化レベルと比べて上記残基のうちの1つ若しくは複数のメチル化のより高いレベルは大腸新生物又は大腸新生物状態の発症の素因を示している、
上記方法が提供される。

0062

別の実施形態では、上記1つ又は複数のシトシン残基は、GRASP、SDC2、COL4A1、IRX1、SOX21、FGF5、ZNF471、SUSD5、EFEMP1、TCF21、COL1A2、FOXB1、FOXF1、PDX1及びDLX5から選択される。

0063

一特定の実施形態では、上記1つ又は複数のシトシン残基は








から選択される。

0064

本発明の検出法は任意の適切な生体試料で実施することが可能である。このために、「生体試料」への言及は、細胞物質生体液(たとえば、血液)、糞便、組織生検標本外科的標本又は動物の身体に導入されそれに続いて取り除かれた(たとえば、浣腸液から回収された溶液などの)液体などの、しかしこれらの限定されない動物由来生体物質の任意の試料への言及として理解されるべきである。本発明の方法に従って試験される生体試料は、直接試験することもあれば、試験に先立ってある種の処理を必要とすることもある。たとえば、生検又は外科的試料は試験に先立って均質化を必要とすることもあれば、個々の遺伝子の質的発現レベルのインサイツ試験のためにセクショニングを必要とすることもある。代わりに、細胞試料は試験に先立って透過処理を必要とすることもある。さらに、生体試料が液体形態ではない限り、(そのような形態が試験のために必要であれば)上記生体試料は、試料を動態化するためにバッファーなどの試薬の添加を必要とすることもある。

0065

対象のDNA領域が生体試料中に存在する限り、生体試料は直接試験してもよいし、さもなければ生体試料中に存在する核酸のすべて若しくは一部を試験に先立って単離してもよい。さらに別の例では、試料は部分的に精製される、又は分析に先立って他の方法で濃縮されてもよい。たとえば、生体試料が極めて多様な細胞集団を含む限り、特定の対象の亜集団について濃縮することが望ましいこともある。標的細胞集団又はそこに由来する分子を試験に先立って処理する、たとえば、生ウイルス不活化することは本発明の範囲内である。生体試料は新たに収穫してもよく、又は試験に先立って保存していてもよく(たとえば、凍結により)、若しくは他の方法で試験に先立って処理してもよい(培養を受けることによりなど)ことも理解されるべきである。

0066

本明細書に開示される方法に従って試験するためにはどのような種類の試料がもっとも適切なのかの選択は、状況の性質に依存することになる。好ましくは、上記試料は便(糞便)試料、浣腸水、外科的切除、組織生検又は血液試料(たとえば、全血血清又は血漿)である。

0067

さらに好ましくは、上記生体試料は血液試料、生検試料又は糞便試料である。

0068

上文に詳述されるように、本発明は大腸に位置する新生物細胞又は細胞集団についてスクリーニングするように設計されている。したがって、「細胞又は細胞集団」への言及は、個々の細胞又は細胞の群への言及として理解されるべきである。上記細胞の群は、細胞の拡散集団、細胞懸濁液、細胞の被包性集団又は組織の形態をとる細胞の集団のこともある。

0069

アデノーマ又は腺癌などの新生物の「発症」への言及は、異形成を示す個体の1つ又は複数の細胞への言及として理解されるべきである。この点に関して、アデノーマ又は腺癌は、多量の異形成細胞が発生している点でよく発達していることがある。代わりに、アデノーマ又は腺癌は、比較的少数の異常な細胞分裂のみが診断時に起きている点でごく初期段階であることもある。本発明は、アデノーマ又は腺癌などの新生物の発生の個体の素因の評価までにも及ぶ。本発明をいかなる点でも限定せずに、変化したメチル化レベルは、アデノーマ若しくは腺癌又は別のアデノーマ若しくは腺癌の将来の発生などの、新生物を発症する個体の素因を示していることがある。

0070

好ましい方法は、新生物発生又はその素因を診断する目的でメチル化レベルを評価することであるが、上記メチル化のレベルにおける逆の変化の検出は、場合によっては、たとえば、アデノーマ又は腺癌の発生などの新生物状態を調節することに向けられる治療又は予防処置の有効性をモニターするためには望ましいこともある。たとえば、メチル化レベルの上昇が、個体がアデノーマ又は腺癌の発生により特徴付けられる状態を発症したことを示す場合、治療的処置レジメン(therapeutic treatment regime)の開始に続くメチル化レベルの減少についてのスクリーニングは、新生物細胞の排除に成功したことを示すのに利用し得る。別の例では、この方法を使用して腫瘍の全縁が取り除かれたかどうかを確定するために腫瘍切片の縁の組織を試験することができる。

0071

したがって、本方法は、疾病リスクの診断、予後、分類、予測疾病再発の検出、いくつかの種類の新生物の治療の選択及び新生物のモニタリングに使用することが可能である。原発転移性及び再発がんなどのいかなる進行段階のがんも検出することが可能である。

0072

本発明は、哺乳動物(たとえば、ヒト)が大腸の新生物を有するかどうか、哺乳動物から採取した生体試料が新生物細胞若しくは新生物細胞由来のDNAを含有するかどうかを確定する、哺乳動物が新生物を発症しているリスク若しくは可能性を推定する、抗がん治療効力をモニターする、又はがんを有する哺乳動物における適切な抗がん治療を選択するための方法を提供する。そのような方法は、本明細書に記載されるDNA領域において新生物細胞が正常細胞とは異なるメチル化状態を有することの決定に基づいている。したがって、細胞が本明細書に記載されるDNA領域において差次的にメチル化された配列を含有するかどうかを確定することにより、細胞が新生物であることを決定することが可能である。

0073

本発明の方法は、新生物を有することが知られている若しくは疑われる個体を評価するために、又は常用の臨床試験として、すなわち、必ずしも新生物を有すると疑われるわけではない個体において使用することが可能である。追加の診断アッセイを実施して、個体における新生物状態を確かめることが可能である。

0074

さらに、本方法を使用して処置経過の効力を評価し得る。たとえば、抗がん治療の効力は、がんに罹っている哺乳動物において本明細書に記載される配列のDNAメチル化を時間をかけてモニターすることにより、評価することができる。たとえば、治療前に又は治療の早期に哺乳動物から採取した試料中のレベルと比べて、治療に続いて哺乳動物から採取した生体試料における本発明の診断配列のいずれかでのメチル化の減少又は非存在は、有効な治療であることを示している。

0075

したがって、本発明の方法は、1回限りの検査として又は新生物発生の危険があると考えられる個体の継続的モニターとして又は新生物発生を阻害する若しくは他の方法で遅延することに向けられる治療的若しくは予防的処置レジメンの有効性のモニターとして有用である。これらの状況では、いずれか1つ又は複数の種類の生体試料におけるメチル化レベルのモジュレーションを位置付けることは、個体の状態又は現在使用されている治療的若しくは予防的レジメンの有効性についての価値ある指標である。したがって、本発明の方法は、その正常レベル(上文に定義されている)と比べて、又は個体の生体試料から確定された1つ若しくは複数の以前のメチル化レベルと比べて、上記個体におけるメチル化レベルの増加又は減少についてモニターすることにまで及ぶと理解されるべきである。

0076

新生物を検出するための方法は、1つ又は複数の他のがん関連ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の検出を含むことができる。したがって、本発明の方法によるメチル化の検出は、単独で又は新生物の診断若しくは予後のための他のスクリーニング法と組み合わせて使用することが可能である。

0077

DNAメチル化を検出するためのいかなる方法も、本発明の方法において使用することができる。いくつかの方法が、原発組織試料における又は血液、尿、糞便若しくは唾液などの患者試料における特定の遺伝子座での差次的にメチル化されたDNAの検出に利用することが可能である(Kristensen and Hansen Clin Chem.55:1471〜83頁、2009年;Ammerpohl et al.Biochem Biophys Acta.1790:847〜62頁、2009年;Shames et al.Cancer Lett.251:187〜98頁、2007年;Clark et al.Nat Protoc.1:2353〜64頁、2006年に概説されている)。標的遺伝子のDNAメチル化の割合又は程度の分析では、DNAは通常、亜硫酸水素ナトリウムで処理され、対象の領域は、DNAのメチル化状態とは無関係に増幅することになるプライマー及びPCR条件を使用して増幅される。次に、全体のアンプリコン又は個々のCpG部位のメチル化は、ピロシーケンス制限酵素消化(COBRA)を含む塩基配列決定により又は融解曲線解析により評価することが可能である。代わりに、特定のCpG部位でのメチル化の分析のためのライゲーションベースの方法を使用し得る。腫瘍から体液中に放出された異常にメチル化されたDNAの検出はがん診断の手段として開発中である。ここでは、高度メチル化された配列の場合、メチル化されていない正常細胞DNAの背景からのメチル化されたDNA配列の選択的増幅を可能にする感度の良い方法を使用する必要がある。亜硫酸水素塩処理されたDNAに基づくそのような方法には、たとえば、メチル化選択PCR(MSP)、ヘビーメチル(Heavymethyl)PCR、ヘッドループ(Headloop)PCR及びヘルパー依存性(Helper−dependent)連鎖反応国際出願PCT/AU2008/001475)が含まれる。

0078

手短に言えば、いくつかの実施形態では、メチル化を検出するための方法は、ゲノムDNAを無作為に剪断する又は無作為に断片化し、メチル化依存性又はメチル化感受性制限酵素でDNAを切断し、それに続いて切断された又は切断されていないDNAを選択的に同定する及び/又は分析することを含む。選択的同定には、たとえば、切断されたDNAと切断されていないDNAを分離し(たとえば、サイズにより)、切断された又は代わりに切断されていない対象の配列を定量化することを含むことができる。たとえば、米国特許第7,186,512号を参照されたい。代わりに、上記方法は、制限酵素消化後無傷のDNAを増幅し、それによって増幅された領域において制限酵素により切断されなかったDNAのみを増幅することを包含することができる。たとえば、米国特許出願第10/971,986号、米国特許出願第11/071,013号及び米国特許出願第10/971,339号を参照されたい。いくつかの実施形態では、増幅は、遺伝子特異的であるプライマーを使用して実施することができる。代わりに、アダプターを無作為に断片化されたDNAの端部に付加することができ、上記DNAはメチル化依存性又はメチル化感受性制限酵素で消化することができ、無傷のDNAは上記アダプター配列にハイブリダイズするプライマーを使用して増幅することができる。この場合、DNAの増幅されたプールにおいて特定の遺伝子の存在、非存在又は量を決定する第2のステップを実施することができる。いくつかの実施形態では、上記DNAはリアルタイム定量的PCRを使用して増幅される。

0079

いくつかの実施形態では、上記方法は、ゲノムDNAの集団内の標的配列における平均メチル化密度を定量化することを含む。いくつかの実施形態では、上記方法は、遺伝子座における潜在的制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されないままであることを可能にする条件下で、ゲノムDNAをメチル化依存性制限酵素又はメチル化感受性制限酵素に接触させ、上記遺伝子座の無傷のコピーを定量化し、増幅された産物の量を対照DNAのメチル化の量を表す対照値と比較し、それによって上記対照DNAのメチル化密度と比べた上記遺伝子座における平均メチル化密度を定量化することを含む。

0080

DNAの遺伝子座のメチル化の量は、上記遺伝子座を含むゲノムDNAの試料を提供し、上記DNAをメチル化感受性又はメチル化依存性である制限酵素で切断し、次に無傷のDNAの量を定量化する又は対象のDNA遺伝子座で切断されたDNAの量を定量化することにより決定することができる。無傷の又は切断されたDNAの量は、上記遺伝子座を含有するゲノムDNAの最初の量、上記遺伝子座におけるメチル化の量、及び上記ゲノムDNAにおいてメチル化されている遺伝子座におけるヌクレオチドの数(すなわち、割合)に依存することになる。DNA遺伝子座におけるメチル化の量は、無傷のDNA又は切断されたDNAの量を同様な処理を受けたDNA試料における無傷のDNA又は切断されたDNAの量を表す対照値と比較することにより決定することができる。対照値は、メチル化されたヌクレオチドの既知の又は予想される数を表すことができる。代わりに、対照値は、別の(たとえば、正常な、非疾患)細胞における同じ遺伝子座又は第二の遺伝子座由来の無傷の又は切断されたDNAの量を表すことができる。

0081

遺伝子座における潜在的制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されないままであることを可能にする条件下で、少なくとも1つのメチル化感受性又はメチル化依存性制限酵素を使用し、それに続いて残っている無傷のコピーを定量化し、その量を対照と比較することにより、遺伝子座の平均メチル化密度を決定することができる。メチル化感受性酵素は、その認識配列がメチル化されていなければDNAを切断する酵素であり、メチル化依存性酵素は、その認識配列がメチル化されているとDNAを切断する。メチル化感受性制限酵素を、遺伝子座における潜在的制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されないままであることを可能にする条件下で、DNA遺伝子座のコピーに接触させるならば、残っている無傷のDNAはメチル化密度に正比例することになり、したがって、対照と比較して、試料中の遺伝子座の相対的メチル化密度を決定し得る。同様に、メチル化依存性制限酵素を、遺伝子座における潜在的制限酵素切断部位の少なくとも一部のコピーが切断されないままであることを可能にする条件下で、DNA遺伝子座のコピーに接触させるならば、残っている無傷のDNAはメチル化密度に反比例することになり、したがって、対照と比較して、試料中の遺伝子座の相対的メチル化密度を決定し得る。そのようなアッセイは、たとえば、米国特許出願第10/971,986号に開示されている。

0082

上記方法のためのキットは、たとえば、メチル化依存性制限酵素、メチル化感受性制限酵素、増幅(たとえば、PCR)試薬、プローブ及び/又はプライマーのうちの1つ又は複数を含むことができる。

0083

定量的増幅法(たとえば、定量的PCR又は定量的線形増幅)を使用して、制限消化に続いて、増幅プライマーが隣接する遺伝子座内の無傷のDNAの量を定量化することができる。定量的増幅の方法は、たとえば、米国特許第6,180,349号、米国特許第6,033,854号及び米国特許第5,972,602号、並びにたとえば、Gibson et al.、Genome Research 6:995〜1001頁(1996);DeGraves et al.、Biotechniques 34(1):106〜10頁、112〜5頁(2003);Deiman B、et al.、Mol.Biotechnol.20(2):163〜79頁(2002)に開示されている。増幅は「リアルタイム」でモニターし得る。

0084

DNAメチル化を検出するための追加の方法は、DNAを亜硫酸水素塩で処理する前及び後のゲノム配列決定を含むことができる。たとえば、Frommer et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1827〜1831頁(1992)を参照されたい。亜硫酸水素ナトリウムをDNAに接触させると、非メチル化シトシンウラシルに変換され、メチル化されたシトシンは改変されない。

0085

いくつかの実施形態では、亜硫酸水素塩変換DNAから増幅されたPCR産物の制限酵素消化を使用して、DNAメチル化を検出する。たとえば、Sadri&Hornsby、Nucl.AcidsRes.24:5058〜5059頁(1996);Xiong&Laird、Nucleic Acids Res.25:2532〜2534頁(1997)を参照されたい。

0086

いくつかの実施形態では、メチル化特異的PCR(「MSP」)反応は、単独で又はDNAメチル化を検出する他の方法と組み合わせて使用される。MSPアッセイは、亜硫酸水素ナトリウムによるDNAの最初の改変、すべての非メチル化であるがメチル化されないシトシンのウラシルへの変換、及びメチル化対非メチル化DNAに特異的なプライマーを用いたそれに続く増幅を必要とする。Herman et al.、Natl.Acad.Sci.USA 93:9821〜9826頁(1996);米国特許第5,786,146号を参照されたい。

0087

いくつかの実施形態では、メチライト(MethyLight)アッセイは、単独で又はDNAメチル化を検出する他の方法と組み合わせて使用される(Eadset al.、Cancer Res.59:2302〜2306頁(1999)参照)。手短に言えば、メチライトプロセスでは、ゲノムDNAは亜硫酸水素ナトリウム反応において変換される(亜硫酸水素塩プロセスは非メチル化シトシン残基をウラシルに変換する)。次に、対象のDNA配列の増幅は、CpGジヌクレオチドにハイブリダイズするPCRプライマーを使用して実施される。メチル化されたDNAの亜硫酸水素塩変換から生じる配列(又は代わりに非メチル化配列)のみにハイブリダイズするプライマーを使用することにより、増幅は上記プライマーがハイブリダイズする配列のメチル化状態を示すことができる。さらに、増幅産物は、非メチル化DNAの亜硫酸水素塩処理から生じる配列に特異的に結合するプローブを用いて検出することができる。必要であれば、プライマーとプローブの両方を使用してメチル化状態を検出することが可能である。したがって、メチライトで使用するためにキットは、亜硫酸水素ナトリウム並びに、亜硫酸水素塩で処理されているメチル化されたDNAと非メチル化DNAを区別するプライマー又は検出可能的に標識されたプローブ(Taqman又は分子ビーコンプローブを含むがこれらに限定されない)を含むことができる。他のキット成分は、たとえば、PCRバッファー、デオキシヌクレオチド及び熱安定ポリメラーゼを含むがこれらに限定されない、DNAの増幅に必要な試薬を含むことができる。

0088

いくつかの実施形態では、Ms−SNuPE(メチル化感受性一塩基プライマー伸長)反応は、単独で又はDNAメチル化を検出する他の方法と組み合わせて使用される(Gonzalgo&Jones、Nucleic AcidsRes.25:2529〜2531頁(1997)参照)。Ms−SNuPE法は、DNAの亜硫酸水素塩処理、続いて一塩基プライマー伸長に基づいて特定のCpG部位でのメチル化の差を評価するための定量的方法である(Gonzalgo&Jones、上記参照)。手短に言えば、ゲノムDNAを亜硫酸水素ナトリウムと反応させて、5−メチルシトシン不変のままにして、非メチル化シトシンをウラシルに変換する。次に、目的の標的配列の増幅は、亜硫酸水素塩変換DNAに特異的なPCRプライマーを使用して実施され、得られた産物は単離されて対象のCpG部位(複数可)でのメチル化分析のための鋳型として使用される。

0089

Ms−SNuPE分析のための典型的な試薬(たとえば、典型的なMs−SNuPEベースのキットに見られるような)は、特定の遺伝子(又はメチル化変更されたDNA配列又はCpGアイランド)のためのPCRプライマー;最適化されたPCRバッファー及びデオキシヌクレオチド;ゲル抽出キット;正の対照プライマー;特定の遺伝子のためのMs−SNuPEプライマー;反応バッファー(Ms−SNuPE反応のための);並びに検出可能的に標識されたヌクレオチドを含むことができるが、これらに限定されない。さらに、亜硫酸水素塩変換試薬は、DNA変性バッファー;スルホン化バッファー;DNA回収試薬又はキット(たとえば、沈殿限外濾過親和性カラム);脱スルホン化バッファー;及びDNA回収成分を含み得る。

0090

追加のメチル化検出法には、メチル化されたCpGアイランド増幅(Toyota et al.、Cancer Res.59:2307〜12頁(1999)参照)及び、たとえば、米国特許出願公開第2005/0069879号;Rein,et al.、Ncleic AcidsRes.26(10):2255〜64頁(1998);Olek,et al.、Nat.Genet.17(3):275〜6頁(1997);及び国際出願PCT/WO 00/70090に記載される方法を含むが、これらの方法に限定されない。

0091

これらの一般的に記載されている方法のいくつかに関するさらに詳細な情報は以下に提供される、

0092

(a)プローブ又はプライマー設計及び/又は作製
新生物の診断のための本明細書に記載されるいくつかの方法は、1つ又は複数のプローブ及び/又はプライマーを使用する。たとえば、PCR又はハイブリダイゼーションにおいて使用するためのプローブ及び/又はプライマーを設計するための方法は当技術分野では公知であり、たとえば、Dieffenbach and Dveksler(Eds)(In:PCR Primer:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratories、NY.1995)に記載されている。さらに、種々のアッセイのための最適プローブ及び/又はプライマーを設計するいくつかのソフトウェアパッケージ、たとえば、the Center for Genome Research、Cambridge、Mass.、USAから入手可能なPrimer3が公開されている。

0093

明らかに、プローブ又はプライマーの潜在的使用はその設計中に検討するほうがよい。たとえば、プローブ又はプライマーがメチル化特異的PCR又はリガーゼ連鎖反応(LCR)アッセイにおいて使用するために作製されるとすれば、3’端部(又はLCRの場合は5’端部)のヌクレオチドは好ましくは核酸中のメチル化されたヌクレオチドに一致するほうがよい。

0094

新生物に関連する配列の検出に有用なプローブ及び/又はプライマーは評価されて、ヘアピンを形成することも、セルフプライムすることも、(たとえば、検出アッセイにおいて使用される別のプローブ又はプライマーと)プライマーダイマーを形成することもないプローブ及び/又はプライマーを決定する。さらに、プローブ又はプライマー(又はその配列)は評価されて、それが標的核酸から変性する温度(すなわち、プローブ若しくはプライマーの融解温度又はTm)を決定する場合が多い。Tmを推定するための方法は当技術分野では公知であり、たとえば、Santa Lucia、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95:1460〜1465頁、1995年又はBresslauer et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、83:3746〜3750頁、1986年に記載されている。

0095

本発明のプローブ又はプライマーを作製する/合成するための方法は当技術分野では公知である。たとえば、オリゴヌクレオチド合成は、Gait(Ed)(In:Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach、IRL Press、Oxford、1984年)に記載されている。たとえば、プローブ又はプライマーは、生物学的合成により(たとえば、制限エンドヌクレアーゼを用いた核酸の消化により)又は化学合成により得られる。短い配列では(約100ヌクレオチドまで)、化学合成が好ましい。

0096

もっと長い配列では、たとえば、Messing、MethodsEnzymol、101,20〜78頁、1983年により記載される一本鎖DNAのためのM13の使用などの、分子生物学で用いられる標準複製法が有用である。オリゴヌクレオチド合成のための他の方法には、たとえば、リン酸トリエステル及びリン酸ジエステル法(Narang、et al.、Meth.Enzymol 68:90頁、1979年)及び支持体上での合成(Beaucage、et al.、Tetrahedron Letters 22:1859〜1862頁、1981年)並びにホスホロアミド酸法、Caruther,M.H.、et al.、Methods in Enzymology、Vol.154、287〜314頁(1988)、並びに「DNAとRNAの合成と適用(Synthesis and Applications of DNA and RNA)」、S.A.Narang editor、Academic Press、New York、1987年及びそこに引用される参考文献に記載される他の方法が含まれる。ロックド核酸(LNA)を含むプローブは、たとえば、Nielsen et al.、J.Chem.Soc.Perkin Trans.、1:3423頁、1997年;Singh and Wengel、Chem Commun.1247頁、1998年に記載される通りに合成される。その上、ペプチド核酸(PNA)を含むプローブは、たとえば、Egholm et al.、Am.Chem.Soc.、114:1895頁、1992年;Egholm et al.、Nature、365:566頁、1993年;及びOrum et al.、Nucl.Acids Res.、21:5332頁、1993年に記載される通りに合成される。

0097

(b)DNAのメチル化感受性エンドヌクレアーゼ消化
一例では、試料中のメチル化の増加は、核酸が消化されるのに十分な条件下で一定量のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ酵素で核酸を処理し、次に生成された断片を検出することを含むプロセスを使用して決定される。例となるメチル化感受性エンドヌクレアーゼには、たとえば、HhaI又はHpaIIが含まれる。好ましくは、アッセイは、用いられるメチル化感受性酵素と同じ特異性を有するメチル化非感受性酵素で消化される内部標準を含む。たとえば、メチル化非感受性酵素MspIは、メチル化感受性酵素HpaIIのイソ制限酵素である。

0098

ハイブリダイゼーションアッセイフォーマット
一例では、核酸の消化は未消化核酸へのプローブ又はプライマーの選択的ハイブリダイゼーションにより検出される。代わりに、プローブは消化された核酸と未消化核酸の両方に選択的にハイブリダイズするが、たとえば、電気泳動により両方の形態の区別を促進する。ハイブリダイゼーションプローブへの選択的ハイブリダイゼーションを達成するのに適切な検出法には、たとえば、サザン又は他の核酸ハイブリダイゼーションが含まれる(Kawai et al.、Mol.Cell.Biol.14:7421〜7427頁、1994年;Gonzalgo et al.、Cancer Res.57:594〜599頁、1997年)。

0099

適切なハイブリダイゼーション条件は、プローブを含む核酸二重鎖の融解温度(Tm)に基づいて決定される。いくつかの一般論を適用することは可能であるが、最適ハイブリダイゼーション反応条件はプローブごとに経験的に決定するほうがよいことは当業者であれば知っているであろう。好ましくは、短いオリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションは、低いから中程度の厳密性で実施される。GCリッチプローブ若しくはプライマー又はもっと長いプローブ若しくはプライマーの場合には、高厳密性ハイブリダイゼーション及び/又は洗浄が好ましい。高厳密性は本明細書では、約0.1×SSCバッファー及び/若しくは約0.1%(w/v)SDS若しくはさらに低い塩濃度において、並びに/又は少なくとも65℃の温度若しくは同等の条件で実施されるハイブリダイゼーション及び/又は洗浄であると定義される。特定レベルの厳密性への本明細書での言及は、当業者には公知のSSC以外の洗浄/ハイブリダイゼーション溶液を使用する同等の条件を包含する。

0100

本例に従えば、試験試料及び負の対照試料のために作製される断片の差異は対象が新生物を有することを示している。同様に、対照試料が、腫瘍、がん組織又はがん細胞若しくは前がん細胞のデータを含む場合、試験試料と対照試料間の類似性は、必ずしも絶対的同一性ではないとしても、陽性診断(すなわち、がん)を示している。

0101

増幅アッセイフォーマット
別の例では、制限酵素により生成される断片は、たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ローリングサークル増幅RCA)、逆ポリメラーゼ連鎖反応(iPCR)、インサイツPCR(Singer−Sam et al.、Nucl. AcidsRes.18:687頁、1990年)、鎖置換増幅(SDA)又はサイクリングプローブ技術などの増幅システムを使用して検出される。

0102

PCRの方法は当技術分野では公知であり、たとえば、McPherson et al.、PCR:A Practical Approach.(series eds、D.Rickwood and B.D.Hames)、IRL Press Limited、Oxford.1〜253頁、1991年により、及びDieffenbach(ed) and Dveksler(ed)(In:PCR Primer:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbour Laboratories、NY、1995年)により記載されており、上記内容はそれぞれが参照によりその全体を組み込まれている。一般に、PCRでは、少なくとも18ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも20〜30ヌクレオチド長を含む2つの非相補的核酸プライマー分子は、核酸鋳型分子の異なる鎖にそのそれぞれのアニーリング部位でハイブリダイズされ、アニーリング部位に介在する鋳型の特定の核酸分子コピーは酵素的に増幅される。増幅産物は、たとえば、電気泳動及び核酸に結合する検出可能マーカーを用いる検出を使用して検出し得る。代わりに、オリゴヌクレオチドのうちの1つ又は複数は検出可能なマーカー(たとえば、フルオロフォア)で標識され、増幅産物は、たとえば、ライトサイクラー(Perkin Elmer、Wellesley、Mass.、USA、Roche Applied Science、Indianapolis、IN、USA)を使用して検出される。

0103

鎖置換増幅(SDA)は、オリゴヌクレオチドプライマーDNAポリメラーゼ及び制限エンドヌクレアーゼを利用して標的配列を増幅する。オリゴヌクレオチドは標的核酸にハイブリダイズされ、ポリメラーゼを使用してプライマーアニーリング部位に介在する領域のコピーを作製する。次に、コピーされた核酸と標的核酸の二重鎖は、上記コピーされた核酸の始まりの配列を特異的に認識するエンドヌクレアーゼで切れ目が入れられる。DNAポリメラーゼは切れ目を入れられたDNAを認識し、同時に標的領域の別のコピーを作製して、すでに生成されている核酸を置換する。SDAの利点は、それが等温フォーマットで起こり、それによってハイスループット自動分析を促進することである。

0104

サイクリングプローブ技術は、標的配列にハイブリダイズすることができるDNA−RNA−DNAを含むキメラ合成プライマーを使用する。標的配列にハイブリダイズすると、形成されたRNA−DNA二重鎖はリボヌクレアーゼHの標的となり、それによってプライマーを切断する。次に、切断されたプライマーは、たとえば、質量分析又は電気泳動により検出される。

0105

メチル化感受性エンドヌクレアーゼ認識部位に隣接する又は近接しているプライマーでは、そのようなプライマーは新生物において高度メチル化されている部位のみに隣接して確実に診断増幅産物が作製されるようにすることが好ましい。この点に関して、増幅産物は制限部位が切断されない場合、すなわち、制限部位がメチル化される場合のみ生成されることになる。したがって、増幅産物の検出は対象のCpGジヌクレオチド(単数又は複数)がメチル化されていることを示している。

0106

当業者には公知であるように、増幅産物の正確な長さは、プライマー間の距離に応じて変動する。明らかに、それぞれのジヌクレオチドがメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ部位の中に存在すれば、この形式の分析を使用して複数のCpGジヌクレオチドのメチル化状態を確定し得る。これらの方法では、プライマーのうちの1つ又は複数を検出可能なマーカー、たとえば、蛍光標識(たとえば、Cy5又はCy3)又は放射性同位元素(たとえば、32P)で標識して、増幅された核酸の急速検出を促進し得る。

0107

増幅された核酸は、一般に、たとえば、未変性アガロースゲル電気泳動、未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動、質量分析、液体クロマトグラフィー(たとえば、HPLC又はdHPLC)又はキャピラリー電気泳動(たとえば、MALDI−TOF)を使用して分析される。たとえば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間(MALDI−TOF)、エレクトロスプレーイオン化(ESI)、質量分析(タンデム質量分析、たとえば、LC MS/MSを含む)、バイオセンサー技術、エバネッセントファイバーオプティックス技術又はDNAチップ技術(たとえば、国際公開第98/49557号パンフレット;国際公開第96/17958号パンフレット;Fodor et al.、Science 767〜773頁、1991年;米国特許第5,143,854号及び米国特許第5,837,832号、これら文献の内容はすべてが参照により本明細書に組み込まれる)などのハイスループット検出法は、本明細書に記載されるすべてのアッセイフォーマットのために特に好ましい。代わりに、核酸の増幅は、本明細書及び/又はたとえば、米国特許第6,174,670号に記載される融解曲線分析法を使用して絶えずモニターし得る(上記特許文献は参照により本明細書に組み込まれる)。

0108

(c)他のアッセイフォーマット
別の例では、試料におけるメチル化の増加は、核酸が消化されるのに十分な条件下で核酸を含有するクロマチンを一定量のデオキシリボヌクレアーゼIで処理し、次に生成された断片を検出することを含むプロセスを実施することにより決定される。このアッセイフォーマットは、メチル化されたDNA、たとえば、高度メチル化されたDNAを含有するクロマチンは、非高度メチル化DNAよりも密に閉ざされた立体構造を有し、結果として、デオキシリボヌクレアーゼIによるエンドヌクレアーゼ消化に感受性が低いという理解に基づいている。

0109

この方法に従えば、長さの異なるDNA断片は、非メチル化DNAと比べたメチル化されたDNAのデオキシリボヌクレアーゼI消化により作製される。そのような異なったDNA断片は、たとえば、以上記載されたアッセイを使用して検出される。代わりに、DNA断片は、基本的には、たとえば、Gregory and Feil Nucleic AcidsRes.、27、e32i〜e32iv、1999年に記載されているPCR−SSCPを使用して検出される。PCR−SSCPを本発明に適応させる際、新生物試料ではデオキシリボヌクレアーゼI消化に抵抗性であるが健康な/正常な対照又は健康な/正常な試験試料ではデオキシリボヌクレアーゼI消化に抵抗性ではない核酸中の1つ又は複数のCpGジヌクレオチドに隣接する又は含む増幅プライマーを使用して、デオキシリボヌクレアーゼI生成される断片を増幅する。この場合、デオキシリボヌクレアーゼIを使用した特定の核酸断片の作製は新生物の診断に役立つ。なぜならば、上記DNAは効率的には分解されないからである。これとは対照的に、健康な/正常な対象試料由来の鋳型DNAはデオキシリボヌクレアーゼIの作用により分解され、結果として、増幅は別々の増幅産物を生成することができない。たとえば、PCR−dHPLCなどのPCR−SSCPに代わる方法も当技術分野では公知であり、本発明により企図されている。

0110

(d)非メチル化DNAの選択的変異誘発
別の方法では、試料中のメチル化の増加は、変異誘発誘導するのに十分な条件下でCpGジヌクレオチド内の非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で上記核酸を処理することを含むプロセスを使用して決定される。

0111

たとえば、亜硫酸水素の塩、たとえば、亜硫酸水素ナトリウム又は亜硫酸水素カリウムなどの好ましい化合物はシトシンをウラシル又はチミジンに変異させる(Frommer et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89、1827〜1831頁、1992年)。DNAの亜硫酸水素塩処理は、CpGジヌクレオチド内にはない又はメチル化を受けないCpGジヌクレオチド内に位置するシトシン残基を含む、メチル化により保護されないシトシン残基を変異させることにより、メチル化されたシトシン残基を非メチル化シトシン残基と区別することが知られている。

0112

列ベースの検出
一例では、1つ若しくは複数の変異ヌクレオチドの存在又は変異配列の数は変異DNAの塩基配列決定により決定される。一形態の分析は、本明細書に記載される増幅反応、たとえば、PCRを使用して変異核酸を増幅することを含む。次に、増幅された産物は直接塩基配列決定される又はクローニングされ、クローニングされた産物は塩基配列決定される。DNAを塩基配列決定するための方法は当技術分野では公知であり、たとえば、ジデオキシ連鎖終止法又はマクサムギルバート法が含まれる(Sambrook et al.、Molecular Cloning、A Laboratory Manual(2nd Ed.、CSHP、New York 1989年)又はZyskind et al.、Recombinant DNA Laboratory Manual、(Acad.Press、1988年)参照)。

0113

たとえば、亜硫酸水素塩などの化合物で核酸を処理することにより非メチル化シトシンがウラシル(したがって、増幅過程後にチミジン)に変異されるので、配列の分析によりメチル化されたヌクレオチドの存在又は非存在が決定される。たとえば、対照試料若しくは亜硫酸水素塩で処理されていない試料を使用して得られる配列又は対象の領域の既知のヌクレオチド配列を処理された試料と比較することにより、ヌクレオチド配列の差異の検出が促進される。対照又は未処理の試料と比べられた処理された試料におけるシトシンの部位で検出されたどんなチミン残基も、亜硫酸水素塩処理の結果としての変異により引き起こされると見なし得る。亜硫酸水素塩処理された核酸の塩基配列決定を使用するメチル化の検出に適した方法は、たとえば、Frommer et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89、1827〜1831頁、1992年又はClark et al.、Nucl.AcidsRes.22:2990〜2997頁、1994年に記載されている。

0114

別の方法では、亜硫酸水素塩処理された試料における変異した又は非変異ヌクレオチドの存在は、たとえば、Uhlmann et al.、Electrophoresis、23:4072〜4079頁、2002年に記載されているなどのピロシーケンスを使用して検出される。基本的に、この方法は、メチル化されているシトシンの部位に隣接する又は近い部位にハイブリダイズするプライマーを使用するリアルタイム塩基配列決定の一種である。DNAポリメラーゼの存在下でのプライマーと鋳型のハイブリダイゼーションに続いて、4種の改変されたデオキシヌクレオチド三リン酸のそれぞれがあらかじめ決められた分配順に従って別々に付加される。亜硫酸水素塩処理された試料に相補的である付加されるヌクレオチドのみが組み込まれ、無機ピロリン酸(PPi)が遊離される。次に、PPiは反応を推進し、検出可能レベルの光を発生する。そのような方法により、プライマーのハイブリダイゼーション部位に隣接する特定のヌクレオチドの種類を決定することができる。

0115

固相ピロシーケンスの方法は当技術分野では公知であり、たとえば、Landegren et al.、Genome Res.、8(8):769〜776頁、1998年に概説されている。そのような方法により、いくつかのCpGジヌクレオチドのメチル化のハイスループット検出が可能になる。

0116

亜硫酸水素塩処理されたヌクレオチドの配列を決定するための関連する方法は、メチル化感受性一塩基プライマー伸長(Me−SnuPE)又はSNaPmethである。適切な方法は、たとえば、Gonzalgo and Jones、Nucl.AcidsRes.、25:2529〜2531頁又はUhlmann et al.、Electrophoresis、23:4072〜4079頁、2002年に記載されている。メチル化されているシトシンの部位に隣接する核酸の領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドが使用される。次に、このオリゴヌクレオチドは、ポリメラーゼ及び亜硫酸水素塩処理に続いてこの部位に存在する考えられる塩基(すなわち、チミン又はシトシン)のうちのどちらか又はいずれにでも一致する遊離のヌクレオチド二リン酸又はジデオキシヌクレオチド三リン酸を用いるプライマー伸長プロトコールにおいて使用される。好ましくは、ヌクレオチド−二リン酸は検出可能なマーカー(たとえば、フルオロフォア)で標識される。プライマー伸長に続いて、非結合の標識されたヌクレオチド二リン酸は、たとえば、サイズ排除クロマトグラフィー若しくは電気泳動を使用して取り除かれる、又はたとえば、アルカリホスファターゼを使用して加水分解され、標識されたヌクレオチドのオリゴヌクレオチドへの取り込みが検出され、上記部位に存在する塩基が示される。

0117

明らかに、他のハイスループット塩基配列決定法は本発明に包含されている。そのような方法には、たとえば、固相ミニシークエンシング(たとえば、Southern et al.、Genomics、13:1008〜1017頁、1992年に記載されている)、又はFRETを用いるミニシークエンシング(たとえば、Chen and Kwok、Nucleic AcidsRes.25:347〜353頁、1997年に記載されている)が含まれる。

0118

制限エンドヌクレアーゼベースのアッセイフォーマット
一方法では、非変異配列の存在は、基本的にXiong and Laird、Nucl.AcidsRes.、25:2532〜2534頁、2001年に記載されている組合せ亜硫酸水素塩制限分析(COBRA)を使用して検出される。この方法は、非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる化合物、たとえば、亜硫酸水素塩を用いた処理後メチル化された核酸と非メチル化核酸間の制限酵素認識部位の差異を利用する。

0119

亜硫酸水素塩処理に続いて、メチル化され制限エンドヌクレアーゼ認識配列に含まれる1つ又は複数のCpGジヌクレオチドを含む対象の領域は、本明細書に記載される増幅反応、たとえば、PCRを使用して増幅される。次に、増幅産物を、切断が起こるのに十分な時間及び条件下で、CpGジヌクレオチドの部位で切断する制限酵素に接触させる。制限部位はメチル化の存在又は非存在を示すように選択され得る。たとえば、制限エンドヌクレアーゼTaqIは配列TCGAを切断するが、非メチル化核酸の亜硫酸水素塩処理に続いて、上記配列はTTGAになり、結果として、切断されなくなる。次に、消化及び/又は未消化核酸は、たとえば、電気泳動及び/又は質量分析などの、当技術分野で公知の検出手段を使用して検出される。核酸の切断又は非切断は対象におけるがんを示している。明らかに、この方法は、がんの診断のための陽性読出し又は陰性読出しシステムにおいて用い得る。

0120

陽性読出しアッセイフォーマット
一実施形態では、本発明のアッセイフォーマットは、たとえば、亜硫酸水素塩で処理された試料由来のDNAが陽性シグナルとして検出される陽性読出しシステムを含む。好ましくは、健康な又は正常な対照対象由来の非高度メチル化DNAは検出されない又は微弱にしか検出されない。

0121

好ましい実施形態では、対象試料におけるメチル化の増加は、
(i)変異誘発を誘導するのに十分な条件下で非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理し、それによって変異核酸を作製するステップ、
(ii)非変異核酸への選択的ハイブリダイゼーションが起こるような条件下でメチル化されたシトシン残基を含む配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブ又はプライマーに核酸をハイブリダイズさせるステップ、及び
(iii)選択的ハイブリダイゼーションを検出するステップ
を含むプロセスを使用して決定される。

0122

この状況では、用語「選択的ハイブリダイゼーション」は、非変異核酸へのプローブ又はプライマーのハイブリダイゼーションが、対応する変異配列への同じプローブ又はプライマーのハイブリダイゼーションよりも高い頻度若しくは速度で起こる、又は高い最大反応速度を有することを意味する。好ましくは、上記プローブ又はプライマーは、使用される反応条件下では変異(複数可)を担持する非メチル化配列にはハイブリダイズしない。

0123

ハイブリダイゼーションベースのアッセイフォーマット
一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、サザン、ドットブロットスロットブロット又は他の核酸ハイブリダイゼーション手段を使用して検出される(Kawai et al.、Mol.Cell.Biol.14:7421〜7427頁、1994年;Gonzalgo et al.、Cancer Res.57:594〜599頁、1997年)。適切なプローブ選択を条件として、そのようなアッセイフォーマットは、本明細書において上に一般的に記載されており、現在記載されている選択的変異誘発アプローチを準用する。

0124

好ましくは、リガーゼ連鎖反応フォーマットを用いて、変異と非変異核酸の区別をする。リガーゼ連鎖反応(EP320,308及び米国特許第4,883,750号に記載されている)は、標的核酸に並置されるように標的核酸にアニールする少なくとも2つのオリゴヌクレオチドプローブを使用する。リガーゼ連鎖反応アッセイでは、標的核酸は、診断プローブが実質的に標的核酸のみに結合したままである条件下で、標的配列、たとえば、1つ又は複数のメチル化されたCpGジヌクレオチド(複数可)を含む核酸の診断部分に相補的である第一のプローブ(診断プローブ)、及び診断部分に近接しているヌクレオチド配列に相補的である第二のプローブ(近接プローブ)にハイブリダイズされる。診断及び近接プローブは、ハイブリダイゼーションの厳密性を調整して標的へのその選択的ハイブリダイゼーションが可能になるように、長さが異なり及び/又は異なる融解温度を有することができ、融解温度が高いほうのプローブはより高い厳密性でハイブリダイズされ、未結合及び/又は非選択的に結合したプローブを洗浄して取り除くことに続いて融解温度が低いほうのもう一方のプローブはより低い厳密性でハイブリダイズされる。次に、診断プローブと近接プローブは、たとえば、T4DNAリガーゼを使用してなどの共有結合的にライゲートされて、それによって標的配列に相補的であるより大きな標的プローブを生成し、ライゲートされないプローブはハイブリダイゼーション厳密性を変更することにより取り除かれる。この点に関して、ライゲートされなかったプローブは、ライゲートされたプローブよりも低い厳密性ハイブリダイゼーション条件下で選択的にハイブリダイズすることになる。したがって、長いほうのプローブを、好ましくは、ライゲーションに続いて短いほうのプローブにより与えられる増加した長さに起因するより高い厳密性でハイブリダイズさせるのに使用される厳密性と少なくとも同じくらいの高さの厳密性までハイブリダイゼーションの厳密性を高めることが可能である。

0125

別の例では、標的−プローブ二重鎖を溶解し、解離したプローブを溶出し、標識(複数可)について試験することにより、標的配列の存在又は非存在を試験することができるように、上記プローブのうちの1つ又は両方は標識される。両方のプローブが標識される場合、異なるリガンドを使用してライゲートされたプローブと非ライゲートプローブの区別を可能にし、その場合、同じ溶出画分中に両方のプローブが存在すればライゲーション事象が確認される。標的核酸が、たとえば、サザンハイブリダイゼーション、スロットブロット、ドットブロット、又はマイクロチップアッセイフォーマットにおいて固体マトリックスに結合しているならば、診断と近接プローブの両方の存在は直接決定することが可能である。

0126

メチル化特異的マイクロアレイ(MSO)も変異と非変異配列を区別するのに有用である。適切な方法は、たとえば、Adorjan et al.、Nucl.AcidsRes.、30:e21、2002年に記載されている。MSOでは、変異と非変異核酸の両方を増幅させる増幅反応のための鋳型として、非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる化合物(たとえば、亜硫酸水素塩)で処理されている核酸が使用される。増幅は、たとえば、フルオロフォア、たとえば、Cy3又はCy5などの検出可能標識を含む少なくとも1つのプライマーを用いて実施される。

0127

変異核酸の検出のためのマイクロアレイを作製するために、オリゴヌクレオチドは、たとえば、グラススライド上に、好ましくはある程度重複してスポットされる(たとえば、Golub et al.、Science、286:531〜537頁、1999年に記載されている)。好ましくは、分析されるCpGジヌクレオチドごとに、2つの異なるオリゴヌクレオチドが使用される。それぞれのオリゴヌクレオチドは、CpGジヌクレオチドのメチル化又は非メチル化状態を反映する配列N2−16CGN2−16又はN2−16TGN2−16(Nは対象のCpGジヌクレオチドに隣接している又は並置しているヌクレオチドの数である)を含む。

0128

次に、標識された増幅産物は一塩基差異の検出を可能にする条件下、マイクロアレイ上でオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせる。洗浄して未結合増幅産物を取り除くことに続いて、ハイブリダイゼーションは、たとえば、マイクロアレイスキャナーを使用して検出される。この方法は、多数のCpGジヌクレオチドのメチル化状態を決定することを可能にするだけではなく、半定量的でもあり、分析されるそれぞれのCpGジヌクレオチドでメチル化の程度を決定することが可能である。1つの試料においてメチル化のある程度の不均一性が存在し得るので、そのような定量化はがんの診断に役立ち得る。

0129

増幅ベースのアッセイフォーマット
別の例では、ハイブリダイゼーションは、増幅システムを使用して検出される。メチル化特異的PCRフォーマットでは(MSP;Herman et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:9821〜9826頁、1992年)、ハイブリダイゼーションは亜硫酸水素塩処理されたDNAを増幅することを含むプロセスを使用して検出される。したがって、中程度及び/又は高厳密性条件下で非変異配列に特異的にアニールする1つ又は複数のプローブ又はプライマーを使用することにより、増幅産物はメチル化されたヌクレオチドを含む試料のみを使用して生成される。亜硫酸水素塩処理されたDNAの混合物からのメチル化された又は非メチル化成分の選択的増幅のために提供される別のアッセイは、Cottrell et al.、Nucl.AcidsRes.32:e10、2003年(HeavyMethyl PCR)、Rand et al.Nucl.Acids Res.33:e127、2005年(Headloop PCR)、Rand et al.Epigenetics 1:94〜100頁、2006年(Bisulfite Differential Denaturation PCR)及び国際出願PCT/AU07/000389号パンフレット(End−specific PCR)により提供される。

0130

たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ローリングサークル増幅(RCA)、逆ポリメラーゼ連鎖反応(iPCR)、インサイツPCR(Singer−Sam et al.、Nucl.AcidsRes.18、687頁、1990年)、鎖置換増幅又はサイクリングプローブ技術などの、本明細書に記載されるいずれの増幅アッセイフォーマットも使用することが可能である。PCR技法は、遺伝子変異の検出(Kuppuswamy et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:1143〜1147頁、1991年)及び対立遺伝子特異的発現の定量化(Szabo and Mann、Genes Dev.9:3097〜3108頁、1995年;及びSinger−Sam et al.、PCR Methods Appl.1:160〜163頁、1992年)のために開発された。そのような技法は、PCR生成された鋳型にアニールし、アッセイされる単一ヌクレオチドの5’で直ちに終結する内部プライマーを使用する。そのようなフォーマットは本明細書の上に記載されるリガーゼ連鎖反応と容易に組み合わされる。リアルタイム定量的アッセイフォーマットの使用も有用である。適切なプライマーを選択することを条件として、そのようなアッセイフォーマットは本明細書の上に一般的に記載されており、現在記載されている選択的変異誘発アプローチを準用する。

0131

メチル化特異的融解曲線分析(基本的に、Worm et al.、Clin.Chem.、47:1183〜1189頁、2001年に記載されている)も本発明により企図されている。このプロセスは、亜硫酸水素塩処理されたメチル化された又は非メチル化核酸を使用して作製される増幅産物における融解温度の差異を利用する。基本的に、亜硫酸水素塩処理された試料の非差別的増幅が、二本鎖DNAに特異的に結合する蛍光色素(たとえば、SYBR Green I)の存在下で実施される。蛍光をモニターしながら増幅産物の温度を増加することにより、融解特性及びしたがって増幅産物の配列が決定される。蛍光の減少は、増幅産物における少なくともドメインの融解を反映する。蛍光が減少する温度は、増幅された核酸のヌクレオチド配列を示しており、それによって1つ又は複数のCpGジヌクレオチドの部位のヌクレオチドを、本発明を使用して増幅される核酸の配列として決定することができる。

0132

本発明は、この実施例を実施するために、たとえば、TaqMan(Holland et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276〜7280頁、1991年;Lee et al.、Nucleic Acidsres.21:3761〜3766頁、1993年)などのリアルタイム定量型のPCRの使用も包含している。たとえば、Eads et al.、Nucl.Acids Res.28:E32、2000年のメチルライト法では、修正されたTaqManアッセイを使用して、CpGジヌクレオチドのメチル化を検出する。基本的に、この方法は、核酸試料を亜硫酸水素塩で処理し、増幅反応、たとえば、PCRを使用して、新生物細胞ではメチル化されているが対照試料ではメチル化されていない1つ又は複数のCpGジヌクレオチドを含む核酸を増幅させることを含む。増幅反応は、3つのオリゴヌクレオチド、対象の領域に隣接するフォワード及びリバースプライマー並びに上記2つのプライマー間で1つ又は複数のメチル化されたCpGジヌクレオチドの部位にハイブリダイズするプローブの存在下で実施される。上記プローブは、5’蛍光レポーター及び3’クエンチャー(又は逆にして)で二重に標識される。プローブが無傷の場合、クエンチャー色素はその近接のせいでレポーターの蛍光を吸収する。PCR産物へのアニーリングに続いて、プローブは、たとえば、TaqDNAポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性により切断される。この切断により、レポーターはクエンチャーから放出され、それによって最初の鋳型メチル化レベルを推定するのに使用することができる増大した蛍光シグナルを生じる。非変異核酸(すなわち、メチル化された核酸)に選択的にハイブリダイズするプローブ又はプライマーを使用することにより、たとえば、標準曲線を使用してメチル化のレベルが決定される。

0133

代わりに、切断を必要とする標識されたプローブを使用するのではなく、たとえば、分子ビーコンなどのプローブが使用される(たとえば、Mhlanga and Malmberg、Methods25:463〜471頁、2001年参照)。分子ビーコンは、ステムループ構造を有する一本鎖核酸分子である。ループ構造は、新生物試料ではメチル化されているが対照試料ではメチル化されていない1つ又は複数のCpGジヌクレオチドを囲む領域に相補的である。ステム構造は、プローブ(ループ)のどちら側にもある、互いに相補的な2本の「アーム」をアニールすることにより形成される。蛍光部分は一方のアームに結合しており、分子ビーコンが標的配列に結合していないときにはいかなる検出可能な蛍光も抑制する消光部分はもう一方のアームに結合している。ループ領域がその標的核酸に結合すると、アームは分離され蛍光が検出可能になる。しかし、単一の塩基ミスマッチでさえ、試料において検出される蛍光のレベルを著しく変える。したがって、特定の塩基の存在又は非存在は、検出される蛍光のレベルにより決定される。そのようなアッセイは、核酸における1つ又は複数の非変異部位(すなわち、メチル化されたヌクレオチド)の検出を促進する。

0134

蛍光的に標識されたロックド核酸(LNA)分子又は蛍光的に標識されたタンパク質−核酸(PNA)分子は、ヌクレオチド差異の検出に有用である(たとえば、Simeonov and Nikiforov、Nucleic AcidsResearch、30(17):1〜5頁、2002年)。LNA及びPNA分子は、核酸、特にDNAに高親和性で結合する。LNA又はPNAプローブコンジュゲートしたフルオロフォア(特に、ローダミン又はヘキサクロロフルオレセイン)は、標的核酸に上記プローブがハイブリダイズすると著しく大きなレベルで蛍光を発する。しかし、一つのヌクレオチドミスマッチでも存在すると、蛍光の増加レベルは同一レベルにまで増強されなくなる。したがって、試料において検出される蛍光の程度は、メチル化されたCpGジヌクレオチドにおける変異シトシンの存在下などのLNA又はPNAプローブと標的核酸間のミスマッチの存在を示している。好ましくは、蛍光的に標識されたLNA又はPNA技術を使用して、たとえば、当技術分野で公知の及び/又は本明細書に記載される増幅法を使用してすでに増幅されている核酸における少なくとも一塩基変化を検出する。

0135

当業者には明らかになるように、LNA又はPNA検出技術は、Orum et al.、Clin.Chem.45:1898〜1905頁、1999年に記載されるように、LNA又はPNAプローブを固体支持体固定化することにより、1つ又は複数のマーカーのハイスループット検出を受け入れることができる。

0136

代わりに、たとえば、いわゆるヘビーメチルアッセイ(Cottrell et al.、Nucl.AcidsRes.32:e10、2003年)などのリアルタイムアッセイを使用して、試験試料における核酸のメチル化の存在又はレベルを決定する。基本的に、この方法では、メチル化特異的な形で亜硫酸水素塩処理された核酸に結合する1つ又は複数の非伸長可能核酸(たとえば、オリゴヌクレオチド)ブロッカーが使用される(すなわち、ブロッカー(単数又は複数)は中程度から高厳密性条件下で未変異DNAに特異的に結合する)。増幅反応は、任意選択でメチル化特異的であってもよいが上記1つ又は複数のブロッカーに隣接する1つ又は複数のプライマーを使用して実施される。非メチル化核酸(すなわち、非変異DNA)の存在下で、ブロッカー(単数又は複数)は結合し、PCR産物は生成されない。基本的に上に記載される通りにTaqManアッセイを使用して、試料における核酸のメチル化レベルが決定される。

0137

非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる化合物を用いた処理に続いてメチル化された核酸を検出するための他の増幅ベースの方法には、たとえば、メチル化特異的一本鎖立体構造分析(MS−SSCA)(Bianco et al.、Hum.Mutat.、14:289〜293頁、1999年)、メチル化特異的変性勾配ゲル電気泳動(MS−DGGE)(Abrams and Stanton、MethodsEnzymol.、212:71〜74頁、1992年)及びメチル化特異的変性高速液体クロマトグラフィー(MS−DHPLC)(Deng et al.、Chin.J.Cancer Res.、12:171〜191頁、2000年)が含まれる。これらの方法のそれぞれで、ヌクレオチド配列及び/又は二次構造における差異に基づいて増幅産物における核酸差異を検出するための異なった技法が使用される。そのような方法は、明らかに本発明により企図されている。

0138

他の増幅ベースのアッセイフォーマットの場合と同じように、増幅産物は、ゲル電気泳動ゲル濾過、質量分析を含む様々な手法を使用して、標識されたプライマーの場合には、増幅産物における標識を同定することにより、分析される、別の実施形態では、亜硫酸水素塩変換されたDNAから増幅されるPCR産物の制限酵素消化は、基本的に、Sadri and Hornsby、Nucl.AcidsRes.24:5058〜5059頁、1996年;及びXiong and Laird、Nucl.Acids Res.25:2532〜2534頁、1997年により記載される通りに実施されて、形成される産物を分析する。

0139

たとえば、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間(MALDI−TOF)、エレクトロスプレーイオン化(ESI)、質量分析(タンデム質量分析、たとえば、LC MS/MSを含む)、バイオセンサー技術、エバネッセントファイバーオプティクス技術又はDNAチップ技術などのハイスループット検出法を用いることも可能である。

0140

ハイブリダイゼーション及び/又は増幅検出システムを利用する本明細書に記載されるその他のアッセイフォーマットの場合と同じように、本明細書において上に記載されるようなプロセスの組合せは、本発明の選択的変異誘発ベースのアッセイフォーマットにより特に企図されている。一例では、
(i)変異誘発を誘導するのに十分な条件下でCpGジヌクレオチド内の非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理し、それによって変異された核酸を作製するステップ、
(ii)非変異核酸へのハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、メチル化されたシトシン残基を含むDNAにおける配列に相補的であるヌクレオチド配列をそれぞれが含む2つの非重複及び非相補的プライマーに核酸をハイブリダイズさせるステップ、
(iii)ハイブリダイズされたプライマーに介在する核酸を増幅させ、それによってプライマー配列を含む配列からなるDNA断片を作製するステップ、
(iv)非変異核酸へのハイブリダイゼーションが起こるような条件下でメチル化されたシトシン残基を含む配列に一致する又は相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブに増幅されたDNA断片をハイブリダイズさせ、上記ハイブリダイゼーションを検出するステップ、
を含むプロセスを実施することによりメチル化の増加が検出される。

0141

陰性読出しアッセイ
別の例では、アッセイフォーマットは、健康な/正常な対照試料由来のDNAのメチル化の減少が陽性シグナルとして検出され、好ましくは、新生物試料由来のメチル化されたDNAが検出されない又は微弱にしか検出されない陰性読出しシステムを含む。

0142

好ましい実施形態では、
(i)変異誘発を誘導するのに十分な条件下でCpGアイランド内の非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理し、それによって変異された核酸を作製するステップ、
(ii)変異核酸への選択的ハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、変異シトシン残基を含む配列に相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブ又はプライマーに核酸をハイブリダイズさせるステップ、及び
(iii)上記選択的ハイブリダイゼーションを検出するステップ
を含むプロセスを使用して、メチル化の減少は決定される。

0143

この状況では、用語「選択的ハイブリダイゼーション」は、変異核酸へのプローブ又はプライマーのハイブリダイゼーションが、対応する非変異配列への同一プローブ又はプライマーのハイブリダイゼーションよりも高い頻度で若しくは速度で起こる、又は高い最高反応速度を有することを意味する。好ましくは、上記プローブ又はプライマーは、使用される反応条件下ではメチル化された配列(又は非変異配列)にはハイブリダイズしない。

0144

ハイブリダイゼーションベースのアッセイフォーマット
一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、サザン、ドットブロット、スロットブロット又は他の核酸ハイブリダイゼーション手段を使用して検出される(Kawai et al.、Mol.Cell.Biol.14:7421〜7427頁、1994年;Gonzalgo et al.、Cancer Res.57:594〜599頁、1997年)。適切なプローブ選択を条件として、そのようなアッセイフォーマットは、本明細書において上に一般的に記載されており、現在記載されている選択的変異誘発アプローチを準用する。好ましくは、リガーゼ連鎖反応フォーマットを用いて、非変異と変異核酸の区別をする。この点に関して、アッセイ要件及び条件は陽性読出しアッセイについて本明細書において上に記載されている通りであり、現在のフォーマットを準用する。しかし、プローブの選択は異なることになる。陰性読出しアッセイでは、非変異配列ではなく変異配列に選択的にハイブリダイズする1つ又は複数のプローブが選択される。

0145

好ましくは、CpGジヌクレオチドのシトシンがチミジンに変異される場合、たとえば、非メチル化シトシン残基の場合にのみ、診断プローブ及び近接プローブがライゲートされることができるように、リガーゼ連鎖反応プローブ(複数可)は、健康な対照試料ではメチル化されていないが、癌では高度メチル化されているCpGジヌクレオチドを含む3’端部及び/又は5’端部配列を有する。

0146

当業者には明らかになるように、上に記載されるMSO法は陽性及び/又は陰性読出しアッセイのどちらか又は両方を受け入れられる。これは、記載されるアッセイが変異と非変異配列の両方を検出し、それによってメチル化のレベルを決定することを促進するからである。しかし、メチル化された又は非メチル化配列のみを検出するアッセイは本発明により企図されている。

0147

増幅ベースのアッセイフォーマット
別の例では、ハイブリダイゼーションは、変異核酸に選択的にハイブリダイズするプライマー(及び適用可能な場合はプローブ)を使用しているのもかかわらず、陽性読出しアッセイのために本明細書において上に記載される任意の増幅アッセイフォーマットを使用する増幅システムを使用して検出される。

0148

上に記載されるヘビーメチルアッセイを陰性読出しフォーマットに適応する際に、亜硫酸水素塩処理された核酸にメチル化特異的な形で結合するブロッカーは、中程度から高厳密性条件下で変異DNAに特異的に結合する。増幅反応は、任意選択でメチル化特異的であってもよい(すなわち、変異核酸のみに結合する)が上記1つ又は複数のブロッカーに隣接する1つ又は複数のプライマーを使用して実施される。メチル化された核酸(すなわち、変異DNA)の存在下で、ブロッカー(単数/複数)は結合し、PCR産物は生成されない。

0149

一例では、
(i)変異誘発を誘導するのに十分な条件下で非メチル化シトシン残基を選択的に変異させる一定量の化合物で核酸を処理して、それによって変異核酸を作製するステップ、
(ii)変異核酸へのハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、変異シトシン残基を含むDNA中の配列に相補的であるヌクレオチド配列をそれぞれが含む2つの非重複及び非相補的プライマーに核酸をハイブリダイズさせるステップ、
(iii)ハイブリダイズしたプライマーに介在する核酸を増幅させそれによってプライマー配列を含む配列からなるDNA断片を作製するステップ、
(iv)変異核酸へのハイブリダイゼーションが起こるような条件下で、変異シトシン残基を含む配列に一致する又は相補的であるヌクレオチド配列を含むプローブに上記増幅されたDNA断片をハイブリダイズさせるステップ、並びに
(v)上記ハイブリダイゼーションを検出するステップ
を含むプロセスを実施することにより正常な/健康な対照対象におけるメチル化の減少が検出される。

0150

当業者には明らかになるように、陰性読出しアッセイは好ましくは、確実に陰性結果が反応の失敗ではなくメチル化された核酸により引き起こされるように適切な対照試料を含む。

0151

本発明は、本明細書に記載される方法を使用する、本発明の診断配列又はその発現若しくはメチル化の検出及び/又は定量化のためのキットも提供する。

0152

メチル化の検出のためのキットでは、本発明のキットは、本発明の診断配列のうちの少なくとも1つにハイブリダイズする少なくとも1つのポリヌクレオチド及び遺伝子メチル化の検出のための少なくとも1つの試薬を含むことができる。メチル化の検出のための試薬には、たとえば、亜硫酸水素ナトリウム、バイオマーカー配列がメチル化されていなければ(たとえば、少なくとも1つのC→U変換を含有する)、本発明のバイオマーカー配列の産物である配列にハイブリダイズするよう設計されたポリヌクレオチド及び/又はメチル化感受性若しくはメチル化依存性制限酵素が含まれる。キットは、上記配列のメチル化された又は非メチル化形を表す対照天然又は合成DNA配列も含み得る。キットは、アッセイにおける使用するように構成されるアッセイ器具の形態で固体支持体を提供することができる。キットは、キットにおいて任意選択でポリヌクレオチド(たとえば、プローブ)に連結されている検出可能な標識をさらに含み得る。試験管、移動ピペット、及び同種のものを含む、アッセイの実施に有用な他の材料もキットに含めることが可能である。キットは、本明細書に記載されるアッセイのいずれにおいてもこれらの試薬のうちの1つ又は複数の使用のための書面による使用説明書も含むことが可能である。

0153

上文で詳述されているように、高度メチル化は転写サイレンシングに関連している。したがって、大腸新生物の素因又は発症についてスクリーニングする基礎を提供するこれら遺伝子のメチル化レベルの増加に加えて、これら遺伝子の発現レベルの下方調節も診断的に価値がある。本発明のこの態様に従えば、遺伝子「発現産物」又は「遺伝子の発現」への言及は、転写産物(たとえば、一次RNA又はmRNA)又はタンパク質などの翻訳産物への言及である。この点に関して、生成される発現産物(すなわち、RNA又はタンパク質)のレベルの変化、遺伝子に会合しているクロマチンタンパク質の変化、たとえば、アミノ酸位番号9若しくは27のリジン上でのメチル化されたヒストンH3の存在(抑制的修飾)又はDNAのメチル化の変化などの、発現を下方調節するよう作用するDNAそれ自体の変化についてスクリーニングすることにより遺伝子の発現レベルの変化を評価することが可能である。これらの遺伝子及びその遺伝子発現産物は、それがRNA転写物であれ、発現を下方調節するよう作用するDNAの変化であれ、コードされたタンパク質であれ、「新生物マーカー」と総称される。

0154

したがって、本発明の別の態様は、個体における大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又は大腸新生物をモニターする方法であって、上記個体由来の生体試料において、
(i)Hg19座標のうちのいずれか1つ又は複数及び転写開始部位の2kb上流により定義される領域、




(ii)




のうちのいずれか1つ又は複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
から選択されるDNA領域の発現のレベルを評価することを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)のDNA領域の発現のより低いレベルは大腸新生物又は新生物状態の発症の素因を示している、
方法を対象とする。

0155

本発明のこの態様の方法は、生体試料の新生物マーカーのレベルとこれらのマーカーの対照レベルとの比較に基づいている。「対照レベル」は、新生物ではない対応する大腸細胞又は細胞集団により発現されるマーカーのレベルである「正常レベル」でもよい。

0156

上文で詳述されるように、正常(又は「非新生物」)レベルは、試験対象である同じ個体由来の組織を使用して決定し得る。しかし、これは関係する個体には極めて侵襲的になることがあり、したがって、問題の患者以外の個体から得られる個々の又は集団の結果を反映する標準結果と比べて試験結果を分析するほうが都合がよい可能性があることは認識されるであろう。

0157

したがって、さらに具体的には、個体における大腸新生物の発症若しくは発症の素因についてスクリーニングする又は大腸新生物をモニターする方法であって、上記個体由来の生体試料において、
(i)Hg19座標のうちのいずれか1つ又は複数及び転写開始部位の2kb上流により定義される領域、




(ii)




のうちのいずれか1つ又は複数の2kb上流を含む、遺伝子領域
から選択される1つ又は複数の遺伝子又は転写物の発現のレベルを評価することを含み、
対照レベルと比べて群(i)及び/又は(ii)の遺伝子又は転写物の発現のより低いレベルは腫瘍性大腸新生物又は新生物状態の発症の素因を示している、
上記方法が提供される。

0158

好ましくは、上記対照レベルは非新生物レベルである。

0159

上文で詳述されるように、本発明は、大腸に位置している新生物細胞又は細胞集団についてスクリーニングするように設計されている。したがって、「細胞又は細胞集団」への言及は、個々の細胞又は細胞の群への言及として理解されるべきである。上記細胞の群は拡散した細胞集団、細胞懸濁液、被包性細胞集団又は組織の形態をとる細胞集団であってもよい。

0160

「発現」への言及は、核酸分子の転写及び/又は翻訳への言及として理解されるべきである。「RNA」への言及は、一次RNA又はmRNA又は非翻訳RNA(たとえば、miRNA、等)などの任意の形態のRNAへの言及を包含すると理解されるべきである。いかなる点でも本発明を限定することなく、増加した又は減少したRNA合成をもたらす遺伝子転写のモジュレーションは、タンパク質産物を産生するこれらのRNA転写物の一部(たとえば、mRNA)の翻訳とも相関していることがある。したがって、本発明は、細胞又は細胞集団の新生物状態の指標としての新生物マーカータンパク質産物のモジュレートしたレベル又はパターンについてスクリーニングすることを対象とする検出方法論までにも及ぶ。一方法は、mRNA転写物及び/又は対応するタンパク質産物についてスクリーニングすることであるが、本発明はこの点に関して限定されることはなく、たとえば、一次RNA転写物などの他の任意の形態の新生物マーカー発現産物についてスクリーニングすることにまで及ぶことは理解されるべきである。

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