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技術 RGM Aタンパク質に対するモノクローナル抗体及びその使用

出願人 アッヴィ・ドイチュラント・ゲー・エム・ベー・ハー・ウント・コー・カー・ゲーアッヴィ・インコーポレイテッド
発明者 ベルンハルト・カー・ミューラーマルティン・シュミットイブ・エイチ・バーロウメアリー・アール・レディーチョンミン・シェフィリップ・ディー・バードウェル
出願日 2019年10月3日 (1年3ヶ月経過) 出願番号 2019-182721
公開日 2020年2月6日 (10ヶ月経過) 公開番号 2020-018316
状態 未査定
技術分野 微生物による化合物の製造 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性 ペプチド又は蛋白質 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 突然変異または遺伝子工学 医薬品製剤 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 微生物、その培養処理
主要キーワード P面積 溶出不純物 無孔性材料 揮発剤 中央領 インクボール 単一像 平均測定
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (20)

課題

GMタンパク質に結合し、それを中和する単離タンパク質、特にモノクローナル抗体を提供する。

解決手段

RGMAの受容体及び/又は共受容体へのRGM Aの結合を阻害する能力を有する抗体。以下に限定されないが、多発性硬化症哺乳動物脳外傷脊髄損傷、卒中、神経変性疾患及び統合失調症を含む疾患に罹患しているヒトにおいて、RGM Aを検出するために及びRGM A活性を阻害するために有用である抗体又はその一部。

概要

背景

背景情報
哺乳動物中枢神経系(CNS)内での、損傷後又炎症性攻撃後又は神経変性疾患後の軸索再生は、殆どの場合不可能であり、その転帰は、CNSにおける神経繊維固有再成長能と、病変又は損傷部位微小環境局在するCNS内の阻害性因子との間のバランスに依存し、この阻害性因子は、再成長、従って損傷を受けた繊維路再生を積極的に妨害する。

インビトロならびインビボ成長円錐虚脱及び神経突起成長阻害を引き起こし、それにより結果的に軸索再成長を直接阻害することから、乏突起膠細胞及び病変瘢痕により生成されるCNSミエリンは、損傷初期における軸索成長に対する最も重要な非許容構造であることが立証されている。CNSミエリン及び瘢痕組織における主要な阻害性因子であるRGMタンパク質が同定されている(Monnierら、Nature 419:392−395、2002;Schwabら、Arch.Neurol.62:1561−8、2005a;Schwabら、Eur.J.Neurosci.21:1569−76、2005b;Hataら、J.Cell.Biol.173:47−58、2006;概説としては:Muellerら、Philos.Trans.R.Soc.Lond.Biol.Sci.361:1513−29、2006;Yamashitaら、Curr.Opin.Neurobiol.17:29−34、2007を参照。)。RGMタンパク質は、脳外傷又は虚血性傷害死亡したヒトの損傷又は病変部位上方制御され(Schwabら、Arch.Neurol.62:1561−8、2005a)、脊髄損傷のあるラットの病変部位で上方制御される(Schwabら、Eur.J.Neurosci.21:1569−76、2005b;Hataら、J.Cell.Biol.173:47−58、2006、概説については:Muellerら、Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.361:1513−29、2006;Yamashitaら、Curr.Opin.Neurobiol.17:29−34、2007を参照。)。さらに、多発性硬化症患者及び健常者からの臨床試料を用いた最初のデータから、MSに罹患している患者脳脊髄液中でヒトRGMAが上方制御されることが示唆される(データは示さず。)。

RGMA特異的ポリクローナル抗体の再生促進能を評価するために、第9/10胸椎ベル脊髄のおよそ60%が離断された脊髄損傷の中度から重度モデルにこの抗体を投与した。組織学的検査から、このような損傷により、皮質脊髄路の全ての背外側繊維が切断されたことが明らかになった。2週間にわたりポンプを介して局所的に投与されたRGM A−特異的ポリクローナル抗体により、損傷を受けた神経繊維の長距離の再生が誘導された(Hataら、J.Cell.Biol.173:47−58、2006)。

幾百もの神経繊維が病変部位を越えて伸長し、最長繊維は、病変部を10mm超越えて再生したが、一方、対照抗体処理動物では病変部より遠位再生繊維は見られなかった。対照抗体処理した脊髄損傷ラットと比較して、抗RGMA処置ラットの機能回復が顕著に向上し、それにより、RGM Aが強力な神経再生阻害物質であり、軸索損傷又は神経繊維損傷を特徴とする指標において回復刺激するための有益な標的であることが証明される(Hataら、J.Cell.Biol.173:47−58、2006;Kyotoら、Brain Res.1186:74−86、2007)。さらに、機能を阻止するポリクローナル抗体でRGM Aタンパク質中和することによって、脊髄損傷ラットでの損傷神経繊維の再成長が刺激されるだけでなく、それらのシナプス形成が促進され、それにより、損傷を受けた神経回路再形成又は回復が可能になる(Kyotoら、Brain Res.1186:74−86、2007)。

rgm遺伝子ファミリーは、3つの異なる遺伝子を包含し、これらのうち2つ、即ちrgm a及びbは、RGMA及びRGM Bタンパク質が由来する哺乳動物CNSで発現され、一方、第三のメンバーであるrgm cは、末梢で発現され(Muellerら、Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.361:1513−29、2006)、ここで、RGM Cは鉄代謝において重要な役割を果たす。RGM Aは、インビトロで、RGM受容体として同定されているネオゲニンに結合することにより神経突起伸長を阻害する(Rajagopalanら、Nat Cell Biol.:6(8)、756−62、2004)。ネオゲニンは、最初にネトリン結合タンパク質として記載された(Keino−Masuら、Cell、87(2):175−85、1996)。ネオゲニン又はその近縁の受容体DCC(結腸直腸癌欠損)に対するネトリン−1の結合により、神経突起成長を阻害するのではなく、刺激することが報告されているので、これは重要な知見である(Braistedら、J.Neurosci.20:5792−801、2000)。従って、RGM Aを阻止することによって、ネオゲニンがその神経突起成長刺激性リガンド、ネトリンに結合できるようにすることにより、RGM介在性成長阻害解除される。これらの観察に基づき、RGM Aの中和は、ヒト脊髄損傷モデルでのネオゲニンの中和よりも優れていると評価され得る。ネオゲニンへのRGM Aの結合及び神経突起成長阻害の誘導の他に、骨形成タンパク質BMP−2及びBMP−4へのRGM A又はBの結合は、神経再生及び機能回復の成功に対して同様の障害となり得る(Muellerら、Philos.Trans.R.Soc.Lond.Biol.Sci.361:1513−29、2006)。

概要

RGMAタンパク質に結合し、それを中和する単離タンパク質、特にモノクローナル抗体を提供する。RGM Aの受容体及び/又は共受容体へのRGM Aの結合を阻害する能力を有する抗体。以下に限定されないが、多発性硬化症、哺乳動物の脳外傷、脊髄損傷、卒中、神経変性疾患及び統合失調症を含む疾患に罹患しているヒトにおいて、RGM Aを検出するために及びRGM A活性を阻害するために有用である抗体又はその一部。なし

目的

本願は、(a)RGMAの受容体ネオゲニンへ及び骨形成タンパク質2及び4(BMP−2、BMP−4)へのRGM Aの結合を選択的に阻害する、RGM Aに対する中和モノクローナル抗体の生成及び(b)骨形成タンパク質2及び4(BMP−2、BMP−4)へのRGM Aの結合を選択的に阻害する、RGM Aに対する中和モノクローナル抗体の生成を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

1x10−7M以下のKD及び1x10−2s−1以下のkoff速度定数(両者とも表面プラズモン共鳴により測定)でヒトRGMAから解離する、結合タンパク質

請求項2

ヒトRGMAに結合し、標準インビトロアッセイで測定される場合に、ヒトRGMAの神経突起伸長阻害活性中和する、結合タンパク質。

請求項3

次のさらなる機能特性ラットRGMAに対する結合、ヒトRGMCに対する結合ラットRGMCに対する結合の少なくとも1つを有する、請求項1及び請求項2の一項の結合タンパク質。

請求項4

RGMの受容体の少なくとも1つに対するRGMの結合能を調節する、請求項1から請求項3の一項の結合タンパク質。

請求項5

ヒトRGMAの受容体結合ドメイン相互作用する、請求項4の結合タンパク質。

請求項6

次の相互作用:ヒトBMP−4に対するヒトRGMAの結合ヒトネオゲニンに対するhRGMAの結合ヒトネオゲニンに対するhRGMCの結合ヒトBMP−2に対するヒトRGMAの結合の少なくとも1つを調節する、請求項4の結合タンパク質。

請求項7

ヒト化抗体である、請求項1から請求項6の一項に記載の結合タンパク質。

請求項8

抗原結合ドメインを含む、請求項1から請求項7の一項に記載の結合タンパク質(該結合タンパク質は、RGM分子エピトープに結合することができ、該抗原結合ドメインは、GTTPDY(配列番号59)、FQATHDPLT(配列番号62)、ARRNEYYGSSFFDY(配列番号65)、LQGYIPPRT(配列番号68)及び該配列の1つと少なくとも50%の配列同一性を有する修飾CDRアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含む。)。

請求項9

抗原結合ドメインを含む結合タンパク質(該結合タンパク質は、RGM分子のエピトープに結合することができ、該抗原結合ドメインは、GTTPDY(配列番号59)、FQATHDPLT(配列番号62)、ARRNEYYGSSFFDY(配列番号65)、LQGYIPPRT(配列番号68)及び該配列の1つと少なくとも50%の配列同一性を有する修飾CDRアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含む。)。

請求項10

配列番号57、58、60、61、63、64、66、67及び該配列の1つと少なくとも50%の配列同一性を有する修飾CDRアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRをさらに含む、請求項1から請求項9の一項に記載の結合タンパク質。

請求項11

前記少なくとも1つのCDRが、からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1から請求項10の何れか一項に記載の結合タンパク質。

請求項12

からなる可変ドメインCDRセット又は該3つのCDRの少なくとも1つが、親配列と少なくとも50%の配列同一性を有する修飾CDRアミノ酸配列である可変ドメインセットから選択される少なくとも3つのCDRを含む、請求項11に記載の結合タンパク質。

請求項13

少なくとも2つの可変ドメインCDRセットを含む、請求項12に記載の結合タンパク質。

請求項14

前記少なくとも2つの可変ドメインCDRセットが、VH5F9セット及びVL5F9セット及びVH8D1セット及びVL8D1セットからなる群から選択される、請求項13に記載の結合タンパク質。

請求項15

ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む、請求項1から請求項14の一項に記載の結合タンパク質。

請求項16

前記ヒトアクセプターフレームワークが、配列番号15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32及び33からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含む、請求項15に記載の結合タンパク質。

請求項17

VH3−48セット(配列番号15、16及び17)VH3−33セット(配列番号21、22及び23)VH3−23セット(配列番号24、25及び26)(これらのセットのそれぞれは、JH3(配列番号18)、JH4(配列番号19)、JH6(配列番号20)から選択されるさらなるフレームワーク配列と組み合わせられる。)のセットからなる群から選択されるか;又はA18セット:(配列番号27、28及び29)A17セット:(配列番号31、32及び33)(これらのセットのそれぞれは、JK2(配列番号2)から選択されるさらなるフレームワーク配列と組み合わせられる。)のセットからなる群から選択される、フレームワーク配列のセットを含む、請求項16に記載の結合タンパク質。

請求項18

配列番号35、36、37、38、39、40、41、42及び43から選択される少なくとも1つの重鎖可変ドメイン;及び/又は配列番号44、45及び46から選択される少なくとも1つの軽鎖可変ドメインを含む、請求項1から請求項17の何れか一項に記載の結合タンパク質。

請求項19

2つの可変ドメインを含み、該2つの可変ドメインが、配列番号35及び44;36及び44;37及び44;38及び44;39及び44;40及び44;41及び44;42及び44;43及び44;配列番号35及び45;36及び45;37及び45;38及び45;39及び45;40及び45;41及び45;42及び45;43及び45;配列番号35及び46;36及び46;37及び46;38及び46;39及び46;40及び46;41及び46;42及び46;43及び46から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項18の結合タンパク質。

請求項20

前記ヒトアクセプターフレームワークが、キーとなる残基において少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、該キーとなる残基が、CDRに隣接する残基;グリコシル化部位残基;希少残基;RGMエピトープと相互作用可能な残基;CDRと相互作用可能な残基;カノニカル(canonical)残基;重鎖可変領域軽鎖可変領域との間の接触残基;バーニアゾーン内の残基;パラグルタミン酸(paraglutamate)形成が可能なN末端残基;及びChothiaにより定義された可変重鎖CDR1とKabatにより定義された第一の重鎖フレームワークとの間で重複する領域中の残基からなる群から選択される、請求項15から請求項19の何れか一項に記載の結合タンパク質。

請求項21

前記キーとなる残基が、(重鎖配列位置):1、5、37、48、49、88、98(軽鎖配列位置):2、4、41、51からなる群から選択される、請求項20に記載の結合タンパク質。

請求項22

結合タンパク質がコンセンサスヒト可変ドメインである、請求項1から請求項21の何れか一項の結合タンパク質。

請求項23

前記ヒトアクセプターフレームワークが、少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、フレームワークのアミノ酸配列が、該ヒトアクセプターフレームワークの配列と少なくとも65%同一であり、ならびに該ヒトアクセプターフレームワークと同一である少なくとも70アミノ酸残基を含む、請求項15から請求項22の何れか一項の結合タンパク質。

請求項24

配列番号47、48、49、50;配列番号51、52、53及び54からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つの(フレームワークが突然変異した)可変ドメインを含む、請求項1から請求項23の何れか一項の結合タンパク質。

請求項25

2つの可変ドメインを含み、該2つの可変ドメインが、配列番号47及び44;47及び45;47及び46;47及び51;47及び52;47及び53;47及び54;配列番号48及び44;48及び45;48及び46;48及び51;48及び52;48及び53;48及び54;配列番号49及び44;49及び45;49及び46;49及び51;49及び52;49及び53;49及び54;配列番号50及び44;50及び45;50及び46;50及び51;50及び52;50及び53;50及び54からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項24の結合タンパク質。

請求項26

RGM分子から選択される標的に結合することができる、請求項1から請求項25の何れか一項の結合タンパク質。

請求項27

ヒトRGMAに結合することができる、請求項1から請求項26の何れか一項の結合タンパク質。

請求項28

次のさらなる機能特性:ラットRGMAに対する結合、ヒトRGMCに対する結合、ラットRGMCに対する結合の少なくとも1つを有する、請求項27の結合タンパク質。

請求項29

RGM分子から選択される標的の生物学的機能を調節することができる、請求項1から請求項28の何れか一項の結合タンパク質。

請求項30

RGMの受容体の少なくとも1つへのRGMの結合能を調節する、請求項29の結合タンパク質。

請求項31

次の相互作用:ヒトBMP−4に対するヒトRGMAの結合、ヒトネオゲニンに対するhRGMAの結合、ヒトネオゲニンに対するhRGMCの結合、ヒトBMP−2に対するヒトRGMAの結合の少なくとも1つを調節する、請求項30の結合タンパク質。

請求項32

RGM生物活性阻害することができる、請求項1から請求項31の何れか一項の結合タンパク質。

請求項33

RGM分子がRGMAである、請求項32の結合タンパク質。

請求項34

RGMAが、ヒト、カニクイザル、ラット、ヒヨコカエル及びから選択される、請求項33の結合タンパク質。

請求項35

少なくとも約102M−1s−1;少なくとも約103M−1s−1;少なくとも約104M−1s−1;少なくとも約105M−1s−1;少なくとも約106M−1s−1及び少なくとも約107M−1s−1(表面プラズモン共鳴により測定される場合)からなる群から選択される前記標的に対する会合速度定数(kon)を有する、請求項1から請求項34の何れか一項の結合タンパク質。

請求項36

最大約10−2s−1;最大約10−3s−1;最大約10−4s−1;最大約10−5s−1;及び最大約10−6s−1(表面プラズモン共鳴により測定される場合)からなる群から選択される前記標的に対する解離速度定数(koff)を有する、請求項1から請求項35の何れか一項の結合タンパク質。

請求項37

最大約10−7M;最大約10−8M;最大約10−9M;最大約10−10M;最大約10−11M;最大約10−12M;及び最大10−13Mからなる群から選択される前記標的に対する解離定数(KD)を有する、請求項1から請求項36の何れか一項の結合タンパク質。

請求項38

リンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む、請求項1から請求項37の何れか一項に記載の結合タンパク質を含む抗体コンストラクト

請求項39

前記結合タンパク質が、免疫グロブリン分子モノクローナル抗体キメラ抗体、CDRグラフト抗体、ヒト化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体ダイアボディ、多特異性抗体、二重特異性抗体、二重可ドメイン免疫グロブリン及び二特異性抗体からなる群から選択される、請求項38に記載の抗体コンストラクト。

請求項40

前記結合タンパク質が、ヒトIgM定常ドメイン、ヒトIgG1定常ドメイン、ヒトIgG2定常ドメイン、ヒトIgG3定常ドメイン、ヒトIgG4定常ドメイン、ヒトIgE定常ドメイン、ヒトIgD定常ドメイン、ヒトIgA1定常ドメインヒトIgA2定常ドメイン、ヒトIgY定常ドメイン及び対応する突然変異したドメインからなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項38及び請求項39の何れか一項に記載の抗体コンストラクト。

請求項41

配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン定常ドメインを含む、請求項38から請求項40の何れか一項に記載の抗体コンストラクト。

請求項42

免疫接着分子、造影剤治療薬及び細胞毒性剤からなる群から選択される作用物質をさらに含む、請求項38から請求項41の何れか一項に記載の抗体コンストラクトを含む抗体複合体

請求項43

前記作用物質が、放射性標識酵素蛍光標識発光標識生体発光標識、磁気標識及びビオチンからなる群から選択される造影剤である、請求項42に記載の抗体複合体。

請求項44

前記造影剤が、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho及び153Smからなる群から選択される放射性標識である、請求項43に記載の抗体複合体。

請求項45

前記作用物質が、代謝拮抗剤アルキル化剤抗生物質成長因子サイトカイン血管新生阻害剤抗有糸分裂剤アントラサイクリン毒素及びアポトーシス剤からなる群から選択される治療薬又は細胞毒性剤である、請求項43に記載の抗体複合体。

請求項46

前記結合タンパク質がヒトグリコシル化パターンを保持する、請求項38から請求項41の何れか一項に記載の抗体コンストラクト。

請求項47

前記結合タンパク質がヒトグリコシル化パターンを保持する、請求項42から請求項45の何れか一項に記載の抗体複合体。

請求項48

結晶として存在する、請求項1から請求項37の何れか一項に記載の結合タンパク質。

請求項49

結晶として存在する、請求項38から請求項41の何れか一項に記載の抗体コンストラクト。

請求項50

前記抗体コンストラクトが結晶として存在する、請求項42から請求項45の何れか一項に記載の抗体複合体。

請求項51

前記結晶が無担体医薬制御放出結晶である、請求項48に記載の結合タンパク質。

請求項52

前記結晶が無担体医薬制御放出結晶である、請求項49に記載の抗体コンストラクト。

請求項53

前記結晶が無担体医薬制御放出結晶である、請求項50に記載の抗体複合体。

請求項54

可溶性形態対応物よりも、インビボでより長い半減期を有する、請求項48に記載の結合タンパク質。

請求項55

可溶性形態の対応物よりも、インビボでより長い半減期を有する、請求項49に記載の抗体コンストラクト。

請求項56

可溶性形態の対応物よりも、インビボでより長い半減期を有する、請求項50に記載の抗体複合体。

請求項57

生物活性を保持する、請求項48に記載の結合タンパク質。

請求項58

生物活性を保持する、請求項49に記載の抗体コンストラクト。

請求項59

生物活性を保持する、請求項50に記載の抗体複合体。

請求項60

請求項1から請求項37の何れか一項の結合タンパク質アミノ酸配列をコードする単離核酸

請求項61

請求項38から請求項41の何れか一項の抗体コンストラクトアミノ酸配列をコードする単離核酸。

請求項62

請求項42から請求項45の何れか一項の抗体複合体アミノ酸配列をコードする単離核酸。

請求項63

請求項60から請求項62の何れか一項に記載の単離核酸を含むベクター

請求項64

cDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pHybE及びpBJからなる群から選択される、請求項63に記載のベクター。

請求項65

請求項63及び請求項64の何れか一項に記載のベクターを含む宿主細胞

請求項66

原核細胞である、請求項65に記載の宿主細胞。

請求項67

E.コリである、請求項66に記載の宿主細胞。

請求項68

真核細胞である、請求項67に記載の宿主細胞。

請求項69

前記真核細胞が、原生生物細胞動物細胞植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される、請求項68に記載の宿主細胞。

請求項70

前記真核細胞が、哺乳動物細胞鳥類細胞及び昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である、請求項69に記載の宿主細胞。

請求項71

HEK細胞CHO細胞、COS細胞及び酵母細胞から選択される、請求項69に記載の宿主細胞。

請求項72

前記酵母細胞が、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomycescerevisiae)である、請求項71に記載の宿主細胞。

請求項73

昆虫Sf9細胞である、請求項70に記載の宿主細胞。

請求項74

RGMに結合することができる結合タンパク質を産生させるのに十分な条件下で培地中で請求項65から請求項73の何れか一項の宿主細胞を培養することを含む、RGMに結合することができるタンパク質を産生させる方法。

請求項75

請求項74に記載の方法に従い産生される、タンパク質。

請求項76

(a)処方物(該処方物は、請求項48から請求項50の何れか一項に記載の結晶化生成物タンパク質を含む。)及び成分と、(b)少なくとも1つのポリマー性担体と、を含む、結合タンパク質の放出のための組成物

請求項77

前記ポリマー性担体が、ポリアクリル酸)、ポリ(シアノアクリルレート)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸−グリコール酸コポリマー又はPLGA、ポリ(b−ヒドロキシブチレート)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン);ポリ(エチレングリコール)、ポリ((ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリ[(オルガノホスファゼン]、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオールアルブミンアルギネートセルロース及びセルロース誘導体コラーゲンフィブリンゼラチンヒアルロン酸オリゴ糖グリカミノグリカン、硫酸化多糖類、その混合物及びコポリマーからなる群の1以上から選択されるポリマーである、請求項76に記載の組成物。

請求項78

前記成分が、アルブミン、スクローストレハロースラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンメトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項76に記載の組成物。

請求項79

請求項77及び請求項78の何れか一項に記載の組成物の有効量を哺乳動物投与する段階を含む、哺乳動物を治療するための方法。

請求項80

請求項1から請求項59の何れか一項の生成物と、医薬的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物

請求項81

前記医薬的に許容可能な担体が、前記結合タンパク質の吸収又は分散を向上させるために有用なアジュバントとして機能する、請求項80の医薬組成物。

請求項82

前記アジュバントがヒアルロニダーゼである、請求項81の医薬組成物。

請求項83

RGM活性が有害である疾患を治療するための少なくとも1つのさらなる治療薬剤をさらに含む、請求項82の医薬組成物。

請求項84

前記さらなる薬剤が、治療薬、造影剤、細胞毒性剤、血管新生阻害剤;キナーゼ阻害剤副刺激分子ブロッカー接着分子ブロッカー;抗サイトカイン抗体又はその機能断片メトトレキセートシクロスポリンラパマイシン;FK506;検出可能標識又はレポーターTNFアンタゴニスト抗リウマチ剤筋弛緩剤麻酔剤非ステロイド抗炎症薬(NSAID)、鎮痛剤麻酔薬鎮静剤局所麻酔薬神経筋ブロッカー、抗菌剤乾癬治療薬、コルチコステロイドアナボリックステロイドエリスロポエチン免疫付与、免疫グロブリン、免疫抑制剤成長ホルモンホルモン補充剤放射性医薬品抗うつ剤抗精神病薬興奮剤喘息治療薬、βアゴニスト吸入ステロイドエピネフリン又は類似物質、サイトカイン及びサイトカインアンタゴニストからなる群から選択される、請求項83の医薬組成物。

請求項85

ヒトRGMA活性が低下するように、請求項1から請求項59の何れか一項の生成物とヒトRGMAを接触させることを含む、ヒトRGMA活性を低下させるための方法。

請求項86

ネオゲニン受容体へのhRGMA結合を減少させることを必要とする対象に、請求項1から請求項59の何れか一項の生成物を投与する段階を含む、該対象においてネオゲニン受容体へのhRGMA結合を減少させるための方法。

請求項87

骨形成タンパク質−2及び骨形成タンパク質−4(BMP−2及びBMP−4)へのhRGMA結合を減少させることを必要とする対象に、請求項1から請求項59の何れか一項の生成物を投与する段階を含む、該対象において骨形成タンパク質−2及び骨形成タンパク質−4(BMP−2及びBMP−4)へのhRGMA結合を減少させるための方法。

請求項88

請求項1から請求項59の何れか一項の生成物を、単独で又はその他の治療薬と組み合わせて、投与する段階を含む、RGMA活性に関与する疾患に対して対象を治療する方法。

請求項89

請求項1から請求項59の何れか一項の生成物を、単独で又はその他の治療薬と組み合わせて、RGMA活性が有害である疾患に罹患している対象に投与することを含む、該対象においてRGMA活性を低下させるための方法。

請求項90

請求項91

請求項1から請求項51の何れか1項で定義されるような結合タンパク質の単離CDR。

技術分野

0001

(技術分野)
本願は、RGMAへの結合能を有し、RGM A受容体及びその他のRGM A結合タンパク質へのRGMタンパク質の結合を妨害し、従ってRGM Aの機能を中和する、RGM A結合タンパク質、特にモノクローナル抗体及び特にそのCDRグラフトヒト化形態を記載する。これらの抗体は、以下に限定されないが、多発性硬化症哺乳動物脳外傷脊髄損傷、卒中、神経変性疾患及び統合失調症を含むいくつかの状況の治療において有用性があり得る。

背景技術

0002

背景情報
哺乳動物の中枢神経系(CNS)内での、損傷後又炎症性攻撃後又は神経変性疾患後の軸索再生は、殆どの場合不可能であり、その転帰は、CNSにおける神経繊維固有再成長能と、病変又は損傷部位微小環境局在するCNS内の阻害性因子との間のバランスに依存し、この阻害性因子は、再成長、従って損傷を受けた繊維路再生を積極的に妨害する。

0003

インビトロならびインビボ成長円錐虚脱及び神経突起成長阻害を引き起こし、それにより結果的に軸索再成長を直接阻害することから、乏突起膠細胞及び病変瘢痕により生成されるCNSミエリンは、損傷初期における軸索成長に対する最も重要な非許容構造であることが立証されている。CNSミエリン及び瘢痕組織における主要な阻害性因子であるRGMタンパク質が同定されている(Monnierら、Nature 419:392−395、2002;Schwabら、Arch.Neurol.62:1561−8、2005a;Schwabら、Eur.J.Neurosci.21:1569−76、2005b;Hataら、J.Cell.Biol.173:47−58、2006;概説としては:Muellerら、Philos.Trans.R.Soc.Lond.Biol.Sci.361:1513−29、2006;Yamashitaら、Curr.Opin.Neurobiol.17:29−34、2007を参照。)。RGMタンパク質は、脳外傷又は虚血性傷害死亡したヒトの損傷又は病変部位上方制御され(Schwabら、Arch.Neurol.62:1561−8、2005a)、脊髄損傷のあるラットの病変部位で上方制御される(Schwabら、Eur.J.Neurosci.21:1569−76、2005b;Hataら、J.Cell.Biol.173:47−58、2006、概説については:Muellerら、Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.361:1513−29、2006;Yamashitaら、Curr.Opin.Neurobiol.17:29−34、2007を参照。)。さらに、多発性硬化症患者及び健常者からの臨床試料を用いた最初のデータから、MSに罹患している患者脳脊髄液中でヒトRGMAが上方制御されることが示唆される(データは示さず。)。

0004

RGMA特異的ポリクローナル抗体の再生促進能を評価するために、第9/10胸椎ベル脊髄のおよそ60%が離断された脊髄損傷の中度から重度モデルにこの抗体を投与した。組織学的検査から、このような損傷により、皮質脊髄路の全ての背外側繊維が切断されたことが明らかになった。2週間にわたりポンプを介して局所的に投与されたRGM A−特異的ポリクローナル抗体により、損傷を受けた神経繊維の長距離の再生が誘導された(Hataら、J.Cell.Biol.173:47−58、2006)。

0005

幾百もの神経繊維が病変部位を越えて伸長し、最長繊維は、病変部を10mm超越えて再生したが、一方、対照抗体処理動物では病変部より遠位再生繊維は見られなかった。対照抗体処理した脊髄損傷ラットと比較して、抗RGMA処置ラットの機能回復が顕著に向上し、それにより、RGM Aが強力な神経再生阻害物質であり、軸索損傷又は神経繊維損傷を特徴とする指標において回復刺激するための有益な標的であることが証明される(Hataら、J.Cell.Biol.173:47−58、2006;Kyotoら、Brain Res.1186:74−86、2007)。さらに、機能を阻止するポリクローナル抗体でRGM Aタンパク質を中和することによって、脊髄損傷ラットでの損傷神経繊維の再成長が刺激されるだけでなく、それらのシナプス形成が促進され、それにより、損傷を受けた神経回路再形成又は回復が可能になる(Kyotoら、Brain Res.1186:74−86、2007)。

0006

rgm遺伝子ファミリーは、3つの異なる遺伝子を包含し、これらのうち2つ、即ちrgm a及びbは、RGMA及びRGM Bタンパク質が由来する哺乳動物CNSで発現され、一方、第三のメンバーであるrgm cは、末梢で発現され(Muellerら、Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.361:1513−29、2006)、ここで、RGM Cは鉄代謝において重要な役割を果たす。RGM Aは、インビトロで、RGM受容体として同定されているネオゲニンに結合することにより神経突起伸長を阻害する(Rajagopalanら、Nat Cell Biol.:6(8)、756−62、2004)。ネオゲニンは、最初にネトリン−結合タンパク質として記載された(Keino−Masuら、Cell、87(2):175−85、1996)。ネオゲニン又はその近縁の受容体DCC(結腸直腸癌欠損)に対するネトリン−1の結合により、神経突起成長を阻害するのではなく、刺激することが報告されているので、これは重要な知見である(Braistedら、J.Neurosci.20:5792−801、2000)。従って、RGM Aを阻止することによって、ネオゲニンがその神経突起成長刺激性リガンド、ネトリンに結合できるようにすることにより、RGM介在性成長阻害解除される。これらの観察に基づき、RGM Aの中和は、ヒト脊髄損傷モデルでのネオゲニンの中和よりも優れていると評価され得る。ネオゲニンへのRGM Aの結合及び神経突起成長阻害の誘導の他に、骨形成タンパク質BMP−2及びBMP−4へのRGM A又はBの結合は、神経再生及び機能回復の成功に対して同様の障害となり得る(Muellerら、Philos.Trans.R.Soc.Lond.Biol.Sci.361:1513−29、2006)。

先行技術

0007

Monnier他、Nature 419、2002年、p.392−395
Schwab他、Arch.Neurol.62、2005年、p.1561−8、
Schwab他、Eur.J.Neurosci.21、2005年、p.1569−76
Hata他、J.Cell.Biol.173、2006年、p.47−58
Mueller他、Philos.Trans.R.Soc.Lond.B Biol.Sci.361、2006年、p.1513−29
Yamashita他、Curr.Opin.Neurobiol.17、2007年、p.29−34
Kyoto他、Brain Res.1186、2007年、p.74−86
Rajagopalan他、Nat Cell Biol.:6(8)、2004年、p.756−62
Keino−Masu他、Cell、87(2)、1996年、p.175−85
Braisted他、J.Neurosci.20、2000年、p.5792−801

発明が解決しようとする課題

0008

当技術分野で、RGMAに結合し得る改善された抗体、好ましくはRGM Aを遮断し、RGM Aとその受容体及び/又は結合タンパク質、即ちネオゲニン及びBMP−2、BMP−4との間の相互作用を妨害するモノクローナル抗体が当技術分野で必要とされている。

0009

本願は、(a)RGMAの受容体ネオゲニンへ及び骨形成タンパク質2及び4(BMP−2、BMP−4)へのRGM Aの結合を選択的に阻害する、RGM Aに対する中和モノクローナル抗体の生成及び(b)骨形成タンパク質2及び4(BMP−2、BMP−4)へのRGM Aの結合を選択的に阻害する、RGM Aに対する中和モノクローナル抗体の生成を提供する。神経細胞がRGM A基質において移動及び伸長し易く、コラーゲンIのような許容基質(permissive substrate)ではそうではない条件下で、本発明の中和モノクローナル抗体の1つは、RGM Aの阻害的性質を転換すると思われるので、本発明の中和モノクローナル抗体は、損傷を受けたか又は障害された神経繊維の再成長及び再生する神経繊維の機能的シナプスの形成を刺激すると予想される。さらに、この抗体は、視神経損傷のインビボラットモデルで長距離再生を誘導することができ、これはまた、損傷を受け再生している神経繊維の再ミエリン形成も促進する。

0010

従って、本発明の中和モノクローナル抗体は、損傷を受け、炎症を起こしたヒトCNSにおいて、例えば多発性硬化症において、急性脊髄損傷、脳外傷後、又は例えばハンチントン舞踏病パーキンソン病アルツハイマー病などの神経変性疾患において、障害されるか又は破壊されたニューロン結合の神経再生及び再成長を促進することが予想される。

課題を解決するための手段

0011

(発明の要旨)
ある態様によると、本発明は、1x10−7M以下のKD及び1x10−2s−1以下のkoff速度定数(両者とも表面プラズモン共鳴により測定)でヒトRGMAから解離する結合タンパク質を提供する。

0012

別の態様によると、本発明は、ヒトRGMAに結合し、例えば、下記実施例3で例示されるとおりのNtera神経伸長アッセイのような標準的インビトロアッセイで測定される場合に、例えば上記の速度論的特性を示す結合タンパク質のような、ヒトRGM Aの神経突起伸長阻害活性を中和する、結合タンパク質に関する。

0013

本発明はまた、次のさらなる機能特性の少なくとも1つ:
ラットRGMAへの結合、
ヒトRGM Cへの結合及び
ラットRGM Cへの結合
を有する、上記で定義されるとおりの結合タンパク質にも関する。

0014

特に、本明細書中に記載のような結合タンパク質は、その受容体の少なくとも1つへのRGMの結合能を調節する。

0015

このような結合タンパク質は、特に、ヒトRGMAの受容体結合ドメインに結合する。RGM Aに対して、N及びC末端受容体結合ドメインが同定されている。本発明の結合タンパク質の特定の実施形態は、例えば47−168のようなN末端hRGM A断片とネオゲニン及びBMP−4のような受容体分子との間の結合の阻害により説明されるように、RGM AのN末端受容体結合ドメインに結合する。このN末端hRGM A断片の全長は、約30から約150又は約30から約122アミノ酸残基であり得る。非限定例として、本明細書中で記載のようなhRGM Aの断片0(N末端残基47−168に対応)又は何らかのより短い受容体結合断片を挙げ得る。

0016

特に、この結合タンパク質は、次の相互作用の少なくとも1つ:
ヒトBMP−4へのヒトRGMAの結合、
ヒトネオゲニンへのhRGM Aの結合、
ヒトネオゲニンへのhRGM Cの結合、
ヒトBMP−2へのヒトRGM Aの結合、
を調節、好ましくは阻害する。

0017

特定の実施形態によると、本明細書中で定義されるような結合タンパク質はヒト化抗体である。

0018

上記に記載のような結合タンパク質は、抗原結合ドメインを有し得、この結合タンパク質はRGM分子エピトープに結合することができ、この抗原結合ドメインは、
GTTPDY(配列番号59)、
QATHDPLT(配列番号62)、
RRNEYYGSSFFDY(配列番号65)、
LQGYIPPRT(配列番号68)及び
該配列の1つと少なくとも50%の配列同一性を有する修飾CDRアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含む。別の実施形態において、本発明は、抗原結合ドメインを含む結合タンパク質(該結合タンパク質は、RGM分子のエピトープに結合することができ、該抗原結合ドメインは、
GTTPDY(配列番号59)、
FQATHDPLT(配列番号62)、
ARRNEYYGSSFFDY(配列番号65)、
LQGYIPPRT(配列番号68)及び
該配列の1つと少なくとも50%の配列同一性、例えば少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95%の同一性など、を有する修飾CDRアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRを含む。)に関する。

0019

例えば、この結合タンパク質は、前記のCDRのうち2つ、例えば配列番号59及び62;又は配列番号65及び68などを含み得;これらのCDRのうち少なくとも1つが修飾され得、前記の配列の1つと少なくとも50%の配列同一性、例えば少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95%同一など、を有する。

0020

この結合タンパク質は、配列番号57、58、60、61、63、64、66、67及び、この配列の1つと少なくとも50%の配列同一性、例えば少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95%の同一性など、を有する修飾CDRアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのCDRをさらに含み得る。

0021

別の実施形態において、この少なくとも1つのCDRが、

0022

からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、結合タンパク質が提供される。

0023

特定の実施形態において、この結合タンパク質は、

0024

からなる可変ドメインCDRセット
又は表2の3つのCDRの少なくとも1つが、親配列に対して少なくとも50%の配列同一性、例えば少なくとも55、60、65、70、75、80、85、90、95%の同一性など、を有する修飾CDRアミノ酸配列である可変ドメインセット
から選択される、少なくとも3つのCDRを含む。

0025

特に、この上述の修飾のそれぞれは、1個又は複数のアミノ酸付加、欠失もしくは特に置換又はこれらの組み合わせによりもたらされ得る。

0026

別の実施形態において、この結合タンパク質は、少なくとも2つの可変ドメインCDRセットを含む。

0027

特に、この少なくとも2つの可変ドメインCDRセットは、
VH5F9セット及びVL5F9セット;及び
VH8D1セット及びVL8D1セット
からなる群から選択される。

0028

本発明による結合タンパク質は、ヒトアクセプターフレームワークをさらに含む。

0029

このヒトアクセプターフレームワークは、配列番号15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32及び33からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を含み得る。

0030

本発明の結合タンパク質は、特に、セット:
(1)
VH3−48セット(配列番号15、16及び17)
VH3−33セット(配列番号21、22及び23)
VH3−23セット(配列番号24、25及び26)(これらのセットのそれぞれは、
JH3(配列番号18)
JH4(配列番号19)
JH6(配列番号20)
から選択されるさらなるフレームワーク配列と組み合わせられる。)
からなる群から選択されるか;又は
(2)
A18セット:(配列番号27、28及び29)
A17セット:(配列番号31、32及び33)(これらのセットのそれぞれは、JK2(配列番号2)から選択されるさらなるフレームワーク配列と組み合わせられる。)
からなる群から選択される、フレームワーク配列の少なくとも1つのセットを含み得る。

0031

特定の実施形態によると、先行する請求項の何れか一項に記載の結合タンパク質は、配列番号35、36、37、38、39、40、41、42及び43から選択される少なくとも1つのCDRグラフト重鎖可変ドメイン;及び/又は配列番号44、45及び46から選択される少なくとも1つのCDRグラフト軽鎖可変ドメインを含む。

0032

とりわけ、本発明の結合タンパク質は、2つの可変ドメインの組み合わせを含み、この2つの可変ドメインは、
配列番号35及び44;36及び44;37及び44;38及び44;39及び44;40及び44;41及び44;42及び44;43及び44;
配列番号35及び45;36及び45;37及び45;38及び45;39及び45;40及び45;41及び45;42及び45;43及び45;
配列番号35及び46;36及び46;37及び46;38及び46;39及び46;40及び46;41及び46;42及び46;43及び46
から選択されるアミノ酸配列を有する。

0033

本発明の別の実施形態において、結合タンパク質のこのヒトアクセプターフレームワークは、キーとなる残基における少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、このキーとなる残基は、
CDRに隣接する残基;
グリコシル化部位残基;
希少残基;
RGMエピトープと相互作用可能な残基;
CDRと相互作用可能な残基;
カノニカル(canonical)残基;
重鎖可変領域軽鎖可変領域との間の接触残基;
バーニアゾーン内の残基;
パラグルタミン酸(paraglutamate)形成が可能なN末端残基及び
Chothiaにより定義された可変重鎖CDR1とKabatにより定義された第一の重鎖フレームワークとの間で重複する領域中の残基
からなる群から選択される。

0034

特に、このキーとなる残基は、
重鎖配列位置):1、5、37、48、49、88、98
軽鎖配列位置):2、4、41、51
からなる群から選択される。

0035

特定の実施形態において、本発明の結合タンパク質は、コンセンサスヒト可変ドメインであるか又はこれを含む。

0036

本発明の結合タンパク質の別の実施形態によると、このヒトアクセプターフレームワークは少なくとも1つのフレームワーク領域アミノ酸置換を含み、このフレームワークのアミノ酸配列は、このヒトアクセプターフレームワークの配列と、少なくとも65%、例えば少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%、同一であり、このヒトアクセプターフレームワークと同一である、少なくとも70アミノ酸残基、例えば少なくとも75、80又は85残基、を含む。

0037

特定の実施形態によると、本発明の結合タンパク質は、
配列番号47、48、49、50;(VHドメイン)からなる群から選択される及び/又は配列番号51、52、53及び54(VLドメイン)からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのフレームワーク突然変異可変ドメインを含む。

0038

特に、この結合タンパク質は、2つの、場合によってはフレームワークが突然変異した可変ドメインを含み、この2つの可変ドメインは、
配列番号47及び44;47及び45;47及び46;47及び51;47及び52;47及び53;47及び54;
配列番号48及び44;48及び45;48及び46;48及び51;48及び52;48及び53;48及び54;
配列番号49及び44;49及び45;49及び46;49及び51;49及び52;49及び53;49及び54;
配列番号50及び44;50及び45;50及び46;50及び51;50及び52;50及び53;50及び54
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。

0039

本明細書中で記載されるような本発明の結合タンパク質は、RGM分子から選択される少なくとも1つの標的に結合することができる。

0040

特に、これらは、ヒトRGMA及び場合によっては少なくとも1つのさらなるヒト由来のRGM分子又はカニクイザル、ラット、ヒヨコカエル及び由来のものに結合し得る。

0041

例えば、これらは、ラットRGMA、ヒトRGM C及び/又はラットRGM Cにさらに結合し得る。

0042

特に、本発明の結合タンパク質は、上記で定義されるようなRGM分子から選択される標的の生物学的機能を調節することができ、特に中和又は阻害することができる。

0043

特に、本発明の結合タンパク質は、RGM受容体の少なくとも1つ、例えばネオゲニン及びBMP(BMP−2及びBMP−4など)に対するRGMの結合能を調節、特に阻害する。

0044

例えばこの結合タンパク質は、次の相互作用:
ヒトBMP−4に対するヒトRGMAの結合、
ヒトネオゲニンに対するhRGM Aの結合、
ヒトネオゲニンに対するhRGM Cの結合、
ヒトBMP−2に対するヒトRGM Aの結合
の少なくとも1つを調節、特に抑制、及び好ましくは阻害する。

0045

本明細書中で開示されるような、機能特性の様々な組み合わせを有し、結果として様々な機能プロファイルを示す結合タンパク質もまた本発明の範囲内である。このようなプロファイルの非限定例を下記で挙げる:

0046

例えば、プロファイル1は、本発明により提供されるような抗体5F9及び本明細書中に記載のその誘導体に対応する。

0047

例えば、プロファイル2は、本発明により提供されるような抗体8D1及び本明細書中に記載のようなその誘導体に対応する。

0048

特に、本発明の結合タンパク質は、RGM、特に、RGM Aの少なくとも1つの生物活性を阻害することができ、このRGM Aは、ヒト、カニクイザル、ラット、ヒヨコ、カエル及び魚から選択される。

0049

別の実施形態によると、本発明の結合タンパク質は、次の速度論的特性:
(a)少なくとも約102M−1s−1;少なくとも約103M−1s−1;少なくとも約104M−1s−1;少なくとも約105M−1s−1;少なくとも約106M−1s−1及び少なくとも約107M−1s−1(表面プラズモン共鳴により測定される場合)からなる群から選択される前記の標的に対する会合速度定数(kon);
(b)最大約10−2s−1;最大約10−3s−1;最大約10−4s−1;最大約10−5s−1;及び最大約10−6s−1(表面プラズモン共鳴により測定される場合)からなる群から選択される前記の標的に対する解離速度定数(koff)又は
(c)最大約10−7M;最大約10−8M;最大約10−9M;最大約10−10M;最大約10−11M;最大約10−12M;及び最大10−13Mからなる群から選択される前記の標的に対する解離定数(KD)
の1以上を有する。

0050

さらなる態様によると、本発明は、上記の結合タンパク質を含み、リンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常ドメインをさらに含む、抗体コンストラクトを提供する。

0051

本発明の抗体コンストラクト又は結合タンパク質は、免疫グロブリン分子、モノクローナル抗体、キメラ抗体、CDRグラフト抗体、ヒト化抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、ジスルフィド結合Fv、scFv、単一ドメイン抗体ダイアボディ、多特異性抗体、二重特異性抗体、二重可変ドメイン免疫グロブリン及び二特異性抗体からなる群から選択され得る。

0052

本発明による抗体コンストラクトにおいて、この結合タンパク質は、
ヒトIgM定常ドメイン
ヒトIgG1定常ドメイン、
ヒトIgG2定常ドメイン、
ヒトIgG3定常ドメイン、
ヒトIgG4定常ドメイン、
ヒトIgE定常ドメイン、
ヒトIgD定常ドメイン、
ヒトIgA1定常ドメイン、
ヒトIgA2定常ドメイン、
ヒトIgY定常ドメイン及び
対応する突然変異定常ドメイン
からなる群から選択される重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。

0053

特に、本発明による抗体コンストラクトは、配列番号11、12、13及び14からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する免疫グロブリン定常ドメインを含む。

0054

別の態様によると、本発明は、本明細書中に記載の抗体コンストラクトを含み、免疫接着分子、造影剤治療薬及び細胞毒性剤(これらの作用物質のそれぞれは、前記の結合タンパク質に結合、例えば共有結合されている。)からなる群から選択される作用物質をさらに含む、抗体複合体を提供する。

0055

例えば、この作用物質は、放射性標識酵素蛍光標識発光標識生体発光標識、磁気標識及びビオチンからなる群から選択される造影剤である。特に、この造影剤は、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho及び153Smからなる群から選択される放射性標識である。

0056

例えば、この作用物質は、代謝拮抗剤アルキル化剤抗生物質成長因子サイトカイン血管新生阻害剤抗有糸分裂剤アントラサイクリン毒素及びアポトーシス剤からなる群から選択される治療薬又は細胞毒性剤である。

0057

別の実施形態によると、本明細書中に記載のような本発明の結合タンパク質はヒトグリコシル化パターンを保持する。

0058

さらに、本発明による、結合タンパク質、抗体コンストラクト及び抗体複合体は、好ましくは生物活性を保持する結晶として(結晶形態で)存在し得る。

0059

特に、この結晶は、無担体医薬制御放出結晶である。この結晶形態の観点で、本結合タンパク質、抗体コンストラクト又は抗体複合体は、対応する可溶性形態よりも、インビボで長い半減期を有し得る。

0060

別の態様において、本発明は、本明細書中に記載のような、結合タンパク質アミノ酸配列、抗体コンストラクトアミノ酸配列及び抗体複合体アミノ酸配列をコードする単離核酸を提供する。

0061

本発明はまた、本明細書中に記載のような単離核酸を含むベクターにも関する。特に、本ベクターは、pcDNA、pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV及びpBJからなる群から選択される。

0062

本発明はまた、このようなベクターを含む宿主細胞にも関する。特に、この宿主細胞は、例えばE.コリのような原核細胞であるか又は真核細胞であり、原生生物細胞動物細胞植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択され得る。特に、この真核細胞は、哺乳動物細胞鳥類細胞及び昆虫細胞からなる群から選択される動物細胞である。好ましくは、この宿主細胞は、HEK細胞CHO細胞、COS細胞及び酵母細胞から選択される。この酵母細胞はサッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)であり得、この昆虫細胞はSf9細胞であり得る。

0063

本発明はまた、RGMに結合可能である結合タンパク質を産生させるのに十分な条件下で培地中で本明細書中で定義されるような宿主細胞を培養することを含む、RGMに結合することができるタンパク質を産生させる方法も提供する。

0064

本発明はまた、この方法に従い産生されるタンパク質にも関する。

0065

本発明はまた、
(a)処方物(この処方物は、本明細書中で定義されるような結晶化生成物タンパク質を含む。)及び成分と、
(b)少なくとも1つのポリマー性担体と、
を含む、結合タンパク質の放出のための組成物も提供する。

0066

このポリマー性担体は、ポリアクリル酸)、ポリ(シアノアクリルレート)、ポリ(アミノ酸)、ポリ(無水物)、ポリ(デプシペプチド)、ポリ(エステル)、ポリ(乳酸)、ポリ(乳酸−グリコール酸コポリマー又はPLGA、ポリ(b−ヒドロキシブチレート)、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(ジオキサノン);ポリ(エチレングリコール)、ポリ((ヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリ[(オルガノホスファゼン]、ポリ(オルトエステル)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピロリドン)、無水マレイン酸アルキルビニルエーテルコポリマー、プルロニックポリオールアルブミンアルギネートセルロース及びセルロース誘導体、コラーゲン、フィブリンゼラチンヒアルロン酸オリゴ糖グリカミノグリカン、硫酸化多糖類、その混合物及びコポリマーからなる群の1以上から選択され得る。

0067

この成分は、アルブミン、スクローストレハロースラクチトール、ゼラチン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンメトキシポリエチレングリコール及びポリエチレングリコールからなる群から選択され得る。

0068

別の態様によると、本発明は、本明細書中で定義されるような組成物の有効量を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物を治療するための方法を提供する。

0069

別の態様によると、本発明は、生成物(特に、本明細書中で上述するような、結合タンパク質、コンストラクト又は結合物)と医薬的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物を提供する。

0070

この医薬的に許容可能な担体は、本結合タンパク質の吸収又は分散を向上させるために有用なアジュバントとして機能し得る。

0071

例えばこのアジュバントはヒアルロニダーゼである。

0072

別の実施形態によると、この調合薬は、RGM活性が有害である疾患を治療するための少なくとも1つのさらなる治療薬をさらに含む。例えば、この作用物質は、治療薬、造影剤、細胞毒性剤、血管新生阻害剤;キナーゼ阻害剤副刺激分子ブロッカー接着分子ブロッカー;抗サイトカイン抗体又はその機能断片メトトレキセートシクロスポリンラパマイシン;FK506;検出可能標識又はレポーターTNFアンタゴニスト抗リウマチ剤筋弛緩剤麻酔剤非ステロイド抗炎症薬(NSAID)、鎮痛剤麻酔薬鎮静剤局所麻酔薬神経筋ブロッカー、抗菌剤乾癬治療薬、コルチコステロイドアナボリックステロイドエリスロポエチン免疫付与、免疫グロブリン、免疫抑制剤成長ホルモンホルモン補充剤放射性医薬品抗うつ剤抗精神病薬興奮剤喘息治療薬、βアゴニスト吸入ステロイドエピネフリン又は類似体、サイトカイン及びサイトカインアンタゴニストからなる群から選択される。

0073

本発明はまた、少なくとも1つのヒトRGMA活性が低下させられるように、少なくとも1つの生成物(特に、本明細書中で上述されるような、結合タンパク質、コンストラクト又は結合物)とヒトRGM Aを接触させることを含む、ヒトRGM A活性を低下させるための方法にも関する。

0074

本発明はまた、ネオゲニン受容体に対するhRGMA結合を減少させることを必要とする対象に本発明の生成物(特に、本明細書中で上述されるような、結合タンパク質、コンストラクト又は結合物)を投与する段階を含む、該対象においてネオゲニン受容体へのhRGM A結合を減少させるための方法にも関する。

0075

本発明はまた、骨形成タンパク質−2及び/又は骨形成タンパク質−4(BMP−2及びBMP−4)に対するhRGMA結合を減少させることを必要とする対象に、本発明の生成物(特に、本明細書中で上述されるような、結合タンパク質、コンストラクト又は結合物)を投与する段階を含む、該対象において骨形成タンパク質−2及び/又は骨形成タンパク質−4(BMP−2及びBMP−4)に対するhRGM A結合を減少させるための方法にも関する。

0076

本発明はまた、本発明の生成物(特に、本明細書中で上述されるような、結合タンパク質、コンストラクト又は結合物)を、単独で又はその他の治療薬と組み合わせて投与する段階を含む、RGMA活性を伴う疾患に対して対象を治療するための方法にも関する。

0077

本発明はまた、本発明の生成物(特に、本明細書中で上述されるような、結合タンパク質、コンストラクト又は結合物)を、単独で又はその他の治療薬と組み合わせて、RGMA活性が有害である疾患に罹患している対象に投与することを含む、RGM A活性が有害である疾患に罹患している対象においてRGM A活性を低下させるための方法にも関する。

0078

この疾患は、好ましくは、筋萎縮性側索硬化症上腕神経損傷、脳損傷外傷性脳損傷を含む。)、脳性麻痺ギランバレー大脳白質萎縮症、多発性硬化症、ポリオ症候群二分脊椎、脊髄損傷、脊髄性筋萎縮症脊椎腫瘍、卒中、横断性脊髄炎認知症老年性認知症、軽度認知機能障害アルツハイマー関連認知症、ハンチントン舞踏病、遅発性ジスキネジー多動そう病、パーキンソン病、スティール・リチャード症候群、ダウン症重症筋無力症神経外傷、血管アミロイド症、アミロイド症を伴う大脳出血I、脳炎、急性混乱障害、筋萎縮性側索硬化症、緑内障及びアルツハイマー病からなる群から選択される神経性疾患を含む。

0079

本発明のさらなる特定の態様は以下に記載する。

0080

hRGMAタンパク質の少なくとも1つのエピトープと特異的に相互作用する単離結合タンパク質;
モノクローナル中和抗体又はその抗原結合断片である、前記単離タンパク質
VH及びVLドメインを含む、前記抗原結合断片;
hRGM Aの、その受容体への結合能を低下させる、前記中和抗体;
hRGM A生物活性を阻害することができる、前記中和抗体;
ヒト、カニクイザル、ラット、ヒヨコ、カエル及び魚から選択されるRGM A受容体を認識する、前記抗体;
アミノ酸配列配列番号2と90%相同性を有するRGM Aタンパク質を認識する、前記抗体;
RGM Aタンパク質が、核酸配列配列番号1と90%相同性を有する核酸によりコードされる、前記抗体;
配列番号9もしくは34の配列を含む重鎖可変領域(VH領域)又は、このVH領域の、ヒト化、場合によってはさらに突然変異した形態を含む配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、前記抗体;
配列番号10の配列を含む軽鎖可変領域(VL領域)又は、このVL領域の、ヒト化、場合によってはさらに突然変異した形態を含む配列と少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する、前記抗体;
hRGM Aに結合する、前記抗体(この抗体はグリコシル化されている。);
マウス抗体、ヒト化抗体、完全ヒト、キメラ抗体、ヒト化抗体の抗原結合断片又はキメラ抗体の抗原結合断片である、前記抗体又は抗原結合断片;
Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片及びFv断片からなる群から選択される抗原結合断片である、前記抗体又は抗原結合断片;
hRGM Aの少なくとも1つのエピトープと特異的に結合する、前記モノクローナル抗体(このモノクローナル抗体は、本明細書中に記載のようなハイブリドーマ細胞株により分泌されるモノクローナル抗体である。);
結合の結果、hRGM Aのその受容体との相互作用が不活性化される、前記モノクローナル抗体;
hRGM Aの少なくとも1つのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する、前記ハイブリドーマ細胞株;
ハイブリドーマが、ヒト、マウス、ラット、ヒツジブタウシヤギ及びウマハイブリドーマからなる群から選択される、前記ハイブリドーマ細胞株;
結合の結果、hRGM Aが不活性化される、前記モノクローナル抗体;
hRGM Aの少なくとも1つのエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する、前記ハイブリドーマ細胞株;
ハイブリドーマが、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ及びウマハイブリドーマからなる群から選択される、前記ハイブリドーマ細胞株;
a)nM範囲以下の親和性で哺乳動物RGM Aに結合すること;
b)μm、nM以下の効率で神経突起伸長アッセイにおいてインビトロでRGM A活性と機能的に拮抗すること;
c)視神経破壊モデルにおいて発をインビボで誘導すること;
d)脊髄損傷モデルにおいて発芽をインビボで誘導すること;
e)損傷を受けた神経繊維の再生的成長を促進することによりインビボの実験的脊髄損傷を軽減すること;又は
f)シナプス形成を促進することによりインビボの実験的脊髄損傷を軽減すること
からなる群から選択される少なくとも1つの特性を有する、前記モノクローナル中和抗体又はその抗原結合断片;
前記モノクローナル中和抗体又は抗原結合断片をコードする単離核酸;
前記単離核酸を含むベクター;
pcDNA;pTT;pTT3;pEFBOS;pBV;pJV;pHybE及びpBJからなる群から選択される、前記ベクター;
原生生物細胞、動物細胞、植物細胞及び真菌細胞からなる群から選択される形態である、前記ベクターにより形質転換される宿主細胞;
動物細胞がHEK293、CHO及びCOSからなる群から選択される哺乳動物細胞である、宿主細胞;
真核細胞である、請求項24に記載のベクターで形質転換された宿主細胞;
hRGM Aに結合する結合タンパク質を産生させるのに十分な条件下で培地中で宿主細胞を培養することを含む、hRGM Aに結合する結合タンパク質を産生させる方法;
前記モノクローナル抗体又は抗原結合部分と、医薬的に許容可能な担体と、を含む、医薬組成物;
ネオゲニン受容体に対するhRGM A結合を減少させることを必要とする対象に、前記抗体を投与する段階を含む、該対象においてネオゲニン受容体に対するhRGM A結合を減少させるための方法;
骨形成タンパク質−2及び骨形成タンパク質−4(BMP−2及びBMP−4)に対するhRGM A結合を減少させることを必要とする対象に、前記抗体を投与する段階を含む、該対象において骨形成タンパク質−2及び骨形成タンパク質−4(BMP−2及びBMP−4)に対するhRGM A結合を減少させるための方法;
前記の抗体を、単独で又はその他の治療薬と組み合わせて投与する段階を含む、RGM A活性を伴う疾患に対して対象を治療する方法;
前記の抗体を、単独で又はその他の治療薬と組み合わせて、RGM A活性が有害である疾患に罹患している対象に投与することを含む、該対象においてRGM A活性を低下させるための方法;
配列番号35、36、37、38、39、40、41、42及び43から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのVH領域を含む、前記抗体;
配列番号44、45及び46から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも1つのVL領域を含む、前記抗体;
VH又はVL配列における1から5個の突然変異によりさらに修飾される、前記抗体;
突然変異が、フレームワーク復帰突然変異及びバーニア及びVH/VL接触残基の突然変異から選択される、前記抗体;
同様に、本明細書中で開示されるような配列番号34に対する何れの教示又は参照も配列番号9に対して適用される。

図面の簡単な説明

0081

図1Aは、ELISAアッセイにおいて、モノクローナル抗体がhRGMAに結合することを示す。
図1Bは、モノクローナル抗体が、HEK293細胞で発現されるhRGM Aに結合することを示す。
図1Cは、モノクローナル抗体が、HEK293細胞で発現されるラットRGM Aに結合することを示す。
図2は、全長RGM Aがネオゲニンに結合することを示す。MAB 5F9は、全長、fc−連結hRGM Aのネオゲニンに対する結合を阻害する。
図3は、全長RGM AがBMP−4に結合することを示す。MAB 5F9は、fc−連結全長hRGM A断片(47−422)のBMP−4に対する結合を阻害する。
図4は、RGM A断片0がBMP−4に結合することを示す。MAB 5F9は、fc−連結hRGM A断片0(47−168)のBMP−4に対する結合を阻害する。
図5は、全長RGM AがBMP−2に結合することを示す。MAB 5F9は、fc連結全長hRGM A断片(47−422)のBMP−2に対する結合を阻害する。
図6は、Ntera細胞神経突起伸長アッセイでのRGM A断片のmAb 5F9による中和を示す顕微鏡写真の組み合わせである。MAB 5F9は、ヒトNtera凝集体を用いた神経突起伸長アッセイでのfc−結合した強力なhRGM A阻害物質断片の伸長阻害活性を中和する。A.対照の培養、ラミニンにおける、B.ラミニン−hRGM A断片(47−168)基質における、C.−E.0.1μg/mL MAB 5F9(C)、1μg/mL MAB 5F9(D.)、10μg/mL MAB 5F9(E.)存在下での、ラミニン−hRGM A断片(47−168)基質における、Nteraニューロンの成長。
図7は、NTera2アッセイ結果定量分析を示す。MAB 5F9は、ヒトNtera凝集体を用いた神経突起伸長アッセイにおいて、fc−結合した強力なhRGM A阻害物質断片(断片0、47−168)の伸長阻害活性を用量依存的に中和する。
図8は、SH−SY5Yストライプアッセイの定量分析を示す。MAB 5F9は、ストライプ膜カーペットにおける、ヒトSH−SY5Yニューロン細胞の、全長ヒトRGM Aからなるストライプにより誘導される反発を中和する。MAB 5F9非存在下で(A)又は低MAB濃度SH−SY5Y存在下で、ニューロンはRGM Aストライプを回避する傾向がある。この挙動は、MAB 5F9の濃度を上昇させることにより逆転させられる。(BからD)最大MAB濃度(10μg/mL)において(E)、SH−SY5Yニューロンは、コラーゲンIストライプと比較して、RGM Aストライプに対して強い選択性を示す。
図8は、SH−SY5Yストライプアッセイの定量分析を示す。MAB 5F9は、ストライプ膜カーペットにおける、ヒトSH−SY5Yニューロン細胞の、全長ヒトRGM Aからなるストライプにより誘導される反発を中和する。MAB 5F9非存在下で(A)又は低MAB濃度SH−SY5Y存在下で、ニューロンはRGM Aストライプを回避する傾向がある。この挙動は、MAB 5F9の濃度を上昇させることにより逆転させられる。(BからD)最大MAB濃度(10μg/mL)において(E)、SH−SY5Yニューロンは、コラーゲンIストライプと比較して、RGM Aストライプに対して強い選択性を示す。
図8は、SH−SY5Yストライプアッセイの定量分析を示す。MAB 5F9は、ストライプ膜カーペットにおける、ヒトSH−SY5Yニューロン細胞の、全長ヒトRGM Aからなるストライプにより誘導される反発を中和する。MAB 5F9非存在下で(A)又は低MAB濃度SH−SY5Y存在下で、ニューロンはRGM Aストライプを回避する傾向がある。この挙動は、MAB 5F9の濃度を上昇させることにより逆転させられる。(BからD)最大MAB濃度(10μg/mL)において(E)、SH−SY5Yニューロンは、コラーゲンIストライプと比較して、RGM Aストライプに対して強い選択性を示す。
図8は、SH−SY5Yストライプアッセイの定量分析を示す。MAB 5F9は、ストライプ膜カーペットにおける、ヒトSH−SY5Yニューロン細胞の、全長ヒトRGM Aからなるストライプにより誘導される反発を中和する。MAB 5F9非存在下で(A)又は低MAB濃度SH−SY5Y存在下で、ニューロンはRGM Aストライプを回避する傾向がある。この挙動は、MAB 5F9の濃度を上昇させることにより逆転させられる。(BからD)最大MAB濃度(10μg/mL)において(E)、SH−SY5Yニューロンは、コラーゲンIストライプと比較して、RGM Aストライプに対して強い選択性を示す。
図8は、SH−SY5Yストライプアッセイの定量分析を示す。MAB 5F9は、ストライプ膜カーペットにおける、ヒトSH−SY5Yニューロン細胞の、全長ヒトRGM Aからなるストライプにより誘導される反発を中和する。MAB 5F9非存在下で(A)又は低MAB濃度SH−SY5Y存在下で、ニューロンはRGM Aストライプを回避する傾向がある。この挙動は、MAB 5F9の濃度を上昇させることにより逆転させられる。(BからD)最大MAB濃度(10μg/mL)において(E)、SH−SY5Yニューロンは、コラーゲンIストライプと比較して、RGM Aストライプに対して強い選択性を示す。
図9は、mAB 5F9及び8D1結合特性の定量分析をまとめる。MAB5FhRGM A−ネオゲニン、hRGM A−BMP−2及びhRGM A−BMP−4結合アッセイにおいて、9及び8D1を様々な濃度で評価する。
図10は、SH−SY5Y化学走性アッセイにおける、ヒト化5F9抗体(h5F9.21、h5F9.23、h5F9.25)の、hRGM Aの化学反発活性に対する中和活性を示す。
図11は、視神経損傷の動物モデルにおける、5F9局所適用のインビボ神経再生活性を示す。MAB 5F9の局所適用により、RGM Aが中和され、視神経破壊ラット動物モデルにおいて障害された視神経軸索の再生伸長が刺激される。5F9処理動物(A)において、ラットRGM Aに結合しない対照MAB8D1(B)とは対照的に、多くのGAP−43陽性繊維が破壊部位を越えて伸長している。
図12A及び図12Bは、視神経損傷の動物モデルにおける5F9局所適用の定量分析を示す。(A)5F9によって、再生GAP−43陽性繊維の数が顕著に増加したが、対照MAB8D1では増加しなかった。5F9処置動物において、200μm、400μm及び600μmの距離で、有意に多くの繊維(p<0.05)が観察され、1200μmでは、5F9処置動物でのみ繊維が見られ、対象動物では見られず、(B)5F9は、視神経損傷部位において、対照抗体8D1及びビヒクル対照PBSと比較して、GAP−43陽性面積を有意に増加させた。Axiovisionソフトウェア(Zeiss)を用いて、再生伸長面積(GAP−43陽性面積)を測定した。
図13は、視神経損傷の動物モデルにおける、5F9全身適用のインビボ神経再生活性を示す。それぞれ2mg/kg及び10mg/kgで、第0日及び第21日に、5F9で動物を処置した。抗体又はビヒクル腹腔内又は静脈内投与した。ラット視神経の合成画像。5F9処理動物において(A)、多くのGAP−43陽性繊維は、PBS処置対照動物(B)とは対照的に、破壊部位を越えて伸長している。破壊部位は左端にあり、再生繊維は、GAP−43に対する抗体で染色される。5F9処理動物の視神経の上下縁で多くの繊維が観察されるが、PBS動物では観察されない。
図14Aは、視神経損傷の動物モデルにおける、5F9全身適用の定量分析を示す。
図14Bは、視神経損傷の動物モデルにおける、5F9全身適用の定量分析を示す。
図15は、視神経損傷の動物モデルにおける5F9全身適用のインビボ再ミエリン形成活性を示す。それぞれ2mg/kg及び10mg/kgで、第0日及び第21日に、5F9で動物を処置した。抗体又はビヒクルを腹腔内又は静脈内投与した。ラット視神経の合成画像。ミエリンマーカーであるミエリン塩基性タンパク質MBPに対する抗体を用いて、ミエリン形成を視覚化する。破壊部位は複合神経の中央部にあり、この領域は、ビヒクル処理対照動物(A及びB)にはない。5F9処理動物(C及びD)において、多くのMBP陽性構造は、視神経の中央領域(破壊中心)で観察される。
図16は、視神経損傷の動物モデルでの、5F9の全身適用の再ミエリン形成における定量的影響を示す。

0082

(詳細な記述
本発明は、RGMAに結合する、RGM A結合タンパク質、とりわけモノクローナルRGM A抗体、特にヒト化モノクローナルRGM A抗体、又はその抗原結合部分を記載する。本願の様々な態様は、抗体及び抗体断片及びその医薬組成物、ならびに、このような抗体及び断片を作製するために、核酸、組み換え発現ベクター及び宿主細胞に関する。ヒトRGM Aを検出するために、インビボ又はインビトロの何れかでヒトRGM及び/又はヒトRGM A活性を中和するために、及び遺伝子発現を制御するために、本願の抗体を使用する方法も本発明に包含される。

0083

1.一般的な定義
本明細書中で別段の定義がない限り、本発明に関して使用される科学用語及び技術用語は、当業者により一般に理解される意味を有する。これらの用語の意味及び範囲は明確であるが、しかし、何らかの潜在的な曖昧性がある場合には、本明細書中で提供される定義が、あらゆる辞書又は付帯的な定義よりも優先される。さらに、内容により必要とされない限り、単数形である語は、複数性を含み、複数形の語は単数性を含む。本願において、「又は」の使用は、別段の断りがない限り、「及び/又は」を意味する。さらに、「含む(including)」という用語ならびに「含む(includes)」及び「含まれる(included)」などのその他の形態の使用は限定ではない。また、別段の具体的な断りがない限り、「要素」又は「成分」などの用語は、1単位を含む要素及び成分及び複数のサブユニットを含む要素及び成分の両方を包含する。

0084

一般に、本明細書中に記載の、細胞及び組織培養分子生物学免疫学微生物学遺伝学及びタンパク質及び核酸化学及びハイブリッド形成と関連して使用される命名法及びそれらの技術は当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。本発明の方法及び技術は、一般に、別段の指示がない限り、当技術分野で周知の従来法に従い、本願を通じて引用され考察される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載のように、行われる。酵素反応及び精製技術は、製造者仕様書に従い、当技術分野で一般に遂行されるように、又は本明細書中に記載のように、行われる。本明細書中に記載の、分析化学、合成有機化学及び医学及び製薬化学と関連して使用される命名法及びそれらの検査法及び技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用される。化学合成化学分析薬剤調合、処方及び送達ならびに患者の処置に対して標準的技術が使用される。

0085

本発明がより容易に理解され得るように、選択した用語を下記で定義する。

0086

ポリペプチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、アミノ酸の何らかのポリマー鎖を指す。「ペプチド」及び「タンパク質」という用語はポリペプチドという用語と交換可能に使用され、また、アミノ酸のポリマー鎖も指す。「ポリペプチド」という用語は、ネイティブ又は人工タンパク質タンパク質断片及びタンパク質配列ポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは単量体性又はポリマー性であり得る。

0087

「単離タンパク質」又は「単離ポリペプチド」という用語は、誘導物のその起源又は源に基づいて、その生来の状態でそれに付随する天然会合される成分と会合していないタンパク質又はポリペプチドであるか;同じ種由来のその他のタンパク質を実質的に含まないか;異なる種由来の細胞により発現されるか;又は天然では生じないものである。このようにして、化学的に合成されるか又はそれが天然に由来する細胞とは異なる細胞系で合成されるポリペプチドは、その天然会合成分から「単離」される。タンパク質はまた、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって、天然会合成分を実質的に含まないようにされているものでもあり得る。

0088

回収する」という用語は、本明細書中で使用される場合、例えば当技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって、ポリペプチドなどの化学種が、天然会合成分を実質的に含まないようにされるプロセスを指す。

0089

「ヒトRGMA」(本明細書中でhRGM Aと省略)は、本明細書中で使用される場合、450アミノ酸のグリコシルホスファチジルイノシトール(gpi)−アンカー加糖タンパク質を指し、最初に、トポグラフィック投射(topographic projection)の進行中の、神経突起伸長消退物質又は神経突起伸長阻害物質として記載された(Stahlら、Neuron 5:735−43、1990;Mueller、Molecular Basis of Axon Growth and Nerve Pattern Formation、H.Hujisawa編、Japan Scientific Societies Press、215−229、1997)。rgm遺伝子ファミリーは、3種類の異なる遺伝子を包含し、それらのうち2つ、rgm a及びbは哺乳動物CNSで発現され、一方第三のメンバーであるrgm cは末梢で発現され(Muellerら、Philos.Trans.R.Soc.Lond.Biol.Sci.361:1513−29、2006)、ここで、rgm cは鉄代謝において重要な役割を果たす。ヒトRGMタンパク質は、43%−50%の配列同一性を有し、ヒト及びラットRGM Aのアミノ酸相同性は89%である。ヒトRGMタンパク質は、何らかのその他の公知のタンパク質と顕著な配列相同性はない。これらは、RGD領域を含有するプロリン富むタンパク質であり、フォンウィルブラント因子ドメインに対して構造的相同性を有し、未知プロテアーゼによりN末端アミノ酸168で切断され、機能的活性タンパク質が生じる(Muellerら、Philos.Trans.R.Soc.Lond.Biol.Sci.361:1513−29、2006)。

0090

インビトロで、RGMAは、RGM受容体として同定されているネオゲニンに結合することによりピコモル濃度で神経突起伸長を阻害する(Rajagopalanら、Nat Cell Biol.:6(8)、756−62、2004)。ネオゲニンは、最初に、ネトリン−結合タンパク質として記載されたが(Keino−Masuら、Cell、87(2):175−85、1996)、ネトリンに対するその親和性(Kd2nM)は、RGM(Kd0.2nM)に対するものよりも小さい桁のものである(Rajagopalanら、Nat Cell Biol.:6(8)、756−62、2004)。ネオゲニンに対する又はその近縁受容体DCC(結腸直腸癌で欠失)に対するネトリン−1の結合が神経突起伸長を阻害するのではなく刺激することが報告されているので、これは重要な知見である(Braistedら、J.Neurosci.20:5792−801、2000)。

0091

ネオゲニンへのRGMAの結合及び神経突起伸長阻害の誘導の他に、骨形成タンパク質BMP−2及びBMP−4に対するRGM A又はBの結合は、神経再生及び機能回復の成功に対する同様の障害となり得る(Muellerら、Philos.Trans.R.Soc.Lond.Biol.Sci.361:1513−29、2006)。タンパク質の両クラス(ネオゲニン及びBMP)は、2つの完全に異なり独立するシグナル伝達回路を介して、RGM Aの神経突起成長阻害性シグナルを変換することが報告されている。通常、これらのBMPタンパク質の発現は、成体CNSの殆どの領域で比較的低いが、損傷及び傷害応答して、一部のBMP(例えばBMP−2、BMP−6、BMP−7)の発現及び蓄積が急激に上昇することが報告されている(Laiら、Neuroreport 8:2691−94、1997;Martinezら、Brain Res.894:1−11、2001;Hall及びMiller、J.Neurosci.Res.76:1−8、2004;Setoguchiら、Exp.Neurol.189:33−44、2004)。さらに、多発性硬化症のモデル、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルにおいて、マウス脊髄でBMP−4、BMP−6及びBMP−7が上方制御された(Araら、J.Neurosci.Res.86:125−35、2008)。BMP−2は、細胞表面RGM A、BMP−受容体I及びIIに結合することによって及びLIMキナーゼを直接活性化することによって、神経突起成長を阻害することが報告されており(Matsuuraら、Biochem Biophys Res Commun.、360:868−73、2007)、従って、RGM A−BMP−2相互作用を阻止することによって、CNS損傷後の機能的回復がさらに促進されることが予想される。

0092

上述のように、脊髄損傷ラット及び脳損傷のあるヒトは、損傷部位において細胞性RGMの大規模な蓄積を示し、脊髄病変部位でのラットにおけるRGM Aの染色パターンは、ヒトでの総RGM 抗体染色と非常に類似しており、このことから、ヒトにおける総RGM染色の殆どが、RGMB局在ではなくRGM A局在に関連するものであることが示唆される(Schwabら、Arch.Neurol.62:1561−8、2005a;Schwabら、Eur.J.Neurosci.21:1569−76、2005b;Hataら、J.Cell.Biol.173:47−58、2006)。健康なヒト脳において、白質繊維、乏突起膠細胞、少数のニューロンの周核体、一部の血管平滑筋及び少数の内皮細胞で総RGM染色(RGM A及びB免疫反応性)が検出された。星状膠細胞の染色は観察されなかった。成人健常ヒト脳のRGM染色パターンは、成体ラット脊髄で観察される染色パターンと非常に類似している(Schwabら、Eur.J.Neurosci.21:1569−76、2005b;Hataら、J.Cell.Biol.173:47−58、2006)。

0093

脳及び脊髄損傷での損傷部でのRGMAの蓄積に基づき、及びその細胞性の神経突起成長阻害活性ゆえに、このタンパク質が神経突起成長阻害活性を発揮し、ヒトRGM Aの少なくとも1つのエピトープに結合する抗体又はその抗原結合断片によるその中和の結果、損傷を受けた神経繊維の再成長が向上し、神経繊維損傷及びRGM蓄積を特徴とする指標において機能的回復が促進されることが予想される。

0094

別段の断りがない限り、「RGMA」という用語はまた、その他の種、例えばマウス又はラットなどのげっ歯類から単離又は得られたRGM A分子、具体的には本明細書中で「ラットRGM A」と呼ばれるラット由来分子も包含する。

0095

0096

「生物活性」は、本明細書中で使用される場合、本明細書中で定義されるようなRGMAの全ての生来の生物学的特性を指す。

0097

特異的結合」又は「特異的に結合する」という用語は、本明細書中で使用される場合、第二の化学種との抗体、タンパク質又はペプチドの相互作用に関して、相互作用が、その化学種において特定の構造(例えば、下記で定義されるような「抗原決定基」又は「エピトープ」)の存在に依存することを意味し;例えば、抗体は、一般的にタンパク質ではなく特異的なタンパク質構造を認識し、それに結合する。抗体がエピトープ「A」に特異的である場合、エピトープA(又は遊離非標識A)を含有する分子が存在すると、標識された「A」及びその抗体を含有する反応において、抗体に結合する標識されたAの量が減少する。

0098

「抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、広く、4本のポリペプチド鎖、2本の重(H)鎖及び2本の軽(L)鎖から構成される何らかの免疫グロブリン(Ig)分子又はその何らかの機能的断片突然変異体変異体もしくは誘導体(これは、Ig分子の必須のエピトープ結合特性を保持する。)を指す。このような突然変異体、変異体もしくは誘導抗体形態は当技術分野で公知である。この非限定実施形態は下記で考察する。抗体は、それが、分子と特異的に反応することができ、それによりその抗体にその分子が結合する場合、分子に「結合可能」であると言われる。

0099

「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で使用される場合、様々な抗体の混合物を含有する「ポリクローナル抗体調製物に対して、共通の重鎖及び共通の軽鎖アミノ酸配列を有する抗体分子調製物を指すものとする。モノクローナル抗体は、ファージ、細菌、酵母又はリボソーム提示などのいくつかの新規技術ならびにハイブリドーマ由来抗体(例えば、標準的なKohler及びMilsteinハイブリドーマ法((1975)Nature 256:495−497)など、ハイブリドーマ技術によって調製されたハイブリドーマにより分泌される抗体)により例示される古典的方法により作製され得る。

0100

全長抗体において、各重鎖は、重鎖可変領域(本明細書中で略してHCVR又はVH)及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2及びCH3からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域(本明細書中で略してLCVR又はVL)及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLからなる。VH及びVL領域は、より保存性が高いフレームワーク領域(FR)と呼ばれる領域が散在する、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変領域にさらに分類され得る。各VH及びVLは、アミノ末端からカルボキシ末端へと、FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4という順序で並んだ、3つのCDR及び4つのFRから構成される。免疫グロブリン分子は、何らかのタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及びIgY)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)又はサブクラスのものであり得る。

0101

抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」(又は単純に「抗体部分」又は「抗体断片」)という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原(例えばhRGMA)に特異的に結合する能力を保持する抗体の1以上の断片を指す。全長抗体の断片により抗体の抗原結合機能を発揮させ得ることが示されている。このような抗体実施形態はまた、2以上の異なる抗原に特異的に結合する、二特異性、二重特異性又は多特異性形態でもあり得る。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例には、(i)Fab断片(VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価断片)、(ii)F(ab’)2断片(ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片)、(iii)VH及びCH1ドメインからなるFd断片、(iv)抗体の単一アームのVL及びVHドメインからなるFv断片、(v)1つの可変ドメインを含むdAb断片(Wardら(1989)Nature 341:544−546、Winterら、PCT公開WO90/05144A1(参照により本明細書中に組み込まれる。))及び(vi)単離された相補性決定領域(CDR)が含まれる。さらに、Fv断片の2つのドメインであるVL及びVHは別個の遺伝子によってコードされているが、これらは、VL及びVH領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として、これらの作製を可能とする合成リンカーによって、組み換え法を用いて連結され得る(一本鎖Fv(scFv)として知られている。例えば、Birdら(1988)Science 242:423−426;及びHustonら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879−5883を参照。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含されるものとする。ダイアボディなどの一本鎖抗体のその他の形態も包含される。ダイアボディは、VH及びVLドメインが1本のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上にあるこの2つのドメイン間での対合を可能とするには短すぎるリンカーを使用して、これによりこれらのドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合させ、2つの抗原結合部位作出する、二価の二特異性抗体である(例えば、Holliger、P.ら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444−6448;Poljak R.J.ら(1994)Structure 2:1121−1123を参照)。このような抗体結合部分は、当技術分野で公知である(Kontermann及びDubel編、Antibody Engineering(2001)Springer−Verlag.New York.790pp.(ISBN 3−540−41354−5)。

0102

「抗体コンストラクト」という用語は、本明細書中で使用される場合、リンカーポリペプチド又は免疫グロブリン定常ドメインに連結された本発明の1以上の抗原結合部分を含むポリペプチドを指す。リンカーポリペプチドは、ペプチド結合により連結される2以上のアミノ酸残基を含み、1以上の抗原結合部分を連結するために使用される。このようなリンカーポリペプチドは当技術分野で周知である(例えば、Holliger、P.ら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90:6444−6448;Poljak、R.J.ら(1994)Structure 2:1121−1123参照)。免疫グロブリン定常ドメインとは、重鎖又は軽鎖定常ドメインを指す。ヒトIgG重鎖及び軽鎖定常ドメインアミノ酸配列は、当技術分野で公知であり、表2で示される。

0103

0104

またさらに、抗体又はその抗原結合部分は、1以上のその他のタンパク質又はペプチドとの抗体又は抗体部分の共有又は非共有結合により形成される、より大きな免疫接着分子の一部であり得る。このような免疫接着分子の例には、四量体scFv分子を生成させるためのストレプトアビジンコア領域の使用(Kipriyanov、S.M.ら(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6:93−101)及び二価及びビオチン化scFv分子を生成させるための、システイン残基マーカーペプチド及びC末端ポリヒスチジンタグの使用(Kipriyanov、S.M.ら(1994)Mol.Immunol.31:1047−1058)が含まれる。全抗体のそれぞれパパイン又はペプシン消化などの従来技術を用いて、全抗体から、Fab及びF(ab’)2断片などの抗体部分を調製することができる。さらに、本明細書中に記載のように、標準的組み換えDNA技術を用いて、抗体、抗体部分及び免疫接着分子を得ることができる。

0105

単離抗体」とは、本明細書中で使用される場合、異なる抗原特異性を有するその他の抗体を実質的に含まない抗体を指すものとする(例えば、hRGMAに特異的に結合する単離抗体は、hRGM A以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない。)。しかし、hRGM Aに特異的に結合する単離抗体は、その他の種由来のRGM A分子などのその他の抗原との交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、その他の細胞性物質及び/又は化学物質を実質的に含まないものであり得る。

0106

本明細書中で使用される場合、「ヒト抗体」という用語には、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する抗体が含まれるものとする。本発明のヒト抗体は、例えばCDR、特にCDR3中のヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでの無作為又は部位特異的突然変異誘発によるか又はインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異)を含み得る。しかし、「ヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系列由来のCDR配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含まないものとする。

0107

組み換えヒト抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、宿主細胞に遺伝子移入された組み換え発現ベクターを用いて発現される抗体(下記で詳述)、組み換え体コンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離される抗体(Hoogenboom H.R.(1997)TIB Tech.15:62−70;Azzay H.及びHighsmith W.E.(2002)Clin.Biochem.35:425−445;Gavilondo J.V.及びLarrick J.W.(2002)Bio Techniques 29:128−145;Hoogenboom H.及びChames P.(2000)Immunology Today 21:371−378)、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニックである動物(例えばマウス)から単離される抗体(例えば、Taylor、L.D.ら(1992)Nucl.AcidsRes.20:6287−6295;Kellermann S−A.及びGreen L.L.(2002)Current Opinion in Biotechnology 13:593−597;Little M.ら(2000)Immunology Today 21:364−370参照)又はヒト免疫グロブリン遺伝子配列のその他のDNA配列へのスプライシングを含む何らかのその他の手段により、調製され、発現され、作製されるか又は単離される抗体など、組み換え手段により、調製され、発現され、作製されるか又は単離される、全てのヒト抗体を含むものとする。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列由来の可変及び定常領域を有する。しかし、ある種の実施形態において、このような組み換えヒト抗体はインビトロ突然変異誘発(又は、ヒトIg配列に対してトランスジェニックである動物が使用される場合、インビボ体細胞突然変異誘発)を受け、従って、組み換え抗体のVH及びVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列VH及びVL配列由来であり、関連する一方で、インビボでのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然には存在し得ない配列である。

0108

「キメラ抗体」という用語は、ヒト定常領域に連結されたマウス重鎖及び軽鎖可変領域を有する抗体など、ある種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列及び別の種に由来する定常領域配列を含む抗体を指す。キメラ抗体は、組み換え分子生物学技術を通じて作製され得るか又は物理的に一緒に結合され得る。

0109

「CDRグラフト抗体」という用語は、マウスCDRの1以上(例えばCDR3)がヒトCDR配列で置換されているマウス重鎖及び軽鎖可変領域配列を有する抗体など、ある種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むが、VH及び/又はVLのCDR領域の1以上の配列が、別の種のCDR配列と置換されている抗体を指す。

0110

「Kabat付番」、「Kabat定義」及び「Kabatラベリング」という用語は本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、当技術分野で認識されており、抗体の重鎖及び軽鎖可変領域又はその抗原結合部分におけるその他のアミノ酸残基よりもより可変性がある(即ち超可変性)アミノ酸残基に付番する系を指す(Kabatら(1971)Ann.NY Acad、Sci.190:382−391及びKabat、E.A.ら(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S.Department of Health and Human Services、NIH Publication No.91−3242)。重鎖可変領域の場合、超可変領域は、CDR1についてはアミノ酸位置31から35の範囲であり、CDR2についてはアミノ酸位置50から65であり、CDR3についてはアミノ酸位置95から102の範囲である。軽鎖可変領域の場合、超可変領域は、CDR1についてはアミノ酸位置24から34の範囲であり、CDR2についてはアミノ酸位置50から56であり、CDR3についてはアミノ酸位置89から97である。

0111

本明細書中で使用される場合、「アクセプター」及び「アクセプター抗体」という用語は、フレームワーク領域の1以上のアミノ酸配列の少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は100%を与えるか又はコードする、抗体又は核酸配列を指す。ある実施形態において、「アクセプター」という用語は、定常領域を与えるか又はコードする、抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。さらに別の実施形態において、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域及び定常領域の1以上を与えるか又はコードする、抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。具体的な実施形態において、「アクセプター」という用語は、フレームワーク領域の1以上のアミノ酸配列の少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は100%を与えるか又はコードする、ヒト抗体アミノ酸又は核酸配列を指す。この実施形態によると、アクセプターは、ヒト抗体の1以上の特異的位置で生じない、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5又は少なくとも10個のアミノ酸残基を含有し得る。アクセプターフレームワーク領域及び/又はアクセプター定常領域は、例えば、生殖細胞系列抗体遺伝子成熟抗体遺伝子、機能的抗体(例えば、当技術分野で周知の抗体、開発中の抗体又は市販の抗体)由来であり得るか又はそれらから得ることができる。

0112

本明細書中で使用される場合、「CDR」という用語は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖及び軽鎖の可変領域のそれぞれに3個のCDRがあり、これらは、可変領域のそれぞれに対して、CDR1、CDR2及びCDR3と呼ばれる。「CDRセット」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原に結合し得る1つの可変領域で生じる3つのCDRの群を指す。これらのCDRの正しい境界は、系によって別に規定される。Kabatにより記載される系(Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health、Bethesda、MD(1987)及び(1991))は、抗体のあらゆる可変領域に適用可能である明確な残基付番システムを提供するだけでなく、3つのCDRを定義する明確な残基境界ももたらす。これらのCDRは、Kabat CDRと呼ばれる得る。Chothia及び共同研究者ら(Chothia及びLesk、J.Mol.Biol.196:901−917(1987)及びChothiaら、Nature 342:877−883(1989))は、アミノ酸配列のレベルで非常に多様であるにもかかわらず、Kabat CDR内のある一定の部分(subportion)がほぼ同一のペプチド骨格構造をとることを見出した。これらの部分(subportion)は、L1、L2及びL3又はH1、H2及びH3と名付けられた(ここで、「L」及び「H」は、それぞれ軽鎖及び重鎖領域を表す。)。これらの領域は、Chothia CDRと呼ばれ得、これらは、Kabat CDRと重複する境界を有する。KabatCDRと重複するCDRを定義するその他の境界は、Padlan(FASEB J.9:133−139(1995))及びMacCallum(J Mol.Biol.262(5):732−45(1996))により記載されている。さらに他のCDR境界の定義は、上記のシステムの1つに正確には従わない可能性があるが、特定の残基又は残基群又はCDR全体でさえも抗原結合に重大な影響を与えないという予想又は実験的知見を考慮すると、それらが短くされ得るか又は長くされ得るかにかかわらず、それでもなお、Kabat CDRと重複する。本明細書中で使用される方法は、これらのシステムの何れかに従い定義されるCDRを使用し得るが、好ましい実施形態は、Kabat又はChothiaで定義されるCDRを使用する。

0113

本明細書中で使用される場合、「カノニカル(canonical)」残基という用語は、Chothiaら(J.Mol.Biol.196:901−907(1987);Chothiaら、J.Mol.Biol.227:799(1992)、両者とも参照により本明細書中に組み込まれる。)により定義されるような、特定のカノニカル(canonical)CDR構造を定義する、CDR又はフレームワークにおける残基を指す。Chothiaらによると、多くの抗体のCDRの重要な部分は、アミノ酸配列のレベルでは非常に多様であるにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格構造を有する。各カノニカル(canonical)構造は、主に、ループを形成するアミノ酸残基の隣接セグメントに対する一組のペプチド骨格ねじれ角を指す。

0114

本明細書中で使用される場合、「ドナー」及び「ドナー抗体」という用語は、1以上のCDRを提供する抗体を指す。好ましい実施形態において、ドナー抗体は、フレームワーク領域が得られるか又はそれが由来する抗体とは異なる種由来の抗体である。ヒト化抗体に関して、「ドナー抗体」という用語は、1以上のCDRを提供する非ヒト抗体を指す。

0115

本明細書中で使用される場合、「フレームワーク」又は「フレームワーク配列」という用語は、CDRを差し引いた可変領域の残存配列を指す。CDR配列の正確な定義は異なるシステムにより決定され得るので、フレームワーク配列の意味は、相応して異なる解釈に従う。6個のCDR(軽鎖のCDR−L1、−L2及び−L3及び重鎖のCDR−H1、−H2及び−H3)もまた、軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域を各鎖において4つのサブ領域(FR1、FR2、FR3及びFR4)に分けるが、ここで、CDR1は、FR1とFR2との間に位置し、CDR2はFR2とFR3との間に位置し、CDR3はFR3とFR4との間に位置する。FR1、FR2、FR3又はFR4として特定のサブ領域を指定することなく、その他により指定される場合、フレームワーク領域は、1本の天然の免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わせられたFR’を示す。本明細書中で使用される場合、FR(単数形)は4つのサブ領域の1つを表し、FR(複数形)は、フレームワーク領域を構成する4つのサブ領域の2以上を表す。

0116

ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は当技術分野で公知である。本発明のある実施形態において、ヒト重鎖及び軽鎖アクセプター配列は、表3及び表4に記載の配列から選択される。ヒトフレームワーク配列FR1からFR4に対する様々な組み合わせはこれらの表で述べる。

0117

0118

0119

本明細書中で使用される場合、「生殖細胞系列抗体遺伝子」又は「遺伝子断片」という用語は、特定の免疫グロブリンの発現に対して遺伝子再編成及び突然変異をもたらす成熟プロセスが行われていない非リンパ系細胞によりコードされる免疫グロブリン配列を指す(例えば、Shapiroら、Crit.Rev.Immunol.22(3):183−200(2002);Marchalonisら、Adv Exp Med Biol.484:13−30(2001)参照)。本発明の様々な実施形態により提供される長所の1つは、生殖細胞系列抗体遺伝子が、成熟抗体遺伝子よりも、種における個体の必須のアミノ酸配列構造の特徴を保存する可能性が高く、それゆえ、その種において治療用に使用される場合、外来の源由来のものとして認識される可能性が低いという認識によるものである。

0120

本明細書中で使用される場合、「キーとなる」残基という用語は、抗体の、特にヒト化抗体の、結合特異性及び/又は親和性においてより大きな影響がある可変領域内のある一定の残基を指す。キーとなる残基には、以下に限定されないが、次のもの:CDRに隣接する残基、潜在的グリコシル化部位(N−又はO−グリコシル化部位の何れかであり得る。)、希少残基、抗原と相互作用可能な残基、CDRと相互作用可能な残基、カノニカル残基、重鎖可変領域及と軽鎖可変領域との間の接触残基、バーニアゾーン内の残基及び可変重鎖CDR1のChothia定義と第一の重鎖フレームワークのKabat定義との間で重複する領域における残基の1以上が含まれる。

0121

「ヒト化抗体」という用語は、一般に、非ヒト種(例えばマウス)由来の重鎖及び軽鎖可変領域配列を含む抗体を指すが、しかし、ここで、VH及び/又はVL配列の少なくとも一部が、より「ヒトに近く」になるように改変されている、即ち、ヒト生殖細胞系列の可変配列により類似するように改変されている。ヒト化抗体のあるタイプは、対応する非ヒトCDR配列を置換するためにヒトCDR配列が非ヒトVH及びVL配列に導入される、CDRグラフト抗体である。

0122

特に、「ヒト化抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、関心のある抗原に免疫特異的に結合し、ヒト抗体のアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク(FR)領域及び実質的に非ヒト抗体のアミノ酸配列を有する相補性決定領域(CDR)を含む、抗体又はその変異体、誘導体、類似体又は断片である。本明細書中で使用される場合、CDRに関して「実質的に」という用語は、非ヒト抗体CDRのアミノ酸配列と少なくとも50、55、60、65、70、75又は80%、好ましくは少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%又は少なくとも99%同一であるアミノ酸配列を有するCDRを指す。ヒト化抗体は、CDR領域の全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリン(即ちドナー抗体)のものに対応し、フレームワーク領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ及び通常は2つの、可変ドメイン(Fab、Fab’、F(ab’)2、FabC、Fv)の実質的に全てを含む。好ましくは、ヒト化抗体はまた、通常はヒト免疫グロブリンのものである、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部も含む。ある実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖ならびに少なくとも重鎖の可変ドメインの両方を含有する。本抗体はまた、重鎖の、CH1、ヒンジ、CH2、CH3及びCH4領域も含み得る。ある実施形態において、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみを含有する。ある実施形態において、ヒト化抗体はヒト化重鎖のみを含有する。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、軽鎖のヒト化可変ドメイン及び/又はヒト化重鎖のみを含有する。

0123

ヒト化抗体は、IgY、IgM、IgG、IgD、IgA及びIgE及び何らかのアイソタイプ(以下に限定されないが、IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4を含む。)を含む、免疫グロブリンの何らかのクラスから選択することができる。ヒト化抗体は、複数のクラス又はアイソタイプからの配列を含み得、当技術分野で周知である技術を用いて、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択し得る。

0124

ヒト化抗体の、フレームワーク及びCDR領域は、親配列に正確に対応する必要はなく、例えば、その部位でCDR又はフレームワーク残基がドナー抗体又はコンセンサスフレームワークの何れかに相当しないように、少なくとも1つのアミノ酸残基の、置換、挿入及び/又は欠失により、ドナー抗体CDR又はコンセンサスフレームワークに対して突然変異誘発が行われ得る。しかし、好ましい実施形態において、このような突然変異は大規模ではない。通常、ヒト化抗体残基の、少なくとも50、55、60、65、70、75又は80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%が親FR及びCDR配列のものに相当する。本明細書中で使用される場合、「コンセンサスフレームワーク」という用語は、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク領域を指す。本明細書中で使用される場合、「コンセンサス免疫グロブリン配列」という用語は、関連免疫グロブリン配列のファミリーにおいて最も高頻度に現れるアミノ酸(又はヌクレオチド)から形成される配列を指す(例えば、Winnaker、From Gene to Clones(Verlagsgesellschaft、Weinheim、Germany 1987参照)。免疫グロブリンのファミリーにおいて、コンセンサス配列の各位置には、そのファミリーのその位置で最も高頻度に現れるアミノ酸がある。2種類のアミノ酸が同等の頻度で現れる場合、何れかをコンセンサス配列に含め得る。

0125

本明細書中で使用される場合、「バーニア」ゾーンは、Foote及びWinter(1992、J.Mol.Biol.224:487−499、参照により本明細書中に組み込まれる。)により記載されるように、CDR構造を調整し得、抗原への適合を細かく調整し得るフレームワーク残基のサブセットを指す。バーニアゾーン残基は、CDRの基礎をなす層を形成し、CDRの構造及び抗体の親和性に影響を及ぼし得る。

0126

RGMのその受容体の1つへの「結合の阻害」という用語は、本明細書中で使用される場合、この受容体結合活性の、部分的(例えば、約20%、40%、60%、80%、85%、90%、95%以上)又は完全な低下を包含する。この「結合の阻害」は、当技術分野で利用可能な何らかの適切な方法により、好ましくは、例えばELISAに基づく結合アッセイなど、本明細書中で例示されるような何らかの方法により、決定され得る。

0127

本明細書中で使用される場合、「中和」という用語は、結合タンパク質が標的タンパク質に特異的に結合するときの、標的タンパク質の生物活性の中和を指す。中和することは、この結合タンパク質の標的への結合の様々な手段の結果であり得る。例えば、中和することは、標的分子への受容体結合に影響を与えない標的の領域における結合タンパク質の結合により引き起こされ得る。あるいは、結合タンパク質の結合の結果、標的への受容体結合が阻止され得、この阻止により最終的に標的タンパク質活性が中和される。この様々な機能のそれぞれは、本発明に従い起こり得る。好ましくは、中和結合タンパク質は、hRGMAへのその結合の結果、hRGM Aの生物活性が中和される中和抗体である。好ましくは、中和結合タンパク質は、hRGM Aに結合し、少なくとも約20%、40%、60%、80%、85%以上、hRGM Aの活性を生物学的に低下させる。当技術分野で周知のhRGM A生物活性の1以上の指標を測定することにより、中和結合タンパク質によるhRGM Aの生物活性の中和を評価することができる。例えば、hRGM Aの中和により、Ntera神経伸長アッセイにおいて阻害が逆転される(下記実施例3参照)。Ntera神経突起成長アッセイは、神経突起伸長の阻害を扱うものである。阻害性RGM Aタンパク質又は断片の非存在下及び伸長刺激基質ラミニンの存在下で、ニューロンNTera凝集は、伸長する神経突起の大規模で密集したネットワークを示す。RGM A又はRGM A断片は神経突起伸長を阻害し、その結果、神経突起が短くなり、その数が減少する。機能阻止RGM Aアンタゴニスト又はMAB(MAB 5F9など)は、分化したヒトNTeraニューロンの凝集体による神経突起成長アッセイにおいてヒトRGM Aタンパク質の強力なfc−結合hRGM A軽鎖断片(アミノ酸47−168)の神経突起伸長阻害活性を中和し、その結果、神経突起が長くなり、その数が顕著に増加した。

0128

「中和モノクローナル抗体」とは、本明細書中で使用される場合、その特異的抗原への結合がこの抗原に対する天然リガンドの結合と競合し、これを阻害し得る、抗体分子の調製物を指すものとする。本願の特定の実施形態において、本発明の中和抗体は、ネオゲニンに対する及び/又はBMP−2及び/又はBMP−4に対する結合に対してRGMAと競合し得、RGM A生物活性又は機能を妨害し得る。特に、本発明の中和抗体は、RGM Aと結合し、ネオゲニンへ及び/又はBMP−2及び/又はBMP−4に対する結合を妨害し、RGM A生物活性又は機能を妨害し得る。「活性」という用語には、抗原に対する抗体の結合特異性/親和性(例えばRGM A抗原に結合する抗hRGM A抗体)及び/又は、抗体の中和能(例えば、RGM Aに対するその結合がhRGM Aの生物活性を阻害する抗hRGM A抗体(例えば下記実験セクションに記載のようなhRGM A-ネオゲニン結合アッセイ、hRGM A−BMP−2結合アッセイ又はhRGM A−BMP−4結合アッセイで測定される場合))などの活性が含まれる。

0129

RGMAの生物活性は、細胞移動を制御することとも言われ得る。細胞移動の具体例は神経突起成長であり、これはRGM Aタンパク質により妨害されるか又は阻害される。さらに、RGMタンパク質は、BMP−タンパク質の活性を調節することが示されている。本明細書中で、公開されている例は、片側でBMP−経路におけるRGMタンパク質の相乗増強活性及びBMP−経路におけるRGMタンパク質の阻害活性(これは、鉄代謝、骨及び軟骨再生の制御に対して、及び再ミエリン形成及び再生のためにCNSにおいて重要である。)を記載している。

0130

「エピトープ」又は「抗原決定基」という用語は、免疫グロブリン又はT細胞受容体と特異的に結合することができる何らかのポリペプチド決定基を含む。ある種の実施形態において、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面基群を含み、ある種の実施形態においては、特定の3次元構造的特徴及び/又は特定の電荷的特徴を有し得る。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。ある種の実施形態において、抗体は、タンパク質及び/又は巨大分子の複雑な混合物中でその標的抗原を選択的に認識した際に抗原に特異的に結合すると言われる。

0131

「表面プラズモン共鳴」という用語は、本明細書中で使用される場合、例えばBIAcoreシステムを用いた、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度における変化の検出により、リアルタイム生体特異的相互作用分析を可能にする光学現象を指す(Pharmacia Biosensor AB、Uppsala、Sweden及びPiscataway、NJ)。さらなる説明については、Jonsson、U.ら(1993)Ann.Biol.Clin.51:19−26;Jonsson、U.ら(1991)Biotechniques 11:620−627;Johnsson、B.ら(1995)J.Mol.Recognit.8:125−131;及びJohnnson、B.ら(1991)Anal.Biochem.198:268−277)を参照。

0132

「kon」という用語は、本明細書中で使用される場合、当技術分野において公知であるような抗体/抗原複合体を形成するための抗原への抗体の会合に対する会合速度定数を指すものとする。

0133

「koff」という用語は、本明細書中で使用される場合、当技術分野で公知であるような抗体/抗原複合体由来の抗体の解離に対する解離速度定数を指すものとする。

0134

「Kd」という用語は、本明細書中で使用される場合、当技術分野において公知であるような特定の抗体抗原相互作用の解離定数を指すものとする。

0135

「標識された結合タンパク質」という用語は、本明細書中で使用される場合、結合タンパク質の同定を可能にする標識が取り込まれたタンパク質を指す。好ましくは、標識は、検出可能なマーカーであり、例えば、放射性標識されたアミノ酸の取り込み又は目印を付したアビジン(例えば、光学的又は比色分析法によって検出することができる、蛍光マーカー又は酵素活性を含有するストレプトアビジン)によって検出することができるビオチン部分のポリペプチドへの連結である。ポリペプチドに対する標識の例には、以下に限定されないが、次のもの:放射性同位体又は放射性核種(例えば、3H、14C、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I、177Lu、166Ho又は153Sm);蛍光標識(例えば、FITCローダミンランタニド蛍光体);酵素標識(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼルシフェラーゼアルカリホスファターゼ);化学発光マーカー;ビオチニル基;二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位金属結合ドメインエピトープタグ);及びガドリニウムキレート剤などの磁性試薬(magnetic agent)が含まれる。

0136

「抗体複合体」という用語は、第二の化学部分(治療薬又は細胞毒性剤など)に化学的に連結される、抗体などの結合タンパク質を指す。本明細書中で、「作用物質(agent)」という用語は、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生体高分子又は生物物質から調製される抽出物を表すために使用される。好ましくは、治療薬又は細胞毒性剤には、以下に限定されないが、百日咳毒素タキソールサイトカラシンBグラミシジンD、臭化エチジウムエメチンマイトマイシンエトポシド、テノポシド、ビンクリスチンビンブラスチンコルヒチンドキソルビシンダウノルビシンジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロンミトラマイシンアクチノマイシンD、1−デヒドロテストステロングルココルチコイドプロカインテトラカインリドカインプロプラノロール及びピューロマイシン及びこれらの類似体又はホモログが含まれる。

0137

「結晶」及び「結晶化された」という用語は、本明細書中で使用される場合、結晶の形態で存在する抗体又はその抗原結合部分を指す。結晶は、物質の固体状態の一形態であり、これは、非晶質の固体状態又は液晶状態などの他の形態とは異なる。結晶は、原子イオン、分子(例えば、抗体などのタンパク質)又は分子集合体(例えば、抗原/抗体複合体)の規則的な反復三次元配列から構成される。これらの三次元配列は、当技術分野においてよく理解されている特異的な数学的関係に従って配列される。結晶中で反復される基礎的単位又は構築ブロックは非対称単位と呼ばれる。所定の十分に整えられた結晶学対称性合致する配置での非対称単位の反復により、結晶の「単位格子」がもたらされる。全ての三次元中での規則的な並進による単位格子の反復により結晶がもたらされる。Giege、R.及びDucruix、A.Barrett、Crystallization of Nucleic Acidsand Proteins、a Practical Approach、第2版、pp.20 1−16、Oxford University Press、New York、New York(1999)を参照。

0138

本明細書中で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、2以上のヌクレオチド(リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドの何れか又はヌクレオチドの何れかの型の修飾形態)のポリマー形態を意味する。この用語は、DNAの1本鎖及び2本鎖形態を含むが、好ましくは2本鎖DNAである。

0139

本明細書中で使用される場合、「単離ポリヌクレオチド」という用語は、その起源ゆえに、「単離ポリヌクレオチド」が、その「単離ポリヌクレオチド」が本来ともに見出されるポリヌクレオチドの全部又は一部と会合していないか;天然にはそれが連結されないポリヌクレオチドに操作可能に連結されているか;又はより大きな配列の一部として天然には存在しない、(例えば、ゲノム、cDNAもしくは合成起源又はこれらのいくつかの組み合わせの)ポリヌクレオチドを意味する。

0140

本明細書中で使用される場合、「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すものとする。ベクターのある種類は「プラスミド」であり、これは、さらなるDNAセグメントが結合され得る環状2本鎖DNAループを指す。ベクターの別の種類はウイルスベクターであり、この場合、さらなるDNAセグメントがウイルスゲノムに結合され得る。ある種のベクターは、それらが導入される宿主細胞中で自己複製可能である(例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター)。その他のベクター(例えば非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞中に導入されると宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、これにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは、それらが操作可能に連結される遺伝子の発現を誘導することが可能である。このようなベクターは、本明細書中で、「組み換え発現ベクター」(又は単に「発現ベクター」)と呼ばれる。一般に、組み換えDNA技術において有用な発現ベクターは、プラスミド形態であることが多い。プラスミドは最も一般的に使用されるベクター形態であるので、本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」は交換可能に使用され得る。しかし、本発明は、同等の機能を果たす、ウイルスベクター(例えば、複製欠損レトロウイルスアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス)などの発現ベクターのこのようなその他の形態を含むものとする。

0141

「操作可能に連結された」という用語は、記載された成分が、その意図する様式でそれらを機能させることができる関係にある併置状態を指す。コード配列に対して「操作可能に連結された」調節配列は、調節配列と適合する条件下で、コード配列の発現が達成されるように結合される。「操作可能に連結された」配列は、関心のある遺伝子と連続する発現調節配列及び関心のある遺伝子を調節するように、トランスで又は離れて作用する発現調節配列の両方を含む。「発現調節配列」という用語は、本明細書中で使用される場合、それらが結合されるコード配列の発現及びプロセシングに影響を与えるために必要であるポリヌクレオチド配列を指す。発現調節配列には、適切な転写開始終結プロモーター及びエンハンサー配列;スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的なRNAプロセシングシグナル;細胞質mRNAを安定化させる配列;翻訳効率を向上させる配列(即ちKozakコンセンサス配列);タンパク質の安定性を向上させる配列;及び必要に応じて、タンパク質分泌を促進する配列が含まれる。このような調節配列の性質宿主生物によって異なり、原核生物では、このような調節配列には一般に、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列が含まれ、真核生物では、一般に、このような調節配列には、プロモーター及び転写終結配列が含まれ得る。「調節配列」という用語は、その存在が発現及びプロセシングに必須である成分を含むものとし、その存在が有利であるさらなる成分、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列も含み得る。

0142

「形質転換」とは、本明細書中で定義される場合、外来DNAが宿主細胞に入る何らかのプロセスを指す。形質転換は、当技術分野で周知の様々な方法を用いて、天然又は人工の条件下で起こり得る。形質転換は、原核又は真核宿主細胞外来核酸配列を挿入するための何らかの公知の方法に依存し得る。本方法は、形質転換されている宿主細胞に基づいて選択され、この方法には、以下に限定されないが、ウイルス感染エレクトロポレーションリポフェション及び粒子衝突が含まれ得る。このような「形質転換された」細胞には、挿入されたDNAが自己複製するプラスミドとして又は宿主染色体の一部としての何れかで複製することができる、安定して形質転換された細胞が含まれる。これらには、挿入されたDNA又はRNAを、限られた時間、一過性発現する細胞も含まれる。

0143

組み換え宿主細胞」(又は単に「宿主細胞」)という用語は、本明細書中で使用される場合、外来DNAが導入されている細胞を指すものとする。このような用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、このような細胞の子孫も指すことを理解されたい。突然変異又は環境的な影響の何れかのために、後続の世代中にある種の修飾が生じ得るので、このような子孫は、実際には親細胞と同一でないことがあり得るが、本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」という用語の範囲内になお含まれる。好ましくは、宿主細胞には、生物の何れかの界から選択される原核及び真核細胞が含まれる。好ましい真核細胞には、原生生物、真菌、植物及び動物細胞が含まれる。最も好ましくは、宿主細胞には、以下に限定されないが、原核細胞株E.コリ;哺乳動物細胞株CHO、HEK293及びCOS;昆虫細胞株Sf9及び真菌細胞サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)が含まれる。

0144

組み換えDNA、オリゴヌクレオチド合成及び組織培養及び形質転換(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション)に対して標準的技術が使用され得る。酵素反応及び精製技術は、製造者の仕様書に従って、又は当技術分野で一般に遂行されるように、又は本明細書中に記載のように、実施され得る。一般に、先述の技術及び手順は、当技術分野で周知の従来の方法に従い、及び本明細書を通じて引用及び考察される様々な一般的及び具体的な参考文献中に記載のように、実施され得る。例えば、「Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.(1989))」(参照によりあらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。)を参照のこと。

0145

当技術分野において公知であるように、及び本明細書において使用する場合、「トランスジェニック生物」とは、トランス遺伝子を含有する細胞を有する生物を指し、この場合、生物(又は生物の子孫)中に導入されたトランス遺伝子は、その生物中で天然には発現されないポリペプチドを発現する。「トランス遺伝子」とは、トランスジェニック生物の1以上の細胞種又は組織において、コードされた遺伝子産物の発現を支配する、トランスジェニック生物が発生する細胞のゲノム中に安定して及び操作可能に組み込まれるDNAコンストラクトである。

0146

「制御する」又は「調節する」という用語は交換可能に使用され、本明細書中で使用される場合、関心のある分子の活性(例えばhRGMAの生物活性)の変化又は変更を指す。調節は、関心のある分子のある種の活性又は機能の強さの向上又は低下であり得る。分子の典型的な活性及び機能には、以下に限定されないが、結合特性、酵素活性、細胞受容体活性化及びシグナル伝達が含まれる。

0147

同様に、「調節物質」という用語は、本明細書中で使用される場合、関心のある分子の活性又は機能(例えば、hRGMAの生物活性)を変化又は変更させることが可能な化合物である。例えば、調節物質は、調節物質の非存在下で観察される活性又は機能の強さと比較して、分子のある種の活性又は機能の強さを向上又は低下させ得る。本明細書中で使用される場合、「アゴニスト」という用語は、関心のある分子と接触した際に、アゴニストの非存在下で観察される活性又は機能の強さと比較して、分子のある種の活性又は機能の強さを向上させる調節物質を指す。関心のある特定のアゴニストには、以下に限定されないが、hRGM Aポリペプチド又は、hRGM Aに結合する、ポリペプチド、核酸、炭水化物もしくは何らかのその他の分子が含まれ得る。「アンタゴニスト」という用語は、本明細書中で使用される場合、関心のある分子と接触した場合に、アンタゴニスト非存在下で観察される活性又は機能の強さと比較して、分子のある種の活性又は機能の強さを低下させる調節物質を指す。代表的アンタゴニストには、以下に限定されないが、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディ、炭水化物又は低分子の有機分子が含まれる。ペプチボディは例えばWO01/83525に記載されている。

0148

関心のある特定のアンタゴニストには、hRGMAの生物活性又は免疫学的活性を阻止又は調節するものが含まれる。hRGM Aのアンタゴニストには、以下に限定されないが、RGM A分子と相互作用するモノクローナル抗体のような、hRGM Aに結合する、タンパク質、核酸、炭水化物又は何らかのその他の分子が含まれ得る。RGM Aとの相互作用の結果、その他のリガンド/細胞膜成分の結合及び中和が起こり得、複数の疾患に対する相加的又は相乗的機能に対して有用であり得ることに注意されたい。

0149

本明細書中で使用される場合、「有効量」という用語は、疾患又はその1以上の症候の、重症度及び/又は持続時間を低下(短縮)させるか又は改善するか、疾患の進行を予防するか、疾患の軽減を引き起こすか、疾患に付随する1以上の症候の再発、発現、発症もしくは進行を予防するか、疾患を検出するか、又は別の治療薬(例えば予防薬又は治療薬)の予防的もしくは治療的効果を促進もしくは向上させるのに十分である治療薬の量を指す。

0150

試料」という用語は、本明細書中で使用される場合、その最も広い意味で使用される。「生体試料」とは、本明細書中で使用される場合、以下に限定されないが、生物由来の又は死亡した生物由来の物質のあらゆる量が含まれる。このような生物には、以下に限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サルイヌウサギ及びその他の動物が含まれる。このような物質には、以下に限定されないが、血液、血清、尿、滑液、細胞、器官、組織、骨髄リンパ節及び脾臓が含まれる。

0151

2.hRGMAに結合するポリペプチド
本願の主要な実施形態は、RGM Aタンパク質の少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する単離タンパク質又はポリペプチドを含む。RGM Aタンパク質の少なくとも1つのエピトープに特異的に結合する単離タンパク質又はポリペプチドは、RGM Aの受容体ネオゲニンに対する及び/又は骨形成タンパク質2及び4(BMP−2、BMP−4)に対するRGM Aの結合を阻害し得る。

0152

本願の最も好ましい実施形態は、RGMA又はその抗原結合部分もしくは断片に結合する抗体を含む。

0153

好ましくは、本発明の抗RGMA抗体は、例えば、当技術分野で公知であるか又は以下に記載のいくつかのインビトロ及びインビボアッセイの何れか1つにより評価した場合、RGM A活性を低下させるか又は中和する高い能力を示す。

0154

本願は、最も好ましくは、RGMAの受容体、ネオゲニンへの及び骨形成タンパク質2及び4(BMP−2、BMP−4)へのRGM Aの結合を選択的に妨害する、RGM Aに対する中和モノクローナル抗体及び、RGM Aのその共受容体、骨形成タンパク質2及び4(BMP−2、BMP−4)への結合を選択的に妨害する、RGM Aに対する中和モノクローナル抗体の作製を含む。

0155

好ましくは、本願のモノクローナル中和抗体は、ヒト抗体又はヒト化抗体である。「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に対応するか又はそれ由来の、可変及び定常領域を有する抗体を指す(例えば、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、U.S.Department of Health and Human Services、NIH Publication No.91−3242、1991参照)。しかし、本願のヒト抗体は、例えばCDRにおける、及び特にCDR3における、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基(例えば、インビトロでの無作為又は部位特異的突然変異誘発により又はインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異)を含み得る。

0156

様々な実施形態において、本抗体は組み換え抗体又はモノクローナル抗体である。本願の最も好ましい中和抗体は、本明細書中で、mAb5F9及びmAb8D1及びその機能的抗体断片を指し、解離速度が低く、中和能が高いRGMAへの高親和性結合など、mAb5F9及びmAb8D1と同等の特性を有するその他の抗体及び機能的抗体断片は、本発明の一部をなすものであるとする。免疫原性RGM Aポリペプチド又はその断片に対する本願の抗RGM A抗体の結合親和性及び解離速度は、当技術分野で公知の何らかの方法により決定され得る。例えば、結合親和性は、競合的ELISA、cRIA、BIAcore又はKinExA技術により測定することができる。解離速度もまた、BIAcore又はKinExA技術により測定することができる。結合親和性及び解離速度は、例えばBIAcoreを用いて表面プラズモン共鳴により測定される。

0157

本願の好ましいモノクローナル抗体の1つであるmAb5F9抗体は、配列番号9又は34の配列を含む重鎖可変領域(VH領域)及び配列番号10の配列を含む軽鎖可変領域(VL領域)を含む配列と、少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有する。

0158

本願のRGMAと相互作用する単離モノクローナル抗体が、抗体又はその抗原結合部分に1以上の炭水化物残基が含まれるグリコシル化結合タンパク質であり得ることも意図される。新生インビボタンパク質産生は、翻訳後修飾として知られるさらなるプロセシングを受け得る。特に、糖(グリコシル)残基を酵素により添加し得る(グリコシル化として知られるプロセス)。共有結合されるオリゴ糖側鎖を有する、結果として得られるタンパク質は、グリコシル化タンパク質又は糖タンパク質として知られる。タンパク質グリコシル化は、関心のあるタンパク質のアミノ酸配列ならびにそのタンパク質が発現される宿主細胞に依存する。生物によって産生されるグリコシル化酵素が異なり得(例えば、グリコシルトランスフェラーゼ及びグリコシダーゼ)、利用可能な基質が異なり得る(ヌクレオチド糖)。このような因子のために、タンパク質グリコシル化パターン及びグリコシル残基組成は、特定のタンパク質が発現される宿主系によって異なり得る。本発明において有用なグリコシル残基には、以下に限定されないが、グルコースガラクトースマンノースフコース、n−アセチルグルコサミン及びシアル酸が含まれ得る。好ましくはグリコシル化結合タンパク質は、グリコシル化パターンがヒトとなるようにグリコシル残基を含む。

0159

本願の抗体は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM、IgY又はIgD定常領域などの重鎖定常領域を含む。さらに、本抗体は、軽鎖定常領域、κ軽鎖定常領域又はλ軽鎖定常領域の何れかを含み得る。好ましくは、本抗体はκ軽鎖定常領域を含む。あるいは、抗体部分は、例えば、Fab断片又は1本鎖Fv断片であり得る。抗体エフェクターの機能を変化させるためのFc部分におけるアミノ酸残基の置換は当技術分野で公知である(Winterら、米国特許第5,648,260号及び同第5,624,821号)。抗体のFc部分は、例えば、抗体及び抗原−抗体複合体の、サイトカイン誘導、ADCC食作用補体依存性細胞傷害(CDC)及び半減期/クリアランス速度などのいくつかの重要なエフェクターの機能を媒介する。場合によっては、これらのエフェクターの機能は、治療用抗体に対して好ましいが、その他の場合において、治療目的によっては、不要であり得るか又は有害でもあり得る。ある種のヒトIgGアイソタイプ、特にIgG1及びIgG3は、それぞれFcγR及び補体C1qへの結合を介してADCC及びCDCを媒介する。新生児Fc受容体(FcRn)は、抗体の循環半減期を決定する重要な要素である。さらに別の実施形態において、抗体のエフェクターの機能が変化するように、抗体の定常領域、例えば抗体のFc領域において、少なくとも1つのアミノ酸残基が置換される。

0160

3.抗hRGMA抗体の作製
3.1.一般原理
本願の抗体は、適切な宿主(例えば、ヒト、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、爬虫類魚類両生類を含む脊椎動物において及び鳥類、爬虫類及び魚類のにおいて)の免疫付与により作製され得る。本願の抗体を作製するために、本発明の免疫原性RGM Aポリペプチド又はその断片で宿主に免疫付与する。「免疫付与」という用語は、本明細書中で、免疫レパートリーが、天然の遺伝子改変されていない生物又はトランスジェニック生物(人工的人免疫レパートリーを提示するように修飾されたものを含む。)に存在するか否かにかかわらず、免疫レパートリーに対して抗原を提示するプロセスを指す。同様に、「免疫原性調製物」は、アジュバント又は抗原の免疫原性を促進するその他の添加物を含有する抗原の処方物である。

0161

当技術分野で公知の何らかの方法により、動物の免疫付与を行い得る。例えば、Harlow及びLane、Antibodies:A Laboratory Manual、New York:Cold Spring Harbor Press、1990参照。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ及びウマなどの非ヒト動物を免疫付与するための方法は当技術分野で周知である。例えば、Harlow及びLane及び米国特許第5,994,619号参照。好ましい実施形態において、免疫反応を刺激するために、RGMA抗原はアジュバントとともに投与される。このようなアジュバントには、完全又は不完全フロイントアジュバントRIBI(ムラミルジペプチド)又はISCOM(免疫刺激性複合体)が含まれる。このようなアジュバントは、局所沈着するようにポリペプチドを封鎖することによって急速にポリペプチドが分散しないようにし得るか又は、これらは、マクロファージ及び免疫系のその他の成分に対して化学走性がある因子を分泌させるために宿主を刺激する物質を含有し得る。好ましくは、ポリペプチドが投与されている場合、免疫付与スケジュールには、数週間にわたる2回以上のポリペプチドの投与が含まれる。

0162

動物宿主は、無傷細胞又は破壊細胞細胞膜と会合している抗原で免疫付与され、本願の抗体は、本発明の免疫原性ポリペプチドへの結合により同定されることが企図される。抗原での動物宿主の免疫付与後、動物から抗体が得られ得る。採血するか又は動物を屠殺することにより、動物から抗体含有血清が得られる。この血清は動物から得られた状態のままで使用され得るか、又は免疫グロブリン分画が血清から回収され得るか、又は抗体が血清から精製され得る。このようにして得られた血清又は免疫グロブリンはポリクローナルであり、従って、異なる一連の特性を有する。

0163

3.2ハイブリドーマ技術を用いた抗RGMAモノクローナル抗体
ハイブリドーマ、組み換え及びファージディスプレイ技術又はそれらの組み合わせの使用を含む当技術分野で公知の多岐にわたる技術を用いて、モノクローナル抗体を調製し得る。例えば、当技術分野で公知であり、例えば、Harlowら、Antibodies:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、1988);Hammerlingら、Monoclonal Antibodies and T−Cell Hybridomas 563−681(Elsevier、N.Y.1981)(これらの参考文献は、それらの全体において参照により組み込まれる。)で教示されるものを含むハイブリドーマ技術を用いて、モノクローナル抗体を作製し得る。「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書中で使用される場合、ハイブリドーマ技術を通じて作製される抗体に限定されない。「モノクローナル抗体」という用語は、何らかの真核、原核又はファージクローンを含む単一クローン由来の抗体を指し、それが作製される方法ではない。

0164

ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を作製し、これについてスクリーニングするための方法は通常のものであり当技術分野で周知である。ある実施形態において、本発明は、モノクローナル抗体を作製する方法ならびに、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含む方法により産生される抗体を提供するが、この場合、好ましくはハイブリドーマは、本発明の抗原で免疫付与されたマウスから単離された脾臓細胞骨髄腫細胞と融合させ、次いで本発明のポリペプチドに結合可能である抗体を分泌するハイブリドーマクローンに対する融合の結果得られるハイブリドーマをスクリーニングすることにより作製される。簡潔に述べると、RGMA抗原によりマウスに免疫付与することができる。好ましい実施形態において、免疫反応を刺激するために、抗原はアジュバントとともに投与される。このようなアジュバントには、フロイントの完全又は不完全アジュバント、RIBI(ムラミルジペプチド)又はISCOM(免疫刺激性複合体)が含まれる。このようなアジュバントは、局所沈着するようにポリペプチドを封鎖することによって急速にポリペプチドが分散しないようにし得るか、又は、これらは、マクロファージ及び免疫系のその他の成分に対して化学走性がある因子を分泌させるために宿主を刺激する物質を含有し得る。好ましくは、ポリペプチドが投与されている場合、免疫付与スケジュールには、数週間にわたる2回以上のポリペプチドの投与が含まれる。

0165

免疫反応が検出されたら、例えば、マウス血清中で抗原RGMAに対する特異的な抗体が検出されたら、マウス脾臓を摘出し、脾臓細胞を単離する。次に、脾臓細胞を周知の技術により何らかの適切な骨髄腫細胞(例えばATCCから入手可能な細胞株SP20由来の細胞)に融合させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈法によりクローニングする。次に、RGM Aに結合可能である抗体を分泌する細胞について、当技術分野で公知の方法によりハイブリドーマクローンをアッセイする。陽性ハイブリドーマクローンを用いてマウスに免疫付与することによって、通常高レベルの抗体を含有する腹水を産生させ得る。

0166

別の実施形態において、免疫付与動物から、抗体産生不死化ハイブリドーマを調製し得る。免疫付与後、動物を屠殺し、当技術分野で周知であるように脾臓B細胞を不死化骨髄腫細胞に融合させる。例えば、Harlow及びLane、上出参照。好ましい実施形態において、骨髄腫細胞は免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない(非分泌細胞株)。融合及び抗生物質選択後、RGMA又はその一部又はRGM Aを発現する細胞を用いて、ハイブリドーマをスクリーニングする。好ましい実施形態において、最初のスクリーニングは、酵素連結免疫アッセイ(ELISA)又は放射性免疫アッセイ(RIA)(好ましくはELISA)を用いて行う。ELISAスクリーニングの例は、WO00/37504(参照により本明細書中に組み込まれる。)で提供される。

0167

下記でさらに考察するように、抗RGMA抗体産生ハイブリドーマを選択し、クローニングし、さらに、ロバストなハイブリドーマ増殖、高抗体産生及び所望の抗体特性を含む所望の特徴についてスクリーニングする。ハイブリドーマを培養し、インビボで同系動物において、免疫系欠損動物(例えばヌードマウス)において、又はインビトロで細胞培養において、増殖させ得る。ハイブリドーマを選択し、クローニングし、増殖させる方法は当業者にとって周知である。

0168

好ましい実施形態において、上述のように、ハイブリドーマはマウスハイブリドーマである。別の好ましい実施形態において、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ又はウマなどの、非ヒト、非マウス種で産生される。別の実施形態において、ハイブリドーマは、ヒト非分泌性骨髄腫が抗RGMA抗体を発現するヒト細胞と融合させられているヒトハイブリドーマである。

0169

特異的エピトープを認識する抗体断片を公知の技術により作製し得る。例えば、(Fab断片を作製するための)パパイン又は(F(ab’)2断片を作製するための)ペプシンなどの酵素を用いて、免疫グロブリン分子のタンパク質分解性切断によって、本発明のFab及びF(ab’)2断片を作製し得る。F(ab’)2断片は、可変領域、軽鎖定常領域及び重鎖のCH1ドメインを含有する。

0170

3.3SLAMを用いた抗RGMAモノクローナル抗体
本発明の別の態様において、米国特許第5,627,052号、PCT公開WO92/02551及びBabcock、J.S.ら(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:7843−7848に記載のような、当技術分野で選択的リンパ球抗体法(Selected lymphocyte antibody method、(SLAM))と呼ばれる手順を用いて、単一の単離リンパ球から組み換え抗体を作製する。この方法において、抗原特異的溶血プラークアッセイを用いて、関心のある抗体を分泌する単一細胞(例えば上述の免疫付与動物の何れか1つ由来のリンパ球)をスクリーニンするが、ここで、抗原RGM A、RGM Aのサブユニット又はその断片は、ビオチンなどのリンカーを用いてヒツジ赤血球細胞に連結されており、RGM Aに対する特異性を有する抗体を分泌する単一の細胞を同定するために使用される。関心のある抗体分泌細胞の同定後、逆転写酵素PCRにより重鎖及び軽鎖可変領域cDNAを細胞から取り出し、次いで、COS又はCHO細胞などの哺乳動物宿主細胞において、適切な免疫グロブリン定常領域(例えばヒト定常領域)の下で、これらの可変領域を発現させることができる。次に、例えばRGM Aに対する抗体を発現する細胞を単離するために遺伝子移入された細胞を選び出すことにより、インビボ選択リンパ球由来の増幅された免疫グロブリン配列を遺伝子移入された宿主細胞をインビトロでさらに分析及び選択することができる。PCT公開WO97/29131及びPCT公開WO00/56772に記載のものなどのインビトロ親和性成熟法などによって、増幅された免疫グロブリン配列をインビトロでさらに操作することができる。

0171

3.4トランスジェニック動物を用いた抗RGMAモノクローナル抗体
本発明の別の実施形態において、RGM A抗原でヒト免疫グロブリン遺伝子座のいくつか又は全てを含む非ヒト動物に免疫付与することによって抗体を作製する。好ましい実施形態において、非ヒト動物は、XENOMOUSEトランスジェニックマウス、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きな断片を含み、マウス抗体産生欠損である、改変マウス系列である。例えば、Greenら、Nature Genetics 7:13−21(1994)及び米国特許第5,916,771号、同第5,939,598号、同第5,985,615号、同第5,998,209号、同第6,075,181号、同第6,091,001号、同第6,114,598号及び同第6,130,364号を参照。また、WO91/10741(1991年7月25日公開)、WO94/02602(1994年2月3日公開)、WO96/34096及びWO96/33735(両方とも1996年10月31日公開)、WO98/16654(1998年4月23日公開)、WO98/24893(1998年6月11日公開)、WO98/50433(1998年11月12日公開)、WO99/45031(1999年9月10日公開)、WO99/53049(1999年10月21日公開)、WO00/09560(2000年2月24日公開)及びWO00/037504(2000年6月29日公開)も参照。XENOMOUSEトランスジェニックマウスは、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原−特異的ヒトMabを産生する。XENOMOUSEトランスジェニックマウスは、ヒト重鎖遺伝子座及びx軽鎖遺伝子座の、メガベースの大きさの生殖細胞系列構造YAC断片の導入を通じて、ヒト抗体レパートリーのおよそ80%を含有する。Mendezら、Nature Genetics 15:146−156(1997)、Green及びJakobovits J.Exp.Med.188:483−495(1998)を参照(これらの開示は、参照により本明細書中に組み込まれる。)。

0172

3.5組み換え抗体ライブラリを用いた抗RGMAモノクローナル抗体
本発明の抗体を作製するために、インビトロ法を使用することもでき、この場合、所望の結合特異性を有する抗体を同定するために、抗体ライブラリをスクリーニングする。組み換え抗体ライブラリのこのようなスクリーニングのための方法は、当技術分野で周知であり、これには、例えば、Ladnerら、米国特許第5,223,409号;Kangら、PCT公開WO92/18619;Dowerら、PCT公開WO91/17271;Winterら、PCT公開WO92/20791;Marklandら、PCT公開WO92/15679;Breitlingら、PCT公開WO93/01288;McCaffertyら、PCT公開WO92/01047;Garrardら、PCT公開WO92/09690;Fuchsら(1991)、Bio/Technology 9:1370−1372;Hayら(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81−85;Huseら(1989)、Science 246:1275−1281;McCaffertyら、Nature(1990)348:552−554;Griffithsら(1993)EMBO J 12:725−734;Hawkinsら(1992)J Mol Biol 226:889−896;Clacksonら(1991)Nature 352:624−628;Gramら(1992)PNAS 89:3576−3580;Garradら(1991)Bio/Technology 9:1373−1377;Hoogenboomら(1991)Nuc Acid Res 19:4133−4137;及びBarbasら(1991)PNAS 88:7978−7982、米国出願公開第20030186374及びPCT公開WO97/29131(これらのそれぞれの内容は参照により本明細書中に組み込まれる。)に記載の方法が含まれる。

0173

組み換え抗体ライブラリは、RGMA又はRGM Aの一部で免疫付与された対象由来であり得る。あるいは、組み換え抗体ライブラリは、未処理の対象、即ちRGM Aで免疫付与されていない対象由来であり得、例えば、ヒトRGM Aで免疫付与されていないヒト対象からのヒト抗体ライブラリなどである。ヒトRGM Aを含むペプチドを用いて組み換え抗体ライブラリをスクリーニングし、それによりRGM Aを認識する抗体を選択することによって、本発明の抗体を選択する。このようなスクリーニング及び選択を行うための方法は、先行する段落における参考文献に記載のものなど、当技術分野で周知である。特定のkoff速度定数でヒトRGM Aから解離するものなど、RGM Aに対する特定の結合親和性を有する本発明の抗体を選択するために、表面プラズモン共鳴の当技術分野で公知の方法を使用して、所望のkoff速度定数を有する抗体を選択することができる。特定のIC50を有するものなど、RGM Aに対する特定の中和活性を有する本発明の抗体を選択するために、hRGM A活性の阻害を評価するための当技術分野で公知の標準的方法を使用し得る。

0174

ある態様において、本発明は、ヒトRGMAに結合する、単離抗体又はその抗原結合部分に関する。好ましくは、本抗体は中和抗体である。様々な実施形態において、本抗体は組み換え抗体又はモノクローナル抗体である。

0175

例えば、本発明の抗体はまた、当技術分野で公知の様々なファージディスプレイ法を用いて作製し得る。ファージディスプレイ法において、機能的抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を担うファージ粒子の表面で機能的抗体ドメインを提示する。特に、このようなファージは、レパートリー又はコンビナトリアル抗体ライブラリ(例えばヒト又はマウス)から発現される抗原結合ドメインを提示するために使用され得る。抗原により、例えば標識抗原又は固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉される抗原を用いて、関心のある抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージを選択するか又は同定することができる。これらの方法において使用されるファージは、通常、ファージ遺伝子III又は遺伝子VIIIタンパク質の何れかに組み換え融合される、Fab、Fv又はジスルフィド安定化Fv抗体ドメインとともにファージから発現されるfd及びM13結合ドメインを含む線状ファージである。本発明の抗体を作製するために使用することができるファージディスプレイ法の例には、Brinkmanら、J.Immunol.Methods182:41−50(1995);Amesら、J.Immunol.Methods 184:177−186(1995);Kettleboroughら、Eur.J.Immunol.24:952−958(1994);Persicら、Gene 187 9−18(1997);Burtonら、Advances in Immunology 57:191−280(1994);PCT/GB91/01134;PCT公開WO90/02809;WO91/10737;WO92/01047;WO92/18619;WO93/11236;WO95/15982;WO95/20401;及び米国特許第5,698,426号;同第5,223,409号;同第5,403,484号;同第5,580,717号;同第5,427,908号;同第5,750,753号;同第5,821,047号;同第5,571,698号;同第5,427,908;同第5,516,637号;同第5,780,225号;同第5,658,727号;同第5,733,743及び同第5,969,108号(これらはそれぞれ、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。)で開示されるのものが含まれる。

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