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技術 免疫エフェクター細胞の拡大のための遺伝子改変免疫エフェクター細胞及び遺伝子操作細胞

出願人 ボード・オブ・リージエンツ,ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム
発明者 ローレンスジェイ.エヌ.クーパーハルジートシングヘレンハルズサイモンオリバレスビプレンデュジェナクリーナパテル
出願日 2019年11月8日 (1年1ヶ月経過) 出願番号 2019-203260
公開日 2020年2月13日 (10ヶ月経過) 公開番号 2020-022504
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験 微生物、その培養処理 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 動物,微生物物質含有医薬 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 誤差変動 凝縮状態 二酸化酸素 電気的導入 共有スペース メモリー型 光子束 温度負荷
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2020年2月13日)のものです。
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図面 (20)

課題

改善されたT細胞及びin vivo持続性の制御を可能にするCAR構築物を提供する。

解決手段

本発明は、標的抗原をコードする導入遺伝子及びヒト白血球抗原HLA)をコードする導入遺伝子を含む遺伝子操作抗原提示細胞APC)を提供する。いくつかの態様では、遺伝子操作APCは、共刺激因子(例えば、IL−15)をコードする1つまたは複数の導入遺伝子を追加で含んでよい。かかる遺伝子操作APCは、例えば、ex vivoでのT細胞(例えば、CAR T細胞)の拡大のための方法に使用され得るか、またはin vivoで抗原特異的T細胞成長刺激するために対照投与されてよい。ゆえに、本明細書に提供する細胞を使用して、疾患(例えば、癌)の処置のために(to for)抗原特異的T細胞の成長を刺激してよい。

概要

背景

1.発明の分野
キメラ抗原受容体(CAR)、CAR発現免疫エフェクター細胞ならびにCAR及びCAR T細胞を作製する及び使用する方法を本明細書に記載する。向上した治療特性を有する免疫エフェクター細胞組成物及び抗原提示細胞も提供する。
2.関連技術の説明
臨床グレードのT細胞の効力は、遺伝子療法免疫療法を組み合わせて、より優れた(i)腫瘍関連抗原(TAA)の認識、(ii)注入後の持続性、(iii)腫瘍部位への移入可能性、及び(iv)腫瘍微小環境内でエフェクター機能再循環させる能力の可能性を有する生物学的産物遺伝子操作することにより改善することができる。T細胞のかかる遺伝子工学を使用して、細胞の特異性を再指向し、抗原を標的とする細胞毒性活性を有する治療用組成物を提供することができる。これらの遺伝子操作T細胞組成物は、例えば、癌患者における治療的介入に有効であると示されている(Jena et al.,2010;Till et al.,2008;Porter et al.,2011;Brentjens et al.,2011;Cooper and Bollard,2012;Kalos et al.,2011;Kochenderfer et al.,2010;Kochenderfer et al.,2012;Brentjens et al.,2013)。しかしながら、改善されたT細胞及びin vivo持続性の制御を可能にするCAR構築物に対する必要性が依然として残っている。

概要

改善されたT細胞及びin vivo持続性の制御を可能にするCAR構築物を提供する。本発明は、標的抗原をコードする導入遺伝子及びヒト白血球抗原HLA)をコードする導入遺伝子を含む遺伝子操作抗原提示細胞(APC)を提供する。いくつかの態様では、遺伝子操作APCは、共刺激因子(例えば、IL−15)をコードする1つまたは複数の導入遺伝子を追加で含んでよい。かかる遺伝子操作APCは、例えば、ex vivoでのT細胞(例えば、CAR T細胞)の拡大のための方法に使用され得るか、またはin vivoで抗原特異的T細胞成長刺激するために対照投与されてよい。ゆえに、本明細書に提供する細胞を使用して、疾患(例えば、癌)の処置のために(to for)抗原特異的T細胞の成長を刺激してよい。なし

目的

向上した治療特性を有する免疫エフェクター細胞組成物及び抗原提示細胞も提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

標的抗原をコードする第一の導入遺伝子及びヒト白血球抗原HLA)をコードする第二の導入遺伝子を含む、遺伝子操作抗原提示細胞APC)であって、前記HLAが、前記標的抗原のエピトープ複合体化して前記APCの表面上に発現されている、前記遺伝子操作抗原提示細胞。

請求項2

前記APCが、不死化されていない、請求項1に記載の遺伝子操作APC。

請求項3

前記APCが、一次細胞である、請求項1に記載の遺伝子操作APC。

請求項4

前記APCが、T細胞またはT細胞前駆体である、請求項1に記載の遺伝子操作APC。

請求項5

前記APCが、TCRαβまたはTCRγδを発現するT細胞である、請求項1に記載の遺伝子操作APC。

請求項6

共刺激分子をコードする少なくとも第三の導入遺伝子をさらに含む、請求項1に記載の遺伝子操作APC。

請求項7

前記標的抗原が、NY−ESO−1である、請求項1に記載の遺伝子操作APC。

請求項8

前記HLAがHLA−A2である、請求項1に記載の遺伝子操作APC。

請求項9

前記HLAが、HLA−A、HLA−B、HLA−CまたはHLA−DRB1である、請求項1に記載の遺伝子操作APC。

請求項10

前記共刺激分子がサイトカインである、請求項6に記載の遺伝子操作APC。

請求項11

前記サイトカインが膜結合型IL−15である、請求項10に記載の遺伝子操作APC。

請求項12

前記膜結合型IL−15がIL−15およびIL−15Rαの融合物である、請求項11に記載の遺伝子操作APC。

請求項13

編集されたまたは欠失したPD−1、LIM−3、CTLA−4またはTCRをさらに含む、請求項1に記載の遺伝子操作APC。

請求項14

疾患を有する対象を処置するための組成物であって、請求項1〜6のいずれか一項に記載の遺伝子操作APCを含み、前記APCが前記疾患に関連する標的抗原を発現する、前記組成物。

請求項15

前記対象が、前記APCによりコードされる前記標的抗原を発現する癌を有する、請求項14に記載の組成物。

請求項16

標的抗原が、NY−ESO−1である、請求項14に記載の組成物。

請求項17

抗原特異的免疫エフェクター細胞を増殖させる方法であって、前記抗原特異的免疫エフェクター細胞を遺伝子操作APCとともに培養するステップを含み、前記APCが、標的抗原をコードする第一の導入遺伝子及びヒト白血球抗原(HLA)をコードする第二の導入遺伝子を含み、前記HLAが、前記標的抗原のエピトープと複合体化して前記APCの表面上に発現されている、前記方法。

請求項18

前記標的抗原が、NY−ESO−1である、請求項17に記載の方法。

請求項19

前記抗原特異的免疫エフェクター細胞が、CARまたはTCRを発現している、請求項17に記載の方法。

請求項20

前記HLAがHLA−A2である、請求項17に記載の方法。

請求項21

前記HLAが、HLA−A、HLA−B、HLA−CまたはHLA−DRB1である、請求項17に記載の方法。

請求項22

前記APCが、TCRαβまたはTCRγδを発現するT細胞である、請求項17に記載の方法。

請求項23

ミトコンドリア予備呼吸能が高いCAR改変T細胞を選択する方法であって、ミトコンドリアのレポーター遺伝子発現レベルを検出すること及び前記ミトコンドリアのレポーター遺伝子の発現レベルが上昇したCAR改変T細胞を選択すること、それによりミトコンドリアの予備呼吸能を有するCAR改変T細胞を選択することを含む、前記方法。

請求項24

前記ミトコンドリアのレポーター遺伝子が、内因性遺伝子である、請求項23に記載の方法。

請求項25

前記ミトコンドリアのレポーター遺伝子が、外因性遺伝子である、請求項23に記載の方法。

請求項26

前記外因性遺伝子が、蛍光レポータータンパク質をコードする、請求項25に記載の方法。

請求項27

前記蛍光レポータータンパク質が、ミトコンドリア局在化配列を含む、請求項26に記載の方法。

技術分野

0001

本出願は、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願第62/075,642号、2014年11月5日に出願;米国仮特許出願第62/075,561号、2014年11月5日に出願;米国仮特許出願第62/075,667号、2014年11月5日に出願;及び米国仮特許出願第62/169,979号、2015年6月2日の利益を主張する。

0002

配列表の組み込み
配列表は、ファイル名「UTFCP1251WO_ST25.txt」に含有され、これは48KB(Microsoft Windows(登録商標)にて測定)であり、2015年11月5日に作成され、電子提出により本明細書と共に提出され、参照により本明細書に組み込まれる。

背景技術

0003

1.発明の分野
キメラ抗原受容体(CAR)、CAR発現免疫エフェクター細胞ならびにCAR及びCAR T細胞を作製する及び使用する方法を本明細書に記載する。向上した治療特性を有する免疫エフェクター細胞組成物及び抗原提示細胞も提供する。
2.関連技術の説明
臨床グレードのT細胞の効力は、遺伝子療法免疫療法を組み合わせて、より優れた(i)腫瘍関連抗原(TAA)の認識、(ii)注入後の持続性、(iii)腫瘍部位への移入可能性、及び(iv)腫瘍微小環境内でエフェクター機能再循環させる能力の可能性を有する生物学的産物遺伝子操作することにより改善することができる。T細胞のかかる遺伝子工学を使用して、細胞の特異性を再指向し、抗原を標的とする細胞毒性活性を有する治療用組成物を提供することができる。これらの遺伝子操作T細胞組成物は、例えば、癌患者における治療的介入に有効であると示されている(Jena et al.,2010;Till et al.,2008;Porter et al.,2011;Brentjens et al.,2011;Cooper and Bollard,2012;Kalos et al.,2011;Kochenderfer et al.,2010;Kochenderfer et al.,2012;Brentjens et al.,2013)。しかしながら、改善されたT細胞及びin vivo持続性の制御を可能にするCAR構築物に対する必要性が依然として残っている。

先行技術

0004

Jena et al.,Blood,116:1035−1044,2010.
Till et al.,Blood,112:2261−2271,2008.
Porter et al.,N.Engl.J.Med.,365:725−733,2011.
Brentjens et al.,Blood,118:4817−4828,2011.
Cooper and Bollard,Blood,119:2700−2702,2012.
Kalos et al.,Sci.Transl.Med.,3:95ra73,2011.
Kochenderfer et al.,Blood,116:4099−4102,2010.
Kochenderfer et al.,Blood,119:2709−2720,2012.
Brentjens et al.,Sci.Transl.Med.,5:177ra138,2013.

課題を解決するための手段

0005

第一の実施形態では、抗原結合性ドメインヒンジドメイン膜貫通ドメイン及び1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン複数可)を含むキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、ヒンジドメインは、FcγR2aまたはFcγR1aなどのFc受容体に結合する配列を含む。例えば、ヒンジ配列は、Fc受容体に結合する、ヒト免疫グロブリン(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgMIgDまたはIgE)からのFcドメインを含んでよい。ある特定の態様では、ヒンジドメイン(及び/またはCAR)は、野生型ヒトIgG4 CH2及びCH3配列を含まない。

0006

さらなる態様では、本実施形態のCARのヒンジドメインは、Fc受容体(FcγR2a及び/またはFcγR1a Fc受容体など)との結合が低下したまたはそれと本質的に結合しない配列を含んでよい。いくつかの態様では、ヒンジドメインは、(i)配列番号1に対して同一である少なくとも8個連続したアミノ酸を有するヒトIgG4−Fc配列(突然変異IgG4−Fc配列)、前記配列は、完全長野生型IgG4−Fcに対して低下したFc受容体結合を有する;または(ii)ヒトCD8a細胞外配列を含む。

0007

いくつかの態様では、ヒンジドメインは、配列番号1に対して同一である少なくとも8個連続したアミノ酸を有するヒトIgG4−Fc配列(突然変異IgG4−Fc配列)を含んでよく、前記配列は、完全長野生型IgG4−Fcに対して低下したFc受容体結合を有する。いくつかの態様では、ヒンジドメインは、配列番号3に対して少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一である配列を含んでよい(12−aaスペーサー)。一態様では、ヒンジドメインは、配列番号3に対して同一である配列を含んでよい。なおもさらなる態様では、ヒンジドメインは、配列番号3に対して、1、2、または3個以下のアミノ酸欠失または置換を有する配列を含んでよい(12−aaスペーサー)。

0008

ある特定の態様では、ヒンジドメインは、IgG4−Fc配列を含んでよく、前記配列は、野生型IgG4−Fcに対して、Fc受容体結合を低下させる少なくとも1つの突然変異を含む。いくつかの態様では、IgG4−Fc配列は、配列番号1に対して少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であってよい。いくつかの態様では、IgG4−Fc配列は、野生型配列に対して、L235EまたはN297Q突然変異を含んでよい。ある特定の態様では、IgG4−Fc配列は、野生型配列に対して、L235E及びN297Q突然変異を含んでよい。一態様では、IgG4−Fc配列は、配列番号1に対して同一であってよいか、または配列番号1に対して1、2、もしくは3個以下のアミノ酸欠失もしくは置換を含んでよい。別の態様では、IgG4−Fc配列Iは、配列番号1に対して同一である。

0009

いくつかの態様では、ヒンジドメインは、CD8a細胞外配列を含んでよい。例えば、ヒンジドメインは、配列番号2の細胞外部分に対して少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一である配列を含んでよい。さらなる態様では、CARポリペプチドは、配列番号2の細胞外部分に対して同一である配列を含んでよいか、または配列番号2の細胞外部分に対して1、2、もしくは3個以下のアミノ酸欠失もしくは置換を含んでよい。なおもさらなる態様では、CARポリペプチドのヒンジドメインは、配列番号20に対して少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一である配列を含む。さらなる態様では、CARポリペプチドは、配列番号20に対して同一である配列を含んでよいか、または配列番号20に対して1、2、もしくは3個以下のアミノ酸欠失もしくは置換を含んでよい。

0010

いくつかの態様では、膜貫通ドメインは、CD8a膜貫通ドメインを含んでよい。ある特定の態様では、CARポリペプチドは、配列番号2の膜貫通部分に対して少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一である配列を含んでよい。一態様では、CARポリペプチドは、配列番号2の膜貫通部分に対して同一である配列を含んでよいか、または配列番号2の膜貫通部分に対して1、2、もしくは3個以下のアミノ酸欠失もしくは置換を含んでよい。ある特定の態様では、膜貫通ドメインは、CD28、CD8aまたはCD137の膜貫通ドメインを含んでよい。なおもさらなる態様では、膜貫通ドメインは、配列番号19に対して85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるCD8a膜貫通ドメインを含んでよい。なおもさらなる態様では、CARポリペプチドは、配列番号19に対して同一である膜貫通配列を含んでよいか、または配列番号19に対して1、2、もしくは3個以下のアミノ酸欠失もしくは置換を含んでよい。

0011

いくつかの態様では、細胞内細胞シグナル伝達ドメインは、CD3ζからのドメインを含んでよい。例えば、本実施形態のCARポリペプチドは、配列番号13に対して85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるCD3ζ配列を含んでよい。なおもさらなる態様では、CARポリペプチドは、配列番号13に対して同一であるCD3ζ配列を含んで含んでよいか、または配列番号13に対して1、2、もしくは3個以下のアミノ酸欠失もしくは置換を含んでよい。なおもさらなる態様では、細胞内細胞シグナル伝達ドメインは、CD28またはCD137(4−1BB)からの細胞内ドメインを含んでよい。例えば、CARは、配列番号15または配列番号17に対して85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一である配列を含む細胞内細胞シグナル伝達ドメインを含んでよい。なおもさらなる態様では、CARポリペプチドは、配列番号15もしくは配列番号17に対して同一である配列を含む細胞内細胞シグナル伝達ドメインを含んでよいか、または配列番号15もしくは17に対して1、2、もしくは3個以下のアミノ酸欠失もしくは置換を含んでよい。

0012

種々の態様では、本実施形態のCARの抗原結合性ドメインは、scFvまたは抗体の重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)を含んでよい。さらなる態様では、抗原結合性ドメインは、第一のscFvドメイン及び第二のscFvドメインを含んでよく、ここで第一または第二のscFvドメインの一方は第一の抗原と結合し、他方のドメインは第二の抗原と結合する。いくつかの態様では、VLドメインは、VHドメインに対してN末端に位置してよい。ある特定の態様では、VHドメインは、VLドメインに対してN末端に位置してよい。ある特定の態様では、CARポリペプチドは、軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメイン及び/または第一と第二のscFvドメインの間にリンカー配列をさらに含んでよい。いくつかの態様では、リンカー配列は、ウィットローリンカーであってよい(配列番号7)。

0013

種々の態様では、抗原結合性ドメインは、感染性疾患抗原または癌細胞抗原に結合してよい。癌細胞抗原の例としては、CD19、CD20、ROR1、CD22癌胎児性抗原アルファフェトプロテイン、CA−125、5T4、MUC−1、上皮性腫瘍抗原前立腺特異的抗原、メラノーマ関連抗原、変異型p53、変異型ras、HER2/Neu、葉酸結合タンパク質HIV−1エンベロープ糖タンパク質gp120、HIV−1エンベロープ糖タンパク質gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c−Met、メソテリン、GD3、HERV−K、IL−11Rアルファカッパ鎖ラムダ鎖、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、HER2−HER3組み合わせ、HER1−HER2組み合わせまたはHER1−HER3組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、癌細胞抗原は、CD19であってよく、CARは、CD19標的CARであってよい。

0014

さらなる実施形態では、本実施形態に係るCARポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。いくつかの態様では、CARをコードする配列は、トランスポゾン反復またはウイルスLTRに隣接する。

0015

なおもさらなる実施形態では、本実施形態に係るCARポリペプチドまたは核酸を含む単離された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞またはNK T細胞)を提供する。いくつかの態様では、細胞は、T細胞またはT細胞前駆体である。さらなる態様では、細胞は、ヒト細胞である。ある特定の態様では、細胞組成物は、百個または1,000個と少ない細胞を含んでよい。しかしながら、いくつかの態様では、細胞組成物は、少なくとも約104、105、106、107、108、109、1010、1011個またはそれ以上のCAR発現免疫エフェクター細胞を含む。いくつかの態様では、細胞は、本質的に同一である遺伝物質を有してよい。さらなる態様では、細胞は、ドナーまたは患者であり得る単一の対象に由来するヒト細胞であってよい。さらなる実施形態は、薬学的に許容され得るキャリア中の本実施形態に係るCAR発現細胞集団を含む医薬組成物を提供する。

0016

なおもさらなる実施形態では、対象(例えば、癌または感染性疾患を有する対象)を処置する方法であって、本実施形態に係るCARポリペプチドを発現する有効量の免疫エフェクター細胞を投与することを含む、前記方法を提供する。ある特定の態様では、対象は、癌を有し得る。ある特定の態様では、癌は、血液癌または固形癌、例えば、T細胞ALL、B−ALL、CML結腸癌卵巣癌神経芽細胞腫脳腫瘍(複数可)、または膵臓癌であってよい。いくつかの態様では、患者は、以前の抗癌治療を受けていてよい。一態様では、患者は、寛解期にあってよい。なおも別の態様では、患者は、検出可能な癌細胞を含むが癌の症状を有さなくてよい。別の態様では、対象は、ウイルス感染(例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタインバール・ウイルス(EBV)、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV))を有してよい。なおも別の態様では、対象は、細菌感染を有してよい。一態様では、疾患は、敗血症であってよい。

0017

ある特定の態様では、対象を処置する方法は、ヒトFc受容体に結合するポリペプチド配列を有するヒンジドメインを含むCARを発現する免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)を投与することを含む。いくつかの態様では、かかる免疫エフェクター細胞は、局所的、例えば、罹患組織の部位に投与される。ある特定の態様では、局所送達の部位は、Fc受容体を発現する細胞の数が低下している(または実質的に無い)。例えば、投与部位は、対象の中枢神経系(例えば、脳)、眼または精巣内であることができる。

0018

いくつかの態様では、CARポリペプチドは、癌細胞抗原に結合する抗原結合性ドメインを含んでよい。いくつかの態様では、癌は、乳癌、卵巣癌、メラノーマ、非小細胞肺癌胃癌結腸直腸癌または膵臓癌であってよい。さらなる態様では、癌は、CARの抗原結合性ドメインにより結合される癌細胞抗原を発現する。なおもさらなる態様では、対象は、CARポリペプチドが結合する癌細胞抗原を発現する癌を有すると同定されている。なおもさらなる態様では、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)は、対象から以前に単離されている。

0019

いくつかのさらなる態様では、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)は、患者にアロジェネイックであってよい。種々の態様では、アロジェネイックな細胞は、患者とHLA共有してもしなくてもよい。別の態様では、免疫エフェクター細胞は、患者に自己由来であってよい。

0020

なおもさらなる実施形態では、免疫エフェクター細胞またはその前駆体(例えば、T細胞またはT細胞前駆体)を含む細胞の試料を獲得すること、細胞に本実施形態に係るCARポリペプチドをコードするDNAをトランスフェクトしてトランスジェニックCAR発現細胞の集団を提供すること、及びトランスジェニックCAR細胞の集団をex vivoでCAR発現免疫エフェクター細胞(例えば、CAR発現T細胞)の増殖を選択的に増強する培地中で培養することを含む、方法を提供する。ある特定の態様では、本方法は、細胞にトランスポゾン隣接CAR及びCARをコードするDNAを細胞のゲノム内に組み込むのに有効であるトランスポゼースをトランスフェクトすることをさらに含む。さらなる態様では、本方法は、トランスフェクションの前に試料中のT細胞を精製するまたは濃縮することを含む。ある特定の場合では、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞またはT細胞前駆体)は、誘導多能性幹細胞または胚性幹細胞に由来する。さらなる態様では、試料中の細胞を濃縮することは、単核細胞画分回収することを含む。細胞の試料は、いくつかの場合では、対象からの臍帯血リンパ器官または末梢血試料からのものであってよい。細胞の試料は、いくつかの場合では、アフェレーシスまたは静脈穿刺によって得られてよい。なおもさらなる態様では、細胞の試料は、T細胞の分集団などの免疫細胞の分集団である。いくつかの態様では、トランスジェニックCAR細胞は、内因性T細胞受容体及び/または内因性HLAの発現に関して不活性化される。さらなる態様では、細胞の試料を獲得することは、第三者からの細胞を獲得することを含む。

0021

いくつかの態様では、(例えば、CAR構築物の)トランスフェクションの方法は、CARをコードするDNAを細胞(例えば、T細胞)内にエレクトロポレートすることを含む。さらなる態様では、CAR構築物は、ウイルスベクターを使用して細胞内に形質導入されてよい。いくつかの態様では、トランスフェクションは、細胞にウイルスを感染させるまたは形質導入することを必然的に含まなくてよい。なおもさらなる態様では、細胞は、膜結合型Cγサイトカインをコードする核酸でさらにトランスフェクトされる。膜結合型Cγサイトカインは、いくつかの例では、膜結合型IL−7、IL−15またはIL−21であってよい。特定の態様では、膜結合型Cγサイトカインは、IL−15−IL−15Rα融合タンパク質(例えば、配列番号4のmIL−15ポリペプチドなど)である。

0022

なおもさらなる態様では、CARをコードするDNAは、プラスミドである。さらなる態様では、CARは、細胞内に導入されるRNAによりコードされてよい。トランスポゼースは、いくつかの態様では、DNA発現ベクターmRNA、ポリペプチド、または発現可能RNAとして提供されてよい。特定の態様では、トランスポゼースは、サケ科型Tc1−様トランスポゼース(SB)である。さらなる特定の態様では、トランスポゼースは、SB11またはSB100xトランスポゼースである。

0023

実施形態のなおもさらなる態様では、本明細書に詳述する方法に従ってトランスジェニックCAR細胞を培養することは、トランスジェニックCAR細胞を、CAR発現免疫エフェクター細胞の拡大を刺激する樹状細胞ならびに活性化及び増殖細胞(AaPC)の存在下で培養することを含む。なおもさらなる態様では、AaPCは、AaPCの表面上で発現されるCAR結合性抗体またはその断片を含む。AaPCは、いくつかの場合では、T細胞を活性化するまたは共刺激する追加の分子を含んでよい。追加の分子は、いくつかの場合では、膜結合型Cγサイトカインを含んでよい。なおもまださらなる態様では、AaPCは不活性化もしくは照射される、または感染性物質に関して検査され、これを含まないと確認されている。なおもさらなる態様では、AaPCの存在下でトランスジェニックCAR細胞を培養することは、IL−21及び/またはIL−2などの可溶性サイトカインを含む培地中で、トランスジェニックCAR細胞を培養することを含む。細胞は、約10:1〜約1:10;約3:1〜約1:5;約1:1〜約1:3(免疫エフェクター細胞対AaPC);またはその間で誘導可能な任意の範囲の比率で培養されてよい。例えば、T細胞とaAPC共培養は、約1:1、約1:2または約1:3の比率であることができる。

0024

さらなる態様では、トランスジェニックCAR細胞の集団は、7、14、21、28、35または42日間以下にわたって培養される。いくつかの例では、トランスジェニック細胞は、AaPCの存在下ex vivoで培養されない。いくつかの特定の例では、本実施形態の方法は、トランスフェクション及び/または培養ステップの後に、CAR発現免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)の細胞集団を濃縮させることをさらに含む。濃縮することは、蛍光活性細胞選別FACS)及びCAR発現細胞について選別することを含んでよい。さらなる態様では、CAR発現細胞について選別することは、CAR結合性抗体の使用を含む。濃縮することは、CD56+細胞の枯渇も含んでよい。本実施形態のなおもまださらなる態様では、本方法は、トランスジェニックCAR細胞の集団の試料を低温保存することをさらに含む。

0025

さらなる実施形態では、本実施形態のいずれか一つに記載の方法により作製されるCAR発現免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)集団を提供する。

0026

さらなる実施形態では、患者において疾患を処置する方法であって、本発明の実施形態の方法に従って細胞組成物を産生すること、及び有効量の前記細胞組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様では、医学的状態を有する個体を処置するための方法であって、いくつかの態様では、2回以上、例えば少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、またはそれ以上の日にちを空けて、本明細書に記載の細胞の集団から有効量の細胞を提供するステップを含む、前記方法を提供する。

0027

なおもさらなる実施形態では、標的抗原をコードする第一の導入遺伝子及びヒト白血球抗原(HLA)をコードする第二の導入遺伝子を含む遺伝子操作抗原提示細胞(APC)であって、前記HLAが標的抗原のエピトープ複合体化してAPCの表面上に発現されている、前記遺伝子操作抗原提示細胞を提供する。遺伝子操作APCは、不死化されていてもいなくてもよい。いくつかの態様では、遺伝子操作APCは、一次細胞またはT細胞またはT細胞前駆体である。いくつかのさらなる態様では、遺伝子操作APCは、αβTCRまたはγδTCRを発現するT細胞である。ある特定の特定の態様では、遺伝子操作APCにおいて発現されるHLAは、HLA−A2である。なおもさらなる態様では、遺伝子操作APCは、感染性物質に関して検査され、これを含まないと確認されている。

0028

いくつかの態様では、本実施形態の遺伝子操作APCは、共刺激分子をコードする少なくとも第三の導入遺伝子をさらに含んでよい。共刺激分子は、膜結合型Cγサイトカインであってよい共刺激サイトカインであってよい。ある特定の態様では、共刺激サイトカインは、膜結合型であってもなくてもよいIL−15である。

0029

さらなる態様では、本実施形態の遺伝子操作APCは、不活性化または照射されている。いくつかの態様では、遺伝子操作APCは、阻害遺伝子の発現を低下させるまたは除外するように編集された遺伝子を含んでよい。特定の態様では、阻害遺伝子は、PD−1、LIM−3、CTLA−4またはTCRであってよい。

0030

なおもさらなる態様では、本実施形態の遺伝子操作APCにおいて発現される標的抗原は、感染性疾患抗原または腫瘍関連抗原(TAA)であることができる。標的抗原は、細胞内また細胞表面抗原であってよい。例えば、いくつかの態様では、標的抗原は、腫瘍細胞細胞内コンパートメントに由来するTAAなどのTAAである。TAAは、膜結合型、細胞質核局在化であってよいか、または腫瘍細胞により分泌されてもよい。好ましくは、TAAは、対応する正常組織と比較して差次的に発現され、それにより免疫エフェクター細胞による腫瘍細胞の優先的な認識が可能になる。腫瘍抗原は、癌胎児性(典型的には、胎児組織及び癌性体細胞においてのみ発現される)、発がんウイルス腫瘍化ウイルスによりコードされる)、過剰発現蓄積(正常組織と新生物組織の両方により発現され、新生物における発現のレベルが高度に上昇している)、癌・精巣(癌細胞ならびに精巣及び胎盤などの成人生殖組織によってのみ発現される)、系列制限(主に単一の癌組織型により発現される)、変異型(遺伝的突然変異または転写変性の結果としての癌によってのみ発現される)、翻訳後変性(グリコシル化等における腫瘍関連変性)、またはイディオタイプ(高度に多型の遺伝子、ここで腫瘍細胞は特定の「クロノタイプ」を発現する、例えば、クローン異常の結果生じる、B細胞、T細胞リンパ腫白血病のように)として大きく分類することができ、これらのTAAのいずれもが本実施形態に係る標的抗原として機能し得る。標的抗原の特定の例には、これらに限定されないが、WT1、MUC1、LMP2、HPVE6 E7、EGFRvIII、HER−2/neu、イディオタイプ、MAGE A3、p53非変異体、NY−ESO−1、PSMA、GD2、CEAメランA/MART1、Ras突然変異体、gp100、p53突然変異体、プロテイナーゼ3(PR1)、bcr−abl、チロシナーゼサバイビン、PSA、hTERT、肉腫転座ブレークポイント、EphA2、PAP、ML−IAPAFP、EpCAMERG(TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、ALK、アンドロゲン受容体サイクリンB1、ポリシアル酸、MCN、RhoC、TRP−2、GD3、フコシルGM1、メソテリン、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GloboH、ETV6−AML、NY−BR−1、RGS5、SART3、STn、炭酸脱水酵素IX、PAX5、OT−TES1、精液タンパク質17、LCK、HMWMAA、AKAP−4、SSX2、XAGE 1、B7H3、レグマイン、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD−CT−1、FAP、PDGFR−β、MAD−CT−2、及びFos関連抗原1が含まれる。他の態様では、標的抗原は、感染性疾患抗原である。

0031

なおもまださらなる態様では、本実施形態の遺伝子操作APCは、ヒト細胞である。いくつかの態様では、遺伝子操作APCの第一及び/または第二の導入遺伝子は、細胞のゲノム内に組み込まれてよい。さらに、ある特定の態様では、第一及び/または第二の導入遺伝子は、トランスポゾン反復またはウイルスLTRに隣接してよい。さらなる態様では、第一及び/または第二の導入遺伝子は、組換えmRNAによりコードされる。

0032

さらなる実施形態では、本実施形態に係る遺伝子操作APCの集団及びAPCにて発現されるHLAと複合体化した標的抗原のエピトープに対する特異性を有する免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)の集団を含む細胞培養物を提供する。ある特定の態様では、培養物の免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作APCと同じ遺伝的背景を有する。特定の態様では、免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作APCにて発現されるHLAと複合体化した標的抗原のエピトープに結合するT細胞受容体(TCR)を発現する。特定の態様では、TCRは、αβTCRである。ある特定の態様では、標的抗原は、NY−ESO−1である。いくつかの特定の態様では、TCRは、抗NY−ESO−1−αβTCR(配列番号28)に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるかまたは同一である配列を含む。

0033

さらなる態様では、(本実施形態の遺伝子操作APCを含む)細胞培養物の免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作APCにて発現されるHLAと複合体化した標的抗原のエピトープに結合するキメラT細胞受容体(CAR)を発現する。CARは、APCにて発現されるHLAと複合体化した標的抗原のエピトープに結合する抗体可変ドメインを含んでよい。いくつかの特定の態様では、標的抗原は、NY−ESO−1である。ある特定の態様では、CARは、NY−ESO−1R−CD28Tm−CD137−Z CAR(配列番号22);NY−ESO−1R−CD8a−CD28−Z CAR(配列番号24);またはNY−ESO−1R−CD8a−CD137−Z CAR(配列番号26)に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるかまたは同一である配列を含む。

0034

いくつかの態様では、本実施形態の遺伝子操作APCの細胞培養物は、免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)拡大を刺激する培地を含んでよい。培地は、IL−21及び/またはIL−2を含んでよい。特定の態様では、培養物は、約10:1〜約1:10(免疫エフェクター細胞対遺伝子操作APC)の比率を含む。

0035

なおもさらなる実施形態では、薬学的に許容され得るキャリア中の本明細書に記載の実施形態に係る遺伝子操作APCの集団を含む医薬組成物を提供する。

0036

なおもさらなる実施形態では、疾患を有する対象を処置する方法であって、本実施形態に係る有効量の遺伝子操作APCを対象に投与することを含み、前記APCが、該疾患に関連する標的抗原を発現する、前記方法を提供する。いくつかの態様では、対象は、遺伝子操作APCによりコードされる標的抗原を発現する癌を有する。癌は、骨髄腫または滑膜肉腫であってよい。ある特定の態様では、癌は、NY−ESO−1陽性癌であり、標的抗原は、NY−ESO−1である。

0037

本実施形態のいくつかの態様では、遺伝子操作APCは、対象から以前に単離されている。さらなる態様では、本方法は、抗原特異的免疫エフェクター細胞の集団を対象に投与することを追加的に含み、前記免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作APCにて発現されるHLAと複合体化した標的抗原のエピトープに対する特異性を有する。免疫エフェクター細胞は、対象から以前に単離されていてよい。さらなる態様では、免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作APCにて発現されるHLAと複合体化した標的抗原のエピトープに結合するT細胞受容体(TCR)を発現するように遺伝子操作されている。特定の態様では、TCRは、αβTCRである。いくつかの特定の態様では、標的抗原は、NY−ESO−1である。ある特定の態様では、TCRは、抗NY−ESO−1−αβTCR(配列番号28)に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるかまたは同一である配列を含む。

0038

本実施形態のさらなる態様では、免疫エフェクター細胞は、遺伝子操作APCにて発現されるHLAと複合体化した標的抗原のエピトープに結合するキメラT細胞受容体(CAR)を発現する。CARは、遺伝子操作APCにて発現されるHLAと複合体化した標的抗原のエピトープに結合する抗体可変ドメインを含んでよい。いくつかの特定の態様では、標的抗原は、NY−ESO−1である。さらなる態様では、CARは、NY−ESO−1R−CD28Tm−CD137−Z CAR(配列番号22);NY−ESO−1R−CD8a−CD28−Z CAR(配列番号24);またはNY−ESO−1R−CD8a−CD137−Z CAR(配列番号26)に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるかまたは同一である配列を含む。

0039

さらなる実施形態では、NY−ESO−1R−CD28Tm−CD137−Z CAR(配列番号22);NY−ESO−1R−CD8a−CD28−Z CAR(配列番号24);またはNY−ESO−1R−CD8a−CD137−Z CAR(配列番号26)に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるかまたは同一である配列を含む組換えCARポリペプチドを提供する。なおもさらなる実施形態では、NY−ESO−1R−CD28Tm−CD137−Z CAR(配列番号22);NY−ESO−1R−CD8a−CD28−Z CAR(配列番号24);またはNY−ESO−1R−CD8a−CD137−Z CAR(配列番号26)に対して少なくとも80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるかまたは同一であるCARポリペプチドを含む免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)を提供する。

0040

なおもさらなる態様では、本実施形態の方法は、抗原発現遺伝子操作APCの細胞集団を濃縮させることを追加的に含む。いくつかの態様では、濃縮は、蛍光活性化細胞選別(FACS)を含む。特定の態様では、濃縮は、抗原発現について選別することを含む。

0041

さらなる実施形態では、本実施形態の遺伝子操作APCを作製する方法であって、APCを含む細胞の試料を獲得すること、ならびに細胞に標的抗原をコードする導入遺伝子及びヒト白血球抗原(HLA)をコードする導入遺伝子を含む核酸を、前記HLAが標的抗原のエピトープと複合体化してAPCの表面上に発現されるように、トランスフェクトして、遺伝子操作APCの集団を産生することを含む、前記方法を提供する。ある特定の態様では、APCは、T細胞またはT細胞前駆体である。さらなる態様では、本方法は、トランスフェクションの前に試料中のAPCを精製するまたは濃縮することを追加的に含む。特定の態様では、T細胞またはT細胞前駆体は、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞または造血幹細胞に由来する。さらなる態様では、試料中のT細胞を濃縮することは、単核細胞画分を収集することを含む。いくつかの態様では、細胞の試料は、対象からの臍帯血、リンパ器官または末梢血試料からのものであってよい。ある特定の態様では、細胞の試料は、アフェレーシスまたは静脈穿刺により獲得してよい。なおもさらなる態様では、細胞の試料は、T細胞の分集団である。いくつかの特定の態様では、トランスジェニックCAR細胞は、内因性T細胞受容体及び/または内因性HLAの発現に対して不活性化される。特定の態様では、細胞の試料を得ることは、第三当事者から細胞を獲得することを含む。

0042

いくつかの態様では、APCのトランスフェクションは、導入遺伝子をコードするDNAをAPC内にエレクトロポレートして遺伝子操作APCを生成することを含む。さらなる態様では、APCは、ウイルスベクターを使用して形質導入することができる。いくつかの態様では、トランスフェクションは、細胞にウイルスを感染させるまたは形質導入することを必然的に含んでも含まなくてもよい。さらなる態様では、細胞は、膜結合型Cγサイトカインをコードする核酸をさらにトランスフェクトされる。ある特定の態様では、膜結合型Cγサイトカインは、膜結合型IL−7、IL−15またはIL−21であってよい。特定の態様では、膜結合型Cγサイトカインは、IL−15−IL−15Rα融合タンパク質である。

0043

さらなる態様では、APCのトランスフェクションは、トランスポゼースを細胞内に導入することを追加的に含み、ここで導入遺伝子の少なくとも1つは、トランスポゾン反復に隣接する。いくつかの態様では、トランスポゼースは、DNA発現ベクター、mRNA、ポリペプチド、または発現可能RNAとして提供されてよい。特定の態様では、トランスポゼースは、サケ科型Tc1様トランスポゼース(SB)である。さらなる特定の態様では、トランスポゼースは、SB11またはSB100xトランスポゼースである。

0044

本実施形態のなおもさらなる態様では、遺伝子操作APCを産生する方法は、ex vivoでAPCの増殖を増強する培地中で遺伝子操作APC細胞の集団を培養する追加のステップを含む。いくつかの態様では、遺伝子操作APCを培養することは、T細胞などの抗原特異的免疫エフェクター細胞の存在下で細胞を培養することを含んでよく、前記細胞は、APCにて発現されるHLAと複合体化した標的抗原のエピトープに対する特異性を有する。ある特定の態様では、免疫エフェクター細胞は、APCと同じ対象から獲得してよい。さらなる態様では、免疫エフェクター細胞は、APCにて発現されるHLAと複合体化した標的抗原のエピトープに結合するT細胞受容体(TCR)を発現するように遺伝子操作されている。特定の態様では、TCRは、αβTCRである。なおもさらなる態様では、免疫エフェクター細胞は、APCにて発現されるHLAと複合体化した標的抗原のエピトープに結合するキメラ抗原受容体(CAR)を発現するように遺伝子操作されている。いくつかの態様では、CARは、APCにて発現されるHLAと複合体化した標的抗原のエピトープに結合する抗体可変ドメインを含んでよい。

0045

さらなる態様では、本実施形態の遺伝子操作APCは、感染性物質に関して検査され、これを含まないと確認されている。いくつかの態様では、免疫エフェクター細胞の存在下で遺伝子操作APCを培養することは、IL−21及び/またはIL−2を含む培地中で細胞を培養することを含んでよい。さらなる態様では、免疫エフェクター細胞の存在下で遺伝子操作APCを培養することは、約10:1〜約1:10(免疫エフェクター細胞対APC)の比率で細胞を培養することを含んでよい。ある特定の態様では、遺伝子操作APCを培養することは、7、14、21、28、35または42日間以下にわたる。

0046

なおもさらなる実施形態では、本明細書に記載の任意の実施形態の方法により作製された遺伝子操作APC集団を提供する。

0047

さらなる実施形態では、遺伝子操作APC及び/または抗原特異的免疫エフェクター細胞を含む細胞組成物を提供する。細胞組成物は、百個または1、000個と少ない細胞を含んでよい。しかしながら、いくつかの態様では、細胞組成物は、少なくとも約104、105、106、107、108、109、1010、1011個またはそれ以上の遺伝子操作APC及び/または抗原特異的免疫エフェクター細胞を含む。一態様では、細胞は、本質的に同一である遺伝物質を有してよい。いくつかの態様では、細胞は、ドナーまたは患者であり得る単一の対象に由来するヒトであってよい。

0048

なおもさらなる実施形態では、本実施形態の遺伝子操作APCを含む細胞組成物及び薬学的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物を提供する。

0049

なおもさらなる実施形態では、患者において疾患を処置する方法であって、有効量の、遺伝子操作APCを含む細胞集団または遺伝子操作APCを含む医薬組成物を投与することを含む、前記方法を提供する。一態様では、患者は、ヒト患者であってよい。ある特定の態様では、疾患は、癌であってよい。さらなる態様では、癌は、血液癌または固形癌、例えば、T細胞ALL、B−ALL、CML、結腸癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、脳腫瘍(複数可)、または膵臓癌であってよい。いくつかの態様では、患者は、以前の抗癌治療を受けていてよい。一態様では、患者は、寛解期にあってよい。なおも別の態様では、患者は、検出可能な癌細胞を含むが癌の症状を有さなくてよい。別の態様では、疾患は、ウイルス感染(例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン・バール・ウイルス(EBV)、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV))であってよい。なおも別の態様では、疾患は、細菌感染であってよい。一態様では、疾患は、敗血症であってよい。

0050

いくつかのさらなる態様では、遺伝子操作APCを含む細胞組成物は、患者にアロジェネイックであってよい。種々の態様では、アロジェネイックな細胞組成物は、患者とHLAを共有してもしなくてもよい。別の態様では、遺伝子操作APCを含む細胞組成物は、患者に自己であってよい。

0051

さらなる実施形態では、患者において疾患を処置する方法であって、本発明の実施形態の遺伝子操作APCを含む細胞組成物を産生すること及び有効量の前記細胞組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、前記方法を提供する。

0052

いくつかの態様では、医学的状態を有する個体を処置するための方法であって、いくつかの態様では、2回以上、例えば少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、またはそれ以上の日にちを空けて、有効量の本実施形態の遺伝子操作APCを提供するステップを含む、前記方法を提供する。

0053

なおもさらなる実施形態では、治療を目的として遺伝子改変後に高エネルギー免疫エフェクター細胞(例えば、CAR+T細胞)を同定する及び選択するための方法を提供する。従って、一実施形態では、ミトコンドリア予備呼吸能を有するCAR改変免疫エフェクター細胞を選択するための方法を提供する。いくつかの態様では、本方法は、ミトコンドリアのレポーター遺伝子発現レベルを検出すること及びミトコンドリアのレポーター遺伝子の発現レベルが上昇した免疫エフェクター細胞を選択すること、それによりミトコンドリアの予備呼吸能を有する免疫エフェクターを選択することを含む。いくつかの態様では、免疫エフェクター細胞は、CAR改変ヒトT細胞などのヒト細胞であってよい。

0054

いくつかの態様では、本実施形態にかかる使用のためのミトコンドリアのレポーター遺伝子は、内因性遺伝子であってよい。いくつかの態様では、ミトコンドリアのレポーター遺伝子は、蛍光レポータータンパク質をコードする遺伝子などの外因性遺伝子であってよい。いくつかの態様では、蛍光レポータータンパク質は、ミトコンドリア局在化配列を含んでよい。ある特定の態様では、SRCを有する免疫エフェクター細胞を選択するための方法は、フローサイトメトリーまたはFACSを含んでよい。

0055

ある特定の態様では、SRCを有する免疫エフェクター細胞を同定するためのレポーター遺伝子の発現は、核プロモーター(例えば、hEF1a)の制御下にあり得る。ある特定の態様では、レポーター遺伝子の発現は、ミトコンドリアのプロモーターの制御下にあり得る。ある特定の態様では、発現されたレポータータンパク質は、ミトコンドリア局在化配列を含んでよい。ある特定の態様では、発現されたレポータータンパク質は、細胞表面に指向されてよい。ある特定の態様では、レポーター遺伝子の発現は、ミトコンドリアのプロモーターの制御下にあり得、発現されたレポータータンパク質は、細胞表面に指向され得る。いくつかの態様では、外因性レポーター遺伝子は、トランスポゾン反復またはウイルスLTRに隣接してよい。いくつかの態様では、外因性レポーター遺伝子は、mRNAまたはエピソーマルベクターなどの染色体外核酸内に含まれてよい。

0056

いくつかの態様では、SRCについて選択された免疫エフェクター細胞(例えば、CAR改変T細胞)は、ex vivoである期間にわたって拡大されてよく、これは、いくつかの態様では、CARに結合するCARリガンドまたは抗体(例えば、2D3scFv)を含有する活性化及び増殖細胞(AaPC)などのフィーダー細胞と細胞を培養することを含んでよい。一態様では、AaPCは、トランスジェニックK562細胞であってよい。一態様では、AaPCは、CD137Lを発現してよい。他の態様では、AaPCは、CD19、CD64、CD86、またはmIL15をさらに発現してよい。ある特定の態様では、AaPCは、例えば、OKT3及び/またはUCHT1などの少なくとも1つの抗CD3抗体クローンを発現する。一態様では、AaPCは不活性化(例えば、照射)されてよい。一態様では、AaPCは、感染性物質に関して検査され、これを含まないと確認されていてよい。かかるAaPCを産生するための方法は当該分野で公知である。一態様では、CAR改変T細胞集団をAaPCと培養することは、細胞を、約10:1〜約1:10;約3:1〜約1:5;約1:1〜約1:3(T細胞対AaPC);またはその間で誘導可能な任意の範囲の比率で培養することを含んでよい。例えば、T細胞とAaPCの共培養は、約1:1、約1:2または約1:3の比率であることができる。一態様では、培養ステップは、アミノビスホスホネート(例えば、ゾレドロン酸)と培養することをさらに含んでよい。

0057

さらなる実施形態では、ミトコンドリアの予備呼吸能を有する免疫エフェクター細胞(例えば、CAR改変T細胞)の集団及び薬学的に許容され得るキャリアを提供する。細胞の集団は、本発明の実施形態の方法に従って選択されてよい。いくつかの態様では、細胞は、治療的に実行可能であり得る。いくつかの態様では、細胞の集団は、少なくとも10、1×102、1×103、1×104、1×105、または1×106個の細胞、またはその間で誘導可能な任意の数の細胞を含んでよい。種々の態様では、細胞は、NK細胞、ナチュラルキラーT細胞、αβT細胞、またはγδT細胞であってよい。一態様では、免疫エフェクター細胞は、本質的に同一である遺伝物質を有してよい。いくつかの態様では、免疫エフェクター細胞は、ヒトCAR改変T細胞であってよい。いくつかの態様では、細胞は、ドナーまたは患者であり得る、単一の対象に由来してよい。

0058

なおもさらなる実施形態では、それを必要とする患者において疾患を処置する方法であって、ミトコンドリアの予備呼吸能を有するまたはこれについて選択された有効量の免疫エフェクター細胞(例えば、CAR改変T細胞)の集団を投与することを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様では、本方法は、約100〜約1×106個の細胞、またはその間で誘導可能な任意の数の細胞を患者に投与することを含んでよい。いくつかの態様では、患者は、ヒト患者であってよい。ある特定の態様では、SRCを有する免疫エフェクター細胞の集団は、患者にアロジェネイックであってよい。種々の態様では、アロジェネイックな細胞組成物は、患者とHLAを共有してもしなくてもよい。ある特定の態様では、SRCを有する免疫エフェクター細胞の集団は、患者に自己であってよい。種々の態様では、本方法は、患者に第二の治療を投与することをさらに含んでよい。

0059

いくつかの態様では、SRCを有する(またはこれについて選択された)免疫エフェクター細胞を用いて処置する疾患は、癌であってよい。ある特定の態様では、癌は、血液癌または固形癌、例えば、T細胞ALL、B−ALL、CML、結腸癌、卵巣癌、神経芽細胞腫、脳腫瘍(複数可)、または膵臓癌であってよい。いくつかの態様では、患者は、以前の抗癌治療を受けていてよい。一態様では、患者は、寛解期にあってよい。なおも別の態様では、患者は、検出可能な癌細胞を含むが癌の症状を有さなくてよい。別の態様では、SRCを有する免疫エフェクター細胞を用いて処置する疾患は、ウイルス感染(例えば、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン・バール・ウイルス(EBV)、またはヒト免疫不全ウイルス(HIV))であってよい。なおも別の態様では、疾患は、細菌感染であってよい。一態様では、疾患は、敗血症であってよい。

0060

一実施形態では、患者において疾患を処置する方法であって、本実施形態に係るSRCを有する免疫エフェクター細胞を含む細胞組成物を産生すること、及び有効量の前記細胞組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、前記方法を提供する。いくつかの態様では、医学的状態を有する個体を処置するための方法であって、いくつかの態様では、2回以上、例えば少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、またはそれ以上の日にちを空けて、SRCを有する有効量の免疫エフェクター細胞を提供するステップを含む、前記方法を提供する。

0061

一実施形態では、患者における疾患の処置に使用するための、本発明の実施形態の細胞集団を含む組成物を提供する。

0062

本実施形態の方法及び/または組成物の文脈において考察される実施形態は、本明細書に記載の任意の他の方法または組成物に関して採用されてよい。ゆえに、そして一方法または組成物に係る実施形態は、同様に本実施形態の他の方法及び組成物に適応されてよい。

0063

本実施形態の他の目的、特性、及び利点は、以下の発明を実施するための形態から明らかになるだろう。しかしながら、発明を実施するための形態及び特定の実施例は、本実施形態の精神及び範囲内での様々な変更及び修正が、この発明を実施するための形態から当業者に明らかになり得るため、例示として与えられるにすぎないということが理解されるべきである。
特定の実施形態では、例えば、以下が提供される:
項目1)
抗原結合性ドメイン;ヒンジドメイン;膜貫通ドメイン及び1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン(複数可)を含むキメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドであって、前記ヒンジドメインがIgG4−Fc配列を含み、前記IgG4−Fc配列が、野生型IgG4−Fcに対して、Fc受容体結合を低下させる少なくとも1つの突然変異を含む、前記キメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチド。
(項目2)
前記IgG4−Fc配列が、配列番号1に対して少なくとも約90%同一である、項目1に記載のCARポリペプチド。
(項目3)
前記IgG4−Fc配列が、前記野生型配列に対して、突然変異を位置L235またはN297で含む、項目1に記載のCARポリペプチド。
(項目4)
前記IgG4−Fc配列が、前記野生型配列に対して、突然変異を位置L235及びN297で含む、項目1に記載のCARポリペプチド。
(項目5)
前記IgG4−Fc配列が、前記野生型配列に対して、L235EまたはN297Q突然変異を含む、項目1に記載のCARポリペプチド。
(項目6)
前記IgG4−Fc配列が、前記野生型配列に対して、L235E及びN297Q突然変異を含む、項目1に記載のCARポリペプチド。
(項目7)
前記IgG4−Fc配列が、配列番号1に対して同一である、項目1に記載のCARポリペプチド。
(項目8)
抗原結合性ドメインが、scFvを含む、項目1に記載のCARポリペプチド。
(項目9)
前記細胞内細胞シグナル伝達ドメインが、CD3ζからのドメインを含む、項目1に記載のCARポリペプチド。
(項目10)
前記細胞内細胞シグナル伝達ドメインが、CD28またはCD137(4−1BB)からの細胞内ドメインをさらに含む、項目9に記載のCARポリペプチド。
(項目11)
前記膜貫通ドメインが、CD28、CD8aまたはCD137の膜貫通ドメインを含む、項目1に記載のCARポリペプチド。
(項目12)
前記抗原結合性ドメインが、感染性疾患抗原または癌細胞抗原に結合する、項目1に記載のCARポリペプチド。
(項目13)
前記抗原結合性ドメインが、癌細胞抗原に結合する、項目12に記載のCARポリペプチド。
(項目14)
前記癌細胞抗原が、CD19であり、前記CARが、CD19標的CARである、項目13に記載のCARポリペプチド
(項目15)
項目1〜14のいずれか一項に記載のCARポリペプチドをコードする核酸分子。
(項目16)
項目1〜14のいずれか一項に記載のCARポリペプチドまたは項目15に記載の核酸を含む、単離された免疫エフェクター細胞。
(項目17)
前記細胞が、T細胞である、項目16に記載の細胞。
(項目18)
前記細胞が、ヒト細胞である、項目16に記載の細胞。
(項目19)
薬学的に許容され得るキャリア中で項目16に記載の細胞の集団を含む医薬組成物。
(項目20)
対象を処置する方法であって、項目1〜14のいずれか一項に記載のCARポリペプチドを発現する有効量のキメラ抗原受容体(CAR)T細胞を投与することを含む、前記方法。
(項目21)
標的抗原をコードする第一の導入遺伝子及びヒト白血球抗原(HLA)をコードする第二の導入遺伝子を含む、遺伝子操作抗原提示細胞(APC)であって、前記HLAが、前記標的抗原のエピトープと複合体化して前記APCの表面上に発現されている、前記遺伝子操作抗原提示細胞。
(項目22)
前記APCが、不死化されていない、項目21に記載の遺伝子操作APC。
(項目23)
前記APCが、一次細胞である、項目21に記載の遺伝子操作APC。
(項目24)
前記APCが、T細胞またはT細胞前駆体である、項目21に記載の遺伝子操作APC。
(項目25)
前記APCが、TCRαβまたはTCRγδを発現するT細胞である、項目21に記載の遺伝子操作APC。
(項目26)
共刺激分子をコードする少なくとも第三の導入遺伝子をさらに含む、項目21に記載の遺伝子操作APC。
(項目27)
前記標的抗原が、NY−ESO−1である、項目21に記載の遺伝子操作APC。
(項目28)
疾患を有する対象を処置する方法であって、項目21〜26のいずれか一項に記載の有効量の遺伝子操作APCを前記対象に投与することを含み、前記APCが前記疾患に関連する標的抗原を発現する、前記方法。
(項目29)
前記対象が、前記APCによりコードされる前記標的抗原を発現する癌を有する、項目28に記載の方法。
(項目30)
標的抗原が、NY−ESO−1である、項目28に記載の方法。
(項目31)
ミトコンドリアの予備呼吸能が高いCAR改変T細胞を選択する方法であって、ミトコンドリアのレポーター遺伝子の発現レベルを検出すること及び前記ミトコンドリアのレポーター遺伝子の発現レベルが上昇したCAR改変T細胞を選択すること、それによりミトコンドリアの予備呼吸能を有するCAR改変T細胞を選択することを含む、前記方法。
(項目32)
前記ミトコンドリアのレポーター遺伝子が、内因性遺伝子である、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記ミトコンドリアのレポーター遺伝子が、外因性遺伝子である、項目31に記載の方法。
(項目34)
前記外因性遺伝子が、蛍光レポータータンパク質をコードする、項目33に記載の方法。
(項目35)
前記蛍光レポータータンパク質が、ミトコンドリア局在化配列を含む、項目34に記載の方法。

図面の簡単な説明

0064

CD19受容体を標的とするキメラ抗原受容体の例示的な模式図である。CAR構築物(CD19RCD28)は、CD19結合性ドメイン(VL/VH);ヒンジドメイン(IgG4−Fc);膜貫通ドメイン(CD28 TM)及び細胞内シグナル伝達ドメイン(CD28−CD3ζ)を含む。
図2A〜B:Aは、エレクトロポレーションの1日後及びK562 aAPCとの共培養の28日後の、T細胞上のCD19RCD28 CARの発現を示すフローサイトメトリーにより得られた散布図を示す。Bは、CD19RCD28CAR T細胞によるFc受容体(CD32(FcγR2a)、CD64(FcγR1a))のin vitro結合を示すフローサイトメトリーにより得られた散布図である。
図2A〜B:Aは、エレクトロポレーションの1日後及びK562 aAPCとの共培養の28日後の、T細胞上のCD19RCD28 CARの発現を示すフローサイトメトリーにより得られた散布図を示す。Bは、CD19RCD28CAR T細胞によるFc受容体(CD32(FcγR2a)、CD64(FcγR1a))のin vitro結合を示すフローサイトメトリーにより得られた散布図である。
図3A〜B:FcR結合に起因する制限されたin vivo持続性は、有効性を低下させ得る。NSGマウスに、hRLuc+NALM6腫瘍を注射し、その後、CD19RCD28 T細胞を単回注射した(または対照を注射した)。A、腫瘍に関連する生物発光を経時的なイメージングを介して測定した。B、グラフは、測定発光レベルに基づく経時的な処置動物または対照動物における腫瘍負荷を示す。
図3A〜B:FcR結合に起因する制限されたin vivo持続性は、有効性を低下させ得る。NSGマウスに、hRLuc+NALM6腫瘍を注射し、その後、CD19RCD28 T細胞を単回注射した(または対照を注射した)。A、腫瘍に関連する生物発光を経時的なイメージングを介して測定した。B、グラフは、測定発光レベルに基づく経時的な処置動物または対照動物における腫瘍負荷を示す。
図4A〜H:構築され、検査された様々なCARの概略図を示す。選択されたCARドメインの配列も提供する。ヒトIgG4ヒンジ領域については、ヒンジをアミノ酸CPSC(配列番号9として提供される完全長配列)からCPPC(配列番号10として提供される完全長配列)へと突然変異させて、二量体化IgG4重鎖の安定性を向上させた。ヒトIgG4 Fc(EQ突然変異体、アミノ酸変化L235E、及びN297Qを有する)を配列番号1として提供する。ヒトCD8a鎖ヒンジ及び膜貫通ドメインを、配列番号3として提供する。ヒトIgG4 Fcからの12アミノ酸スペーサーを、アミノ酸CPSC(配列番号18として提供)及びCPPC(配列番号2として提供)から突然変異させて、配列番号2として提供される二量体化IgG4重鎖の安定性を向上させた。ヒトCD28膜貫通細胞質ドメインについては、ヒトCD28膜貫通及びエンドドメインを、RLLH(配列番号11として提供される完全長配列)からRGGH(配列番号12として提供される完全長配列)に改変してCARの発現を改善した。ヒトCD28細胞質ドメインについては、ヒトCD28エンドドメインをRLLH(配列番号16として提供される完全長配列)からRGGH(配列番号17として提供される完全長配列)に改変して、CARの発現を改善した。
図4A〜H:構築され、検査された様々なCARの概略図を示す。選択されたCARドメインの配列も提供する。ヒトIgG4ヒンジ領域については、ヒンジをアミノ酸CPSC(配列番号9として提供される完全長配列)からCPPC(配列番号10として提供される完全長配列)へと突然変異させて、二量体化IgG4重鎖の安定性を向上させた。ヒトIgG4 Fc(EQ突然変異体、アミノ酸変化L235E、及びN297Qを有する)を配列番号1として提供する。ヒトCD8a鎖ヒンジ及び膜貫通ドメインを、配列番号3として提供する。ヒトIgG4 Fcからの12アミノ酸スペーサーを、アミノ酸CPSC(配列番号18として提供)及びCPPC(配列番号2として提供)から突然変異させて、配列番号2として提供される二量体化IgG4重鎖の安定性を向上させた。ヒトCD28膜貫通細胞質ドメインについては、ヒトCD28膜貫通及びエンドドメインを、RLLH(配列番号11として提供される完全長配列)からRGGH(配列番号12として提供される完全長配列)に改変してCARの発現を改善した。ヒトCD28細胞質ドメインについては、ヒトCD28エンドドメインをRLLH(配列番号16として提供される完全長配列)からRGGH(配列番号17として提供される完全長配列)に改変して、CARの発現を改善した。
図4A〜H:構築され、検査された様々なCARの概略図を示す。選択されたCARドメインの配列も提供する。ヒトIgG4ヒンジ領域については、ヒンジをアミノ酸CPSC(配列番号9として提供される完全長配列)からCPPC(配列番号10として提供される完全長配列)へと突然変異させて、二量体化IgG4重鎖の安定性を向上させた。ヒトIgG4 Fc(EQ突然変異体、アミノ酸変化L235E、及びN297Qを有する)を配列番号1として提供する。ヒトCD8a鎖ヒンジ及び膜貫通ドメインを、配列番号3として提供する。ヒトIgG4 Fcからの12アミノ酸スペーサーを、アミノ酸CPSC(配列番号18として提供)及びCPPC(配列番号2として提供)から突然変異させて、配列番号2として提供される二量体化IgG4重鎖の安定性を向上させた。ヒトCD28膜貫通細胞質ドメインについては、ヒトCD28膜貫通及びエンドドメインを、RLLH(配列番号11として提供される完全長配列)からRGGH(配列番号12として提供される完全長配列)に改変してCARの発現を改善した。ヒトCD28細胞質ドメインについては、ヒトCD28エンドドメインをRLLH(配列番号16として提供される完全長配列)からRGGH(配列番号17として提供される完全長配列)に改変して、CARの発現を改善した。
図4A〜H:構築され、検査された様々なCARの概略図を示す。選択されたCARドメインの配列も提供する。ヒトIgG4ヒンジ領域については、ヒンジをアミノ酸CPSC(配列番号9として提供される完全長配列)からCPPC(配列番号10として提供される完全長配列)へと突然変異させて、二量体化IgG4重鎖の安定性を向上させた。ヒトIgG4 Fc(EQ突然変異体、アミノ酸変化L235E、及びN297Qを有する)を配列番号1として提供する。ヒトCD8a鎖ヒンジ及び膜貫通ドメインを、配列番号3として提供する。ヒトIgG4 Fcからの12アミノ酸スペーサーを、アミノ酸CPSC(配列番号18として提供)及びCPPC(配列番号2として提供)から突然変異させて、配列番号2として提供される二量体化IgG4重鎖の安定性を向上させた。ヒトCD28膜貫通細胞質ドメインについては、ヒトCD28膜貫通及びエンドドメインを、RLLH(配列番号11として提供される完全長配列)からRGGH(配列番号12として提供される完全長配列)に改変してCARの発現を改善した。ヒトCD28細胞質ドメインについては、ヒトCD28エンドドメインをRLLH(配列番号16として提供される完全長配列)からRGGH(配列番号17として提供される完全長配列)に改変して、CARの発現を改善した。
図4A〜H:構築され、検査された様々なCARの概略図を示す。選択されたCARドメインの配列も提供する。ヒトIgG4ヒンジ領域については、ヒンジをアミノ酸CPSC(配列番号9として提供される完全長配列)からCPPC(配列番号10として提供される完全長配列)へと突然変異させて、二量体化IgG4重鎖の安定性を向上させた。ヒトIgG4 Fc(EQ突然変異体、アミノ酸変化L235E、及びN297Qを有する)を配列番号1として提供する。ヒトCD8a鎖ヒンジ及び膜貫通ドメインを、配列番号3として提供する。ヒトIgG4 Fcからの12アミノ酸スペーサーを、アミノ酸CPSC(配列番号18として提供)及びCPPC(配列番号2として提供)から突然変異させて、配列番号2として提供される二量体化IgG4重鎖の安定性を向上させた。ヒトCD28膜貫通細胞質ドメインについては、ヒトCD28膜貫通及びエンドドメインを、RLLH(配列番号11として提供される完全長配列)からRGGH(配列番号12として提供される完全長配列)に改変してCARの発現を改善した。ヒトCD28細胞質ドメインについては、ヒトCD28エンドドメインをRLLH(配列番号16として提供される完全長配列)からRGGH(配列番号17として提供される完全長配列)に改変して、CARの発現を改善した。
図4A〜H:構築され、検査された様々なCARの概略図を示す。選択されたCARドメインの配列も提供する。ヒトIgG4ヒンジ領域については、ヒンジをアミノ酸CPSC(配列番号9として提供される完全長配列)からCPPC(配列番号10として提供される完全長配列)へと突然変異させて、二量体化IgG4重鎖の安定性を向上させた。ヒトIgG4 Fc(EQ突然変異体、アミノ酸変化L235E、及びN297Qを有する)を配列番号1として提供する。ヒトCD8a鎖ヒンジ及び膜貫通ドメインを、配列番号3として提供する。ヒトIgG4 Fcからの12アミノ酸スペーサーを、アミノ酸CPSC(配列番号18として提供)及びCPPC(配列番号2として提供)から突然変異させて、配列番号2として提供される二量体化IgG4重鎖の安定性を向上させた。ヒトCD28膜貫通細胞質ドメインについては、ヒトCD28膜貫通及びエンドドメインを、RLLH(配列番号11として提供される完全長配列)からRGGH(配列番号12として提供される完全長配列)に改変してCARの発現を改善した。ヒトCD28細胞質ドメインについては、ヒトCD28エンドドメインをRLLH(配列番号16として提供される完全長配列)からRGGH(配列番号17として提供される完全長配列)に改変して、CARの発現を改善した。
図4A〜H:構築され、検査された様々なCARの概略図を示す。選択されたCARドメインの配列も提供する。ヒトIgG4ヒンジ領域については、ヒンジをアミノ酸CPSC(配列番号9として提供される完全長配列)からCPPC(配列番号10として提供される完全長配列)へと突然変異させて、二量体化IgG4重鎖の安定性を向上させた。ヒトIgG4 Fc(EQ突然変異体、アミノ酸変化L235E、及びN297Qを有する)を配列番号1として提供する。ヒトCD8a鎖ヒンジ及び膜貫通ドメインを、配列番号3として提供する。ヒトIgG4 Fcからの12アミノ酸スペーサーを、アミノ酸CPSC(配列番号18として提供)及びCPPC(配列番号2として提供)から突然変異させて、配列番号2として提供される二量体化IgG4重鎖の安定性を向上させた。ヒトCD28膜貫通細胞質ドメインについては、ヒトCD28膜貫通及びエンドドメインを、RLLH(配列番号11として提供される完全長配列)からRGGH(配列番号12として提供される完全長配列)に改変してCARの発現を改善した。ヒトCD28細胞質ドメインについては、ヒトCD28エンドドメインをRLLH(配列番号16として提供される完全長配列)からRGGH(配列番号17として提供される完全長配列)に改変して、CARの発現を改善した。
図4A〜H:構築され、検査された様々なCARの概略図を示す。選択されたCARドメインの配列も提供する。ヒトIgG4ヒンジ領域については、ヒンジをアミノ酸CPSC(配列番号9として提供される完全長配列)からCPPC(配列番号10として提供される完全長配列)へと突然変異させて、二量体化IgG4重鎖の安定性を向上させた。ヒトIgG4 Fc(EQ突然変異体、アミノ酸変化L235E、及びN297Qを有する)を配列番号1として提供する。ヒトCD8a鎖ヒンジ及び膜貫通ドメインを、配列番号3として提供する。ヒトIgG4 Fcからの12アミノ酸スペーサーを、アミノ酸CPSC(配列番号18として提供)及びCPPC(配列番号2として提供)から突然変異させて、配列番号2として提供される二量体化IgG4重鎖の安定性を向上させた。ヒトCD28膜貫通細胞質ドメインについては、ヒトCD28膜貫通及びエンドドメインを、RLLH(配列番号11として提供される完全長配列)からRGGH(配列番号12として提供される完全長配列)に改変してCARの発現を改善した。ヒトCD28細胞質ドメインについては、ヒトCD28エンドドメインをRLLH(配列番号16として提供される完全長配列)からRGGH(配列番号17として提供される完全長配列)に改変して、CARの発現を改善した。
エレクトロポレーションの1日後及びK562 aAPCとの共培養の28日後に、T細胞上のCARの様々なCARの発現を示すフローサイトメトリーにより得られた散布図を示す。
CD19R*CD28 CAR T細胞によるFc受容体(CD32(FcγR2a)、CD64(FcγR1a))のin vitro結合の低下を示すフローサイトメトリーにより得られた散布図を示す。
K562 aAPCとの共培養の28日間にわたる様々なCAR T細胞の拡大動態を示すグラフを示す。
CD19EL−4及びNALM−6標的細胞に対して様々なCAR T細胞により示されるCD19特異的細胞毒性を示すグラフを示す。
異なる標的細胞と接触したときの様々なCAR T細胞によるCD19特異的IFNガンマ産生を示すグラフを示す。
腫瘍(hRLuc+NALM−6)を(静脈内)注射され、その後ffLuc+CAR+T細胞を翌日に(皮内)注射されたNSGマウスの発光イメージングを示す。腫瘍及びT細胞イメージングは、それぞれXenogen IVIS 100シリーズステムを使用するEnduRenまたはルシフェリンの注射後に行った。T細胞を、心臓内注射を確認するために直後に撮像した(上段)。経時的な腫瘍由来hRLuc活性からの光子束を表す影付きの画像を示す。
疾患を制御するCAR+T細胞のin vivo有効性の改善。図10における生物発光測定に基づく腫瘍負荷を表すグラフを示す。上に詳述するように、NSGマウスにhRLuc+NALM−6腫瘍を注射し、その後CAR T細胞を単回注射した。腫瘍に関連する生物発光を経時的に測定し、それを示す。(*)は、腫瘍のみの群に対する少なくともp<0.05の有意性を表す。
様々なCAR T細胞を用いて処置されたNSGマウスの生存曲線を示すグラフを示す。有意性(p値)は、腫瘍のみの(無処置)群と比較するときに算出する。
図13A〜D:CAR+T細胞の特徴づけ。PBMCを、CD19R*CD28またはCD19RCD8CD28トランスポゾン&SB11トランスポゼースでエレクトロポレートし、IL−2及びIL−21と共に照射K562抗原提示細胞上で、28日間にわたり、7日間刺激サイクルで共培養した。各刺激サイクルの終了時に、細胞を数え上げ表現型を決定した(CD3、CAR)。(A)エレクトロポレーションの翌日(1日目)及び28日間の共培養後のCD3+T細胞上のCARの発現。(B)拡大動態を示すCD3及びCAR+T細胞の推測される細胞数。(C)CD19特異的細胞毒性を、標準的なクロムリリースアッセイをCD19pos標的(CD19+EL−4、NALM−6、Daudiβ2m)に対して使用して測定した。バックグラウンド溶解を、CD19negEL−4の溶解により示す。(D)CD19を発現する様々なエフェクター標的で刺激したときのCAR+T細胞によるIFN−γの細胞内産生。
図13A〜D:CAR+T細胞の特徴づけ。PBMCを、CD19R*CD28またはCD19RCD8CD28トランスポゾン&SB11トランスポゼースでエレクトロポレートし、IL−2及びIL−21と共に照射K562抗原提示細胞上で、28日間にわたり、7日間刺激サイクルで共培養した。各刺激サイクルの終了時に、細胞を数え上げ、表現型を決定した(CD3、CAR)。(A)エレクトロポレーションの翌日(1日目)及び28日間の共培養後のCD3+T細胞上のCARの発現。(B)拡大動態を示すCD3及びCAR+T細胞の推測される細胞数。(C)CD19特異的細胞毒性を、標準的なクロムリリースアッセイをCD19pos標的(CD19+EL−4、NALM−6、Daudiβ2m)に対して使用して測定した。バックグラウンド溶解を、CD19negEL−4の溶解により示す。(D)CD19を発現する様々なエフェクター標的で刺激したときのCAR+T細胞によるIFN−γの細胞内産生。
図13A〜D:CAR+T細胞の特徴づけ。PBMCを、CD19R*CD28またはCD19RCD8CD28トランスポゾン&SB11トランスポゼースでエレクトロポレートし、IL−2及びIL−21と共に照射K562抗原提示細胞上で、28日間にわたり、7日間刺激サイクルで共培養した。各刺激サイクルの終了時に、細胞を数え上げ、表現型を決定した(CD3、CAR)。(A)エレクトロポレーションの翌日(1日目)及び28日間の共培養後のCD3+T細胞上のCARの発現。(B)拡大動態を示すCD3及びCAR+T細胞の推測される細胞数。(C)CD19特異的細胞毒性を、標準的なクロムリリースアッセイをCD19pos標的(CD19+EL−4、NALM−6、Daudiβ2m)に対して使用して測定した。バックグラウンド溶解を、CD19negEL−4の溶解により示す。(D)CD19を発現する様々なエフェクター標的で刺激したときのCAR+T細胞によるIFN−γの細胞内産生。
図13A〜D:CAR+T細胞の特徴づけ。PBMCを、CD19R*CD28またはCD19RCD8CD28トランスポゾン&SB11トランスポゼースでエレクトロポレートし、IL−2及びIL−21と共に照射K562抗原提示細胞上で、28日間にわたり、7日間刺激サイクルで共培養した。各刺激サイクルの終了時に、細胞を数え上げ、表現型を決定した(CD3、CAR)。(A)エレクトロポレーションの翌日(1日目)及び28日間の共培養後のCD3+T細胞上のCARの発現。(B)拡大動態を示すCD3及びCAR+T細胞の推測される細胞数。(C)CD19特異的細胞毒性を、標準的なクロムリリースアッセイをCD19pos標的(CD19+EL−4、NALM−6、Daudiβ2m)に対して使用して測定した。バックグラウンド溶解を、CD19negEL−4の溶解により示す。(D)CD19を発現する様々なエフェクター標的で刺激したときのCAR+T細胞によるIFN−γの細胞内産生。
図14A〜D:NSG(NOD.Cg−PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ、NOD scidガンマ)マウスにおけるCD19+NALM−6細胞株に対するCAR+T細胞のin vivo有効性。(A〜B)微小残存疾患モデルにおいて、NSGマウス(n=5/群)に、104個のhRluc+mKate+NALM−6の細胞を0日目に注射し、その後T細胞(107個/マウス)を1日目に心臓内注射した。腫瘍負荷を、EnduRen生細胞基質を使用してhRluc+NALM−6に由来する生物発光イメージングにより経時的に評価した。(C〜D)確立した腫瘍モデルについては、NSGマウス(n=6/群)に、1.5×104個のffLuc+EGFP+NALM−6を0日目に注射し、腫瘍を5日間自然に生着させ、腫瘍負荷を評価し、T細胞(107個/マウス)を6日目に心臓内注射した。腫瘍束を、D−ルシフェリン基質を使用するffLuc+NALM−6からの生物発光イメージングを使用して経時的に算出した。経時的な光子束及び腫瘍束を表す擬色画像を示す。
CAR T細胞の追加のシグナル伝達分子を示す。上のパネルは、膜結合型IL−15/IL−15受容体(mIL15)構築物(構築物のポリペプチド配列は、配列番号4として提供される)を示す。下のパネルは、膜結合型IL−15/IL−15受容体(左パネル)及びCAR構築物(右パネル)により提供されるシグナル伝達の模式図である。
mIL15及びCARの安定した共発現。左上のパネルは、エレクトロポレーションまたは刺激4(Stim4)から24時間後のmIL15+CAR+T細胞の代表的なフロープロットを示す。左下のパネルは、CARまたはCARとmIL15を発現するエレクトロポレートした細胞の割合(%)を示すグラフである。右上のパネル、グラフは、抗原除去後の培養物中のCAR T細胞数における変化を示す。試験は、IL−15無し、IL−15複合体付加またはmIL−15及びCARを共発現する細胞で完了した。右下のパネルは、mIL−15を発現するCAR T細胞における様々な転写制御因子の発現レベルのグラフを示す。
図17A〜B:Aは、CARを単独またはmIL−15と組み合わせてのいずれかで発現するffLuc+T細胞を注射されたマウスの発光イメージングを示す。T細胞イメージングを、それぞれXenogen IVIS 100シリーズシステムを使用してルシフェリンの注射後に行った。影付きの画像は、経時的なffLuc+T細胞活性からの光子束を表す。B、左パネルは、抗原の存在下または抗原除去(WD)後の培養mIL−15−CAR T細胞中因子の発現レベルを示すグラフである。右パネルは、刺激の有無でのCAR T細胞及びmIL−15−CAR T細胞のヒストグラムを示す。
図17A〜B:Aは、CARを単独またはmIL−15と組み合わせてのいずれかで発現するffLuc+T細胞を注射されたマウスの発光イメージングを示す。T細胞イメージングを、それぞれXenogen IVIS 100シリーズシステムを使用してルシフェリンの注射後に行った。影付きの画像は、経時的なffLuc+T細胞活性からの光子束を表す。B、左パネルは、抗原の存在下または抗原除去(WD)後の培養mIL−15−CAR T細胞中の因子の発現レベルを示すグラフである。右パネルは、刺激の有無でのCAR T細胞及びmIL−15−CAR T細胞のヒストグラムを示す。
CAR T細胞による腫瘍のin vivo制御。hRLuc+腫瘍細胞を注射されたマウスの発光イメージング(上パネル)及び定量化(下パネル、グラフ)を示す。示すように、ある特定のマウスは、CARまたはCARとmIL−15を発現するT細胞も注射された。
抗原提示細胞として機能するT細胞(T−APC)を示す模式図。自己移植後のT細胞も同様に、直接及びクロスプライミングの両方を通して内因性長期免疫を改善する。
腫瘍抗原NY−ESO−1を発現するようにヒトT細胞を遺伝子改変するために使用したスリピングビューティープラスミドを図示する。構成的発現は、hEF1−アルファプロモーターにより駆動され、選択は、0.2mg/mLハイグロマイシン下でT細胞を増殖させることにより達成される。
aAPCとして使用するためのK562上でのT細胞共刺激分子の発現。
FLAGタグ付きNY−ESO−1及びHyTKを共発現するSBプラスミドの電気的導入後、OKT3−aAPC上での共培養の28日目でのヒトT−APCのフローサイトメトリー。
NY−ESO−1+T−APC(上)対K562 aAPC(下)で拡大したPBMC。
NY−ESO−1+T−APC対K562 aAPCで拡大したNY−ESO−1+CAR T細胞。
3刺激後のNY−ESO−1+T−APC上の阻害分子
NY−ESO−1+mIL−15+HLA−A2+T−APCは、aAPCの存在下で増殖した。
T−APC拡大。T−APCは、CAR T細胞、ならびに陽性対照であるK562由来aAPCを拡大することに成功した。
NY−ESO−1特異的TCR+及びCAR+T細胞によるNY−ESO−1+U266ヒト多発性骨髄腫細胞株の殺傷を示すクロムリリースアッセイ。T細胞は、K562由来の人工活性化及び増殖細胞(AaPC)上で拡大し、HLA−A02及びNY−ESO−1+を発現する。データは、2つの独立した実験を表し、9−2−15のNY−ESO−1特異的CAR T細胞を、HLA−A2/NY−ESO−1 T−APCを用いて3刺激にわたって及びK562由来のAaPCを用いて2刺激にわたって増殖させた。9−2−15 CARは、CD8αストークを含有するが、以前のものはIgG4ストークを含有した。
図29A〜29B:図29A。照射K562 AaPCの存在下でex vivoで成長した対照T細胞と遺伝子改変T細胞のTEM透過型電子顕微鏡)画像。ミトコンドリアの数における増加が、同様の条件下で活性化された未改変対照細胞(左パネル)と比較してCAR改変細胞(右パネル)において見られる。図29B。35日目の培養にて増殖しているCAR改変T細胞におけるミトコンドリアの凝縮状態と比較して未改変対照T細胞におけるミトコンドリアの通常の正当な構造を示す透過型電子顕微鏡(TEM)画像(目盛り500nm、50,000倍の倍率)。
図29A〜29B:図29A。照射K562 AaPCの存在下でex vivoで成長した対照T細胞と遺伝子改変T細胞のTEM(透過型電子顕微鏡)画像。ミトコンドリアの数における増加が、同様の条件下で活性化された未改変対照細胞(左パネル)と比較してCAR改変細胞(右パネル)において見られる。図29B。35日目の培養にて増殖しているCAR改変T細胞におけるミトコンドリアの凝縮状態と比較して未改変対照T細胞におけるミトコンドリアの通常の正当な構造を示す透過型電子顕微鏡(TEM)画像(目盛り500nm、50,000倍の倍率)。
共刺激を伴わないHER1−3二重特異的CAR−T細胞のex vivo拡大。細胞は、未改変であるか、またはCD28及び/またはCD137T細胞シグナル伝達エンドドメインでCAR改変されているかのいずれかである。CD137T細胞シグナル伝達エンドドメインを有する細胞は、培養において良好に生存し、CD28シグナル伝達ドメインを含有するCAR T細胞では反対であった。このとき、培養中に共刺激は提供されなかった。未改変対照細胞に対するOKT3刺激は、良好に作用したが、これはCD3zを通してより高いシグナル伝達強さが誘導されたからである可能性がある。K562 AaPCの存在下で、ex vivoで増殖させた腫瘍抗原HER1−3を標的とするCAR−T細胞のTEM画像を示す。これは、ROR1、CD123、及びC19などの他の腫瘍抗原を標的とするCARについても検査した。生存する絶対T細胞数は、Nexcelom Cellometer(登録商標)により、トリパンブルー生存/死亡排除法を使用して計数した。
蛍光タンパク質レポーターのSBプラスミド構築物。GRX2は、GLRX2(Pubmed ID番号NP_932066.1)に由来するミトコンドリア局在化配列である。NLSは、核局在化配列である(Pubmed ID番号NM_017921)。
CAR改変細胞におけるEYFPの内因性発現のフローサイトメトリー分析。培養の35日目で共刺激を伴わずに成長したCD137−CAR T細胞における高EYFPを有するCAR+T細胞の出現。CD28−T細胞は、より少ないまたは減光したEYFP陽性T細胞を示した。フローサイトメトリーは、ミトコンドリアの強さに関するCAR発現及びに内因性EYFP関するFc染色に基づいた。
図33A〜33B:T細胞共刺激を伴わない照射フィーダー細胞(K562 AaPC)で拡大したHER1−3二重特異的CAR−T細胞のミトコンドリアのバイオマス図33A。未改変T細胞及びHER1−HER3を標的とするプロトタイプのCAR(CD28−CD3zまたはCD137−CD3z T細胞シグナル伝達エンドドメインのいずれかからなる)を発現するように改変されたT細胞におけるミトコンドリアの分布を示す透過型電子顕微鏡(TEM)画像(目盛り500nm、15,000倍の倍率)。図33B。細胞あたりのミトコンドリアの平均数を、棒グラフにて表す。全体的にCD137 T細胞シグナル伝達ドメインを有するCAR−T細胞は、CD28シグナル伝達ドメインを含有するCAR−T細胞と比較して培養の21日目の後でバイオマスにおける増加を示した。
図33A〜33B:T細胞共刺激を伴わない照射フィーダー細胞(K562 AaPC)で拡大したHER1−3二重特異的CAR−T細胞のミトコンドリアのバイオマス。図33A。未改変T細胞及びHER1−HER3を標的とするプロトタイプのCAR(CD28−CD3zまたはCD137−CD3z T細胞シグナル伝達エンドドメインのいずれかからなる)を発現するように改変されたT細胞におけるミトコンドリアの分布を示す透過型電子顕微鏡(TEM)画像(目盛り500nm、15,000倍の倍率)。図33B。細胞あたりのミトコンドリアの平均数を、棒グラフにて表す。全体的にCD137 T細胞シグナル伝達ドメインを有するCAR−T細胞は、CD28シグナル伝達ドメインを含有するCAR−T細胞と比較して培養の21日目の後でバイオマスにおける増加を示した。
高エネルギーT細胞(eT)のin vitro細胞毒性。高いミトコンドリア質量について選別された高エネルギーT細胞は、細胞毒性活性を保持すると見いだされ、これは、腫瘍抗原陽性乳癌細胞の特異的殺傷により証明された。データは、特定の抗原に陽性である乳房腫瘍株に対するCr標識HER1−3+T細胞で行われたクロムリリースアッセイからのものであり、これは、高いEYFP/ミトコンドリアの強さを有するCAR T細胞により溶解された。
最小の活性化及び共刺激の完全な不在を伴う照射フィーダー細胞(K562 AaPC)の存在下でex vivoで拡大された未改変及びCAR改変T細胞の蛍光顕微鏡検査画像。CD137 T細胞シグナル伝達エンドドメインを含有するCAR−T細胞は、ミトコンドリア質量のより高い分布を示し、これは、レポータータンパク質(EYFP−GRX2)から内因的発出する蛍光シグナル強度から観察された。代謝的に活性なT細胞の数は、CD28シグナル伝達ドメインを含有するCAR−T細胞と比較してCD137 T細胞シグナル伝達エンドドメインを含有するCAR−T細胞において有意に高かった。これは、ドナーまたはCAR型に関係なく、一致した。
照射フィーダー細胞(K562 AaPC)の存在下で成長させた、ex vivoで拡大させたCAR改変T細胞のミトコンドリアの分布のパターン
図37A〜37B:蛍光顕微鏡検査画像の形態分析(Integrated morphometry analysis)は、特定のシグナル伝達エンドドメインを表す遺伝子改変T細胞群(HER1−HER3 CD137−CD3z T細胞)内でのミトコンドリアの強さに基づくCAR改変T細胞の不均一な集団を示す。図37A。HER1−3 CD137 CAR+T細胞間でのEYFP−Mitoの集団変動性図37B。HER1−3 CD137 CAR+T細胞間でのEYFP−Mitoの平均強度
図37A〜37B:蛍光顕微鏡検査画像の形態分析(Integrated morphometry analysis)は、特定のシグナル伝達エンドドメインを表す遺伝子改変T細胞群(HER1−HER3 CD137−CD3z T細胞)内でのミトコンドリアの強さに基づくCAR改変T細胞の不均一な集団を示す。図37A。HER1−3 CD137 CAR+T細胞間でのEYFP−Mitoの集団変動性。図37B。HER1−3 CD137 CAR+T細胞間でのEYFP−Mitoの平均強度。
汎用K562−AaPC上で成長したCAR+T細胞の透過型電子顕微鏡(TEM)画像。画像は、実施例8に記載する試験の14日目からのものである。
汎用K562−AaPC上のROR1−CAR T細胞の成長動態。CD28シグナル伝達を含有するCAR−T細胞は、アポトーシスを迅速に受けた(左チャート)が、一方でCD137zシグナル伝達を含有するCAR−T細胞はより長く持続した(右チャート)。

0065

臨床治験は、遺伝子改変されたT細胞を受けている患者における抗腫瘍効果を実証している。例えば、CAR−T細胞療法は、進行性B細胞悪性腫瘍苦しむヒト患者において有意義寛解を送達すると示されている(Maude et al.,2014)。CAR−T細胞は、体内の腫瘍細胞を探し、破壊するために不可欠な特異性及び細胞毒性能力を有し、再発の防止に十分な期間持続することができる。連続殺傷のこの典型的な状況(アレルギーを伴うことなく複数の腫瘍細胞を1つのT細胞が殺傷する)は、近年様々な第I相治験下で処置された何人かの患者において示されている(Corrigan−Curay et al.,2014)。しかしながら、均一かつ明確な臨床的に重要な転帰は、CAR設計、CAR T細胞エンドドメイン、スペーサー長使用、scFvの親和性等にわたってまだ出現していない(Jena et al.,2014)。これは、CAR−T細胞注入を通した処置を求める患者集団の間で変動し得る腫瘍負荷及び腫瘍型によってさらに複雑になる。腫瘍型、腫瘍ステージ、及び患者集団のスペクトル全体にわたって(重大な毒性を伴わずに)臨床的に重要な結果をもたらすだろう治療的に有効なCAR構築物を、そして最終的には遺伝子改変T細胞集団を設計することは、大きな挑戦である。

0066

本明細書に詳述する試験は、CAR T細胞持続性において役割を担う重要な要素を同定し、それは、T細胞の有効性及び(例えば、オフターゲット細胞毒性活性からの)潜在的な毒性に影響することができる。具体的には、Fc受容体により結合されるCARポリペプチドの能力がT細胞の持続性及び抗腫瘍有効性を調節すると示されている。ゆえに、CAR T細胞有効性(及びin vivo持続性)は、T細胞上に発現されるCARポリペプチドのFc受容体結合特性を変えることにより改変することができる。例えば、ヒト免疫グロブリン定常領域からなどのFc受容体結合配列をCAR内に含んで、T細胞の持続性を低下させ潜在的な毒性を制御することができる。逆に、CARポリペプチドを、Fc受容体結合要素を除去するように改変して、CAR T細胞のin vivo持続性及び有効性を向上させてよい。ゆえに、本明細書に詳述するCARポリペプチド、CAR T細胞及び方法は、(Fc受容体結合を調整することにより)CAR T細胞持続性を微調整してCAR T細胞療法の有効性及び毒性を制御することを可能にする。

0067

さらなる実施形態では、標的抗原をコードする導入遺伝子及びヒト白血球抗原(HLA)をコードする導入遺伝子を含む遺伝子操作抗原提示細胞(APC)を提供する。いくつかの態様では、遺伝子操作APCは、共刺激因子(例えば、IL−15)をコードする1つまたは複数の導入遺伝子を追加で含んでよい。かかる遺伝子操作APCは、例えば、ex vivoでのT細胞(例えば、CAR T細胞)の拡大のための方法に使用され得るか、またはin vivoで抗原特異的T細胞の成長を刺激するために対照に投与されてよい。ゆえに、本明細書に提供する細胞を使用して、疾患(例えば、癌)の処置のために(to for)抗原特異的T細胞の成長を刺激してよい。

0068

本明細書に開示のさらなる実施形態は、SRCを有するまたはそれについて選択された免疫エフェクター細胞を提供し、これは、向上した治療特性を提供し得る。高いミトコンドリアのバイオマスを有する細胞は、本明細書では、例えば、「エネルギーT細胞」または「eT細胞」と称する。遺伝子改変免疫エフェクター細胞の持続性の増加が、治療可能性の改善に正相関するため、エネルギーT細胞などの免疫細胞は、大部分の遺伝子改変T細胞より良好に作用すると予想される。加えて、多数の変異がCAR設計に、及びゆえにCAR有効性に与える影響は、長期生存CAR−T細胞を、ミトコンドリアの強さ(すなわち、予備呼吸能、つまりSRC)に基づいて注入前に同定できる場合に、利用することができる。ゆえに、ミトコンドリアの強さは、CARエンドドメイン使用、CAR構築物設計、スペーサー長さ、及びscFvの親和性とは無関係に、最良の連続T細胞キラーの選択/選別を助け得、それにより、特定の腫瘍抗原及び腫瘍型に適合されたCAR設計を最適化するための翻訳の障害を減らし得る。注入前に最良T細胞(例えば、腫瘍微小環境内で最大の生存可能性を有するもの)を選出することは、多くの状況において有利であり得る。それゆえに、CAR+T細胞の「適合度」を、レポーター蛍光タンパク質(例えば、EYFP−GRX2)を使用して測定する方法を提供する。これは、定量化可能であり、ミトコンドリアSRCと相関し、これが、低酸素解糖のための特定の栄養の欠如、及び高負荷腫瘍抗原により引き起こされる活性化誘導細胞死の好ましくない条件を生存するための遺伝子改変T細胞の代謝能力を順次示す。

0069

さらには、注入するための、より数が少ない、より強力なCAR+T細胞を選択することは、注入後のT細胞関連毒性を低下させるまたはさらには抑止することを助け得る。注入に必要とされる細胞の数を制限することは、遺伝子改変のための、増殖する多数の、成長が難しい、患者由来の自己T細胞の負荷を少なくするだろう。例えば、養子細胞療法の方法では、少数のT細胞などの免疫エフェクター細胞を、高い抗腫瘍殺傷を引き出す(illicit)ために使用することが望ましくあり得る。少数のT細胞に使用は、CAR改変T細胞注入から生じる注入関連毒性を最小化し得る。さらには、注入された細胞がin vivoでより長く生存し、それにより腫瘍再発が防止されると、好ましくあり得る。これらの状況の両方ともにおいて、高エネルギーCAR改変T細胞を同定する、選択する、及び注入する本発明の方法は、有益であるだろう。

0070

任意の特定のバッチに関してCAR改変T細胞内でのミトコンドリアの分布ならびにSRCにおいて不均一性がある。ゆえに、注意深く選択すれば、より少ない細胞は、バルク集団と比較してin vivoで同様の結果を達成することができる。これは、(i)CARが正常と腫瘍関連抗原を区別することができず、したがって、より少ない細胞の注入が望ましい、(ii)元となる細胞集団の固有奇形のために患者由来自己T細胞の拡大が難しい、(iii)注入後のin vivoでのCAR改変T細胞の制限された持続性が望ましい場合に、腫瘍に対して有益であり得る。SRC/ミトコンドリアの強さを決定する方法は、mito−tracker染色(Invitrogen)を使用して細胞を標識すること、または臨床適用のための細胞の回収が不可能である場合は、同様の改変後方法に基づくことができる。ミトコンドリアの強さを決定する他の方法、例えば、酸素消費量または細胞外酸性化を測定することは、個別の細胞の強さよりもむしろバルク細胞の強さを測定し、これも臨床適用を欠く。本明細書で提供するとき、非ウイルス性DNAエレクトロポレーション法を使用して、T細胞などのエフェクター細胞を、同時にCAR発現及びSRC同定のために改変してよい。具体的には、eT細胞を選択するために、CAR分子を伴う細胞内の蛍光ミトコンドリア指向性レポータータンパク質の発現は、臨床翻訳のために適応されている、非ウイルス性のDNAに基づく遺伝子送達システムであるスリーピングビューティー媒介性転移により達成することができる。遺伝子改変後及びリガンド刺激したK562をベースとする共培養後のeT細胞のフローサイトメトリーに基づく選別は、GMP条件下で行うことができ、翻訳されることができ、臨床に容易に適用することができる。まとめると、所望の抗腫瘍有効性を送達できる代謝的に活性なT細胞(eT細胞)は、T細胞を遺伝子改変するための臨床的に重要な手法を組み合わせることにより生成され得、活性化を最小にした照射されたK562をベースとする共培養を使用して多数に拡大し得、蛍光レポータータンパク質の発現に基づいて同定され得る。

0071

I.定義
本明細書で用いるとき、「a」または「an」は、1つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲(複数可)で用いるとき、「含む」という語句と併せて使用される時、「a」または「an」という語句は、1つ以上を意味し得る。

0072

特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみに言及することが明確に示されない限りまたは代替物が相互に排他的でない限り、「及び/または」を意味するように使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び/または」を指す定義を支持する。本明細書中で用いるとき、「別の」は、少なくとも第二またはそれ以降を意味し得る。

0073

本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するために使用されるデバイス、方法または研究対象の間に存在する変動に対する固有の誤差変動を含むことを示すために使用される。

0074

本明細書中で用いるとき、「抗原」という用語は、抗体またはT細胞受容体により結合されることが可能な分子である。抗原はさらに、体液性免疫応答及び/または細胞性免疫応答を誘導し、B及び/またはTリンパ球の産生をもたらすことが可能である。

0075

本明細書で用いるとき、「抗腫瘍有効量」という用語は、対象における癌細胞もしくは腫瘍成長を減少させるまたは腫瘍体積もしくは腫瘍細胞の数を低減させるために有効な量のCAR発現免疫エフェクター細胞を指す。「抗腫瘍有効量」は、平均余命を増加させるまたは腫瘍もしくは癌に関連する生理学的影響を緩和するために有効な量のCAR発現免疫エフェクター細胞も指すことができる。

0076

II.キメラ抗原受容体及び構成要素
キメラ抗原受容体分子は、組換え融合タンパク質であり、抗原(例えば、HER1/HER3)と結合する能力及びそれらの細胞質尾に存在する免疫受容体活性化モチーフ(ITAM)を介して活性化シグナルを伝達するという両方の能力により識別される。抗原結合性部分(例えば、一本鎖抗体(scFv)から生成される、を利用する受容体構築物は、それらが、HLAに依存しない様式で標的細胞表面上の未変性抗原と結合するという点で「汎用」であるという追加の利点を有している。

0077

本実施形態に係るキメラ抗原受容体は、当該分野で公知の任意の手段により産生することができるが、好ましくは、それは組換えDNA技術を使用して産生される。キメラ抗原受容体のいくつかの領域をコードする核酸配列は、分子クローニングの標準的な技術(ゲノムライブラリースクリーニングPCRプライマー補助ライゲーション酵母及び細菌からのscFvライブラリー部位特異的突然変異誘発、等)により、調製することができ、完全なコード配列へと組み立てることができる。結果得られるコード領域を発現ベクター内に挿入し、好適な発現宿主にアロジェネイックまたは自己である免疫エフェクター細胞を形質転換するために使用することができる。

0078

本明細書に記載のCARの実施形態は、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び1つまたは複数のシグナル伝達モチーフを含む細胞外ドメインを含むことを含む抗原特異的キメラ抗原受容体(CAR)ポリペプチドをコードする核酸を含む。ある特定の実施形態では、CARは、1つまたは複数の抗原間の共有スペースを含んでなるエピトープを認識し得る。いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体は、a)細胞内シグナル伝達ドメイン、b)膜貫通ドメイン、及びc)抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメインを含む。任意で、CARは、膜貫通ドメインと抗原結合性ドメインの間に位置するヒンジドメインを含むことができる。ある特定の態様では、本実施形態のCARは、CARの発現を細胞表面に指向する、シグナルペプチドをさらに含む。例えば、いくつかの態様では、CARは、GM−CSFからのシグナルペプチドを含むことができる(例えば、配列番号5を参照されたい)。

0079

ある特定の実施形態では、CARは、少量の腫瘍関連抗原があるとき、持続性を改善するために膜結合型サイトカインと共発現されることもできる。例えば、CARは、膜結合型IL−15と共発現されることができる。

0080

CARのドメインの配置及びドメイン内で使用される特定の配列に応じて、CARを発現する免疫エフェクター細胞は、標的細胞に対する異なるレベルの活性を有し得る。いくつかの態様では、異なるCAR配列を、免疫エフェクター細胞内へと導入して、トランスジェニック細胞を生成してよく、このトランスジェニック細胞を上昇したSRCについて選択し、選択された細胞を活性について検査して、最大の治療有効性を有すると予測されるCAR構築物を同定する。

0081

A.抗原結合性ドメイン
ある特定の実施形態では、抗原結合性ドメインは、モノクローナル抗体相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、及び/またはその抗原結合性断片を含むことができる。別の実施形態では、その特異性は、受容体に結合するペプチド(例えば、サイトカイン)に由来する。「相補性決定領域(CDR)」は、抗原受容体(例えば、免疫グロブリン及びT細胞受容体)タンパク質の可変ドメインに見いだされる短いアミノ酸配列であり、抗原を補足することでその特定の抗原に対する特異性を有する受容体を提供する。抗原受容体の各ポリペプチド鎖は、3つのCDR(CDR1、CDR2、及びCDR3)を含有する。抗原受容体は、典型的に2つのポリペプチド鎖を含んでなるため、抗原と接触することができる各抗原受容体には6つのCDRがあり、重鎖及び軽鎖がそれぞれ3つのCDRを含有する。免疫グロブリン及びT細胞受容体に関連する配列変異の大半が、CDRにおいて見いだされるため、これらの領域は、超可変ドメインと称されることもある。これらのなかでも、CDR3は、VJ(重鎖及びTCRαβ鎖の場合におけるVDJ)領域の組換えによりコードされるため、最大可変性を示す。

0082

CAR核酸は、特にscFv配列は、ヒト患者の細胞免疫療法を向上させるためのヒト遺伝子であることが企図される。特定の実施形態では、完全長CARcDNAまたはコード領域が提供される。抗原結合性領域またはドメインは、特定のマウス、またはヒトもしくはヒト化モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片(scFv)のVH及びVL鎖の断片を含むことができる。断片はまた、抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合性ドメインであることができる。より特定の実施形態では、断片は、ヒト細胞における発現のためのヒトコドン使用に最適化されている配列によりコードされる抗原特異的scFvである。ある特定の態様では、CARのVH及びVLドメインは、ウィットローリンカーなどのリンカー配列により分離されている(例えば、配列番号20を参照されたい)。本実施形態に従って改変または使用され得るCAR構築物は、参照により本明細書に組み込まれる、国際(PCT)特許公開番号WO/2015/123642においても提供される。

0083

いくつかの特定の例では、CARの抗原結合性ドメインは、HER2/Neu(Stancovski et al.,1993)、ERBB2(Moritz et al.,1994)、葉酸結合タンパク質(Hwu et al.,1995)、腎細胞癌腫(Weitjens et al.,1996)、及びHIV−1エンベロープ糖タンパク質gp120及びgp41(Roberts et al.,1994)への結合に特異的である。CARにより結合され得る他の細胞表面標的抗原には、CD20、癌胎児性抗原、メソテリン、ROR1、c−Met、CD56、GD2、GD3、αフェトプロテイン、CD23、CD30、CD123、IL−11Rα、κ鎖λ鎖、CD70、CA−125、MUC−1、EGFR及び変異体、上皮性腫瘍抗原、等が挙げられるがこれらに限定されない。

0084

キメラ抗原受容体のある特定の実施形態では、受容体の抗原特異的部分(抗原結合性領域を含む細胞外ドメインと称されてよい)は、上記に詳述するようにHER1/HER3結合性ドメインを含む。いくつかの態様では、例えば、HER1/HER3結合性ドメインは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第2012/0121596号に提供される配列のうちの1つを含む。

0085

B.ヒンジドメイン
ある特定の態様では、本実施形態のCARポリペプチドは、抗原結合性ドメインと膜貫通ドメインの間に位置するヒンジドメインを含むことができる。いくつかの場合では、ヒンジドメインを、CARポリペプチド内に含んで、抗原結合性ドメインと細胞表面の間に十分な距離を提供するまたはCAR遺伝子改変T細胞の抗原結合性またはエフェクター機能に有害な影響を与え得る潜在的な立体障害を軽減し得る。

0086

いくつかの場合では、CARヒンジドメインは、ヒト免疫グロブリン(Ig)定常領域もしくはIgヒンジを含むその一部から得る、またはヒトCD8α膜貫通ドメイン及びCD8aヒンジ領域から得ることができる。一態様では、CARヒンジドメインは、抗体アイソタイプIgG4のヒンジ−CH2−CH3領域を含むことができる。いくつかの態様では、点突然変異を、抗体重鎖CH2ドメインに導入して、CAR−T細胞または任意の他のCAR改変細胞のグリコシル化及び非特異的Fcガンマ受容体結合を低下させることができる。

0087

ある特定の態様では、本実施形態のCARヒンジドメインは、野生型IgFcドメインに対して、Fc受容体結合を低下させる少なくとも1つの突然変異を含むIg Fcドメインを含む。例えば、CARヒンジドメインは、野生型IgG4−Fcドメインに対して、Fc受容体結合を低下させる少なくとも1つの突然変異を含むIgG4−Fcドメインを含むことができる。いくつかの態様では、CARヒンジドメインは、野生型IgG4−Fc配列に対して、(アミノ酸欠失または置換などの)突然変異をL235及び/またはN297に対応する位置で有するIgG4−Fcドメインを含む。例えば、CARヒンジドメインは、野生型IgG4−Fc配列に対して、L235E及び/またはN297Q突然変異を有するIgG4−Fcドメインを含むことができる。さらなる態様では、CARヒンジドメインは、親水性である、例えば、R、H、K、D、E、S、T、NもしくはQまたはDなどの「E」に類似する特性を有するアミノ酸への、アミノ酸置換を位置L235で有するIgG4−Fcドメインを含むことができる。ある特定の態様では、CARヒンジドメインは、SまたはTなどの「Q」に類似する特性を有するアミノ酸への、アミノ酸置換を位置N297で有するIgG4−Fcドメインを含むことができる。さらなる態様では、CARヒンジドメインは、野生型IgG4−Fc配列に対して、突然変異をL235及び/またはN297に対応する位置で含み、配列番号1または配列番号10に対して約90%同一である。

0088

ある特定の特定の態様では、ヒンジドメインは、配列番号1もしくは配列番号10のIgG4−Fcドメイン、配列番号20のCD8α細胞外ドメインまたは配列番号3の合成ヒンジ配列に対して約85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一である、配列を含む。

0089

C.膜貫通ドメイン
抗原特異的細胞外ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインによって連結してよい。膜貫通ドメインの一部として使用できるポリペプチド配列には、これに限定されないが、ヒトCD4膜貫通ドメイン、ヒトCD28膜貫通ドメイン、膜貫通ヒトCD3ζドメイン、またはシステイン変異ヒトCD3ζドメイン、またはCD16及びCD8及びエリスロポエチン受容体などの他のヒト膜貫通シグナル伝達タンパク質からの他の膜貫通ドメインが含まれる。いくつかの態様では、例えば、膜貫通ドメインは、この両方ともが参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第2014/0274909号または米国特許第8,906,682号に提供される配列の1つを含む。ある特定の特定の態様では、膜貫通ドメインは、配列番号19のCD8α膜貫通ドメインまたは配列番号12のCD28膜貫通ドメインに85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一であることができる。

0090

D.細胞内シグナル伝達ドメイン
本実施形態のキメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ抗原受容体を発現するように遺伝子操作された免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも1つの活性化を担う。「エフェクター機能」という用語は、分化細胞特殊化した機能を指す。T細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得、サイトカインの分泌を含む。ナイーブメモリー、またはメモリー型T細胞におけるエフェクター機能は、抗原依存性増殖を含む。ゆえに、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞を特殊化した機能を行うように仕向けるタンパク質の部分を指す。いくつかの態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、未変性受容体の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する。かかる未変性受容体の例には、T細胞受容体のゼータ鎖またはその相同体のいずれか(例えば、エータ、デルタ、ガンマ、またはイプシロン)、MB1鎖、B29、FcRIII、Fc RI、及びシグナル伝達分子の組み合わせ、例えば、CD3ζとCD28、CD27、4−1BB、DAP−10、OX40、及びそれらの組み合わせ、ならびに他の類似する分子及び断片が挙げられる。活性化タンパク質ファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分、例えば、FcγRIII及びFcεRIを使用することができる。Gross et al.(1992)、Stancovski et al.(1993)、Moritz et al.(1994)、Hwu et al.(1995)、Weijtens et al.(1996)、及びHekele et al.(1996)を、これらの代替の膜貫通及び細胞内ドメインを使用するT細胞受容体の開示に関して参照されたい。通常は、細胞内シグナル伝達ドメイン全体を採用し得るが、多くの場合では、細胞内ポリペプチド全体を使う必要はないだろう。細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が使用され得る限り、かかる切断部分は、それがエフェクター機能シグナルを伝達する限りインタクトな鎖の代わりに使用され得る。「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語は、ゆえに、標的へのCAR結合の際に、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分を含むと意図される。好ましい実施形態では、ヒトCD3ζ細胞内ドメインは、本実施形態のCARの細胞内シグナル伝達ドメインとして使用される。

0091

特定の実施形態では、CAR内の細胞内受容体シグナル伝達ドメインは、T細胞抗原受容体複合体のもの、例えば、CD3のζ鎖、また、例えば、FcγRIII共刺激シグナル伝達ドメイン、CD28、CD27、DAP10、CD137、OX40、CD2を、単独でまたはCD3ζと連なって含む。特定の実施形態では、細胞内ドメイン(細胞質ドメインと称され得る)は、TCRζ鎖、CD28、CD27、OX40/CD134、4−1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、IL−2Rβ/CD122、IL−2Rα/CD132、DAP10、DAP12、及びCD40のうちの1つまたは複数の一部またはすべてを含む。いくつかの実施形態では、あるものは、細胞内ドメインの内因性T細胞受容体複合体の任意の部分を採用する。例えば、いわゆる第三世代CARが、付加効果または相乗効果のために一つに融合した少なくとも2つまたは3つのシグナル伝達ドメインを有するように、1つまたは複数の細胞質ドメインを採用してよい。

0092

いくつかの実施形態では、CARは、追加の他の共刺激ドメインを含む。他の共刺激ドメインは、CD28、CD27、OX−40(CD134)、DAP10、及び4−1BB(CD137)の1つまたは複数を含むことができるが、これらに限定されない。CD3ζにより開始される一次シグナルに加えて、ヒトCAR内に挿入されたヒト共刺激受容体により提供される追加のシグナルが、T細胞の完全活性化に重要であり、養子免疫療法のin vivo持続性及び治療的成功の改善を助け得る。

0093

ある特定の特定の態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号13のCD3ζ細胞内ドメイン、配列番号17のCD28細胞内ドメインまたは配列番号15のCD137細胞内ドメインに対して85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一である配列を含む。

0094

III.ベクター及び細胞工学
具体的な実施形態では、導入遺伝子をコードするDNA配列を組み込むDNA単離された核酸セグメント及び発現カセットを提供する。例えば、導入遺伝子は、CARポリペプチドをコードすることができる。さらなる態様では、導入遺伝子は、標的抗原(またはそのエピトープ)及び/またはHLAポリペプチドをコードする。さらなる態様では、導入遺伝子は、ミトコンドリアのレポーター導入遺伝子、例えば、ミトコンドリア局在化シグナルを含むレポーターポリペプチド(例えば、蛍光レポーター)をコードする。

0095

当業者に理解され得るように、いくつかの例では、コードされる導入遺伝子の末端のいくつかのアミノ酸のコード配列は欠失してよい。例えば、CARをコードする導入遺伝子の場合、CARの抗原結合性ドメインのいくつかのアミノ酸のコード配列は、分子の特異性またはエフェクター結合親和性のいずれかに影響することなく欠失することができ、例えば、通常10個以下、より通常は5個以下の残基である。また、少数のアミノ酸を導入遺伝子コード配列の境界で導入することが望ましい場合があり、通常10個以下、より通常は5個以下の残基である。アミノ酸の欠失または挿入は、構築の必要性の結果であり得、好都合制限部位、簡便な操作、発現レベルの改善等を提供する。加えて、1つまたは複数のアミノ酸の異なるアミノ酸での置換は、同様の理由で生じることができ、通常は、(例えば、CARの任意のドメインにおける)導入遺伝子コード配列にて約5個以下のアミノ酸を置換する。

0096

本実施形態に係るトランスジェニック構築物を、従来の方法で調製することができる。なぜなら、大半の部分について、天然配列が採用され得、必要に応じて、様々な構成要素の適切な接合を可能にするために天然遺伝子が単離及び操作され得るからである。例えば、CARの場合、キメラ抗原受容体のN末端及びC末端タンパク質構成要素をコードする核酸配列は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を採用することにより単離することができ、これには、遺伝子の望ましくない部分の欠失をもたらす適切なプライマーを使用する。あるいは、クローンした遺伝子の制限消化を使用して、キメラ構築物を生成することができる。いずれの場合も、平滑末端である、または相補的重複を有する制限部位を提供するように配列を選択することができる。

0097

トランスジェニック構築物を調製するための様々な操作をin vitroで実行することができ、具体的な実施形態では、キメラ構築物は、適切な宿主におけるクローニング及び発現のためのベクター内に導入され、これには標準的な形質転換またはトランスフェクション法を使用する。ゆえに、各操作の後、DNA配列の接合から結果得られる構築物はクローニングされ、ベクターを単離し、配列をスクリーニングして、配列が所望の導入遺伝子(例えば、キメラ抗原受容体)及び発現制御配列をコードするか確認する。配列は、制限分析、配列決定等によりスクリーニングできる。

0098

本実施形態のベクターは、主として、調節された真核生物プロモーターの制御下で、所望の遺伝子を、免疫細胞に、好ましくは免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)またはAPCに送達するように設計されている。本実施形態に従って使用することができるプロモーターには、例えば、MNDU3プロモーター、CMVプロモーター、EF1αプロモーター、またはユビキチンプロモーターが含まれる。また、ベクターは、他の理由がない場合でも、in vitroでのそれらの操作を促進するために選択可能マーカーを含有してよい。他の実施形態では、導入遺伝子(例えば、CAR)は、in vitroでDNA鋳型から転写されたmRNAから発現することができる。

0099

本実施形態に従って採用される例示的な核酸構築物ポリヌクレオチド)では、プロモーターは、本実施形態の導入遺伝子をコードする核酸配列に機能的に連結する、すなわち、それらは、導入遺伝子をコードするDNAからのメッセンジャーRNAの転写を促進するように配置される。プロモーターは、ゲノム起源であるかまたは合成して生成することができる。T細胞において使用するための種々のプロモーターは当該分野で周知である(例えば、Marodon et al.(2003)により開示されるCD4プロモーター)。プロモーターは、構成的であるかまたは誘導的であることができ、ここで誘導は、例えば、特定の細胞型または特定の成熟レベルに関連する。あるいは、いくつかの周知のウイルスプロモーターも好適である。目的のプロモーターには、β−アクチンプロモーターSV40初期及び後期プロモーター、免疫グロブリンプロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、レトロウイルスプロモーター、及びフレンド限局形成ウイルスプロモーターが含まれる。プロモーターは、エンハンサー随伴してもしなくてもよく、ここでエンハンサーは、特定のプロモーターに天然で随伴してもよく、または異なるプロモーターに随伴してもよい。

0100

導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムDNA源、cDNA源から得ることができるか、または(例えば、PCRを介して)合成されることができるか、またはそれらの組み合わせであることができる。ゲノムDNAのサイズ及びイントロンの数に応じて、cDNAまたはその組み合わせを使用することが望ましくあり得、それは、イントロンがmRNAを安定化させるまたはT細胞特異的発現を提供すると見いだされているからである(Barthel and Goldfeld,2003)。また、mRNAを安定化させるために内因性または外因性非コード領域を使用することもさらに有利であり得る。

0101

本実施形態の導入遺伝子の発現については、導入遺伝子をコードする核酸配列の天然に生じるまたは内因性転写開始領域を使用して、標的宿主内でキメラ抗原受容体を生成することができる。あるいは、外因性転写開始領域を使用することができ、これは、構成的または誘導的発現(例えば、tet−onまたはtet−offプロモーターシステム)を可能にし、ここで発現は標的宿主、所望の発現レベル、標的宿主の性質等に応じて制御することができる。

0102

同様に、いくつかの場合では、導入遺伝子によりコードされるポリペプチドを細胞表面に指向するシグナル配列を使用してよい。いくつかの場合では、シグナル配列は、導入遺伝子の未変性版に存在するシグナル配列である。任意で、いくつかの例では、この配列を異なるシグナル配列に交換することが望ましくあり得る。しかしながら、選択されるシグナル配列は、導入遺伝子が細胞の表面上に提示されるように、導入遺伝子(例えば、T細胞)の発現のために使用される細胞の分泌経路両立可能であるべきである。

0103

同様に、終結領域は、導入遺伝子の未変性版の天然に生じるまたは内因性転写終結領域により提供され得る。あるいは、終結領域は、異なる源に由来してよい。ほとんどの部分について、終結領域の源は、通常、組換えタンパク質の発現に重要であるとは考えられず、発現に悪影響を与えることなく広範囲の終結領域を利用することができる。

0104

CAR発現構築物などの導入遺伝子構築物は、対象自身の細胞内に(または異なるドナー対象からの細胞内に)DNAとしてまたは好適なベクター内で導入することができることが企図される。裸DNAを使用してエレクトロポレーションによりT細胞などの細胞を安定的にトランスフェクトする方法は、当該分野で公知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,410,319号を参照されたい。裸DNAは、通常、発現に適切な配向でプラスミド発現ベクター内に含有される本発明の実施形態の導入遺伝子(例えば、キメラ抗原受容体)をコードするDNAを指す。有利なことに、裸DNAの使用は、本実施形態の導入遺伝子を発現する細胞を産生するために必要とされる時間を減少させることができる。

0105

さらなる態様では、導入遺伝子構築物は、細胞のゲノムDNA内への導入遺伝子(例えば、CAR)構築物の組込みを媒介するためのトランスポゾンをベースとするシステムを使用して細胞内に導入することができる。一般に、かかる方法は、細胞内に、(i)トランスポゼース(またはトランスポゼースポリペプチド)をコードする第一のベクター及び(ii)トランスポゾン反復に隣接する所望の導入遺伝子発現因子をコードする第二のベクターを導入することを必然的に含むだろう。トランスポゾンまたは転移因子は、末端反復配列をその上流及び下流に伴う(短い)核酸配列を含み、標的DNA配列内への核酸の切り出し及び挿入を促進する酵素をコードする。いくつかのトランスポゾン/トランスポゼースシステムは、非相同DNA配列の遺伝的挿入に適応されており、これには、スリーピングビューティー(SB)、種々の脊椎培養細胞株において転移性活性を呈する魚類からのTc1/マリナー様因子、胚性幹細胞、及びin vivoを含む(Ivics et al.,1997)。追加のトランスポゼース及びトランスポゾンシステムは、米国特許第6,489,458号;同第7,148,203号;同第8,227,432号;米国特許公開第2011/0117072号;Mates et al.,2009及びIvics et al.,1997において提供され、このそれぞれはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

0106

あるいは、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルスベクターアデノウイルスベクターアデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスベクター)を使用して、細胞内に導入遺伝子を導入することができる。本実施形態の方法に従って使用するために好適なベクターは、対象の細胞において非複製的である。細胞内で維持されるウイルスのコピー数が細胞の生存力を維持する程度に十分低い、ウイルスをベースとする多数のベクターが知られている。例示的なベクターとしては、本明細書に開示するpFB−neoベクター(STRATAGENE(登録商標))、ならびにHIV、SV40、EBV、HSV、またはBPVをベースとするベクターが含まれる。

0107

IV.免疫エフェクター細胞
ある特定の態様では、本明細書に記載の実施形態は、抗原特異的再指向免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞、NK細胞またはNK T細胞)を作製する及び/または拡大する方法であって、細胞を、CARをコードするDNA(またはRNA)構築物を含有する発現ベクターでトランスフェクトして、次いで、任意で細胞をフィーダー細胞、組換え抗原、または受容体に対する抗体で刺激して、細胞を増殖させることを含む、前記方法を含む。ある特定の態様では、CARを発現するように遺伝子操作された細胞(または細胞集団)は、幹細胞iPS細胞、免疫細胞またはこれらの細胞の前駆体である。以下に記載する方法は、CAR発現のためのT細胞(または他の免疫細胞)遺伝子操作の特定の例に取り組む。

0108

免疫エフェクター細胞の源には、アロジェネイック及び自己源の両方を含む。いくつかの場合では、免疫エフェクター細胞は、幹細胞または誘導多能性幹細胞(iPSC)から分化し得る。ゆえに、本実施形態に従って遺伝子操作するための細胞は、臍帯血、末梢血ヒト胚性幹細胞、またはiPSCから単離することができる。例えば、アロジェネイックなT細胞を改変して、キメラ抗原受容体を含む(及び任意で、機能的TCRを欠如させる)ことができる。いくつかの態様では、免疫エフェクター細胞は、一次ヒトT細胞であり、例えば、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)由来のT細胞であり、PBMCは、G−CSF、骨髄、または臍帯血を用いた刺激後に回収した。(例えば、CAR発現構築物を用いた)トランスフェクションまたは形質導入の後、細胞は、直ちに注入してもよいしまたは保管してもよい。ある特定の態様では、トランスフェクション後、細胞への遺伝子導入後約1、2、3、4、5日またはそれ以上以内にバルク集団としてex vivoで、細胞を数日間、数週間、または数カ月にわたって増殖させてよい。さらなる態様では、トランスフェクション後、トランスフェクタントをクローンし、クローンは、単一の組込まれたまたはエピソームに保持された発現カセットまたはプラスミドの存在を示し、キメラ抗原受容体の発現はex vivoで拡大される。拡大用に選択されたクローンは、抗原発現標的細胞を特異的に認識及び溶解する能力を示す。組換えT細胞は、IL−2、または共通ガンマ鎖(例えば、IL−7、IL−12、IL−15、IL−21、及びその他)と結合する他のサイトカインを用いる刺激により拡大され得る。組換えT細胞は、人工抗原提示細胞を用いる刺激により拡大され得る。組換えT細胞は、人工抗原提示細胞上でまたはT細胞表面上のCD3に架橋するOKT3などの抗体で拡大され得る。組換えT細胞のサブセットは、人工抗原提示細胞上でまたはT細胞表面上のCD52と結合するCampathなどの抗体で欠失され得る。さらなる態様では、遺伝子改変細胞は、低温保存されてよい。

0109

さらなる態様では、本実施形態の免疫エフェクター細胞は、高いミトコンドリアの予備呼吸能(SRC)について選択されている。本明細書で用いるとき、「高いミトコンドリアSRCを有する免疫エフェクター細胞」とは、対応する平均的な免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)よりも高いミトコンドリア活性またはミトコンドリア数を有する免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)を指す。ゆえに、いくつかの態様では、本実施形態の細胞組成物は、高いミトコンドリアSRCを有する免疫エフェクター細胞の集団、例えば高いミトコンドリアSRCを有するCAR発現T細胞の集団を含む。

0110

高いミトコンドリアSRCを有する、CD8+T細胞などの免疫エフェクター細胞は、高い腫瘍負荷、低酸素、解糖のための栄養の欠如、または抑制性サイトカイン環境などのストレス条件の間、より低いSRCを有する細胞に比べて向上した生存を呈し得る。さらには、高いミトコンドリアSRCについて選択された免疫エフェクター細胞は、細胞毒性活性を、ストレス条件下でさえ保持し得る。従って、高いミトコンドリアSRCを有する免疫エフェクター細胞を選択することにより、治療用及びCAR構築物の検査用の両方について改善された細胞組成物を産生することができる。

0111

一態様では、トランスジェニックエフェクター細胞のミトコンドリアSRCを決定するために使用できるレポーターを含む、トランスジェニック免疫エフェクター細胞を提供する。例えば、トランスジェニック細胞は、ミトコンドリア局在化シグナルに連結するレポーターポリペプチドを含んでよい。例えば、レポーターは、増強黄色蛍光タンパク質(YFP)または増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)などの蛍光ポリペプチドであることができ、ミトコンドリア局在化シグナルは、グルタレドキシン(Grx2)由来であることができる。この文脈では、蛍光レポーターは、高いミトコンドリアSRCを有するCAR+T細胞を同定する。例えば、該レポーターを発現するトランスジェニック細胞を、蛍光強度に基づいて選別することができ、in vivoでの腫瘍殺傷のために注入することができる。同様に、トランスジェニック細胞は、例えば、候補CARポリペプチドの治療有効性を決定するために標的細胞の殺傷についてex vivoで検査することができる。

0112

いくつかの態様では、本実施形態に従って使用するためのミトコンドリアのレポーター遺伝子は、内因性遺伝子であってよい。さらなる態様では、ミトコンドリアのレポーター遺伝子は、蛍光レポータータンパク質をコードする遺伝子などの、外因性遺伝子であってよい。いくつかの態様では、蛍光レポータータンパク質は、ミトコンドリア局在化配列を含んでよい。ある特定の態様では、高SRCを有する免疫エフェクター細胞を選択するための方法は、フローサイトメトリーまたはFACSを含んでよい。

0113

ある特定の態様では、SRCを有する免疫エフェクター細胞を同定するためのレポーター遺伝子の発現は、核プロモーター(例えば、hEF1a)の制御下にあり得る。ある特定の態様では、レポーター遺伝子の発現は、ミトコンドリアのプロモーターの制御下にあり得る。ある特定の態様では、発現されたレポータータンパク質は、ミトコンドリア局在化配列を含んでよい。ある特定の態様では、発現されたレポータータンパク質は、細胞表面に指向されてよい。ある特定の態様では、レポーター遺伝子の発現は、ミトコンドリアのプロモーターの制御下にあり得、発現されたレポータータンパク質は、細胞表面に指向されてよい。いくつかの態様では、外因性レポーター遺伝子は、トランスポゾン反復またはウイルスLTRに隣接してよい。いくつかの態様では、外因性レポーター遺伝子は、mRNAまたはエピソーマルベクターなどの染色体外核酸内に含まれてよい。

0114

V.免疫エフェクター細胞を増殖させるための方法
いくつかの場合では、本実施形態の免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)は、活性化及び増殖細胞(AaPC)と共培養されて、細胞拡大を助ける。例えば、抗原提示細胞(APC)は、本実施形態の治療用組成物及び細胞療法生成物の調製に有用である。抗原提示システムの調製及び使用に関する一般的なガイダンスについては、例えば、米国特許第6,225,042号、同第6,355,479号、同第6,362,001号及び同第6,790,662号;米国特許出願公開第2009/0017000号及び同第2009/0004142号;ならびに国際公開番号WO2007/103009を参照されたく、このそれぞれは参照により本明細書に組み込まれる。

0115

いくつかの場合では、AaPCは、追加の処理を伴わずに、MHC分子へのペプチドの直接結合を可能にする最適な長さのペプチドとインキュベートされる。あるいは、細胞は、目的の抗原を発現できる(すなわち、MHC非依存性抗原認識の場合)。さらには、いくつかの場合では、APCは、特定のCARポリペプチドまたは概してCARポリペプチド(例えば、汎用な活性化及び増殖細胞(uAPC)のいずれかに結合する抗体を発現できる。かかる方法は、国際(PCT)特許公開番号WO/2014/190273に開示されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。目的のペプチド−MHC分子または抗原に加えて、AaPCシステムは、少なくとも1つの外因性補助分子も含んでよい。任意の好適な数及び組み合わせの補助分子が採用されてよい。補助分子は、共刺激分子及び接着分子などの補助分子から選択されてよい。例示的な共刺激分子は、CD70及びB7.1(B7.1は、以前にはB7として知られ、CD80としても知られていた)を含み、これは、他のもののなかでも、T細胞の表面上のCD28及び/またはCTLA−4分子に結合し、それにより、例えば、T細胞拡大、Th1分化、短期T細胞生存、及びインターロイキン(IL)−2などのサイトカイン分泌に影響する(Kim et al.,2004を参照されたい)。接着分子は、セレクチンなどの炭水化物結合性糖タンパク質インテグリンなどの膜貫通結合性糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、及び例えば、細胞対細胞または細胞対マトリックス接触を促進する細胞内接着分子ICAM)などの1回膜貫通免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリータンパク質を含んでよい。例示的な接着分子は、LFA−3及びICAM、例えば、ICAM−1を含む。共刺激分子及び接着分子を含む例示的な補助分子の選択、クローニング、調製、及び発現に有用な、技術、方法、及び試薬は、例えば、米国特許第6,225,042号、同第6,355,479号、及び同第6,362,001号に例示されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

0116

AaPCになるように選択された細胞は、好ましくは、細胞内抗原プロセシング、細胞内ペプチドトラフィッキング、及び/または細胞内MHCクラスIもしくはクラスII分子−ペプチド負荷において欠損を有するか、または変温性である(すなわち、温度負荷に対する感受性哺乳類細胞株より低い)か、または欠損及び変温特性の両方を有する。好ましくは、AaPCになるように選択された細胞は、細胞内に導入される外因性MHCクラスIまたはクラスII分子及び補助分子構成要素に対する少なくとも1つの内因性対応物(例えば、内因性MHCクラスIもしくはクラスII分子及び/または上述の内因性補助分子)を発現する能力も欠く。さらには、AaPCは、好ましくは、AaPCを生成するためのその改変の前に細胞が有する欠損及び変温特性を保持する。例示的なAaPCは、構成的であるか、または昆虫細胞株などの抗原プロセシング(TAP)欠損細胞株に関連する輸送体に由来するかのいずれかである。例示的な変温昆虫細胞株は、シュナイダー2細胞株などのショウジョウバエ細胞株である(例えば、Schneider 1972を参照されたい、シュナイダー2細胞の調製、成長、及び培養のための例示的な方法は、米国特許第6,225,042号、同第6,355,479号、及び同第6,362,001号に提供される。

0117

一実施形態では、AaPCはまた、凍結融解サイクルに供される。例示的な凍結融解サイクルでは、AaPCは、AaPCを含有する好適な容器を、適切な量の液体窒素固体二酸化酸素(すなわち、ドライアイス)または類似する低温素材と、急速に凍結が生じるように、接触させることにより凍結され得る。凍結したAPCは、次いで融解されるが、これはAaPCを低温素材から除去して周囲の室温条件暴露することによるか、または微湯浴または暖かい手を使用してより短い融解時間を促進する融解促進プロセスによる。加えて、AaPCは、凍結され、長期保存されてから融解されてよい。凍結したAaPCは、融解され、その後さらなる使用の前に凍結乾燥されてもよい。好ましくは、凍結−融解工程に有害な影響を与え得る保存剤、例えば、ジメチルスルホキシドDMSO)、ポリエチレングリコール(PEG)、及び他の保存剤は、凍結融解サイクルを受けるAaPCを含有する培地には含まれていないか、またはかかる保存剤が本質的に無い培地にAaPCを移すことなどにより本質的に除去される。

0118

さらなる実施形態では、異種核酸及びAaPCに内因性の核酸は、不活性化後、細胞成長、核酸の複製または発現が本質的に生じなくなるように、架橋により不活性化され得る。一実施形態では、AaPCは、外因性MHC及び補助分子の発現、AaPCの表面上でのかかる分子の提示、ならびに選択された単一のペプチドまたは複数のペプチドによる提示されたMHC分子の負荷に後続の点で不活性化される。従って、かかる不活化及び選択されたペプチド負荷AaPCは、本質的に増殖不能又は複製不能にされているものの、選択されたペプチド提示機能を保持している。好ましくは、架橋によっても、AaPCの抗原提示細胞機能を実質的に低減させることなく、細菌及びウイルスなどの微生物汚染が本質的にないAaPCがもたらされる。ゆえに、架橋は、重要なAaPC機能を維持する一方で、AaPCを用いて開発された細胞療法生成物の安全性に関する懸念を軽減するのに役立つ。架橋及びAaPCに関する方法については、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第20090017000号を参照されたい。

0119

ある特定の場合では、CAR改変細胞は、治療剤として使用する前に、FACSを使用して蛍光レポータータンパク質を採用することによりそれらのミトコンドリアの強さ(または細胞の総ミトコンドリア含量)に基づいて選別することができる。

0120

VI.遺伝子操作抗原提示細胞
ある特定の実施形態では、遺伝子操作抗原提示細胞(APC)をさらに提供する。かかる細胞は、例えば、上記のように、免疫エフェクター細胞をex vivoで増殖させるために使用され得る。さらなる態様では、遺伝子操作ACPは、それら自体が患者に投与されて、それにより免疫エフェクター細胞の拡大をin vivoで刺激してよい。本実施形態の遺伝子操作APCは、それら自体が治療剤として使用されてよい。いくつかの実施形態では、遺伝子操作APCは、標的抗原に特異的な内因性免疫エフェクター細胞の活性化を刺激することができる治療剤として使用することができる、及び/または標的抗原に特異的な養子移入された免疫エフェクター細胞の活性もしくは持続性を増加させるために使用することができる。

0121

本明細書で用いるとき、「遺伝子操作APC」という用語は、ヒト白血球抗原(HLA)をコードする少なくとも第一の導入遺伝子を含む細胞(複数可)を指す。かかる(Suvch)遺伝子操作APCは、抗原がHLAと複合体化してAPCの表面上に提示されるように、抗原の発現のための第二の導入遺伝子をさらに含んでよい。いくつかの態様では、遺伝子操作APCは、抗原を提示する細胞型(例えば、樹状細胞)であることができる。さらなる態様では、遺伝子操作APCは、通常は抗原を提示しない、T細胞またはT細胞前駆体などの細胞型から産生されることができる(「T−APC」と称する)。ゆえに、いくつかの態様では、本実施形態の遺伝子操作APCは、HLAが標的抗原のエピトープと複合体化して遺伝子操作APCの表面上に発現されるように、標的抗原をコードする第一の導入遺伝子及びHLAをコードする第二の導入遺伝子を含む。ある特定の特定の態様では、遺伝子操作APCにおいて発現されるHLAは、HLA−A、HLA−B、HLA−CまたはHLA−DRB1である。さらなる態様では、遺伝子操作APCにおいて発現されるHLAは、HLA−A2である。

0122

いくつかの態様では、本実施形態の遺伝子操作APCは、共刺激分子をコードする少なくとも第三の導入遺伝子をさらに含んでよい。共刺激分子は、膜結合型Cγサイトカインであってよい共刺激サイトカインであってよい。ある特定の態様では、共刺激サイトカインは、膜結合型IL−15などのIL−15である。いくつかのさらなる態様では、遺伝子操作APCは、編集された(または欠失した)遺伝子を含んでよい。例えば、PD−1、LIM−3、CTLA−4またはTCRなどの阻害遺伝子を編集して、遺伝子の発現を低下させるまたは除去することができる。

0123

本実施形態の遺伝子操作APCは、任意の目的の標的抗原をコードする導入遺伝子を含んでよい。例えば、標的抗原は、感染性疾患抗原または腫瘍関連抗原(TAA)であることができる。標的抗原は、細胞内または細胞表面抗原であってよい。例えば、いくつかの態様では、標的抗原は、腫瘍細胞の細胞内コンパートメント由来のTAAなどのTAAである。TAAは、膜結合型、細胞質、核局在化であってよいか、または腫瘍細胞により分泌されてもよい。いくつかの態様では、TAAは、対応する正常組織と比較して差次的に発現され、それにより免疫エフェクター細胞による腫瘍細胞の優先的な認識が可能になる。標的抗原の具体例には、これらに限定されないが、WT1、MUC1、LMP2、HPVE6 E7、EGFRvIII、HER−2/neu、イディオタイプ、MAGE A3、p53非変異体、NY−ESO−1、PSMA、GD2、CEA、メランA/MART1、Ras突然変異体、gp100、p53突然変異体、プロテイナーゼ3(PR1)、bcr−abl、チロシナーゼ、サバイビン、PSA、hTERT、肉腫転座ブレークポイント、EphA2、PAP、ML−IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2 ETS融合遺伝子)、NA17、PAX3、ALK、アンドロゲン受容体、サイクリンB1、ポリシアル酸、MCN、RhoC、TRP−2、GD3、フコシルGM1、メソテリン、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYP1B1、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GloboH、ETV6−AML、NY−BR−1、RGS5、SART3、STn、炭酸脱水酵素IX、PAX5、OT−TES1、精液タンパク質17、LCK、HMWMAA、AKAP−4、SSX2、XAGE 1、B7H3、レグマイン、Tie 2、Page4、VEGFR2、MAD−CT−1、FAP、PDGFR−β、MAD−CT−2、及びFos関連抗原1が含まれる。

0124

いくつかの特定の態様では、本実施形態の遺伝子操作APCは、抗原提示細胞として機能するように遺伝子操作されているT細胞である(「T−APC」と称する)。具体的には、本実施形態のT−APCは、標的抗原をコードする第一の導入遺伝子及びHLAをコードする第二の導入遺伝子を含む。ゆえに、T−APCは、TAAなどのコードした抗原を提示することができる。例えば、本明細書で例示するT−APCは、NY−ES0−1抗原及びHLA−A2をコードする導入遺伝子を含む。ゆえに、これらの細胞を使用して、NY−ESO−1特異的免疫エフェクター細胞をex vivoまたはin vivo(患者に投与された後)のいずれかで増殖させ得る。さらに、本明細書で例示するT−APCを、さらに遺伝子操作して追加の共刺激分子、具体的には膜結合型IL−15(miL−15)を発現させた。追加の共刺激分子は、標的抗原特異的免疫エフェクター細胞の生成をさらに改善し、これらの細胞の持続性を増加させる。

0125

VII.治療適用
いくつかの態様では、本実施形態のキメラ抗原受容体構築物及び細胞は、癌を有するまたは有すると疑われる対象において、これらの対象の腫瘍のサイズを低下させるまたは腫瘍の成長もしくは再成長を防止することにより適用される。従って、本明細書に提供する実施形態は、本発明の実施形態のキメラ抗原受容体構築物を対象の単離されたT細胞へと導入し、形質転換したT細胞を対象に再導入し、それにより抗腫瘍応答に影響をあたえて対象における腫瘍を減少させるまたは除去することによる、対象において成長を減少させるまたは腫瘍形成を防止するための方法にさらに関する。使用することができる好適なT細胞には、細胞毒性リンパ球(CTL)または破壊を必要とするT細胞受容体を有する任意の細胞が含まれる。当業者に周知であるように、対象からこれらの細胞を単離するための様々な方法が容易に利用可能である。例えば、細胞表面マーカー発現を使用することまたは市販のキット(例えば、Pierce製のISOCELL(商標)、イリノイ州、ロックフォード)を使用することである。

0126

一度、トランスフェクトされたまたは形質導入された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)がキメラ抗原受容体を表面膜タンパク質として、所望の調節を伴い所望のレベルで発現することができると確立されたら、キメラ抗原受容体が、宿主細胞において、所望のシグナル誘導を提供するように機能するかどうかを決定することができる。その後、形質導入された免疫エフェクター細胞を再導入されるかまたは対象に投与して、抗腫瘍応答を対象内で活性化させる。投与を容易にするために、本実施形態に係る形質導入されるT細胞は、医薬組成物へと作成またはin vivoでの投与に適切な移植片へと作製することができ、これは、さらに医薬的に許容され得る、適切なキャリアまたは希釈剤を伴う。かかる組成物または移植片を作成する手段は、当該分野で記載されている(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences,16th Ed.,Mack,ed.(1980)を参照されたい)。適切な場合、形質導入されるT細胞は、それらのそれぞれの投与経路にとって通常の方法において、半固体または液体形態調製物、例えば、カプセル液剤、注射、吸入剤、またはエアロゾルへと製剤化することができる。当該分野で公知の手段を利用して、組成物の放出及び吸収を、それが標的組織または臓器に到達するまで、または組成物の持続放出を確保するために、防ぐまたは最小化することができる。しかしながら、望ましくは、キメラ抗原受容体を発現する細胞を無効化しない医薬的に許容され得る形態が採用される。ゆえに、望ましくは、形質導入するT細胞は、平衡塩溶液、好ましくは、ハンクス平衡塩溶液、または通常の食塩水を含有する医薬組成物へと作製することができる。

0127

ある特定の実施形態では、本実施形態のCAR発現細胞は、癌または感染を有する個体などの、それを必要とする個体へと送達される。次いで、細胞は、それぞれの癌または病原体感染細胞攻撃するための個体の免疫系を増強する。いくつかの場合では、個体は、1つまたは複数の用量の抗原特異的CAR細胞を提供される。個体が、2回以上の用量の抗原特異的CAR細胞を提供される場合、投与の間の期間は、個体内での増殖を可能にするために十分であるべきであり、特定の実施形態では、用量間の期間は、1、2、3、4、5、6、7日、またはそれ以上である。治療効果に好適な用量は、1用量あたり少なくとも105個または約105から約1010個の間の細胞であり、例えば、好ましくは一連投薬サイクルであるだろう。例示的な投薬レジメンは、漸増用量の4回の1週間投薬サイクルからなり、0日目に少なくとも約105個の細胞から開始し、例えば、患者内用量漸増スキームの開始の数週間以内に約1010個の細胞の標的用量まで徐々に増加しする。好適な投与様式には、静脈内、皮下、腔内(例えば、病原アクセスデバイスによる)、腹腔内、及び腫瘍塊への直接注射が含まれる。

0128

(例えば、CAR発現T細胞を含む)本実施形態の医薬組成物は、単独で、または癌の処置に有用な十分に確立された他の薬剤と組み合わせて使用することができる。単独でまたは他の薬剤と組み合わせて送達されてもいずれでも、本実施形態の医薬組成物は、様々な経路を介して、様々な部位に、哺乳類、特にヒトの体内に送達されて、特定の効果を達成することができる。当業者は、2つ以上の経路を投与のために使用することができるが、別の経路よりも特定の経路がより迅速な、より効果的な応答を提供することができることを、認識するだろう。例えば、皮内送達は、メラノーマの処置のために使用され得る。局所または全身送達は、体腔内への製剤の適用もしくは滴下注入、エアロゾルの吸入もしくは吹送を含む投与により、または筋肉内、静脈内、門脈内肝臓内腹膜、皮下、もしくは皮内投与を含む非経口導入により、達成することができる。

0129

本実施形態の組成物は、単位剤形において提供することができ、ここで各剤形、例えば、注射は、所定量の組成物を、単独で、または他の活性剤と適切な組み合わせで含有する。単位剤形という用語は、本明細書で用いるとき、ヒト及び動物対象に好適な一体型投薬として好適な物理的に別個の単位を指し、各単位は所定量の本実施形態の組成物を、単独でまたは他の活性薬剤と組み合わせて含有し、これは所望の効果を産生するのに十分な量に算出され、医薬的に許容され得る希釈剤、キャリア、またはビヒクルを適切な場合には伴う。本実施形態の新規単位剤形に関する仕様は、特定の対象における医薬組成物と関連する特定の薬力学に依存する。

0130

望ましくは、有効量または十分な数の単離された形質導入されたT細胞が組成物中に存在し、かかる処置がなされなかった場合の結果よりも、長期で、特異的な、抗腫瘍応答が確立されて腫瘍のサイズを低下させるまたは腫瘍成長もしくは再成長を除去するように、対象内に導入される。望ましくは、対象に再導入される形質導入されたT細胞の量は、形質導入されたT細胞が存在しない以外は同じである条件と比較して、腫瘍サイズにおいて10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、または100%低減を引き起こす。本明細書で用いるとき、「抗腫瘍有効量」という用語は、対象において癌細胞または腫瘍成長を減少させるCAR発現免疫エフェクター細胞の有効量を指す。

0131

従って、形質導入された免疫エフェクター細胞(例えば、T細胞)の投与量は、投与経路を考慮するべきであり、所望の治療応答を達成するために十分な数の形質導入された免疫エフェクター細胞が導入され得る量であるべきである。さらには、本明細書に記載の組成物中に含まれる各活性剤の量(例えば、接触されるべき各細胞あたりの量またはある特定の体重あたりの量)は、用途によって変動することができる。一般に、形質導入されたT細胞の濃度は、望ましくは、処置される対象において少なくとも約1×106個〜約1×109個の形質導入されたT細胞、さらにより望ましくは、約1×107個〜約5×108個の形質導入されたT細胞を提供するのに十分であるべきであるが、任意の好適な量、上で、例えば、5×108個の細胞より多い、または下で、例えば、1×107個未満のいずれかを使用することができる。投薬スケジュールは、十分に確立された細胞療法に基づくことができる(例えば、Topalian and Rosenberg,1987;米国特許第4,690,915号を参照されたい)、または代替の連続注入方式も採用することができる。

0132

これらの値は、本実施形態の方法を最適化する際に専門家により利用される形質導入されたT細胞の範囲の一般的なガイダンスを提供する。かかる範囲の本明細書での列挙は、具体的な用途において保証される可能性があるため、決してより高いまたは低い量の構成成分の使用を排除しない。例えば、実際の用量及びスケジュールは、組成物が他の医薬組成物と併用で投与されるかどうかに依存して、または薬物動態、薬物消長、及び代謝の個体間差異に依存して変動することができる。当業者は、具体的な状況の緊急性に従って任意の必要な調整を容易になすことができる。

0133

VII.本実施形態のキット
本明細書に記載の組成物のいずれもが、キットに含まれてよい。いくつかの実施形態では、アロジェネイックなCAR T細胞がキット内に提供され、これは、細胞の拡大に好適な試薬、例えば、培地、APC、遺伝子操作APC、成長因子、抗体(例えば、CAR T細胞を選別するまたは特徴付けるため)及び/または導入遺伝子をコードするプラスミド、例えば、標的抗原、HLA、ミトコンドリアのレポーター、CARまたはトランスポゼースも含んでよい。

0134

非限定的な例では、キメラ抗原受容体発現構築物、キメラ抗原受容体発現構築物を生成するための1つまたは複数の試薬、発現構築物のトランスフェクションのための細胞、及び/または発現構築物のトランスフェクションのためのアロジェネイックな細胞を得るための1つまたは複数の機器(例えば、機器は、シリンジピペット鉗子、及び/または任意のかかる医学的に承認されている装置であってよい)。

0135

いくつかの実施形態では、内因性TCRα/β発現を除去するための発現構築物、構築物を生成するための1つまたは複数の試薬、及び/またはCAR+T細胞を、キット内に提供する。いくつかの実施形態では、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(複数可)をコードする発現構築物を含む。

0136

いくつかの態様では、キットは、細胞のエレクトロポレーション用の試薬または装置を含む。

0137

キットは、1つまたは複数の好適に分割された本実施形態の組成物または本実施形態の組成物を生成するための試薬を含んでよい。キットの構成要素は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装されてよい。キットの容器手段は、少なくとも1つのバイアル試験管フラスコボトル、シリンジ、または、その中に構成要素が配置され得る、及び好ましくは好適に分割され得る他の容器手段を含んでよい。キット内に2つ以上の構成要素がある場合、キットは、一般的に、その中に追加の構成要素が別々に配置され得る第二、第三または他の追加の容器も含有するだろう。しかしながら、様々な組み合わせの構成要素がバイアル中に含まれてよい。本実施形態のキットは、典型的に、キメラ抗原受容体構築物及び任意の他の試薬容器を市販のために密閉して含有するための手段も含むだろう。かかる容器は、例えば、注射またはその中に所望のバイアルが保持されるブロー成型プラスチック容器を含んでよい。

0138

VIII.実施例
本発明の実施形態を、以下の実施例を参照することにより詳細にさらに記載する。これらの実施例は、例示の目的でのみ与えられ、別段の指定がない限り、限定することを意図しない。ゆえに、本発明は、決して以下の実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供する教示の結果として明らかになる任意及び全ての変形を包含すると解釈されるべきである。

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