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技術 腫瘍浸潤リンパ球および治療の方法

出願人 リージェンツオブザユニバーシティオブミネソタインティマバイオサイエンス,インコーポレイテッドザユナイテッドステイツオブアメリカ,アズリプレゼンテッドバイザセクレタリー,デパートメントオブヘルスアンドヒューマンサービシーズ
発明者 モリアリティ,ブランデンウェバー,ビューチョードリー,モダシールローゼンバーグ,スティーブンエー.パーマー,ダグラスシー.レスティフォ,ニコラスピー.
出願日 2017年10月18日 (4年1ヶ月経過) 出願番号 2019-520738
公開日 2019年11月7日 (2年0ヶ月経過) 公開番号 2019-532080
状態 未査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 化合物または医薬の治療活性 動物,微生物物質含有医薬 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬
主要キーワード 量記号 基準数値 最小測定値 中央制御モジュール プロセス検証 適合性情報 リン酸塩粉末 フィート長
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課題・解決手段

ウイルスベクターおよび腫瘍浸潤リンパ球など、消化器がん処置のための遺伝子改変組成物が開示される。CRISPR系を用いて、遺伝子改変組成物を作製する方法が、開示される。また、遺伝子改変組成物を作製し、消化器がんの処置のために使用する方法も開示される。本明細書では、対象における免疫応答を減少させるのに十分な量での、対象への少なくとも1つの免疫抑制薬投与を含む準備レジメン;対象における真菌感染症阻害するのに十分な量での、抗真菌剤を含む医薬組成物;およびサイトカイン誘導性SH2含有タンパク質CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む処置方法が開示される。

概要

背景

腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の養子移入は、転移性黒色腫耐久性がある退縮を媒介することにおいて相当な成功を収めた。このような成功にもかかわらず、他の固形腫瘍の状況下でのTIL療法の使用は、難度が高かった。これは、腫瘍微小環境によって発揮される抑制効果ならびに受容体シグナル伝達およびエフェクター機能獲得におけるT細胞固有機能障害によるものである可能性がある。プログラム細胞死タンパク質1(PD−1)および細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質(CTLA−4)機能をターゲティングする、モノクローナル抗体に基づく免疫チェックポイントインヒビターは、T細胞外因性抑制効果を軽減し得る場合もあるが、それらに非腫瘍反応性T細胞に対して全身性活性があることに起因する潜在的に致死的自己免疫性副作用リスクを有する。近年、腫瘍上の分子標的をin vivoで認識するためのリンパ球遺伝子操作が著しく進歩した結果として、腫瘍標的寛解の目覚ましい症例がもたらされている。しかし、これらの成功は、主に、血液学的腫瘍に限定されており、特定の腫瘍内の細胞によって発現される同定可能分子欠如、および腫瘍破壊を媒介するために腫瘍標的への特異的結合に使用することができる分子の欠如により、固形腫瘍へのより広範な適用は、限定的である。近年におけるいくつかの進歩は、場合によって抗腫瘍細胞応答を誘発する腫瘍特異的変異の同定に焦点を当てている。例えば、これらの内因性変異は、全エクソムシケンシング法を使用して同定することができる。Tran Eら、「Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer」、Science 344巻:641〜644頁(2014年)。

概要

ウイルスベクターおよび腫瘍浸潤リンパ球など、消化器がん処置のための遺伝子改変組成物が開示される。CRISPR系を用いて、遺伝子改変組成物を作製する方法が、開示される。また、遺伝子改変組成物を作製し、消化器がんの処置のために使用する方法も開示される。本明細書では、対象における免疫応答を減少させるのに十分な量での、対象への少なくとも1つの免疫抑制薬投与を含む準備レジメン;対象における真菌感染症阻害するのに十分な量での、抗真菌剤を含む医薬組成物;およびサイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む処置方法が開示される。

目的

場合によって、コンピュータシステムまたはソフトウェアを用いて、低いオフターゲット可能性の予測を有する候補gRNAの推奨を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

a)対象における免疫応答を減少させるのに十分な量での、前記対象への少なくとも1つの免疫抑制薬投与を含む準備レジメンと;b)前記対象における真菌感染症阻害するのに十分な量での、抗真菌剤を含む医薬組成物と;c)サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む、医薬組成物とを、それを必要とする前記対象に投与するステップを含む処置方法

請求項2

抗生物質を投与するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。

請求項3

a)対象における免疫応答を抑制するのに十分な量での、前記対象への少なくとも1つの免疫抑制薬の投与を含む準備レジメンと;b)前記対象における細菌感染症を阻害するのに十分な量での、抗生物質を含む医薬組成物と;c)サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む、医薬組成物とを、それを必要とする前記対象に投与するステップを含む処置方法。

請求項4

抗真菌剤を投与するステップをさらに含む、請求項3に記載の方法。

請求項5

a)対象における免疫応答を減少させるのに十分な量での、シクロホスファミドおよびフルダラビンを含む医薬組成物と;b)前記対象における真菌感染症を阻害するのに十分な量での、フルコナゾールを含む医薬組成物と;c)サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む医薬組成物とを、それを必要とする前記対象に投与するステップを含む処置方法。

請求項6

前記対象における細菌感染症を阻害するのに十分な量での、トリメトプリムおよびスルファメトキサゾールを含む医薬組成物を投与するステップをさらに含む、請求項5に記載の方法。

請求項7

a)対象における免疫応答を減少させるのに十分な量での、シクロホスファミドおよびフルダラビンを含む医薬組成物と;b)前記対象における細菌感染症を阻害するのに十分な量での、トリメトプリムおよびスルファメトキサゾールを含む医薬組成物と;c)サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む医薬組成物とを、それを必要とする前記対象に投与するステップを含む処置方法。

請求項8

前記対象における真菌感染症を阻害するのに十分な量での、フルコナゾールを含む医薬組成物を投与するステップをさらに含む、請求項7に記載の方法。

請求項9

がん処置するための方法であって、治療有効量のexvivo操作腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、前記exvivo操作TILが、前記exvivo操作TILにおけるサイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)タンパク質機能の抑制をもたらすCISH遺伝子における破壊を含み、前記破壊が、配列番号68のガイドポリ核酸が結合した配列において起こる、方法。

請求項10

前記準備レジメンが、前記TIL投与の約14日〜約24時間前に、前記免疫抑制薬の投与を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。

請求項11

前記準備レジメンが、前記TIL投与の約10日〜約24時間前に、前記免疫抑制薬の投与を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。

請求項12

前記準備レジメンが、前記TIL投与の約7日〜約24時間前に、前記免疫抑制薬の投与を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。

請求項13

前記免疫抑制薬が、放射線療法剤生物学的薬剤または化学薬剤を含む、請求項1〜4および10〜12のいずれか一項に記載の方法。

請求項14

前記免疫抑制薬が、前記化学薬剤を含む、請求項13に記載の方法。

請求項15

請求項16

前記化学薬剤が、前記シクロホスファミドを含む、請求項15に記載の方法。

請求項17

前記化学薬剤が、フルダラビンである、請求項15に記載の方法。

請求項18

前記シクロホスファミドが、前記対象の約40mg/kg〜約50mg/kgで投与される、請求項15〜17のいずれか一項に記載の方法。

請求項19

前記シクロホスファミドが、少なくとも約2日間〜約5日間にわたって前記対象に投与される、請求項18に記載の方法。

請求項20

前記シクロホスファミドが、前記対象の約10mg/kg〜約15mg/kgで投与される、請求項15〜17のいずれか一項に記載の方法。

請求項21

前記シクロホスファミドが、少なくとも約7日間〜約10日間にわたって前記対象に投与される、請求項20に記載の方法。

請求項22

前記シクロホスファミドが、前記対象1kg当たり約3mg〜前記対象1kg当たり約5mgで投与される、請求項15〜17のいずれか一項に記載の方法。

請求項23

前記シクロホスファミドが、前記対象1kg当たり約50mg〜約80mg/kgで投与される、請求項15〜17のいずれか一項に記載の方法。

請求項24

前記シクロホスファミドが、1kg当たり50mgを超えて投与される、請求項15〜17のいずれか一項に記載の方法。

請求項25

前記シクロホスファミドが、1kg当たり約60mgで投与される、請求項24に記載の方法。

請求項26

前記フルダラビンが、前記対象の体表面積の約20mg/m2〜約30mg/m2で投与される、請求項15〜25のいずれか一項に記載の方法。

請求項27

前記フルダラビンが、前記対象の体表面積の約25mg/m2で投与される、請求項26に記載の方法。

請求項28

前記準備レジメンが、部分的または完全免疫抑制を含む、請求項1〜4および10〜27のいずれか一項に記載の方法。

請求項29

前記抗真菌薬が、ポリエンアゾールアリルアミンおよびエキノキャンディンからなる群から選択される、請求項1、2、4および10〜28のいずれか一項に記載の方法。

請求項30

前記抗真菌薬が、前記アゾールである、請求項29に記載の方法。

請求項31

前記アゾールが、ビホナゾールブトコナゾールクロトリマゾールエコナゾールフェンコナゾールイソコナゾールケトコナゾールルリコナゾールミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾールセルタコナゾールスルコナゾールチオコナゾールアルバコナゾールエフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾールポサコナゾールプロピコナゾールラブコナゾール、テルコナゾール、およびボリコナゾールからなる群から選択される、請求項30に記載の方法。

請求項32

前記アゾールが、フルコナゾールである、請求項31に記載の方法。

請求項33

前記フルコナゾールが、約100mg〜約800mgで投与される、請求項32に記載の方法。

請求項34

前記フルコナゾールが、400mgで投与される、請求項33に記載の方法。

請求項35

前記抗真菌薬が、前記TILと同時にまたは逐次に投与される、請求項1、2、4および10〜34のいずれか一項に記載の方法。

請求項36

前記抗真菌薬が、前記TILの約0日後〜約4日後に投与される、請求項35に記載の方法。

請求項37

前記抗生物質が、細菌壁標的剤細胞膜標的剤、細菌酵素干渉剤殺菌剤タンパク質合成インヒビターまたは静菌剤のうちの少なくとも1つを含む、請求項2〜4および10〜36のいずれか一項に記載の方法。

請求項38

前記抗生物質が、殺菌剤を含む、請求項37に記載の方法。

請求項39

前記殺菌剤が、セファロスポリンまたはキノロンである、請求項38に記載の方法。

請求項40

前記抗生物質が、静菌剤を含む、請求項37に記載の方法。

請求項41

前記静菌剤が、予防的に投与される、請求項40に記載の方法。

請求項42

前記静菌剤が、トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンである、請求項37〜41のいずれか一項に記載の方法。

請求項43

前記トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンが、約100mg〜約1000mgで投与される、請求項42に記載の方法。

請求項44

前記トリメトプリムが、160mgで投与される、請求項43に記載の方法。

請求項45

前記スルファメトキサゾールが、800mgで投与される、請求項43に記載の方法。

請求項46

前記ペンタミジンが、300mgで投与される、請求項43に記載の方法。

請求項47

前記静菌剤が、前記TILの前に、前記TILと同時に、または前記TILの後に投与される、請求項37〜46のいずれか一項に記載の方法。

請求項48

前記静菌剤が、前記TILの前記投与の約14日前〜前記TILの前記投与の約6カ月後に投与される、請求項47に記載の方法。

請求項49

前記静菌剤が、前記TILの約8日前〜前記TILの少なくとも4日後に投与される、請求項37〜48のいずれか一項に記載の方法。

請求項50

前記投与が、静脈内、経口、筋肉内、腹腔内または胸膜内投与を含む、請求項1〜49のいずれか一項に記載の方法。

請求項51

前記免疫抑制薬が、注入によって投与される、請求項1〜50のいずれか一項に記載の方法。

請求項52

前記シクロホスファミドが、約60mg/kgの用量であり、250mlの5%デキストロース水溶液希釈され、1時間にわたって注入される、請求項15〜51のいずれか一項に記載の方法。

請求項53

前記フルダラビンが、100mlの0.9%塩化ナトリウム、USPにおける25mg/m2の用量であり、約15〜約30分間にわたって注入される、請求項15〜52のいずれか一項に記載の方法。

請求項54

前記対象における前記TILを活性化するのに十分な量での免疫刺激薬を含む医薬組成物を投与するステップをさらに含む、請求項1〜53のいずれか一項に記載の方法。

請求項55

前記免疫刺激薬が、ワクチンコロニー刺激剤インターフェロンインターロイキンウイルス抗原共刺激剤免疫原性薬剤免疫モジュレーターまたは免疫療法剤からなる群から選択される少なくとも1つのメンバーを含む、請求項54に記載の方法。

請求項56

前記免疫刺激薬が、前記インターロイキンを含む、請求項55に記載の方法。

請求項57

前記インターロイキンが、アルデスロイキンであり、約550,000〜約800,000IU/kgの用量で投与される、請求項56に記載の方法。

請求項58

前記アルデスロイキンが、約720,000IU/kgの用量で投与される、請求項57に記載の方法。

請求項59

前記対象における感染症を防止するのに十分な量での感染予防剤を含む医薬組成物を投与するステップをさらに含む、請求項1〜58のいずれか一項に記載の方法。

請求項60

前記感染予防剤が、ヘルペスウイルス予防薬剤である、請求項59に記載の方法。

請求項61

前記対象が、HSV陽性である、請求項60に記載の方法。

請求項62

前記ヘルペスウイルス予防薬剤が、バラシクロビルまたはアシクロビルである、請求項60または61に記載の方法。

請求項63

前記破壊が、CRISPR、亜鉛フィンガー、TALENおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される系によって誘導される、請求項1〜62のいずれか一項に記載の方法。

請求項64

前記系が、CRISPR系である、請求項63に記載の方法。

請求項65

前記CRISPR系が、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、およびCas9HiFiからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼを含む、請求項63または64に記載の方法。

請求項66

前記エンドヌクレアーゼが、Cas9である、請求項65に記載の方法。

請求項67

前記エンドヌクレアーゼが、前記破壊を行う、請求項65または66に記載の方法。

請求項68

前記破壊が、遺伝子のエクソンまたはイントロンを含む、請求項1〜67のいずれか一項に記載の方法。

請求項69

前記破壊が、遺伝子のエクソン中である、請求項68に記載の方法。

請求項70

前記破壊が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の約20塩基対以内である、請求項1〜69のいずれか一項に記載の方法。

請求項71

前記破壊が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の約10塩基対以内である、請求項1〜70のいずれか一項に記載の方法。

請求項72

前記破壊が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の約5塩基対以内である、請求項1〜71のいずれか一項に記載の方法。

請求項73

前記破壊が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)から3塩基対である、請求項1〜72のいずれか一項に記載の方法。

請求項74

前記破壊が、配列番号13のエクソンまたはイントロン中である、請求項1〜73のいずれか一項に記載の方法。

請求項75

前記破壊が、配列番号13のエクソン中である、請求項74に記載の方法。

請求項76

前記CRISPR系が、ガイドポリ核酸を含む、請求項63〜75のいずれか一項に記載の方法。

請求項77

前記ガイドポリ核酸が、配列番号68に対して少なくとも約60%の相同性を含む、請求項76に記載の方法。

請求項78

前記破壊が、二本鎖切断を含む、請求項1〜77のいずれか一項に記載の方法。

請求項79

前記二本鎖切断が、配列番号71または配列番号77で生じる、請求項78に記載の方法。

請求項80

前記TILが、細胞約1×109個、細胞3×109個、細胞1×1010個、細胞3×1010個〜細胞約1×1011個の用量で投与される、請求項1〜79のいずれか一項に記載の方法。

請求項81

前記TILが、約30分間にわたって投与される、請求項1〜80のいずれか一項に記載の方法。

請求項82

前記TILが、静脈内投与される、請求項1〜81のいずれか一項に記載の方法。

請求項83

前記静脈内投与が、注入を含む、請求項82に記載の方法。

請求項84

前記TILにおいて注入前試験を行うステップをさらに含む、請求項1〜83のいずれか一項に記載の方法。

請求項85

前記注入前試験が、表現型試験、効力試験、微生物学的試験エンドトキシン試験生存率試験および腫瘍細胞試験のうちの少なくとも1つを含む、請求項84に記載の方法。

請求項86

前記表現型試験が、前記TILにおけるCD3の存在を検出するステップを含む、請求項85に記載の方法。

請求項87

前記効力試験が、前記TILの抗CD3刺激後に、IFNγのレベルを検出するステップを含む、請求項85または86に記載の方法。

請求項88

前記微生物学的試験が、好気培養嫌気培養グラム状態、真菌状態またはマイコプラズマ状態の増殖を検出するステップを含む、請求項85〜87のいずれか一項に記載の方法。

請求項89

前記エンドトキシン試験が、リムルスアッセイを行うステップを含む、請求項85〜88のいずれか一項に記載の方法。

請求項90

前記生存率試験が、トリパンブルー排除アッセイを行うステップを含む、請求項85〜89のいずれか一項に記載の方法。

請求項91

前記腫瘍細胞試験が、細胞病理学アッセイを含む、請求項85〜90のいずれか一項に記載の方法。

請求項92

前記注入前試験が、前記微生物学的試験について陰性である場合、前記TILが投与される、請求項84〜91のいずれか一項に記載の方法。

請求項93

前記注入前試験が、前記生存率試験について少なくとも約70%超の生細胞である場合、前記TILが投与される、請求項84〜92のいずれか一項に記載の方法。

請求項94

前記注入前試験が、前記表現型試験について少なくとも約80%CD3陽性である場合、前記TILが投与される、請求項84〜93のいずれか一項に記載の方法。

請求項95

前記注入前試験が、前記効力試験において前記TILの抗CD3刺激後に細胞105個当たり少なくとも約200pg/mLのIFNγである場合、前記TILが投与される、請求項84〜94のいずれか一項に記載の方法。

請求項96

前記注入前試験が、前記細胞病理学試験において検討された少なくとも約200個のTIL当たりで腫瘍細胞について陰性である場合、前記TILが投与される、請求項84〜95のいずれか一項に記載の方法。

請求項97

サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の剤形と;抗真菌剤の剤形とを含む治療用製品

請求項98

前記対象における真菌感染症を阻害するのに十分な量での、葉酸合成インヒビターまたは核酸架橋剤の剤形と;サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の剤形とを含む治療用製品。

請求項99

ポリエン、アゾール、アリルアミンまたはエキノキャンディンから選択される抗真菌剤の剤形と;サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の剤形とを含む治療用製品。

請求項100

サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の剤形を含む治療用製品であって、前記TILが、約7.0×107細胞/mL〜約2.0×108細胞/mLの凍結密度凍結保存される、治療用製品。

請求項101

a)抗真菌剤の剤形と;b)免疫抑制薬の剤形と;c)抗生物質の剤形と;e)サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の剤形とを含む治療用製品。

請求項102

免疫抑制薬の剤形をさらに含む、請求項97〜100のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項103

前記免疫抑制薬が、前記TILの投与の約14日〜約24時間前に、対象への投与のために製剤化される、請求項102に記載の治療用製品。

請求項104

前記免疫抑制薬が、前記TILの前記投与の約10日〜約24時間前に、対象への投与のために製剤化される、請求項102または103に記載の治療用製品。

請求項105

前記免疫抑制薬が、前記TILの前記投与の約7日〜約24時間前に、対象への投与のために製剤化される、請求項102〜104のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項106

前記免疫抑制薬が、放射線療法剤、生物学的薬剤または化学薬剤を含む、請求項102〜105のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項107

前記免疫抑制薬が、前記化学薬剤を含む、請求項106に記載の治療用製品。

請求項108

前記化学薬剤が、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド、チオテパ、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、フルダラビン、ニトロソウレア、白金、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンC、ブレオマイシンおよびミスラマイシンからなる群から選択される少なくとも1つのメンバーを含む、請求項107に記載の治療用製品。

請求項109

前記化学薬剤が、シクロホスファミドを含む、請求項108に記載の治療用製品。

請求項110

前記化学薬剤が、フルダラビンを含む、請求項108に記載の治療用製品。

請求項111

前記シクロホスファミドが、前記対象の約40mg/kg〜約50mg/kgで投与される、請求項108〜110のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項112

前記シクロホスファミドが、少なくとも約2日間〜約5日間にわたって前記対象に投与される、請求項111に記載の治療用製品。

請求項113

前記シクロホスファミドが、前記対象の約10mg/kg〜約15mg/kgで投与される、請求項108〜110のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項114

前記シクロホスファミドが、少なくとも約7日間〜約10日間にわたって前記対象に投与される、請求項113に記載の治療用製品。

請求項115

前記シクロホスファミドが、前記対象1kg当たり約3mg〜前記対象1kg当たり約5mgで投与される、請求項108〜110のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項116

前記シクロホスファミドが、前記対象1kg当たり約50mg〜約80mg/kgで投与される、請求項108〜110のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項117

前記シクロホスファミドが、1kg当たり50mgを超えて投与される、請求項108〜110のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項118

前記シクロホスファミドが、1kg当たり約60mgで投与される、請求項117に記載の治療用製品。

請求項119

前記フルダラビンが、前記対象の体表面積の約20mg/m2〜約30mg/m2で投与される、請求項108〜118のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項120

前記フルダラビンが、前記対象の体表面積の約25mg/m2で投与される、請求項119に記載の治療用製品。

請求項121

前記免疫抑制薬が、部分的または完全免疫抑制を生じる、請求項102〜120のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項122

抗真菌剤の前記剤形が、ポリエン、アゾール、アリルアミンおよびエキノキャンディンからなる群から選択される、請求項97〜121のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項123

前記抗真菌剤が、アゾールである、請求項122に記載の治療用製品。

請求項124

前記アゾールが、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、および、ボリコナゾールからなる群から選択される、請求項123に記載の治療用製品。

請求項125

前記アゾールが、フルコナゾールである、請求項124に記載の治療用製品。

請求項126

前記フルコナゾールが、約100mg〜約800mgの量で存在する、請求項124または125に記載の治療用製品。

請求項127

前記フルコナゾールが、400mgの量で存在する、請求項126に記載の治療用製品。

請求項128

抗真菌薬の前記剤形が、前記TILと同時にまたは逐次に投与される、請求項97〜127のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項129

抗真菌薬の前記剤形が、前記TILの約0日後〜約4日後に投与される、請求項128に記載の治療用製品。

請求項130

抗生物質の剤形をさらに含む、請求項97〜129のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項131

前記抗生物質が、細菌壁標的剤、細胞膜標的剤、細菌酵素干渉剤、殺菌剤、タンパク質合成インヒビターおよび静菌剤のうちの少なくとも1つを含む、請求項130に記載の治療用製品。

請求項132

前記抗生物質が、殺菌剤を含む、請求項131に記載の治療用製品。

請求項133

前記殺菌剤が、セファロスポリンまたはキノロンである、請求項132に記載の治療用製品。

請求項134

抗生物質の前記剤形が、静菌剤である、請求項130〜133のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項135

前記静菌剤が、予防的投与のために製剤化される、請求項134に記載の治療用製品。

請求項136

前記静菌剤が、トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンである、請求項134または135に記載の治療用製品。

請求項137

前記トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンが、約100mg〜約1000mgの量で存在する、請求項136に記載の治療用製品。

請求項138

前記トリメトプリムが、160mgの量で存在する、請求項137に記載の治療用製品。

請求項139

前記スルファメトキサゾールが、800mgの量で存在する、請求項137に記載の治療用製品。

請求項140

前記ペンタミジンが、300mgの量で存在する、請求項137に記載の治療用製品。

請求項141

前記静菌剤が、前記TILの前に、前記TILと同時に、または前記TILの後に投与される、請求項131〜140のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項142

前記静菌剤が、前記TILの前記投与の約14日前〜前記TILの前記投与の約6カ月後に投与される、請求項141に記載の治療用製品。

請求項143

前記静菌剤が、前記TILの約8日前〜前記TILの少なくとも4日後に投与される、請求項131〜142のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項144

前記剤形を投与するステップをさらに含む、請求項1〜49のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項145

静脈内、経口、筋肉内、腹腔内または胸膜内投与のために製剤化される、請求項144に記載の治療用製品。

請求項146

免疫抑制薬の前記剤形が、注入による投与のために製剤化される、請求項102〜145のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項147

前記シクロホスファミドが、約60mg/kgの用量で投与され、250mlの5%デキストロース水溶液に希釈され、1時間にわたって注入される、請求項108〜146のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項148

前記フルダラビンが、100mlの0.9%塩化ナトリウム、USPにおける25mg/m2の用量で投与され、約15〜約30分間にわたって注入される、請求項108〜147のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項149

前記免疫刺激薬が、前記対象における前記TILを活性化するのに十分な量で存在する、請求項97〜148のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項150

前記免疫刺激薬が、ワクチン、コロニー刺激剤、インターフェロン、インターロイキン、ウイルス、抗原、共刺激剤、免疫原性薬剤、免疫モジュレーターおよび免疫療法剤からなる群から選択される少なくとも1つのメンバーを含む、請求項149に記載の治療用製品。

請求項151

免疫刺激薬の前記剤形が、インターロイキンを含む、請求項150に記載の治療用製品。

請求項152

前記インターロイキンが、アルデスロイキンであり、約550,000〜約800,000IU/kgの用量で投与される、請求項151に記載の治療用製品。

請求項153

前記アルデスロイキンが、約720,000IU/kgの用量で投与される、請求項152に記載の治療用製品。

請求項154

前記対象における感染症を防止するのに十分な量での感染予防剤の剤形をさらに含む、請求項97〜153のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項155

前記感染予防剤が、ヘルペスウイルス予防薬剤である、請求項154に記載の治療用製品。

請求項156

前記ヘルペスウイルス予防薬剤が、HSV陽性対象の処置に有効な量で存在する、請求項155に記載の治療用製品。

請求項157

前記ヘルペスウイルス予防薬剤が、バラシクロビルまたはアシクロビルである、請求項155または156に記載の治療用製品。

請求項158

前記破壊が、CRISPR、亜鉛フィンガー、TALENおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される系によって誘導される、請求項97〜157のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項159

前記系が、CRISPR系である、請求項158に記載の治療用製品。

請求項160

前記CRISPR系が、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、およびCas9HiFiからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼを含む、請求項158または159に記載の治療用製品。

請求項161

前記エンドヌクレアーゼが、Cas9である、請求項160に記載の治療用製品。

請求項162

前記エンドヌクレアーゼが、前記破壊を行う、請求項160または161に記載の治療用製品。

請求項163

前記破壊が、遺伝子のエクソンまたはイントロンを含む、請求項97〜162のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項164

前記破壊が、遺伝子のエクソン中である、請求項163に記載の治療用製品。

請求項165

前記破壊が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の約20塩基対以内である、請求項97〜164のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項166

前記破壊が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の約10塩基対以内である、請求項97〜164のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項167

前記破壊が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の約5塩基対以内である、請求項97〜164のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項168

前記破壊が、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)から3塩基対である、請求項97〜167のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項169

前記破壊が、配列番号13のエクソンまたはイントロン中である、請求項97〜168のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項170

前記破壊が、配列番号13のエクソン中である、請求項169に記載の治療用製品。

請求項171

前記CRISPR系が、ガイドポリ核酸を含む、請求項158〜170のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項172

前記ガイドポリ核酸が、配列番号68に対して少なくとも約60%の相同性を含む、請求項171に記載の治療用製品。

請求項173

前記破壊が、二本鎖切断を含む、請求項97〜172のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項174

前記二本鎖切断が、配列番号71または配列番号77で生じる、請求項173に記載の治療用製品。

請求項175

前記TILが、細胞約1×109個、細胞3×109個、細胞1×1010個、細胞3×1010個〜細胞約1×1011個の量で存在する、請求項97〜174のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項176

前記TILが、約30分間にわたって投与される、請求項97〜175のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項177

前記TILが、静脈内投与される、請求項97〜176のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項178

前記静脈内投与が、注入を含む、請求項177に記載の治療用製品。

請求項179

前記TILにおける注入前試験を行うステップをさらに含む、請求項97〜178のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項180

前記注入前試験が、表現型試験、効力試験、微生物学的試験、エンドトキシン試験、生存率試験および腫瘍細胞試験のうちの少なくとも1つを含む、請求項179に記載の治療用製品。

請求項181

前記表現型試験が、前記TILにおけるCD3の存在を検出するステップを含む、請求項180に記載の治療用製品。

請求項182

前記効力試験が、前記TILの抗CD3刺激後に、IFNγのレベルを検出するステップを含む、請求項180または181に記載の治療用製品。

請求項183

前記微生物学的試験が、好気培養、嫌気培養、グラム状態、真菌状態またはマイコプラズマ状態の増殖を検出するステップを含む、請求項180〜182のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項184

前記エンドトキシン試験が、リムルスアッセイを行うステップを含む、請求項180〜183のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項185

前記生存率試験が、トリパンブルー排除アッセイを行うステップを含む、請求項180〜184のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項186

前記腫瘍細胞試験が、細胞病理学アッセイを含む、請求項180〜185のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項187

前記注入前試験が、前記微生物学的試験について陰性である場合、前記TILが投与される、請求項97〜186のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項188

前記注入前試験が、前記生存率試験について少なくとも約70%超の生細胞である場合、前記TILが投与される、請求項97〜187のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項189

前記注入前試験が、前記表現型試験について少なくとも約80%CD3陽性である場合、前記TILが投与される、請求項97〜188のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項190

前記注入前試験が、前記効力試験において前記TILの抗CD3刺激後に細胞105個当たり少なくとも約200pg/mLのIFNγである場合、前記TILが投与される、請求項97〜189のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項191

前記注入前試験が、前記細胞病理学試験において検討された少なくとも約200個のTIL当たりで腫瘍細胞について陰性である場合、前記TILが投与される、請求項97〜190のいずれか一項に記載の治療用製品。

請求項192

配列番号64〜配列番号69のいずれか1つに対して少なくとも60%の配列相同性を含む核酸組成物

請求項193

前記配列相同性が、少なくとも約65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または最大約100%である、請求項192に記載の核酸組成物。

技術分野

0001

関連出願
本願は、2016年10月18日出願の米国仮特許出願第62/409,651号および2017年1月30日出願の米国仮特許出願第62/452,244号の優先権を主張し、当該出願の各々は、全ての目的について全体が参照により本明細書に組み込まれる。

背景技術

0002

腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の養子移入は、転移性黒色腫耐久性がある退縮を媒介することにおいて相当な成功を収めた。このような成功にもかかわらず、他の固形腫瘍の状況下でのTIL療法の使用は、難度が高かった。これは、腫瘍微小環境によって発揮される抑制効果ならびに受容体シグナル伝達およびエフェクター機能獲得におけるT細胞固有機能障害によるものである可能性がある。プログラム細胞死タンパク質1(PD−1)および細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質(CTLA−4)機能をターゲティングする、モノクローナル抗体に基づく免疫チェックポイントインヒビターは、T細胞外因性抑制効果を軽減し得る場合もあるが、それらに非腫瘍反応性T細胞に対して全身性活性があることに起因する潜在的に致死的自己免疫性副作用リスクを有する。近年、腫瘍上の分子標的をin vivoで認識するためのリンパ球遺伝子操作が著しく進歩した結果として、腫瘍標的寛解の目覚ましい症例がもたらされている。しかし、これらの成功は、主に、血液学的腫瘍に限定されており、特定の腫瘍内の細胞によって発現される同定可能分子欠如、および腫瘍破壊を媒介するために腫瘍標的への特異的結合に使用することができる分子の欠如により、固形腫瘍へのより広範な適用は、限定的である。近年におけるいくつかの進歩は、場合によって抗腫瘍細胞応答を誘発する腫瘍特異的変異の同定に焦点を当てている。例えば、これらの内因性変異は、全エクソムシケンシング法を使用して同定することができる。Tran Eら、「Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer」、Science 344巻:641〜644頁(2014年)。

先行技術

0003

Tran Eら、「Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer」、Science 344巻:641〜644頁(2014年)

課題を解決するための手段

0004

発明の要旨
本明細書では、対象における免疫応答を減少させるのに十分な量での、対象への少なくとも1つの免疫抑制薬投与を含む準備レジメン;対象における真菌感染症阻害するのに十分な量での、抗真菌剤を含む医薬組成物;およびサイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む処置方法が開示される。場合によって、方法は、抗生物質を投与するステップをさらに含み得る。
本明細書では、対象における免疫応答を抑制するのに十分な量での、対象への少なくとも1つの免疫抑制薬の投与を含む準備レジメン;対象における細菌感染症を阻害するのに十分な量での、抗生物質を含む医薬組成物;およびサイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む処置方法が開示される。場合によって、方法は、抗真菌剤を投与するステップをさらに含み得る。

0005

本明細書では、対象における免疫応答を減少させるのに十分な量での、シクロホスファミドおよびフルダラビンを含む医薬組成物;対象における真菌感染症を阻害するのに十分な量での、フルコナゾールを含む医薬組成物;ならびにサイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、処置方法が開示される。場合によって、方法は、対象における細菌感染症を阻害するのに十分な量での、トリメトプリムおよびスルファメトキサゾールを含む医薬組成物を投与するステップをさらに含み得る。

0006

本明細書では、対象における免疫応答を減少させるのに十分な量での、シクロホスファミドおよびフルダラビンを含む医薬組成物;前記対象における細菌感染症を阻害するのに十分な量での、トリメトプリムおよびスルファメトキサゾールを含む医薬組成物;ならびにサイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む、複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、処置方法が開示される。場合によって、方法は、対象における真菌感染症を阻害するのに十分な量での、フルコナゾールを含む医薬組成物を投与するステップをさらに含み得る。

0007

本明細書では、治療有効量のex vivo操作腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、がん処置するための方法であって、ex vivo操作TILが、ex vivo操作TILにおけるCISHタンパク質機能の抑制をもたらすサイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子における破壊を含み、破壊が、配列番号68のガイドポリ核酸が結合した配列において起こる、方法が開示される。場合によって、準備レジメンは、TILの投与の約14日〜約24時間前の免疫抑制薬の投与を含む。場合によって、準備レジメンは、TILの投与の約10日〜約24時間前の免疫抑制薬の投与を含む。準備レジメンは、TILの投与の約7日〜約24時間前の免疫抑制薬の投与を含み得る。場合によって、免疫抑制薬は、放射線療法剤生物学的薬剤または化学薬剤を含む。免疫抑制薬は、化学薬剤を含み得る。化学薬剤は、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロランブシルメルファランイホスファミドチオテパヘキサメチルメラミンブスルファン、フルダラビン、ニトロソウレア白金メトトレキサートアザチオプリンメルカプトプリンプロカルバジンダカルバジンテモゾロミドカルムスチンロムスチンストレプトゾシンフルオロウラシルダクチノマイシンアントラサイクリンマイトマイシンCブレオマイシンおよびミスラマシンからなる群から選択される少なくとも1つのメンバーを含み得る。化学薬剤は、シクロホスファミドを含み得る。化学薬剤は、フルダラビンであり得る。シクロホスファミドは、対象の約40mg/kg〜約50mg/kgで投与され得る。シクロホスファミドは、少なくとも約2日間〜約5日間にわたって対象に投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、対象の約10mg/kg〜約15mg/kgで投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、少なくとも約7日間〜約10日間にわたって対象に投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、対象1kg当たり約3mg〜対象1kg当たり約5mgで投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、対象1kg当たり約50mg〜約80mg/kgで投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、1kg当たり50mgを超えて投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、1kg当たり約60mgで投与され得る。場合によって、フルダラビンは、対象の体表面積の約20mg/m2〜約30mg/m2で投与され得る。場合によって、フルダラビンは、対象の体表面積の約25mg/m2で投与され得る。場合によって、準備レジメンは、部分的または完全免疫抑制を含む。抗真菌薬は、ポリエンアゾールアリルアミンおよびエキノキャンディンからなる群から選択され得る。抗真菌薬は、アゾールであり得る。アゾールは、ビホナゾールブトコナゾールクロトリマゾールエコナゾールフェンコナゾールイソコナゾールケトコナゾールルリコナゾールミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾールセルタコナゾールスルコナゾールチオコナゾールアルバコナゾールエフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾールポサコナゾールプロピコナゾールラブコナゾール、テルコナゾール、およびボリコナゾールからなる群から選択され得る。アゾールである抗真菌薬は、フルコナゾールであり得る。場合によって、フルコナゾールは、約100mg〜約800mgで投与され得る。フルコナゾールは、400mgで投与され得る。抗真菌薬は、TILと同時にまたは逐次投与され得る。抗真菌薬は、TILの約0日後〜約4日後に投与され得る。場合によって、抗生物質は、細菌壁ターゲティング剤細胞膜ターゲティング剤、細菌酵素干渉剤殺菌剤タンパク質合成インヒビターまたは静菌剤のうちの少なくとも(least)1つを含む。場合によって、抗生物質は、殺菌剤を含む。殺菌剤は、セファロスポリンまたはキノロンであり得る。場合によって、抗生物質は、静菌剤を含む。静菌剤は、予防的に投与され得る。場合によって、静菌剤は、トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンであり得る。トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンは、約100mg〜約1000mgで投与され得る。場合によって、トリメトプリムは、160mgで投与され得る。場合によって、スルファメトキサゾールは、800mgで投与され得る。場合によって、ペンタミジンは、300mgで投与され得る。静菌剤は、TILの前に、TILと同時に、またはTILの後に投与され得る。静菌剤は、TILの投与の約14日前〜TILの投与の約6カ月後に投与され得る。場合によって、静菌剤は、前記TILの約8日前〜TILの少なくとも4日後に投与され得る。

0008

場合によって、投与は、静脈内、経口、筋肉内、腹腔内または胸膜内投与を含む。場合によって、免疫抑制薬は、注入によって投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、約60mg/kgの用量であり得、250mlの5%デキストロース水溶液希釈され、1時間にわたって注入される。場合によって、フルダラビンは、100mlの0.9%塩化ナトリウム、USPにおける25mg/m2の用量であり得、約15〜約30分間にわたって注入され得る。方法は、対象におけるTILを活性化するのに十分な量の免疫刺激薬を含む医薬組成物を投与するステップをさらに含み得る。免疫刺激薬は、ワクチンコロニー刺激剤インターフェロンインターロイキンウイルス抗原共刺激剤免疫原性薬剤免疫モジュレーターまたは免疫療法剤からなる群から選択される少なくとも1つのメンバーを含み得る。免疫刺激薬は、インターロイキンを含み得る。インターロイキンは、アルデスロイキンであり得、約550,000〜約800,000IU/kgの用量で投与され得る。場合によって、アルデスロイキンは、約720,000IU/kgの用量で投与され得る。場合によって、方法は、対象における感染を防止するのに十分な量の感染予防剤を含む医薬組成物を投与するステップをさらに含み得る。場合によって、感染予防剤は、ヘルペスウイルス予防薬剤であり得る。場合によって、対象は、HSV陽性であり得る。場合によって、ヘルペスウイルス予防薬剤は、バラシクロビルまたはアシクロビルであり得る。場合によって、破壊は、CRISPR、亜鉛フィンガー、TALENおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される系によって誘導され得る。系は、CRISPR系であり得る。CRISPR系は、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、およびCas9HiFiからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼを含み得る。エンドヌクレアーゼは、Cas9であり得る。場合によって、エンドヌクレアーゼは、破壊を行う。破壊は、遺伝子のエクソンまたはイントロンを含み得る。破壊は、遺伝子のエクソン中であり得る。破壊は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の約20塩基対以内であり得る。破壊は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の約10塩基対以内であり得る。破壊は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の約5塩基対以内であり得る。破壊は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)から3塩基対であり得る。場合によって、破壊は、配列番号13のエクソンまたはイントロン中である。破壊は、配列番号13のエクソン中であり得る。場合によって、CRISPR系は、ガイドポリ核酸を含む。ガイドポリ核酸(polynucleic)は、配列番号68に対する少なくとも約60%相同性を含み得る。場合によって、破壊は、二本鎖切断を含む。二本鎖切断は、配列番号71または配列番号77で生じ得る。場合によって、TILは、細胞約1×109個、細胞3×109個、細胞1×1010個、細胞3×1010個〜細胞約1×1011個の用量で投与され得る。場合によって、TILは、約30分間にわたって投与され得る。場合によって、TILは、静脈内投与され得る。静脈内投与は、注入を含み得る。

0009

場合によって、方法は、TILに関する注入前試験を行うステップをさらに含み得る。注入前試験は、表現型試験、効力試験、微生物学的試験エンドトキシン試験生存率試験および腫瘍細胞試験のうちの少なくとも1つを含み得る。場合によって、表現型試験は、TILにおけるCD3の存在を検出するステップを含む。場合によって、効力試験は、TILの抗CD3刺激後のIFNγのレベルを検出するステップを含む。場合によって、微生物学的試験は、好気培養嫌気培養グラム状態、真菌状態またはマイコプラズマ状態の増殖を検出するステップを含む。エンドトキシン試験は、リムルスアッセイを行うステップを含み得る。場合によって、生存率試験は、トリパンブルー排除アッセイを行うステップを含む。場合によって、腫瘍細胞試験は、細胞病理学アッセイを含む。場合によって、注入前試験が微生物学的試験について陰性であり得る場合、TILは、投与され得る。場合によって、注入前試験が、前記生存率試験について少なくとも約70%生細胞を超える場合、TILは、投与され得る。場合によって、注入前試験が、表現型試験について少なくとも約80%CD3陽性である場合、TILは、投与され得る。場合によって、注入前試験が、効力試験においてTILの抗CD3刺激後に細胞105個当たり少なくとも約200pg/mLのIFNγである場合、TILは、投与され得る。場合によって、注入前試験が、細胞病理学試験において検討された少なくとも約200個のTIL当たりで腫瘍細胞について陰性であり得る場合、TILは、投与され得る。

0010

本明細書では、サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の剤形;および抗真菌剤の剤形を含む治療用製品が開示される。

0011

本明細書では、対象における真菌感染症を阻害するのに十分な量での葉酸合成インヒビターまたは核酸架橋剤の剤形;およびサイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の剤形を含む治療用製品が開示される。

0012

本明細書では、ポリエン、アゾール、アリルアミンまたはエキノキャンディンから選択される抗真菌剤の剤形;およびサイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の剤形を含む治療用製品が開示される。

0013

本明細書では、サイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の剤形を含む治療用製品が開示され、TILは、約7.0×107細胞/mL〜約2.0×108細胞/mLの凍結密度凍結保存されている。

0014

本明細書では、抗真菌剤の剤形;免疫抑制薬の剤形;抗生物質の剤形;およびサイトカイン誘導性SH2含有タンパク質(CISH)遺伝子の少なくとも一部の破壊を含む複数の腫瘍浸潤リンパ球(TIL)の剤形を含む治療用製品が開示される。場合によって、治療用製品は、免疫抑制薬の剤形をさらに含み得る。免疫抑制薬は、TILの投与の約14日〜約24時間前の対象への投与のために製剤化され得る。場合によって、免疫抑制薬は、TILの投与の約10日〜約24時間前の対象への投与のために製剤化され得る。場合によって、免疫抑制薬は、TILの投与の約7日〜約24時間前の対象への投与のために製剤化され得る。場合によって、免疫抑制薬は、放射線療法剤、生物学的薬剤または化学薬剤を含む。場合によって、免疫抑制薬は、化学薬剤を含む。場合によって、化学薬剤は、シクロホスファミド、メクロレタミン、クロラムブシル、メルファラン、イホスファミド、チオテパ、ヘキサメチルメラミン、ブスルファン、フルダラビン、ニトロソウレア、白金、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、フルオロウラシル、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンC、ブレオマイシンおよびミスラマイシンからなる群から選択される少なくとも1つのメンバーを含む。場合によって、化学薬剤は、シクロホスファミドを含む。場合によって、化学薬剤は、フルダラビンを含む。場合によって、シクロホスファミドは、対象の約40mg/kg〜約50mg/kgで投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、少なくとも約2日間〜約5日間にわたって対象に投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、対象の約10mg/kg〜約15mg/kgで投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、少なくとも約7日間〜約10日間にわたって対象に投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、対象1kg当たり約3mg〜対象1kg当たり約5mgで投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、対象1kg当たり約50mg〜約80mg/kgで投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、1kg当たり50mgを超えて投与され得る。場合によって、シクロホスファミドは、1kg当たり約60mgで投与され得る。場合によって、フルダラビンは、対象の体表面積の約20mg/m2〜約30mg/m2で投与され得る。場合によって、フルダラビンは、対象の体表面積の約25mg/m2で投与され得る。場合によって、免疫抑制薬は、部分的または完全免疫抑制を生じる。場合によって、抗真菌剤の剤形は、ポリエン、アゾール、アリルアミンおよびエキノキャンディンからなる群から選択され得る。場合によって、抗真菌剤は、アゾールであり得る。アゾールは、ビホナゾール、ブトコナゾール、クロトリマゾール、エコナゾール、フェンチコナゾール、イソコナゾール、ケトコナゾール、ルリコナゾール、ミコナゾール、オモコナゾール、オキシコナゾール、セルタコナゾール、スルコナゾール、チオコナゾール、アルバコナゾール、エフィナコナゾール、エポキシコナゾール、フルコナゾール、イサブコナゾール、イトラコナゾール、ポサコナゾール、プロピコナゾール、ラブコナゾール、テルコナゾール、および、ボリコナゾールからなる群から選択され得る。場合によって、アゾールは、フルコナゾールであり得る。場合によって、フルコナゾールは、約100mg〜約800mgの量で存在し得る。場合によって、フルコナゾールは、400mgの量で存在し得る。場合によって、抗真菌薬の剤形は、TILと同時にまたは逐次投与され得る。抗真菌薬の剤形は、TILの約0日後〜約4日後に投与され得る。場合によって、治療用製品は、抗生物質の剤形をさらに含み得る。抗生物質は、細菌壁ターゲティング剤、細胞膜ターゲティング剤、細菌酵素干渉剤、殺菌剤、タンパク質合成インヒビターおよび静菌剤のうちの少なくとも1つを含み得る。場合によって、抗生物質は、殺菌剤を含む。殺菌剤は、セファロスポリンまたはキノロンであり得る。場合によって、抗生物質の剤形は、静菌剤であり得る。静菌剤は、予防的投与のために製剤化され得る。場合によって、静菌剤は、トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンであり得る。場合によって、トリメトプリム、スルファメトキサゾールまたはペンタミジンは、約100mg〜約1000mgの量で存在し得る。場合によって、トリメトプリムは、160mgの量で存在し得る。場合によって、スルファメトキサゾールは、800mgの量で存在し得る。場合によって、ペンタミジンは、300mgの量で存在し得る。場合によって、静菌剤は、TILの前に、TILと同時に、またはTILの後に投与され得る。場合によって、静菌剤は、前記TILの前記投与の約14日前〜前記TILの前記投与の約6カ月後に投与され得る。場合によって、静菌剤は、前記TILの約8日前〜前記TILの少なくとも4日後に投与され得る。治療用製品は、剤形の投与をさらに含み得る。

0015

治療用製品は、静脈内、経口、筋肉内、腹腔内または胸膜内投与による投与のために製剤化され得る。場合によって、免疫抑制薬の剤形は、注入による投与のために製剤化され得る。場合によって、シクロホスファミドは、約60mg/kgの用量で投与され得、250mlの5%デキストロース水溶液に希釈され、1時間にわたって注入される。場合によって、フルダラビンは、100mlの0.9%塩化ナトリウム、USPにおける25mg/m2の用量で投与され得、約15〜約30分間にわたって注入され得る。場合によって、免疫刺激薬は、対象におけるTILを活性化するのに十分な量で存在し得る。免疫刺激薬は、ワクチン、コロニー刺激剤、インターフェロン、インターロイキン、ウイルス、抗原、共刺激剤、免疫原性薬剤、免疫モジュレーターおよび免疫療法剤からなる群から選択される少なくとも1つのメンバーを含む。場合によって、免疫刺激薬の剤形は、インターロイキンを含む。インターロイキンは、アルデスロイキンであり得、約550,000〜約800,000IU/kgの用量で投与され得る。場合によって、アルデスロイキンは、約720,000IU/kgの用量で投与され得る。場合によって、治療用製品は、対象における感染を防止するのに十分な量での感染予防剤の剤形をさらに含み得る。感染予防剤は、ヘルペスウイルス予防薬剤であり得る。ヘルペスウイルス予防薬剤は、HSV陽性対象の処置に有効な(effect)量で存在し得る。場合によって、ヘルペスウイルス予防薬剤は、バラシクロビルまたはアシクロビルであり得る。場合によって、破壊は、CRISPR、亜鉛フィンガー、TALENおよびこれらの任意の組合せからなる群から選択される系によって誘導され得る。系は、CRISPR系であり得る。CRISPR系は、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、およびCas9HiFiからなる群から選択されるエンドヌクレアーゼを含み得る。場合によって、エンドヌクレアーゼは、Cas9であり得る。エンドヌクレアーゼは、破壊を行うことができる。破壊は、遺伝子のエクソンまたはイントロンを含み得る。場合によって、破壊は、遺伝子のエクソン中であり得る。場合によって、破壊は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の約20塩基対以内であり得る。場合によって、破壊は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の約10塩基対以内であり得る。場合によって、破壊は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の約5塩基対以内であり得る。場合によって、破壊は、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)から3塩基対であり得る。場合によって、破壊は、配列番号13のエクソンまたはイントロン中であり得る。場合によって、破壊は、配列番号13のエクソン中であり得る。場合によって、CRISPR系は、ガイドポリ核酸を含む。ガイドポリ核酸(polynucleic)は、配列番号68に対する少なくとも約60%相同性を含み得る。破壊は、二本鎖切断を含み得る。場合によって、二本鎖切断は、配列番号71または配列番号77に発生する。場合によって、TILは、細胞約1×109個、細胞3×109個、細胞1×1010個、細胞3×1010個〜細胞約1×1011個の量で存在し得る。場合によって、TILは、約30分間にわたって投与され得る。場合によって、TILは、静脈内投与され得る。静脈内投与は、注入を含み得る。場合によって、治療用製品は、TILに関する注入前試験を行うことをさらに含み得る。場合によって、注入前試験は、表現型試験、効力試験、微生物学的試験、エンドトキシン試験、生存率試験および腫瘍細胞試験のうちの少なくとも1つを含む。場合によって、表現型試験は、前記TILにおけるCD3の存在を検出するステップを含む。場合によって、効力試験は、TILの抗CD3刺激後にIFNγのレベルを検出するステップを含む。場合によって、微生物学的試験は、好気培養、嫌気培養、グラム状態、真菌状態またはマイコプラズマ状態の増殖を検出するステップを含む。場合によって、エンドトキシン試験は、リムルスアッセイを行うステップを含む。場合によって、生存率試験は、トリパンブルー排除アッセイを行うステップを含む。場合によって、腫瘍細胞試験は、細胞病理学アッセイを含む。場合によって、注入前試験が、前記微生物学的試験について陰性である場合、TILは、投与され得る。場合によって、注入前試験が、生存率試験について少なくとも約70%超の生細胞を有する場合、TILは、投与され得る。場合によって、注入前試験が、表現型試験について少なくとも約80%CD3陽性である場合、TILは、投与され得る。注入前試験が、効力試験においてTILの抗CD3刺激後に細胞105個当たり少なくとも約200pg/mLのIFNγである場合、TILは、投与され得る。場合によって、注入前試験が、細胞病理学試験において検討された少なくとも約200個のTIL当たりで腫瘍細胞について陰性であり得る場合、TILは、投与され得る。

0016

本明細書では、配列番号64〜配列番号69のいずれか1つに対する少なくとも60%配列相同性を含む核酸組成物が開示される。場合によって、配列相同性は、少なくとも約65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または最大約100%であり得る。

0017

本明細書では、がんなどの状態を処置する方法であって、腫瘍試料から腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を得るステップと、変異反応性TILを同定するステップと、CRISPRヌクレアーゼにより内因性遺伝子またはその部分を破壊するステップとを含む方法が開示される。場合によって、腫瘍試料は、シーケンシング解析にかけることができる。場合によって、シーケンシング解析は、腫瘍試料に存在し、非腫瘍試料には存在しない変異を同定する。場合によって、シーケンシング解析は、全エクソームシーケンシング、トランスクリプトームシーケンシング、またはこれらの組合せを含み得る。シーケンシング解析は、全エクソームシーケンシングであり得る。

0018

場合によって、同定は、変異を含むペプチドを発現する抗原提示細胞APC)へのTILの導入を含み得る。場合によって、同定は、変異を含むペプチドを発現するAPCに導入されたTILによって分泌されたインターフェロンγ(IFNγ)の存在の検出をさらに含み得る。ペプチドは、約15mer〜最大約30merの長さを含み得る。ペプチドは、25merの長さを含み得る。場合によって、同定は、変異を含むポリ核酸を電気穿孔された抗原提示細胞(APC)へのTILの導入を含み得る。

0019

場合によって、同定は、APCに導入されたTILによって分泌されたインターフェロンγ(IFNγ)の存在の検出をさらに含み得る。破壊は、TILのゲノムにおける二本鎖切断を含み得る。二本鎖切断は、CRISPRヌクレアーゼによって行われ得る。場合によって、CRISPRヌクレアーゼは、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、およびCas9HiFiからなる群から選択され得る。CRISPRヌクレアーゼは、Cas9であり得る。

0020

場合によって、方法は、TILを拡大するステップをさらに含み得る。TILは、ヒトであり得る。方法は、抗真菌薬を対象に投与するステップをさらに含み得る。方法は、抗生物質を対象に投与するステップをさらに含み得る。

0021

本明細書では、それを必要とする対象における消化器がんを処置する方法であって、それを必要とする対象の消化器腫瘍試料から腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を得るステップと、変異反応性TILを同定するステップと、前記変異反応性TILにおいてCRISPRヌクレアーゼによりCISH遺伝子を破壊するステップと、1×109〜約2×1011の用量まで前記TILを拡大するステップとを含み、前記消化器腫瘍試料を、エクソームシーケンシングして、前記腫瘍試料に存在し、健康組織試料には存在しない変異を同定し、前記同定するステップが、抗原提示細胞(APC)の表面における前記変異の提示、およびIFN−γのレベルを検出するための前記APCと前記TILとの培養を含む、方法が開示される。場合によって、提示は、変異を含むポリ核酸を電気穿孔された抗原提示細胞(APC)とTILとの培養を含み得る。場合によって、提示は、変異を含むペプチドをパルスした抗原提示細胞(APC)とTILとの培養を含み得る。サイトカインは、変異反応性TILにおいて検出され得、非変異反応性TILにおいては検出され得ない。サイトカインは、非変異反応性TILにおけるものよりも高レベルで変異反応性TILにおいて検出され得る。CRISPRヌクレアーゼは、Cas9であり得る。TILは、T細胞であり得る。

0022

本発明の新規の特色は、付属の特許請求の範囲において詳細に明示される。本発明の原理が用いられる例示的な実施形態と、付属の図面とを明示する、以下の詳細な記載を参照することにより、本発明の特色および利点のよりよい理解が得られるであろう。

図面の簡単な説明

0023

図1は、Cas9ヌクレアーゼプラスミド、HPRTgRNAプラスミド、Amaxa EGFPmaxプラスミド、およびHPRT標的ベクターを含む、4つのプラスミドの構造を示す。

0024

図2は、潜在的な標的部位において、CRISPR gRNAにより生じる遺伝子改変の%を示す。

0025

図3は、刺激T細胞内のCRISPR誘導性DSBを示す。

0026

図4Aおよび図4Bは、ガイドRNAのトランスフェクション後6日目における、PD−1、CTLA−4、PD−1、およびCTLA−2、またはCCR5、PD−1、およびCTLA−4の発現を示す。代表的ガイド:PD−1(P2、P6、P2/6)、CTLA−4(C2、C3、C2/3)、またはCCR5(CC2)である。Aは、阻害性受容体の発現パーセントを示す。Bは、対照ガイドRNAに対して正規化した、阻害性受容体の発現を示す。

0027

図5Aは、非染色の、ガイドを伴わない対照と比較した、CRISPR、ならびにCTLA−4特異的ガイドRNAである、ガイド#2および#3の電気穿孔の後における、初代ヒトT細胞内のCTLA−4の発現を示す。図5Bは、非染色の、ガイドを伴わない対照と比較した、CRISPR、ならびにPD−1特異的ガイドRNAである、ガイド#2および#6の電気穿孔の後における、初代ヒトT細胞内のPD−1の発現を示す。

0028

図6は、CRISPR、ならびにマルチプレックス化させたCTLA−4ガイドRNAおよびPD−1ガイドRNAの電気穿孔の後における、初代ヒトT細胞内のCTLA−4およびPD−1の発現についてのFACS結果を示す。

0029

図7Aおよび図7Bは、CRISPRによる処置後における、初代ヒトT細胞内の二重ノックアウトパーセントを示す。図7Aは、CTLA−4ガイド#2、#3、#2および#3、PD−1ガイド#2およびCTLA−4ガイド#2、PD−1ガイド#6およびCTLA−4ガイド#3で処置したT細胞内の、CTLA−4ノックアウトパーセントであって、Zapのみ、Cas9のみ、および全てのガイドRNA対照と比較したノックアウトパーセントを示す。図7Bは、PD−1ガイド#2、PD−1ガイド#6、PD−1ガイド#2および#6、PD−1ガイド#2およびCTLA−4ガイド#2、PD−1ガイド#6およびCTLA−4ガイド#3で処置したT細胞内の、PD−1ノックアウトパーセントであって、Zapのみ、Cas9のみ、および全てのガイドRNA対照と比較したノックアウトパーセントを示す。

0030

図8は、CRISPR、およびCTLA−4、PD−1、またはこれらの組合せに特異的なガイドRNAの電気穿孔後における、T細胞の生存率を示す。

0031

図9は、PD−1ガイドRNAのみを導入する条件下、PD−1ガイドRNAおよびCTLA−4ガイドRNAを導入する条件下、またはCCR5ガイドRNA、PD−1ガイドRNA、およびCLTA−4ガイドRNAを導入する条件下、Zapのみによる対照条件下、またはgRNAのみによる対照条件下における、PD−1ガイドRNA#2、#6、#2および#6による切断を示す、CEL−Iアッセイの結果を示す。

0032

図10は、CLTA−4ガイドRNAのみを導入する条件下、PD−1ガイドRNAおよびCTLA−4ガイドRNAを導入する条件下、またはCCR5ガイドRNA、PD−1ガイドRNA、およびCLTA−4ガイドRNAを導入する条件下、Zapのみによる対照条件下、またはgRNAのみによる対照条件下における、CTLA−4ガイドRNA#2、#3、#2および#3による切断を示す、CEL−Iアッセイの結果を示す。

0033

図11は、Zapのみによる対照条件下、Cas9のみによる対照条件下、またはガイドRNAのみによる対照条件下と比較した、CCR5ガイドRNAを導入する条件下、CCR5ガイドRNA、PD−1ガイドRNA、またはCTLA−4ガイドRNAを導入する条件下における、CCR5ガイドRNA#2による切断を示す、CEL−Iアッセイの結果を示す。

0034

図12は、2’O−メチルRNA修飾を伴う、最適化されたCRISPRガイドRNAを、5マイクログラムおよび10マイクログラムで用いる、初代ヒトT細胞内の、TCRアルファのノックアウトであって、FACSにおけるCD3の発現により測定されるノックアウトを示す。

0035

図13は、CRISPR、およびCTLA−4へのガイドRNAによる処置後における、T細胞の生存率および表現型を測定する方法を示す。表現型は、正常FSCSSプロファイルを呈する処置細胞の頻度であって、電気穿孔単独による対照の頻度に対して正規化された頻度を定量化することにより測定した。生存率はまた、FSC/SSCゲートをかけた集団内の細胞による、Viability Dyeの除外によっても測定した。T細胞表現型は、CD3およびCD62Lにより測定する。

0036

図14は、CRISPR、ならびにPD−1へのガイドRNA、ならびにPD−1およびCTLA−4へのガイドRNAによる処置後における、T細胞の生存率および表現型を測定する方法を示す。表現型は、正常FSC/SSCプロファイルを呈する処置細胞の頻度であって、電気穿孔単独による対照の頻度に対して正規化された頻度を定量化することにより測定した。生存率はまた、FSC/SSCゲートをかけた集団内の細胞による、Viability Dyeの除外によっても測定した。T細胞表現型は、CD3およびCD62Lにより測定する。

0037

図15は、初代ヒトT細胞およびJurkat対照への、PD−1ガイドRNAまたはCTLA−4ガイドRNAのトランスフェクション後4日目における、CRISPR遺伝子編集を検出する、T7E1アッセイの結果を示す。NNとは、T7E1ヌクレアーゼを伴わない対照である。

0038

図16は、TIDE(tracking of indels by decomposition)解析の結果を示す。遺伝子編集効率パーセントを、PD−1ガイドRNAおよびCTLA−4ガイドRNAについて示す。

0039

図17は、単一のガイドのトランスフェクションについての、TIDE(tracking of indels by decomposition)解析の結果を示す。欠失または挿入を伴う配列のパーセントを、PD−1ガイドRNAまたはCTLA−1ガイドRNAおよびCRISPRをトランスフェクトした初代ヒトT細胞について示す。

0040

図18は、二重ターゲティングによるPD−1配列の欠失を示す。

0041

図19は、二重ターゲティングによるPD−1配列の欠失についての、PCR産物のシーケンシング結果を示す。試料6および14は、介在する135bpを切り出した、2つのgRNA配列融合体により示される。

0042

図20は、二重ターゲティングによるCTLA−4配列の欠失を示す。二重ガイドによりターゲティングされたCTLA−4のシーケンシングにおいてもまた、2つのガイドRNA配列間の欠失が存在する(試料9および14)。T7E1アッセイは、PCRによる欠失を確認する。

0043

図21Aおよび21Bは、抗CTLA−4ガイドRNAおよびCRISPRのトランスフェクション後における、CTLA−4陽性ヒトT細胞についてのCTLA−4FACS解析を示す。Bは、抗CTLA−4ガイドRNAおよびCRISPRのトランスフェクション後における、ヒトT細胞内の、パルス対照と比べた、CTLA−4ノックアウト効率を示す。

0044

図22は、CISH、PD−1、CTLA4、およびAAVS1のための修飾sgRNAを示す。

0045

図23Aは、抗PD−1 CRISPR系のトランスフェクション後における、PD−1の発現パーセントを示す。図23Bは、Cas9のみによる対照と比較した、PD−1ノックアウト効率パーセントを示す。

0046

図24は、CRISPRおよび抗CTLA−4ガイドRNAをトランスフェクトした、CTLA−4染色ヒトT細胞についてのFACS解析による定量化データを示す。トランスフェクション後6日目における、CTLA−4の発現パーセントおよびノックアウトパーセントについてのデータを示す。

0047

図25は、CRISPRおよび抗PD−1ガイドRNAをトランスフェクトした、PD−1染色ヒトT細胞についてのFACS解析を示す。トランスフェクション後14日目における、PD−1の発現(抗ヒトCD279 PerCP−Cy5.5)についてのデータを示す。

0048

図26は、CRISPRおよび抗PD−1ガイドRNAをトランスフェクトしたヒトT細胞についての、Cas9のみによる対照と比較した、PD−1の発現パーセントおよびPD−1のノックアウトパーセントを示す。

0049

図27は、CRISPR、抗CTLA−4ガイドRNA、および抗PD−1ガイドRNAをトランスフェクトしたヒトT細胞の、14日目における細胞数および生存率を示す。

0050

図28は、CRISPR、ならびに抗PD−1ガイド#2単独、抗PD−1ガイド#2および#6、または抗CTLA−4ガイド#3単独の電気穿孔後14日目における、ヒトT細胞についてのFACSデータを示す。操作T細胞を、48時間にわたり再刺激して、CTLA−4およびPD−1の発現について評価し、ガイドRNAを伴わずに電気穿孔した対照細胞と比較した。

0051

図29は、CRISPR、ならびに抗CTLA−4ガイド#2および#3、抗PD−1ガイド#2および抗CTLA−4ガイド#3、または抗PD−1ガイド#2および#6、抗CTLA−4ガイド#3および#2の電気穿孔後14日目における、ヒトT細胞についてのFACSデータを示す。操作T細胞を、48時間にわたり再刺激して、CTLA−4およびPD−1の発現について評価し、ガイドRNAを伴わずに電気穿孔した対照細胞と比較した。

0052

図30は、初代ヒトT細胞内のCISH遺伝子座の、CRISPRを媒介する遺伝子改変についてのSurveyorアッセイの結果を示す。

0053

図31は、体細胞の変異負荷が、腫瘍型間で変動することを示す。腫瘍特異的ネオ抗原の作製および提示は理論的に、変異負荷と正比例する。

0054

図32は、核酸に対して施し得る、シュードウリジン−5’−三リン酸修飾および5−メチルシチジン−5−三リン酸修飾を示す。

0055

図33は、CRISPRおよびCISH gRNA1、3、4、5、または6をトランスフェクトした293T細胞についての、密度測定解析の二連実験を示す。

0056

図34Aおよび34Bは、CISH gRNA 1についての二連のTIDE解析を示す。

0057

図35Aおよび35Bは、CISH gRNA 3についての二連のTIDE解析を示す。

0058

図36Aおよび36Bは、CISH gRNA 4についての二連のTIDE解析を示す。

0059

図37Aおよび37Bは、CISH gRNA 5についての二連のTIDE解析を示す。

0060

図38Aおよび38Bは、CISH gRNA 6についての二連のTIDE解析を示す。

0061

図39は、初代T細胞内のCRISPRノックアウト後における、CISHタンパク質の喪失を示すウェスタンブロットを示す。

0062

図40Aおよび40Bは、ヒトTILの刺激前および刺激後における絶対細胞数を示す。図40Aは、刺激前および刺激後における、RPMI培地中またはex vivo培地中で培養された、第1のドナーの細胞数を示す。図40Bは、刺激前および刺激後における、RPMI培地中で培養された、第2のドナーの細胞数を示す。

0063

図41Aおよび41Bは、PD−1遺伝子座をターゲティングするCRISPR系を電気穿孔したヒト腫瘍浸潤リンパ球(TIL)または対照細胞の細胞拡大を示す。図41Aは自家フィーダーの添加を伴う拡大を示し、図41Bは、自家フィーダーの添加を伴わない拡大を示す。

0064

図42は、CISH KO TILの産生を示す。インターロイキン2で拡大したTILを、固定化された抗CD3および可溶性抗CD28と共に4日間インキュベーションすることによって刺激する。0日目にTILを回収し、CISHをターゲティングするCRISPR/Cas9試薬を電気穿孔によって送達する。電気穿孔後、修飾されたTILを、後続の急速拡大のために放射線照射した末梢血単核細胞フィーダーおよびIL−2の存在下でG−Rexフラスコに移す。最初の細胞計数中および(+)7日目における継代培養の際、細胞の少量のアリコートを回収して、シーケンシングにより挿入/欠失(インデル)頻度を決定する。その後、TILを(+)14日目に採取し、この時点で品質管理評価のために試料を得、その後、注入準備済みバッグ内で凍結保存する。
図43A、43B、および43Cは、CRISPR/Cas9編集後のCISH遺伝子座のTiDE解析を示す。14日間の急速拡大の後、ゲノムDNAを単離し、PDCD1およびCISH内のCRISPR標的領域に関してPCRを行った。PCRアンプリコンをTiDE解析にかけた。プロットは、対象PV1、PV2、およびPV3に関する、喪失または獲得された塩基対におけるそれらのサイズに基づくインデルの総頻度ならびに挿入および欠失の分布指し示す

0065

図44は、対象PV1、PV2、およびPV3に関する、CRISPR/Cas9編集後のCISH遺伝子座のTiDE解析の概要を示す。

0066

図45Aおよび45Bは、CRISPR/Cas9編集後のCISHタンパク質発現の喪失を示す。電気穿孔の14日後、CISH発現を誘導するため、48時間にわたってPB T細胞およびTILを再刺激したか、または再刺激しなかった。対照は、細胞にCRISPR/Cas9構成要素を与えなかったことを指し示す。Cas9+gRNAは、Cas9mRNAと、CISH遺伝子座のエクソン3をターゲティングするようにデザインされたgRNAとを与えた細胞を指し示す。

0067

図46A、46B、および46Cは、CRISPR編集後のT細胞の増殖および生存率を示す。図46Aは、電気穿孔後6日目の生存率を示す。図46Bは、3×106個の細胞から始めた電気穿孔後12日目の総細胞数を示す。細胞=操作なし、ZAP=電気穿孔のみである。図46Cは、各条件で3×106個の細胞から始めた標準的な組織培養フラスコにおける11日間にわたるTILの総細胞数を示す。

0068

図47Aおよび47Bは、CRISPR/Cas9編集されたT細胞およびTILにおけるサイトカイン産生のSPICEプロットを示す。電気穿孔の14日後、プレートに結合した抗CD3および可溶性抗CD28抗体を使用してT細胞およびTILを再刺激し、細胞内染色およびフローサイトメトリーによってサイトカイン産生についてアッセイした。

0069

図48Aは、CRISPR/Cas9編集後のPD−1タンパク質発現の喪失を示す。電気穿孔の14日後、PD−1発現を誘導するため、72時間にわたって末梢血T細胞またはTILを再刺激した。再刺激されたT細胞におけるPD−1発現である。図48Bは、再刺激されたTILにおけるPD−1発現を示す。喪失パーセントは赤色で示されている。

0070

図49は、対照およびCISHが修飾された腫瘍浸潤リンパ球の絶対細胞数を示す。

0071

図50Aは、IL−2の存在下で培養した7日目の対照およびCISHノックアウトTILを示す。図50Bは、IL−2の非存在下で培養した7日目の対照およびCISHノックアウトTILを示す。

0072

図51Aは、PDCD1のオフターゲット部位を示す。図51Bは、GUIDE−Seqによって同定されたCISH gRNAを示す。

0073

図52は、GUIDE−SeqおよびGMPPQの製造試行でのCISH遺伝子座におけるターゲティングされたインデルの頻度を示す(ns、P=0.93)。

0074

開示の詳細な説明
以下の記載および実施例は、本発明の実施形態を詳細に例示する。本発明は、本明細書で記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって変化し得ることを理解されたい。当業者は、その範囲内に包含される本発明の多数の変形および改変が存在することを認識するであろう。
定義

0075

本明細書で使用される基準数値およびその文法同等物に関する、「約」という用語およびその文法的同等物は、その値からプラスまたはマイナス10%の範囲の値を含み得る。例えば、「約10」という量は、9〜11の量を含む。基準数値に関する「約」という用語はまた、その値からプラスまたはマイナス10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、もしくは1%の範囲の値も含み得る。

0076

本明細書で使用される「活性化」という用語およびその文法的同等物は、細胞が、休眠状態から、活性状態へと移行する過程を指す場合がある。この過程は、抗原への応答遊走、および/または機能的活性状態への、表現型もしくは遺伝子的変化を含み得る。例えば、「活性化」という用語は、T細胞活性化の段階的過程を指す場合がある。例えば、T細胞は、完全に活性化するのに、少なくとも2つのシグナルを要求し得る。第1のシグナルは、抗原−MHC複合体の、TCRへの会合の後で生じることが可能であり、第2のシグナルは、共刺激性分子の会合により生じ得る。in vitroにおいて、抗CD3は、第1のシグナルを模倣することが可能であり、抗CD28は、第2のシグナルを模倣し得る。

0077

本明細書で使用される「隣接する」という用語およびその文法的同等物は、基準の対象物のすぐ隣を指す場合がある。例えば、ヌクレオチド配列文脈における隣接するという用語は、間にヌクレオチドを伴わないことを意味する。例えば、ポリヌクレオチドBと隣接するポリヌクレオチドAとは、AとBとの間にヌクレオチドを伴わないABを意味し得る。

0078

本明細書で使用される「抗原」という用語およびその文法的同等物は、1または複数の受容体が結合することが可能な、1または複数のエピトープを含有する分子を指す場合がある。例えば、抗原は、宿主の免疫系を刺激して、抗原が提示されている場合の、細胞性抗原特異的免疫応答をもたらす場合もあり、体液性抗体応答をもたらす場合もある。抗原はまた、それ自体により、または別の分子と組み合わせて存在する場合に、細胞性応答および/または体液性応答を誘発する能力も有し得る。例えば、腫瘍細胞抗原は、TCRにより認識され得る。ネオ抗原など、抗原は、変異負荷が大きな腫瘍と関連し得る(図31)。

0079

本明細書で使用される「エピトープ」という用語およびその文法的同等物は、抗体、B細胞、T細胞、または操作細胞により認識され得る、抗原の一部を指す場合がある。例えば、エピトープは、TCRにより認識されるがんエピトープであり得る。また、抗原内の複数のエピトープも認識することができる。エピトープはまた、変異している場合もある。

0080

本明細書で使用される「自家」という用語およびその文法的同等物は、同じ存在に由来することを指す場合がある。例えば、試料(例えば、細胞)を採取し、加工し、後に同じ対象(例えば、患者)へと戻すことができる。自家工程は、ドナーとレシピエントとが異なる対象である、同種工程と区別される。

0081

本明細書で使用される「がん」という用語およびその文法的同等物は、細胞の過剰増殖であって、その固有の形質(正常な制御の喪失)が、調節されていない増殖、分化の欠如、限局的組織浸潤、および転移を結果としてもたらす過剰増殖を指す場合がある。本発明の方法との関連で、がんは、急性リンパ球がん、急性骨髄性白血病胞巣状横紋筋肉腫膀胱がん、骨がん、脳腫瘍乳がん肛門がん、肛門管がん、直腸がん、眼がん、肝臓内胆管がん、関節がん、頸部がん、胆嚢がん、または胸膜がん、がん、鼻腔がん、または中耳がん、口腔がん、外陰がん、慢性リンパ球性白血病慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん子宮頸がん線維肉腫、消化器がん、ホジキンリンパ腫下咽頭がん腎臓がん、喉頭がん、白血病液性腫瘍、肝臓がん肺がんリンパ腫悪性中皮腫マスト細胞腫、黒色腫多発性骨髄腫鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫卵巣がん膵臓がん腹膜がん、網がん、および腸間膜がん、咽頭がん前立腺がん、直腸がん、腎臓がん、皮膚がん小腸がん、軟組織がん、固体腫瘍、胃がん精巣がん甲状腺がん尿管がん、および/または膀胱がんのうちのいずれかを含む、任意のがんであり得る。本明細書で使用される「腫瘍」という用語は、細胞または組織の異常な増殖であって、例えば、悪性型または良性型の増殖を指す。

0082

本明細書で使用される「がんネオ抗原」または「ネオ抗原」または「ネオエピトープ」という用語およびその文法的同等物は、正常な、変異していない宿主のゲノム内ではコードされない抗原を指す場合がある。「ネオ抗原」は、場合によって、腫瘍形成性ウイルスタンパク質、または体細胞変異帰結として発生する異常なタンパク質を表し得る。例えば、ネオ抗原は、ウイルスタンパク質の活性を介する、細胞機構の破壊により発生し得る。別の例は、場合によって、体細胞変異をもたらし得る、発がん性化合物への曝露であり得る。この体細胞変異は最終的に、腫瘍/がんの形成をもたらし得る。

0083

本明細書で使用される「細胞傷害作用」という用語は、細胞の正常状態の、意図されないかまたは所望されない変更を指す。細胞の正常状態とは、細胞傷害性組成物細胞傷害剤、および/または細胞傷害性状態への細胞の曝露の前に顕在化されるかまたは存在する状態を指す場合がある。一般に、正常状態にある細胞とは、ホメオスタシスにある細胞である。細胞の正常状態の、意図されないかまたは所望されない変更は、例えば、細胞死(例えば、プログラム細胞死)、複製の潜在能減殺、膜の完全性などの細胞の完全性の減殺、代謝活性の減殺、発生能の減殺、または本出願で開示される細胞傷害作用のうちのいずれかの形態で顕在化され得る。

0084

「細胞傷害作用を低減すること」または「細胞傷害作用を低減する」という語句は、細胞傷害性組成物、細胞傷害剤、および/または細胞傷害性状態への曝露時における、細胞の正常状態の、意図されないかまたは所望されない変更の程度または頻度の低減を指す。語句は、細胞傷害性組成物、細胞傷害剤、および/または細胞傷害性状態へと曝露された個々の細胞内の細胞傷害作用の程度を低減することを指す場合もあり、細胞集団を、細胞傷害性組成物、細胞傷害剤、および/または細胞傷害性状態へと曝露した場合に、細胞傷害作用を呈する集団の細胞数を低減することを指す場合もある。

0085

本明細書で使用される「操作された」という用語およびその文法的同等物は、核酸、例えば、生物のゲノム内の核酸の、1または複数の変更を指す場合がある。「操作された」という用語は、遺伝子の変更、付加、および/または欠失を指す場合がある。操作細胞とはまた、遺伝子を付加し、欠失させ、かつ/または変更した細胞も指す場合がある。

0086

本明細書で使用される「細胞」または「操作細胞」という用語およびこれらの文法的同等物は、ヒト由来の細胞を指す場合もあり、非ヒト動物由来の細胞を指す場合もある。

0087

本明細書で使用される「チェックポイント遺伝子」という用語およびその文法的同等物は、免疫応答の振幅を調節するように作用する阻害性過程(例えば、フィードバックループ)、例えば、有害な応答の、制御されない伝播緩和させる、免疫阻害性フィードバックループに関与する、任意の遺伝子を指す場合がある。これらの応答は、感染症に対する免疫応答時に生じ得る付帯的な組織損傷に対して防御する分子シールド、および/または末梢における自己寛容の維持への寄与を含み得る。チェックポイント遺伝子の非限定的な例は、拡張CD28ファミリーの受容体のメンバーおよびそれらのリガンド、ならびに共阻害性経路(例えば、CTLA−4およびPD−1)に関与する遺伝子を含み得る。「チェックポイント遺伝子」という用語はまた、免疫チェックポイント遺伝子を指す場合がある。

0088

「CRISPR」、「CRISPR系」、または「CRISPRヌクレアーゼ系」、およびこれらの文法的同等物は、DNAに結合する非コードRNA分子(例えば、ガイドRNA)と、ヌクレアーゼの機能性(例えば、2つのヌクレアーゼドメイン)を伴うCasタンパク質(例えば、Cas9)とを含み得る。例えば、Sander, J.D.ら、「CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes」、Nature Biotechnology、32巻:347〜355頁(2014年)を参照されたい。例えば、Hsu, P.D.ら、「Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering」、Cell、157巻(6号):1262〜1278頁(2014年)もまた、参照されたい。

0089

本明細書で使用される「〜を破壊すること」という用語およびその文法的同等物は、例えば、切断、欠失、挿入、変異、再配列またはこれらの任意の組合せにより遺伝子を改変または変更する工程を指す場合がある。破壊は、タンパク質発現のノックアウトまたはノックダウンをもたらす場合がある。ノックアウトは、完全または部分的ノックアウトであり得る。例えば、遺伝子は、ノックアウトまたはノックダウンにより破壊することができる。遺伝子の破壊は、遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を部分的に低減することの場合もあり、これを完全に抑制することの場合もある。遺伝子の破壊はまた、異なる遺伝子、例えば、下流における遺伝子の活性化も引き起こし得る。一部の実施形態では、「〜を破壊すること」という用語は、抑制すること、妨害すること、または操作することなどの用語と互換的に使用することができる。

0090

本明細書で使用される「機能」という用語およびその文法的同等物は、意図される目的を果たすか、有するか、またはこれに適う能力を指す場合がある。「機能的」とは、正常機能の、ベースラインから100%までの任意のパーセントを含み得る。例えば、機能的とは、正常機能の5、10、15、20、25、30、35、40、45、50,55、60、65、70、75、80、85、90、95、および/もしくは100%を含み得るか、またはほぼこれらの比率を含み得る。場合によって、機能的という用語は、正常機能の100%またはほぼ100%を超える、例えば、正常機能の125、150、175、200、250、300%、および/もしくはこれを上回ることを意味し得る。

0091

本明細書で使用される「遺伝子編集」という用語およびその文法的同等物は、ゲノムにおいて、1または複数のヌクレオチドを挿入するか、置き換えるか、または除去する遺伝子操作を指す場合がある。遺伝子編集は、ヌクレアーゼ(例えば、天然で存在するヌクレアーゼまたは人工的に操作されたヌクレアーゼ)を使用して実施することができる。

0092

本明細書で使用される「変異」という用語およびその文法的同等物は、ポリヌクレオチド内の、1または複数のヌクレオチドの置換、欠失、および挿入を含み得る。例えば、ポリヌクレオチド(cDNA、遺伝子)配列内またはポリペプチド配列内で、最大1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、11、12、13、14、15、20、25、30、40、50、またはそれよりも多い、ヌクレオチド/アミノ酸を、置換し、欠失させ、かつ/または挿入することができる。変異は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を及ぼし得る。変異はまた、ゲノム配列構造、またはコードされるmRNAの構造/安定性にも影響を及ぼし得る。

0093

本明細書で使用される「非ヒト動物」という用語およびその文法的同等物は、ヒト以外の全ての動物種であって、天然動物の場合もあり、遺伝子改変された非ヒト動物の場合もある、非ヒト哺乳動物を含む動物種を含み得る。「核酸」、「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語、ならびにこれらの文法的同等物は、互換的に使用することができ、直鎖状コンフォメーションまたは環状コンフォメーションにあり、一本鎖形態または二本鎖形態にある、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーを指し得る。本開示の目的では、これらの用語は、長さに関して限定的とはみなされるべきではない。用語は、天然ヌクレオチド類似体のほか、塩基部分、糖部分、および/またはリン酸部分(例えば、ホスホロチオエート骨格)において修飾されたヌクレオチドも包含し得る。用語の変化形はまた、脱メチル化、CpGメチル化の付加、細菌性メチル化の除去、および/または哺乳動物性メチル化の付加も包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有し得る、すなわち、Aの類似体は、Tと塩基対であり得る。

0094

本明細書で使用される「末梢血リンパ球」(PBL)という用語およびその文法的同等物は、血液(例えば、末梢血)中を循環するリンパ球を指す場合がある。末梢血リンパ球とは、臓器へと局在化しないリンパ球を指す場合がある。末梢血リンパ球は、T細胞、NK細胞、B細胞、またはこれらの任意の組合せを含み得る。

0095

本明細書で使用される「表現型」という用語およびその文法的同等物は、生物の観察可能な特徴または形質の複合物であって、その形状、発生、生化学的特性または生理学的特性生物季節学挙動、および挙動の結果などの複合物を指す場合がある。文脈に応じて、「表現型」という用語は、ある場合には、集団の観察可能な特徴または形質の複合物を指す。

0096

本明細書で使用される「プロトスペーサー」という用語およびその文法的同等物は、PAMに隣接する核酸配列であって、ガイドRNAのスペーサー配列または操作されたターゲティング部分など、ガイドRNAの部分にハイブリダイズすることが可能な核酸配列を指す場合がある。プロトスペーサーは、遺伝子内、ゲノム内、または染色体内のヌクレオチド配列であって、ガイドRNAにターゲティングされるヌクレオチド配列であり得る。天然状態では、プロトスペーサーは、PAM(プロトスペーサー隣接モチーフ)と隣接する。RNAにガイドされるヌクレアーゼの切断部位は、プロトスペーサー配列内にある。例えば、ガイドRNAが、特異的プロトスペーサーをターゲティングする場合、Casタンパク質は、プロトスペーサー配列内で二本鎖切断を生じ、これにより、プロトスペーサーを切断するであろう。切断後、プロトスペーサーの破壊は、非相同末端結合(NHEJ)または相同性により導かれる修復HDR)を結果としてもたらし得る。プロトスペーサーの破壊は、プロトスペーサーの欠失を結果としてもたらし得る。加えて、または代替的に、プロトスペーサーの破壊は、プロトスペーサーへと挿入されるか、またはこれを置き換える外因性核酸配列を結果としてもたらし得る。

0097

本明細書で使用される「レシピエント」という用語およびその文法的同等物は、ヒトまたは非ヒト動物を指す場合がある。レシピエントはまた、それを必要とするレシピエントでもあり得る。

0098

本明細書で使用される「組換え」という用語およびその文法的同等物は、2つのポリ核酸の間の遺伝情報交換過程を指す場合がある。本開示の目的では、「相同組換え」または「HR」とは、例えば、二本鎖切断の修復時において生じ得る、このような遺伝子交換特化形態を指す場合がある。この過程は、例えば、標的分子(例えば、二本鎖切断を経た分子)を修復するための鋳型として、ドナー分子を使用して、ヌクレオチド配列相同性を要求する場合があり、ある場合には、非交叉遺伝子変換またはショートトラクト型遺伝子変換として公知である。このような移入はまた、破壊される標的とドナーとの間で形成されるヘテロ二重鎖DNAのミスマッチ是正、および/または標的の一部となりうる遺伝情報を再合成するのにドナーを使用し得る合成依存性アニーリング、および/または関連する過程も伴いうる。このような特化したHRは、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部を、標的ポリヌクレオチドへと組み込みうるように、標的分子の配列の変更を結果としてもたらし得ることが多い。場合によって、「組換えアーム」という用語と、「相同性アーム」という用語は、本明細書で互換的に使用することができる。

0099

本明細書では、「標的ベクター」という用語と、「ターゲティングベクター」という用語とを、互換的に使用する。

0100

本明細書で使用される「T細胞」という用語およびその文法的同等物は、任意の由来のT細胞を指す場合がある。例えば、T細胞は、初代T細胞、例えば、自家T細胞、細胞株などであり得る。T細胞はまた、ヒトT細胞の場合もあり、非ヒトT細胞の場合もある。

0101

本明細書で使用される「TIL」または腫瘍浸潤リンパ球という用語およびこれらの文法的同等物は、腫瘍から単離された細胞を指す場合がある。例えば、TILは、腫瘍へと遊走した細胞であり得る。TILはまた、腫瘍に浸潤した細胞でもあり得る。TILは、腫瘍内で見出される任意の細胞であり得る。例えば、TILは、T細胞、B細胞、単球ナチュラルキラー(NK)細胞、またはこれらの任意の組合せであり得る。TILは、混合細胞集団であり得る。TIL集団は、表現型の異なる細胞、分化程度の異なる細胞、系統の異なる細胞、またはこれらの任意の組合せを含み得る。

0102

治療効果」は、処置される状態に変化が見られる場合に生じ得る。変化は、肯定的変化の場合もあり、否定的変化の場合もある。例えば、「肯定的効果」は、対象における活性化T細胞数の増大に対応し得る。別の例では、「否定的効果」は、対象における腫瘍の量またはサイズの減少に対応し得る。少なくとも10%の改善、好ましくは、少なくとも25%、より好ましくは、少なくとも50%、なおより好ましくは、少なくとも75%、および最も好ましくは、100%の改善が見られる場合に、処置される状態には「変化」が見られる。変化は、個体において処置される状態の重症度の改善に基づく場合もあり、本発明の組成物をそれと組み合わせて投与する治療用組成物による処置を伴う個体およびこれを伴わない個体の集団における、状態の改善の頻度の差違に基づく場合もある。同様に、本開示の方法は、対象へと、「治療有効」量の細胞を投与するステップを含み得る。「治療的に有効な」という用語は、「治療効果を及ぼすこと」に対応する定義を有するように理解されるべきである。

0103

本明細書で使用される「セーフハーバー」および「免疫セーフハーバー」という用語ならびにこれらの文法的同等物は、外因性核酸を組み込むために使用され得るゲノム内の場所であって、組込みが、核酸単独の添加により、宿主細胞の増殖に対して、著名な効果を引き起こさない場所を指す場合がある。セーフハーバーの非限定的な例は、HPRT、AAVS部位(例えば、AAVS1、AAVS2など)、CCR5、またはRosa26を含み得る。

0104

本明細書で使用される「配列」という用語およびその文法的同等物は、DNAの場合もあり、RNAの場合もあり;直鎖状の場合もあり、環状の場合もあり、分枝状の場合もあり;一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もある、ヌクレオチド配列を指す場合がある。配列は、変異させることができる。配列は、任意の長さ、例えば、2〜1,000,000の間、またはそれよりも多いヌクレオチドの長さ(またはこれらの間であるか、もしくはこれらを上回る、任意の整数値)、例えば、約100〜約10,000ヌクレオチドの間または約200〜約500ヌクレオチドの間であり得る。

0105

概観
本明細書では、がんなどの疾患または状態の処置に有用な、組成物および方法が開示される。がんなどの様々な疾患または状態の治療法のための処置レジメンも、本明細書に開示される。処置レジメンは、治療適用のための腫瘍浸潤リンパ球などの遺伝子改変細胞の投与を含み得る。効果的な養子細胞移入ベース免疫療法(ACT)は、がん(例えば、転移性がん)患者を処置するのに有用であり得る。例えば、腫瘍浸潤リンパ球は、免疫チェックポイント遺伝子を破壊するように改変され得る。

0106

細胞
本明細書で開示される組成物は、細胞を用い得る。細胞は、初代細胞であり得る。細胞は、組換え細胞であり得る。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄リンパ節組織臍帯血胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水胸水脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な供給源から得ることができる。例えば、任意のT細胞株を使用することができる。代替的に、細胞は、健常ドナーに由来する場合もあり、がんを伴うと診断された患者に由来する場合もあり、または感染を伴うと診断された患者に由来する場合もある。別の実施形態では、細胞は、異なる表現型特徴を提示する混合細胞集団の一部であり得る。細胞はまた、細胞療法バンクから得ることもできる。免疫抑制処置に対して抵抗性破壊細胞も得ることができる。所望の細胞集団はまた、改変前に選択することもできる。選択は、磁気分離、フローサイトメトリー選択、抗生物質選択のうちの少なくとも1つを含み得る。1または複数の細胞は、任意の血球細胞、例えば、末梢血単核細胞(PBMC)、リンパ球、単球、またはマクロファージであり得る。1または複数の細胞は、任意の免疫細胞、例えばリンパ球、B細胞またはT細胞であり得る。細胞はまた、自然食品アフェレーシス、または対象の腫瘍試料から得ることもできる。細胞は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)であり得る。場合によって、アフェレーシスは、白血球アフェレーシスであり得る。白血球アフェレーシスは、血球が血液から単離される手順であり得る。白血球アフェレーシス中、血液は、対象の腕の針から除去され、全血赤血球血漿、およびリンパ球に分ける機械を通って循環し、その後、血漿および赤血球は、他方の腕の針を通して対象に戻され得る。場合によって、細胞は、処置レジメンおよび細胞療法の投与後に単離される。例えば、アフェレーシスは、細胞投与と順に、またはそれと同時に実施することができる。場合によって、アフェレーシスは、細胞生成物投与前、および投与の最長で約6週間後に実施される。場合によって、アフェレーシスは、細胞生成物の投与の−3週間、−2週間、−1週間、0、1週間、2週間、3週間、4週間、1カ月、2カ月、3カ月、4カ月、5カ月、6カ月、7カ月、8カ月、9カ月、10カ月、11カ月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、または最長で約10年後に実施される。場合によって、アフェレーシスにより収集した細胞は、特異的溶解サイトカイン放出メタボロミクス研究、生体エネルギー療法研究、サイトカイン産生の細胞内FACs、ELISAスポットアッセイ、およびリンパ球サブセット解析についての試験を受け得る。場合によって、細胞生成物またはアフェレーシス生成物の試料は、注入細胞の表現型および機能の遡及的解析のために凍結保存され得る。

0107

TILは、がんを患う臓器から単離することができる。1または複数の細胞は、脳、心臓、眼、膵臓、腎臓、肝臓、腸、子宮膀胱、皮膚、毛髪、爪、、鼻、口腔、口唇脾臓歯茎、歯、唾液腺扁桃腺咽頭食道大腸、小腸、直腸、肛門、甲状腺、胸腺、骨、軟骨靱帯腎上体骨格筋平滑筋、血管、血液、脊髄気管、尿管、尿道視床下部下垂体幽門副腎卵巣卵管、子宮、乳腺精巣精嚢陰茎リンパリンパ節、またはリンパ管であり得る、がんを有する臓器から単離することができる。1または複数のTILは、脳、心臓、肝臓、皮膚、腸、肺、腎臓、眼、小腸または膵臓に由来し得る。TILは、膵臓、腎臓、眼、肝臓、小腸、肺または心臓に由来し得る。TILは、膵臓に由来し得る。1または複数の細胞は、膵島細胞、例えば、膵β細胞であり得る。場合によって、TILは、消化器がんに由来し得る。TIL培養物は、多数の方式で調製することができる。例えば、腫瘍は、非がん性組織または壊死領域からトリミングされ得る。次に、腫瘍は、約2〜3mmの長さに断片化され得る。場合によって、腫瘍は、約0.5mm〜約5mmのサイズ、約1mm〜約2mm、約2mm〜約3mm、約3mm〜約4mmまたは約4mm〜約5mmに断片化され得る。次に、腫瘍断片は、培地およびサイトカインなどの細胞刺激剤を用いて、in vitroで培養され得る。場合によって、IL−2を用いて、腫瘍断片からTILを拡大することができる。IL−2の濃度は、約6000IU/mLであり得る。IL−2の濃度は、約2000IU/mL、3000IU/mL、4000IU/mL、5000IU/mL、6000IU/mL、7000IU/mL、8000IU/mL、9000IU/mLまたは最大約10000IU/mLであり得る。TILを拡大したら、これを、腫瘍反応性を決定するためのin vitroアッセイにかけることができる。例えば、TILは、CD3、CD4、CD8およびCD58発現に関するFACsによって評価することができる。TILは、共培養細胞毒性、ELISAまたはELISPOTアッセイにかけることもできる。場合によって、TIL培養物は、凍結保存され得る、または急速拡大を受けることができる。TILなどの細胞は、胎児新生児若齢者、および成年者を含むがこれらに限定されない発生段階のドナーから単離することができる。TILは、成体ヒトから単離することができる。細胞を単離することができるヒトは、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1未満であり得る。例えば、細胞は、6歳未満のヒトから単離することができる。TILなどの細胞は、3歳未満のヒトから単離することもできる。場合によって、ヒトドナーは、少なくとも約18歳からの成体であり得る。場合によって、血液産物は保存され得る。例えば、cryostore凍結バッグを用いて、血液産物を保存および凍結することができる。

0108

場合によって、細胞療法において用いることができる細胞、またはゲノム的に破壊することができる細胞は、所与因子について陽性の場合もあり、所与の因子について陰性の場合もある。一部の実施形態では、細胞は、CD3+細胞、CD3−細胞、CD5+細胞、CD5−細胞、CD7+細胞、CD7−細胞、CD14+細胞、CD14−細胞、CD8+細胞、CD8−細胞、CD103+細胞、CD103−細胞、CD11b+細胞、CD11b−細胞、BDCA1+細胞、BDCA1−細胞、L−セレクチン+細胞、L−セレクチン−細胞、CD25+、CD25−細胞、CD27+、CD27−細胞、CD28+細胞、CD28−細胞、CD44+細胞、CD44−細胞、CD56+細胞、CD56−細胞、CD57+細胞、CD57−細胞、CD62L+細胞、CD62L−細胞、CD69+細胞、CD69−細胞、CD45RO+細胞、CD45RO−細胞、CD127+細胞、CD127−細胞、CD132+細胞、CD132−細胞、IL−7+細胞、IL−7−細胞、IL−15+細胞、IL−15−細胞、レクチン様受容体G1陽性細胞、レクチン様受容体G1陰性細胞、またはこれらの分化細胞もしくは脱分化細胞であり得る。細胞が発現する因子の例は、限定的であることを意図するものではなく、当業者は、細胞が、当技術分野で公知の任意の因子について陽性の場合もあり、陰性の場合もあることを察知するであろう。一部の実施形態では、細胞は、2つまたはそれよりも多い因子について陽性であり得る。例えば、細胞は、CD4+およびCD8であり得る。一部の実施形態では、細胞は、2つまたはそれよりも多い因子について陰性であり得る。例えば、細胞は、CD25−、CD44−、およびCD69−であり得る。一部の実施形態では、細胞は、1または複数の因子について陽性であり、かつ、1または複数の因子について陰性であり得る。例えば、細胞は、CD4+およびCD8−であり得る。次いで、選択した細胞を、対象へと注入することができる。一部の実施形態では、細胞を、1または複数の所与の因子を有するかまたは有さないことについて選択することができる(例えば、細胞を、1または複数の因子の有無に基づき分離することができる)。一部の実施形態では、選択した細胞はまた、in vitroで拡大することもできる。選択した細胞は、注入の前に、in vitroで拡大することができる。本明細書で開示される方法のうちのいずれかにおいて使用される細胞は、本明細書で開示される細胞のうちのいずれかの混合物(例えば、2つまたはそれよりも多い異なる細胞)であり得ることを理解されたい。例えば、本開示の方法は、細胞を含むことが可能であり、細胞は、CD4+細胞と、CD8+細胞との混合物である。別の例では、本開示の方法は、細胞を含むことが可能であり、細胞は、CD4+細胞と、ナイーブ細胞との混合物である。場合によって、細胞は、CD45RO(−)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L+(L−セレクチン)、CD27+、CD28+、およびIL−7Rα+から構成される、ステムメモリー(stem memory)TSCM細胞であることが可能であり、ステムメモリー細胞はまた、CD95、IL−2Rβ、CXCR3、およびLFA−1を発現することが可能であり、ステムメモリー細胞特有の、多数の機能的な属性を示す。操作細胞はまた、L−セレクチンおよびCCR7を含む、セントラルメモリー細胞であるTCM細胞でもあることが可能であり、この場合、セントラルメモリー細胞は、例えば、IL−2を分泌し得るが、IFNγまたはIL−4は分泌しえない。操作細胞はまた、L−セレクチンまたはCCR7を含む、エフェクターメモリー細胞であるTEM細胞でもあることが可能であり、例えば、IFNγおよびIL−4など、エフェクターサイトカインを産生し得る。場合によって、細胞集団を、対象へと導入することができる。例えば、細胞集団は、T細胞とNK細胞との組合せであり得る。他の場合には、集団は、ナイーブ細胞とエフェクター細胞との組合せであり得る。細胞集団は、TILであり得る。

0109

特に、T細胞集団は、表面上に固定化された、抗CD3抗体もしくはその抗原結合性断片、または抗CD2抗体と接触させることにより、あるいは、ある場合には、カルシウムイオノフォアと共に、プロテインキナーゼCアクチベーター(例えば、ブリオスタチン)と接触させることなどにより、in vitroで刺激することができる。T細胞の表面上のアクセサリー分子共刺激するために、アクセサリー分子に結合するリガンドを使用することができる。例えば、T細胞の集団を、T細胞の増殖を刺激し得る条件下で、抗CD3抗体および抗CD28抗体と接触させることができる。場合によって、4−1BBを使用して、細胞を刺激することができる。例えば、細胞は、4−1BBおよびIL−21または別のサイトカインで刺激することができる。CD4 T細胞またはCD8 T細胞の増殖を刺激するために、抗CD3抗体および抗CD28抗体を使用することができる。例えば、シグナルをもたらす薬剤は、溶液中の場合もあり、表面へとカップリングさせる場合もある。粒子の細胞に対する比は、標的細胞と比べた粒子サイズに依存し得る。さらなる実施形態では、T細胞などの細胞は、薬剤でコーティングしたビーズと組み合わせることができ、この場合、ビーズと細胞とは、後で分離し、任意選択で、培養することができる。各ビーズは、抗CD3抗体もしくは抗CD28抗体、または、場合によって、2つの組合せでコーティングすることができる。代替的な実施形態では、培養の前に、薬剤でコーティングしたビーズと細胞とを分離せず、併せて培養する。細胞表面タンパク質は、抗CD3および抗CD28を接合させうる常磁性ビーズ(3×28ビーズ)を、T細胞へと接触させることにより、ライゲーションすることができる。場合によって、細胞およびビーズ(例えば、比を1:1とする、DYNABEADS(登録商標)M−450 CD3/CD28 T常磁性ビーズ)を、緩衝液、例えば、リン酸緩衝生理食塩液PBS)中で組み合わせる(例えば、カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを伴わずに)。任意の細胞濃度を使用することができる。混合物は、数時間(例えば、約3時間)もしくはほぼこの時間〜14日間もしくは約14日間、またはこれらの間の任意の時間整数値にわたり培養することができる。別の実施形態では、混合物は21日間もしくはほぼこの期間にわたり、または最長で21日間もしくはほぼこの期間にわたり混合物を培養することもできる。T細胞を培養するのに適切な条件は、増殖および生存率に必要な因子であって、血清(例えば、ウシ胎仔血清またはヒト血清)、インターロイキン−2(IL−2)、インスリン、IFN−g、IL−4、IL−7、GMCSF、IL−10、IL−21、IL−15、TGFベータ、およびTNFアルファ、または細胞を増殖させるための他の任意の添加剤を含む因子を含有し得る、適切な培地(例えば、最小必須培地またはRPMIMedia 1640またはX−vivo 5(Lonza))を含み得る。細胞を増殖させるための他の添加剤は、界面活性物質、Plasmanate、ならびにN−アセチルシステインおよび2−メルカプトエタノールなどの還元剤を含むがこれらに限定されない。培地は、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを添加し、無血清であるか、あるいは適切な量の血清(または血漿)もしくは規定されたセットのホルモン、および/またはT細胞を増殖させ、拡大するために十分な量のサイトカインを補充した、RPMI 1640、A1 M−V、DMEMMEM、α−MEM、F−12、X−Vivo 1およびX−Vivo 20、Optimizerを含み得る。場合によって、865mLボトルのRPMIは、100mLのヒト血清、25mLのHepes(1M)、10mLのペニシリンストレプトマイシン(10,000U/mLおよび10,000μg/mL)および0.2mLのゲンタマイシン(50mg/mL)を有し得る。添加剤の添加後に、RPMI培地は、0.2μm×1Lフィルターを使用して濾過し、4℃で保存することができる。一部の実施形態では、抗生物質、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験用培養物中に限り組入れうるが、対象へと注入される細胞の培養物中には組み入れることができない。場合によって、ヒト血清は、37℃ウォーターバス内で解凍し、次いで熱不活化(例えば、100mLボトルに対して56℃で30分間)させることができる。血清は、培地の添加の前に0.8μmおよび0.45μmフィルターを通して濾過することができる。

0110

標的細胞は、増殖を支援するのに必要な条件、例えば、適切な温度(例えば、37℃)および雰囲気(例えば、5%CO2を加えた空気)下で維持することができる。場合によって、変動させる刺激時間へと曝露されたT細胞は、異なる特徴を呈し得る。場合によって、ヒトCD3、CD28、CD2、またはこれらの任意の組合せに対する、可溶性で一特異性の、四量体抗体を使用することができる。

0111

場合によって、破壊を受けるべき細胞は、組織または細胞と共培養することにより、活性化させることもでき、拡大することもできる。細胞は、抗原提示細胞であり得る。人工抗原提示細胞(aAPC)は、T細胞受容体および共刺激分子に対するリガンドを発現することが可能であり、場合によって、それらの効力および機能を改善しながら、移入のためのT細胞を活性化させ、拡大し得る。aAPCは、T細胞活性化のための任意の遺伝子を発現するように操作することができる。aAPCは、T細胞拡大のための任意の遺伝子を発現するように操作することができる。aAPCは、ビーズ、細胞、タンパク質、抗体、サイトカインまたはこれらの任意の組合せであり得る。aAPCは、ゲノム移植を経る可能性がある細胞集団へと、シグナルを送達し得る。例えば、aAPCは、シグナル1、シグナル2、シグナル3、またはこれらの任意の組合せを送達し得る。シグナル1は、抗原認識シグナルであり得る。例えば、シグナル1は、TCRへの、ペプチド−MHC複合体のライゲーション、またはCD3に対するアゴニスト抗体であって、CD3シグナル−形質導入複合体の活性化をもたらし得るアゴニスト抗体の結合であり得る。シグナル2は、共刺激性シグナルであり得る。例えば、共刺激性シグナルは、それぞれ、ICOS−L、CD70、および4−1BBLに結合する、抗CD28、誘導性共刺激因子(ICOS)、CD27、および4−1BB(CD137)であり得る。シグナル3は、サイトカインシグナルであり得る。サイトカインは、任意のサイトカインであり得る。サイトカインは、IL−2、IL−7、IL−12、IL−15、IL−21、またはこれらの任意の組合せであり得る。

0112

場合によって、人工抗原提示細胞(aAPC)を使用して、細胞集団を活性化させ、かつ/または拡大することができる。場合によって、人工抗原提示細胞は、アロ特異性を誘導しえない。aAPCは場合によって、HLAを発現しえない。aAPCは、活性化および/または刺激のために使用し得る遺伝子を安定的に発現するように、遺伝子改変することができる。場合によって、K562細胞を、活性化のために使用することができる。K562細胞はまた、拡大のために使用することもできる。K562細胞は、ヒト赤白血病細胞株であり得る。K562細胞は、目的の遺伝子を発現するように操作することができる。K562細胞は、HLAクラスI分子、HLAクラスII分子、またはCD1d分子を内因的に発現しえないが、ICAM−1(CD54)およびLFA−3(CD58)を発現し得る。K562は、シグナル1を、T細胞へと送達するように操作することができる。例えば、K562細胞は、HLAクラスIを発現するように操作することができる。場合によって、K562細胞は、B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4−1BBL、抗CD3、抗CD3 mAb、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜結合型IL−15、膜結合型IL−17、膜結合型IL−21、膜結合型IL−2、切断型CD19、または任意の組合せなど、さらなる分子を発現するように操作することができる。場合によって、操作K562細胞は、CD80およびCD83に加えて、抗CD3 mAbの膜形態である、クローンOKT3を発現し得る。場合によって、操作K562細胞は、CD80およびCD83に加えて、抗CD3 mAbの膜形態である、クローンOKT3、抗CD28 mAbの膜形態を発現し得る。

0113

場合によって、細胞の再刺激は、抗原、およびフィーダーPBMCなどの放射線照射された組織適合性抗原提示細胞(APC)により行うことができる。場合によって、細胞は、PHAなどの非特異的マイトジェンおよび同種間フィーダー細胞を使用して増殖させることができる。フィーダーPBMCは、40Gyで放射線照射することができる。フィーダーPBMCは、約10Gy〜約15Gy、約15Gy〜約20Gy、約20Gy〜約25Gy、約25Gy〜約30Gy、約30Gy〜約35Gy、約35Gy〜約40Gy、約40Gy〜約45Gy、約45Gy〜約50Gyで放射線照射することができる。場合によって、放射線照射されたフィーダー細胞の対照フラスコのみが、抗CD3およびIL−2で刺激され得る。

0114

aAPCは、ビーズであり得る。球形ポリスチレンビーズを、CD3およびCD28に対する抗体でコーティングし、T細胞を活性化させるために使用することができる。ビーズは、任意のサイズであり得る。場合によって、ビーズは、3および6マイクロメートルであり得るか、またはほぼこの長さであり得る。ビーズは、4.5マイクロメートルのサイズであり得るか、またはほぼこのサイズであり得る。ビーズは、任意の細胞対ビーズ比で用いることができる。例えば、1ミリメートル当たり100万個の細胞で、3対1のビーズ対細胞比を使用することができる。aAPCはまた、剛性球形粒子、ポリスチレンラテックスマイクロビーズ磁性ナノ粒子または磁性マイクロ粒子ナノサイズ量ドット、4、ポリ乳酸−co−グリコール酸)(PLGA)マイクロスフェア非球形粒子、5、カーボンナノチューブバンドル、6、楕円体のPLGAマイクロ粒子、7、ナノワーム流体脂質二重層含有系、8、2D支援型脂質二重層(2D−SLB)、9、リポソーム、10、RAFTソーム/マイクロドメインリポソーム、11、SLB粒子、またはこれらの任意の組合せでもあり得る。

0115

場合によって、aAPCは、CD4 T細胞を拡大し得る。例えば、aAPCは、HLAクラスII拘束性CD4 T細胞の抗原プロセシングおよび提示経路を模倣するように操作することができる。K562は、HLA−D、DPα.DPβ鎖、Ii、DMα、DMβ、CD80、CD83、またはこれらの任意の組合せを発現するように操作することができる。例えば、操作K562細胞は、HLA拘束性抗原特異的CD4 T細胞を拡大するために、HLA拘束性ペプチドでパルスすることができる。

0116

場合によって、aAPCの使用は、T細胞の活性化、拡大、または任意の組合せのために外因的に導入されるサイトカインと組み合わせることができる。細胞はまた、in vivoにおいて、例えば、ゲノム移植された細胞の、対象への投与の後における、対象の血液中で拡大することもできる。

0117

場合によって、細胞は、標準急速拡大プロトコール(REP)によって達成される収量へとスケールアップすることができる。遺伝子改変TILの平均倍率拡大は、1071であり得る。場合によって、平均倍率拡大は、500〜2000であり得る。遺伝子改変されたTILの平均倍率拡大は、500〜600、600〜700、700〜800、800〜900、900〜1000、1000〜最大2000倍であり得る。場合によって、操作細胞投与量は、患者注入のために約1×1010個のノックアウトTILからであり得る。

0118

投与前、投与後、および/または投与時における細胞(例えば、操作細胞または操作された初代T細胞もしくはTIL)は、機能的であり得る。例えば、細胞は、投与後、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、6、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、もしくは100日間、または少なくともほぼこれらの期間にわたり機能的であり得る。養子移入された細胞は、投与後、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12カ月間、または少なくともほぼこれらの期間にわたり機能的であり得る。投与された細胞は、注入後、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、もしくは30年間、またはほぼこれらの期間にわたり機能的であり得る。場合によって、投与された細胞は、最長でレシピエントの生涯にわたり機能的であり得る。

0119

さらに、養子移入された細胞は、その意図される正常な働きの100%で機能し得る。細胞はまた、その意図される正常な働きの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99%でも機能し得る。

0120

長期培養において、ゲノム的に破壊された細胞は、刺激非依存的増殖または形質転換の特性を示すことができない。例えば、場合によって、ゲノム的に破壊された細胞は、IL−2などのサイトカインなしで培養された場合、拡大することができない。場合によって、ゲノム的に破壊された細胞は、IL−2などのサイトカインと接触した後、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98または99日後に生存不能となり得る。

0121

本明細書に記載されている細胞組成物は、凍結保存することができる。凍結保存は、例えば、5%DMSO最終濃度のCryostor CS10において行うことができる。凍結保存は、約7.5×107細胞/mL〜約1.5×108細胞/mLの凍結密度において行うことができる。凍結密度は、約1×107細胞/mLから、1.5×107細胞/mL、2×107細胞/mL、2.5×107細胞/mL、3×107細胞/mL、3.5×107細胞/mL、4×107細胞/mL、4.5×107細胞/mL、5×107細胞/mL、5.5×107細胞/mL、6×107細胞/mL、6.5×107細胞/mL、7×107細胞/mL、7.5×107細胞/mL、8×107細胞/mL、8.5×107細胞/mL、9×107細胞/mL、9.5×107細胞/mL、1×108細胞/mL、1.5×108細胞/mL、2×108細胞/mL、2.5×108細胞/mL、3×108細胞/mL、3.5×108細胞/mL、4×108細胞/mL、4.5×108細胞/mL、5×108細胞/mL、5.5×108細胞/mL、6×108細胞/mL、6.5×108細胞/mL、7×108細胞/mL、7.5×108細胞/mLまたは最大約8×108細胞/mLであり得る。

0122

例えば、場合によって、TILは、収集し、洗浄し、Cryostor緩衝剤などの緩衝剤に再懸濁することができる。この調製物は、等しい体積のCryostore CS10と混合することができる。場合によって、細胞組成物は、それを必要とする対象への導入の前に解凍される。

0123

細胞生存率は、フローサイトメトリーおよびトリパンブルー排除によって決定することができる。場合によって、フローサイトメーターにおける前方散乱および側方散乱は、生細胞パーセントを同定することができる。他の場合では、細胞は、アネキシンVで染色して、死/生細胞のパーセントを決定することができる。トリパンブルー排除を用いて、血球計数器により細胞生存率を決定することもできる。場合によって、投与のために少なくとも約50%細胞が生存可能であり得る。他の場合では、約50%から、60%、70%、80%、90%、95%または最大約100%の細胞が生存可能であり得る。

0124

細胞標的
TILなどの細胞は、抗原をターゲティングし得る。細胞はまた、エピトープもターゲティングし得る。抗原は、腫瘍細胞抗原であり得る。エピトープは、腫瘍細胞エピトープであり得る。腫瘍浸潤リンパ球(TIL)は、対象特異的がんネオ抗原に対する特異的反応性を有するクローナルおよび/またはオリゴクローナル亜集団として選択され得る。特異的反応性は、腫瘍全エクソームシーケンシングおよびタンデムミニ遺伝子/合成長鎖ペプチドスクリーニング法のうちの少なくとも1つを使用して決定することができる、E. Tranら、Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer.、Science 344巻、641〜645頁(2014年)。腫瘍細胞エピトープは、変異から生じる腫瘍に由来する抗原(ネオ抗原またはネオエピトープ)、共有腫瘍特異的抗原分化抗原、および腫瘍内で過剰発現する抗原など、多種多様腫瘍抗原に由来し得る。場合によって、ネオ抗原またはネオエピトープは、5’RACEおよびTCR−PCRによって同定することができる。これらの抗原は、例えば、少数を挙げれば、アルファ−アクチニン−4、ARTC1、BCR−ABL融合タンパク質(b3a2)、B−RAF、CASP−5、CASP−8、ベータ−カテニン、Cdc27、CDK4、CDKN2A、COA−1、dek−can融合タンパク質、EFTUD2、伸長因子2、ETV6−AML1融合タンパク質、FLT3−ITD、FN1、GPNMB、LDLR−フコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質、HLA−A2d、HLA−Al ld、hsp70−2、KIAAO205、MART2、ME1、MUM−1f、MUM−2、MUM−3、ネオPAPミオシンクラスI、NFYC、OGT、OS−9、p53、pml−RARアルファ融合タンパク質、PRDX5、PTPRK、K−ras、N−ras、RBAF600、SIRT2、SNRPD1、SYT−SSX1−もしくは−SSX2融合タンパク質、TGF−ベータRII、トリオースリン酸イソメラーゼ、BAGE−1、GAGE−1、2、8、Gage 3、4、5、6、7、GnTVf、HERV−K−MEL、KK−LC−1、KM−HN−1、LAGE−1、MAGE−A1、MAGE−A2、MAGE−A3、MAGE−A4、MAGE−A6、MAGE−A9、MAGE−A10、MAGE−Al2、MAGE−C2、mucink、NA−88、NY−ESO−1/LAGE−2、SAGE、Sp17、SSX−2、SSX−4、TAG−1、TAG−2、TRAG−3、TRP2−INT2g、XAGE−1b、CEA、gp100/Pmel17、カリクレイン4、マンマグロビン−A、Melan−A/MART−1、NY−BR−1、OA1、PSA、RAB38/NY−MEL−1、TRP−1/gp75、TRP−2、チロシナーゼ、adipophilin、AIM−2、ALDH1A1、BCLX(L)、BCMA、BING−4、CPSF、サイクリンD1、DKK1、ENAH(hMena)、EP−CAM、EphA3、EZH2、FGF5、G250/MN/CAIX、HER−2/neu、IL13Rアルファ2、腸カルボキシルエステラーゼ、アルファフェトタンパク質、M−CSFT、MCSP、mdm−2、MMP−2、MUC1、p53、PBF、PRAME、PSMA、RAGE−1、RGS5、RNF43、RU2AS、セセルニン1、SOX10、STEAP1、スルビビンテロメラーゼVEGFおよび/またはWT1に由来し得る。腫瘍関連抗原は、宿主が正常では発現しない抗原の場合もあり;変異しているか、切断されているか、ミスフォールディングしているか、または他の形で、宿主が正常では発現しない分子の異常な兆候の場合もあり;正常でも発現するが、異常な高レベルで発現する分子と同一な場合もあり;異常な関連または環境で発現する場合もある。腫瘍関連抗原は、例えば、タンパク質もしくはタンパク質断片、複合体炭水化物ガングリオシドハプテン、核酸、他の生物学的分子、またはこれらの任意の組合せであり得る。場合によって、標的は、ネオ抗原またはネオエピトープである。例えば、ネオ抗原は、ERBB2IP内のE805G変異であり得る。場合によって、ネオ抗原およびネオエピトープは、全エクソームシーケンシングにより同定することができる。場合によって、ネオ抗原標的およびネオエピトープ標的は、消化器がん細胞が発現し得る。ネオ抗原およびネオエピトープは、上皮癌において発現し得る。

0125

エピトープは、間質エピトープであり得る。エピトープは、腫瘍微小環境の間質上にあり得る。抗原は、間質抗原であり得る。このような抗原は、腫瘍微小環境の間質上にあり得る。これらの抗原およびこれらのエピトープは、少数を挙げれば、例えば、腫瘍内皮細胞腫瘍血管系、腫瘍線維芽細胞、腫瘍周皮細胞腫瘍間質、および/または腫瘍間葉細胞において存在し得る。これらの抗原は、例えば、CD34、MCSP、FAP、CD31、PCNA、CD117、CD40、MMP4および/またはテネイシンを含み得る。

0126

ゲノム破壊
ゲノム破壊は、エクソンまたはイントロンを含み得る。場合によって、ゲノム破壊は、遺伝子配列の破壊であり得る。遺伝子の破壊は、任意の特定の遺伝子の破壊であり得る。本出願内の遺伝子の遺伝子相同体(例えば、遺伝子の任意の哺乳動物形)を対象とすることが想定される。当技術分野では、一部の遺伝子相同体は公知であるが、場合によって、相同体は公知ではない。しかし、哺乳動物の間で相同な遺伝子は、NCBIのBLASTなど、公表されているデータベースを使用して、核酸(DNAまたはRNA)配列またはタンパク質配列を比較することにより見出すことができる。

0127

ゲノム破壊は、細胞の機能を改善することができる。例えば、ゲノム破壊は、標的の細胞傷害作用を増強することができる。ゲノム破壊は、細胞の増殖または存続を増強することもできる。例えば、破壊され得る遺伝子は、がん免疫療法の治療可能性を改善し得る。細胞は、1または複数の内因性遺伝子をノックアウトするように操作することができる。ノックアウトされ得る内因性遺伝子は、免疫チェックポイント遺伝子を含み得る。免疫チェックポイント遺伝子は、刺激性チェックポイント遺伝子の場合もあり、阻害性チェックポイント遺伝子の場合もある。免疫チェックポイント遺伝子の位置は、Genome Reference Consortium Human Build 38 patch release 2(GRCh38.p2)アセンブリーを使用して提示することができる。ノックアウトされる遺伝子は、データベースを使用して選択することができる。場合によって、ある特定の内因性遺伝子は、ゲノム操作により適する。データベースは、エピジェネティクスにより許容性の標的部位を含み得る。データベースは、場合によって、ENCODE(Encyclopedia of DNA Elements)(http://www.genome.gov/10005107)であり得る。データベースは、ゲノム操作の許容性がより大きい可能性がある、オープンクロマチンを伴う領域を同定し得る。破壊され得る遺伝子は、TCRシグナル伝達、機能的アビディティー、またはがんに対する免疫の減弱に関与し得る。場合によって、破壊される遺伝子は、TCRが刺激されると、上方調節される。遺伝子は、細胞の拡大、機能的アビディティー、またはサイトカインの多機能性の阻害に関与し得る。遺伝子は、細胞によるサイトカインの産生を負に調節することに関与し得る。例えば、遺伝子は、例えば、エフェクターサイトカイン、IFN−ガンマ、および/またはTNFの産生の阻害に関与し得る。遺伝子はまた、TCRの刺激の後で、IL−2など、補助的サイトカインの発現の阻害にも関与し得る。

0128

細胞は、1または複数の遺伝子の破壊を有し得る。例えば、それらの発現が破壊される、1または複数の遺伝子は、PD−1またはCISHなどのチェックポイント遺伝子であり得る。場合によって、その発現が破壊され得る1または複数の遺伝子を表1に示す。例えば、破壊され得る遺伝子は、表1など、本明細書で開示される遺伝子に対する、一定の同一性および/または相同性を呈し得る。またはほぼこれらの比率の相同性(核酸レベルまたはタンパク質レベルで)を呈する遺伝子は、破壊し得ることが想定される。したがって、表1の50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%相同性を呈するか、またはほぼこれらの比率の相同性(核酸またはタンパク質レベルで)を呈する遺伝子は、破壊し得ることが想定される。表1の50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、もしくは100%の同一性を呈するか、またはほぼこれらの比率の同一性(核酸またはタンパク質レベルで)を呈する遺伝子は、破壊し得ることも想定される。

0129

細胞は、1または複数の抑制された遺伝子を有することができる。例えば、その発現が抑制されている1または複数の遺伝子は、表1中の遺伝子と共にその相同または修飾形のうちのいずれか1つを含み得る。遺伝子の抑制はまた、多数の方式で行うこともできる。例えば、遺伝子の発現は、ノックアウトにより抑制することもでき、遺伝子のプロモーターを変更することにより抑制することもでき、かつ/または干渉性RNAを投与することにより抑制することもできる。これは、生物レベルで行うこともでき、組織レベル、臓器レベルおよび/または細胞レベルで行うこともできる。細胞内、組織内、および/または臓器内で、1または複数の遺伝子をノックダウンする場合、1または複数の遺伝子は、RNA干渉性試薬、例えば、siRNA、shRNA、またはマイクロRNAを投与することにより抑制することができる。例えば、shRNAを発現させうる核酸を、細胞へと、安定的にトランスフェクトして、発現をノックダウンすることができる。さらに、shRNAを発現させうる核酸を、T細胞のゲノへと挿入し、これにより、T細胞内の遺伝子をノックダウンすることもできる。

0130

場合によって、破壊または抑制され得る遺伝子は、CISHであり得る。CISH遺伝子は、SOCS(suppressor of cytokine signaling)タンパク質ファミリーまたはSTAT誘導性STATインヒビター(SSI)タンパク質ファミリーとしてもまた公知である、サイトカイン誘導性STATインヒビター(CIS)タンパク質ファミリーのメンバーであり得る(例えば、Palmerら、Cish actively silences TCR signaling in CD8+ T cells to maintain tumor tolerance、The Journal of Experimental Medicine、202巻(12号)、2095〜2113頁(2015年)を参照されたい)。遺伝子は、サイトカインによるシグナル伝達を調節し得る、古典的な負のフィードバック系の一部を形成し得る、SOCSファミリーのタンパク質の一部であり得る。CISHは、エリスロポエチンプロラクチン、またはインターロイキン3(IL−3)受容体など、JAK−STAT5経路を介してシグナル伝達するサイトカインの負の調節に関与し得る。遺伝子は、そのチロシンリン酸化を抑制することにより、STAT5のトランス活性化を阻害し得る。CISHファミリーメンバーは、サイトカインによるシグナル伝達の、サイトカイン誘導性の負の制御因子であることが公知である。遺伝子の発現は、造血系細胞内のIL2、IL3、GM−CSF、またはEPOにより誘導することができる。プロテアソームを媒介する、遺伝子のタンパク質の分解は、エリスロポエチン受容体不活化に関与し得る。場合によって、ターゲティングされる遺伝子は、腫瘍特異的T細胞内で発現し得る。ターゲティングされる遺伝子は、破壊されると、操作細胞の、抗原に関連する腫瘍への浸潤を増大させることができる。

0131

エフェクターT細胞の機能的アビディティーの改善は、腫瘍微小環境内の阻害因子の克服および腫瘍退縮の誘発において不可欠であり得る。場合によって、サイトカインシグナル伝達サプレッサー(SOCS)ファミリーのメンバーであるCish(サイトカイン誘導性SH2タンパク質)は、CD8+T細胞におけるT細胞受容体(TCR)刺激によって誘導され得、腫瘍常在性T細胞において発現され得、腫瘍(複数可)に対するその機能的アビディティーを阻害し得る。腫瘍特異的CD8+T細胞におけるCishの遺伝子欠失は、その拡大、機能的アビディティーおよびサイトカイン多機能性を増強し、確立された腫瘍の顕著なかつ耐久性がある退縮をもたらすことができる。Cishは、不可欠なTCRシグナル伝達中間体ホスホリパーゼC−γ1(PLC−γ1)と物理的に相互作用し、TCR刺激後のプロテアソーム分解のためにこれをターゲティングする。これらの知見は、腫瘍特異的CD8+T細胞の機能的アビディティーを調節し、ACTがん免疫療法を改善するように操られ得る、新規のターゲティング可能な相互作用を確立した。場合によって、Cishノックアウトまたはノックダウンは、サイトカインレベルの増大をもたらすことができる。増大されたサイトカインレベルは、野生型対応物細胞の上清と比較した、上清におけるIFN−γ、TNF−α、IL−2またはこれらの組合せの増大を含み得る。他の場合では、Cishなどの遺伝子のノックアウトまたはノックダウンは、抗原感度の増大を含み得る。抗原感度の増大は、総サイトカイン発現レベルによって測定することができ、場合によって、抗原感度の増大は、40〜100倍であり得る。抗原感度の増大は、対照対応物細胞と比較して、40〜50、50〜60、60〜70、70〜80、80〜90、90〜100倍であり得る。

0132

場合によって、Cishノックアウトまたはノックダウンは、IFN−γ、TNF−αおよび/またはIL−2レベルによって測定される、サイトカイン放出の最大量の増大をもたらすことができる。場合によって、ELISAは、上清における総サイトカインレベルを測定することができ、亜集団または細胞レベルでのサイトカイン産生を直接的に測定しなくてよい。異なる亜集団または個々のT細胞が、サイトカイン産生の増大の原因となり得るか評価するために、CD8+Tを選択し、刺激し、細胞内IFN−γ、TNF−αおよびIL−2について共染色し、フローサイトメトリーにより評価することができる。場合によって、Cishは、腫瘍特異的T細胞における総エフェクターサイトカイン産生および多機能性の両方を負に調節することができる。Cishの遺伝的全身欠失は、機能的アビディティーを増強することができ、持続性腫瘍キラーへとCD8+T細胞をライセンス化し、これは、再発腫瘍に対するメモリー応答における意義を有することができる。

0133

T細胞内の1または複数の遺伝子は、任意の方法を使用して、ノックアウトまたは破壊することができる。例えば、1または複数の遺伝子のノックアウトは、1または複数の遺伝子を、T細胞のゲノムから欠失させることを含み得る。ノックアウトはまた、遺伝子配列の全部または一部を、T細胞から除去することも含み得る。また、ノックアウトは、T細胞のゲノム内の遺伝子の全部または一部を、1または複数のヌクレオチドで置き換えることを含み得ることも想定される。1または複数の遺伝子のノックアウトはまた、配列を、1または複数の遺伝子内に挿入し、これにより、1または複数の遺伝子の発現を破壊することも含み得る。例えば、配列の挿入は、終止コドンを、1または複数の遺伝子の中央部に作製し得る。配列の挿入はまた、1または複数の遺伝子のオープンリーディングフレームシフトさせうる。また、ノックアウト技術の任意の組合せを実行し得ることも想定される。例えば、組織特異的ノックアウトまたは細胞特異的ノックアウトを、誘導技術と組み合わせ、組織特異的または細胞特異的な誘導性ノックアウトを創出することができる。さらに、発生特異的プロモーターなどの他の系を、組織特異的プロモーターおよび/または誘導性ノックアウトと組み合わせて使用することもできる。

0134

ノックアウト技術はまた、遺伝子編集も含み得る。例えば、遺伝子編集は、CRISPR関連タンパク質(Casタンパク質、例えば、Cas9)、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、およびメガヌクレアーゼを含むヌクレアーゼを使用して実施することができる。ヌクレアーゼは、天然で存在するヌクレアーゼの場合もあり、遺伝子改変ヌクレアーゼの場合もあり、かつ/または組換えヌクレアーゼの場合もある。遺伝子編集はまた、トランスポゾンベースの系(例えば、PiggyBac、Sleepingbeauty)を使用して実施することもできる。例えば、遺伝子編集は、トランスポザーゼを使用して実施することができる。

0135

場合によって、操作された細胞、または破壊された遺伝子もしくはその部分を含有する細胞は、注入前試験を受けることができる。注入前試験は、操作細胞の培養物の表現型試験、効力試験、微生物学的試験、エンドトキシン試験、生存率試験および腫瘍細胞試験のうちの少なくとも1つを含み得る。表現型試験は、数例を挙げると、CD3、CD4、CD8、CD56、CD45RA、CD45RO、IL−7受容体アルファ、CD28の存在を検出するステップを含み得る。場合によって、操作細胞におけるマーカーのレベルは、少なくとも約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%を超える、または最大約100%である。注入前試験が、表現型試験について少なくとも約80%CD3陽性であり得る場合、TILは、投与され得る。

0136

場合によって、TILの効力試験は、TIL培養物の抗CD3刺激後にIFNγのレベルを検出するステップを含み得る。場合によって、TIL培養物の抗CD3刺激後のFNγのレベルは、同等の対照細胞集団よりも有意に大きい。場合によって、注入前試験が、効力試験においてTILの抗CD3刺激後に細胞105個当たり少なくとも約200pg/mLのIFNγを生じる場合、TILが投与される。場合によって、注入前試験が、効力試験においてTILの抗CD3刺激後に細胞105個当たり少なくとも約50pg/mL、細胞105個当たり75pg/mL、細胞105個当たり100pg/mL、細胞105個当たり150pg/mL、細胞105個当たり200pg/mL、細胞105個当たり250pg/mL、細胞105個当たり300pg/mLまたは細胞105個当たり最大約350pg/mLのIFNγを生じる場合、TILが投与される。

0137

場合によって、TILの集団は、組成物中の腫瘍細胞の存在について試験される。投与され得るTILは、細胞病理学試験において検討した少なくとも約200個のTIL当たりで腫瘍細胞について陰性であり得る。他の場合では、細胞病理学試験において検討した少なくとも約200個のTIL当たり1%未満の腫瘍細胞が存在する。他の場合では、細胞病理学試験において検討した少なくとも約200個のTIL当たり2%未満の腫瘍細胞が存在する。他の場合では、細胞病理学試験において検討した少なくとも約200個のTIL当たり3%未満の腫瘍細胞が存在する。他の場合では、細胞病理学試験において検討した少なくとも約200個のTIL当たり4%未満の腫瘍細胞が存在する。他の場合では、細胞病理学試験において検討した少なくとも約200個のTIL当たり5%未満の腫瘍細胞が存在する。

0138

CRISPR系
本明細書で記載される方法は、CRISPR系を利用し得る。少なくとも5つの種類のCRISPR系が存在し、これらは全て、RNAタンパク質およびCasタンパク質を包含する。I型III型、およびIV型は、crRNA相補的な核酸を切断することが可能な、多Casタンパク質複合体アセンブルする。I型およびIII型はいずれも、プロセシングされたcrRNAを、多Casタンパク質複合体へとアセンブリングする前に、プレcrRNAのプロセシングを要求する。II型およびV型のCRISPR系は、少なくとも1つのガイドRNAと複合体化させた、単一のCasタンパク質を含む。

0139

CRISPR系の一般的な機構および近年における進歩については、Cong, L.ら、「Multiplex genome engineering using CRISPR systems」、Science、339巻(6121号):819〜823頁(2013年);Fu, Y.ら、「High−frequency off−target mutagenesis induced by CRISPR−Cas nucleases in human cells」、Nature Biotechnology、31巻、822〜826頁(2013年);Chu,VTら、「Increasing the efficiency of homology−directed repair for CRISPR−Cas9−induced precise gene editing in mammalian cells」、Nature Biotechnology、33巻、543〜548頁(2015年);Shmakov, S.ら、「Discovery and functional characterization of diverse Class 2 CRISPR−Cas systems」、Molecular Cell、60巻、1〜13頁(2015年);Makarova, KSら、「An updated evolutionary classification of CRISPR−Cas systems,」、Nature Reviews Microbiology、13巻、1〜15頁(2015年)において論じられている。標的DNAの部位特異的切断は、1)ガイドRNAと標的DNA(また、プロトスペーサーとも呼ばれる)との塩基対合相補性、および2)プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と称する、標的DNA内の短いモチーフの両方により決定される位置において生じる。例えば、操作細胞は、CRISPR系、例えば、II型CRISPR系を使用して作製することができる。本明細書で開示される方法において使用されるCas酵素は、DNAの切断を触媒するCas9であり得る。Streptococcus pyogenesに由来するCas9、または任意の近縁のCas9による酵素作用により、20ヌクレオチドのガイド配列にハイブリダイズし、20ヌクレオチドの標的配列に後続してプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を有する標的部位配列において、二本鎖切断を生じることができる。

0140

場合によって、CRISPR系は、変異を導入することができる。変異は、挿入または欠失であり得る。例えば、CRISPR系は、CISHの少なくとも一部を含む1bp挿入を導入することができる。場合によって、CRISPR系によりTILを操ることは、CRISPR系の電気穿孔後にTIL拡大に負の効果がない場合がある。場合によって、遺伝的レベルで観察されるノックアウト頻度が、タンパク質の損失相関するか決定するために、CRISPRノックアウト後のCISHタンパク質などのタンパク質の発現を評価することができる。例えば、末梢血(PB)T細胞およびTILは、プレート結合した抗CD3および可溶性抗CD28抗体を使用して、電気穿孔後14日目に再刺激することができ、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットによりタンパク質、例えば、CISHタンパク質の損失を評価することができる。場合によって、CRISPR修飾されたPB T細胞およびTILは、14日間拡大させ、次いで48時間再刺激することができる。CISHは細胞内タンパク質であるため、細胞を回収し、ウェスタンブロットによって抽出物を解析することができる。ゲノム修飾のTiDE解析による高い率のノックアウトと整合して、CISHなどのタンパク質は、ノックアウト循環T細胞およびTILにおいて基本的に非存在であり得るまたは減少され得る。

0141

I.Casタンパク質
ベクターは、Casタンパク質(CRISPR関連タンパク質)など、CRISPR酵素をコードする、酵素コード配列に作動可能に連結することができる。Casタンパク質の非限定的な例は、Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(Csn1またはCsx12としても公知である)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx1S、Csf1、Csf2、CsO、Csf4、Cpf1、c2c1、c2c3、Cas9HiFi、これらの相同体、またはこれらの修飾形を含み得る。場合によって、触媒不活性なCasタンパク質、例えば、dCas9を使用することができる。Cas9など、非修飾CRISPR酵素は、DNA切断活性を有し得る。CRISPR酵素は、標的配列内および/または標的配列の相補体内など、標的配列において、一本または両方の鎖の切断を導きうる。例えば、CRISPR酵素は、標的配列の最初または最後のヌクレオチドから約1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10、15、20、25、50、100、200、500、もしくはそれよりも多い塩基対以内、またはほぼこれらの数の塩基対以内において、一本または両方の鎖の切断を導きうる。変異させたCRISPR酵素が、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの一本または両方鎖を切断する能力を欠くように、対応する野生型酵素に照らして変異させたCRISPR酵素をコードするベクターを使用することができる。Casタンパク質は、Cas9HiFiなど、高忠実度のCasタンパク質であり得る。場合によって、Casタンパク質は修飾され得る。例えば、Casタンパク質は、N7−メチル−Gppp(2’−O−メチル−A)であり得る。場合によって、Cas9タンパク質などのCasタンパク質は、臨床使用の前にシーケンシングされ得る。例えば、精製されたin vitro転写産物は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価して、Cas9以外の他のいかなるmRNA種も臨床産物内に存在しないことを検証することができる。その上、Cas9などのCasタンパク質をコードする精製されたmRNAは、逆転写に続くシーケンシングによる検証を受けて、ヌクレオチドレベルでの同一性を検証することができる。Cas配列は、核局在化配列(NLS)を含有し得る。核局在化配列は、SV40に由来し得る。NLSは、SV40、ヌクレオプラスミンインポーチンアルファ、C−myc、EGL−13、TUS、BORG、hnRNPA1、Mata2またはPY−NLSのうちの少なくとも1つに由来し得る。NLSは、Casタンパク質のC末端またはN末端に存在し得る。場合によって、Casタンパク質は、1〜5個のNLS配列を含有し得る。Casタンパク質は、1、2、3、4、5、6、7、8、9または最大10個のNLS配列を含有し得る。Cas9などのCasタンパク質は、2個のNLS配列を含有し得る。Casタンパク質は、SV40およびヌクレオプラスミン(nuceloplasmin)NLS配列を含有し得る。Casタンパク質は、少なくとも1個の非翻訳領域を含有し得る。

0142

Cas9とは、例示的な野生型のCas9ポリペプチド(例えば、S.pyogenesに由来するCas9)に対して、少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、100%の配列同一性および/もしくは配列類似性、または少なくともほぼこれらの比率の配列同一性および/もしくは配列類似性を伴うポリペプチドを指す場合がある。Cas9とは、例示的な野生型のCas9ポリペプチド(例えば、S.pyogenesに由来する)に対して、最大で50%、60%、70%、80%、90%、100%の配列同一性および/もしくは配列類似性、または最大でほぼこれらの比率の配列同一性および/もしくは配列類似性を伴うポリペプチドを指す場合がある。Cas9とは、欠失、挿入、置換、変異体、変異、融合、キメラまたはこれらの任意の組合せなどのアミノ酸変化を含み得る、Cas9タンパク質の野生型または修飾形態を指す場合もある。

0143

エンドヌクレアーゼ(例えば、Cas9などのCasタンパク質)をコードするポリヌクレオチドは、真核細胞など、特定の細胞内の発現のために、コドン最適化することができる。この種の最適化は、同じタンパク質をコードしながら、意図される宿主生物または宿主細胞のコドン優先性を模倣するように、外来由来の(例えば、組換え)DNA変異を伴いうる。

0144

1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10を超えるNLS、またはほぼこれらの数を超えるNLSなど、1または複数の核局在化配列(NLS)を含むCRISPR酵素をコードするベクターを使用することができる。例えば、CRISPR酵素は、アミノ末端において、またはこの近傍に、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10を超えるNLS、またはほぼこれらの数を超えるNLSを含む場合もあり、カルボキシル末端において、またはこの近傍に、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10を超えるNLS、またはほぼこれらの数を超えるNLSを含む場合もあり、これらの任意の組合せ(例えば、アミノ末端における1または複数のNLSと、カルボキシル末端における1または複数のNLSとの組合せ)を含む場合もある。1つを超えるNLSが存在する場合、単一のNLSが、1つを超えるコピーで、かつ/または1もしくは複数のコピーで存在する、他の1もしくは複数のNLSと組み合わせて存在し得るように、各NLSは、他のNLSから独立に選択することができる。

0145

NLSは、1部分からなる(monopartite)場合もあり、2部分からなる(bipartite)場合もある。場合によって、2部分からなるNLSは、1部分からなるNLSとは対照的に、スペーサー配列を有し得る。NLSは、SV40、ヌクレオプラスミン、インポーチンアルファ、C−myc、EGL−13、TUS、BORG、hnRNPA1、Mata2またはPY−NLSのうちの少なくとも1つに由来し得る。NLSは、ポリペプチド鎖内の任意の位置、例えば、N末端またはC末端の近傍に位置し得る。例えば、NLSは、N末端またはC末端から、ポリペプチド鎖に沿って、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50アミノ酸以内であるか、またはほぼこれらの数のアミノ酸以内であり得る。ある場合には、NLSは、N末端またはC末端から、50アミノ酸もしくはそれよりも多い数のアミノ酸、例えば、100、200、300、400、500、600、700、800、900もしくは1000アミノ酸以内であるか、またはほぼこれらの数のアミノ酸以内であり得る。

0146

エンドヌクレアーゼは、例示的な野生型の部位指向型ポリペプチド(例えば、S.pyogenesに由来する由来Cas9)のヌクレアーゼドメインに対して、少なくとも50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%、もしくは100%のアミノ酸配列同一性、または少なくともほぼこれらの比率のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。

0147

S.pyogenes Cas9(SpCas9)(表2)を一般に、ゲノム操作のためのCRISPRエンドヌクレアーゼとして使用するが、どの標的切出し部位にも最良のエンドヌクレアーゼではない場合もある。例えば、SpCas9のためのPAM配列(5’NGG3’)は、ヒトゲノム全体を通して夥多であるが、NGG配列は、修飾に所望される遺伝子を適正にターゲティングするように位置しない場合がある。場合によって、異なるエンドヌクレアーゼを使用して、ある特定のゲノム標的をターゲティングすることができる。場合によって、NGG以外のPAM配列を伴う、合成SpCas9由来の変異体を使用することができる。加えて、多様な種に由来する、他のCas9オーソログも同定されており、これらの「非SpCas9」は、様々なPAM配列に結合し、これらもまた、本発明に有用であり得るだろう。例えば、SpCas9の比較的大きなサイズ(約4kbのコード配列)は、SpCas9cDNAを有するプラスミドは、細胞内で効率的に発現しえないことを意味する。逆に、Staphylococcus aureus Cas9(SaCas9)のコード配列はおよそ、SpCas9より1キロベース短く、おそらく、細胞内の効率的な発現を可能とする。SpCas9と同様に、SaCas9エンドヌクレアーゼも、in vitroの哺乳動物細胞内、およびマウスのin vivoにおいて、標的遺伝子を修飾することが可能である。

0148

S.pyogenes Cas9への代替法は、Cpf1ファミリーに由来する、RNAにガイドされるエンドヌクレアーゼであって、哺乳動物細胞内の切断活性を提示するエンドヌクレアーゼを含み得る。Cas9ヌクレアーゼと異なり、Cpf1を媒介するDNAの切断の結果は、短い3’突出を伴う二本鎖切断である。Cpf1の付着末端切断パターンは、従来の制限酵素クローニングと類似する指向性遺伝子移入であって、遺伝子編集の効率を増大させる指向性遺伝子移入の可能性を開きうる。上記で記載したCas9の変異体およびオーソログと同様に、Cpf1もまた、CRISPRにより、SpCas9が優先するNGG PAM部位を欠く、ATリッチ領域またはATリッチゲノムへとターゲティングし得る部位の数を拡大し得る。

0149

任意の機能的濃度のCasタンパク質を、細胞へと導入することができる。例えば、15マイクログラムのCasmRNAを、細胞へと導入することができる。他の場合には、0.5マイクログラム〜100マイクログラムのCas mRNAを導入することができる。0.5、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、または100マイクログラムのCas mRNAを導入することができる。

0150

場合によって、二重ニカーゼ法を使用して、二本鎖切断またはゲノム切断を導入することができる。Casタンパク質は、いずれかのヌクレアーゼドメイン内の公知のアミノ酸において変異させ、これにより、1つのヌクレアーゼドメインの活性を欠失させ、一本鎖切断を生じることが可能な、ニカーゼCasタンパク質を作製することができる。2つの顕著に異なるガイドRNAターゲティング逆鎖を伴うニカーゼは、標的部位内でDSBを作製するのに用いることができる(「二重ニック」CRISPR系または「二重ニカーゼ」CRISPR系と称することが多い)。この手法は、2つのオフターゲットニックが、DSBを引き起こすのに十分に近接して作製される可能性は小さいので、標的特異性を劇的に増大させうる。

0151

Cas9などのヌクレアーゼは、使用の前に同一性および効力について試験することができる。例えば、同一性および効力は、分光光度解析、RNAアガロースゲル解析、LC−MS、エンドトキシン解析および無菌性試験のうちの少なくとも1つを使用して決定することができる。場合によって、同一性試験は、臨床/治療的使用に許容されるレベルを決定することができる。例えば、許容される分光光度解析結果は、1.0±0.1mg/mLにおける105±10μL/バイアルであり得る。許容される分光光度解析結果はまた、1.0±0.1mg/mLにおける約90〜120±10μL/バイアルまたは約0.1〜5.0±0.1mg/mLにおける約90〜120±10μL/バイアルであり得る。

0152

場合によって、Cas9などのヌクレアーゼは、約1.0±0.1のUV260/280比を有し得る。UV260−280比は、約1.0〜5.0±0.1であり得る。

0153

場合によって、Cas9などのヌクレアーゼは、RNAアガロースゲル解析によって測定される完全性/サイズを有することができる。Cas9のサイズは、約4500塩基であり得る。Cas9のサイズは、約4000〜約8000塩基であり得る。Cas9のサイズは、約4000〜約5000塩基、約5000〜約6000塩基、約6000〜約7000塩基、約7000〜約8000塩基であり得る。場合によって、バイオアナライザを用いて、Cas9などのヌクレアーゼ配列のサイズを決定することができる。バイオアナライザは、約4000〜約5000塩基、約5000〜約6000塩基、約6000〜約7000塩基、約7000〜約8000塩基であり得るCas9配列のサイズを決定することができる。

0154

場合によって、Cas9などのヌクレアーゼのエンドトキシンレベルを決定することができる。エンドトキシン試験は、リムルスアッセイであり得る。エンドトキシンの臨床上/治療上許容されるレベルは、3EU/mL未満であり得る。エンドトキシンの臨床上/治療上許容されるレベルは、10EU/mL未満であり得る。エンドトキシンの臨床上/治療上許容されるレベルは、8EU/mL未満であり得る。エンドトキシンの臨床上/治療上許容されるレベルは、5EU/mL未満であり得る。エンドトキシンの臨床上/治療上許容されるレベルは、4EU/mL未満であり得る。エンドトキシンの臨床上/治療上許容されるレベルは、3EU/mL未満であり得る。エンドトキシンの臨床上/治療上許容されるレベルは、2EU/mL未満であり得る。エンドトキシンの臨床上/治療上許容されるレベルは、1EU/mL未満であり得る。エンドトキシンの臨床上/治療上許容されるレベルは、0.5EU/mL未満であり得る。

0155

場合によって、Cas9などのヌクレアーゼは、無菌性試験を受けることができる。無菌性試験の臨床上/治療上許容されるレベルは、0であり得る、または培養物における増殖なしによって表示することができる。無菌性試験の臨床上/治療上許容されるレベルは、0.5%未満の増殖であり得る。無菌性試験の臨床上/治療上許容されるレベルは、1%未満の増殖であり得る。

0156

場合によって、Cas9配列などのヌクレアーゼ配列をシーケンシングして、その同一性を確認することができる。例えば、インプットCas9mRNA転写鋳型は、Cas9 mRNAロットの産生の前に、約4倍被覆度でシーケンシングすることができる。精製されたin vitro転写産物(produce)は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)によって評価して、mRNAが、Cas9に予想されるサイズであり、他のいかなるmRNA種も、臨床または治療用製品内に存在しないことを検証することができる。場合によって、精製されたmRNAは、逆転写酵素(RT)媒介の逆転写に続くDNAシーケンシングによる検証を受けて、ヌクレオチドレベルでの同一性を検証するであろう。

0157

場合によって、ヌクレアーゼ機能性の効力は、試行的ランにより試験することができる。例えば、Cas9は、3名の独立したドナーに由来する初代ヒトT細胞において機能的効力について試験することができる。試薬送達は、患者試料と同じ様式で行うことができる。効力は、標的ゲノム遺伝子座のシーケンシングによって決定することができ、インデル頻度は、各ドナーにおいて50%を満たすまたはこれを超えうる。場合によって、効力は、標的ゲノム遺伝子座のシーケンシングによって決定することができ、インデル頻度は、各ドナーにおいて60%を満たすまたはこれを超えうる。場合によって、効力は、標的ゲノム遺伝子座のシーケンシングによって決定することができ、インデル頻度は、各ドナーにおいて65%を満たすまたはこれを超えうる。場合によって、効力は、標的ゲノム遺伝子座のシーケンシングによって決定することができ、インデル頻度は、各ドナーにおいて70%を満たすまたはこれを超えうる。場合によって、効力は、標的ゲノム遺伝子座のシーケンシングによって決定することができ、インデル頻度は、各ドナーにおいて75%を満たすまたはこれを超えうる。

0158

II.ガイドポリ核酸
ガイドポリ核酸は、DNAまたはRNAであることが可能である。ガイドポリ核酸は、一本鎖または二本鎖であることが可能である。場合によって、ガイドポリ核酸は、一本鎖領域および二本鎖領域の領域を含有し得る。ガイドポリ核酸はまた、二次構造を形成し得る。本明細書で使用される「ガイドRNA(gRNA)」という用語、およびその文法的同等物は、標的DNAに特異的であることが可能であり、Casタンパク質と複合体を形成し得るRNAを指す場合がある。ガイドRNAは、標的部位を指定し、RNA/Cas複合体を、切断のために指定される標的DNAへとガイドする、ガイド配列またはスペーサー配列を含み得る。例えば、ガイドRNAは、CRISPR複合体を、異なる遺伝子へとターゲティングし、ターゲティングされた二本鎖切断を実施し得る。標的DNAの部位特異的切断は、1)ガイドRNAと標的DNA(また、プロトスペーサーとも呼ばれる)との塩基対合相補性、および2)プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)と称する、標的DNA内の短いモチーフの両方により決定される位置において生じる。場合によって、gRNAは、一般的に発現される転写物内の初期エクソンに位置するgRNAを同定することができるアルゴリズムを使用してデザインすることができる。候補gRNAは、次の項目を考慮に入れ得るスコアリングシステムを使用して、オフターゲット可能性によってランク付けすることができる:(a)gRNA配列およびいずれかの密接にマッチするゲノム配列の間のミスマッチの総数;(b)PAM部位の近くに収まるミスマッチのための活性における負の効果と相関するPAM部位と比べたミスマッチ位置(複数可);(c)ガイド−DNA相互作用破壊における近接ミスマッチの累積効果を説明するミスマッチ間の距離;ならびにこれらの任意の組合せ。場合によって、gRNAおよびゲノム標的部位の間のより多い数のミスマッチは、当該部位のCRISPR媒介性切断のより低い可能性を生じ得る。場合によって、ミスマッチ位置は、PAM部位に直接隣接する。他の場合では、ミスマッチ位置は、PAM部位から1ヌクレオチド〜最大100キロベース離れていてもよい。ミスマッチを含む候補gRNAは、場合によってPAMに隣接していなくてよい。他の場合では、ミスマッチを含む少なくとも2つの候補gRNAは、互いから1ヌクレオチド〜最大100キロベース離れたゲノムに結合し得る。ミスマッチは、ヌクレオチドの置換であり得る。例えば、場合によって、Gが、Tに代えて置換される。gRNAおよびゲノムの間のミスマッチは、CRISPR遺伝子編集の忠実度減少を可能にすることができる。場合によって、正のスコアリングのgRNAは、約110ヌクレオチドの長さであり得、相補的ゲノム配列に対するミスマッチを含有しなくてよい。他の場合では、正のスコアリングのgRNAは、約110ヌクレオチドの長さであり得、相補的ゲノム配列に対する最大3個のミスマッチを含有し得る。他の場合では、正のスコアリングのgRNAは、約110ヌクレオチドの長さであり得、相補的ゲノム配列に対する最大20個のミスマッチを含有し得る。ポリ核酸は、表4の配列のいずれかに対して、少なくとも50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、もしくは最大約100%の配列同一性および/もしくは配列類似性、または少なくともほぼこれらの比率の配列同一性および/または配列類似性を有し得る。場合によって、ガイドポリ核酸は、ホスホロチオエートであり得るヌクレオチド間連結を含有し得る。任意の数のホスホロチオエートが存在してもよい。例えば、1〜約100個のホスホロチオエートが、ガイドポリ核酸配列に存在し得る。場合によって、1〜10個のホスホロチオエートが存在する。場合によって、0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個のホスホロチオエートが、ガイドポリ核酸配列に存在する。

0159

場合によって、上位スコアリングgRNAをデザインおよび選択し、それぞれのオンターゲット編集効率を、患者由来TILおよび末梢血由来T細胞において実験的に評価することができる。場合によって、TiDE解析によって決定される編集効率は、少なくとも約20%を超え得る。他の場合では、編集効率は、約20%〜約50%、約50%〜約80%、約80%〜約100%であり得る。場合によって、TiDEによって測定される編集効率は、PD−1については85%、CISHについては90%であり得る。場合によって、インデルパーセントは、試行的GMPランにおいて決定することができる。例えば、最終細胞生成物は、サンガーシーケンシングおよびTIDE解析によってオンターゲットインデル形成に関して解析することができる。ゲノムDNAは、対照および実験試料の両方に由来する約1×106個の細胞から抽出し、CISHなど、破壊された遺伝子を挟むプライマーを使用したPCRにかけることができる。サンガーシーケンシングクロマトグラム(chromatogramp)は、対照およびノックアウト試料の比較によってインデル頻度およびインデルのサイズ分布を定量化し得るTIDEソフトウェアプログラムを使用して解析することができる。

0160

本明細書で開示される方法はまた、細胞またはへと、少なくとも1つのガイドRNA、または少なくとも1つのガイドRNAをコードする核酸、例えば、DNAを導入するステップも含み得る。ガイドRNAは、RNAにガイドされるエンドヌクレアーゼと相互作用して、エンドヌクレアーゼを、その部位において、ガイドRNAの5’末端が、染色体配列内の特異的プロトスペーサー配列と塩基対合する、特異的標的部位へと導きうる。

0161

ガイドRNAは、2つのRNA、例えば、CRISPR RNA(crRNA)およびトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含み得る。ガイドRNAは、ある場合には、crRNAおよびtracrRNAの部分(例えば、機能的な部分)の融合により形成される、単一のガイドRNA(sgRNA)を含み得る。ガイドRNAはまた、crRNAおよびtracrRNAを含む二重RNAでもあり得る。ガイドRNAは、crRNAを含むことが可能であり、tracrRNAを欠きうる。さらに、crRNAは、標的DNAまたはプロトスペーサー配列とハイブリダイズし得る。

0162

上記で論じた通り、ガイドRNAは、発現産物であり得る。例えば、ガイドRNAをコードするDNAは、ガイドRNAをコードする配列を含むベクターであり得る。ガイドRNAは、細胞または生物に、ガイドRNAをコードする配列およびプロモーターを含む単離ガイドRNAまたは単離プラスミドDNAをトランスフェクトすることにより、細胞または生物へと移入させることができる。ガイドRNAはまた、ウイルスを媒介する遺伝子送達を使用するなど、他の形で、細胞または生物へと移入させることもできる。

0163

ガイドRNAは、単離ガイドRNAであり得る。例えば、ガイドRNAは、単離RNAの形態で、細胞または生物へとトランスフェクトすることができる。ガイドRNAは、任意のin vitro転写系を使用する、in vitro転写により調製することができる。ガイドRNAは、細胞へと、ガイドRNAのコード配列を含むプラスミドの形態ではなく、単離RNAの形態で移入させることができる。

0164

ガイドRNAは、DNAターゲティングセグメントおよびタンパク質結合性セグメントを含み得る。DNAターゲティングセグメント(またはDNAターゲティング配列、またはスペーサー配列)は、標的DNA内の特異的配列(例えば、プロトスペーサー)と相補的であり得るヌクレオチド配列を含む。タンパク質結合性セグメント(またはタンパク質結合性配列)は、部位指向型修飾性ポリペプチド、例えば、Casタンパク質など、RNAにガイドされるエンドヌクレアーゼと相互作用し得る。「セグメント」とは、分子のセグメント/区画/領域、例えば、RNA内のヌクレオチドの連続的連なりを意味する。セグメントはまた、セグメントが、1つを超える分子の領域を含み得るように、複合体の領域/区画も意味する。例えば、場合によって、DNAターゲティングRNAのタンパク質結合性セグメントは、1つのRNA分子およびタンパク質結合性セグメントであり、したがって、このRNA分子の領域を含む。他の場合には、DNAターゲティングRNAのタンパク質結合性セグメントは、相補性領域に沿ってハイブリダイズさせた、2つの個別の分子を含む。

0165

ガイドRNAは、2つの個別のRNA分子を含む場合もあり、単一のRNA分子を含む場合もある。例示的な単一分子のガイドRNAは、DNAターゲティングセグメントおよびタンパク質結合性セグメントの両方を含む。

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