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技術 ヒト白血球抗原拘束ガンマデルタT細胞受容体及びその使用方法

出願人 ガデタ・ベー・フェー
発明者 ユルゲン・ヘルベルト・エルンスト・クバルグイド・ヨーリス・ヤン・キールケルスゾルト・シェベスチェーン
出願日 2017年6月12日 (2年10ヶ月経過) 出願番号 2018-564945
公開日 2019年9月12日 (7ヶ月経過) 公開番号 2019-525898
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 機能効率 パルス持続期間 獲得モード 切断バリ 例示的実施 電導性材料 大注入 アルファベータ
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (20)

課題・解決手段

がんを有する対象を処置する組成物及び方法が本明細書に開示される。組成物及び方法は、腫瘍細胞死滅をもたらす免疫応答細胞を利用する。

概要

背景

がんは、全世界の社会により重大な影響を有する。2016年には、米国のみで推定1,685,210件の新たながんの症例が診断されることとなり、595,690人の人がこの疾患で死ぬことになる。Journal of Oncology Practice(Erikson 2007)によると、2005年の1170万人(26人に1人)から増えて、2020年までに、1820万人のアメリカ人、おおよそ19人に1人が、がん患者又はがん生存者となる。

概要

がんを有する対象を処置する組成物及び方法が本明細書に開示される。組成物及び方法は、腫瘍細胞死滅をもたらす免疫応答細胞を利用する。

目的

したがって、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とする

効果

実績

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請求項1

ヒト白血球抗原(HLA)分子標的細胞上の少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化する場合、前記標的細胞上の前記HLA分子又はその部分に選択的に結合するポリペプチド構築物を含む組成物であって、前記ポリペプチド構築物が複合体化されていないHLA分子に結合せず、前記ポリペプチド構築物が細胞上で発現されるか又は合成される、組成物。

請求項2

前記HLA分子が、HLA-A血清型又はそのバリアントである、請求項1に記載の組成物。

請求項3

前記HLA-A血清型が、HLA-A*24である、請求項2に記載の組成物。

請求項4

前記HLA-A*24が、HLA-A*24:02である、請求項3に記載の組成物。

請求項5

前記複合体が、前記HLA分子のクラスター形成を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。

請求項6

前記複合体が、K-立体構造を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。

請求項7

前記K-立体構造が、同等の正常細胞と比較した場合、前記HLA分子の差次的特有分布又は差次的なクラスター形成のうちの少なくとも1つを含む、請求項6に記載の組成物。

請求項8

前記ポリペプチド構築物が、少なくとも1つの共受容体に結合する、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。

請求項9

前記少なくとも1つの共受容体が、CD8、CD4、CD28、CCR、及びCXCR4からなる群から選択される、請求項8に記載の組成物。

請求項10

前記少なくとも1つの共受容体が、CD8である、請求項9に記載の組成物。

請求項11

前記少なくとも1つの共受容体が、CD8アルファ又はCD8ベータのうちの少なくとも1つを含む、請求項10に記載の組成物。

請求項12

前記標的細胞が、がん細胞である、請求項1から11のいずれか一項に記載の組成物。

請求項13

前記がん細胞が、前記HLA分子を異常に発現している、請求項12に記載の組成物。

請求項14

前記異常な発現が、前記標的細胞上での前記K-立体構造を含み、前記異常な発現及び前記複合体化が、同等の正常細胞上には存在しない、請求項13に記載の組成物。

請求項15

前記異常な発現が、同等の正常細胞上の異常に発現していないHLAと比較して、構造、可動性フレキシビリティー、又は区画化のうちの少なくとも1つを含む、請求項13に記載の組成物。

請求項16

前記複合体化が、フローサイトメトリー又は顕微鏡法によって検出される、請求項1から15のいずれか一項に記載の組成物。

請求項17

前記がん細胞が、前記同等の正常細胞と比較して、前記HLAを過剰発現している、請求項12から16のいずれか一項に記載の組成物。

請求項18

前記過剰発現が、フローサイトメトリーによって検出する場合、前記がん細胞の集団における約1%から約100%の発現を含む、請求項17に記載の組成物。

請求項19

前記過剰発現が、免疫組織化学(IHC)分析による前記HLA分子の陽性検出を含む、請求項17又は18に記載の組成物。

請求項20

前記ポリペプチド構築物が、免疫細胞上で発現される、請求項1から19のいずれか一項に記載の組成物。

請求項21

前記免疫細胞が、骨髄又はリンパ系統に由来する、請求項20に記載の組成物。

請求項22

前記免疫細胞が、リンパ系統に由来する、請求項21に記載の組成物。

請求項23

リンパ系統由来の前記免疫細胞が、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、又はT細胞のうちの少なくとも1つである、請求項22に記載の組成物。

請求項24

前記免疫細胞が、複数のT細胞である、請求項20から23のいずれか一項に記載の組成物。

請求項25

前記複数のT細胞が、遺伝子操作されたαβT細胞である、請求項24に記載の組成物。

請求項26

前記免疫細胞が、前記ポリペプチド構築物を発現するようにウイルスによって改変されている、請求項20から25のいずれか一項に記載の組成物。

請求項27

前記免疫細胞が、前記ポリペプチド構築物を発現するようにウイルスによって改変されていない、請求項20から26のいずれか一項に記載の組成物。

請求項28

前記ポリペプチド構築物が、T細胞受容体(TCR)、抗体、キメラ抗原受容体(CAR)、B細胞受容体、及びそれらの任意の組合せのうちの少なくとも一部をコードする、請求項1から27のいずれか一項に記載の組成物。

請求項29

TCRの前記少なくとも一部が、遺伝子操作されたTCRである、請求項28に記載の組成物。

請求項30

前記TCRが、γδTCRである、請求項28又は29に記載の組成物。

請求項31

前記γδTCRが、γ9δ2TCR又はγ5δ1TCRである、請求項30に記載の組成物。

請求項32

前記γδTCRが、前記免疫細胞にとって外因性である、請求項30又は31に記載の組成物。

請求項33

前記免疫細胞が増殖される、請求項20から32のいずれか一項に記載の組成物。

請求項34

前記免疫細胞が、それを必要とする対象に投与される、請求項20から33のいずれか一項に記載の組成物。

請求項35

それを必要とする前記対象が、前記免疫細胞の前記投与前に、リンパ球枯渇レジメンを受けた、請求項34に記載の組成物。

請求項36

前記リンパ球枯渇レジメンが、シクロホスファミドフルダラビン放射線、又はそれらの組合せの投与を含む、請求項35に記載の組成物。

請求項37

前記ポリペプチド構築物が、γ-TCRのポリペプチド配列、δ-TCRのポリペプチド配列、それらのバリアント及び断片のうちの少なくとも1つを含む、請求項1から36のいずれか一項に記載の組成物。

請求項38

前記ポリペプチド構築物が、表2及び表6のリストから選択されるγ-TCRポリペプチド配列のCDR3領域、表2及び表5のリストから選択されるδ-TCRポリペプチド配列のCDR3領域、それらのバリアント及び断片を含む、請求項1から37のいずれか一項に記載の組成物。

請求項39

前記ポリペプチド構築物が、配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293及び配列番号6から配列番号428からなる群の配列から選択される配列と、少なくとも約80%、90%、95%、98%から、約99%までの配列同一性を有する配列を含む、請求項1から38のいずれか一項に記載の組成物。

請求項40

少なくとも1つのさらなる治療剤と組み合わせて、それを必要とする前記対象に投与される、請求項1から39のいずれか一項に記載の組成物。

請求項41

医薬組成物である、請求項1から40のいずれか一項に記載の組成物。

請求項42

a.請求項1から41のいずれか一項に記載の組成物と、b.賦形剤希釈剤、又は担体のうちの少なくとも1つとを含む医薬組成物。

請求項43

単位剤形で投与される、請求項40に記載の医薬組成物。

請求項44

錠剤液体剤シロップ剤経口製剤静脈内製剤、内製剤、皮下製剤、吸入可能な呼吸器製剤、坐剤、及びそれらの任意の組合せの形態である、請求項42又は43に記載の医薬組成物。

請求項45

輸液剤の形態で投与される、請求項44に記載の医薬組成物。

請求項46

前記医薬組成物の前記投与が、それを必要とする前記対象の疾患又は状態を少なくとも部分的に緩和する、請求項45に記載の医薬組成物。

請求項47

前記緩和が、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、少なくとも約30%の腫瘍サイズの低減を含む、請求項46に記載の医薬組成物。

請求項48

前記緩和が、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、腫瘍病変直径のベースライン測定値の変化が10%未満と測定されるように、腫瘍サイズを安定化させることを含む、請求項47に記載の医薬組成物。

請求項49

それを必要とする対象を処置する方法であって、少なくとも1つのさらなるヒト白血球抗原(HLA)分子と複合体化されたHLA分子に結合するポリペプチド構築物を含む有効量の医薬組成物を前記対象に投与する工程を含み、前記ポリペプチド構築物が、複合体化されていないHLA分子に結合しない、方法。

請求項50

前記HLA分子が、HLA-A血清型のもの又はそのバリアントである、請求項49に記載の方法。

請求項51

前記HLA-Aが、HLA-A*24である、請求項50に記載の方法。

請求項52

前記HLA-A*24が、HLA-A*24:02である、請求項51に記載の方法。

請求項53

前記ポリペプチド構築物が、γ-TCRポリペプチド配列、δ-TCRポリペプチド配列、それらのバリアント及び断片のうちの少なくとも1つを含む、請求項49から52のいずれか一項に記載の方法。

請求項54

前記ポリペプチド構築物が、表2及び表6のリストから選択されるγ-TCRポリペプチド配列のCDR3領域、表2及び表5のリストから選択されるδ-TCRポリペプチド配列のCDR3領域、それらのバリアント、及び断片を含む、請求項49から53のいずれか一項に記載の方法。

請求項55

前記ポリペプチド構築物が、配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293及び配列番号6から配列番号428からなる群の配列から選択される配列と、約80%、90%、95%、98%から、約99%までの配列同一性を有する配列を含む、請求項49から54のいずれか一項に記載の方法。

請求項56

サイトカイン化学療法、放射線、又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つを、それを必要とする前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項49から55のいずれか一項に記載の方法。

請求項57

前記サイトカインが、インターロイキン2である、請求項56に記載の方法。

請求項58

前記化学療法が、シクロホスファミド又はフルダラビンのうちの少なくとも1つを含む、請求項56又は57に記載の方法。

請求項59

前記ポリペプチド構築物が、凍結乾燥されている、請求項49から58のいずれか一項に記載の方法。

請求項60

アジュバント、希釈剤、担体、又はそれらの組合せをさらに含む、請求項49から59のいずれか一項に記載の方法。

請求項61

異常なHLA-A*24発現を含む疾患を処置する方法であって、ヒト白血球抗原(HLA)-A*24の少なくとも一部に結合する第1の治療剤を投与する工程、及びそれに続いて前記第1の治療剤を再投与する工程と、第2の治療剤を投与する工程とのうちの少なくとも一方の工程を含む方法。

請求項62

前記第1の治療剤が、T細胞受容体(TCR)、抗体、キメラ抗原受容体(CAR)、B細胞受容体、及びそれらの任意の組合せのうちの少なくとも一部を含む、請求項61に記載の方法。

請求項63

TCRの前記少なくとも一部が、αβTCR又はγδTCRである、請求項62に記載の方法。

請求項64

前記TCRが、γδTCRである、請求項63に記載の方法。

請求項65

前記第1の治療剤が、前記γδTCRを発現する遺伝子操作された細胞である、請求項61から64のいずれか一項に記載の方法。

請求項66

前記遺伝子操作された細胞が、リンパ系統又は骨髄系統に由来する、請求項65に記載の方法。

請求項67

前記遺伝子操作された細胞が、リンパ系統に由来し、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、又はT細胞から選択される、請求項66に記載の方法。

請求項68

前記遺伝子操作された細胞が、T細胞である、請求項67に記載の方法。

請求項69

前記第1の治療剤が、HLA-A*24が少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化する場合、がん細胞に結合する、請求項61から68のいずれか一項に記載の方法。

請求項70

前記再投与が、前記第1の治療剤を投与する工程の約24時間から約1年後に行われる、請求項61から69のいずれか一項に記載の方法。

請求項71

定量PCR(qPCR)又はフローサイトメトリーのうちの少なくとも1つによって、前記第1の治療剤のレベルを検出する工程をさらに含む、請求項61から70のいずれか一項に記載の方法。

請求項72

前記第2の治療剤が、化学療法剤放射線療法、又は免疫療法剤からなる群から選択される、請求項61から71のいずれか一項に記載の方法。

請求項73

前記第2の治療剤が、免疫療法剤である、請求項72に記載の方法。

請求項74

ヒト白血球抗原(HLA)分子が標的細胞上で少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化する場合、前記標的細胞上の前記HLA分子又はその部分に選択的に結合するポリペプチド構築物をコードするゲノム変化を含む遺伝子操作された細胞であって、前記ポリペプチド構築物が、複合体化されていないHLA分子に結合しない、遺伝子操作された細胞。

請求項75

前記HLAが、クラスI、クラスII、又はそれらの組合せを含む、請求項74に記載の遺伝子操作された細胞。

請求項76

前記HLAが、クラスI(HLA-I)を含む、請求項75に記載の遺伝子操作された細胞。

請求項77

前記HLA-Iが、HLA-Aを含む、請求項76に記載の遺伝子操作された細胞。

請求項78

前記HLA-Aが、HLA-A*24である、請求項77に記載の遺伝子操作された細胞。

請求項79

前記HLA-A*24対立遺伝子が、HLA-A*24:02を含む、請求項78に記載の遺伝子操作された細胞。

請求項80

前記ゲノム変化が、前記ポリペプチド構築物のウイルスによる導入を含むノックインを含む、請求項74から79のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞。

請求項81

前記ウイルスによる導入が、レンチウイルスレトロウイルスアデノウイルス、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択されるウイルスを含む、請求項80に記載の遺伝子操作された細胞。

請求項82

前記ウイルスによる導入が、レトロウイルスを含む、請求項81に記載の遺伝子操作された細胞。

請求項83

前記ポリペプチド構築物が、少なくとも1つのγδTCR又はその断片若しくはバリアントを含む、請求項74から82のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞。

請求項84

前記γδTCRが、表2及び表6のリストから選択されるγ-TCRポリペプチド配列、表2及び表5のリストから選択されるδTCRポリペプチド配列のCDR3領域、それらのバリアント及び断片を含む、請求項83に記載の遺伝子操作された細胞。

請求項85

前記ポリペプチド構築物が、少なくとも1つのさらなるペプチド及び/又は少なくとも1つの共受容体の存在下で、前記標的細胞上の前記HLAに選択的に結合する、請求項74から84のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞。

請求項86

前記少なくとも1つの共受容体が、CD8、CD4、CD28、CCR、及びCXCR4からなる群から選択される、請求項85に記載の遺伝子操作された細胞。

請求項87

前記少なくとも1つの共受容体が、CD8である、請求項86に記載の遺伝子操作された細胞。

請求項88

前記少なくとも1つの共受容体が、CD8アルファ又はCD8ベータの少なくとも1つを含む、請求項87に記載の遺伝子操作された細胞。

請求項89

請求項74から88のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞を含む細胞の集団。

請求項90

前記遺伝子操作された細胞の約60%から約100%が、前記ポリペプチド構築物を発現している、請求項89に記載の集団。

請求項91

前記遺伝子操作された細胞が、複数のαβT細胞である、請求項89又は90に記載の集団。

請求項92

前記集団がそれを必要とする対象に投与される場合、がんが制御、低減、又は排除される、請求項89から91のいずれか一項に記載の集団。

請求項93

前記集団がそれを必要とする対象に投与される場合、ウイルス感染が、制御、低減、又は排除される、請求項89から92のいずれか一項に記載の集団。

請求項94

前記投与が、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、腫瘍サイズを少なくとも30%低減するのに効果的である、請求項93に記載の集団。

請求項95

前記投与が、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、腫瘍病変直径のベースライン測定値の10%未満の変化と測定されるように、腫瘍サイズを安定化させるのに効果的である、請求項93に記載の集団。

請求項96

約5×104から約1×1012個の細胞が、それを必要とする前記対象に投与される、請求項92から95のいずれか一項に記載の集団。

請求項97

前記投与が、それを必要とする前記対象の寿命を、未処置の対象と比較して約1週間から約50年間延長する、請求項92から96のいずれか一項に記載の集団。

請求項98

前記遺伝子操作された細胞が、抗体の結合によって阻害される、請求項89から97のいずれか一項に記載の集団。

請求項99

前記抗体の結合が、前記遺伝子操作された細胞の前記投与に関連する毒性を低減する、請求項98に記載の集団。

請求項100

配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、又は配列番号5のアミノ酸21〜293のうちの少なくとも1つのポリペプチド配列をコードする配列と少なくとも90%、95%、97%又は99%同一である配列を含むポリ核酸

請求項101

配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、又は配列番号5のアミノ酸21〜293のうちの少なくとも1つと少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である受容体配列を含む遺伝子操作された細胞。

請求項102

配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293及び配列番号6から配列番号428のうちの少なくとも1つと少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である配列を有する受容体の少なくとも一部を含む遺伝子操作された細胞。

請求項103

増殖されて遺伝子操作された細胞の集団になっている、請求項102に記載の遺伝子操作された細胞。

請求項104

遺伝子操作された細胞の前記集団が、医薬組成物に製剤化されている、請求項103に記載の遺伝子操作された細胞。

請求項105

ヒト白血球抗原(HLA)分子が標的細胞上の少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化する場合、前記標的細胞上の前記HLA分子又はその部分に選択的に結合するポリペプチドであって、複合体化されていないHLA分子に結合しない、ポリペプチド。

請求項106

前記HLA分子が、HLA-A血清型又はそのバリアントであり、好ましくは、前記HLA-A血清型がHLA-A*24であり、より好ましくは、前記HLA-A*24がHLA-A*24:02である、請求項105に記載のポリペプチド。

請求項107

前記標的細胞が、がん細胞であり、好ましくは、前記がん細胞が、前記HLA分子を異常に発現する、請求項105又は106に記載のポリペプチド。

請求項108

CDR3領域を含むδT細胞受容体鎖又はその部分であり、前記δT細胞受容体鎖又はその部分が、配列番号3、配列番号5のアミノ酸21〜293、又は配列番号6から237のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含むアミノ酸配列によって表される、請求項105から107のいずれか一項に記載のポリペプチド。

請求項109

CDR3領域を含むγT細胞受容体鎖又はその部分であり、前記δT細胞受容体鎖又はその部分が、配列番号2、配列番号4のアミノ酸19〜309、又は配列番号238から428のアミノ酸のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含むアミノ酸配列によって表される、請求項105から107のいずれか一項に記載のポリペプチド。

請求項110

a.請求項108に規定のδT細胞受容体鎖又はその部分、及びb.請求項109に規定のγT細胞受容体鎖又はその部分を含むT細胞受容体(TCR)、好ましくは、遺伝子操作されたTCR。

請求項111

請求項105から109のいずれか一項に記載のポリペプチド又は請求項110に記載のTCRをコードする核酸分子

請求項112

請求項111に記載の核酸分子を含む核酸構築物

請求項113

請求項112に記載の核酸構築物を含む細胞。

請求項114

医薬として使用するための、請求項105から109のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項110に記載のTCR、請求項111に記載の核酸分子、請求項112に記載の核酸構築物又は請求項113に記載の細胞。

請求項115

がん又は感染に対する医薬として使用するための、請求項105から109のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項110に記載のTCR、請求項111に記載の核酸分子、請求項112に記載の核酸構築物又は請求項113に記載の細胞。

請求項116

請求項74から88のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞、又は請求項113に記載の細胞の投与に関連する毒性を低減する方法であって、少なくとも1つの抗体又はその部分の、それを必要とする対象への投与を含む、方法。

請求項117

前記抗体が、遮断抗体又は中和抗体である、請求項116に記載の方法。

請求項118

前記抗体又はその部分が、前記遺伝子操作された細胞又は前記細胞の、HLA-A*24:02を発現する細胞への結合を阻害する、請求項116又は117に記載の方法。

請求項119

前記HLA-A*24:02を発現する細胞が、がん細胞又は同等の正常細胞のうちの少なくとも1つである、請求項118に記載の方法。

請求項120

少なくとも1つの抗体又はその部分の前記投与が、それを必要とする前記対象のサイトカイン放出症候群(CRS)、B細胞形成不全、及び腫瘍崩壊症候群(TLS)のうちの少なくとも1つのレベルを低減する、請求項116から119のいずれか一項に記載の方法。

請求項121

前記少なくとも1つの抗体が、前記HLA-A*24:02に完全に又は部分的に結合する、請求項116から120のいずれか一項に記載の方法。

請求項122

前記抗体が、ヒト抗体ヒト化抗体、又はその断片若しくはバリアントである、請求項121に記載の方法。

請求項123

前記バリアントが、scFv又はscFabである、請求項122に記載の方法。

請求項124

所定の相対湿度を有する雰囲気中で、所定の時間、25℃又は4℃で密封容器中に保存した場合に、活性を保持する、請求項1から48のいずれか一項に記載の組成物又は医薬組成物。

請求項125

前記所定の相対湿度が、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%又は95%の相対湿度である、請求項124に記載の組成物又は医薬組成物。

請求項126

前記所定の時間が、少なくとも1カ月、2カ月、3カ月、6カ月、1年、1.5年、2年、2.5年又は3年である、請求項124又は125に記載の組成物又は医薬組成物。

請求項127

少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化するHLA分子への結合によって決定する場合、少なくとも50%、60%、70%、80%又は90%の活性を保持する、請求項124から126のいずれか一項に記載の組成物又は医薬組成物。

技術分野

0001

配列表
本出願は、ASCIIフォーマット電子的に提出され、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる配列表を含有する。2017年6月9日に作成された前記ASCIIコピー名称は51887-705_601_SL.txtであり、156,305バイトのサイズである。

背景技術

0002

がんは、全世界の社会により重大な影響を有する。2016年には、米国のみで推定1,685,210件の新たながんの症例が診断されることとなり、595,690人の人がこの疾患で死ぬことになる。Journal of Oncology Practice(Erikson 2007)によると、2005年の1170万人(26人に1人)から増えて、2020年までに、1820万人のアメリカ人、おおよそ19人に1人が、がん患者又はがん生存者となる。

0003

米国特許出願公開第20040101519号
米国特許出願公開第20060034810号
米国特許第5,350,674号
米国特許第5,585,362号
US2005/0255105

先行技術

0004

Journal of Oncology Practice(Erikson 2007)
Computational Molecular Biology、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988年
Biocomputing: Informatics and Genome Projects、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993年
Computer Analysis of Sequence Data、第I部、Griffin, A. M.、及びGriffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994年
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発明が解決しようとする課題

0005

がん免疫療法の圧倒的な臨床成功に鑑みて、腫瘍浸潤性γδT細胞が多くのがん型にわたる臨床成績の主要な予測因子であるため、γδT細胞は目的となる注目を浴びている。いくつかの手法が前臨床モデル試験されてきており、多数の臨床試験が現在進行中である。γδT細胞を臨床にもたらすための多大な努力にもかかわらず、これらの使用はほとんど効果的ではなかった。したがって、これらの抗腫瘍効率を利用する新たなモダリティが必要とされる。

課題を解決するための手段

0006

幅広い種類のがんに対する代わりの且つ有効な処置への差し迫った必要性が存在する。本発明は、この必要性に対処し、関連する利益も同様に提供する。したがって、本発明は処置方法を開示する。

0007

ヒト白血球抗原(HLA)分子標的細胞上の少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化する場合、標的細胞上のHLA分子又はその部分に選択的に結合するポリペプチド構築物コンストラクト)を含む組成物であって、ポリペプチド構築物が複合体化されていないHLA分子と結合しない組成物が本明細書に開示される。ある特定の場合には、複合体化されていないHLA分子は、少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化されていないHLA分子である。一部の場合には、ポリペプチド構築物は細胞上で発現されるか又は合成される。一部の場合には、HLA分子は、HLA-A血清型又はそのバリアントであり得る。一部の場合には、HLA-A血清型は、HLA-A*24であり得る。HLA-A*24は、HLA-A*24:02であり得る。一部の場合には、本明細書に記載のポリペプチドによって認識されるHLA分子は、複数のHLA分子と複合体を形成し得る。特定の場合には、複合体化されたHLA分子は、任意選択クラスターを形成し得る。ポリペプチド構築物は、少なくとも1つの共受容体に結合し得る。一部の場合には、少なくとも1つの共受容体は、CD8、CD4、CD28、CCR、及びCXCR4からなる群から選択され得る。一部の場合には、少なくとも1つの共受容体は、CD8であり得る。少なくとも1つの共受容体は、CD8アルファ又はCD8ベータのうちの少なくとも1つを含み得る。一部の場合には、標的細胞は、がん細胞であり得る。がん細胞は、HLA分子を異常に発現する場合がある。異常な発現は、標的細胞上での複合体化を含む可能性があり、異常な発現及び複合体化は、同等の正常細胞上には存在しない場合がある。異常な発現は、同等の正常細胞上の異常に発現していないHLAと比較して、構造、可動性フレキシビリティー、又は区画化のうちの少なくとも1つを含み得る。複合体化は、フローサイトメトリー又は顕微鏡法によって検出され得る。がん細胞は、同等の正常細胞と比較して、HLAを過剰発現し得る。過剰発現は、フローサイトメトリーによって検出する場合、がん細胞の集団における約1%から約100%の発現を含み得る。過剰発現は、免疫組織化学(IHC)分析によるHLA分子の陽性検出を含み得る。ポリペプチド構築物は、免疫細胞上で発現され得る。免疫細胞は、骨髄又はリンパ系統に由来し得る。一部の場合には、免疫細胞は、リンパ系統に由来し得る。リンパ系統由来の免疫細胞は、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、又はT細胞のうちの少なくとも1つであり得る。一部の場合には、免疫細胞は、複数のT細胞であり得る。複数のT細胞は、遺伝子操作されたαβT細胞であり得る。一部の場合には、免疫細胞は、ポリペプチド構築物を発現するようにウイルスによって改変されていてもよい。一部の場合には、免疫細胞は、ポリペプチド構築物を発現するようにウイルスによって改変されていなくてもよい。ポリペプチド構築物は、T細胞受容体(TCR)、抗体、キメラ抗原受容体(CAR)、B細胞受容体、及びそれらの任意の組合せのうちの少なくとも一部をコードし得る。一部の場合には、TCRの少なくとも一部は、遺伝子操作されたTCRであり得る。TCRは、γδTCRであり得る。γδTCRは、γ9δ2TCR又はγ5δ1TCRであり得る。γδTCRは、免疫細胞にとって外因性であり得る。免疫細胞は増殖され得る。免疫細胞は、それを必要とする対象に投与され得る。それを必要とする対象は、免疫細胞の投与前に、リンパ球枯渇(lymphodepleting)レジメンを受けていてもよい。リンパ球枯渇レジメンは、シクロホスファミドフルダラビン放射線、又はそれらの組合せの投与を含むことができる。ポリペプチド構築物は、γ-TCRのポリペプチド配列、δ-TCRのポリペプチド配列、それらのバリアント及び断片のうちの少なくとも1つを含むことができる。ポリペプチド構築物は、表2及び表6のリストから選択されるγ-TCRポリペプチド配列のCDR3領域、表2及び表5のリストから選択されるδ-TCRポリペプチド配列のCDR3領域、それらのバリアント、及び断片を含むことができる。ポリペプチド構築物は、配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293、配列番号4、配列番号5及び配列番号6から配列番号428からなる群の配列から選択される配列と、少なくとも約80%、90%、95%、98%から、約99%までの配列同一性を有する配列を含むことができる。組成物は、少なくとも1つのさらなる治療剤と組み合わせて、それを必要とする対象に投与され得る。組成物は、医薬組成物であり得る。

0008

請求項1から39のいずれか一項に記載の組成物と、賦形剤希釈剤、又は担体のうちの少なくとも1つとを含む医薬組成物が本明細書に開示される。医薬組成物は、単位剤形で投与することができる。医薬組成物は、錠剤液体剤シロップ剤経口製剤静脈内製剤、内製剤、皮下製剤、吸入可能な呼吸器製剤、坐剤、及びそれらの任意の組合せの形態であり得る。医薬組成物は、輸液剤の形態で投与することができる。一部の場合には、医薬組成物の投与は、それを必要とする対象の疾患又は状態を少なくとも部分的に緩和する。緩和は、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、少なくとも約30%までの腫瘍サイズの低減を含むことができる。緩和は、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、腫瘍病変直径のベースライン測定値の変化が10%未満と測定されるように、腫瘍サイズを安定化させることを含むことができる。

0009

それを必要とする対象を処置する方法であって、少なくとも1つのさらなるヒト白血球抗原(HLA)分子と複合体化されたHLA分子に結合するポリペプチド構築物を含む有効量の医薬組成物を対象に投与する工程を含み、ポリペプチド構築物が、複合体化されていないHLA分子に結合しない、方法が本明細書に開示される。ある特定の場合には、ポリペプチド構築物は、HLA分子が少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化されていない場合、HLA分子に結合しない。HLA分子は、HLA-A血清型又はそのバリアントを有し得る。HLA-Aは、HLA-A*24であり得る。HLA-A24は、HLA-A*24:02であり得る。ポリペプチド構築物は、γ-TCRポリペプチド配列、δ-TCRポリペプチド配列、それらのバリアント及び断片のうちの少なくとも1つを含むことができる。ポリペプチド構築物は、表2及び表6のリストから選択されるγ-TCRポリペプチド配列のCDR3領域、表2及び表5のリストから選択されるδ-TCRポリペプチド配列のCDR3領域、それらのバリアント、及び断片を含むことができる。ポリペプチド構築物は、配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293、配列番号4、配列番号5及び配列番号6から配列番号428からなる群の配列から選択される配列と、少なくとも約80%、90%、95%、98%から、約99%までの配列同一性を有する配列を含むことができる。一部の場合には、方法は、サイトカイン化学療法、放射線、又はそれらの組合せのうちの少なくとも1つを、それを必要とする対象に投与する工程をさらに含むことができる。サイトカインは、インターロイキン2であり得る。一部の場合には、化学療法は、シクロホスファミド又はフルダラビンのうちの少なくとも1つを含むことができる。一部の場合には、ポリペプチド構築物は、凍結乾燥され得る。一部の場合には、方法は、アジュバント、希釈剤、担体、又はそれらの組合せをさらに含むことができる。

0010

異常なHLA-A*24発現を含む疾患を処置する方法であって、ヒト白血球抗原(HLA)-A*24の少なくとも一部に結合する第1の治療剤を投与する工程、及びそれに続いて前記第1の治療剤を再投与する工程と、第2の治療剤を投与する工程とのうちの少なくとも一方の工程を含む方法が本明細書に開示される。第1の治療剤は、T細胞受容体(TCR)、抗体、キメラ抗原受容体(CAR)、B細胞受容体、及びそれらの任意の組合せのうちの少なくとも一部を含むことができる。一部の場合には、TCRの少なくとも一部は、αβTCR又はγδTCRであり得る。TCRは、γδTCRであり得る。第1の治療剤は、γδTCRを発現する遺伝子操作された細胞であり得る。遺伝子操作された細胞は、リンパ系統又は骨髄系統に由来し得る。遺伝子操作された細胞は、リンパ系統に由来し得、ナチュラルキラー(NK)細胞、B細胞、又はT細胞から選択することができる。遺伝子操作された細胞は、T細胞であり得る。第1の治療剤は、HLA-A*24が少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化することができる場合、がん細胞に結合することができる。一部の場合には、再投与は、第1の治療剤を投与する工程の約24時間から約1年後に実施することができる。一部の場合には、方法は、定量PCR(qPCR)又はフローサイトメトリーのうちの少なくとも1つによって、第1の治療剤のレベルを検出する工程をさらに含むことができる。第2の治療剤は、化学療法剤放射線療法剤、又は免疫療法剤からなる群から選択され得る。第2の治療剤は、免疫療法剤であり得る。

0011

ヒト白血球抗原(HLA)分子が標的細胞上で少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化する場合、前記標的細胞上の前記HLA分子又はその部分に選択的に結合するポリペプチド構築物コードするゲノム変化を含む遺伝子操作された細胞であって、前記ポリペプチド構築物が、複合体化されていないHLA分子に結合しないか、又は前記HLA分子が少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化されていない場合、前記HLA分子に結合しない、遺伝子操作された細胞が本明細書に開示される。HLAは、クラスI、クラスII、又はそれらの組合せを含むことができる。HLAは、クラスI(HLA-I)を含むことができる。HLA-Iは、HLA-Aを含むことができる。HLA-Aは、HLA-A*24であり得る。HLA-A*24対立遺伝子アレル)は、HLA-A*24:02を含むことができる。一部の場合には、ゲノム変化は、前記ポリペプチド構築物のウイルスによる導入を含むノックインを含むことができる。ウイルスによる導入は、レンチウイルスレトロウイルスアデノウイルス、及びこれらの任意の組合せからなる群から選択されるウイルスを含むことができる。ウイルスによる導入は、レトロウイルスを含むことができる。一部の場合には、ポリペプチド構築物は、少なくとも1つのγδTCR又はその断片若しくはバリアントを含むことができる。γδTCRは、表2及び表6のリストから選択されるγ-TCRポリペプチド配列、表2及び表5のリストから選択されるδTCRポリペプチド配列のCDR3領域、それらのバリアント、及び断片を含むことができる。ポリペプチド構築物は、少なくとも1つのさらなるペプチド及び/又は少なくとも1つの共受容体の存在下で、標的細胞上のHLAに選択的に結合することができる。一部の場合には、少なくとも1つの共受容体は、CD8、CD4、CD28、CCR、及びCXCR4からなる群から選択することができる。少なくとも1つの共受容体は、CD8であり得る。少なくとも1つの共受容体は、CD8アルファ又はCD8ベータの少なくとも1つであり得る。

0012

請求項72から86のいずれか一項に記載の遺伝子操作された細胞を含む細胞集団が本明細書に開示される。一部の場合には、遺伝子操作された細胞の約60%から約100%は、ポリペプチド構築物を発現することができる。遺伝子操作された細胞は、複数のαβT細胞であり得る。集団は、がんを制御、低減、又は排除するためにそれを必要とする対象に投与することができる。一部の場合には、集団がそれを必要とする対象に投与され得る場合、ウイルス感染は、制御、低減、又は排除され得る。遺伝子操作された細胞の投与は、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、腫瘍サイズを少なくとも30%低減するのに効果的であり得る。投与は、コンピュータ断層撮影(CT)スキャンにより測定された場合、腫瘍病変直径のベースライン測定値の変化が10%未満と測定されるように、腫瘍サイズを安定化させるのに効果的であり得る。一部の場合には、約5×104から約1×1012個の細胞が、それを必要とする対象に投与され得る。一部の場合には、投与は、それを必要とする対象の寿命を、未処置の対象と比較して約1週間から約50年延長することができる。一部の場合には、遺伝子操作された細胞は、抗体の結合によって阻害され得る。抗体の結合は、遺伝子操作された細胞の投与に関連する毒性を低減することができる。バリアントは、ヒト化バリアントであり得る。一部の場合には、バリアントは、scFv、又はscFabである。

0013

配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293、配列番号4、又は配列番号5のうちの少なくとも1つのポリペプチド配列をコードする配列と少なくとも90%、95%、97%又は99%同一である配列を含むポリ核酸が本明細書に開示される。

0014

配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293、配列番号4、又は配列番号5のうちの少なくとも1つと少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である受容体配列を含む遺伝子操作された細胞が本明細書に開示される。

0015

配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293、配列番号4、配列番号5及び配列番号6から配列番号428のうちの少なくとも1つと少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である配列を有する受容体の少なくとも一部を含む遺伝子操作された細胞が本明細書に開示される。一部の場合には、遺伝子操作された細胞は、遺伝子操作された細胞の集団に増殖され得る。遺伝子操作された細胞の集団は、医薬組成物に製剤化され得る。

0016

ヒト白血球抗原(HLA)分子が標的細胞上の少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化する場合、前記標的細胞上の前記HLA分子又はその部分に選択的に結合するポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、複合体化されていないHLA分子に結合しないか、又は前記HLA分子が少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化されていない場合、前記HLA分子に結合しないポリペプチドが本明細書に開示される。一部の場合には、HLA分子はHLA-A血清型又はそのバリアントであり得、好ましくは、HLA-A血清型はHLA-A*24であり得、より好ましくは、HLA-A*24はHLA-A*24:02であり得る。標的細胞はがん細胞であり得、好ましくは、がん細胞はHLA分子を異常に発現し得る。一部の場合には、ポリペプチドは、CDR3領域を含むδT細胞受容体鎖又はその部分であり得、δT細胞受容体鎖又はその部分は、アミノ酸配列である配列番号3、配列番号5のアミノ酸21〜293、配列番号5又は配列番号6から237のうちのいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含むアミノ酸配列によって表され得る。一部の場合には、ポリペプチドは、CDR3領域を含むγΤ-細胞受容体鎖又はその部分、アミノ酸配列である配列番号2、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号4又は配列番号238から428のうちのいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含むアミノ酸配列によって表されるγΤ-細胞受容体鎖又はその部分であり得る。

0017

δT細胞受容体鎖又はその部分、及びγT細胞受容体鎖又はその部分を含む、T細胞受容体(TCR)、好ましくは、遺伝子操作されたTCRが本明細書に開示される。

0018

ポリペプチド又はTCRをコードする核酸分子が本明細書に開示される。

0019

核酸分子を含む核酸構築物が本明細書に開示される。

0020

核酸構築物を含む細胞が本明細書に開示される。

0021

医薬として使用するための、ポリペプチド、TCR、核酸分子、核酸構築物、又は細胞が本明細書に開示される。

0022

がん又は感染に対する医薬として使用するための、ポリペプチド、TCR、核酸分子、核酸構築物、又は細胞が本明細書に開示される。

0023

遺伝子操作された細胞、又は細胞の投与に関連する毒性を低減する方法であって、少なくとも1つの抗体又はその部分のそれを必要とする対象への投与を含む、方法が本明細書に開示される。一部の場合には、抗体は、遮断抗体又は中和抗体であり得る。抗体又はその部分は、遺伝子操作された細胞又は細胞のHLA-A*24:02を発現する細胞への結合を阻害することができる。HLA-A*24:02を発現する細胞は、がん細胞又は同等の正常細胞のうちの少なくとも1つであり得る。少なくとも1つの抗体又はその部分の投与は、それを必要とする対象のサイトカイン放出症候群(CRS)のレベルを低減し得る。

0024

非常に安定した貯蔵寿命を有する組成物及び医薬組成物が本明細書に提供される。一部の場合には、本明細書に記載の少なくとも1つのポリペプチド又は本明細書に記載のポリペプチドを発現する細胞を含有する本明細書に記載の組成物又は医薬組成物は、25℃又は4℃で密封容器中に保存され、容器は、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%又は95%の相対湿度を有する雰囲気に置かれる。1カ月、2カ月、3カ月、6カ月、1年、1.5年、2年、2.5年又は3年後に、組成物又は医薬組成物の少なくとも50%、60%、70%、80%又は90%が、標準プロトコールによって決定された状態のままである。

0025

参照による組込み
本明細書におけるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれ個々の刊行物、特許、又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的且つ個別に示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における用語と組み込まれた参照における用語の間に矛盾がある場合には、本明細書における用語が支配する。

0026

本開示の新規特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に示される。本開示の原理を利用することができる例示的実施形態を示す以下の詳細な説明、及び以下の添付の図面を参照することにより本開示の特徴及び利点のより良い理解が得られる。

図面の簡単な説明

0027

図1Aは、本明細書に記載のγδT細胞のクローンをSW480、EBV-LCL、及びPBMCと共に共培養する場合のELISPOTアッセイの結果を示すグラフである。15,000個のγδT細胞当たりのIFNγスポットが示されている。図1Bは、SW480、EBV-LCL、及びPBMCと共に共培養した疑似形質導入された細胞及び本明細書に記載のγδTCR細胞のELISPOTアッセイの結果を示すグラフである。15,000個のγδT細胞当たりのIFNγスポットが示されている。
本明細書に記載のγδTCR細胞をLCL-TM、DAUDI、U266、OPM2、及びSW480腫瘍細胞株と共に共培養した場合のELISPOTアッセイの結果を示すグラフである。IFN-γのELIspot数が示される。
図3Aは、本明細書に記載のγδTCRをCOS7-A*02、COS7-A*24、K562-A*02、K562-A*24、K562-WTATCC、及びPBMC d206と共に共培養する場合のIFNγのELISAアッセイの結果を示すグラフである。図3Bは、Cyto Dで前処理した本明細書に記載のγδ-TCRをCOS7-A*02、COS7-A*24、K562-A*02、K562-A*24、K562-WT ATCC、及びPBMC d206と共に共培養する場合のIFNγのELISAアッセイの結果を示す。
図4Aは、本明細書に記載のγδTCRをCOS7-A*02、COS7-A*24、K562-A*02、K562-A*24、K562-WT ATCC、及びPBMC d206と共に共培養する場合のIFNγのELISAアッセイの結果を示すグラフである。図4Bは、本明細書に記載のγδTCRを固定した標的:COS7-A*02、COS7-A*24、K562-A*02、K562-A*24、K562-WT ATCC、及びPBMC d206と共に共培養する場合のIFNγのELISAアッセイの結果を示すグラフである。
HLA-A*02:01(配列番号439)とHLA-A*24:02(配列番号440)の間の配列アラインメントを示す図である。
図6Aは、HLA-A*02の構造を示す図である。HLA-A*02は灰色で示される。β2Μは黄色で示され、ペプチドは黒色で示され、遺伝子多型は赤色で示される。図6Bは、HLA-A*02の構造を示す図である。HLA-A*02 は灰色で示される。β2Μは黄色で示され、ペプチドは黒色で示され、遺伝子多型は赤色で示される。
図7Aは、HLA-A*02の構造を示す図である。図7Bは、HLA-A*02の構造を示す図である。
図8Aは、本明細書に記載のγδTCRが形質導入されたT細胞によるSW480及びLCL-TMの認識に関するFE-11様ハイブリドーマ上清による遮断効果を示すグラフである。図8Bは、αβTCR WT1が形質導入されたT細胞によるWT1ペプチドを負荷したSW480の認識に関するFE-11様ハイブリドーマ上清による遮断効果を示すグラフである。図8Cは、LABScreen Single AntigenHLAクラスIビーズをHLAに結合する抗体と共にインキュベートし、ここで、前記抗体はハイブリドーマから精製され、HLAに完全に又は部分的に、及び二次的なα-mlgG-PEに結合され、Luminexを使用して測定された。
単離したクローンが、γδTCR反応性腫瘍細胞又はDaudi陰性対照に特異的に結合する抗体を産生する例示的スクリーニング方法を示すグラフである。
図10Aは、異なるHLA遺伝子型を有するEBV-LCLにより本明細書に記載のγδTCR及び陰性対照としてDaudiが形質導入されたT細胞の活性化を示すグラフである。
図10Bは、HLA-A*24:02又はHLA-A*02:01標的細胞によりγδTCR FE11が形質導入されたT細胞の活性化を示すグラフである。図10Cは、γδTCR FE11が形質導入されたT細胞の活性化に関するHLA-A*24:02陽性標的細胞のβ2m KOの効果を示すグラフである。
図10Dは、異なる、ホモ接合性又はヘテロ接合性のいずれかの、HLA-A*24:02発現を有するEBV-LCLによりγδTCR FE11が形質導入されたT細胞の活性化を示すグラフである。図10Eは。未処理又はモネンシン終夜処理したK562 HLA-A*24:02細胞により本明細書に記載のγδTCRが形質導入されたT細胞の活性化を示すグラフである。
図10Fは、LCL-TM又はA2拘束WT1ペプチドを負荷したT2細胞により本明細書に記載のγδTCR又はαβTCR WT1(対照)が形質導入されたJurma細胞の活性化を示すグラフである。プレートに結合したα-CD3 mAbのクローンであるOKT-3によるCD3架橋陽性対照としての役割を果たす。
認識の低下が、β2-マイクログロブリン(β2m)KOの割合に匹敵することを示すグラフである。認識されたLCL内の(β2m)のCRISPR/Cas9 KOは、対照と比較してTEG011の認識を低減する。
図12Aは、悪性細胞及び健常T細胞における本明細書に記載のγδTCRが形質導入されたT細胞の活性化を示すグラフである。図12Bは、EBVにより形質転換され、本明細書に記載のγδTCR又は疑似形質導入されたT細胞と共に共培養された健常ドナーのB細胞を示すグラフである。認識は、ELISAを使用してIFNγ分泌を測定することによって評価された。
図13Aは、HLA-A*24:03陽性又は陰性標的細胞により本明細書に記載のγδTCRが形質導入されたT細胞の、インターフェロン-ガンマ発現を介した活性化を示すグラフである。図13Bは、2つの非相同性アミノ酸を赤色で示すHLA-A*24:02(配列番号441)、02:01(配列番号442)、24:03(配列番号443)、及び25:01(配列番号444)のアラインメントを示す図である。
図13Cは、HLA-A24:02(pdb:3wl9)の構造上にマッピングされたHLA-A*02:01とHLA-A24:02の間の差を示す図であり、HLA-A*24:02とHLA-A*24:03の間の2つの非相同アミノ酸を赤色の円で示す。
図13Dは、負荷していないか又はA*24拘束ウイルスペプチドNEF(134-10)若しくはCMV(pp65 341-349)を負荷した、HLA-A*24:02が形質導入されたTAP欠乏T2細胞により、本明細書に記載のγδTCRが形質導入されたT細胞の活性化を示すグラフである。図13Eは、WT1 TCR、NY-ESOl TCR及びTCRが形質導入されたT細胞に結合するWT1四量体、NY-ESOl五量体及びCMV五量体を示すグラフである。
図13Fは、γδTCRが形質導入されたT細胞の活性化に関するHLA-A*24:02が形質導入された標的細胞のボルテゾミブ処置の効果を示すグラフである。図13Gは、フローサイトメトリーFRETによってHLA-A*24:02陽性と認識された細胞及び認識されなかった細胞に関して、ホモ二量体化について評価したことを示すグラフである。
図13Hは、HLA-A*24:02が形質導入されたCOS-7及びK562又はHLA-A*02:01(対照)により本明細書に記載のγδTCR又はαβTCR WT1(対照)が形質導入されたT細胞の活性化を示すグラフである。ここで、示された標的細胞は、共にインキュベートされる前に固定された。ここで、示された標的細胞は、WT1ペプチドと共にインキュベートされた。
図14Aは、クローンFE11及びγδTCRが形質導入されたαβT細胞上のCD8α又はCD8β発現を示す図である。
図14Bは、本明細書に記載のγδTCRが形質導入されたCD4+及びCD8+αβT細胞を選別し、示された標的細胞と共に共培養したことを示すグラフである。T細胞の活性化をIFNγのELISPOTによって評価した。図14Cは、本明細書に記載のγδTCRを発現するCD4+及びCD8+αβT細胞を(A)のように、しかし、対照抗体又はCD8α若しくはCD8βに対する遮断抗体の存在下で、SW480標的細胞と共にインキュベートしたことを示すグラフである。
図14Dは、CD69上方調節によって測定したHLA-A*24:02陽性及び陰性標的細胞により本明細書に記載のγδTCRが形質導入されたJurma細胞の活性化を示すグラフである。図14Eは、HLA-A*02拘束WT1ペプチドを負荷したHLA-A*02:01陽性標的細胞によるαβTCR WT1が形質導入されたJurma細胞の活性化を示すグラフである。プレートに結合したα-CD3 mAbのクローンであるOKT-3によるCD3架橋は陽性対照(D+E)としての役割を果たす。
図14Fは、CD4+、CD8+、CD4+CD8α+及びCD4+CD8α'+T細胞集団を選別した後に、αβT細胞には、FE11 γδTCRと一緒に、野生型CD8α又は切断した、シグナル伝達欠損CD8αバリアント(CD8α')が形質導入されたことを示す図である。健常なPBMC及びSW480並びにEBV-LCL腫瘍標的の認識を、ELISPOTを使用するIFNγ分泌を測定することによって評価した。

0028

以下の説明及び実施例は、本開示の実施形態を詳細に例証する。この開示は、本明細書に記載の特定の実施形態に限定されず、それ自体変更可能であることが理解されるべきである。当業者は、本開示には、その範囲内に包含される多数の変形及び修正が存在することを認識するであろう。他に指示されなければ、任意の実施形態は、任意の他の実施形態と組み合わせることができる。

0029

すべての用語は、当業者によって理解されるように理解されることを意図する。他に定義されていなければ、本明細書で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本開示が関係する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。

0030

本明細書で使用する場合、他に指示されていなければ、本明細書における一部の発明の実施形態は、数値範囲を意図する。この発明の様々な態様は、範囲形式で表すことができる。範囲形式での記載は、単に簡便性及び簡潔性のためであり、本発明の範囲に関する変更できない限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲についての記載は、具体的に開示したすべての可能な下位範囲及びその範囲内の個々の数値をまるではっきりと書き出したかのように有するものとみなされるべきである。例えば、1から6までなどの範囲についての記載は、例えば、1から3まで、1から4まで、1から5まで、2から4まで、2から6まで、3から6までなどの具体的に開示された下位範囲、並びにその範囲内個々の数値、例えば、1、2、3、4、5、及び6を有するものとみなされるべきである。これは、範囲の広さにかかわらず適用される。範囲が存在する場合、その範囲は範囲の終点を含む。

0031

以下の定義は、当技術分野における定義を補足するものであり、本出願を対象とし、任意の関連する又は関連しない事例に、例えば、任意の共同所有の特許又は出願に帰するべきではない。本明細書に記載のものと同様の又は等しい任意の方法及び材料は、本開示について試験するための実践において使用され得るが、好ましい材料及び方法は本明細書に記載されている。したがって、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とするものであって、限定として解釈されるべきではない。

0032

定義
本明細書で使用する場合、他に指定されていなければ、詞「a」は、他に明確に提供されていなければ、1つ又は複数を意味する。

0033

本明細書で使用する場合、他に指定されていなければ、「含有する(contain)」、「含有すること(containing)」、「含む(include)」、「含むこと(including)」などの用語は「含むこと(comprising)」を意味する。

0034

用語「活性化」及びその文法同等物は、本明細書で使用する場合、それによって細胞が休止状態から活性状態遷移するプロセスを指すことができる。このプロセスは、抗原に対する応答、機能的に活性な状態への移行、及び/又は表現型若しくは遺伝子の変化を含むことができる。

0035

「抗原」は、本明細書で使用する場合、抗原結合単位によって特異的に認識され、結合される物質を意味する。抗原は、ペプチド、タンパク質糖タンパク質多糖、及び脂質、それらの部分並びにそれらの組合せを含むことができる。「抗原」は、免疫応答惹起する分子も指すことができる。この免疫応答は、抗体産生、若しくは特異的免疫担当細胞の活性化、又はその両方に関与してもよい。当業者は、実質的にすべてのタンパク質又はペプチドを含む任意の高分子が抗原としての役割を果たすことができることを理解するであろう。

0036

用語「自己の」及びその文法的同等物は、本明細書で使用する場合、同一の存在に由来することを指すことができる。例えば、試料(例えば、細胞)を除去し、処理し、後で同一の対象(例えば、患者)に戻すことができる。自己のプロセスは、ドナー及びレシピエントが異なる対象である同種間のプロセスと区別される。

0037

この明細書及び請求項で使用する場合、単語「含むこと(comprising)」(及び「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」などの含むの任意の形態)、「有すること(having)」(「有する(have)」及び「有する(has)」などの有するの任意の形態)、「含むこと(including)」(「含む(includes)」及び「含む(include)」などの含むの任意の形態)又は「含有すること(containing)」(「含有する(contains)」及び「含有する(contain)」などの含有の任意の形態)は、包括的又はオープンエンドであり、さらなる、記載されていない要素又は方法の工程を除外するものではない。この明細書において議論される任意の実施形態は、本発明の任意の方法又は組成物に関して実施することができ、逆もまた同様であることが企図される。さらに、本発明の組成物を使用して本発明の方法を達成することができる。

0038

用語「エピトープ」及びその文法的同等物は、本明細書で使用する場合、抗体、B細胞、T細胞又は本明細書に記載のポリペプチド構築物を発現する遺伝子操作された細胞によって認識することができる抗原の一部又は部分又は断片を指すことができる。例えば、エピトープは、TCR、例えば、本明細書に記載のガンマデルタTCRによって認識されるがんエピトープであり得る。抗原内の多数のエピトープを認識することもできる。エピトープには変異が入る場合もある。

0039

用語「遺伝子操作された」及びその文法的同等物は、本明細書で使用する場合、核酸、例えば、生物のゲノム内の又はポリペプチドの核酸の1つ又は複数の変更を指すことができる。用語「遺伝子操作された(engineered)」は、遺伝子又はポリペプチドの変更、付加、及び/又は欠失を指すことができる。遺伝子操作された細胞は、付加、欠失及び/又は変更した遺伝子又はポリペプチドを有する細胞を指すこともできる。

0040

用語「細胞」又は「遺伝子操作された細胞」及びそれらの文法的同等物は、本明細書で使用する場合、ヒト又は非ヒト動物起源の細胞を指すことができる。遺伝子操作された細胞は、遺伝子操作されたエフェクター細胞を指すこともできる。ある特定の場合には、遺伝子操作された細胞は、本明細書に記載のポリペプチド構築物を発現するよう遺伝子操作されたエフェクター細胞を指す。

0041

用語「医薬品適正製造基準(good manufacturing practices)」(GMP)及びその文法的同等物は、本明細書で使用する場合、FDAに従い、安全、効果的、又は純粋である製品を指すことができる。GMPはまた、「cGMP」と称される場合もあり得る。「c」は、「現行の(current)」の略語である。製品の製造には、GMP製品の規制準拠するために最新の技術及びシステムを用いることができる。GMPに適合する製品は、典型的には、研究の設定と対照的に臨床の設定で利用される。

0042

用語「トランスフェクション」は、本明細書で使用する場合、外来核酸真核細胞への導入を指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム-DNA共沈殿DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、電気穿孔微量注入リポソーム融合、リポフェクションプロトプラスト融合レトロウイルス感染、及び微粒子銃を含む当技術分野で公知の様々な手段によって達成されてよい。

0043

用語「安定なトランスフェクション」又は「安定にトランスフェクトされた」は、外来の核酸、DNA又はRNAのトランスフェクトされた細胞のゲノムへの導入及び組込みを指す。用語「安定なトランスフェクタント」は、外来DNAがゲノムDNAに安定に組み込まれた細胞を指す。

0044

核酸及び/又は核酸配列は、それらが、共通の祖先の核酸又は核酸配列に、天然に又は人工的に由来する場合、「相同」である。タンパク質(又はポリペプチド)及び/又はタンパク質(ポリペプチド)配列は、それらをコードするDNAが、共通の祖先の核酸又は核酸配列に、天然に又は人工的に由来する場合、相同である。

0045

本発明の文脈では、ポリペプチドは、アミノ酸配列によって表される。好ましいポリペプチドは、本明細書で説明される抗腫瘍応答を媒介する、δT細胞及び/若しくはγT細胞受容体鎖又はその部分である。本発明の文脈では、このようなδT細胞及び/又はγT細胞受容体鎖又はその部分をコードする核酸分子としての核酸分子は、このようなポリペプチドをコードする核酸又はヌクレオチド配列によって表される。核酸分子は、調節領域を含んでもよい。所与配列識別番号(配列番号)によって、本明細書で特定される各核酸分子又はポリペプチド又は構築物は、開示された特定の配列に限定されないことが理解されるべきである。この出願全体を通して、所与のポリペプチドをコードする特定のヌクレオチド配列の配列番号(例として、配列番号Xとする)について言及する度に、そのヌクレオチド配列は、以下に定義する相同ヌクレオチド配列によって置き換えられてもよい:i 配列番号Xと少なくとも60%の配列同一性若しくは類似性を有するヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列;ii その相補鎖が(i)の配列の核酸分子にハイブリダイズするヌクレオチド配列;(iii)その配列が、遺伝子コード退化により、(i)若しくは(ii)の核酸分子の配列と異なるヌクレオチド配列;又は、(iv)配列番号Xのヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも60%のアミノ酸同一性若しくは類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列。この出願全体を通して、特定のアミノ酸配列の配列番号(例として、配列番号Yとする)について言及する度に、そのアミノ酸配列は、配列番号Yのアミノ酸配列と少なくとも60%の配列同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドによって置き換えられてもよい。本明細書に記載の各ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列は、それぞれ、所与のヌクレオチド配列又はアミノ酸配列との同一性又は類似性の割合(少なくとも60%)により、さらに好ましい実施形態では、それぞれ、所与のヌクレオチド又はアミノ酸配列と少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又はそれより高い同一性又は類似性の同一性又は類似性を有する。好ましい実施形態では、配列同一性又は類似性は、本明細書で特定される配列の全長を比較することによって
決定される。本明細書で他に特定されていなければ、所与の配列番号に関する同一性又は類似性は、前記配列の全長(すなわち、その全体の長さ又は全体として)に基づく同一性又は類似性を意味する。

0046

相同分子は、相同体と称することができる。例えば、本明細書に記載の、任意の天然に存在するタンパク質は、任意の利用可能な突然変異誘発方法によって改変することができる。発現した場合、この突然変異誘発された核酸は、元の核酸によってコードされるタンパク質と相同であるポリペプチドをコードする。相同性は、一般的に、2つ又はそれより多い核酸又はタンパク質(又はその配列)間の配列同一性から推測される。相同性を確立するのに有用である配列間の同一性の正確な割合は、問題となっている核酸及びタンパク質に関して変化するが、相同性を確立するために、日常的に、25%程度の低い配列同一性が使用される。よりレベルの高い、例えば、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%若しくは99%又はそれより高い配列同一性を使用して相同性を確立することもできる。少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%の同一性が本明細書において包含される。

0047

「配列同一性」は、配列を比較することによって決定される、2つ若しくはそれより多いアミノ酸(ポリペプチド若しくはタンパク質)配列又は2つ若しくはそれより多い核酸(ポリヌクレオチド)配列間の関係として本明細書において定義される。2つのアミノ酸又は2つの核酸配列間の同一性は、好ましくは、本明細書で特定した配列番号全体又はその部分内のそれらの同一性を評価することによって定義される。その部分は、配列番号の長さの少なくとも50%、又は少なくとも60%、又は少なくとも70%、又は少なくとも80%、又は少なくとも90%を意味してもよい。当技術分野では、「同一性」は、場合によって、このような配列のストリング間のマッチによって決定される、アミノ酸又は核酸配列間の配列関連性の度合いも意味する。2つのアミノ酸配列間の「類似性」は、アミノ酸配列と、1つのポリペプチドの第2のポリペプチド配列に対する保存的アミノ酸置換とを比較することによって決定される。「同一性」及び「類似性」は、これらに限定されないが、(Computational Molecular Biology、Lesk, A. M.編、Oxford University Press、New York、1988年;Biocomputing: Informatics and Genome Projects、Smith, D. W.編、Academic Press、New York、1993年;Computer Analysis of Sequence Data、第I部、Griffin, A. M.、及びGriffin, H. G.編、Humana Press、New Jersey、1994年;Sequence Analysis in Molecular Biology、von Ileine, G.、Academic Press、1987年;及びSequence Analysis Primer、Gribskov, M.及びDevereux, J.編、M Stockton Press、New York、1991年;並びにCarillo, H.、及びLipman, D.、SIAM J. Applied Math.、48:1073頁(1988年))に記載のものを含む公知の方法によって容易に計算することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間に最大のマッチを与えるように設計される。同一性及び類似性を決定するための方法は、一般に利用可能なコンピュータプログラムにおいてコード化されている。2つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法として、例えば、GCG program package(Devereux, J.ら、Nucleic AcidsResearch 12 (1):387頁(1984年))、BestFit、BLASTP、BLASTN、及びFASTA(Altschul, S. F.ら、J. Mol. Biol. 215:403〜410頁(1990年))が挙げられる。BLAST Xプログラムは、NCBI及び他の供給源(BLAST Manual、Altschul, S.ら、NCBINLM NIH Bethesda、MD 20894頁;Altschul, S.ら、J. Mol. Biol. 215:403〜410頁(1990年))から一般に利用可能である。周知のSmith Watermanアルゴリズムを使用して同一性を決定してもよい。ポリペプチド配列の比較に関して好ましいパラメータとして以下が挙げられる:アルゴリズム:Needleman及びWunsch、J. Mol. Biol. 48:44〜453頁(1970年);比較マトリックス: Ilentikoff及びIlentikoffからのBLOSSUM62、Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915〜10919頁(1992年);ギャップペナルティ:12;及びギャップ長ペナルティ:4。これらのパラメータに関して有用なプログラムは、Madison, WIに位置するGenetics Computer Groupからの「Ogap」プログラムとして一般に利用可能である。前述のパラメータは、アミノ酸比較に対するデフォルトパラメータである(エンドギャップに対するペナルティなしで)。核酸比較に対する好ましいパラメータとして以下が挙げられる:アルゴリズム:Needleman及びWunsch、J. Mol. Biol. 48:443〜453頁(1970年);比較マトリックス:マッチ=+10、ミスマッチ=0;ギャップペナルティ:50;ギャップ長ペナルティ:3。Madison、Wisに位置するGenetics Computer GroupからのGapプログラムとして利用可能。核酸比較に対するデフォルトパラメータは上記に与えられている。任意選択で、アミノ酸類似性の度合いを決定する際に、当業者は、当業者にとって明らかとなるように、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮にいれてもよい。保存的アミノ酸置換は、同様の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリジンアラニンバリンロイシン、及びイソロイシンであり;脂肪族-ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンであり;アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり;芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニンチロシン、及びトリプトファンであり;塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジンアルギニン、及びヒスチジンであり;並びに硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存アミノ酸置換群は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、及びアスパラギン-グルタミンである。本明細書に開示されるアミノ酸配列の置換バリアントは、開示された配列の少なくとも1つの残基が除去され、異なる残基がその場所に挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸変化は保存的である。天然に存在するアミノ酸のそれぞれに対する好ましい保存的置換は、以下の通りである:AlaからSer;ArgからLys;AsnからGin又はHis;AspからGlu;CysからSer又はAla;GinからAsn;GluからAsp;GlyからPro;HisからAsn又はGin;IleからLeu又はVal;LeuからIle又はVal;LysからArg、Gin又はGlu;MetからLeu又はIle;PheからMet、Leu又はTyr;SerからThr;ThrからSer;TrpからTyr;TyrからTrp又はPhe;及びValからIle又はLeu。

0048

本明細書で使用する場合、用語「をコードする核酸分子」、「をコードするDNA配列」、及び「をコードするDNA」は、デオキシリボ核酸ストランドに沿ったデオキシリボヌクレオチド順序又は配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序により、ポリペプチド(タンパク質)鎖に沿ったアミノ酸の順序が決定される。したがって、核酸配列は、アミノ酸配列をコードする。

0049

用語「対象」は、本明細書で使用する場合、任意の動物、例えば、哺乳動物又は有袋類を指す。本発明の対象として、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類(例えば、アカゲザル又は他のタイプのマカク)、マウスブタウマロバウシヒツジラット及び任意の種類の家禽が挙げられる。

0050

用語「レシピエント」及びそれらの文法的同等物は、本明細書で使用する場合、治療又は処置を受けるヒト又は非ヒト動物を指すことができる。

0051

用語「末梢血リンパ球」(PBL)及びその文法的同等物は、本明細書で使用する場合、血中(例えば、末梢血中)を循環するリンパ球を指すことができる。末梢血リンパ球は、器官に位置していないリンパ球を指すことができる。末梢血リンパ球は、T細胞、NK細胞、B細胞、又はこれらの任意の組合せを含むことができる。

0052

用語「免疫応答細胞」は、これらに限定されないが、T細胞、B細胞、及びNK細胞、それらのそれぞれの前駆細胞並びにその後代を含む、免疫応答を誘発することができる細胞を指すことができる。免疫応答細胞は、リンパ系統又は骨髄系統の細胞を指すこともできる。

0053

用語「T細胞」及びその文法的同等物は、本明細書で使用する場合、任意の器官に由来するT細胞を指すことができる。例えば、T細胞は、初代T細胞、例えば、自己T細胞、細胞株などであり得る。T細胞は、ヒト又は非ヒトのものでもあり得る。

0054

用語「T細胞活性化」又は「T細胞誘発」及びその文法的同等物は、本明細書で使用する場合、十分に刺激され、検出可能な細胞増殖サイトカイン産生及び/又は検出可能なエフェクター機能誘導したT細胞の状態を指すことができる。一部の場合には、「十分なT細胞活性化」は、T細胞の細胞傷害性を誘発することに類似し得る。T細胞活性化は、当技術分野で公知の種々のアッセイを使用して測定することができる。前記アッセイは、サイトカイン分泌を測定するためのELISA、ELISPOT、細胞内サイトカイン発現(CD107)を測定するためのフローサイトメトリーアッセイ、増殖を測定するためのフローサイトメトリーアッセイ、標的細胞除去を決定するための細胞傷害性アッセイ(51Cr放出アッセイ)であり得る。

0055

用語「配列」及びその文法的同等物は、使用する場合、DNA又はRNAを包含することができ、一本鎖又は二本鎖のいずれかであり得るヌクレオチド配列(配列表の配列番号)を指す。核酸配列には、変異が入ることがある。核酸配列は、任意の長さ、例えば、2から1,000,000の間又はそれより多いヌクレオチド長(又はそれらの間若しくはそれらを超えるの任意の整数)、例えば、約100から約10,000ヌクレオチドの間又は約200から約500ヌクレオチドの間であり得る。

0056

本明細書で定義するように、ポリペプチド構築物は、好ましくは、標準の分子生物学技術によって構築され、天然に存在しない遺伝子操作されたポリペプチド又は組換えポリペプチドである。表現「ポリペプチド構築物」は、単語ポリペプチドで置き換えられてもよい。

0057

単語「約」は、整数に付随して使用される場合(約10)、好ましくは、その値が、その値より1多いか又は少ない所与の値10であってよく、約10は、好ましくは、9から11を意味する。単語「約」は、数値に付随して使用される場合(約10.6)、好ましくは、値10.6より1%多いか又は少ない所与の値10.6であってよい。

0058

本発明の文脈では、病的な、がんの、異常な、悪性の又は感染した細胞と比較して、健常な、正常な、又は非がん性の若しくは非感染の細胞について述べられている。健常な、正常な、非がん性の又は非感染のという用語のそれぞれは同義であり、互換的に使用されてよい。病的な、異常なという用語のそれぞれは同義であり、がんの、悪性の又は感染したと互換的であり得る。

0059

本発明の文脈では、核酸の又は核酸配列の又はポリペプチドの又はポリペプチド配列の又はエピトープの又はエピトープ配列の一部又は断片又は部分は、その配列の長さの少なくとも50%、又は少なくとも60%、又は少なくとも70%、又は少なくとも80%、又は少なくとも90%を意味する。

0060

用語「ベクター」及びその文法的同等物は、単離した核酸を含み、使用して単離した核酸を細胞の内部に送達することができる物質の組成物を指すことができる。これらに限定されないが、直鎖状ポリヌクレオチドイオン性又は両親媒性化合物と関連するポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含む多数のベクターが当技術分野で公知である。したがって、用語「ベクター」は、自律複製プラスミド又はウイルスを含む。この用語は、核酸の細胞内への移行を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどを含むものとも解釈されるべきである。ウイルスベクターの例として、これらに限定されないが、アデノウイルスベクターアデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられる。

0061

標的組成物及びその使用方法
ヒト白血球抗原(HLA)受容体が細胞表面上で検出される場合、抗腫瘍応答を媒介するHLA特異的受容体の組成物が本明細書に開示される。ある特定の実施形態では、1つ又は複数のHLA特異的受容体を包含するポリペプチド構築物、例えば、抗腫瘍応答を媒介することができるγδTCR断片又はそのバリアントを含む組成物である。本明細書に記載のポリペプチドを利用して、立体構造的制約されたHLA分子に選択的に結合することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、非がん細胞上の対応するHLA分子と比較して、がん細胞で発現されるHLA分子に選択的に結合することができる。本明細書に記載のポリペプチド構築物は、表2、表4及び表5のいずれか1つに開示された配列又はその部分を含む少なくとも1つの受容体を含むことができる。一部の場合には、1つ又は複数のHLA特異的受容体を包含することができるポリペプチド構築物、例えば、抗腫瘍応答を媒介することができるγδTCR断片又はそのバリアントを含む組成物を本明細書で提供することができる。本明細書に開示されるポリペプチドを利用して、立体構造的に制約されたHLA分子に選択的に結合することができる。例えば、本明細書に開示されるポリペプチド構築物は、前記HLA分子が、標的細胞上の少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化することができる場合、標的細胞上のHLA分子又はその部分に選択的に結合することができる。一部の場合には、ポリペプチド構築物は、複合体化されていないHLA分子に結合しない。一部の実施形態では、複合体化されていないHLA分子は、少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化されていないHLA分子である。ポリペプチド構築物は、遺伝子操作された細胞で発現され、合成され得る。

0062

一部の場合には、本明細書に記載のHLA受容体を含むポリペプチド構築物を発現する遺伝子操作された細胞を作製する方法である。例えば、方法は、細胞を用意する工程、γδTCR鎖又はその断片若しくはバリアントをコードする核酸配列を用意する工程、核酸配列を細胞内に導入し、HLAへの特異性を示すγδTCR受容体、その断片若しくはバリアントを有する遺伝子操作された細胞を提供する工程を含むことができる。

0063

一部の実施形態では、HLA分子が標的細胞上の少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化する場合、標的細胞上の前記HLA分子又はその部分に選択的に結合するポリペプチド構築物である。一部の場合には、ポリペプチド構築物は、少なくとも1つのさらなるHLA分子と複合体化されていないHLA分子(本明細書において、ある特定の実施形態では、複合体化されていないHLA分子とも称される)に結合しない。一部の場合には、ポリペプチド構築物は、遺伝子操作された細胞で発現され、合成され得る。

0064

本明細書に記載のポリペプチド構築物によって含まれる種々の形態の結合単位が本明細書に開示され得る。例えば、本明細書に記載のポリペプチド構築物によって構成される結合単位は、例えば、表2、表4及び表5のうちの少なくとも1つに開示される配列を含むγδTCRであり得る。γδTCRは、主要組織適合複合体分子(MHC)に結合したペプチド抗原を認識するαβTCRとは異なり、インタクトなタンパク質又は非ペプチド化合物の形態の抗原を直接認識することができる。ガンマ-デルタT細胞(γδT細胞)は、一部の場合には、1つのγ鎖及び1つのδ鎖からなる特有のT細胞受容体(TCR)を発現することができる。各T細胞受容体は、1つのアルファ及び1つのベータ鎖又は1つのデルタ及び1つのガンマ鎖からなる二量体であり得る。単一の細胞では、T細胞受容体の位置は、デルタ、ガンマ、ベータ、及びアルファの順で再配列され、発現される。ガンマの位置には、V(可変)、J(接合)、及びC(定常)セグメントが含まれる。

0065

例えば、一部の場合には、γδT細胞のクローンは、HLA-DR7、HLA-A2、HLA-A*24を含むクラスI又はクラスIIのMHCを認識することができる(Spitsら、1990年、Cytotoxic activity and lymphokine production of T cell receptor (TCR)-αβ+ and TCR-γδ+ cytotoxic T lymphocyte (CTL) clones recognizing HLA-A2 and HLA-A2 mutants、The Journal of Immunology 144:4156〜4162頁、及びCiccone ら、1989年、Specificity of human T lymphocytes expressing a γ/δ T cell antigen receptor. European Journal of Immunology 19: 1267〜1271頁)。しかし、前述の言及に対する直接的対比では、本明細書に記載のγδT細胞組成物は、悪性細胞及び健常でないカウンターパート細胞によって発現されたHLA-A*24:02を認識し、その認識は、細胞の固定化によって阻害される場合があり、このことは、認識プロセスの間の空間的及び立体構造的変化について示唆することができ、これは、αβT細胞の古典的なアロ反応性又はペプチド反応性とも異なる。

0066

本明細書に記載の実施形態では、ポリペプチド構築物は、がんを標的とすることができるγδTCRを含む。γδTCRにより遺伝子操作されたT細胞を含む、遺伝子操作されたT細胞で標的とされ得る種々のがんの例として、これらに限定されないが、肝臓がん胃がん食道がん肺がん乳がん頭頚部がん、卵巣がん腎臓がん、膀胱がん子宮頸がん膵臓がん脂肪肉腫精巣セミノーマ胚細胞がん(testicular noneminomatous germ cell cancer)、黒色腫腺腫副腎がん、シュワン腫、悪性腫瘍線維性組織球腫(fibrous histiochytoma)、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。さらに、本明細書に開示されるγδTCR発現T細胞などの、本明細書に開示される免疫応答細胞を利用して、卵巣癌胆管細胞癌中皮腫、乳がん、扁平上皮癌子宮頸部上皮内腫瘍、子宮頸部の扁平上皮癌、肝内及び肝外がん、胆嚢癌浸潤性乳管癌、明細胞癌、膨大細胞種、乳頭癌腺癌、乳頭癌、並びに乳房小葉癌及び髄様癌を標的とすることができる。

0067

一部の場合には、γδTCRは、HLAの処理及び提示を必要とすることなく、腫瘍上に発現した抗原又はその部分、例えば、HLA-A*24:02を標的とすることができる。本明細書に記載のγδTCRは、生殖系列コード化受容体レパートリーに結合することができる。例えば、γδTCRは、一部の微生物、例えば、ウイルスによって分泌され得るか又は腫瘍細胞で過剰産生され得る、ストレス誘導性自己抗原、脂質、又はピロリン酸を認識し、結合することができる。γδTCRは、さらに、細胞の表面に発現したタンパク質又はその部分に結合することができる。一部の場合には、γδTCRは、DNA損傷経路により発現され得るタンパク質又はその部分に結合することもできる。一部の場合には、本明細書に記載のγδTCRは、がん細胞上に発現した脂質又はその部分に結合することもできる。

0068

一部の場合には、HLA-A*24:02は、がんで過剰発現する場合があり、正常組織では低減しているか又は発現していない。一部の場合には、がんの特異的抗原及びそのエピトープは、γδTCR又は内因性若しくは外因性のαβTCRにより標的化され得る。抗原は、幅広い種類の腫瘍抗原、例えば、変異により生じる腫瘍由来の腫瘍抗原、共通腫瘍特異的抗原分化抗原、及び腫瘍で過剰発現した抗原に由来してもよい。

0069

一部の場合には、ペプチドは、健常な、ストレスを受けていないか、又は形質転換されていない細胞と異なる可能性のある、HLA、例えば、HLA-A*24:02における空間の及び/又は立体構造の変化(標的-立体構造、短い:T立体構造)と組み合わせた任意の自己ペプチドであり得る。一部の場合には、がん細胞は、K-立体構造において、HLA-Aタンパク質を異常に発現する場合がある。一部の場合には、HLA-Aの複合体化は、腫瘍細胞表面上でのHLA分子のクラスター形成を含むことができる。一部の場合には、複合体化は、K-立体構造を含む。K-立体構造は、同等の正常細胞、例えば、非腫瘍性の同等の細胞と比較した場合、腫瘍細胞上でHLA分子の差次的な特有の分布又は差次的なクラスター形成のうちの少なくとも1つを含むことができる。

0070

一部の場合には、所望の抗原と免疫反応性であり得る抗原結合単位を特定する方法を本明細書で提供することができる。このような方法は、以下の工程に関与することができる:(a)抗原結合単位の遺伝学的に多様なライブラリーを調製する工程であって、ライブラリーが少なくとも1つの対象抗原結合単位を含むことができる工程;(b)抗原結合単位のライブラリーを所望の抗原と接触させる工程;(c)抗原結合単位と抗原の間の特異的結合を検出し、それによって、所望の抗原と免疫反応性であり得る抗原結合単位を特定する工程。

0071

抗原又はT-立体構造の組織発現(両方が標的又は「その標的」であり得る)を、免疫組織化学(IHC)分析及び/又はフローサイトメトリー分析によって測定してもよい。組織発現は、定量的PCR(qPCR)によるコピー数に関して測定することもできる。一部の場合には、標的抗原は、がんの細胞表面上で発現される場合がある。γδTCRは、非MHC拘束方式で細胞表面の抗原を標的としてもよい。過剰発現は、IHC、qPCR、又はフローサイトメトリーによって測定した場合、正常組織上の発現に対して、1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、若しくは最大100倍であり得るか又は約1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、若しくは最大100倍であり得る。

0072

所望の抗原又は標的に特異的に結合する抗原結合単位の能力は、当技術分野で十分に確立された様々な手順によって試験することができる。Harlow及びLane (1988年) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory New York;Gherardiら(1990年) J. Immunol. Meth. 126:61〜68頁を参照のこと。典型的には、所望の結合特異性を示す抗原結合単位は、免疫アッセイ、例えば、標識した抗原結合単位を固体支持体又は基質上に固定化した抗原と反応させることによって、直接検出され得る。一般的に、抗原が付着できる基質は、免疫アッセイの間に低レベル非特異的結合を示す材料を用いて製作され得る。例の固体支持体は、以下のタイプの材料のうちの1つ又は複数から作製することができる:プラスチックポリマーガラスセルロースニトロセルロース、半電導性材料、及び金属。一部の例では、基質は、ペトリ皿クロマトグラフィービーズ、磁気ビーズなどであり得る。

0073

このような固相アッセイでは、未反応の抗原結合単位を洗浄することによって除去することができる。しかし、液相アッセイでは、未反応の抗原結合単位は、一部の他の分離技術、例えば、濾過又はクロマトグラフィーによって除去することができる。抗原を標識した抗原結合単位に結合させた後、結合した標識の量を決定することができる。この技術の変形は、抗原が元の結合分子による飽和まで結合され得る競合アッセイであり得る。対象の抗原結合単位の集団を複合体に導入することができる場合、より高い結合親和性を示すものだけが競合することができ、したがって、抗原に結合したままである。

0074

或いは、所与の抗原又は所与の標的に対する特異的結合は、選別される細胞上に所望の抗原を提示し、次いで、標的細胞を検出可能な薬剤カップリングされ得る抗原結合単位で標識し、その後、細胞選別機において、標識された細胞を未標識細胞から分離することに関与する細胞選別によって評価することができる。高性能細胞分離方法は、蛍光標識細胞分取(FACS)であり得る。

0075

溶出した抗原又は標的結合単位の次の分析は、アミノ酸配列の軽鎖及び重鎖描写するためのタンパク質シークエンシングに関与してもよい。次いで、推測したアミノ酸配列に基づき、抗体ポリペプチドをコードするcDNAを、PCR、ライブラリースクリーニング、既存の核酸データベースにおける相同性検索、又はこれらの任意の組合せを含む組換えクローニング方法によって得ることができる。通常用いられるデータベースとして、これらに限定されないが、GenBankEMBLDDBJ、PDB、SWISS-PROT、EST、STS、GSS、及びHTGSが挙げられる。

0076

遺伝子コードの退化により、ポリペプチド構築物をコードする配列のヌクレオチド、並びに本明細書に開示されるポリヌクレオチド及びベクターの構築に適する配列にかなりの変異が存在し得る。配列バリアントは、修飾DNA又はアミノ酸配列、1つ若しくは複数の置換、欠失、又は付加を有する場合があり、その正味の効果は、所望の結合活性を保持することであり得る。例えば、コードされたアミノ酸を変化させないか又は保存的変化を生じるかのいずれかの種々の置換が、コード領域においてなされ得る。これらの置換が、本発明において包含され得る。保存的アミノ酸置換として、以下の群内の置換を挙げることができる:グリシン、アラニン;バリン、イソロイシン、ロイシン;アスパラギン酸グルタミン酸;アスパラギン、グルタミン;セリン、トレオニン;リジン、アルギニン;及びフェニルアラニン、チロシン。保存的置換は、産生されるポリペプチドに含有される1つ又は複数のアミノ酸残基を有効に変化させない場合があるが、置換によって、産生される得られる抗原結合単位の抗原結合活性は妨げられない場合がある。コードされるアミノ酸残基を変化させない可能性のあるヌクレオチドの置換は、異なる系の遺伝子発現を最適化するのに有用であり得る。適切な置換は当業者に公知であり、例えば、発現系における好ましいコドンの使用を反映するためになされる。一部の場合には、結合単位に対する修飾が、標的の結合活性を変化させるためになされる場合がある。

0077

一部の場合には、ポリペプチド構築物における所望の結合単位は、アルファベータTCR(αβ-TCR)であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物によって構成されるT細胞受容体(TCR)は、T細胞の表面上で対合してヘテロ二量体受容体を形成する多数の鎖(αβ又はγδ)からなる。

0078

αβTCRは、体内のほとんどのT細胞上で発現することができ、特異的MHC拘束抗原の認識に関与することが知られ得る。各α及びβ鎖は、2つのドメインからなる:タンパク質を細胞膜に固定し、CD3シグナル伝達装置インバリアントサブユニットと関連する定常ドメイン(C);及び相補性決定領域(CDR)と称される6つのループを介して抗原認識を付与する可変ドメイン(V)。Vドメインのそれぞれは、超可変領域としてのCDR3と共に、3つのCDR、例えば、CDR1、CDR2及びCDR3を含む。これらのCDRは、主要組織適合複合体(pepMHC)(例えば、HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DPA1、HLA-DPB 1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA、又はHLA-DRB1複合体)によってコードされるタンパク質に結合される抗原ペプチド間に形成される複合体と相互作用する。一部の場合には、定常ドメインは、定常ドメインを可変ドメインに接続する接合領域をさらに含む。一部の場合には、ベータ鎖は、接合領域の部分を構成する短い多様性領域をさらに含む。

0079

一部の場合には、γδT細胞は、αβT細胞のリガンドと異なる可能性のあるリガンドに結合することができる。例えば、γδT細胞認識は、一部の場合には、抗原処理を利用せず、一部の場合には、γδT細胞はタンパク質を直接認識することができる(Chienら、1996年、Recognition by γ/δ T cells, Annual Review of Immunology 14: 511〜532頁)。αβTCRと対照的に、γδTCRは、1つのγ鎖と1つのδ鎖からなる。αβT細胞より体内にはるかに少ない量しか存在しないが、γδT細胞は、広範に発現した腫瘍関連分子の認識に関する有効な抗腫瘍エフェクター機能と結びつき、したがって、がん免疫療法の臨床応用に対する強力な候補物質である。γδT細胞の大多数は、MHC非依存的様式で活性化され、抗原処理を必要とせず、MHC拘束αβT細胞と対照的である。代わりに、γδT細胞は、抗原提示細胞との細胞間接触に依拠し、インタクトなタンパク質又は非ペプチド化合物の形態で抗原を直接認識する。標的細胞上でのTCR媒介抗原認識によるγδT細胞の活性化により、サイトカイン及びケモカインの産生並びに標的細胞(例えば、腫瘍細胞)の細胞溶解を導くことができる。

0080

一部の場合には、HLA-A*02とHLA-A*24の間の差は、ペプチド結合クレフト、α1及びα2ヘリックス、又はこれらの組合せに存在し得る。一部の場合には、変化する可能性のある残基は、HLA-A*02構造におけるW107、A185、S207、又はこれらの組合せであり得る。他の場合には、HLA-A*24タンパク質は、これらの位置で、それぞれ、G、P及びGの置換基を有してもよい。遺伝子多型は、HLA-A*24タンパク質全体にわたって存在することができる。例えば、遺伝子多型は、C末端N末端、又はこれらの組合せ上に存在することができる。

0081

一部の場合には、遺伝子多型は、HLA-Aタンパク質においてプロットすることができる。例えば、HLA- A*02は、アルファ3ドメイン上に遺伝子多型を有することができる。一部の場合には、遺伝子多型は、結合に関する効果を有することができる。一部の場合には、HLA-Aタンパク質、例えば、HLA-A*24上の遺伝子多型は、CD4対CD8結合部位における結合に差を生じる場合がある。

0082

ヒト末梢血中の主要なγδT細胞サブセットであるVγ9Vδ2 T細胞は、Vγ9及びVδ2鎖からなるγδTCRを発現することができ、イソペンテニルピロリン酸(IPP)などの哺乳動物のメバロン酸経路又は微生物の2-C-メチル-D-エリスリトール4-ホスフェート(MEP)経路の中間体によって特異的に活性化される。細胞内ホスホ抗原(pAg)レベルは、メバロン酸経路の調節不全により、又は微生物感染に際して腫瘍細胞中に蓄積し、形質転換細胞又は感染細胞のVγ9Vδ2細胞による標的化を可能とする。同様に、細胞内pAgレベルは、アミノビスホスホネート(ABP)などのメバロン酸経路阻害剤で細胞を処理することによって薬学的に増加する可能性があり、それによって、Vγ9Vδ2 T細胞による認識に対して細胞を感作させることができる。一部の場合には、Vγ5Vδ1 TCRを本発明で提供される組成物中で利用することができる。

0083

任意のYγ Vδ TCR、好ましくはYγ5Vδ1 TCR又は他のVδ2neg γδ TCRを単離し、T細胞、好ましくはαβT細胞中に導入することができる。一部の場合には、αβT細胞の内因性TCRが存在したままである。他の場合には、内因性αβTCRは、Vγ5Vδ1 TCR又は他のVδ2neg γδTCRの導入前、導入と同時に、又は導入後にゲノムが破壊される。

0084

成体の末梢血では、γδT細胞サブセットは、Vδ2及びVγ9遺伝子セグメントを含むTCRを発現することができ、Vδ2pos γδΤ細胞と称することができる。対照的に、上皮組織に存在するγδT細胞は、多様なVγ鎖と対合するVδ1又はVδ3鎖から主になるTCRを発現し、これらのγδT細胞の比率により、Vδ2neg γδΤ細胞と称することができるCD8αα又はCD8αβが発現される。CD8αα又はCD8αβは、白血病反応性Vδ1 TCRに対する同時刺激の役割を果たすことができることが実証された(Scheperら、2013年、γδ T cells elicited by CMV reactivation after allo-SCTcross-recognize CMV and leukemia、Leukemia 27:1328〜1338頁)。一部の場合には、Vδ2neg γδΤ細胞は、CMV感染及び白血病に取り組むためのツールとして使用されてもよい。他の場合には、CD8αα、CD8αβ、又は他の分子は、がん細胞によって発現されるHLA-A*24に対して反応性であるγδT細胞に対する同時刺激の役割を果たすことができる。

0085

一部の場合には、共受容体は、本明細書に記載のポリペプチド構築物のHLA相互作用に関与してもよい。例えば、共受容体は、HLAの文脈では又はHLAとは無関係に、TCRペプチド結合に動員されるか又は関与してもよい。種々の共受容体が関与してもよい。例えば、CD8、CD4、CD28、CCR、及びCXCR4のうちの少なくとも1つが関与してもよい。CD受容体は、TCR-HLA相互作用に対する共受容体であってもよい。例えば、CD4は、HLA-クラスIIに結合することができる場合、TCRに対する共受容体として作用する。CD8は、HLA-クラスIに結合することができる場合、TCRに対する共受容体として作用する。CD4受容体は、特に、「ボールオンスティック」モデルに従ってHLAクラスIIと相互作用することができ、ここで、Phe-43ボールは、保存された疎水性α2及びβ2ドメイン残基にフィットする。クラスIIとの結合の間、CD4は独立した構造を維持し、TCR受容体といずれの結合も形成しない可能性がある。一部の場合には、共受容体は、CD8、例えば、CD8アルファであり得る。

0086

一部の場合には、可溶性結合単位は、本明細書に記載のポリペプチド構築物の部分として生成され、含まれ得る。TCRリガンド相互作用の親和性は、抗体と比較して比較的低い可能性がある。この差に関する理由の1つは、結合活性であり得る。例えば、抗体は、結合の促進を導く、1つの分子上の2つのリガンド結合部位を有することができる。抗体は、一部の場合には、1から10個のリガンド結合部位を有することができる。例えば、いくつかのTCR抗体キメラを、所望のキメラに到達する前に生成し、試験することができる。例えば、γδ可変ドメインを抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインに置き換えることができる。結合の促進に加え、抗体のFcドメインは、Fcγ受容体陽性免疫細胞及び/又は補体系を介して細胞傷害性を媒介することができる。一部の場合には、TCR抗体のキメラは、HEK293細胞を使用して生成され、次に、プロテインA親和性クロマトグラフィーと、その後のサイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製することができる。キメラの適切なフォールディングは、γ及びδ可変ドメインを標的とすることができる立体構造特異的抗体を使用して探索することができる。キメラは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)及び補体依存性細胞傷害(CDC)アッセイで使用して、HLA-A*24:02腫瘍細胞に対する機能効率を決定することができる。in vitroアッセイを実施した後、TCR抗体のキメラの機能効率をin vitro及び/又はin vivoで試験することができる。

0087

一部の場合には、ポリペプチド構築物の可溶性形態は、複合体化されたHLA-A*24又はその部分を認識することができる。ポリペプチド構築物は、結合実体に対する種々の形態、例えば、TCR、抗体、scFv、BCR、又はこれらの任意の組合せを含むことができる。一部の場合には、TCRの少なくとも一部、例えば、Vγ9Vδ2又はVγ5Vδ1は、生成されて、医薬組成物において利用することができる。Vγ9Vδ2又はVγ5Vδ1の可溶性形態は、複合体化されたHLA-Aを認識し、結合することができる。一部の場合には、Vγ9Vδ2又はVγ5Vδ1の可溶性形態は、腫瘍細胞上の複合体化されたHLA-A*24を認識し、結合することができる。一部の場合には、Vγ9Vδ2又はVγ5Vδ1の可溶性形態は、複合体化されたHLA-A*24:02を認識し、結合することができる。ポリペプチドの可溶性形態は、同等の健常細胞上で異常に発現していないHLA-A*24と比較して、異常な構造、異常な可動性、異常なフレキシビリティー、又は異常な区画化のうちの少なくとも1つを含む可能性のあるHLA-A*24の異常発現を認識し、結合することもできる。一部の場合には、複合体化は、HLA分子のクラスター形成を含むことができる。一部の場合には、複合体化は、K-立体構造を含む。K-立体構造は、同等の正常細胞と比較して、前記HLA分子の差次的な特有の分布又は差次的なクラスター形成のうちの少なくとも1つを含むことができる。一部の場合には、本明細書に開示される組成物は、K-立体構造におけるHLA-A*24:02を標的とし、結合することができる。

0088

ヒト白血球抗原(HLA)
HLA-Aは、HLAクラスI重鎖パラログに属する。このクラスI分子は、重鎖及び軽鎖を含むヘテロ二量体であり得る(ベータ-2ミクログロブリン)。重鎖は、膜内に固定することができる。クラスI分子は、小胞体内腔に由来するペプチドを提示することによって免疫系で役割を果たすことができる。これらは、ほぼすべての細胞内で発現され得る。重鎖は、およそ45kDaであり得、その遺伝子は、8個のエクソンを含有することができる。エクソン1はリーダーペプチドをコードすることができ、エクソン2及び3は、両方ともペプチドに結合することができるアルファ1及びアルファ2ドメインをコードすることができ、エクソン4はアルファ3ドメインをコードすることができ、エクソン5は膜貫通領域をコードすることができ、エクソン6及び7は細胞質尾部をコードすることができる。エクソン2及びエクソン3内の遺伝子多型は、各クラス1の分子のペプチド結合特異性の要因となり得る。数百ものHLA-A対立遺伝子が記載されてきた。例えば、細胞に導入することができる予め規定された特異性を有するγδTCR又はその断片又はそのバリアントを含むポリペプチド構築物が本明細書で提供される。ある特定の場合には、γδTCRは、表1のHLA-A若しくはその残基及び/又はその遺伝子多型の1つ若しくは複数に対して特異的であり得る。好ましくは、γδTCRは、配列番号1の少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%の同一性に対して特異的であり、結合することができる。

0089

0090

HLA-A*24:02に結合することができるγδTCR又はその断片若しくはバリアントを含むポリペプチド構築物が本明細書で提供される。一部の場合には、本明細書に記載のγδTCR又はその断片若しくはバリアントは、遺伝子操作されたαβT細胞において発現することができる。一部の場合には、HLAに拘束される、γδTCR又はその断片若しくはバリアントを含むポリペプチド構築物は、がんで発現されたHLAにのみ結合し、健常組織で発現されたHLAには結合しない場合がある。HLA-Aを発現する健常又は正常組織は、副腎、虫垂、骨髄、脳、結腸十二指腸子宮内膜食道脂肪胆嚢心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ節卵巣膵臓胎盤前立腺唾液腺、皮膚、小腸脾臓、精巣、甲状腺膀胱、又はこれらの任意の組合せであり得る。一部の場合には、HLA-Aタンパク質は、健常組織でのその発現に対して、がんで差次的に発現され得る。一部の場合には、がんでのHLA-A発現は、HLA-Aの異常発現であり得る。異常発現として、同等の細胞上で発現されたHLAと比較して、可動性、フレキシビリティー、フォールディング、及び/又は区画化に関しての異常を挙げることができる。例えば、がん細胞は、非がん性の同等の細胞と比較して、HLA-Aの異常発現を有する場合がある。異常発現には、TCRの結合に影響を及ぼす可能性のあるがん細胞表面上でのHLA-Aの可動性の差が含まれ得る。同様に、異常発現は、がん細胞上のHLAタンパク質、例えば、HLA-Aのフレキシビリティーに影響を及ぼし得る。標的細胞上のHLA-Aの異常発現により、同等の細胞上には存在しない可能性のある特有の結合部位又は特有の結合立体構造が作成され得る。本明細書に開示される組成物は、異常なHLA-A発現を利用するために遺伝子操作されたポリペプチド構築物、又はこのようなポリペプチド構築物を発現する遺伝子操作された細胞を含み、非特異的結合を低減する腫瘍標的療法を提供することができる。

0091

一部の場合には、本明細書に開示されるポリペプチド構築物は、腫瘍では発現されるが健常組織では発現されないHLA-A及び/又はその遺伝子多型の1つ若しくは複数に対して特異的であり得るγδTCR又はその断片若しくはバリアントを含むことができる。一部の場合には、本明細書に開示されるポリペプチド構築物は、腫瘍では発現されるが健常組織では発現されないHLA-A*24:2及びその対立遺伝子に対して特異的であり得るγδTCR又はその断片若しくはバリアントを含むことができる。一部の場合には、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、腫瘍では発現されるが健常組織では発現されない1つ又は複数のHLA-A形状に対して特異的であり得る。一部の場合には、ポリペプチド構築物は、腫瘍では発現されるが健常組織では発現されないHLA-A*24:02に対して特異的であってもよい。ポリペプチド構築物は、悪性に形質転換した細胞を認識し、結合することができる。一部の場合には、悪性に形質転換した細胞は、HLA-A*24:02陽性であり得る。一部の場合には、γδTCRは、HLA-A*24タンパク質のCD8結合部位に結合する。一部の場合には、結合することができる残基は、W107、A185、S207、及びこれらの任意の組合せであり得る。一部の場合には、結合することができる残基は、G、P及びG、並びにこれらの任意の組合せであり得る。一部の場合には、HLA-A*24タンパク質のC末端残基に結合することができる。他の場合には、HLA-A*24タンパク質のN末端残基に結合することができる。一部の場合には、γδTCRは、HLA-A*24タンパク質のペプチド結合クレフトに結合することができる。一部の場合には、γδTCRは、ペプチド結合クレフトの「A」ポケットに結合することができる。

0092

本明細書に記載のポリペプチド構築物は、表2、表4、表5、及び表6のいずれか1つに開示された配列又はその一部を含むか又はそれからなる、又はそれに由来する少なくとも1つの受容体鎖を含むことができる。少なくとも1つのCDRを含む抗原結合単位、例えば、γδTCR又はその部分が本明細書に開示される。一部の態様では、抗原結合単位は、軽鎖CDRを含むことができる。軽鎖CDRは、抗原結合単位の軽鎖の相補性決定領域であり得る。軽鎖CDRは、非相補性決定領域、例えば、フレームワーク領域によって分離され、任意選択でそれらに隣接するアミノ酸残基の連続配列、又はアミノ酸残基の2つ若しくはそれより多い隣接配列を含むことができる。一部の例では、軽鎖CDRは、軽鎖CDR-1、CDR-2などと称することができる、2つ又はそれより多い軽鎖CDRを含む。一部の態様では、抗原結合単位は、重鎖CDRを含むことができる。重鎖CDRは、抗原結合単位の重鎖の相補性決定領域であり得る。重鎖CDRは、非相補性決定領域、例えば、フレームワーク領域によって分離され、任意選択でそれらに隣接するアミノ酸残基の連続配列、又はアミノ酸残基の2つ若しくはそれより多い隣接配列を含むことができる。一部の例では、重鎖CDRは、重鎖CDR-1、CDR-2などと称することができる、2つ又はそれより多い重鎖CDRを含む。一部の場合には、CDR3配列を利用してもよい。標的に結合することができるCDR配列、例えば、CDR3配列を生成する方法も本明細書に開示される。例えば、FE11様CDR3配列を生成することができる。FE11又はFE11様CDR3配列は、HLA-A*24に結合することができる抗体又はその結合部分であり得る。FE11様CDR3配列は、FE11ポリペプチド又はFE11をコードする核酸分子との相同性の少なくとも一部を共有する抗体又はその結合部分であり得る。一部の場合には、FE11様CDR3配列は、立体構造、結合、アミノ酸配列の差、すなわち、配列の一部の差を有する場合がある。基準FE11の活性は、前記FE11又はFE11様CDR3配列において少なくともある程度まで保持される。基準FE11の活性は、HLA-A*24に対する結合であってもよい。このような結合は、当業者に公知の技術を使用して評価することができる。この文脈内では、「少なくともある程度」は、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%若しくは少なくとも100%又はそれより多いことを意味する。FE11又はFE11様CDR3配列の別の活性は、抗腫瘍又は抗がん又は抗感染活性又は応答であり得る。

0093

抗腫瘍応答は、本明細書で特定されるガンマ及び/又はデルタ配列を発現するT細胞を腫瘍細胞と接触させることによって評価されてもよい(すなわち、いわゆる遺伝子操作されたT細胞)。使用される前記T細胞が、δT細胞受容体鎖の生物学的関連を評価するためにγT細胞受容体鎖も発現すべきであることは、当業者にとって明らかである。言い換えれば、γδTCRは、好ましくは、前記T細胞で発現され、δTCRは、本明細書で特定されたものである。或いは、γδTCRは、好ましくは、前記T細胞で発現され、γTCRは、本明細書で特定されたものである。代替として、γδTCRは、好ましくは、前記T細胞で発現され、各TCR鎖は、本明細書で特定されたものである。好ましい実施形態では、δT細胞(又はγT細胞)受容体鎖をコードする核酸分子又はその部分は、T細胞における発現ベクター中、又はレトロウイルス若しくはレンチウイルスベクター中で提供される。T細胞は、δT及び/又はγT細胞受容体鎖をコードする核酸の移入前又は後に増殖されてもよい。好ましくは、増殖は移入後であり、その結果、移入される必要のある核酸の量は可能な限り少ない。前記T細胞のこの増殖は、IL-2の存在下で、抗CD3/CD28 Dynabeadsによる刺激によって実施されてもよい。遺伝子操作されたγδT細胞受容体を含む増殖された細胞は、例えば、選択マーカーを介して選択されてもよく、例えば、実施例に記載されるMACS分離システムを使用して、CD4抗原及びCD8抗原の提示に対してさらに選択されてもよい。次に、遺伝子操作されたT細胞は、参照により本明細書に組み込まれるRiddel及びGreenberg、1990年 J Immunol Methods. 128(2):189〜201頁に記載されるREPプロトコールを使用して、又はそれと同様の増殖方法をさらに使用して、さらに増殖されてもよい。簡潔には、増殖方法は、T細胞活性化分子、例えば、TCR、CD3及びCD28並びに/又は支持細胞並びに/又は刺激性サイトカインを対象とする抗体を使用することに関与する。

0094

δT細胞(又はγT細胞)受容体鎖を発現する前記T細胞の抗腫瘍応答は、当業者に公知の任意の技術を使用して評価されてもよい。δT細胞受容体鎖は、δ2-T細胞受容体鎖であってもよい。γT細胞受容体鎖は、γ9-T細胞受容体鎖であってもよい。抗腫瘍活性を決定する工程は、腫瘍細胞分裂速度、すなわち、腫瘍細胞が分裂する速度、細胞死、腫瘍細胞への結合、IFNy、IL-2又はTNFαなどのサイトカイン産生の誘導に関する効果を有するなど、抗腫瘍効果が決定される任意のアッセイを含んでもよい。腫瘍細胞は、任意の種類の腫瘍細胞であってもよい。例えば、患者由来原発性腫瘍細胞。腫瘍細胞は、細胞株、例えば、当技術分野で周知である、Daudi、RPMI8226/S、OPM2、LME1、K562、Saos2、MZ1851 RC、SCC9、Fadu、MDA-MB231 、MCF7、BT549、SW480という名称の実施例で列挙された細胞株由来の腫瘍細胞であってもよい。腫瘍細胞株は、American Type Culture Collection(ATCC、Manassas、Virginia)などから容易に入手することができる。

0095

好ましい実施形態では、抗腫瘍応答を決定することは、前記遺伝子操作されたT細胞を腫瘍細胞と接触させること及び腫瘍細胞を溶解させ及び/又はIFN-γ、IL-2又はTNFαなどのサイトカイン産生を誘導するその能力を測定することを含む。この接触させる工程、培養する工程又はインキュベーション工程は、10時間から1、2、3、4、5日までの期間を有してもよい。腫瘍細胞を溶解させる能力は、前記T細胞が接触される固定量の腫瘍細胞を提供することを含み、インキュベーション期間の後、生存可能な腫瘍細胞数が計数される。インキュベーション工程の終わりに、生存可能な腫瘍細胞数が、インキュベーション工程の開始時の初期腫瘍細胞数の90%未満、80%未満、70%未満、60%未満、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満である場合に、抗腫瘍応答は特定されるか又は決定されていてもよい。或いは、遺伝子操作されたT細胞とのインキュベーション工程の終わりに、生存可能な腫瘍細胞数が、共有される、特定された配列で遺伝子操作されていない対照T細胞との同様のインキュベーション工程の終わりの腫瘍細胞数より少ない場合に、抗腫瘍応答が特定されるか又は決定されていてもよい。この文脈では、より少ないとは、少なくとも10%より少ない、少なくとも20%より少ない、少なくとも30%より少ない、少なくとも40%より少ない、少なくとも50%より少ない、少なくとも60%より少ない、少なくとも70%より少ない、少なくとも80%より少ない、少なくとも90%より少ないことを意味してもよい。

0096

インキュベーション工程の終わりに生存可能な腫瘍細胞数を計数することに加えて、又はその代替として、当業者に公知である51クロム放出アッセイが実施されてもよい。51クロム放出量は、溶解された細胞数の尺度である。同様に、IFN-γ、IL-2若しくはTNFαなどのサイトカイン産生又は活性化マーカーの分泌若しくは発現も、例えば、抗体染色、ELISA及び/又は発現したmRNAに対する定量的PCRを介して決定されてもよい。IFN-γ、IL-2又はTNFαなどのサイトカイン産生を決定するためのアッセイは、広く市販されている。IL-2、TNFα又はIFNγなどのサイトカイン産生が検出される場合、前記T細胞は、抗腫瘍応答を示すと考えられる。或いは及び好ましくは、遺伝子操作されたT細胞と接触させる工程の終わりに生じたIFNγ、IL-2又はTNFαの量が、腫瘍細胞が対照のT細胞と接触した場合に生じたIFNγ IL-2又はTNFαの量より多い(好ましくは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%又はそれより多い)場合、T細胞は、抗腫瘍応答を示すと考えられる。対照のT細胞は、本発明で特定されたδT細胞(又はγT細胞)受容体鎖を含むアミノ酸をコードする規定の核酸分子を発現しない。抗腫瘍応答は、インキュベーション工程の終わりに、遺伝子操作されたT細胞の腫瘍細胞への結合を評価することによって決定されてもよい。遺伝子操作されたT細胞の腫瘍細胞への結合が、接触させる工程の終わりに検出される場合、T細胞は、抗腫瘍応答を示すと考えられる。或いは及び好ましくは、接触させる工程の終わりのT細胞の結合が、対照のT細胞(前出の定義を参照のこと)の同一腫瘍細胞への結合より多い(好ましくは、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%又はそれより多い)場合、T細胞は、抗腫瘍応答を示すと考えられる。接触させる工程は、ホスホ抗原、例えば、パミドロン酸の存在下で行われてもよい。

0097

標的に結合することができるCDR配列を生成する方法は、数ある技法の中で、変異、置換、欠失、挿入を含むことができる。例えば、FE11様CDR3配列は、アミノ酸置換によって生成することができる。任意の数のアミノ酸が置換され得る。アミノ酸置換は、約1から約1000個を含むことができる。1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、又は最大約1000個のアミノ酸が置換され得る。アミノ酸置換数は、以下の方法のうちの1つにおいて定義されてもよい:検討される分子内に存在する10、15、20、25個のアミノ酸当たり少なくとも1個のアミノ酸置換を有する方法、置換アミノ酸の少なくとも1%、少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも15%を有する方法。

0098

アミノ酸置換は、CDR領域に種々の効果を有することができる。一部の場合には、置換又は変異は、ドメインの安定性に影響を及ぼし得る。他の場合には、置換又は変異は、発現レベルに影響を及ぼし得る。CDR3などのCDR領域の置換又は変異は、構造に影響を及ぼし得る。CDR3領域への変化は、可変ドメイン、定常ドメイン、又はこれらの組合せを含むことができる。一部の場合には、置換又は変異は、リガンド結合に影響を及ぼし得る。置換、変異、欠失、又は挿入は、Jγ1及び/又はJδ1セグメントの少なくとも一部で実施され得る。一部の場合には、置換又は変異は、リガンド結合に影響を及ぼし得る。置換、変異、欠失、又は挿入は、アミノ酸配列のC末端、N末端、又は両方の末端で実施され得る。一部の場合には、基準ポリペプチドと比較して変異したポリペプチド又は少なくとも1つの置換を有するポリペプチドであって、前記変異したポリペプチドは、配列番号2から配列番号428のうちのいずれか1つを含むことができる。好ましい実施形態では、アミノ酸配列である配列番号2、配列番号3、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号5のアミノ酸21〜293、配列番号4、配列番号5及び配列番号6から配列番号428のうちのいずれかと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含むアミノ酸配列によって表されるポリペプチドが提供される。好ましくは、同一性は、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%のものである。

0099

一部の場合には、遺伝子操作された細胞は、配列番号6から配列番号428のうちの少なくとも1つと少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一である配列によってコードされる受容体の少なくとも一部(a portion of or a part of)を含むことができる。好ましくは、同一性は、全体の長さに対して評価される。一部の場合には、変異配列は、TCRのガンマ又はデルタ鎖内に見出すことができる。

0100

本明細書に開示されるある特定の方法では、γ9T細胞受容体又はγ9陰性γT細胞受容体鎖及びδ2T細胞受容体又はδ2陰性δT細胞受容体鎖のCDR3領域は修飾され、組み合わされて、本明細書に開示されるHLA立体構造に選択的に結合する新規γ9δ2TCRを形成することができる。より好ましい実施形態では、CDR3領域を含むδT細胞受容体鎖又はその部分が提供され、前記δT細胞受容体鎖又はその部分はアミノ酸配列によって表され、前記アミノ酸配列は、アミノ酸配列である配列番号6から237のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含む。好ましくは、同一性は、少なくとも少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%のものである。別のより好ましい実施形態では、CDR3領域を含むγT細胞受容体鎖又はその部分が提供され、前記γT細胞受容体鎖又はその部分はアミノ酸配列によって表され、前記アミノ酸配列は、アミノ酸配列である配列番号238から428のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含む。好ましくは、同一性は、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%のものである。

0101

ある特定の実施形態では、γ9陰性γT細胞受容体鎖、δ2T細胞受容体、及び/又はδ2陰性δT細胞受容体鎖を含むポリペプチド構築物である。設計されたγδTCRは、T細胞中に提供され、好ましくは、組み込むことができ、次に細胞表面でγδTCRを発現することができる。したがって、CTEにより遺伝子操作されたT細胞の抗腫瘍応答が決定される。このように、多数の組合せについて試験することができ、各組合せについて、抗腫瘍応答を決定することができる。抗腫瘍応答を決定した後、活性の高い抗腫瘍応答を媒介するγ9δ2T細胞受容体を特定することができる。本明細書に開示されるある特定の方法では、γ5T細胞受容体鎖及びδ1T細胞受容体鎖のCDR3領域を修飾し、組み合わせて、本明細書に開示されるHLA立体構造に選択的に結合する新規γ5δ1TCRを形成することができる。ある特定の実施形態では、表2、表4及び表5のうちの1つ又は複数に開示されたγ5T細胞受容体鎖及び/又はδ1T細胞受容体鎖を含むポリペプチド構築物である。設計されたγ5δ1TCRは、T細胞中に提供され、好ましくは、組み込むことができ、次に細胞表面でγ5δ1TCRを発現することができる。したがって、CTEにより遺伝子操作されたT細胞の抗腫瘍応答が決定される。このように、多数の組合せについて試験することができ、各組合せについて、抗腫瘍応答を決定することができる。抗腫瘍応答を決定した後、活性の高い抗腫瘍応答を媒介するγ5δ1T細胞受容体を特定することができる。したがって、TCR、好ましくは、CDR3領域を含むδT細胞受容体鎖又はその部分を含む遺伝子操作されたTCRが提供され、前記δT細胞受容体鎖又はその部分はアミノ酸配列によって表され、前記アミノ酸配列は、アミノ酸配列である配列番号3、及び配列番号6から237のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含み、γT細胞受容体鎖又はその部分はCDR3領域を含み、前記γT細胞受容体鎖又はその部分はアミノ酸配列によって表され、前記アミノ酸配列は、アミノ酸配列である配列番号2、及び配列番号238から428のいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含む。好ましくは、同一性は、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%のものである。本明細書に開示される実施形態のいずれかの一部の態様では、対象の抗原結合単位は、HLA-A*24:02の少なくとも一部に特異的に結合する。HLA-A*24:02は、本明細書で使用される場合、公知のHLA-A*24:02配列の相同分子種、相同体、コドン最適化形態、切断形態断片化形態、変異形態、又は任意の他の公知の誘導体形態を指すこともできる。例えば、HLA-A*24:02はヒトHLA-A*24:02であり得る。HLA-A*24:02はマウスのHLA-A*24:02であり得る。一部の場合には、MHCは、いくつか例を挙げると、チンパンジー、ブタ、ゴリラニワトリ、ウシ、ヤギなどの哺乳動物に由来し得る。

0102

一部の場合には、γδTCRは、表6由来の配列番号2、配列番号4のアミノ酸19〜309、配列番号4又は配列番号238〜428に対して、約10%から又は10%から、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%までの相同性を含むことができる。一部の場合には、γδTCRは、表5由来の配列番号3、配列番号5のアミノ酸21〜293、配列番号5又は配列番号6〜237に対して、約10%から、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%までの相同性を含むことができる。一部の場合には、γδTCRは、配列番号4のアミノ酸19〜309及び配列番号5のアミノ酸21〜293の両方を含むことができる。一部の場合には、γδTCRは、表5及び表6由来の配列を含むことができる。

0103

本明細書に記載のポリペプチドを利用して、立体構造的に制約されたHLA分子に選択的に結合することができる。例えば、立体構造的に制約されたHLA分子は、同等の細胞上の正常なHLA分子と比較して、異常な立体構造を有するHLA、腫瘍細胞上に発現したHLAを含むことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物は、非がん細胞上の対応するHLA分子と比較して、がん細胞上に発現したHLA分子に選択的に結合することができる。一部の場合には、がんによって発現したHLAは、健常組織に発現したHLAと比較して、立体構造的に異なる場合がある。例えば、悪性腫瘍は、HLAに、γδTCRによって認識され得る腫瘍細胞表面にクラスターを形成させる場合がある。腫瘍細胞上でのクラスター形成によってHLAにおける立体構造の変化が誘導され、γδTCRによる検出が可能となる場合がある。細胞表面でのクラスター形成には、少なくとも2つのHLAタンパク質の接触が含まれてもよい。一部の場合には、クラスター形成は、互いに隣接する少なくとも2つのHLAタンパク質を含むことができる。一部の場合には、クラスター形成は、細胞表面でのタンパク質の密度によって測定することができる。

0104

立体構造の変化は、クラスター形成されない場合に存在しない可能性のあるHLA上の新たな結合部位を作成することができる。一部の場合には、クラスター形成されないタンパク質と比較して、クラスター形成されたHLAタンパク質上には、1から100個の新たな結合部位が存在してもよい。一部の場合には、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個の新たな結合部位が存在してもよい。一部の場合には、γδTCRは、クラスター形成されたHLAタンパク質上の新たな結合部位に結合することができる。一部の場合には、γδTCRは、クラスター形成されたHLA-Aに結合することができる。一部の場合には、γδTCRは、クラスター形成されたHLA-A*24に結合することができる。一部の場合には、γδTCRは、クラスター形成されたHLA-A*24:02に結合することができる。

0105

一部の場合には、免疫金標識抗原走査フォース顕微鏡によって検出されるマイクロメートル範囲の受容体間距離によって特徴付けられるHLAクラスター形成は、腫瘍細胞の表面に提示され得る。一部の場合には、電子顕微鏡を使用して、細胞表面のHLAクラスター形成を検出及び測定することができる。一部の場合には、走査フォース顕微鏡を使用して、クラスター形成を検出及び測定することができる。一部の場合には、顕微鏡技法において、30及び15nmの免疫金ビーズを利用して、クラスター形成を測定及び検出することができる。例えば、直径約5nmから、10nm、15nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、又は100nmまでの任意のサイズのビーズを使用することができる。ビーズは、一部の場合には、実質的に球形であり得る。一部の場合には、HLAのクラスター化は、無作為の場合を表すポアソン分布由来のそれらの空間的分布偏差によって検出される、その内部に提示される抗原、ビーズ、又はペプチドの分布によって検出することができる。蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)測定を使用して、別の階層レベルのHLA分子のクラスター形成を示すこともできる。例えば、約2から10nmのフォルスタ距離範囲によって特徴付けられるFRETによって、受容体の分子構成の詳細を提供することができる。他の場合には、HLAクラスターを検出するために使用することができるフォルスター距離範囲は、約0.5nmから、1nm、1.5nm、2nm、2.5nm、3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、5.5nm、6nm、6.5nm、7nm、7.5nm、8nm、8.5nm、9nm、9.5nm、10nm、10.5nm、11nm、11.5nm、12nm、12.5nm、13nm、13.5nm、14nm、14.5nm、15nm、15.5nm、16nm、16.5nm、17nm、17.5nm、18nm、18.5nm、19nm、19.5nm、又は20nmまでであり得る。

0106

細胞の工学的操作
細胞の工学的操作のプロセス又は方法の部分として、免疫細胞の供給源は対象から得ることができる。免疫細胞は、骨髄又はリンパ起源であり得る。一部の場合には、T細胞、B細胞、又はナチュラルキラー(NK)細胞を使用することができる。T細胞は、細胞株、例えば、SupT-1、Jurkat、若しくはRaji細胞又は任意の他の広範囲に利用可能な細胞株であってもよい。初代細胞又は任意の他の細胞株である任意の細胞型を利用することができる。一部の場合には、T細胞受容体を発現する細胞、すなわち、FACS選別においてαβTCRに対して陽性であるような細胞が企図されてもよい。また、γδTCRと共に提供される場合、機能的TCR複合体を形成し、例えば、機能的細胞傷害性応答及び/又はサイトカイン産生を発揮することが可能であり得る任意の細胞又は細胞集団が企図されてもよい。提供され得る細胞は、前駆細胞、好ましくは、血液前駆細胞、例えば、胸腺細胞又は血液幹細胞であってもよく、これらは、右の刺激と共に提供された後、T細胞又は遺伝子操作されたT細胞に発達することができる。それ故に、γδTCRと共に細胞を提供することは、これらが遺伝子操作されたT細胞に発達するように、前駆細胞を提供すること、これらをγδTCRと共に提供すること及びこれらの前駆細胞を刺激することを含んでもよいことが理解され得る。

0107

末梢血単核球(PBMCs)、骨髄、リンパ節組織臍帯血胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水胸水脾臓組織、及び腫瘍を含む多数の供給源からT細胞を得ることができる。当技術分野で利用可能な任意の数のT細胞株が使用されてもよい。T細胞は、Ficoll(商標)分離などの当業者に公知の任意の数の技法を使用して対象由来採血単位から得ることができる。一部の場合には、個体の循環血由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、T細胞、単球顆粒球、B細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球、及び血小板を含有し、一実施形態では、アフェレーシスによって採取された細胞を洗浄して血漿画分を除去し、次の処理工程のために、細胞を適当な緩衝液又は媒体に置く。一部の場合には、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄される。一部の場合には、洗浄溶液カルシウム欠如してもよく、マグネシウムを欠如してもよく、又はすべての二価カチオンではないにしても多くを欠如してもよい。洗浄工程は、製造業者説明書に従って、半自動化フロースルー遠心分離(例えば、the Cobe 2991 cell processor、the Baxter CytoMate、又はthe Haemonetics Cell Saver 5)を使用することなどによって当業者に公知の方法によって達成されてもよい。洗浄工程の後、単離した細胞は、緩衝液の有無にかかわらず、例えば、Ca3+を含まないか、Mg2+を含まないPBS、PlasmaLyte A、又は他の生理食塩水などの様々な生体適合性緩衝液中に再懸濁されてもよい。或いは、アフェレーシス試料の任意の望ましくない構成成分を除去して、細胞を培養培地に直接再懸濁させてもよい。一部の場合には、T細胞は、例えば、PERCOLL(商標)勾配による遠心分離によってか又は向流遠心溶出によって、赤血球を溶解させ、単球を枯渇させることによって、末梢血リンパ球から単離することができる。T細胞の具体的な亜集団、例えば、CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、及びCD45RO+T細胞は、陽性又は陰性の選択技術によってさらに単離することができる。例えば、一実施形態では、T細胞は、所望のT細胞の陽性選択に対して十分な期間、抗CD3/抗CD28(すなわち、3×28)-コンジュゲートビーズ、例えば、DYNABEADS(登録商標)M-450 CD3/CD28 Tを用いるインキュベーションによって単離される。一実施形態では、期間は、約30分である。一部の場合には、期間は、約30分から36時間又はそれより長い期間及びその間のすべての整数値の範囲である。さらなる実施形態では、期間は、少なくとも1、2、3、4、5、又は6時間である。別の場合には、期間は、約10時間から約24時間である。一部の場合には、期間は24時間であり得る。白血病を有する患者由来のT細胞の単離に対して、24時間などのより長いインキュベーション時間の使用により、細胞収率が増加し得る。より長いインキュベーション時間を使用して、腫瘍組織又は免疫無防備状態個体由来の腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)を単離する際のように、他の細胞型と比較して、T細胞がほとんど存在しない任意の状況でT細胞を単離してもよい。さらに、より長いインキュベーション時間の使用によって、CD8+T細胞の捕捉効率を増加させることができる。したがって、単に、時間を短くしたり延ばしたりすることによって、T細胞をCD3/CD28ビーズに結合させることが可能となり、及び/又はT細胞に対するビーズの比を増加させるか又は低下させることによって(本明細書でさらに記載されるように)、T細胞の亜集団を、培養開始時又はプロセス間の他の時点で、優先的に選択することができる。さらに、ビーズ又は他の表面上の抗CD3及び/又は抗CD28抗体の比を増大又は低下させることによって、T細胞の亜集団は、培養開始のために若しくはそれに対して又は他の所望の時点で優先的に選択することができる。当業者は、この発明の文脈で、複数ラウンドの選択を使用することができると認識するであろう。

0108

一部の場合には、陰性選択によるT細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に特有の表面マーカーを対象とする抗体の組合せにより達成することができる。1つの方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーを対象とするモノクローナル抗体カクテルを使用してもよい陰性磁気免疫付着又はフローサイトメトリーによる細胞選別及び/又は選択であり得る。例えば、陰性選択によりCD4+細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD 14、CD20、CD l1b、CD 16、HLA-DR、及びCD8に対する抗体を含む。ある特定の実施形態では、典型的には、CD4+、CD25+、CD62L+、GITR+、及びFoxP3+を発現する調節T細胞を濃縮するか又は陽性選択することが望ましい。或いは、ある特定の実施形態では、T調節細胞は、抗CD25コンジュゲートビーズ又は他の同様の選択方法によって枯渇される可能性がある。

0109

陽性又は陰性選択による所望の細胞集団の単離に関して、細胞及び表面(例えば、ビーズなどの粒子)の濃度を変化させることができる。ある特定の実施形態では、ビーズと細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させ(すなわち、細胞の濃度を増加させ)、細胞とビーズの最大接触を確保することが望ましい場合がある。例えば、一実施形態では、1ml当たり20億個の濃度の細胞を使用することができる。一実施形態では、1ml当たり10億個の濃度の細胞を使用することができる。さらなる実施形態では、1ml当たり1億個の濃度の細胞を使用することができる。さらなる実施形態では、1ml当たり1000万、1500万、2000万、2500万、3000万、3500万、4000万、4500万、又は5000万個の濃度の細胞を使用することができる。さらに別の実施形態では、1ml当たり7500、8000、8500、9000、9500万、又は1億個の濃度の細胞を使用することができる。さらなる実施形態では、1ml当たり1億2500万又は1億5000万個の濃度の細胞を使用することができる。高濃度を使用することにより、細胞収率、細胞の活性化、及び細胞の増殖の増加をもたらすことができる。刺激するために、洗浄工程の後、T細胞を凍結させることもできる。

0110

凍結及び次の解凍工程により、細胞集団において、顆粒球及びある程度まで単球を除去することにより、より均一な生成物を提供することができる。血漿及び血小板を除去することができる洗浄工程の後、細胞を凍結溶液に懸濁させてもよい。多くの凍結溶液及びパラメータが当技術分野で公知であり、この文脈で有用である場合があるが、1つの方法は、20%のDMSOと8%のヒト血清アルブミンを含有するPBS、又は10%のデキストラン40及び5%のデキストロース、20%のヒト血清アルブミン及び7.5%のDMSO、若しくは31.25%のPlasmaiyte-A、31.25%のデキストロース 5%、0.45%のNaCl、10%のデキストラン 40及び5%のデキストロース、20%のヒト血清アルブミン、及び7.5%のDMSOを含有する培養培地又は、例えば、Hespan及びPlasmaLyte Aを含有する他の適切な細胞凍結媒体を使用することに関与し、次いで、細胞を1分当たり1度の割合で-80℃まで凍結させて、液体窒素貯蔵タンク気相中に保存してもよい。凍結を制御する他の方法を、-20℃又は液体窒素中における未制御の直ちに凍結する方法と同様に使用してもよい。ある特定の実施形態では、凍結保存した細胞を本明細書に記載されるように解凍及び洗浄し、活性化前に、室温で1時間休ませてもよい。

0111

本明細書に記載されるように、増殖された細胞が必要とされる前の期間に、対象由来の血液試料又はアフェレーシス産物の採取を企図することもできる。一実施形態では、血液試料又はアフェレーシスを概して健常な対象から得ることができる。ある特定の実施形態では、血液試料又はアフェレーシスを、疾患を発症するリスクを有する可能性があるが、未だ疾患を発症していない概して健常な対象から得ることができ、目的の細胞を単離して、後の使用のために凍結することができる。一部の場合には、T細胞を増殖し、凍結して、後で使用してもよい。一部の場合には、試料は、本明細書に記載されるように、特定の疾患の診断直後であるが、任意の処置の前に、患者から採取される。一部の場合には、これらに限定されないが、ナタリズマブエファリズマブ抗ウイルス剤、化学療法、放射線、シクロスポリンアザチオプリンメトトレキサート、ミコフェノレート、及びFK506などの免疫抑制剤、抗体、又はCAMPATHなどの免疫アブレーション剤、抗CD3抗体シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、FK506、ラパマイシンミコフェノール酸ステロイド、FR901228、及び放射線照射を含む任意の数の関連する処置モダリティの前に対象由来の血液試料又はアフェレーシスから細胞を単離してもよい。これらの薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼカルシニューリンを阻害するか(シクロスポリン及びFK506)又は成長因子に誘導されるシグナル伝達に重要なp70S6キナーゼを阻害するか(ラパマイシン)のいずれかである。

0112

一部の場合には、骨髄又は幹細胞移植、フルダラビン、外部ビーム放射療法(XRT)、シクロホスファミドなどの化学療法剤、又はOKT3若しくはCAMPATHなどの抗体のいずれかを使用するT細胞アブレーション療法と併せた(例えば、前に、同時に又は後に)、後の使用のために、細胞を患者ごとに単離し、凍結することができる。別の実施形態では、CD20と反応する薬剤、例えば、リツキサンなどのB細胞アブレーション療法後の処置のために、前もって細胞を単離し、後の使用のために凍結することができる。

0113

一部の場合には、T細胞を、処置の後、患者から直接得ることができる。これに関して、ある特定のがん処置、特に、免疫系を損傷する薬物による処置の後であって、患者が通常処置から回復している期間の処置直後に、得られるT細胞の品質が、ex vivoで増殖するそれらの能力に関して最適であるか又は改善されている場合があることが観察されてきた。同様に、本明細書に記載の方法を使用するex vivo操作後に、これらの細胞は、生着及びin vivoでの増殖の促進に対して好ましい状態にある場合がある。したがって、本発明の文脈内では、この回復期の間に、T細胞、樹状細胞、又は造血系の他の細胞を含む血液細胞を採取することが企図される。さらに、ある特定の実施形態では、特に、後の療法の規定の時間枠の間に、可動化(例えば、GM-CSFによる可動化)及び馴化レジメンを使用して、特定の細胞型の再増殖再循環再生、及び/又は増殖が好まれる可能性のある対象の状態を創出することができる。例証となる細胞型として、T細胞、B細胞、樹状細胞、及び免疫系の他の細胞が挙げられる。

0114

細胞の単離の後、免疫細胞、例えば、T細胞を、T細胞に付着する表面と、CD3 TCR複合体に関連するシグナルを刺激する薬剤及びT細胞の表面の同時刺激分子を刺激するリガンドと接触させることによって増殖させることができる。特に、例えば、表面に固定された抗CD3抗体、若しくはその抗原結合断片、又は抗CD2抗体と接触させることによって、又はカルシウムイオノホアと併せて、プロテインキナーゼC活性化剤(例えば、ブリオスタチン)と接触させることによって、本明細書に記載されているように、T細胞集団を刺激してもよい。T細胞表面のアクセサリー分子の同時刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、T細胞集団を、T細胞の増殖を刺激するのに適当な条件下で、抗CD3抗体及び抗CD28抗体と接触させることができる。CD4+T細胞又はCD8+T細胞のいずれかの増殖を刺激するための、抗CD3抗体及び抗CD28抗体。抗CD28抗体の例として9.3,B-T3が挙げられ、当技術分野で通常知られている他の方法(Bergら、Transplant Proc. 30(8):3975〜3977頁、1998年;Haanenら、J. Exp. Med. 190(9):13191328頁、1999年;Garlandら、J. Immunol Meth. 227(1-2):53〜63頁、1999年)を使用できるように、XR-CD28(Diacione、Besancon、France)を使用することができる。

0115

ある特定の実施形態では、T細胞に対する一次刺激シグナル及び同時刺激シグナルは、異なるプロトコールによって提供されてもよい。例えば、各シグナルを提供する薬剤は溶液中に存在するか、又は表面にカップリングされてもよい。表面にカップリングされる場合、薬剤は、同じ表面(すなわち、「cis」構造)又は別の表面(すなわち、「trans」構造)にカップリングされてもよい。或いは、1つの薬剤が表面にカップリングされ、他の薬剤が溶液中に存在してもよい。一実施形態では、同時刺激シグナルを与える薬剤は、細胞表面に結合させることができ、一次活性化シグナルを与える薬剤は、溶液中に存在するか又は表面にカップリングされてもよい。ある特定の実施形態では、両方の薬剤が溶液中に存在してもよい。別の実施形態では、薬剤は可溶性形態であってもよく、次いで、表面、例えば、Fc受容体若しくは抗体を発現する細胞又は薬剤に結合することになる他の結合剤に架橋してもよい。これに関しては、例えば、本発明においてT細胞を活性化及び増殖させる際の使用を企図する人工抗原提示細胞(aAPC)に対する米国特許出願公開第20040101519号及び米国特許出願公開第20060034810号を参照のこと。

0116

一部の場合には、本明細書に記載の細胞を成長させるために使用することができる培養培地は、多数の添加剤を含むことができる。一部の例では、添加剤として、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、コロニー刺激因子又は腫瘍壊死因子を挙げることができる。一部の場合には、ケモカインは、細胞の移動を誘導する化学誘引物質としての役割を果たし、4つのサブファミリー:CXC、CC、CX3C、及びXCに分類される。例示的ケモカインは、CCサブファミリー:CCL1、CCL2(MCP-1)、CCL3、CCL4、CCL5(RANTES)、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9(又はCCL10)、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、及びCCL28;CXCサブファミリー:CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、及びCXCL17;XCサブファミリー:XCL1及びXCL2;並びにCX3Cサブファミリー CX3CL1由来のケモカインを含む。インターフェロン(IFN)は、インターフェロン型I(例えば、IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、及びIFN-ω)、インターフェロン型II(例えば、IFN-γ)、及びインターフェロン型IIIを含むことができる。一部の実施形態では、IFN-αは、IFNA1、IFNA2、IFNA4、IFNA5、IFNA6、IFNA7、IFNA8、IFNA10、IFNA13、IFNA14、IFNA16、IFNA17、及びIFNA21を含む約13個の亜型にさらに分類される。インターロイキンは、白血球(leukocyte)又は白血球細胞(white blood cell)によって発現されることが可能であり、T及びBリンパ球及び造血細胞の発達及び分化を促進する。例示的インターロイキンは、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(CXCL8)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-21、IL-22、IL-23、IL-24、IL-25、IL-26、IL-27、IL-28、IL-29、IL-30、IL-31、IL-32、IL-33、IL-35、及びIL-36を含む。一部の場合には、腫瘍壊死因子(TNF)を培養培地に導入することができる。TNFは、アポトーシスモジュレートするサイトカインの一群であり得る。一部の例では、これらに限定されないが、TNFα、リンホトキシン-アルファ(LT-アルファ)、リンホトキシン-ベータ(LT-ベータ)、T細胞抗原gp39(CD40L)、CD27L、CD30L、FASL、4-1BBL、OX40L、及びTNF-関連アポトーシス誘導リガンド(TRAIL)を含むTNFファミリー内の約19個のメンバーが存在する。コロニー刺激因子(CSF)は、造血幹細胞の表面の受容体タンパク質と相互作用する分泌糖タンパク質であり、次に、細胞増殖及び特定の種類の血液細胞への分化をモジュレートすることができる。一部の例では、CSFは、マクロファージコロニー刺激因子顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)又はプロメガプロテインを含む。

0117

一部の場合には、ガンマ-デルタTCRをコードするポリペプチドを免疫細胞に導入することができる。外因性ガンマ-デルタTCRを発現する免疫細胞を増殖させることができる。一部の場合には、免疫細胞を遺伝子操作する方法は、細胞を準備する工程と、細胞表面で、少なくとも1つの外因性ガンマ-デルタTCRを発現する工程とを含む。ガンマ-デルタTCRをコードするポリヌクレオチドを、例えば、組換えウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス)、リポソームなどによって、細胞に導入してもよい。例えば、一過性形質転換方法として、例えば、微量注入、電気穿孔又は微粒子銃を挙げることができる。ガンマ-デルタTCRをコードするポリヌクレオチドを、ウイルスによって又はウイルスによらずに導入することができる。ウイルスによる導入には、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はこれらの組合せを利用することができる。

0118

ポリ核酸を挿入することができるベクターも本明細書において提供することができる。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターは、それらが、導入遺伝子の長期的な、安定した組込みと、娘細胞におけるその伝播を可能とすることができるため、長期的な遺伝子移入を達成するための適切なツールである。レンチウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターに対して、それらが、肝細胞などの非増殖性細胞に形質導入され得るという点でさらなる利点を有する。レンチウイルスベクターは、免疫原性が低いというさらなる利点も有する。

0119

本明細書に記載の方法及び組成物に対して有用なポリヌクレオチドベクターは、医薬品適正製造基準(GMP)に適合するベクターであり得る。例えば、GMPベクターは、非GMPベクターより純粋であり得る。一部の場合には、生物汚染度によって純度を測定することができる。例えば、生物汚染度は、ベクター組成物中の好気性菌嫌気性菌胞子菌真菌、又はこれらの組合せの有無であり得る。一部の場合には、純粋なベクターは、エンドドキシンが低いか又はエンドドキシンを含まない場合がある。純度は、二本鎖プライマーウォーキングシークエンスによっても測定することができる。プラスミドの同一性は、ベクターの純度を決定する原因でもあり得る。本発明のGMPベクターは、非GMPベクターより10%から99%純度が高い可能性がある。GMPベクターは、生物汚染度、エンドドキシン、シークエンス、又はこれらの組合せの存在によって測定される場合、非GMPベクターより10%から、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%純度が高い可能性がある。

0120

γδTCRをコードする核酸配列も提供することができる。核酸は、単離された核酸であり得る。γδTCRをコードすることができる核酸は、DNA又はRNA形態であり得る。例えば、γδTCRをコードするDNAベクターを本明細書において提供することができる。γδTCRをコードするDNAミニサークルも本明細書において提供することができる。一部の場合には、γδTCRは、mRNAの形態であり得る。例えば、細胞に、γδTCRをコードするmRNAを電気穿孔することができる。核酸は、二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖の核酸は、短い直鎖状DNA(ドギーボーン)ベクターであり得る。

0121

核酸は、多数の型のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、これらに限定されないが、プラスミド、ファージミドファージ誘導体動物ウイルス、及びコスミドを含むベクターにクローニングすることができる。ベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及びシークエンシングベクターも含むことができる。さらに、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。ウイルスベクター技術は、当技術分野で周知であり、例えば、Sambrookら、(2001年、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York)、及び他のウイルス学及び分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとして、これらに限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられる。一般的に、適切なベクターは、少なくとも1つの生物において機能的な複製起点プロモーター配列、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び1つ又は複数の選択マーカーを含有する。多数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子移入に対して開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系に対する簡便なプラットフォームを提供する。当技術分野で公知の技法を使用して、選択された遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子パッケージングすることができる。次いで、組換えウイルスを単離し、in vivo又はex vivoのいずれかで、対象の細胞に送達することができる。多数のレトロウイルス系が当技術分野で公知である。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。多数のアデノウイルスベクターが当技術分野で公知である。一実施形態では、レンチウイルスベクターが使用される。さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーにより、転写開始頻度を調節することができる。典型的には、多数のプロモーターが、開始部位の下流に機能的要素を含有することが最近示されているが、これらのプロモーター要素は、同様の開始部位の30〜110bp上流の領域に位置する。プロモーター要素間の間隔はフレキシブルであることが多く、その結果、要素が互いに対して入れ替わるか
又は移動する場合にもプロモーター機能は保存され得る。プロモーターによって、個々の要素が、協同的に又は独立して機能し、転写を活性化することができる。適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター配列であり得る。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結した任意のポリヌクレオチド配列の発現を高レベルに駆動することができる強力な構成的プロモーター配列である。適切なプロモーターの別の例は、伸長成長因子-1a(EF-1a)である。しかし、これらに限定されないが、シミアンウイルス40(SV40)初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス(MMTV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)末端反復配列(LTR)プロモーター、MoMuLVプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン-バーウイルス前初期プロモーター、Rous肉腫ウイルスプロモーター、並びにヒト遺伝子プロモーター、例えば、これらに限定されないが、アクチンプロモーターミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及びクレアチンキナーゼプロモーターを含む他の構成的プロモーター配列を使用してもよい。さらに、誘導性プロモーターも企図される。誘導性プロモーターは、このような発現が望まれる場合に、作動可能に連結することができるポリヌクレオチド配列の発現をオンにし、発現が望まれない場合には発現をオフにすることができる分子スイッチを提供することができる。誘導性プロモーターの例として、これらに限定されないが、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられる。ガンマ-デルタポリペプチド又はその部分の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターを介してトランスフェクトされるか又は感染されると考えられる細胞集団からの発現している細胞の特定及び選択を容易にするために、選択マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子又はその両方を含有することもでき、別の態様では、選択マーカーは別々のDNA片に運ばれ、同時トランスフェクション手順で使用されてもよい。選択マーカーとレポーター遺伝子の両方は、適当な調節配列と共に隣接し、宿主細胞における発現を可能としてもよい。有用な選択マーカーとして、例えば、ネオマイシンなどの抗生物質
耐性遺伝子緑色蛍光タンパク質(GFP)、eGFP、ルシフェラーゼ、GUSなどが挙げられる。

0122

レポーター遺伝子は、トランスフェクトされる可能性のある細胞を特定するため、及び調節配列の機能性を評価するためにも使用される。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、又は緑色蛍光タンパク質遺伝子を含んでもよい。適切な発現系は周知であり、公知の技法を使用して調製するか又は市場で入手してもよい。一般的に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小限の5'フランキング領域を有する構築物が、プロモーターとして特定される。このようなプロモーター領域をレポーター遺伝子に連結させて、薬剤が、プロモーターに駆動される転写をモジュレートする能力を評価するために使用してもよい。細胞に遺伝子を導入して発現させる方法は、当技術分野で公知である。発現ベクターの文脈で、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、又は昆虫の細胞に、当技術分野における任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターを、物理的、化学的、又は生物学的手段によって宿主細胞に移入することができる。宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法として、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、微量注入、電気穿孔などが挙げられる。ベクター及び/又は外因性核酸を含む細胞を製造するための方法は、当技術分野で周知である。例えば、Sambrookら(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)を参照されたい。宿主細胞へのポリヌクレオチド導入のための方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションであり得る。目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法には、DNAベクター及びRNAベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター、特に、レトロウイルスベクターは、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス単純ヘルペスウイルスI型、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第5,350,674号及び米国特許第5,
585,362号を参照されたい。

0123

一部の場合には、第1の遺伝子プログラムの終わりのターミネーター配列を使用することができる。ターミネーター配列は、第2のプログラムを開始する前に、転写が終わることを保証することができる。例えば、発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列を含有することができる。このような配列は、通常、真核生物又はウイルスDNA又はcDNAの5'、時には3'の非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、mRNAの非翻訳部分のポリアデニル化断片として転写されたヌクレオチドセグメントを含有することができる。発現ベクターを含む細胞を、in vivo又はin vitroのいずれかで、所望のポリペプチドの発現をもたらす条件下で成長させる。

0124

一部の場合には、ベクターのポリヌクレオチドによってコードされた第1のポリペプチドの末端で、スペーサー配列を使用することができる。他の場合には、ベクターの第2の遺伝子の末端で、スペーサー配列を使用することができる。スペーサー配列は、ベクターの第1の遺伝子及び第2の遺伝子の後に使用することもできる。

0125

これらのベクターは、遺伝子によってコードされたポリペプチドポリペプチド、又は目的の遺伝子の部分を発現するために使用することができる。部分の遺伝子又は遺伝子は、任意の方法を使用して、ウイルス又は非ウイルスにより挿入することができる。例えば、方法は、非ウイルスベースの技法であってもよい。

0126

宿主細胞に外因性核酸を導入するか、又はそうでなければ、細胞を本明細書に記載のポリペプチド構築物に曝露するために使用される方法にかかわらず、宿主細胞における組換えDNA配列の存在を確認するために、様々なアッセイが実施されてもよい。このようなアッセイとして、例えば、当業者に周知の「分子生物学」アッセイ、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、RT-PCR及びPCR; 例えば、免疫学的手段(ELISA及びウェスタンブロット)によって又は本発明の範囲内の薬剤を特定するために本明細書に記載のアッセイによって、特定のペプチドの有無を検出することなどの「生化学」アッセイが挙げられる。

0127

一部の場合には、ガンマ-デルタTCRなどの外因性受容体は、細胞集団の割合で発現され得る。例えば、集団における約10%から、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%、99.9%、又は100%の細胞が、ガンマ-デルタTCRを発現してもよい。ガンマ-デルタTCRなどの外因性受容体の発現の測定は、フローサイトメトリー分析によってなされてもよい。

0128

一部の場合には、ガンマ-デルタTCRをウイルスによらずに導入することができる。ガンマ-デルタTCRをコードするポリヌクレオチドは、DNA又はRNAとして導入することができる。一部の場合には、ガンマ-デルタTCRは、DNAとして導入することができる。他の場合には、ガンマ-デルタTCRはRNAとして導入することができる。ガンマ-デルタTCRは、mRNAとして導入することができる。mRNAは、例えば、電気穿孔によって、細胞に直接導入することができる。電気穿孔のために、CytoPulse技術を利用することができる。CytoPulse技術は、パルス出力電界を使用して、ガンマ-デルタTCRなどの物質の送達のために、生細胞を一過的に透過処理することができる。この技術により、パルス持続期間、強度及びパルス間の間隔の制御を可能とすることができる。最小限の死亡率で、高いトランスフェクション効率に対して理想的な条件とするために、これらのパラメータはすべて改変され得る。一部の場合には、トランスフェクション効率及び/又は細胞生存能を最適化するために、電気穿孔のパルス電圧を変化させてもよい。一部の場合には、トランスフェクション効率及び/又は細胞生存能を最適化するために、電気穿孔のパルス数を変化させてもよい。一部の場合には、トランスフェクション効率及び/又は細胞生存能を最適化するために、電気穿孔に対する開始細胞密度を変化させてもよい。

0129

したがって、TCR、好ましくは遺伝子操作されたTCRを含むか又は発現する細胞、好ましくはT細胞、より好ましくは遺伝子操作されたT細胞が提供され、前記TCR又は遺伝子操作されたTCRは、以下を含む:
-CDR3領域を含むδT細胞受容体鎖又はその部分であり、前記δT細胞受容体鎖又はその部分が、アミノ酸配列である配列番号3及び配列番号6から237のうちのいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含むアミノ酸配列によって表されるδT細胞受容体鎖又はその部分
- CDR3領域を含むγΤ-細胞受容体鎖又はその部分であり、アミノ酸配列である配列番号2及び配列番号238から428のうちのいずれか1つと少なくとも60%の配列同一性又は類似性を含むアミノ酸配列によって表されるγΤ-細胞受容体鎖又はその部分。好ましくは、同一性は、少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%のものである。

0130

処置
効果的な養子細胞移入ベースの免疫療法(ACT)は、がん(例えば、転移性がん)患者の処置に有用であり得る。一部の場合には、ACTを利用して、ウイルス感染を処置することもできる。レシピエントの疾患(例えば、がん又はウイルス感染)を処置する方法であって、外因性TCR、例えば、ガンマ-デルタTCRを発現する1つ又は複数の遺伝子操作されたT細胞をレシピエントに移植する工程を含む方法を本明細書に記載することができる。一部の場合には、いくつか例を挙げると、ヒトパピローマウイルス(HPV)、サイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン-バーウイルス(EBV)、B型肝炎(HBV)及びC型肝炎(HCV)、カポジ肉腫-関連ヘルペスウイルス(KSHV)、ヒトT-リンパ増殖性ウイルス-1(HTLV)、メルケル細胞ポリオーマウイルス(MCV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)などによるウイルス感染が、がんをもたらし得る。本明細書に開示される組成物を利用して、前述のウイルス感染のうちのいずれか1つに感染した対象を処置することができる。

0131

対象の抗HLA-A*24:02により遺伝子操作されたT細胞を医薬組成物に製剤化し、疾患、例えば、がんと診断されたそれを必要とするヒト又は哺乳動物を処置するために使用することができる。対象の抗HLA-A*24により遺伝子操作されたT細胞を医薬組成物に製剤化し、ウイルス感染と診断されたそれを必要とするヒト又は哺乳動物を処置するために使用することができる。これらの薬学的医薬は、1つ又は複数の化学療法剤又は化学療法化合物と一緒に、ヒト又は哺乳動物に同時投与することができる。用語「薬学的医薬」は、用語「医薬組成物」又は「医薬」と置き換えることができる。

0132

遺伝子操作されたT細胞、例えば、HLA-A*24:02に特異的なγδTCRを発現するように遺伝子操作されたαβT細胞を、当業者に公知の技法を使用して、対象に投与するために製剤化してもよい。遺伝子操作された細胞の集団を含む製剤には、薬学的に許容される賦形剤が含まれてもよい。製剤中に含まれる賦形剤は、例えば、使用されるT細胞の亜集団及び投与方式によって異なる目的を有することとなる。一般的に使用される賦形剤の例として、これらに限定されないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、注射用水グリセロールエタノール、及びこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝液及び防腐剤等張剤、充填剤、及び滑剤が挙げられる。遺伝子操作された細胞の集団を含む製剤をあらゆる非ヒト構成成分、例えば、動物の血清非存在下で調製及び培養してもよい。製剤は、遺伝子操作された細胞の1つの集団、又は1つより多い、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又はそれより多い遺伝子操作された細胞の集団を含んでもよい。例えば、製剤は、遺伝子操作された細胞の1つの集団、又は1つより多い、例えば、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ又はそれより多い遺伝子操作された細胞の集団を含んでもよい。例えば、1つより多い外因性受容体が細胞中で発現されてもよい。他の場合には、異なる外因性受容体をそれぞれ発現する細胞の2つの集団を組み合わせて、単一製剤とする。

0133

本明細書に記載の製剤は、抗酸化剤金属キレート剤チオール含有化合物及び他の一般的な安定剤から利益を得てもよい。このような安定剤の例として、これらに限定されないが、(a)約0.5%から約2%w/vのグリセロール、(b)約0.1%から約1%w/vのメチオニン、(c)約0.1%から約2%w/vのモノチオグリセロール、(d)約1mMから約10mMのEDTA、(e)約0.01%から約2%w/vのアスコルビン酸、(f)0.003%から約0.02%w/vのポリソルベート80、(g)0.001%から約0.05%w/vのポリソルベート20、(h)アルギニン、(i)ヘパリン、(j)デキストラン硫酸、(k)シクロデキストリン、(1)多硫酸ペントサン及び他のヘパリノイド、(m)マグネシウム及び亜鉛などの二価のカチオン;又は(n)これらの組合せが挙げられる。

0134

一部の場合には、結合剤を使用してもよい。結合剤は、粘着性を付与することができ、例えば、アルギン酸及びその塩;セルロース誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースメチルセルロース(例えば、Methocel(登録商標))、ヒドロキシプロピルメチルセルロースヒドロキシエチルセルロースヒドロキシプロピルセルロース(例えば、Klucel(登録商標))、エチルセルロース(例えば、Ethocel(登録商標))、及び微結晶セルロース(例えば、Avicel(登録商標));微結晶デキストロース;アミロース;ケイ酸アルミニウムマグネシウム;多糖酸(polysaccharide acid);ベントナイト;ゼラチン;ポリビニルピロリドン/酢酸ビニル共重合体;クロスポビドン;ポビドン;デンプン;アルファ化デンプン;トラガカントデキストリン、糖、例えば、ショ糖(例えば、Dipac(登録商標))、グルコース、デキストロース、モラセスマンニトールソルビトールキシリトール(例えば、Xylitab(登録商標))、及びラクトース;天然又は合成ゴム、例えば、アカシア、トラガカント、ガティガム、イサポール殻(isapol husk)の粘液、ポリビニルピロリドン(例えば、Polyvidone(登録商標)CL、Kollidon(登録商標)CL、Polyplasdone(登録商標)XL-10)、カラマツアラビノガラクタン(larch arabogalactan)、Veegum(登録商標)、ポリエチレングリコールロウアルギン酸ナトリウムなどを含む。

0135

「担体」又は「担体材料」として、医薬品において一般的に使用される任意の賦形剤が挙げられ、これらは、本明細書に開示される化合物、例えば、イブルチニブ及び抗がん剤との適合性、並びに所望の剤形放出プロフィール特性に基づいて選択されるべきである。例示的な担体材料としては、例えば、結合剤、懸濁化剤崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定剤、滑剤、湿潤剤、希釈剤などが挙げられる。「薬学的に適合性の担体材料」としては、これらに限定されないが、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素グリセロリン酸カルシウム乳酸カルシウムマルトデキストリングリセリンケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン(PVP)、コレステロールコレステロールエステルカゼイン酸ナトリウム大豆レシチンタウロコール酸ホスファチジルコリン塩化ナトリウムリン酸三カルシウムリン酸二カリウム、セルロース及びセルロースコンジュゲート、糖類ステアロイルラクチル酸ナトリウムカラギーナンモノグリセリドジグリセリド、アルファ化デンプンなどを挙げられる。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第19版(Easton, Pa.:Mack Publishing Company、1995年);Hoover, John E.、Remington's Pharmaceutical Sciences、Mack Publishing Co.、Easton、Pennsylvania 1975年;Liberman, H.A.及びLachman, L.編、Pharmaceutical Dosage Forms、Marcel Decker, New York、N.Y.、1980年;及びPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems、第7版(Lippincott Williams & Wilkins 1999年)を参照のこと。

0136

分散剤」、及び/又は「粘度調整剤」としては、液体媒体又は造粒法若しくはブレンド法によって薬物の拡散及び均質性を制御する材料が挙げられる。一部の実施形態では、これらの薬剤はまた、コーティング又は浸食性マトリックスの有効性を促進する。例示的な拡散促進剤/分散剤としては、例えば、親水性ポリマー電解質、Tween(登録商標)60若しくは80、PEG、ポリビニルピロリドン(PVP;Plasdone(登録商標)として商業的に公知)、及び炭水化物系分散剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース(例えば、HPC、HPC-SL、及びHPC-L)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(例えば、HPMC K100、HPMC K4M、HPMC K15M、及びHPMC K100M)、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート(HPMCAS)、非結晶性セルロース、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミンポリビニルアルコール(PVA)、ビニルピロリドン/酢酸ビニル共重合体(S630)、エチレンオキシドホルムアルデヒドの4-(1,1,3,3-テトラメチルブチル)-フェノールポリマー(チロキサポールとしても公知)、ポロキサマー(例えば、エチレンオキシドとプロピレンオキシドブロック共重合体である、Pluronics F68(登録商標)、F88(登録商標)、及びF108(登録商標));及びポロキサミン(例えば、エチレンジアミンへのプロピレンオキシド及びエチレンオキシドの逐次付加から誘導された四官能性ブロック共重合体である、Poloxamine 908(登録商標)としても公知の、Tetronic 908(登録商標)(BASFCorporation、Parsippany、N.J.))、ポリビニルピロリドンK12、ポリビニルピロリドンK17、ポリビニルピロリドンK25、又はポリビニルピロリドンK30、ポリビニルピロリドン/酢酸ビニル共重合体(S-630)、ポリエチレングリコール、例えば、ポリエチレングリコールは約300から約6000、又は約3350から約4000、又は約7000から約5400の分子量を有し得る、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート-80、アルギン酸ナトリウム、ゴム、例えば、トラガカントゴム及びアカシアゴムグアーゴムキサンタン(キサンタンゴムを含む)など、糖類、セルロース誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど、ポリソルベート-80、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアルコール(PVA)、アルギネートキトサン及びこれらの組合せが挙げられる。セルロース又はトリエチルセルロースなどの可塑剤も分散剤として使用され得る。リポソーム分散液及び自己乳化分散液において特に有用な分散剤は、ジミリストイルホスファチジルコリン、卵由来の天然ホスファチジルコリン、卵由来の天然ホスファチジルグリセロール、コレステロール及びミリスチン酸イソプロピルである。

0137

遺伝子操作された細胞の集団を含む製剤は、当業者に公知の方式及び技法を使用して、対象に投与されてもよい。例示的な方式として、これらに限定されないが、静脈内注射が挙げられる。他の方式として、限定されないが、腫瘍内、皮内、皮下(S.C.、s.q.、sub-Q、Hypo)、筋肉内(i.m.)、腹腔内(i.p.)、動脈内、内、心臓内、関節内(関節)、関節滑液嚢内(関節滑液領域)、頭蓋内、脊髄内、及び髄構内(脊髄液)が挙げられる。このような投与を行うために、製剤の輸液剤の腹腔内注射に有用な任意の公知のデバイスを使用することができる。

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