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図面 (12)

課題

補体関連障害処置するための組成物および方法を提供すること。

解決手段

CD46タンパク質、CD55タンパク質およびCD59タンパク質の少なくとも2つのタンパク質融合物を組み合わせて有するタンパク質、またはCD46タンパク質、CD55タンパク質およびCD59タンパク質の少なくとも2つを有する組換えキメラタンパク質、またはこれらのタンパク質をコードする核酸を用いて、被験体において補体関連障害を処置するための組成物、方法およびキットが提供される。この組成物は、古典的補体経路および第二補体経路を負にモジュレートし、それによって、補体関連障害、例えば、黄斑変性加齢黄斑変性糖尿病性網膜症炎症性腸疾患甲状腺炎クリオグロブリン血症胎児消失臓器グラフト拒絶がんなどを処置する。

概要

背景

補体系は、侵入する病原体不活化し、組織恒常性を維持することを担う、先天免疫
体液性成分である(Thurman, J.M.ら、2011年 Lab Inves
t 91巻:4〜11頁)。補体系は強力であり、したがって、補体の種々の可溶性阻害
剤および膜結合型阻害剤によって厳重に調節される(Thurman, J.M.ら、2
011年 Lab Invest 91巻:4〜11頁、Zipfel, P.F.ら、
2009年 Nat Rev Immunol 9巻:729〜740頁)。補体の不適
切な活性化は、自己免疫性炎症性血液学的神経変性がん虚血再灌流傷害、臓
移植および敗血症を含む、広範な種々の遺伝性および後天性疾患と関連付けられてきた
(Zipfel, P.F.ら、2009年 Nat Rev Immunol 9巻:
729〜740頁、Makrides, S.C. 1998年 Pharmacol
Rev 50巻:59〜87頁、Holers, V.M. 2008年 Immuno
l Rev 223巻:300〜316頁)。医療用インプラント血液透析フィルター
および遺伝子送達系などの生体材料中に存在する外来表面もまた、補体の活性化を誘発す
る(Makrides, S.C. 1998年 Pharmacol Rev 50巻
:59〜87頁)。

補体の急性活性化は、敗血症または移植片拒絶などの疾患において生じる。しかし、補
体の活性化と関連する障害の大部分は、加齢黄斑変性(AMD)、発作性夜間ヘモグロ
尿症または関節リウマチなど、慢性である(Zipfel, P.F.ら、2009年
Nat Rev Immunol 9巻:729〜740頁)。補体が関与する慢性疾
患の一部分は、補体の調節因子における欠損によって引き起こされる(Zipfel,
P.F.ら、2009年 Nat Rev Immunol 9巻:729〜740頁)
。補体調節因子における欠損は、主に第二経路のものであり、遺伝性血管浮腫または全身
エリテマトーデスSLE)などでは、古典的経路がこれに関与し得る(Mayily
an, K.R. 2012年 Protein Cell 3巻:487〜496頁)

補体の活性化は、細胞膜破壊し、引き続いて細胞を溶解させる孔である細胞膜傷害
合体(MAC)の形成をもたらす(Walport, M.J. 2001年 N En
gl J Med 344巻:1058〜1066頁)。補体調節因子における多型性
たは変異とカップリングされたMACの上昇したレベルが、AMDなどの慢性疾患を有す
患者において見出され、このことは、補体活性化における種々のチェックポイントにお
ける不全が疾患病因と関連することを示している(Mullins, R.F.ら、20
11年 Exp Eye Res 93巻:565〜567頁)。AMDを有する個体の
場合、MACを形成する低減された能力を有する個体は、顕著な合併症なしに疾患病因か
ら部分的に防御され、このことは、慢性障害に対する、補体活性化の長期減弱が、AMD
および他の補体関連の障害、例えば関節リウマチの処置のための実行可能なアプローチ
あり得るという前提を支持している(Nishiguchi, K.M.ら、2012年
Invest Ophthalmol Vis Sci 53巻:508〜512頁、
Piccoli, A.K.ら、2011年 Rev Bras Reumatol 5
1巻:503〜510頁)。

本願の出願の時点では、患者にとって利用可能な、補体のFDA認可された阻害剤は、
僅かしか存在していない(Ricklin, D.およびLambris, J.D.
2013年 J Immunol 190巻:3839〜3847頁)。AMDなどの慢
性障害に関して、これらの治療剤の一部は、眼への補体阻害剤の反復注射を必要とし、こ
れは、顕著な副作用と関連する送達様式である(Wu, L.ら、2008年 Grae
fes Arch Clin Exp Ophthalmol 246巻:81〜87頁
、Shima, C.ら、2008年 Acta Ophthalmol 86巻:37
2〜376頁)。

概要

補体関連障害を処置するための組成物および方法を提供すること。CD46タンパク質、CD55タンパク質およびCD59タンパク質の少なくとも2つのタンパク質融合物を組み合わせて有するタンパク質、またはCD46タンパク質、CD55タンパク質およびCD59タンパク質の少なくとも2つを有する組換えキメラタンパク質、またはこれらのタンパク質をコードする核酸を用いて、被験体において補体関連障害を処置するための組成物、方法およびキットが提供される。この組成物は、古典的補体経路および第二補体経路を負にモジュレートし、それによって、補体関連障害、例えば、黄斑変性、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症炎症性腸疾患甲状腺炎クリオグロブリン血症胎児消失臓器グラフト拒絶、がんなどを処置する。なし

目的

本発明の一態様は、組換えキメラタンパク質が、古典的補体経路および第二補体経路を
負にモジュレートするように、CD46タンパク質、CD55タンパク質およびCD59
タンパク質の少なくとも2つ由来アミノ酸配列を有する組換えキメラタンパク質、また
は組換えキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、被験体において補体関
連状態を処置するための医薬組成物を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

本明細書に記載の発明。

技術分野

0001

関連出願
この出願は、「Compositions,methodsand kits fo
r treating complement related disorders」
との表題の2014年8月28日に出願された連続番号62/043,084を有する仮
出願(発明者Rajendra Kumar−Singh、Derek Leadere
rおよびSiobhan Cashman)の利益を主張する。この仮出願は、その全体
が参考として本明細書に援用される。

0002

技術分野
本発明は一般に、補体関連障害処置するための組成物および方法に関する。

0003

政府支援
この発明は、National Institute of Health/NEI
よって付与された助成金EY021805およびEY013837の下、政府の支援を受
けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

背景技術

0004

補体系は、侵入する病原体不活化し、組織恒常性を維持することを担う、先天免疫
体液性成分である(Thurman, J.M.ら、2011年 Lab Inves
t 91巻:4〜11頁)。補体系は強力であり、したがって、補体の種々の可溶性阻害
剤および膜結合型阻害剤によって厳重に調節される(Thurman, J.M.ら、2
011年 Lab Invest 91巻:4〜11頁、Zipfel, P.F.ら、
2009年 Nat Rev Immunol 9巻:729〜740頁)。補体の不適
切な活性化は、自己免疫性炎症性血液学的神経変性がん虚血再灌流傷害、臓
移植および敗血症を含む、広範な種々の遺伝性および後天性疾患と関連付けられてきた
(Zipfel, P.F.ら、2009年 Nat Rev Immunol 9巻:
729〜740頁、Makrides, S.C. 1998年 Pharmacol
Rev 50巻:59〜87頁、Holers, V.M. 2008年 Immuno
l Rev 223巻:300〜316頁)。医療用インプラント血液透析フィルター
および遺伝子送達系などの生体材料中に存在する外来表面もまた、補体の活性化を誘発す
る(Makrides, S.C. 1998年 Pharmacol Rev 50巻
:59〜87頁)。

0005

補体の急性活性化は、敗血症または移植片拒絶などの疾患において生じる。しかし、補
体の活性化と関連する障害の大部分は、加齢黄斑変性(AMD)、発作性夜間ヘモグロ
尿症または関節リウマチなど、慢性である(Zipfel, P.F.ら、2009年
Nat Rev Immunol 9巻:729〜740頁)。補体が関与する慢性疾
患の一部分は、補体の調節因子における欠損によって引き起こされる(Zipfel,
P.F.ら、2009年 Nat Rev Immunol 9巻:729〜740頁)
。補体調節因子における欠損は、主に第二経路のものであり、遺伝性血管浮腫または全身
エリテマトーデスSLE)などでは、古典的経路がこれに関与し得る(Mayily
an, K.R. 2012年 Protein Cell 3巻:487〜496頁)

0006

補体の活性化は、細胞膜破壊し、引き続いて細胞を溶解させる孔である細胞膜傷害
合体(MAC)の形成をもたらす(Walport, M.J. 2001年 N En
gl J Med 344巻:1058〜1066頁)。補体調節因子における多型性
たは変異とカップリングされたMACの上昇したレベルが、AMDなどの慢性疾患を有す
患者において見出され、このことは、補体活性化における種々のチェックポイントにお
ける不全が疾患病因と関連することを示している(Mullins, R.F.ら、20
11年 Exp Eye Res 93巻:565〜567頁)。AMDを有する個体の
場合、MACを形成する低減された能力を有する個体は、顕著な合併症なしに疾患病因か
ら部分的に防御され、このことは、慢性障害に対する、補体活性化の長期減弱が、AMD
および他の補体関連の障害、例えば関節リウマチの処置のための実行可能なアプローチ
あり得るという前提を支持している(Nishiguchi, K.M.ら、2012年
Invest Ophthalmol Vis Sci 53巻:508〜512頁、
Piccoli, A.K.ら、2011年 Rev Bras Reumatol 5
1巻:503〜510頁)。

0007

本願の出願の時点では、患者にとって利用可能な、補体のFDA認可された阻害剤は、
僅かしか存在していない(Ricklin, D.およびLambris, J.D.
2013年 J Immunol 190巻:3839〜3847頁)。AMDなどの慢
性障害に関して、これらの治療剤の一部は、眼への補体阻害剤の反復注射を必要とし、こ
れは、顕著な副作用と関連する送達様式である(Wu, L.ら、2008年 Grae
fes Arch Clin Exp Ophthalmol 246巻:81〜87頁
、Shima, C.ら、2008年 Acta Ophthalmol 86巻:37
2〜376頁)。

先行技術

0008

Ricklin,D.およびLambris,J.D. J Immunol(2013年)190巻:3839〜3847頁
Wu,L.ら、Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol(2008年)246巻:81〜87頁
Shima,C.ら、Acta Ophthalmol(2008年)86巻:372〜376頁

発明が解決しようとする課題

0009

AMDおよび肝臓障害などの補体疾患を処置するための、補体の阻害剤が必要とされて
いる。

課題を解決するための手段

0010

本発明の一態様は、組換えキメラタンパク質が、古典的補体経路および第二補体経路を
負にモジュレートするように、CD46タンパク質、CD55タンパク質およびCD59
タンパク質の少なくとも2つ由来アミノ酸配列を有する組換えキメラタンパク質、また
は組換えキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、被験体において補体関
連状態を処置するための医薬組成物を提供する。この組成物の一実施形態では、組換え
メラタンパク質は、可溶性活性補体ターミネーターである。この組成物の一実施形態では
、変異が、置換欠失および付加の少なくとも1つであるように、CD59タンパク質の
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、グリコシルホスファチジルイノシトール
(GPI)アンカリングドメイン機能喪失を付与する少なくとも1つの変異を含む。こ
の組成物の一実施形態では、変異が、置換、欠失および付加の少なくとも1つであるよう
に、CD55タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、グリコシル
スファチジルイノシトール(GPI)アンカリングドメインの機能喪失を付与する少なく
とも1つの変異を含む。この組成物の一実施形態では、変異が、置換、欠失および付加の
少なくとも1つを含むように、CD46タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオ
チド配列は、膜貫通ドメインの機能喪失を付与する少なくとも1つの変異を含む。一部の
実施形態では、この組成物は、補体関連状態について被験体を処置するのに有効な用量で
製剤化される。一部の実施形態では、CD59タンパク質のアミノ酸配列は、分泌シグナ
ルペプチドを含む。

0011

この組成物の一部の実施形態では、タンパク質は、CD59タンパク質およびCD46
タンパク質のアミノ酸配列;CD46タンパク質およびCD55タンパク質のアミノ酸
列;ならびにCD55タンパク質およびCD59タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも
1つを接続するリンカーをさらに含む。この組成物の別の実施形態では、ヌクレオチド
列は、少なくとも1つのアミノ酸、例えばグリシンセリンまたはアラニンを含むリンカ
ーをさらにコードする。この組成物の一実施形態では、CD46、CD55およびCD5
9タンパク質のアミノ酸配列は、これらのタンパク質の発現作動可能に連結した転写
合物および発現と同じリーディングフレームタンパク質融合物をコードする核酸によっ
てコードされる。

0012

この組成物の一実施形態では、CD46タンパク質アミノ酸配列は、ショートコンセン
サスリピートドメインおよびセリン/スレオニンプロリンリッチドメインの少なくとも
1つを含む、またはCD46タンパク質アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、
膜貫通ドメインの喪失を生じる少なくとも1つの変異、例えば、置換、欠失もしくは付加
を含む、またはCD55タンパク質アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列は、CD
55タンパク質のグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカリングドメ
ンの機能喪失を生じる少なくとも1つの変異を含み、この変異は、置換、欠失もしくは付
加を含む、またはCD55タンパク質アミノ酸配列は、ショートコンセンサスリピート
メインおよびセリン/スレオニン/プロリンリッチドメインの少なくとも1つを含む。

0013

この組成物の一実施形態では、組換えキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列
は、プラスミドを構成する。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ウイルスベクタ
ーを構成する。この組成物の一実施形態では、ベクターは、アデノウイルスアデノ随伴
ウイルスヘルペスウイルスポックスウイルスおよびレンチウイルスの群より選択され
る少なくとも1つである。一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、ベータアクチン
例えばニワトリベータアクチン、ペリフェリン/RDS、cGMPホスホジエステラーゼ
およびロドプシンからなる群より選択される遺伝子由来のプロモーターを含む。この組成
物の一部の実施形態は、細胞または組織を標的化するように作出(engineer)さ
れた送達ビヒクルをさらに含み、この送達ビヒクルは、リポソーム、脂質、ポリカチオン
ペプチドナノ粒子金粒子およびポリマーの群より選択される。この組成物の一実施
形態は、薬学的に許容される塩または軟化薬の少なくとも1つをさらに含む。この組成物
の一実施形態は、抗腫瘍剤抗凝固剤抗ウイルス剤抗菌剤、抗マイコバクテリア剤、
抗真菌剤抗増殖剤および抗アポトーシス剤からなる群より選択される薬剤をさらに含む

0014

本発明の一態様は、被験体において補体関連状態を処置する方法であって、ヌクレオチ
ド配列が、CD59タンパク質、CD46タンパク質およびCD55タンパク質の各々の
アミノ酸配列をコードするように、または組成物が、CD46タンパク質、CD55タン
パク質、CD59タンパク質もしくは組換えキメラタンパク質をコードするヌクレオチド
配列を保有するベクターを含むように、被験体の細胞を、細胞において組換えキメラタン
パク質の発現を引き起こすプロモーター配列に作動可能に連結したCD46タンパク質、
CD55タンパク質およびCD59タンパク質または組換えキメラタンパク質を含む組成
物と接触させるステップ;被験体における補体関連状態の症状を測定するステップ;被験
体の症状を、接触させるステップの前の症状と比較するステップ;ならびに被験体におけ
る補体関連状態の症状における減少を測定するステップを含み、それによって補体関連状
態を処置する方法を提供する。この方法の一実施形態では、組換えキメラタンパク質は、
可溶性活性補体ターミネーターである。

0015

この方法の一実施形態では、測定するステップは、補体経路のタンパク質の量および細
胞膜傷害複合体の量の少なくとも1つを測定するステップを含む。一実施形態では、細胞
が、筋肉上皮内皮および脈管から選択されるように、または細胞が、眼、心臓腎臓
甲状腺、脳、肝臓膵臓および脈管系の少なくとも1つにおける組織から選択
されるように、細胞膜傷害複合体を測定するステップは、細胞における細胞膜傷害複合体
の量を分析するステップを含む。これらの方法の実施形態では、状態は、黄斑変性加齢
黄斑変性、炎症性腸疾患甲状腺炎クリオグロブリン血症(cryoglobulin
aemia)、胎児消失(fetal loss)、臓器グラフト拒絶(organ g
raft rejection)、敗血症、ウイルス感染症真菌感染症細菌感染症
トキシックショック症候群TSS)、膜性増殖性糸球体腎炎、デンスデポジット病(d
ense deposit disease)、発作性夜間ヘモグロビン尿症(pero
ximal nocturnal hemoglobinurea)、ループス腎炎、膜
腎炎(membranous nephritis)、免疫グロブリンA腎症グッド
パスチャー症候群連鎖球菌感染後糸球体腎炎(post−streptococcal
glomerulonephritis)、全身性エリテマトーデス、非典型溶血性尿
毒症症候群、全身性エリテマトーデス(systemic lupus erythro
matosis)、ループス関節炎(lupus arthritis)、関節リウマチ
シェーグレン症候群ベーチェット症候群全身性硬化症アルツハイマー病多発性
硬化症重症筋無力症ギランバレー症候群大脳ループス(cerebral lu
pus)、脳卒中、成人呼吸促迫症候群慢性閉塞性肺疾患嚢胞性線維症溶血性貧血
発作性寒冷ヘモグロビン尿症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、血管炎天疱瘡水疱
類天疱瘡光毒性反応(phototoxic reaction)、乾癬、アナフィ
キシーショックアレルギー喘息心筋梗塞糖尿病性網膜症微小脈管障害(mic
rovasculopathy)、皮膚筋炎B細胞リンパ増殖性障害、脱髄疾患、急性
腎臓傷害、COPD、Rh疾患(Rh disease)、免疫性溶血性貧血、免疫性血
小板減少性紫斑病、補体関連糸球体症およびアテローム動脈硬化症の群より選択される。

0016

この方法の一部の実施形態では、細胞を、in vitroまたはex vivoまた
はin vivoまたはin situで接触させる。一部の実施形態では、この方法は
、細胞を接触させるステップの前に、組換えキメラタンパク質をコードするヌクレオチド
を保有するベクターを作出するステップをさらに含む。この方法の一部の実施形態では、
作出するステップは、少なくとも1つの変異が、グリコシルホスファチジルイノシトール
(GPI)アンカリングドメインの機能喪失を生じるように、CD55タンパク質アミノ
酸配列をコードする核酸を変異させるステップを含み、または作出するステップは、少な
くとも1つの変異が、膜貫通ドメインの除去を生じるように、CD46タンパク質アミノ
酸配列をコードする核酸を変異させるステップを含み、または作出するステップは、少な
くとも1つの変異が、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカリングド
メインの機能喪失を生じるように、CD59タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸配
列を変異させるステップを含み、または作出するステップは、CD46タンパク質C末端
をコードする核酸を、CD55タンパク質N末端のアミノ酸をコードする核酸と組換え接
合するステップ、およびCD55タンパク質C末端をコードする核酸配列を、CD59タ
ンパク質N末端をコードする核酸と組換え接合するステップを含む。一部の実施形態では
、この変異は、置換、欠失および付加の少なくとも1つを含む。この方法の一部の実施形
態では、細胞を接触させるステップは、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、粘膜、皮下、
下、鼻腔内、経口、眼内、硝子体内外用(topical)、経皮および注入から
なる群より選択される少なくとも1つの経路によって組成物を投与するステップを含む。

0017

本発明の一態様は、被験体において補体関連状態を調節するためのキットまたはそれを
処置するキットを提供し、このキットは、その組成物が、古典的補体経路および第二補体
経路を負にモジュレートし、補体関連状態について被験体を処置するのに有効な用量で製
剤化されるように、CD46タンパク質、CD55タンパク質およびCD59タンパク質
の各々由来のアミノ酸配列を含む組換えキメラタンパク質、または組換えキメラタンパク
質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物;被験体を処置するための指示;ならびに
容器を含む。

0018

本発明の一態様は、被験体において補体関連状態を処置するための医薬組成物であって
、組換えキメラタンパク質が、古典的補体経路および第二補体経路を負にモジュレートす
るように、CD55タンパク質およびCD59タンパク質由来のアミノ酸配列を有する組
換えキメラタンパク質、または組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列を含
む医薬組成物を提供する。

0019

本発明の一態様は、被験体において補体関連状態を処置するための医薬組成物であって
、第1または第2のタンパク質が、古典的補体経路および第二補体経路を負にモジュレー
トするように、CD46タンパク質、CD55タンパク質およびCD59タンパク質の少
なくとも2つ由来のアミノ酸配列、またはCD46タンパク質、CD55タンパク質およ
びCD59タンパク質の各々由来のアミノ酸配列を含む第1の組換えキメラタンパク質、
またはCD55タンパク質およびCD59タンパク質由来のアミノ酸配列を有する第2の
組換えキメラタンパク質、または第1の組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド
配列、または第2の組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列を含む医薬組成
物を提供する。

0020

本発明の一態様は、被験体において補体関連状態を処置するための医薬組成物であって
、第1および第2の組換えキメラタンパク質が、古典的補体経路および第二補体経路を負
にモジュレートするように、CD46タンパク質、CD55タンパク質およびCD59タ
ンパク質の各々由来のアミノ酸配列を含む第1の組換えキメラタンパク質、ならびにCD
55タンパク質およびCD59タンパク質由来のアミノ酸配列を有する第2の組換えキメ
ラタンパク質、または第1の組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列および
第2の組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列を含む医薬組成物を提供する

0021

本発明の一態様は、被験体において補体関連状態を処置する方法であって、ヌクレオチ
ド配列が、CD59タンパク質およびCD55タンパク質の各々のアミノ酸配列をコード
するように、または組成物が、CD55タンパク質、CD59タンパク質もしくは組換え
キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を保有するベクターを含むように、被験
体の細胞を、細胞において組換えキメラタンパク質の発現を引き起こすプロモーター配列
に作動可能に連結したCD55タンパク質およびCD59タンパク質または組換えキメラ
タンパク質を含む組成物と接触させるステップ;ならびに被験体における補体関連状態の
症状を観察するステップ;被験体の症状を、接触させるステップの前の症状と比較するス
テップ;ならびに被験体における補体関連状態の症状における減少を観察するステップを
含み、それによって補体関連状態を処置する方法を提供する。この方法の一実施形態では
、組換えキメラタンパク質は、活性補体の二重ターミネーターである。

0022

この方法の一実施形態では、測定するステップは、補体経路のタンパク質および細胞膜
傷害複合体の量の少なくとも1つを測定するステップを含む。この方法の一実施形態では
、細胞が、筋肉、上皮、内皮および脈管から選択されるように、または細胞が、眼、心臓
、腎臓、甲状腺、脳、胃、肺、肝臓、膵臓および脈管系の少なくとも1つにおける組織か
ら選択されるように、細胞膜傷害複合体を測定するステップは、細胞における細胞膜傷害
複合体の量を分析するステップを含む。これらの方法の実施形態では、状態は、黄斑変性
、加齢黄斑変性、炎症性腸疾患、甲状腺炎、クリオグロブリン血症、胎児消失、臓器グラ
フト拒絶、敗血症、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、トキシックショック症候
群(TSS)、膜性増殖性糸球体腎炎、デンスデポジット病、発作性夜間ヘモグロビン尿
症、ループス腎炎、膜性腎炎、免疫グロブリンA腎症、グッドパスチャー症候群、連鎖球
菌感染糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、非典型溶血性尿毒症症候群全身性エリ
テマトーデス、ループス関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、ベーチェット症候
群、全身性硬化症、アルツハイマー病、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレー
候群、大脳ループス、脳卒中、成人呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、
溶血性貧血、発作性寒冷ヘモグロビン尿症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、血管炎、天疱
瘡、水疱性類天疱瘡、光毒性反応、乾癬、アナフィラキシーショック、アレルギー、喘息
、心筋梗塞、糖尿病性網膜症、微小脈管障害、皮膚筋炎、B細胞リンパ増殖性障害、脱髄
疾患、急性腎臓傷害、COPD、Rh疾患、免疫性溶血性貧血、免疫性血小板減少性紫斑
病、補体関連糸球体症およびアテローム動脈硬化症の群より選択される。

0023

この方法の代替的実施形態では、細胞を、in vitro、ex vivoまたはi
n vivoで接触させ、in vivoの場合、おそらくはin situでも接触さ
せる。一部の実施形態では、この方法は、細胞を接触させるステップの前に、組換えキメ
ラタンパク質をコードするヌクレオチドを保有するベクターを作出するステップをさらに
含む。この方法の一部の実施形態では、作出するステップは、少なくとも1つの変異が、
グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカリングドメインの機能喪失を生
じるように、CD55タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸を変異させるステップを
含み、または作出するステップは、少なくとも1つの変異が、膜貫通ドメインの除去を生
じるように、CD46タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸を変異させるステップを
含み、または作出するステップは、少なくとも1つの変異が、グリコシルホスファチジル
イノシトール(GPI)アンカリングドメインの機能喪失を生じるように、CD59タン
パク質アミノ酸配列をコードする核酸配列を変異させるステップを含み、または作出する
ステップは、CD46タンパク質C末端をコードする核酸を、CD55タンパク質N末端
のアミノ酸をコードする核酸と組換え接合するステップ、およびCD55タンパク質C末
端をコードする核酸配列を、CD59タンパク質N末端をコードする核酸と組換え接合す
るステップを含む。一部の実施形態では、この変異は、置換、欠失および付加の少なくと
も1つを含む。この方法の一部の実施形態では、細胞を接触させるステップは、静脈内、
筋肉内、腹腔内、皮内、粘膜、皮下、舌下、鼻腔内、経口、眼内、硝子体内、外用、経皮
、膣および注入からなる群より選択される少なくとも1つの経路によって組成物を投与す
るステップを含む。
本発明は、例えば、以下を提供する。
項目1)
被験体において補体関連状態を処置するための医薬組成物であって、CD46タンパク質、CD55タンパク質およびCD59タンパク質の少なくとも2つ由来のアミノ酸配列を有する組換えキメラタンパク質、または前記組換えキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、前記組換えキメラタンパク質が、古典的補体経路および第二補体経路を負にモジュレートする、医薬組成物。
(項目2)
前記組換えキメラタンパク質が、可溶性活性補体ターミネーターである、項目1に記載の組成物。
(項目3)
前記CD59タンパク質の前記アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列が、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカリングドメインの機能喪失を付与する少なくとも1つの変異を含み、前記変異が、置換、欠失および付加の少なくとも1つである、項目1に記載の組成物。
(項目4)
前記CD55タンパク質の前記アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列が、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカリングドメインの機能喪失を付与する少なくとも1つの変異を含み、前記変異が、置換、欠失および付加の少なくとも1つである、項目1に記載の組成物。
(項目5)
前記CD46タンパク質の前記アミノ酸配列をコードする前記ヌクレオチド配列が、膜貫通ドメインの機能喪失を付与する少なくとも1つの変異を含み、前記変異が、置換、欠失および付加の少なくとも1つを含む、項目1に記載の組成物。
(項目6)
前記補体関連状態について前記被験体を処置するのに有効な用量で製剤化される、項目1に記載の組成物。
(項目7)
前記CD59タンパク質の前記アミノ酸配列が、分泌シグナルペプチドを含む、項目1に記載の組成物。
(項目8)
前記タンパク質が、前記CD59タンパク質および前記CD46タンパク質;前記CD46タンパク質および前記CD55タンパク質;ならびに前記CD55タンパク質および前記CD59タンパク質のアミノ酸配列の少なくとも1つを接続するリンカーをさらに含む、項目1に記載の組成物。
(項目9)
前記ヌクレオチド配列が、少なくとも1つのアミノ酸、例えばグリシン、セリンまたはアラニンを含むリンカーをさらにコードする、項目1に記載の組成物。
(項目10)
前記CD46タンパク質、前記CD55タンパク質および前記CD59タンパク質の前記アミノ酸配列が、前記タンパク質の発現が作動可能に連結した転写融合物および発現と同じリーディングフレームでタンパク質融合物をコードする核酸によってコードされる、項目1に記載の組成物。
(項目11)
前記CD46タンパク質アミノ酸配列が、ショートコンセンサスリピートドメインおよびセリン/スレオニン/プロリンリッチドメインの少なくとも1つを含むか、または前記CD46タンパク質アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、膜貫通ドメインの喪失を生じる少なくとも1つの変異、例えば、置換、欠失もしくは付加を含むか、またはCD55タンパク質アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が、前記CD55タンパク質のグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカリングドメインの機能喪失を生じる少なくとも1つの変異を含み、前記変異が、置換、欠失もしくは付加を含むか、または前記CD55タンパク質アミノ酸配列が、ショートコンセンサスリピートドメインおよびセリン/スレオニン/プロリンリッチドメインの少なくとも1つを含む、項目1に記載の組成物。
(項目12)
前記組換えキメラタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列が、プラスミドを構成する、項目1に記載の組成物。
(項目13)
前記ヌクレオチド配列が、ウイルスベクターを構成する、項目1に記載の組成物。
(項目14)
前記ベクターが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびレンチウイルスの群より選択される少なくとも1つである、項目11に記載の組成物。
(項目15)
前記ヌクレオチド配列が、ベータアクチン、例えばニワトリベータアクチン、ペリフェリン/RDS、cGMPホスホジエステラーゼおよびロドプシンからなる群より選択される遺伝子由来のプロモーターを含む、項目1に記載の組成物。
(項目16)
細胞または組織を標的化するように作出された送達ビヒクルをさらに含み、前記送達ビヒクルが、リポソーム、脂質、ポリカチオン、ペプチド、ナノ粒子、金粒子およびポリマーの群より選択される、項目1に記載の組成物。
(項目17)
薬学的に許容される塩または軟化薬の少なくとも1つをさらに含む、項目1に記載の組成物。
(項目18)
抗腫瘍剤、抗凝固剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗マイコバクテリア剤、抗真菌剤、抗増殖剤および抗アポトーシス剤からなる群より選択される薬剤をさらに含む、項目1に記載の組成物。
(項目19)
被験体において補体関連状態を処置する方法であって、
前記被験体の細胞を、細胞において組換えキメラタンパク質の発現を引き起こすプロモーター配列に作動可能に連結したCD46タンパク質、CD55タンパク質およびCD59タンパク質または前記組換えキメラタンパク質を含む組成物と接触させるステップであって、ヌクレオチド配列が、前記CD59タンパク質、前記CD46タンパク質および前記CD55タンパク質の各々のアミノ酸配列をコードするか、または前記組成物が、前記CD46タンパク質、前記CD55タンパク質、前記CD59タンパク質もしくは前記組換えキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を保有するベクターを含む、ステップ;
前記被験体における前記補体関連状態の症状を測定するステップ;
前記被験体の症状を、接触させるステップの前の症状と比較するステップ;ならびに
前記被験体における前記補体関連状態の症状における減少を測定するステップ
を含み、それによって前記補体関連状態を処置する、方法。
(項目20)
前記組換えキメラタンパク質が、可溶性活性補体ターミネーターである、項目19に記載の方法。
(項目21)
測定するステップが、補体経路のタンパク質および細胞膜傷害複合体の量の少なくとも1つを測定するステップを含む、項目19に記載の方法。
(項目22)
細胞膜傷害複合体を測定するステップが、細胞における細胞膜傷害複合体の量を分析するステップを含み;前記細胞が、筋肉、上皮、内皮および脈管から選択されるか、または前記細胞が、眼、心臓、腎臓、甲状腺、脳、胃、肺、肝臓、膵臓および脈管系の少なくとも1つにおける組織から選択される、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記状態が、黄斑変性、加齢黄斑変性、炎症性腸疾患、甲状腺炎、クリオグロブリン血症、胎児消失、臓器グラフト拒絶、敗血症、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、トキシックショック症候群(TSS)、膜性増殖性糸球体腎炎、デンスデポジット病、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ループス腎炎、膜性腎炎、免疫グロブリンA腎症、グッドパスチャー症候群、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、非典型溶血性尿毒症症候群、全身性エリテマトーデス、ループス関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、ベーチェット症候群、全身性硬化症、アルツハイマー病、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、大脳ループス、脳卒中、成人呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、溶血性貧血、発作性寒冷ヘモグロビン尿症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、血管炎、天疱瘡、水疱性類天疱瘡、光毒性反応、乾癬、アナフィラキシーショック、アレルギー、喘息、心筋梗塞、糖尿病性網膜症、微小脈管障害、皮膚筋炎、B細胞リンパ増殖性障害、脱髄疾患、急性腎臓傷害、COPD、Rh疾患、免疫性溶血性貧血、免疫性血小板減少性紫斑病、補体関連糸球体症およびアテローム動脈硬化症の群より選択される、項目19に記載の方法。
(項目24)
前記細胞を、in vitroまたはex vivoまたはin vivoまたはin
situで接触させる、項目19に記載の方法。
(項目25)
前記細胞を接触させるステップの前に、前記組換えキメラタンパク質をコードする前記ヌクレオチドを保有する前記ベクターを作出するステップをさらに含む、項目19に記載の方法。
(項目26)
作出するステップが、前記CD55タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸を変異させるステップを含み、少なくとも1つの変異が、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカリングドメインの機能喪失を生じるか、または作出するステップが、前記CD46タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸を変異させるステップを含み、少なくとも1つの変異が、膜貫通ドメインの除去を生じるか、または作出するステップが、CD59タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸配列を変異させるステップを含み、少なくとも1つの変異が、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカリングドメインの機能喪失を生じるか、または作出するステップが、前記CD46タンパク質C末端をコードする核酸を、CD55タンパク質N末端のアミノ酸をコードする核酸と組換え接合するステップ、および前記CD55タンパク質C末端をコードする核酸配列を、前記CD59タンパク質N末端をコードする核酸と組換え接合するステップを含む、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記変異が、置換、欠失および付加の少なくとも1つを含む、項目26に記載の方法。
(項目28)
前記細胞を接触させるステップが、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、粘膜、皮下、舌下、鼻腔内、経口、眼内、硝子体内、外用、経皮、膣および注入からなる群より選択される少なくとも1つの経路によって前記組成物を投与するステップを含む、項目19に記載の方法。
(項目29)
被験体において補体関連状態を調節するためのキットまたはそれを処置するキットであって、
CD46タンパク質、CD55タンパク質およびCD59タンパク質の各々由来のアミノ酸配列を含む組換えキメラタンパク質、または前記組換えキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む組成物であって、古典的補体経路および第二補体経路を負にモジュレートし、前記補体関連状態について前記被験体を処置するのに有効な用量で製剤化される組成物;
前記被験体を処置するための指示;ならびに
容器
を含む、キット。
(項目30)
被験体において補体関連状態を処置するための医薬組成物であって、CD55タンパク質およびCD59タンパク質由来のアミノ酸配列を有する組換えキメラタンパク質、または前記組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列を含み、前記組換えキメラタンパク質が、古典的補体経路および第二補体経路を負にモジュレートする、医薬組成物。
(項目31)
被験体において補体関連状態を処置するための医薬組成物であって、CD46タンパク質、CD55タンパク質およびCD59タンパク質の少なくとも2つ由来のアミノ酸配列、またはCD46タンパク質、CD55タンパク質およびCD59タンパク質の各々由来のアミノ酸配列を含む第1の組換えキメラタンパク質、またはCD55タンパク質およびCD59タンパク質由来のアミノ酸配列を有する第2の組換えキメラタンパク質、または前記第1の組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列、または前記第2の組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列を含み、前記第1の組換えキメラタンパク質または前記第2の組換えキメラタンパク質が、古典的補体経路および第二補体経路を負にモジュレートする、医薬組成物。
(項目32)
被験体において補体関連状態を処置するための医薬組成物であって、CD46タンパク質、CD55タンパク質およびCD59タンパク質の各々由来のアミノ酸配列を含む第1の組換えキメラタンパク質、ならびにCD55タンパク質およびCD59タンパク質由来のアミノ酸配列を有する第2の組換えキメラタンパク質、または前記第1の組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列および前記第2の組換えキメラタンパク質を発現するヌクレオチド配列を含み、前記第1のタンパク質および前記第2のタンパク質が、古典的補体経路および第二補体経路を負にモジュレートする、医薬組成物。
(項目33)
被験体において補体関連状態を処置する方法であって、
前記被験体の細胞を、細胞において組換えキメラタンパク質の発現を引き起こすプロモーター配列に作動可能に連結したCD55タンパク質およびCD59タンパク質または前記組換えキメラタンパク質を含む組成物と接触させるステップであって、ヌクレオチド配列が、前記CD59タンパク質および前記CD55タンパク質の各々のアミノ酸配列をコードするか、または前記組成物が、前記CD55タンパク質、前記CD59タンパク質もしくは前記組換えキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を保有するベクターを含む、ステップ;
前記被験体における前記補体関連状態の症状を観察するステップ;
前記被験体の症状を、接触させるステップの前の症状と比較するステップ;ならびに
前記被験体における前記補体関連状態の症状における減少を観察するステップ
を含み、それによって前記補体関連状態を処置する、方法。
(項目34)
前記組換えキメラタンパク質が、活性補体の二重ターミネーターである、項目33に記載の方法。
(項目35)
測定するステップが、補体経路のタンパク質および細胞膜傷害複合体の量の少なくとも1つを測定するステップを含む、項目33に記載の方法。
(項目36)
細胞膜傷害複合体を測定するステップが、細胞における細胞膜傷害複合体の量を分析するステップを含み;前記細胞が、筋肉、上皮、内皮および脈管から選択されるか、または前記細胞が、眼、心臓、腎臓、甲状腺、脳、胃、肺、肝臓、膵臓および脈管系の少なくとも1つにおける組織から選択される、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記状態が、黄斑変性、加齢黄斑変性、炎症性腸疾患、甲状腺炎、クリオグロブリン血症、胎児消失、臓器グラフト拒絶、敗血症、ウイルス感染症、真菌感染症、細菌感染症、トキシックショック症候群(TSS)、膜性増殖性糸球体腎炎、デンスデポジット病、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ループス腎炎、膜性腎炎、免疫グロブリンA腎症、グッドパスチャー症候群、連鎖球菌感染後糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス、非典型溶血性尿毒症症候群、全身性エリテマトーデス、ループス関節炎、関節リウマチ、シェーグレン症候群、ベーチェット症候群、全身性硬化症、アルツハイマー病、多発性硬化症、重症筋無力症、ギラン・バレー症候群、大脳ループス、脳卒中、成人呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、嚢胞性線維症、溶血性貧血、発作性寒冷ヘモグロビン尿症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、血管炎、天疱瘡、水疱性類天疱瘡、光毒性反応、乾癬、アナフィラキシーショック、アレルギー、喘息、心筋梗塞、糖尿病性網膜症、微小脈管障害、皮膚筋炎、B細胞リンパ増殖性障害、脱髄疾患、急性腎臓傷害、COPD、Rh疾患、免疫性溶血性貧血、免疫性血小板減少性紫斑病、補体関連糸球体症およびアテローム動脈硬化症の群より選択される、項目33に記載の方法。
(項目38)
前記細胞を、in vitroまたはex vivoまたはin vivoまたはin situで接触させる、項目33に記載の方法。
(項目39)
前記細胞を接触させるステップの前に、前記組換えキメラタンパク質をコードする前記ヌクレオチドを保有する前記ベクターを作出するステップをさらに含む、項目33に記載の方法。
(項目40)
作出するステップが、前記CD55タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸を変異させるステップを含み、少なくとも1つの変異が、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカリングドメインの機能喪失を生じるか、または作出するステップが、CD59タンパク質アミノ酸配列をコードする核酸配列を変異させるステップを含み、少なくとも1つの変異が、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカリングドメインの機能喪失を生じるか、または作出するステップが、前記CD55タンパク質C末端をコードする核酸を、前記CD59タンパク質N末端をコードする核酸と組換え接合するステップを含む、項目33に記載の方法。
(項目41)
前記変異が、置換、欠失および付加の少なくとも1つを含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記細胞を接触させるステップが、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮内、粘膜、皮下、舌下、鼻腔内、経口、眼内、硝子体内、外用、経皮、膣および注入からなる群より選択される少なくとも1つの経路によって前記組成物を投与するステップを含む、項目33に記載の方法。

図面の簡単な説明

0024

図1Aおよび図1Bは、SACTおよびDTACの構造を示す模式図およびそれらの発現を示す写真である。図1Aは、ヒト膜会合型補体調節因子CD46、CD55およびCD59ならびに可溶性組換えタンパク質SACTおよびDTACの構造の模式図である。CD55およびCD46は共に、各々、4つのショートコンセンサスリピート(SCR)ドメインおよびセリン/スレオニン(S/T)リッチ領域を含む。SCRおよびS/Tドメインは、それぞれ、N結合型グリコシル化およびO結合グリコシル化の部位である。CD46は、疎水性ドメインを介して膜中に挿入し、CD55およびCD59は各々、グリコシルホスファチジルイノシトール(glycophosphatidylinositol)(GPI)アンカーを介して膜に結合する。CD59は、76アミノ酸の短い機能的単位を含む。SACTおよびDTACは共に、ポリグリシンリンカーによってヒトCD59の機能的ドメインから分離された、ヒトCD55の4つのSCRドメインおよびS/T−リッチ領域を含む。SACTは、N末端において、ポリグリシンリンカーによってCD55のSCRから分離された、ヒトCD46の4つのSCRドメインをさらに含む。SACTおよびDTACは共に、ヒトCD59由来の分泌シグナルを含む。組換えタンパク質を作出するとき、CD46の膜貫通ドメイン、ならびにCD55およびCD59の各々へのGPIアンカーの結合のためのシグナルは含めなかった。図1Bは、CD46、CD55およびCD59に対する抗体でプローブした、pDTAC、pGFPまたはpSACTをトランスフェクトした細胞由来培地を示すウエスタンブロットの写真である。

0025

図2A、図2B、図2Cおよび図2Dは、SACTが、C3bの第I因子媒介性切断のための補因子として作用することを示す、模式図、写真および棒グラフである。図2Aは、C3bの第I因子切断の模式図である。C3bは、ジスルフィド連結によって接合された、2つのポリペプチド鎖(α’およびβ)からなる。第I因子は、不活性断片iC3bHおよびiC3bLへの、104kDaのα’鎖の切断を媒介する。図2Bは、不活性iC3bへの第I因子媒介性切断のための補因子として作用する、細胞膜上に沈着したC3bのCD46結合を示す模式図である。図2Cは、第I因子の存在下または非存在下で、pSACT、pDTACまたはpGFPのいずれかをトランスフェクトした細胞由来の培地中でインキュベートし、C3に対して特異的な抗体でプローブした、精製されたC3bのウエスタンブロットの写真である。このウエスタンブロットは、pGFPまたはpDTACのいずれかの存在下で生じた切断と比較して、pSACTをトランスフェクトした細胞由来の培地の存在下でのα’鎖の増加した切断を示す。図2Dは、それぞれ、C3bおよび第I因子を含むpGFPトランスフェクト細胞およびpDTACトランスフェクト細胞由来の培地と比較した、C3bおよび第I因子を含むpSACTトランスフェクト細胞由来の培地中のC3bのα’鎖の量における、51.8±10.5%(p=0.007)および46.2±4.8%(p=0.0007)の低減を示すウエスタンブロットデータの定量化の棒グラフである。α’鎖についてのシグナル強度を、β鎖のシグナル強度に対して正規化した。

0026

図3A、図3Bおよび図3Cは、SACTおよびDTACが、C3コンバターゼの分解を促進することを示す、模式図および棒グラフである。図3Aは、C3コンバターゼの分解を促進させるための、CD55およびC3bに結合するB因子解離の模式図である。図3Bは、B因子に対する抗体を使用した、アガロース結合したC3bへのB因子結合の免疫染色の定量化の棒グラフである。このグラフは、pDTACまたはpSACTをトランスフェクトした細胞由来の培地が、pGFPトランスフェクト細胞由来の培地(n=10)と比較して、C3b結合したB因子における、それぞれ、16.1±6.4%(p=0.0214、n=11)および16.8±6.1%(p=0.0127、n=11)の低減を生じたことを示している。B因子結合は、pGFPトランスフェクト細胞由来の培地の存在下でC3bに結合したB因子の平均染色強度と比較した%染色として示される。図3Cは、CD55遮断抗体の存在下または非存在下で、pDTACまたはpSACTのいずれかをトランスフェクトした細胞由来の培地と共にインキュベートしたヒツジ赤血球のヒト補体媒介性溶解の定量化の棒グラフである。細胞溶解に対する保護における有意な低減が、抗体の存在下で、DTACおよびSACTの両方について観察された。

0027

図4Aおよび図4Bは、SACTおよびDTACが、細胞膜傷害複合体中へのC9の取込みを阻害することを示す、模式図および棒グラフである。図4Aは、CD59機能の模式図である。CD59は、膜会合型C5b−8タンパク質複合体に結合して、C9の取込みおよび細胞膜傷害複合体(MAC)の形成を防止する。MACは、細胞表面上に孔を形成し、膜の完全性を低減させる。図4Bは、pGFP、pDTACまたはpSACTをトランスフェクトした培地の存在下で、C9と共にインキュベートしたC9枯渇ヒト血清によるヒツジ赤血球の溶解の定量化の棒グラフである。pDTACトランスフェクト細胞およびpSACTトランスフェクト細胞由来の培地は、pGFPトランスフェクト細胞由来の培地の存在下でインキュベートした赤血球と比較して、それぞれ、34.8±3.6%(p<0.0001)および29.9±4.6%(p<0.0001)、赤血球のヒト補体媒介性溶解を低減させた。

0028

図5Aおよび図5Bは、SACTおよびDTACが、ヒツジ赤血球およびマウス肝細胞の両方を、ヒト補体媒介性溶解からin vitroで保護することを示す棒グラフである。図5Aは、GFPトランスフェクト細胞由来の培地と比較して、それぞれ、DTACおよびSACTによる溶解における47±2.9%(p<0.0001)および21.5±2.8%(p<0.0001)の低減を示す、pGFP、pDTACまたはpSACTをトランスフェクトした細胞由来の培地の存在下でのヒト血清によるヒツジ赤血球の溶解(溶血)の定量化の棒グラフである。図5Bは、pGFP、pDTACまたはpSACTをトランスフェクトした細胞由来の培地の存在下で正常ヒト血清(NHS)と共にインキュベートしたマウス肝細胞によるヨウ化プロピジウム(PI)取込みの定量化のグラフである。pGFPトランスフェクト細胞由来の培地の存在下で熱不活化NHS(hiNHS)と共にインキュベートした肝細胞の対照試料もまた示される。pDTACまたはpSACTをトランスフェクトした細胞由来の培地と共にインキュベートした肝細胞は、pGFPトランスフェクト細胞由来の培地と共にインキュベートした肝細胞(n=7)と比較して、それぞれ、PI取込みにおける28.73%±10.21%(p=0.014、n=8)または20.8±9.0%(p=0.037、n=8)の低減を有することが観察された。

0029

図6Aおよび図6Bは、DTACおよびSACTがin vitroで細胞膜傷害複合体の沈着を低減させることを示す、顕微鏡写真および棒グラフである。図6Aは、pGFP、pDTACまたはpSACTをトランスフェクトした細胞由来の培地の存在下でNHSと共にインキュベートしたマウス肝細胞の蛍光顕微鏡写真のセットである。細胞を、MACに対する抗体またはDAPIで染色した。図6Bは、MAC染色強度面積の定量化をグラフ化するものであり、pGFPトランスフェクト細胞由来の培地と共にインキュベートした肝細胞(n=6)と比較して、pDTACまたはpSACTをトランスフェクトした細胞由来の培地と共にインキュベートしたマウス肝細胞上のMAC沈着における、それぞれ53.8±10.4%(p=0.0004、n=6)または67.8±9.2%(p<0.0001、n=6)の低減を示す。pGFPトランスフェクト細胞由来の培地の存在下でhiNHSと共にインキュベートした肝細胞の対照試料もまた示される。DAPI、4’,6−ジアミジノ−2−フェニルインドール;MAC、細胞膜傷害複合体;hiNHS、熱不活化正常ヒト血清。

0030

図7A、図7B、図7Cおよび図7Dは、DTACが、マウス肝臓脈管構造をヒトMAC沈着からin vivoで保護することを示す、顕微鏡写真および棒グラフである。図7Aは、マウス肝臓のAAV2/8GFP形質導入を示す凍結切片の蛍光顕微鏡写真のセットである。効率的な形質導入が、組織を通じて観察された。四角で囲んだ領域のより高い倍率もまた示されている。図7Bは、AAV2/8pAまたはAAV2/8DTACを腹腔内空間中に注射し、mPECAM1抗体およびNHSで灌流したマウスから回収した、抗MAC抗体で染色した肝臓凍結切片の蛍光顕微鏡写真のセットである。四角で囲んだ領域のより高い倍率もまた示されている。図7Cは、AAV2/8ポリA注射マウスと比較してAAV2/8DTAC注射マウスの肝臓脈管構造上のヒトMAC沈着における56.7±16.4%(p=0.0061)の低減を示す、肝臓切片のMAC染色強度(IU)の定量化の棒グラフのセットである。図7Dは、AAV2/8ポリA注射マウスと比較してAAV2/8DTAC注射マウスの肝臓におけるヒトMAC沈着における55.6±11.3%(p=0.0006)の低減を示す、血管の面積当たりのMAC染色強度の定量化の棒グラフである。染色強度を、マウス1匹当たり8つの切片から平均した。AAV2/8ポリA注射マウスについてn=6およびAAV2/8DTAC注射マウスについてn=6(DIC微分干渉;IU:強度単位)。

0031

図8A、図8Bおよび図8Cは、SACTがマウス肝臓脈管構造をヒトMAC沈着からin vivoで保護することを示す、顕微鏡写真および棒グラフである。図8Aは、AAV2/8pAまたはAAV2/8SACTを腹腔内空間中に注射し、mPECAM1抗体およびNHSで灌流したマウスから回収した、抗MAC抗体で染色した肝臓凍結切片の蛍光顕微鏡写真のセットである。四角で囲んだ領域のより高い倍率もまた示されている。図8Bは、AAV2/8ポリA注射マウスと比較してAAV2/8SACT注射マウスの肝臓脈管構造上のヒトMAC沈着における63.2%±20.5%(p=0.0075)の低減を示す、肝臓切片のMAC染色強度(IU)の定量化の棒グラフである。図8Cは、AAV2/8ポリA注射マウスと比較してAAV2/8SACT注射マウスの血管上のヒトMAC沈着における61.1±18.9%(p=0.0056)の低減を示す、血管の面積当たりのMAC染色強度の定量化の棒グラフである。染色強度を、マウス1匹当たり8つの切片から平均した。AAV2/8ポリA注射マウスについてn=8およびAAV2/8SACT注射マウスについてn=9。

0032

図9は、ヒト膜会合型補体調節因子CD46、CD55およびCD59ならびに可溶性組換えタンパク質STACの構造を示す、活性化された補体の可溶性ターミネーター(soluble terminator of activated complement)(STAC)の構造の模式図である。STACは、ヒトCD59由来の分泌シグナルを含む。ヒトCD46の4つのSCRドメインおよびS/T−リッチ領域を、ポリグリシンリンカーを介してCD59に結合させた。ヒトCD55の4つのSCRドメインおよびS/T−リッチ領域を、ポリグリシンリンカーによってヒトCD46の機能的ドメインから分離されるように作出した。

0033

図10Aおよび図10Bは、STACがC3bの第I因子媒介性切断のための補因子として作用することを示す、写真および棒グラフである。図10Aは、第I因子の存在下または非存在下で、pAdCAGGFPまたはpAdCAGSTACのいずれかをトランスフェクトした細胞から取得された培地中でインキュベートし、C3に対する抗体でプローブした、精製されたC3bのウエスタンブロットの写真である。データは、pAdCAGGFPの存在下で生じた切断と比較した、pAdCAGSTACをトランスフェクトした細胞由来の培地の存在下でのα’鎖の増加した切断を示す。図10Bは、C3bおよび第I因子を含むpAdCAGGFPトランスフェクト細胞由来の培地(n=4)と比較して、C3bおよび第I因子を含むpAdCAGSTACトランスフェクト細胞由来の培地中のC3bα’鎖の量における34.3%±3.9%(n=4;p=0.0001)の低減を示すウエスタンブロットデータの定量化のグラフである。α’鎖についてのシグナル強度を、β鎖のシグナル強度に対して正規化した。

0034

図11は、STACのCD55部分が機能性を保持することを示す棒グラフである。このグラフは、CD55遮断抗体の存在下または非存在下で、pAdCAGGFPまたはpAdCAGSTACのいずれかをトランスフェクトした細胞由来の培地と共にインキュベートした感作したヒツジ赤血球のヒト補体媒介性溶解の定量化を示す。mAb遮断の非存在下でSTAC処理した試料は、抗体遮断なしのGFP処理試料(n=6)と比較して、細胞溶解において32.1%±10.4%の低減(n=6、p=0.0115)を有することが観察された。CD55遮断抗体を含むpAdCAGSTACトランスフェクト細胞由来の培地中に懸濁したヒツジ赤血球は、細胞溶解において、13.4%±9.4%の統計的に有意でない低減を示した(n=6;p=0.1831)。遮断抗体なしのGFP培地中で生じた細胞溶解を、100%細胞溶解に設定した。

0035

図12は、STACが、細胞膜傷害複合体中へのC9取込みを防止できなかったことを示す棒グラフである。このグラフは、pAdCAGGFP、pAdCAGSTACまたはpAdCAGsCD59(陽性対照)をトランスフェクトした培地の存在下で、C9ありまたはなしでインキュベートしたC9枯渇ヒト血清によるヒツジ赤血球の溶解の定量化である。sCD59+C9で処理した赤血球は、GFP+C9処理した細胞(n=14)と比較して、細胞溶解において21%±9.1%(n=8;p=0.033)の低減を有することが観察された。STAC+C9で処理した試料は、細胞溶解における減少を示さなかった(n=14;p=0.428)。

0036

種々の障害が補体の活性化と関連している。CD46、CD55およびCD59は、ヒ
ト細胞上の、補体の主要な膜会合型調節因子である。遺伝子移入を介したCD55、CD
46またはCD59の独立した発現は、ヒト補体媒介性攻撃に対してマウス組織を保護す
る。本出願の実施例は、CD46、CD55およびCD59の補体調節特性を、可溶性非
膜アンカー型形態でアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターから発現される単一の遺伝子
産物へと組み合わせる可能性を記載している。

0037

補体系の調節不全は、高齢者における失明の主要原因の1つであるAMDの病因に寄与
する主要因子の1つである(Gehrsら 2010年 Arch Ophthalmo
l 128巻:349〜358頁)。この疾患の最も深刻な形態は、患者のおよそ10%
を侵しており(Klein 2008年 Ophthalmology 115巻:10
26〜1031頁)、脈絡膜脈管構造からブルッフ膜を通って網膜中への、減弱された血
管の成長を含む。これらの「不適格な」血管によって放出される血漿は、光受容体および
他の網膜細胞を損傷し、重症視力喪失を最終的にもたらす。しかし、AMD患者の圧倒
的多数は、網膜色素上皮(RPE)とブルッフ膜との間に生じ、RPEの萎縮(地図状萎
縮)を最終的にもたらす、ドルーゼンと呼ばれる細胞外沈着物提示する。

0038

補体タンパク質がAMD眼のドルーゼンにおいて同定されたので、AMDにおける補体
の潜在的役割が考慮された(Johnsonら 2001年 Exp Eye Res
73巻:887〜896頁;Johnsonら 2000年 Exp Eye Res
70巻:441〜449頁;Mullinsら Eye (Lond)15巻:390〜
395頁;およびMullinsら 2000年FASEB J 14巻:835〜8
46頁)。多型性は、いくつかの補体遺伝子において同定されており、AMDを強く予測
するかまたはAMDに対して保護的であるかのいずれかであることが観察された。H因子
における単一のアミノ酸変化Y402Hが、加齢眼におけるAMDの40〜50%もの多
くを占める(Edwardsら 2005年 Science 308巻:421〜42
4頁;Hagemanら 2005年 Proc Natl Acad Sci USA
102巻:7227〜7232頁;およびHainesら 2005年 Scienc
e 308巻:419〜421頁)。

0039

B因子および補体成分2(C2)の両方におけるハプロタイプバリアントは、AMDを
発症する顕著に低減されたリスクを生じ(Goldら 2006年 Nat Genet
38巻:458〜462頁)、補体成分3(C3)におけるR80G置換は、AMDを
有するリスクを、22%の高さまで増加させた(Yatesら 2007年 N Eng
l J Med 357巻:553〜561頁)。B因子(32Q)バリアントは、コン
バターゼを形成する低減された能力と共に、C3bに対する、4分の1の結合親和性を有
することが示されている(Montesら 2009年 Proc Natl Acad
Sci USA 106巻:4366〜4371頁)。さらに、C2、C3およびB因
子における多型性は、両方の型の進行型AMD疾患、脈絡膜新生血管および地図状萎縮
の進行と顕著に関連することが示されている(Klein 2008年 Ophthal
mology 115巻:1026〜1031頁;Mallerら 2007年 Nat
Genet 39巻:1200〜1201頁;およびReynoldsら 2009年
Invest Ophthalmol Vis Sci 50巻:5818〜5827
頁)。

0040

補体タンパク質の沈着は、糖尿病性網膜症を有する患者の脈絡毛細管において(Ger
lら 2002年 Invest Ophthalmol Vis Sci 43巻:1
104〜1108頁)、および糖尿病被験体の網膜血管において(Zhangら 200
2年 Diabetes 51巻:3499〜3504頁)観察されている。網膜血管は
補体調節タンパク質CD55およびCD59の発現における顕著な低減を示した。補体
成分は、増殖性硝子体網膜症PVR)に罹患している患者の網膜上膜においても観察さ
れ、古典的経路のイニシエータータンパク質C1qの上方調節、およびカスケードの他の
タンパク質の変更された発現が、緑内障眼において観察されている(Baudouinら
1990年 Am J Ophthalmol 110巻:593〜598頁;Sta
siら 2006年 Invest Ophthalmol Vis Sci 47巻:
1024〜1029頁;およびTezelら 2010年 Invest Ophtha
lmol Vis Sci 51巻(11号):5697〜707頁)。

0041

網膜の機能および病理における補体の役割を直接調査するのに有用である動物モデル
ほとんど存在しない。これらのモデルのほとんどは、マウス網膜におけるレーザー誘導
脈絡膜新生血管(CNV)の発症における異なる補体タンパク質の影響を分析するために
使用されてきた。他の研究は、古典的経路でもレクチン経路でもなく第二経路に対する、
および細胞膜傷害複合体の形成に対する、網膜病理の依存を実証している(Boraら
2007年 J Immunol 178巻:1783〜1790頁;Boraら 20
06年 J Immunol 177巻:1872〜1878頁;およびBoraら 2
005年 J Immunol 174巻:491〜497頁)。以前の研究は、CNV
の発症においてアナフィラトキシンC3aおよびC5aによって果たされる顕著な役割を
実証している(Nozakiら 2006年 Proc Natl Acad Sci
USA 103巻:2328〜2333頁)。H因子の欠損を有する高齢マウスは、ブル
ッフ膜、RPEおよび光受容体における変更された構造、ならびに低減されたERGを示
し(Coffeyら 2007年 Proc Natl Acad Sci USA 1
04巻:16651〜16656頁)、網膜血管の完全性の喪失を呈した(Lundh
von Leithnerら 2009年 Am J Pathol 175巻:412
〜421頁)。第二補体経路は、D因子が欠損したマウスにおいて顕著に低減されること
が示されている、光誘導性網膜変性における主要因子としても暗示されてきた(Rohr
erら 2007年 Invest Ophthalmol Vis Sci 48巻:
5282〜5289頁)。C3欠失マウスの神経節細胞は、一過的ではあるが顕著な、網
虚血再灌流に起因する変性からの保護を示した(Kuehnら 2008年 Exp
Eye Res 87巻:89〜95頁)。

0042

3つの別個の補体経路(古典的、レクチンまたは第二)の1つが、補体カスケードを開
始させ(Markiewskiら 2007年 Am J Pathol 171巻:7
15〜727頁)、これらの経路は、経路中の、C3aおよびC3bへのC3の分解の点
において収束する。C3の分解は、自己または非自己細胞の膜中に挿入してそれらの溶解
を引き起こす孔様構造、細胞膜傷害複合体(MAC)の形成で終わる経路の最終部分を開
始させる。オプソニンC3bの産生による細胞溶解の可能性に加えて、C3の活性化は、
アナフィラトキシンC3aおよびC5aを生成し、これらは共に、炎症の強力かつ多面
エフェクターである。古典的経路またはレクチン経路とは異なり、第二経路は、血清中
で生じる少量のC3加水分解およびコンバターゼへの変換を伴って、構成的に活性である

0043

AMDまたは関節リウマチなどの慢性疾患に対する、補体の阻害剤の送達のためのアプ
ローチは、体細胞遺伝子治療の使用である。遺伝子治療は、単一の遺伝子障害の処置のた
めにヒトにおいて効果的であり、関節リウマチなどの複合障害を有する患者もまた、遺伝
子治療アプローチを使用して首尾よく処置されてきた(Ginn, S.L.ら、201
3年 J Gene Med 15巻:65〜77頁)。遺伝子治療の使用は、補体の他
の膜会合型阻害剤の可溶性バージョン動員させるにあたり独自に効果的であることが見
出されている。例えば、CD59(プロテクチン(protectin))は、グリコ
ホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーを介して細胞の膜に係留されて見出さ
れる、MACの天然に存在する阻害剤である。膜会合型CD59は、MACの強力な阻害
剤であり、可溶性膜非依存的CD59は、アデノ随伴ウイルス(AAV)などの遺伝子治
療ベクターを介して送達される場合にのみ、in vivoで効果的であることが報告
れている(Cashman, S.M.ら、2011年PLoS One 6巻:e1
9078頁)。

0044

CD55(崩壊促進因子)は、古典的ならびに第二C3コンバターゼの崩壊を促進する
ことによって補体活性を調節するGPIアンカー型タンパク質である(Walport,
M.J. 2001年 N Engl J Med 344巻:1058〜1066頁
)。CD46(膜補因子タンパク質)は、C3bおよびC4bの第I因子媒介性切断のた
めの補因子として作用し、古典的および第二C3コンバターゼの形成を防止する、遍在的
に発現される1型膜貫通糖タンパク質である(Riley−Vargas, R.C.ら
、2004年 Immunol 25巻:496〜503頁)。CD46は、補体の活性
化の第二経路の増幅ループを調節する。CD55およびCD46は、異なる特性を有し、
各々、補体調節モジュールとして作用するショートコンセンサスリピート(SCR)と呼
ばれる一連の60アミノ酸のリピートモチーフを含む(Coyne, K.E.ら、19
92年 J Immunol 149巻:2906〜2913頁)。ヒト補体タンパク質
とマウス補体タンパク質との間の種特異性が、in vivoでのマウス組織におけるヒ
ト補体阻害剤の試験を制限している(Kim, D.D.ら、2006年 Clin I
mmunol 118巻:127〜136頁)。本明細書で提供される方法および組成物
は、補体活性化の最適な阻害のために、新規非膜会合型組換えタンパク質を作出すること
に関する。これは、補体の古典的経路および第二経路の両方、かつ補体カスケードの異な
る点における同時標的化によって達成される。補体の古典的経路および第二経路は、CD
55、CD46およびCD59の特性を組み合わせることによって標的化される。本明細
書の実施例は、新規の作出された組換えタンパク質の合成を記載し、細胞培養物において
ヒト補体を阻害するその能力、および遺伝子治療によってマウス組織においてin vi
voでヒト補体を阻害するその能力のメリットを測定する。本明細書の実施例は、CD5
5およびCD59の補体阻害特性を組み合わせる組換えタンパク質もまた記載している。

0045

CD46、CD55およびCD59の組み合わされた特性を示す非膜会合型組換え分子
SACTが、本明細書で提供される。SACTは、C3bの第I因子媒介性切断のための
補因子として作用し得、C3コンバターゼの分解を促進し得、MAC中へのC9の動員を
減弱させ、ヒト補体媒介性溶解から細胞を保護し得、in vitroおよびin vi
voでマウス細胞上でのヒトMACの沈着を阻害し得る、分泌型タンパク質である。CD
55およびCD59の組み合わされた特性を有することが観察され、C3bの第I因子媒
介性切断のための補因子として作用しない組成物DTACもまた、本明細書で提供される

0046

補体は、脊椎動物における免疫防御の重要な第一線であり、外来生物および損傷した自
己細胞の脅威の両方に対する保護を提供する(Walport, M.J. 2001年
N Engl J Med 344巻:1058〜1066頁)。補体媒介性病理の処
置のための補体調節因子の過剰発現は、リスクならびに利点をもたらす。したがって、C
3コンバターゼ形成、ならびにMACの崩壊および形成の組み合わされた点において補体
経路が阻害され、これが、C1qを、改変された自己および非自己表面と相互作用させ、
原因細胞および生物のC3b媒介性ファゴサイトーシスを可能にする(Trouwら、2
008年 Mol Immunol 45巻:1199〜1207頁)。CD55、CD
46およびCD59の機能を、単一の作出されたタンパク質SACTへと組み合わせた。
さらに、CD46は、C3b分解のレベルにおいて機能し、CD55は、C3bを変更す
ることなしに、コンバターゼの形成を防止し、またはコンバターゼの崩壊を促進するので
、CD46は、標的細胞のC3b媒介性排除を妨害することが、本明細書で想定される。
これは、アポトーシス細胞の低減されたクリアランス瀕死の細胞に対する自己免疫性応
答を生じさせ得るループス様疾患の処置のために特に重要であり得る(Trouwら、2
008年 Mol Immunol 45巻:1199〜1207頁)。SLEに関与す
遺伝因子多様性の研究は、カスケードの上流成分の活性化のための潜在力を維持し、
下流事象を遮断することの重要性包括的説明を提供している(Karp, D.R.
2005年 Curr Opin Rheumatol 17巻:538〜542頁)。
したがって、CD55およびCD59機能のみを含む第2の組換え分子DTACを生成し
、試験した。

0047

培養物中の細胞に、またはin vivoでマウス肝臓に、SACTまたはDTACを
送達するために、遺伝子治療アプローチを使用した。遺伝子治療の分野における顕著な進
歩は、これが、遺伝性または後天性疾患の処置のための実行可能なアプローチであること
を示す。補体の活性化は、補体系の慢性疾患、関節リウマチを含む多くの障害において、
顕著な役割を果たす。C3およびMACの上昇したレベル、ならびにCD59の低減され
たレベルが、関節リウマチ患者滑膜組織において報告されている(Kemp, P.A
.ら、1992年 J Clin Lab Immunol 37巻:147〜162頁
、Konttinen, Y.T.ら、1996年 Ann Rheum Dis 55
巻:888〜894頁)。これらの研究は、CD59に対するモノクローナル抗体による
ラット膝関節の注射が、膜標的化組換えCD59の使用によって補正され得る表現型、C
D59−/−マウスにおける、自発的および急性関節炎、ならびに関節病理における増加
を生じるという観察によって、さらに支持されている(Kemp, P.A.ら、199
2年 J Clin Lab Immunol 37巻:147〜162頁)。C5を標
的化することによる補体活性化の減弱は、関節リウマチのマウスモデルにおいて有効であ
ることが見出されており、このことは、補体ベース治療薬のための標的として機能し得
る補体カスケードの複数の点が存在することを示している(Kemp, P.A.ら、1
992年 J Clin Lab Immunol 37巻:147〜162頁)。した
がって、SACTおよびDTACは、補体カスケードの種々の点を同時に標的化および減
弱させるので、これらは各々、補体活性化の特に有効な阻害剤である。関節リウマチを有
する患者中への補体活性化の阻害剤の反復注射が実行可能であっても、遺伝子治療を介し
長期持続性の単回の注射が、効率のためおよび患者の利便性のために、潜在的に好まし
い。アデノ随伴ウイルス(AAV)は、ヒトにおいて数年間にわたって、大型動物におい
十年超にわたって持続することが示されている(Colella, P.ら、2009
年 TrendsMol Med 15巻:23〜31頁、Jiang, H.ら、2
006年 Mol Ther 14巻:452〜455頁)。さらに、AAVは、いずれ
の公知のヒト疾患とも関連していない。

0048

AMDなどの疾患に対して、遺伝子治療アプローチを介した補体の阻害剤の送達に関す
る強い主張がなされ得る。AMDに罹患する患者のおよそ50%は、補体調節因子H因子
中に多型性を有する(Klein, R.J.ら、2005年 Science 308
巻:385〜389頁)。H因子中のY402H多型性についてホモ接合性である個体は
、それらの脈絡膜血管および網膜色素上皮(RPE)において、およそ70%多いMAC
を有する(Mullins, R.F.ら、2011年 Exp Eye Res 93
巻:565〜567頁)。地図状萎縮として公知のAMDの進行型形態を有する個体は、
それらのRPE上に、低減されたレベルの補体阻害剤を有する(Ebrahimi, K
.B.ら、2013年 J Pathol 229巻:729〜742頁)。個体がMA
Cを効率的に組み立てることを妨害する、日本人集団においてC9中に一般に存在する多
型性は、AMDの進行に対して保護的であり、このことは、遺伝子治療アプローチを介し
た補体の不活化が、この疾患の処置のための実行可能な手段であり得ることを示唆してい
る(Nishiguchi, K.M.ら、2012年 Invest Ophthal
mol Vis Sci 53巻:508〜512頁)。

0049

しかし、現在臨床試験中の補体活性化の阻害剤は全て、AMD患者の眼中に頻繁に再注
射される必要がある、小分子、アプタマーまたは抗体である(Keane, P.A.ら
、2012年 J Ophthalmol 2012巻:483034頁)。これらの阻
害剤は、顕著な副作用、例えば、増加した眼内圧眼内炎および網膜剥離を有する(Wu
, L.ら、2008年 Graefes Arch Clin Exp Ophtha
lmol 246巻:81〜87頁、Shima, C.ら、2008年 Acta O
phthalmol 86巻:372〜376頁)。SACTまたはDTACの発現を媒
介する、AAVベクターなどの、延長された時間にわたって局所的に治療タンパク質を産
生し得る単回の注射は、AMDなどの疾患の処置のために特に魅力的であり得る。補体タ
ンパク質間の種の制限は、マウス補体に関しての、したがって、AMDのマウスモデルに
おいての、ヒトCD55およびヒトCD46の試験を限定する(Kim, D.D.ら、
2006年 Clin Immunol 118巻:127〜136頁)。本願の発明者
らは、ヒトCD55またはヒトCD46が、MAC沈着のex vivoマウスモデルに
おいて、マウス網膜組織上に沈着したヒト補体を効率的に阻害したことを示している(S
weigard, J.H.ら、2011年 Gene Ther 18巻:613〜6
21頁)。

0050

現時点では、補体の活性化の減弱のための、臨床開発および前臨床開発中の25超の小
分子、抗体またはタンパク質が存在する。これらの分子は、急性腎臓傷害、COPD、発
作性夜間ヘモグロビン尿症、関節リウマチ、敗血症、AMDおよび移植を含む、広範な種
々の適応症を目的としている。これらの治療薬の大部分は、C3またはC5のレベルで補
体を標的化する(Ricklin, D.ら、2013年 J Immunol 190
巻:3839〜3847頁)。CD46中の変異は、個体を家族性溶血性尿毒症症候群に
罹りやすくすることが示されている(Kavanagh, D.ら、2008年 Ann
u Rev Med 59巻:293〜309頁)。CD55の欠損は、原発性自己免疫
性溶血性貧血、SLEと、および発作性夜間ヘモグロビン尿症において、関連している(
Richaud−Patin, Y.ら、2003年 Immunol Lett 88
巻:95〜99頁、Iwamoto, N.ら、1995年 Blood 85巻:22
28〜2232頁)。CD55は、虚血再灌流臓器損傷を減弱させることも示されている
(Weeks, C.ら、2007年 Clin Immunol 124巻:311〜
327頁)。CD59における変異または欠損は、乳児期における慢性溶血および再発性
末梢脱髄疾患、発作性夜間ヘモグロビン尿症、自己免疫性溶血性貧血またはSLEを生じ
ることが示されている(Iwamoto, N.ら、1995年 Blood 85巻:
2228〜2232頁、Nevo, Y.ら、2013年 Blood 121巻:12
9〜135頁)。SACTおよびDTACなどの補体阻害剤は、これらの障害の処置に有
用であることが、本明細書で想定される。

0051

Fodorらは、CD55およびCD59の組み合わされた特性を含む膜会合型組換え
分子を記載している(Fodor, W.L.ら、1995年 J Immunol 1
55巻:4135〜4138頁)。同様に、Kroshusらは、CD46およびCD5
5の特性を組み合わせる可溶性分子を記載しており、この分子が、ブタヒト間の移植モデ
ルにおいて急性心組織傷害を低減できたことを実証した(Kroshus, T.J.ら
、2000年 Transplantation 69巻:2282〜2289頁)。C
R2およびH因子由来の選択されたドメインから構成される組換えタンパク質は、ループ
スのマウスモデルにおいて、増加した生存、低減した自己抗体産生および改善された腎臓
機能を実証した(Sekine, H.ら、2011年 Arthritis Rheu
m 63巻:1076〜1085頁)。しかし、これらの研究のいずれも、遺伝子治療ア
プローチを介して組換えタンパク質を送達したわけではなかった。

0052

本明細書のin vivo実施例のために、AAV8カプシドシュードタイプ化(p
seudotyped)されたAAV2(AAV2/8)を使用した。このベクターは、
マウスの肝臓の非常に高い効率の形質導入を有することが示されている(Paneda,
A.ら、2009年 Hum Gene Ther 20巻:908〜917頁)。大
量のヒトMACがマウス肝臓上に容易に形成し得るので、このin vivo実施例は、
肝臓において一部実施された(Gandhi, J.ら、2011年PLoS One
6巻:e21621頁)。さらに、肝細胞は、補体の血漿成分の80〜90%の生合成
を担うので、肝臓が一部において選択された(Qin, X.ら、2006年 Cell
Mol Immunol 3巻:333〜340頁)。最終的に、肝臓は総血流の25
%を受け、循環系を通じたDTACおよびSACTの広い分布を可能にし、このことは補
体の活性化が関与する全身障害の処置にとって重要である(Myers, J.D.ら、
1948年 J Clin Invest 27巻:620〜627頁)。in viv
oでのDTACおよびSACTの発現は、両方が、in vivo設定におけるヒト補体
の強力な阻害剤であることを示しており、本明細書の実施例に示されるデータは、肝臓か
ら分泌された場合のこれらの分子の治療的価値への支持を与える。

0053

補体調節領域の順序が機能的能力に影響を与えるかどうかを調査するために、本明細書
で提供されるタンパク質を、活性化された補体の可溶性ターミネーター(STAC)、2
014年11月4日に発行した米国特許第8,877,896号と比較してアッセイした
。STACは、以下を含む:STACのN末端は、ヒトCD59開始コドン、分泌シグナ
ルペプチドおよびSCRドメインを含む;ポリグリシンリンカーは、ヒトCD46の4つ
のSCRドメインおよびS/T−リッチ領域を、CD59のC末端に結合させる;ならび
にヒトCD55の4つのSCRドメインおよびS/T−リッチ領域が、ポリグリシン配列
を介して、CD46のC末端に連結される(図9)。STACのc−DNAを調製し、タ
ンパク質を、CMVエンハンサー/ニワトリβ−アクチンプロモーター(CAG)とウサ
ギグビンポリアデニル化(pA)終結配列との間で発現させた(同書)。

0054

CD46、CD55およびCD59成分の各々の機能性を、本明細書の実施例に記載さ
れるように、STACにおいて個々に測定した。STAC中のCD59部分は非機能的
あったことが観察された。CD59は、補体系の最終経路の強力な阻害剤である(Rol
lins SAら、J Immunol. 1990年;144巻(9号):3478〜
83頁)。CD59は、細胞膜傷害複合体(MAC)中へのC9取込みを遮断し、それに
よって細胞膜における孔形成を遮断することによって機能する(Rollins SAら
、J Immunol. 1990年;144巻(9号):3478〜83頁)。STA
CのCD59部分は、C9取込みを防止することができないことが観察された。したがっ
て、STACのCD59部分は、非機能的であり、したがって、STACのこの部分は、
補体の阻害剤としての機能に寄与しない。

0055

本明細書の本発明は、CD46、CD55およびCD59の組合せ特性を示す機能的な
非膜会合型組換えタンパク質SACTを提供し、CD55およびCD59の組合せ特性を
有する組換えタンパク質DTACもまた提供する。これらのタンパク質の各々は、それら
モジュラー成分の特性および機能を驚くべきことに示すことが観察され、これらのタン
パク質の各々は、in vitroおよびin vivoで、補体の活性化の強力な阻害
剤である。SACTタンパク質およびDTACタンパク質の成分の各々は、STACとは
対照的に、それらの生物学的機能を示すことが観察された。

0056

SACTタンパク質
膜結合型CD59は、細胞を補体媒介性疾患から保護することが以前に観察されたが、
この調節因子の発現の部位は、RPEなどの眼組織における保護の「パッチ」のみを生じ
た。したがって、網膜を介して拡散することが可能であり、罹患領域全体に対する保護を
提供する、CD59の分泌型調節因子(sCD59またはrmiCD59)を、本明細書
で作出する(その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2009年2月13日出
の、Kumar−Singhら、PCT出願番号PCT/US09/00947)。

0057

可溶性sCD59は、膜標的化部分と融合させない限り、in vivoでの補体の非
効率的な調節因子と以前にみなされた(Mizunoら 2001年 Arthriti
s Rheum 44巻:2425〜2434頁;Bora 2010年 J Biol
Chem 285巻:33826〜33833頁;Songら 2003年 J Cl
in Invest 111巻:1875〜1885頁;およびZhangら 1999
年 J Clin Invest 103巻:55〜61頁)。アデノウイルスまたはA
AVベクターを介してマウス眼組織においてin vivoで発現させた膜非依存的sC
D59は、新生血管AMDのマウスモデルにおいて、MAC沈着およびレーザー誘導性脈
絡膜新生血管を顕著に低減させた(その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ca
shmanら 2011年PLoS ONE 6巻(4号):e19078頁)。アデ
ノウイルス送達されたsCD59は、マウス肝臓脈管構造上でも、ヒトMAC沈着を阻害
することが観察された。

0058

任意の特定の理論にも作用機構にも限定されることなく、CD59タンパク質、CD4
6タンパク質およびCD55タンパク質の少なくとも2つを含む組換え融合タンパク質
、いくつかの補体経路およびタンパク質の強力な調節因子であることが、本明細書で想定
される。本明細書の実施例は、補体カスケードをモジュレートすることによって補体関連
状態を処置するのに有効である、CD46タンパク質、CD55タンパク質およびCD5
9タンパク質の各々の小さい機能的単位を有する新規可溶性活性補体ターミネーター(S
ACT)を作出するための方法を提供し、そしてその組成物を提供する。得られたSAC
タンパク質組成物は、ある特定の実施形態では作動可能に連結した、CD46タンパク
質、CD55タンパク質およびCD59タンパク質の機能的単位を含む。例えば、これら
の機能的単位は、成分の機能にもタンパク質の構造的定性にも影響を与えないアミノ酸
の配列であるリンカーによって接続される。さらに、このタンパク質は、ある特定の実施
形態では、タンパク質膜アンカーをコードする配列を除去または欠失するために変異させ
る。関連する実施形態では、例示的なSACTタンパク質は、N末端に分泌シグナルを含
む。このSACTタンパク質は、およそ130KDaであり、補体調節に関与する各成分
タンパク質の単位/ドメインのみを保持するものが取得された。他の可溶性補体調節因子
、例えば、H因子(150kDa)およびsCR1(200kDa)はより大きく、これ
らは、補体を調節するために使用されてきた(Ripocheら 1984年 Bioc
hem J 221巻:89〜96頁;およびYoonら 1985年 J Immun
ol 134巻:3332〜3338頁)。

0059

本明細書で作出された組換えSACTタンパク質は、CD59、CD46およびCD5
5タンパク質の異なる組合せ由来の複数の補体調節ドメインを含み、膜非依存的であるの
で、天然に存在する調節因子とは異なる。したがって、SACTタンパク質は、一度の単
回の投与の後に、拡散し、処置のために罹患細胞または組織の大きい群を覆うことが可能
である。例えば、このSACTタンパク質は、CD46タンパク質、CD55タンパク質
およびCD59タンパク質の少なくとも2つ由来のアミノ酸配列を含む。例えば、このS
ACTタンパク質は、CD46タンパク質およびCD59タンパク質、CD46タンパク
質およびCD55タンパク質、ならびにCD55タンパク質およびCD59タンパク質の
少なくとも1つを含む。あるいは、このSACTタンパク質は、作動可能に連結した、例
えば、可溶性形態で発現される、CD59タンパク質、CD46タンパク質およびCD5
5タンパク質の各々を含む。種々の実施形態では、このCD46タンパク質、CD55タ
ンパク質およびCD59タンパク質は、哺乳動物タンパク質(例えば、ヒト、マウスおよ
ウサギ)由来である。例えば、このSACTタンパク質は、ヒトタンパク質であるCD
46タンパク質およびCD59タンパク質、ならびにマウスタンパク質であるCD55タ
ンパク質を含み、またはヒトタンパク質であるCD46、CD55およびCD59の各々
を含む。したがって、種々の実施形態では、このSACTタンパク質は、同じ哺乳動物
由来であるタンパク質、または異なる型の哺乳動物由来であるタンパク質を含む。

0060

任意の特定の理論にも作用機構にも限定されることなく、SACTタンパク質が、CD
59タンパク質、CD46タンパク質およびCD55タンパク質の各々によって調節され
る補体経路の各々を含む、補体経路中の複数のステップにおいて、補体活性化を相乗的に
遮断することが、本明細書で想定される。このSACTタンパク質は、アデノウイルスベ
クターによって送達された場合にMAC沈着をin vivoで阻害したことが、本明細
書の実施例において観察され、したがって、補体関連の疾患または状態を処置するためま
たはさらには予防するための抗補体治療として、潜在的に有効である。

0061

種々の実施形態では、SACTタンパク質または組成物は、シグナル配列および疎水性
膜貫通ドメインのアミノ酸配列を除去するように改変されたCD46の全長核酸によって
コードされるCD46タンパク質を含む。あるいは、CD46タンパク質の核酸配列は、
得られたタンパク質が細胞膜に結合できないように、疎水性膜貫通ドメイン中に位置する
改変を有する改変されたアミノ酸配列をコードする核酸配列を取得するために、点変異
置換または欠失によって改変される。

0062

本明細書で使用される用語「膜非依存的CD46」とは、疎水性膜貫通ドメインを欠く
、または細胞膜もしくは細胞膜会合型構造、例えば膜結合型タンパク質に結合する機能的
能力を欠く改変された疎水性膜貫通ドメインを有する、CD46アミノ酸配列を指す。本
明細書のCD46タンパク質の範囲は、本明細書に記載された、欠失、置換および付加を
含む保存的配列改変を含むと想定される。

0063

本明細書で使用する場合、用語「保存的配列改変」とは、そのアミノ酸配列を含むCD
46タンパク質の特徴に顕著には影響を与えない、またはかかる特徴を顕著には変更させ
ないアミノ酸改変を指し、即ち、アミノ酸配列中の同じ相対的位置において側鎖を提示す
るCD46タンパク質のアミノ酸配列は、ヒトCD46タンパク質と類似の様式で機能す
る。かかる保存的改変には、アミノ酸の置換、付加および欠失が含まれる。CD46タン
パク質のアミノ酸配列の改変は、当該分野の任意の公知の技術、例えば、部位特異的変異
誘発またはPCRベースの変異誘発を使用して達成される。かかる技術は、Sambro
okら、Molecular Cloning: A Laboratory Manu
al、Cold Spring Harbor Press、Plainview、NY
、1989年およびAusubelら、Current Protocols in M
olecular Biology、John Wiley & Sons、New Y
ork、NY、1989年に記載されている。

0064

保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、機能的に類似の側鎖を有するアミノ酸残基で
置き換えられるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、
当該分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例
えば、リシンアルギニンヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アス
ラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アス
パラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシンシステイントリプトファン
非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリンロイシンイソロイシン
プロリンフェニルアラニンメチオニン)、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸(例えば
、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チ
シン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。

0065

ある特定の実施形態では、CD46アミノ酸配列は、野生型配列のものと実質的に同一
であるアミノ酸配列である。用語「実質的に同一な」は、第1および第2のアミノ酸配列
が、共通の構造的ドメインおよび/または共通の機能的活性を有し得るように、第2のア
ミノ酸配列中の整列されたアミノ酸残基と同一である、十分なまたは最小の数のアミノ酸
残基を含む第1のアミノ酸配列を指すために、本明細書で使用される。例えば、少なくと
も約60%の同一性、または少なくとも75%、85%、95%、96%、98%もしく
は99%の同一性を有する共通の構造的ドメインを含むアミノ酸配列は、実質的に同一で
ある。

0066

配列間の配列同一性の計算は、以下のように実施される。2つのアミノ酸配列のパーセ
ント同一性を決定するために、これらの配列は、最適な比較目的のために整列される(例
えば、ギャップが、最適なアラインメントのために、第1および第2のアミノ酸配列の一
方または両方中に導入され得る)。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位
置におけるアミノ酸残基が比較される。第1の配列中の位置が、第2の配列中の対応する
位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、これらのタンパク
質は、その位置において同一である。2つの配列間のパーセント同一性は、2つの配列の
最適なアラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長
さを考慮に入れた、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。

0067

2つの配列間の配列の比較およびパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを使用
して達成される。2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、デフォルトパラメータ
を使用するアラインメントソフトウェアプログラムを使用して決定される。適切なプログ
ラムには、例えば、Thompsonら、Nuc. AcidsResearch 2
2巻:4673頁、1994年によるCLUSTAL W(www.ebi.ac.uk
/clustalw)、TatusovaおよびMadden、FEMS Microb
iol. Lett. 174巻:247頁、1999年によるBL2SEQ(www.
ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html)、
NotredameおよびHiggins、Nuc. Acids Research
24巻:1515頁、1996年によるSAGA(igs−server.cnrs−m
rs.fr/〜cnotred)、ならびにMorgensternら、Bioinfo
rmatics 14巻:290頁、1998年によるDIALIGN(bibiser
v.techfak.uni−bielefeld.de/dialign)が含まれる

0068

種々の実施形態では、SACTタンパク質または組成物は、CD55タンパク質および
/またはCD59タンパク質を含む。種々の実施形態では、このCD55タンパク質は、
CD55の全長核酸を含む。あるいは、このCD55タンパク質は、本明細書に記載され
る全長核酸配列またはアミノ酸配列の一部分またはホモログである。ある特定の実施形態
では、このCD55タンパク質は、CD59タンパク質の保存的配列改変を含む。

0069

成熟ヒトCD59タンパク質は、77アミノ酸から構成され、約18kD〜約21kD
の分子量を有する。前駆体ヒトCD59タンパク質は、25アミノ酸のアミノ末端シグナ
ルペプチド、および膜アンカーの結合を可能にする、26アミノ酸のカルボキシル末端
プチドを含む。前駆体ヒトCD59タンパク質、成熟ヒトCD59タンパク質、ならびに
他の哺乳動物、例えば、ヒヒアフリカミドリザルヨザルマーモセットHVS−1
5、ブタ、ウサギ、ラットおよびマウスのCD59タンパク質のアミノ酸配列は、その全
体が参照により本明細書に組み込まれる、2007年1月23日に発行した、Simsら
、米国特許第7,166,568号に示されている。

0070

CD59のタンパク質構造は、3つのループおよび小さい4番目らせんループと共に
疎水性コアを有する単一のシステイン−リッチドメインとして特徴付けられる(Yuら、
Journal of Experimental Medicine、185巻(4号
):745〜753頁、1997年)。ジスルフィド結合したシステイン対が、これらの
ループの各々を接続する(Yuら、1997年)。

0071

CD59をコードする遺伝子の構造は、特徴付けられている(1997年4月29日に
発行した、Fodorら、米国特許第5,624,837号)。この遺伝子は、ヒトにお
ける第11染色体短腕、特に、染色体11p13および11p14上に位置し(Onl
ine Mendelian Inheritance in Man受託番号1072
71)、20kbに及ぶ4つのエクソンからなる(Petrankaら Proc. N
at. Acad. Sci. 89巻:7876〜7879頁、1992年)。翻訳
れない1番目のエクソンには、コンセンサスTATAまたはCAATモチーフを欠くGお
よびC−リッチプロモーター領域が先行する。2番目のエクソンは、タンパク質の疎水性
リーダー配列をコードし、3番目のエクソンは、成熟タンパク質のN末端部分をコードす
る。4番目のエクソンは、細胞膜へのグリコシルホスファチジルイノシトール(glyc
ophosphoinosital)アンカー結合のための疎水性配列を含む、成熟タン
パク質の残部をコードする。

0072

CD59は、ヒト末梢血白血球、赤血球および多くの細胞株上で発現されるグリコシル
ホスファチジルイノシトールアンカー型糖タンパク質である。このタンパク質は、造血
胞および非造血細胞の両方の上に、例えば、内皮細胞末梢神経線維ニューロン、ミク
ログリア乏突起神経膠細胞星状細胞上衣細胞上皮細胞唾液腺腺房細胞気管
支上皮、腎尿細管および扁平上皮の上に発現される。Nose, M.ら 1990年
Immunology 70巻(2号):145〜149頁;Vedeler, C.ら
1994年 Immunology 82巻(4号):542〜547頁;およびHi
destima, T.ら 1990年 Immunology 69巻(3号):39
6:401頁を参照のこと。CD59をコードするcDNAは、Sawada, R.ら
1989年 Nucleic AcidsRes 17巻(16号)6728頁によ
って報告された。CD59をコードするcDNAは、ヒトT細胞白血病(YT)細胞株お
よびヒト赤白血病(K562)細胞株からもクローニングされており、CD59は、CO
S細胞において一過的に発現されている(Walsh, L.A.ら 1990年 Eu
r J. Immol 21巻(3号):847〜850頁)。核酸配列によってコード
されるヒトCD59は、77位のアミノ酸アスパラギンにおけるGPIアンカーの結合の
ためのシグナル配列を含む、C末端に位置する26アミノ酸を含む。CD59の全長cD
NAのアミノ酸配列は、1997年4月29日に発行した、Fodorら、米国特許第5
,624,837号に示されている。

0073

CD59とMACの成分との物理会合の分析は、CD59に対する別々の結合部位
、ヒトC8およびヒトC9の各々のα鎖内に含まれていることを示している(Kimbe
rleyら 2007年 Mol Immunol 44巻:73〜81頁を参照のこと
)。ヒトCD59とヒトC9との相互作用のための結合部位は、成熟ヒトCD59の配列
中のアミノ酸残基42〜58として同定されており、そのタンパク質のヒトアミノ酸残基
334〜418に対応するヒトC9の領域、より詳細には、C9の予測された膜挿入ドメ
インのすぐC末端側のヒトC9アミノ酸残基359〜384に結合する(その全体が参照
により本明細書に組み込まれる、1996年11月8日に発行した、Simsら、PCT
/US96/17940)。

0074

公開されたNMRデータからの成熟ヒトCD59の溶液構造およびCD59分子の活性
部分の知識から同定された、C8/C9に結合するのに利用可能である、活性な表面曝露
されたアミノ酸残基側鎖は、44位のヒスチジン、48位のアスパラギン、49位のアス
パラギン酸、51位および52位のスレオニン、55位のアルギニン、ならびに58位の
グルタミン酸である。CD59のNMR構造は、Kiefferらによる寄託、Huma
n Complement Regulatory Protein CD59(Ext
racellular Region、Residues 1 70;NMR、10 S
tructures)、MMDB Id:891、PDB Id:1ERH;Kieff
erらによる寄託、Human Complement Regulatory Pro
tein CD59(Extracellular Region、Residues
1 70;NMR、Restrained)、MMDB Id:890、PDB Id:
1ERG;Fletcherらによる寄託、CD59 Complexed With
Glcnac−Beta−1,4−(Fuc−Alpha−1,6)−Glcnac−B
eta−1(NMR、10 Structures)、MMDB Id:498、PDB
Id:1CDS;Fletcherらによる寄託、CD59 Complexed W
ith Glcnac−Beta−1,4−Glcnac−Beta−1(NMR、10
Structures)、MMDB Id:497、PDB Id:1CDRに記載さ
れている。Fletcherらによる1CDSおよび1CDR寄託。同じ相対的位置にお
いてこれらの側鎖を提示するCD59のアミノ酸配列は、ヒトCD59と類似の様式で機
能し(Simsら)、かかるバリアントは、本明細書の方法、キットおよび医薬組成物の
範囲内である。

0075

本明細書のSACTタンパク質の構築において使用されるある特定の実施形態における
CD59タンパク質は、機能的GPIアンカーのための一次アミノ酸配列を欠く。機能的
に等価なタンパク質である一実施形態は、機能的に欠損し、膜を標的化する能力を欠く、
改変されたGPIアンカードメインアミノ酸配列を含む。膜非依存的CD59タンパク質
を有するSACTタンパク質を取得するさらなる方法には、膜会合の阻害剤を提供するこ
と、例えば、GPIアンカーが欠如するようにCD59をin vivoまたはin v
itroで合成することなどの、非組換え法が含まれる。膜非依存的CD59を取得する
方法は、本明細書の実施例に示されている。分子の核酸配列およびアミノ酸配列を変更す
るためのさらなる組換え技術は、遺伝学および分子生物学の分野で周知である。

0076

種々の実施形態では、この組成物は、77位のアミノ酸アスパラギンをコードするヌク
レオチドにおけるGPIアンカーの結合のためのシグナル配列を除去するように改変され
たCD59タンパク質の全長核酸を有するCD59タンパク質のアミノ酸配列を含む。あ
るいは、CD59の核酸配列は、このタンパク質が細胞の膜に結合できないように、GP
アンカー位置において改変されたアミノ酸配列を有するアミノ酸配列をコードする核酸
配列を取得するために、1または複数の点変異、置換または欠失によって改変される。本
明細書で使用する用語「膜非依存的CD59」とは、GPIアンカーを欠く、または機能
を欠く、即ち、細胞膜もしくは細胞膜会合型構造、例えば膜結合型タンパク質に結合する
能力を欠く改変されたGPIアンカーを有する、CD59アミノ酸配列を指す。

0077

GPIアンカリングには、多数の遺伝子産物の相互作用を含む、小胞体中の複数ステッ
プの経路が関与する。CD59を含む多くのタンパク質が、細胞表面においてGPIが発
現され、有効に機能することを必要とする。タンパク質シグナル中の構造がGPIアンカ
ーの結合をコードする機構は、Orlean, P.ら 2007年 JLR 48巻:
993〜1011頁によって概説されている。GPI結合には一般に、タンパク質をER
に標的化する疎水性N末端分泌シグナルおよびC末端GPIシグナルアンカー配列を含む
アミノ酸配列が関与する。GPIが連結されるアミノ酸は、オメガ(ω)残基と称され、
オメガ残基に対してN末端側のアミノ酸は、オメガ−マイナス(ω−)と称され、オメガ
残基に対してC末端側のアミノ酸は、オメガ−プラス(ω+)と称される。GPIアンカ
ー配列は、可撓性リンカー領域を形成する約10個の極性アミノ酸(即ち、ω−10〜ω
−1)、例えば、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、
またはグルタミン酸のストレッチを含む。このω残基は、グリシン、アラニン、セリン、
アスパラギン、アスパラギン酸またはシステインの1つであることが観察されている。オ
メガ位置のアミノ酸をコードする核酸の置換および欠失を含む変異は、GPIアンカーの
結合を低減もしくは排除するため、またはGPIアンカーの有効な機能性を低減もしくは
排除するために使用される。例えば、かかるバリエーションは、疎水性ロイシンをコード
する核酸(例えば、核酸CTG)およびアラニンをコードする核酸(例えば、核酸GCA
)を、より疎水性が低い(即ち、より親水性が高い)アミノ酸であるグリシンをコードす
る核酸(例えば、核酸CAG)およびグルタミン酸をコードする核酸(例えば、核酸GA
A)で置換することを含む。あるいは、バリエーションは、ω残基を別のアミノ酸で置換
すること、例えば、チロシンをグリシンに置換することを含む。

0078

GPIアンカリングに関与しないタンパク質の他の部分中に、本明細書のSTACタン
パク質は、保存的配列改変を有するCD59タンパク質由来のアミノ酸配列を含む。本明
細書で使用する場合、用語「保存的配列改変」とは、そのアミノ酸配列を含むCD59タ
ンパク質もしくは膜非依存的CD59の特徴に顕著には影響を与えない、またはかかる特
徴を顕著には変更させないアミノ酸改変を指し、即ち、同じ相対的位置においてこれらの
側鎖を提示するCD59のアミノ酸配列は、ヒトCD59と類似の様式で機能する。かか
る保存的改変には、アミノ酸の置換、付加および欠失が含まれる。CD59のアミノ酸配
列の改変は、当該分野の任意の公知の技術、例えば、部位特異的変異誘発またはPCRベ
ースの変異誘発を使用して達成される。かかる技術は、Sambrookら、Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual、Cold S
pring Harbor Press、Plainview、NY、1989年および
Ausubelら、Current Protocols in Molecular
Biology、John Wiley & Sons、New York、NY、19
89年に記載されている。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有する
アミノ酸残基で置き換えられるアミノ酸置換であり、例えば、小さいアミノ酸を異なる小
さいアミノ酸で置き換える、親水性アミノ酸を異なる親水性アミノ酸で置き換えるなどで
ある。

0079

本明細書の実施例は、SACTが、古典的補体経路および第二補体経路を負にモジュレ
ートし、補体関連状態を処置するように、CD46タンパク質、CD55タンパク質およ
びCD59タンパク質の各々由来のアミノ酸配列を有する、キメラの、活性化された補体
の可溶性ターミネーター(SACT)タンパク質、ならびにこの組換えSACTタンパク
質をコードおよび発現するように作出された核酸を有する、方法、組成物およびキットを
含む。あるいは、このSACTタンパク質は、CD46タンパク質、CD55タンパク質
およびCD59タンパク質の少なくとも2つ由来のアミノ酸配列を含む。本明細書および
特許請求の範囲で使用する語句「補体関連(complement−related)」
は、限定なしに「補体関連の(complement−associated)」を含み
、補体経路によって影響される任意の細胞または組織を指す。補体関連障害または状態の
例には、黄斑変性、ループス腎炎、シェーグレン症候群、臓器グラフト拒絶、喘息および
慢性閉塞性肺疾患が含まれる。

0080

ベクター
補体関連障害を処置または予防するための本明細書の方法は、細胞を、C3タンパク質
、CD46タンパク質、CD55タンパク質、SACTタンパク質またはDTACタンパ
ク質を含む医薬組成物と接触させるステップを含み、タンパク質は組換え産生される。用
語「組換え」とは、遺伝子改変された生物、例えば微生物の操作によって産生されたタン
パク質を指す。

0081

タンパク質の例示的な供給源には、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が含
まれ、例えば、タンパク質をコードするヌクレオチド配列または機能的等価物は、適切な
発現ベクター、即ち、組換えタンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に
作動可能に連結した挿入されたコード配列の転写および翻訳を調節するエレメントをコー
ドする必要な核酸を含むベクター中に挿入される。

0082

業者に周知である方法が、適切な転写および翻訳制御エレメントに作動可能に連結し
た、タンパク質をコードする配列を含む発現ベクターを構築するために使用される。これ
らの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術およびin vivo組換
えまたは遺伝子組換えが含まれる。かかる技術は、Sambrookら、Molecul
ar Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spr
ing Harbor Press、Plainview、NY、1989年に記載され
ている。

0083

種々の市販の発現ベクター/宿主系が、タンパク質コード配列を保有および発現するた
めに有用である。これらには、微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド
またはコスミドDNA発現ベクター形質転換された細菌;酵母発現ベクターで形質転換
された酵母ウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)と接触させた昆虫細胞
系;ウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコ
モザイクウイルス、TMV)でトランスフェクトされた、もしくは細菌発現ベクター(例
えば、Ti、pBR322またはpET25bプラスミド)で形質転換された植物細胞
;または動物細胞系が含まれるがこれらに限定されない。Ausubelら、Curre
nt Protocols in Molecular Biology、John W
iley & Sons、New York、NY、1989年を参照のこと。

0084

ウイルスベクターには、アデノウイルスベクターレンチウイルスベクターアデノ
伴ウイルス(AAV)ベクターおよびヘルパー依存的アデノウイルスベクターが含まれる
がこれらに限定されない。例えば、ウイルスベクターは、補体関連状態を本明細書で示さ
れるように処置するSACTタンパク質またはDTACタンパク質をコードする核酸配列
を送達する。アデノウイルスパッケージングベクターは、American Type
Tissue Culture Collection(Manassas、VA)から
市販されている。アデノウイルスベクターを構築する方法およびアデノウイルスベクター
を使用する方法は、Kleinら、Ophthalmology、114巻:253〜2
62頁、2007年およびvan Leeuwenら、Eur. J. Epidemi
ol.、18巻:845〜854頁、2003年に示されている。

0085

アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現(Levreroら、Gene、10
1巻:195〜202頁、1991年)およびワクチン開発(Grahamら、Meth
odsin Molecular Biology: Gene Transfer
and Expression Protocols 7、(Murray編)、Hum
ana Press、Clifton、NJ、109〜128頁、1991年)において
使用されてきた。さらに、組換えアデノウイルスベクターは、遺伝子治療のために使用さ
れる(Wuら、米国特許第7,235,391号)。

0086

組換えアデノウイルスベクターは、例えば、シャトルベクタープロウイルスベクター
との間の相同組換えから生成される(Wuら、米国特許第7,235,391号)。本明
細書のアデノウイルスベクターは、複製欠損であり、例えば、条件的に欠損であり、アデ
ノウイルス領域を欠き、そしてペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチド
は、コード配列が除去された位置に導入される。あるいは、目的の遺伝子をコードするポ
リヌクレオチドは、別の領域中に挿入される。

0087

ヘルパー細胞株は、ヒト細胞、例えば、293ヒト胚腎臓細胞、筋肉細胞造血細胞
たは他のヒト間葉系もしくは上皮細胞から誘導され得る。あるいは、ヘルパー細胞は、
ヒトアデノウイルスに対して許容的な他の哺乳動物種の細胞、例えば、Vero細胞また
は他のサル胚間葉系もしくは上皮細胞から誘導され得る。ヘルパー細胞株を使用するこれ
らの複製欠損アデノウイルスベクターの生成および繁殖は、Grahamら、J. Ge
n. Virol.、36巻:59〜72頁、1977年に記載されている。

0088

レンチウイルスベクターパッケージングベクターは、Invitrogen Corp
oration(Carlsbad CA)から市販されている。レンチウイルスベクタ
ーの産生のためのHIVベースのパッケージングシステムは、Naldiniら、Sci
ence 272巻:263〜267頁、1996年;Zuffereyら、Natur
e Biotechnol.、15巻:871〜875頁、1997年;およびDull
ら、J. Virol. 72巻:8463〜8471頁、1998年中の構築物を使用
して調製される。

0089

いくつかのベクター構築物は、第3世代レンチウイルスSINベクター骨格に基づくシ
ステムを使用してパッケージングされるのに利用可能である(Dullら、J. Vir
ol. 72巻:8463〜8471頁、1998年)。例えば、ベクター構築物pRR
LsinCMVGFPpreは、HIVプロモーター配列がラウス肉腫ウイルス(RSV
)のもので置き換えられた5’LTR、U3プロモーター領域中に欠失を含む自己不活化
性3’LTR、HIVパッケージングシグナル、CMVプロモーターによって駆動される
AequoreaクラゲGFPからなるマーカー遺伝子カセットに連結されたRRE配列
、および核外輸送を増強すると考えられるウッドチャック肝炎ウイルスPREエレメント
を含む。GFPマーカー遺伝子は、UV蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーの直接
観察による、トランスフェクションまたは形質導入効率の定量化を可能にする(Kafr
iら、Nature Genet.、17巻:314〜317頁、1997年およびSa
kodaら、J. Mol. Cell. Cardiol.、31巻:2037〜20
47頁、1999年)。

0090

ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を含むレトロウイルスベクターを構築す
るためのレトロウイルス核酸の操作、およびパッケージング細胞の操作は、当該分野にお
いて公知の技術を使用して達成される。Ausubelら、1992年、1巻、III節
ユニット9.10.1〜9.14.3);Sambrookら、1989年. Mol
ecular Cloning: A Laboratory Manual. 第2版
. Cold Spring Harbor Laboratory Press、Co
ld Spring Harbor、N.Y.;Millerら、Biotechniq
ues. 7巻:981〜990頁、1989年;Eglitisら、Biotechn
iques. 6巻:608〜614頁、1988年;米国特許第4,650,764号
、同第4,861,719号、同第4,980,289号、同第5,122,767号お
よび同第5,124,263号;ならびにPCT特許公開番号WO85/05629、W
O89/07150、WO90/02797、WO90/02806、WO90/136
41、WO92/05266、WO92/07943、WO92/14829およびWO
93/14188を参照のこと。

0091

レトロウイルスベクターが構築され、広宿主性パッケージングシステムを使用して非感
染性形質導入性ウイルス粒子ビリオン)中にパッケージングされる。かかるパッケージ
ングシステムの例は、例えば、Millerら、Mol. Cell Biol. 6巻
:2895〜2902頁、1986年;Markowitzら、J. Virol. 6
2巻:1120〜1124頁、1988年;Cossetら、J. Virol. 64
巻:1070〜1078頁、1990年;米国特許第4,650,764号、同第4,8
61,719号、同第4,980,289号、同第5,122,767号および同第5,
124,263号、ならびにPCT特許公開番号WO85/05629、WO89/07
150、WO90/02797、WO90/02806、WO90/13641、WO9
2/05266、WO92/07943、WO92/14829およびWO93/141
88中に見出される。

0092

産生細胞」の生成は、本明細書で「形質導入する」、「トランスフェクトする」また
は「感染する」と称される接触させるプロセスである、パッケージング細胞中にレトロ
イルスベクターを導入することによって達成される。かかるレトロウイルスベクターの例
は、例えば、Kormanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
. 84巻:2150〜2154頁、1987年;Morgensternら、Nucl
eic AcidsRes. 18巻:3587〜3596頁、1990年;米国特許
第4,405,712号、同第4,980,289号および同第5,112,767号;
ならびにPCT特許公開番号WO85/05629、WO90/02797およびWO9
2/07943中に見出される。

0093

ヘルペスウイルスパッケージングベクターは、Invitrogen Corpora
tion(Carlsbad、CA)から市販されている。例示的なヘルペスウイルスは
、α−ヘルペスウイルス、例えば、水痘帯状疱疹ウイルスまたは仮性狂犬病ウイルス;単
純ヘルペスウイルス、例えば、HSV−1またはHSV−2;およびヘルペスウイルス、
例えば、エプスタイン・バーウイルスである。ほとんどのヘルペスウイルスにとって有能
であるヘルパーウイルスの非存在下で、所望のヌクレオチドセグメント、例えばヌクレオ
チドまたはポリヌクレオチド配列を伴ってパッケージングされ得る空のヘルペスウイルス
粒子を調製するための方法は、Fraefelら(1999年12月7日に発行した、米
国特許第5,998,208号)に示されている。

0094

ヘルペスウイルスDNAベクターは、当業者に知られた技術を使用して構築され得る。
例えば、ヘルペスウイルスのゲノム全体をコードするDNAセグメントは、大きいDNA
セグメントを保有することが可能ないくつかのベクター、例えば、コスミド(Evans
ら、Gene 79巻、9〜20頁、1989年)、酵母人工染色体(YAC)(Sam
brook, J.ら、MOLECULAR CLONING: A LABORATO
RYMANUAL、第2版、Cold Spring Harbor Press、C
old Spring Harbor、N.Y.、1989年)またはE.coli F
エレメントプラスミド(O’Connerら、Science 244巻:1307〜1
313頁、1989年)間で分割される。

0095

例えば、エプスタイン・バーウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、仮性狂犬病ウイルスお
よびHSV−1を含む種々のヘルペスウイルスのゲノム全体を提示する重複するクローン
を含むコスミドのセットが、単離されている。M. van Zijlら、J. Vir
ol. 62巻、2191頁、1988年;Cohenら、Proc. Nat’l A
cad. Sci. U.S.A. 90巻、7376頁、1993年;Tomkins
onら、J. Virol. 67巻、7298頁、1993年;およびCunning
hamら、Virology 197巻、116頁、1993年を参照のこと。

0096

AAVは、培養細胞における増殖性感染を受けるために、別のウイルス(アデノウイル
ス、またはヘルペスウイルスファミリーのメンバーのいずれか)との共感染に依存すると
いう点で、依存的パルボウイルスである(Muzyczka、Curr Top Mic
robiol Immunol、158巻:97 129頁、1992年)。例えば、組
換えAAV(rAAV)ウイルスは、目的の遺伝子、例えば、2つのAAV末端反復(M
cLaughlinら、J. Virol.、62巻(6号):1963 1973頁、
1988年;Samulskiら、J. Virol、63巻:3822 3828頁、
1989年)が隣接した目的の遺伝子を含むプラスミド、および末端反復なしの野生型
AVコード配列を含む発現プラスミドを共トランスフェクトすることによって作製される
。また、細胞をアデノウイルス、またはAAVヘルパー機能に必要なアデノウイルス遺伝
子を保有するプラスミドと接触させるまたは細胞にそれらをトランスフェクトする。かか
る様式で作製された組換えAAVウイルスストックは、組換えAAV粒子から(例えば、
塩化セシウム密度遠心分離によって)物理的に分離されなければならないアデノウイルス
を含む。

0097

アデノ随伴ウイルス(AAV)パッケージングベクターは、GeneDetect(A
uckland、New Zealand)から市販されている。AAVは、高頻度の組
込みを有し、非分裂細胞に感染することが示されており、これが、AAVを、組織培養物
中の哺乳動物細胞中への遺伝子の送達のために有用なものにしている(Muzyczka
、Curr Top Microbiol Immunol、158巻:97 129頁
、1992年)。AAVは、感染性に関して広い宿主範囲を有する(Tratschin
ら、Mol. Cell. Biol.、4巻:2072 2081頁、1984年;L
aughlinら、J. Virol.、60巻(2号):515 524頁、1986
年;Lebkowskiら、Mol. Cell. Biol.、8巻(10号):39
88 3996頁、1988年;McLaughlinら、J. Virol.、62巻
(6号):1963 1973頁、1988年)。

0098

AAVベクターを構築する方法およびAAVベクターを使用する方法は、例えば、米国
特許第5,139,941号および同第4,797,368号に記載されている。遺伝子
送達におけるAAVの使用は、LaFaceら、Virology、162巻(2号):
483 486頁、1988年;Zhouら、Exp. Hematol、21巻:92
8 933頁、1993年;Flotteら、Am. J. Respir. Cell
Mol. Biol.、7巻(3号):349 356頁、1992年;およびWal
shら、J. Clin. Invest、94巻:1440 1448頁、1994年
にさらに記載されている。

0099

組換えAAVベクターは、マーカー遺伝子のin vitroおよびin vivoで
の形質導入(Kaplittら、Nat Genet.、8巻(2号):148 54頁
、1994年;Lebkowskiら、Mol. Cell. Biol.、8巻(10
号):3988 3996頁、1988年;Samulskiら、EMBO J.、10
巻:3941 3950頁、1991年;ShellingおよびSmith、Gene
Therapy、1巻:165 169頁、1994年;Yoderら、Blood、
82巻(補遺):1巻:347A頁、1994年;Zhouら、Exp. Hemato
l、21巻:928 933頁、1993年;Tratschinら、Mol. Cel
l. Biol.、5巻:3258 3260頁、1985年;McLaughlinら
、J. Virol.、62巻(6号):1963 1973頁、1988年)、ならび
にヒト疾患に関与する遺伝子の形質導入(Flotteら、Am. J. Respir
. Cell Mol. Biol.、7巻(3号):349 356頁、1992年;
Ohiら、Gene、89巻(2号):279 282頁、1990年;Walshら、
J. Clin. Invest、94巻:1440 1448頁、1994年;および
Weiら、Gene Therapy、1巻:261 268頁、1994年)のために
、首尾よく使用されてきた。

0100

ある特定の実施形態では、本明細書のベクターは、ウイルス粒子と関連せず、標的細胞
または組織に遺伝子材料を特異的に送達する、非ウイルスベクター、例えば、合成遺伝子
送達ビヒクルまたはベクターである。非ウイルスベクターの例には、リポソーム、ペプチ
ド、ナノ粒子、エマルジョン、もしくはカプセル化された2つまたはそれ超の相系、また
は他の適切な調製物が含まれる。したがって、ある特定の実施形態では、方法、キットま
たは組成物は、ロードされ、組織または細胞に接触させる核酸を有する非ウイルスベクタ
ーを含む。例えば、タンパク質をコードするのDNAを含むリポソームは、リポソーム
中にカプセル化され、このリポソームは、核酸が、補体関連疾患の処置のために組織また
は細胞に有効に送達されるように、組織または細胞に接触させる。

0101

医薬組成物
本発明の一態様は、補体タンパク質または経路を負にモジュレートすることによって補
関連障害を処置するための、CD46タンパク質、CD55タンパク質、DTACタン
パク質およびSACTタンパク質、またはそのタンパク質をコードおよび発現する核酸の
少なくとも1つを含む医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態では、この医薬組成物
は、被験体への全身送達のために構成され、例えば、この組成物は、注射剤として製剤化
される。この組成物は、別の一実施形態では、眼への投与のための眼科学的製剤として製
剤化され、眼底への送達のため、もしくは網膜における局所的放出のために構成され得、
または眼組織に負に影響を与える補体障害に関与する血管および/もしくは組織の有効な
処置を提供するために他の方法で製剤化される。関連の実施形態では、この医薬組成物は
ヒト被験体への、例えば、ヒト被験体の脈管系または内皮系への投与のために、十分に
純粋で製剤化される。ある特定の実施形態では、これらの組成物は、任意選択で、1また
は複数のさらなる治療剤をさらに含む。ある特定の実施形態では、このさらなる治療剤(
単数または複数)は、増殖因子抗炎症剤一酸化窒素およびカルシウムチャネルブロ
カーが含まれるがこれらに限定されない血管収縮剤コラゲナーゼ阻害剤、外用ステロ
ド、マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤アスコルベートアンジオテンシンII
アンジオテンシンIII、カルレティキュリンテトラサイクリンフィブロネクチン
コラーゲントロンボスポンジントランスフォーミング増殖因子(TGF)、ケラチノ
イト増殖因子(KGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、インスリン様増殖因子(I
GF)、IGF結合性タンパク質(IGFBP)、上皮増殖因子(EGF)、血小板由来
増殖因子(PDGF)、neu分化因子(NDF)、肝細胞増殖因子HGF)、脈管内
皮増殖因子(VEGF)、ヘパリン結合性EGF(HBEGF)、トロンボスポンジン、
フォン・ヴィルブランド因子−C、ヘパリンおよびヘパリン硫酸、ならびにヒアルロン酸
からなる群より選択される。

0102

ある特定の実施形態では、複数の治療剤が、同じ、同時発生的なまたは関連の症状、状
態または疾患を処置するために、医薬組成物中に含まれる。一部の実施形態では、この治
療剤は、抗凝固剤、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤、抗菌剤、抗マイコバクテリア剤、抗真菌剤
、抗増殖剤または抗アポトーシス剤が限定なしに含まれ得る薬物である。本発明の組成物
中に含まれる薬物は、当該分野で周知である。例えば、それらの全体が参照により本明細
書にその内容が組み込まれる、Goodman & Gilman’s The Pha
rmacological Basis of Therapeutics、第9版、H
ardmanら編、McGraw−Hill、1996年を参照のこと。

0103

本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される担体」には、所望の特定の剤形
適した、ありとあらゆる溶媒希釈剤または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、表
活性剤等張剤(isotonic agent)、増粘または乳化剤防腐剤固体
結合剤滑沢剤などが含まれる。Remington’s Pharmaceutica
l Sciences、Gennaro編、Mack Publishing、East
on、PA、1995年は、医薬組成物を製剤化する際に使用される種々の担体、および
その調製のための公知の技術を提供している。薬学的に許容される担体として機能し得る
材料の一部の例には、糖、例えば、グルコースおよびスクロース賦形剤、例えば、カカ
オ脂および坐剤ワックス;油、例えば、ピーナツ油、綿実油ベニバナ油ゴマ油オリ
ーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油グリコール、例えば、プロピレングリコール
エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル寒天(agar);緩衝
剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムアルギン酸発熱物質を含
まない水;等張性食塩水リンゲル溶液エチルアルコール;ならびにリン酸塩緩衝溶液
が含まれるがこれらに限定されず、他の非毒性の適合性滑沢剤、例えば、ラウリル硫酸ナ
トリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤放出剤(releasin
g agent)、コーティング剤、防腐剤および抗酸化剤もまた、この組成物中に存在
し得、薬剤および非刺激性濃度の選択は、処方者の判断に従って決定される。

0104

治療有効用
本明細書で提供される方法は、細胞または組織を医薬組成物と接触させるステップ、例
えば、補体関連状態の徴候の低減または予防を含む所望の結果を達成するために必要な量
で、そのような時間にわたって、それを必要とする被験体に、CD46タンパク質、CD
55タンパク質、DTACタンパク質およびSACTタンパク質、タンパク質をコードす
る核酸またはこのタンパク質の発現の供給源の少なくとも1つを活性薬剤として有する医
薬組成物の治療有効量を投与するステップを含む。

0105

本発明の方法に従う組成物は、補体関連障害を処置するために有効な任意の量および任
意の投与経路を使用して投与され得る。したがって、表現「補体関連疾患または状態を処
置するために有効な量」とは、本明細書で使用する場合、その疾患または状態の症状を有
益に予防または改善するのに十分な組成物の量を指す。

0106

正確な投薬量は、処置される患者を考慮して個々の医師によって選択される。投薬量お
よび投与は、十分なレベルの活性薬剤(複数可)を提供するため、または所望の効果を維
持するために調整される。考慮され得るさらなる因子には、疾患状態重症度、例えば、
中間段階または進行段階の黄斑変性;患者の年齢、体重および性別食餌、投与の時間お
よび頻度;投与経路;薬物組合せ;反応感受性;ならびに治療に対する耐性応答が含ま
れる。長時間作用性の医薬組成物は、特定の組成物の半減期およびクリアランス速度に依
存して、毎時、1時間に2回、3〜4時間毎毎日、1日2回、3〜4日毎、毎週、また
は2週間に1回投与され得る。

0107

本発明の活性薬剤は、好ましくは、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために、投薬
単位形態で製剤化される。本明細書で使用する表現「投薬単位形態」とは、処置される患
者に適切な活性薬剤の、物理的に分離した単位を指す。しかし、本発明の組成物の合計1
日使用量は、健全医学的判断の範囲内で、担当医によって決定されることが理解される
。任意の活性薬剤のために、治療有効用量は、細胞培養アッセイ、または本明細書で提供
されるような、通常はマウスであるが、潜在的にはラット、ウサギ、イヌもしくはブタ由
来の動物モデルのいずれかにおいて、最初に推定され得る。本明細書で提供される動物
胞モデルおよびin vivoモデルは、所望の濃度および合計投薬範囲および投与経路
を達成するためにも使用される。次いで、かかる情報は、ヒトでの投与のために有用な用
量および経路を決定するために使用され得る。

0108

治療有効用量とは、症状もしくは状態を改善する、または疾患もしくは状態の進行を予
防する、活性薬剤の量を指す。活性薬剤の治療効力および毒性、例えば、ED50(この
用量は、集団の50%において治療的に有効である)およびLD50(この用量は、集団
の50%にとって致死である)は、細胞培養物または実験動物において標準的な製薬手順
によって決定され得る。毒性効果治療効果用量比は、治療指数であり、比LD50/
ED50として表現され得る。大きい治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養ア
セイおよび動物研究から得られたデータは、ヒト使用のための一定範囲の投薬量を製剤
化する際に使用される。

0109

製品の1日投薬量は、成人ヒト1人当たり1日に0.001から1000mg(1グラ
ム)までなどの、広い範囲にわたって変動し得る。眼投与のために、これらの組成物は、
例えば、処置される患者への投薬量の対症的調整のために、0.001、0.01、0.
05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0、50
.0、100.0、250.0または500.0マイクログラム活性成分を含む溶液
形態で提供される。

0110

単位用量は、典型的には、約0.001マイクログラムから約500マイクログラムま
での活性成分、好ましくは約0.1マイクログラムから約100マイクログラムまでの活
性成分、より好ましくは約1.0マイクログラムから約10マイクログラムまでの活性成
分を含む。薬物の有効量は、通常、約0.0001mg/kg体重/日から約25mg/
kg体重/日までの投薬量レベルで供給される。例えば、この範囲は、約0.001mg
/kg体重/日から10mg/kg体重/日、または約0.001mg/kg体重/日か
ら1mg/kg体重/日までである。これらの組成物は、例えば、1日に1〜4回または
それ超のレジメンで、投与され得る。単位用量は、分割され得、例えば、2またはそれ超
の分割された用量で投与され得る。

0111

タンパク質の発現の供給源の投与は、ある用量のウイルスベクターまたは核酸ベクター
の投与であり、例えば、この用量は、処置される細胞1つ当たり、少なくとも約50、1
00、500、1000または少なくとも約5000の粒子を含む。あるいは、ウイルス
ベクターまたは核酸ベクターの用量は、少なくとも約104〜約105;約105〜約1
06;106〜約107;107〜約108;約108〜約109;約109〜約101
0;または少なくとも約1010〜約1011である。細胞数を処置するのに有効な用量
は、当業者に公知の方法によって、処置を必要とする面積から計算され得る。

0112

医薬組成物の投与
所望の投薬量で、適切な薬学的に許容される担体を用いて製剤化される場合、本明細書
で提供される医薬組成物は、予防または治療目的、ならびに補体関連障害または状態の重
症度および性質に依存して、ヒトおよび他の哺乳動物に、例えば、外用(粉末軟膏また
は液滴などによって)、経口、直腸、粘膜、舌下、非経口、槽内、腟内、腹腔内、頬側
舌下、眼に、または鼻腔内で投与される。

0113

注射には、静脈内注射、または房水もしくは硝子体液中への眼内注射、あるいは結膜下
注射もしくはテノン嚢下(subtenon)注射などによる、眼の外層中への注射が含
まれる。

0114

例えば、静脈内、眼、粘膜または他の投与のための液体剤形には、薬学的に許容される
エマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁物シロップ剤およびエリキシル剤
含まれるがこれらに限定されない。活性薬剤(複数可)に加えて、液体剤形は、当該分野
で一般に使用される不活性希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤(
emulsifier)、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール炭酸
チル、酢酸エチルベンジルアルコール安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1
,3−ブチレングリコールジメチルホルムアミド、油(特に、綿実油、ラッカセイ油
groundnut oil)、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油ヒマシ油および
ゴマ油)、グリセロールテトラヒドロフルフリルアルコールポリエチレングリコール
、およびソルビタン脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などを含み得る。不活性
希釈剤に加えて、眼、経口または他の全身送達される組成物は、アジュバント、例えば、
湿潤剤、ならびに乳化剤(emulsifying agent)および懸濁化剤もまた
含み得る。

0115

本発明の医薬組成物の外用または経皮投与のための剤形には、軟膏、ペーストクリ
ム、ローションゲル、粉末、溶液、スプレー吸入剤またはパッチが含まれる。活性薬
剤は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体、および必要とされ得る場合には、任意の
必要な防腐剤または緩衝液と混合される。例えば、眼または皮膚の投与経路は、水性液滴
ミスト、エマルジョンまたはクリームを用いて達成される。投与は、治療的であり得る
か、または予防的であり得る。本発明は、開示された組成物を含む眼科学的デバイス、外
科的デバイス、聴能学的デバイスまたは製品(例えば、ガーゼ包帯またはストリップ)、
およびかかるデバイスまたは製品を作製または使用する方法を含む。これらのデバイスは
、本明細書に記載される組成物でコーティングされ得、組成物に含浸され得、組成物に結
合され得、または組成物で他の方法で処理され得る。

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