図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2020年1月16日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (1)

課題

解決手段

下式で表されるピロリシン類似体等。(X=O又はS;Y=CH2、NH、O又はS;Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;FG=アジドアルケンアルキンケトンエステルアリール又はシクロアルキン;a=1〜7の整数;ZがNH、O又はSであるとき、bが2〜7の整数である以外は、b=1〜7の整数であり、ただし、a+bは、2〜8の範囲であり;d=1〜4の整数)

概要

背景

ピロリンは、天然アミノ酸であり、アンバーコドンにより真正に指定される唯一アミノ酸である。ピロシリンは、21番目アミノアシル−tRNAシンテターゼ(PylRS)を利用するが、これは、自然に進化して、他の全てのアミノ酸及びtRNAに対して直交性になったものである。Blight et al.,2004は、PylRS及びその対応tRNA(tRNApyl)が、大腸菌(E.coli)のアンバーコドンにピロリシンを組み込むことができることを証明した。彼らはまた、wtPylRSが、天然では乱交雑性であり、リシン類似体を組み込み得ることも明らかにした。

Yokoyama et al.(欧州特許第1911840号明細書)は、PylRS/tRNApyl系が、真核細胞において直交性であることを立証し、細菌細胞のアンバーコドンによってコード化された標的タンパク質への複数の非天然アミノ酸(nnAA)の組み込みを明らかにした。これらの著者は、アミノ酸結合ポケットを形成し、かつ、他の規定アミノ酸に対してピロリシンを選択する上で機能する、pylRSの重要なアミノ酸も明らかにした。この部位での突然変異によって、tRNApylを認識し、AzZ−lysでアミノアシル化することができる突然変異体が作製された(Yanagisawa 2008)。

この直交性は、細菌及び真核細胞にまで広がる。

PylRSは、自然に進化してリシンを排除した、天然に乱交雑性のシンテターゼであるが、アジドアルキン及びアルケンなどのリシン類似体を突然変異なしで組み込み得る(Yanagisawa et al.,2008;Neumann et al.2008;Mukai et al.,2008;Nguyen et al.,2009)。この特異性の基準は、pylRS結合ポケットのアミノ酸残基と、シンテターゼの活性部位におけるアミノ酸を安定化し、かつ正しく配置するピロリシンのピロール環との疎水性相互作用に依存する(Kavran et al.,2007)。このRS/tRNAペアは、細菌、酵母及び哺乳動物細胞中に、一過性トランスフェクションによって導入されており、標的タンパク質へのいくつかの非天然アミノ酸の組み込みに有効であることがわかっている。

例えば、欧州特許第1911840号明細書は、大腸菌(E.coli)細胞における標的タンパク質へのN−ε−boc−リシンの組み込みを立証している。

ピロリシン類似体は、天然又は遺伝子的進化PylRSのいずれかによって認識されて、アンバーコドン部位でタンパク質に組み込まれるアミノ酸誘導体として定義されるが、これらは、過去数年にわたって開示されており、例えば、Fekner et al.(Fekner,Li&Chan,2010)及びLiu et al.により論述されている。PylRS−tRNApyl系を用いて、官能基又は翻訳後修飾担持する類似体がタンパク質に部位特異的に組み込まれている。いくつかの研究(例えば、Yanagisawa et al.を参照)は、N6置換基が、結合ポケットピロリシン内の芳香環である類似体を収容するために、PylRS酵素内の突然変異に注目した。他の者、例えば、Nguyen et al.(また、国際公開第2010/139948号パンフレット)、及びLi et al.(また、国際公開第2011/044255号パンフレット)は、嵩高のN6置換基を担持しないピロリシン類似体の同定に的を絞り、より単純な類似体の取得を達成し、これは、簡単に合成して、天然PylRS/tRNApylペアと相互作用させることができるであろう。さらに、Chin et al.は、銅触媒クリックケミストリー(CUAAC)によるタンパク質標識に使用しやすい末端アルキン及びアジド基を有する2つの類似体を開発した。

概要

生体共役反応プロセスに有用なピロリシン類似体の提供。下式で表されるピロリシン類似体等。(X=O又はS;Y=CH2、NH、O又はS;Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトンエステルアリール又はシクロアルキン;a=1〜7の整数;ZがNH、O又はSであるとき、bが2〜7の整数である以外は、b=1〜7の整数であり、ただし、a+bは、2〜8の範囲であり;d=1〜4の整数)なし

目的

本発明に記載するアミノ酸類似体は、新規かつ有用であり、しかも、タンパク質に容易に組み込まれる(典型的には、適切に使用されれば、生物活性損失なしに)と共に、生体共役反応に有用な手段を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

式X:(式中、X=O又はS;Y=CH2、NH、O又はS;Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;FG=アジドアルケンアルキンケトンエステルアリール又はシクロアルキン;a=1〜7の整数;ZがNH、O又はSであるとき、bが2〜7の整数である以外は、b=1〜7の整数であり、ただし、a+bは、2〜8の範囲であり;d=1〜4の整数)のピロリシン類似体

請求項2

式III:(式中、a、b、Y、Z、d及びFGは、請求項1に定義した通りである)のピロリシン類似体である、請求項1に記載のピロリシン類似体。

請求項3

以下:から選択される、請求項2に記載のピロリシン類似体。

請求項4

式IV:(式中、a、b、Y、Z、d及びFGは、請求項1に定義した通りである)のピロリシン類似体である、請求項1に記載のピロリシン類似体。

請求項5

以下:から選択される、請求項4に記載のピロリシン類似体。

請求項6

式I:(式中、Z=結合、CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O、S又はCH−NH2であり;aは、3〜7の整数であり;bは、0又は1〜7の整数であり;FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキンであるが;以下:aが4、ZがOを表すとき、−(CH2)b−FGは、−CH2−C≡CH、−CH2CH2−N3、−CH2−CH=CH2又は−CH2−Phではなく;aが4、ZがOを表すとき、−(CH2)b−FGは、−CH2CH2CH2−C(=O)CH3又は−CH2CH2CH2−CH=CH2ではなく;aが4、Zが結合、bが0を表すとき、−(CH2)b−FGは、−C(=O)Bn又は−C(=O)Meではなく;かつaが4、Zが結合を表すとき、−(CH2)b−FGは、−CH2CH2−C≡CHではないことを条件とする)のピロリシン類似体。

請求項7

aが3である、請求項6に記載のピロリシン類似体。

請求項8

aが4である、請求項6に記載のピロリシン類似体。

請求項9

ZがOである、請求項6〜8のいずれか一項に記載のピロリシン類似体。

請求項10

ZがNである、請求項6〜8のいずれか一項に記載のピロリシン類似体。

請求項11

Zが結合である、請求項6〜8のいずれか一項に記載のピロリシン類似体。

請求項12

以下:から選択される、請求項8に記載のピロリシン類似体。

請求項13

以下:から選択される、請求項7に記載のピロリシン類似体。

請求項14

式II:(式中、Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン;a=3又は5〜7の整数;及びb=1〜4の整数である)のピロリシン類似体。

請求項15

式V:(式中、R=20の天然アミノ酸のうちの1つの側鎖;Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン;a=1;及びb=1〜4の整数)のピロリシン類似体。

請求項16

以下:から選択される、請求項15に記載のピロリシン類似体。

請求項17

式VI:(式中、Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン;a=4又は5;及びb=1〜4の整数)のピロリシン類似体。

請求項18

以下:から選択される、請求項17に記載のピロリシン類似体。

請求項19

式VII:(式中、R=アルキルアルケニルシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル;a=1〜7の整数;及びb=1〜3の整数)のピロリシン類似体。

請求項20

以下:である、請求項19に記載のピロリシン類似体。

請求項21

式VIII:(式中、Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;R1=H、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル;R2=アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル;R3=H、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル;及びa=1)のピロリシン類似体。

請求項22

以下:から選択される、請求項21に記載のピロリシン類似体。

請求項23

非天然アミノ酸として、請求項1〜22のいずれか一項に記載の1つ又は複数のピロリシン類似体を含む突然変異体タンパク質

請求項24

非天然アミノ酸として、請求項1〜22のいずれか一項に記載の1つのピロリシン類似体を含む、請求項23に記載の突然変異体タンパク質。

請求項25

1つ又は複数の非天然アミノ酸を介して、タンパク質細胞傷害性薬剤、薬物及びポリマーから選択される1つ又は複数の部分に結合される、請求項23又は24に記載の突然変異体タンパク質。

請求項26

PEG部分に結合される、請求項25に記載の突然変異体タンパク質。

請求項27

抗体部分に結合される、請求項25に記載の突然変異体タンパク質。

請求項28

細胞傷害性薬剤に結合される、請求項25に記載の突然変異体タンパク質。

請求項29

薬物部分に結合される、請求項25に記載の突然変異体タンパク質。

請求項30

1つ又は複数の非天然アミノ酸を含む突然変異体タンパク質の製造における、請求項1〜22のいずれか一項に記載のピロリシン類似体の使用。

技術分野

0001

本発明は、生体共役反応(bioconjugation)方法に用いるためのアミノ酸誘導体に関する。

背景技術

0002

ピロリンは、天然アミノ酸であり、アンバーコドンにより真正に指定される唯一アミノ酸である。ピロシリンは、21番目アミノアシル−tRNAシンテターゼ(PylRS)を利用するが、これは、自然に進化して、他の全てのアミノ酸及びtRNAに対して直交性になったものである。Blight et al.,2004は、PylRS及びその対応tRNA(tRNApyl)が、大腸菌(E.coli)のアンバーコドンにピロリシンを組み込むことができることを証明した。彼らはまた、wtPylRSが、天然では乱交雑性であり、リシン類似体を組み込み得ることも明らかにした。

0003

Yokoyama et al.(欧州特許第1911840号明細書)は、PylRS/tRNApyl系が、真核細胞において直交性であることを立証し、細菌細胞のアンバーコドンによってコード化された標的タンパク質への複数の非天然アミノ酸(nnAA)の組み込みを明らかにした。これらの著者は、アミノ酸結合ポケットを形成し、かつ、他の規定アミノ酸に対してピロリシンを選択する上で機能する、pylRSの重要なアミノ酸も明らかにした。この部位での突然変異によって、tRNApylを認識し、AzZ−lysでアミノアシル化することができる突然変異体が作製された(Yanagisawa 2008)。

0004

この直交性は、細菌及び真核細胞にまで広がる。

0005

PylRSは、自然に進化してリシンを排除した、天然に乱交雑性のシンテターゼであるが、アジドアルキン及びアルケンなどのリシン類似体を突然変異なしで組み込み得る(Yanagisawa et al.,2008;Neumann et al.2008;Mukai et al.,2008;Nguyen et al.,2009)。この特異性の基準は、pylRS結合ポケットのアミノ酸残基と、シンテターゼの活性部位におけるアミノ酸を安定化し、かつ正しく配置するピロリシンのピロール環との疎水性相互作用に依存する(Kavran et al.,2007)。このRS/tRNAペアは、細菌、酵母及び哺乳動物細胞中に、一過性トランスフェクションによって導入されており、標的タンパク質へのいくつかの非天然アミノ酸の組み込みに有効であることがわかっている。

0006

例えば、欧州特許第1911840号明細書は、大腸菌(E.coli)細胞における標的タンパク質へのN−ε−boc−リシンの組み込みを立証している。

0007

ピロリシン類似体は、天然又は遺伝子的進化PylRSのいずれかによって認識されて、アンバーコドン部位でタンパク質に組み込まれるアミノ酸誘導体として定義されるが、これらは、過去数年にわたって開示されており、例えば、Fekner et al.(Fekner,Li&Chan,2010)及びLiu et al.により論述されている。PylRS−tRNApyl系を用いて、官能基又は翻訳後修飾担持する類似体がタンパク質に部位特異的に組み込まれている。いくつかの研究(例えば、Yanagisawa et al.を参照)は、N6置換基が、結合ポケットピロリシン内の芳香環である類似体を収容するために、PylRS酵素内の突然変異に注目した。他の者、例えば、Nguyen et al.(また、国際公開第2010/139948号パンフレット)、及びLi et al.(また、国際公開第2011/044255号パンフレット)は、嵩高のN6置換基を担持しないピロリシン類似体の同定に的を絞り、より単純な類似体の取得を達成し、これは、簡単に合成して、天然PylRS/tRNApylペアと相互作用させることができるであろう。さらに、Chin et al.は、銅触媒クリックケミストリー(CUAAC)によるタンパク質標識に使用しやすい末端アルキン及びアジド基を有する2つの類似体を開発した。

発明が解決しようとする課題

0008

依然として、さらに別のピロリシン類似体を開発する必要がある。これまで作製されたピロリシン類似体は、リシン骨格から進化したものに限定されているが、本発明者らは、様々なアミノ酸構造から出発して、天然PylRS/tRNApylペアと一緒にタンパク質に好適に組み込まれたピロリシン類似体を作製した。

課題を解決するための手段

0009

本発明に従い、本明細書に記載する式I〜VIIIのピロリシン類似体が提供される。

0010

また、非天然アミノ酸として、本明細書に記載する式I〜VIIIの1つ又は複数(例えば、1つ)のピロリシン類似体も提供される。

0011

さらに、1つ又は複数(例えば、1つ)の非天然アミノ酸を介して、タンパク質、細胞傷害性物質薬剤及びポリマーから選択される1つ又は複数(例えば、1つ)の部分と結合される、前述した突然変異タンパク質も提供される。

0012

さらには、1つ又は複数の非天然アミノ酸を含む突然変異体タンパク質の製造における、前述したピロリシン類似体の使用も提供される。

0013

本発明に記載するアミノ酸類似体は、新規かつ有用であり、しかも、タンパク質に容易に組み込まれる(典型的には、適切に使用されれば、生物活性損失なしに)と共に、生体共役反応に有用な手段を提供する点で、調製するのが簡単であるという利点を有する。

図面の簡単な説明

0014

モノクローナル抗体を含むアジドのペグ化を示す。レーン1:重鎖に組み込まれ、ペグ化条件に付された式IA.1類似体を含む抗体;レーン2:重鎖に組み込まれ、ペグ化条件に付された式III.1類似体を含む抗体。

0015

配列表の配列の簡単な説明:
列番号1:PylRSメタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)WTヌクレオチド配列
配列番号2:PylRSメタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)WTアミノ酸配列
配列番号3:PylRSメタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)、Y384F突然変異体ヌクレオチド配列
配列番号4:PylRSメタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)、Y384F突然変異体アミノ酸配列
配列番号5:tRNApylメタノサルシナ・マゼイ(Methanosarcina mazei)Go1
配列番号6:U6snRNAプロモータ
配列番号7:U6−tRNApyl構築物
配列番号8:GFPヌクレオチド配列
配列番号9:GFPアミノ酸配列
配列番号10:GFPY40ヌクレオチド配列
配列番号11:GFPY40アミノ酸配列
配列番号12:抗Her2(4D5)γヌクレオチド配列
配列番号13:抗Her2(4D5)γアミノ酸配列
配列番号14:抗Her2(4D5)γ_K274アンバーヌクレオチド配列
配列番号15:抗Her2(4D5)γ_K274アンバーアミノ酸配列
配列番号16:抗Her2(4D5)κヌクレオチド配列
配列番号17:抗Her2(4D5)κアミノ酸配列

0016

定義
用語「アミド」は、−C(=O)−NH−結合を指す。

0017

用語「カルバメート」は、−O−C(=O)−NH−結合を指す。

0018

用語「エステル」は、−C−C(=O)−O−C結合を指す。

0019

用語「アルキル」は、典型的に、1〜6個、例えば、1〜4個の炭素原子を含む脂肪族結合又は置換基を指し、直鎖又は分岐状のいずれでもよい。例としては、メチルエチル、n−プロピル、i−プロピル、n−ブチル及びt−ブチルが挙げられる。

0020

用語「アルコキシ」は、基−O−アルキルを指す。

0021

用語「アルケニル」、「アルケン」又は「オレフィン」は、典型的に、2〜6個、例えば、2〜4個の炭素原子を含む脂肪族結合又は置換基を指し、直鎖又は分岐状のいずれでもよく、少なくとも1つのC=C部分を含有するという点で、不飽和である。例としては、エテニルプロペン−1−イル、プロペン−2−イル、及び2−メチル−プロペン−2−イルが挙げられる。アルケニル基は、任意選択で、例えば、ハロゲン(例:Cl)若しくはエーテル基(例:−O−C1〜6アルキル)などの1つ又は複数(例えば、1つ)の置換基で置換されていてもよいが、好適には置換されていない。

0022

用語「アルキニル」又は「アルキン」は、典型的に、2〜6個、例えば、2〜4個の炭素原子を含む脂肪族結合又は置換基を指し、直鎖又は分岐状のいずれでもよく、少なくとも1つのC≡C部分を含有するという点で、不飽和である。例としては、−C≡CH及び−C≡C−CH3が挙げられる。アルキニル基は、任意選択で、例えば、ハロゲン(例:Cl)若しくはエーテル基(例:−O−C1〜6アルキル)などの1つ又は複数(例えば、1つ)の置換基で置換されていてもよいが、好適には置換されていない。

0023

用語「シクロアルキル」は、典型的に、3〜8個の環状炭素原子を含む脂環式及び不飽和化合物を指す。炭素原子の総数は、典型的に、3〜10である。例示的基としては、シクロプロピルシクロブチルシクロペンチル、3−メチル−シクロプロピル及びシクロヘキシルが挙げられる。

0024

用語「シクロアルケニル」は、典型的に、5〜8個の環状炭素原子を含み、かつ少なくとも1つのC≡C部分を含有する脂環式化合物を指す。シクロアルケニル基は、分岐を含んでもよい。

0025

炭素原子の総数は、典型的に、5〜10である。例示的基としては、シクロペンテニル、3−メチル−シクロプロピニル及びシクロヘキセニルが挙げられる。

0026

用語「ヘテロシクリル」は、環が、O、N及びSから選択される1つ又は複数(例:1つ、2つ若しくは3つ、例えば、1つ若しくは2つ、特に1つ)のヘテロ原子を含む、シクロアルキル又はシクロアルケニル部分を指す。例としては、アゼチジンピロリジンピペリジンピペラジンN−メチルピペラジンモルホリン及びチオモルホリンが挙げられる。

0027

用語「アリール」は、結合の一部又は置換基の一部であり得る芳香環構造を指す。アリール部分は、1つの環(例えば、フェニル)又は2つの環(例えば、ナフチル)を含んでもよい。アリール基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、フルオロアルキル、ハロゲン、アルコキシ、ニトロ及びシアノから選択される、1つ又は複数(例:1つ若しくは2つ、例えば、1つ)の置換基により、置換されていてもよい。例示的アリールは、フェニルである。

0028

用語「ヘテロアリール」は、結合の一部又は置換基の一部であり得るヘテロ芳香環構造を指す。ヘテロ芳香環は、O、N及びSから選択される、1〜4(より一般的には1〜3、例えば、1又は2)個のヘテロ原子を含んでよい。ヘテロアリール部分は、1つの環又は2つの環を含んでよい。1つの6員環を含む基の例としては、ピリジン及びピリミジンが挙げられる。1つの5員環を含む基の例としては、ピロールフランチオフェンオキサゾールチアゾールジアゾールチアジアゾール、及びテトラゾールが挙げられる。2つの環を含むヘテロアリールは、1つ若しくは両方の環にヘテロ原子を含んでもよい。例としては、キノリン及びイソキノリンが挙げられる。ヘテロアリール基は、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、フルオロアルキル、ハロゲン、アルコキシ、ニトロ及びシアノから選択される、1つ又は複数(例:1つ若しくは2つ、例えば、1つ)の置換基により、置換されていてもよい。

0029

用語「芳香族ハロゲン化物」は、フッ素塩化物臭化物若しくはヨウ素などの少なくとも1つ(例えば、1つ)のハロ基により置換された芳香環(典型的にはフェニル)を指す。前記芳香環は、さらなる置換基、例えば、アリールについて述べたものを含んでもよい。

0030

用語「アジド(azide)」及び「アジド(azido)」は、N=N(+)=N(−)官能基を指す。

0031

用語「シクロアルキン」は、環構造捕捉された炭素−炭素三重結合を含む、炭素原子(典型的には、6〜9員、特に8〜9員)の環状構成を指す。例としては、シクロオクチン及びシクロノニチンが挙げられる。別の例として、ベンジンがある。シクロアルキン基は、分岐を含んでもよい。炭素の総数は、典型的に、6〜12、例えば、6〜10である。

0032

用語「ケトン」は、C−C(=O)−C結合を指す。

0033

用語「ピロリシン類似体」は、天然又は遺伝的進化PylRSのいずれかにより認識されて、タンパク質のアンバーコドン部位に組み込まれたアミノ酸誘導体を意味する。

0034

「20の天然アミノ酸のうちの1つの側鎖」という表現は、その1文字コード:A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W及びYで知られる20の天然アミノ酸に関する式:HOOC−CHR−NH2における、基Rを指す。L又はD立体化学のいずれか(又はその混合物)が意図されるが、L立体化学が好ましい。

0035

本発明は、ピロリシン類似体を開示する。

0036

本発明の一部のピロリシン類似体は、式I:



(式中、
Z=結合、CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O、S又はCH−NH2であり;
aは、3〜7の整数であり;
bは、0又は1〜7の整数であり;
FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン)の構造を有する。

0037

式(I)のいくつかの化合物が知られている。

0038

従って、aが4、ZがOを表し、−(CH2)b−FGが、−CH2−C≡CH、−CH2CH2−N3、−CH2−CH=CH2及び−CH2−Phを表す、式(I)の化合物が、国際公開第2012/032181号パンフレットに開示されている。さらに、aが4、ZがOを表し、−(CH2)b−FGが、−CH2−CH2CH2−C(=O)CH3及び−CH2CH2CH2−CH=CH2を表す、式(I)の化合物が、国際公開第2010/139948号パンフレットに開示されている。

0039

aが4、Zが結合、bが0を表し、−(CH2)b−FGが、−C(=O)Bn及び−C(=O)Meを表す、式(I)の化合物が、国際公開第2012/032181号パンフレットに開示されている。さらに、aが4、Zが結合を表し、−(CH2)b−FGが、−CH2CH2−C≡CHを表す、式(I)の化合物が、国際公開第2010/139948号パンフレットに開示されている。

0040

本発明の一実施形態では、式Iの化合物は、a=4を有し、これにより、一般式IA:



の化合物が得られる。

0041

本発明の一実施形態では、式Iの化合物は、a=3を有し、これにより、一般式IB:



の化合物が得られる。

0042

式I、IA及びIBの実施形態において、Zは結合であり、例えば、Zは結合、bは0であり、FGは、C(=O)−アリール又はC(=O)−アルキルである。

0043

式I、IA及びIBの実施形態において、Zは、CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O、S又はCH−NH2である。例えば、Zは、Oであってもよい。あるいは、Zは、NHであってもよい。あるいは、Zは、CH2、CH−NH2、CH−OH、S又はCH−NH2であってもよい。

0044

一実施形態では、bは、1〜4である。

0045

一実施形態では、FGは、アジドである。

0046

一実施形態では、FGは、アルキン(例えば、エチニル)又はシクロアルキンである。

0047

一実施形態では、FGは、アルケン、例えば、エテニルである。

0048

式I、IA及びIBにおいて、FGがアリールを表すとき、一例は、芳香族ハロゲン化物、例えば、4−ヨードフェニルなどの4−ハロフェニルである。

0049

式IAの化合物例は、下記のものである。
(2S)−2−アミノ−6−{[(2−アジドエトキシカルボニル]アミノ}ヘキサン酸



(2S)−2−アミノ−6−{[(プロプ−2−イン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}ヘキサン酸



(2S)−2−アミノ−6−{[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}ヘキサン酸



(2S)−2−アミノ−6−{[(2−アジドエチル)カルバモイル]アミノ}ヘキサン酸



(2S)−2−アミノ−6−{[(プロプ−2−エン−1−イル)カルバモイル]アミノ}ヘキサン酸



(2S)−2−アミノ−6−{[(3−アジドプロポキシ)カルボニル]アミノ}ヘキサン酸



(2S)−2−アミノ−6−[(2S)−2−アミノ−4−アジドブタンアミド]ヘキサン酸



(2S)−2−アミノ−6−({[(4−ヨードフェニル)メトキシ]カルボニル}アミノ)ヘキサン酸



(2S)−2−アミノ−6−(4−アジドブタンアミド)ヘキサン酸

0050

下記の化合物は、式IBの化合物の例である。
(2S)−2−アミノ−5−{[(2−アジドエトキシ)カルボニル]アミノ}ペンタン酸



(2S)−2−アミノ−5−{[(プロプ−2−イン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}ペンタン酸



(2S)−2−アミノ−5−{[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}ペンタン酸

0051

本発明の別のピロリシン類似体は、式II:



(式中、
Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;
FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン;a=3又は5〜7の整数;及び
b=1〜4の整数である)
の構造を有する。

0052

一実施形態では、FGは、アジドである。一実施形態では、FGは、アルキン(例えば、エチニル)又はシクロアルキンである。一実施形態では、FGは、アルケン、例えば、エテニルである。一実施形態では、Zは、NHを表す。一実施形態では、bは、1又は2を表す。一実施形態では、Z(CH2)bFGは、NH(CH2)2N3又はNHCH2C≡CHを表す。

0053

式IIにおいて、FGがアリールを表すとき、一例は、芳香族ハロゲン化物、例えば、4−ヨードフェニルなどの4−ハロフェニルである。

0054

部分Z(CH2)bFGは、例えば、CO−アリール、例えば、CO−フェニル又は−COアルキル、例えば、−COMeを表す。

0055

本発明のさらに別のピロシリン類似体は、式III:



(式中、
Y=CH2、NH、O又はS;
Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;
FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン;a=1〜7の整数;
ZがNH、O又はSであるとき、bが2〜7の整数である以外は、b=1〜7の整数であり、ただし、a+bは、2〜8の範囲であり;
d=1〜4の整数)
の構造を有する。

0056

一実施形態では、a+bは、3〜6、例えば、3〜4の範囲である。

0057

一実施形態では、aは、1である。

0058

一実施形態では、bは、2である。別の実施形態では、bは、3である。

0059

一実施形態では、FGは、アジドである。

0060

一実施形態では、FGは、アルキン(例えば、エチニル)又はシクロアルキンである。

0061

一実施形態では、FGは、アルケン、例えば、エテニルである。

0062

式IIIにおいて、FGがアリールを表すとき、一例は、芳香族ハロゲン化物、例えば、4−ヨードフェニルなどの4−ハロフェニルである。

0063

式IIIの化合物例は、下記のものである。
(2S)−2−アミノ−3−[(2−{[(2−アジドエトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)スルファニルプロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−[(2−{[(プロプ−2−イン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}エチル)スルファニル]プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−[(2−{[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}エチル)スルファニル]プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−[(2−{[(2−アジドエチル)カルバモイル]アミノ}エチル)スルファニル]プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−[(2−{[(プロプ−2−イン−1−イル)カルバモイル]アミノ}エチル)スルファニル]プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−[(2−{[(プロプ−2−エン−1−イル)カルバモイル]アミノ}エチル)スルファニル]プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−[(2−{[(2−アジドエチル)カルバモイル]オキシ}エチル)スルファニル]プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−[(2−{[(プロプ−2−イン−1−イル)カルバモイル]オキシ}エチル)スルファニル]プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−[(2−{[(プロプ−2−エン−1−イル)カルバモイル]オキシ}エチル)スルファニル]プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−({3−[(2−アジドエチル)カルバモイル]プロピル}スルファニル)プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−({3−[(プロプ−2−イン−1−イル)カルバモイル]プロピル}スルファニル)プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−({3−[(プロプ−2−エン−1−イル)カルバモイル]プロピル}スルファニル)プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−({3−[(2−アジドエチル)カルバモイル]プロピル}スルファニル)プロパン酸

0064

さらにまた別のピロリシン類似体は、式IV:



(式中、
Y=CH2、NH、O又はS;
Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;
FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン;a=1〜7の整数;
ZがNH、O又はSであるとき、bが2〜7の整数である以外は、b=1〜7の整数であり、ただし、a+bは、2〜8の範囲であり、
d=1〜4の整数)
の構造を有する。

0065

一実施形態では、a+bは、3〜6、例えば、3〜4の範囲である。

0066

一実施形態では、aは、1である。

0067

一実施形態では、bは、2である。別の実施形態では、bは、3である。

0068

一実施形態では、YはNHで、ZはOである。一実施形態では、YはNHで、ZはNHである。一実施形態では、YはOで、ZはOである。一実施形態では、YはCH2で、ZはNHである。

0069

一実施形態では、FGは、アジドである。

0070

一実施形態では、FGは、アルキン(例えば、エチニル)又はシクロアルキンである。

0071

一実施形態では、FGは、アルケン、例えば、エテニルである。

0072

式IVにおいて、FGがアリールを表すとき、一例は、芳香族ハロゲン化物、例えば、4−ヨードフェニルなどの4−ハロフェニルである。

0073

より一般的には、式III及びIVの化合物は、式X:



(式中、Xは、O又はSを表し、他の全ての変数は、式III又はIVの化合物について定義した通りである)
の化合物と呼ばれる。

0074

式IVの化合物例は、下記のものである。
(2S)−2−アミノ−3−(2−{[(2−アジドエトキシ)カルボニル]アミノ}エトキシ)プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−(2−{[(プロプ−2−イン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}エトキシ)プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−(2−{[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}エトキシ)プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−(2−{[(2−アジドエチル)カルバモイル]アミノ}エトキシ)プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−(2−{[(プロプ−2−イン−1−イル)カルバモイル]アミノ}エトキシ)プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−(2−{[(プロプ−2−エン−1−イル)カルバモイル]アミノ}エトキシ)プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−(2−{[(2−アジドエチル)カルバモイル]オキシ}エトキシ)プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−(2−{[(プロプ−2−イン−1−イル)カルバモイル]オキシ}エトキシ)プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−(2−{[(プロプ−2−エン−1−イル)カルバモイル]オキシ}エトキシ)プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−{3−[(2−アジドエチル)カルバモイル]プロポキシ}プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−{3−[(プロプ−2−イン−1−イル)カルバモイル]プロポキシ}プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−{3−[(プロプ−2−エン−1−イル)カルバモイル]プロポキシ}プロパン酸

0075

別のピロリシン類似体は、式V:



(式中、
R=20の天然アミノ酸のうちの1つの側鎖;
Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;
FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン;a=1;及び
b=1〜4の整数)
の構造を有する。

0076

一実施形態では、ZはOである。

0077

一実施形態では、FGは、アジドである。

0078

一実施形態では、FGは、アルキン(例えば、エチニル)又はシクロアルキンである。

0079

一実施形態では、FGは、アルケン、例えば、エテニルである。

0080

式Vにおいて、FGがアリールを表すとき、一例は、芳香族ハロゲン化物、例えば、4−ヨードフェニルなどの4−ハロフェニルである。

0081

式Vの化合物例は、以下の通りである。
(2S)−2−アミノ−3−(2−{[(2−アジドエトキシ)カルボニル]アミノ}アセトアミド)プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−(2−{[(プロプ−2−イン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}アセトアミド)プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−(2−{[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}アセトアミド)プロパン酸

0082

別のピロリシン類似体は、式VI:



(式中、
Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;
FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール及びシクロアルキン;a=4又は5;及び
b=1〜4の整数)
の構造を有する。

0083

一実施形態では、Zは、NHである。

0084

一実施形態では、aは、5である。

0085

一実施形態では、FGは、アジドである。

0086

一実施形態では、FGは、アルキン(例えば、エチニル)又はシクロアルキンである。

0087

一実施形態では、FGは、アルケン、例えば、エテニルである。

0088

式VIにおいて、FGがアリールを表すとき、一例は、芳香族ハロゲン化物、例えば、4−ヨードフェニルなどの4−ハロフェニルである。

0089

以下は、式VIの化合物例である:
(2S)−2−アミノ−7−[(2−アジドエチル)カルバモイル]ヘプタン酸



(2S)−2−アミノ−7−[(プロプ−2−イン−1−イル)カルバモイル]ヘプタン酸



(2S)−2−アミノ−7−[(プロプ−2−エン−1−イル)カルバモイル]ヘプタン酸

0090

代替的ピロリシン類似体は、式VII:



(式中、
R=アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル;
a=1〜7の整数;及び
b=1〜3の整数)
の構造を有する。

0091

一実施形態では、a=4である。

0092

式VIIの好ましい化合物は、(2S)−2−アミノ−6−(2−アジドペンタンアミド)ヘキサン酸

0093

代替的ピロリシン類似体は、式(VIII):



(式中、
Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;
R1=H、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル;
R2=アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル;
R3=H、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル;及び
a=1)
の構造を有する。

0094

好適には、R1は、H又はアルキル、例えば、H又はメチル、特にHを表す。

0095

好適には、R3は、H又はアルキル、例えば、H又はメチル、特にHを表す。

0096

好適には、Zは、Oを表す。

0097

R2は、例えば、C3〜4アルケニル、例えば、CH2CH=CH2又はC1〜4アルキル、例えば、n−プロピル若しくはt−ブチルであってもよい。

0098

式VIIIの化合物例は、以下の通りである。
(2S)−2−アミノ−3−(4−アジド−2−{[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}ブタンアミド)プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−{4−アジド−2−[(プロポキシカルボニル)アミノ]ブタンアミド}プロパン酸



(2S)−2−アミノ−3−{4−アジド−2−[(t−ブトキシカルボニル)アミノ]ブタンアミド}プロパン酸

0099

式I〜VI及びXの構造において、FGがアルケンを表すとき、これは、好適には、−CH=CH2又は−CH=CH−CH3、好ましくは−CH=CH2である。−(CH2)b−FG及び−(CH2)d−FGの例は、−CH2−CH=CH2及び−CH2−CH2−CH=CH2である。

0100

式I〜VI及びXの構造において、FGがアルキンを表すとき、これは、好適には、−C≡CH又は−C≡C−CH3、好ましくは−C≡CHである。−(CH2)b−FG及び−(CH2)d−FGの例は、−CH2−C≡CHである。

0101

式I〜VI及びXの構造において、FGがケトンを表すとき、これは、好適には、−C(=O)−CH3又は−C(=O)−CH2−CH3、好ましくは−C(=O)−CH3である。

0102

式I〜VI及びXの構造において、FGがエステルを表すとき、これは、好適には、−C(=O)−Oアルキル、例えば、−C(=O)−Oメチルである。

0103

式I〜VI及びXの構造において、FGがアリールを表すとき、これは、好適には、ハロゲン、特にヨウ素により置換されたフェニル(例えば、4−ヨード−フェニル)である。

0104

式I〜VI及びXの構造において、FGがシクロアルキンを表すとき、これは、好適には、シクロオクチン、例えば、シクロオクト−4,5−インである。

0105

式I〜VI及びXの構造において、FGがアジドを表すとき、−(CH2)b−FG又は−(CH2)d−FGの例は、−(CH2)2−N3である。

0106

式VII及びVIIIの構造において、R、R1、R2及びR3が、アリールを表すとき、これは、好適には、フェニルである。

0107

本明細書に開示するピロリシン類似体は、様々な方法を用いて作製することができる。反応条件は、一般に、当業者が決定することができる。

0108

式I類似体は、活性カルボニル基、例えば、クロロホルメート、活性化カルボン酸エステルイソシアネート、活性化炭酸塩又はハロゲン化スルホニルを、1型の単保護ジアミノ基質(αアミノ基が、Boc、Cbz、TFAアセチル若しくはFmoc基などの保護基(「PG」)により保護されている)に添加することにより、容易に調製される(スキーム1を参照)。所望の官能性を設置するために、結合生成物3を、アジド求核基によるハロゲン化物の置換などのさらなる修飾に付してもよい。そうでなければ、中間物3を脱保護して、αアミノ酸マスク基を除去することにより、所望の式1類似体を取得する。

0109

式VII類似体は、最初に、所望のαアジド前駆体を調製することにより、容易に作製される。これを達成するための1つの戦略は、ハロゲン化物(Cl、Br、若しくはI)又はスルホン酸アルキルトシレートメシレートトリフレート)などの脱離基(LG)をアジ化ナトリウムで置換することにより、αアジド酸6を得る。次に、これを、HBTU、DCC及びNHS若しくはCDIなどの基でカルボン酸を活性化することにより、7型の単保護ジアミノ基質とカップリングすることができる。αアミノ基をマスクする保護基を除去することにより、生成物8が得られる。保護基は、スキーム1に従って使用してよい。スキーム2を参照されたい。

0110

ヒドロキシルアミノ酸9と、カルボン酸エステルなどの活性化カルボニル、イソシアネート、酸塩化物、活性化炭酸塩又はハロゲン化スルホニルを含む基質10との結合により、式II類似体を調製した。結合生成物11は、ハロゲン化物又は活性化アルコールなどの脱離基の置換によるアジド官能基の設置のようなさらなる修飾に付すことができる。所望のアミノ酸類似体12は、最終脱保護によってαアミノ酸マスク基を除去することにより、得られる。保護基は、スキーム1に従って使用してよい。スキーム3を参照されたい。

0111

チオエーテル結合を含む式III類似体は、基本的なS−アルキル化ステップにより容易に調製される。システインなどのチオアミノ酸13を、所望の官能化アルキル化剤14で処理することにより、S−アルキル化に影響を与える。次に、さらなる官能化を実施して、アミノ酸をその最終形態に固定する(例えば、アジド基の設置)。必要に応じた最終脱保護により、所望のアミノ酸16が現れる。保護基は、スキーム1に従って使用してよい。
スキーム4を参照されたい。

0112

式IV類似体は、エーテル結合ヒドロキシルアルキル化によって調製される、システイン類似体と類似の様式で調製することができる。セレンなどの保護ヒドロキシルアミノ酸17をアルキル化剤18で処理して、O−アルキル化に影響を与える。次に、さらなる官能化を実施して、アミノ酸をその最終形態に固定する(例えば、アジド基の設置)。必要に応じた最終脱保護により、所望のアミノ酸20が現れる。保護基は、スキーム1に従って使用してよい。スキーム5を参照されたい。

0113

式V類似体は、単保護ジアミノ誘導体24との基本的なペプチドカップリングにより、簡単に調製される。この方法は、α又はβアミノ酸などの二官能性アミン21と、カルボン酸エステルなどの活性化カルボニル、イソシアネート、酸塩化物、活性化炭酸塩又はハロゲン化スルホニルとのカップリングによって中間物23を得ることにより、開始する。次に、23のカルボン酸を、HBTU、DCC及びNHS若しくはCDIなどの試薬又はこれらの組み合わせで活性化した後、これを用いて、ジアミノプロピオン酸などの単保護ジアミン24をアシル化することにより、ペプチド25を得る。中間物25を脱保護するか、又はさらに官能化(例えば、アジド化)した直後に脱保護するかのいずれかによって、所望のアミノ酸26を得る。保護基は、スキーム1に従って使用してよい。スキーム6を参照されたい。

0114

式VI類似体は、グリシン同等物のα中心のアルキル化により調製することができる。この配列では、アセトアミドマロン酸ジエチルなどの保護グリシン同等物27をグリシン誘導体のα位置でアルキル化を実施するために、塩基性条件下で、28のようなアルキル化剤で処理する。続いて、酸性又は塩基性条件下での脱保護により、所望のアミノ酸30が得られる。

0115

アジドホモアラニン誘導体を24などの二官能性アミンの側鎖アミンとカップリングすることにより、式VIII類似体を調製した。この工程は、中間物33を得るための、アジドホモアラニン31と、カルボン酸エステルなどの活性化カルボニル、イソシアネート、酸塩化物、活性化炭酸塩又はハロゲン化スルホニルとのカップリングによって開始する。次に、カルボン酸33を、HBTU、DCC及びNHS若しくはCDIなどの試薬又はこれらの組み合わせで活性化した後、これを用いて、ジアミノプロピオン酸などの単保護ジアミン24をアシル化することにより、ペプチド34を得る。中間物34を脱保護して、35を得る。保護基は、スキーム1に従って使用してよい。スキーム8を参照されたい。

0116

タンパク質への非天然アミノ酸の組み込み
本明細書に開示するピロリシン類似体は、組み換えタンパク質に組み込むことができる。特に、組み換えタンパク質への類似体の部位特異的組み込みは、アンバー抑制によって達成することができ、この場合、ナンセンス(アンバー)コドンを、組み換えタンパク質コード化ヌクレオチド配列内のピロリシン類似体を挿入しようとする部位に挿入する。突然変異したヌクレオチド配列を、PylRS及びtRNApylをコード化する1つ又は複数のプラスミドと一緒に、無細胞発現系の細胞に挿入する。

0117

宿主細胞は、前述したようにDNA構築物を含むベクター形質転換した真核細胞株であってもよい。

0118

あるいは、宿主細胞から得られる合成反応溶解物が、ポリペプチドの合成に必要な少なくとも1つの成分を含む、無細胞発現系が提供される。上記合成反応溶解物は、細菌又は真核細胞から得られる。

0119

好ましくは、合成反応溶解物は、真核細胞、より好ましくは、ウサギ網状赤血球細胞又は麦芽から得られる。

0120

好ましくは、無細胞発現系は、本発明のWT PylRS及びtRNApylを発現することができ、この場合、本発明のDNA構築物を含む合成反応溶解物を得るために用いられる細胞に、tRNApylを導入する。

0121

本発明で使用するのに好適な無細胞発現系は、例えば、国際公開第201008110号パンフレット、同第2010081111号パンフレット、同第2010083148号パンフレットに記載されており、これらの文献は、その全体を参照により本明細書に組み込む。

0122

ピロリシン類似体を無細胞発現系に添加する場合、前記類似体を組み換えタンパク質内の指定位置に組み込む。nnAAとtRNApylをpylRSにより結合した後、tRNApylをnnAAでアミノアシル化する。アンバーアンチコドンを含有するこのtRNApylが、細胞質ゾル中に放出されると、そこで、アンバー終止コドン応答して、リボソームと相互作用することができ、nnAAが放出されて、成長するポリペプチド鎖とのペプチド結合を形成する。

0123

本発明のピロリシン類似体を組み込むように修飾された組み換えタンパク質は、部位特異的翻訳後修飾を受けやすいあらゆる組み換えタンパク質、例えば、治療用タンパク質、例えば、サイトカイン、抗体及び抗体誘導体Fab断片、又は一本鎖抗体、例えば、一本鎖可変断片(scfv)など)、ペプチド、酵素、融合タンパク質デコイ受容体タンパク質ワクチン、タンパク質ホルモン、例えば、インスリン成長因子、(例えば、ヒト成長ホルモン、hGH、hGCSF、hFSH、hHCG)を含む。本発明のピロリシン類似体で修飾可能な別のタンパク質としては、診断標識、イメージング試薬がある。

0124

好適には、タンパク質を部位特異的に修飾して、本発明の1つ又は複数のnnAA(ピロリシン類似体)を組み込むこともできる。例えば、抗体は、重鎖、若しくは軽鎖、又は軽鎖及び重鎖の両方に本発明のnnAAを組み込み得る。

0125

非天然アミノ酸とタンパク質の部位特異的結合
本発明のピロリシン類似体を組み込んだタンパク質を、官能化タンパク質コンジュゲートの調製に用いてもよい。非天然アミノ酸を組み込んだタンパク質と結合することができる分子としては、(i)他のタンパク質、例えば、抗体、特にモノクローナル抗体;(ii)ポリマー、例えば、当該系に半減期延長をもたらし得るPEG基又は他の基;(iv)細胞傷害性薬剤、例えば、オーリスタチン(Auristatin)F;並びに(v)薬物部分、例えば、ドキソルビシン及び放射性同位体含有部分が挙げられる。さらに、これらの修飾タンパク質は、上記の効力のある化合物の標的化送達のために薬物又はヌクレオチドと結合することができる。

0126

特定の実施形態について、以下の抗体薬コンジュゲートの説明でさらに詳細に記述する。

0127

ピロリシン類似体は、好都合なことに、他のアミノ酸との副作用リスクなしに、標的化された様式での結合を可能にするユニークな化学基を含有し得る。例えば、非天然アミノ酸は、アジド又はアルキン基を含有してもよく、これにより、ヒュゲン1,3−双極子環状付加反応を用いて、対応するアルキン又はアジド基を含有する、結合させようとする分子との反応が可能になる。

0128

本発明の好ましい結合化学は、天然の20のアミノ酸に対して直交性の反応を含む。こうした反応は、天然の20のアミノ酸と相互作用しないか、又はこれらとの副反応を引き起こさず、反応に伴う官能基に特異的である。好適には、本発明のピロリシン類似体を用いて、必要な官能基を標的タンパク質に組み込む。

0129

さらに、タンパク質に対して破壊的でない、条件、例えば、タンパク質に対して許容可能で、かつその溶解度を維持するpH範囲を有する水性溶媒、タンパク質に有害な作用をもたらさない温度で、前記反応を進行させる。

0130

タンパク質とリンカーとの結合部分の安定性を高めることも有利となりうる。従来の方法は、マレイミドとの反応によりシステインのチオール基と結合させて、チオールエーテルを形成する。チオールエーテルを逆反応に付して、抗体からリンカー薬物誘導体を放出させることもできる。本発明の一実施形態では、アジドとアルキンとの間で使用される結合化学によって、芳香族トリアゾールが形成されるが、これは、有意に安定しており、可逆性被りにくい。

0131

さらに、反応の産物、タンパク質とペイロード同士の結合は、安定している、すなわち、従来の結合(アミド、チオールエーテル)に関連する安定性と等しいか、それより高くなければならない。結合に対する障害ではないが、結合反応天然条件下で実施することができれば、余分な再生プロセシングテップが排除されることから、多くの場合、有利である。

0132

本発明のコンジュゲートの生成のための好ましい化学結合としては、以下のものが挙げられる:3+2アルキン−アジド環状付加;3+2双極子環状付加;ヒュスゲン3+2環状付加;銅促進アジド−アルキン環状付加(CuAAC);ルテニウム促進アジドアルキン環状付加(RAAC);金属促進アジドアルキン環状付加(MAAC);歪促進アジドアルキン環状付加(SPAAC);パラジウムを用いたカップリング、例えば、ヘック(Heck)反応、薗頭(Sonogashira)反応、鈴木(Suzuki)反応、スティル(Stille)カップリング、山/デンマーク(Hiyama/Denmark)反応、オレフィンメタセシスディールスアルダー(Diels−alder)反応、ヒドラジンヒドラジドアルコキシアミン又はヒドロキシルアミンとのカルボニル縮合ニトリル及びニトリルオキシドとの歪促進環状付加;電子促進環状付加;断片放出(fragment extrusion)環状付加;アルケン環状付加とこれに続くb−脱離反応

0133

1つの好ましい実施形態によれば、組み込まれたアミノ酸は、アジド又はアルキン基を含有し、化学修飾の方法は、前記アジド又はアルキン基を、アルキン又はアジド基を含む試薬と反応させるステップを含む。考慮される反応は、トリアゾール結合の生成をもたらすヒュスゲン1,3−双極子環状付加反応である。アルキン又はアジド基を含む試薬は、タンパク質(例えば、抗体)、又は細胞傷害性薬剤、又は任意選択でリンカーを介してアルキン又はアジド基を担持し、半減期の延長に好適な薬物若しくは物質(例えば、PEG基)であってよい。

0134

組み込まれたnnAAと標的ペイロードとの部位特異的結合は、抗体、抗体断片、及びサイトカインなどの完全に折り畳まれたタンパク質を用いて実施することができる。あるいは、この結合は、ドデシル硫酸ナトリウム及び尿素などの変性剤の存在下で、変性タンパク質に対して実施してもよい。銅触媒アジドアルキン添加は、変性剤と、ジチオトレイトール及び2−メルカプトエタノールなどの還元剤の存在下で実施することができる。

0135

2つ以上のnnAAが、標的タンパク質(例えば、抗体)に組み込まれる場合、化学修飾は、同じでも異なっていてもよい。例えば、2つのnnAAが組み込まれる場合、一方を薬物部分に結合するように修飾し、他方をPEG部分に結合するように修飾してもよい。

0136

好都合なことには、異なるが相補的反応基を担持する本発明の2つ以上のnnAAを組み込むと、前記nnAAは、互いに反応して、分子内リンクを生成することができる。

0137

一実施形態では、抗体薬物コンジュゲートを調製するために、本発明の結合化学を用いる。また、抗体−タンパク質コンジュゲート、タンパク質タンパク質コンジュゲート、例えば、抗体断片から成る二重特異的コンジュゲートなどを構築するために、結合化学を用いてもよい。さらに、結合化学は、薬物動態学的特性を操作する目的で、PEGなどのポリマーをタンパク質と結合させるのに用いてもよい。

0138

PEG部分
標的タンパク質をPEG部分に結合してもよい。PEG部分を抗体薬物コンジュゲートに組み込んでもよい。PEG部分は、典型的に、5kDa〜40kDaの分子量を有し得る。より好ましくは、PEG部分は、約20kDaの分子量を有し得る。PEG部分は直鎖でも、分岐していてもよい。

0139

抗体薬剤コンジュゲート(ADC
本発明のピロリシン類似体は、均質性である抗体薬物コンジュゲート(所与の薬物、典型的には、細胞傷害性薬物、あるいは、タンパク質若しくはPEG基に、合成リンカーにより共有結合された組換え抗体)の製造に特に有用であり、抗体当たりの薬物(又は他の結合された分子)の数及び抗体に対するこれら薬物の位置は明確に制御されており、これによって、組み込まれた非天然アミノ酸を含有するモノクローナル抗体が得られ、直交性化学により、薬物部分(又は他の結合された分子)を担持するリンカーに部位特異的に結合される。

0140

本発明のピロリシン類似体を用いて得られるADCは、下記の方法に従って製造することができ、この方法は、以下:
1.完全長抗体をコードするDNA配列を担持する1つ又は複数のプラスミドを安定した細胞株に導入することにより、終止コドンを上記配列内の特定の位置に導入するステップ、
2.所望の位置に設定されたピロリシン類似体(nnAA)を含む修飾抗体を精製するステップ、
3.抗体に設定されたnnAAに相補的な官能基を含むように修飾された細胞毒−リンカー誘導体を、直交性化学により、相補的反応基を含有する修飾抗体と反応させるステップ、
4.得られたADCを精製するステップ
を含む。

0141

従って、本発明は、抗体成分が、所望の位置にユニークな反応性官能基を担持する非天然アミノ酸を組み込むように修飾され、これにより、前記官能基が薬物部分(又はタンパク質若しくはPEG基)との結合を可能にするADCも提供する。

0142

一実施形態では、本発明は、タンパク質、薬物及びPEG部分から選択される1つ又は複数(例えば、1つ、2つ、3つ若しくは4つ、好ましくは1つ若しくは2つ、特に1つ)の部分と、トリアゾール部分を含むリンカーによって結合された抗Her−2抗体を含む抗体コンジュゲートを提供する。

0143

特に、トリアゾール部分は、抗Her−2抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の側鎖のアジド又はアルキン部分と、タンパク質、薬物若しくはPEG部分に結合したアルキン又はアジド部分との反応により形成することができる。

0144

一実施形態において、トリアゾール部分は、抗Her−2抗体の配列に組み込まれた非天然アミノ酸の側鎖のアジド又はアルキン部分と、タンパク質、薬物若しくはPEG部分に結合したアルキン又はアジド部分との、銅(I)触媒作用の条件下での反応により形成される。

0145

一実施形態では、銅アジドアルキン環状付加を結合に用いる。好適には、この反応には、末端アルキンを担持するオーリスタチン、アマニチンタキソール又はドキソルビシンなどの細胞傷害性薬剤を使用する。さらに、この反応では、硫酸銅酢酸銅ヨウ化銅若しくは臭化銅などの銅供給源アスコルビン酸ナトリウム、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、亜硫酸水素ナトリウム、ジチオトレイトール、システイン、b−メルカプトエタノールなどの還元剤;トリス[(1−ベンジル−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)メチル]アミン(TBTA)又はトリス(3−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン(THPTA)などの銅キレートリガンドを使用する。好適には、上記反応は、4〜50℃で実施する。好適には、反応時間は、0.5〜48時間の範囲である。別の実施形態では、歪促進アジドアルキン環状付加を結合に用いる。好適には、この反応には、色素、PEGポリマー、又は細胞傷害性薬剤、例えば、シクロオクチン基を担持するオーリスタチンを使用する。好適には、反応は、室温で0.5〜48時間にわたってインキュベートさせる。

0146


本明細書に記載するピロリシン類似体は、任意選択で、塩の形態で使用してもよい。こうした塩のいずれも本発明の態様を形成する。カルボン酸の塩は、第1族金属及び第2族金属を用いて形成される塩、特にナトリウム及びカリウム塩などの可溶性塩を含み得る。アミンの塩は、HCl、HBr又は酢酸などの弱酸及び強酸で形成された塩を含み得る。

0147

本発明の実施形態
本発明の実施形態は、以下のように表される:
1.式I:



(式中、
Z=結合、CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O、S又はCH−NH2;
aは、3〜7の整数であり;
bは、0又は1〜7の整数であり;及び
FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン)のピロリシン類似体。

0148

2.aが3である、実施形態1に記載のピロリシン類似体。

0149

3.aが4である、実施形態1に記載のピロリシン類似体。

0150

4.以下:



から選択される、実施形態3に記載のピロリシン類似体。

0151

5.以下:



から選択される、実施形態2に記載のピロリシン類似体。

0152

6.式II:



(式中、
Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;
FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン;a=3又は5〜7の整数;及び
b=1〜4の整数)
のピロリシン類似体。

0153

7.式III:



(式中、
Y=CH2、NH、O又はS;
Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;
FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン;a=1〜7の整数;
ZがNH、O又はSであるとき、bが2〜7の整数である以外は、b=1〜7の整数であり、ただし、a+bは、2〜8の範囲であり、
及びd=1〜4の整数)
のピロリシン類似体。

0154

8.以下:









から選択される、実施形態7に記載のピロリシン類似体。

0155

9.式IV:



(式中、
Y=CH2、NH、O又はS;
Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;
FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン;a=1〜7の整数;
ZがNH、O又はSであるとき、bが2〜7の整数である以外は、b=1〜7の整数であり、ただし、a+bは、2〜8の範囲であり、
及び
d=1〜4の整数)
のピロリシン類似体。

0156

10.以下:









から選択される、実施形態9に記載のピロリシン類似体。

0157

11.式V:



(式中、
R=20の天然アミノ酸のうちの1つの側鎖;
Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;
FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン;a=1;及び
b=1〜4の整数)
のピロリシン類似体。

0158

12.以下:



から選択される、実施形態11に記載のピロリシン類似体。

0159

13.式VI:



(式中、
Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;
FG=アジド、アルケン、アルキン、ケトン、エステル、アリール又はシクロアルキン;a=4又は5;及び
b=1〜4の整数)
のピロリシン類似体。

0160

14.以下:
式VI.1



から選択される、実施形態13に記載のピロリシン類似体。

0161

15.式VII:



(式中、
R=アルキル、アルケニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル;
a=1〜7の整数;及び
b=1〜3の整数)
のピロリシン類似体。

0162

16.



である、実施形態15に記載のピロリシン類似体。

0163

17.式VIII:



(式中、
Z=CH2、CH−NH2、CH−OH、NH、O又はS;
R1=H、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル;
R2=アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル;
R3=H、アルキル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、ヘテロアリール又はヘテロシクリル;及び
a=1)
のピロリシン類似体。

0164

18.以下:



から選択される、実施形態17に記載のピロリシン類似体。

0165

19.非天然アミノ酸として、実施形態1〜18のいずれか1つに記載の1つ又は複数のピロリシン類似体を含む、突然変異体タンパク質。

0166

20.非天然アミノ酸として、実施形態1〜18のいずれか1つに記載の1つのピロリシン類似体を含む、実施形態19に記載の突然変異体タンパク質。

0167

21.非天然アミノ酸を介して、タンパク質、細胞傷害性薬剤、薬物及びポリマーから選択される1つ又は複数の部分と結合される、実施形態19又は実施形態20に記載の突然変異体タンパク質。

0168

22.PEG部分に結合される、実施形態21に記載の突然変異体タンパク質。

0169

23.抗体部分に結合される、実施形態21に記載の突然変異体タンパク質。

0170

24.細胞傷害性薬剤部分に結合される、実施形態21に記載の突然変異体タンパク質。

0171

25.薬物部分に結合される、実施形態21に記載の突然変異体タンパク質。

0172

26.1つ又は複数の非天然アミノ酸を含む突然変異体タンパク質の製造における、実施形態1〜18のいずれか1つに記載の1つのピロリシン類似体の使用。

0173

実施例1.式I及びIB類似体の製造
(2S)−2−アミノ−6−[(2S)−2−アミノ−4−アジドブタンアミド]ヘキサン酸(式IA.7)の調製。マグネチックスターラを備えた20mLバイアル中に、4mLのDMF中のN−Boc−アジドホモアラニン(200mg、1当量)及びHBTU(311mg、1当量)を導入した。混合物を15分間攪拌してから、DMF(3mL)中の溶液N−Boc−リシン(235mg、1当量)、続いてトリエチルアミン(228uL)を添加した。バイアルにキャップをして、4時間攪拌した。混合物を250mMクエン酸及び酢酸エチルの間で分配した。有機層を保持し、水層を酢酸エチルでさらに2回抽出した。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。質量分析により、所望の中間物の形成が判明した。シリカゲルクロマトグラフィーによって、さらなる精製を実施した。

0174

Boc保護中間物を20mLバイアルに導入し、アセトニトリル(4mL)に懸濁させた。これに、ジオキサン(4N、4mL)中の塩酸の溶液を添加した。溶液を2時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。混合物を凍結乾燥した。イオン交換樹脂(Dowex−50)でさらに精製することにより、所望のアミノ酸が得られた。質量分析により、生成物を確認した。

0175

(2S)−2−アミノ−6−{[(2−アジドエチル)カルバモイル]アミノ}ヘキサン酸(式IA.4)の調製。マグネチックスターラを備えた4mLバイアル中に、Boc−N−6−リシン(50mg、1当量)及びDMF(1mL)を導入した。これに、2−クロロエチルイソシアネート(17.3mg、1.0当量)及びピリジン(32.3uL、2当量)を添加した。バイアルにキャップをして、4時間攪拌した。溶液を抽出漏斗に移し、酢酸エチル及び100mMクエン酸で抽出した。混合物を振盪させ、各層を分離した。水層を酢酸エチルでさらに2回抽出した。有機層を合わせて、5%塩化リチウム洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。質量分析により、生成物を同定し、次のステップに直接供した。

0176

マグネチックスターラを備えた4mLバイアル中に、粗クロロ誘導体及びDMSO(1mL)を導入した。アジ化ナトリウム(130mg、5当量)及びピリジン(32.3uL、2当量)を混合物に添加し、バイアルにキャップをした。混合物を60℃で一晩攪拌した。溶液を抽出漏斗に移してから、100mMクエン酸及び酢酸エチルで希釈した。混合物を振盪させ、各層を分離した。水層を酢酸エチルでさらに2回抽出した。有機層を合わせて、5%塩化リチウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。質量分析により、中間物を同定し、次のステップに移った。

0177

20mLバイアル中に、粗生成物とアセトニトリル(2mL)を導入した。これに、ジオキサン(4N、2mL)中の塩酸の溶液を添加した。溶液を2時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。混合物を半固体まで凍結乾燥した後、翻訳試験に使用した。生成物を質量分析により確認した。

0178

(2S)−2−アミノ−6−{[(プロプ−2−エン−1−イル)カルバモイル]アミノ}ヘキサン酸(式IA.5)の調製。マグネチックスターラを備えた4mLバイアル中に、Boc−N−6−ヒドロキシノルロイシン(50mg、1当量)及びDMF(1.5mL)を導入した。これに、アリルイソシアネート(18.0uL、1.0当量)及びピリジン(32.3uL、2当量)を添加した。バイアルにキャップをして、4時間攪拌した。溶液を抽出漏斗に移し、酢酸エチル及び100mMクエン酸で抽出した。混合物を振盪させ、各層を分離した。水層を酢酸エチルでさらに2回抽出した。有機層を合わせて、5%塩化リチウムで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過し、濃縮した。質量分析により、生成物を同定し、次のステップに直接供した。

0179

20mLバイアル中に、アセトニトリル(2mL)中の粗ヒドロキシルロイシンアリルカルバメート誘導体を導入した。これに、ジオキサン(4N、2.5mL)中の塩酸の溶液を添加した。溶液を2時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。混合物を半固体まで凍結乾燥した後、翻訳試験に使用した。生成物を質量分析により確認した。さらなる精製は、イオン交換樹脂(Dowex−50)で実施することができた。

0180

(2S)−2−アミノ−5−{[(2−アジドエトキシ)カルボニル]アミノ}ペンタン酸(式IB.1)の調製。マグネチックスターラを備えた20mLバイアル中に、炭酸カリウム(1M、2.5mL)及びジオキサン(2.5mL)の溶液中のN−Boc−オルニチン(500mg、1当量)を導入した。2−クロロエチルクロロホルメート(223uL、1当量)を添加し、バイアルにキャップをして、4時間攪拌した。1Mクエン酸で混合物をほぼpH2まで酸性化した。溶液を抽出漏斗に移し、酢酸エチルで水層を抽出した(3×)。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。LC/MSにより、大部分の生成物が所望の質量であることを確認した。それ以上の精製はせずに、粗生成物を次のステップに供した。

0181

粗塩化物中間物を20mLバイアル中に導入し、DMSO(15mL)に溶解させた。アジ化ナトリウム(625mg、4当量)及びピリジン(155uL)を添加し、バイアルにキャップをしてから、60℃で一晩攪拌した。混合物を250mMクエン酸と一緒に抽出漏斗に注ぎ込み、酢酸エチルで抽出した(3×)。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。LC/MSにより、生成物の形成を確認した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、さらなる精製を実施した。

0182

20mLバイアル中に、Boc中間物を導入して、アセトニトリル(4mL)に懸濁させた。これに、ジオキサン(4N、4mL)中の塩酸の溶液を添加した。溶液を2時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。濃縮物を水に溶解させてから、イオン交換樹脂(Dowex−50)に適用した。捕捉物質を水で洗浄してから、炭酸水素アンモニウム溶出した。アミノ酸を含む濃縮画分TLCにより同定した後、プールして、凍結乾燥することにより、所望の生成物を得た。生成物を質量分析により確認した。

0183

(2S)−2−アミノ−5−{[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}ペンタン酸(式IB.3)の調製。マグネチックスターラを備えた20mLバイアル中に、炭酸カリウム(1M、2mL)及びジオキサン(2mL)の溶液中のN−Boc−オルニチン(300mg、1当量)を導入した。クロロギ酸アリル(137uL、1当量)を添加し、バイアルにキャップをして、4時間攪拌した。1Mクエン酸で混合物をほぼpH2に酸性化した。溶液を抽出漏斗に移し、酢酸エチルで水層を抽出した(3×)。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮した。LC/MSにより、大部分の生成物が所望の質量であることを確認した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、さらなる精製を実施した。

0184

20mLバイアル中に、Boc中間物を導入して、アセトニトリル(3mL)に懸濁させた。これに、ジオキサン中の塩酸の溶液(4N、3mL)を添加した。溶液を2時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。濃縮物を水に溶解させてから、イオン交換樹脂(Dowex−50)に適用した。捕捉物質を水で洗浄してから、炭酸水素アンモニウムで溶出した。アミノ酸を含む濃縮画分をTLCにより同定した後、プールして、凍結乾燥することにより、所望の生成物を得た。生成物を質量分析により確認した。

0185

実施例2.式IIIの化合物の調製
(2S)−2−アミノ−3−[(2−{[(2−アジドエトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)スルファニル]プロパン酸(式III.1)の調製。マグネチックスターラを備えた4mLバイアル中に、システイン(75mg、1当量)及び炭酸ナトリウムの溶液(2.8M、620uL)を導入した。これに、DMSO(620uL)中の2−クロロエチル−N−(2−ブロモエチル)カルバメート(99mg、1.0当量)を添加した。バイアルにキャップをして、8時間攪拌した。質量分析により、所望のs−アルキル化中間物の形成が判明した。中間物質量の確認後、アジ化ナトリウム(120mg)及びDMSO(1mL)を添加し、バイアルに再度キャップをしてから、混合物を60℃に一晩加熱した。質量分析により、所望の質量の好適な形成が判明した。粗混合物のpHを2に調節してから、凍結乾燥して、ペーストを得た。材料を水に懸濁させ、イオン交換樹脂(Dowex−50)に捕捉させた後、水で洗浄してから、水酸化アンモニウムで溶出した。溶出した画分をプールして、凍結乾燥することにより、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

0186

(2S)−2−アミノ−3−[(2−{[(プロプ−2−イン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}エチル)スルファニル]プロパン酸(式III.2)の調製。マグネチックスターラを備えた4mLバイアル中に、システイン(75mg、1当量)及び炭酸ナトリウムの溶液(2.8M、620uL)を導入した。これに、ジオキサン(620uL)中のプロプ−2−イン−1−イルN−(2−ブロモエチル)カルバメート(86mg、1.0当量)を添加した。バイアルにキャップをして、一晩攪拌した。質量分析により、所望のS−アルキル化生成物の形成が判明した。粗混合物のpHを2に調節してから、ペースト状に凍結乾燥した。材料を水に懸濁させ、イオン交換樹脂(Dowex−50)に捕捉させた後、水で洗浄してから、水酸化アンモニウムで溶出した。濃縮画分をプールして、凍結乾燥することにより、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

0187

(2S)−2−アミノ−3−[(2−{[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}エチル)スルファニル]プロパン酸(式III.3)の調製。マグネチックスターラを備えた4mLバイアル中に、システイン(75mg、1当量)及び炭酸ナトリウムの溶液(2.8M、620uL)を導入した。これに、ジオキサン(620uL)中のプロプ−2−エン−1−イルN−(2−ブロモエチル)カルバメート(88mg、1.0当量)を添加した。バイアルにキャップをして、一晩攪拌した。質量分析により、所望のS−アルキル化生成物の形成が判明した。粗混合物のpHを2に調節してから、ペースト状に凍結乾燥した。材料を水に懸濁させ、イオン交換樹脂(Dowex−50)に捕捉させた後、水で洗浄してから、水酸化アンモニウムで溶出した。濃縮画分をプールして、凍結乾燥することにより、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

0188

(2S)−2−アミノ−3−({3−[(2−アジドエチル)カルバモイル]プロピル}スルファニル)プロパン酸(式III.3)の調製。マグネチックスターラを備えた20mLバイアル中に、システイン(75mg、1当量)及び炭酸ナトリウムの溶液(1M、1.7mL)を導入した。これに、ジオキサン(1.5mL)中のN−(2−アジドエチル)−4−ブロモブタンアミド(86mg、1.0当量)を添加した。バイアルにキャップをして、8時間攪拌した。質量分析により、所望のS−アルキル化生成物の形成が判明した。粗混合物のpHを2に調節し、イオン交換樹脂(Dowex−50)に適用した後、水で洗浄してから、水酸化アンモニウムで溶出した。TLCにより同定したアミノ酸を含む画分をプールして、凍結乾燥することにより、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

0189

(2S)−2−アミノ−3−({3−[(プロプ−2−エン−1−イル)カルバモイル]プロピル}スルファニル)プロパン酸(式III.12)の調製。マグネチックスターラを備えた20mLバイアル中に、システイン(285mg、1当量)及び炭酸ナトリウムの溶液(2.8M、1.2mL)を導入した。これに、4−ブロモ−N−(プロプ−2−エン−1−イル)ブタンアミド(333mg、1.0当量)を添加した。バイアルにキャップをして、一晩攪拌した。質量分析により、所望のs−アルキル化生成物の形成が判明した。粗混合物のpHを2に調節してから、凍結乾燥して、ペーストを得た。材料を水に懸濁させ、イオン交換樹脂(Dowex−50)に適用した後、水で洗浄してから、水酸化アンモニウムで溶出した。濃縮画分をプールして、凍結乾燥することにより、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

0190

実施例3.式Vの化合物の調製
(2S)−2−アミノ−3−(2−{[(2−アジドエトキシ)カルボニル]アミノ}アセトアミド)プロパン酸(式V.1)の調製。マグネチックスターラを備えた4mLバイアル中に、1mLのDMF中の2−{[(2−クロロエトキシ)カルボニル]アミノ}酢酸(50mg、1当量)及びHBTU(105mg、1当量)を導入した。混合物を15分間攪拌した後、DMF(1mL)中の(2S)−3−アミノ−2−{[(tert−ブトキシ)カルボニル]アミノ}プロパン酸(66mg、1当量)の溶液、続いてトリエチルアミン(77uL)を添加した。バイアルにキャップをして、4時間攪拌した。混合物を250mMクエン酸及び酢酸エチルに注ぎ込み、振盪させた。層を分離させて、有機層を保持した。水層を酢酸エチルでさらに2回抽出した。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過及び濃縮した。質量分析により、所望の生成物の形成を確認した。それ以上の精製はせずに、粗生成物を次のステップに供した。

0191

塩化物中間物を20mLバイアル中に導入し、DMSO(5mL)に溶解させた。アジ化ナトリウム(72mg、4当量)を添加し、バイアルにキャップをしてから、60℃で一晩攪拌した。混合物を250mMクエン酸及び酢酸エチルに注ぎ込み、振盪させた。層を分離させて、有機層を保持した。水層を酢酸エチルでさらに2回抽出した。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過及び濃縮した。質量分析により、所望の生成物の形成を確認した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、さらなる精製を達成することができた。

0192

単純な酸性化によりboc基を取り出した。20mLバイアル中に、Boc−アジド中間物を導入して、アセトニトリル(2mL)に懸濁させた。これに、ジオキサン中の塩酸の溶液(4N、2mL)を添加した。溶液を2時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。混合物を凍結乾燥して、ペーストを得た。イオン交換樹脂(Dowex−50)を用いたさらなる精製により、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

0193

(2S)−2−アミノ−3−(2−{[(プロプ−エン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}アセトアミド)プロパン酸(式V.3)の調製。マグネチックスターラを備えた4mLバイアル中に、1mLのDMF中の2−{[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}酢酸(50mg、1当量)及びHBTU(120mg、1当量)を導入した。混合物を15分間攪拌した後、DMF(1mL)中の(2S)−3−アミノ−2−{[(tert−ブトキシ)カルボニル]アミノ}プロパン酸(75mg、1当量)の溶液、続いてトリエチルアミン(88uL)を添加した。バイアルにキャップをして、8時間攪拌した。混合物を250mMクエン酸及び酢酸エチルの間で分配した。有機層を保持し、水層を酢酸エチルでさらに2回抽出した。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過及び濃縮した。質量分析により、所望の生成物の形成を確認した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、さらなる精製を達成することができた。

0194

Boc保護中間物を20mLバイアル中に導入し、アセトニトリル(2mL)に懸濁させた。これに、ジオキサン(4N、2mL)中の塩酸の溶液を添加した。溶液を2時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。混合物を凍結乾燥して、ペーストを得た。イオン交換樹脂(Dowex−50)を用いたさらなる精製により、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

0195

(2S)−2−アミノ−3−(2−{[(プロプ−2−イン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}アセトアミド)プロパン酸(式V.2)の調製。マグネチックスターラを備えた4mLバイアル中に、1mLのDMF中の2−{[(プロプ−2−イン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}酢酸(50mg、1当量)及びHBTU(121mg、1当量)を導入した。混合物を15分間攪拌した後、DMF(1mL)中の(2S)−3−アミノ−2−{[(tert−ブトキシ)カルボニル]アミノ}プロパン酸(76mg、1当量)の溶液、続いてトリエチルアミン(89uL)を添加した。バイアルにキャップをして、8時間攪拌した。混合物を250mMクエン酸及び酢酸エチルの間で分配した。有機層を保持し、水層を酢酸エチルでさらに2回抽出した。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過及び濃縮した。質量分析により、所望の生成物の形成を確認した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、さらなる精製を達成することができた。

0196

Boc保護中間物、(2S)−2−{[(tert−ブトキシ)カルボニル]アミノ}−3−(2−{[(プロプ−2−イン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}アセトアミド)プロパン酸を20mLバイアル中に導入し、アセトニトリル(2mL)に懸濁させた。これに、ジオキサン中の塩酸の溶液(4N、2mL)を添加した。溶液を2時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。混合物を凍結乾燥して、ペーストを得た。イオン交換樹脂(Dowex−50)を用いたさらなる精製により、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

0197

実施例4.式VII類似体の調製
(2S)−2−アミノ−6−(2−アジドペンタンアミド)ヘキサン酸(式VII.1)の調製。マグネチックスターラを備えた20mLバイアル中に、3mLのDMF中の2−アジドペンタン酸(100mg、1当量)及びHBTU(266mg、1当量)を導入した。混合物を15分間攪拌した後、DMF(3mL)中のN−Boc−リシン(200mg、1当量)の溶液、続いてトリエチルアミン(195uL)を添加した。バイアルにキャップをして、8時間攪拌した。混合物を250mMクエン酸及び酢酸エチルの間で分配した。有機層を保持し、水層を酢酸エチルでさらに2回抽出した。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過及び濃縮した。質量分析により、所望の中間物の形成を確認した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、さらなる精製を実施した。

0198

中間物を20mLバイアル中に導入し、アセトニトリル(2mL)に懸濁させた。これに、ジオキサン中の塩酸の溶液(4N、2mL)を添加した。溶液を2時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。混合物を凍結乾燥した。イオン交換樹脂(Dowex−50)を用いたさらなる精製により、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

0199

実施例5.式VIII類似体の調製
(2S)−2−アミノ−3−(4−アジド−2−{[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}ブタンアミド)プロパン酸(式VIII.1)の調製。マグネチックスターラを備えた4mLバイアル中に、1mLのDMF中の(2S)−3−(4−アジド−2−{[(プロプ−2−エン−1−イルオキシ)カルボニル]アミノ}ブタンアミド)−2−{[(tert−ブトキシ)カルボニル]アミノ}プロパン酸(65mg、1当量)及びHBTU(108mg、1当量)を導入した。混合物を15分間攪拌した後、DMF(1mL)中の(2S)−3−アミノ−2−{[(tert−ブトキシ)カルボニル]アミノ}プロパン酸(68mg、1当量)の溶液、続いてトリエチルアミン(79uL)を添加した。バイアルにキャップをして、4時間攪拌した。混合物を250mMクエン酸及び酢酸エチルに注ぎ込み、振盪させて、有機層を保持した。水層を酢酸エチルでさらに2回抽出した。有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させ、ろ過及び濃縮した。質量分析により、所望の生成物の形成を確認した。シリカゲルクロマトグラフィーにより、さらなる精製を達成することができた。

0200

Boc保護中間物を20mLバイアル中に導入し、アセトニトリル(2mL)に懸濁させた。これに、ジオキサン中の塩酸の溶液(4N、2mL)を添加した。溶液を2時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。混合物を凍結乾燥した。イオン交換樹脂(Dowex−50)を用いたさらなる精製により、所望のアミノ酸を得た。生成物を質量分析により確認した。

0201

実施例6.GFPアッセイによる翻訳試験
pylRS/tRNAペアと本発明のピロリシン類似体(nnAA)との適合性及び標的タンパク質へのnnAA組み込みの効率を評価するために、in vitro細胞アッセイを開発した。このために、PylRS(配列番号4)を安定に発現するHEK293細胞を、tRNApyl(配列番号7)の発現用のプラスミド及びGFPY40をコードするリポータ構築物(アミノ酸残基番号40(ここで、1は、イニシエータメチオニン)のチロシンの代わりにアンバーコドンを含む)で一時的にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を2mMのnnAAと一緒に2〜3日の間インキュベートし、顕微鏡での視覚検査により、GFP生成を定量的に分析した。Accuriフローサイトメータを用いたフローサイトメトリーにより、GFP蛍光を定量した後、蛍光細胞幾何平均を決定した。

0202

細胞アッセイを用いて、様々なnnAAが、pylRSの好適な基質であり、標的タンパク質へのその翻訳を可能にするかどうかを決定した。PylRS/tRNApylペアを発現すると共に、GFPY40リポータ遺伝子をコードするベクターを含む細胞をnnAAの存在下でインキュベートした。PylRS/tRNApylペアにより容易に使用されるnnAAは、GFPのアンバー部位へのnnAAの翻訳を支持し、完全長GFP(蛍光タンパク質)のリードスルーを可能にする。細胞の蛍光強度は、nnAA組み込みの効率に応じて変動する。従って、あまり使用されないnnAAは、弱い蛍光又は無蛍光細胞を生成する。顕微鏡観察によって、pylRSにより使用可能なnnAAの数を明らかにした(表1、陽性GFP)。さらに、各サンプル中の相対的発現を、pylRSにより効率的に使用されることがわかっている物質により生成されたものと比較した。式1A.1(MFI=931,289)、式1A.2(MFI=1,676,250)及び式1A.3(MFI=2,250,000)(表1を参照)は、幾何平均と共に、高レベルのGFP発現を支持した。

0203

本発明者らにより、本発明の式IA.4、IA.5、III.1、III.2、III.3、III.12、III.13、V.1、V.2、V.3、VII.1の類似体は、GFPリポータ遺伝子に組み込まれて、使用した実験条件下で緑色細胞をもたらすことがみいだされた。これらの中でも、類似体式III.1(MFI=1,989,750)、式III.2(MFI=1,847,250)及び式III.3(MFI=2,187,000)(表2を参照)は、高レベルのGFP発現を支持したことから、使用した実験条件下でpylRS/tRNAペアにより効率的に使用される類似体を表している。

0204

0205

0206

0207

0208

0209

実施例7.抗体へのピロリシン類似体の部位特異的挿入並びにピロリシン類似体残基を含む抗Her2抗体の結合構築及び発現
2つの非天然アミノ酸(各重鎖に1つ)を含む完全長抗Her2抗体(4D5−2AZ抗体)(配列番号15)を哺乳動物細胞に発現させた。K274位でアンバー部位をコード化するHer2抗体(配列番号14)を安定に発現すると共に、pylRS/tRNAペアを発現するCHO細胞を式III.1及び式1A.1のnnAAに暴露した。アジド部分を含有する式III.1又は式1A.1のnnAAを重鎖位置K274に組み込んだ後、プロテインA樹脂(GE Healthcare)又はIgSelect(GE Healthcare,17096901)のいずれかを用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製した。次に、精製した物質を濃縮し、結合反応に付した。

0210

マウス抗体4D5の重鎖及び軽鎖両方の可変領域を、ヒトIgGをコードする遺伝子を含有するベクターにクローニングすることにより、Her2/neuの細胞外ドメインに向けられる抗体を作製した。オーバーラップオリゴマーを用いた遺伝子合成により、4D5の可変領域を作製して、pFUSE−CHIg−hG1(IgG1重鎖;γ)(配列番号12及び13)並びにpFUSE−CHLIg−hk(軽鎖;κ;Invivogen)(配列番号16及び17)によりコード化されるヒトIgG1フレームワークにクローニングして、マウス−ヒトハイブリッドを作製した。部位特異的突然変異により、アンバーコドンを重鎖(γ)のK274位に導入した(配列番号14及び15)。アンバーコドンを含むクローンをDNA配列決定により同定した。組み込み構築物を作製するために、重鎖のためのプロモータ及びORFをPCRにより増幅し、制限酵素消化、及びpOptivec(Life Technologies)への連結によりクローニングした。軽鎖とtRNAの単コピーを、オーバーラップオリゴマーを用いて、2ステップPCR法により結合した後、重鎖を含むpOptivecプラスミドの利用可能な部位にクローニングした。次に、この構築物をpylRS/tRNAペアを含むCHO−DG44細胞株にトランスフェクトした後、ヒポキサチン及びチミジン欠失した培地におけるその増殖により、トランスフェクタントを選択した。続いて、選択した細胞をクローニングし、アンバーコドンへのnnAAの効率的な導入が可能な高IgG発現(完全長IgGの発現)を単離した。選択された細胞株を用いて、前述したnnAAを含むIgGを作製した。Excel DHFR培地(Sigma−Aldrich)において細胞を1〜2×106細胞/mLの密度まで増殖させた後、式III.1又は式IA.1のnnAAを1mMの最終濃度まで培地に添加した。細胞を5日間インキュベートし、増殖培地からIgGを精製した。上清回収し、遠心分離にかけることにより、懸濁細胞及び他の残屑を回収した。次に、上清を0.22umフィルターを通してろ過することにより、あらゆる粒子状物質を除去した後、クロマトグラフィーカラムに適用した。ろ過した上清を、AKTAクロマトグラフィー系を用い、1〜5mL/分の流量で、1mL〜5mL充填HiTrapプロテインASepharoseに適用した。結合した物質及び樹脂をPBSで洗浄することにより、結合の緩いタンパク質を除去した後、結合物質を、100mMグリシン(pH3.0)を用い、1mL/分の流量で溶出した。標的タンパク質を含むピーク画分を0.1体積分率の1Mトリス−HCl(pH8.0)で中和した。全構築物をPBSに対して4℃で16時間最終リン酸バッファー中に透析した。両方の重鎖の274位に、nnAAとして式III.1が組み込まれた抗体は、「4D5−2AzAb−HC−274−(2S)−2−アミノ−3−[(2−{[(2−アジドエトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)スルファニル]プロパン酸」と称した。

0211

4D5−2AzAb−HC−274−(2S)−2−アミノ−3−[(2−{[(2−アジドエトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)スルファニル]プロパン酸のペグ化
200uLPCRチューブ中に、4D5−2AzAb−HC274−(2S)−2−アミノ−3−[(2−{[(2−アジドエトキシ)カルボニル]アミノ}エチル)スルファニル]プロパン酸(式III.1)の溶液(100uL、0.05mg/mL)、続いて、20KPEGシクロオクチンの溶液(33.3、60mg/mL)を導入した。溶液をボルテックスミキサー激しく混合した後、一晩インキュベートした。混合物を200uLまで希釈してから、プロテインA磁気ビーズに適用した。混合物をボルテックスし、回転させることにより、ビーズを90分間混合した。ビーズを固定化し、通過物質廃棄した。ビーズをPBSで洗浄し(2X)、還元ゲルバッファー中に懸濁させた。ボルテックスしてから、95℃に3分加熱した。懸濁液をSDS−PAGEゲル上に直接ロードした。SDS−PAGEゲルのクーマシー染色は、重鎖の選択的ペグ化を示した(図1、レーン2)。

0212

参考文献
Fekner,T.,Li,X.,&Chan,M.K.(2010).Pyrrolysine Analogs for Translational Incorporation into Proteins.European Jouranal of Organic Chemistry,4171−4179.
Kavran,J.M.,Gundllapalli,S.,O’Donoghue,P.,Englert,M.,Soll,D.,&Steltz,T.A.(2007).Structure of pyrrolysyl−tRNAsynthetase,an archaeal enzyme for genetic code innovation.Proceedings National Academy of Sciences,104(27),11268−11273.
Kobayashi,T.,Yanagisawa,T.,Sakamoto,K.,&Yokoyama,S.(2009).Recognition of Non−a−amino Substrates by Pyrrolysyl−tRNA Synthetase.J.Mol.Biol.(1352−1360),385.
Liu,Chang C,and Peter G Schultz.“Adding New Chemistries to the Genetic Code.”Annual Review of Biochemistry,2010:413−444.Chan,Michael K,Tomasz Fekner,Xin Li,Marianne Lee,and Jennifer J Ottesen.International Patent WO2011/044255A1.2011.
Nguyen,D.P.,Lusic,H.,Neumann,H.K.,Deiters,A.,&Chin,J.W.(2009).Genetic Encoding and Labeling of Aliphatic Azides and Alkynes in Recombinant Proteins via a Pyrrolysyl−tRNA
Synthetase/tRNAcua Pair and Click Chemistry.Journal of the American Chemical Society,8720−8721.Yanagisawa,T.,Ishii,R.,Fukunaga,R.,Kobayashi,T.,Sakamoto,K.,&Yokoyama,S.(2008).Crystallographic Studies on Multiple Conformational States of Active−site loops in Pyrrolysyl−tRNA synthetase.J.Mol.Biol.,378,634−652.
Yanagisawa,T.,Ishii,R.,Fukunaga,R.,Kobayashi,T.,Sakamoto,K.,&Yokoyama,S.(2008).Multistep Engineering of Pyrrolysyl−tRNA Synthetase to Genetically Encode Ne−(o−Azidobenzyloxycarbonyl)lysine for Site Specific Protein Modification.Chemistry and Biology,15,1187−1197.
Yanagisawa,T.,Sumida,T.,Ishii,R.,&Yokoyama,S.(2013).A novel crystal fom of pyrrolysyl−tRNA synthetase reveals the pre− and post−aminoacyl−tRNA synthesis conformational states of the adenylate and aminoacyl moieties and an asparagine residue in the catalytic site.Acta Crystallographica Section D,D69,5−15.

0213

本発明、並びに以下に記載する特許請求の範囲全体を通して、文脈から別の意味に解釈すべき場合を除き、「含む」という用語、並びに「含む」及び「含んでいる」などの変形は、記載された整数、ステップ、整数の群又はステップの群の包含を意味するが、いずれか他の整数、ステップ、整数の群又はステップ群の除外を意味するわけではないことは理解されよう。

実施例

0214

本明細書で言及する全ての特許及び特許出願は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ