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技術 二重特異性チェックポイント阻害剤抗体

出願人 ゼンコアインコーポレイテッド
発明者 バーネット,マシュームーア,グレゴリーデスジャルレイス,ジョンヘドバット,マイケルボンゾン,クリスティーンニスタール,アレックス
出願日 2017年6月14日 (2年10ヶ月経過) 出願番号 2018-565349
公開日 2019年9月12日 (7ヶ月経過) 公開番号 2019-525738
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 総フラックス 二重チェック 特定位 栓抜き 単一電荷 技術データ 機能効果 インホール
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、二重特異性ヘテロ二量体チェックポイント抗体を対象とする。

概要

背景

TLA−4、PD−1(プログラム細胞死1)、TIM−3(T細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン3)、LAG−3(リンパ球活性化遺伝子3)、TIGIT(IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体)などのチェックポイント受容体は、T細胞および他の細胞型の活性化、増殖、および/またはエフェクター活性阻害する。チェックポイント受容体が、腫瘍細胞に対する内因性細胞応答を抑制するという仮説に導かれて、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、およびトレリムマブを含む抗CTLA4および抗PD1抗体の前臨床研究および臨床研究では、確かに、様々な悪性腫瘍を有するごく一部の患者において、チェックポイント遮断により、優れた抗腫瘍応答がもたらされ、内因性T細胞が刺激されて腫瘍細胞が攻撃され、長期の癌の寛解がもたらされることが示された。残念ながら、患者の一部のみがこれらの療法への応答を示し、その応答率は、適応症および他の要因に応じて、通常、10〜30%の範囲であり、各単剤療法に関してはそれよりも高いときもある。これらの作用剤治療的組み合わせ、例えば、イピリムマブにニボルマブを加えた組み合わせは、場合によっては60%近くの、さらにより高い応答率をもたらす。前臨床研究では、抗PD−1抗体および/または抗CTLA−4抗体と、LAG−3、TIM−3、BTLA、およびTIGITを含む、最近になって同定されたチェックポイント受容体の遮断との間の付加的相乗効果が示された。複数のチェックポイント遮断の潜在能力が極めて有望である一方で、そのような作用剤との組み合わせ療法では、重い経済的負担を背負うことが求められる。さらに、組み合わせ療法、例えば、ニボルマブにイピリムマブを加えた療法の自己免疫毒性は、単剤療法と比較して大幅に上昇し、多くの患者を療法の停止へと至らしめる。

腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を調査したいくつかの研究(Ahmadzadeh et al.,Blood114:1537(2009)、Matsuzaki et al.,PNAS 107(17):7875−7880(2010)、Fourcade et al.,Cancer Res.72(4):887−896(2012)、およびGros et al.,J.Clinical Invest.124(5):2246(2014))では、TILは一般的に複数のチェックポイント受容体を発現することが示された。さらに、複数のチェックポイントを発現するTILは、おそらく、実際に最も腫瘍応答性であろう。これとは対象的に、末梢にある非腫瘍応答性T細胞は、単一のチェックポイントを発現する可能性が高い。単一特異性完全長抗体を用いたチェックポイント遮断は、自己免疫毒性に寄与すると思われる自己抗原応答性の単一発現T細胞に対する腫瘍応答性TILの抑制解除に関して、おそらく、無差別的である。

したがって、本発明は、2つの異なるチェックポイント阻害剤タンパク質に結合する二重特異性抗体を対象とするものである。

概要

本発明は、二重特異性ヘテロ二量体チェックポイント抗体を対象とする。A−I

目的

本発明は、ヒトPD−1、ヒトCTLA−4、ヒトTIM−3、ヒトLAG−3、およびヒトTIGITなどの2つの異なるチェックポイント細胞表面受容体に結合する二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
- 件
牽制数
- 件

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請求項1

a)第1の重鎖であって、i)第1の変異Fcドメインと、ii)第1の抗原に結合する単鎖Fv領域(scFv)であって、前記scFv領域は、第1の可変ドメイン(heavydomain)、第1の可変軽ドメイン(lightdomain)、および帯電scFvリンカーを含み、前記帯電scFvリンカーは、前記第1の可変重ドメインと前記可変軽ドメインを共有結合している、単鎖Fv領域と、を含む、第1の重鎖と、b)VH−CH1−ヒンジ−CH2−CH3単量体を含む第2の重鎖であって、VHは、第2の可変重ドメインであり、CH2−CH3は、第2の変異Fcドメインである、第2の重鎖と、c)第2の可変軽ドメインおよび軽定常ドメインを含む、軽鎖と、を含み、前記第2の変異Fcドメインは、アミノ酸置換N208D/Q295E/N384D/Q418E/N241Dを含み、前記第1および第2の変異Fcドメインは各々、アミノ酸置換E233P/L234V/L235A/G236del/S267Kを含み、前記第1の変異Fcドメインは、アミノ酸置換S364K/E357Qを含み、第2の変異Fcドメインは、アミノ酸置換L368D/K370Sを含み、前記第1の可変重ドメインおよび第1の可変軽ドメインは、配列番号11376および配列番号11377、配列番号22970および配列番号22971、配列番号11394および配列番号11395、配列番号11367および配列番号11368、ならびに配列番号11412および配列番号11413を含む組から選択され、番号付けは、KabatのEUインデックスによる、ヘテロ二量体抗体。

請求項2

前記第2の重鎖の前記CH1−ヒンジ−CH2−CH3構成要素が、配列番号37725を有し、前記第1の変異Fcドメインが、配列番号37726を有し、前記定常軽ドメインが、配列番号37727を有する、請求項1に記載のヘテロ二量体抗体。

請求項3

前記第2の可変重ドメインおよび前記第2の可変軽ドメインが、ヒトCTLA−4、ヒトLAG−3、ヒトTIM−3、およびヒトTIGITの群由来のヒトチェックポイント受容体に結合する抗原結合ドメインを形成している、請求項1または2に記載のヘテロ二量体抗体。

請求項4

前記第1の可変重ドメインが、配列番号11394を有し、第1の可変軽ドメインが、配列番号11395を有する、請求項1、2、または3に記載のヘテロ二量体抗体。

請求項5

前記第1の重鎖が、配列番号23581を有し、前記第2の重鎖が、配列番号23576を有し、前記軽鎖が、配列番号23591を有する、請求項1、2、3、または4に記載のヘテロ二量体抗体。

請求項6

a)請求項1〜5に記載の第1の重鎖をコードする第1の核酸と、b)請求項1〜5に記載の第2の重鎖をコードする第2の核酸と、c)請求項1〜5に記載の軽鎖をコードする第3の核酸と、をそれぞれ含む、核酸組成物

請求項7

a)請求項6に記載の第1の核酸を含む、第1の発現ベクターと、b)請求項6に記載の第2の核酸を含む、第2の発現ベクターと、c)請求項6に記載の第3の核酸を含む、第3の発現ベクターと、を含む、発現ベクター組成物

請求項8

請求項7に記載の発現ベクター組成物を含む、宿主細胞

請求項9

請求項1〜5に記載のヘテロ二量体抗体を作製する方法であって、前記抗体が発現する条件下で、請求項8に記載の宿主細胞を培養することと、前記抗体を回収することと、を含む、方法。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2016年6月14日出願の米国仮特許出願第62/350,145号、2016年6月22日出願の同第62/353,511号、および2016年11月10日出願の同第.62/420,500号の優先権を主張するものであり、これらの内容は、それらの全体が本明細書に参照により明示的かつ完全に組み込まれる。

0002

配列表
本出願は、ASCII形式電子的に提出され、その全体が本明細書に参照により組み込まれる配列表を含む。2017年6月9日作成のこのASCIIの複製は、067461_5191WO_SL.txtという名前であり、サイズは、32,442,145キロバイトである。

背景技術

0003

TLA−4、PD−1(プログラム細胞死1)、TIM−3(T細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン3)、LAG−3(リンパ球活性化遺伝子3)、TIGIT(IgおよびITIMドメインを有するT細胞免疫受容体)などのチェックポイント受容体は、T細胞および他の細胞型の活性化、増殖、および/またはエフェクター活性阻害する。チェックポイント受容体が、腫瘍細胞に対する内因性細胞応答を抑制するという仮説に導かれて、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、およびトレリムマブを含む抗CTLA4および抗PD1抗体の前臨床研究および臨床研究では、確かに、様々な悪性腫瘍を有するごく一部の患者において、チェックポイント遮断により、優れた抗腫瘍応答がもたらされ、内因性T細胞が刺激されて腫瘍細胞が攻撃され、長期の癌の寛解がもたらされることが示された。残念ながら、患者の一部のみがこれらの療法への応答を示し、その応答率は、適応症および他の要因に応じて、通常、10〜30%の範囲であり、各単剤療法に関してはそれよりも高いときもある。これらの作用剤治療的組み合わせ、例えば、イピリムマブにニボルマブを加えた組み合わせは、場合によっては60%近くの、さらにより高い応答率をもたらす。前臨床研究では、抗PD−1抗体および/または抗CTLA−4抗体と、LAG−3、TIM−3、BTLA、およびTIGITを含む、最近になって同定されたチェックポイント受容体の遮断との間の付加的相乗効果が示された。複数のチェックポイント遮断の潜在能力が極めて有望である一方で、そのような作用剤との組み合わせ療法では、重い経済的負担を背負うことが求められる。さらに、組み合わせ療法、例えば、ニボルマブにイピリムマブを加えた療法の自己免疫毒性は、単剤療法と比較して大幅に上昇し、多くの患者を療法の停止へと至らしめる。

0004

腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を調査したいくつかの研究(Ahmadzadeh et al.,Blood114:1537(2009)、Matsuzaki et al.,PNAS 107(17):7875−7880(2010)、Fourcade et al.,Cancer Res.72(4):887−896(2012)、およびGros et al.,J.Clinical Invest.124(5):2246(2014))では、TILは一般的に複数のチェックポイント受容体を発現することが示された。さらに、複数のチェックポイントを発現するTILは、おそらく、実際に最も腫瘍応答性であろう。これとは対象的に、末梢にある非腫瘍応答性T細胞は、単一のチェックポイントを発現する可能性が高い。単一特異性完全長抗体を用いたチェックポイント遮断は、自己免疫毒性に寄与すると思われる自己抗原応答性の単一発現T細胞に対する腫瘍応答性TILの抑制解除に関して、おそらく、無差別的である。

0005

したがって、本発明は、2つの異なるチェックポイント阻害剤タンパク質に結合する二重特異性抗体を対象とするものである。

0006

本発明は、ヒトPD−1、ヒトCTLA−4、ヒトTIM−3、ヒトLAG−3、およびヒトTIGITなどの2つの異なるチェックポイント細胞表面受容体に結合する二重特異性ヘテロ二量体抗体を提供する。したがって、いくつかの態様では、好適な二重特異性抗体は、PD−1およびCTLA−4、PD−1およびTIM−3、PD−1およびLAG−3、PD−1およびTIGIT、PD−1およびBTLA、CTLA−4およびTIM−3、CTLA−4およびLAG−3、CTLA−4およびTIGIT、CTLA−4およびBTLA、TIM−3およびLAG−3、TIM−3およびTIGIT、TIM−3およびBTLA、LAG−3およびTIGIT、LAG−3およびBTLA、ならびにTIGITおよびBTLAに結合する。

0007

一態様では、本発明は、栓抜き型を提供し、この栓抜き型は、a)帯電scFvリンカー(いくつかの実施形態では、図7の+H配列が好ましい)を使用して連結された可変重ドメインおよび可変軽ドメインを有するscFv、非対称変異体S364K/E357Q、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267Kを含むFcドメイン、ならびに本明細書で概説するチェックポイント受容体に結合するFvを含む第1の単量体(時として「scFv重鎖」と称される「scFv単量体」)と、b)非対称変異体L368D/K370S、pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267Kを有するFcドメイン、および可変軽ドメインと一緒になって、本明細書で概説する第2のチェックポイント受容体に結合するFvを作りあげる可変重ドメインを含む、第2の単量体(「Fab単量体」または「重鎖」)と、c)軽鎖と、を含む。この特定の実施形態では、好適な単量体Fvの対としては、(Fabを最初に記載し、次にscFvを記載する)PD−1およびCTLA−4、CTLA−4およびPD−1、PD−1およびTIM−3、TIM−3およびPD−1、PD−1およびLAG−3、LAG−3XPD1、PD−1およびTIGIT、TIGITおよびPD−1、PD−1およびBTLA、BTLAおよびPD−1、CTLA−4およびTIM−3、TIM−3およびCTLA−4、CTLA−4およびLAG−3、LAG−3およびCTLA−4、CTLA−4およびTIGIT、TIGITおよびCTLA−4、CTLA−4およびBTLA、BTLAおよびCTLA−4、TIM−3およびLAG−3、LAG−3およびTIM−3、TIM−3およびTIGIT、TIGITおよびTIM−3、TIM−3およびBTLA、BTLAおよびTIM−3、LAG−3およびTIGIT、TIGITおよびLAG−3、LAG−3およびBTLA、BTLAおよびLAG−3、BTLAおよびTIGIT、ならびにTIGITおよびBTLAが挙げられる。

0008

本発明の他の態様を、本明細書に提供する。

図面の簡単な説明

0009

本発明のいくつかの型を示す。最初の型は、「栓抜き」型であり、第1および第2の抗抗原結合ドメインを有する。加えて、mAb−Fv、mAb−scFv、中心−scFv、中心−Fv、片腕中心−scFv、1scFv−mAb、scFv−mAb、および二重scFv型全てが示されている。示されるscFvドメインの全てについて、それらは、NからC末端可変重−(任意のリンカー)−可変軽、またはその逆のいずれかであり得る。加えて、片腕scFv−mAbについて、scFvは、重鎖単量体のN末端または軽鎖のN末端のいずれかに結合され得る。
図2A、2B、2C、および2D)臨床開発がしやすいようにヒトおよびカニクイザルの配列の両方に結合する抗原結合ドメインの開発を容易にするために、多くの場合ヒトおよびカニクイザルの両方を含む、本発明において使用するいくつかの抗原抗原配列を示す。
ヘテロ二量体化変異体のセットの有用な対(非対称変異体およびpI変異体を含む)を示す。図3Eでは、対応する「単量体2」の変異体が存在しない変異体が存在する。これらはどちらかの単量体で単独で使用されるか、または栓抜きのFab側に含まれ得るpI変異体であり、例えば、適切な帯電scFvリンカーが第2の抗原結合ドメインとしてscFvを利用する第2の単量体で使用され得る。好適な帯電リンカーは、図7に示される。
配電子変異体抗体定常領域およびそれらのそれぞれの置換リストを示す。pI_(−)は、より低いpI変異体を示し、一方でpI_(+)は、より高いpI変異体を示す。これらは、本発明の他の二量体化変異体と、(かつ本明細書に概説されるように、他の変異体の型と)任意選択かつ独立に組み合わせることができる。
FcγR結合を切断する有用な切断変異体(「ノックアウト」または「KO」変異体と呼ばれることがある)を示す。一般に、切断変異体は、両方の単量体に見られるが、場合によっては、それらは、1つの単量体にしか存在しなくもよい。
図1Aまたは図1Fの型のいずれかに使用することができる本発明の2つの特に有用な実施形態を示す。図1Aの型について、この実施形態の「非Fv」構成要素が図37Aに示されるが、他の型も(および図38のものも)同様に使用することができる。
1つ以上のscFvを構成要素として利用するヘテロ二量体抗体のpIを増加または減少させることにおいて有用であるいくつかの帯電scFvリンカーを示す。(+H)陽性リンカーは、本明細書に示される特に抗CD3vlおよびvh配列と共に、本明細書において特に有用である。単一電荷を有する、単一の先行技術scFvリンカーは、Whitlow et al.,Protein Engineering 6(8):989−995(1993)にちなんで、「Whitlow」と呼ばれる。このリンカーは、scFvにおいて、凝集の低減、およびタンパク質分解に対する安定性の増強に向けて使用されることに留意されたい。
操作されたヘテロ二量体非対称Fc変異体のリストをヘテロ二量体の収率HPLCCIEXにより決定)および熱安定性DSCにより決定)と共に示す。未決定の熱安定性は、「n.d.」と示される。
列番号6209〜11464、配列番号11465〜17134、配列番号33003〜33072、配列番号33073〜35394、および配列番号36127〜36146としてリストに記載される追加の抗PD−1 ABDと共に、選択されたいくつかのPD−1 ABDを示す。CDR下線が付され、scFvリンカーは二重下線が付され(配列において、scFvリンカーは正帯電scFv(GKPGS)4リンカー(配列番号37755)であるが、当業者に理解されるように、このリンカーは、非帯電または負帯電リンカーを含む他のリンカーに置き換えられてもよく、その一部が図7に示される)、斜線可変ドメイン境界複数可)を示す。加えて、命名規則は、NからC末端のscFvの配向を図示する。すなわち、「H1.279_L1.194」は、配向がvh−scFvリンカー−vlである(NからC末端、使用される型に応じて、任意選択のドメインリンカーが片側または両側にある)ことを示すが、これらの配列は、反対の配向の(NからC末端)vl−リンカー−vhでも使用することができる。同様に、「L1.194_H1.279」は、配向がvl−scFvリンカー−vhである(NからC末端、同様に、任意選択のドメインリンカーを有する)ことを示し、反対の配向も本発明内に含まれる。本明細書に記載され、CDRを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、CDR位置の正確な同定は、表1に示されるように、使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、したがって、下線が付されているCDRだけでなく、他の番号付けシステムを使用するvhおよびvlドメイン内に含まれるCDRも本明細書に含まれる。さらに、図の全ての配列に関して、これらのvhおよびvl配列は、scFv型またはFab型のいずれかで使用され得る。
配列番号21〜2918、配列番号2919〜6208、配列番号36739〜36818、および配列番号35395〜35416としてリストに記載される追加の抗CTLA−4 ABDと共に、いくつかのCTLA−4 ABDを示す。CDRは下線が付され、scFvリンカーは二重下線が付され(配列において、scFvリンカーは正帯電scFv(GKPGS)4リンカー(配列番号37755)であるが、当業者に理解されるように、このリンカーは、非帯電または負帯電リンカーを含む他のリンカーに置き換えられてもよく、そのうちのいくつかが図7に示される)、斜線は可変ドメインの境界(複数可)を示す。上記のように、命名規則は、NからC末端のscFvの配向を図示する。この図のリストに記載される配列において、それらは全て、vh−scFvリンカー−vl(NからC末端)のように配向されるが、これらの配列は、反対の配向の(NからC末端)vl−リンカー−vhでも使用することができる。加えて、配列番号21〜2918、配列番号:2919〜6208、配列番号36739〜36818、および配列番号35395〜35416の配列のうちのいくつかは、反対の配向にある。本明細書に記載され、CDRを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、CDR位置の正確な同定は、表1に示されるように、使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、したがって、下線が付されているCDRだけでなく、他の番号付けシステムを使用するvhおよびvlドメイン内に含まれるCDRも本明細書に含まれる。さらに、図の全ての配列に関して、これらのvhおよびvl配列は、scFv型またはFab型のいずれかで使用され得る。特に、図の多くは、scFv型およびFab型の両方のXENP識別子を含み、例えば、XENP19235がFab型を使用する分子であり、XENP19769がscFv分子であることを示す図10Aを参照されたい。
配列番号17135〜20764、配列番号36819〜36962、配列番号35417〜35606、配列番号25194〜32793、および配列番号32794〜33002としてリストに記載される追加の抗LAG−3 ABDと共に、いくつかのLAG−3 ABDを示す。CDRは下線が付され、scFvリンカーは二重下線が付され(配列において、scFvリンカーは正帯電scFv(GKPGS)4リンカーであるが、当業者に理解されるように、このリンカーは、非帯電または負帯電リンカーを含む他のリンカーに置き換えられてもよく、そのうちのいくつかが図7に示される)、斜線は可変ドメインの境界(複数可)を示す。上記のように、命名規則は、NからC末端のscFvの配向を図示する。この図のリストに記載される配列において、それらは全て、vh−scFvリンカー−vl(NからC末端)のように配向されるが、これらの配列は、反対の配向の(NからC末端)vl−リンカー−vhでも使用することができる。加えて、配列番号17135〜20764、配列番号36819〜36962、配列番号35417〜35606、配列番号25194〜32793、および配列番号32794〜33002の配列のうちのいくつかは、反対の配向にある。本明細書に記載され、CDRを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、CDR位置の正確な同定は、表1に示されるように、使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、したがって、下線が付されているCDRだけでなく、他の番号付けシステムを使用するvhおよびvlドメイン内に含まれるCDRも本明細書に含まれる。さらに、図の全ての配列に関して、これらのvhおよびvl配列は、scFv型またはFab型のいずれかで使用され得る。
配列番号20885〜21503および配列番号36707〜36738としてリストに記載される追加の抗BTLA ABDと共に、いくつかのBTLA ABDを示す。CDRは下線が付され、scFvリンカーは二重下線が付され(配列において、scFvリンカーは正帯電scFv(GKPGS)4リンカーであるが、当業者に理解されるように、このリンカーは、非帯電または負帯電リンカーを含む他のリンカーに置き換えられてもよく、そのうちのいくつかが図7に示される)、斜線は可変ドメインの境界(複数可)を示す。上記のように、命名規則は、NからC末端のscFvの配向を図示する。この図のリストに記載される配列において、それらは全て、vh−scFvリンカー−vl(NからC末端)のように配向されるが、これらの配列は、反対の配向の(NからC末端)vl−リンカー−vhでも使用することができる。加えて、配列番号20885〜21503および配列番号36707〜36738の配列のうちのいくつかは、反対の配向にある。本明細書に記載され、CDRを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、CDR位置の正確な同定は、表1に示されるように、使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、したがって、下線が付されているCDRだけでなく、他の番号付けシステムを使用するvhおよびvlドメイン内に含まれるCDRも本明細書に含まれる。さらに、図の全ての配列に関して、これらのvhおよびvl配列は、scFv型またはFab型のいずれかで使用され得る。
配列番号20765〜20884、配列番号37587〜37698、および配列番号36347〜36706としてリストに記載される追加の抗TIM−3 ABDと共に、いくつかのTIM−3 ABDを示す。CDRは下線が付され、scFvリンカーは二重下線が付され(配列において、scFvリンカーは正帯電scFv(GKPGS)4リンカーであるが、当業者に理解されるように、このリンカーは、非帯電または負帯電リンカーを含む他のリンカーに置き換えられてもよく、そのうちのいくつかが図7に示される)、斜線は可変ドメインの境界(複数可)を示す。上記のように、命名規則は、NからC末端のscFvの配向を図示する。この図のリストに記載される配列において、それらは全て、vh−scFvリンカー−vl(NからC末端)のように配向されるが、これらの配列は、反対の配向の(NからC末端)vl−リンカー−vhでも使用することができる。加えて、配列番号20765〜20884、配列番号37587〜37698、および配列番号36347〜36706の配列のうちのいくつかは、反対の配向にある。本明細書に記載され、CDRを含有する本明細書の全ての配列に当てはまるように、CDR位置の正確な同定は、表1に示されるように、使用される番号付けに応じてわずかに異なる場合があり、したがって、下線が付されているCDRだけでなく、他の番号付けシステムを使用するvhおよびvlドメイン内に含まれるCDRも本明細書に含まれる。さらに、図の全ての配列に関して、これらのvhおよびvl配列は、scFv型またはFab型のいずれかで使用され得る。
栓抜き型の特定の抗CTLA−4 X抗PD−1抗体(Fab−scFv−Fc)のアミノ酸配列を示す。抗体は、最初にFab可変領域、次にscFv可変領域、ダッシュ記号で分離され、続いて鎖指定(Fab−Fc重鎖、scFv−Fc重鎖、または軽鎖)を使用して命名される。CDRは下線が付され、斜線は可変領域の境界(複数可)を示す。scFvドメインは、示されるように、vh−リンカー−vlまたはvl−リンカー−vhのいずれかの異なる配向(NからC末端)を有するが、これは逆にすることができる。加えて、血清中のより長い半減期をもたらす本明細書に概説される各配列は、1つ、または好ましくは両方のFcドメインにM428L/N434S変異体を含むか、または除外することができる。
特定の抗LAG−3X抗PD−1 Fab−scFv−Fc二重特異性抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、最初にFab可変領域、次にscFv可変領域、ダッシュ記号で分離され、続いて鎖指定(Fab−Fc重鎖、scFv−Fc重鎖、または軽鎖)を使用して命名される。CDRは下線が付され、斜線は可変領域の境界(複数可)を示す。scFvドメインは、配向(NからC末端)vl−リンカー−vhを有するが、これは逆にすることができる。加えて、血清中のより長い半減期をもたらす本明細書に概説される各配列は、1つ、または好ましくは両方のFcドメインにM428L/N434S変異体を含むか、または除外することができる。
特定の抗BTLA X抗PD−1 Fab−scFv−Fc二重特異性抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、最初にFab可変領域、次にscFv可変領域、ダッシュ記号で分離され、続いて鎖指定(Fab−Fc重鎖、scFv−Fc重鎖、または軽鎖)を使用して命名される。CDRは下線が付され、斜線は可変領域の境界(複数可)を示す。scFvドメインは、配向(NからC末端)vl−リンカー−vhを有するが、これは逆にすることができる。加えて、血清中のより長い半減期をもたらす本明細書に概説される各配列は、1つ、または好ましくは両方のFcドメインにM428L/N434S変異体を含むか、または除外することができる。
特定の抗LAG−3 X抗CTLA−4 Fab−scFv−Fc二重特異性抗体のアミノ酸配列を示す。抗体は、最初にFab可変領域、次にscFv可変領域、ダッシュ記号で分離され、続いて鎖指定(Fab−Fc重鎖、scFv−Fc重鎖、または軽鎖)を使用して命名される。CDRは下線が付され、斜線は可変領域の境界(複数可)を示す。scFvドメインは、配向(NからC末端)vh−リンカー−vlを有するが、これは逆にすることができる。加えて、血清中のより長い半減期をもたらす本明細書に概説される各配列は、1つ、または好ましくは両方のFcドメインにM428L/N434S変異体を含むか、または除外することができる。
いくつかの抗LAG−3ハイブリドーマスクリーニングの結果を示す。10μL中1μgのヒトLAG−3−hIgを、室温で20分間、50μLのハイブリドーマ上清(2倍希釈、10%FBSを含むRPMI培地において8回)と混合した。40μLのDaudiまたはRamos細胞(内因的MHC−IIを発現する)を添加し、4℃で30分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、抗ヒトFc−Alexa647二次抗体と共に30分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、FACSによりAlexa647について分析した。
ヒトPBMCのSEB刺激および抗CTLA−4X抗PD−1二重特異性抗体での処置後のサイトカイン放出アッセイ(A:IL−2、B:IFNγ)を示す。
ヒトPBMCが0日目にNSGマウス移植され、続いて、1日目に示される試験物品投薬した後の、14日目のCD45+事象およびCD8+事象を示す。
抗TIM−3ハイブリドーマから生成されるキメラ抗体によるSEB刺激PBMCアッセイにおけるT細胞結合を示す。
3つの実験からのいくつかの抗TIM−3抗原結合ドメイン技術データを示す。これは、二価の実施形態のXENPコード誘導体クローン、vhおよびvl操作されたドメインの指定、Octetにより測定される、ヒトTIM−3に対するKD結合定数会合定数、ならびに解離定数を示す。
いくつかの抗PD−1抗原結合ドメイン技術データを示す。これは、二価およびscFvの実施形態のXENPコード、vhおよびvl操作されたドメインの指定、scFv配向(NからC末端)、Octetにより測定される、ヒトPD−1に対するKD結合定数、ならびにscFvのTmを示す。
いくつかの抗CTLA−4 Fabスクリーニングの結果を示す。これは、FabおよびscFvの実施形態のXENPコード、vhおよびvl操作されたドメインの指定、Octetにより測定される、ヒトおよびcynoCTLA−4に対するKD結合定数、ならびにscFvおよびFabのTmを示す。加えて、少なくとも1つのヒトVHまたはVL生殖系列と正確に一致した配列9量体の数は、FabおよびscFvの両方の可変領域のヒト性の尺度として示される。
ニボルマブ(抗PD−1モノクローナル抗体、Opdivo(登録商標)として販売されている)単独、イピリムマブ単独(抗CTLA−4モノクローナル抗体、Yervoy(登録商標)として販売されている)、ニボルマブおよびイピリムマブアームに基づくプロトタイプ抗CTLA−4x抗PD−1二重特異性体、および「片腕」組み合わせ対照.によるIL−2放出の増強を見る混合リンパ球反応を示す。
変異体CTLA−4 Fabアームおよび変異体抗PD−1 scFvアームを有する抗CTLA−4x抗PD−1二重特異性抗体、ならびにニボルマブ単独、イピリムマブ単独、ならびに対照としてニボルマブおよびイピリムマブアームに基づくプロトタイプ抗CTLA−4x抗PD−1二重特異性体によるIL−2放出の増強を見る混合リンパ球反応を示す。
抗CTLA−4x抗PD−1二重特異性体がヒトPBMC移植NSGマウスにおいて生着(ヒトCD45計数によって測定される)を増強することを示す。増強は、ニボルマブ(XENP16432)単独(破線)で見られるよりも大きい。
移植片対宿主病における体重とCD45細胞計数との間の相関を示し、CD45細胞レベルが疾患を予測することを示す。
図27に示される研究におけるCD45細胞計数とIFNγ放出との間の相関を示す。
抗CTLA−4x抗PD−1二重特異性体がヒトPBMC移植NSGマウスにおいて生着(ヒトCD45計数によって測定される)を増強することを示す。増強は、ニボルマブ(XENP16432)単独(破線)で見られるよりも大きい。
図30に示される研究におけるCD45細胞計数とIFNγ放出との間の相関を示す。
ニボルマブ単独よりも抗PD−1x抗CTLA−4二重特異性チェックポイント抗体が一貫して優れていることを示す図27および30に示される研究間の試験物品効果の比較を示す。
抗CTLA−4x抗PD−1、抗LAG−3x抗PD−1、および抗LAG−3x抗CTLA−4二重特異性体を評価するための混合リンパ球反応の結果を示す。分析物レベルを、ニボルマブ単独により誘導されたレベルに標準化した(1より大きい値はニボルマブに対する増強を表す)。
抗LAG−3x抗CTLA−4二重特異性体を評価するためのSEB反応を示す。抗LAG−3x抗CTLA−4二重特異性自体は対照に対するIL−2応答を増強するが、ニボルマブ単独よりも劣っている。しかしながら、ニボルマブと組み合わされた抗LAG−3x抗CTLA−4二重特異性体は、どちらかの単独よりも著しく高いIL−2応答をもたらす。
抗CTLA−4x抗PD−1、抗LAG−3x抗PD−1、抗BTLAx抗PD−1、および抗LAG−3x抗CTLA−4二重特異性体は、ヒトPBMC移植NSGマウスにおける生着(ヒトCD45計数によって測定される)を増強する。増強は、ニボルマブ(XENP16432)単独で見られるよりも大きい。また、抗LAG−3x抗CTLA−4二重特異性体は、ニボルマブと組み合わされて、最高生着レベルをもたらす。
抗BTLAx抗PD−1二重特異性体は、ニボルマブと同等の非抑制(de−repressive)活性を有するためにHVEM/BTLA相互作用破壊を必要とすることを示す。
Fv配列を含まない(例えば、scFv、ならびにFab側のvhおよびvl)、ヒトIgG1に基づくいくつかの有用な栓抜き型骨格の配列を示す。栓抜き骨格1は、ヒトIgG1(356E/358Mアロタイプ)に基づき、Fab側上にN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI変異体および両鎖上にE233P/L234V/L235A/G236del/S267K切断変異体のS364K/E357Q:L368D/K370S非対称変異体を含む。栓抜き骨格2は、ヒトIgG1(356E/358Mアロタイプ)に基づき、Fab側上にN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI変異体および両鎖上にE233P/L234V/L235A/G236del/S267K切断変異体の異なる非対称変異体を含む。栓抜き骨格3は、ヒトIgG1(356E/358Mアロタイプ)に基づき、Fab側上にN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI変異体および両鎖上にE233P/L234V/L235A/G236del/S267K切断変異体の異なる非対称変異体を含む。栓抜き骨格4は、ヒトIgG1(356E/358Mアロタイプ)に基づき、Fab側上にN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI変異体および両鎖上にE233P/L234V/L235A/G236del/S267K切断変異体の異なる非対称変異体を含む。栓抜き骨格5は、ヒトIgG1(356D/358Lアロタイプ)に基づき、Fab側上にN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI変異体および両鎖上にE233P/L234V/L235A/G236del/S267K切断変異体のS364K/E357Q:L368D/K370S非対称変異体を含む。栓抜き骨格6は、ヒトIgG1(356E/358Mアロタイプ)に基づき、Fab側上にN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI変異体および両鎖上にE233P/L234V/L235A/G236del/S267K切断変異体のS364K/E357Q:L368D/K370S非対称変異体、ならびに両鎖上にN297A変異体を含む。栓抜き骨格7は、変異がN297Sであることを除いて6と同一である。栓抜き骨格6および7の代替型は、両鎖の切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267Kを除外することができる。骨格8は、ヒトIgG4に基づき、Fab側上にN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI変異体および両鎖上にE233P/L234V/L235A/G236del/S267K切断変異体のS364K/E357Q:L368D/K370S非対称変異体、ならびに両鎖上にS228P(EU番号付け、これはKabatにおいてS241Pである)変異体(当該技術分野に既知であるように、Fabアーム交換を切断する)を含む。栓抜き骨格8の代替型は、両鎖の切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267Kを除外することができる。骨格9は、ヒトIgG2に基づき、Fab側上にN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI変異体であるS364K/E357Q:L368D/K370S非対称変異体を含む。骨格10は、ヒトIgG2に基づき、Fab側上にN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI変異体のS364K/E357Q:L368D/K370S非対称変異体、ならびに両鎖上にS267K変異体を含む。 当業者に理解されるように、また以下に概説されるように、これらの配列は、一方の単量体がscFvを含み(任意選択で帯電scFvリンカーを含む)、もう一方の単量体がFab配列(例えば、vhが「Fab側重鎖」に結合され、vlが「定常軽鎖」に結合される)を含んで、本明細書に概説される任意のvhおよびvl対で使用することができる。すなわち、抗CTLA−4、抗PD−1、抗LAG−3、抗TIM−3、抗TIGIT、および抗BTLAについて本明細書に概説される任意のFv配列は、scFv(同様に、任意選択で帯電scFvリンカーを有する)またはFabとしてにかかわらず、任意の組み合わせでこれらの図37の骨格に組み込むことができる。図37Aに示される定常軽鎖は、図中の構築物のすべてに使用され得るが、カッパ定常軽鎖も置換され得る。 これらの栓抜き骨格は、第1のFabと同じ抗原結合を有する追加の第2のFab(vh−CH1およびvl定常軽)が「栓抜き側」上のscFvのN末端に付加される場合、図1Fの中心−scFv型において有用であることに留意されたい。 列挙される配列に対して90、95、98、および99%同一(本明細書に定義される)であり、かつ/または1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のさらなるアミノ酸置換(当業者に理解されるように、親ヒトIgG1(または骨格に応じてIgG2またはIgG4と比較して、既にいくつかのアミノ酸改変を含有する図の「親」と比較して)を含有する配列は、これらのそれぞれの骨格内に含まれる。すなわち、列挙される骨格は、この図の骨格内に含有される非対称、pI、および切断変異体に加えて、追加のアミノ酸改変(一般にアミノ酸置換)を含有し得る。
本発明のFv配列が付加される、本発明に使用されるmAb−scFv骨格の配列を示す。mAb−scFv骨格1は、ヒトIgG1(356E/358Mアロタイプ)に基づき、Fab側上にN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI変異体および両鎖上にE233P/L234V/L235A/G236del/S267K切断変異体のS364K/E357Q:L368D/K370S非対称変異体を含む。骨格2は、ヒトIgG1(356D/358Lアロタイプ)に基づき、Fab側上にN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI変異体および両鎖上にE233P/L234V/L235A/G236del/S267K切断変異体のS364K/E357Q:L368D/K370S非対称変異体を含む。骨格3は、ヒトIgG1(356E/358Mアロタイプ)に基づき、Fab側上にN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI変異体および両鎖上にE233P/L234V/L235A/G236del/S267K切断変異体のS364K/E357Q:L368D/K370S非対称変異体、ならびに両鎖上にN297A変異体を含む。骨格4は、変異がN297Sであることを除いて3と同一である。mAb−scFv骨格3および4の代替型は、両鎖の切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267Kを除外することができる。骨格5は、ヒトIgG4に基づき、Fab側上にN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI変異体および両鎖上にE233P/L234V/L235A/G236del/S267K切断変異体のS364K/E357Q:L368D/K370S非対称変異体、ならびに両鎖上にS228P(EU番号付け、これはKabatにおいてS241Pである)変異体(当該技術分野に既知であるように、Fabアーム交換を切断する)を含む。骨格6は、ヒトIgG2に基づき、Fab側上にN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI変異体のS364K/E357Q:L368D/K370S非対称変異体を含む。骨格7は、ヒトIgG2に基づき、Fab側上にN208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI変異体のS364K/E357Q:L368D/K370S非対称変異体、ならびに両鎖上にS267K変異体を含む。 当業者に理解されるように、また以下に概説されるように、これらの配列は、一方の単量体がFabおよびscFvの両方を含み(任意選択で帯電scFvリンカーを含む)、もう一方の単量体がFab配列(例えば、vhが「Fab側重鎖」に結合され、vlが「定常軽鎖」に結合される)を含んで、本明細書に概説される任意のvhおよびvl対で使用することができる。すなわち、抗CTLA−4、抗PD−1、抗LAG−3、抗TIM−3、抗TIGIT、および抗BTLAについて本明細書に概説される任意のFv配列は、scFv(同様に、任意選択で帯電scFvリンカー)またはFabとしてにかかわらず、任意の組み合わせでこの図38の骨格に組み込むことができる。単量体1側は、Fab−scFv pI陰性側であり、ヘテロ二量体化変異体L368D/K370S、等配電子pI変異体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D、切断変異体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K(全てIgG1に対して)を含む。モノマー2側は、scFv pI陽性側であり、ヘテロ二量体化変異体364K/E357Qを含む。しかしながら、他の非対称変異体対、特に、[[S364K/E357Q:L368D/K370S]、[L368D/K370S:S364K]、[L368E/K370S:S364K]、[T411T/E360E/Q362E:D401K]、[L368D/K370S:S364K/E357L]、[K370S:S364K/E357Q]、[T366S/L368A/Y407V:T366W]、および[T366S/L368A/Y407V/Y394C:T366W/S354C]が置換され得る。図38Aに示される定常軽鎖は、図中の構築物のすべてに使用され得るが、カッパ定常軽鎖も置換され得る。 これらのmAb−scFv骨格は、図1HのmAb−Fv型(一方の単量体がC末端にvlを含み、もう一方がC末端にvhを含む)ならびに図1EのscFv−mAb型(scFvドメインが単量体のうちの1つのC末端に付加される)の両方に有用であることに留意されたい。 列挙される配列に対して90、95、98、および99%同一(本明細書に定義される)であり、かつ/または1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のさらなるアミノ酸置換(当業者に理解されるように、親ヒトIgG1(または骨格に応じてIgG2またはIgG4と比較して、既にいくつかのアミノ酸改変を含有する図の「親」と比較して)を含有する配列は、これらのそれぞれの骨格内に含まれる。すなわち、列挙される骨格は、この図の骨格内に含有される非対称、pI、および切断変異体に加えて、追加のアミノ酸改変(一般にアミノ酸置換)を含有し得る。
本発明の二重特異性チェックポイント抗体の可能な組み合わせのマトリックスを示す。図39Aにおいて、組み合わせは型に拘束されず、図1の任意の型を使用することができる。ボックス内の「A」は、第1のABDからのCDR(X軸に列記される)が第2のABDのCDR(Y軸に列記される)と組み合わされ得ることを意味する。ボックス内の「B」は、第1のABDからのvhおよびvl鎖が第2のABDからのvhおよびvl鎖と組み合わせられ得ることを意味する。ボックス内の「C」は、第1のABDからのCDRが第2のABDからのvhおよびvl鎖と組み合わせられ得ることを意味する。ボックス内の「D」は、第1のABDからのvhおよびvl鎖が第2のABDからのCDRと組み合わせられ得ることを意味する。ボックス内の「E」は、PD−1 ABDが、1G6_H1.279_L1.194、1G6_H1.280_L1.224、1G6_L1.194_H1.279、1G6_L1.210_H1.288、および2E9_H1L1の群から選択されることを意味する。ボックス内の「F」は、CTLA−4 ABDが、[CTLA−4]_H0.25_L0、[CTLA−4]_H0.26_L0;[CTLA−4]_H0.27_L0、[CTLA−4]_H0.29_L0、[CTLA−4]_H0.38_L0、[CTLA−4]_H0.39_L0、0[CTLA−4]_H0.40_L0、[CTLA−4]_H0.70_L0、[CTLA−4]_H0_L0.22、[CTLA−4]_H2_L0、[CTLA−4]_H3.21_L0.124、[CTLA−4]_H3.21_L0.129、[CTLA−4]_H3.21_L0.132、[CTLA−4]_H3.23_L0.124、[CTLA−4]_H3.23_L0.129、[CTLA−4]_H3.23_L0.132、[CTLA−4]_H3.25_L0.124、[CTLA−4]_H3.25_L0.129、[CTLA−4]_H3.25_L0.132、[CTLA−4]_H3.4_L0.118、[CTLA−4]_H3.4_L0.119、[CTLA−4]_H3.4_L0.12、[CTLA−4]_H3.4_L0.121、[CTLA−4]_H3.4_L0.122、[CTLA−4]_H3.4_L0.123、[CTLA−4]_H3.4_L0.124、[CTLA−4]_H3.4_L0.125、[CTLA−4]_H3.4_L0.126、[CTLA−4]_H3.4_L0.127、[CTLA−4]_H3.4_L0.128、[CTLA−4]_H3.4_L0.129、[CTLA−4]_H3.4_L0.130、[CTLA−4]_H3.4_L0.131、[CTLA−4]_H3.4_L0.132、[CTLA−4]_H3.5_L2.1、[CTLA−4]_H3.5_L2.2、[CTLA−4]_H3.5_L2.3、[CTLA−4]_H3_L0、[CTLA−4]_H3_L0.22、[CTLA−4]_H3_L0.44、[CTLA−4]_H3_L0.67、および[CTLA−4]_H3_L0.74の群から選択されることを意味する。ボックス内の「G」は、TIM−3 ABDが、1D10_H0L0、1D12_H0L0、3H3_H1_L2.1、6C8_H0L0、6D9_H0_1D12_L0;7A9_H0L0、7B11_H0L0、7B11var_H0L0、および7C2_H0L0の群から選択されることを意味する。ボックス内の「H」は、LAG−3 ABDが、識別子2A11_H0L0、2A11_H1.125_L2.113、2A11_H1.144_L2.142、2A11_H1_L2.122、2A11_H1_L2.123、2A11_H1_L2.124、2A11_H1_L2.25、2A11_H1_L2.47、2A11_H1_L2.50、2A11_H1_L2.91、2A11_H1_L2.93、2A11_H1_L2.97、2A11_H1L1、2A11_H1L2、2A11_H2L2、2A11_H3L1、2A11_H3L2、2A11_H4L1、2A1_H4L2、7G8_H0L0、7G8_H1L1、7G8_H3.18_L1.11、7G8_H3.23_L1.11、7G8_H3.28_L1、7G8_H3.28_L1.11、7G8_H3.28_L1.13、7G8_H3.30_L1.34、7G8_H3.30_L1.34、および7G8_H3L1の群から選択されることを意味する。ボックス内の「I」は、ボックス内の「J」は、BTLA ABDが、9C6_H0L0、9C6_H1.1_L1、および9C6_H1.11_L1から選択されることを意味する。図39Bは、図39Bが栓抜き型に特異的であることを除いて、図39Aと同一である。Bにおいて、第1のABDがPD−1に結合するとき、第1のABDはscFv単量体であり、他のABD(CTLA−4、LAG−3、TIGIT、TIM−3、およびBTLA)はFab単量体にある。Bにおいて、第1のABDがCTLA−4に結合するとき、それはscFv単量体にあり(PD−1と組み合わされるとき、Fab側であるときを除く)、他のABD(CTLA−4、LAG−3、TIGIT、TIM−3、およびBTLA)はFab単量体にある。
可能な栓抜き型の組み合わせのマトリックスを示す。ボックス内の「Q」は、第1のABDドメイン(同様に、X軸に列記される)がscFvであり、第2のABD(再度、Y軸に列記される)がFab側であることを意味する。ボックス内の「R」は、第1のABDがFab側であり、第2のABDがscFvであることを意味する。ボックス内の「S」は、第1のABDが抗PD−1であり、scFv側であることを意味する。ボックス内の「T」は、第1のABDが抗CTLA−4であり、scFv側であることを意味する。ボックス内の「U」は、第1のABDが抗TIM−3であり、scFv側であることを意味する。ボックス内の「V」は、第1のABDが抗LAG−3であり、scFv側であることを意味する。ボックス内の「W」は、第1のABDが抗TIGITであり、scFv側であることを意味する。ボックス内の「X」は、第1のABDが抗BTLAであり、scFv側であることを意味する。加えて、図39に概説される各組み合わせは、図38のCDR、scFv、ならびにvhおよびvlの組み合わせを使用することができる。加えて、図39の栓抜き骨格の特定の実施形態は、図36の配列である。
二重特異性チェックポイント抗体が2つの異なる抗体または薬物を使用する組み合わせ療法で提供することができる利益と関連する概略図を示す。
腫瘍TILが複数のチェックポイントを共発現するため、二価結合が活性を増加させ、抗腫瘍活性を増強し、末梢毒性を回避することを示す、類似の概略図を示す。
本発明の二重特異性チェックポイント抗体(例えば、抗LAG−3x抗CTLA−4)が他の単一特異性チェックポイント抗体(例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ)と組み合わされ得ることを示す。
PD−1およびCTLA−4が、膀胱癌乳癌結腸癌前立腺癌肺癌黒色腫、および卵巣癌を含む様々な腫瘍型において共発現されることを示す。
B)抗PD−1二価および抗CTLA−4x抗PD−1、ならびにC)およびSEB刺激PBMCアッセイにおける片腕抗PD−1+片腕抗CTLA−4および抗CTLA−4x抗PD−1、ならびにC)SEB刺激なしの対照実験によるIL−2の増強の比較を示す。
片腕抗PD−1および片腕抗CTLA−4抗体と比較した、例示的な抗CTLA−4x抗PD−1二重特異性体によるPD−1のリガンドPD−L1およびPD−L2の遮断を示す。
例示的な抗CTLA−4x抗PD−1二重特異性抗体によるSEB刺激PBMCアッセイにおけるT細胞結合を示す。
抗CTLA−4x抗PD−1二重特異性体がヒトPBMC移植NSGマウスにおいて生着(ヒトCD45計数によって測定される)を増強することを示す。増強は、ニボルマブ(XENP16432)単独で見られるよりも大きい。
抗BTLAx抗PD−1二重特異性候補が、SEB刺激PBMCアッセイにおける「片腕」対照と比較して、T細胞により強力に結合することを示す。
抗BTLAx抗PD−1キメラ二重特異性体がSEB刺激PBMCからのIL−2分泌を促進することを示す。PBMCを、示される試験物品と共に10ng/mLのSEBで3日間刺激した。細胞上清を収集し、示される分析物についてMSDでアッセイした。A:20μg/mLの試験物品;B 5μg/mLの試験物品。
抗BTLAx抗PD−1キメラ二重特異性体がSEB刺激PBMCからのIFNγ分泌を促進することを示す。PBMCを、示される試験物品と共に10ng/mLのSEBで3日間刺激した。細胞上清を収集し、示される分析物についてMSDでアッセイした。A:20μg/mLの試験物品;B 5μg/mLの試験物品。
抗BTLAx抗PD−1二重特異性抗体(キメラおよびヒト化/最適化抗BTLA Fabアーム)がSEB刺激PBMCからのIL−2分泌およびIFN−γを促進することを示す。両パネルを、示される20μg/mLの試験物品と共に10ng/mLのSEBで3日間PBMC刺激した。72時間後に細胞上清を収集し、示される分析物についてアッセイした。
GVHD研究における例示的な抗BTLAx抗PD−1二重特異性抗体によるCD45細胞計数およびIFNγ分泌の経時変化(10、14、および22日目)の増強を示す。
ある9C6抗BTLA抗原結合ドメイン技術データを示す。これは、二価の実施形態のXENPコード、vhおよびvl操作されたドメインの指定、ならびにOctetにより測定される、ヒトBTLAに対するKD結合定数を示す。
ある2A11抗LAG−3抗原結合ドメイン技術データを示す。これは、Fabの実施形態のXENPコード、vhおよびvl操作されたドメインの指定、Octetにより測定される、ヒトLAG−3に対するKD結合定数、ならびにFabのTmを示す。
ある7G8抗LAG−3抗原結合ドメイン技術データを示す。これは、Fabの実施形態のXENPコード、vhおよびvl操作されたドメインの指定、Octetにより測定される、ヒトLAG−3に対するKD結合定数、ならびにFabのTmを示す。
Octetにより測定される、最適化2A11または7G8抗LAG−3 Fabアームのいずれかに基づく抗LAG−3X抗CTLA−4二重特異性ヘテロ二量体栓抜き型のKdを示す。
抗LAG−3(7G8)×抗CTLA−4および抗LAG−3(2A11)×抗CTLA−4二重特異性体が片腕抗LAG−3対照よりも強力に結合することを示す。PBMCを、100ng/mLのSEBで3日間刺激した。次いで、細胞を、4℃で30分間、示される試験物品で処理し、2回洗浄した。次いで、細胞を抗CD3−FITCおよび抗ヒトFc−APC抗体で処理した。次いで、細胞を2回洗浄し、フローサイトメトリーにより分析した。
IL−2およびIFNγ放出における増強によって示されるように、7G8に基づく抗LAG−3x抗CTLA−4二重特異性体がPBMCで2A11に基づく抗LAG−3x抗CTLA−4二重特異性体よりも選択的な機能を呈することを示す。PBMCを、500ng/mLのSEBで2日間刺激した。次いで、細胞を培養培地で2回洗浄し、示される量の試験物品と組み合わせて500ng/mLのSEBで刺激した。細胞を、処理の24時間後に、示される分析物(IL−2またはIFN−γのいずれか)についてアッセイした。各点は、技術的一重項試験した固有ドナーを表す。
抗LAG−3X抗CTLA−4二重特異性抗体との混合リンパ球反応(MLR)を示す。40の固有のMLR反応を、20ug/mLの示される試験物品の存在下で行った。次いで、細胞上清を、A:IL−2およびB:IFNγについて、処理の6日後に、MSDによりアッセイした。
SEBアッセイにおける追加の抗LAG−3X抗 CTLA−4候補によるIL−2およびIFNγ放出の増強を示す。PBMCを、500ng/mLのSEBで2日間刺激した。次いで、細胞を培養培地で2回洗浄し、示される量の試験物品と組み合わせて500ng/mLのSEBで刺激した。細胞を、処理の24時間後に、示される分析物(IL−2またはIFN−γのいずれか)についてアッセイした。各点は、技術的一重項で試験した固有のドナーを表す。
Octetにより測定される、最適化2A11または7G8抗LAG−3 Fabアームのいずれかに基づく抗LAG−3X抗PD−1二重特異性ヘテロ二量体栓抜き型のKdを示す。
内因的にMHC−IIを発現するDaudi細胞へのLAG−3結合を遮断するヒト化/最適化7G8および2A11抗LAG−3クローンの能力を示す。
SEB刺激T細胞に対する抗LAG−3x抗PD−1候補機能を示す。PBMCを、500ng/mLのSEBで2日間刺激した。次いで、細胞を培養培地で2回洗浄し、示される量の試験物品と組み合わせて500ng/mLのSEBで刺激した。細胞を、処理の24時間後に、示される分析物についてアッセイした。各点は、技術的一重項で試験した固有のドナーを表す。
腫瘍浸潤リンパ球(TIL)が様々な腫瘍において複数のチェックポイント受容体を共発現することを示すグラフである。特に、グラフは、様々な腫瘍がPD−1およびCTLA−4、PD−1およびBTLA、PD−1およびLAG−3、ならびにLAG−3およびCTLA−4を共発現することを示す。示される結果は、TCGA Research network:http://cancergenome.nih.gov/によって生成されるデータに基づく。
本明細書に提供される対象二重特異性抗体が二重チェックポイント陽性T細胞を選択的に標的とすることを示す。二重特異性PD−1xLAG−3抗体は、陰性対照と比較して、staphylococcalエンテロトキシンB(SEB)で刺激されたCD3+T細胞におけるPD−1およびLAG−3受容体占有率を示すために使用される。
本明細書に提供される対象抗体の構成要素抗体ドメインがチェックポイント受容体/リガンド相互作用を遮断することが可能であることを示すグラフである。特に、1G6抗PD−1 scFvアームを含む二重特異性抗体は、PD−1/PD−L1およびPD−1/PD−L2相互作用を遮断することが可能であり、7G8抗LAG−3片腕は、LAG−3/MHCII相互作用を遮断することが可能であり、例示的な抗PD−1 Fabアームを含む二重特異性抗体は、CTLA−4/CD80およびCTLA−4/CD86相互作用を遮断することが可能であり、9C6抗BTLA Fabアームを含む二重特異性抗体は、BTLA/HVEM相互作用を遮断することが可能である。
例示的な抗CTLA−4x抗PD−1二重特異性抗体およびニボルマブによるIL−2放出の増強を比較する。
例示的な抗LAG−3x抗CTLA−4二重特異性抗体、ニボルマブと組み合わせた同じ二重特異性抗体、およびニボルマブ単独によるIL−2放出の増強を比較する。
例示的な抗LAG−3x抗PD−1二重特異性抗体およびニボルマブによるIL−2放出の増強を比較する。
例示的な抗BTLAx抗PD−1二重特異性抗体およびニボルマブによるIL−2放出の増強を比較する。
例示的な抗PD−1x抗CTLA−4二重特異性抗体、ニボルマブ単独、およびイピリムマブと組み合わせたニボルマブによるGVHD(CD45細胞計数によって示される)の増強を比較する。
例示的な抗BTLAx抗PD−1二重特異性抗体およびニボルマブによるGVHD(CD45細胞計数によって示される)の増強を比較する。
例示的な抗LAG−3x抗CTLA−4二重特異性抗体、ニボルマブと組み合わせた同じ二重特異性抗体、およびニボルマブ単独によるGVHD(CD45細胞計数によって示される)の増強を比較する。
例示的な抗LAG−3x抗PD−1二重特異性抗体およびニボルマブによるGVHD(CD45細胞計数によって示される)の増強を比較する。
抗CTLA−4x抗PD−1二重特異性抗体がインビボT細胞媒介抗腫瘍効力を促進し得ることを示す2つの研究を示す。KG1a−lucがん細胞をマウスに移植した。21日後、huPMCを同じマウスに移植し、毎週抗体処置(抗CTLA−4x抗PD−1二重特異性抗体、抗PD−1二価抗体、または抗PD−1二価抗体+抗CTLA−4二価抗体)を施した。IVISがん細胞撮像をマウスに対して行って、腫瘍束の変化によって決定される腫瘍サイズを評価した。

0010

A.資料の組み込み
1.図および凡例
米国特許出願第62,350,145号、同第62/353,511号、および同第62/420,500号のすべての図およびそれに付随する凡例は、特に本明細書に示されるアミノ酸配列に関して、その全体が本明細書に参照により明示的かつ独立して組み込まれる。

0011

2.配列
添付の配列表に関して、以下の通り説明する:ABDとして使用するのに好適な抗PD−1配列としては、配列番号6209〜11464(PD−1scのFv配列ではあるが、それらの中のFv配列は、Fabの形式になっている場合がある)、配列番号11465〜17134(PD−1のFab配列ではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号33003〜33072(追加のPD−1のFab配列ではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号33073〜35394(追加のPD−1のscFv配列ではあるが、それらの中のFv配列は、Fabの形式になっている場合がある)、および配列番号36127〜36146(PD−1の二価の構築物、これらは、scFvまたはFabのいずれかの形式になっている場合がある)が挙げられる。ABDとして使用するのに好適な抗CTLA−4の配列としては、配列番号21〜2918(CTLA−4のscFv配列ではあるが、それらの中のFv配列は、Fabの形式になっている場合がある)、配列番号2919〜6208(CTLA−4のFab配列ではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号36739〜36818(追加のCTLA−4のFab配列ではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、および配列番号35395〜35416(CTLA−4の片腕構築物、これらは、FabまたはscFvのいずれかの形式になっている場合がある)が挙げられる。ABDとして使用するのに好適な抗LAG−3の配列としては、配列番号17135〜20764(LAG−3のFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号36819〜36962(追加のLAG−3のFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号35417〜35606(追加のLAG−3のFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号25194〜32793(追加のLAG−3のFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、および配列番号32794〜33002(片腕LAG−3の構築物、これらはFabまたはscFvのいずれかの形式になっている場合がある)が挙げられる。ABDとして使用するのに好適な抗TIM−3の配列としては、配列番号20765〜20884(TIM−3のFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、配列番号37587〜37698(追加のTIM−3のFab、Fv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、および配列番号36347〜36706(二価のTIM−3の構築物、これらは、FabまたはscFvのいずれかの形式になっている場合がある)が挙げられる。ABDとして使用するのに好適な抗BTLAの配列としては、配列番号20885〜21503(BTLAのFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、および配列番号36707〜36738(追加のBTLAのFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)が挙げられる。ABDとして使用するのに好適な抗TIGITの配列としては、配列番号21504〜21523(TIGITのFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)、および配列番号37435〜37586(追加のTIGITのFabではあるが、それらの中のFv配列は、scFvの形式になっている場合がある)が挙げられる。

0012

本発明の二重特異性抗体には、配列番号35607〜35866および配列番号21524〜22620のLAG3とCTLA4との構築物が含まれる。PD−1とCTLA4との構築物には、配列番号36167〜36346および配列番号23316〜23735としてリストに記載されるものが含まれる。PD−1とTIM3との構築物には、配列番号25174〜25193としてリストに記載されるものが含まれる。PD−1とLAG3との構築物には、配列番号35867〜36126および配列番号23736〜25133としてリストに記載されるものが含まれる。PD−1とTIGITとの構築物には、配列番号25134〜25173としてリストに記載されるものが含まれる。PD−1とBTLAとの構築物には、配列番号22724〜23315および配列番号36147〜36166としてリストに記載されるものが含まれる。CTLA4とBTLAとの構築物には、配列番号22624〜22723としてリストに記載されるものが含まれる。最後に、XENP23552、XENP22841、XENP22842、XENP22843、XENP22844、XENP22845、XENP22846、XENP22847、XENP22848、XENP22849、XENP22850、XENP22851、XENP22852、XENP22858、XENP22854、XENP22855の名前はすべて、不注意に省かれた「M428L/N434S」の表示をタイトルに含むべきであった。

0013

B.概要
PD−1などの免疫チェックポイント阻害剤に向けられる治療抗体は、癌治療の限定された状況では、大いに期待できる。癌は、患者が癌性細胞を認識し、排除することができないとみなされ得る。多くの事例において、これらの形質転換(例えば、癌性)細胞は、免疫監視を弱める。制御されていないT細胞活性を防止するために、体内でT細胞の活性化を制限する天然制御機構があり、これは、免疫応答を回避または抑制するために、癌性細胞によって利用され得る。癌を認識および排除するために、免疫エフェクター細胞、特にT細胞の能力を回復させることが、免疫療法目標である。時折「免疫療法」と称される免疫腫瘍学の分野は、Yervoy、Keytruda、およびOpdivoなどのT細胞チェックポイント阻害抗体のいくつかの最近の承認により、急速に展開している。これらの抗体は一般に、T細胞免疫の負の制御因子を遮断するため、「チェックポイント阻害物質」と称される。一般に、共刺激および共阻害性の両方の様々な免疫調節シグナルを使用して、最適な抗原特異的免疫応答を調整することができることが理解されている。

0014

一般に、これらのモノクローナル抗体は、CTLA−4およびPD−1等のチェックポイント阻害タンパク質に結合し、これにより、通常の状況であれば、細胞傷害性T細胞(CTL)の活性化が予防または抑制される。例えば、これらのタンパク質に結合する抗体の使用によりチェックポイントタンパク質を阻害することによって、腫瘍に対するT細胞応答の増加が達成され得る。すなわち、これらの癌チェックポイントタンパク質は、免疫応答を抑制し、例えば、チェックポイントタンパク質に対して抗体を使用して、これらのタンパク質が遮断されたとき、免疫系が活性化され、癌および感染性疾患などの病態治療をもたらす。

0015

しかしながら、上述のように、TILは一般的に複数のチェックポイント受容体を発現することが研究により明らかになっており、これは、単一のチェックポイント遮断では、完全なT細胞応答を促進するのに十分ではないことを示唆している可能性がある。さらに、複数のチェックポイントを発現するTILは、実際には、最も腫瘍反応性である可能性が高く、したがって、2つ以上のチェックポイント抗原を塞ぐ療法が非常に有用であり得ることを示唆するものである。

0016

したがって、本発明は、2つの抗原を発現する細胞に結合する二重特異性チェックポイント抗体と、T細胞および/またはNK細胞を活性化させて、癌および感染性疾患などの疾患、または免疫活性を高めることによって治療される他の病態を治療する方法と、を提供する。

0017

したがって、本発明は、場合によっては、単一細胞上で2つの異なるチェックポイント阻害剤分子に結合する二重特異性抗体を提供し、有利に1つの治療物質のみの投与を必要とすることにより、毒性の問題および複数の抗体投与の費用を解決することを対象とする。

0018

2つの異なる標的を同時に結合することができる二重特異性抗体は、TIL対末梢T細胞標的の選択性を改善する可能性を提供し、一方で療法の費用も低減する。細胞表面上の2つの標的との抗体の二価相互作用は、場合によっては、一度に1つの標的との一価相互作用に対してより高い結合力をもたらすはずである。このため、通常の二価抗体は、細胞表面上のそれらの標的に高い結合力を有する傾向がある。二重特異性抗体では、両方の標的への同時結合によって得られるより高い結合力を利用して、2つの異なる標的を同時に発現する細胞に対してより高い選択性創出する可能性がある。

0019

したがって、本発明は、例えば、二重特異性結合を可能にするために、2つ以上のチェックポイント抗原またはリガンドへの結合を可能にするヘテロ二量体抗体を提供するための新規構築物を対象とする。したがって、例えば、抗PD1x抗CTLA4(PD1×CTLA4)二重特異性抗体は、PD1+CTLA4+二重陽性TIL対単一陽性PD1のみまたはCTLA4のみT細胞により選択的であると予想される。したがって、二重陽性TIL対単一陽性T細胞の選択的遮断は、組み合わされたチェックポイント遮断の治療指数を改善することが予想される。これは、本明細書に概説されるように、他の可能な組み合わせに関して同様に当てはまる。したがって、本発明の好適な二重特異性抗体は、PD−1およびCTLA−4、PD−1およびTIM−3、PD−1およびLAG−3、PD−1およびTIGIT、PD−1およびBTLA、CTLA−4およびTIM−3、CTLA−4およびLAG−3、CTLA−4およびTIGIT、CTLA−4およびBTLA、TIM−3およびLAG−3、TIM−3およびTIGIT、TIM−3およびBTLA、LAG−3およびTIGIT、LAG−3およびBTLA、ならびにTIGITおよびBTLAに結合する。一般に、これらの二重特異性抗体は、各対について、「抗PD−1X抗CTLA−4」、または一般に単純化して、または簡単にするために(よって互換的に)、「PD−1XCTLA−4」等と命名されることに留意する。

0020

本発明のヘテロ二量体二重特異性チェックポイント抗体は、様々な種類の癌を治療するのに有用である。当業者に理解されるように、腫瘍抗原に結合する従来のモノクローナル抗体、または例えばCD3および腫瘍抗原に結合する二重特異性抗体のより新しいクラス(例えば、USSN15/141,350に記載されるような)とは対照的に、チェックポイント抗体は、免疫応答を高めるために使用されるが、一般に、それらの作用において腫瘍特異的ではない。すなわち、本発明の二重特異性チェックポイント抗体は、免疫系の抑制を阻害し、一般にT細胞活性化につながり、これはがん性細胞に対するより大きな免疫応答、したがって、治療につながる。.したがって、そのような抗体は、多種多様な腫瘍型の治療のための有用性見出すことが予想され得る。例えば、FDAは、腫瘍型ではなく遺伝子特徴に基づいた抗PD−1単一特異性抗体であるKeytruda(登録商標)を最近認可した。

0021

以下で論じるように、T細胞活性化を測定することができる様々な方法がある。NKおよびT細胞に対する二重特異性チェックポイント抗体の機能効果は、次のパラメータ:増殖、サイトカイン放出、および細胞表面マーカーの変化を測定することによって、インビトロで(および以下により完全に記載されるように、場合によっては、インビボで)評価され得る。NK細胞について、細胞増殖の増加、細胞傷害性(CD107a、グランザイムパーフォリン発現の増加によって測定される標的細胞を殺傷させる能力、または標的細胞殺傷を直接測定することによって)、サイトカイン産生(例えば、IFN−γおよびTNF)、および細胞表面受容体発現(例えば、CD25)は、免疫調節、例えばがん細胞の増強された殺傷の指標となる。T細胞について、増殖の増加、活性化の細胞表面マーカーの発現の増加(例えば、CD25、CD69、CD137、およびPD1)、細胞傷害性(標的細胞を殺傷する能力)、およびサイトカイン産生(例えば、IL−2、IL−4、IL−6、IFN−γ、TNF−α、IL−10、IL−17A)は、免疫調節、例えばがん細胞の増強された殺傷の指標となる。したがって、治療の評価は、次のうちの1つ以上を評価するアッセイを使用して行うことができる:(i)免疫応答の増加、(ii)αβおよび/またはγδT細胞の活性化の増加、(iii)細胞傷害性T細胞活性の増加、(iv)NKおよび/またはNKT細胞活性の増加、(v)αβおよび/またはγδT細胞抑制の軽減、(vi)炎症誘発性サイトカイン分泌の増加、(vii)IL−2分泌の増加、(viii)インターフェロンγ産生の増加、(ix)Th1応答の増加、(x)Th2応答の減少、(xi)制御性T細胞および細胞のうちの少なくとも1つの細胞数および/または活性の減少、(xii)腫瘍免疫浸潤物の増加。

0022

したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、(a)炎症誘発性サイトカインの上方制御、(b)T細胞の増殖、拡大、もしくは腫瘍浸潤の増加、(c)T細胞によるインターフェロンγ、TNF−α、および他のサイトカイン産生の増加、(d)IL−2分泌の増加、(e)抗体応答の刺激、(f)癌細胞成長の阻害、(g)抗原特異的T細胞免疫の促進、(h)CD4+および/もしくはCD8+T細胞活性化の促進、(i)T細胞抑制の低減、(j)NK細胞活性化の促進、(k)癌細胞のアポトーシスまたは溶解の促進、ならびに/または(l)癌細胞に対する細胞傷害性もしくは細胞増殖抑制効果を必要とする対象に、これらのうちの1つ以上を実施するための、二重特異性チェックポイント抗体の使用を提供する。

0023

したがって、本発明は、二重特異性ヘテロ二量体チェックポイント抗体を提供する。ヘテロ二量体抗体構築物は、抗体の重鎖の2つのFcドメイン、例えば、「二量体」に組織化する2つの「単量体」の自己組織化性質に基づく。ヘテロ二量体抗体は、以下により完全に論じられる各単量体のアミノ酸配列を変えることによって作製される。したがって、本発明は、一般に、いくつかの方法で、チェックポイント抗原を共捕捉することができるヘテロ二量体抗体の創出を対象とし、それぞれの鎖で異なる、定常領域のアミノ酸変異体に依存することで、ヘテロ二量体形成を促進し、かつ/またはホモ二量体に関してヘテロ二量体精製の容易化を可能にする。

0024

したがって、本発明は、二重特異性チェックポイント抗体を提供する。抗体技術における継続問題は、2つ(以上)の異なる抗原に同時に結合し、一般に、そのようにして、異なる抗原を近接させることを可能にし、新しい機能性および新しい治療をもたらす「二重特異性」抗体が、切望されていることである。一般に、これらの抗体は、各重鎖および軽鎖の遺伝子を宿主細胞(一般に、本発明において、本明細書に概説される2つの重鎖単量体および軽鎖の遺伝子)に含めることによって作られる。これにより、一般に、所望のヘテロ二量体(A−B)、ならびに2つのホモ二量体(A−AおよびB−B)の形成がもたらされる。しかしながら、二重特異性抗体形成における主な障壁は、ヘテロ二量体抗体を精製してホモ二量体抗体を除去すること、および/またはホモ二量体形成を上回るようにヘテロ二量体形成に偏らせることが困難であるということである。

0025

この問題を解決するために、本発明のヘテロ二量体を生成するために使用することができる機構がいくつか存在する。加えて、当業者に理解されるように、これらの機構は、高いヘテロ二量体化を確実にするために組み合わせることができる。したがって、ヘテロ二量体抗体の産生につながるアミノ酸変異体は、「ヘテロ二量体化変異体」と呼ばれる。以下に論じられるように、ヘテロ二量体化変異体は、立体変異体(例えば、以下に記載される「ノブアンドホール」または「非対称」変異体、および以下に記載される「電荷対」変異体)、ならびにヘテロ二量体を除去してホモ二量体の精製を可能にする「pI変異体」を含み得る。

0026

ヘテロ二量体形成を好み、ホモ二量体形成を好まないように立体および/または静電影響を創出するアミノ酸操作を指す、一般に当該技術分野において「ノブアンドホール」(「KIH」)と呼ばれるか、または本明細書において「非対称」変異体と呼ばれることがある1つの機構を任意選択で使用することもでき、Ridgway et al.,Protein Engineering 9(7):617(1996)、Atwell et al.,J.Mol.Biol.1997 270:26、米国特許第8,216,805号、US2012/0149876に記載されるとおりである(それらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる)。図において、「ノブアンドホール」アミノ酸置換を含むいくつかの「単量体A−単量体B」の対が同定されている。加えて、Merchant et al.,Nature Biotech.16:677(1998)において記載されるように、これらの「ノブアンドホール」変異は、ジスルフィド結合と組み合わせて、形成をヘテロ二量体化へと非対称にすることができる。本発明において使用されるものは、特に以下に概説されるpI変異体を含む他のヘテロ二量体化変異体と組み合わせて、T366Wと対であるT366S/L368A/Y407V、ならびに架橋ジスルフィドを伴うこの変異体、T366W/S354Cと対であるT366S/L368A/Y407V/Y349Cである。

0027

ヘテロ二量体抗体の生成において有用である追加の機構は、「静電操縦」または「電荷対」と呼ばれることがあり、Gunasekaran et al.,J.Biol.Chem.285(25):19637(2010)において記載されるとおりである(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。これは、本明細書において「電荷対」と呼ばれることがある。この実施形態では、静電気が、形成をヘテロ二量体化へと非対称にするために使用される。当業者であれば、これらは、pIに対しても効果を有し得、そうすることで、精製に対しても効果を有し得、したがって、場合によっては、pI変異体と考えられ得ることを理解するであろう。しかしながら、これらは、ヘテロ二量体化を押し進めるために生成され、精製手段としては使用されなかったため、それらは、「立体変異体」として分類される。これらには、限定されないが、D221R/P228R/K409Rと対であるD221E/P228E/L368E(例えば、これらは、「単量体が対応するセットである)およびC220R/E224R/P228R/K409Rと対であるC220E/P228E/368Eが含まれ、他は図に示される。

0028

本発明において、いくつかの実施形態では、pI変異体は、単量体のうちの1つまたは両方のpIを変えるために使用され、そうすることで、A−A二量体タンパク質、A−B二量体タンパク質、およびB−B二量体タンパク質の等電点分離を可能にする。

0029

本発明において、ヘテロ二量体タンパク質の精製を容易にすることができるいくつかの基礎的な機構が存在する。すなわち、pI変異体の使用に依存し、その結果、単量体は、それぞれが異なるpIを有し、そうすることで、A−A二量体タンパク質、A−B二量体タンパク質、及びB−B二量体タンパク質の等電点精製を可能にする。あるいは、「三重F」型などのいくつかの足場型は、サイズに基づく分離も可能にする。以下にさらに概説されるように、ヘテロ二量体形成が、ホモ二量体を上回るようにする「非対称」も可能である。したがって、立体二量体化変異体、およびpI変異体または電荷対変異体の組み合わせは、本発明において、特に有用である。加えて、以下にさらに概説されるように、三重F型などのscFv(複数可)を利用する足場は、精製目的に向けて、さらなるpIの増大を与える帯電scFvリンカー(正か負のいずれか)を含むことができる。当業者に理解されるように、三重F型によっては、帯電scFvリンカーのみを有し、追加のpI調整無しでも有用であるが、本発明は、帯電scFvリンカー(および本明細書に論じられるFc、FcRn、およびKOの組み合わせ)を有する非対称変異体の使用も提供する。

0030

ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にするための分離機構としてpIを利用する本発明において、アミノ酸変異体は、単量体ポリペプチドのうちの1つまたは両方に導入されてもよい。すなわち、単量体のうちの1つのpI(本明細書において、単に「単量体A」と呼ばれる)が単量体Bを除去するために操作され得るか、または単量体AおよびBの両方が帯電され、単量体AのpIを増加させ、単量体BのpIを減少させることができる。以下に、より完全に概説されるように、単量体のいずれか、または両方のpIの変化は、帯電残基を除去もしくは追加(例えば、中性アミノ酸は、正もしくは負に帯電したアミノ酸残基によって置き換えられ、例えば、グリシンからグルタミン酸への置き換えである)するか、帯電残基を正もしくは負から反対の電荷へと変化(例えば、アスパラギン酸からリジンへ)させるか、または帯電残基を中性残基へと変化(例えば、リジンからセリンへであり、これにより帯電が消失する)させることによって行うことができる。いくつかのこれらの変異体が、図に示される。加えて、本明細書のヘテロ二量体抗体の創出に使用するための好適なpI変異体は、例えば、著しい免疫原性を導入することなくpIを変化させるように、異なるIgGアイソタイプからpI変異体を移入する、アイソタイプのものであり、米国公開第2014/0288275号の図29(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)を参照されたい。

0031

したがって、本発明のこの実施形態において、単量体のうちの少なくとも1つにおいて、pIの十分な変化の創出を提供し、その結果、ヘテロ二量体は、ホモ二量体から分離され得る。当業者に理解されるように、そして、以下にさらに論じられるように、これは、「野生型重鎖定常領域と、そのpIが増加もしくは減少(wt A−+Bもしくはwt A−−B)のいずれかとなるように操作された変異体領域と、を使用することによって行うことができるか、または一方の領域を増加させ、もう一方の領域を減少させること(A+−B−もしくはA−B+)によって行うことができる。

0032

したがって、一般に、本発明のいくつかの実施形態の構成要素は、抗体の定常領域におけるアミノ酸変異体であり、このアミノ酸変異体は、アミノ酸置換(「pI変異体」または「pI置換」)を単量体のうちの1つまたは両方へ組み込むことによって、「pI二量体」(タンパク質が抗体であるとき、これらは「pI抗体」と呼ばれる)を形成するために、二量体タンパク質の単量体の両方か、もし両方でないなら少なくとも1つの等電点(pI)を変えることに向けられる。本明細書で示されるように、2つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、2つの単量体のpIが、わずか0.1pH単位でも異なれば達成でき、0.2、0.3、0.4、および0.5、またはそれより大きな差異は、すべて本発明において有用である。

0033

当業者に理解されるように、良好な分離を得るために単量体(複数可)のそれぞれまたは両方に含まれるpI変異体の数は、対象のscFvおよびFabの出発pIに依存する部分がある。すなわち、どの単量体を操作するか、またはどの「方向」(例えば、より正、もしくはより負)にするかを決定するために、2つの標的抗原のFv配列が計算され、そこから決定がなされる。当該技術分野で知られるように、異なるFvであれば、本発明で活用される異なる出発pIを有する。一般に、本明細書に概説されるように、pIが操作されることにより、それぞれの単量体で、少なくとも約0.1logの総pI差異がもたらされ、本明細書に概説されるように当該総pI差異は、0.2〜0.5であることが好ましい。

0034

さらに、当業者に理解され、本明細書に概説されるように、場合によっては(型による)、ヘテロ二量体は、サイズ(例えば分子量)に基づいてホモ二量体から分離することができる。例えば、図1のいくつかの実施形態に示されるように、型によって、異なるサイズのホモ二量体およびヘテロ二量体をもたらす(例えば、栓抜きについて、1つのホモ二量体は「二重scFv」型であり、1つのホモ二量体は標準抗体であり、ヘテロ二量体は1つのFabおよび1つのscFvを有する。

0035

加えて、図1に示されるように、いくつかの抗原が二価で結合されることが可能である(例えば、単一抗原に対して2つの抗原結合部位)ことを認識する。理解されるように、FabおよびscFvの任意の組み合わせを利用して、所望の結果および組み合わせを達成することができる。

0036

pI変異体が、重鎖(複数可)の定常領域(複数可)を使用することによって、ホモ二量体を上回るヘテロ二量体精製を達成するために使用される場合は、抗体を含む多重特異性タンパク質の設計および精製に対する、よりモジュール型の手法が提供される。したがって、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体化変異体(非対称ヘテロ二量体化変異体および精製ヘテロ二量体化変異体を含む)は、可変領域に含まれておらず、その結果、個々の抗体は、それぞれ操作されなければならない。加えて、いくつかの実施形態では、pI変異体からもたらされる免疫原性の可能性は、異なるIgGアイソタイプ由来のpI変異体を移入することによって、著しく低減され、その結果、著しい免疫原性を導入することなくpIを変化させる。したがって、解決すべき追加の問題は、ヒト配列含量が高い低pI定常ドメイン解明であり、例えば、何らかの特定位置における非ヒト残基の最小化または回避である。

0037

このpI操作で起こり得る付帯利点は、血清半減期延長およびFcRn結合の増加でもある。すなわち、USSN13/194,904に記載されるように(参照によりその全体が組み込まれる)、抗体定常ドメイン(抗体およびFc融合体においてみられるものを含む)のpIを下げることは、インビボにおいて、血清での保持が長期化することにつながり得る。血清半減期の増加に向けた、これらのpI変異体によって、精製に向けたpI変化も容易となる。

0038

加えて、ホモ二量体が存在する場合に、排除、最小化、および区別するいずれかの能力が顕著であるため、ヘテロ二量体化変異体のpI変異体が、二重特異性抗体の分析論および品質管理工程に追加の利点をもたらすことに留意されたい。同様に、ヘテロ二量体タンパク質産生の再現性を確実に試験する能力が重要である。

0039

当業者に理解され、以下により完全に論じられるように、本発明のヘテロ二量体融合タンパク質は、一般に、図1に示されるように、多種多様の立体配置をとることができる。いくつかの図は、分子の一方の「アーム」上に1種類の特異性、およびもう一方の「アーム」上に異なる特異性がある「シングルエンド化(single ended)」立体配置を示す。他の図は、分子の「上部」に少なくとも1種類の特異性、および分子の「下部」に1つ以上の異なる特異性がある「二重エンド化(dual ended)」立体配置を示す。したがって、本発明は、第1の抗原および第2の抗原を共捕捉する新規の免疫グロブリン組成物を対象とする。本発明の第1および第2の抗原は、本明細書において、それぞれ、抗原−1および抗原−2(または「チェックポイント−1」および「チェックポイント−2」)と称される。

0040

本発明において特に有用な1つのヘテロ二量体足場は、「三重F」または図1Aに示される「栓抜き」足場型である。この実施形態では、抗体の一方の重鎖は、単鎖Fv(以下に定義される「scFv」)を含み、もう一方の重鎖は、「定型的な(regular)」FAb型であって、可変重鎖および軽鎖を含む。この構造は、本明細書で「三重F」型(scFv−FAb−Fc)、または栓抜きにおおよそ視覚的に類似している(図1A参照)ことから「栓抜き」型と呼ばれることがある。2つの鎖は、ヘテロ二量体抗体の形成を促進する定常領域(例えば、Fcドメインおよび/またはヒンジ領域)において、アミノ酸変異体を使用することによって一緒にまとめられており、以下に、より完全に記載される。

0041

本「三重F」型には、いくつかの明確に異なる利点が存在する。当該技術分野で知られるように、2つのscFv構築物に依存する抗体類似体は、安定性および凝集の問題を有することが多いが、本発明においては、「定型的な」重鎖および軽鎖の対を追加することによって、こうした問題を軽減することができる。加えて、2つの重鎖および2つの軽鎖に依存する型とは対照的に、重鎖および軽鎖が、不正確に対になる(例えば、重1が、軽2と対になる等)という問題は存在しない。

0042

さらに、本明細書で概説されるように、追加のアミノ酸変異体は、追加の機能性を追加するために、本発明の二重特異性抗体に導入することができる。例えば、Fc領域内のアミノ酸変化は、ADCCまたはCDCの増加を容易にするため(例えば、Fcγ受容体への結合を変える)、ならびにFcRnへの結合を増加し、かつ/または得られる分子の血清半減期を増加させるために(1つの単量体または両方の単量体のいずれかに)付加され得る。本明細書にさらに記載され、当業者に理解されるように、本明細書に概説されるすべての変異体が任意選択かつ独立して他の変異体と組み合わせることができる。

0043

同様に、機能性変異体の別のカテゴリーは、「Fcγ切断変異体」または「Fcノックアウト(FcKOもしくはKO)変異体である。これらの実施形態では、いくつかの治療用途に向け、Fcγ受容体(例えば、FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)のうちの1つ以上またはすべてに対するFcドメインの通常の結合を低減または除去して、作用の付加的な機構を回避することが望ましい。すなわち、例えば、一般に、FcγRIIIa結合を切断して、ADCC活性を排除または著しく低減することが望ましい。好適な切断変異体は、図5に示される。

0044

C.命名法
本発明の二重特異性抗体は、いくつかの異なる型でリストに記載される。各ポリペプチドは固有の「XENP」番号を与えられるが、当技術分野で理解されるように、より長い配列がより短い番号を含む場合がある。例えば、所与の配列の栓抜き型のscFv側単量体の重鎖は、第1のXENP番号を有し、一方でscFvドメインは異なるXENP番号を有する。分子によっては3つのポリペプチドを有し、そのため、構成要素と共にXENP番号が名称として使用される。したがって、栓抜き型である分子XENP20717は、一般に、「XENP20717 HC−Fab」、「XENP20717HC−scFv」、および「XENP20717LC」と称される3つの配列、または等価物含むが、当業者は、配列アライメントによりこれらを容易に同定することができるだろう。これらのXENP番号ならびに識別子は、配列表にあり、図で使用されている。加えて、3つの構成要素を含む1つの分子は、複数の配列識別子をもたらす。例えば、Fab単量体のリストは、完全長配列、可変重配列、および可変重配列の3つのCDRを有し、軽鎖は、完全長配列、可変軽配列、および可変軽配列の3つのCDRを有し、scFv−Fcドメインは、完全長配列、scFv配列、可変軽配列、3つの軽CDR、scFvリンカー、可変重配列、および3つの重CDRを有する。scFvドメインを有する本明細書のすべての分子が単一の帯電scFvリンカー(+H)を使用するが、他が使用され得ることに留意する。加えて、特定の可変ドメインの命名法は、「Hx.xx_Ly.yy」の種類の形式を使用し、番号は特定の可変鎖配列に対する固有の識別子である。したがって、XENP22841のFab側の可変ドメインは、「7G8_H3.30_L1.34」であり、これは、可変重ドメインH3.30が軽ドメインL1.34と組み合わされたことを示す。これらの配列がscFvsとして使用される場合、指定「7G8_H3.30_L1.34」は、可変重ドメインH3.30が軽ドメインL1.34と組み合わされ、NからC末端のvh−リンカー−vl配向にあることを示す。重可変ドメインおよび軽可変ドメインの同一の配列を有するが逆の順序であるこの分子は、「7G8_L1.34_H3.30」と命名されるであろう。同様に、異なる構築物は、配列表および図から明らかであるように、重鎖および軽鎖を「うまく組み合わせる」ことができる。

0045

D.定義
本出願をより完全に理解し得るために、いくつかの定義を以下に示す。そのような定義は、文法的に等価であるものを包含することを意図する。

0046

本明細書では、「切断」とは、活性の低減または除去を意味する。したがって、例えば、「FcγR結合の切断」は、特定の変異体を含有しないFc領域と比較して、Fc領域アミノ酸変異体が、出発結合の50%未満を有することを意味し、活性を70〜80〜90〜95〜98%超喪失していることが好ましく、一般に、活性は、Biacore、SPR、またはBLIアッセイにおいて、検出可能な結合レベルを下回る。FcγR結合の切断において特に使用されるものは、図5に示されるものであり、これらは一般に両単量体に付加される。

0047

本明細書で使用される場合、「ADCC」または「抗体依存性細胞傷害性」とは、細胞が媒介する反応であり、FcγRを発現する非特異的細胞傷害性の細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の溶解を引き起こすことを意味する。ADCCは、FcγRIIIaに対する結合と相関しており、FcγRIIIaに対する結合の増加は、ADCC活性の増加につながる。

0048

本明細書で使用される場合、「ADCP」または抗体依存性細胞貪食とは、細胞が媒介する反応であり、FcγRを発現する非特異的貪食細胞が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、その後に標的細胞の貪食を引き起こすことを意味する。

0049

本明細書では、「抗原結合ドメイン」または「ABD」とは、ポリペプチド配列の一部として存在するとき、本明細書で論じられるように、標的抗原に特異的に結合する6つの相補性決定領域(CDR)のセットを意味する。したがって、「チェックポイント抗原結合ドメイン」は、本明細書に概説される標的チェックポイント抗原に結合する。当該技術分野で知られるように、これらのCDRは、一般に、可変重CDR(vhCDRまたはVHCDR)の第1のセット、および可変軽CDR(vlCDRまたはVLCDR)の第2のセットとして存在し、それぞれが、3つのCDR:重鎖のvhCDR1、vhCDR2、vhCDR3、ならびに軽鎖のvlCDR1、vlCDR2、およびvlCDR3を含む。CDRは、それぞれ、可変重ドメインおよび可変軽ドメインに存在し、一緒にFv領域を形成する。(表1およびCDR番号付けスキームについての上記の関連する考察を参照されたい)。したがって、場合によっては、抗原結合ドメインの6つのCDRは、可変重ドメインおよび可変軽ドメインにより寄与される。「Fab」型において、6つのCDRのセットは、2つの異なるポリペプチド配列である、可変重ドメイン(vhまたはVH;vhCDR1、vhCDR2、およびvhCDR3を含有する)および可変軽ドメイン(vlまたはVL;vlCDR1、vlCDR2、およびvlCDR3を含有する)により寄与され、vhドメインのC末端が重鎖のCH1ドメインのN末端に結合され、vlドメインのC末端が定常軽ドメインのN末端に結合する(したがって、軽鎖を形成する)。scFv型において、vhおよびvlドメインは、本明細書に概説されるように、一般にリンカー(「scFvリンカー」の使用により、単一ポリペプチド配列に共有結合され、これは、(N末端から開始して)vh−リンカー−vlまたはvl−リンカー−vhのいずれかであってよく、前者が一般に好ましい(使用される型(例えば図1から)により、各側に任意選択のドメインリンカーを含む。一般に、scFvドメインのC末端は、第2の単量体のヒンジのN末端に結合される。

0050

本明細書では、「改変」とは、ポリペプチド配列における、アミノ酸の置換、挿入、および/もしくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分に対する変更を意味する。例えば、改変は、糖質の変更またはタンパク質に結合されたPEG構造であってよい。本明細書では、「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列における、アミノ酸の置換、挿入、および/または欠失を意味する。明確化のために、別段の記載が無い限り、アミノ酸改変は、常に、DNAよってコードされるアミノ酸への改変であり、例えば、DNAおよびRNAにおいてコドンを有する20個のアミノ酸である。

0051

本明細書では、「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列における特定位置で、アミノ酸を異なるアミノ酸と置き換えることを意味する。特に、いくつかの実施形態では、置換は、特定位置で自然発生しないアミノ酸に対するものであり、生物内において、または何らかの生物において、いずれでも自然発生しない。例えば、置換E272Yは、変異体ポリペプチドを指し、この場合、位置272で、グルタミン酸が、チロシンで置き換えられているFc変異体である。明確化のために、核酸コード配列を変化させるが、出発アミノ酸を変化させないように操作されたタンパク質(例えば、CGG(アルギニンをコードする)をCGA(依然としてアルギニンをコードする)に交換して、宿主生物発現レベルを増加させる)は、「アミノ酸置換」ではない。すなわち、同じタンパク質をコードする新たな遺伝子の創出にかかわらず、タンパク質が、それが開始した特定の位置で同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。

0052

本明細書で使用される場合、「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列における特定位置でのアミノ酸配列の追加を意味する。例えば、−233Eまたは233Eは、位置233の後かつ位置234の前でのグルタミン酸の挿入を指定する。さらに、−233ADEまたはA233ADEは、位置233の後かつ位置234の前でのAlaAspGluの挿入を指定する。

0053

本明細書で使用される場合、「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列における特定位置でのアミノ酸配列の除去を意味する。例えば、E233−またはE233#、E233()またはE233delは、位置233でグルタミン酸の欠失を指定する。加えて、EDA233−またはEDA233#は、位置233から始まる配列GluAspAlaの欠失を指定する。

0054

本明細書で使用される場合、「変異体タンパク質」または「タンパク質変異体」または「変異体」は、少なくとも1つのアミノ酸改変の理由によって、親タンパク質のそれとは異なるタンパク質を意味する。タンパク質変異体は、親タンパク質と比較して少なくとも1つのアミノ酸改変を有するが、それほど多くはなく、変異体タンパク質は、以下に記載されるようなアライメントプログラムを用いて親タンパク質と整列しない。一般に、変異体タンパク質(本明細書で概説される変異体Fcドメインなどは、一般に、BLASTなどの以下に記載されるアライメントプログラムを使用して、親タンパク質に対して少なくとも75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99%同一である。

0055

以下に記載されるとおり、いくつかの実施形態では、親ポリペプチド、例えば、Fc親ポリペプチドは、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4由来の重定常ドメインまたはFc領域などのヒト野生型配列であるが、変異体を有するヒト配列は、「親ポリペプチド」として機能することもでき、例えば、米国公開第2006/0134105号のIgG1/2ハイブリッドが含まれ得る。本明細書のタンパク質変異体配列は、好ましくは、親タンパク質配列と、少なくとも約80%の同一性、最も好ましくは少なくとも約90%の同一性、より好ましくは少なくとも95〜98〜99%の同一性を有する。したがって、本明細書で使用される場合、「抗体変異体」または「変異体抗体」とは、少なくとも1つのアミノ酸改変の理由によって、親抗体とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される場合、「IgG変異体」または「変異体IgG」は、少なくとも1つのアミノ酸改変の理由によって、親IgG(同様に、多くの場合、ヒトIgG配列から)とは異なる抗体を意味し、本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン変異体」または「変異体免疫グロブリン」は、少なくとも1つのアミノ酸修飾の理由によって親免疫グロブリン配列とは異なる免疫グロブリン配列を意味する。本明細書で使用される場合、「Fc変異体」または「変異体Fc」は、ヒトIgG1、IgG2、またはIgG4のFcドメインと比較して、Fcドメインにアミノ酸改変を含むタンパク質を意味する。

0056

本発明のFc変異体は、それを構成するアミノ酸改変に従って定義される。したがって、例えば、N434Sまたは434Sは、親Fcポリペプチドに対して、位置434で置換セリンを有するFc変異体であり、番号付けは、EUインデックスに従うものである。同様に、M428L/N434Sは、親Fcポリペプチドに対して、置換M428L及び置換N434Sを有するFc変異体を定義する。WTアミノ酸の同一性が、特定されていなくてもよく、その場合、先に記載した変異体は、428L/434Sと呼ばれる。置換が提供される規則は任意であることに留意されたい。つまり、例えば、N434S/M428Lは、M428L/N434Sと同一のFc変異体である等である。本発明において論じられ、抗体に関連する位置のすべてで、別段の記載が無い限り、アミノ酸位置の番号付けは、EUインデックスに従うものである。EUインデックスまたはKabatもしくはEU番号付けスキームにあるようなEUインデックスは、EU抗体の番号付けを指す。Kabatらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列保存の程度に基づき、彼らは、個々の一次配列をCDRおよびフレームワークへと分類し、そのリストを作製した(SEQUENCESOFIMMUNOLOGICALNTEREST,5th edition,NIH publication,No.91−3242,E.A.Kabat et al.を参照されたい。参照によって、全体が組み込まれる)。Edelman et al.,1969,Proc Natl Acad Sci USA 63:78−85も参照されたい。参照により全体が組み込まれる。改変は、追加、欠失、または置換であり得る。

0057

本明細書では、「タンパク質」とは、少なくとも2つの共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびペプチドが含まれる。加えて、本発明の抗体を作りあげるポリペプチドは、1つ以上の側鎖または末端合成誘導体化、グリコシル化、PEG化、円順列環化、他の分子へのリンカー、タンパク質またはタンパク質ドメインへの融合、およびペプチドタグまたはペプチド標識の追加を含んでよい。

0058

本明細書で使用される場合、「残基」とは、タンパク質における位置を意味し、アミノ酸同一性と関連する。例えば、アスパラギン297(Asn297またはN297とも呼ばれる)は、ヒト抗体IgG1における位置297の残基である。

0059

本明細書で使用される場合、「Fab」または「Fab領域」とは、一般に、2つの異なるポリペプチド鎖上にVH、CH1、VL、およびCL免疫グロブリンドメイン(例えば、一方の鎖上にVH−CH1、そしてもう一方の鎖上にVL−CL)を含むポリペプチドを意味する。Fabは、この領域を単独で、または本発明の二重特異性抗体の文脈においてこの領域を指してよい。Fabの文脈において、Fabは、CH1およびCLドメインに加えてFv領域を含む。

0060

本明細書で使用される場合、「Fv」または「Fv断片」または「Fv領域」は、ABDのVLドメインおよびVHドメインを含むポリペプチドを意味する。Fv領域は、Fab(上述のように、一般に、上記に概説される定常領域も含む2つの異なるポリペプチド)およびscFvの両方として形式化されてよく、ここで、vlおよびvhドメインは組み合わされて(一般に、本明細書で論じられるリンカーで)、scFvを形成する。

0061

本明細書では、「単鎖Fv」または「scFv」とは、scFvまたはscFvドメインを形成するために、一般に本明細書に論じられるscFvリンカーを使用して、可変軽ドメインに共有結合した可変重ドメインを意味する。.scFvドメインは、NからC末端のいずれかの配向(vh−リンカー−vlまたはvl−リンカー−vh)であってよい。配列表および図に示される配列において、vhドメインおよびvlドメインの順序は名称で示され、例えば、H.X_L.Yは、NからC末端がvh−リンカー−vlであることを意味し、L.Y_H.Xはvl−リンカー−vhである。

0062

本明細書で使用される場合、「IgGサブクラス改変」または「アイソタイプ改変」は、1つのIgGアイソタイプの1個のアミノ酸を、異なる、整列されたIgGアイソタイプにおいて、対応するアミノ酸に変換するアミノ酸改変を意味する。例えば、EU位置296に、IgG1は、チロシンを含み、IgG2は、フェニルアラニンを含むため、IgG2におけるF296Y置換は、IgGサブクラス改変であると考えられる。

0063

本明細書で使用される場合、「非自然発生改変」とは、アイソタイプではないアミノ酸改変を意味する。例えば、ヒトIgGのいずれも位置434にセリンを含まないため、IgG1、IgG2、IgG3、もしくはIgG4(またはそのハイブリッド)における置換434Sは、非自然発生改変であると考えられる。

0064

本明細書で使用される場合、「アミノ酸」および「アミノ酸同一性」は、DNAおよびRNAによってコードされる自然発生する20個のアミノ酸のうちの1つを意味する。

0065

本明細書で使用される場合、「エフェクター機能」とは、抗体Fc領域と、Fc受容体またはFcリガンドとの相互作用からもたらされる生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、限定されないが、ADCC、ADCP、およびCDCが含まれる。

0066

本明細書で使用される場合、「IgGFcリガンド」とは、IgG抗体のFc領域に結合し、Fc/Fcリガンド複合体を形成する、何らかの生物由来の分子、好ましくは、ポリペプチドを意味する。Fcリガンドには、限定されないが、FcγRI、FcγRII、FcγRIII、FcRn、C1q、C3、マンナン結合レクチンマンノース受容体、staphylococcalプロテインA、streptococcalプロテインG、およびウイルスFcγRが含まれる。Fcリガンドは、FcγRに相同性のFc受容体のファミリーであるFc受容体相同体(FcRH)(Davis et al.,2002,Immunological Reviews 190:123−136、参照により全体が組み込まれる)も含む。Fcリガンドには、Fcに結合する未発見分子が含まれてよい。特定のIgG Fcリガンドは、FcRnおよびFcガンマ受容体である。本明細書で使用される場合、「Fcリガンド」とは、抗体のFc領域に結合し、Fc/Fcリガンド複合体を形成する、何らかの生物由来の分子、好ましくはポリペプチドを意味する。

0067

本明細書で使用される場合、「Fcガンマ受容体」、「FcγR」、または「FcガンマR」とは、IgG抗体のFc領域に結合するタンパク質ファミリーの何らかのメンバーを意味し、FcγR遺伝子によってコードされる。ヒトにおいては、このファミリーには、限定されないが、アイソフォームFcγRIa、アイソフォームFcγRIb、およびアイソフォームFcγRIcを含むFcγRI(CD64)、アイソフォームFcγRIIa(アロタイプH131およびアロタイプR131を含む)、アイソフォームFcγRIIb(FcγRIIb−1およびFcγRIIb−2を含む)、ならびにアイソフォームFcγRIIcを含むFcγRII(CD32)、ならびにアイソフォームFcγRIIIa(アロタイプV158およびアロタイプF158を含む)、およびアイソフォームFcγRIIIb(アロタイプFcγRIIb−NA1およびアロタイプFcγRIIb−NA2を含む)を含むFcγRIII(CD16)(Jefferis et al.,2002,Immunol Lett 82:57−65の全体が、参照によって組み込まれる)、ならびに何らかの未発見のヒトFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはFcγRアロタイプが含まれる。FcγRは、何らかの生物由来であってよく、限定されないが、ヒト、マウス、ラットウサギ、およびサルが含まれる。マウスFcγRには、限定されないが、FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、FcγRIII(CD16)、およびFcγRIII−2(CD16−2)、ならびに何らかの未発見のマウスFcγRまたはFcγRアイソフォームもしくはFcγRアロタイプが含まれる。

0068

本明細書で使用される場合、「FcRn」または「新生児型Fc受容体」とは、IgG抗体のFc領域に結合するタンパク質を意味し、少なくとも一部がFcRn遺伝子によってコードされる。FcRnは、何らかの生物由来であってよく、限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、およびサルが含まれる。当該技術分野で知られるように、機能性FcRnタンパク質は、2つのポリペプチドを含み、重鎖および軽鎖と呼ばれることが多い。軽鎖は、ベータ−2−ミクログロブリンであり、重鎖は、FcRn遺伝子によってコードされる。別段の記載が無い限り、FcRnまたはFcRnタンパク質は、FcRn重鎖のベータ−2−ミクログロブリンとの複合体を指す。FcRn受容体への結合の増加に使用され、場合によっては、血清半減期の増加に使用される様々なFcRn変異体。「FcRn変異体」は、FcRn受容体への結合を増加させるものであり、好適なFcRn変異体は以下に示される。

0069

本明細書で使用される場合、「親ポリペプチド」とは、後に改変されて変異体を生成する出発ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、自然発生するポリペプチド、または自然発生するポリペプチドの変異体もしくは操作された型であってよい。したがって、本明細書で使用される場合、「親免疫グロブリン」とは、変異体を生成するように改変される未改変免疫グロブリンポリペプチドを意味し、本明細書で使用される場合、「親抗体」とは、変異体抗体を生成するように改変される未改変抗体を意味する。「親抗体」は、以下に概説されるように、既知の市販の組換え産生抗体を含むことに留意されたい。この文脈において、「親Fcドメイン」は、列記される変異体に対してであり、したがって、「変異体ヒトIgG1 Fcドメイン」は、ヒトIgG1の親Fcドメインと比較され、「変異体ヒトIgG4 Fcドメイン」は、親FcドメインヒトIgG4等と比較される。

0070

本明細書で使用される場合、「Fc」または「Fc領域」または「Fcドメイン」とは、IgG分子のCH2−CH3ドメインを含み、場合によっては、ヒンジを含むポリペプチドを意味する。ヒトIgG1のEU番号付けにおいて、CH2−CH3ドメインは、アミノ酸231〜447を含み、ヒンジは216〜230である。したがって、「Fcドメイン」の定義は、アミノ酸231〜447(CH2−CH3)もしくは216〜447(ヒンジ−CH2−CH3)の両方、またはその断片を含む。この文脈において、「Fc断片」は、NおよびC末端のいずれか、または両方からのより少ないアミノ酸を含有し得るが、一般にサイズに基づく(例えば、非変性クロマトグラフィーサイズ排除クロマトグラフィー等)標準的な方法を使用して検出され得るとき、依然として別のFcドメインもしくはFc断片を有する二量体を形成する能力を保持する。ヒトIgG Fcドメインは、本発明において、特定の使用のものであり、ヒトIgG1、IgG2、またはIgG4由来のFcドメインであり得る。

0071

「変異体Fcドメイン」は、親Fcドメインと比較してアミノ酸改変を含有する。したがって、「変異体ヒトIgG1 Fcドメイン」は、ヒトIgG1 Fcドメインと比較して、アミノ酸改変(一般に、アミノ酸置換だが、切断変異体の場合、アミノ酸欠失が含まれる)を含有するものである。一般に、変異体Fcドメインは、対応する親ヒトIgG Fcドメインに対して少なくとも約80、85、90、95、97、98、または99パーセントの同一性を有する(以下に論じられる同一性アルゴリズムを使用し、一実施形態では、デフォルトパラメータを使用して、当該技術分野で知られるBLASTアルゴリズムを利用する)。あるいは、変異体Fcドメインは、親Fcドメインと比較して、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個のアミノ酸改変を有し得る。加えて、本明細書で論じられるように、本明細書において変異体Fcドメインは、非変性ゲル電気泳動などの本明細書に記載される既知の技法を使用して測定されるように、依然として別のFcドメインを有する二量体を形成する能力を保持する。

0072

本明細書において、「重鎖定常領域」とは、可変重ドメインを除く抗体(またはその断片)のCH1−ヒンジ−CH2−CH3部分を意味し、ヒトIgG1のEU番号付けにおいて、これはアミノ酸118〜447である。本明細書では、「重鎖定常領域断片」とは、NおよびC末端のいずれか、または両方からのより少ないアミノ酸を含有するが、依然として別の重鎖定常領域を有する二量体を形成する能力を保持する、重鎖定常領域を意味する。

0073

本明細書で使用される場合、「位置(position)」とは、タンパク質の配列における場所(location)を意味する。位置は、連続して番号付けされるか、または確立された形式に従ってよく、例えば、抗体の番号付けのためのEUインデックスに従ってよい。

0074

本明細書で使用される場合、「標的抗原」とは、所与の抗体の可変領域を含む抗原結合ドメインによって特異的に結合される分子を意味する。以下に論じられるように、本事例において、標的抗原はチェックポイント阻害剤タンパク質である。

0075

本明細書において、本発明のヘテロ二量体抗体の単量体の構成における「鎖性(strandedness)」とは、「適合」するDNAの2つの鎖(strand)と同様に、ヘテロ二量体化変異体が、「適合」してヘテロ二量体を形成する能力を保つように、それぞれの単量体へと取り込まれることを意味する。例えば、いくつかのpI変異体が、単量体Aへと操作される(例えば、pIを高くする)のであれば、「電荷対」である立体変異体も利用することができ、pI変異体を妨害しない。例えば、pIを高くする電荷変異体を、同一「鎖」または同一「単量体」に加えることにより、両機能性が保持される。同様に、以下により完全に概説されるセットの対で起こる「非対称」変異体については、当業者は、pI分離も非対称のpIを使用して最大になるように、どの鎖または単量体を1セットの対に組み込むかを決定するときにpIを考慮する。

0076

本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、標的抗原を発現している細胞を意味する。

0077

本明細書において、本発明に従う二重特異性抗体を産生する文脈において、「宿主細胞」とは、二重特異性抗体の構成要素をコードする外来核酸を含有し、好適な条件下で二重特異性抗体を発現することができる細胞を意味する。好適な宿主細胞を以下に論じる。

0078

本明細書で使用される場合、「可変領域」または「可変ドメイン」とは、それぞれ、カッパ免疫グロブリンラムダ免疫グロブリン、および重鎖免疫グロブリン遺伝子座を作りあげるVκ遺伝子、Vλ遺伝子、および/またはVH遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる1つ以上のIgドメインを含み、抗原特異性を付与するCDRを含有する免疫グロブリンの領域を意味する。したがって、「可変重ドメイン」は「可変軽ドメイン」と対となり、抗原結合ドメイン(「ABD」)を形成する。加えて、各可変ドメインは、3つの超可変領域(「相補性決定領域」、「CDR」)(可変重ドメインについてvhCDR1、vhCDR2、およびvhCDR3、ならびに可変軽ドメインについてvlCDR1、vlCDR2、およびvlCDR3)と、4つのフレームワーク(FR)領域とを含み、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される:FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4。

0079

本明細書では、「野生型またはWT」は、自然界にみられるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味し、対立遺伝子変動を含む。WTタンパク質は、意図的に改変されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。

0080

本発明は、ヒト抗体ドメインに対して配列同一性を有するいくつかの抗体ドメインを提供する。2つの類似する配列(例えば、抗体可変ドメイン)間の配列同一性は、Smith,T.F.&Waterman,M.S.(1981)“Comparison Of Biosequences,”Adv.Appl.Math.2:482[局地的相同性アルゴリズム]、Needleman,S.B.&Wunsch,CD.(1970)“A General Method Applicable To The Search For Similarities In The Amino Acid Sequence Of Two Proteins,”J.Mol.Biol.48:443[相同性アライメントアルゴリズム]、Pearson,W.R.&Lipman,D.J.(1988)“Improved Tools For Biological Sequence Comparison,”Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444[類似検索法]、またはAltschul,S.F.et al,(1990)“Basic Local Alignment Search Tool,”J.Mol.Biol.215:403−10(「BLAST」 アルゴリズム)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiを参照されたい)などのアルゴリズムにより測定することができる。前述のアルゴリズムのうちのいずれかを使用する場合、デフォルトパラメータ(ウィンドウの長さ、ギャップペナルティ等)が使用される。一実施形態では、配列同一性は、デフォルトパラメータを使用して、BLASTアルゴリズムを使用して行われる。

0081

本発明の抗体は、一般に、単離されているか、または組換え体である。「単離された」が、本明細書に開示される様々なポリペプチドについての説明に使用されるとき、それが発現される細胞または細胞培養から、同定され、分離され、および/または回収されたポリペプチドを意味する。通常、単離されたポリペプチドは、少なくとも1つの精製段階によって調製されることになる。「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。「組換え体」は、抗体が、外来宿主細胞において組換え核酸技法を使用して生成されることを意味し、それらも単離され得る。

0082

特異的結合(Specific binding)」、または特定の抗原もしくはエピトープ「に特異的に結合する(specifically bind to)」、または特定の抗原もしくはエピトープ「に向けた特異的(specific for)」は、非特異的相互作用とは、測定可能な程に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に、結合活性を有さない類似構造の分子である対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって、測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子との競合によって決定することができる。

0083

特定の抗原またはエピトープに向けた特異的結合は、例えば、抗原またはエピトープに向けて、抗体が、少なくとも約10−4MのKD、少なくとも約10−5MのKD、少なくとも約10−6MのKD、少なくとも約10−7MのKD、少なくとも約10−8MのKD、少なくとも約10−9MのKD、あるいは、少なくとも約10−10MのKD、少なくとも約10−11MのKD、少なくとも約10−12MのKD以上のKDを有することによって示すことができ、KDは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープに対して、対照分子が、20倍〜、50倍〜、100倍〜、500倍〜、1000倍〜、5,000倍〜、10,000倍〜、またはこれらを上回る倍数のKDを有する。

0084

また、特定の抗原またはエピトープに向けた特異的結合は、例えば、対照に対して、抗体が、そのエピトープに向けて、少なくとも20倍〜、50倍〜、100倍〜、500倍〜、1000倍〜、5,000倍〜、10,000倍〜、またはこれらを上回る倍数の、抗原またはエピトープに向けたKAまたはKaを有することによって示すことができ、KAまたはKaは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は一般に、Biacore、SPR、またはBLIアッセイを使用して測定される。

0085

E.抗体
本発明は、本明細書で論じられるように、2つの異なるチェックポイント抗原に結合する二重特異性チェックポイント抗体の生成に関する。以下に論じられるように、「抗体」という用語が、一般に使用される。本発明において有用である抗体は、本明細書に記載されるいくつかの型を呈し、伝統的な抗体、ならびに本明細書に記載され、図に示される抗体の誘導体、断片、および模倣体が含まれる。

0086

伝統的な抗体構造単位は、典型的には、四量体を含む。それぞれの四量体は、典型的には、ポリペプチド鎖の2つの同一対からなり、それぞれの対が、1つの「軽」鎖(典型的には、約25kDaの分子量を有する)、および1つの「重」鎖(典型的には、約50〜70kDaの分子量を有する)を有する。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖およびラムダ軽鎖として分類される。本発明は、一般に、IgGクラスに基づいた二重特異性抗体を対象とし、IgGクラスは、いくつかのサブクラスを有し、限定されないが、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4が含まれる。一般に、IgG1、IgG2、およびIgG4がIgG3よりも頻繁に使用される。IgG1は、356(DまたはE)および358(LまたはM)に多型を有する異なるアロタイプを有することに留意されたい。本明細書に示される配列は、356E/358Mアロタイプを使用しているが、他のアロタイプも本明細書に含まれる。すなわち、本明細書に含まれるIgG1Fcドメインを含む任意の配列は、356E/358Mアロタイプを置き換える356D/358Lを有し得る。

0087

加えて、本明細書の抗体の多くは、位置220にセリンに置き換えられるシステインのうちの少なくとも1つを有し、一般に、これは、本明細書に示される配列の大半に関して「scFv単量体」側にあるが、ジスルフィド形成を低減するために、「Fab単量体」側にあるか、またはその両方にあってもよい。置き換えられたこれらのシステイン(C220S)の一方または両方が本明細書の配列内に具体的に含まれる。

0088

したがって、本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、その定常領域の化学的特性および抗原特性によって定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。治療用抗体は、アイソタイプおよび/またはサブクラスのハイブリッドも含み得ることを理解されたい。例えば、参照によって組み込まれる米国公開第2009/0163699号に示されるように、本発明は、ヒトIgG1/G2ハイブリッドの使用。

0089

超可変領域は、軽鎖可変領域における、約アミノ酸残基24〜34(LCDR1;「L」は軽鎖を示す)、50〜56(LCDR2)、および89〜97(LCDR3)、重鎖可変領域における、およそ約31〜35B(HCDR1;「H」は、重鎖を示す)、約50〜65(HCDR2)、および約95〜102(HCDR3)のアミノ酸残基;Kabat et al.,SEQUENCESOF PROTEINS OFIMMUNOLOGICALINTEREST,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)、ならびに/または超可変ループを形成するそれらの残基(例えば、軽鎖可変領域における残基26〜32(LCDR1)、50〜52(LCDR2)、および91〜96(LCDR3)、ならびに重鎖可変領域における26〜32(HCDR1)、53〜55(HCDR2)、および96〜101(HCDR3);Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901−917、由来のアミノ酸残基を包含することが一般的である。本発明の特定のCDRは、以下に記載される。

0090

当業者に理解されるように、CDRの正確な番号付けおよび配置は、異なる番号付けシステム間で異なり得る。しかしながら、可変重および/または可変軽配列の開示は関連する(固有)CDRの開示を含むことを理解されたい。したがって、各可変重領域の開示は、vhCDR(例えば、vhCDR1、vhCDR2、およびvhCDR3)の開示であり、各可変軽領域の開示は、vlCDR(例えば、vlCDR1、vlCDR2、およびvlCDR3)の開示である。CDR番号付けの有用な比較は、以下のとおりであり、Lafranc et al.,Dev.Comp.Immunol.27(l):55−77(2003):を参照されたい。

0091

本明細書を通して、可変ドメイン(およそ、軽鎖可変領域の残基1〜107、および重鎖可変領域の残基1〜113)における残基を指すときは、Kabat番号付けシステムが一般に使用され、Fc領域についてはEU番号付けシステムが一般に使用される(例えば、Kabat et al.、上記(1991))。

0092

重鎖のIgドメインの別の型は、ヒンジ領域である。本明細書では、「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「ヒンジドメイン」は、抗体の第1の定常ドメインと第二定常ドメインとの間にアミノ酸を含む可動性のポリペプチドを意味する。構造的に、IgGCH1ドメインは、EU位置215で終了し、IgG CH2ドメインは、残基EU位置231から始まる。したがって、IgGについて、抗体ヒンジは、本明細書において、位置216(IgG1においてE216)〜230(IgG1においてp230)を含むように定義され、番号付けは、KabatにあるようにEUインデックスに従う。場合によっては、「ヒンジ断片」が使用され、これは、ヒンジドメインのNおよびC末端のいずれか、または両方により少ないアミノ酸を含有する。本明細書に示されるように、pI変異体は、ヒンジ領域においても作製することができる。

0093

軽鎖は、一般に、2つのドメイン、可変軽ドメイン(軽鎖CDRを含み、可変重ドメインと共にFv領域を形成する)および定常軽鎖領域(CLまたはCκと呼ばれることが多い)を含む。

0094

以下に概説される、追加の置換のための別の関心領域は、Fc領域である。

0095

本発明は、多数の異なるCDRのセットを提供する。この場合、「完全なCDRのセット」は、3つの可変軽CDRおよび3つの可変重CDR、例えば、vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2、およびvhCDR3を含む。これらは、それぞれより大きい可変軽ドメインまたは可変重ドメインの一部であり得る。加えて、より完全に本明細書に概説されるように、可変重ドメインおよび可変軽ドメインは、重鎖および軽鎖が使用される場合(例えば、Fabが使用される場合)別個のポリペプチド鎖上に、またはscFv配列の場合は単一ポリペプチド鎖上にあり得る。

0096

CDRは、抗原結合の形成、またはより具体的には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」は、パラトープとして知られる、抗体分子の可変領域における特定の抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の分類であり、通常、特定の構造特性、および特定の電荷特性を有する。単一抗原が2つ以上のエピトープを有してよい。

0097

エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基(エピトープの免疫優性構成要素とも呼ばれる)、および特異的な抗原結合ペプチドによって、効果的に遮断されるアミノ残基などの、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基を含んでよい。換言すれば、アミノ酸残基は、特異的な抗原結合ペプチドのフットプリント範疇である。

0098

エピトープは、立体構造的、または直線的のいずれでもよい。立体構造的エピトープは、空間的に並置されたアミノ酸によって、直線的ポリペプチド鎖の異なるセグメントから産生される。直線的エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接アミノ酸残基によって産生されるものである。立体構造的エピトープおよび非立体構造的エピトープは、前者に対する結合であって、後者に対するものではない結合が、変性溶媒の存在下で消失するという点で区別されてよい。

0099

エピトープは、固有の空間的立体構造において、典型的には少なくとも3個のアミノ酸を含み、より一般的には、少なくとも5または8〜10個のアミノ酸を含む。同一エピトープを認識する抗体は、1つの抗体が、標的抗原に対する別の抗体の結合を遮断する能力を示す単純な免疫アッセイにおいて検証することができ、例えば、「ビニング(binning)」である。以下に概説されるように、本発明は、本明細書において列挙される抗原結合ドメインおよび抗体を含むだけでなく、列挙される抗原結合ドメインによって結合されるエピトープと結合について競合するものも含む。

0100

したがって、本発明は、異なる抗体ドメインを提供する。本明細書に記載され、当該技術分野で知られるように、本発明のヘテロ二量体抗体は、鎖および軽鎖内に異なるドメインを含み、そのドメインはまた、重複し得る。これらのドメインには、限定されないが、Fcドメイン、CH1ドメイン、CH2ドメイン、CH3ドメイン、ヒンジドメイン、重定常ドメイン(CH1−ヒンジ−FcドメインまたはCH1−ヒンジ−CH2−CH3)、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、軽定常ドメイン、FAbドメイン、およびscFvドメインが含まれる。

0101

したがって、「Fcドメイン」は、−CH2−CH3ドメイン、および任意選択でヒンジドメイン(−H−CH2−CH3)を含む。本明細書の実施形態では、scFvがFcドメインに結合されるとき、それは、Fcドメインのヒンジのすべてまたは一部に結合されるscFv構築物のC末端であり、例えば、それは一般に、ヒンジの開始である配列EPKSに結合される。重鎖は、可変重ドメインおよび定常ドメインを含み、CH2−CH3を含むCH1−任意選択のヒンジ−Fcドメインを含む。軽鎖は、可変軽鎖および軽定常ドメインを含む。scFvは、可変重鎖、scFvリンカー、および可変軽ドメインを含む。本明細書に概説される構築物および配列の大半において、可変重鎖のC末端は、scFvリンカーのN末端に結合され、そのC末端は、可変軽鎖のN末端に結合される(N−vh−リンカー−vl−C)が、それは交換することができる(N−vl−リンカー−vh−C)。

0102

本発明のいくつかの実施形態は、自然に発生しないが、一般に、scFvリンカーによって一緒に連結される可変重ドメインおよび可変軽ドメインを含む少なくとも1つのscFvドメインを含む。本明細書で概説されるように、scFvドメインは、一般に、vh−scFvリンカー−vlのようにNからC末端に配向されるが、これは、scFvドメインのいずれか(またはFabからのvhおよびvl配列を使用して構築されるもの)に関して逆にすることができ、一端または両端の任意選択のリンカーは型(一般に図1を参照されたい)に依存する。

0103

本明細書に示されるように、使用され得るいくつかの好適なリンカー(ドメインリンカーまたはscFvリンカーのいずれかとして使用するための)があり、それらのリンカーは、組換え技術によって生成される伝統的なペプチド結合を含む、列記されるドメインを共有結合するために使用され得る。いくつかの実施形態では、リンカーペプチドは、次のアミノ酸残基を主に含み得る:Gly、Ser、Ala、またはThr。リンカーペプチドは、2つの分子を連結するために適切な長さを有するべきであり、そのようにして、それらは、お互いに対して正しい立体構造をとり、その結果、それらは、所望の活性を保持する。一実施形態では、リンカーは、長さが、アミノ酸で約1〜50個、好ましくは、長さが、アミノ酸で約1〜30個である。一実施形態では、長さが、アミノ酸で1〜20個であるリンカーを、いくつかの実施形態において有用である約5〜約10個のアミノ酸と共に使用してよい。有用なリンカーには、グリシン−セリン重合体(例えば、(GS)n、(GSGGS)n(配列番号37756)、(GGGGS)n(配列番号37757)、および(GGGS)n(配列番号37758)を含み、ここで、nは、少なくとも1(かつ一般に3〜4)である整数である)、グリシン−アラニン重合体アラニン−セリン重合体、および他の可動性リンカーが含まれる。あるいは、限定されないが、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリプロピレングリコールポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールの共重合体を含む様々な非タンパク質性の重合体が、リンカーとして有用であり得る。

0104

他のリンカー配列は、CL/CH1ドメインのすべての残基ではないが、CL/CH1ドメインの何らかの長さの何らかの配列を含んでよく、例えば、CL/CH1ドメインの最初の5〜12個のアミノ酸残基を含んでよい。リンカーは、免疫グロブリン軽鎖由来であり得、例えば、CκまたはCλである。リンカーは、何らかのアイソタイプの免疫グロブリン重鎖由来であり得、例えば、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε、およびCμが含まれる。リンカー配列は、Ig様タンパク質(例えば、TCR、FcR、KIR)、ヒンジ領域由来の配列、および他のタンパク質由来の他の天然の配列などの他のタンパク質に由来してもよい。

0105

いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に一緒に概説されるあらゆる2つのドメインを連結させるために使用される「ドメインリンカー」である。例えば、図1Fにおいて、FabのCH1ドメインのC末端をscFvのN末端に結合させるドメインリンカーが存在してよく、別の任意選択のドメインリンカーが、scFvのC末端をCH2ドメインに結合させる(しかし、多くの実施形態では、ヒンジがこのドメインリンカーとして使用される)。いずれの好適なリンカーが使用され得るが、多くの実施形態は、ドメインリンカーとして、グリシン−セリン重合体を利用し、これには、例えば、(GS)n、(GSGGS)n(配列番号37756)、(GGGGS)n(配列番号37757)、および(GGGS)n(配列番号37758)(ここで、nは、少なくとも1(かつ一般に3〜4〜5)である整数である)、ならびに各ドメインがその生物学的機能を保持することを可能にするのに十分な長さおよび柔軟性を有する、2つのドメインの組換え結合を可能にするあらゆるペプチド配列を含む。場合によっては、および以下に概説されるように「鎖性」に注目すると、scFvリンカーのいくつかの実施形態において使用されるように、帯電ドメインリンカーが使用され得る。

0106

いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書で論じられるように、vhおよびvlドメインを共有結合させるために使用されるscFvリンカーである。多くの場合では、scFvリンカーは、帯電scFvリンカーであり、そのいくつかは、

0107

図7に示される。したがって、本発明は、第1の単量体と第2の単量体との間でpIにおける分離を容易にするために帯電scFvリンカーをさらに提供する。すなわち、帯電scFvリンカーを組み込むことによって、正であっても、負であっても(あるいは異なる単量体上でscFvを使用する足場の場合は両方)、これは、帯電リンカーを含む単量体が、Fcドメインをさらに変更することなくpIを変えることを可能にする。これらの帯電リンカーは、標準リンカーを含有するあらゆるscFvに置換され得る。かさねて、当業者に理解されるように、帯電scFvリンカーは、pIにおける所望の変更に従って、正しい「鎖」または単量体上に使用される。例えば、本明細書で論じられるように、三重F型のヘテロ二量体抗体を作製するために、所望の抗原結合ドメインのそれぞれについてのFv領域の最初のpIが計算され、1つがscFvを作製するために選択され、pIによって、正または負のリンカーいずれかが選択される。

0108

帯電ドメインリンカーはまた、本発明の単量体のpI分離を増加するためにも使用することができ、したがって、

0109

図7に含まれるものは、リンカーが利用される本明細書のいずれの実施形態においても使用され得る。

0110

具体的には、図1に示される型は、通常「ヘテロ二量体抗体」と呼ばれる抗体であり、タンパク質が、ヘテロ二量体Fcドメインに自己組織化される少なくとも2つの関連Fc配列、および少なくとも2つのFv領域(FabとしてまたはscFvとしてにかかわらず)を有することを意味する。

0111

キメラ抗体およびヒト化抗体
ある特定の実施形態では、本発明の抗体は、特定の生殖系列重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および/または特定の生殖系列軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。例えば、そのような抗体は、特定の生殖系列配列「の産物」であるか、または特定の生殖系列配列「に由来する」重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むヒト抗体を含むか、またはそれからなり得る。ヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」であるか、またはヒト生殖系列免疫グロブリン配列「に由来する」ヒト抗体は、ヒト抗体のアミノ酸配列をヒト生殖系列免疫グロブリンのアミノ酸配列と比較し、配列がヒト抗体の配列に最も近い(すなわち、最大の同一性%)ヒト生殖系列免疫グロブリン配列を選択する(本明細書に概説される方法を使用する)ことによってそのように同定され得る。特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「の産物」であるか、または特定のヒト生殖系列免疫グロブリン配列「に由来する」ヒト抗体は、例えば、自然発生する体細胞変異または部位指向変異の意図的な導入により、生殖系列配列と比較してアミノ酸差異を含有し得る。しかしながら、ヒト化抗体は典型的には、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列が少なくとも90%同一であり、他の種の生殖系列免疫グロブリンアミノ酸配列(例えば、マウス生殖系列配列)と比較したとき、ヒト配列に由来するものとして抗体を同定するアミノ酸残基を含有する。ある特定の場合では、ヒト化抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列が少なくとも95、96、97、98、または99%同一であるか、またはさらには少なくとも96%、97%、98%、もしくは99%同一であり得る。典型的には、特定のヒト生殖系列配列に由来するヒト化抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と10〜20個以上のアミノ酸差異を示さない(本明細書の任意の非対称、pI、および切断変異体の導入前、すなわち、本発明の変異体の導入前の変異体の数は、一般に少ない)。ある特定の場合では、ヒト化抗体は、生殖系列免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と5個以上、またはさらには4、3、2、もしくは1個以上のアミノ酸差異を示さない(同様に、本明細書の任意の非対称、pI、および切断変異体の導入前、すなわち、本発明の変異体の導入前の変異体の数は、一般に少ない)。

0112

一実施形態では、親抗体は、親和性が成熟しており、当該技術分野で知られるとおりである。構造に基づく方法が、ヒト化および親和性の成熟に用いられてよく、例えば、USSN11/004,590において説明されるとおりである。抗体可変領域のヒト化および/または親和性成熟のために、選択に基づく方法が用いられてよく、限定されないが、Wu et al.,1999,J.Mol.Biol.294:151−162、Baca et al.,1997,J.Biol.Chem.272(16):10678−10684、Rosok et al.,1996,J.Biol.Chem.271(37):22611−22618、Rader et al.,1998,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:8910−8915、Krauss et al.,2003,Protein Engineering 16(10):753−759において説明される方法が含まれ、これらはすべて、参照により全体が組み込まれる。他のヒト化方法は、CDRの一部のみの移植を伴うものでよく、限定されないが、USSN09/810,510、Tan et al.,2002,J.Immunol.169:1119−1125、De Pascalis et al.,2002,J.Immunol.169:3076−3084において説明される方法が含まれ、これらはすべて、参照により全体が組み込まれる。

0113

IV.ヘテロ二量体抗体
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、自己組織化してヘテロ二量体Fcドメインおよびヘテロ二量体抗体を形成する、2つの異なる重鎖変異体Fc配列の使用に依存するヘテロ二量体チェックポイント抗体を提供する。

0114

したがって、本発明は、例えば、二重特異性結合を可能にするために、2つ以上のチェックポイント抗原またはリガンドへの結合を可能にするヘテロ二量体抗体を提供するための新規構築物を対象とする。ヘテロ二量体抗体構築物は、抗体の重鎖の2つのFcドメイン、例えば、「二量体」に組織化する2つの「単量体」の自己組織化の性質に基づく。ヘテロ二量体抗体は、以下により完全に論じられる各単量体のアミノ酸配列を変えることによって作製される。したがって、本発明は、一般に、いくつかの方法で、抗原を共捕捉することができるヘテロ二量体チェックポイント抗体の創出を対象とし、それぞれの鎖で異なる、定常領域のアミノ酸変異体に依存することで、ヘテロ二量体形成を促進し、かつ/またはホモ二量体に関してテロ二量体精製の容易化を可能にする。

0115

したがって、本発明は、二重特異性抗体を提供する。抗体技術における継続問題は、2つの異なる抗原に同時に結合し、一般に、そのようにして、異なる抗原を近接させることを可能にし、新しい機能性および新しい治療をもたらす「二重特異性」抗体が、切望されていることである。一般に、これらの抗体は、重鎖および軽鎖それぞれの遺伝子を宿主細胞に含めることによって作られる。これにより、一般に、所望のヘテロ二量体(A−B)、ならびに2つのホモ二量体(A−A及びB−B(軽鎖ヘテロ二量体の問題を含まない))の形成がもたらされる。しかしながら、二重特異性抗体形成における主な障壁は、ヘテロ二量体抗体を精製してホモ二量体抗体を除去すること、および/またはホモ二量体形成を上回るようにヘテロ二量体形成に偏らせることが困難であるということである。

0116

本発明のヘテロ二量体を生成するために使用することができる機構がいくつか存在する。加えて、当業者に理解されるように、これらの機構は、高いヘテロ二量体化を確実にするために組み合わせることができる。したがって、ヘテロ二量体の産生につながるアミノ酸変異体は、「ヘテロ二量体化変異体」と呼ばれる。以下に論じられるように、ヘテロ二量体化変異体は、立体変異体(例えば、以下に記載される「ノブアンドホール」または「非対称」変異体、および以下に記載される「電荷対」変異体)、ならびにヘテロ二量体を除去してホモ二量体の精製を可能にする「pI変異体」を含み得る。これにより、参照によりその全体が組み込まれ、特に「ヘテロ二量体化変異体」の議論について以下のようにWO2014/145806において一般に記載されるように、ヘテロ二量体化の有用な機構には、「ノブアンドホール」(「KIH」、時に本明細書では「非対称」変異体として(WO2014/145806の議論参照)、WO2014/145806に記載される「静電操縦」または「電荷対」、WO2014/145806に記載されるpI変異体、ならびにWO2014/145806および以下に概説される一般的な追加のFc変異体が含まれる。

0117

本発明には、ヘテロ二量体抗体の精製を容易にすることができるいくつかの基礎的な機構が存在する。すなわち、pI変異体の使用に依存し、その結果、単量体は、それぞれが異なるpIを有し、そうすることで、A−A二量体タンパク質、A−B二量体タンパク質、及びB−B二量体タンパク質の等電点精製を可能にするものである。あるいは、「三重F」型などのいくつかの足場型は、サイズに基づく分離も可能にする。以下にさらに概説されるように、ヘテロ二量体形成が、ホモ二量体を上回るようにする「非対称」も可能である。したがって、立体二量体化変異体、およびpI変異体または電荷対変異体の組み合わせは、本発明において、特に有用である。

0118

一般に、本発明において特に有用な実施形態は、非対称変異体を含む変異体のセットに依存し、この変異体は、2つの単量体間でpI差異を増加させるpI変異体と共に、ホモ二量体化形成より優先してヘテロ二量体化形成を促し、ホモ二量体を除去してヘテロ二量体の精製を容易にする。

0119

加えて、以下により完全に概説されるように、ヘテロ二量体抗体の型に応じて、pI変異体は、単量体の定常および/またはFcドメイン内のいずれかに含有され得るか、あるいはドメインリンカーまたはscFvリンカーのいずれかである帯電リンカーが使用され得る。すなわち、三重F型などのscFv(複数可)を利用する足場は、精製目的に向けて、さらなるpIの増大を与える帯電scFvリンカー(正か負のいずれか)を含むことができる。当業者に理解されるように、三重F型によっては、帯電scFvリンカーのみを有し、追加のpI調整無しでも有用であるが、本発明は、単量体のうちの1つまたは両方にあるpI変異体、および/または帯電ドメインリンカーも提供する。加えて、代替機能性のために操作する追加のアミノ酸はまた、Fc、FcRn、およびKO変異体などのpI変化を与え得る。

0120

ヘテロ二量体タンパク質の精製を可能にするための分離機構としてpIを利用する本発明において、アミノ酸変異体は、単量体ポリペプチドのうちの1つまたは両方に導入されてもよい。すなわち、単量体のうちの1つのpI(本明細書において、単に「単量体A」と呼ばれる)が単量体Bを除去するために操作され得るか、または単量体AおよびBの変化の両方が帯電され、単量体AのpIを増加させ、単量体BのpIを減少させることができる。論じられるように、単量体のいずれか、または両方のpIの変化は、帯電残基を除去もしくは追加(例えば、中性アミノ酸は、正もしくは負に帯電したアミノ酸残基によって置き換えられ、例えば、グリシンからグルタミン酸への置き換えである)するか、帯電残基を正もしくは負から反対の電荷へと変化(例えば、アスパラギン酸からリジンへ)させるか、または帯電残基を中性残基へと変化(例えば、リジンからセリンへであり、これにより帯電が消失する)させることによって行うことができる。いくつかのこれらの変異体が、図に示される。

0121

したがって、本発明のこの実施形態は、単量体のうちの少なくとも1つにおいて、pIの十分な変化の創出を提供し、その結果、ヘテロ二量体は、ホモ二量体から分離され得る。当業者に理解されるように、そして、以下にさらに論じられるように、これは、「野生型」重鎖定常領域と、そのpIが増加もしくは減少(wt A−+Bもしくはwt A−−B)のいずれかとなるように操作された変異体領域と、を使用することによって行うことができるか、または一方の領域を増加させ、もう一方の領域を減少させること(A+−B−もしくはA−B+)によって行うことができる。

0122

したがって、一般に、本発明のいくつかの実施形態の構成要素は、抗体の定常領域におけるアミノ酸変異体であり、このアミノ酸変異体は、アミノ酸置換(「pI変異体」または「pI置換」)を単量体のうちの1つまたは両方へ組み込むことによって、「pI抗体」を形成するために、二量体タンパク質の単量体の両方か、もし両方でないなら少なくとも1つの等電点(pI)を変えることに向けられる。本明細書で示されるように、2つのホモ二量体からのヘテロ二量体の分離は、2つの単量体のpIが、わずか0.1pH単位でも異なれば達成でき、0.2、0.3、0.4、および0.5、またはそれより大きな差異は、すべて本発明において有用である。

0123

当業者に理解されるように、良好な分離を得るために単量体(複数可)のそれぞれまたは両方に含まれるpI変異体の数は、構成要素の出発pI、例えば、三重F型で、対象のscFvおよびFabの出発pIに依存する部分がある。すなわち、どの単量体を操作するか、またはどの「方向」(例えば、より正、もしくはより負)にするかを決定するために、2つの標的抗原のFv配列が計算され、そこから決定がなされる。当該技術分野で知られるように、異なるFvであれば、本発明で活用される異なる出発pIを有する。一般に、本明細書に概説されるように、pIが操作されることにより、それぞれの単量体で、少なくとも約0.1logの総pI差異がもたらされ、本明細書に概説されるように当該総pI差異は、0.2〜0.5であることが好ましい。

0124

さらに、当業者に理解され、本明細書に概説されるように、いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体は、サイズに基づいてホモ二量体から分離することができる。例えば図1に示されるように、型のいくつかは、サイズに基づくヘテロ二量体及びホモ二量体の分離を可能にする。

0125

A.ヘテロ二量体化変異体
本発明は、ヘテロ二量体タンパク質を提供し、これには、ホモ二量体を除去してヘテロ二量体形成および/または精製を可能にするためにヘテロ二量体変異体を利用する様々な型のヘテロ二量体抗体を含む。

0126

いくつかの好適なヘテロ二量体化非対称変異体のセットの対がある。これらの変異体は、「セット」の「対」で起こる。すなわち、対の一方のセットは、第1の単量体に組み込まれ、対のもう一方のセットは、第2の単量体に組み込まれる。これらのセットは、一方の単量体上の残基ともう一方の単量体上の残基との間の1対1の対応を有する「ノブインホール」変異体として必ずしも機能せず、すなわち、これらの対のセットは、ヘテロ二量体形成を促し、ホモ二量体形成を防止する2つの単量体の間で境界面を形成し、生物学的条件下自発的に形成するヘテロ二量体のパーセンテージが、予想された50%よりもむしろ90%を超えることを可能にする(25%のホモ二量体A/A:50%のヘテロ二量体A/B:25%のホモ二量体B/B)ことに留意されたい。

0127

B.立体変異体
いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体の形成は、立体変異体の追加によって容易になる場合がある。すなわち、それぞれの重鎖におけるアミノ酸を変化させることによって、同一Fcアミノ酸配列を有するホモ二量体を形成するよりも、異なる重鎖が、会合してヘテロ二量体構造を形成する可能性が高くなる。好適な立体変異体は、図に含まれる。

0128

ヘテロ二量体形成を促し、ホモ二量体形成を防止するように立体的影響を創出するアミノ酸操作を指す、当該技術分野で一般に「ノブアンドホール」と呼ばれる1つの機構も任意選択で使用され得る。これは、USSN61/596,846、Ridgway et al.,Protein Engineering 9(7):617(1996);Atwell et al.,J.Mol.Biol.1997 270:26、米国特許第8,216,805号(それらの全ては参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されるように、「ノブアンドホール」と呼ばれる場合がある。「ノブアンドホール」に依存するいくつかの「単量体A−単量体B」の対が図において同定されている。加えて、Merchant et al.,Nature Biotech.16:677(1998)に記載されるように、これらの「ノブアンドホール」変異は、ジスルフィド結合と組み合わせて、ヘテロ二量体化へと形成を非対称にすることができる。

0129

ヘテロ二量体の生成に有用である追加の機構は、「静電操縦」と呼ばれることがあり、Gunasekaran et al.,J.Biol.Chem.285(25):19637(2010)(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に記載されるとおりである。これは、本明細書で「電荷対」と呼ばれることがある。この実施形態では、静電気が、ヘテロ二量体化へと形成を非対称とするために使用される。当業者であれば、これらは、pIに対しても効果を有し得、そうすることで、精製に対しても影響を有し得、したがって、場合によっては、pI変異体であり得るとも考えられることを理解するであろう。しかしながら、これらは、ヘテロ二量体化を押し進めるために生成され、精製手段としては使用されなかったため、それらは、「立体変異体」として分類される。これらには、限定されないが、D221R/P228R/K409Rと対であるD221E/P228E/L368E(例えば、これらは、「単量体が対応するセットである)およびC220R/E224R/P228R/K409Rと対であるC220E/P228E/368Eが含まれる。

0130

追加の単量体A変異体および単量体B変異体を、本明細書に概説されるpI変異体、またはUS2012/0149876の図37に示される他のこの当該特許文献の図および説明文ならびに配列番号は、参照により本明細書に明確に組み込まれる。

0131

いくつかの実施形態では、本明細書に概説される立体変異体を、何らかのpI変異体(またはFc変異体、FcRn変異体等の他の変異体)と共に1つまたは両方の単量体へ、任意選択かつ独立して、組み込むことができ、本発明のタンパク質を独立かつ任意選択で含むか、またはこのタンパク質から除外することができる。

0132

好適な非対称変異体のリストは図3にみられ、図8は、多くの実施形態における特定の有用性のいくつかの対を示す。多くの実施形態において特に使用されるものは、限定されないが、S364K/E357Q:L368D/K370S、L368D/K370S:S364K、L368E/K370S:S364K、T411T/E360E/Q362E:D401K、L368D/K370S:S364K/E357L、K370S:S364K/E357Q、およびT366S/L368A/Y407V:T366W(任意選択で架橋ジスルフィド、T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C)を含む、セットの対である。命名法の点から、上記のように、対「S364K/E357Q:L368D/K370S」は、単量体のうちの一方が二重変異体セットS364K/E357Qを有し、もう一方が二重変異体セットL368D/K370Sを有することを意味し、これらの対の「鎖性」は出発pIに依存する。

0133

C.ヘテロ二量体のpI(等電点)変異体
一般に、当業者に理解されるように、pI変異体には2つの一般的なカテゴリー:タンパク質のpIを増加させるもの(塩基性の変化)、およびタンパク質のpIを減少させるもの(酸性の変化)が存在する。本明細書に記載されるように、これらの変異体のすべての組み合わせを行うことができる、つまり、一方の単量体が、野生型、または野生型と顕著に異なるpIを示さない変異体であり得、もう一方は、より塩基性、またはより酸性であり得る。あるいは、それぞれの単量体を、1つはより塩基性へ、1つはより酸性へと変化させる。

0134

pI変異体の好ましい組み合わせは図4に示される。本明細書に概説され、図に示されるように、これらの変化は、IgG1に対して示されるが、すべてのアイソタイプおよびアイソタイプハイブリッドを、このように変えることができる。重鎖定常ドメインが、IgG2〜4由来である場合は、R133EおよびR133Qも使用することができる。

0135

一実施形態では、例えば、図1A、E、F、G、H、およびI型では、pI変異体の好ましい組み合わせは、208D/295E/384D/418E/421D変異体(ヒトIgG1に対しての場合、N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)を含む1つの単量体と、正の帯電scFvリンカー((GKPGS)4を含む)(配列番号37755)を含む第2の単量体(正のscFv側)とを有する。しかしながら、当業者に理解されるように、第1のモノマーは、位置208を含むCH1ドメインを含む。したがって、CH1ドメインを含まない構築物において(例えば、ドメインのうちの1つにCH1ドメインを利用しない抗体のため、例えば、図1B、C、またはDに示されるものなどの二重scFv型または「片腕」型において)、好ましい負のpI変異体Fcセットは、295E/384D/418E/421D変異体(ヒトIgG1に対しての場合、Q295E/N384D/Q418E/N421D)を含む。

0136

したがって、いくつかの実施形態では、一方の単量体は図4からの置換のセットを有し、もう一方の単量体は帯電リンカー(型が指示するように、その単量体がscFvまたは帯電ドメインリンカーを含むため、帯電scFvリンカーの形態のいずれかで、これは図7に示されるものから選択され得る)を有する。

0137

1.アイソタイプ変異体
加えて、本発明の多くの実施形態が、1つのIgGアイソタイプから別のものへの、特定位置でのpIアミノ酸の「取り込み」に依存しており、したがって、変異体へ導入される不要な免疫原性の可能性を低下または除去している。これらのいくつかは、米国公開第2014/0370013号の図21に示され、参照により本明細書に組み込まれる。すなわち、IgG1は、高いエフェクター機能を含む様々な理由で、治療用抗体のための共通のアイソタイプである。しかしながら、IgG1の重定常領域は、IgG2のそれと比較して、より高いpIを有している(8.10対7.31)。特定位置で、IgG2残基を、IgG1骨格に導入することによって、得られる単量体のpIは低下(または増加)し、付加的に血清半減期の長期化を示す。例えば、IgG1は、位置137にグリシン(pI5.97)を有し、IgG2は、グルタミン酸(pI3.22)を有している。つまり、グルタミン酸の取り込みは、得られるタンパク質のpIに影響を与えることになる。以下に記載されるように、いくつかのアミノ酸置換は、一般に、変異体抗体のpIに顕著な影響を与えることが必要とされている。しかしながら、以下に論じられるように、IgG2分子における変化でさえ、血清半減期の増加を可能にすることに留意されるべきである。

0138

以下にさらに記載されるように、他の実施形態では、得られるタンパク質の全体の電荷状態を低下(例えば、より高いpIアミノ酸を、より低いpIアミノ酸へと変化させることによって)させるか、または安定に向けた構造の適応を可能にする等のいずれかのために、非アイソタイプアミノ酸変化がなされる。

0139

加えて、重定常ドメインおよび軽定常ドメインの両方のpI操作によって、ヘテロ二量体のそれぞれの単量体において、顕著な変化をみることができる。本明細書で論じられるように、2つの単量体のpIを少なくとも0.5異なるようにすることで、イオン交換クロマトグラフィーもしくは等電点電気泳動、または等電点感受性の他の方法によっての分離が可能になる。

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