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技術 synTacポリペプチド及びその使用

出願人 アルバートアインシュタインカレッジオブメディシン,インコーポレイティド
発明者 サイデルザサードロナルドディー.チャパーロロドルフォジェイ.ヒルリッチブランダンエス.ガーフォーススコットジェイ.アルモスティーブンシー.
出願日 2019年10月23日 (8ヶ月経過) 出願番号 2019-192453
公開日 2020年2月13日 (4ヶ月経過) 公開番号 2020-022491
状態 特許登録済
技術分野 微生物による化合物の製造 化合物または医薬の治療活性 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 ペプチド又は蛋白質 動物,微生物物質含有医薬 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 微生物、その培養処理 動物の育種及び生殖細胞操作による繁殖 突然変異または遺伝子工学
主要キーワード 連結形式 規制措置 副結合 はりす 連結方式 追加物 モジュール設計 一般型
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重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2020年2月13日)のものです。
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図面 (20)

課題

細胞クローン的阻害または刺激するための方法及び組成物を提供する。

解決手段

a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;ii)第一の主要組織適合複合体MHCポリペプチドを含む第一のポリペプチド、並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)任意で免疫グロブリンIgFcポリペプチドまたは非Ig骨格を含む第二のポリペプチドを含み、A)前記第一のポリペプチドのC末端に;B)前記第二のポリペプチドのN末端に;C)前記第二のポリペプチドのC末端に;またはD)前記第一ポリペプチドのC末端及び前記第二のポリペプチドのN末端に存在する1つ以上の免疫調節ドメインを含む、多量体ポリペプチド

概要

背景

緒言
本出願を通して、様々な出版物角括弧で参照される。これら参考文献の完全な引用は、本明細書の文末を参照されたい。これら出版物の開示、並びに本明細書に参照されるすべての特許、公開特許公報、及び書籍は、参照することによってその全体が本願に組み込まれ、本願発明が属する技術をさらに十分に説明する。

過去十年間にわたる臨床的意義のあるバイオマーカー発見に対するハイスループット技術の開発の急速な進歩は、活性成分生物学的起源(例えば、モノクローナル抗体治療用タンパク質、及びペプチド)によって製造されるかまたは該生物学的起源から抽出される薬物である生物製剤の段階的な展開及び適用と並行してきたとともに、免疫関連疾患治療革命をもたらした。しかしながら、現行生物学的療法は、安全規制措置をそれらの合成対応物の2倍の割合で促している(生物製剤に対して17%、合成物質は8.5%)[1]。これは、免疫を調節するこれら生物製剤の作用機序から、すなわち自己免疫の場合の包括的な免疫抑制(例えば、Humira[2])及びがんの治療に関する包括的な免疫刺激(例えば、Yervoy[3])から現れると考えられている。これらの治療は、免疫調節病原性的に関連する細胞に適切には限定せず、その結果として、患者致死的可能性がある感染症にかかりやすくし、多くの厄介副作用を起こしやすくする[4〜6]。さらに、これら薬物の中程度の効能と安全性プロファイル[7]は、標的治療方法へと向かう最近の傾向を誘発した。第一世代の「標的」生物製剤は、それらの影響をより限定されたT細胞サブセットへ向ける(例えば、抗4−1BB、抗CD27、LAG−3、及びTIM−3等の抗体及びタンパク質治療剤)[8〜11]。しかしながら、以前の治療法のように、これら「第一世代」の取り組みは、病気に関連する細胞のみを標的にすることが依然としてできない。

適応免疫反応を含む分子事象中核をなすのは、T細胞受容体(TCR)と、主要組織適合複合体MHC分子によって非共有結合的提示される低分子ペプチド抗原の結合である。これは、免疫系の標的化機序を表しており、かつ、T細胞活性化とエフェクター機能に必須の分子間相互作用である。エピトープ特異的な細胞の標的化に続いて、動員されたT細胞は、抗原提示細胞上で見られる共刺激分子の一般的な結合によって活性化される。両方のシグナルが、T細胞の特異性及び活性化または阻害操縦のために必要とされる。重要なことには、T細胞の発生の際、ゲノム編集過程でT細胞ごとに独自のTCRが発現する[12]が、該共刺激分子は、一般にすべてのT細胞(または大型のT細胞の「サブセット」)上に発現する。現行の手法は、ほとんど該共刺激分子の一般的な結合だけに依拠し、結果として「包括的な治療」になる。これら包括的な免疫療法は、非常に効力があるが、無差別にT細胞を標的とし、重篤な毒性につながる。共刺激分子が、病気に関連するTCRを有するT細胞に選択的に結合できれば、それらの効力は、不利益な点から長所へと前進するであろう。

T細胞を調節するためのいくつかの方法があり、共刺激作用を阻止可能な一般にFc融合体として表される可溶性共刺激分子または共刺激分子に対する抗体[13、14]、抗体薬物複合体ADC)[15]、二重特異性抗体(BsAb)[16、17]、及び遊離ペプチド抗原[18]が挙げられる。特に、ADC(しばしば魔法の弾丸と呼ばれる)は、病的細胞への毒素(または他の薬物ペイロード)の直接的な標的化導入約束する。しかしながら、ADCは、現在のところ、抗体標的化に好適なバイオマーカーを欠いており、また、内在化は多くの場合細胞の死滅に必要とされるが、投与量のわずか約1.5%の低い内在化率しか腫瘍細胞内で見いだされない。二重特異性抗体は、複数のmAbの相加効果および相乗効果を組み合わせる魅力ある機会を与え、腫瘍細胞とT細胞の橋渡しをするために用いることができ[17]、ゆえに反応を誘発するために内在化を必要としない。二重特異性抗体は2つの異なる抗原と二価相互作用を有するように開発された[19]が、これらの構築物はなおモジュール性を欠き、親mAbと比較して親和性が低い[20]。養子T細胞(CAR−T)療法は、これらの問題にある程度対処しており、上述の従来の治療に対して魅力的代替手段である[21]。CAR−Tは、キメラ抗原受容体(CAR)をその表面に有する遺伝子改変された一次T細胞を用いる。すなわち、患者のT細胞を取り出し、精製し、かつ、CARを介して腫瘍特異的抗原を標的とするように遺伝子改変する。CARは一般に外部一本鎖可変ドメイン抗体フラグメント)を有し、これは病的細胞を標的とするが、従来の共刺激分子の細胞質ドメインを有する。遺伝子操作されたT細胞がいったん標的抗原と結合すると、内部刺激ドメインは該T細胞が完全に活性となるために必要なシグナルを与える。この完全な活性状態で、該T細胞はより効果的に増殖することができ、がん細胞を攻撃できる。サイトカイン放出症候群及びそれに伴う副作用を避けるためのこの反応の緩和、並びに拡張性の問題(例えば、相当な費用並びにT細胞の取り出し及び改変に伴う難しさ)のため、今のところこの技術は主流として用いられない[22]。

生物薬剤としても知られる生物製剤は、その活性成分が生物学的起源によって製造されるかまたは該生物学的起源から抽出される薬物である(「小分子」薬物とは対照的である)。生物製剤は、治療学の世界市場にとって比較的新しい追加物であり、大部分が、遺伝子操作によって製造される組み換えタンパク質であり;これらはモノクローナル抗体、治療用タンパク質、及びペプチドを含む。現在上市されている生物製剤薬物のほとんどは、患者が慢性疾患、例えば、がん、糖尿病循環器疾患不妊症、及び嚢胞性線維症を患っているのを緩和するために用いられている。生物製剤の世界市場は、2012年には1630億ドル規模を誇り、5年間の複合年間成長率9%を維持して2017年までに2520億ドルに拡大すると予想されている。この成長を推し進めるために、より費用のかかる創薬パイプライン、治りにくい病気に対する魅力的な標的の特定、及び最近の短縮されたFDA承認経路の導入がよい例となる後続の生物製剤(バイオ後続品、ジェネリック生物製剤)の追跡への支援が必要である。

本発明は、免疫腫瘍学及び自己免疫に関する精密な治療方法の必要性、すなわち、現在上市もしくは開発中の包括的かつ「疑似標的化」モジュレーターとは異なり、病気に関連するT細胞のみを(例えば、がんの場合における)上方調節または(例えば、自己免疫の場合における)抑制のためにクローン的に標的とするテーラード治療法の必要性に対応する。

概要

T細胞をクローン的に阻害または刺激するための方法及び組成物を提供する。a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;ii)第一の主要組織適合複合体(MHC)ポリペプチドを含む第一のポリペプチド、並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)任意で免疫グロブリンIgFcポリペプチドまたは非Ig骨格を含む第二のポリペプチドを含み、A)前記第一のポリペプチドのC末端に;B)前記第二のポリペプチドのN末端に;C)前記第二のポリペプチドのC末端に;またはD)前記第一ポリペプチドのC末端及び前記第二のポリペプチドのN末端に存在する1つ以上の免疫調節ドメインを含む、多量体ポリペプチド。なし

目的

本発明は、第一のB2Mリーダー配列と同一のアミノ酸配列、これに隣接する候補エピトープペプチド、これに隣接する第一のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然B2Mペプチド配列と同一のアミノ酸配列、これに隣接する第二のアミノ酸リンカー配列、これに隣接するT細胞調節ドメインペプチド配列、これに隣接する第三のアミノ酸リンカー、これに隣接する第二のB2Mリーダー配列、これに隣接する、MHC重鎖と同一のアミノ酸配列、これに隣接する、免疫グロブリンFcドメインと同一のアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチドを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;ii)第一の主要組織適合複合体MHCポリペプチドを含む第一のポリペプチド、並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)任意で免疫グロブリンIgFcポリペプチドまたは非Ig骨格を含む第二のポリペプチドを含み、A)前記第一のポリペプチドのC末端に;B)前記第二のポリペプチドのN末端に;C)前記第二のポリペプチドのC末端に;またはD)前記第一ポリペプチドのC末端及び前記第二のポリペプチドのN末端に存在する1つ以上の免疫調節ドメインを含む、多量体ポリペプチド

請求項2

a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;ii)第一のMHCポリペプチド;及びiii)免疫調節ドメインを含む第一のポリペプチド、並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む、請求項1に記載の多量体ポリペプチド。

請求項3

a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;及びii)第一のMHCポリペプチドを含む第一のポリペプチド、並びにb)N末端からC末端の順にi)免疫調節ドメイン;iii)第二のMHCポリペプチド;及びii)免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む、請求項1に記載の多量体ポリペプチド。

請求項4

a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;及びii)第一のMHCポリペプチドを含む第一のポリペプチド、並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)IgFcポリペプチド;及びiii)免疫調節ドメインを含む第二のポリペプチドを含む、請求項1に記載の多量体ポリペプチド。

請求項5

a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;及びii)第一のMHCポリペプチドを含む第一のポリペプチド、並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)免疫調節ドメインを含む第二のポリペプチドを含む、請求項1に記載の多量体ポリペプチド。

請求項6

a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;及びii)第一のMHCポリペプチドを含む第一のポリペプチド、並びにb)N末端からC末端の順にi)免疫調節ドメイン;及びii)第二のMHCポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む、請求項1に記載の多量体ポリペプチド。

請求項7

a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;ii)第一のMHCポリペプチド;及びiii)免疫調節ドメインを含む第一のポリペプチド、並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む、請求項1に記載の多量体ポリペプチド。

請求項8

前記非Ig骨格が、XTENポリペプチド、トランスフェリンポリペプチド、Fc受容体ポリペプチド、エラスチン様ポリペプチドシルク様ポリペプチド、またはシルクエラスチン様ポリペプチドである、請求項1に記載の多量体ポリペプチド。

請求項9

前記第一のMHCポリペプチドがβ2ミクログロブリンポリペプチドであり;かつ前記第二のMHCポリペプチドがMHCクラス重鎖ポリペプチドである、請求項1から8のいずれか一項に記載の多量体ポリペプチド。

請求項10

前記β2ミクログロブリンポリペプチドが、SEQIDNO:4に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項9に記載の多量体ポリペプチド。

請求項11

前記MHCクラスI重鎖ポリペプチドが、HLA−A、HLA−B、またはHLA−Cの重鎖である、請求項8に記載の多量体ポリペプチド。

請求項12

前記MHCクラスI重鎖ポリペプチドが、SEQIDNO:5に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項9に記載の多量体ポリペプチド。

請求項13

前記第一のMHCポリペプチドが、MHCクラスIIα鎖ポリペプチドであり;かつ前記第二のMHCポリペプチドが、MHCクラスIIβ鎖ポリペプチドである、請求項1から8のいずれか一項に記載の多量体ポリペプチド。

請求項14

前記エピトープがT細胞エピトープである、請求項1から8のいずれか一項に記載の多量体ポリペプチド。

請求項15

Fcポリペプチドを含み、かつ、前記IgFcポリペプチドが、IgG1 Fcポリペプチド、IgG2 Fcポリペプチド、IgG3 Fcポリペプチド、IgG4 Fcポリペプチド、IgAFcポリペプチド、またはIgMFcポリペプチドである、請求項1から7のいずれか一項に記載の多量体ポリペプチド。

請求項16

前記IgFcポリペプチドが、図24A〜24Cに示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項15に記載の多量体ポリペプチド。

請求項17

前記第一のポリペプチド及び前記第二のポリペプチドが非共有結合的会合している、請求項1から8のいずれか一項に記載の多量体ポリペプチド。

請求項18

前記第一のポリペプチド及び前記第二のポリペプチドが共有結合的に連結されている、請求項1から8のいずれか一項に記載の多量体ポリペプチド。

請求項19

前記共有結合がジスルフィド結合による、請求項13に記載の多量体ポリペプチド。

請求項20

前記第一のMHCポリペプチド、または前記エピトープと前記第一のMHCポリペプチドとの間のリンカーが、第一のCys残基を提供するためのアミノ酸置換を含み、かつ前記第二のMHCポリペプチドが、第二のCys残基を提供するためのアミノ酸置換を含み、かつ、前記ジスルフィド結合が前記第一のCys残基と前記第二のCys残基との間に存在する、請求項19に記載の多量体ポリペプチド。

請求項21

前記エピトープと前記第一のMHCポリペプチドとの間に挿入された第一のリンカーを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の多量体ポリペプチド。

請求項22

前記免疫調節ポリペプチドが、4−1BBLポリペプチド、B7−1ポリペプチド、B7−2ポリペプチド、ICOS−Lポリペプチド、OX−40Lポリペプチド、CD80ポリペプチド、CD86ポリペプチド、PD−L1ポリペプチド、FasLポリペプチド、及びPD−L2ポリペプチドから選択される、請求項1から8のいずれか一項に記載の多量体ポリペプチド。

請求項23

2つ以上の免疫調節ポリペプチドを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の多量体ポリペプチド。

請求項24

前記2つ以上の免疫調節ポリペプチドがタンデムになっている、請求項23に記載の多量体ポリペプチド。

請求項25

第三のポリペプチドを含み、前記第三のポリペプチドが、前記第一のポリペプチドまたは前記第二のポリペプチドの前記免疫調節ポリペプチドに対する少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫調節ポリペプチドを含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の多量体ポリペプチド。

請求項26

前記第三のポリペプチドが、前記第一のポリペプチドに共有結合的に連結されている、請求項25に記載の多量体ポリペプチド。

請求項27

前記第二のポリペプチドが、N末端からC末端の順にi)前記第二のMHCポリペプチド;ii)前記IgFcポリペプチド;及びiii)親和性タグを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の多量体ポリペプチド。

請求項28

i)組み換えポリペプチドが、N末端からC末端の順にa)エピトープ;b)第一の主要組織適合複合体(MHC)ポリペプチド;c)免疫調節ポリペプチド;d)タンパク質分解的開裂可能なリンカー、もしくはリボソームスキッピングシグナル;e)第二のMHCポリペプチド;及びf)免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチドを含むか、またはii)前記組み換えポリペプチドが、N末端からC末端の順にa)エピトープ;b)第一のMHCポリペプチド;c)タンパク質分解的に開裂可能なリンカー、もしくはリボソームスキッピングシグナル;d)免疫調節ポリペプチド;e)第二のMHCポリペプチド;及びf)Ig Fcポリペプチドを含む、前記組み換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸

請求項29

前記第一のMHCポリペプチドがβ2ミクログロブリンポリペプチドであり;かつ前記第二のMHCポリペプチドがMHCクラスI重鎖ポリペプチドである、請求項28に記載の核酸。

請求項30

前記β2ミクログロブリンポリペプチドが、SEQIDNO:4に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項29に記載の核酸。

請求項31

前記MHCクラスI重鎖ポリペプチドが、HLA−A、HLA−B、またはHLA−Cの重鎖である、請求項28に記載の核酸。

請求項32

前記MHCクラスI重鎖ポリペプチドが、SEQIDNO:5に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項31に記載の核酸。

請求項33

前記第一のMHCポリペプチドがMHCクラスIIα鎖ポリペプチドであり;かつ前記第二のMHCポリペプチドがMHCクラスIIβ鎖ポリペプチドである、請求項28に記載の核酸。

請求項34

前記エピトープがT細胞エピトープである、請求項28に記載の核酸。

請求項35

前記IgFcポリペプチドが、IgG1 Fcポリペプチド、IgG2 Fcポリペプチド、IgG3 Fcポリペプチド、IgG4 Fcポリペプチド、IgAFcポリペプチド、またはIgMFcポリペプチドである、請求項28に記載の核酸。

請求項36

前記IgFcポリペプチドが、図24A〜24Cに示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項35に記載の核酸。

請求項37

前記免疫調節ポリペプチドが、4−1BBLポリペプチド、B7−1ポリペプチド、B7−2ポリペプチド、ICOS−Lポリペプチド、OX−40Lポリペプチド、CD80ポリペプチド、CD86ポリペプチド、PD−L1ポリペプチド、FasLポリペプチド、及びPD−L2ポリペプチドから選択される、請求項28に記載の核酸。

請求項38

前記免疫調節ポリペプチドが、CD7、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA−G、MICA、MICB、HVEMリンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、及びHVEMから選択される、請求項27に記載の核酸。

請求項39

前記タンパク質分解的に開裂可能なリンカーまたは前記リボソームスキッピングシグナルが、から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項28に記載の核酸。

請求項40

前記組み換えポリペプチドが、N末端からC末端の順にa)第一のリーダーペプチド;b)前記エピトープ;c)前記第一のMHCポリペプチド;d)前記免疫調節ポリペプチド;e)前記タンパク質分解的に開裂可能なリンカーまたは前記リボソームスキッピングシグナル;f)第二のリーダーペプチド;g)前記第二のMHCポリペプチド;及びh)前記免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチドを含む、請求項28に記載の核酸。

請求項41

前記第一のリーダーペプチド及び前記第二のリーダーペプチドがβ2−Mリーダーペプチドである、請求項40に記載の核酸。

請求項42

前記ヌクレオチド配列が転写調節因子作動可能に連結されている、請求項28に記載の核酸。

請求項43

前記転写調節因子が、真核細胞中で機能的であるプロモーターである、請求項42に記載の核酸。

請求項44

前記第一のMHCポリペプチド、または前記エピトープと前記第一のMHCポリペプチドとの間のリンカーが、第一のCys残基を提供するためのアミノ酸置換を含み、かつ前記第二のMHCポリペプチドが、第二のCys残基を提供するためのアミノ酸置換を含み、かつ、前記第一のCys残基及び前記第二のCys残基が、前記第一のMHCポリペプチドと前記第二のMHCポリペプチドとの間にジスルフィド結合を提供する、請求項28に記載の核酸。

請求項45

請求項28から44のいずれか一項に記載の核酸を含む、組み換え発現ベクター

請求項46

ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項45に記載の組み換え発現ベクター。

請求項47

請求項45に記載の組み換え発現ベクターによって遺伝子改変された宿主細胞

請求項48

インビトロである、請求項47に記載の宿主細胞。

請求項49

内因性MHCβ2ミクログロブリンポリペプチドを産生しないように遺伝子改変されている、請求項47に記載の宿主細胞。

請求項50

Tリンパ球である、請求項47に記載の宿主細胞。

請求項51

a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;ii)第一のMHCポリペプチド;及びiii)免疫調節ドメインを含む第一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸;並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸を含む、組成物

請求項51

a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;及びii)第一のMHCポリペプチドを含む第一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸;並びにb)N末端からC末端の順にi)免疫調節ドメインii)第二のMHCポリペプチド;及びiii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸を含む、組成物。

請求項53

前記第一の核酸及び/または前記第二の核酸が組み換え発現ベクター内に存在する、請求項51または52に記載の組成物。

請求項54

請求項51から53のいずれか一項に記載の組成物によって遺伝子改変された宿主細胞。

請求項55

a)47または54の宿主細胞が請求項1に記載の多量体ポリペプチドを合成するような条件下で、前記宿主細胞を培地中のインビトロで培養する段階;ならびにb)前記宿主細胞から及び/または前記培地から前記多量体ポリペプチドを単離する段階を含む、前記多量体ポリペプチドを産生する方法。

請求項56

前記第二のポリペプチドが親和性タグを含み、かつ、前記単離する段階が、前記細胞によって産生された前記多量体ポリペプチドを前記親和性タグの結合パートナーと接触させることを含み、ここで前記結合パートナーが固定化されており、それによって前記多量体ポリペプチドを固定化する、請求項55に記載の方法。

請求項57

固定化された前記多量体ポリペプチドを溶出する段階を含む、請求項55に記載の方法。

請求項58

エピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節する方法であって、前記T細胞を、請求項1に記載の多量体ポリペプチドと接触させる段階を含み、前記接触させる段階が、前記エピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節する、方法。

請求項59

前記免疫調節ポリペプチドが活性化ポリペプチドであり、かつ前記多量体ポリペプチドが前記エピトープ特異的T細胞を活性化する、請求項58に記載の方法。

請求項60

前記免疫調節ポリペプチドが阻害ポリペプチドであり、かつ前記多量体ポリペプチドが前記エピトープ特異的T細胞を阻害する、請求項58に記載の方法。

請求項61

前記接触させる段階がインビトロである、請求項58に記載の方法。

請求項62

前記接触させる段階がインビボである、請求項58に記載の方法。

請求項63

個体におけるエピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節する方法であって、前記個体に、個体におけるエピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節するのに有効な請求項1に記載の多量体ポリペプチドの有効量を投与する段階を含む、方法。

請求項64

前記免疫調節ポリペプチドが活性化ポリペプチドであり、かつ前記多量体ポリペプチドが前記エピトープ特異的T細胞を活性化する、請求項63に記載の方法。

請求項65

前記エピトープががん関連エピトープであり、かつ前記投与する段階が、前記がん関連エピトープに特異的なT細胞の活性を選択的に増大させる、請求項64に記載の方法。

請求項66

前記免疫調節ポリペプチドが阻害性ポリペプチドであり、かつ前記多量体ポリペプチドが前記エピトープ特異的T細胞の活性を阻害する、請求項63に記載の方法。

請求項67

前記エピトープが自己エピトープであり、かつ前記投与する段階が、前記自己エピトープに特異的なT細胞の活性を選択的に阻害する、請求項66に記載の方法。

請求項68

個体における感染症治療する方法であって、前記個体に、有効量のa)請求項1に記載の多量体ポリペプチド;またはb)請求項1に記載の多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む1つ以上の組み換え発現ベクター;もしくはc)請求項1に記載の多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む1つ以上のmRNAを投与する段階を含み、前記エピトープが病原体関連エピトープであり、前記免疫調節ポリペプチドが活性化ポリペプチドであり、かつ前記投与する段階が、個体において病原体関連エピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節するのに有効である、方法。

請求項69

前記病原体がウイルス、細菌、または原生動物である、請求項68に記載の方法。

請求項70

前記投与する段階が皮下投与である、請求項63から68のいずれか一項に記載の方法。

請求項71

前記投与する段階が静脈内投与である、請求項63から68のいずれか一項に記載の方法。

請求項72

前記投与する段階が筋肉内投与である、請求項63から68のいずれか一項に記載の方法。

請求項73

前記投与する段階が全身投与である、請求項63から68のいずれか一項に記載の方法。

請求項74

前記投与する段階が治療部位に対して遠位の投与である、請求項63から68のいずれか一項に記載の方法。

請求項75

前記投与する段階が局所投与である、請求項63から68のいずれか一項に記載の方法。

請求項76

前記投与する段階が治療部位または治療部位近傍での投与である、請求項63から68のいずれか一項に記載の方法。

請求項77

a)請求項1から27のいずれか一項に記載の多量体ポリペプチド;及びb)薬学的に許容される賦形剤を含む組成物。

請求項78

a)請求項28から34のいずれか一項に記載の核酸、または請求項45もしくは46に記載の組み換え発現ベクター;及びb)薬学的に許容される賦形剤を含む組成物。

技術分野

0001

相互参照
本出願は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる、2014年6月18日に出願された米国仮特許出願第62/013,715号の恩典を主張する。

0002

政府支援の言明
本発明は、国立衛生研究所、NIGMSによって与えられた認可番号3U54GM094662−02及び同5U01GM094665−02の下、政府支援を受けてなされた。政府は本発明に所定の権利を有する。

0003

テキストファイルで提供された配列表の参照による組み込み
配列表が、2015年6月10日に作成された142KBサイズのテキストファイル「IMGN−E003WO_ST25.txt」としてここに提供される。本テキストファイルの内容は、参照することによってその全体が本明細書に組み込まれる。

背景技術

0004

緒言
本出願を通して、様々な出版物角括弧で参照される。これら参考文献の完全な引用は、本明細書の文末を参照されたい。これら出版物の開示、並びに本明細書に参照されるすべての特許、公開特許公報、及び書籍は、参照することによってその全体が本願に組み込まれ、本願発明が属する技術をさらに十分に説明する。

0005

過去十年間にわたる臨床的意義のあるバイオマーカー発見に対するハイスループット技術の開発の急速な進歩は、活性成分生物学的起源(例えば、モノクローナル抗体治療用タンパク質、及びペプチド)によって製造されるかまたは該生物学的起源から抽出される薬物である生物製剤の段階的な展開及び適用と並行してきたとともに、免疫関連疾患治療革命をもたらした。しかしながら、現行生物学的療法は、安全規制措置をそれらの合成対応物の2倍の割合で促している(生物製剤に対して17%、合成物質は8.5%)[1]。これは、免疫を調節するこれら生物製剤の作用機序から、すなわち自己免疫の場合の包括的な免疫抑制(例えば、Humira[2])及びがんの治療に関する包括的な免疫刺激(例えば、Yervoy[3])から現れると考えられている。これらの治療は、免疫調節病原性的に関連する細胞に適切には限定せず、その結果として、患者致死的可能性がある感染症にかかりやすくし、多くの厄介副作用を起こしやすくする[4〜6]。さらに、これら薬物の中程度の効能と安全性プロファイル[7]は、標的治療方法へと向かう最近の傾向を誘発した。第一世代の「標的」生物製剤は、それらの影響をより限定されたT細胞サブセットへ向ける(例えば、抗4−1BB、抗CD27、LAG−3、及びTIM−3等の抗体及びタンパク質治療剤)[8〜11]。しかしながら、以前の治療法のように、これら「第一世代」の取り組みは、病気に関連する細胞のみを標的にすることが依然としてできない。

0006

適応免疫反応を含む分子事象中核をなすのは、T細胞受容体(TCR)と、主要組織適合複合体MHC分子によって非共有結合的提示される低分子ペプチド抗原の結合である。これは、免疫系の標的化機序を表しており、かつ、T細胞活性化とエフェクター機能に必須の分子間相互作用である。エピトープ特異的な細胞の標的化に続いて、動員されたT細胞は、抗原提示細胞上で見られる共刺激分子の一般的な結合によって活性化される。両方のシグナルが、T細胞の特異性及び活性化または阻害操縦のために必要とされる。重要なことには、T細胞の発生の際、ゲノム編集過程でT細胞ごとに独自のTCRが発現する[12]が、該共刺激分子は、一般にすべてのT細胞(または大型のT細胞の「サブセット」)上に発現する。現行の手法は、ほとんど該共刺激分子の一般的な結合だけに依拠し、結果として「包括的な治療」になる。これら包括的な免疫療法は、非常に効力があるが、無差別にT細胞を標的とし、重篤な毒性につながる。共刺激分子が、病気に関連するTCRを有するT細胞に選択的に結合できれば、それらの効力は、不利益な点から長所へと前進するであろう。

0007

T細胞を調節するためのいくつかの方法があり、共刺激作用を阻止可能な一般にFc融合体として表される可溶性共刺激分子または共刺激分子に対する抗体[13、14]、抗体薬物複合体ADC)[15]、二重特異性抗体(BsAb)[16、17]、及び遊離ペプチド抗原[18]が挙げられる。特に、ADC(しばしば魔法の弾丸と呼ばれる)は、病的細胞への毒素(または他の薬物ペイロード)の直接的な標的化導入約束する。しかしながら、ADCは、現在のところ、抗体標的化に好適なバイオマーカーを欠いており、また、内在化は多くの場合細胞の死滅に必要とされるが、投与量のわずか約1.5%の低い内在化率しか腫瘍細胞内で見いだされない。二重特異性抗体は、複数のmAbの相加効果および相乗効果を組み合わせる魅力ある機会を与え、腫瘍細胞とT細胞の橋渡しをするために用いることができ[17]、ゆえに反応を誘発するために内在化を必要としない。二重特異性抗体は2つの異なる抗原と二価相互作用を有するように開発された[19]が、これらの構築物はなおモジュール性を欠き、親mAbと比較して親和性が低い[20]。養子T細胞(CAR−T)療法は、これらの問題にある程度対処しており、上述の従来の治療に対して魅力的代替手段である[21]。CAR−Tは、キメラ抗原受容体(CAR)をその表面に有する遺伝子改変された一次T細胞を用いる。すなわち、患者のT細胞を取り出し、精製し、かつ、CARを介して腫瘍特異的抗原を標的とするように遺伝子改変する。CARは一般に外部一本鎖可変ドメイン抗体フラグメント)を有し、これは病的細胞を標的とするが、従来の共刺激分子の細胞質ドメインを有する。遺伝子操作されたT細胞がいったん標的抗原と結合すると、内部刺激ドメインは該T細胞が完全に活性となるために必要なシグナルを与える。この完全な活性状態で、該T細胞はより効果的に増殖することができ、がん細胞を攻撃できる。サイトカイン放出症候群及びそれに伴う副作用を避けるためのこの反応の緩和、並びに拡張性の問題(例えば、相当な費用並びにT細胞の取り出し及び改変に伴う難しさ)のため、今のところこの技術は主流として用いられない[22]。

0008

生物薬剤としても知られる生物製剤は、その活性成分が生物学的起源によって製造されるかまたは該生物学的起源から抽出される薬物である(「小分子」薬物とは対照的である)。生物製剤は、治療学の世界市場にとって比較的新しい追加物であり、大部分が、遺伝子操作によって製造される組み換えタンパク質であり;これらはモノクローナル抗体、治療用タンパク質、及びペプチドを含む。現在上市されている生物製剤薬物のほとんどは、患者が慢性疾患、例えば、がん、糖尿病循環器疾患不妊症、及び嚢胞性線維症を患っているのを緩和するために用いられている。生物製剤の世界市場は、2012年には1630億ドル規模を誇り、5年間の複合年間成長率9%を維持して2017年までに2520億ドルに拡大すると予想されている。この成長を推し進めるために、より費用のかかる創薬パイプライン、治りにくい病気に対する魅力的な標的の特定、及び最近の短縮されたFDA承認経路の導入がよい例となる後続の生物製剤(バイオ後続品、ジェネリック生物製剤)の追跡への支援が必要である。

0009

本発明は、免疫腫瘍学及び自己免疫に関する精密な治療方法の必要性、すなわち、現在上市もしくは開発中の包括的かつ「疑似標的化」モジュレーターとは異なり、病気に関連するT細胞のみを(例えば、がんの場合における)上方調節または(例えば、自己免疫の場合における)抑制のためにクローン的に標的とするテーラード治療法の必要性に対応する。

0010

概要
本発明は、第一のB2Mリーダー配列と同一のアミノ酸配列、これに隣接する候補エピトープペプチド、これに隣接する第一のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然B2Mペプチド配列と同一のアミノ酸配列、これに隣接する第二のアミノ酸リンカー配列、これに隣接するT細胞調節ドメインペプチド配列、これに隣接する第三のアミノ酸リンカー、これに隣接する第二のB2Mリーダー配列、これに隣接する、MHC重鎖と同一のアミノ酸配列、これに隣接する、免疫グロブリンFcドメインと同一のアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチドを提供する。

0011

本発明はまた、第一のB2Mリーダー配列と同一のアミノ酸配列、これに隣接する候補エピトープペプチド、これに隣接する第一のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然B2Mペプチド配列と同一のアミノ酸配列、これに隣接する第二のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する第二のB2Mリーダー配列、これに隣接するT細胞調節ドメインペプチド配列、これに隣接する第三のアミノ酸リンカー、これに隣接するMHC重鎖と同一のアミノ酸配列、これに隣接する、免疫グロブリンFcドメインと同一のアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチドも提供する。

0012

さらに、エピトープペプチドを認識するT細胞クローンを阻害する方法であって、該クローンのT細胞を、T細胞クローンの阻害に有効な量の本明細書に記載の組み換えペプチドと接触させる段階を含み、該組み換えペプチドが、該エピトープペプチドを含み、かつ、阻害性ドメインであるT細胞調節ドメインを含む、方法も提供される。

0013

さらに、エピトープペプチドを認識する自己反応性T細胞クローンの阻害によって自己免疫疾患を治療する方法であって、該クローンのT細胞を、自己免疫疾患の治療に有効な量の本明細書に記載の組み換えペプチドと接触させる段階を含み、該組み換えペプチドが、該エピトープペプチドを含み、かつ、阻害性ドメインであるT細胞調節ドメインを含む、方法も提供される。

0014

さらに、エピトープペプチドを認識するT細胞クローンを刺激する方法であって、該クローンのT細胞を、T細胞クローンの刺激に有効な量の本明細書に記載の組み換えペプチドと接触させる段階を含み、該組み換えペプチドが、該エピトープペプチドを含み、かつ、刺激性ドメインであるT細胞調節ドメインを含む、方法も提供される。

0015

さらに、がんのエピトープペプチドを認識するT細胞クローンの刺激によってがんを治療する方法であって、該クローンのT細胞を、がんの治療に有効な量の本明細書に記載の組み換えペプチドと接触させる段階を含み、該組み換えペプチドが、該エピトープペプチドを含み、かつ、刺激性ドメインであるT細胞調節ドメインを含む、方法も提供される。

0016

さらに、(i)第一のアミノ酸リンカー配列によって結合された候補エピトープペプチド、これに隣接する、ヒト天然B2Mペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第二のアミノ酸リンカー配列、これに隣接するT細胞調節ドメインペプチドを含み、(i)が、1つまたは2つ以上のジスルフィド結合によって、(ii)MHC重鎖の配列を有するアミノ酸配列、これに隣接する第三のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンFcドメインと同一のアミノ酸配列に結合されている、組み換えポリペプチド構築物も提供される。

0017

さらに、(i)第一のアミノ酸リンカー配列によって結合された候補エピトープペプチド、これに隣接する、ヒト天然B2Mペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列を含み、(i)が、1つまたは2つ以上のジスルフィド結合によって、(ii)T細胞調節ドメインペプチド、これに隣接する第二のアミノ酸リンカー、これに隣接する、MHC重鎖の配列を有するアミノ酸配列、これに隣接する第三のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンFcドメインと同一のアミノ酸配列に結合されている、組み換えポリペプチド構築物も提供される。

0018

さらに、それぞれの免疫グロブリンFcドメイン間の1つ以上のジスルフィド結合によって結合された本明細書に記載の組み換えポリペプチド構築物のうちの2つを含むタンパク質も提供される。

0019

さらに、本それぞれの免疫グロブリンFcドメイン間の1つ以上のジスルフィド結合によって結合された明細書に記載の該組み換えポリペプチド構築物のうちの2つを含むタンパク質も提供される。

0020

本発明は、本明細書に記載の組み換えポリペプチドをコードする配列を5'から3'順に含む異種核酸によって形質導入または形質転換された、単離された懸濁適応細胞を提供する。

0021

本開示は、第一のB2Mリーダー配列と同一のアミノ酸配列、これに隣接する候補エピトープペプチド、これに隣接する第一のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然B2Mペプチド配列と同一のアミノ酸配列、これに隣接する第二のアミノ酸リンカー配列、これに隣接するT細胞調節ドメインペプチド配列、これに隣接する第三のアミノ酸リンカー、これに隣接する第二のB2Mリーダー配列、これに隣接する、MHC重鎖と同一のアミノ酸配列、これに隣接する、免疫グロブリンFcドメインと同一のアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチドを提供する。いくつかの場合、該候補エピトープは、7〜20アミノ酸を含む。いくつかの場合、該第三のアミノ酸リンカーは、自己開裂型である。いくつかの場合、該第二のアミノ酸リンカーは、自己開裂型である。いくつかの場合、該自己開裂型のペプチドは、ウイルス2Aペプチドであるか、またはその配列を有する。いくつかの場合、該第一のB2Mリーダー配列及び/または該第二のB2Mリーダー配列は、ヒトB2Mリーダー配列の配列を有する。いくつかの場合、該MHCの重鎖は、ヒトMHCの重鎖である。いくつかの場合、該MHCの重鎖は、MHC I分子である。いくつかの場合、該MHCの重鎖は、HLA−A02:01である。いくつかの場合、該MHCの重鎖は、MHC II分子である。いくつかの場合、該免疫グロブリンFcドメインはIgGのFcドメインである。いくつかの場合、該免疫グロブリンFcドメインはIgAのFcドメインである。いくつかの場合、該免疫グロブリンFcドメインはIgMのFcドメインである。いくつかの場合、該免疫グロブリンFcドメインはヒト免疫グロブリンFcドメインである。いくつかの場合、該免疫グロブリンFcドメインはIgG1のFcドメインである。いくつかの場合、該組み換えポリペプチドは、そのC末端に隣接するHis−8タグを有する。いくつかの場合、該T細胞調節ドメインは、阻害性ドメインである。いくつかの場合、該T細胞調節ドメインは、刺激性ドメインである。いくつかの場合、該T細胞調節ドメインは、抗体及び抗体フラグメント、ペプチドリガンド、T細胞共刺激ペプチド、サイトカイン、または毒素である。いくつかの場合、該T細胞調節ドメインは、PD−L1ペプチド、PD−L1ペプチドのIg可変ドメインを含み、該T細胞調節ドメインは、4−1BBLを含み、該T細胞調節ドメインは、B7−1W88Aを含むか、または、該T細胞調節ドメインは、抗CD28一本鎖Fvを含む。いくつかの場合、該組み換えポリペプチドは、そのヒト天然B2Mペプチド配列とその重鎖配列との間のジスルフィド結合を生じさせるように該B2Mペプチド配列中及び該重鎖配列中に変異を含む。

0022

本開示は、第一のB2Mリーダー配列と同一のアミノ酸配列、これに隣接する候補エピトープペプチド、これに隣接する第一のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、ヒト天然B2Mペプチド配列と同一のアミノ酸配列、これに隣接する第二のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する第二のB2Mリーダー配列、これに隣接するT細胞調節ドメインペプチド配列、これに隣接する第三のアミノ酸リンカー、これに隣接する、MHC重鎖と同一のアミノ酸配列、これに隣接する、免疫グロブリンFcドメインと同一のアミノ酸配列を含む、組み換えポリペプチドを提供する。いくつかの場合、該候補エピトープは、7〜20アミノ酸を含む。いくつかの場合、該第三のアミノ酸リンカーは、自己開裂型である。いくつかの場合、該第二のアミノ酸リンカーは、自己開裂型である。いくつかの場合、該自己開裂型のペプチドは、ウイルス2Aペプチドであるか、またはその配列を有する。いくつかの場合、該第一のB2Mリーダー配列及び/または該第二のB2Mリーダー配列は、ヒトB2Mリーダー配列の配列を有する。いくつかの場合、該MHC重鎖は、ヒトMHC重鎖である。いくつかの場合、該MHC重鎖は、MHC I分子である。いくつかの場合、該MHC重鎖は、HLA−A02:01である。いくつかの場合、該MHC重鎖は、MHC II分子である。いくつかの場合、該免疫グロブリンFcドメインはIgGのFcドメインである。いくつかの場合、該免疫グロブリンFcドメインはIgAのFcドメインである。いくつかの場合、該免疫グロブリンFcドメインはIgMのFcドメインである。いくつかの場合、該免疫グロブリンFcドメインはヒト免疫グロブリンFcドメインである。いくつかの場合、該免疫グロブリンFcドメインはIgG1のFcドメインである。いくつかの場合、該組み換えポリペプチドは、そのC末端に隣接するHis−8タグを有する。いくつかの場合、該T細胞調節ドメインは、阻害性ドメインである。いくつかの場合、該T細胞調節ドメインは、刺激性ドメインである。いくつかの場合、該T細胞調節ドメインは、抗体及び抗体フラグメント、ペプチドリガンド、T細胞共刺激ペプチド、サイトカイン、または毒素である。いくつかの場合、該T細胞調節ドメインは、PD−L1ペプチド、PD−L1ペプチドのIg可変ドメインを含み、該T細胞調節ドメインは、4−1BBLを含み、該T細胞調節ドメインは、B7−1W88Aを含むか、または、該T細胞調節ドメインは、抗CD28一本鎖Fvを含む。いくつかの場合、該組み換えポリペプチドは、そのヒト天然B2Mペプチド配列とその重鎖配列との間のジスルフィド結合を生じさせるように該B2Mペプチド配列中及び該重鎖配列中に変異を含む。

0023

いくつかの場合、該組み換えポリペプチドは、そのヒト天然B2Mペプチド配列とその重鎖配列との間のジスルフィド結合を生じさせるように該B2Mペプチド配列中及び体重鎖配列中に変異を含む。いくつかの場合、該重鎖配列はHLAであり、該ジスルフィド結合は下記の残基の対のうちの1つを連結する:B2M残基12、HLA残基236;B2M残基12、HLA残基237;B2M残基8、HLA残基234;B2M残基10、HLA残基235;B2M残基24、HLA残基236;B2M残基28、HLA残基232;B2M残基98、HLA残基192;B2M残基99、HLA残基234;B2M残基3、HLA残基120;B2M残基31、HLA残基96;B2M残基53、HLA残基35;B2M残基60、HLA残基96;B2M残基60、HLA残基122;B2M残基63、HLA残基27;B2M残基Arg3、HLA残基Gly120;B2M残基His31、HLA残基Gln96;B2M残基Asp53、HLA残基Arg35;B2M残基Trp60、HLA残基Gln96;B2M残基Trp60、HLA残基Asp122;B2M残基Tyr63、HLA残基Tyr27;B2M残基Lys6、HLA残基Glu232;B2M残基Gln8、HLA残基Arg234;B2M残基Tyr10、HLA残基Pro235;B2M残基Ser11、HLA残基Gln242;B2M残基Asn24、HLA残基Ala236;B2M残基Ser28、HLA残基Glu232;B2M残基Asp98、HLA残基His192;及びB2M残基Met99、HLA残基Arg234。

0024

いくつかの場合、該組み換えポリペプチドは、そのヒト天然B2Mペプチド配列とその重鎖配列との間のジスルフィド結合を生じさせるように該B2Mペプチド配列中及び該重鎖配列中に変異を含む。いくつかの場合、該重鎖配列は、HLAであり、該ジスルフィド結合は下記の残基の対のうちの1つを連結する:第一のリンカー部位Gly2、重鎖(HLA)部位Tyr84;軽鎖(B2M)部位Arg12、HLA Ala236;及び/またはB2M残基Arg12、HLA残基Gly237。

0025

いくつかの場合、該T細胞調節ドメインは、阻害性ドメインである。いくつかの場合、該T細胞調節ドメインは、刺激性ドメインである。いくつかの場合、該T細胞調節ドメインは、抗体及び抗体フラグメント、ペプチドリガンド、T細胞共刺激ペプチド、サイトカイン、または毒素である。いくつかの場合、該T細胞調節ドメインは、PD−L1ペプチド、PD−L1ペプチドのIg可変ドメインを含むか、該T細胞調節ドメインは、4−1BBLを含むか、該T細胞調節ドメインは、B7−1W88Aを含むか、または、該T細胞調節ドメインは、抗CD28一本鎖Fvを含む。

0026

本開示は、上述または本明細書の他の場所に記載の組み換えポリペプチドのいずれかをコードする核酸を提供する。本開示は、上述または本明細書の他の場所に記載の組み換えポリペプチドのいずれかをコードする核酸で形質転換された細胞を提供する。

0027

本開示は、エピトープペプチドを認識するT細胞クローンを阻害する方法であって、該クローンのT細胞を、T細胞クローンの阻害に有効な量の上述または本明細書の他の場所に記載の組み換えペプチドのいずれかと接触させる段階を含み、該組み換えペプチドが、該エピトープペプチドを含み、かつ、阻害性ドメインであるT細胞調節ドメインを含む、方法を提供する。

0028

本開示は、エピトープペプチドを認識する自己反応性T細胞クローンの阻害によって自己免疫疾患を治療する方法であって、該クローンのT細胞を、自己免疫疾患の治療に有効な量の上述または本明細書の他の場所に記載の組み換えペプチドと接触させる段階を含み、該組み換えペプチドが、該エピトープペプチドを含み、かつ、阻害性ドメインであるT細胞調節ドメインを含む、方法を提供する。

0029

本開示は、エピトープペプチドを認識するT細胞クローンを刺激する方法であって、該クローンのT細胞を、T細胞クローンの刺激に有効な量の上述または本明細書の他の場所に記載の組み換えペプチドと接触させる段階を含み、該組み換えペプチドが、該エピトープペプチドを含み、かつ、刺激性ドメインであるT細胞調節ドメインを含む、方法を提供する。

0030

本開示は、がんのエピトープペプチドを認識するT細胞クローンの刺激によってがんを治療する方法であって、該クローンのT細胞を、がんの治療に有効な量の上述または本明細書の他の場所に記載の組み換えペプチドと接触させる段階を含み、該組み換えペプチドが、該エピトープペプチドを含み、かつ、刺激性ドメインであるT細胞調節ドメインを含む、方法を提供する。

0031

本開示は、(i)第一のアミノ酸リンカー配列によって結合された候補エピトープペプチド、これに隣接する、ヒト天然B2Mペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第二のアミノ酸リンカー配列、これに隣接するT細胞調節ドメインペプチドを含み、(i)が、1つまたは2つ以上のジスルフィド結合によって、(ii)MHC重鎖の配列を有するアミノ酸配列、これに隣接する第三のアミノ酸リンカー、これに隣接する、免疫グロブリンFcドメインと同一のアミノ酸配列に結合されている、組み換えポリペプチド構築物を提供する。本開示は、それぞれの免疫グロブリンFcドメイン間の1つ以上のジスルフィド結合によって結合された該組み換えポリペプチド構築物のうちの2つを含むタンパク質を提供する。

0032

本開示は、(i)第一のアミノ酸リンカー配列に結合された候補エピトープペプチド、これに隣接する、ヒト天然B2Mペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列を含み、(i)が、1つまたは2つ以上のジスルフィド結合によって、(ii)T細胞調節ドメインペプチド、これに隣接する第二のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、MHC重鎖の配列を有するアミノ酸配列、これに隣接する第三のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンFcドメインと同一のアミノ酸配列に結合されている、組み換えポリペプチド構築物を提供する。本開示は、それぞれの免疫グロブリンFcドメイン間の1つ以上のジスルフィド結合によって結合された該組み換えポリペプチド構築物のうちの2つを含むタンパク質を提供する。

0033

本開示は、少なくとも第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを含む、多量体ポリペプチドであって、該第一のポリペプチドが、N末端からC末端の順にi)エピトープ;及びii)第一の主要組織適合複合体(MHC)ポリペプチドを含み;該第二のポリペプチドが、N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチドを含み、該第一のポリペプチドのC末端または該第二のポリペプチドのN末端に免疫調節ドメインを含む、多量体ポリペプチドを提供する。本開示は、該多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。本開示は、該核酸を含む組み換え発現ベクターを提供する。本開示は、本開示の核酸または本開示の組み換え発現ベクターによって遺伝子改変された宿主細胞を提供する。本開示は、薬学的組成物を含み、該多量体ポリペプチドを含む、組成物を提供する。本開示は、本開示の多量体ポリペプチドと該T細胞を接触させる段階を含む、T細胞活性を調節する方法を提供する。本開示は、有効量の本開示の多量体ポリペプチドを、それを必要とする個体に投与する段階を含む治療方法を提供する。本開示は、本開示の多量体ポリペプチドまたは本開示の多量体ポリペプチドを含む組成物(例えば、薬学的組成物)を含む、容器を提供する。

0034

本開示は、a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;及びii)第一のMHCポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)免疫調節ドメイン;iii)第二のMHCポリペプチド;及びii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチドを提供する。本開示は、a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;ii)第一のMHCポリペプチド;及びiii)免疫調節ドメインを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチドを提供する。いくつかの場合、該第一のMHCポリペプチドは、β2ミクログロブリンポリペプチドであり;かつ該第二のMHCポリペプチドは、MHCクラス重鎖ポリペプチドである。いくつかの場合、該β2ミクログロブリンポリペプチドは、SEQID NO:4に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、HLA−A、HLA−B、またはHLA−Cの重鎖である。いくつかの場合、該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、該第一のMHCポリペプチドは、MHCクラスIIα鎖ポリペプチドであり;かつ該第二のMHCポリペプチドは、MHCクラスIIβ鎖ポリペプチドである。いくつかの場合、該エピトープは、T細胞エピトープである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチド、IgG2 Fcポリペプチド、IgG3 Fcポリペプチド、IgG4 Fcポリペプチド、IgAFcポリペプチド、またはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、図24A〜24Cに示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、非共有結合的に会合している。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、共有結合的に連結されている。いくつかの場合、該共有結合はジスルフィド結合による。いくつかの場合、該第一のMHCポリペプチド、または該エピトープと該第一のMHCポリペプチドとの間のリンカーは第一のCys残基を提供するためのアミノ酸置換を含みかつ該第二のMHCポリペプチドは第二のCys残基を提供するためのアミノ酸置換を含み、かつ該ジスルフィド結合は該第一Cys残基と該第二のCys残基と間に存在する。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、該エピトープと該第一のMHCポリペプチドとの間に挿入された第一のリンカーを含む。いくつかの場合、該免疫調節ポリペプチドは、4−1BBLポリペプチド、B7−1ポリペプチド、B7−2ポリペプチド、ICOS−Lポリペプチド、OX−40Lポリペプチド、CD80ポリペプチド、CD86ポリペプチド、PD−L1ポリペプチド、FasLポリペプチド、及びPD−L2ポリペプチドから選択される。いくつかの場合、該第一のポリペプチドまたは該第二のポリペプチドは、2つ以上の免疫調節ポリペプチドを含む。いくつかの場合、該2つ以上の免疫調節ポリペプチドは、タンデムになっている。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、第三のポリペプチドを含み、該第三のポリペプチドは、該第一のポリペプチドの該免疫調節ポリペプチドに対する少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫調節ポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第三のポリペプチドは、該第一のポリペプチドに共有結合的に連結されている。いくつかの場合、該第二のポリペプチドは、N末端からC末端の順にi)該第二のMHCポリペプチド;ii)該免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチド;及びiii)親和性タグを含む。

0035

本開示は、a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;ii)第一のMHCポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)任意でIgFcポリペプチドまたは非Ig骨格を含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチドを提供し、該多量体ポリペプチドは任意で免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチドまたは非Ig骨格を含み、該多量体ポリペプチドは1つ以上の免疫調節ドメインを含み、該1つ以上の免疫調節ドメインは、A)該第一のポリペプチドのC末端に;B)該第二のポリペプチドのN末端に;C)該第二のポリペプチドのC末端に;またはD)該第一ポリペプチドのC末端及び該第二のポリペプチドのN末端に存在する。いくつかの場合、多量体ポリペプチドは、単一の免疫調節ポリペプチドを含む。いくつかの場合、多量体ポリペプチドは、2つの免疫調節ポリペプチド(例えば、同じ免疫調節ポリペプチドの2つのコピー)を含む。いくつかの場合、多量体ポリペプチドは、3つの免疫調節ポリペプチド(例えば、同じ免疫調節ポリペプチドの3つのコピー)を含む。いくつかの場合、多量体ポリペプチドは、4つの免疫調節ポリペプチド(例えば、同じ免疫調節ポリペプチドの4つのコピー)を含む。いくつかの場合、多量体ポリペプチドは、単一の免疫調節ポリペプチドを含む。いくつかの場合、多量体ポリペプチドは、2つの免疫調節ポリペプチド(例えば、同じ免疫調節ポリペプチドの2つのコピー)を含む。いくつかの場合、多量体ポリペプチドは、3つの免疫調節ポリペプチド(例えば、同じ免疫調節ポリペプチドの3つのコピー)を含む。いくつかの場合、多量体ポリペプチドは、4つの免疫調節ポリペプチド(例えば、同じ免疫調節ポリペプチドの4つのコピー)を含む。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;ii)第一のMHCポリペプチド;及びiii)免疫調節ドメインを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)Ig Fcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;及びii)第一のMHCポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)免疫調節ドメイン;iii)第二のMHCポリペプチド;及びii)免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;及びii)第一のMHCポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)Ig Fcポリペプチド;及びiii)免疫調節ドメインを含む第二のポリペプチドを含む。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;及びii)第一のMHCポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)免疫調節ドメインを含む第二のポリペプチドを含む。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;及びii)第一のMHCポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)免疫調節ドメイン;及びii)第二のMHCポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;ii)第一のMHCポリペプチド;及びiii)免疫調節ドメインを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む。いくつかの場合、該非Ig骨格は、XTENポリペプチド、トランスフェリンポリペプチド、Fc受容体ポリペプチド、エラスチン様ポリペプチドシルク様ポリペプチド、またはシルクエラスチン様ポリペプチドである。いくつかの場合、該第一のMHCポリペプチドは、β2ミクログロブリンポリペプチドであり;かつ該第二のMHCポリペプチドは、MHCクラスI重鎖ポリペプチドである。いくつかの場合、該β2ミクログロブリンポリペプチドは、SEQID NO:4に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、HLA−A、HLA−B、またはHLA−Cの重鎖である。いくつかの場合、該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、該第一のMHCポリペプチドは、MHCクラスIIα鎖ポリペプチドであり;かつ該第二のMHCポリペプチドは、MHCクラスIIβ鎖ポリペプチドである。いくつかの場合、該エピトープは、T細胞エピトープである。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、Fcポリペプチドを含み、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチド、IgG2 Fcポリペプチド、IgG3 Fcポリペプチド、IgG4 Fcポリペプチド、IgAFcポリペプチド、またはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、図24A〜24Cに示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、非共有結合的に会合している。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、共有結合的に連結されている。いくつかの場合、該共有結合はジスルフィド結合による。いくつかの場合、該第一のMHCポリペプチド、または該エピトープと該第一のMHCポリペプチドとの間のリンカー、第一のCys残基を提供するためのアミノ酸置換を含みかつ該第二のMHCポリペプチドは第二のCys残基を提供するためのアミノ酸置換を含み、かつ該ジスルフィド結合は該第一のCys残基と該第二のCys残基との間に存在する。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、該エピトープと該第一のMHCポリペプチドとの間に挿入された第一のリンカーを含む。いくつかの場合、該免疫調節ポリペプチドは、4−1BBLポリペプチド、B7−1ポリペプチド、B7−2ポリペプチド、ICOS−Lポリペプチド、OX−40Lポリペプチド、CD80ポリペプチド、CD86ポリペプチド、PD−L1ポリペプチド、FasLポリペプチド、及びPD−L2ポリペプチドから選択される。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、2つ以上の免疫調節ポリペプチドを含む。いくつかの場合、該2つ以上の免疫調節ポリペプチドは、タンデムになっている。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、第三のポリペプチドを含み、該第三のポリペプチドは、該第一のポリペプチドまたは該第二のポリペプチドの該免疫調節ポリペプチドに対する少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫調節ポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第三のポリペプチドは、該第一のポリペプチドに共有結合的に連結されている。いくつかの場合、該第二のポリペプチドは、N末端からC末端の順にi)該第二のMHCポリペプチド:ii)該Ig Fcポリペプチド;及びiii)親和性タグを含む。

0036

本開示は、本開示の多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供し;いくつかの場合、該核酸は、組み換え発現ベクター内に存在する。本開示は、組み換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供し、i)該組み換えポリペプチドは、N末端からC末端の順にa)エピトープ;b)第一のMHCポリペプチド;c)免疫調節ポリペプチド;d)タンパク質分解的に開裂可能なリンカー、もしくはリボソームスキッピングシグナル;e)第二のMHCポリペプチド;及びf)免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチドもしくは非Ig系骨格を含むか;またはii)該組み換えポリペプチドは、N末端からC末端の順にa)エピトープ;b)第一のMHCポリペプチド;c)タンパク質分解的に開裂可能なリンカー、もしくはリボソームスキッピングシグナル;d)免疫調節ポリペプチド;e)第二のMHCポリペプチド;及びf)Ig Fcポリペプチドもしくは非Ig系骨格を含む。いくつかの場合、該第一のMHCポリペプチドは、β2ミクログロブリンポリペプチドであり;かつ該第二のMHCポリペプチドは、MHCクラスI重鎖ポリペプチドである。いくつかの場合、該β2ミクログロブリンポリペプチドは、SEQID NO:4に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、HLA−A、HLA−B、またはHLA−Cの重鎖である。いくつかの場合、該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、該第一のMHCポリペプチドは、MHCクラスIIα鎖ポリペプチドであり;かつ該第二のMHCポリペプチドは、MHCクラスIIβ鎖ポリペプチドである。いくつかの場合、該エピトープは、T細胞エピトープである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチド、IgG2 Fcポリペプチド、IgG3 Fcポリペプチド、IgG4 Fcポリペプチド、IgAFcポリペプチド、またはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、図24A〜24Cに示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、該免疫調節ポリペプチドは、4−1BBLポリペプチド、B7−1ポリペプチド、B7−2ポリペプチド、ICOS−Lポリペプチド、OX−40Lポリペプチド、CD80ポリペプチド、CD86ポリペプチド、PD−L1ポリペプチド、FasLポリペプチド、及びPD−L2ポリペプチドから選択される。いくつかの場合、該免疫調節ポリペプチドは、CD7、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA−G、MICA、MICB、HVEMリンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、及びHVEMから選択される。いくつかの場合、該タンパク質分解的に開裂可能なリンカー、またはリボソームスキッピングシグナルは、

から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、該組み換えポリペプチドは、N末端からC末端の順にa)第一のリーダーペプチド;b)該エピトープ;c)該第一のMHCポリペプチド;d)該免疫調節ポリペプチド;e)該タンパク質分解的に開裂可能なリンカー、またはリボソームスキッピングシグナル;f)第二のリーダーペプチド;g)該第二のMHCポリペプチド;及びh)該免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のリーダーペプチド及び該第二のリーダーペプチドは、β2−Mリーダーペプチドである。いくつかの場合、該ヌクレオチド配列は、転写調節因子作動可能に連結されている。いくつかの場合、該転写調節因子は真核細胞中で機能的であるプロモーターである。いくつかの場合、該第一のMHCポリペプチド、または該エピトープと該第一のMHCポリペプチドとの間のリンカーは第一のCys残基を提供するためのアミノ酸置換を含みかつ該第二のMHCポリペプチドは第二のCys残基を提供するためのアミノ酸置換を含み、かつ該第一のCys残基及び該第二のCys残基は、該第一のMHCポリペプチドと該第二のMHCポリペプチドとの間にジスルフィド結合を提供する。本開示は、上述または本明細書の他の場所に記載の核酸のいずれか1つを含む組み換え発現ベクターを提供する。いくつかの場合、該組み換え発現ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの場合、該組み換え発現ベクターは、非ウイルスベクターである。本開示は、上述または本開示の他の場所に記載の組み換え発現ベクターによって遺伝子改変された宿主細胞を提供する。いくつかの場合、該宿主細胞はインビトロである。いくつかの場合、該宿主細胞は、該細胞が内因性MHCβ2ミクログロブリンポリペプチドを産生しないように遺伝子改変される。いくつかの場合、該宿主細胞はTリンパ球である。

0037

本開示は、a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;ii)第一のMHCポリペプチド;及びiii)免疫調節ドメインを含む第一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸;並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)IgFcポリペプチドまたは非Ig系骨格を含む第二のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸を含む、組成物を提供する。本開示は、a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;及びii)第一のMHCポリペプチドを含む第一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸;並びにb)N末端からC末端の順にi)免疫調節ドメイン;ii)第二のMHCポリペプチド;及びiii)Ig Fcポリペプチドを含む第二のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸を含む、組成物を提供する。いくつかの場合、該第一の核酸及び/または該第二の核酸は、組み換え発現ベクター内に存在する。本開示は、上述または本開示の他の場所に記載の核酸組成物によって遺伝子改変された宿主細胞を提供する。

0038

本開示は、上述または本開示の他の場所に記載の多量体ポリペプチドを産生する方法であって;a)該宿主細胞が該多量体ポリペプチドを合成するような条件下で、上述または本開示の他の場所に記載の宿主細胞を培地中のインビトロで培養する段階;ならびにb)該宿主細胞から及び/または該培地から該多量体ポリペプチドを単離する段階を含む、方法を提供する。いくつかの場合、該第二のポリペプチドは親和性タグを含み、かつ、該単離する段階は、該細胞によって産生された該多量体ポリペプチドを該親和性タグの結合パートナーと接触させることを含み、ここで、該結合パートナーは固定化されており、それによって該多量体ポリペプチドを固定化する。いくつかの場合、本方法は該固定化された多量体ポリペプチドを溶出する段階を含む。

0039

本開示は、エピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節する方法であって、該T細胞を、上述または本開示の他の場所に記載の多量体ポリペプチドと接触させる段階を含み、該接触させる段階が、該エピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節する、方法を提供する。いくつかの場合、該免疫調節ポリペプチドは活性化ポリペプチドであり、かつ該多量体ポリペプチドは該エピトープ特異的T細胞を活性化する。いくつかの場合、該免疫調節ポリペプチドは、阻害性ポリペプチドであり、かつ該多量体ポリペプチドは該エピトープ特異的T細胞を阻害する。いくつかの場合、該接触させる段階はインビトロで行われる。いくつかの場合、該接触させる段階はインビボで行われる。

0040

本開示は、個体におけるエピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節する方法であって、該個体に、個体におけるエピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節するのに有効な上述または本開示の他の場所に記載の効果的な多量体ポリペプチドの有効量を投与する段階を含む、方法を提供する。いくつかの場合、該免疫調節ポリペプチドは、活性化ポリペプチドであり、該多量体ポリペプチドは該エピトープ特異的T細胞を活性化する。いくつかの場合、該エピトープはがん関連エピトープであり、該投与する段階は、該がん関連エピトープに特異的なT細胞の活性を選択的に増大させる。いくつかの場合、該免疫調節ポリペプチドは、阻害性ポリペプチドであり、該多量体ポリペプチドは該エピトープ特異的T細胞の活性を阻害する。いくつかの場合、該エピトープは自己エピトープであり、該投与する段階は、該自己エピトープに特異的なT細胞の活性を選択的に阻害する。

0041

本開示は、個体における感染症を治療する方法であって、該個体に、有効量のa)上述もしくは本開示の他の場所に記載の多量体ポリペプチド;またはb)該多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む1つ以上の組み換え発現ベクター;もしくはc)該多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む1つ以上のmRNAを投与する段階を含み、該エピトープが病原体関連エピトープであり、該免疫調節ポリペプチドが活性化ポリペプチドであり、該投与する段階が、個体において病原体関連エピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節するのに有効である、方法を提供する。いくつかの場合、該病原体は、ウイルス、細菌、または原生動物である。いくつかの場合、該投与する段階は皮下投与である(すなわち、該投与する段階は皮下投与で行われる)。いくつかの場合、該投与する段階は静脈内投与である(すなわち、該投与する段階は静脈内投与で行われる)。いくつかの場合、該投与する段階は筋肉内投与である(すなわち、該投与する段階は筋肉内投与で行われる)。いくつかの場合、該投与する段階は全身投与である。いくつかの場合、該投与する段階は、治療部位に対して遠位の投与である(すなわち、該投与する段階は皮下投与で行われる)。該投与する段階は局所投与である(すなわち、該投与する段階は皮下投与で行われる)。該投与する段階は治療部位または治療部位近傍での投与である。

0042

本開示は、a)上述または本開示の他の場所に記載の多量体ポリペプチド;及びb)薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。

0043

本開示は、a)上述もしくは本開示の他の場所に記載の核酸、または上述もしくは本明細書の他の場所に記載の組み換え発現ベクター;及びb)薬学的に許容される賦形剤を含む組成物を提供する。
[本発明1001]
a)N末端からC末端の順に
i)エピトープ;
ii)第一の主要組織適合複合体(MHC)ポリペプチド
を含む第一のポリペプチド、並びに
b)N末端からC末端の順に
i)第二のMHCポリペプチド;及び
ii)任意で免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチドまたは非Ig骨格
を含む第二のポリペプチド
を含み、
A)前記第一のポリペプチドのC末端に;
B)前記第二のポリペプチドのN末端に;
C)前記第二のポリペプチドのC末端に;または
D)前記第一ポリペプチドのC末端及び前記第二のポリペプチドのN末端に
存在する1つ以上の免疫調節ドメインを含む、多量体ポリペプチド。
[本発明1002]
a)N末端からC末端の順に
i)エピトープ;
ii)第一のMHCポリペプチド;及び
iii)免疫調節ドメイン
を含む第一のポリペプチド、並びに
b)N末端からC末端の順に
i)第二のMHCポリペプチド;及び
ii)Ig Fcポリペプチド
を含む第二のポリペプチド
を含む、本発明1001の多量体ポリペプチド。
[本発明1003]
a)N末端からC末端の順に
i)エピトープ;及び
ii)第一のMHCポリペプチド
を含む第一のポリペプチド、並びに
b)N末端からC末端の順に
i)免疫調節ドメイン;
iii)第二のMHCポリペプチド;及び
ii)免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチド
を含む第二のポリペプチド
を含む、本発明1001の多量体ポリペプチド。
[本発明1004]
a)N末端からC末端の順に
i)エピトープ;及び
ii)第一のMHCポリペプチド
を含む第一のポリペプチド、並びに
b)N末端からC末端の順に
i)第二のMHCポリペプチド;及び
ii)Ig Fcポリペプチド;及び
iii)免疫調節ドメイン
を含む第二のポリペプチド
を含む、本発明1001の多量体ポリペプチド。
[本発明1005]
a)N末端からC末端の順に
i)エピトープ;及び
ii)第一のMHCポリペプチド
を含む第一のポリペプチド、並びに
b)N末端からC末端の順に
i)第二のMHCポリペプチド;及び
ii)免疫調節ドメイン
を含む第二のポリペプチド
を含む、本発明1001の多量体ポリペプチド。
[本発明1006]
a)N末端からC末端の順に
i)エピトープ;及び
ii)第一のMHCポリペプチド
を含む第一のポリペプチド、並びに
b)N末端からC末端の順に
i)免疫調節ドメイン;及び
ii)第二のMHCポリペプチド
を含む第二のポリペプチド
を含む、本発明1001の多量体ポリペプチド。
[本発明1007]
a)N末端からC末端の順に
i)エピトープ;
ii)第一のMHCポリペプチド;及び
iii)免疫調節ドメイン
を含む第一のポリペプチド、並びに
b)N末端からC末端の順に
i)第二のMHCポリペプチド
を含む第二のポリペプチド
を含む、本発明1001の多量体ポリペプチド。
[本発明1008]
前記非Ig骨格が、XTENポリペプチド、トランスフェリンポリペプチド、Fc受容体ポリペプチド、エラスチン様ポリペプチド、シルク様ポリペプチド、またはシルクエラスチン様ポリペプチドである、本発明1001の多量体ポリペプチド。
[本発明1009]
前記第一のMHCポリペプチドがβ2ミクログロブリンポリペプチドであり;かつ前記第二のMHCポリペプチドがMHCクラスI重鎖ポリペプチドである、本発明1001から1008のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1010]
前記β2ミクログロブリンポリペプチドが、SEQID NO:4に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1009の多量体ポリペプチド。
[本発明1011]
前記MHCクラスI重鎖ポリペプチドが、HLA−A、HLA−B、またはHLA−Cの重鎖である、本発明1008の多量体ポリペプチド。
[本発明1012]
前記MHCクラスI重鎖ポリペプチドが、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1009の多量体ポリペプチド。
[本発明1013]
前記第一のMHCポリペプチドが、MHCクラスIIα鎖ポリペプチドであり;かつ前記第二のMHCポリペプチドが、MHCクラスIIβ鎖ポリペプチドである、本発明1001から1008のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1014]
前記エピトープがT細胞エピトープである、本発明1001から1008のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1015]
Fcポリペプチドを含み、かつ、前記Ig Fcポリペプチドが、IgG1 Fcポリペプチド、IgG2 Fcポリペプチド、IgG3 Fcポリペプチド、IgG4 Fcポリペプチド、IgAFcポリペプチド、またはIgMFcポリペプチドである、本発明1001から1007のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1016]
前記Ig Fcポリペプチドが、図24A〜24Cに示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1015の多量体ポリペプチド。
[本発明1017]
前記第一のポリペプチド及び前記第二のポリペプチドが非共有結合的に会合している、本発明1001から1008のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1018]
前記第一のポリペプチド及び前記第二のポリペプチドが共有結合的に連結されている、本発明1001から1008のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1019]
前記共有結合がジスルフィド結合による、本発明1013の多量体ポリペプチド。
[本発明1020]
前記第一のMHCポリペプチド、または前記エピトープと前記第一のMHCポリペプチドとの間のリンカーが、第一のCys残基を提供するためのアミノ酸置換を含み、かつ前記第二のMHCポリペプチドが、第二のCys残基を提供するためのアミノ酸置換を含み、かつ、前記ジスルフィド結合が前記第一のCys残基と前記第二のCys残基との間に存在する、本発明1019の多量体ポリペプチド。
[本発明1021]
前記エピトープと前記第一のMHCポリペプチドとの間に挿入された第一のリンカーを含む、本発明1001から1008のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1022]
前記免疫調節ポリペプチドが、4−1BBLポリペプチド、B7−1ポリペプチド、B7−2ポリペプチド、ICOS−Lポリペプチド、OX−40Lポリペプチド、CD80ポリペプチド、CD86ポリペプチド、PD−L1ポリペプチド、FasLポリペプチド、及びPD−L2ポリペプチドから選択される、本発明1001から1008のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1023]
2つ以上の免疫調節ポリペプチドを含む、本発明1001から1008のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1024]
前記2つ以上の免疫調節ポリペプチドがタンデムになっている、本発明1023の多量体ポリペプチド。
[本発明1025]
第三のポリペプチドを含み、前記第三のポリペプチドが、前記第一のポリペプチドまたは前記第二のポリペプチドの前記免疫調節ポリペプチドに対する少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む免疫調節ポリペプチドを含む、本発明1001から1008のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1026]
前記第三のポリペプチドが、前記第一のポリペプチドに共有結合的に連結されている、本発明1025の多量体ポリペプチド。
[本発明1027]
前記第二のポリペプチドが、N末端からC末端の順に
i)前記第二のMHCポリペプチド;
ii)前記Ig Fcポリペプチド;及び
iii)親和性タグ
を含む、本発明1001から1007のいずれかの多量体ポリペプチド。
[本発明1028]
i)組み換えポリペプチドが、N末端からC末端の順に
a)エピトープ;
b)第一の主要組織適合複合体(MHC)ポリペプチド;
c)免疫調節ポリペプチド;
d)タンパク質分解的に開裂可能なリンカー、もしくはリボソームスキッピングシグナル;
e)第二のMHCポリペプチド;及び
f)免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチド
を含むか、または
ii)前記組み換えポリペプチドが、N末端からC末端の順に
a)エピトープ;
b)第一のMHCポリペプチド;
c)タンパク質分解的に開裂可能なリンカー、もしくはリボソームスキッピングシグナル;
d)免疫調節ポリペプチド;
e)第二のMHCポリペプチド;及び
f)Ig Fcポリペプチド
を含む、
前記組み換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
[本発明1029]
前記第一のMHCポリペプチドがβ2ミクログロブリンポリペプチドであり;かつ前記第二のMHCポリペプチドがMHCクラスI重鎖ポリペプチドである、本発明1028の核酸。
[本発明1030]
前記β2ミクログロブリンポリペプチドが、SEQ ID NO:4に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1029の核酸。
[本発明1031]
前記MHCクラスI重鎖ポリペプチドが、HLA−A、HLA−B、またはHLA−Cの重鎖である、本発明1028の核酸。
[本発明1032]
前記MHCクラスI重鎖ポリペプチドが、SEQ ID NO:5に示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1031の核酸。
[本発明1033]
前記第一のMHCポリペプチドがMHCクラスIIα鎖ポリペプチドであり;かつ前記第二のMHCポリペプチドがMHCクラスIIβ鎖ポリペプチドである、本発明1028の核酸。
[本発明1034]
前記エピトープがT細胞エピトープである、本発明1028の核酸。
[本発明1035]
前記Ig Fcポリペプチドが、IgG1 Fcポリペプチド、IgG2 Fcポリペプチド、IgG3 Fcポリペプチド、IgG4 Fcポリペプチド、IgA Fcポリペプチド、またはIgM Fcポリペプチドである、本発明1028の核酸。
[本発明1036]
前記Ig Fcポリペプチドが、図24A〜24Cに示すアミノ酸配列に対する少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、本発明1035の核酸。
[本発明1037]
前記免疫調節ポリペプチドが、4−1BBLポリペプチド、B7−1ポリペプチド、B7−2ポリペプチド、ICOS−Lポリペプチド、OX−40Lポリペプチド、CD80ポリペプチド、CD86ポリペプチド、PD−L1ポリペプチド、FasLポリペプチド、及びPD−L2ポリペプチドから選択される、本発明1028の核酸。
[本発明1038]
前記免疫調節ポリペプチドが、CD7、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA−G、MICA、MICB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、及びHVEMから選択される、本発明1027の核酸。
[本発明1039]
前記タンパク質分解的に開裂可能なリンカーまたは前記リボソームスキッピングシグナルが、

から選択されるアミノ酸配列を含む、本発明1028の核酸。
[本発明1040]
前記組み換えポリペプチドが、N末端からC末端の順に
a)第一のリーダーペプチド;
b)前記エピトープ;
c)前記第一のMHCポリペプチド;
d)前記免疫調節ポリペプチド;
e)前記タンパク質分解的に開裂可能なリンカーまたは前記リボソームスキッピングシグナル;
f)第二のリーダーペプチド;
g)前記第二のMHCポリペプチド;及び
h)前記免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチド
を含む、本発明1028の核酸。
[本発明1041]
前記第一のリーダーペプチド及び前記第二のリーダーペプチドがβ2−Mリーダーペプチドである、本発明1040の核酸。
[本発明1042]
前記ヌクレオチド配列が転写調節因子に作動可能に連結されている、本発明1028の核酸。
[本発明1043]
前記転写調節因子が、真核細胞中で機能的であるプロモーターである、本発明1042の核酸。
[本発明1044]
前記第一のMHCポリペプチド、または前記エピトープと前記第一のMHCポリペプチドとの間のリンカーが、第一のCys残基を提供するためのアミノ酸置換を含み、かつ前記第二のMHCポリペプチドが、第二のCys残基を提供するためのアミノ酸置換を含み、かつ、前記第一のCys残基及び前記第二のCys残基が、前記第一のMHCポリペプチドと前記第二のMHCポリペプチドとの間にジスルフィド結合を提供する、本発明1028の核酸。
[本発明1045]
本発明1028から1044のいずれかの核酸を含む、組み換え発現ベクター。
[本発明1046]
ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、本発明1045の組み換え発現ベクター。
[本発明1047]
本発明1045の組み換え発現ベクターによって遺伝子改変された宿主細胞。
[本発明1048]
インビトロである、本発明1047の宿主細胞。
[本発明1049]
内因性MHCβ2ミクログロブリンポリペプチドを産生しないように遺伝子改変されている、本発明1047の宿主細胞。
[本発明1050]
Tリンパ球である、本発明1047の宿主細胞。
[本発明1051]
a)N末端からC末端の順に
i)エピトープ;
ii)第一のMHCポリペプチド;及び
iii)免疫調節ドメイン
を含む第一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸;並びに
b)N末端からC末端の順に
i)第二のMHCポリペプチド;及び
ii)Ig Fcポリペプチド
を含む第二のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸
を含む、組成物。
[本発明1051]
a)N末端からC末端の順に
i)エピトープ;及び
ii)第一のMHCポリペプチド
を含む第一のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸;並びに
b)N末端からC末端の順に
i)免疫調節ドメイン
ii)第二のMHCポリペプチド;及び
iii)Ig Fcポリペプチド
を含む第二のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む第一の核酸
を含む、組成物。
[本発明1053]
前記第一の核酸及び/または前記第二の核酸が組み換え発現ベクター内に存在する、本発明1051または1052の組成物。
[本発明1054]
本発明1051から1053のいずれかの組成物によって遺伝子改変された宿主細胞。
[本発明1055]
a)47または54の宿主細胞が本発明1001の多量体ポリペプチドを合成するような条件下で、前記宿主細胞を培地中のインビトロで培養する段階;ならびに
b)前記宿主細胞から及び/または前記培地から前記多量体ポリペプチドを単離する段階
を含む、前記多量体ポリペプチドを産生する方法。
[本発明1056]
前記第二のポリペプチドが親和性タグを含み、かつ、前記単離する段階が、前記細胞によって産生された前記多量体ポリペプチドを前記親和性タグの結合パートナーと接触させることを含み、ここで前記結合パートナーが固定化されており、それによって前記多量体ポリペプチドを固定化する、本発明1055の方法。
[本発明1057]
固定化された前記多量体ポリペプチドを溶出する段階を含む、本発明1055の方法。
[本発明1058]
エピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節する方法であって、前記T細胞を、本発明1001の多量体ポリペプチドと接触させる段階を含み、前記接触させる段階が、前記エピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節する、方法。
[本発明1059]
前記免疫調節ポリペプチドが活性化ポリペプチドであり、かつ前記多量体ポリペプチドが前記エピトープ特異的T細胞を活性化する、本発明1058の方法。
[本発明1060]
前記免疫調節ポリペプチドが阻害ポリペプチドであり、かつ前記多量体ポリペプチドが前記エピトープ特異的T細胞を阻害する、本発明1058の方法。
[本発明1061]
前記接触させる段階がインビトロである、本発明1058の方法。
[本発明1062]
前記接触させる段階がインビボである、本発明1058の方法。
[本発明1063]
個体におけるエピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節する方法であって、前記個体に、個体におけるエピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節するのに有効な本発明1001の多量体ポリペプチドの有効量を投与する段階を含む、方法。
[本発明1064]
前記免疫調節ポリペプチドが活性化ポリペプチドであり、かつ前記多量体ポリペプチドが前記エピトープ特異的T細胞を活性化する、本発明1063の方法。
[本発明1065]
前記エピトープががん関連エピトープであり、かつ前記投与する段階が、前記がん関連エピトープに特異的なT細胞の活性を選択的に増大させる、本発明1064の方法。
[本発明1066]
前記免疫調節ポリペプチドが阻害性ポリペプチドであり、かつ前記多量体ポリペプチドが前記エピトープ特異的T細胞の活性を阻害する、本発明1063の方法。
[本発明1067]
前記エピトープが自己エピトープであり、かつ前記投与する段階が、前記自己エピトープに特異的なT細胞の活性を選択的に阻害する、本発明1066の方法。
[本発明1068]
個体における感染症を治療する方法であって、前記個体に、有効量の
a)本発明1001の多量体ポリペプチド;または
b)本発明1001の多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む1つ以上の組み換え発現ベクター;もしくは
c)本発明1001の多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む1つ以上のmRNA
を投与する段階を含み、
前記エピトープが病原体関連エピトープであり、前記免疫調節ポリペプチドが活性化ポリペプチドであり、かつ前記投与する段階が、個体において病原体関連エピトープ特異的T細胞の活性を選択的に調節するのに有効である、方法。
[本発明1069]
前記病原体がウイルス、細菌、または原生動物である、本発明1068の方法。
[本発明1070]
前記投与する段階が皮下投与である、本発明1063から1068のいずれかの方法。
[本発明1071]
前記投与する段階が静脈内投与である、本発明1063から1068のいずれかの方法。
[本発明1072]
前記投与する段階が筋肉内投与である、本発明1063から1068のいずれかの方法。
[本発明1073]
前記投与する段階が全身投与である、本発明1063から1068のいずれかの方法。
[本発明1074]
前記投与する段階が治療部位に対して遠位の投与である、本発明1063から1068のいずれかの方法。
[本発明1075]
前記投与する段階が局所投与である、本発明1063から1068のいずれかの方法。
[本発明1076]
前記投与する段階が治療部位または治療部位近傍での投与である、本発明1063から1068のいずれかの方法。
[本発明1077]
a)本発明1001から1027のいずれかの多量体ポリペプチド;及び
b)薬学的に許容される賦形剤
を含む組成物。
[本発明1078]
a)本発明1028から1034のいずれかの核酸、または本発明1045もしくは1046の組み換え発現ベクター;及び
b)薬学的に許容される賦形剤
を含む組成物。

図面の簡単な説明

0044

synTac:T細胞活性化用の人工免疫学的シナプスである。パネルの左側は従来のT細胞活性化のための2シグナル仮説を示す。すなわち、T細胞と抗原提示細胞(APC)間の独自のTCR:MHC−エピトープ相互作用を介した標的T細胞の結合と、それに続く共刺激分子の結合を介した刺激または阻害である。中央のパネルは、synTac分子の略図であり、synTacに対する作用機序(右)へと続く。天然の応答(左)と類似して、synTac融合タンパク質は、MHC−エピトープを介した高度に特異的な細胞の標的化を可能にする。これに続くのはT細胞調節ドメイン(「MOD」)であり、これは共刺激分子の結合を介して作用し、活性化または阻害のどちらかをもたらすことができる。これは、T細胞全体ではなくクローン性の応答を誘発する。特に、MODは、任意の既知のまたは認可された抗体、抗体フラグメント、共刺激分子、もしくは文献で確認された他のペイロード(サイトカイン、毒素等)ならびに新規なものでありうる。
図2A〜2Cは、synTacのFc融合構築物である。1つのストラテジーでは、Fc融合構築物を用いて関連生成物結合価、安定性、及び治療域を増大させる。簡潔に言えば、Fc領域は天然の共有結合ホモ量体であり、2つの同一の免疫グロブリンCH2−CH3ドメイン(Fcと呼ばれる)の相互作用によって形成され、2つの細い線で示すCH2ドメイン間の2つのジスルフィド結合によって安定化される。図2Aは、IgGのFc領域にカルボキシル末端で連結された一本鎖ペプチドのMHCタンパク質を示す。代替タンパク質(MOD等)連結を導入するため、この構築物は、それぞれの重鎖及び軽鎖に分割され、ペプチド及びタンパク質の両方を別々の末端に融合させる。1つの構築物、すなわち、図2Bは、軽鎖(β2ミクログロブリン、B2M)への該ペプチドのアミノ末端結合と、それに続くMODエフェクター分子への該軽鎖のカルボキシル末端延長をもたらす。このシナリオでは、重鎖(HLA分子、HC)がFc領域に融合される。構築物はジスルフィド架橋(S−Sと表示される)を介して共有結合的にくっついている。別の配向、すなわち、図2Cは、該MODをFc融合重鎖のアミノ末端に付け、該ペプチドはB2Mの軽鎖に依然として連結されている。
図3A〜3Bは、2つの基礎となるsynTac分子の全体的な構造設計である。この構築物は天然のヒトB2Mリーダー配列(LEADER)を用いて、効率的な分泌とERプロセッシングを可能にし、直後に候補エピトープ(PEPTIDEと表示)が続く。軽鎖連結(LC、図3A)については、これは、リンカーL1を介して天然B2M分子に、さらにリンカーL2を介してMODにつながれる。この全カセットは、別のB2Mリーダー配列、MHCの重鎖、及びIgG1のFcドメインに、ウイルスのブタテッショウウイルス‐1(P2A)「自己開裂」ペプチドによって連結されて、各鎖の化学量論的発現を可能にする。重鎖(HC、図3B)連結は、同様であるが、ウイルスP2Aペプチドがこの場合B2Mに続き、かつMODは第二のリーダーペプチドに続く。両方の構築物は、8xHisタグで終わる。
RISPR/CASによる内因性β2ミクログロブリンのノックアウトである。ガイドRNAは、内因性B2Mに対して設計し、CRISPR/CASをコードするプラスミドとともに導入し、3日間培養した。培養細胞をB2Mについて表面染色し、蛍光活性化細胞分類FACS)によって対抗選択蛍光損失分類)した。分類した細胞を回復させ、さらに2回の染色、対抗分類、及び回復の巡回(全部で3回)に供し、有効なノックアウトを確実にした。最終的なプールは、上記したFACSによるB2M表面発現を観察することで品質チェックした。
図5A〜5Bは、操作されたジスルフィド結合を有するsynTac構築物の生成及び活性試験である。高レベルの発現が1つの構築物(H236−L12、synTac18と表示)で、適度の発現が2番目(H237−L12、synTac17)で示された。dt−SCTジスルフィドスキーマを正の対照として用いる(synTac2と表示)。非還元PAGEにより、高分子量、すなわちジスルフィド結合された部分が予想通り形成されたことが示唆された(図5A)。すべての発現構築物を100ml規模にスケールアップし、精製し、HEK細胞表面で発現される同族TCR(A6と呼ばれる)の結合によって活性試験し、FACS蛍光によって観察されるように、適切な折りたたみと活性が示唆された(図5B)。非同族TCR(AS01と呼ばれる)を発現する細胞は負の対照として用いた。
図6A〜6Bは、各種synTacタンパク質融合の発現である。(図6A)軽鎖連結synTacの各種標的化ペプチド及び、PD−L1のMODドメイン、特に1)HTLVヒトHLA−A02、2)IGRPマウスH2−Kd、及び3)TUMマウスH2−Kdを有するHLAアイソタイプとの融合、(図6B)各種MODドメイン、すなわち4)PD−L1のIg可変ドメイン、5)4−1BBL、6)抗CD28一本鎖Fv、及び7)B7−1W88Aを有するIGRP系synTac融合、(図6C)各種MOD、すなわち8)PD−L1及び9)抗CD28一本鎖Fvを有する重鎖連結として発現するIGRP系synTac融合の発現の達成。
図7A〜7Bは、TCR−synTac−PD1架橋であり、synTacタンパク質成分完全性を検証する。同族TCR(A6)を発現するHEK細胞を正の対照として用い、また、非同族TCR(AS01)を発現する細胞を生成し、形質導入していない親細胞とともに負の対照として用いた。細胞に、非蛍光精製HTLV−PD−L1synTac変異体負荷し、この細胞をマウスIgG2aと融合したその同族受容体PD1とともに培養した。PD1−Fc融合は、FITC標識抗マウス二次抗体を用いて検出した。反応の概略図を図7Aに示し、FACsの結果を図7Bに示す。予想通り、共局在化蛍光は、PD−L1MODを有するHTLV提示synTacが同族(A6)HEK細胞株に対して投与された場合に観察されたのみであった。注目すべきは、非同族TCRを有するHEK細胞または親細胞に対して投与した場合、すなわち、FITC−PD1−Fcのみに対して投与した場合、もしくはMODが存在しなかった場合に、これは観察されなかった。
図8A〜8Dは、作用時のsynTac:インビトロT細胞アッセイである。8.3トランスジェニックNODマウス由来のCD8+T細胞を固定化抗CD3抗体の存在下で培養し、ポリクローナルT細胞活性化を刺激した。刺激された培養物は、可溶性型のsynTac TUM−PD−L1(図8A)またはsynTac IGRP−PD−L1(図8C)のどちらかで処理し、任意の抑制効果抗原特異性を調べた。PD−L1のないsynTac IGRP型(図8B)は、MODドメインに対するエフェクターの対照としての役割を果たした。播種の前に、T細胞活性化で誘導される細胞増殖の程度を観察するためにカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で細胞を標識化した。細胞は5日目に採取し、フローサイトメトリーを用いて生存率と増殖を調べた。上清もまた、CD8+T細胞エフェクターサイトカインのIFNγ及びTNFαの発現について、多重化フローサイトメトリービーズアッセイを用いて調べた。調べたすべてのCD8+T細胞活性化パラメータは、抗原特異的かつエフェクター(すなわち、MOD)ドメイン依存的に抑制された(図8D)。
図9AはsynTacポリペプチドのアミノ酸配列及びドメイン構造を示す。
図9BはsynTacポリペプチドのアミノ酸配列及びドメイン構造を示す。
図9CはsynTacポリペプチドのアミノ酸配列及びドメイン構造を示す。
図9DはsynTacポリペプチドのアミノ酸配列及びドメイン構造を示す。
図9EはsynTacポリペプチドのアミノ酸配列及びドメイン構造を示す。
図9FはsynTacポリペプチドのアミノ酸配列及びドメイン構造を示す。
図10A〜10Cは、4−1BBL3量体発現のための構築物を示す。(図10A)膜近位(Memb Prox、MP)及びTNF相同(TNF−H)ドメインを示す天然4−1BBL外部ドメイン(残基50〜254)の単量体型、(図10B)4−1BBL2量体synTac、及び(図10C)従来型のsynTac構築物と、親和性タグを持たない4−1BBL外部ドメイン(残基50〜254、図10A)の「遊離」型の共発現によって生成される4−1BBLsynTacの完全活性二重3量体型素描表現。すべての構築物は、哺乳類の細胞でともに発現される時に集合する。精製はFc領域(プロテインA/G)を通過し、その後サイズ排除が続き、遊離のBBLから4−1BBL3量体synTacの分離を可能にする。
図11A〜11Bは、synTacタンパク質を有する3量体4−1BBLの多角度光散乱(MALS分析である。(図11A)複数の独立した測定の例を示すMALSで特定された主要な種類の分子量。(図11B)比較的高レベルの光散乱及び低UV吸収のsynTac40+51のMALSからの代表的トレースであり、少量の高分子量タンパク質の存在を反映している。低分子量の緩衝剤成分は、UV吸光度の変化を伴わずに屈折率に大きな変化(正または負のどちらか)をもたらす。
synTac4−1BBL受容体結合である。プロテインAのマイクロビーズ飽和状態まで組み換えヒトまたはマウス4−1BB−Fc融合タンパク質被覆して用い、共調節ドメインとして4−1BBリガンド(2量体及び3量体)を有するsynTac構築物、続いて該synTacの重鎖アイソタイプに特異的な蛍光検出抗体を結合した。synTac4−1BBLのビーズ付き4−1BBへの特異的結合の程度をその後ハイスループットフローサイトメトリーで測定した。この系を用いて、ヒト及びマウスの4−1BBの両方に対する4−1BBLの交差反応性及び相対的親和性の程度を該synTac骨格の中で調査した。4−1BBLを有するsynTacは、同族受容体と結合し、「受容体のない」(MODなしと呼ばれる)Fc結合マイクロビーズと結合しないことが示され、十分に折りたたまれた活性タンパク質試薬を示唆した。特に、該3量体は二重3量体結合に対して予期される親和性範囲で結合したが、元の2量体は、結合親和性における10分の1の減少を示し、すべての構築物はマウス及びヒト受容体間で交差反応する。
8.3トランスジェニックNODマウス由来のCD8+T細胞を固定化抗CD3抗体の存在下培養し、ポリクローナルT細胞活性化を刺激した。刺激された培養物は、可溶性型のsynTac TUM−41BBL(A)またはsynTac IGRP−41BBL(B及びC)のどちらかで処理し、任意の刺激効果の抗原特異性を調べた。対照の処理は培地のみ(−CNTRL)または固定化抗CD3(+CNTRL)で、反応の大きさの判断基準とした。細胞は、T細胞活性化で誘導される細胞増殖の程度を観察するためにカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識化した。4日後、細胞を採取し、フローサイトメトリーを用いて生存率及び増殖について調べた。上清もまた、CD8+T細胞エフェクターサイトカインのIFNγ及びTNFαの発現について、多重化フローサイトメトリー系ビーズアッセイを用いて調べた。調べたすべてのCD8+T細胞活性化パラメータは、抗原特異的かつエフェクター(すなわち、MOD)ドメイン依存的に活性化された。
単回投与インビボT細胞刺激アッセイである。NODマウスに、synTac IGRP−41BBL、synTac TUM−41BBL、またはPBS腹腔内注射した。注射の6日後、これらマウスを殺処分し、適切なペプチド‐MHC5量体染色を用いて、IGRP特異的CD8T細胞の相対頻度について、脾細胞をフローサイトメトリーで調べた。IGRP−41BBL処理は、IGRP特異的CD8T細胞の頻度を対照に対してはるかに高くし、単回投与がもたらすインビボでの有意な増加を裏付けた。
複数回投与インビボT細胞刺激アッセイである。NODマウスに、synTac IGRP−41BBL、synTac TUM−41BBL、またはPBSを2週間にわたって3回腹腔内注射した。注射の7日後、これらマウスを殺処分し、適切なペプチド‐MHC5量体染色を用いて、IGRP特異的CD8T細胞の相対頻度について、PBMC血液由来)をフローサイトメトリーで調べた。IGRP−41BBL処理は、IGRP特異的CD8T細胞の頻度を対照に対して高くし、まれな腫瘍に特異的なT細胞(TUM)を含めて、複数回投与がもたらすインビボでの有意な増加を裏付けた。
図16A〜16Bは、4−1BBL3量体発現に関して最適化された構築物の概略図である。ジスルフィド固定(図16A、DL)及び一本鎖3量体(図16B、SCT)。
synTac4−1BBL受容体結合である。プロテインAのマイクロビーズを飽和状態まで組み換えヒトまたはマウス4−1BB−Fc融合タンパク質で被覆して用い、補助調節ドメインとして4−1BBリガンド(ジスルフィド固定3量体(69、70、及び71)並びに一本鎖3量体(SCT)を有するsynTac構築物、続いて該synTacの重鎖アイソタイプに特異的な蛍光検出抗体を結合した。示した天然の3量体は結合の対照(3量体)である。synTac4−1BBLのビーズ付き4−1BBへの特異的結合の程度をその後ハイスループットフローサイトメトリーで測定した。4−1BBLを有するsynTacは、同族受容体を結合し、「受容体のない」(「MODなし」と呼ばれる)Fc結合マイクロビーズを結合しないことが示され、十分に折りたたまれた活性タンパク質試薬を示唆した。すべての構築物はマウス及びヒト受容体間で交差反応する。
最適化4−1BBL構築物の発現の検証である。元の4−1BBLモジュレーター(synTac40/51、ジスルフィド固定なし、「O」(元の(original))と表示)及び3量体のコンフォメーション拘束する操作されたジスルフィド固定を含む3つの最適化構築物との共発現によるsynTac産物。各構築物の2つの天然残基をシステイン残基置換し(Q94C:P245C(ゲル中、「DL1」と表示)、Q94C:P242C「DL2」、及びQ89C:L115C「DL3」、それぞれsynTac69、70、及び71と呼ぶ)、ヒト細胞中、同じ変異を有する「遊離」非タグ型(それぞれ98、99、100と呼ばれる)と共発現させ、該細胞中で共有結合的固定を可能にした。ジスルフィド結合度は、非還元SDS−PAGE分析において、放出された(非共有結合的結合)「遊離」4−1BBLの量によって観察した。遊離BBLは約20kDa(囲み)に移動するので、遺伝子操作された構築物のジスルフィド固定を確認する。4−1BBLの一本鎖3量体型(SCT)を担持するsynTacも、アフィニティー及びゲルろ過精製の後に示される(「SCT」と表示)。正確な質量が多角度光散乱(MALS)によって確認される。
図19A〜19Iは、本開示のsynTac構築物の実施形態の概要図である。図19A〜19Cは、それぞれ図2A〜2Cに関して説明される構築物を示す;図19B及び19Cでは、P2Aが未開裂のポリペプチドが示され(上部)、さらに開裂されたポリペプチド(P2A介在自己開裂を通して)がジスルフィド結合(SS)とともに示され(下部)、図示されたシステイン置換(*)によって仲介される。図19D〜19Fは、それぞれ図8A〜8Cに関して上述の構築物を示し;図19D〜19Fの各々では、図示されたシステイン置換(*)によって仲介される、ジスルフィド結合(SS)を有するP2A介在自己開裂ポリペプチド(下部)の上にP2Aの未開裂型(上部)が示される。図19Gは、図示された未開裂(上部)及び自己開裂/ジスルフィド結合された(下部)ポリペプチドで、図9Bに関連してsynTac40構築物の一般型を示す。図19Hは、図9C〜9Eに関連してsynTac69、synTac70、及びsynTac71の一般型を示し、未開裂(上部)及び自己開裂/ジスルフィド結合された(下部)ポリペプチドが図示され、4−1BBLドメイン内のさらなるシステイン置換も示される(*)。図19Iは、図9Fに関連してsynTac4−1BBL一本鎖3量体(SCT)の一般型を示し、未開裂(上部)及び自己開裂/ジスルフィド結合された(下部)ポリペプチドが図示される。
図19Aの説明を参照のこと。
図19Aの説明を参照のこと。
図19Aの説明を参照のこと。
図19Aの説明を参照のこと。
図19Aの説明を参照のこと。
図19Aの説明を参照のこと。
図19Aの説明を参照のこと。
図19Aの説明を参照のこと。
ホモ・サピエンス(Homo sapiens)(NP_004039.1;SEQID NO:78)、チンパンジー(Pan troglodytes)(NP_001009066.1;SEQ ID NO:79)、アカゲザル(Macaca mulatta)(NP_001040602.1;SEQ ID NO:80)、ボスタウラス(Bos Taurus)(NP_776318.1;SEQ ID NO:81)、及びハツカネズミ(Mus musculus)(NP_033865.2;SEQ ID NO:82)由来のβ2ミクログロブリン(B2M)前駆体(すなわち、リーダー配列を含む)の複数のアミノ酸配列アラインメントを示す。
SEQ ID NO:6の構築物のドメイン構造を示す。
SEQ ID NO:7の構築物のドメイン構造を示す。
synTac IGRP−PDL1、synTac TUM−PDL1、またはリン酸緩衝生理食塩水(PBS)のインビボ投与のIGRP特異的CD8+T細胞の頻度に対する影響を示す。
図24Aは、免疫グロブリンFcポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
図24Bは、免疫グロブリンFcポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
図24Cは、免疫グロブリンFcポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
図25A〜25Cは、ヒト白血球抗原(HLA)クラスI重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
図26A〜26Bは、PD−L1ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
4−1BBLポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
ICOS−Lポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
OX40Lポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
PD−L2ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
CD80(B7−1)ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
CD86(B7−2)ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
Fasリガンド(FAS−L)ポリペプチドのアミノ酸配列を示す。
図34A〜34Hは、本開示のsynTac構築物の実施形態の概要図を示し、システイン置換(*)によって仲介されるジスルフィド結合(SS)が図示される。これらの実施形態では、ジスルフィド結合は別々のポリペプチドに存在するMHC(例えば、HLA)ポリペプチド間に形成される。
図34Aの説明を参照のこと。
図34Aの説明を参照のこと。
図34Aの説明を参照のこと。
図34Aの説明を参照のこと。
図34Aの説明を参照のこと。
図34Aの説明を参照のこと。
図34Aの説明を参照のこと。

0045

定義
本明細書で使用される「リーダー配列」は、ヒトB2Mリーダーを含めて、哺乳類細胞によってプロセッシングされうる任意のシグナルペプチドを含む。かかる配列は、当技術分野では周知である。

0046

本明細書で使用される、例えば、要素A及び要素Bに関して「隣接する」とは、要素Aが要素Bに隣接し、好ましくは、別段の定めのない限り、共有結合によって要素Bに結合していることを意味する。例えば、第二のアミノ酸配列に隣接する第一のアミノ酸配列については、該第一のアミノ酸配列のC末端が、該第二のアミノ酸配列のN末端にペプチド結合によって結合され得る。

0047

「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では区別なく用いられ、任意の長さのアミノ酸の多量体型を指し、コード及び非コードアミノ酸、化学的もしくは生化学的修飾または誘導体化アミノ酸、並びに修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドを含みうる。これらの用語は、ポリペプチドの翻訳時修飾(例えば、シグナルペプチド開裂)及び翻訳後修飾、例えば、ジスルフィド結合形成グリコシル化アセチル化リン酸化、タンパク質分解的開裂等を有するポリペプチドも含む。さらに、本明細書で使用される「ポリペプチド」は、そのタンパク質が所望の活性を維持する限り、元の配列に対して欠失、付加、及び置換(当業者に知られるように実際は概して保存的である)等の修飾を含むタンパク質に言及する。これらの修飾は、特定部位突然変異誘発によるなどの故意、または、例えば該タンパク質を産生する宿主の変異もしくはPCR増幅もしくは他の組み換えDNA法に起因するエラーを介した偶然の場合がある。

0048

核酸分子を説明するために本明細書で使用される「組み換え体」という用語は、ゲノム、cDNA、ウイルス、半合成、及び/または合成起源ポリヌクレオチドであって、その起源または操作が理由で、それが本来伴うポリヌクレオチド配列のすべてもしくは一部を伴わない、ポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して用いられる「組み換え体」という用語は、組み換えポリヌクレオチド由来の発現によって産生されるポリペプチドを指す。宿主細胞またはウイルスに関して用いられる「組み換え体」という用語は、組み換えポリヌクレオチドが導入された宿主細胞またはウイルスを指す。組み換え体はまた、本明細書では、異種物質(例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクター)の導入によって修飾された物質(例えば、細胞、核酸、タンパク質、またはベクター)に関連して指す。

0049

「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、及び「核酸分子」という用語は、本明細書では区別なく用いられ、ヌクレオチド、すなわち、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドの多量体型を含める。本用語は、該分子の一次構造のみを指す。従って、これらの用語は3本鎖、2本鎖、及び1本鎖DNA、並びに3本鎖、2本鎖、及び1本鎖RNAを含む。これらの用語はまた、例えばメチル化及び/またはキャッピングによる修飾を有するかかる分子、並びにポリヌクレオチドの未修飾型も含む。より具体的には、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、及び「核酸分子」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド(2‐デオキシ‐D‐リボースを含む)、ポリリボヌクレオチド(D‐リボースを含む)、プリンもしくはピリミジン塩基のN‐またはC‐グリコシドである他の種類のポリヌクレオチド、並びに非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマー、ポリマー、並びに、該ポリマーがDNA及びRNAで見られるような塩基対合及び塩基積み重ねを可能にする配置に核酸塩基を含む他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。

0050

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、核酸配列標的細胞に導入できる媒体を指す。例えば、ベクターは標的細胞内で発現されうるコード配列を含んでよい。本明細書で使用される、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、及び「遺伝子導入ベクター」とは、概して、目的の遺伝子の発現を指示することが可能で、該目的の遺伝子を標的細胞内に導入するのに有用な任意の核酸構築物を指す。ゆえに、該用語は、クローニング及び発現媒体、並びに組込みベクター及び非組込みベクターを含む。ベクターはこのように核酸配列を標的細胞に導入することが可能で、ある場合には、核酸配列の操作、例えば、核酸配列の組み換え(すなわち、組み換え核酸配列を作ること)等に用いられる。本開示のためのベクターの例としては、限定されないが、プラスミド、ファージトランスポゾンコスミド、ウイルス等が挙げられる。

0051

本明細書で使用される「発現カセット」は、目的の遺伝子/コード配列を含めた任意のRNA転写産物の発現を指示することができる任意の核酸構築物及び非翻訳RNAを含む。かかるカセットは、該発現カセットを標的細胞内に導入するために、「ベクター」、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、または「遺伝子導入ベクター」に構築することができる。従って、本用語はクローニング及び発現媒体並びにウイルスベクターを含む。発現カセットの転写産物は、安定に、または一時的に発現されうるとともに、所望に応じて、宿主のゲノムと合体する(標的化もしくは未標的化形式で)カセットから発現されても、または合体しないままであってもよい。

0052

「作動可能に連結されている」とは、かかる成分が、それらの対象とする方式でそれらが機能することを可能にする関係にある並置を指す。例えば、プロモーターは、該プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を与える場合、該コード配列に作動可能に連結されている。本明細書で使用される「異種プロモーター」並びに「異種調節領域」という用語は、通常本来特定の核酸と結合しないプロモーター及び他の調節領域を指す。例えば、「コード領域に対して異種の転写調節領域」とは、通常本来該コード領域と結合しない転写調節領域である。

0053

本明細書で使用される「免疫学的シナプス」または「免疫シナプス」という用語は、概して、2つの適応免疫反応の相互作用免疫細胞間の天然の界面を指し、例えば、抗原提示細胞(APC)または標的細胞とエフェクター細胞、例えば、リンパ球、エフェクターT細胞、ナチュラルキラー細胞等との界面を含む。APCとT細胞間の免疫学的シナプスは、例えば、参照することによってその開示全体が本明細書に組み込まれる、Bromley et al., Annu Rev Immunol. 2001;19:375−96に記載されるように、通常、T細胞抗原受容体及び主要組織適合複合体分子の相互作用によって開始される。

0054

本明細書で使用される、核酸配列、タンパク質、またはポリペプチドに関して用いられる「異種」という用語は、これらの分子が、該異種核酸配列、タンパク質、またはポリペプチドが得られた細胞内で天然には生じないことを意味する。例えば、ヒトの細胞ではない細胞に挿入されるヒトのポリペプチドをコードする核酸配列は、その個々の状況において異種核酸配列である。異種核酸は異なる有機体または動物種由来でありうるものの、かかる核酸は、異種であるために別の有機体種由来である必要はない。例えば、ある場合には、合成核酸配列またはそれからコードされるポリペプチドは、それが導入される細胞に対して、該細胞は該合成核酸を以前に含んでいなかったという点において、異種でありうる。このように、例えば、合成核酸配列またはそれからコードされるポリペプチドの1成分以上がもとはヒト細胞由来であったとしても、該合成核酸配列またはそれからコードされるポリペプチドは、ヒト細胞に対して異種であると見なされうる。

0055

本明細書で使用される「宿主細胞」とは、インビボもしくはインビトロ真核細胞または単細胞実体として培養された多細胞生物(例えば、細胞株)由来の細胞を意味し、これら真核細胞は、核酸(例えば、本開示の多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター)に対するレシピエントとして使用可能、または使用されており、該核酸によって遺伝子改変された元の細胞の後代を含む。単一細胞の後代は自然の、偶然の、または計画的な突然変異のために、元の親と必ずしも完全に同一の形態学またはゲノムもしくは全DNA補体であるとは限らないことが理解される。「組み換え宿主細胞」(「遺伝子改変された宿主細胞」とも呼ばれる)は、異種核酸、例えば、発現ベクターが導入された宿主細胞である。例えば、遺伝子改変された真核宿主細胞は、異種核酸、例えば、該真核宿主細胞にとって異質である外因性核酸、または該真核宿主細胞に通常は見られない組み換え核酸による適切な真核宿主細胞への導入によって遺伝子改変されている。

0056

いくつかの場合、ポリペプチド及びポリペプチドをコードする核酸を含めて、核酸またはアミノ酸配列は、「配列類似性」または「配列同一性」を基に、例えば、1つ以上の参照配列と比較して参照される。他の例では、変異または変種配列は、1つ以上の参照配列との比較を基に参照されうる。配列の比較については、通常、1つの配列が参照配列の役割を果たし、これに対して試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。該配列比較アルゴリズムは次に、指定されたプログラムパラメータを基にして、該試験配列について、該参照配列に対する配列同一性%を計算する。

0057

必要または所望に応じて、比較用に最適な配列アラインメントを、例えば、Smith及びWatermanの局所相同性アルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2:482(1981)、参照することによって本明細書に組み込まれる)、Needleman及びWunschの相同性アラインメントアルゴリズム(J. Mol. Biol. 48:443−53(1970)、参照することによって本明細書に組み込まれる)、Pearson及びLipmanの類似性検索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444−48(1988)、参照することによって本明細書に組み込まれる)、これらアルゴリズムのコンピュータ実行(例えば、GAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA、Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr.,ウィスコシン州マジソン)または外観検査(一般的には、Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology,第4版,John Wiley and Sons,New York(1999)参照)によって導くことができる。

0058

「T細胞」は、CD3を発現するすべての種類の免疫細胞を含み、ヘルパーT細胞(CD4+細胞)、細胞毒性T細胞(CD8+細胞)、制御性T細胞(Treg)、及びNK−T細胞を含む。

0059

本明細書で使用される用語「共刺激リガンド」は、抗原提示細胞(例えば、APC、樹状細胞B細胞等)上の分子であって、T細胞上の同族共刺激分子と特異的に結合し、それによって、例えば、TCR/CD3複合体をペプチドが詰まったMHC分子に結合することによってもたらされる一次シグナルに加えて、限定されないが、増殖、活性化、分化等が挙げられるT細胞応答を媒介するシグナルを与える、分子を含む。共刺激リガンドとしては、限定されないが、CD7、B7−1(CD80)、B7−2(CD86)、PD−L1、PD−L2、4−1BBL、OX40L、Fasリガンド(FasL)、誘導共刺激リガンド(ICOS−L)、細胞間接着分子ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA−G、MICA、MICB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、Tollリガンド受容体と結合する作動薬または抗体、及びB7−H3と特異的に結合するリガンドを挙げることができる。共刺激リガンドは、とりわけ、T細胞上に存在する共刺激分子、例えば、限定されないが、CD27、CD28、4−1BB、OX40、CD30、CD40、PD−1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1(LFA−1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7−H3、及びCD83と特異的に結合する抗体も網羅する。

0060

「精製」、「単離」等の用語は、所望の物質、例えば、組み換えタンパク質を所望されない物質、例えば、混入物質を含む溶液から除去すること、または、所望の物質を含む溶液から所望されない物質を除去して基本的に所望の物質のみを残すことを指す。いくつかの場合、精製された物質は他の物質、例えば混入物質を基本的に含まない可能性がある。本明細書で使用される精製とは、多岐にわたる最終純度を指すことがあり、例えば、精製された物質は、溶液中の全物質の80%超を構成し、85%超、90%超、91%超、92%超、93%超、94%超、95%超、96%超、97%超、98%超、99%超、99.5%超、99.9%超等を含む。当業者には理解されるように、一般に溶液自体の成分、例えば、水もしくは緩衝液、または塩は、物質の純度の決定の際に考慮されない。

0061

本明細書で使用される「治療(treatment)」、「治療すること(treating)」等という用語は、所望の薬理作用及び/または生理作用を得ることを指す。該作用は、疾患もしくその症状を完全に、もしくは部分的に防ぐという観点から予防的である場合、並びに/または疾患及び/もしくは該疾患に起因する悪影響を部分的もしくは完全に治すという観点から治療的である場合がある。本明細書で使用される「治療」は、哺乳類、例えば、ヒトの疾患の任意の治療に及び:(a)疾患にかかりやすい可能性があるがまだ罹患していると診断されていない対象での発病の予防;(b)該疾患の阻止、すなわち、その進行の停止;及び(c)該疾患の緩和、すなわち、該疾患の退行を引き起こすことを含む。

0062

本明細書では区別なく用いられる「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、限定されないがネズミ科動物(例えば、ラット、マウス)、ウサギ目の動物(例えば、ウサギ)、非ヒト霊長類、ヒト、イヌネコ有蹄動物(例えば、ウマウシヒツジ、ブタ、ヤギ)等を含めて哺乳類を指す。

0063

「治療有効量」または「有効量」は、哺乳類もしくは他の対象に対して疾患の治療用に投与される場合、かかる疾患の治療をもたらすのに十分な作用物質の量もしくは2つの作用物質を合わせた量を指す。この「治療有効量」は、作用物質、疾患及びその重症度、並びに治療される対象の年齢、体重等によって異なる。

0064

本発明をさらに説明する前に、本発明は記載される特定の実施形態に限定されず、それ自体当然のことながら変化しうることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される術語は、具体的な実施形態を説明する目的のみであり、限定することを目的としないこともまた理解されたい。

0065

値域が示される場合、各介在値は、その文脈が明らかに他を示さない限り、下限値の10分の1の単位までその範囲の上限と下限の間で、及びその規定範囲における他の規定値または介在値が本発明の範囲内に含まれることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、これらのより小さい範囲に独立して含まれうるとともに、該規定範囲において特に排除される任意の境界次第で、本発明の範囲内にも含まれる。該規定範囲が該境界のうちの一方または両方を含む場合、これらの含まれる境界のうちのどちらかまたは両方を排除する範囲もまた本発明に含まれる。

0066

他に規定のない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様もしくは同等の任意の方法及び材料も本発明の実施または試験に用いることができるが、好適な方法及び材料をここに記載する。本明細書で言及するすべての出版物は、参照することによって本明細書に組み込まれ、該出版物の引用に関連する該方法及び/または材料を開示並びに記載する。

0067

本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」、並びに「その(the)」は、その文脈が明らかに他を指示しない限り、複数の指示対象を含むことに留意する必要がある。従って、例えば、「1つの多量体ポリペプチド(a multimeric polypeptide)」への言及は複数のかかるポリペプチドを含み、「免疫調節ポリペプチド(the immunomodulatory polypeptide)」への言及は、1つ以上の免疫調節ポリペプチド及び当業者に周知のその同等物への言及を含む等である。さらに、特許請求の範囲は、任意の随意的な要素を排除するように起草されうるということを記載する。したがって、本文は、請求項の要素の列挙に関連して、「〜だけ(solely)」、「のみ(only)」等の排他的な述語の使用のための、または「否定の」限定の使用のための先行詞の役割を果たすことを意図されている。

0068

明確にするために別々の実施形態の中に記載される本発明のある特定の特徴は、単一の実施形態に合わせて示されてもよいことが理解される。反対に、簡潔にするために単一の実施形態の中に記載される本発明の様々な特徴は、別々に示されても、任意の適切な副結合に示されてもよい。本発明に関連する実施形態のすべての組合せは、まさにありとあらゆる組合せが個別にかつ明確に開示されたものとして、本発明に具体的に包含され、本明細書に開示される。さらに、これらの様々な実施形態及びそれらの要素のすべての副結合もまた、まさにありとあらゆるかかる副結合が個別にかつ明確に本明細書に開示されたものとして、本発明に具体的に包含され、本明細書に開示される。

0069

本明細書で論じられる出版物は、本出願の出願日の前にそれらの開示のためだけを提供される。本明細書において、本発明が先行発明に基づくかかる出版物に先行する権利がないと認めることと解釈されるものはない。さらに、規定された公開日は、独立して確認が必要である場合がある実際の公開日と異なる場合がある。

0070

発明の詳細な説明
従来の免疫反応を反復する新規なタンパク質ベースの治療プラットフォーム、すなわち、T細胞活性化用の人工免疫学的シナプス(synTac)を本明細書に記載する。共刺激分子をMHC−エピトープに連結して、正確なT細胞の結合と、MOD分子部位に応じてクローン性T細胞活性化または阻害とを可能にする新規な融合タンパク質である。

0071

多量体ポリペプチド
本開示は、多量体(例えば、ヘテロ2量体、ヘテロ3量体)ポリペプチドを提供する。本開示は、本開示の多量体ポリペプチドのポリタンパク質前駆体を提供する。本開示は、前駆体遺伝子産物、例えば、本開示の多量体ポリペプチドのポリタンパク質前駆体、及び本開示の多量体ポリペプチドの2つ以上のポリペプチド鎖をコードするmRNA遺伝子産物を提供する。

0072

さらに、(i)第一のアミノ酸リンカー配列によって結合された候補エピトープペプチド、これに隣接する、ヒト天然B2Mペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列、これに隣接する第二のアミノ酸リンカー、これに隣接するT細胞調節ドメインペプチド配列を含み、(i)が、1つまたは2つ以上のジスルフィド結合によって、(ii)MHC重鎖の配列を有するアミノ酸配列、これに隣接する第三のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、免疫グロブリンのFcドメインと同一のアミノ酸配列に結合されている、組み換えポリペプチド構築物も提供される。実施形態では、該組み換えポリペプチド構築物は、

を含む。

0073

さらに、(i)第一のアミノ酸リンカー配列によって結合された候補エピトープペプチド、これに隣接する、ヒト天然B2Mペプチド配列と同一の配列を含むアミノ酸配列を含み、(i)が、1つまたは2つ以上のジスルフィド結合によって、(ii)T細胞調節ドメインペプチド、これに隣接する第二のアミノ酸リンカー配列、これに隣接する、MHC重鎖の配列を有するアミノ酸配列、これに隣接する第三のアミノ酸リンカー、これに隣接する、免疫グロブリンのFcドメインと同一のアミノ酸配列に結合されている、組み換えポリペプチド構築物も提供される。実施形態では、該組み換えポリペプチド構築物は、

を含む。

0074

さらに、それぞれの免疫グロブリンのFcドメイン間の1つ以上のジスルフィド結合によって結合された本明細書に記載の組み換えポリペプチド構築物のうちの2つを含むタンパク質も提供される。

0075

さらに、本それぞれの免疫グロブリンのFcドメイン間の1つ以上のジスルフィド結合によって結合された明細書に記載の組み換えポリペプチド構築物のうちの2つを含むタンパク質も提供される。

0076

本発明は、synTacプラットフォーム、すなわち、標的T細胞活性化用の人工免疫学的シナプスを提供する。

0077

実施形態において、β2ミクログロブリンは、ヒトβ2ミクログロブリンと同じ配列を有する。実施形態において、組織適合性複合体の重鎖の配列は、ヒトHLA−Aの配列と同じ配列を有する。実施形態において、組織適合性複合体の重鎖の膜透過ドメインは、ヒト主要組織適合複合体I(MHCI)の重鎖の膜透過ドメインと同じ配列を有する。実施形態において、組織適合性複合体の重鎖の膜透過ドメインは、ヒト主要組織適合複合体II(MHC II)の重鎖の膜透過ドメインと同じ配列を有する。

0078

さらに、複数の該構築物を含む組成物も提供される。

0079

実施形態において、該候補エピトープペプチドは、8、9、10、11、または12アミノ酸のペプチドである。実施形態において、該候補エピトープペプチドは、13、14、15、16、または17アミノ酸のペプチドである。実施形態において、該候補エピトープペプチドは、9量体(9アミノ酸の長さ)である。

0080

本開示は、2つ以上(例えば、2つ、3つ、4つ、またはそれ以上)のポリペプチド鎖を含む多量体ポリペプチドを提供する。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;ii)第一の主要組織適合複合体(MHC)ポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)任意で免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチドまたは非Ig骨格を含む第二のポリペプチドを含み、該多量体ポリペプチドは、1つ以上の免疫調節ドメインを含み、該1つ以上の免疫調節ドメインは、A)該第一のポリペプチドのC末端に;B)該第二のポリペプチドのN末端に;C)該第二のポリペプチドのC末端に;またはD)該第一のポリペプチドのC末端及び該第二のポリペプチドのN末端に存在する。

0081

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを含み、該第一のポリペプチドは、アミノ末端(N末端)からカルボキシル末端(C末端)の順にa)エピトープ(例えば、T細胞エピトープ);b)第一の主要組織適合複合体(MHC)ポリペプチド及びc)免疫調節ポリペプチドを含み;該第二のポリペプチドは、N末端からC末端の順にa)第二のMHCポリペプチド;及びb)免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチドを含む。他の例では、本開示の多量体ポリペプチドは、第一のポリペプチド及び第二のポリペプチドを含み、該第一のポリペプチドは、N末端からC末端の順にa)エピトープ(例えば、T細胞エピトープ);及びb)第一のMHCポリペプチドを含み;該第二のポリペプチドは、N末端からC末端の順にa)免疫調節ポリペプチド;b)第二のMHCポリペプチド;及びc)Ig Fcポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のMHCポリペプチド及び該第二のMHCポリペプチドは、クラスIのMHCポリペプチドであって;例えば、いくつかの場合、該第一のMHCポリペプチドは、MHCクラスIのβ2ミクログロブリン(B2M)ポリペプチドであり、該第二のMHCポリペプチドは、MHCクラスI重鎖(H鎖)である。他の例では、該第一のMHCポリペプチド及び該第二のMHCポリペプチドは、クラスIIのMHCポリペプチドであって;例えば、いくつかの場合、該第一のMHCポリペプチドは、MHCクラスIIα鎖ポリペプチドであり、該第二のMHCポリペプチドは、MHCクラスIIβ鎖ポリペプチドである。別の例では、該第一のポリペプチドは、MHCクラスIIβ鎖ポリペプチドであり、該第二のMHCポリペプチドは、MHCクラスIIα鎖ポリペプチドである。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、2つ以上の免疫調節ポリペプチドを含む。本開示の多量体ポリペプチドが2つ以上の免疫調節ポリペプチドを含む場合、いくつかの場合、該2つ以上の免疫調節ポリペプチドは、同じポリペプチド鎖に存在し、タンデムになってもよい。本開示の多量体ポリペプチドが2つ以上の免疫調節ポリペプチドを含む場合、いくつかの場合、該2つ以上の免疫調節ポリペプチドは別々のポリペプチドに存在する。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、ヘテロ2量体である。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、3量体ポリペプチドである。

0082

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;及びii)第一のMHCポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)IgFcポリペプチド;及びiii)免疫調節ドメインを含む第二のポリペプチドを含む。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;及びii)第一のMHCポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチド;及びii)免疫調節ドメインを含む第二のポリペプチドを含む。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;及びii)第一のMHCポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)免疫調節ドメイン;及びii)第二のMHCポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、a)N末端からC末端の順にi)エピトープ;ii)第一のMHCポリペプチド;及びiii)免疫調節ドメインを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)第二のMHCポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む。本開示の多量体ポリペプチドが非Ig骨格を含むいくつかの場合、該非Ig骨格は、XTENポリペプチド、トランスフェリンポリペプチド、Fc受容体ポリペプチド、エラスチン様ポリペプチド、シルク様ポリペプチド、またはシルクエラスチン様ポリペプチドである。

0083

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは一価である。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは多価である。例えば、本開示の多量体ポリペプチドに存在するFcポリペプチド次第で、該多量体ポリペプチドは、ホモ2量体であることができ、該多量体ポリペプチドの2分子が該ホモ2量体で存在し、該多量体ポリペプチドの該2分子は、例えば、該2分子に存在するFcポリペプチドを介して互いにジスルフィド結合されうる。別の例として、本開示の多量体ポリペプチドは、3、4、または5分子の該多量体ポリペプチドを含むことができ、該多量体ポリペプチドのこれら分子は、例えば、これら分子に存在するFcポリペプチドを介して互いにジスルフィド結合されうる。

0084

リンカー
本開示の多量体ポリペプチドは、例えばエピトープとMHCポリペプチドとの間、MHCポリペプチドと免疫調節ポリペプチドとの間、またはMHCポリペプチドとIgFcポリペプチドとの間に挿入されたリンカーペプチドを含むことができる。

0085

適切なリンカー(「スペーサー」とも呼ばれる)は、容易に選択可能であり、いくつかの適切な長さ、例えば、1アミノ酸(例えば、Gly)から20アミノ酸、2アミノ酸から15アミノ酸、3アミノ酸から12アミノ酸、4アミノ酸から10アミノ酸、5アミノ酸から9アミノ酸、6アミノ酸から8アミノ酸、または7アミノ酸から8アミノ酸であってよく、1、2、3、4、5、6、または7アミノ酸であってよい。

0086

典型的なリンカーとしては、グリシンポリマー(G)n、グリシン‐セリンポリマー(例えば、nは少なくとも整数1である、(GS)n、(GSGGS)n(SEQID NO:8)、及び(GGGS)n(SEQ ID NO:9))、グリシン‐アラニンポリマー、アラニン‐セリンポリマー、及び当技術分野で周知の他の柔軟性リンカーが挙げられる。グリシン及びグリシン‐セリンポリマーが使用可能であり;GlyとSerはともに比較的組織化されておらず、それ故成分間の中立テザーの役割を果たすことができる。グリシンポリマーが使用可能であり;グリシンは、実にアラニンよりも著しく多くのファイプサイ空間を使用可能にし、より長い側鎖の残基よりはるかに規制が少ない(Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173−142(1992)参照)。典型的なリンカーは、限定されないが、

等を含むアミノ酸配列を含みうる。

0087

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドの第一のポリペプチドに存在するリンカーポリペプチドは、本開示の多量体ポリペプチドの第二のポリペプチドに存在するシステイン残基とジスルフィド結合を形成することができるシステイン残基を含む。いくつかの場合、例えば、適切なリンカーは、アミノ酸配列

を含む。

0088

エピトープ
本開示の多量体ポリペプチドに存在するエピトープは約4アミノ酸から約25アミノ酸の長さを有することができ、例えば、該エピトープは4アミノ酸(aa)から10aa、10aaから15aa、15aaから20aa、または20aaから25aaの長さを有することができる。例えば、本開示の多量体ポリペプチドに存在するエピトープは、4アミノ酸(aa)、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、13aa、14aa、15aa、16aa、17aa、18aa、19aa、20aa、21aa、22aa、23aa、24aa、または25aaの長さを有することができる。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドに存在するエピトープは、5アミノ酸から10アミノ酸、例えば、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、または10aaの長さを有する。

0089

本開示の多量体ポリペプチドに存在するエピトープは、T細胞によって特異的に結合される。すなわち、該エピトープは、エピトープ特異的T細胞によって特異的に結合される。エピトープ特異的T細胞は、参照アミノ酸配列を有するエピトープに結合するが、該参照アミノ酸配列と異なるエピトープには実質的に結合しない。例えば、エピトープ特異的T細胞は、参照アミノ酸配列を有するエピトープに結合し、該参照アミノ酸配列と異なるエピトープに結合したとしても、親和性は10−6M未満、10−5M未満、または10−4M未満である。エピトープ特異的T細胞は、親和性が少なくとも10−7M、少なくとも10−8M、少なくとも10−9M、または少なくとも10−10Mで特異的なエピトープに結合できる。

0090

エピトープの限定されない例としては、例えば、ヒトT細胞リンパ向性ウイルス‐1エピトープLLFGYPVYV(SEQID NO:17);腫瘍エピトープKYQAVTTTL(SEQ ID NO:18)、及び膵島特異的グルコース‐6‐リン酸触媒サブユニット関連タンパク質(IGRP)エピトープVYLKTNVFL(SEQ ID NO:19)またはTYLKTNLFL(SEQ ID NO:20)が挙げられる。Yang et al.(2006) J.Immunol.176:2781。

0091

MHCポリペプチド
上述の通り、本開示の多量体ポリペプチドは、MHCポリペプチドを含む。本開示のために、「主要組織適合複合体(MHC)ポリペプチド」という用語は、ヒトMHC(ヒト白血球抗原(HLA)とも呼ばれる)ポリペプチド、げっ歯類(例えば、マウス、ラット等)MHCポリペプチド、及び他の哺乳類種(例えば、ウサギ目、非ヒト霊長類、イヌ科ネコ科、有蹄動物(例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ等)等、様々な種のMHCポリペプチドを含むように意図されている。「MHCポリペプチド」という用語は、クラスIのMHCポリペプチド(例えば、β‐2ミクログロブリン及びMHCクラスI重鎖)及びMHCクラスIIポリペプチド(例えば、MHCクラスIIαポリペプチド及びMHCクラスIIβポリペプチド)を含むように意図されている。

0092

上述の通り、本開示の多量体ポリペプチドのいくつかの実施形態において、該第一のMHCポリペプチド及び該第二のMHCポリペプチドは、クラスIのMHCポリペプチドであり;例えば、いくつかの場合、該第一のMHCポリペプチドは、MHCクラスIのβ2ミクログロブリン(B2M)ポリペプチドであり、該第二のMHCポリペプチドは、MHCクラスI重鎖(H鎖)である。他の例では、該第一のMHCポリペプチ及び該第二のMHCポリペプチドは、クラスIIのMHCポリペプチドであり;例えば、いくつかの場合、該第一のMHCポリペプチドは、MHCクラスIIα鎖ポリペプチドであり、該第二のMHCポリペプチドは、MHCクラスIIβ鎖ポリペプチドである。他の例では、該第一のポリペプチドは、MHCクラスIIβ鎖ポリペプチドであり、該第二のMHCポリペプチドは、MHCクラスIIα鎖ポリペプチドである。

0093

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのMHCポリペプチドは、「ヒト白血球抗原」(「HLA」)ポリペプチドとも呼ばれる、ヒトMHCポリペプチドである。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのMHCポリペプチドは、クラスIのHLAポリペプチド、例えば、β2ミクログロブリンポリペプチド、またはクラスIのHLAの重鎖ポリペプチドである。クラスIのHLAの重鎖ポリペプチドとしては、HLA−Aの重鎖ポリペプチド、HLA−Bの重鎖ポリペプチド、HLA−Cの重鎖ポリペプチド、HLA−Eの重鎖ポリペプチド、HLA−Fの重鎖ポリペプチド、及びHLA−Gの重鎖ポリペプチドが挙げられる。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのMHCポリペプチドは、クラスIIのHLAポリペプチド、例えば、クラスIIのHLAα鎖またはクラスIIのHLAのβ鎖である。MHCクラスIIのポリペプチドとしては、MCHクラスIIのDPα及びβポリペプチド、DMα及びβポリペプチド、DOAα及びβポリペプチド、DOBα及びβポリペプチド、DQα及びβポリペプチド、並びにDRα及びβポリペプチドが挙げられる。

0094

例として、本開示の多量体ポリペプチドのMHCクラスI重鎖ポリペプチドは、図25Aに示すヒトHLA−A重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸25〜365に対する少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。

0095

例として、本開示の多量体ポリペプチドのMHCクラスI重鎖ポリペプチドは、以下のヒトHLA−A重鎖のアミノ酸配列:

のアミノ酸25〜365に対する少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。

0096

別の例として、本開示の多量体ポリペプチドのMHCクラスI重鎖ポリペプチドは、図25Bに示すヒトHLA−B重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸25〜362に対する少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。

0097

別の例として、本開示の多量体ポリペプチドのMHCクラスI重鎖ポリペプチドは、図25Cに示すヒトHLA−C重鎖ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸25〜362に対する少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。

0098

別の例として、本開示の多量体ポリペプチドのMHCクラスI重鎖ポリペプチドは、以下のアミノ酸配列:

に対する少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。

0099

本開示の多量体ポリペプチドのβ2ミクログロブリン(B2M)ポリペプチドは、ヒトB2Mポリペプチド、非ヒト霊長類B2Mポリペプチド、マウスB2Mポリペプチド等でありうる。いくつかの場合、B2Mポリペプチドは、図20に示すB2Mのアミノ酸配列に対する少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0100

いくつかの場合、MHCポリペプチドは、参照MHCポリペプチド(参照MHCポリペプチドは野生型MHCポリペプチドでありうる)に対して単一のアミノ酸置換を含み、該単一のアミノ酸置換は、システイン(Cys)残基でアミノ酸を置換する。かかるシステイン残基は、本開示の多量体ポリペプチドの第一のポリペプチドのMHCポリペプチドに存在する場合、本開示の多量体ポリペプチドの第二のポリペプチド鎖に存在するシステイン残基とジスルフィド結合を形成することができる。

0101

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドの第一のポリペプチドの第一のMHCポリペプチド及び/または本開示の多量体ポリペプチドの第二のポリペプチドの第二のMHCポリペプチドは、システインでアミノ酸を置換するアミノ酸置換を含み、該第一のMHCポリペプチド内の該置換システインは、該第二のMHCポリペプチド内のシステインとジスルフィド結合を形成するか、該第一のMHCポリペプチド内のシステインは該第二のMHCポリペプチド内の該置換システインとジスルフィド結合を形成するか、または、該第一のMHCポリペプチド内の該置換システインは、該第二のMHCポリペプチド内の該置換システインとジスルフィド結合を形成する。

0102

例えば、いくつかの場合、HLAのβ2ミクログロブリン及びHLAクラスI重鎖の以下の残基の対のうちの1つがシステインで置換される:1)B2M残基12、HLAクラスI重鎖残基236;2)B2M残基12、HLAクラスI重鎖残基237;3)B2M残基8、HLAクラスI重鎖残基234;4)B2M残基10、HLAクラスI重鎖残基235;5)B2M残基24、HLAクラスI重鎖残基236;6)B2M残基28、HLAクラスI重鎖残基232;7)B2M残基98、HLAクラスI重鎖残基192;8)B2M残基99、HLAクラスI重鎖残基234;9)B2M残基3、HLAクラスI重鎖残基120;10)B2M残基31、HLAクラスI重鎖残基96;11)B2M残基53、HLAクラスI重鎖残基35;12)B2M残基60、HLAクラスI重鎖残基96;13)B2M残基60、HLAクラスI重鎖残基122;14)B2M残基63、HLAクラスI重鎖残基27;15)B2M残基Arg3、HLAクラスI重鎖残基Gly120;16)B2M残基His31、HLAクラスI重鎖残基Gln96;17)B2M残基Asp53、HLAクラスI重鎖残基Arg35;18)B2M残基Trp60、HLAクラスI重鎖残基Gln96;19)B2M残基Trp60、HLAクラスI重鎖残基Asp122;20)B2M残基Tyr63、HLAクラスI重鎖残基Tyr27;21)B2M残基Lys6、HLAクラスI重鎖残基Glu232;22)B2M残基Gln8、HLAクラスI重鎖残基Arg234;23)B2M残基Tyr10、HLAクラスI重鎖残基Pro235;24)B2M残基Ser11、HLAクラスI重鎖残基Gln242;25)B2M残基Asn24、HLAクラスI重鎖残基Ala236;26)B2M残基Ser28、HLAクラスI重鎖残基Glu232;27)B2M残基Asp98、HLAクラスI重鎖残基His192;及び28)B2M残基Met99、HLAクラスI重鎖残基Arg234。該MHC/HLAクラスI重鎖の該アミノ酸番号は、シグナルペプチドを除いた成熟MHC/HLAクラスI重鎖に準拠している。例えば、シグナルペプチドを含む、図25Aに示すアミノ酸配列において、Gly120はGly144であり;Gln96はGln120である等。

0103

免疫調節ポリペプチド
本開示の多量体ポリペプチドの免疫調節ポリペプチドは、活性化免疫調節ポリペプチドまたは阻害性免疫調節ポリペプチドでありうる。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、単一の免疫調節ポリペプチドを含む。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、2つの免疫調節ポリペプチドを含む。いくつかの場合、該2つの免疫調節ポリペプチドは、ポリペプチド鎖内でタンデムになっている。いくつかの場合、該2つの免疫調節ポリペプチドは、別々のポリペプチド鎖中に存在する。いくつかの場合、該2つの免疫調節ポリペプチドは、別々のポリペプチド鎖中に存在して互いにジスルフィド結合されている。

0104

本開示の多量体ポリペプチドの免疫調節ポリペプチドは、いくつかの例ではT細胞調節ポリペプチドである。いくつかの場合、該T細胞調節ポリペプチドは、刺激性(活性化)T細胞調節ポリペプチドである。いくつかの場合、該T細胞調節ポリペプチドは、阻害性T細胞調節ポリペプチドである。T細胞調節ポリペプチドは、抗体、ペプチドリガンド、T細胞共刺激ポリペプチド、サイトカイン、または毒素でありうる。

0105

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドの免疫調節ポリペプチドは、エピトープ特異的T細胞の表面で発現する共刺激ポリペプチドと特異的に結合する抗体系または非抗体系認識部分である。抗体系認識部分としては、例えば、抗体;限定されないが、Fab、Fv、一本鎖Fv(scFv)、及びFdフラグメントが挙げられる抗原に対する特異的結合を保つ抗体のフラグメント;キメラ抗体ヒト化抗体一本鎖抗体(scAb)、単一ドメイン抗体(dAb);単一ドメイン重鎖抗体単一ドメイン軽鎖抗体等が挙げられる。適切な非抗体系認識部分としては、例えばアフィボディ(affibody);遺伝子操作されたKunitzドメインモノボディアドネクチン(adnectin));アンチカリン(anticalin);アプタマー;設計されたアンキリンリピートドメイン(DARPin);システインリッチポリペプチドの結合部位(例えば、システインリッチknottinペプチド);アビマー(avimer);アフリン(afflin)等が挙げられる。抗体系または非抗体系認識部分は、エピトープ特異的T細胞の表面で発現する共刺激ポリペプチドと特異的に結合し、かかる共刺激ポリペプチドとしては、限定されないが、CTLA4、PD1、ICOS、OX40、CD20、及び4−1BBが挙げられる。エピトープ特異的T細胞の表面で発現する共刺激ポリペプチドは、当技術分野で周知である。

0106

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドの免疫調節ポリペプチドは、T細胞共刺激ポリペプチドである。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドの免疫調節ポリペプチドは、T細胞共刺激ポリペプチドでありかつ腫瘍壊死因子(TNF)スーパーファミリー一員であり;例えば、FasLポリペプチド、41BBLポリペプチド、CD40ポリペプチド、OX40Lポリペプチド、CD30Lポリペプチド、CD70ポリペプチド等である。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドの免疫調節ポリペプチドは、T細胞共刺激ポリペプチドでありかつ免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーの一員であり;例えば、CD7ポリペプチド、CD86ポリペプチド、ICAMポリペプチド等である。

0107

本開示の多量体ポリペプチドの適切な免疫調節ポリペプチドとしては、限定されないが、CD80(B7−1)、CD86(B7−2)、4−1BBL、OX40L、ICOS−L、ICAM、PD−L1、FasL、及びPD−L2が挙げられる。本開示の多量体ポリペプチドの適切な免疫調節ポリペプチドとしては、例えば、CD7、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA−G、MICA、MICB、HVEM、リンホトキシンβ受容体、3/TR6、ILT3、ILT4、及びHVEMが挙げられる。

0108

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのT細胞調節ポリペプチドは、PD−L1ポリペプチドである。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのPD−L1ポリペプチドは、図26Aまたは26Bに示すPD−L1のアミノ酸配列のアミノ酸19〜290に対する少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0109

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのT細胞調節ポリペプチドは、4−1BBLポリペプチドである。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドの4−1BBLポリペプチドは、図27に示す4−1BBLのアミノ酸配列のアミノ酸50〜254に対する少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0110

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのT細胞調節ポリペプチドは、ICOS−Lポリペプチドである。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのICOS−Lポリペプチドは、図28に示すICOS−Lのアミノ酸配列のアミノ酸19〜302に対する少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0111

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのT細胞調節ポリペプチドは、OX40Lポリペプチドである。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのOX40Lポリペプチドは、図29に示すOX40Lのアミノ酸配列のアミノ酸1〜183に対する少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0112

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのT細胞調節ポリペプチドは、PD−L2ポリペプチドである。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのPD−L2ポリペプチドは、図30に示すPD−L2のアミノ酸配列のアミノ酸20〜273に対する少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0113

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのT細胞調節ポリペプチドは、CD80(B7−1)ポリペプチドである。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのCD80ポリペプチドは、図31に示すCD80のアミノ酸配列のアミノ酸35〜288に対する少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0114

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのT細胞調節ポリペプチドは、CD86ポリペプチドである。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのCD86ポリペプチドは、図32に示すCD86のアミノ酸配列のアミノ酸31〜329に対する少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0115

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのT細胞調節ポリペプチドは、FasLポリペプチドである。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドのFasLポリペプチドは、図33に示すFasLのアミノ酸配列のアミノ酸1〜281に対する少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0116

本発明で用いられうるさらなるT細胞調節ドメイン(MOD)としては、天然由来または合成ヒト遺伝子産物(タンパク質)、限定されないが、古典的及び非古典的(例えば、FGF2、IL1、S100A4)分泌機構に起因するすべての分泌タンパク質を含むヒト遺伝子産物を標的とする親和性試薬(例えば、抗体、抗体フラグメント、一本鎖Fv、アプタマー、ナノボディ)、並びに天然由来の遺伝的にコードされたタンパク質セグメント単一膜もしくは多重膜スパン)またはGPI連結等の翻訳後修飾によって固定されたすべての細胞表面タンパク質の外部ドメインが挙げられる。細胞表面グリカンもしくは他の翻訳後修飾(例えば、硫酸化)を標的とする任意の天然由来または合成親和性試薬(例えば、抗体、抗体フラグメント、一本鎖Fv、アプタマー、ナノボディ、レクチン等)である。例としては、限定されないが、TNF/TNFRファミリー員(OX40L、ICOSL、FASL、LTA、LTB、TRAIL、CD153、TNFSF9、RANKL、TWEAK、TNFSF13、TNFSF13b、TNFSF14、TNFSF15、TNFSF18、CD40LG、CD70)または該TNF/TNFRファミリー員指向の親和性試薬;該免疫グロブリンスーパーファミリー員(VISTA、PD1、PD−L1、PD−L2、B71、B72、CTLA4、CD28、TIM3、CD4、CD8、CD19、T細胞受容体鎖、ICOS、ICOSリガンド、HHLA2、ブチフィリンBTLA、B7−H3、B7−H4、CD3、CD79a、CD79b、IgSFCAMS(CD2、CD58、CD48、CD150、CD229、CD244、ICAM−1を含む)、白血球免疫グロブリン様受容体(LILR)、キラー細胞免疫グロブリン様受容体(KIR))、レクチンスーパーファミリー員、セレクチン、サイトカイン/ケモカイン及びサイトカイン/ケモカイン受容体成長因子及び成長因子受容体)、接着分子インテグリンフィブロネクチンカドヘリン)、もしくは多スパンの内在性膜タンパク質の外部ドメイン、または該免疫グロブリンスーパーファミリー及び記載された遺伝子産物指向の親和性試薬が挙げられる。さらに、限定されないが、ウイルス配列(例えば、CMV、EBV)、細菌配列、真菌配列、真核病原体(例えば、Schistosoma、Plasmodium、Babesia、Eimeria、Theileria、Toxoplasma、Entamoeba、Leishmania、及びTrypanosoma)、並びに哺乳類由来コード領域を含むこれら遺伝子産物の活性ホモログオルソログである。さらに、MODは、ヒト遺伝子産物を標的とする小分子薬物を含んでもよい。

0117

Fcポリペプチド
本開示の多量体ポリペプチドは、Fcポリペプチドまたは別の適切な骨格ポリペプチドを含む。

0118

適切な骨格ポリペプチドとしては、抗体系骨格ポリペプチド及び非抗体系骨格が挙げられる。非抗体系骨格としては、例えば、アルブミン、XTEN(延長組み換え)ポリペプチド、トランスフェリン、Fc受容体ポリペプチド、エラスチン様ポリペプチド(例えば、Hassouneh et al.(2012)MethodsEnzymol.502:215参照;例えば、Xがプロリン以外のアミノ酸である、(Val−Pro−Gly−X−Gly)の5ペプチドの繰り返し単位を含むポリペプチド)、アルブミン結合ポリペプチド、シルク様ポリペプチド(例えば、Valluzzi et al.(2002)Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.357:165参照)、シルクエラスチン様ポリペプチド(SELP;例えば、Megeed et al.(2002) Adv Drug Deliv Rev.54:1075参照)等が挙げられる。適切なXTENポリペプチドとしては、例えば、WO2009/023270、WO2010/091122、WO2007/103515、US2010/0189682、及びUS2009/0092582に開示のものが挙げられ;Schellenberger et al.(2009)Nat Biotechnol.27:1186も参照されたい。適切なアルブミンポリペプチドとしては、例えばヒト血清アルブミンが挙げられる。

0119

適切な骨格ポリペプチドは、いくつかの場合、半減期延長ポリペプチドであろう。ゆえに、いくつかの場合、適切な骨格ポリペプチドは、該骨格ポリペプチドを欠く対照多量体ポリペプチドと比較して、該多量体ポリペプチドのインビボ半減期(例えば、血清半減期)を延ばす。例えば、いくつかの場合、骨格ポリペプチドは、該骨格ポリペプチドを欠く対照多量体ポリペプチドと比較して、該多量体ポリペプチドのインビボ半減期(例えば、血清半減期)を、少なくとも約10%,少なくとも約15%,少なくとも約20%,少なくとも約25%,少なくとも約50%,少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約25倍、少なくとも約50倍、少なくとも約100倍、または100倍超延ばす。例えば、いくつかの場合、Fcポリペプチドは、該Fcポリペプチドを欠く対照多量体ポリペプチドと比較して、該多量体ポリペプチドのインビボ半減期(例えば、血清半減期)を、少なくとも約10%、少なくとも約15%、,少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約2倍、少なくとも約2.5倍、少なくとも約5倍、少なくとも約10倍、少なくとも約25倍、少なくとも約50倍、少なくとも約100倍、または100倍超延ばす。

0120

本開示の多量体ポリペプチドのFcポリペプチドは、ヒトIgG1のFc、ヒトIgG2のFc、ヒトIgG3のFc、ヒトIgG4のFc等でありうる。いくつかの場合、該Fcポリペプチドは、図24A〜Cに示すFc領域のアミノ酸配列に対する少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、該Fc領域は、図24Aに示すヒトIgG1Fcポリペプチドに対する少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、該Fcポリペプチドは、図24Aに示すヒトIgG2 Fcポリペプチドに対する少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;例えば、該Fcポリペプチドは、図24Aに示すヒトIgG2 Fcポリペプチドのアミノ酸99〜325に対する少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、該Fcポリペプチドは、図24Aに示すヒトIgG3 Fcポリペプチドに対する少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;例えば、該Fcポリペプチドは、図24Aに示すヒトIgG3 Fcポリペプチドのアミノ酸19〜246に対する少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、該Fcポリペプチドは、図24Bに示すヒトIgMFcポリペプチドに対する少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;例えば、該Fcポリペプチドは、図24Bに示すヒトIgM Fcポリペプチドのアミノ酸1〜276に対する少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合、該Fcポリペプチドは、図24Cに示すヒトIgAFcポリペプチドに対する少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み;例えば、該Fcポリペプチドは、図24Cに示すヒトIgA Fcポリペプチドのアミノ酸1〜234に対する少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

0121

追加ポリペプチド
本開示の多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖は、上述したものに加えて1つ以上のポリペプチドを含むことができる。適切な追加ポリペプチドとしては、エピトープタグ及び親和性ドメインが挙げられる。該1つ以上の追加ポリペプチドは、本開示の多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖のN末端に、本開示の多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖のC末端に、または、本開示の多量体ポリペプチドのポリペプチド鎖の内部に含まれうる。

0122

エピトープタグ
適切なエピトープタグとしては、限定されないが、ヘマグルチニンHA;例えば、YPYDVPDYA(SEQID NO:23);FLAG(例えば、DYKDDDDK(SEQ ID NO:24);c−myc(例えば、EQKLISEEDL;SEQ ID NO:25)等が挙げられる。

0123

親和性ドメイン
親和性ドメインとしては、例えば、同定または精製に有用な、固体担体に固定化されたもの等の、結合パートナーと相互作用できるペプチド配列が挙げられる。複数の連続するヒスチジン等の単一のアミノ酸をコードするDNA配列は、発現たんぱく質への融合時、ニッケルセファロース等の樹脂カラムへの高親和性結合による該組み換えタンパク質の一段階精製に用いられうる。典型的な親和性ドメインとしては、His5(HHHHH)(SEQID NO:26)、HisX6(HHHHHH)(SEQ ID NO:27)、C−myc(EQKLISEEDL)(SEQ ID NO:25)、Flag(DYKDDDDK)(SEQ ID NO:24)、StrepTag(WSHPQFEK)(SEQ ID NO:28)、ヘマグルチニン、例えば、HATag(YPYDVPDYA)(SEQ ID NO:23)、グルタチオン‐S‐トランスフェラーゼ(GST)、チオレドキシンセルロース結合ドメイン、RYIRS(SEQ ID NO:30)、Phe−His−His−Thr(SEQ ID NO:31)、キチン結合ドメイン、S‐ペプチド、T7ペプチド、SH2ドメイン、C末端RNAタグ、

金属結合ドメイン、例えば、亜鉛結合ドメインまたはカルシウム結合ドメイン、例えば、カルシウム結合タンパク質、例えば、カルモジュリントロポニンC、カルシニューリンB、ミオシン軽鎖リカバリン、S−モジュリン、ビジニン、VILIP、ニューロカルシン、ヒポカルシン、フリクエニン、カルトクチンカルパインラージサブユニット、S100タンパク質、パルブアルブミンカルビンジンD9K、カルビンジンD28K、及びカルレチニン由来のもの、インテインビオチンストレプトアビジン、MyoD、Id、ロイシンジッパー配列、及びマルトース結合タンパク質が挙げられる。

0124

修飾
本開示の多量体ポリペプチドは、該多量体ポリペプチドに共有結合的に連結した1つ以上の非ポリペプチド部分を含むことができる。適切な非ポリペプチド部分としては、例えば、生体適合性脂肪酸及びそれらの誘導体ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、例えば、ヒドロキシエチルデンプンHES);ポリエチレングリコール、;ヒアルロン酸(HA);ヘパロサンポリマー(HEP);ホスホリルコリン系ポリマー;デキストランポリシアル酸(PSA)等が挙げられる。いくつかの場合、該非ポリペプチド部分は、該非ポリペプチド部分を含まない対照多量体ポリペプチドと比較して、該多量体ポリペプチドのインビボ半減期を延ばす。

0125

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、検出可能な標識を具備する。適切な検出可能な標識としては、放射性同位体、例えば、1231I(ヨウ素)、18F(フッ素)、99Tc(テクネチウム)、111In(インジウム)、67Ga(ガリウム)、放射性Gd同位体(153Gd);造影剤、例えばガドリニウム(Gd)、ジスプロシウム、及び鉄;検出可能な産物を生成する酵素(例えば、ルシフェラーゼβ−ガラクトシダーゼ西ワサビペルオキシダーゼアルカリフォスファターゼ等);蛍光タンパク質;発色タンパク質、染料(例えば、フルオレセインイソチオシアネートローダミンフィコエリトリン等);蛍光発光金属、例えば、152Eu、またはランタン系列のその他;化学発光化合物、例えば、ルミノールイソルミノール、アクリジニウム塩等;生物発光化合物等が挙げられる。

0126

活性
本開示の多量体ポリペプチドに存在する免疫調節(「MOD」)ポリペプチドの特質に応じて、該多量体ポリペプチドは標的T細胞を活性化または阻害できる。本開示の多量体ポリペプチドは、該多量体ポリペプチドに存在するエピトープ特異的な標的T細胞を選択的に活性化または阻害する。「標的T細胞」としては、エピトープ特異的CD4+T細胞、エピトープ特異的CD8+T細胞が挙げられる。いくつかの場合、該標的CD4+T細胞はヘルパーT細胞(例えば、Th1、Th2、またはTh17細胞)である。いくつかの場合、該標的CD4+T細胞はCD4+/CD25+/FoxP3+制御性T(Treg)細胞である。いくつかの場合、該標的T細胞は、CD8+T細胞であり、細胞毒性T細胞である。いくつかの場合、該標的T細胞は、CD4+T細胞またはCD8+T細胞であることができ一般にCD45RO+である、メモリーT細胞である。いくつかの場合、該標的T細胞はNK−T細胞である。

0127

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、T細胞のホーミング及びトラフィッキングを高める。例えば、いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、標的T細胞との接触時、治療部位への該標的T細胞の溢出を高める。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、標的T細胞との接触時、治療部位への該標的T細胞の溢出を、該多量体ポリペプチドと接触されない該標的T細胞の溢出レベルと比較して、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、または100倍超高める。溢出の増大で、治療部位でのT細胞数を増加させることができる。いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、標的T細胞との接触時、治療部位でのT細胞数を増加させる。

0128

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、標的T細胞によるリンパ球のトラフィッキングを媒介または制御する、1つ以上のタンパク質の該標的T細胞による発現を高める。例えば、いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、標的T細胞との接触時、該標的T細胞における1つ以上の接着分子及び/またはケモカイン受容体分子のレベルを増加させる。例えば、いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、標的T細胞との接触時、該標的T細胞による1つ以上の接着分子及び/またはケモカイン受容体分子の発現を、該多量体ポリペプチドと接触されない該標的T細胞によって産生される該接着分子及び/またはケモカイン受容体分子のレベルと比較して、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、または100倍超高める。接着分子の例としては、CD8T細胞によって産生される接着分子が挙げられ、かかる接着分子の例としては、限定されないが、CD44、LFA−1、及びVLA−4が挙げられる。ケモカイン受容体の例としては、CD8T細胞によって産生されるケモカイン受容体が挙げられ、かかるケモカイン受容体の例としては、限定されないが、CCR5、CCR7、及びCXCR3が挙げられる。

0129

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、以前に認識したエピトープに対する迅速な細胞障害反応が可能なメモリーT細胞を生成する。例えば、いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、標的T細胞との接触時、0.5%以上の抗原特異的T細胞プールを含むメモリーT細胞を生成する。例えば、いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、標的T細胞との接触時、0.5%以上、1%以上、2%以上、3%以上、4%以上、5%以上、10%以上、15%以上、または20%以上の抗原特異的T細胞プールを含むメモリーT細胞を生成する。Tメモリー細胞細胞表面マーカーの一例はCD45ROである。

0130

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、標的T細胞の増殖を高める。例えば、いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、標的T細胞との接触時、該標的T細胞の増殖を、該多量体ポリペプチドと接触されない該標的T細胞の増殖と比較して、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、または100倍超高める。

0131

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、標的細胞に対するT細胞の細胞毒性を高める。例えば、いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、標的T細胞との接触時、標的細胞に対する該T細胞の細胞毒性を、該多量体ポリペプチドと接触されない該標的細胞に対する該T細胞の細胞毒性と比較して、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、または100倍超高める。T細胞の標的としては、ウイルス感染細胞、がん細胞等が挙げられる。

0132

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、標的T細胞によるサイトカイン産生を高める。例えば、いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、標的T細胞との接触時、該T細胞によるサイトカイン産生を、該多量体ポリペプチドと接触されない該標的T細胞によって産生されるサイトカインレベルと比較して、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも75%、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、少なくとも100倍、または100倍超高める。サイトカインの例としては、Th1細胞によって産生されるサイトカイン、例えば、IL−2、IFN−γ、及びTNF−α;Th17細胞によって産生されるサイトカイン、例えば、IL−17、IL−21、及びIL−22;Treg細胞によって産生されるサイトカイン、例えば、TGF−β、IL−35、及びIL−10が挙げられる。

0133

いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、標的T細胞によるサイトカイン産生を阻害する。例えば、いくつかの場合、本開示の多量体ポリペプチドは、標的T細胞との接触時、標的T細胞によるサイトカイン産生を、該多量体ポリペプチドと接触されない該標的T細胞によって産生されるサイトカインレベルと比較して、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、もしくは少なくとも90%、または90%超阻害する。サイトカインの例としては、Th2細胞によって産生されるサイトカイン、例えば、IL−4、IL−5、IL−6、IL−10、及びIL−13が挙げられる。

0134

典型的な実施形態
本開示の多量体ポリペプチドの限定されない例としては以下が挙げられる。

0135

1)a)N末端からC末端の順にi)T細胞エピトープ;ii)MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド;及びiii)4−BBLポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)MHCクラスI重鎖ポリペプチド;及びii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチド。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチドは、該エピトープと該β2ミクログロブリンポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該リンカーポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合され;これら実施形態のいくつかでは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド及び/または該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、該ジスルフィド結合に関与するシステインを提供するためのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG2 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG3 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgAFcポリペプチドまたはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、MHCクラスIIのポリペプチドが該MHCクラスIのポリペプチドの代わりに用いられる。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、エピトープタグ及び/または親和性ドメインを該FcポリペプチドのC末端に含む。

0136

2)a)N末端からC末端の順にi)T細胞エピトープ;ii)MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド;及びiii)PD−L1ポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)MHCクラスI重鎖ポリペプチド;及びii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチド。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチドは該エピトープと該β2ミクログロブリンポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該リンカーポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合される。該エピトープと該β2ミクログロブリンポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合され;これら実施形態のいくつかでは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド及び/または該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、該ジスルフィド結合に関与するシステインを提供するためのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG2 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG3 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgAFcポリペプチドまたはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、MHCクラスIIのポリペプチドが該MHCクラスIのポリペプチドの代わりに用いられる。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、エピトープタグ及び/または親和性ドメインを該FcポリペプチドのC末端に含む。

0137

3)a)N末端からC末端の順にi)T細胞エピトープ;ii)MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド;及びiii)ICOS−Lポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)MHCクラスI重鎖ポリペプチド;及びii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチド。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチドは該エピトープと該β2ミクログロブリンポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該リンカーポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合され;これら実施形態のいくつかでは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド及び/または該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、該ジスルフィド結合に関与するシステインを提供するためのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG2 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG3 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgAFcポリペプチドまたはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、MHCクラスIIのポリペプチドが該MHCクラスIのポリペプチドの代わりに用いられる。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、エピトープタグ及び/または親和性ドメインを該FcポリペプチドのC末端に含む。

0138

4)a)N末端からC末端の順にi)T細胞エピトープ;ii)MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド;及びiii)OX40Lポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)MHCクラスI重鎖ポリペプチド;及びii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチド。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチドは該エピトープと該β2ミクログロブリンポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該リンカーポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合され;これら実施形態のいくつかでは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド及び/または該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、該ジスルフィド結合に関与するシステインを提供するためのアミノ酸置換を含む。一部の例で は、該Ig のFcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG2 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG3 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgAFcポリペプチドまたはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、MHCクラスIIのポリペプチドが該MHCクラスIのポリペプチドの代わりに用いられる。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、エピトープタグ及び/または親和性ドメインを該FcポリペプチドのC末端に含む。

0139

5)a)N末端からC末端の順にi)T細胞エピトープ;ii)MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド;及びiii)CD80ポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)MHCクラスI重鎖ポリペプチド;及びii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチド。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチドは該エピトープと該β2ミクログロブリンポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該リンカーポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合され;これら実施形態のいくつかでは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド及び/または該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、該ジスルフィド結合に関与するシステインを提供するためのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG2 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG3 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgAFcポリペプチドまたはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、MHCクラスIIのポリペプチドが該MHCクラスIのポリペプチドの代わりに用いられる。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、エピトープタグ及び/または親和性ドメインを該FcポリペプチドのC末端に含む。

0140

6)a)N末端からC末端の順にi)T細胞エピトープ;ii)MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド;及びiii)CD86ポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)MHCクラスI重鎖ポリペプチド;及びii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチド。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチドは該エピトープと該β2ミクログロブリンポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該リンカーポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合され;これら実施形態のいくつかでは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド及び/または該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、該ジスルフィド結合に関与するシステインを提供するためのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG2 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG3 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgAFcポリペプチドまたはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、MHCクラスIIのポリペプチドが該MHCクラスIのポリペプチドの代わりに用いられる。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、エピトープタグ及び/または親和性ドメインを該FcポリペプチドのC末端に含む。

0141

7)a)N末端からC末端の順にi)T細胞エピトープ;ii)MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド;及びiii)PD−L2ポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)MHCクラスI重鎖ポリペプチド;及びii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチドである。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチドは該エピトープと該β2ミクログロブリンポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該リンカーポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合され;これら実施形態のいくつかでは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド及び/または該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、該ジスルフィド結合に関与するシステインを提供するためのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG2 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG3 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgAFcポリペプチドまたはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、MHCクラスIIのポリペプチドが該MHCクラスIのポリペプチドの代わりに用いられる。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、エピトープタグ及び/または親和性ドメインを該FcポリペプチドのC末端に含む。

0142

8)a)N末端からC末端の順にi)T細胞エピトープ;及びii)MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)i)4−BBLポリペプチド;ii)MHCクラスI重鎖ポリペプチド;及びiii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチド。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチドは該エピトープと該β2ミクログロブリンポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該リンカーポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合され;これら実施形態のいくつかでは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド及び/または該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、該ジスルフィド結合に関与するシステインを提供するためのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG2 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG3 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgAFcポリペプチドまたはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、MHCクラスIIのポリペプチドが該MHCクラスIのポリペプチドの代わりに用いられる。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、エピトープタグ及び/または親和性ドメインを該FcポリペプチドのC末端に含む。

0143

9)a)N末端からC末端の順にi)T細胞エピトープ;及びii)MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)i)PD−L1ポリペプチド;ii)MHCクラスI重鎖ポリペプチド;及びiii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチド。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチドは該エピトープと該β2ミクログロブリンポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該リンカーポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合され;これら実施形態のいくつかでは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド及び/または該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、該ジスルフィド結合に関与するシステインを提供するためのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG2 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG3 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgAFcポリペプチドまたはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、MHCクラスIIのポリペプチドが該MHCクラスIのポリペプチドの代わりに用いられる。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、エピトープタグ及び/または親和性ドメインを該FcポリペプチドのC末端に含む。

0144

10)a)N末端からC末端の順にi)T細胞エピトープ;及びii)MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)i)ICOS−Lポリペプチド;ii)MHCクラスI重鎖ポリペプチド;及びiii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチド。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチドは該エピトープと該β2ミクログロブリンポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該リンカーポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合され;これら実施形態のいくつかでは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド及び/または該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、該ジスルフィド結合に関与するシステインを提供するためのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG2 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG3 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgAFcポリペプチドまたはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、MHCクラスIIのポリペプチドが該MHCクラスIのポリペプチドの代わりに用いられる。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、エピトープタグ及び/または親和性ドメインを該FcポリペプチドのC末端に含む。

0145

11)a)N末端からC末端の順にi)T細胞エピトープ;及びii)MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)i)OX40Lポリペプチド;ii)MHCクラスI重鎖ポリペプチド;及びiii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチド。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチドは該エピトープと該β2ミクログロブリンポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該リンカーポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合され;これら実施形態のいくつかでは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド及び/または該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、該ジスルフィド結合に関与するシステインを提供するためのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG2 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG3 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgAFcポリペプチドまたはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、MHCクラスIIのポリペプチドが該MHCクラスIのポリペプチドの代わりに用いられる。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、エピトープタグ及び/または親和性ドメインを該FcポリペプチドのC末端に含む。

0146

12)a)N末端からC末端の順にi)T細胞エピトープ;及びii)MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)i)CD80ポリペプチド;ii)MHCクラスI重鎖ポリペプチド;及びiii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチド。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチドは該エピトープと該β2ミクログロブリンポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該リンカーポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合され;これら実施形態のいくつかでは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド及び/または該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、該ジスルフィド結合に関与するシステインを提供するためのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG2 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG3 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgAFcポリペプチドまたはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、MHCクラスIIのポリペプチドが該MHCクラスIのポリペプチドの代わりに用いられる。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、エピトープタグ及び/または親和性ドメインを該FcポリペプチドのC末端に含む。

0147

13)a)N末端からC末端の順にi)T細胞エピトープ;及びii)MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)i)CD86ポリペプチド;ii)MHCクラスI重鎖ポリペプチド;及びiii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチド。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチドは該エピトープと該β2ミクログロブリンポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該リンカーポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合され;これら実施形態のいくつかでは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド及び/または該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、該ジスルフィド結合に関与するシステインを提供するためのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG2 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG3 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgAFcポリペプチドまたはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、MHCクラスIIのポリペプチドが該MHCクラスIのポリペプチドの代わりに用いられる。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、エピトープタグ及び/または親和性ドメインを該FcポリペプチドのC末端に含む。

0148

14)a)N末端からC末端の順にi)T細胞エピトープ;及びii)MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)i)PD−L2ポリペプチド;ii)MHCクラスI重鎖ポリペプチド;及びiii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチド。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチドは該エピトープと該β2ミクログロブリンポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該リンカーポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合され;これら実施形態のいくつかでは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド及び/または該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、該ジスルフィド結合に関与するシステインを提供するためのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG2 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG3 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgAFcポリペプチドまたはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、MHCクラスIIのポリペプチドが該MHCクラスIのポリペプチドの代わりに用いられる。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、エピトープタグ及び/または親和性ドメインを該FcポリペプチドのC末端に含む。

0149

15)a)N末端からC末端の順にi)T細胞エピトープ;及びii)MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドを含む第一のポリペプチド;並びにb)N末端からC末端の順にi)i)FasLポリペプチド;ii)MHCクラスI重鎖ポリペプチド;及びiii)IgFcポリペプチドを含む第二のポリペプチドを含む多量体ポリペプチド。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチドは該エピトープと該β2ミクログロブリンポリペプチドの間にリンカーポリペプチドを含む。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該リンカーポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合される。いくつかの場合、該第一のポリペプチド及び該第二のポリペプチドは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチドに存在するシステイン残基と該MHCクラスI重鎖ポリペプチドに存在するシステイン残基を介して互いにジスルフィド結合され;これら実施形態のいくつかでは、該MHCクラスIβ2ミクログロブリンポリペプチド及び/または該MHCクラスI重鎖ポリペプチドは、該ジスルフィド結合に関与するシステインを提供するためのアミノ酸置換を含む。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG1 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG2 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgG3 Fcポリペプチドである。いくつかの場合、該Ig Fcポリペプチドは、IgAFcポリペプチドまたはIgMFcポリペプチドである。いくつかの場合、MHCクラスIIのポリペプチドが該MHCクラスIのポリペプチドの代わりに用いられる。いくつかの場合、該多量体ポリペプチドは、エピトープタグ及び/または親和性ドメインを該FcポリペプチドのC末端に含む。

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