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技術 PD−L1結合ポリペプチドを用いるPET造影

出願人 ブリストル-マイヤーズスクイブカンパニー
発明者 ポール・イー・モーリンデイビッド・ドネリーダーサ・リポブセクヨッヘム・ゴーケマイヤーマリア・ジュア-クンケルデイビッド・ファブリジオマーティン・シー・ライトダグラス・ディスキーノサミュエル・ジェイ・ボナコーシラルフ・アダム・スミスヴィルジニー・ラフォンダニエル・コーエンデイビッド・ケイ・レオン
出願日 2017年5月31日 (2年11ヶ月経過) 出願番号 2018-563054
公開日 2019年9月12日 (7ヶ月経過) 公開番号 2019-525891
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 単一平板 モジュラー構成要素 滞留面 結合セクション 捕捉板 計算比 液体センサー 密閉耐圧容器
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年9月12日)のものです。
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図面 (12)

課題・解決手段

ここに提供されるのは、PD−L1に特異的に結合する新規10Fn3ドメインおよびそれに基づく診断用造影剤である。

概要

背景

背景
計画細胞死リガンド−1(PD−L1)は、活性化TおよびB細胞により発現され、免疫抑制仲介する重要な免疫チェックポイント受容体であるPD−1の表面糖タンパク質リガンドであり、抗原提示細胞およびヒト癌の両者で見られ、PD−1への結合によりT細胞活性化およびサイトカイン分泌下方制御する(Freeman et al., 2000; Latchman et al, 2001)。PD−L1/PD−1相互作用阻害は、前臨床モデルで強力な抗腫瘍活性を可能とし、この相互作用を妨害する抗体が、癌処置に関する治験に入っている(米国特許8,008,449および7,943,743;Brahmer et al., 2010; Topalian et al., 2012b; Brahmer et al., 2012; Flies et al., 2011; Pardoll, 2012; Hamid and Carvajal, 2013)。

PETまたは陽電子放出断層撮影は、体内の種々の分子過程のまたは疾患病理に関連するタンパク質の位置の三次元画像を取得する非侵襲的核医学技術である。この方法は、体内に導入された生物学的活性分子ポジトロン放出放射性核種(トレーサー)により間接的に放出されるガンマ線の対を検出する。PET造影ツールは、医薬品開発で広範な用途を有し、同じツールが前臨床および臨床の両段階で使用し得るという、特有トランスレーシナル医療上の利点を有する。その例は、インビボ標的の飽和化;毒性または患者間変動予測のための、正常組織取り込み追跡;罹病組織の定量化腫瘍転移;経時的薬効または経時的耐性追跡などの直接的可視化を含む。

概要

ここに提供されるのは、PD−L1に特異的に結合する新規10Fn3ドメインおよびそれに基づく診断用造影剤である。

目的

対象の“処置”または“治療”は、疾患と関連する症状、合併症、状態もしくは生化学徴候発症、進行、発生、重症度もしくは再発回復、軽減、寛解、阻止、遅延もしくは阻止を目的とする

効果

実績

技術文献被引用数
- 件
牽制数
- 件

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請求項1

対象におけるPD−L1タンパク質可視化する方法であって、(a)該対象にPD−L1造影剤を約3〜10mCi(100〜333MBq)の用量で投与し;そして(b)段階(a)の後対象のPET走査を約30〜120分実施することを含む、方法。

請求項2

用量のPD−L1造影剤が約6mCi(±10%)である、請求項1に記載の方法。

請求項3

段階(b)のPET走査を段階(a)の約60〜100分後に実施する、請求項1または2に記載の方法。

請求項4

対象が癌を有する対象である、請求項1〜3の何れかに記載の方法。

請求項5

対象が少なくとも1つの腫瘍を有する、請求項1〜4の何れかに記載の方法。

請求項6

対象の腫瘍におけるPD−L1タンパク質のレベルを決定のためである、請求項4〜5の何れかに記載の方法。

請求項7

対象が免疫腫瘍剤での処置応答しそうであるかどうかを決定するための、請求項1〜6の何れかに記載の方法。

請求項8

対象がPD−1またはPD−L1アンタゴニスト、例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはアテゾリズマブでの処置に応答するかどうかを決定し、1つまたはそれを超える腫瘍におけるPD−L1のレベルがPD−1またはPD−L1アンタゴニスト(例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはアテゾリズマブ)での処置を必要とするPD−L1のレベルに等しいかまたはそれを超えるならば、例えば、5%、25%、50%またはそれを超える腫瘍細胞がPD−L1を発現するならば、対象がPD−1またはPD−L1アンタゴニストでの処置に応答しそうである、請求項7に記載の方法。

請求項9

1つまたはそれを超える腫瘍におけるPD−L1のレベルがPD−1またはPD−L1アンタゴニスト(例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブまたはアテゾリズマブ)での処置を必要とするPD−L1のレベルに等しいかまたはそれを超えるならば、例えば、5%、25%、50%またはそれを超える腫瘍細胞がPD−L1を発現するならば、対象をPD−1またはPD−L1アンタゴニストで処置する、請求項1〜6の何れかに記載の方法。

請求項10

対象が治療剤で処置されている、請求項1〜6の何れかに記載の方法。

請求項11

治療剤が免疫療法剤である、請求項10に記載の方法。

請求項12

免疫療法剤がPD−1アンタゴニストである、請求項11に記載の方法。

請求項13

PD−1アンタゴニストが抗PD−1抗体である、請求項12に記載の方法。

請求項14

抗PD−1抗体がニボルマブまたはペムブロリズマブまたはアテゾリズマブである、請求項13に記載の方法。

請求項15

PD−L1造影剤がヒトPD−L1に特異的に結合するタンパク質であり、該タンパク質が検出可能剤に結合している、請求項1〜14の何れかに記載の方法。

請求項16

PD−L1造影剤が抗PD−L1アドネクチンである、請求項15に記載の方法。

請求項17

検出可能剤が放射性PETトレーサーである、請求項15〜16の何れかに記載の方法。

請求項18

放射性PETトレーサーが18Fである、請求項17に記載の方法。

請求項19

PD−L1造影剤が18Fで標識された抗ヒトPD−L1アドネクチンである、請求項1〜18の何れかに記載の方法。

請求項20

造影剤が治療剤の最初の投与前に対象に投与される、請求項10〜19の何れかに記載の方法。

請求項21

造影剤が治療剤の最初の投与後に対象に投与される、請求項10〜19の何れかに記載の方法。

請求項22

造影剤が最初の治療剤投与の1〜7日後に対象に投与される、請求項21に記載の方法。

請求項23

造影剤が最初の治療剤投与前および最初の治療剤投与の1〜7日後に対象に投与される、請求項10〜22の何れかに記載の方法。

請求項24

抗ヒトPD−L1アドネクチンがフィブロネクチンIII型第10ドメイン(10Fn3)を含み、ここで、(a)10Fn3ドメインがAB、BC、CD、DE、EFおよびFGループを含み、(b)該10Fn3が、ヒト10Fn3ドメインの対応するループの配列(配列番号1)と比較して改変されたアミノ酸配列を有するループBC、DEおよびFGから選択される少なくとも1つのループを有し、そして(c)そのポリペプチドがヒトPD−L1に特異的に結合する、請求項16〜23の何れかに記載の方法。

請求項25

ポリペプチドがヒトPD−L1に500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pMまたは100pMまたはそれ未満のKDで結合する、請求項24に記載の方法。

請求項26

ポリペプチドがヒトPD−L1に1nMまたはそれ未満のKDで結合する、請求項25に記載の方法。

請求項27

BC、DEおよびFGループが(a)それぞれ配列番号6、7および8;(b)それぞれ配列番号21、22および23;(c)それぞれ配列番号36、37および38;(d)それぞれ配列番号51、52および53;(e)それぞれ配列番号66、67および68;(f)それぞれ配列番号81、82および83;または(g)それぞれ配列番号97、98および99のアミノ酸配列を含む、請求項24〜26の何れかに記載の方法。

請求項28

ポリペプチドが配列番号5、20、35、50、65、80または96と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項24〜27の何れかに記載の方法。

請求項29

ポリペプチドが配列番号80と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項28に記載の方法。

請求項30

ポリペプチドが配列番号96と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項28に記載の方法。

請求項31

ポリペプチドが配列番号5、20、35、50、65、80または96の非BC、DEおよびFGループ領域と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項24〜30の何れかに記載の方法。

請求項32

ポリペプチドが配列番号9〜15、24〜30、39〜45、54〜60、69〜75、84〜91および100〜107からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項24〜30の何れかに記載の方法。

請求項33

ポリペプチドが配列番号9〜15、24〜30、39〜45、54〜60、69〜75、84〜91および100〜107からなる群から選択されるアミノ酸配列の非BC、DEおよびFGループ領域と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項24〜30および32の何れかに記載の方法。

請求項34

ポリペプチドが配列番号112〜121からなる群から選択されるN末端リーダーおよび/または配列番号122〜156からなる群から選択されるC末端テイルを含む、請求項24〜33の何れかに記載の方法。

請求項35

ポリペプチドがポリエチレングリコールおよびシアル酸からなる群から選択される1つまたはそれを超える薬物動態(PK)部分を含む、請求項24〜34の何れかに記載の方法。

請求項36

PK部分およびポリペプチドが少なくとも1つのジスルフィド結合ペプチド結合、ポリペプチド、重合糖またはポリエチレングリコール部分を介して結合される、請求項35に記載の方法。

請求項37

PK部分とポリペプチドが配列番号167〜216からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリンカーで結合される、請求項36に記載の方法。

請求項38

造影剤が18F放射標識補欠分子族および二機能性接合(BFC)部分を含み、該造影剤が次の構造を有し、ここで、18FがN原子に対してオルトであり、xが1〜8の整数であるかまたはその薬学的に許容される塩である、請求項1〜37の何れかに記載の方法。

請求項39

18F放射標識補欠分子族が次の構造を有する、請求項38に記載の方法。

請求項40

[O(CH2)2]x部分がピリジン環窒素に対して1−3配置で存在する、請求項38または39に記載の方法。

請求項41

[O(CH2)2]x部分がピリジン環の窒素に対して1−2配置で存在する、請求項38または39に記載の方法。

請求項42

[O(CH2)2]x部分がピリジン環の窒素に対して1−4配置で存在する、請求項38または39に記載の方法。

請求項43

18F放射標識補欠分子族が次の構造を有する、請求項38に記載の方法。

請求項44

xが2〜6の整数である、請求項38〜41の何れかに記載の方法。

請求項45

xが3〜5の整数である、請求項44に記載の方法。

請求項46

xが4である、請求項44に記載の方法。

請求項47

[O(CH2)2]x部分がピリジン環の窒素に対して1−3配置で存在する、請求項44〜46の何れかに記載の方法。

請求項48

ピリジン環がフッ素化反応を妨害しないさらに置換基を含む、請求項38〜47の何れかに記載の方法。

請求項49

ピリジン環の置換基がC1−6アルキルである、請求項48に記載の方法。

請求項50

置換基がメチルエチルまたはプロピルである、請求項49に記載の方法。

請求項51

ここで、18F放射標識補欠分子族が構造を有する、請求項38に記載の方法。

請求項52

造影剤が18F放射標識補欠分子族および二機能性接合(BFC)部分を有し、造影剤が次の構造を有し、ここで、“OPEG”が[O(CH2)2]xであり、xが1〜8の整数であるまたはその薬学的に許容される塩であり、ここで、“タンパク質”が請求項38〜51の何れかの造影剤に含まれるポリペプチドである、請求項38〜51の何れかに記載の方法。

請求項53

xが2〜6の整数であるかまたはその薬学的に許容される塩である、請求項52に記載の方法。

請求項54

xが3〜5の整数であるかまたはその薬学的に許容される塩である、請求項53に記載の方法。

請求項55

xが4であるかまたはその薬学的に許容される塩である、請求項54に記載の方法。

請求項56

BFCがタンパク質のアミンカルボキシルカルボニルまたはチオール官能基共有結合を形成する反応性基を含むシクロオクチンである、請求項38〜55の何れかに記載の方法。

請求項57

シクロオクチンがジベンゾシクロオクチン(DIBO)、ビアリールアザシクロオクチノン(BARAC)、ジメトキシアザシクロオクチン(DIMAC)およびジベンゾシクロオクチン(DBCO)からなる群から選択される、請求項56に記載の方法。

請求項58

シクロオクチンがDBCOである、請求項57に記載の方法。

請求項59

BFCがさらにポリエチレングリコール(PEG)yスペーサーアームを含み、ここで、yが1〜8の整数である、請求項38〜58の何れかに記載の方法。

請求項60

yが2〜6の整数である、請求項59に記載の方法。

請求項61

yが4または5である、請求項60に記載の方法。

請求項62

BFCがDBCO−PEG4−NHS−エステル、DBCO−スルホ−NHS−エステル、DBCO−PEG4−酸、DBCO−PEG4−アミンまたはDBCO−PEG4−マレイミドである、請求項59〜61の何れかに記載の方法。

請求項63

BFCがDBCO−PEG4−マレイミドである、請求項52〜62の何れかに記載の方法。

請求項64

造影剤が次の構造を有し、ここで、Xは配列番号13、28、43、58、73、88および104の何れかのアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項38に記載の方法。

請求項65

ポリペプチドが配列番号88に示すアミノ酸配列を含む、請求項64に記載の方法。

請求項66

ポリペプチドが配列番号104に示すアミノ酸配列を含む、請求項64に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2016年6月1日出願の米国仮出願62/344,258に基づく優先権を主張する。前記出願の内容を、引用により本明細書に包含させる。

背景技術

0002

背景
計画細胞死リガンド−1(PD−L1)は、活性化TおよびB細胞により発現され、免疫抑制仲介する重要な免疫チェックポイント受容体であるPD−1の表面糖タンパク質リガンドであり、抗原提示細胞およびヒト癌の両者で見られ、PD−1への結合によりT細胞活性化およびサイトカイン分泌下方制御する(Freeman et al., 2000; Latchman et al, 2001)。PD−L1/PD−1相互作用阻害は、前臨床モデルで強力な抗腫瘍活性を可能とし、この相互作用を妨害する抗体が、癌処置に関する治験に入っている(米国特許8,008,449および7,943,743;Brahmer et al., 2010; Topalian et al., 2012b; Brahmer et al., 2012; Flies et al., 2011; Pardoll, 2012; Hamid and Carvajal, 2013)。

0003

PETまたは陽電子放出断層撮影は、体内の種々の分子過程のまたは疾患病理に関連するタンパク質の位置の三次元画像を取得する非侵襲的核医学技術である。この方法は、体内に導入された生物学的活性分子ポジトロン放出放射性核種(トレーサー)により間接的に放出されるガンマ線の対を検出する。PET造影ツールは、医薬品開発で広範な用途を有し、同じツールが前臨床および臨床の両段階で使用し得るという、特有トランスレーシナル医療上の利点を有する。その例は、インビボ標的の飽和化;毒性または患者間変動予測のための、正常組織取り込み追跡;罹病組織の定量化腫瘍転移;経時的薬効または経時的耐性追跡などの直接的可視化を含む。

0004

本明細書で説明するのは、例えば、陽電子放出断層撮影において、診断造影剤としての使用に適する新規抗PD−L1アドネクチンである。

0005

概要
本発明は、少なくとも一部、例えば、陽電子放出断層撮影において、診断/造影剤として有用である新規抗ヒトPD−L1アドネクチンおよびその対象への投与方法発見に基づく。これらの薬剤は、例えば、PD−L1発現細胞と非PD−L1発現細胞、例えば、腫瘍細胞または腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)の区別およびPD−L1発現組織と非PD−L1発現組織、例えば、癌組織の区別に有用である。

0006

ある態様において、ここに提供されるのは、フィブロネクチンIII型第10ドメイン(10Fn3)を含むポリペプチドであり、ここで、(a)10Fn3ドメインはAB、BC、CD、DE、EFおよびFGループを含み、(b)該10Fn3は、ヒト10Fn3ドメイン(配列番号1)の対応するループの配列と比較して改変されたアミノ酸配列を有するループBC、DEおよびFGから選択される少なくとも1つのループを有し、そして(c)該ポリペプチドはPD−L1に特異的に結合する。ある実施態様において、このポリペプチドはPD−L1に500mMまたはそれ未満、例えば、100mMまたはそれ未満のKDで結合する。

0007

ある実施態様において、10Fn3ドメインは、次のアミノ酸配列からなるBC、DEおよびFGループを含む。
(1)それぞれ配列番号6、7および8;
(2)それぞれ配列番号21、22および23;
(3)それぞれ配列番号36、37および38;
(4)それぞれ配列番号51、52および53;
(5)それぞれ配列番号66、67および68;
(6)それぞれ配列番号81、82および83;
(7)それぞれ配列番号97、98および99;
(8)それぞれ配列番号113、114および115;
(9)それぞれ配列番号124、125および126;
(10)それぞれ配列番号135、136および137;
(11)それぞれ配列番号146、147および148;
(12)それぞれ配列番号157、158および159;
(13)それぞれ配列番号168、169および170;
(14)それぞれ配列番号179、180および181;
(15)それぞれ配列番号190、191および192;
(16)それぞれ配列番号201、202および203;
(17)それぞれ配列番号212、213および214;
(18)それぞれ配列番号223、224および225;
(19)それぞれ配列番号234、235および236;
(20)それぞれ配列番号245、246および247;
(21)それぞれ配列番号256、257および258;
(22)それぞれ配列番号267、268および269;
(23)それぞれ配列番号278、279および280;
(24)それぞれ配列番号289、290および291;
(25)それぞれ配列番号300、301および302;
(26)それぞれ配列番号311、312および313;
(27)それぞれ配列番号322、323および324;
(28)それぞれ配列番号333、334および335;
(29)それぞれ配列番号344、345および346;
(30)それぞれ配列番号355、356および357;
(31)それぞれ配列番号366、367および368;
(32)それぞれ配列番号377、378および379;
(33)それぞれ配列番号388、389および390;
(34)それぞれ配列番号399、400および401;
(35)それぞれ配列番号410、411および412;
(36)それぞれ配列番号421、422および423;
(37)それぞれ配列番号432、433および434;
(38)それぞれ配列番号443、444および445;
(39)それぞれ配列番号454、455および456;
(40)それぞれ配列番号465、466および467;
(41)それぞれ配列番号476、477および478;
(42)それぞれ配列番号487、488および489;
(43)それぞれ配列番号498、499および500;
(44)それぞれ配列番号509、510および511;
(45)それぞれ配列番号520、521および522;
(46)それぞれ配列番号531、530および531;
(47)それぞれ配列番号542、543および544;
(48)それぞれ配列番号553、554および555;または
(49)それぞれ配列番号564、565および566。

0008

ある実施態様において、ポリペプチドは、表3に示す配列、例えば、配列番号5、20、35、50、65、80,96、112、123、134、145、156、167、178、189、200、211、222、233、244、255、266、277、288、299、310、321、332、343、354、365、376、387、398、409、420、431、442、453、464、475、486、497、508、519、530、541、552および563の何れかと少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ポリペプチドは、配列番号5、20、35、50、65、80、96、112、123、134、145、156、167、178、189、200、211、222、233、244、255、266、277、288、299、310、321、332、343、354、365、376、387、398、409、420、431、442、453、464、475、486、497、508、519、530、541、552または563の非BC、DEおよびFGループ領域と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ポリペプチドは、配列番号9〜15、24〜30、39〜45、54〜60、69〜75、84〜91、100〜107、116〜122、127〜133、138〜144、150〜155、160〜166、171〜177、182〜188、193〜199、204〜210、215〜221、227〜232、237〜243、248〜254、259〜265、271〜276、291〜287、292〜298、303〜309、314〜320、325〜331、337〜342、347〜353、358〜364、369〜375、380〜386、391〜397、402〜408、413〜419、424〜430、435〜441、446〜452、457〜463、468〜474、479〜485、490〜496、501〜507、512〜518、523〜529、534〜540、545〜551および556〜562からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ポリペプチドは、配列番号9〜15、24〜30、39〜45、54〜60、69〜75、84〜91、100〜107、116〜122、127〜133、138〜144、150〜155、160〜166、171〜177、182〜188、193〜199、204〜210、215〜221、227〜232、237〜243、248〜254、259〜265、271〜276、291〜287、292〜298、303〜309、314〜320、325〜331、337〜342、347〜353、358〜364、369〜375、380〜386、391〜397、402〜408、413〜419、424〜430、435〜441、446〜452、457〜463、468〜474、479〜485、490〜496、501〜507、512〜518、523〜529、534〜540、545〜551および556〜562からなる群から選択されるアミノ酸配列の非BC、DEおよびFGループ領域と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。

0009

ある実施態様において、ポリペプチドは配列番号574〜583からなる群から選択されるN末端リーダーおよび/または配列番号584〜618からなる群から選択されるC末端テイルまたはPmCnを含み、ここで、Pはプロリンであり、mは少なくとも0である整数(例えば、0、1または2)であり、nは少なくとも1である整数(例えば、1または2)である。

0010

ある実施態様において、ポリペプチドは、ポリエチレングリコールシアル酸、Fc、Fcフラグメントトランスフェリン血清アルブミン血清アルブミン結合タンパク質および血清免疫グロブリン結合タンパク質からなる群から選択される1以上の薬物動態(PK)部分を含む。ある実施態様において、PK部分とポリペプチドは、少なくとも1つのジスルフィド結合ペプチド結合、ポリペプチド、重合糖またはポリエチレングリコール部分を介して結合される。ある実施態様において、PK部分とポリペプチドは、配列番号629〜678からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するリンカーを介して結合される。

0011

ここに提供されるのは、ここに記載する、ポリペプチドをコードする核酸、ならびに核酸を含むベクターおよび細胞である。ある実施態様において、核酸は、配列番号16〜19、31〜34、46〜49、61〜64、76〜79、92〜95および108〜111からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

0012

ここに提供されるのは、ここに記載するポリペプチドおよび担体を含む組成物である。例えば、ここに記載する組成物は、配列番号5、9〜15、20、24〜30、35、39〜45、50、54〜60、65、69〜75、80、84〜91、96、100〜107、112、116〜122、123、127〜133、134、138〜144、145、150〜155、156、160〜166、167、171〜177、178、182〜188、189、193〜199、200、204〜210、211、215〜221、222、227〜232、233、237〜243、244、248〜254、255、259〜265、266、271〜276、277、291〜287、288、292〜298、299、303〜309、310、314〜320、321、325〜331、332、337〜342、343、347〜353、354、358〜364、365、369〜375、376、380〜386、387、391〜397、398、402〜408、409、413〜419、420、424〜430、431、435〜441、442、446〜452、453、457〜463、464、468〜474、475、479〜485、486、490〜496、497、501〜507、508、512〜518、519、523〜529、530、534〜540、541、545〜551、552および556〜562からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび担体を含む。

0013

ここに提供されるのは、ここに記載するポリペプチドを含む造影剤である。ある実施態様において、造影剤は、配列番号5、9〜15、20、24〜30、35、39〜45、50、54〜60、65、69〜75、80、84〜91、96、100〜107、112、116〜122、123、127〜133、134、138〜144、145、150〜155、156、160〜166、167、171〜177、178、182〜188、189、193〜199、200、204〜210、211、215〜221、222、227〜232、233、237〜243、244、248〜254、255、259〜265、266、271〜276、277、291〜287、288、292〜298、299、303〜309、310、314〜320、321、325〜331、332、337〜342、343、347〜353、354、358〜364、365、369〜375、376、380〜386、387、391〜397、398、402〜408、409、413〜419、420、424〜430、431、435〜441、442、446〜452、453、457〜463、464、468〜474、475、479〜485、486、490〜496、497、501〜507、508、512〜518、519、523〜529、530、534〜540、541、545〜551、552および556〜562からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

0014

ある実施態様において、造影剤は、検出可能標識を含む。ある実施態様において、造影剤は、ここに記載するポリペプチド、キレート剤および検出可能標識を含む。ある実施態様において、造影剤はここに記載するポリペプチド、二機能性キレーターまたは接合(BFC)部分および検出可能標識を含む。ある実施態様において、検出可能標識は、放射性核種を含む補欠分子族である。ある実施態様において、検出可能標識は、陽電子放出断層撮影により検出可能である。

0015

ある実施態様において、キレート剤および/または二機能性キレーターまたは接合(BFC)部分は、DFO、DOTA、CB−DO2A、3p−C−DEPA、TCMC、DBCO、DIBO、BARAC、DIMAC、Oxo−DO3A、TE2A、CB−TE2A、CB−TE1A1P、CB−TE2P、MM−TE2A、DM−TE2A、diamsar、NODASA、NODAGA、NOTA、NETA、TACN−TM、DTPA、1B4M−DTPA、CHX−A’’−DTPA、TRAP、NOPO、AAZTA、DATA、H2dedpa、H4octapa、H2azapa、H5decapa、H6phospa、HBED、SHBED、BPCA、CP256、PCTA、HEHA、PEPA、EDTA、TETAおよびTRITAからなる群から選択される。

0016

ある実施態様において、検出可能標識は、放射性核種、例えば、64Cu、124I、76/77Br、86Y、89Zr、68Ga、18F、11C、125I、124I、131I、123I、131I、123I、32Cl、33Cl、34Cl、68Ga、74Br、75Br、76Br、77Br、78Br、89Zr、186Re、188Re、90Y、177Lu、99Tcまたは153Smである。

0017

ある実施態様において、キレート剤はNODAGAであり、放射性核種は64Cuである。ある実施態様において、造影剤は抗PD−L1ポリペプチド(例えば、ここに記載する抗PD−L1アドネクチン、例えば、配列番号80または96に示すアミノ酸配列を含む抗PD−L1アドネクチン)、キレート剤NODAGAおよび放射性核種64Cuを含む。

0018

ある実施態様において、造影剤は、抗PD−L1ポリペプチド(例えば、ここに記載する抗PD−L1アドネクチン、例えば、配列番号80または96に示すアミノ酸配列を含む抗PD−L1アドネクチン)、二機能性キレーターまたは接合(BFC)部分および放射性核種18Fを含む補欠分子族を含む。ある実施態様において、造影剤は、次の構造



を有するかまたはその薬学的に許容される塩である。

0019

ある実施態様において、造影剤は、次の構造



を有する。

0020

ある実施態様において、BFCは、タンパク質のアミンカルボキシルカルボニルまたはチオール官能基共有結合を形成する反応性基を含むシクロオクチンである。ある実施態様において、シクロオクチンは、ジベンゾシクロオクチン(DIBO)、ビアリールアザシクロオクチノン(BARAC)、ジメトキシアザシクロオクチン(DIMAC)およびジベンゾシクロオクチン(DBCO)からなる群から選択される。ある実施態様において、シクロオクチンはDBCOである。

0021

ある実施態様において、BFCはDBCO−PEG4−NHS−エステル、DBCO−スルホ−NHS−エステル、DBCO−PEG4−酸、DBCO−PEG4−アミンまたはDBCO−PEG4−マレイミドである。ある実施態様において、BFCはDBCO−PEG4−マレイミドである。

0022

ある実施態様において、造影剤は次の構造を有する。



ここで、Xは配列番号13、28、43、58、73、88、104、120、131、142、153、164、175、186、197、208、219、230、241、252、263、274、285、296、307、318、329、340、351、362、373、384、395、406、417、428、439、450、461、472、483、494、505、516、527、538、549、560および571の何れかのアミノ酸配列を含むポリペプチドである。ある実施態様において、ポリペプチドは、配列番号88に示すアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ポリペプチドは、配列番号104に示すアミノ酸配列を含む。

0023

ここに提供されるのは、ここに記載する抗PD−L1アドネクチン組成物および/または造影剤および使用指示を含むキットである。

0024

ここに提供されるのは、サンプルにおけるPD−L1を検出する方法であって、方法は、サンプルと抗PD−L1アドネクチンを接触させ、PD−L1を検出することを含む。

0025

ここに提供されるのは、対象に抗PD−L1アドネクチンを含む造影剤を投与し、造影剤を検出することを含み、検出された造影剤が対象におけるPD−L1陽性細胞の位置を規定する、対象におけるPD−L1陽性細胞を検出する方法である。

0026

ここに提供されるのは、対象に抗PD−L1アドネクチンを含む造影剤を投与し、造影剤を検出することを含み、検出された造影剤が対象における腫瘍の位置を規定する、対象におけるPD−L1発現腫瘍を検出する方法である。ある実施態様において、造影剤は陽電子放出断層撮影により検出される。

0027

ここに提供されるのは、抗PD−L1アドネクチンを含む造影剤の画像を得る方法であって、
a)対象に造影剤を投与し;そして
b)陽電子放出断層撮影により造影剤の分布をインビボで造影する
ことを含む、方法である。

0028

ここに提供されるのは、PD−L1を発現する組織または細胞の定量的画像を得る方法てあって、方法は、細胞または組織と抗PD−L1アドネクチンを含む造影剤を接触させ、陽電子放出断層撮影を使用してPD−L1発現組織を検出または定量することを含む。

0029

ここに提供されるのは、造影有効量の抗PD−L1アドネクチンを含む造影剤をPD−L1発現腫瘍を有する対象に投与し、該造影剤の腫瘍における放射線放出を陽電子放出断層撮影を使用して検出することを含む、PD−L1発現腫瘍を検出する方法であって、ここで、放射線放出が腫瘍において検出される。

0030

ここに提供されるのは、対象におけるPD−L1発現腫瘍の存在を診断する方法であって、方法は、
(a)それを必要とする対象に抗PD−L1アドネクチンを含む造影剤を投与し;そして
(b)造影剤の存在または非存在を検出するために、対象の少なくとも一部の放射線画像を得る;
ことを含み、ここで、背景を超える造影剤の存在および位置が、対象におけるPD−L1発現腫瘍の存在および位置の指標である。

0031

ここに提供されるのは、癌を有する対象を処置する方法であって、
(a)それを必要とする対象に抗PD−L1アドネクチンを含む造影剤を投与し、そして1っ以上の腫瘍におけるPD−L1の存在を決定するために対象の少なくとも一部の画像を得て;そして、PD−L1が1っ以上の腫瘍で検出されたならば、
(b)対象に抗腫瘍治療、例えば、PD−1とPD−L1の相互作用を阻害する薬剤(PD−1またはPD−L1アンタゴニスト)を投与する
ことを含む、方法である。

0032

ここに提供されるのは、対象におけるPD−L1発現腫瘍に対する抗腫瘍治療の進行をモニタリングする方法であって、
(a)それを必要とする対象に、第一の時点で抗PD−L1アドネクチンを含む造影剤を投与し、腫瘍のサイズを決定するために対象の少なくとも一部の画像を得て;
(b)対象に抗腫瘍治療剤を投与し;
(c)対象に造影剤をその後1以上の時点で投与し、各時点で対象の少なくとも一部の画像を得ることを含み;ここで、各時点の腫瘍の寸法および位置が、疾患進行の指標である、
方法である。

図面の簡単な説明

0033

ここに記載する例示抗PD−L1アドネクチンのコアアミノ酸配列の模式図である。BC、DEおよびFGループに下線を付す。野生型(WT)(配列番号2)、ATI−968(配列番号5)、ATI−964(配列番号20)、ATI−967(配列番号65)、A02(配列番号80)、E01(配列番号96)、ATI−965(配列番号35)およびATI−966(配列番号50)。

0034

[18F]−E01−4PEG−DBCO−FPEGA化学合成の模式図である。分子のE01部分は、配列番号104に示す配列を有する。

0035

は、64Cu−E01抗PD−L1アドネクチン(NODAGAキレーター有り)でのhPD−L1陽性L2987細胞とhPD−L1陰性HT−29細胞の鑑別を示すグラフである。特異性は、過剰の冷(非標識)E01アドネクチンと共インキュベートしたときの細胞関連64Cu−E01の減少により確認した。

0036

NODAGA−64Cu標識A02抗PD−L1アドネクチンでの両側性異種移植マウスにおけるhPD−L1(+)とhPD−L1(−)腫瘍の鑑別を示すPET画像である。プローブ滞留面積を示す積算0〜2時間画像を示す。明るい領域は暴露中最大占拠の組織である。

0037

hPD−L1(+)[L2987]腫瘍における腫瘍標識の時間経過を示すグラフである。hPD−L1(−)[HT29]腫瘍およびhPD−L1(+)系[L2987遮断]におけるパルスチェイス実験は、標識の特異性を示す。

0038

ガンマカウンターによりエクスビボで測定した両側性hPD−L1(+)L2987およびhPD−L1(−)HT−29異種移植変担持マウスにおける18F標識A02抗PD−L1アドネクチン放射性トレーサー組織分布を示すグラフである。

0039

カニクイザルにおける18F標識E01抗PD−L1アドネクチン分布の多層画像である。

0040

記載する濃度の冷A02アドネクチンと共インキュベートした0.25nM 18F−DBCO−A02抗PD−L1アドネクチンで標識した異種移植およびヒト肺組織インビトロオートラジオグラフィーを示す画像である。

0041

hPD−L1の腫瘍発現を示すために抗PD−L1アドネクチンで標識した異種移植およびヒト肺腫瘍検体免疫組織化学画像を示す。

0042

[18F]−A02−4PEG−DBCO−FPPEGA合成の反応スキームを示す。同じ反応スキームを使用して、E01アドネクチンを標識した。

0043

[18F]−FPPEGAの自動化合成のためのGE TRACERlab FX2 N合成モジュールの模式図である。

0044

[18F]−FPPEGAの自動化合成のためのSynthera合成モジュール(IBA)の模式図である。

0045

抗PD−L1アドネクチンの例示的競合曲線を記載する。

0046

詳細な記載
定義
異なる定義がされない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、一般に当業者により理解されるのと同じ意味を有する。ここに記載するものに類するまたは等価なあらゆる方法および組成物を、本発明の実施または試験に使用できるが、好ましい方法および組成物は、ここに記載される。

0047

“計画細胞死リガンド−1(PD−L1)”は、PD−1への結合によりT細胞活性化およびサイトカイン分泌を下方制御する、PD−1の2つの細胞表面糖タンパク質リガンドの一方である(他方はPD−L2)。ここで使用する用語“PD−L1”は、ヒトPD−L1(hPD−Ll)、hPD−Llのバリアントアイソフォームおよび種ホモログおよびhPD−Llと少なくとも1つの共通エピトープを有するアナログを含む。完全hPD−Ll配列は、GenBankAccession No. Q9NZQ7下に見られる。PD−L1はCD274、B7−H、B7H1、PDCD1L1およびPDCD1LG1とも称される。

0048

ここで使用する“ポリペプチド”は、長さ、翻訳後修飾または機能に関わらず、2以上のアミノ酸のあらゆる配列をいう。ポリペプチドは、天然アミノ酸および米国特許6,559,126(引用により本明細書に包含させる)に記載のものなどの非天然アミノ酸を含み得る。ポリペプチドはまた種々の標準化学方法で修飾もされ得る(例えば、アミノ酸を保護基で修飾でき;カルボキシ末端アミノ酸末端アミド基に修飾でき;アミノ末端残基を、例えば、親油性を増加するために修飾でき;またはポリペプチドを化学的グリコシル化または他に修飾して、安定性またはインビボ半減期延長し得る)。ポリペプチド修飾は、環状化合物または他の分子ポリペプチドなどの他の構造の結合を含み、立体配置が変えられた(すなわち、RまたはS;または、LまたはD)1以上のアミノ酸を含むポリペプチドも含む。ここに記載するペプチドは、フィブロネクチンIII型第10ドメイン由来のタンパク質であり、これは、ヒトPD−L1に特異的に結合し、ここで、“抗PD−L1アドネクチン”または“PD−L1アドネクチン”と称する。

0049

ここで使用する“ポリペプチド鎖”は、そのドメインの各々が、他のドメインと非共有結合相互作用またはジスルフィド結合ではなく、ペプチド結合により結合される、ポリペプチドをいう。

0050

“単離”ポリペプチドは、その天然環境の成分から同定、分離および/または取得されたものである。その天然環境の夾雑成分は、該ポリペプチドの診断または治療使用を妨害する物質であり、酵素ホルモンおよび他のタンパク質的または非タンパク質溶質であり得る。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(1)ローリー法で測定して、95重量%を超える、最も好ましく99重量%を超えるポリペプチドまで、(2)スピニングカップシークエネーターの使用により少なくともN末端または内部アミノ酸配列の残基を得るのに十分な程度までまたは(3)クマブルーまたは、好ましくは、銀染色を使用して、還元または非還元条件下のSDS−PAGEにより均一まで精製される。単離ポリペプチドは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも1成分が存在しないため、組み換え細胞内の生体内でのポリペプチドを含む。しかしながら、単離ポリペプチドは、通常、少なくとも1精製工程により調製される。

0051

ここで使用する10Fn3ドメインの“領域”は、ヒト10Fn3ドメインのループ(AB、BC、CD、DE、EFおよびFG)、β鎖(A、B、C、D、E、FおよびG)、N末端(配列番号1のアミノ酸残基1〜7に対応)またはC末端(配列番号1のアミノ酸残基93〜94に対応)の何れかをいう。

0052

足場領域”は、ヒト10Fn3ドメインの非ループ領域の何れかをいう。足場領域は、A、B、C、D、E、FおよびGβ鎖ならびにN末端領域(配列番号1の残基1〜7に対応するアミノ酸)およびC末端領域(配列番号1の残基93〜94に対応するアミノ酸および所望によりヒトフィブロネクチンにおけるFn3ドメインの第10と第11間の反復天然リンカーを構成する7アミノ酸を含む)を含む。

0053

ここでの“パーセント(%)アミノ酸配列同一性”は、配列を整列させ、最大パーセント配列同一性を達成するために、必要であれば、ギャップを挿入した後の、配列同一性の一部として保存的置換を何ら考慮せず、選択配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして決定される。パーセントアミノ酸配列同一性決定の目的でのアラインメントは当分野の技術の範囲内である種々の方法により、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2またはMegalign(DNASTARTM)ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、達成できる。当業者は、比較する配列の完全長にわたり最大アラインメントを達成するための何らかのアルゴリズムを含む、アラインメント測定のための適切なパラメータを容易に決定できる。例えば、あるアミノ酸配列Aとあるアミノ酸配列Bについての、それとのまたはそれに対する%アミノ酸配列同一性(これは、あるアミノ酸配列Bについての、それとのまたはそれに対する%アミノ酸配列同一性を有するまたは含むあるアミノ酸配列Aと言い換えることができる)は、次のとおり計算される:100×分数X/Y(式中、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN−2において、そのプログラムのAおよびBのアラインメントにより同一マッチとして点数化されたアミノ酸残基数であり、YはBの総アミノ酸基数である)。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくないならば、A対Bの%アミノ酸配列同一性は、B対Aの%アミノ酸配列同一性と同一でないことが理解される。

0054

ここで使用する用語“アドネクチン結合部位”は、特定のアドネクチンと相互作用または結合するタンパク質(例えば、PD−L1)の部位または部分をいう。アドネクチン結合部位は、隣接アミノ酸またはタンパク質の三次元折りたたみにより並置される非隣接アミノ酸から形成され得る。隣接アミノ酸により形成されるアドネクチン結合部位は、一般に変性溶媒暴露に際して保持されるが、一方三次元折りたたみにより形成されたアドネクチン結合部位は、一般に変性溶媒処理により喪失する。

0055

ここに記載する抗PD−L1アドネクチンのアドネクチン結合部位は、プロテアーゼマッピングおよび変異解析を含むが、これらに限定されない、抗体のエピトープマッピングに一般に使用される標準的技法の適用により決定され得る。あるいは、アドネクチン結合部位を、同一ポリペプチド、例えば、PD−L1に結合する対照アドネクチンまたは抗体を使用する競合アッセイにより決定できる(下記“交差競合アドネクチンおよび/または同一アドネクチン結合部位に結合するアドネクチン”なる表題の章でさらに説明される)。試験アドネクチンおよび対照分子(例えば、他のアドネクチンまたは抗体)が競合するならば、それらは同一アドネクチン結合部位または一方の分子の結合が他方により妨害されるのに十分に近位のアドネクチン結合部位に結合する。アドネクチン結合部位は、それを同定するために使用する方法により定義される。例えば、アドネクチンは、HDXにより決定される、ある結合部位に結合し得る;アドネクチンは、結晶学により決定される、ある結合部位に結合し得る;またはアドネクチンは、定方向変異解析により決定したある結合部位に結合し得る。

0056

ここでPD−L1へのアドネクチン結合に関連して相互交換可能に使用する用語“特異的に結合する”、“特異的結合”、“選択的結合”および“選択的に結合する”は、スキャッチャード分析および/または競合的結合アッセイ(例えば、競合ELISA、BIACOREアッセイ)を含むが、これらに限定されない当分野で利用可能な技法により測定して、PD−L1に親和性を示すが、異なるポリペプチドには顕著に結合しない(例えば、約10%未満の結合)アドネクチンをいう。本用語はまた例えば、ここに記載するアドネクチンの結合ドメインがPD−L1に特異的であるときも適用可能である。

0057

PD−L1へのアドネクチン結合に関連して使用する用語“優先的に結合する”は、スキャッチャード分析および/または競合的結合アッセイ(例えば、競合ELISA、BIACOREアッセイ)を含むが、これらに限定されない当分野で利用可能な技法により測定して、ここに記載するアドネクチンがPD−L1に異なるポリペプチドより少なくとも約20%多く結合する状況をいう。

0058

アドネクチンに関連してここで使用する、用語“交差反応性”は、同一または極めて類似するアドネクチン結合部位を有する1を超える異なるタンパク質に結合する、アドネクチンをいう。

0059

PD−L1へのアドネクチン結合に関連して使用する用語“KD”は、表面プラズモン共鳴アッセイまたは細胞結合アッセイを使用して測定して、特定のアドネクチン−タンパク質(例えば、PD−L1)相互作用またはアドネクチンのタンパク質(例えば、PD−L1)への親和性の解離平衡定数をいう。ここで使用する“所望のKD”は、意図する目的に十分であるアドネクチンのKDをいう。例えば、所望のKDは、インビトロアッセイ、例えば、細胞ベースルシフェラーゼアッセイにおいて、機能的効果を発揮するのに必要なアドネクチンのKDをいう。

0060

タンパク質のアドネクチン結合に関連してここで使用する用語“ka”は、アドネクチンのアドネクチン/タンパク質複合体への会合についての会合速度定数をいうことを意図する。

0061

タンパク質のアドネクチン結合に関連してここで使用する用語“kd”は、アドネクチン/タンパク質複合体からのアドネクチンの解離についての解離速度定数をいうことを意図する。

0062

アドネクチンに関連してここで使用する用語“IC50”は、インビトロまたはインビボアッセイの何れかで、最大阻害応答の50%であるレベルまで、すなわち、最大阻害応答と未処置応答の半分まで応答を阻害するアドネクチンの濃度をいう。

0063

用語“PK”は、“薬物動態(pharmacokinetic)”の頭字語であり、例として、対象による吸収、分布、代謝および排せつを含む、化合物性質を包含する。ここで使用する“PK調節タンパク質”または“PK部分(moiety)”は、生物学的活性分子に融合したときまたはそれと共に投与したとき、該生物学的活性分子の薬物動態性質に影響するあらゆるタンパク質、ペプチドまたは部分をいう。PK調節タンパク質またはPK部分の例は、PEG、ヒト血清アルブミン(HSA)結合剤(米国公報2005/0287153および2007/0003549、PCT公報WO2009/083804およびWO2009/133208に開示のとおり)、ヒト血清アルブミンおよびそのバリアント、トランスフェリンおよびそのバリアント、FcまたはFcフラグメントおよびそのバリアントおよび糖(例えば、シアル酸)を含む。

0064

タンパク質または化合物の“血清半減期”は、例えば、天然機構による配列または化合物の分解および/または配列または化合物のクリアランスまたは隔離による、インビボでの、ポリペプチドの血清濃度が50%減少するまでにかかる時間である。半減期は、薬物動態分析などの、それ自体知られる任意の方法で決定され得る。適当な技法は当業者に明らかであり、例えば一般に対象に適当な用量のここに記載するアミノ酸配列または化合物を投与し、対象から一定間隔で血液サンプルまたは他のサンプルを得て、該血液サンプルにおけるここに記載するアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度を決定し、そして、こうして得たデータ(のプロット)から、ここに記載するアミノ酸配列または化合物のレベルまたは濃度が、投与の初期レベルと比較して50%まで減少する時間を計算することを含む。例えば、Kenneth, A. et al., Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters et al., Pharmacokinete Analysis: A Practical Approach (1996)などの標準的ハンドブックを参照のこと。Gibaldi, M. et al., Pharmacokinetics, 2nd Rev. Edition, Marcel Dekker (1982)もまた参照のこと。

0065

半減期は、t1/2−アルファ、t1/2−ベータ、HL_ラムダ_zおよび曲線下面積(AUC)などのパラメータを使用して表し得る。

0066

用語“検出可能”は、背景シグナルを超えてシグナルを検出する能力をいう。用語“検出可能シグナル”は、陽電子放出断層撮影(PET)などの、しかし、これに限定されない非侵襲性造影技法由来のシグナルである。検出可能シグナルは、検出可能であり、対象から生じ得る他の背景シグナルと区別可能である。換言すると、検出可能シグナルと背景との間に測定可能かつ統計的有意差がある(例えば、統計的有意差は、検出可能シグナルと背景の間の約0.1%、1%、3%、5%、10%、15%、20%、25%、30%または40%またはそれ以上の差などの検出可能シグナルと背景の区別に十分な差異である)。標準および/または検量曲線を使用して、検出可能シグナルおよび/または背景の相対強度を決定し得る。

0067

ここに記載する造影剤を含む組成物の“検出可能有効量”は、臨床使用で利用可能な装置を使用して、許容される画像を作成するのに十分な量として定義する。ここに提供する造影剤の検出可能有効量を、1回を超える注射で投与し得る。検出可能有効量は、個体の感受性の程度、個体の年齢性別および体重、個体の特異な応答などの因子により変わり得る。造影組成物の検出可能有効量は、また使用する装置および方法によっても変わり得る。このような因子の最適化は、十分に当分野の技術レベルの範囲内である。ある実施態様において、PD−L1造影剤、例えば、ここに記載するものは、2またはそれ以上、例えば、3、4、5またはそれ以上の識別係数(すなわち、特異的シグナル対背景シグナル)を有する。

0068

用語“生体直交型化学”は、天然生化学的過程を妨害せずに、生存系内で生じ得るあらゆる化学反応をいう。本用語は、水中でまたは水の存在下、インビトロで生理学的pHで生じる化学反応である化学反応を含む。生体直交型と見なされるには、反応は選択的であり、出発化合物で見られる他の官能基との副反応を回避する。さらに、これら反応パートナー間の得られた共有結合は、強く、生物学的反応に化学的に不活性でなければならず、所望の分子の生物学的活性に影響してはならない。

0069

用語“クリック化学”は、新規化合物およびコンビナトリアルライブラリの迅速な合成のための一連信頼でき、かつ選択的な生体直交型反応をいう。クリック反応の性質は、生理学的条件下で安定な化合物を産生するための、モジュール性、範囲の広さ、高い収率立体特異性および単純生成物単離(非クロマトグラフ法による不活性副産物からの分離)を含む。放射化学および放射薬品において、クリック化学は、選択的およびモジュラー構成要素を利用し、触媒なしで、生物学的に関連する化合物への放射標識化学選択的結合を可能とする、一連の標識反応についての一般的用語である。“クリック反応”は銅を用いてよくまたは無銅クリック反応であり得る。

0070

用語“補欠分子族”または“二機能性標識剤”は、ペプチドまたはタンパク質に結合され得る、放射性核種(例えば、18F)を含む小有機分子をいう。

0071

放射性医薬品化学に関連してここで使用する用語“キレーターリガンド”は、放射標識補欠分子族を生物活性ターゲティング分子(例えば、ペプチドまたはタンパク質)に共有結合により結合する、二機能性キレーターまたは接合(BFC)部分(これらは、ここで相互交換可能に使用する)をいう。BFCは、アミドカップリングについてはカルボン酸または活性化エステルチオ尿素カップリングについてはイソチオシアネートおよびチオールカップリングについてはマレイミドなどの官能基を使用する。

0072

ここで相互交換可能に使用する用語“個体”、“対象”および“患者”は、ヒトをいう。

0073

“癌”は、体内の非制御の異常細胞増殖により特徴付けられる、種々の疾患の広い一群をいう。非制御の細胞分裂および増殖分裂および増殖は、隣接組織侵襲し、リンパ系または血流をとおって体の離れた場所に転移もし得る、悪性腫瘍の形成をもたらす。

0074

免疫応答”は、脊椎動物体内で、侵入病原体、病原体に感染された細胞もしくは組織、癌細胞もしくは他の異常細胞、またのは、自己免疫もしくは病的炎症の場合、正常ヒト細胞または組織の選択的ターゲティング、結合、損傷、破壊および/または排出をもたらす、細胞または肝臓(Ab、サイトカインおよび補体を含む)の何れかにより産生される、免疫系細胞(例えば、Tリンパ球Bリンパ球ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージ好酸球肥満細胞樹状細胞および好中球)および可溶性巨大分子の作用をいう。

0075

免疫調節因子”は、免疫応答を制御する物質、薬剤、シグナル伝達経路またはその成分をいう。免疫応答の“制御”、“修飾”または“調節”は、免疫系の細胞またはそのような細胞の活性の何らかの変化をいう。このような制御は、種々の細胞型の数の増加または減少、これらの細胞の活性の向上または低下または免疫系内で生じ得る他の何らかの変化により顕在化し得る、免疫系の刺激または抑制を含む。阻害性および刺激性両方の免疫調節因子が同定されており、そのいくつかは、癌微小環境で機能が増強され得る。

0076

用語“免疫療法”は、免疫応答の誘発、増強、抑制または他の修飾を含む方法による、疾患を有する、発症するもしくは再発するリスクにある対象の処置をいう。

0077

対象の“処置”または“治療”は、疾患と関連する症状、合併症、状態もしくは生化学的徴候の発症、進行、発生、重症度もしくは再発の回復、軽減、寛解、阻止、遅延もしくは阻止を目的とする、対象へのあらゆるタイプの介入または実施される過程または活性剤の投与をいう。

0078

抗PD−L1アドネクチンと関連してここで使用する“投与”または“投与する”は、ここに記載するPD−L1アドネクチンまたはPD−L1アドネクチンベースのプローブまたは標識プローブ(ここでは“造影剤”とも称する)の対象への導入をいう。あらゆる投与経路が適当であり、例えば、静脈内、経口、局所、皮下、腹腔動脈内、吸入直腸鼻腔脳脊髄液への導入または体区画への注入が使用され得る。

0079

用語“治療有効量”は、対象に治療的利益を与えるのに必要である、薬剤の少なくとも最小用量であるが、毒性用量未満をいう。

0080

ここで使用する“有効量”は、所望の結果を達成するのに、必要な投与量および時間で、少なくとも有効である量をいう。

0081

ここで使用する“十分量”は、所望の結果の達成に十分である量をいう。

0082

ここで使用する“陽電子放出断層撮影”または“PET”は、トレーサーの体内位置の三次元画像を作成する、非侵襲性、核医学技術をいう。方法は、生物学的活性分子上に体内に導入されたポジトロン放出放射性核種(トレーサー)により間接的に放出されるガンマ線の対を検出する。PET造影ツールは、医薬品開発で広範な用途を有し、同じツールが前臨床および臨床の両方で使用し得るとの、特有のトランスレーショナル医療上の利点を有する。適用例は、標的のインビボ飽和の直接可視化;毒性または患者間変動予測のための、正常組織取り込みモニタリング;疾患組織定量;腫瘍転移;経時的薬物効果または経時的抵抗性モニタリングを含む。

0083

概要
ここに提供されるのは、ヒトPD−L1に結合し、放射標識などの異種分子にカップリングできる、ポリペプチドである。このようなポリペプチドは、例えば、診断アッセイのために、例えば、サンプルまたは組織、例えば、対象(例えば、PD−L1を選択的に発現する癌組織などの組織)における、PD−L1の検出に有用である。

0084

本発明は、患者のPD−L1発現の全身可視化を可能にする、非侵襲性臨床的造影剤の開発に基づく。ある実施態様において、患者の全身の一日“仮想生検”が、PD−L1発現レベルモニターおよび局在化のために実施される。ここに記載するPD−L1造影剤は、一日で高コントラスト全身仮想的生検を提供するために使用され得る。

0085

I.フィブロネクチンベースの足場
Fn3は、フィブロネクチンからのIII型ドメインをいう。Fn3ドメインは、小さく、単量体であり、可溶性であり、かつ安定である。ジスルフィド結合を欠き、それ故に、還元条件下安定である。Fn3は、全体的構造は免疫グロブリンフォールドに類する。Fn3ドメインは、N末端からC末端の順で、ベータまたはベータ様鎖、A;ループ、AB;ベータまたはベータ様鎖、B;ループ、BC;ベータまたはベータ様鎖、C;ループ、CD;ベータまたはベータ様鎖、D;ループ、DE;ベータまたはベータ様鎖、E;ループ、EF;ベータまたはベータ様鎖、F;ループ、FG;およびベータまたはベータ様鎖、Gを含む。7逆平行β鎖が2ベータシートとして配置され、これが安定なコアを形成し、同時にベータまたはベータ様鎖を接続するループからなる2“面”を作る。ループAB、CDおよびEFは一面に位置し(“南極”)、ループBC、DEおよびFGは逆面に位置する(“北極”)。少なくとも15の異なるFn3モジュールがヒトフィブロネクチンにあり、モジュール間の配列相同性は低いが、全て三次構造で高度の類似性共有する。

0086

ここに記載するのは、溶媒到達可能ループの1以上が無作為化または変異されている、Fn3ドメインを含む抗PD−L1アドネクチンである。ある実施態様において、Fn3ドメインは、ヒトフィブロネクチンIII型ドメインの野生型第10モジュール(10Fn3)由来のFn3ドメインである。



(配列番号1)(94アミノ酸;AB、CDおよびEFループは下線を付す;コア10Fn3ドメインはアミノ酸9(“E”)から始まり、アミノ酸94(“T”)で終わり、86アミノ酸ポリペプチドに対応する)。コア野生型ヒト10Fn3ドメインは、配列番号2に示す。

0087

バリアントおよび野生型両方の10Fn3タンパク質は、同一構造、すなわちA〜Gと指定された7ベータ鎖ドメイン配列および7ベータ鎖ドメイン配列を接続する6ループ領域(ABループ、BCループ、CDループ、DEループ、EFループおよびFGループ)により特徴付けられる。N末端およびC末端に最も近く位置するベータ鎖は、溶液でベータ様コンフォメーションをとり得る。配列番号1において、ABループは残基14〜17に対応し、BCループは残基23〜31に対応し、CDループは残基37〜47に対応し、DEループは残基51〜56に対応し、EFループは残基63〜67に対応し、FGループは残基75〜87に対応する。

0088

従って、ある実施態様において、ここに記載する抗PD−L1アドネクチンは、配列番号1に示すヒト10Fn3ドメインまたは配列番号2に示すそのコア配列と少なくとも40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%または90%同一である10Fn3ポリペプチドである。ばらつきのほとんどは、一般にループの1以上またはベータ鎖の1以上またはN末端もしくはC末端領域で生じる。10Fn3ポリペプチドのベータ鎖またはベータ様鎖の各々は、本質的に配列番号1または2のベータ鎖またはベータ様鎖に対応する配列と少なくとも80%、85%、90%、95%または100%同一であるアミノ酸配列からなるが、但しこのような多様性は生理学的条件でポリペプチドの安定性を妨害しない。

0089

ある実施態様において、本発明は、フィブロネクチンIII型第10(10Fn3)ドメインを含む抗ヒトPD−L1アドネクチンを提供し、ここで、10Fn3ドメイはループ、AB;ループ、BC;ループ、CD;ループ、DE;ループEF;およびループFGを含み;ヒト10Fn3ドメインの対応するループの配列と比較して改変されたアミノ酸配列を有するループBC、DEおよびFGから選択される少なくとも1ループを有する。“アドネクチン”は、非修飾ヒト10Fn3ドメインにより結合されない標的に結合する修飾ヒト10Fn3ドメインである。ある実施態様において、ここに記載する抗PD−L1アドネクチンは、配列番号1または2の非ループ領域と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む10Fn3ドメインを含み、ここで、BC、DEおよびFGから選択される少なくとも1っのループが改変されている。ある実施態様において、BCおよびFGループが改変されており、ある実施態様において、BCおよびDEループが改変されており、ある実施態様において、DEおよびFGループが改変されておりおよびある実施態様において、BC、DEおよびFGループが改変されており、すなわち、10Fn3ドメインは、天然に存在しないループを含む。ある実施態様において、AB、CDおよび/またはEFループが改変されている。“改変”により、鋳型配列(対応するヒトフィブロネクチンドメイン)に対する1以上のアミノ酸配列改変を意味し、アミノ酸付加、欠失置換またはそれらの組み合わせを含む。アミノ酸配列改変は、一般に、核酸コード配列の意図的、盲検的または自然配列変動により達成でき、あらゆる技法、例えば、PCRエラープローンPCRまたは化学DNA合成により生じ得る。

0090

ある実施態様において、BC、DEおよびFGから選択された1以上のループが対応するヒトフィブロネクチンループと比較して長さが長くても、短くてもよい。ある実施態様において、ループ長は2〜25アミノ酸延長され得る。ある実施態様において、ループ長は1〜11アミノ酸減少され得る。抗原結合を最適化するために、それ故に、10Fn3のループ長を、抗原結合において可能性のある最大の柔軟性および親和性を得るために、長さにおよび配列で改変し得る。

0091

ある実施態様において、ポリペプチドは、配列番号1または2の非ループ領域と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一である非ループ領域のアミノ酸配列を含むFn3ドメインを含み、ここで、BC、DEおよびFGから選択される少なくとも1ループが改変されている。ある実施態様において、改変BCループは、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10までのアミノ酸置換、1、2、3または4までのアミノ酸欠失、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10までのアミノ酸挿入またはそれらの組み合わせを有する。

0092

ある実施態様において、インテグリン結合モチーフアルギニン−グリシン−アスパラギン酸”(RGD)(配列番号1のアミノ酸78〜80)の1以上の残基は、インテグリン結合を破壊するために置換され得る。ある実施態様において、ここに提供するポリペプチドのFGループは、RGDインテグリン結合部位を含まない。ある実施態様において、RGD配列は、極性アミノ酸中性アミノ酸酸性アミノ酸配列(N末端からC末端方向で)に置き換えられる。ある実施態様において、RGD配列はSGEに置き換えられる。ある実施態様において、RGD配列はRGEに置き換えられる。

0093

ある実施態様において、フィブロネクチンベースの足場タンパク質は、一般に次の配列により定義される10Fn3ドメインを含む。



ここで、ABループは(Z)aにより表され、CDループは(Z)bにより表され、EFループは(Z)cにより表され、BCループは(Z)xにより表され、DEループは(Z)yにより表され、そしてFGループは(Z)zにより表される。Zは任意のアミノ酸を表し、Zの後の下付き文字は、アミノ酸数の整数を表す。特に、aは1〜15、2〜15、1〜10、2〜10、1〜8、2〜8、1〜5、2〜5、1〜4、2〜4、1〜3、2〜3または1〜2アミノ酸のどこかであってよく;そしてb、c、x、yおよびzは各々独立して2〜20、2〜15、2〜10、2〜8、5〜20、5〜15、5〜10、5〜8、6〜20、6〜15、6〜10、6〜8、2〜7、5〜7または6〜7アミノ酸のどこかであってよい。ベータ鎖の配列は、配列番号1または2に示す対応するアミノ酸に対して、全7足場領域にわたり、0〜10、0〜8、0〜6、0〜5、0〜4、0〜3、0〜2または0〜1のどこかの置換、欠失または付加を有し得る。ある実施態様において、ベータ鎖の配列は、配列番号1または2に示す対応するアミノ酸に対して、全7足場領域にわたり、0〜10、0〜8、0〜6、0〜5、0〜4、0〜3、0〜2または0〜1のどこかの保存的置換を有し得る。ある実施態様において、コアアミノ酸残基は固定され、あらゆる置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。

0094

ある実施態様において、ここに記載する抗PD−L1アドネクチンは10Fn3足場に基づき、一般に次の配列により定義される。
EVVAATPTSLLISW(Z)xYRITYGETGGNSPVQEFTV(Z)yATISGLKPGVDYTITVYA(Z)zISINYRT(配列番号4)
ここで、BCループは(Z)xにより表され、DEループは(Z)yにより表され、そしてFGループは(Z)zにより表される。Zは任意のアミノ酸を表し、Zの後の下付き文字は、アミノ酸数の整数を表す。特に、x、yおよびzは各々独立して2〜20、2〜15、2〜10、2〜8、5〜20、5〜15、5〜10、5〜8、6〜20、6〜15、6〜10、6〜8、2〜7、5〜7または6〜7アミノ酸のどこかであってよい。好ましい実施態様において、xは11アミノ酸であり、yは6アミノ酸であり、そしてzは12アミノ酸である。ベータ鎖の配列は、配列番号1または2に示す対応するアミノ酸に対して、全7足場領域にわたり、0〜10、0〜8、0〜6、0〜5、0〜4、0〜3、0〜2または0〜1のどこかの置換、欠失または付加を有し得る。ある実施態様において、ベータ鎖の配列は、配列番号1または2に示す対応するアミノ酸に対して、全7足場領域にわたり、0〜10、0〜8、0〜6、0〜5、0〜4、0〜3、0〜2または0〜1のどこかの保存的置換を有し得る。ある実施態様において、コアアミノ酸残基、例えば、1以上のループの外は固定され、あらゆる置換、保存的置換、欠失または付加は、コアアミノ酸残基以外の残基で生じる。

0095

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは配列番号3または4に示す配列を含み得て、ここで、それぞれ(Z)x、(Z)yおよび(Z)zにより表されるBC、DEおよびFGループの少なくとも1つが改変されている。上記のとおり、配列番号1の残基23〜31、51〜56および75〜87に対応するアミノ酸残基は、それぞれBC、DEおよびFGループを規定する。しかしながら、所望の標的(例えば、PD−L1)に対する強い親和性を有する10Fn3バインダーを達成するために、ループ領域内の全ての残基の修飾を必要とするわけではないことが理解されるべきである。

0096

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは配列番号3または4に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Z)x、(Z)yおよび(Z)zにより表されるBC、DEおよびFGループは、それぞれ配列番号21、22および23に示すBC、DEまたはFGループ配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する。

0097

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは配列番号3または4に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Z)x、(Z)yおよび(Z)zにより表されるBC、DEおよびFGループは、それぞれ配列番号21、22および23のアミノ酸配列を有するBC、DEおよびFGループを含む。

0098

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは配列番号3または4に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Z)x、(Z)yおよび(Z)zにより表されるBC、DEおよびFGループは、それぞれ配列番号36、37および38に示すBC、DEまたはFGループ配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する。

0099

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは配列番号3または4に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Z)x、(Z)yおよび(Z)zにより表されるBC、DEおよびFGループは、それぞれ配列番号36、37および38のアミノ酸配列を有するBC、DEおよびFGループを含む。

0100

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは配列番号3または4に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Z)x、(Z)yおよび(Z)zにより表されるBC、DEおよびFGループは、それぞれ配列番号51、52および53に示すBC、DEまたはFGループ配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する。

0101

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは配列番号3または4に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Z)x、(Z)yおよび(Z)zにより表されるBC、DEおよびFGループは、それぞれ配列番号51、52および53のアミノ酸配列を有するBC、DEおよびFGループを含む。

0102

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは配列番号3または4に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Z)x、(Z)yおよび(Z)zにより表されるBC、DEおよびFGループは、それぞれ配列番号66、67および68に示すBC、DEまたはFGループ配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する。

0103

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは配列番号3または4に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Z)x、(Z)yおよび(Z)zにより表されるBC、DEおよびFGループは、それぞれ配列番号66、67および68のアミノ酸配列を有するBC、DEおよびFGループを含む。

0104

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは配列番号3または4に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Z)x、(Z)yおよび(Z)zにより表されるBC、DEおよびFGループは、それぞれ配列番号6、7および8に示すBC、DEまたはFGループ配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する。

0105

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは配列番号3または4に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Z)x、(Z)yおよび(Z)zにより表されるBC、DEおよびFGループは、それぞれ配列番号6、7および8のアミノ酸配列を有するBC、DEおよびFGループを含む。

0106

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは配列番号3または4に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Z)x、(Z)yおよび(Z)zにより表されるBC、DEおよびFGループは、それぞれ配列番号81、82および83に示すBC、DEまたはFGループ配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する。

0107

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは配列番号3または4に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Z)x、(Z)yおよび(Z)zにより表されるBC、DEおよびFGループは、それぞれ配列番号81、82および83のアミノ酸配列を有するBC、DEおよびFGループを含む。

0108

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは配列番号3または4に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Z)x、(Z)yおよび(Z)zにより表されるBC、DEおよびFGループは、それぞれ配列番号97、98および99に示すBC、DEまたはFGループ配列と少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有する。ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは配列番号3または4に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Z)x、(Z)yおよび(Z)zにより表されるBC、DEおよびFGループは、それぞれ配列番号97、98および99のアミノ酸配列を有するBC、DEおよびFGループを含む。

0109

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは配列番号3または4に示す配列を含み、ここで、それぞれ(Z)x、(Z)yおよび(Z)zにより表されるBC、DEおよびFGループは、それぞれ配列番号113、114および115;それぞれ配列番号124、125および126;それぞれ配列番号135、136および137;それぞれ配列番号146、147および148;それぞれ配列番号157、158および159;それぞれ配列番号168、169および170;それぞれ配列番号179、180および181;それぞれ配列番号190、191および192;それぞれ配列番号201、202および203;それぞれ配列番号212、213および214;それぞれ配列番号223、224および225;それぞれ配列番号234、235および236;それぞれ配列番号245、246および247;それぞれ配列番号256、257および258;それぞれ配列番号267、268および269;それぞれ配列番号278、279および280;それぞれ配列番号289、290および291;それぞれ配列番号300、301および302;それぞれ配列番号311、312および313;それぞれ配列番号322、323および324;それぞれ配列番号333、334および335;それぞれ配列番号344、345および346;それぞれ配列番号355、356および357;それぞれ配列番号366、367および368;それぞれ配列番号377、378および379;それぞれ配列番号388、389および390;それぞれ配列番号399、400および401;それぞれ配列番号410、411および412;それぞれ配列番号421、422および423;それぞれ配列番号432、433および434;それぞれ配列番号443、444および445;それぞれ配列番号454、455および456;それぞれ配列番号465、466および467;それぞれ配列番号476、477および478;それぞれ配列番号487、488および489;それぞれ配列番号498、499および500;それぞれ配列番号509、510および511;それぞれ配列番号520、521および522;それぞれ配列番号531、530および531;それぞれ配列番号542、543および544;それぞれ配列番号553、554および555;またはそれぞれ配列番号564、565および566のアミノ酸配列を有するBC、DEおよびFGループを含む。このような抗PD−L1アドネクチンの足場領域は、配列番号4の足場アミノ酸残基と比較して、0〜20、0〜15、0〜10、0〜8、0〜6、0〜5、0〜4、0〜3、0〜2または0〜1のどこかの置換、保存的置換、欠失または付加を含み得る。このような足場修飾は、抗PD−L1アドネクチンが所望のKDでPD−L1に結合できる限り、製造し得る。

0110

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンのBCループは、6、21、36、51、66、81および97からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

0111

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンのDEループは、7、22、37、52、67、82および98からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

0112

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンのFGループは、8、23、38、53、68、83および99からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

0113

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは、それぞれ配列番号6、21、36、51、66、81および97;配列番号7、22、37、52、67、82および98;および配列番号8、23、38、53、68、83および99の何れかと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるBC、DEおよびFGループアミノ酸配列を含む。

0114

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは、配列番号5、20、35、50、65、80、96、112、123、134、145、156、167、178、189、200、211、222、233、244、255、266、277、288、299、310、321、332、343、354、365、376、387、398、409、420、431、442、453、464、475、486、497、508、519、530、541、552および563の何れかと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。

0115

ある実施態様において、ここに記載する抗PD−L1アドネクチンは、5、20、35、50、65、80または96の非BC、DEおよびFGループ領域と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。

0116

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは、配列番号9〜15、24〜30、39〜45、54〜60、6975、84〜91、100〜107、116〜122、127〜133、138〜144、150〜155、160〜166、171〜177、182〜188、193〜199、204〜210、215〜221、227〜232、237〜243、248〜254、259〜265、271〜276、291〜287、292〜298、303〜309、314〜320、325〜331、337〜342、347〜353、358〜364、369〜375、380〜386、391〜397、402〜408、413〜419、424〜430、435〜441、446〜452、457〜463、468〜474、479〜485、490〜496、501〜507、512〜518、523〜529、534〜540、545〜551および556−562の何れかと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。ある実施態様において、ここに記載する抗PD−L1アドネクチンは、配列番号9〜15、24〜30、39〜45、54〜60、69〜75、84〜91および100〜107の何れかの非BC、DEおよびFGループ領域と少なくとも80%、85%、90%、95%、98%、99%または100%同一であるアミノ酸配列を含む。

0117

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは、それぞれ配列番号6、7および8に示すBC、DEおよびFGループを含む。

0118

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは、それぞれ配列番号21、22および23に示すBC、DEおよびFGループを含む。

0119

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは、それぞれ配列番号36、37および38に示すBC、DEおよびFGループを含む。

0120

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは、それぞれ配列番号51、52および53に示すBC、DEおよびFGループを含む。

0121

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは、それぞれ配列番号66、67および68に示すBC、DEおよびFGループを含む。

0122

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは、それぞれ配列番号81、82および83に示すBC、DEおよびFGループを含む。

0123

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは、それぞれ配列番号97、98および99に示すBC、DEおよびFGループを含む。

0124

ある実施態様において、ここに記載するBC、DEおよび/またはFGループアミノ酸配列(例えば、それぞれ配列番号6、21、36、51、66、81および97;配列番号7、22、37、52、67、82および98;および配列番号8、23、38、53、68、83および99)を、非10Fn3ドメインタンパク質足場に移植する。例えば、1以上のループアミノ酸配列を、抗体重鎖または軽鎖またはそのフラグメントの1以上のCDRループ交換するかまたはそれに挿入する。ある実施態様において、1以上のアミノ酸ループ配列が交換または挿入されたタンパク質ドメインは、コンセンサスFn3ドメイン(Centocor, US)、アンキリン反復タンパク質(Molecular Partners AG, Zurich Switzerland)、ドメイン抗体(Domantis, Ltd, Cambridge, MA)、単一ドメインラクダナノボディ(Ablynx, Belgium)、リポカリン(例えば、アンチカリン;Pieris Proteolab AG, Freising, Germany)、アビマー(Amgen, CA)、アフィボディ(Affibody AG, Sweden)、ユビキチン(例えば、アフィリン;Scil Proteins GmbH, Halle, Germany)、タンパク質エピトープ模倣物(Polyphor Ltd, Allschwil, Switzerland)、ヘリックス束足場(例えばアルファボディ、Complix, Belgium)、Fyn SH3ドメイン(Covagen AG, Switzerland)またはアトリマー(Anaphor, Inc., CA)を含むが、これらに限定されない。

0125

ある実施態様において、ここに提供するポリペプチドのN末端および/またはC末端領域のアミノ酸配列は、野生型ヒト10Fn3ドメインの対応する領域のアミノ酸配列(配列番号1または2)と比較して、欠失、置換または挿入により修飾され得る。10Fn3ドメインは、一般に配列番号1アミノ酸番号1から始まる。しかしながら、アミノ酸欠失を有するドメインも本発明により包含される。さらなる配列も、配列番号1または2のアミノ酸配列を有する10Fn3ドメインのN末端またはC末端に付加し得る。例えば、ある実施態様において、N末端伸長は、M、MGおよびGからなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。ある実施態様において、MG配列は、配列番号1により定義される10Fn3のN末端に配置され得る。Mは通常開裂され、N末端にGが残る。さらに、M、GまたはMGは、表3に示すN末端伸長の何れかのN末端にも配置され得る。

0126

実施態様の例示において、1〜20、1〜15、1〜10、1〜8、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2または1アミノ酸長を有する改変N末端領域を配列番号1または2のN末端領域または表3に示す任意のアドネクチンに付加し得る。例示的改変N末端領域は、(1文字アミノ酸コードにより表す)M、MG、G、MGVSDVPRDL(配列番号574)およびGVSDVPRDL(配列番号575)を含む。例えば、アドネクチンコア配列のN末端に結合し得る他の適当な改変N末端領域は、例えば、XnSDVPRDL(配列番号576)、XnDVPRDL(配列番号577)、XnVPRDL(配列番号578)、XnPRDL(配列番号579)、XnRDL(配列番号580)、XnDL(配列番号581)またはXnLを含み、ここで、n=0、1または2アミノ酸であり、ここで、n=1であるとき、XはMetまたはGlyであり、n=2であるとき、XはMet−Glyである。10Fn3ドメインのN末端にMet−Gly配列が添加されたとき、Mは通常開裂され、N末端にGが残る。ある実施態様において、改変N末端領域はアミノ酸配列MASTSG(配列番号582)を含む。

0127

実施態様の例示において、1〜20、1〜15、1〜10、1〜8、1〜5、1〜4、1〜3、1〜2または1アミノ酸長を有する改変C末端領域が、配列番号1または2のC末端領域または表3に示す任意のアドネクチンに付加され得る。改変C末端領域配列具体例は、例えば、EIEK(配列番号584)、EGSGC(配列番号585)、EIEKPCQ(配列番号586)、EIEKPSQ(配列番号587)、EIEKP(配列番号588)、EIEKPS(配列番号589)またはEIEKPC(配列番号590)を含む、本質的にこれからなるまたはこれからなる、ポリペプチドを含む。ある実施態様において、改変C末端領域はEIDK(配列番号591)を含み、特定の実施態様において、改変C末端領域はEIDKPCQ(配列番号592)またはEIDKPSQ(配列番号593)である。さらなる適当な改変C末端領域は、配列番号594〜618に示す。

0128

ある実施態様において、アドネクチンは、EおよびD残基を含み、8〜50、10〜30、10〜20、5〜10〜2〜4アミノ酸長であり得るC末端伸長配列に結合される。ある実施態様において、テイル配列は、配列がEDのタンデム反復を含むEDベースのリンカーを含む。実施態様の例示において、テイル配列は、2〜10、2〜7、2〜5、3〜10、3〜7、3〜5、3、4または5 ED反復を含む。ある実施態様において、EDベースのテイル配列は、さらに、例えば、EI、EID、ES、EC、EGSおよびEGCなどのさらなるアミノ酸残基を含み得る。このような配列は、一部、残基DおよびKが除去されているEIDKPSQ(配列番号593)などの既知アドネクチンテイル配列に基づく。実施態様の例示において、EDベースのテイルは、ED反復前にE、IまたはE1残基を含む。

0129

ある実施態様において、N末端またはC末端伸長配列を、既知リンカー配列(例えば、表3における配列番号629〜678)で抗PD−L1アドネクチン配列に結合する。ある実施態様において、配列は、薬物動態部分の結合を促進するために、10Fn3ドメインのC末端に位置し得る。例えば、GSGC(配列番号638)などのシステイン含有リンカーを、システイン残基の部位特異的ペグ化を促進するために、C末端に付加し得る。

0130

ある実施態様において、C末端アミノ酸RT(すなわち、アミノ酸94)に結合し得る改変C末端部分は、アミノ酸PmXnを含み、ここで、Pはプロリンであり、Xは任意のアミノ酸であり、mは少なくとも1の整数であり、nは0または少なくとも1の整数である。ある実施態様において、改変C末端部分は、アミノ酸PCを含む。ある実施態様において、改変C末端部分は、アミノ酸PI、PC、PID、PIE、PIDK(配列番号605)、PIEK(配列番号606)、PIDKP(配列番号607)、PIEKP(配列番号608)、PIDKPS(配列番号609)、PIEKPS(配列番号610)、PIDKPC(配列番号611)、PIEKPC(配列番号612)、PIDKPSQ(配列番号613)、PIEKPSQ(配列番号614)、PIDKPCQ(配列番号615)、PIEKPCQ(配列番号616)、PHHHHHH(配列番号617)およびPCHHHHHH(配列番号618)を含む。C末端にPCを有する例示的抗PD−L1アドネクチンは、実施例および表3に提供する。

0131

ある実施態様において、ここに記載するアドネクチンは、6×hisテイル(配列番号619)を有する。

0132

ある実施態様において、フィブロネクチンベースの足場タンパク質は、改変N末端領域配列および改変C末端領域配列の両方を有する10Fn3ドメインおよび所望により6×hisテイルを含む。

0133

II. 抗PD−L1アドネクチンの生物学的性
ここに提供されるのは、例えば、SPR(Biacore)により決定して、10nM、1nM、0.5nM、0.1nMまたはそれ未満のKDでヒトPD−L1に結合し、次の性質の1以上を示すアドネクチンである。
1. 例えば、ヒトPD−1Fcタンパク質およびL2987細胞などのヒトPD−L1陽性細胞を使用する、例えば、フローサイトメトリーにより決定して、ヒトPD−L1とヒトPD−1の相互作用を少なくとも50%、70%、80%、90%またはそれ以上阻害する;
2. 例えば、ELISAアッセイまたはSPR(Biacore)により決定して、ヒトCD80(B7−1)のヒトPD−L1への結合を少なくとも50%、70%、80%、90%またはそれ以上阻害する;
3. 例えば、ELISAアッセイまたはSPR(Biacore)により決定して、抗PD−L1抗体12A4(例えば、米国特許7,943,743に記載)のヒトPD−L1への結合を少なくとも50%、70%、80%、90%またはそれ以上阻害する;および
4.混合リンパ球反応(MLR)における細胞増殖を阻害する。

0134

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは1nMまたはそれ未満のKDでヒトPD−L1に結合し、性質1〜4の何れか1つを示す。ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは0.1nMまたはそれ未満のKDでヒトPD−L1に結合し、性質1〜4の何れか1つを示す。

0135

ここに提供されるのは、ここに記載する抗PD−L1アドネクチンまたはその一部(例えば、BC、DEおよびFGループ)と少なくとも70%、80%、90%、95%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含み、例えば、SPR(Biacore)により決定して、10nM、1nM、0.5nM、0.1nMまたはそれ未満のKDでヒトPD−L1に結合し、次の性質の1以上を示すアドネクチンである。
1. 例えば、ヒトPD−1Fcタンパク質およびL2987細胞などのヒトPD−L1陽性細胞を使用する、例えば、フローサイトメトリーにより決定して、ヒトPD−L1とヒトPD−1の相互作用を少なくとも50%、70%、80%、90%またはそれ以上阻害する;
2. 例えば、ELISAアッセイまたはSPR(Biacore)により決定して、ヒトCD80(B7−1)のヒトPD−L1への結合を少なくとも50%、70%、80%、90%またはそれ以上阻害する;
3. 例えば、ELISAアッセイまたはSPR(Biacore)により決定して、抗PD−L1抗体12A4のヒトPD−L1への結合を少なくとも50%、70%、80%、90%またはそれ以上阻害する;および
4.混合リンパ球反応(MLR)における細胞増殖を阻害する。

0136

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンはここに記載する抗PD−L1アドネクチンまたはその一部(例えば、BC、DEおよびFGループ)と少なくとも70%、80%、90%、95%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含み、1nM以下のKDでヒトPD−L1に結合し、性質1〜4の何れか1つを示す。ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンはここに記載する抗PD−L1アドネクチンまたはその一部(例えば、BC、DEおよびFGループ)と少なくとも70%、80%、90%、95%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含み、0.1nM以下のKDでヒトPD−L1に結合し、性質1〜4の何れか1つを示す。

0137

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは、特定のここに記載する抗PD−L1アドネクチンと、PD−L1への結合について競合(例えば、交差競合)する。このような競合アドネクチンは、標準PD−L1結合アッセイにおいてここに記載するアドネクチンのPD−L1への結合を競合的に阻害するその能力に基づき、同定され得る。例えば、組み換えPD−L1タンパク質がプレート固定化され、アドネクチンの一方が蛍光標識され、非標識アドネクチンが標識アドネクチンの結合を競合して阻害する能力を評価する、標準ELISAアッセイが使用され得る。

0138

ある実施態様において、競合的ELISA形式を実施して、2抗PD−L1アドネクチンがPD−L1の重複するアドネクチン結合部位に結合するか否かを決定できる。ある形式において、アドネクチン#1はプレート上に被覆され、これが次いで遮断および洗浄される。このプレートにPD−L1単独または飽和濃度のアドネクチン#2とプレインキュベートしたPD−L1が添加される。適当なインキュベーション時間後、プレートを洗浄し、ビオチニル化抗PD−L1ポリクローナル抗体などのポリクローナル抗PD−L1抗体でプローブし、続いてストレプトアビジン−HRPコンジュゲートおよび標準テトラメチルベンジジン発色法で検出する。アドネクチン#2とプレインキュベーションしてもしなくてもODシグナルが同一であるならば、それら2アドネクチンは互いに独立して結合し、それらのアドネクチン結合部位は重複しない。しかしながら、PD−L1/アドネクチン#2混合物を入れたウェルのODシグナルがPD−L1単独を入れたウェルより低いならば、アドネクチン#2の結合は、アドネクチン#1のPD−L1への結合を遮断すると確認される。

0139

あるいは、表面プラズモン共鳴(SPR、例えば、BIACORE)により、類似の実験を行う。アドネクチン#1をSPRチップ表面に固定化し、続いて、PD−L1単独または飽和濃度のアドネクチン#2とプレインキュベートしたPD−L1を注入する。PD−L1/アドネクチン#2混合物の結合シグナルがPD−L1単独と同一かそれより高いならば、それら2アドネクチンは互いに独立して結合し、それらのアドネクチン結合部位は重複しない。しかしながら、PD−L1/アドネクチン#2混合物の結合シグナルがPD−L1単独の結合シグナルより低いならばアドネクチン#2の結合は、アドネクチン#1のPD−L1への結合を遮断すると確認される。これらの実験の特色は、飽和濃度のアドネクチン#2の使用である。PD−L1がアドネクチン#2で飽和されていないならば、上記結論は維持されない。類似実験を使用して、あらゆる2PD−L1結合タンパク質が重複アドネクチン結合部位に結合するか否かを決定できる。

0140

上に例示した両アッセイとも、アドネクチン#2を固定化し、PD−L1−アドネクチン#1がプレートに添加される逆順でも実施し得る。あるいは、アドネクチン#1および/または#2を、モノクローナル抗体および/または可溶性受容体Fc融合タンパク質と置き換え得る。

0141

ある実施態様において、HTRFサンドイッチアッセイを使用して、競合を決定し得る。

0142

ある実施態様において、競合アドネクチンは、特定のここに記載する抗PD−L1アドネクチンとPD−L1上の同一アドネクチン結合部位に結合するアドネクチンである。プロテアーゼマッピング、変異解析、HDX−MS、x線晶学および2次元核磁気共鳴などの標準マッピング技法を使用して、アドネクチンが対照アドネクチンと同一アドネクチン結合部位またはエピトープに結合するか否かを決定し得る(例えば、Epitope MappingProtocols in Methodsin Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)参照)。エピトープは、それを配置させるための方法により規定される。例えば、ある実施態様において、PD−L1アドネクチンまたは抗体は、HDX−MSにより決定してまたはX線晶学により決定して、PD−L1ここに記載するアドネクチンの1つと同一エピトープに結合する。

0143

候補競合抗PD−L1アドネクチンは、ここに記載する抗PD−L1アドネクチンのPD−L1への結合を少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%阻害できおよび/またはその結合が抗PD−L1アドネクチンにより少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%阻害される。%競合は、上記方法を使用して決定され得る。

0144

ここに提供されるのは、例えば、SPR(Biacore)により決定して、10nM、1nM、0.5nM、0.1nMまたはそれ以下のKDでヒトPD−L1に結合し、次の性質の1以上を示すアドネクチンである:
1. 例えば、ヒトPD−1Fcタンパク質およびL2987細胞などのヒトPD−L1陽性細胞を使用する、例えば、フローサイトメトリーにより決定して、ヒトPD−L1とヒトPD−1の相互作用を少なくとも50%、70%、80%、90%またはそれ以上阻害する;
2. 例えば、ELISAアッセイまたはSPR(Biacore)により決定して、ヒトCD80(B7−1)のヒトPD−L1への結合を少なくとも50%、70%、80%、90%またはそれ以上阻害する;
3. 例えば、ELISAアッセイまたはSPR(Biacore)により決定して、抗PD−L1抗体12A4のヒトPD−L1への結合を少なくとも50%、70%、80%、90%またはそれ以上阻害する;
4.混合リンパ球反応(MLR)における細胞増殖を阻害する;および
5. ここに記載する抗PD−L1抗体と、ヒトPD−L1への結合について競合する。

0145

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは、ヒトPD−L1に1nM以下のKDで結合し、性質1〜5の何れか1つを示す。ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは0.1nMまたはそれ未満のKDでヒトPD−L1に結合し、性質1〜5の何れか1つを示す。

0146

ここに提供されるのは、ここに記載する抗PD−L1アドネクチンまたはその一部(例えば、BC、DEおよびFGループ)と少なくとも70%、80%、90%、95%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含み、例えば、SPR(Biacore)により決定して、10nM、1nM、0.5nM、0.1nMまたはそれ未満のKDでヒトPD−L1に結合し、次の性質の1以上を示すアドネクチン:
1. 例えば、ヒトPD−1Fcタンパク質およびL2987細胞などのヒトPD−L1陽性細胞を使用する、例えば、フローサイトメトリーにより決定して、ヒトPD−L1とヒトPD−1の相互作用を少なくとも50%、70%、80%、90%またはそれ以上阻害する;
2. 例えば、ELISAアッセイまたはSPR(Biacore)により決定して、ヒトCD80(B7−1)のヒトPD−L1への結合を少なくとも50%、70%、80%、90%またはそれ以上阻害する;
3. 例えば、ELISAアッセイまたはSPR(Biacore)により決定して、抗PD−L1抗体12A4のヒトPD−L1への結合を少なくとも50%、70%、80%、90%またはそれ以上阻害する;
4.混合リンパ球反応(MLR)における細胞増殖を阻害する;および
5. ここに記載する抗PD−L1抗体と、ヒトPD−L1への結合について競合する。

0147

ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは、ここに記載する抗PD−L1アドネクチンまたはその一部(例えば、BC、DEおよびFGループ)と少なくとも70%、80%、90%、95%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含み、ヒトPD−L1に1nMまたはそれ未満のKDで結合し、性質1〜5の何れか1つを示す。ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンはここに記載する抗PD−L1アドネクチンまたはその一部(例えば、BC、DEおよびFGループ)と少なくとも70%、80%、90%、95%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を含み、0.1nMまたはそれ未満のKDでヒトPD−L1に結合し、性質1〜5の何れか1つを示す。

0148

III.薬物動態部分を含む融合物
ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは、望ましくは例えば、PET造影に使用するとき、短半減期を有する。ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは、30分〜3時間、30分〜120分、60分〜120分または80分〜100分の血中または血清半減期を有する。ある実施態様において、PD−L1アドネクチンの半減期は、それに結合した標識、例えば、18Fに類似する。

0149

ここに記載する抗PD−L1アドネクチンは、薬物動態(PK)部分を含み得る。薬物動態改善は、認知される治療必要性により評価し得る。抗PD−L1アドネクチンを、非修飾抗PD−L1アドネクチンと比較して、ヒトにおけるポリペプチドのクリアランス速度を2倍以上、3倍以上、4倍以上または5倍以上減少させる部分と結合させ得る。薬物動態改善の他の測定値は、しばしばアルファ相およびベータ相に分けられる、血清半減期を含む。相の何れかまたは両方が、適切な部分の添加により顕著に改善され得る。例えば、PK部分は、ポリペプチドの血清半減期を、Fn3ドメイン(またはアドネクチン)単独と比較して、10%、20%、50%、2倍、3倍または5倍延長し得る。

0150

ここでは“PK部分”と称するタンパク質の血中からのクリアランスを遅延させる部分は、ポリオキシアルキレン部分(例えば、ポリエチレングリコール)、糖(例えば、シアル酸)および耐容性良好であるタンパク質部分(例えば、Fcおよびそのフラグメントおよびバリアント、トランスフェリンまたは血清アルブミン)を含む。本発明で使用し得る他のPK部分は、Kontermann et al., (Current Opinion in Biotechnology 2011;22:868-76)引用により本明細書に包含させる)に記載されるものを含む。このようなPK部分は、PAS融合物(すなわち、3アミノ酸プロリン、アラニンおよびセリンに基づく組み換えPEG模倣物)、炭水化物コンジュゲート(例えば、ヒドロキシエチルデンプン(HES))、グリコシル化、ポリシアル酸コンジュゲートおよび脂肪酸コンジュゲートを含むが、これらに限定されない。

0151

IV.核酸−タンパク質融合テクノロジー
ある態様において、本発明は、PD−L1に結合するフィブロネクチンIII型ドメインを含むアドネクチンを提供する。特定の結合性質を有するFn3ドメインを迅速に製造し、試験する1つの方法は、Adnexus、Bristol-Myers Squibb R&D Companyの核酸−タンパク質融合テクノロジーである。この開示は、‘PROfusion’と称されるインビトロ発現およびタグ付けテクノロジーを使用し、これは、タンパク質の結合に重要な新規ポリペプチドおよびアミノ酸モチーフの同定のために、核酸−タンパク質融合物(RNA−およびDNA−タンパク質融合物)を利用する。核酸−タンパク質融合テクノロジーは、タンパク質をそのコード化遺伝子情報と共有結合的に結合させるテクノロジーである。RNA−タンパク質融合テクノロジーおよびフィブロネクチンベースの足場タンパク質ライブラリースクリーニング方法の詳細について、Szostak et al.、米国特許,258,558、6,261,804、6,214,553、6,281,344、6,207,446、6,518,018および6,818,418;Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1997;94:12297-12302; およびKurz et al., Molecules, 2000;5:1259-64を参照のこと(これら全て引用により本明細書に包含させる)。

0152

V.ベクターおよびポリヌクレオチド
本発明にまた包含されるのは、ここに記載するタンパク質の何れかをコードする核酸配列である。当業者には明らかなとおり、第三塩基縮重のため、コードヌクレオチド配列においてほとんど全てのアミノ酸が1を超えるトリプレットコドンにより表され得る。さらに、微小塩基対変化は、コードされるアミノ酸配列の保存的置換をもたらし得るが、遺伝子産物の生物学的活性を実質的に変えることは期待されない。それ故に、ここに記載するタンパク質をコードする核酸配列において、配列をわずかに修飾し、なお、その各遺伝子産物をコードさせ得る。ここに記載する抗PD−L1アドネクチンおよびその融合物をコードするある例示的核酸は、配列番号16〜19、31〜34、46〜49、61〜64、76〜79、92〜95および108〜111に示す配列を有する核酸を含む。

0153

また企図されるのは、配列番号16〜19、31〜34、46〜49、61〜64、76〜79、92〜95および108〜111と少なくとも50%、例えば少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%同一であり、PD−L1に結合するタンパク質をコードする核酸配列である。ある実施態様において、得られた翻訳アミノ酸配列を変えないように、ヌクレオチド置換が導入される。

0154

ここに記載する種々のタンパク質またはポリペプチドの何れかをコードする核酸を化学合成し得る。細胞における発現を改善するために、コドン使用頻度を選択し得る。このようなコドン使用頻度は細胞型選択による。特定化コドン使用頻度パターンは、大腸菌および他の細菌、ならびに哺乳動物細胞植物細胞酵母細胞および昆虫細胞について検討されている。例えばMayfield et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (Jan. 21, 2003); Sinclair et al., Protein Expr. Purif., 26(I):96-105 (October 2002); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (October 2001); Makrides et al., Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (September 1996); and Sharp et al., Yeast, 7(7):657-678 (October 1991)参照。

0155

核酸操作の一般的技法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), or Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987)および定期的最新版(引用により本明細書に包含させる)に記載されている。一般に、ポリペプチドをコードするDNAを、哺乳動物ウイルスまたは昆虫遺伝子由来の適当な転写または翻訳調節エレメントと操作可能に結合させる。このような調節エレメントは、転写プロモーター、任意の転写を制御するためのオペレーター配列、適当なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列および転写および翻訳の停止を制御する配列を含む。通常複製起点により付与される宿主で複製する能力および形質転換体の認識を促進するための選択遺伝子がさらに取り込まれる。

0156

ここに記載するタンパク質を、直接的だけでなく、また、好ましくは成熟タンパク質またはポリペプチドのN末端に特異的開裂部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドである、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして組み換えにより産生できる。選択異種シグナル配列は、好ましくは宿主細胞により認識および処理(すなわち、シグナルペプチダーゼにより開裂)されるものである。哺乳動物系でのポリペプチド産生のための例示的N末端リーダー配列は、METDTLLLWVLLLWVPGSTG(配列番号583)であり、これは、発現後宿主細胞により除去される。

0157

天然シグナル配列を認識および処理しない原核宿主細胞について、シグナル配列を、例えば、アルカリホスファターゼペニシリナーゼ、1 ppまたは熱安定エンテロトキシンIIリーダーから選択される、原核シグナル配列に置き換える。

0158

酵母分泌について、天然シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼリーダー、因子リーダー(サッカロミセスおよびクリベロマイセスアルファ−因子リーダーを含む)または酸ホスファターゼリーダー、カンジダアルビカンスグルコアミラーゼリーダーまたは米国特許5,631,144に記載のシグナル配列に置き換える。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスgDシグナルが利用可能である。このような前駆体領域についてのDNAを、リーディングフレーム内で、タンパク質をコードするDNAにライゲートし得る。

0159

発現およびクローニング両方のベクターは、ベクターを1以上の選択宿主細胞で複製可能とする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、宿主染色体DNAと無関係にベクターの複製を可能とするものであり、複製起点または自己複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドpBR322からの複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適し、2ミクロンプラスミド起点は酵母に適し、種々のウイルス起点(SV40ポリオーマアデノウイルス、VSVまたはBPV)は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物発現ベクターに必要ではない(SV40起点は、それが初期プロモーターを含むことのみを理由として、一般に使用される)。

0160

発現およびクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含み得る。典型的選択遺伝子は、(a)抗生物質または他の毒素、例えば、アンピシリンネオマイシンメトトレキサートまたはテトラサイクリンに耐性を与える、(b)栄養要求欠損を補うまたは(c)複合媒体から利用可能ではない必須栄養素を提供するタンパク質をコードする、例えば、桿菌についてはD−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。

0161

発現およびクローニングベクターは、通常宿主生物により認識され、ここに記載するタンパク質、例えば、フィブロネクチンベースの足場タンパク質をコードする核酸に操作可能に結合される、プロモーターを含む。原核宿主での使用に適するプロモーターは、phoAプロモーター、ベータ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系およびtanプロモーターなどのハイブリッドプロモーターを含む。しかしながら、他の既知細菌プロモーターが適する。細菌系で使用するプロモーターは、ここに記載するタンパク質をコードするDNAに操作可能に結合したシャインダルガノ(S.D.)配列を含む。真核生物についてのプロモーター配列は知られる。事実上全真核生物遺伝子は、転写が開始される位置から約25〜30塩基上流にAT富領域を有する。多くの遺伝子の転写が開始される位置から70〜80塩基上流に見られる他の配列は、CNCAAT領域(ここで、Nは任意のヌクレオチドであり得る)である。大部分の真核生物遺伝子の3’末端は、コード配列の3’末端にポリAテイルを付加するためのシグナルであり得るAATAAA配列である。これら配列の全ては、真核生物発現ベクターに好適に挿入される。

0163

哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ポリオーマウイルス鶏痘ウイルス、アデノウイルス(例えばアデノウイルス2)、ウシ乳頭腫ウイルストリ肉腫ウイルスサイトメガロウイルスレトロウイルスB型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはサルウイルス40(SV40)などのウイルスのゲノムから得たプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーターにより制御され得るが、ただし、このようなプロモーターは宿主細胞系と適合性である。

0164

高等真核生物によるここに記載するタンパク質をコードするDNAの転写は、しばしば、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより、増加される。多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子から知られる(グロビンエラスターゼアルブミン、α−フェトタンパク質およびインスリン)。一般に、しかしながら、真核生物細胞ウイルスからのエンハンサーを使用する。例は、複製起点遅発側のSV40エンハンサー(bp 100〜270)、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点遅発側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーを含む。真核生物プロモーター活性化のための増強要素について、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)も参照のこと。エンハンサーは、ペプチドコード化配列に対して5’位または3’位でベクターにスプライスされるが、好ましくはプロモーターから5’位に位置する。

0165

真核生物宿主細胞(例えば、酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは他の多細胞生物からの有核細胞)で使用する発現ベクターはまた転写停止およびmRNAに必要な配列も含む。このような配列は、一般に真核生物またはウイルスDNAまたはcDNAからの5’、そして時折3’、非翻訳領域から入手可能である。これら領域は、ここに記載するタンパク質をコードするmRNAの非翻訳部分におけるポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントを含む。1つの有用な転写停止成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。WO94/11026およびそれに開示の発現ベクター参照。

0166

組み換えDNAはまた、タンパク質精製に有用であり得る、あらゆるタイプのタンパク質タグ配列も含み得る。タンパク質タグの例は、ヒスチジンタグFLAGタグ、mycタグ、HAタグまたはGSTタグを含むが、これらに限定されない。細菌、真菌、酵母および哺乳動物細胞宿主での使用に適切なクローニングおよび発現ベクターは、Cloning Vectors: A Laboratory Manual, (Elsevier, New York (1985))に見ることができ、その関連する開示は、引用により本明細書に包含させる

0167

発現構築物を、当業者に明らかなとおり、宿主細胞に適する方法を使用して、宿主細胞に導入する。宿主細胞に核酸を導入するための種々の方法は当分野で知られ、エレクトロポレーション塩化カルシウム塩化ルビジウムリン酸カルシウムDEAEデキストランまたは他の物質を使用するトランスフェクション微粒子銃リポフェクション;および感染(ベクターが感染因子であるとき)を含むが、これらに限定されない。

0168

適当な宿主細胞は、原核生物、酵母、哺乳動物細胞または細菌細胞を含む。適当な細菌は、グラム陰性またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌または桿菌属を含む。好ましくはサッカロマイセスセレビシエなどのサッカロミセス属からの酵母もポリペプチドの産生に使用し得る。種々の哺乳動物または昆虫細胞培養系も、組み換えタンパク質発現のために用い得る。昆虫細胞における異種タンパク質の産生のためのバキュロウイルス系は、Luckow et al. (Bio/Technology, 6:47 (1988))によりレビューされている。適当な哺乳動物宿主細胞株の例は、内皮細胞、COS−7サル腎臓細胞、CV−1、L細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、ヒト胚腎臓細胞、HeLa、293、293TおよびBHK細胞株を含む。精製ポリペプチドを、組み換えタンパク質の発現のために、適当な宿主/ベクター系を培養することにより製造する。多くの適用について、ここに記載するポリペプチドの多くの小さいサイズが、発現の好ましい方法として、大腸菌で発現される。次いで、タンパク質を培養培地または細胞抽出物から精製する。

0169

VI.タンパク質産生
またここに記載するのは、抗PD−L1アドネクチンまたはその融合ポリペプチドを発現する細胞株である。抗PD−L1アドネクチンを産生する細胞株の創生および単離は、ここに記載のような、当分野で知られる標準技法を使用して達成され得る。

0170

宿主細胞を、タンパク質産生のためにここに記載する発現またはクローニングベクターでトランスフォームし、誘発プロモーターに適するように修飾した慣用栄養培地で培養し、形質転換体を選択するかまたは所望の配列をコードする遺伝子を増幅する。

0171

本発明のアドネクチンはまた、例えば、原核細胞(例えば、大腸菌)におけるアドネクチンの産生により、非グリコシル化形態でも得られる。注目すべきことに、ここに記載するアドネクチンの非グリコシル化形態は、インビトロで試験したとき、グリコシル化アドネクチンと同一の親和性、効力および作用機序を示す。

0172

本発明のタンパク質の産生に使用する宿主細胞は、種々の培地で培養し得る。ハムF10(Sigma)、最小必須培地((MEM)(Sigma)、RPMI−1640(Sigma)およびダルベッコ改変イーグル培地((DMEM)(Sigma))などの市販の培地が。宿主細胞培養に適する。さらに、Ham et al., Meth. Enzymol., 58:44 (1979), Barites et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980)、米国特許4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655、5,122,469、6,048,728、5,672,502または米国特許RE30,985に記載の多くの培地が、宿主細胞の培養培地として使用され得る。これらの培地の何れも、必要に応じて、ホルモンおよび/または他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリンまたは上皮細胞増殖因子)、塩(例えば塩化ナトリウムカルシウムマグネシウムおよびリン酸塩)、緩衝液(例えばHEPES)、ヌクレオチド(例えばアデノシンおよびチミジン)、抗生物質(例えばゲンタマイシン薬物)、微量元素(通常マイクモル濃度範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される)およびグルコースまたは同等のエネルギー源を添加し得る。任意の他の必要な添加物も適切な濃度で包含され得て、これは当業者に知られる。温度、pHなどの培養条件は、発現のための宿主細胞選択について先に用いたものであり、当業者に知られる。

0173

ここに記載するタンパク質は、無細胞翻訳系を使用しても産生され得る。このような目的で、ポリペプチドをコードする核酸は、mRNAを産生するためにインビトロ転写を可能とするためにおよび利用する特定の無細胞系(哺乳動物または酵母無細胞翻訳系などの真核生物または細菌無細胞翻訳系などの原核生物)におけるmRNAの無細胞翻訳を可能とするために、修飾されなければならない。

0174

ここに記載するタンパク質は、化学合成によっても産生できる(例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, The Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984)に記載の方法により)。タンパク質への修飾も、化学合成により実施され得る。

0175

本発明のタンパク質は、タンパク質化学の分野で一般に知られるタンパク質の単離/精製方法により精製され得る。非限定的例は、抽出、再結晶塩析(例えば、硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムで)、遠心分離透析限外濾過吸着クロマトグラフィーイオン交換クロマトグラフィー疎水性クロマトグラフィー順相クロマトグラフィー逆相クロマトグラフィーゲル濾過ゲル浸透クロマトグラフィー親和性クロマトグラフィー電気泳動向流分配またはこれらの任意の組み合わせを含む。精製後、ポリペプチドを、濾過および透析を含むが、これらに限定されない、当分野で知られる種々の方法の何れかによる異なる緩衝液への交換および/または濃縮をすることができる。

0176

精製ポリペプチドは、好ましくは少なくとも85%純度または好ましくは少なくとも95%純度および最も好ましくは少なくとも98%純度である。純度の正確な数値とは無関係に、ポリペプチドは、医薬品として使用するのに十分に純粋である。

0177

ハイスループットタンパク質産生(HTPP)
選択結合剤を、HIS6タグの上流にPET9dベクターにクローン化し、大腸菌BL21 DE3 plysS細胞にトランスフォームし、50μg/mLカナマイシン含有5mlLB培地に、24ウェル形式で接種し、37℃で一夜インキュベートする。新鮮5ml LB培地(50μg/mL カナマイシン)培養物を、一夜培養物から200μlの吸引により、誘導性発現のために調製し、適切なウェルに分配する。培養物を、37℃でA600 0.6〜0.9まで増殖させる。1mMイソプロピル−β−チオガラクトシド(IPTG)で誘導後、培養物を、6時間、30℃で発現させ、4℃で、10分、2750gの遠心分離により取得する。

0178

細胞ペレット(24ウェル形式)を、450μlの溶解緩衝液(50mM NaH2PO4、0.5M NaCl、1×CompleteTMプロテアーゼ阻害剤カクテル−無EDTA(Roche)、1mMPMSF、10mMCHAPS、40mMイミダゾール、1mg/mlリゾチーム、30μg/ml DNAse、2μg/mlアプロチニン、pH8.0)に再懸濁し、室温で1〜3時間振盪することにより溶解させる。溶解液浄化し、96ウェル、1.2ml捕捉板8(catch plate)を備えた96ウェルWhatman GF/D Unifilterに移すことにより、96ウェル形式に再枠付加(re-rack)し、陽圧で濾過する。浄化した溶解液を、平衡緩衝液(50mM NaH2PO4、0.5M NaCl、40mMイミダゾール、pH8.0)で平衡化した96ウェルニッケルまたはコバルトキレティングプレートに移し、5分インキュベートする。未結合物質を陽圧で除去する。樹脂を0.3ml/ウェルで、洗浄緩衝液#1(50mM NaH2PO4、0.5M NaCl、5mM CHAPS、40mMイミダゾール、pH8.0)で2回洗浄する。各洗液を陽圧により除去する。溶出前、各ウェルを50μl溶出緩衝液(PBS+20mM EDTA)で洗浄し、5分インキュベートし、この洗液を陽圧により廃棄する。タンパク質を、さらに100μlの溶出緩衝液を各ウェルに適用することにより溶出させる。室温で30分インキュベーション後、プレートを、5分、200gで遠心分離し、溶出タンパク質を、溶出前に溶出捕捉板の底に添加した5μlの0.5M MgCl2を含む96ウェル捕捉板に捕捉する。溶出タンパク質を、タンパク質標品として野生型10Fn3ドメインを用いて、総タンパク質アッセイを使用して定量する。

0179

不溶性フィブロネクチンベースの足場タンパク質結合剤の中規模発現および精製
不溶性クローンの発現のために、クローンを、HIS6タグ後、pET9d(EMD Bioscience, San Diego, CA)ベクターにクローン化し、大腸菌HMS174細胞で発現させる。20mlの接種培養(単一平板培養コロニーから産生)を、50μg/mlカルベニシリンおよび34μg/mlクロラムフェニコールを含む1リットルのLB培地の接種に使用する。培養物を、37℃でA600 0.6〜1.0まで増殖させる。1mMイソプロピル−β−チオガラクトシド(IPTG)で誘導後、培養物を4時間、30℃で増殖させ、30分、>10,000g、4℃での遠心分離により取得する。細胞ペレットを−80℃で凍結させる。細胞ペレットを、25mlの溶解緩衝液(20mM aH2PO4、0.5M NaCl、1×完全プロテアーゼ阻害剤カクテル−無EDTA(Roche)、1mMPMSF、pH7.4)に、ULTRA-TURRAX(登録商標)ホモジナイザー(IKA works)を使用して、上で再懸濁させる。細胞溶解を、モデルM-l 10SMICROFLUIDIZER(登録商標)(Microfluidics)を使用する、高圧均一化(>18,000psi)により達成する。不溶性フラクションを、30分、23,300g、4℃での遠心分離により分離する。溶解物から遠心分離により取得した不溶性ペレットを、20mMリン酸ナトリウム/500mM NaCl、pH7.4で洗浄する。ペレットを6.0M塩酸グアニジンの20mM リン酸ナトリウム/500M NaCl pH7.4溶液に、超音波処理により再溶解し、37℃で1〜2時間インキュベートする。再可溶化ペレットを0.45μmで濾過し、20mM リン酸ナトリウム/500M NaCl/6.0MグアニジンpH7.4緩衝液で平衡化したHistrapカラムに載せる。充填後、カラムを、さらに25CVの同一緩衝液で洗浄する。結合タンパク質を、50mMイミダゾールの20mM リン酸ナトリウム/500mM NaCl/6.0M guan−HCl pH7.4溶液で溶出する。精製タンパク質を、50mM酢酸ナトリウム/150mM NaCl pH4.5に対して透析する。

0180

可溶性フィブロネクチンベースの足場タンパク質結合剤の中規模発現および精製
可溶性クローン発現のために、クローンを、HIS6タグ後、pET9d(EMD Bioscience, San Diego, CA)ベクターにクローン化し、大腸菌HMS174細胞で発現させる。20mlの接種培養(単一平板培養コロニーから産生)を、50μg/mlカルベニシリンおよび34μg/mlクロラムフェニコールを含む1リットルのLB培地の接種に使用する。培養物を、37℃でA600 0.6〜1.0まで増殖させる。1mMイソプロピル−β−チオガラクトシド(IPTG)で誘導後、培養物を4時間、30℃で増殖させ、30分、>10,000g、4℃での遠心分離により取得する。細胞ペレットを−80℃で凍結させる。細胞ペレットを、25mlの溶解緩衝液(20mM NaH2PO4、0.5M NaCl、1×完全プロテアーゼ阻害剤カクテル−無EDTA(Roche)、1mMPMSF、pH7.4)に、ULTRA-TURRAX(登録商標)ホモジナイザー(IKA works)を使用して、氷上で再懸濁させる。細胞溶解を、モデルM-1 10SMICROFLUIDIZER(登録商標)(Microfluidics)を使用する、高圧均一化(>18,000psi)により達成する。可溶性フラクションを、30分、23,300g、4℃での遠心分離により分離する。上清を0.45μmフィルターで浄化する。浄化溶解物を、20mMリン酸ナトリウム/500M NaCl pH7.4で予め平衡化したHistrapカラム(GE)に載せる。次いで、カラムを25カラム体積の同一緩衝液、続いて20カラム体積の20mM リン酸ナトリウム/500M NaCl/25mMイミダゾール、pH7.4、次いで35カラム体積の20mM リン酸ナトリウム/500M NaCl/40mMイミダゾール、pH7.4で洗浄する。タンパク質を、15カラム体積の20mM リン酸ナトリウム/500M NaCl/500mMイミダゾール、pH7.4で溶出し、フラクションをA2soでの吸光度に基づきプールし、1×PBS、50mM Tris、150mM NaCl; pH8.5または50mM NaOAc;150mM NaCl;pH4.5に対して透析する。何らかの沈殿を0.22μmでの濾過により除去する。

0181

VII.組成物
本発明は、さらに、ここに記載する抗PD−L1アドネクチンまたはその融合タンパク質を含む、医薬組成物および放射性医薬組成物などの組成物を提供し、ここで、組成物は本質的に無エンドトキシンであるかまたは少なくとも適切な規制当局(例えば、FDA)により決定されるエンドトキシンの許容されるレベルを超えて含まない。

0182

組成物を製造する当分野で周知の方法は、例えば、"Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed., ed. A. R. Gennaro AR., 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)に見ることができる。非経腸投与用組成物は、例えば、添加物、無菌水食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール植物起源の油または水素ナフタレンを含み得る。生体適合性生分解性ラクチドポリマー、ラクチド/グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレンポリオキシプロピレンコポリマーを、化合物の溶出制御のために使用し得る。ナノ粒子組成物(例えば、生分解性ナノ粒子固体脂質ナノ粒子リポソーム)を、化合物の生体分布の制御に使用し得る。他の有用な可能性のある非経腸送達は、エチレンビニルアセテートコポリマー粒子浸透圧ポンプ、埋め込み型溶出系およびリポソームを含む。組成物中の化合物濃度は、投与すべき薬物の投与量、投与経路および組成物の目的(例えば、予防、治療、診断)を含む、多数の因子により変わる。

0183

許容される担体、添加物または安定化剤は、用いる濃度でレシピエンドに非毒性であり、リン酸クエン酸および他の有機酸などの緩衝液;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライドヘキサメトニウムクロライド塩化ベンザルコニウム塩化ベンゼトニウムフェノールブチルまたはベンジルアルコールメチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベンカテコールレゾルシノールシクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマーグリシングルタミンアスパラギンヒスチジンアルギニンまたはリシンなどのアミノ酸;グルコース、マンノースまたはデキストランを含む単糖二糖および他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;スクロースマンニトールトレハロースまたはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成カウンターイオン金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);および/またはTween、PLURONICTMまたはポリエチレングリコール(PEG)などの非イオン性界面活性剤を含む。

0184

本発明のポリペプチドは、所望により、製薬業界で一般的に使用される非毒性酸付加塩などの薬学的に許容される塩または金属錯体として投与され得る。酸付加塩の例は、酢酸乳酸、パモ酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸安息香酸パルミチン酸スベリン酸サリチル酸酒石酸メタンスルホン酸トルエンスルホン酸またはトリフルオロ酢酸などの有機酸;タンニン酸カルボキシメチルセルロースなどの重合酸;および塩酸臭化水素酸硫酸リン酸などの無機酸を含む。金属錯体は、亜鉛、鉄などを含む。一例において、ポリペプチドは、熱安定性を高めるために、酢酸ナトリウム存在下で製剤化される。

0185

活性成分を、例えば、コアセルベーション技法または界面重合化により、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−(メチルメタレート)マイクロカプセルに、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェアマイクロエマルジョンナノ−粒子およびナノカプセル)またはマクロエマルジョンに、マイクロカプセル封入してよい。このような技法は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。

0186

インビボ投与に使用するための医薬組成物は、一般に無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜での濾過により達成され得る。組成物が凍結乾燥されるならば、この方法を使用する滅菌を、凍結乾燥および再構成の前または後に実施し得る。非経腸投与用組成物を、凍結乾燥形態でまたは溶液で保存し得る。さらに、非経腸組成物は、一般に無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針穿刺可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れられる。

0187

医薬組成物が製剤化されたら、溶液、懸濁液、ゲルエマルジョン固体または脱水または凍結乾燥粉末として無菌バイアルで保存され得る。このような製剤を、即時使用型形態でまたは投与前に再構成を必要とする形態(例えば、凍結乾燥)で保存し得る。

0188

VIII.生物物理学および生物化学的特徴付け
ここに記載する抗PD−L1アドネクチンのPD−L1、例えば、ヒトPD−L1への結合を、平衡定数(例えば、解離、KD)の観点で、および速度定数(例えば、結合速度定数、konおよび解離速度定数、koff)により評価し得る。アドネクチンは、一般に標的分子に500nM、100nM、10nM、1nM、500pM、200pMまたは100pM未満のKDで結合するが、高いKD値も、koffが十分に低いかまたはkonが十分に高いならば、許容され得る。

0189

結合親和性についてのインビトロアッセイ
PD−L1に結合し、拮抗する抗PD−L1アドネクチンを、種々のインビトロアッセイを使用して、同定し得る。ある実施態様において、アッセイは、複数候補アドネクチンの同時のスクリーニングを可能とするハイスループットアッセイである。

0190

抗PD−L1アドネクチンの結合親和性決定のための例示的アッセイは、結合平衡除外アッセイ(KinExA)(Blake et al.,JBC 1996; 271:27677-85; Drake et al., Anal Biochem 2004; 328:35-43)、Biacore系(Uppsala, Sweden)での表面プラズモン共鳴(SPR)(Welford et al., Opt. Quant. Elect 1991; 23:1; Morton and Myszka, Methodsin Enzymology 1998; 295:268)および均一性時間分解蛍光(HTRF)アッセイ(Newton et al., J Biomol Screen 2008; 13:674-82; Patel et al., Assay Drug Dev Technol 2008; 6:55-68)などの液相方法を含むが、これらに限定されない。

0191

ある実施態様において、生体分子相互作用を、Biacore系を用いてリアルタイムにモニターでき、これは、300nmまで離れた表面の屈折指数の変化により、ガラス支持体上の薄金フィルムの表面での光の共鳴角の変化を検出するための、SPRを使用する。Biacore分析は、会合速度定数、解離速度定数、平衡解離定数および親和性定数をもたらす。結合親和性は、Biacore表面プラズモン共鳴系(Biacore, Inc.)を使用する会合および解離速度定数の評価により得る。バイオセンサーチップは、標的の共有結合カップリングのために活性化される。次いで、標的を希釈し、チップ上に注入して、固定化物質応答単位でシグナルを得る。共鳴単位(RU)でのシグナルが固定化物質の質量に比例するため、これは、マトリックス上の固定化標的密度を表す。会合および解離データを、1:1二分子相互作用についての正味速度発現を解決するための大域解析に同時に適合させ、kon、koffおよびRmax(飽和での最大応答)での最適フィット値を得る。結合についての平衡解離定数KDを、koff/konとしてのSPR測定値から計算する。

0192

ある実施態様において、ここに記載する抗PD−L1アドネクチンは、実施例2に記載のSPR親和性アッセイで、ヒトPD−L1への結合について500nM以下、400nM以下、300nM以下、200nM以下、150nM以下、100nM以下、90nM以下、80nM以下、70nM以下、60nM以下、50nM以下、40nM以下、30nM以下、20nM以下、15nM以下、10nM以下、5nM以下または1nM以下のKDを示す。

0193

上記アッセイは例であり、タンパク質間の結合親和性決定について当分野で知られるあらゆる方法(例えば、蛍光ベース移動(FRET)、酵素結合免疫吸着アッセイおよび競合的結合アッセイ(例えば、ラジオイムノアッセイ))を、ここに記載する抗PD−L1アドネクチンの結合親和性評価に使用できることが理解されるべきである。

0194

IX. 抗PD−L1アドネクチンでのインビボ造影
造影剤
ここに記載する抗PD−L1アドネクチンはまた種々の診断および造影適用に有用である。ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンをインビボで検出可能である部分で標識し、このような標識アドネクチンをインビボ造影剤として、例えば、全身造影のために使用し得る。例えば、ある実施態様において、対象におけるPD−L1陽性腫瘍を検出する方法は、対象に、検出可能標識に結合した抗PD−L1アドネクチンを投与し、適切な時間後、対象における該標識を検出することを含む。

0195

抗PD−L1アドネクチン造影剤を、PD−L1のレベル増加と関連する障害または疾患、例えば、腫瘍が選択的にPD−L1を過発現する癌の診断に使用し得る。類似する方法で、抗PD−L1アドネクチンを、対象、例えば、PD−L1レベルおよび/またはPD−L1陽性細胞(例えば、腫瘍細胞または腫瘍浸潤性リンパ球(TIL))を減少させる処置中の対象または免疫療法、例えば、PD−1アンタゴニストで処置された対象における、PD−L1レベルのモニターに使用できる。抗PD−L1アドネクチン造影剤を、使用して、対象がPD−1またはPD−L1アンタゴニスト処置などのPD−L1の存在を必要とする療法、例えば、免疫療法に応答する可能性があるか否かを決定し得る。抗PD−L1アドネクチンを修飾してまたはせずに使用でき、検出可能部分を共有結合または非共有結合により標識し得る。

0196

使用し得る検出可能部分は、放射性薬剤、例えば、鉄キレートなどの放射性重金属ガドリニウムまたはマンガンの放射性キレート酸素窒素、鉄、炭素またはガリウム陽電子放射体、18F、60Cu、61Cu、62Cu、64Cu、124I、86Y、89Zr、66Ga、67Ga、68Ga、44Sc、47Sc、11C、111In、114mIn、114In、125I、124I、131I、123I、131I、123I、32Cl、33Cl、34Cl、74Br、75Br、76Br、77Br、78Br、89Zr、186Re、188Re、86Y、90Y、177Lu、99Tc、212Bi、213Bi、212Pb、225Acまたは153Smを含む。

0197

ある実施態様において、放射性薬剤は、1以上のアミノ酸残基でアドネクチンとコンジュゲートされる。ある実施態様において、1以上、例えば2以上、3以上、4以上またはそれより多い数の放射性核種が標識プローブに存在し得る。ある実施態様において、放射性核種を、キレート剤によりアドネクチンに直接結合する(例えば、米国特許8,808,665参照)。ある実施態様において、放射性核種は、二機能性キレーターまたは接合(BFC)部分によりアドネクチンにコンジュゲートした補欠分子族に存在する。ある実施態様において、放射性核種キレート剤および/またはコンジュゲート部分は、DFO、DOTAおよびその誘導体(CB−DO2A、3p−C−DEPA、TCMC、Oxo−DO3A)、DBCO、TE2A、CB−TE2A、CB−TE1A1P、CB−TE2P、MM−TE2A、DM−TE2A、diamsarおよび誘導体、NODASA、NODAGA、NOTA、NETA、TACN−TM、DTPA、1B4M−DTPA、CHX−A’’−DTPA、TRAP(PRP9)、NOPO、AAZTAおよび誘導体(DATA)、H2dedpa、H4octapa、H2azapa、H5decapa、H6phospa、HBED、SHBED、BPCA、CP256、PCTA、HEHA、PEPA、EDTA、TETAおよびTRITAベースのキレート剤およびその近似アナログおよび誘導体である。

0198

ある実施態様において、放射性核種キレートまたは接合(BFC)部分は、マレアミド−NODAGAまたはマレアミド−DBCOであり、これは、ポリペプチドのC末端に近いaシステイン残基により、ポリペプチドに共有結合により結合し得る。ある実施態様において、抗PD−L1アドネクチンは、システイン付加によりそのC末端を修飾される。例えば、PxCyは、C末端にアミノ酸残基NYRT(ここで、Pはプロリンであり、Cはシステインであり、xおよびyは、少なくとも1である整数である)に結合し得る。C末端にアミノ酸残基PCを有する例示的抗PD−L1アドネクチンは、実施例に示す。マレイミド−NODAGAまたはマレイミド−DBCOをシステインと反応させ、それぞれアドネクチン−NODAGAまたはアドネクチン−DBCOを生じさせ得る。

0199

ある実施態様において、放射性核種キレート剤はDFOであり、これは、例えば、無作為に表面リシンに結合し得る。

0200

ある実施態様において、64CuのキレーターはDOTA、NOTA、EDTA、Df、DTPAまたはTETAである。キレート剤および放射性核種の適当な組み合わせは、Price et al., Chem Soc Rev 2014;43:260-90に広くレビューされている。

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