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図面 (3)

課題

モノ−およびジ−PEG化IL10の製造方法を提供する。

解決手段

ボロヒドリドナトリウムシアノボヒドリドアミンボランおよびピコリンボランよりなる群から選択される還元剤の存在下において、IL−10をスクシンイミジルカルボナート−PEG、PEG−ブチルアルデヒド、PEG−ペンタアルデヒド、PEG−アミドプロピオンアルデヒド、PEG−ウレタノ−プロピオアルデヒドおよびPEG−プロピルアルデヒドよりなる群から選択される活性化PEG−リンカーと反応させ、モノ−PEG化IL−10およびジ−PEG化IL−10の混合物を製造することを含み、ここで、IL−10および還元剤が、0.0009から0.04のモル比で存在する。

概要

背景

サイトカインであるインターロイキン10(IL10)は、その2つの単量体ブユ
ットを連結する非共有結合性相互作用破壊に際して生物学的に不活性となる二量体であ
る。IL10は最初は2型ヘルパーT細胞の産物として特定され、後に、B細胞およびマ
クロファージを含む他の細胞型により産生されることが示された。それはまた、γ−イン
ターフロン、IL2および腫瘍壊死因子−α(TNF−α)のような1型ヘルパーT細
胞から産生される幾つかのサイトカインの合成を抑制する。IL10が細胞性免疫応答
ジュレーターを抑制し抗原提示細胞依存性細胞応答を抑制しうることは、IL10が免
抑制特性を有することを示している。このサイトカインはまた、IL1、IL6、IL
8、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GMCSF)、顆粒球コロニー刺激因子
(G−CSF)およびTNF−αのような他のサイトカインの単球マクロファージ産生
を抑制する。その多面的活性の結果として、IL10は、多数の臨床用途、例えば、炎症
状態、細菌性敗血症エンテロトキシン誘発性致死性ショックおよび自己免疫疾患、例え
慢性関節リウマチ同種移植拒絶および糖尿病治療に関して研究が進められていると
ころである。

癌および腫瘍は免疫系により抑制または根絶されうる。免疫系は、幾つかのタイプのリ
ンパ系細胞および骨髄性細胞、例えば単球、マクロファージ、樹状細胞(DC)、好酸球
、T細胞、B細胞および好中球を含む。これらのリンパ系および骨髄性細胞は、サイト
インとして公知の分泌性シグナリングタンパク質を産生する。サイトカインは、例えば、
インターロイキン10(IL10)、インターフェロンガンマ(IFNγ)、IL12
およびIL23を含む。免疫応答は、炎症、すなわち、全身または身体の特定の部位にお
ける免疫細胞蓄積を含む。感染因子または外来物質応答して、免疫細胞はサイトカイ
ンを分泌し、そしてこれは免疫細胞の増殖、発生、分化または遊走モジュレーション
る。過剰な免疫応答は自己免疫障害のような病的結果を招きうる一方で、免疫応答の欠損
は癌を引き起こしうる。免疫系による抗腫瘍応答は、例えばマクロファージ、NK細胞
よび好中球によりもたらされる先天性免疫、ならびに例えば抗原提示細胞(APC)、T
細胞およびB細胞によりもたらされる適応免疫を含む(例えば、Abbasら(編)(2
000)Cellular and Molecular Immunology,W.
B.Sannders Co.,Philadelphia,PA;Oppenheim
およびFeldmann(編)(2001)Cytokine Reference,A
cademic Press,San Diego,CA;von Andrianおよ
びMackay(2000)New Engl.J.Med.343:1020−103
4;DavidsonおよびDiamond(2001)New Engl.J.Med
.345:340−350を参照されたい)。

癌、例えばメラノーマの治療においては、免疫応答をモジュレーションする方法が用い
られている。これらの方法は、サイトカイン、例えばIL2、IL10、IL12、腫瘍
壊死因子アルファ(TNFアルファ)、INFγ、顆粒球マクロファージ−コロニー
激因子(GM−CSF)およびトランスフォーミング増殖因子(TGF)での、またはサ
イトカインアンタゴニスト(例えば、抗体)での治療を含む。インターロイキン10は最
初は、サイトカイン合成抑制因子(CSIF;例えば、Fiorentinoら,(19
89)J.Exp.Med.170:2081−2095を参照されたい)として特徴づ
けられた。IL10は、免疫抑制物質および免疫刺激物質の両方として機能しうる、T細
胞、B細胞、単球により産生される多面的サイトカインである(例えば、Grouxら,
(1998)J.Immunol.160:3188−3193;およびHagenba
ughら,(1997)J.Exp.Med.185:2101−2110を参照された
い)。

動物モデルは、IL10が用量依存的にNK細胞活性化を誘導標的細胞破壊を促進し
うることを示唆している(例えば、Zhengら,(1996)J.Exp.Med.1
84:579−584;Kunduら,(1996)J.Natl.Cancer In
st.88:536−541を参照されたい)。更なる研究は、腫瘍微環境中のIL10
の存在がより良好な患者生存相関することを示している(例えば、Luら,(2004
)J.Clin.Oncol.22:4575−4583を参照されたい)。

IL10は、その比較的短い半減期のため、ポリエチレングリコールを含む種々の相手
に対してコンジュゲート化されている。他のサイトカインもPEG化(pegylate
)されており、一般に、モノPEG化(例えば、PEG分子がサイトカインタンパク質上
の単一残基に結合されること)によりPEG化されている。残念ながら、1つのIL10
サブユニット上のモノPEG化は、サブユニットシャッフリングのため、ジPEG化、モ
ノPEG化および非PEG化IL10分子不均一混合物を与える。PEG化反応を完了
まで進行させることは非特異的および多PEG化標的タンパク質をも生成させ、したがっ
てこれらのタンパク質の生物活性を低下させるであろう。このように、適切にPEG化さ
れたIL10を、より高い製造収率で、より効率的に製造することが必要とされている。
本発明は、モノ−およびジ−PEG化IL10の混合物の製造方法を提供することにより
、この要求を満足させるものである。

概要

モノ−およびジ−PEG化IL10の製造方法を提供する。ボロヒドリドナトリウムシアノボヒドリドアミンボランおよびピコリンボランよりなる群から選択される還元剤の存在下において、IL−10をスクシンイミジルカルボナート−PEG、PEG−ブチルアルデヒド、PEG−ペンタアルデヒド、PEG−アミドプロピオンアルデヒド、PEG−ウレタノ−プロピオアルデヒドおよびPEG−プロピルアルデヒドよりなる群から選択される活性化PEG−リンカーと反応させ、モノ−PEG化IL−10およびジ−PEG化IL−10の混合物を製造することを含み、ここで、IL−10および還元剤が、0.0009から0.04のモル比で存在する。

目的

本発明は、モノ−およびジ−PEG化IL10の混合物の製造方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

少なくとも1つのPEG分子IL10の少なくとも1つのサブユニットの少なくとも1つのアミノ酸残基共有結合しているモノ−およびジ−PEG化IL10の混合物の製造方法であって、該製造方法が、ボロヒドリドナトリウムシアノボヒドリドアミンボランおよびピコリンボランよりなる群から選択される還元剤の存在下において、IL−10をスクシンイミジルカルボナート−PEG、PEG−ブチルアルデヒド、PEG−ペンタアルデヒド、PEG−アミドプロピオンアルデヒド、PEG−ウレタノ−プロピオアルデヒドおよびPEG−プロピルアルデヒドよりなる群から選択される活性化PEG−リンカーと反応させ、モノ−PEG化IL−10およびジ−PEG化IL−10の混合物を製造することを含み、ここで、IL−10および還元剤が、0.0009から0.04のモル比で存在する前記方法。

請求項2

還元剤に対するIL−10のモル比が0.0009から0.01である、請求項1に記載の方法。

請求項3

還元剤に対するIL−10のモル比が0.006から0.04である、請求項1に記載の方法。

請求項4

還元剤に対するIL−10のモル比が0.006から0.01である、請求項1に記載の方法。

請求項5

混合物中におけるモノ−PEG化IL−10対ジ−PEG化IL−10の比が1:1である、請求項1に記載の方法。

請求項6

モノ−PEG化IL−10の前記少なくとも1つのPEG分子が、リンカーを介してIL−10サブユニットのN末端におけるアミノ酸アルファアミノ基に結合している、請求項1に記載の方法。

請求項7

ジ−PEG化IL−10の前記少なくとも1つのPEG分子が、リンカーを介してIL−10サブユニットのそれぞれのN末端におけるアミノ酸のアルファアミノ基にそれぞれ結合している、請求項1に記載の方法。

請求項8

PEG−リンカーがPEG−プロピルアルデヒドである、請求項1に記載の方法。

請求項9

PEGの平均分子量が5,000ダルトンから50,000ダルトンである、請求項1に記載の方法。

請求項10

PEGの平均分子量が5,000ダルトンから20,000ダルトンである、請求項1に記載の方法。

請求項11

IL−10がヒトIL−10である、請求項1に記載の方法。

請求項12

IL−10対PEG−リンカーの比が1:1から1:7.7である、請求項1に記載の方法。

請求項13

IL−10対PEG−リンカーの比が1:3.5である、請求項1に記載の方法。

請求項14

pH5.0から7.4で反応させる、請求項1に記載の方法。

請求項15

5℃から30℃の温度で反応させる、請求項1に記載の方法。

請求項16

3から24時間反応させる、請求項1に記載の方法。

請求項17

還元剤がナトリウムシアノボロヒドリドである、請求項1に記載の方法。

請求項18

カチオン交換アニオン交換、サイズ排除および疎水性相互作用よりなる群から選択されるクロマトグラフィーによりモノ−およびジ−PEG化IL−10の混合物を精製することを更に含む、請求項1に記載の方法。

請求項19

前記モノ−およびジ−PEG化IL−10の混合物がサイズ排除クロマトグラフィーによって精製される、請求項18に記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、モノPEG化(pegylated)(PEG)およびジPEGIL10
組成物ならびに使用方法を含む。

背景技術

0002

サイトカインであるインターロイキン10(IL10)は、その2つの単量体ブユ
ットを連結する非共有結合性相互作用破壊に際して生物学的に不活性となる二量体であ
る。IL10は最初は2型ヘルパーT細胞の産物として特定され、後に、B細胞およびマ
クロファージを含む他の細胞型により産生されることが示された。それはまた、γ−イン
ターフロン、IL2および腫瘍壊死因子−α(TNF−α)のような1型ヘルパーT細
胞から産生される幾つかのサイトカインの合成を抑制する。IL10が細胞性免疫応答
ジュレーターを抑制し抗原提示細胞依存性細胞応答を抑制しうることは、IL10が免
抑制特性を有することを示している。このサイトカインはまた、IL1、IL6、IL
8、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GMCSF)、顆粒球コロニー刺激因子
(G−CSF)およびTNF−αのような他のサイトカインの単球マクロファージ産生
を抑制する。その多面的活性の結果として、IL10は、多数の臨床用途、例えば、炎症
状態、細菌性敗血症エンテロトキシン誘発性致死性ショックおよび自己免疫疾患、例え
慢性関節リウマチ同種移植拒絶および糖尿病治療に関して研究が進められていると
ころである。

0003

癌および腫瘍は免疫系により抑制または根絶されうる。免疫系は、幾つかのタイプのリ
ンパ系細胞および骨髄性細胞、例えば単球、マクロファージ、樹状細胞(DC)、好酸球
、T細胞、B細胞および好中球を含む。これらのリンパ系および骨髄性細胞は、サイト
インとして公知の分泌性シグナリングタンパク質を産生する。サイトカインは、例えば、
インターロイキン10(IL10)、インターフェロンガンマ(IFNγ)、IL12
およびIL23を含む。免疫応答は、炎症、すなわち、全身または身体の特定の部位にお
ける免疫細胞蓄積を含む。感染因子または外来物質応答して、免疫細胞はサイトカイ
ンを分泌し、そしてこれは免疫細胞の増殖、発生、分化または遊走モジュレーション
る。過剰な免疫応答は自己免疫障害のような病的結果を招きうる一方で、免疫応答の欠損
は癌を引き起こしうる。免疫系による抗腫瘍応答は、例えばマクロファージ、NK細胞
よび好中球によりもたらされる先天性免疫、ならびに例えば抗原提示細胞(APC)、T
細胞およびB細胞によりもたらされる適応免疫を含む(例えば、Abbasら(編)(2
000)Cellular and Molecular Immunology,W.
B.Sannders Co.,Philadelphia,PA;Oppenheim
およびFeldmann(編)(2001)Cytokine Reference,A
cademic Press,San Diego,CA;von Andrianおよ
びMackay(2000)New Engl.J.Med.343:1020−103
4;DavidsonおよびDiamond(2001)New Engl.J.Med
.345:340−350を参照されたい)。

0004

癌、例えばメラノーマの治療においては、免疫応答をモジュレーションする方法が用い
られている。これらの方法は、サイトカイン、例えばIL2、IL10、IL12、腫瘍
壊死因子アルファ(TNFアルファ)、INFγ、顆粒球マクロファージ−コロニー
激因子(GM−CSF)およびトランスフォーミング増殖因子(TGF)での、またはサ
イトカインアンタゴニスト(例えば、抗体)での治療を含む。インターロイキン10は最
初は、サイトカイン合成抑制因子(CSIF;例えば、Fiorentinoら,(19
89)J.Exp.Med.170:2081−2095を参照されたい)として特徴づ
けられた。IL10は、免疫抑制物質および免疫刺激物質の両方として機能しうる、T細
胞、B細胞、単球により産生される多面的サイトカインである(例えば、Grouxら,
(1998)J.Immunol.160:3188−3193;およびHagenba
ughら,(1997)J.Exp.Med.185:2101−2110を参照された
い)。

0005

動物モデルは、IL10が用量依存的にNK細胞活性化を誘導標的細胞破壊を促進し
うることを示唆している(例えば、Zhengら,(1996)J.Exp.Med.1
84:579−584;Kunduら,(1996)J.Natl.Cancer In
st.88:536−541を参照されたい)。更なる研究は、腫瘍微環境中のIL10
の存在がより良好な患者生存相関することを示している(例えば、Luら,(2004
)J.Clin.Oncol.22:4575−4583を参照されたい)。

0006

IL10は、その比較的短い半減期のため、ポリエチレングリコールを含む種々の相手
に対してコンジュゲート化されている。他のサイトカインもPEG化(pegylate
)されており、一般に、モノPEG化(例えば、PEG分子がサイトカインタンパク質上
の単一残基に結合されること)によりPEG化されている。残念ながら、1つのIL10
サブユニット上のモノPEG化は、サブユニットシャッフリングのため、ジPEG化、モ
ノPEG化および非PEG化IL10分子不均一混合物を与える。PEG化反応を完了
まで進行させることは非特異的および多PEG化標的タンパク質をも生成させ、したがっ
てこれらのタンパク質の生物活性を低下させるであろう。このように、適切にPEG化さ
れたIL10を、より高い製造収率で、より効率的に製造することが必要とされている。
本発明は、モノ−およびジ−PEG化IL10の混合物の製造方法を提供することにより
、この要求を満足させるものである。

0007

発明の概括
本発明は、制御された反応が選択的PEG化モノ−およびジ−PEG−IL10の混合
物を与え、そしてこれが最終PEG化産物の収率を改善し、他のPEG−IL10種に匹
敵する効力を有するという知見に基づくものである。

0008

本発明は、a)0.75mM〜35mMの還元剤の存在下、約5.0〜7.4のpHお
よび5℃〜30℃の温度で12〜15時間にわたり、1mg/ml〜12mg/mlのI
L10タンパク質を活性化PEG−リンカーと反応させ、この場合、IL10対PEG−
リンカーの比が1:1〜1:7.7となるようにし、b)モノ−およびジ−PEG化IL
10の混合物を精製することを含む、少なくとも1つのPEG分子がIL10の少なくと
も1つのサブユニットの少なくとも1つのアミノ酸残基共有結合しているモノ−および
ジ−PEG化IL10の混合物の製造方法を提供する。ある実施形態においては、該PE
G−リンカーは、スクシンイミジルカルボナート−PEG、PEG−ブチルアルデヒド
PEG−ペンタアルデヒド、PEG−アミドプロピオンアルデヒド、PEG−ウレタノ
プロピオアルデヒドおよびPEG−プロピルアルデヒドよりなる群から選択され、該P
EG−リンカーは5,000ダルトン〜12,000ダルトンであり、あるいは該還元剤
は、ボロヒドリドナトリウムシアノボヒドリドアミンボランおよびピコリンボラン
よりなる群から選択される。さらにもう1つの実施形態においては、カチオン交換アニ
オン交換、サイズ排除および疎水性相互作用よりなる群から選択されるクロマトグラフィ
ーによりモノ−およびジ−PEGの混合物を精製する。この反応方法により製造されたモ
ノ−およびジ−PEG−IL10と医薬上許容される担体とを含む医薬組成物も含まれる

0009

本発明は、a)25mMの還元剤の存在下、約6.3のpHおよび15℃の温度で15
時間にわたり、7.5mg/mlのIL10を活性化PEG−リンカーと反応させ、この
場合、IL10対PEG−リンカーの比が1:3.5となるようにし、b)モノ−および
ジ−PEG化IL10の混合物を精製することを含む、少なくとも1つのPEG分子がI
L10の少なくとも1つのサブユニットの少なくとも1つのアミノ酸残基に共有結合して
いるモノ−およびジ−PEG化IL10の混合物の製造方法を含む。ある実施形態におい
ては、該PEG−リンカーは、スクシンイミジルカルボナート−PEG、PEG−ブチル
アルデヒド、PEG−ペンタアルデヒド、PEG−アミド−プロピオンアルデヒド、PE
G−ウレタノ−プロピオアルデヒドおよびPEG−プロピルアルデヒドよりなる群から選
択される。該PEG−リンカーを構成するPEGの分子量は5,000ダルトン〜20,
000ダルトンであり、該還元剤は、ボロヒドリド、ナトリウムシアノボロヒドリド、ア
ミンボランおよびピコリンボランよりなる群から選択され、あるいはカチオン交換、アニ
オン交換、サイズ排除および疎水性相互作用よりなる群から選択されるクロマトグラフィ
ーによりモノ−およびジ−PEGの混合物を精製する。この反応方法により製造されたモ
ノ−およびジ−PEG−IL10と医薬上許容される担体とを含む医薬組成物も含まれる

0010

詳細な説明
添付の特許請求の範囲を含む本明細書において用いる単数表現は、文脈と明らかに矛
盾しない限り、それらの対応複数物を含む。本明細書中引用されている全ての参考文献
を、各個の刊行物、特許出願または特許が参照により組み入れられると具体的かつ個別に
示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。

0011

I.定義
「活性化」、「刺激」および「治療(処理)」は、それが細胞または受容体に適用され
る場合、文脈により又は明示的に特に示されていない限り、同じ意味を有することが可能
であり、例えば、リガンドでの細胞または受容体の活性化、刺激または処理(治療)を意
味しうる。「リガンド」は、天然および合成リガンド、例えばサイトカイン、サイトカイ
変異体類似体突然変異タンパク質、および抗体由来結合性成分を含む。「リガ
ド」はまた、小分子、例えば、サイトカインのペプチド模倣体、および抗体のペプチド
倣体を含む。「活性化」は、内的メカニズムにより及び外的または環境要因により調節さ
れる細胞活性化を意味しうる。「応答」、例えば細胞、組織器官または生物の「応答」
は、生化学的または生理挙動、例えば濃度、密度接着、または生物学的区画内の遊走
遺伝子発現の率、または分化の状態の変化を含み、ここで、該変化は、活性化、刺激ま
たは処理(治療)に、あるいは内的メカニズム、例えば遺伝的プログラミングに相関され
る。

0012

分子の「活性」は、リガンドへの又は受容体への該分子の結合、あるいは触媒活性;遺
伝子発現または細胞シグナリング、分化もしくは成熟を刺激する能力抗原活性、他の分
子の活性のモジュレーションなどを示しうる又は意味しうる。分子の「活性」は、細胞間
相互作用、例えば接着をモジュレーションまたは維持する場合の活性、あるいは細胞の構
造、例えば細胞膜または細胞骨格を維持する場合の活性をも意味しうる。「活性」は、比
活性、例えば、[触媒活性]/[mgタンパク質]、または[免疫活性]/[mgタンパ
ク質]、生物学的区画内の濃度などをも意味しうる。「増殖活性」は、例えば正常な細胞
分裂ならびに癌、腫瘍、異形成、細胞トランスフォーメーション転移および血管新生
促進する、またはそれらに必要である、またはそれらに特異的に関連している活性を含む

0013

投与」および「治療(処理)」は、それが動物、ヒト、実験対象、細胞、組織、器官
または生物学的流体に適用される場合には、該動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官また
は生物学的流体との外因性医薬治療用物質診断剤化合物または組成物の接触を意味
する。「投与」および「治療(処理)」は、例えば、治療方法プラセボ方法、薬物動態
学的方法、診断方法、研究方法および実験方法を意味しうる。「細胞の処理」は、該細胞
との試薬の接触、および該細胞に接触している流体との試薬の接触を含む。「投与」およ
び「処理(治療)」は、試薬、診断剤、結合性成分または別の細胞による、例えば細胞の
インビトロおよびエクスビボ(ex vivo)処理をも意味する。「治療(処理)」
は、それがヒト、獣医学的対象または研究対象に適用される場合には、治療的処理、予防
的または防御的手段、研究および診断適用を意味する。「治療(処理)」は、それがヒト
、獣医学的もしくは研究対象または細胞、組織もしくは器官に適用される場合には、ヒト
もしくは動物対象、細胞、組織、生理学的区画または生理的流体とのPEG−IL10の
接触を含む。「細胞の処理」は、PEG−IL10がIL10受容体(IL10R1とI
L10R2とのヘテロ二量体)と接触する場合、例えば、流体相またはコロイド相におけ
るもの、およびIL10アゴニストまたはアンタゴニストが流体と接触する場合、例えば
、該流体が細胞または受容体と接触しているが該アゴニストまたはアンタゴニストが該細
胞または受容体に直接的に接触していることが示されていない場合をも含む。

0014

悪液質」は、代謝の障害から生じる筋肉喪失筋肉消耗)および脂肪喪失を含む消耗
症候群である。悪液質は種々の癌(「癌悪液質」)、慢性閉塞性肺疾患COPD)、進
行性臓器不全およびエイズにおいて生じる。癌悪液質は、例えば顕著な体重減少食欲
振、無力症および貧血により特徴づけられる。食欲不振は、食べる意欲欠如、例えば食
嫌悪感から生じる障害である(例えば、MacDonaldら,(2003)J.Am
.Coll.Surg.197:143−161;Rubin(2003)Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 100:5384−5389;Tisdale(2
002)Nature Reviews Cancer 2:862−871;Argi
lesら,(2003)Drug Discovery Today 8:838−84
4;Lelliら,(2003)J.Chemother.15:220−225;Ar
gilesら,(2003)Curr.Opin.Clin.Nutr.Metab.C
are 6:401−406を参照されたい)。

0015

「PEG−IL10の保存的に修飾された変異体」はアミノ酸および核酸配列の両方に
適用される。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾された変異体は、同一または実質
的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を意味するか、あるいは該核酸がアミノ酸配列
をコードしていない場合には、実質的に同一の核酸配列を意味する。遺伝暗号縮重のた
め、機能的に同一である多数の核酸がいずれかの与えられたタンパク質をコードしうる。

0016

アミノ酸配列に関しては、コードされている配列内のアミノ酸または小さな割合のアミ
ノ酸を保存的(同類)アミノ酸で置換する、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパ
ク質配列に対する個々の置換は、「保存的に修飾された変異(体)」である、と当業者
認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を示す保存的置換の表は当技術分野におい
てよく知られている。保存的置換の一例は、以下の群の1つにおけるアミノ酸の、同一群
の別のアミノ酸による置換である(Leeらに発行された米国特許第5,767,063
号;KyteおよびDoolittle(1982)J.Mol.Biol 157:1
05−132):
(1)疎水性ノルロイシン、Ile、Val、Leu、Phe、CysまたはMet;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:Asn、Gln、His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe;
(7)小さなアミノ酸:Gly、Ala、Ser。

0017

「有効量」は、医学的状態の症状または徴候を改善または予防するのに十分な量を含む
。有効量はまた、診断を可能または容易にするのに十分な量を意味する。個々の患者また
は獣医学的対象に対する有効量は、例えば治療されている状態、患者の全体的な健康状態
、投与の方法、経路および用量ならびに副作用重症度のような要因に応じて変動しうる
(例えば、Nettiらに発行された米国特許第5,888,530号を参照されたい)
。有効量は、有意な副作用または毒性作用を回避する最大の用量または投与プロトコール
でありうる。該効果は、少なくとも5%、普通は少なくとも10%、より普通には少なく
とも20%、最も普通には少なくとも30%、好ましくは少なくとも40%、より好まし
くは少なくとも50%、最も好ましくは少なくとも60%、理想的には少なくとも70%
、より理想的には少なくとも80%、最も理想的には少なくとも90%(ここで、100
%は、正常対象により示される診断パラメーターと定義される)の、診断尺度またはパラ
メーターの改善をもたらすであろう(例えば、Maynardら,(1996)A Ha
ndbook of SOPs for Good Clinical Practic
e,Interpharm Press,Boca Raton,FL;Dent(20
01)Good Laboratory and Good Clinical Pra
ctice,Urch Publ.,London,UKを参照されたい)。PEG−I
L10の有効量は、腫瘍体積を減少させるのに、腫瘍増殖を抑制するのに、転移を予防す
るのに、または腫瘍部位内へのCD8+ T細胞浸潤を増強するのに十分な量であろう。

0018

「外因性」は、文脈に応じて、生物、細胞または人体の外部で産生される物質に関する
ものである。「内因性」は、文脈に応じて、細胞、生物または人体の内部で産生される物
質に関するものである。

0019

免疫状態」または「免疫障害」は、例えば病的炎症、炎症障害および自己免疫障害ま
たは疾患を含む。「免疫状態」は、感染、持続的感染および増殖性状態、例えば癌、腫瘍
および血管新生をも意味し、免疫系による照射に対する抵抗性を示す感染、腫瘍および癌
をも含む。「癌状態」は、例えば、癌、癌細胞、腫瘍、血管新生および前癌状態、例えば
過形成を含む。

0020

インヒビター」および「アンタゴニスト」、または「アクチベーター」および「アゴ
ニスト」は、例えばリガンド、受容体、補因子、遺伝子、細胞、組織または器官の例えば
活性化に関する、それぞれ、抑制分子または活性化分子を意味する。例えば遺伝子、受容
体、リガンドまたは細胞のモジュレーターは、該遺伝子、受容体、リガンドまたは細胞の
活性を改変する分子であり、この場合、活性はその調節特性において活性化、抑制または
改変されうる。該モジュレーターは単独で作用することが可能であり、あるいはそれは補
因子、例えばタンパク質、金属イオンまたは小分子を利用することもある。インヒビター
は、活性化を低下、遮断、阻止、遅延させる、不活性化する、脱感作する、または例えば
遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体もしくは細胞をダウンレギュレーションする化合
物である。アクチベーターは、活性化を上昇、活性化、促進、増強する、感作する、また
は例えば遺伝子、タンパク質、リガンド、受容体もしくは細胞をアップレギュレーション
する化合物である。インヒビターはまた、構成的活性を軽減、遮断または不活性化する組
成物と定義されうる。「アゴニスト」は、標的の活性化における増強を引き起こす又は促
進するように、該標的と相互作用する化合物である。「アンタゴニスト」は、アゴニスト
の作用に対抗する化合物である。アンタゴニストは、アゴニストの活性を妨げ、低下させ
、抑制し、または中和する。アンタゴニストはまた、特定されているアゴニストが存在し
ない場合であっても、標的、例えば標的受容体の構成的活性を妨げ、抑制し、または低下
させうる。

0021

抑制の度合を調べるためには、例えば、与えられた例えばタンパク質、遺伝子、細胞ま
たは生物を含むサンプルまたはアッセイを潜在的アクチベーターまたはインヒビターで処
理し、該インヒビターの非存在下で対照サンプルと比較する。対照サンプル、すなわち、
アンタゴニストで処理されていないサンプルには100%の相対活性値割り当てる。該
対照に対する活性値が約90%以下、典型的には85%以下、より典型的には80%以下
、最も典型的には75%以下、一般には70%以下、より一般には65%以下、最も一般
には60%以下、典型的には55%以下、普通は50%以下、より普通には45%以下、
最も普通には40%以下、好ましくは35%以下、最も好ましくは30%以下、より一層
好ましくは25%以下、最も好ましくは25%未満である場合に、抑制が達成される。該
対照に対する活性値が約110%、一般には少なくとも120%、より一般には少なくと
も140%、より一般には少なくとも160%、頻繁には少なくとも180%、より頻繁
には少なくとも2倍、最も頻繁には少なくとも2.5倍、普通は少なくとも5倍、より普
通には少なくとも10倍、好ましくは少なくとも20倍、より好ましくは少なくとも40
倍、最も好ましくは40倍以上である場合に、活性化が達成される。

0022

活性化または抑制におけるエンドポイントは以下のとおりにモニターされうる。例えば
細胞、生理的流体、組織、器官および動物またはヒト対象の活性化、抑制ならびにそれら
の処理(治療)に対する応答はエンドポイントによりモニターされうる。該エンドポイン
トは、例えば炎症、発癌能または細胞脱顆粒もしくは分泌(例えば、サイトカイン、毒性
酸素またはプロテアーゼの放出)の指標の予め決められた量または百分率を含みうる。該
エンドポイントは、例えば、イオンフラックスまたは輸送細胞遊走;細胞接着;細胞増
殖;転移能細胞分化;ならびに表現型の変化、例えば、炎症、アポトーシストランス
フォーメーション細胞周期または転移に関する遺伝子の発現の変化の予め決められた量
を含みうる(例えば、Knight(2000)Ann.Clin.Lab.Sci.3
0:145−158;HoodおよびCheresh(2002)Nature Rev
.Cancer 2:91−100;Timmeら,(2003)Curr.Drug
Targets 4:251−261;RobbinsおよびItzkowitz(20
02)Med.Clin.North Am.86:1467−1495;Gradyお
よびMarkowitz(2002)Annu.Rev.Genomics Hum.G
enet.3:101−128;Bauerら,(2001)Glia 36:235−
243;StanimirovicおよびSatoh(2000)Brain Path
ol.10:113−126を参照されたい)。

0023

抑制のエンドポイントは、一般には対照の75%以下、好ましくは対照の50%以下、
より好ましくは対照の25%以下、最も好ましくは対照の10%以下である。一般に、活
性化のエンドポイントは、対照の少なくとも150%、好ましくは対照の少なくとも2倍
、より好ましくは対照の少なくとも4倍、最も好ましくは対照の少なくとも10倍である

0024

「標識」された組成物は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的同位体または
化学的方法により直接的または間接的に検出可能である。例えば、有用な標識には、32
P、33P、35S、14C、3H、125I、安定同位体蛍光色素高電子密度試薬
基質エピトープタグまたは酵素、例えば酵素結合イムノアッセイまたはフルオレット
(fluorette)において使用されるものが含まれる(例えば、Rozinovお
よびNolan(1998)Chem.Biol.5:713−728を参照されたい)

0025

「リガンド」は、例えば、受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用しうる
小分子、ペプチド、ポリペプチドおよび膜会合もしくは膜結合分子またはそれらの複合
を意味する。「リガンド」はまた、アゴニストでもアンタゴニストでもないが受容体の生
物学的特性(例えば、シグナリングまたは接着)に有意な影響を及ぼすことなく該受容体
に結合しうる物質を含む。さらに、「リガンド」は、例えば化学的または組換え方法によ
膜結合リガンド可溶化形態に改変された該膜結合リガンドを含む。通例、リガンドが
第1の細胞上で膜結合型である場合、その受容体は通常、第2の細胞上に存在する。その
第2の細胞は、その第1の細胞と同じ又は異なる実体でありうる。リガンドまたは受容体
は完全に細胞内に存在することが可能である。すなわち、それはシトゾル、核または何ら
かの他の細胞内区画内に存在することが可能である。リガンドまたは受容体は、例えば細
胞内区画から細胞膜の外面へと、その位置を変化させうる。リガンドと受容体との複合体
は「リガンド受容体複合体」と称される。リガンドおよび受容体がシグナリング経路に関
与する場合、該リガンドは該シグナリング経路の上流位置に存在し、該受容体はその下流
位置に存在する。

0026

「小分子」は腫瘍および癌の生理機能および障害の治療(処理)のために与えられる。
「小分子」は、10kD未満、典型的には2kD未満、好ましくは1kD未満の分子量を
有する分子と定義される。小分子には、無機分子有機分子無機成分を含有する有機分
子、放射性原子を含む分子、合成分子、ペプチド模倣体および抗体模倣体が含まれるが、
これらに限定されるものではない。治療用物質としての小分子は、大分子と比較して、細
胞に対して透過性であり、分解を受けにくく、免疫応答を惹起する傾向が低い可能性があ
る。抗体およびサイトカインのペプチド模倣体のような小分子ならびに小分子毒素は記載
されている(例えば、Cassetら,(2003)Biochem.Biophys.
Res.Commun.307:198−205;Muyldermans(200I)
J.Biotechnol.74:277−302;Li(2000)Nat.Biot
echnol.18:1251−1256;Apostolopoulosら,(200
2)Curr.Med.Chem.9:411−420;Monfardiniら,(2
002)Curr.Pharm.Des.8:2185−2199;Domingues
ら,(1999)Nat.Struct.Biol.6:652−656;Satoおよ
びSone(2003)Biochem.J.371:603−608;Stewart
らに発行された米国特許第6,326,482号を参照されたい)。

0027

化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の具体例には以下のも
のが含まれる:アルキル化剤、例えばチオテパ(thiotepa)およびシクロスホス
ファミド(cyclosphosphamide)(CYTOXAN(商標));アル
スルホナート、例えばブスルファン(busulfan)、イムプロスルファン(im
prosulfan)およびピポスルファン(piposulfan);アジリジン、例
えばベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン(carboquone)、メツ
レドーパ(meturedopa)およびウレドーパ(uredopa);エチレンイミ
ンおよびメチルメルアミン(methylamelamine)、例えばアルトレタミ
ン(altretamine)、トリエチレンメラミントリエチレンホスホルアミド
trietylenephosphoramide)、トリエチレンチオスルアミド(
triethylenethiophosphaoramide)およびトリメチロロメ
ラミン(trimethylolomelamime)窒素マスタード、例えばチオラ
シル(chiorambucil)、クロルナファジン(chlornaphazin
e)、クロロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン
estramustine)、イフォスファミド(ifosfamide)、メクロルエ
タミン(mechlorethamine)、メクロルエタミンオキシド塩酸塩、メルフ
ラン(melphalan)、ノベムビチン(novembichin)、フェネステ
リン(phenesterine)、プレニムスチン(prednimustine)
トロフスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード(uraci
l mustard);ニトロソウレア、例えばカルムスチン(carmustine)
、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemust
ine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン(nimustine)、ラ
ニムスチン(ranimustine);抗生物質、例えばアクシノマイシン(acl
acinomysin)、アクノマイシン(actinomycin)、オースラマイシ
ン(authramycin)、アザセリン(azaserine)、ブレオマイシン
bleomycin)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カリケアマイ
シン(calicheamicin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマ
イシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin
)、クロモマイシン(chromomycin)、ダクチノマイシン(dactinom
ycin)、ダウノルビシン(daunorubicin)、デトルビシン(detor
ubicin)、6−ジアゾ−5−オキソ−L−ノルロイシン、ドキソルビシン(dox
orubicin)、エピルビシン(epirubicin)、エソルビシン(esor
ubicin)、イダルビシン(idarubicin)、マルセロマイシン(marc
ellomycin)、マイトマイシン(mitomycin)、ミコフェノール酸、ノ
ガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycin)、
ペプロマイシン(peplomycin)、ポトフィロマイシン(potfiromyc
in)、ピューロマイシン(puromycin)、クエラマイシン(quelamyc
in)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン(strept
onigrin)、ストレプトゾシン(streptozocin)、ツベルシジン(t
ubercidin)、ウベニメックス(ubenimex)、ジノスタチン(zino
statin)、ゾルビシン(zorubicin);代謝拮抗物質、例えばメトトレキ
セート(methotrexate)および5−フルオロウラシル(5−FU);葉酸
似体、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート(methot
rexate)、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(t
rimetrexate);プリン類似体、例えばフルダラビン(fludarabin
e)、6−メルカプトプリンチアプリン(thiamiprine)、チオグアニン
(thioguanine);ピリミジン類似体、例えばアンシタビン(ancitab
ine)、アザシチジン(azacitidine)、6−アザウリジンカルモフール
(carmofur、シタラビン(cytarabine)、ジデオキシウリジン(di
deoxyuridine)、ドキシフルリジン(doxifluridine)、エノ
タビン(enocitabine)、フロクスリジン(floxuridine)、5
−FU;アンドロゲン、例えばカルステロン(calusterone)、ドロモスタノ
ロン(dromostanolone)プロピオナートエピチオスタノール(epit
iostanol)、メピチオスタン(mepitiostane)、テストラクトン
testolactone);抗アドレナール、例えばアミノグルテチミド(amino
glutethimide)、ミトタン(mitotane)、トリロスタン(tril
ostane);葉酸補充物、例えばフロリン酸(frolinic acid);アセ
グラトン(aceglatone);アルドホスファミド(aldophosphami
de)グリコシドアミノレブリン酸アムサクリン(amsacrine);ベスト
ブシル(bestrabucil);ビサントレン(bisantrene);エダトラ
キセート(edatraxate);デフォファミン(defofamine);デメコ
ルシン(demecolcine);ジアジクオン(diaziquone);エルフォ
ルニチン(elfornithine);酢酸リプチニウム(elliptinium
);エトグルシド(etoglucid);硝酸ガリウムヒドロキシ尿素レンチナン
(lentinan);ロニダミン(lonidamine);ミトグアゾン(mito
guazone);ミトザントロン(mitoxantrone);モピダモール(mo
pidamol);ニトクリン(nitracrine);ペントスタチン(pent
ostatin);フェナメット(phenamet);ピラルビシン(pirarub
icin);ポドフィリン酸(podophyllinic acid);2−エチル
ドラジド;プロカルバジン(procarbazine);PSK登録商標);ラゾキ
サン(razoxane);シゾフィラン(sizofiran);スピロゲルマニウム
(spirogermanium);テヌアゾン酸(tenuazonic acid)
トリアジクオン(triaziquone);2,2’,2’’−トリクロロトリエチ
ルアミンウレタンビンデシン(vindesine);ダカルバジン(dacarb
azine);マンノムスチン(mannomustine);ミトブロニトール(mi
tobronitol);ミトラクトール(mitolactol);ピポブロマン(p
ipobroman);ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(arab
inoside)(「Ara−C」);シクロホスファミド(cyclophospha
mide);チオテパ(thiotepa);タキソイド、例えばパクリタキセル(pa
clitaxel)(TAXOL(登録商標)Bristol−Myers Squib
b Oncology,Princeton,N.J.)およびドキセタキセル(dox
etaxel(Taxotere(商標),Rhone−Poulenc Rorer,
Antony,France);クロラムブシル(chlorambucil);ゲムシ
タビン(gemcitabine);6−チオグアニン;メルカプトプリン(merca
ptopurine);メトトレキセート(methotrexate);白金類似体
例えばシスプラチン(cisplatin)およびカルボプラチン(carboplat
in);ビンブラスチン(vinblastine);白金エトポシド(etopos
ide)(VP−16);イフォスファミド(ifosfamide);マイトマイシン
C;ミトザントロン(mitoxantrone);ビンクリスチン(vincrist
ine);ビノレルビン(vinorelbine);ナベルビン(navelbine
);ノバントロン(novantrone);テニポシド(teniposide);ダ
ウノマイシン(daunomycin);アミノプテリン(aminopterin);
Xeloda(登録商標)Roche,Switzerland;イバンドロネート(i
bandronate);CPT11;トポイソメラーゼインヒビターRFS2000
ジフルオロメチルオルニチン(difluoromethylornithine)(
DMFO);レチノイン酸エスペラミシン(esperamicin);カペシタビン
(capecitabine);ならびに前記のいずれかのものの医薬上許容される塩、
酸または誘導体。腫瘍に対するホルモン作用を調節または抑制するよう作用する抗ホルモ
ン剤もこの定義に含まれる。該抗ホルモン剤としては例えば以下のものが挙げられる:抗
エストロゲン、例えばタモキシフェン(tamoxifen)、ラロキシフェン(ral
oxifene)、アロマターゼ阻害性4(5)−イミダゾール、4−ヒドロキシタモ
フェン(hydroxytamoxifen)、トリオキシフェン(trioxife
ne)、ケオキシフェン(keoxifene)、LY117018、オナプリストン
onapristone)およびトレミフェン(toremifene)(Farest
on);ならびに抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミ
ド(nilutamide)、ビカルタミド(bicalutamide)、ロイプロリ
ド(leuprolide)およびゴセレリン(goserelin);ならびに前記の
いずれかのものの医薬上許容される塩、酸または誘導体。

0028

リガンド/受容体、抗体/抗原、または他の結合性ペアに言及する場合の「特異的」ま
たは「選択的」に結合は、タンパク質および他の生物学的物質の不均一集団内のタンパク
質の存在を決定する結合反応を示す。したがって、示されている条件下、特定されたリガ
ンドは特定の受容体に結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質には有意量では結合
しない。想定される方法の抗体、または抗体の抗原結合部位由来結合性組成物は、いず
れかの他の抗体またはそれに由来する結合性組成物の場合のアフィニティより少なくとも
2倍大きな、好ましくは少なくとも10倍大きな、より好ましくは少なくとも20倍大き
な、最も好ましくは少なくとも100倍大きなアフィニティで、その抗原またはその変異
体もしくは突然変異タンパク質に結合する。好ましい実施形態においては、該抗体は、例
えばスキャッチャード(Scatchard)分析(Munsenら,(1980)An
alyt.Biochem.107:220−239)により測定した場合に約109
リットル/molより大きなアフィニティを有するであろう。

0029

本明細書中で用いる「インターロイキン10」または「IL10」は、ポリエチレン
リコールにコンジュゲート化されている場合であっても非コンジュゲート化形態の場合で
あっても、ホモ二量体を形成するよう非共有結合した2つのサブユニットを含むタンパク
質である。特に示さない限り、本明細書中で用いる「インターロイキン10」および「I
L10」はヒトまたはマウスIL10(Genbankアクセッション番号NP 000
563;M37897;またはUS6,217,857)(それらは「hIL10」また
は「mIL10」とも称される)を意味しうる。

0030

「PEG化IL10」または「PEG−IL10」は、結合が安定するようリンカーを
介してIL10タンパク質の1以上のアミノ酸残基に共有結合した1以上のポリエチレン
グリコール分子を有するIL10分子である。「モノPEG化IL10」および「モノP
EG−IL10」は、少なくとも1つのポリエチレングリコール分子がリンカーを介して
IL10二量体の1つのサブユニット上の単一アミノ酸残基に共有結合していることを意
味する。「ジPEG化IL10」および「ジPEG−IL10」は、少なくとも1つのP
EG分子がリンカーを介してIL10二量体の各サブユニット上の単一残基に共有結合し
ていることを意味する。該PEG部分の平均分子量は、好ましくは、約5,000〜約5
0,000ダルトンである。IL10へのPEG結合の方法または部位は決定的なもので
はないが、好ましくは、該PEG化は生物活性分子の活性を改変しないか、または最小限
度に改変するに過ぎない。好ましくは、半減期の増加は生物活性におけるいずれの減少よ
りも大きい。PEG−IL10の場合、生物活性は、典型的には、US 7,052,6
86に記載されているとおり、細菌性抗原リポ多糖LPS)でチャレンジされPEG
−IL10で処理された被験者血清中炎症性サイトカイン(例えば、TNFα、IF
Nγ)のレベルを評価することにより測定される。

0031

本明細書中で用いる「血清半減期」(「t1/2」と略称される)は、消失半減期、す
なわち、物質の血清濃度がその初期または最大値の半分に達する時間を意味する。合成物
質に関して本明細書中で用いる「血清半減期の増加」なる語は、該合成物質が、その非合
内因性物質または組換え製造物より遅い速度で消失することを意味する。

0032

II.総論
本発明はモノ−およびジ−PEGの混合物の製造方法を提供する。PEG化IL10は
腫瘍状態において、より有効であることが示されている。例えば、US2008008
1031を参照されたい。本発明は、モノPEG化(IL10ホモ二量体の1つのサブユ
ニット上に少なくとも1つのPEG分子)およびジPEG化(IL10ホモ二量体の各サ
ブユニット上に少なくとも1つのPEG分子)IL10の両方を精製することによる、P
EG化IL10の収率を増加させるための方法を提供する。

0033

III.ポリエチレングリコール(「PEG」)
ポリエチレングリコール(「PEG」)は、治療用タンパク質製品の製造において使用
されている化学的部分である。「PEG化する」なる動詞は、少なくとも1つのPEG分
子を別の分子、例えば治療用タンパク質に結合させることを意味する。例えば、アデノ
デアミナーゼのPEG化製剤であるアダジェン(Adagen)が重度の複合免疫不全
疾患の治療に関して承認されており、PEG化スーパーオキシドジスムターゼが頭部損傷
の治療に関して臨床治験中であり、PEG化アルファインターフェロン肝炎の治療に関
して第I相臨床治験において試験されており、PEG化グルコセレブロシダーゼおよびP
EG化ヘモグロビン前臨床試験中であると報告されている。ポリエチレングリコールの
結合はタンパク質分解を防ぐことが示されている(例えば、Sadaら,(1991)J
.Fermentation Bioengineering 71:137−139を
参照されたい)。

0034

PEGは、その最も一般的な形態においては、一般構造
HO−(CH2CH2O)n−CH2CH2−OH
を有する、ヒドロキシル基で終わる直鎖状または分枝ポリエーテルである。

0035

PEGを分子(ポリペプチド、多糖ポリヌクレオチドおよび小有機分子)に結合させ
るためには、一方または両方の末端官能基を有する該PEGの誘導体を調製することに
より該PEGを活性化させることが必要である。タンパク質のPEG結合のための最も一
般的な経路は、リシンおよびN末端アミノ基との反応に適した官能基でPEGを活性化す
ることである。特に、ポリペプチドへのPEGの結合に関与する最も一般的な反応性基
リシンのアルファまたはイプシロンアミノ基である。

0036

タンパク質とのPEG化リンカーの反応は、主に以下の部位におけるPEG部分の結合
を招く:タンパク質のN末端におけるアルファアミノ基、リシン残基の側鎖上のイプシロ
ンアミノ基、およびヒスチジン残基の側鎖上のイミダゾール基。ほとんどの組換えタンパ
ク質は単一のアルファならびに多数のイプシロンアミノおよびイミダゾール基を有するた
め、リンカーの化学に応じて多数の位置異性体が生成されうる。

0037

広く使用されている2つの第1世代の活性化モノメトキシPEG(mPEG)はスク
ンイミジルカルボナートPEG(SC−PEG;例えば、Zalipskyら,(199
2)Biotehnol.Appl.Biochem 15:100−114;ならびに
MironおよびWilcheck(1993)Bioconjug.Chem.4:5
68−569)およびベンゾトリアゾールカルボナートPEG(BTC−PEG;例えば
、Dolenceら,米国特許第5,650,234号を参照されたい)であった。それ
らは主としてリシン残基と反応してカルバマート結合を形成するが、ヒスチジンおよびチ
ロシン残基と反応することも公知である。IFNα上のヒスチジン残基への結合は、加水
分解的に不安定なイミダゾールカルバマート結合であることが示されている(例えば、L
eeおよびMcNemar,米国特許第5,985,263号を参照されたい)。

0038

第2世代のPEG化技術は、これらの不安定な結合および残基反応性における選択性
欠如を回避するように設計されている。PEG−アルデヒドリンカーの使用は、還元的ア
ミノ化により、ポリペプチドおよび/またはタンパク質サブユニットのN末端上の単一部
位を標的化する。IL10は、種々の形態のPEG化分子を得るために種々のタイプのリ
ンカーおよびpHを使用してPEG化されうる(例えば、US5,252,714、US
5,643,575、US5,919,455、US5,932,462、US5,98
5,263、US7,052,686を参照されたい)。

0039

IV.PEG−IL10の生物活性
ヒトIL10は、免疫適格性マウスに投与されると、中和抗体の急速な発生を誘導する
。このタイプの中和を回避するために、B細胞欠損マウス(すなわち、抗体応答を惹起し
得ないマウス)においてPEG−hIL10の皮下投与を行った。これらの免疫欠損マウ
スにおける十分に樹立された同系腫瘍はPEG−hIL10により有意に成長遅延したか
又は完全に拒絶された。該腫瘍成長制限または抑制はCD4およびCD8 T細胞に依存
的であった。CD8細胞が欠乏すると、PEG−hIL10の抑制効果は完全に妨げられ
た。したがって、PEG−hIL10はCD8媒介性細胞傷害性応答を誘導する。

0040

腫瘍組織の更なる分析は、PEG−IL10が、非PEG化IL10の場合より大きな
レベルで、腫瘍内へのCD8+ T細胞の浸潤を増強することを示した。該浸潤性CD8
細胞による炎症性サイトカイン発現のレベルも、PEG−IL10処理では、非PEG化
IL10処理と比較して高かった。PEG−IL10での腫瘍患者の治療(処理)は有意
な抗腫瘍応答を誘導し、有意な治療利益をもたらすはずである(例えばを参照されたい)

0041

本発明において使用されるIL10タンパク質は、少なくとも75%、より好ましくは
少なくとも85%、最も好ましくは少なくとも90%またはそれ以上、例えば少なくとも
95%の観測相同性を、成熟IL10タンパク質(すなわち、いずれのリーダー配列をも
欠くもの)の配列と共有するアミノ酸配列を含有する。例えば、米国特許第6,217,
857号を参照されたい。アミノ酸配列相同性または配列同一性は、残基のマッチ(一致
)を最適化することにより、そして必要に応じて、必要なギャップを導入することにより
決定される。相同アミノ酸配列は、典型的には、それぞれの各配列において天然対立遺伝
子変異、多形変異および種間変異を含むと意図される。典型的な相同タンパク質またはペ
プチドは、IL10ポリペプチドのアミノ酸配列に対して25〜100%の相同性(ギャ
ップが導入されうる場合)ないし50〜100%の相同性(保存的置換が含まれる場合)
を有するであろう。Needlehamら,J.Mol.Biol.48:443−45
3(1970);Sankoffら.in Time Warps,String Ed
its,and Macromolecules:The Theory and Pr
actice of Sequence Comparison,1983,Addis
on−Wesley,Reading,Mass.;ならびにIntelliGenet
ics,Mountain View,CalifおよびUniversity of
Wisconsin Genetics Computer Group,Madiso
n,Wis.のソフトウェアパッケージを参照されたい。

0042

該PEG−IL10コンジュゲートにおけるIL10部分はグリコシル化されているこ
とが可能であり、非グリコシル化突然変異タンパク質または他の類似体、例えばBCRF
1(エプスタインバーウイルスウイルス性IL10)タンパク質で修飾されていてもよ
い。IL10をコードする配列の修飾は、種々の技術、例えば部位特異的突然変異誘発
Gillmanら,Gene 8:81−97(1979);Robertsら,Nat
ure 328:731−734(1987)]を用いて実施可能であり、IL10活性
に関する適当なアッセイにおける通常のスクリーニングにより評価されうる。修飾IL1
0タンパク質、例えば変異体は、天然に存在する配列から一次構造レベルで変化している
ことが可能である。そのような修飾はアミノ酸の挿入、置換、欠失および融合により行わ
れうる。IL10変異体は、血清半減期の増加、IL10に対する免疫応答の軽減、精製
または製造の促進、IL10からその単量体サブユニットへの変換の軽減、治療効力の改
善および治療用に使用中の副作用の重症度または頻度の低減を含む種々の目的を意図して
製造されうる。アミノ酸配列変異体は、翻訳後変異体、例えばグリコシル化変異体である
こともあるが、通常は、天然で見いだされない予め決められた変異体である。本発明にお
いてはIL10の任意の変異体が使用されうる。ただし、それは適当なレベルのIL10
活性を保有している必要がある。腫瘍の場合、適当なIL10活性は、例えば、腫瘍部位
内へのCD8+ T細胞浸潤、これらの浸潤性細胞からの炎症性サイトカイン、例えばI
FNγ、IL4、IL6、IL10およびRANK−Lの発現、生物学的サンプルにおけ
るTNFαまたはIFNγのレベルの増加であろう。

0043

本発明において使用されるIL10は、哺乳動物、例えばヒトまたはマウスに由来しう
る。ヒトIL10(hIL10)は、IL10治療を要するヒトの治療に好ましい。本発
明において使用されるIL10は、好ましくは、組換えIL10である。ヒトおよびマウ
スIL10の製造を示す方法は米国特許第5,231,012号に見出されうる。ヒトお
よびマウスIL10の天然に存在する又は保存的に置換された変異体も含まれる。本発明
のもう1つの実施形態においては、IL10はウイルス由来でありうる。エプスタイン
ウイルスからのウイルス性IL10(BCRF1タンパク質)のクローニングおよび発
現はMooreら,Science 248:1230(1990)に開示されている。

0044

IL10は、当技術分野で公知の標準的な技術[例えば、該タンパク質を分泌しうる活
性化細胞(例えば、T細胞)の培地からの単離および精製、化学合成または組換え技術]
を用いる多数の方法により得られうる[例えば、Merrifield,Science
233:341−47(1986);Athertonら,Solid Phase
Peptide Synthesis,A Practical Approach,1
989,I.R.L.Press,Oxford;米国特許第5,231,012号(こ
れは、組換え技術および他の合成技術を含む、IL10活性を有するタンパク質の製造方
法を教示している)を参照されたい]。好ましくは、IL10タンパク質は、組換え技術
を用いて、IL10ポリペプチドをコードする核酸から得られる。また、組換えヒトIL
10は例えばPeproTech,Inc.,Rocky Hill,N.J.から商業
的に入手可能である。

0045

PEG−IL10は、当技術分野でよく知られた技術を用いて製造されうる。ポリエチ
レングリコール(PEG)は、例えばLundblad,R.L.ら(1988)Che
mical Reagents for Protein Modification
CRCPress,Inc.,vol.1,pp.105−125に記載されていると
おりに合成されうる。PEGは、前記のとおりにリンカーを使用してIL10にコンジュ
ゲート化されうる。ある実施形態においては、本発明において使用されるPEG−IL1
0はモノPEG−IL10であり、これにおいては、1〜9個のPEG分子が、リンカー
を介して、IL10二量体の1つのサブユニットのN末端におけるアミノ酸残基のアルフ
ァアミノ基に共有結合している。

0046

IV.治療用組成物、方法
PEG−IL10は、治療的有効量のIL10と医薬担体とを含む医薬組成物として製
剤化されうる。「治療的有効量」は、所望の治療結果を得るのに十分な量である。好まし
くは、そのような量は最小の負の副作用を有する。IL10で治療可能な状態を治療する
ために投与されるPEG−IL10の量は該コンジュゲート化タンパク質のIL10活性
に基づき、これは、当技術分野で公知のIL10活性アッセイにより決定されうる。その
ような治療を要する個々の患者に対する治療的有効量は、例えば、治療される状態、患者
の全体的な健康状態、投与方法、副作用の重症度などのような種々の要因を考慮して決定
されうる。腫瘍の場合、適当なIL10活性は、例えば、腫瘍部位内へのCD8+ T細
胞浸潤、これらの浸潤性細胞からの炎症性サイトカイン、例えばIFNγ、IL4、IL
6、IL10およびRANK−Lの発現、生物学的サンプルにおけるTNFαまたはIF
Nγのレベルの増加であろう。

0047

PEG化IL10の治療的有効量はタンパク質約0.01〜約100μg/kg体重
日(1日当たり体重1kg当たり)の範囲でありうる。好ましくは、PEG化IL10の
量はタンパク質約0.1〜20μg/kg体重/日、より好ましくはタンパク質約0.5
〜10μg/kg体重/日、最も好ましくはタンパク質約1〜4μg/kg体重/日の範
囲である。本発明のPEG−IL10を使用して、より低頻度投与計画が用いられうる
。なぜなら、このコンジュゲート化形態はIL10より長時間作用性だからである。該P
EG化IL10は、凝集物および他のタンパク質を実質的に含有しない精製形態で製剤化
される。好ましくは、PEG−IL10は、1日当たりタンパク質約50〜800μgの
範囲の量(すなわち、タンパク質約1〜16μg/kg体重/日のPEG−IL10)が
運搬されるよう、連続的注入により投与される。1日注入量は副作用および血球数のモニ
ターに基づいて変動しうる。

0048

モノPEG−IL10を含有する医薬組成物を製造するためには、PEG−IL10の
治療的有効量を医薬上許容される担体または賦形剤と混合する。好ましくは、該担体また
は賦形剤は不活性である。医薬担体は、本発明のIL10組成物を患者へ運搬するのに適
したいずれかの適合性無毒性物質でありうる。適当な担体の具体例には、正常食塩水、リ
ンガー液、デキストロース溶液およびハンクス液が含まれる。非水性担体、例えば不揮発
性油およびオレイン酸エチルも使用されうる。好ましい担体は5%デキストロース食塩
水である。該担体は少量の添加物、例えば、等張性および化学的安定性を増強する物質、
例えばバッファーおよび保存剤を含有しうる。例えば、Remington’s Pha
rmaceutical SciencesおよびU.S. Pharmacopeia
:National Formulary,Mack Publishing Comp
any,Easton,PA(1984)を参照されたい。治療用物質および診断用物質
の製剤は、生理的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより、例えば
凍結乾燥粉末スラリー水性溶液水溶液)または懸濁液の形態で製造されうる(例え
ば、Hardmanら,(2001)Goodman and Gilman’s Th
e Pharmacological Basis of Therapeutics,
McGraw−Hill,New York,NY;Gennaro(2000)Rem
ington:The Science and Practice of Pharm
acy,Lippincott,Williams,and Wilkins,New
York,NY;Avisら,(編)(1993)Pharmaceutical Do
sage Forms:Parenteral Medications,Marcel
Dekker,NY;Liebermanら,(編)(1990)Pharmaceu
tical Dosage Forms:Tablets,Marcel Dekker
,NY;Liebermanら,(編)(1990)Pharmaceutical D
osage Forms:Disperse Systems,Marcel Dekk
er,NY;WeinerおよびKotkoskie(2000)Excipient
Toxicity and Safety,Marcel Dekker,Inc.,N
ew York,NYを参照されたい)。

0049

本発明の組成物は経口投与されることが可能であり、あるいは体内に注射されることが
可能である。経口用製剤は、胃腸管内のプロテアーゼから該IL10を更に保護するため
の化合物をも含みうる。注射は、通常、筋肉内、皮下、皮内または静脈内である。あるい
は適当な状況において、関節内注射または他の経路が用いられうる。

0050

非経口投与の場合には、PEG化IL10は、好ましくは、医薬担体を伴う注射可能な
単位投与形(溶液、懸濁液、エマルション)として製剤化される。例えば、Avisら編
,Pharmaceutical Dosage Forms:Parenteral
Medications,Dekker,N.Y.(1993);Liebermanら
編,Pharmaceutical Dosage Forms:Tablets,De
kker,N.Y.(1990);およびLiebermanら編,Pharmaceu
tical Dosage Forms:Disperse Systems,Dekk
er,N.Y.(1990)を参照されたい。あるいは本発明の組成物は移植可能または
注射可能な薬物運搬系ドラッグデリバリーシステム)により患者の体内に導入されうる
(例えば、Urquhartら,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol
.24:199−236,(1984);Lewis編,Controlled Rel
ease of Pesticides and Pharmaceuticals P
lenum Press,New York(1981);米国特許第3,773,91
9号、第3,270,960号など)。該PEG化IL10は、種々の添加剤および/ま
たは希釈剤の存在下または非存在下、例えば水、食塩水塩類液)または緩衝化ビヒクル
のような水性ビヒクル中で投与されうる。

0051

個々の患者に対する有効量は、例えば、治療されている状態、患者の全体的な健康状態
、投与の方法、経路および用量ならびに副作用の重症度のような要因に応じて変動しうる
(例えば、Maynardら,(1996)A Handbook of SOPs f
or Good Clinical Practice,Interpharm Pre
ss,Boca Raton,FL;Dent(2001)Good Laborato
ry and Good Clinical Practice,Urch Publ,
London,UKを参照されたい)。

0052

典型的な獣医学的対象、実験対象または研究対象には、サルイヌネコラット、マ
ウスウサギモルモットウマおよびヒトが含まれる。

0053

適当な用量の決定は、例えば、治療に影響を及ぼすことが当技術分野において知られて
いる若しくはその疑いがある又は治療に影響を及ぼすと予想されるパラメーターまたは因
子を用いて、実施者により行われる。一般に、投与は、最適用量より幾分少ない量で開始
し、ついで、いずれかの負の副作用との比較において所望の又は最適な効果が達成される
まで、それを少しずつ増加させる。重要な診断尺度には、例えば炎症の症状の尺度、また
は産生された炎症性サイトカインのレベルが含まれる。好ましくは、使用される生物学的
物質は治療標的動物と同じ種に由来し、それにより該試薬に対する体液性応答最小限度
に抑えられる。第2の治療用物質、例えばサイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生
物質または放射線との共投与または治療のための方法は当技術分野においてよく知られて
いる(例えば、Hardmanら,(編)(2001)Goodman and Gil
man’s The Pharmacological Basis of Thera
peutics,10thed.,McGraw−Hill,New York,NY;
PooleおよびPeterson(編)(2001)Pharmacotherape
utics for Advanced Practice:A Practical
Approach,Lippincott,Williams & Wilkins,P
hila.,PA;ChabnerおよびLongo(編)(2001)Cancer
Chemotherapy and Biotherapy,Lippincott,W
illiams & Wilkins,Phila.,PAを参照されたい)。治療用物
質の有効量は、典型的には少なくとも10%、通常は少なくとも20%、好ましくは少な
くとも約30%、より好ましくは少なくとも約40%、最も好ましくは少なくとも50%
、症状、例えば腫瘍サイズの減少または腫瘍成長の抑制をもたらす。

0054

VI.用途
本発明は、増殖状態または障害、例えば、子宮子宮頸乳房前立腺精巣陰茎
胃腸管、例えば食道中咽頭小腸大腸結腸または直腸腎臓腎細胞膀胱
骨、骨髄、皮膚、頭部または頚部、皮膚、肝臓胆嚢心臓膵臓唾液腺副腎
甲状腺、脳(例えば、神経膠腫)、神経節中枢神経系(CNS)および末梢神経系(P
NS)ならびに免疫系(例えば、脾臓または胸腺)の癌の治療方法を提供する。本発明は
、例えば、免疫原性腫瘍、非免疫原性腫瘍、休眠腫瘍、ウイルス誘発性癌、例えば上皮
胞癌、内皮細胞癌、扁平上皮癌パピローマウイルス腺癌リンパ腫癌腫メラノー
マ、白血病骨髄腫肉腫奇形癌腫、化学誘発性癌、転移および血管新生の治療方法を
提供する。本発明はまた、例えば、調節性T細胞(Treg)および/またはCD8 T
細胞の活性をモジュレーションすることによる、腫瘍細胞または癌細胞抗原に対する寛容
の軽減を想定している(例えば、Ramirez−Montagutら,(2003)O
ncogene 22:3180−3187;Sawayaら,(2003)New E
ngl.J.Med.349:1501−1509;Farrarら,(1999)J.
Immunol.162:2842−2849;Leら,(2001)J.Immuno
l.167:6765−6772;CannistraおよびNiloff(1996)
New Engl.J.Med.334:1030−1038;Osborne(199
8)New Engl.J.Med.339:1609−1618;LynchおよびC
hapelle(2003)New Engl.J.Med.348:919−932;
EnzingerおよびMayer(2003)New Engl.J.Med.349
:2241−2252;Forastiereら,(2001)New Engl.J.
Med.345:1890−1900;Izbickiら,(1997)New Eng
l.J.Med.337:1188−1194;Hollandら(編)(1996)C
ancer Medicine Encyclopedia of Cancer,4t
hed.,Academic Press,San Diego,CAを参照されたい)

0055

幾つかの実施形態においては、本発明は、PEG−IL10および少なくとも1つの追
加的な治療用または診断用因子を使用する、増殖状態、癌、腫瘍または前癌状態、例えば
過形成の治療方法を提供する。該追加的治療用因子は例えば以下のものでありうる:サイ
トカインまたはサイトカインアンタゴニスト、例えばIL12、インターフェロン−アル
ファ、または抗上皮増殖因子受容体、ドキソルビシン(doxorubicin)、エピ
ルビシン(epirubicin)、葉酸代謝拮抗物質、例えばメトトレキセート(me
thotrexate)またはフルオロウラシル(fluoruracil)、イリノテ
カン(irinotecan)、シクロホスファミド(cyclophosphamid
e)、放射線療法ホルモンまたは抗ホルモン療法、例えばアンドロゲン、エストロゲン
抗エストロゲン、フルタミド(flutamide)またはジエチルスチルベストロー
ル(diethylstilbestrol)、手術、タモキシフェン(tamoxif
en)、イフォスファミド(ifosfamide)、ミトラクトール(mitolac
tol)、アルキル化剤、例えばメルファラン(melphalan)またはシスプラチ
ン(cis−platin)、エトポシド(etoposide)、ビノレルビン(vi
norelbine)、ビンブラスチン(vinblastine)、ビンデシン(vi
ndesine)、グルココルチコイドヒスタミン受容体アンタゴニスト、血管新生イ
ヒビター、放射線、放射線増感剤アントラサイクリン(anthracycline
)、ビンカアルカロイドタキサン、例えばパクリタキセル(paclitaxel)お
よびドセタキセル(docetaxel)、細胞周期インヒビター、例えばサイクリン
存性キナーゼインヒビター、別の腫瘍抗原に対するモノクローナル抗体モノクローナル
抗体と毒素との複合体、T細胞アジュバント骨髄移植、または抗原提示細胞、例えば樹
細胞療法ワクチンは、例えば可溶性タンパク質として、または該タンパク質をコード
する核酸として提供されうる(例えば、Leら,前掲;GrecoおよびZellefs
ky(編)(2000)Radiotherapy of Prostate Canc
er,Harwood Academic,Amsterdam;Shapiroおよび
Recht(2001)New Engl.J.Med.344:1997−2008;
Hortobagyi(1998)New Engl.J.Med.339:974−9
84;Catalona(1994)New Engl.J.Med.331:996−
1004;NaylorおよびHadden(2003)Int.Immunophar
macol.3:1205−1215;The Int.Adjuvant Lung
Cancer Trial Collaborative Group(2004)Ne
w Engl.J.Med.350:351−360;Slamonら(2001)Ne
w Engl.J.Med.344:783−792;Kudelkaら(1998)N
ew Engl.J.Med.338:991−992;van Nettenら(19
96)New Engl.J.Med.334:920−921を参照されたい)。

0056

癌の髄外造血EMH)の治療方法も提供する。EMHは記載されている(例えば、R
aoら(2003)Leuk.Lymphoma 44:715−718;Laneら(
2002)J.Cutan.Pathol.29:608−612を参照されたい)。

0057

本発明の広範な範囲は、以下の実施例を参照して最も良く理解されるが、それらの実施
例は本発明を特定の実施形態に限定することを意図したものではない。

0058

本明細書における全ての引用文献を、各個の刊行物または特許出願が参照により組み入
れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れ
ることとする。

0059

当業者に明らかなとおり、本発明の多数の修飾および変更が、その精神および範囲から
逸脱することなく施されうる。本明細書に記載されている特定の実施形態は単なる例示と
して記載されているに過ぎず、本発明は、添付の特許請求の範囲の条項およびそのような
特許請求の範囲に含まれる均等物の全範囲により限定されるべきであり、本発明は、本明
細書に例示として記載されている特定の実施形態により限定されるべきではない。

図面の簡単な説明

0060

図1はモノ−およびジ−PEG−IL10の製造の反応速度論を示す。
図2は、移植されたPDV6扁平上皮癌に対する種々のモノ−およびジPE G−IL10(マウス)プロトタイプの効力を示す。

0061

実施例
I.一般的方法
分子生物学における標準的な方法は記載されている(Maniatisら(1982)
Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Co
ld Spring Harbor Laboratory Press,Cold S
pring Harbor,NY;SambrookおよびRussell(2001)
Molecular Cloning,3rded.,Cold Spring Har
bor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,
NY;Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Acade
mic Press,San Diego,CA)。標準的な方法はAusubelら(
2001)Current Protocols in Molecular Biol
ogy,VoIs.1−4,John Wiley and Sons,Inc.New
York,NYにも記載されており、これは細菌細胞におけるクローニングおよびDN
突然変異誘発(Vol.1)、哺乳類細胞および酵母におけるクローニング(Vol.
2)、複合糖質およびタンパク質発現(Vol.3)、ならびにバイオインフォマティク
ス(Vol.4)を記載している。

0062

免疫沈降クロマトグラフィー電気泳動遠心分離および結晶化を含むタンパク質精
製のための方法が記載されている(Coliganら(2000)Current Pr
otocols in Protein Science,Vol.1,John Wi
ley aad Sons,Inc.,New York)。化学分析化学修飾翻訳
後修飾、融合タンパク質の製造、タンパク質のグリコシル化が記載されている(例えば、
Coliganら(2000)Current Protocols in Prote
in Science,Vol.2,John Wiley and Sons,Inc
.,New York;Ausubelら(2001)Current Protoco
ls in Molecular Biology,Vol.3,John Wiley
and Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5−16.22.17;
Sigma−Aldrich,Co.(2001)Products for Life
Science Research,St.Louis,MO;pp.45−89;A
mersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirect
ory,Piscataway,N.J.,pp.384−391を参照されたい)。ポ
クローナルおよびモノクローナル抗体の製造、精製および断片化が記載されている(C
oliganら(2001)Current Protcols in Immunol
ogy,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New Y
ork;HarlowおよびLane(1999)Using Antibodies,
Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold
Spring Harbor,NY;HarlowおよびLane,前掲)。リガンド
受容体相互作用を特徴づけるための標準的な技術が利用可能である(例えば、Coli
ganら(2001)Current Protcols in Immunology
,Vol.4,John Wiley,Inc.,New Yorkを参照されたい)。
PEG−IL10の製造方法は、例えば米国特許第7,052,686号に記載されてい
る。

0063

蛍光標示細胞分取検出系(FACS)を含むフローサイトメトリーのための方法が利
用可能である(例えば、Owensら(1994)Flow Cytometry Pr
inciples for Clinical Laboratory Practic
e,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ;Givan(2
001)Flow Cytometry,2nded.;Wiley−Liss,Hob
oken,NJ:Shapiro(2003)Practical Flow Cyto
metry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJを参照さ
れたい)。核酸プライマーおよびプローブを含む核酸、ポリペプチドならびに抗体を修飾
するのに適した、例えば診断試薬として使用される蛍光試薬が入手可能である(Mole
cular Probes(2003)Catalogue,Molecular Pr
obes,Inc.,Eugene,OR;Sigma−Aldrich(2003)C
atalogue,St.Louis,MO)。

0064

免疫系の組織学の標準的方法が記載されている(例えば、Muller−Harmel
ink(編)(1986)Human Thymus:Histopathology
and Pathology,Springer Verlag,New York,N
Y;Hiattら(2000)Color Atlas of Histology,L
ippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA;
Louisら(2002)Basic Histology:Text and Atl
as,McGraw−Hill,New York,NYを参照されたい)。

0065

癌の治療および診断のための方法が記載されている(例えば、Alison(編)(2
001)The Cancer Handbook,Grove’s Dictiona
ries,Inc.,St.Louis,MO;Oldham(編)(1998)Pri
nciples of Cancer Biotherapy,3rd.ed.,Klu
wer Academic Publ,Hingham,MA;Thompsonら(編
)(2001)Textbook of Melanoma,Martin Dunit
z,Ltd.,London,UK;Devitaら(編)(2001)Cancer:
Principles and Practice of Oncology,6the
d.,Lippincott,Phila,PA;Hollandら(編)(2000)
Holland−Frei Cancer Medicine,BC Decker,P
hila.,PA;GarrettおよびSell(編)(1995)Cellular
Cancer Markers,Humana Press,Totowa,NJ;M
acKie(1996)Skin Cancer,2nded.,Mosby,St.L
ouis;Moertel(1994)New Engl.J.Med.330:113
6−1142;Engleman(2003)Semin.Oncol.30(3 Su
ppl.8):23−29;Mohrら(2003)Onkologie 26:227
−233を参照されたい)。

0066

例えば抗原断片、リーダー配列、タンパク質フォールディング機能性ドメイングリ
コシル化部位および配列アライメントを決定するためのソフトウェアパッケージおよびデ
タベースが入手可能である(例えば、GenBank,VectorNTI(登録商
標)Suite(Informax,Inc,Bethesda,MD);GCG Wi
sconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,
CA);DeCypher(登録商標)(TimeLogic Corp.,Cryst
al Bay,Nevada);Menneら(2000)Bioinformatic
s 16:741−742;Menneら(2000)Bioinformatics
Applications Note 16:741−742;Wrenら(2002)
Comput.MethodsPrograms Biomed.68:177−18
1;von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133:17−2
1;von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4
683−4690を参照されたい)。

0067

II.PEG化IL10
IL10(例えば、げっ歯類または霊長類)を50mMリン酸ナトリウム、100m
塩化ナトリウムpH範囲5〜7.4)に対して透析した。1:1〜1:7モル比
5K PEG−プロピルアルデヒドを、0.75〜30mMナトリウムシアノボロヒド
リドの存在下、1〜12mg/mlのIL10と反応させた。あるいは同様にして、該反
応をピコリンボランで活性化することが可能である。該反応を5〜30℃で3〜24時間
インキュベートした。

0068

特に、PEG化反応のpHを6.3に調節し、7.5mg/mlのhIL10をPEG
と反応させて、IL10対PEGリンカーの比を1:3.5とした。シアノボロヒドリド
最終濃度は25mMであり、該反応を15℃で12〜15時間行った。図1はモノ−お
よびジ−PEG−IL10の反応速度論を示す。該モノ−およびジ−PEG IL10は
該反応の最大産物であり、終了時にそれぞれの濃度は50%である。

0069

該反応を、アミノ酸、例えばグリシンおよびリシン、またはTrisバッファーを使用
してクエンチした。所望のPEG化プロトタイプを単離するためには、例えばゲル濾過
アニオンおよびカチオン交換クロマトグラフィーならびにサイズ排除のような複数の精製
方法が用いられている。

0070

あるいは、IL10を10mMリン酸ナトリウム(pH7.0)、100mM Na
Clに対して透析する。該透析バッファーを使用して、該透析IL10を約0.5〜12
mg/mlの濃度へと3.2倍希釈した。リンカーであるSC−PEG−12K(Del
mar Scientific Laboratories,Maywood,IL)の
添加の前に、1容量の100mM Na−テトラボラート(pH9.1)を9容量の該希
釈IL10に加えて、該IL10溶液のpHを8.6に上昇させる。該SC−PEG−1
2Kリンカーを該透析バッファーに溶解し、適当な容量の該リンカー溶液(IL10の1
mol当たりリンカー1.8〜3.6mol)を該希釈IL10溶液中に加えて該PEG
化反応を開始させる。該反応の速度を制御するために、該反応を5℃で行う。該PEG化
反応中、該反応溶液を穏やかに攪拌する。サイズ排除HPLC(SE−HPLC)による
測定で該モノPEG−IL10の収率が40%近くになれば、1Mグリシン溶液を30
mMの最終濃度まで加えることにより該反応を停止させた。HCl溶液を使用して該反応
溶液のpHをゆっくりと7.0に調節し、該反応を0.2ミクロンフィルター濾過し、
−80℃で保存する。

0071

III.効力比
PEG−IL10の種々のプロトタイプを比較するために、治療群当たり10匹のマウ
スにマトリゲル内の106 PDV6扁平上皮癌を100μLの体積内の右脇腹に皮下移
植した。平均腫瘍サイズが100mm3に達したら(移植から約2〜3週間)、以下のマ
ウスPEG−IL10プロトタイプまたは対照での処理を1日1回開始した(特に示され
ていない限り、リンカーはPPAであった)。

0072

対照HEPESバッファ
0.2mpk 2×5K ジPEG−IL10
0.02mpk 2×5K ジPEG−IL10
0.2mpk 1×5KモノPEG−IL10
0.02mpk 1×5K モノPEG−IL10
0.2mpk 1×5K モノPEG−IL10+2×5K ジPEG−IL1

0.02mpk 1×5K モノPEG−IL10+2×5K ジPEG−IL1

0.2mpk 1×12K モノPEG−IL10(SCリンカー)
0.02mpk 1×12K モノPEG−IL10(SCリンカー)
測定したエンドポイントには、腫瘍サイズ(週2回測定)、体重(週1回測定)および血
清濃度(処理の開始時、中間点および終了時)が含まれた。図2は前記の種々のプロト
イプの効力を示す。

0073

本明細書における全ての引用文献を、各個の刊行物または特許出願が参照により組み入
れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れ
ることとする。

0074

当業者に明らかなとおり、本発明の多数の修飾および変更が、その精神および範囲から
逸脱することなく施されうる。本明細書に記載されている特定の実施形態は単なる例示と
して記載されているに過ぎず、本発明は、添付の特許請求の範囲の条項およびそのような
特許請求の範囲に含まれる均等物の全範囲により限定されるべきであり、本発明は、本明
細書に例示として記載されている特定の実施形態により限定されるべきではない。

0075

本発明は以下のものを含む。
[項1]
a)0.75mM〜35mMの還元剤の存在下、約5.0〜7.4のpHおよび5℃〜
30℃の温度で12〜15時間にわたり、1mg/ml〜12mg/mlのIL10タン
パク質を活性化PEG−リンカーと反応させ、この場合、IL10対PEG−リンカーの
比が1:1〜1:7.7となるようにし、
b)モノ−およびジ−PEG化IL10の混合物を精製することを含む、少なくとも1
つのPEG分子がIL10の少なくとも1つのサブユニットの少なくとも1つのアミノ酸
残基に共有結合しているモノ−およびジ−PEG化IL10の混合物の製造方法。
[項2]
該PEG−リンカーが、スクシンイミジルカルボナート−PEG、PEG−ブチルアル
デヒド、PEG−ペンタアルデヒド、PEG−アミド−プロピオンアルデヒド、PEG−
ウレタノ−プロピオアルデヒドおよびPEG−プロピルアルデヒドよりなる群から選択さ
れる、項1記載の製造方法。
[項3]
該PEG−リンカーがPEG−プロピルアルデヒドである、項2記載の製造方法。
[項4]
該PEG−リンカーを構成するPEGの分子量が5,000ダルトン〜20,000ダ
ルトンである、項1記載の製造方法。
[項5]
該PEG−リンカーを構成するPEGの分子量が5,000ダルトンである、項4
記載の製造方法。
[項6]
該還元剤が、ボロヒドリド、ナトリウムシアノボロヒドリド、アミンボランおよびピコ
リンボランよりなる群から選択される、項1記載の製造方法。
[項7]
該還元剤が、ナトリウムシアノボロヒドリドおよびピコリンボランよりなる群から選択
される、項6記載の製造方法。
[項8]
カチオン交換、アニオン交換、サイズ排除および疎水性相互作用よりなる群から選択さ
れるクロマトグラフィーによりモノ−およびジ−PEGの混合物を精製する、項1記
載の製造方法。
[項9]
サイズ排除クロマトグラフィーによりモノ−およびジ−PEG−IL10の混合物を精
製する、項9記載の製造方法。
[項10]
項1記載の製造方法により製造されたモノ−およびジ−PEG−IL10と医薬上
許容される担体とを含む医薬組成物。
[項11]
a)25mMの還元剤の存在下、約6.3のpHおよび15℃の温度で15時間にわた
り、7.5mg/mlのIL10を活性化PEG−リンカーと反応させ、この場合、IL
10対PEG−リンカーの比が1:3.5となるようにし、
b)モノ−およびジ−PEG化IL10の混合物を精製することを含む、少なくとも1
つのPEG分子がIL10の少なくとも1つのサブユニットの少なくとも1つのアミノ酸
残基に共有結合しているモノ−およびジ−PEG化IL10の混合物の製造方法。
[項12]
該PEG−リンカーが、スクシンイミジルカルボナート−PEG、PEG−ブチルアル
デヒド、PEG−ペンタアルデヒド、PEG−アミド−プロピオンアルデヒド、PEG−
ウレタノ−プロピオアルデヒドおよびPEG−プロピルアルデヒドよりなる群から選択さ
れる、項11記載の製造方法。
[項13]
該PEG−リンカーがPEG−プロピルアルデヒドである、項12記載の製造方法

[項14]
該PEG−リンカーを構成するPEGの分子量が5,000ダルトン〜20,000ダ
ルトンである、項11記載の製造方法。
[項15]
該PEG−リンカーを構成するPEGの分子量が5,000ダルトンである、項1
4記載の製造方法。
[項16]
該還元剤が、ボロヒドリド、ナトリウムシアノボロヒドリド、アミンボランおよびピコ
リンボランよりなる群から選択される、項11記載の製造方法。
[項17]
該還元剤が、ナトリウムシアノボロヒドリドおよびピコリンボランよりなる群から選択
される、項16記載の製造方法。
[項18]
カチオン交換、アニオン交換、サイズ排除および疎水性相互作用よりなる群から選択さ
れるクロマトグラフィーによりモノ−およびジ−PEGの混合物を精製する、項11
記載の製造方法。
[項19]
サイズ排除クロマトグラフィーによりモノ−およびジ−PEGの混合物を精製する、請
求項18記載の製造方法。
[項20]
項10記載の製造方法により製造されたモノ−およびジ−PEG−IL10と医薬
上許容される担体とを含む医薬組成物。

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