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技術 ペーパーベースのイムノアッセイにおいて使用するためのバイオマーカー濃縮及びシグナル増幅、ならびにDNAを抽出、濃縮、及び増幅するための単一プラットフォーム

出願人 ザリージェンツオブザユニバーシティオブカリフォルニア
発明者 ダニエル・タカシ・カメイベンジャミン・ミン・ウダニエル・ウィリアム・ブラッドバリーシン・ティン・シェリーン・フリーダ・チュン
出願日 2017年6月7日 (2年10ヶ月経過) 出願番号 2018-564267
公開日 2019年9月5日 (7ヶ月経過) 公開番号 2019-525136
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 操作プラットフォーム ペーパー部分 形態要素 捕捉固定 ペーパーストリップ 電子読み取り装置 フィールド環境 試験層
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2019年9月5日)のものです。
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図面 (16)

課題・解決手段

さまざまな実施形態において、分析対象物を検出及び/または定量化するための方法及びデバイスが提供される。ある特定の実施形態では、第1の相溶液と第2の相とに分離する混合相溶液を含む水性二相系ATPS)であって、使用時に、上記第1の相溶液が先行相となり、上記第2の相溶液が遅行相となる、上記ATPSと、ラテラルフローアッセイLFA)と、プローブ及び/または増進試薬であって、使用時に、上記プローブが、上記ATPSの上記先行相における上記第1の相溶液と結び付き、及び/または上記増進試薬が、上記ATPSの上記遅行相における上記第2の相溶液と結び付く、上記プローブ及び/または増進試薬と、を含むデバイスが提供される。ある特定の実施形態では、例えば、ATPS及び等温増幅試薬を利用し、核酸を精製及び増幅する「ワンポット」系が提供される。

概要

背景

アッセイは、生体液におけるさまざまな物質または病原体の存在または濃度を検出するために使用されている。固相イムノアッセイでは、受容体(典型的には、検出されることになるリガンドに特異的な抗体)が固相支持体固定化される。検出すべき分析対象物を含み得る試験流体が固相支持体と接触し、標的分析対象物が存在すると、受容体と分析対象物との対が形成される。受容体とリガンドとの対を可視化するために、受容体とリガンドとの対に結合する標識抗体が使用され、その後、受容体とリガンドとの対に結合した標識抗体が視覚的に検出され得る。

最も商業化されたポイントオブケア診断デバイスは、ラテラルフローイムノアッセイ(LFA)であり、これは、その低コスト性及び単純性によるものである。典型的な、いわゆるラテラルフローアッセイでは、検出すべき分析対象物を含む可能性のある流体が、多孔性膜層の一端に加えられ、毛細管力の作用下で膜を介して横方向に流れて、検出すべき分析対象物と結合することができる固定化「受容体」によって捕捉される。LFAには、いわゆるサンドイッチイムノアッセイが組み込まれていることが多く、サンドイッチイムノアッセイでは、分析対象物は、標識抗体と、固相支持体に固定化された抗体と、の間に挟み込まれる。

概要

さまざまな実施形態において、分析対象物を検出及び/または定量化するための方法及びデバイスが提供される。ある特定の実施形態では、第1の相溶液と第2の相とに分離する混合相溶液を含む水性二相系ATPS)であって、使用時に、上記第1の相溶液が先行相となり、上記第2の相溶液が遅行相となる、上記ATPSと、ラテラルフローアッセイ(LFA)と、プローブ及び/または増進試薬であって、使用時に、上記プローブが、上記ATPSの上記先行相における上記第1の相溶液と結び付き、及び/または上記増進試薬が、上記ATPSの上記遅行相における上記第2の相溶液と結び付く、上記プローブ及び/または増進試薬と、を含むデバイスが提供される。ある特定の実施形態では、例えば、ATPS及び等温増幅試薬を利用し、核酸を精製及び増幅する「ワンポット」系が提供される。

目的

実施形態116:
核酸を精製及び増幅する方法であって、前記方法が、第1の相溶液及び第2の相溶液に分離する混合相溶液を含む水性二相系(ATPS)を提供する

効果

実績

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請求項1

試料における分析対象物を検出及び/または定量化するためのデバイスであって、前記デバイスが、第1の相溶液と第2の相とに分離する混合相溶液を含む水性二相系ATPS)であって、使用時に、前記第1の相溶液が先行相となり、前記第2の相溶液が遅行相となる、前記ATPSと、ラテラルフローアッセイLFA)またはフロースルーアッセイと、プローブ及び/または増進試薬であって、使用時に、前記プローブが、前記ATPSの前記先行相における前記第1の相溶液と結び付き、及び/または前記増進試薬が、前記ATPSの前記遅行相における前記第2の相溶液と結び付く、前記プローブ及び/または増進試薬と、を含む、前記デバイス。

請求項2

前記LFAが、前記ATPSもしくはその構成成分、及び/または前記プローブ、及び/または前記増進試薬を、受け入れ、及び/または含むように構成された多孔性マトリックスを含む、請求項1に記載のデバイス。

請求項3

前記LFAが、複合パッド、前記分析対象物と結合する抗体を含む試験ライン任意選択で、二次抗体を含む対照ライン、任意選択で吸収パッド、及び任意選択で試料パッドを含む、請求項1〜2のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項4

試料における分析対象物を検出及び/または定量化するためのデバイスであって、前記デバイスが、フロースルー系を含み、前記フロースルー系が、混合相溶液を含む水性二相系(ATPS)を含む濃縮コンポーネントであって、使用時に、前記第1の相溶液が先行相となり、前記第2の相溶液が遅行相となる、前記濃縮コンポーネントと、プローブ及び/または増進試薬であって、使用時に、前記プローブが、前記ATPSの前記先行相における前記第1の相溶液と結び付き、及び/または前記増進試薬が、前記ATPSの前記遅行相における前記第2の相溶液と結び付く、前記プローブ及び/または増進試薬と、前記濃縮コンポーネントの真下に配置された検出コンポーネントと、を含む、前記デバイス。

請求項5

前記濃縮コンポーネントが、1つまたは複数のペーパー層を含む、請求項4に記載のデバイス。

請求項6

前記検出コンポーネントが、複合パッド、反応パッド、及び任意選択でシンクを含む、請求項4〜5のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項7

前記プローブが、前記ATPSに含められる、請求項1〜6のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項8

前記プローブが、前記ATPSの前記第1の相溶液と結び付く、請求項7に記載のデバイス。

請求項9

前記増進試薬が、前記ATPSに含められる、請求項1〜8のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項10

前記増進試薬が、前記ATPSの前記第2の相溶液と結び付く、請求項9に記載のデバイス。

請求項11

前記試料が前記デバイスへ加えられる前に、前記ATPSが前記試料と混合されるように、前記デバイスが構成される、請求項1〜10のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項12

前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記ATPSが脱水されて、前記ラテラルフローアッセイに加えられるか、またはフロースルーアッセイの濃縮コンポーネントに含められる、請求項1〜11のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項13

前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記プローブが脱水されて、前記ラテラルフローアッセイに加えられるか、またはフロースルーアッセイの濃縮コンポーネントに含められる、請求項12に記載のデバイス。

請求項14

前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記増進試薬が脱水されて、前記ラテラルフローアッセイに加えられるか、またはフロースルーアッセイの濃縮コンポーネントに含められる、請求項12〜13のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項15

前記デバイスが前記試料と接触した後に、前記ATPSが、第1の相溶液と第2の相溶液とに分離する混合相溶液を含む、請求項12〜14のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項16

前記プローブが、前記ATPSの親水相極度分配されるように選択される、請求項1〜15のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項17

前記プローブが、前記ATPSの疎水相に極度に分配されるように選択される、請求項1〜15のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項18

前記増進試薬が、前記ATPSの疎水相に極度に分配されるように選択される、請求項1〜17のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項19

前記増進試薬が、前記ATPSの親水相に極度に分配されるように選択される、請求項1〜17のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項20

前記ATPSが、ポリマー/塩ATPS、ポリマー/ポリマーATPS、ミセル/ポリマーATPS、及びミセルATPSからなる群から選択される、請求項1〜19のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項21

前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含む、請求項20に記載のデバイス。

請求項22

前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、請求項20に記載のデバイス。

請求項23

前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含み、前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、請求項20に記載のデバイス。

請求項24

前記ATPSが、ポリマー/塩ATPSである、請求項20に記載のデバイス。

請求項25

前記ATPSが、PEG/塩ATPSである、請求項24に記載のデバイス。

請求項26

前記プローブが、前記ポリマー/塩ATPSの塩高含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ポリマー/塩ATPSのポリマー高含有相に分配される、請求項24〜25のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項27

前記ATPSが、ミセルATPSである、請求項20に記載のデバイス。

請求項28

前記プローブが、前記ATPSのミセル低含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ATPSのミセル高含有相に分配される、請求項27に記載のデバイス。

請求項29

前記プローブが、前記標的分析対象物に結合する結合部分を含む、請求項1〜28のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項30

前記標的分析対象物が、タンパク質核酸、糖またはレクチン、及び微生物からなる群から選択される部分を含む、請求項29に記載のデバイス。

請求項31

前記標的分析対象物が、細菌、原生動物真菌ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物を含む、請求項30に記載のデバイス。

請求項32

前記標的分析対象物が、微生物に対するバイオマーカーを含む、請求項30に記載のデバイス。

請求項33

前記標的分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物に対するバイオマーカーを含む、請求項32に記載のデバイス。

請求項34

前記標的分析対象物が、病状に対するバイオマーカー、食品安全(もしくは危険)に対するバイオマーカー、またはバイオテロ物質に対するバイオマーカーを含む、請求項32に記載のデバイス。

請求項35

前記結合部分が、抗体または抗体断片、レクチン、核酸、及びアプタマーからなる群から選択される、請求項29〜34のいずれか1項に記載の方法。

請求項36

前記プローブが、抗体または抗体断片を含む、請求項35に記載のデバイス。

請求項37

前記プローブが、合成ポリマー、金属、ミネラルガラス石英セラミック生体ポリマー、及びプラスチックからなる群から選択される材料を含む、請求項1〜36のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項38

前記プローブが、ポリエチレンポリプロピレンセルロースキチンナイロンポリオキシメチレンポリテトラフルオロエチレン、またはポリ塩化ビニルデキストラン、ポリプロピレン、またはポリエチレングリコールからなる群から選択される材料を含む、請求項37に記載のデバイス。

請求項39

前記プローブが、金、銀、鉄、白金パラジウムセリウム、及びチタンからなる群から選択される金属を含む、請求項37に記載のデバイス。

請求項40

前記プローブが、ナノ粒子を含む、請求項1〜39のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項41

前記プローブが、前記増進試薬と反応して検出可能なシグナルを生成することができる物質を含む、請求項1〜40のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項42

前記物質が、基質と反応して強力な可視シグナルを形成する酵素を含む、請求項41に記載のデバイス。

請求項43

前記増進試薬が、前記基質を含む、請求項42に記載のデバイス。

請求項44

前記増進試薬が、前記酵素と結合する抗体を含む、請求項42に記載のデバイス。

請求項45

前記物質が、酵素と反応して強力な可視生成物を形成する基質を含む、請求項41に記載のデバイス。

請求項46

前記増進試薬が、前記酵素を含む、請求項45に記載のデバイス。

請求項47

前記酵素が、アルカリホスファターゼセイヨウワサビ(または他の)ペルオキシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼからなる群から選択される、請求項42及び請求項46のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項48

前記プローブが、前記ATPSの前記第1の相溶液または前記第2の相溶液に対する親和性を有するコーティングを含む、請求項1〜47のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項49

前記コーティングが、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、デキストラン、親水性タンパク質、及び疎水性タンパク質からなる群から選択される材料を含む、請求項48に記載のデバイス。

請求項50

前記デバイスが、異なる分析対象物とそれぞれが相互作用する2つ以上のプローブを含む、請求項1〜49のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項51

前記デバイスが、少なくとも2つの異なるプローブ、または少なくとも3つの異なるプローブ、または少なくとも4つの異なるプローブ、または少なくとも5つの異なるプローブ、または少なくとも7つの異なるプローブ、または少なくとも10の異なるプローブ、または少なくとも15の異なるプローブ、または少なくとも20の異なるプローブを含む、請求項50に記載のデバイス。

請求項52

前記デバイスが、サンドイッチアッセイを実施するために構成される、請求項1〜51のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項53

第1の相溶液と第2の相とに分離する混合相溶液であって、LFAまたは他の多孔性媒体における使用時に、前記第1の相溶液が先行相になり、前記第2の相溶液が遅行相になる、前記混合相溶液と、プローブ及び/または増進試薬であって、前記プローブが、前記第1の相溶液と結び付き、前記増進試薬が、前記第2の相溶液と結び付く、前記プローブ及び/または増進試薬と、を含む、水性二相系(ATPS)。

請求項54

前記ATPSが、ポリマー/塩ATPS、ポリマー/ポリマーATPS、ミセル/ポリマーATPS、及びミセルATPSからなる群から選択される、請求項53に記載の水性二相系。

請求項55

前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含み、前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、請求項54に記載の水性二相系。

請求項56

前記ATPSが、ポリマー/塩ATPSである、請求項54に記載の水性二相系。

請求項57

前記ATPSが、PEG/塩ATPSである、請求項56に記載の水性二相系。

請求項58

前記プローブが、前記ポリマー/塩ATPSの塩高含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ポリマー/塩ATPSのポリマー高含有相に分配される、請求項56〜57のいずれか1項に記載の水性二相系。

請求項59

前記ATPSが、ミセルATPSである、請求項54に記載の水性二相系。

請求項60

前記プローブが、前記ATPSのミセル低含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ATPSのミセル高含有相に分配される、請求項59に記載の水性二相系。

請求項61

前記プローブが、前記標的分析対象物に結合する結合部分を含む、請求項1〜60のいずれか1項に記載の水性二相系。

請求項62

前記ATPSが、多孔性媒体に含められる、請求項1〜61のいずれか1項に記載の水性二相系。

請求項63

前記ATPSが、ペーパーに含められる、請求項1〜61のいずれか1項に記載の水性二相系。

請求項64

前記ATPSが、ラテラルフローアッセイ(LFA)に含められる、請求項1〜61のいずれか1項に記載の水性二相系。

請求項65

前記ATPSが、フロースルー系に含められる、請求項1〜61のいずれか1項に記載の水性二相系。

請求項66

分析対象物の検出方法及び/または定量化方法であって、前記方法が、水性二相系(ATPS)へ試料を加えることであって、前記加えることによって、前記分析対象物が、前記試料に存在するのであれば、前記ATPSの1つの相に濃縮されて分析対象物含有相が得られる、前記加えることと、ラテラルフローアッセイ(LFA)またはフロースルーアッセイへ前記分析対象物含有相を加えることであって、前記LFAまたはフロースルーアッセイにおいて検出プローブが前記分析対象物に結合する、前記加えることと、前記LFAまたはフロースルーアッセイへ増進試薬を加えることであって、前記加えることによって、前記検出プローブが生成するシグナルが増強される、前記加えることと、前記試料における前記分析対象物の存在及び/または量を示すための、前記シグナルの検出及び/または定量化と、を含む、前記方法。

請求項67

前記ラテラルフローアッセイまたはフロースルーアッセイが、ラテラルフローアッセイである、請求項66に記載の方法。

請求項68

前記ラテラルフローアッセイまたはフロースルーアッセイが、フロースルーアッセイである、請求項66に記載の方法。

請求項69

前記ATPSがペーパーに加えられ、前記ATPSが前記ペーパーを通過するにつれて相が分離することで、「流れながら濃縮する」ATPSが得られる、請求項66〜68のいずれか1項に記載の方法。

請求項70

前記ATPSがペーパーに加えられると、より疎水的な相が先行し、より親水的な相が遅行する、請求項69に記載の方法。

請求項71

前記ATPSがペーパーに加えられると、より親水的な相が先行し、より疎水的な相が遅行する、請求項69に記載の方法。

請求項72

前記LFAまたはフロースルーアッセイが、結合部分が前記分析対象物を捕捉し、前記検出プローブが前記捕捉分析対象物に結合するものである、請求項66〜71のいずれか1項に記載の方法。

請求項73

前記分析対象物含有相が、手動またはロボット制御で前記ATPSから取り出された後、前記ラテラルフローアッセイに加えられる、請求項66〜72のいずれか1項に記載の方法。

請求項74

前記検出プローブが、前記LFAまたはフロースルーアッセイのコンポーネントとして提供される、請求項73に記載の方法。

請求項75

次に、前記増進試薬が、前記ATPSとは別に、前記ラテラルフローアッセイに加えられる、請求項73〜74のいずれか1項に記載の方法。

請求項76

前記プローブと前記増進試薬との両方が、前記ATPSに加えられるか、または前記ATPSに含めて提供され、前記ATPSの前記構成成分が、前記プローブが前記ATPSの第1の相に実質的に分配され、前記増進試薬が前記ATPSの第2の相に実質的に分配されるように選択される、請求項66〜72のいずれか1項に記載の方法。

請求項77

前記ATPSが、ペーパー基質に加えられると、先行相及び遅行相を形成し、前記先行相が、前記濃縮分析対象物及び前記プローブをLFA試験ストリップまたはフロースルーアッセイに送達した後、前記遅行相が、前記試験ストリップまたはフロースルーアッセイに前記増進試薬を遅れて送達する、請求項76に記載の方法。

請求項78

前記プローブが、前記ATPSの親水相に極度に分配されるように選択される、請求項76〜77のいずれか1項に記載の方法。

請求項79

前記プローブが、前記ATPSの疎水相に極度に分配されるように選択される、請求項76〜77のいずれか1項に記載の方法。

請求項80

前記増進試薬が、前記ATPSの疎水相に極度に分配されるように選択される、請求項76〜79のいずれか1項に記載の方法。

請求項81

前記増進試薬が、前記ATPSの親水相に極度に分配されるように選択される、請求項76〜79のいずれか1項に記載の方法。

請求項82

前記ATPSが、ポリマー/塩ATPS、ポリマー/ポリマーATPS、ミセル/ポリマーATPS、及びミセルATPSからなる群から選択される、請求項66〜81のいずれか1項に記載の方法。

請求項83

前記ATPSの前記第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含み、前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、請求項82に記載の方法。

請求項84

前記ATPSが、ポリマー/塩ATPSである、請求項82に記載の方法。

請求項85

前記ATPSが、PEG/塩ATPSである、請求項84に記載の方法。

請求項86

前記プローブが、前記ポリマー/塩ATPSの塩高含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ポリマー/塩ATPSのポリマー高含有相に分配される、請求項84〜85のいずれか1項に記載の方法。

請求項87

前記ATPSが、ミセルATPSである、請求項82に記載の方法。

請求項88

前記プローブが、前記ATPSのミセル低含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ATPSのミセル高含有相に分配される、請求項87に記載の方法。

請求項89

前記プローブが、前記標的分析対象物に結合する結合部分を含む、請求項66〜88のいずれか1項に記載の方法。

請求項90

前記標的分析対象物が、タンパク質、核酸、糖またはレクチン、及び微生物からなる群から選択される部分を含む、請求項89に記載の方法。

請求項91

前記標的分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物を含む、請求項90に記載の方法。

請求項92

前記標的分析対象物が、微生物に対するバイオマーカーを含む、請求項90に記載の方法。

請求項93

前記標的分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物に対するバイオマーカーを含む、請求項92に記載の方法。

請求項94

前記結合部分が、抗体または抗体断片、レクチン、核酸、及びアプタマーからなる群から選択される、請求項89〜92のいずれか1項に記載の方法。

請求項95

前記プローブが、抗体または抗体断片を含む、請求項94に記載の方法。

請求項96

前記プローブが、合成ポリマー、金属、ミネラル、ガラス、石英、セラミック、生体ポリマー、及びプラスチックからなる群から選択される材料を含む、請求項66〜95のいずれか1項に記載の方法。

請求項97

前記プローブが、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロース、キチン、ナイロン、ポリオキシメチレン、ポリテトラフルオロエチレン、またはポリ塩化ビニル、デキストラン、ポリプロピレン、またはポリエチレングリコールからなる群から選択される材料を含む、請求項96に記載の方法。

請求項98

前記プローブが、金、銀、鉄、白金、パラジウム、セリウム、及びチタンからなる群から選択される金属を含む、請求項96に記載の方法。

請求項99

前記プローブが、ナノ粒子を含む、請求項66〜98のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項100

前記プローブが、前記増進試薬と反応して検出可能なシグナルを生成することができる物質を含む、請求項66〜99のいずれか1項に記載の方法。

請求項101

前記物質が、基質と反応して強力な可視シグナルを形成する酵素を含む、請求項100に記載の方法。

請求項102

前記増進試薬が、前記基質を含む、請求項101に記載の方法。

請求項103

前記増進試薬が、前記酵素と結合する抗体を含む、請求項101に記載の方法。

請求項104

前記物質が、酵素と反応して強力な可視生成物を形成する基質を含む、請求項100に記載の方法。

請求項105

前記増進試薬が、前記酵素を含む、請求項104に記載の方法。

請求項106

前記酵素が、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビ(または他の)ペルオキシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼからなる群から選択される、請求項101及び請求項105のいずれか1項に記載の方法。

請求項107

前記プローブが、前記ATPSの前記第1の相溶液または前記第2の相溶液に対する親和性を有するコーティングを含む、請求項66〜106のいずれか1項に記載のデバイス。

請求項108

前記コーティングが、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、デキストラン、親水性タンパク質、及び疎水性タンパク質からなる群から選択される材料を含む、請求項107に記載のデバイス。

請求項109

前記方法が、請求項1〜52のいずれか1項に記載のデバイスを使用して実施される、請求項66〜108のいずれか1項に記載の方法。

請求項110

分析対象物を検出及び/または定量化するためのキットであって、前記キットが、請求項1〜52のいずれか1項に記載のデバイスと、試料を採取するための採取デバイスと、を含む、前記キット。

請求項111

前記採取デバイスが、口腔液を採取するためのデバイスを含む、請求項110に記載のキット。

請求項112

前記採取デバイスが、血液を採取するためのデバイスを含む、請求項110に記載のキット。

請求項113

前記採取デバイスが、尿採取デバイスを含む、請求項110に記載のキット。

請求項114

前記採取デバイスが、液を採取するためのデバイス、または子宮頸管内スワブから採取するためのデバイスを含む、請求項110に記載のキット。

請求項115

前記採取デバイスが、環境試料のためのデバイスを含む、請求項110に記載のキット。

請求項116

核酸を精製及び増幅する方法であって、前記方法が、第1の相溶液及び第2の相溶液に分離する混合相溶液を含む水性二相系(ATPS)を提供することであって、前記ATPSが、核酸が前記第1の相溶液もしくは前記第2の相溶液のいずれかに分配されることになるものであるか、または前記ATPSが、核酸が前記第1の相溶液と前記第2の相溶液との間の界面に局在化することになるものである、前記提供することと、前記ATPSへ核酸を含む試料を導入することであって、前記核酸が、前記第1の相溶液もしくは前記第2の相溶液、または前記第1の相溶液と前記第2の相溶液との間の前記界面に分配されることで濃縮核酸が得られる、前記導入することと、増幅核酸を得るために核酸増幅反応において前記濃縮核酸を増幅することと、を含む、前記方法。

請求項117

前記核酸が、DNAである、請求項116に記載の方法。

請求項118

前記核酸が、RNAである、請求項116に記載の方法。

請求項119

前記核酸が、RNAから逆転写されたDNAである、請求項116に記載の方法。

請求項120

前記ATPSが、ポリマー/塩ATPS、ポリマー/ポリマーATPS、ミセル/ポリマーATPS、及びミセルATPSからなる群から選択される、請求項116〜119のいずれか1項に記載の方法。

請求項121

前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含み、前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、請求項120に記載の方法。

請求項122

前記増幅することが、前記第1の相から前記濃縮核酸を回収することであって、その方法が、回収濃縮核酸を得るために、前記第1の相溶液もしくは前記第2の溶液、または前記第1の相溶液と前記第2の相溶液との前記界面から前記核酸を回収することを含む、前記回収することと、前記核酸を増幅するために核酸増幅反応への前記回収濃縮核酸を導入することと、を含む、請求項116〜121のいずれか1項に記載の方法。

請求項123

前記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応PCR)反応系を含む、請求項122に記載の方法。

請求項124

前記核酸増幅反応が、等温増幅系を含む、請求項122に記載の方法。

請求項125

前記核酸増幅反応が、自己持続性シーケンス反応(3SR)、核酸ベース転写アッセイ(NASBA)、転写増幅(TMA)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、ループ介在等温増幅(LAMP)、ステムループ増幅、シグナル介在RNA増幅技術(SMART)、等温多置換増幅(IMDA)、単一プライマー等温増幅(SPIA)、環状ヘリカーゼ依存性増幅(cHDA)、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)からなる群から選択される増幅系を含む、請求項124に記載の方法。

請求項126

前記増幅することが、等温核酸増幅のために試薬と前記ATPSを混合することを含む、請求項116〜121のいずれか1項に記載の方法。

請求項127

前記核酸増幅反応が、等温増幅系を含む、請求項126に記載の方法。

請求項128

前記核酸増幅反応が、自己持続性シーケンス反応(3SR)、核酸ベースの転写アッセイ(NASBA)、転写増幅(TMA)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、ループ介在等温増幅(LAMP)、ステムループ増幅、シグナル介在RNA増幅技術(SMART)、等温多置換増幅(IMDA)、単一プライマー等温増幅(SPIA)、環状ヘリカーゼ依存性増幅(cHDA)、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)からなる群から選択される増幅系を含む、請求項127に記載の方法。

請求項129

前記方法が、室温または室温未満の温度で前記等温増幅を実施することを含む、請求項127〜128のいずれか1項に記載の方法。

請求項130

前記方法が、等温増幅のための試薬を含む前記ATPSを実質的に一定な温度まで加熱することを含む、請求項127〜128のいずれか1項に記載の方法。

請求項131

前記増幅が、ヘリカーゼ依存性増幅を含み、約65℃の一定温度で実施される、請求項127〜130のいずれか1項に記載の方法。

請求項132

前記方法が、単一の容器で実施される、請求項126〜131のいずれか1項に記載の方法。

請求項133

前記方法が、マルチウェルプレートウェルに異なる試料をそれぞれ含めて複数の核酸試料で実施される、請求項126〜131のいずれか1項に記載の方法。

請求項134

前記複数の試料が、少なくとも2つの試料、または少なくとも4つの試料、または少なくとも8つの試料、または少なくとも16の試料、または少なくとも32の試料、または少なくとも64の試料、または少なくとも128の試料を含む、請求項133に記載の方法。

請求項135

前記方法が、マイクロ流体系(例えば、ラボオンチップ)のチャンバーまたはチャネルにおいて実施される、請求項126〜131のいずれか1項に記載の方法。

請求項136

前記試料が、細胞溶解物である、請求項116〜135のいずれか1項に記載の方法。

請求項137

前記試料が、核酸である、請求項116〜135のいずれか1項に記載の方法。

請求項138

前記試料が、インタクト細胞を含み、前記ATPSが、細胞を溶解するATPSである、請求項116〜135のいずれか1項に記載の方法。

請求項139

前記ATPSが、ミセルATPSである、請求項116〜138のいずれか1項に記載の方法。

請求項140

前記試料が、血液または濾紙血を含み、前記ATPSが、濾紙血を再溶解するものである、請求項116〜138のいずれか1項に記載の方法。

請求項141

前記ATPSが、PEG/デキストランATPSを含む、請求項140に記載の方法。

請求項142

前記ATPSが、UCON/デキストランATPSを含む、請求項140に記載の方法。

請求項143

核酸を精製及び増幅するためのキットであって、前記キットが、水性二相系(ATPS)の構成成分を含む容器と、等温核酸増幅系の1つまたは複数の構成成分を含む容器と、を含む、前記キット。

請求項144

ATPSの構成成分を含む前記容器と、等温核酸増幅系の構成成分を含む前記容器と、が同一の容器である、請求項143に記載のキット。

請求項145

ATPSの構成成分を含む前記容器と、等温核酸増幅系の構成成分を含む前記容器と、が異なる容器である、請求項143に記載のキット。

請求項146

等温核酸増幅系の1つまたは複数の構成成分を含む前記容器が、自己持続性シーケンス反応(3SR)、核酸ベースの転写アッセイ(NASBA)、転写増幅(TMA)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、ループ介在等温増幅(LAMP)、ステムループ増幅、シグナル介在RNA増幅技術(SMART)、等温多置換増幅(IMDA)、単一プライマー等温増幅(SPIA)、環状ヘリカーゼ依存性増幅(cHDA)、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)からなる群から選択される反応系の1つまたは複数の構成成分を含む、請求項143〜145のいずれか1項に記載のキット。

請求項147

前記1つまたは複数の構成成分が、前記核酸増幅反応を実行する酵素を含む、請求項146に記載のキット。

請求項148

前記1つまたは複数の構成成分が、ヘリカーゼを含む、請求項146に記載のキット。

請求項149

前記ATPSが、ポリマー/塩ATPS、ポリマー/ポリマーATPS、ミセル/ポリマーATPS、及びミセルATPSからなる群から選択される、請求項143〜148のいずれか1項に記載のキット。

請求項150

前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含み、前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、請求項149に記載のキット。

請求項151

前記ATPSが、ミセルATPSを含む、請求項143〜149のいずれか1項に記載のキット。

請求項152

前記ATPSが、PEG/デキストランATPSを含む、請求項143〜149のいずれか1項に記載のキット。

請求項153

前記ATPSが、UCON/デキストランATPSを含む、請求項143〜149のいずれか1項に記載のキット。

請求項154

前記キットが、請求項126〜142のいずれか1項に記載の方法を実施するためのプロトコールを提供する説明資料を含む、請求項143〜153のいずれか1項に記載のキット。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、2016年6月9日出願のUSSN62/348,038の利益及び優先権を主張し、当該出願は、すべての目的のために参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
政府による支援の記載
該当なし

背景技術

0002

アッセイは、生体液におけるさまざまな物質または病原体の存在または濃度を検出するために使用されている。固相イムノアッセイでは、受容体(典型的には、検出されることになるリガンドに特異的な抗体)が固相支持体固定化される。検出すべき分析対象物を含み得る試験流体が固相支持体と接触し、標的分析対象物が存在すると、受容体と分析対象物との対が形成される。受容体とリガンドとの対を可視化するために、受容体とリガンドとの対に結合する標識抗体が使用され、その後、受容体とリガンドとの対に結合した標識抗体が視覚的に検出され得る。

0003

最も商業化されたポイントオブケア診断デバイスは、ラテラルフローイムノアッセイ(LFA)であり、これは、その低コスト性及び単純性によるものである。典型的な、いわゆるラテラルフローアッセイでは、検出すべき分析対象物を含む可能性のある流体が、多孔性膜層の一端に加えられ、毛細管力の作用下で膜を介して横方向に流れて、検出すべき分析対象物と結合することができる固定化「受容体」によって捕捉される。LFAには、いわゆるサンドイッチイムノアッセイが組み込まれていることが多く、サンドイッチイムノアッセイでは、分析対象物は、標識抗体と、固相支持体に固定化された抗体と、の間に挟み込まれる。

0004

米国特許第5,644,048号

先行技術

0005

Beaucage et al.(1993)Tetrahedron 49(10):1925

発明が解決しようとする課題

0006

しかしながら、LFAは、実験室ベースのアッセイ(ELISAなど)と比較すると感度が劣るという問題を抱えている。LFAの感度改善に相当な労力が払われてきたが、こうした取り組みの多くは、高価な電子読み取り装置の使用に頼るものであるか、または使用者による複数段階の実行が必要なものであり、LFAのポイント・オブ・ケアという性質を損なうものである。

0007

同様に、ポイント・オブ・ケアにふさわしい、DNA検出のための核酸増幅検査(NAAT)を設計することに労力が払われてきたが、こうしたものは、過度単純化によって感度が不足するか、または検査精度を確保するために使いやすさを犠牲にするものであることが多い。さらに、現在のポイント・オブ・ケア(POC)NAATは、典型的には、試料分析及び処理するに依然として機器が必要になるものである。したがって、完全に独立型または携帯型のPOC NAATで商業化されたものは存在しない。

課題を解決するための手段

0008

本明細で企図されるさまざまな実施形態には、限定される必要はないが、下記のもののうちの1つまたは複数が含まれ得る:

0009

実施形態1:
試料における分析対象物を検出及び/または定量化するためのデバイスであって、
前記デバイスが、
第1の相溶液と第2の相とに分離する混合相溶液を含む水性二相系ATPS)であって、使用時に、前記第1の相溶液が先行相となり、前記第2の相溶液が遅行相となる、前記ATPSと、
ラテラルフローアッセイ(LFA)またはフロースルーアッセイと、
プローブ及び/または増進試薬(development reagent)であって、使用時に、前記プローブが、前記ATPSの前記先行相における前記第1の相溶液と結び付き、及び/または前記増進試薬が、前記ATPSの前記遅行相における前記第2の相溶液と結び付く、前記プローブ及び/または増進試薬と、
を含む、前記デバイス。

0010

実施形態2:
前記LFAが、前記ATPSもしくはその構成成分、及び/または前記プローブ、及び/または前記増進試薬を、受け入れ、及び/または含むように構成された多孔性マトリックスを含む、実施形態1に記載のデバイス。

0011

実施形態3:
前記LFAが、複合パッド、前記分析対象物と結合する抗体を含む試験ライン任意選択で、二次抗体を含む対照ライン、任意選択で吸収パッド、及び任意選択で試料パッドを含む、実施形態1〜2のいずれか1つに記載のデバイス。

0012

実施形態4:
試料における分析対象物を検出及び/または定量化するためのデバイスであって、
前記デバイスが、フロースルー系を含み、
前記フロースルー系が、
混合相溶液を含む水性二相系(ATPS)を含む濃縮コンポーネントであって、使用時に、前記第1の相溶液が先行相となり、前記第2の相溶液が遅行相となる、前記濃縮コンポーネントと、
プローブ及び/または増進試薬であって、使用時に、前記プローブが、前記ATPSの前記先行相における前記第1の相溶液と結び付き、及び/または前記増進試薬が、前記ATPSの前記遅行相における前記第2の相溶液と結び付く、前記プローブ及び/または増進試薬と、
前記濃縮コンポーネントの真下に配置された検出コンポーネントと、
を含む、
前記デバイス。

0013

実施形態5:
前記濃縮コンポーネントが、1つまたは複数のペーパー層を含む、実施形態4に記載のデバイス。

0014

実施形態6:
前記検出コンポーネントが、複合パッド、反応パッド、及び任意選択でシンクを含む、実施形態4〜5のいずれか1つに記載のデバイス。

0015

実施形態7:
前記プローブが、前記ATPSに含められる、実施形態1〜6のいずれか1つに記載のデバイス。

0016

実施形態8:
前記プローブが、前記ATPSの前記第1の相溶液と結び付く、実施形態7に記載のデバイス。

0017

実施形態9:
前記増進試薬が、前記ATPSに含められる、実施形態1〜8のいずれか1つに記載のデバイス。

0018

実施形態10:
前記増進試薬が、前記ATPSの前記第2の相溶液と結び付く、実施形態9に記載のデバイス。

0019

実施形態11:
前記試料が前記デバイスに加えられる前に、前記ATPSが前記試料と混合されるように、前記デバイスが構成される、実施形態1〜10のいずれか1つに記載のデバイス。

0020

実施形態12:
前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記ATPSが脱水されて、前記ラテラルフローアッセイに加えられるか、またはフロースルーアッセイの濃縮コンポーネントに含められる、実施形態1〜11のいずれか1つに記載のデバイス。

0021

実施形態13:
前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記プローブが脱水されて、前記ラテラルフローアッセイに加えられるか、またはフロースルーアッセイの濃縮コンポーネントに含められる、実施形態12に記載のデバイス。

0022

実施形態14:
前記デバイスが前記試料と接触する前に、前記増進試薬が脱水されて、前記ラテラルフローアッセイに加えられるか、またはフロースルーアッセイの濃縮コンポーネントに含められる、実施形態12〜13のいずれか1つに記載のデバイス。

0023

実施形態15:
前記デバイスが前記試料と接触した後に、前記ATPSが、第1の相溶液と第2の相溶液とに分離する混合相溶液を含む、実施形態12〜14のいずれか1つに記載のデバイス。

0024

実施形態16:
前記プローブが、前記ATPSの親水相極度分配されるように選択される、実施形態1〜15のいずれか1つに記載のデバイス。

0025

実施形態17:
前記プローブが、前記ATPSの疎水相に極度に分配されるように選択される、実施形態1〜15のいずれか1つに記載のデバイス。

0026

実施形態18:
前記増進試薬が、前記ATPSの疎水相に極度に分配されるように選択される、実施形態1〜17のいずれか1つに記載のデバイス。

0027

実施形態19:
前記増進試薬が、前記ATPSの親水相に極度に分配されるように選択される、実施形態1〜17のいずれか1つに記載のデバイス。

0028

実施形態20:
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPS、ポリマー/ポリマーATPS、ミセル/ポリマーATPS、及びミセルATPSからなる群から選択される、実施形態1〜19のいずれか1つに記載のデバイス。

0029

実施形態21:
前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含む、実施形態20に記載のデバイス。

0030

実施形態22:
前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、実施形態20に記載のデバイス。

0031

実施形態23:
前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含み、前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、実施形態20に記載のデバイス。

0032

実施形態24:
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPSである、実施形態20に記載のデバイス。

0033

実施形態25:
前記ATPSが、PEG/塩ATPSである、実施形態24に記載のデバイス。

0034

実施形態26:
前記プローブが、前記ポリマー/塩ATPSの塩高含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ポリマー/塩ATPSのポリマー高含有相に分配される、実施形態24〜25のいずれか1つに記載のデバイス。

0035

実施形態27:
前記ATPSが、ミセルATPSである、実施形態20に記載のデバイス。

0036

実施形態28:
前記プローブが、前記ATPSのミセル低含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ATPSのミセル高含有相に分配される、実施形態27に記載のデバイス。

0037

実施形態29:
前記プローブが、前記標的分析対象物に結合する結合部分を含む、実施形態1〜28のいずれか1つに記載のデバイス。

0038

実施形態30:
前記標的分析対象物が、タンパク質核酸、糖またはレクチン、及び微生物からなる群から選択される部分を含む、実施形態29に記載のデバイス。

0039

実施形態31:
前記標的分析対象物が、細菌、原生動物真菌ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物を含む、実施形態30に記載のデバイス。

0040

実施形態32:
前記標的分析対象物が、微生物に対するバイオマーカーを含む、実施形態30に記載のデバイス。

0041

実施形態33:
前記標的分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物に対するバイオマーカーを含む、実施形態32に記載のデバイス。

0042

実施形態34:
前記標的分析対象物が、病状に対するバイオマーカー、食品安全(もしくは危険)に対するバイオマーカー、またはバイオテロ物質に対するバイオマーカーを含む、実施形態32に記載のデバイス。

0043

実施形態35:
前記結合部分が、抗体または抗体断片、レクチン、核酸、及びアプタマーからなる群から選択される、実施形態29〜34のいずれか1つに記載の方法。

0044

実施形態36:
前記プローブが、抗体または抗体断片を含む、実施形態35に記載のデバイス。

0045

実施形態37:
前記プローブが、合成ポリマー、金属、ミネラルガラス石英セラミック生体ポリマー、及びプラスチックからなる群から選択される材料を含む、実施形態1〜36のいずれか1つに記載のデバイス。

0046

実施形態38:
前記プローブが、ポリエチレンポリプロピレンセルロースキチンナイロンポリオキシメチレンポリテトラフルオロエチレン、またはポリ塩化ビニルデキストラン、ポリプロピレン、またはポリエチレングリコールからなる群から選択される材料を含む、実施形態37に記載のデバイス。

0047

実施形態39:
前記プローブが、金、銀、鉄、白金パラジウムセリウム、及びチタンからなる群から選択される金属を含む、実施形態37に記載のデバイス。

0048

実施形態40:
前記プローブが、ナノ粒子を含む、実施形態1〜39のいずれか1つに記載のデバイス。

0049

実施形態41:
前記プローブが、前記増進試薬と反応して検出可能なシグナルを生成することができる物質を含む、実施形態1〜40のいずれか1つに記載のデバイス。

0050

実施形態42:
前記物質が、基質と反応して強力な可視シグナルを形成する酵素を含む、実施形態41に記載のデバイス。

0051

実施形態43:
前記増進試薬が、前記基質を含む、実施形態42に記載のデバイス。

0052

実施形態44:
前記増進試薬が、前記酵素と結合する抗体を含む、実施形態42に記載のデバイス。

0053

実施形態45:
前記物質が、酵素と反応して強力な可視生成物を形成する基質を含む、実施形態41に記載のデバイス。

0054

実施形態46:
前記増進試薬が、前記酵素を含む、実施形態45に記載のデバイス。

0055

実施形態47:
前記酵素が、アルカリホスファターゼセイヨウワサビ(または他の)ペルオキシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼからなる群から選択される、実施形態42及び実施形態46のいずれか1つに記載のデバイス。

0056

実施形態48:
前記プローブが、前記ATPSの前記第1の相溶液または前記第2の相溶液に対する親和性を有するコーティングを含む、実施形態1〜47のいずれか1つに記載のデバイス。

0057

実施形態49:
前記コーティングが、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、デキストラン、親水性タンパク質、及び疎水性タンパク質からなる群から選択される材料を含む、実施形態48に記載のデバイス。

0058

実施形態50:
前記デバイスが、異なる分析対象物とそれぞれが相互作用する2つ以上のプローブを含む、実施形態1〜49のいずれか1つに記載のデバイス。

0059

実施形態51:
前記デバイスが、少なくとも2つの異なるプローブ、または少なくとも3つの異なるプローブ、または少なくとも4つの異なるプローブ、または少なくとも5つの異なるプローブ、または少なくとも7つの異なるプローブ、または少なくとも10の異なるプローブ、または少なくとも15の異なるプローブ、または少なくとも20の異なるプローブを含む、実施形態50に記載のデバイス。

0060

実施形態52:
前記デバイスが、サンドイッチアッセイを実施するために構成される、実施形態1〜51のいずれか1つに記載のデバイス。

0061

実施形態53:
第1の相溶液と第2の相とに分離する混合相溶液であって、LFAまたは他の多孔性媒体における使用時に、前記第1の相溶液が先行相になり、前記第2の相溶液が遅行相になる、前記混合相溶液と、
プローブ及び/または増進試薬であって、前記プローブが、前記第1の相溶液と結び付き、前記増進試薬が、前記第2の相溶液と結び付く、前記プローブ及び/または増進試薬と、
を含む、水性二相系(ATPS)。

0062

実施形態54:
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPS、ポリマー/ポリマーATPS、ミセル/ポリマーATPS、及びミセルATPSからなる群から選択される、実施形態53に記載の水性二相系。

0063

実施形態55:
前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含み、前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、実施形態54に記載の水性二相系。

0064

実施形態56:
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPSである、実施形態54に記載の水性二相系。

0065

実施形態57:
前記ATPSが、PEG/塩ATPSである、実施形態56に記載の水性二相系。

0066

実施形態58:
前記プローブが、前記ポリマー/塩ATPSの塩高含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ポリマー/塩ATPSのポリマー高含有相に分配される、実施形態56〜57のいずれか1つに記載の水性二相系。

0067

実施形態59:
前記ATPSが、ミセルATPSである、実施形態54に記載の水性二相系。

0068

実施形態60:
前記プローブが、前記ATPSのミセル低含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ATPSのミセル高含有相に分配される、実施形態59に記載の水性二相系。

0069

実施形態61:
前記プローブが、前記標的分析対象物に結合する結合部分を含む、実施形態1〜60のいずれか1つに記載の水性二相系。

0070

実施形態62:
前記ATPSが、多孔性媒体に含められる、実施形態1〜61のいずれか1つに記載の水性二相系。

0071

実施形態63:
前記ATPSが、ペーパーに含められる、実施形態1〜61のいずれか1つに記載の水性二相系。

0072

実施形態64:
前記ATPSが、ラテラルフローアッセイ(LFA)に含められる、実施形態1〜61のいずれか1つに記載の水性二相系。

0073

実施形態65:
前記ATPSが、フロースルー系に含められる、実施形態1〜61のいずれか1つに記載の水性二相系。

0074

実施形態66:
分析対象物の検出方法及び/または定量化方法であって、
前記方法が、
水性二相系(ATPS)へ試料を加えることであって、前記加えることによって、前記分析対象物が、前記試料に存在するのであれば、前記ATPSの1つの相に濃縮されて分析対象物含有相が得られる、前記加えることと、
ラテラルフローアッセイ(LFA)またはフロースルーアッセイへ前記分析対象物含有相を加えることであって、前記LFAまたはフロースルーアッセイにおいて検出プローブが前記分析対象物に結合する、前記加えることと、
前記LFAまたはフロースルーアッセイへ増進試薬を加えることであって、前記加えることによって、前記検出プローブが生成するシグナルが増強される、前記加えることと、
前記試料における前記分析対象物の存在及び/または量を示すための、前記シグナルの検出及び/または定量化と、
を含む、前記方法。

0075

実施形態67:
前記ラテラルフローアッセイまたはフロースルーアッセイが、ラテラルフローアッセイである、実施形態66に記載の方法。

0076

実施形態68:
前記ラテラルフローアッセイまたはフロースルーアッセイが、フロースルーアッセイである、実施形態66に記載の方法。

0077

実施形態69:
前記ATPSがペーパーに加えられ、前記ATPSが前記ペーパーを通過するにつれて相が分離することで、「流れながら濃縮する」ATPSが得られる、実施形態66〜68のいずれか1つに記載の方法。

0078

実施形態70:
前記ATPSがペーパーに加えられると、より疎水的な相が先行し、より親水的な相が遅行する、実施形態69に記載の方法。

0079

実施形態71:
前記ATPSがペーパーに加えられると、より親水的な相が先行し、より疎水的な相が遅行する、実施形態69に記載の方法。

0080

実施形態72:
前記LFAまたはフロースルーアッセイが、結合部分が前記分析対象物を捕捉し、前記検出プローブが前記捕捉分析対象物に結合するものである、実施形態66〜71のいずれか1つに記載の方法。

0081

実施形態73:
前記分析対象物含有相が、手動またはロボット制御で前記ATPSから取り出された後、前記ラテラルフローアッセイに加えられる、実施形態66〜72のいずれか1つに記載の方法。

0082

実施形態74:
前記検出プローブが、前記LFAまたはフロースルーアッセイのコンポーネントとして提供される、実施形態73に記載の方法。

0083

実施形態75:
次に、前記増進試薬が、前記ATPSとは別に、前記ラテラルフローアッセイに加えられる、実施形態73〜74のいずれか1つに記載の方法。

0084

実施形態76:
前記プローブと前記増進試薬との両方が、前記ATPSに加えられるか、または前記ATPSに含めて提供され、前記ATPSの前記構成成分が、前記プローブが前記ATPSの第1の相に実質的に分配され、前記増進試薬が前記ATPSの第2の相に実質的に分配されるように選択される、実施形態66〜72のいずれか1つに記載の方法。

0085

実施形態77:
前記ATPSが、ペーパー基質に加えられると、先行相及び遅行相を形成し、前記先行相が、前記濃縮分析対象物及び前記プローブをLFA試験ストリップまたはフロースルーアッセイに送達した後、前記遅行相が、前記試験ストリップまたはフロースルーアッセイに前記増進試薬を遅れて送達する、実施形態76に記載の方法。

0086

実施形態78:
前記プローブが、前記ATPSの親水相に極度に分配されるように選択される、実施形態76〜77のいずれか1つに記載の方法。

0087

実施形態79:
前記プローブが、前記ATPSの疎水相に極度に分配されるように選択される、実施形態76〜77のいずれか1つに記載の方法。

0088

実施形態80:
前記増進試薬が、前記ATPSの疎水相に極度に分配されるように選択される、実施形態76〜79のいずれか1つに記載の方法。

0089

実施形態81:
前記増進試薬が、前記ATPSの親水相に極度に分配されるように選択される、実施形態76〜79のいずれか1つに記載の方法。

0090

実施形態82:
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPS、ポリマー/ポリマーATPS、ミセル/ポリマーATPS、及びミセルATPSからなる群から選択される、実施形態66〜81のいずれか1つに記載の方法。

0091

実施形態83:
前記ATPSの前記第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含み、前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、実施形態82に記載の方法。

0092

実施形態84:
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPSである、実施形態82に記載の方法。

0093

実施形態85:
前記ATPSが、PEG/塩ATPSである、実施形態84に記載の方法。

0094

実施形態86:
前記プローブが、前記ポリマー/塩ATPSの塩高含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ポリマー/塩ATPSのポリマー高含有相に分配される、実施形態84〜85のいずれか1つに記載の方法。

0095

実施形態87:
前記ATPSが、ミセルATPSである、実施形態82に記載の方法。

0096

実施形態88:
前記プローブが、前記ATPSのミセル低含有相に分配され、前記増進試薬が、前記ATPSのミセル高含有相に分配される、実施形態87に記載の方法。

0097

実施形態89:
前記プローブが、前記標的分析対象物に結合する結合部分を含む、実施形態66〜88のいずれか1つに記載の方法。

0098

実施形態90:
前記標的分析対象物が、タンパク質、核酸、糖またはレクチン、及び微生物からなる群から選択される部分を含む、実施形態89に記載の方法。

0099

実施形態91:
前記標的分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物を含む、実施形態90に記載の方法。

0100

実施形態92:
前記標的分析対象物が、微生物に対するバイオマーカーを含む、実施形態90に記載の方法。

0101

実施形態93:
前記標的分析対象物が、細菌、原生動物、真菌、ウイルス、及び藻類からなる群から選択される微生物に対するバイオマーカーを含む、実施形態92に記載の方法。

0102

実施形態94:
前記結合部分が、抗体または抗体断片、レクチン、核酸、及びアプタマーからなる群から選択される、実施形態89〜92のいずれか1つに記載の方法。

0103

実施形態95:
前記プローブが、抗体または抗体断片を含む、実施形態94に記載の方法。

0104

実施形態96:
前記プローブが、合成ポリマー、金属、ミネラル、ガラス、石英、セラミック、生体ポリマー、及びプラスチックからなる群から選択される材料を含む、実施形態66〜95のいずれか1つに記載の方法。

0105

実施形態97:
前記プローブが、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロース、キチン、ナイロン、ポリオキシメチレン、ポリテトラフルオロエチレン、またはポリ塩化ビニル、デキストラン、ポリプロピレン、またはポリエチレングリコールからなる群から選択される材料を含む、実施形態96に記載の方法。

0106

実施形態98:
前記プローブが、金、銀、鉄、白金、パラジウム、セリウム、及びチタンからなる群から選択される金属を含む、実施形態96に記載の方法。

0107

実施形態99:
前記プローブが、ナノ粒子を含む、実施形態66〜98のいずれか1つに記載のデバイス。

0108

実施形態100:
前記プローブが、前記増進試薬と反応して検出可能なシグナルを生成することができる物質を含む、実施形態66〜99のいずれか1つに記載の方法。

0109

実施形態101:
前記物質が、基質と反応して強力な可視シグナルを形成する酵素を含む、実施形態100に記載の方法。

0110

実施形態102:
前記増進試薬が、前記基質を含む、実施形態101に記載の方法。

0111

実施形態103:
前記増進試薬が、前記酵素と結合する抗体を含む、実施形態101に記載の方法。

0112

実施形態104:
前記物質が、酵素と反応して強力な可視生成物を形成する基質を含む、実施形態100に記載の方法。

0113

実施形態105:
前記増進試薬が、前記酵素を含む、実施形態104に記載の方法。

0114

実施形態106:
前記酵素が、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビ(または他の)ペルオキシダーゼ、及びグルコースオキシダーゼからなる群から選択される、実施形態101及び実施形態105のいずれか1つに記載の方法。

0115

実施形態107:
前記プローブが、前記ATPSの前記第1の相溶液または前記第2の相溶液に対する親和性を有するコーティングを含む、実施形態66〜106のいずれか1つに記載のデバイス。

0116

実施形態108:
前記コーティングが、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、デキストラン、親水性タンパク質、及び疎水性タンパク質からなる群から選択される材料を含む、実施形態107に記載のデバイス。

0117

実施形態109:
前記方法が、実施形態1〜52のいずれか1つに記載のデバイスを使用して実施される、実施形態66〜108のいずれか1つに記載の方法。

0118

実施形態110:
分析対象物を検出及び/または定量化するためのキットであって、前記キットが、実施形態1〜52のいずれか1つに記載のデバイスと、試料を採取するための採取デバイスと、を含む、前記キット。

0119

実施形態111:
前記採取デバイスが、口腔液を採取するためのデバイスを含む、実施形態110に記載のキット。

0120

実施形態112:
前記採取デバイスが、血液を採取するためのデバイスを含む、実施形態110に記載のキット。

0121

実施形態113:
前記採取デバイスが、尿採取デバイスを含む、実施形態110に記載のキット。

0122

実施形態114:
前記採取デバイスが、液を採取するためのデバイス、または子宮頸管内スワブから採取するためのデバイスを含む、実施形態110に記載のキット。

0123

実施形態115:
前記採取デバイスが、環境試料のためのデバイスを含む、実施形態110に記載のキット。

0124

実施形態116:
核酸を精製及び増幅する方法であって、前記方法が、第1の相溶液及び第2の相溶液に分離する混合相溶液を含む水性二相系(ATPS)を提供することであって、前記ATPSが、核酸が前記第1の相溶液もしくは前記第2の相溶液のいずれかに分配されることになるものであるか、または前記ATPSが、核酸が前記第1の相溶液と前記第2の相溶液との間の界面に局在化することになるものである、前記提供することと、前記ATPSへ核酸を含む試料を導入することであって、前記核酸が、前記第1の相溶液もしくは前記第2の相溶液、または前記第1の相溶液と前記第2の相溶液との間の前記界面に分配されることで濃縮核酸が得られる、前記導入することと、増幅核酸を得るために核酸増幅反応において前記濃縮核酸を増幅することと、を含む、前記方法。

0125

実施形態117:
前記核酸が、DNAである、実施形態116に記載の方法。

0126

実施形態118:
前記核酸が、RNAである、実施形態116に記載の方法。

0127

実施形態119:
前記核酸が、RNAから逆転写されたDNAである、実施形態116に記載の方法。

0128

実施形態120:
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPS、ポリマー/ポリマーATPS、ミセル/ポリマーATPS、及びミセルATPSからなる群から選択される、実施形態116〜119のいずれか1つに記載の方法。

0129

実施形態121:
前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含み、前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、実施形態120に記載の方法。

0130

実施形態122:
前記増幅することが、前記第1の相から前記濃縮核酸を回収することであって、その方法が、回収濃縮核酸を得るために、前記第1の相溶液もしくは前記第2の溶液、または前記第1の相溶液と前記第2の相溶液との前記界面から前記核酸を回収することを含む、前記回収することと、前記核酸を増幅するために核酸増幅反応へ前記回収濃縮核酸を導入することと、を含む、実施形態116〜121のいずれか1つに記載の方法。

0131

実施形態123:
前記核酸増幅反応が、ポリメラーゼ連鎖反応PCR)反応系を含む、実施形態122に記載の方法。

0132

実施形態124:
前記核酸増幅反応が、等温増幅系を含む、実施形態122に記載の方法。

0133

実施形態125:
前記核酸増幅反応が、自己持続性シーケンス反応(3SR)、核酸ベース転写アッセイ(NASBA)、転写増幅(TMA)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、ループ介在等温増幅(LAMP)、ステムループ増幅、シグナル介在RNA増幅技術(SMART)、等温多置換増幅(IMDA)、単一プライマー等温増幅(SPIA)、環状ヘリカーゼ依存性増幅(cHDA)、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)からなる群から選択される増幅系を含む、実施形態124に記載の方法。

0134

実施形態126:
前記増幅することが、等温核酸増幅のために試薬と前記ATPSを混合することを含む、実施形態116〜121のいずれか1つに記載の方法。

0135

実施形態127:
前記核酸増幅反応が、等温増幅系を含む、実施形態126に記載の方法。

0136

実施形態128:
前記核酸増幅反応が、自己持続性シーケンス反応(3SR)、核酸ベースの転写アッセイ(NASBA)、転写増幅(TMA)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、ループ介在等温増幅(LAMP)、ステムループ増幅、シグナル介在RNA増幅技術(SMART)、等温多置換増幅(IMDA)、単一プライマー等温増幅(SPIA)、環状ヘリカーゼ依存性増幅(cHDA)、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)からなる群から選択される増幅系を含む、実施形態127に記載の方法。

0137

実施形態129:
前記方法が、室温または室温未満の温度で前記等温増幅を実施することを含む、実施形態127〜128のいずれか1つに記載の方法。

0138

実施形態130:
前記方法が、等温増幅のための試薬を含む前記ATPSを実質的に一定な温度まで加熱することを含む、実施形態127〜128のいずれか1つに記載の方法。

0139

実施形態131:
前記増幅が、ヘリカーゼ依存性増幅を含み、約65℃の一定温度で実施される、実施形態127〜130のいずれか1つに記載の方法。

0140

実施形態132:
前記方法が、単一の容器で実施される、実施形態126〜131のいずれか1つに記載の方法。

0141

実施形態133:
前記方法が、マルチウェルプレートウェルに異なる試料をそれぞれ含めて複数の核酸試料で実施される、実施形態126〜131のいずれか1つに記載の方法。

0142

実施形態134:
前記複数の試料が、少なくとも2つの試料、または少なくとも4つの試料、または少なくとも8つの試料、または少なくとも16の試料、または少なくとも32の試料、または少なくとも64の試料、または少なくとも128の試料を含む、実施形態133に記載の方法。

0143

実施形態135:
前記方法が、マイクロ流体系(例えば、ラボオンチップ)のチャンバーまたはチャネルにおいて実施される、実施形態126〜131のいずれか1つに記載の方法。

0144

実施形態136:
前記試料が、細胞溶解物である、実施形態116〜135のいずれか1つに記載の方法。

0145

実施形態137:
前記試料が、核酸である、実施形態116〜135のいずれか1つに記載の方法。

0146

実施形態138:
前記試料が、インタクト細胞を含み、前記ATPSが、細胞を溶解するATPSである、実施形態116〜135のいずれか1つに記載の方法。

0147

実施形態139:
前記ATPSが、ミセルATPSである、実施形態116〜138のいずれか1つに記載の方法。

0148

実施形態140:
前記試料が、血液または濾紙血を含み、前記ATPSが、濾紙血を再溶解するものである、実施形態116〜138のいずれか1つに記載の方法。

0149

実施形態141:
前記ATPSが、PEG/デキストランATPSを含む、実施形態140に記載の方法。

0150

実施形態142:
前記ATPSが、UCON/デキストランATPSを含む、実施形態140に記載の方法。

0151

実施形態143:
核酸を精製及び増幅するためのキットであって、
前記キットが、
水性二相系(ATPS)の構成成分を含む容器と、
等温核酸増幅系の1つまたは複数の構成成分を含む容器と、
を含む、前記キット。

0152

実施形態144:
ATPSの構成成分を含む前記容器と、等温核酸増幅系の構成成分を含む前記容器と、が同一の容器である、実施形態143に記載のキット。

0153

実施形態145:
ATPSの構成成分を含む前記容器と、等温核酸増幅系の構成成分を含む前記容器と、が異なる容器である、実施形態143に記載のキット。

0154

実施形態146:
等温核酸増幅系の1つまたは複数の構成成分を含む前記容器が、自己持続性シーケンス反応(3SR)、核酸ベースの転写アッセイ(NASBA)、転写増幅(TMA)、鎖置換増幅(SDA)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、ループ介在等温増幅(LAMP)、ステムループ増幅、シグナル介在RNA増幅技術(SMART)、等温多置換増幅(IMDA)、単一プライマー等温増幅(SPIA)、環状ヘリカーゼ依存性増幅(cHDA)、及びリコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)からなる群から選択される反応系の1つまたは複数の構成成分を含む、実施形態143〜145のいずれか1つに記載のキット。

0155

実施形態147:
前記1つまたは複数の構成成分が、前記核酸増幅反応を実行する酵素を含む、実施形態146に記載のキット。

0156

実施形態148:
前記1つまたは複数の構成成分が、ヘリカーゼを含む、実施形態146に記載のキット。

0157

実施形態149:
前記ATPSが、ポリマー/塩ATPS、ポリマー/ポリマーATPS、ミセル/ポリマーATPS、及びミセルATPSからなる群から選択される、実施形態143〜148のいずれか1つに記載のキット。

0158

実施形態150:
前記ATPSの第1の相溶液が、表1に記載の構成成分1を含み、前記ATPSの第2の相溶液が、表1に記載の構成成分2を含む、実施形態149に記載のキット。

0159

実施形態151:
前記ATPSが、ミセルATPSを含む、実施形態143〜149のいずれか1つに記載のキット。

0160

実施形態152:
前記ATPSが、PEG/デキストランATPSを含む、実施形態143〜149のいずれか1つに記載のキット。

0161

実施形態153:
前記ATPSが、UCON/デキストランATPSを含む、実施形態143〜149のいずれか1つに記載のキット。

0162

実施形態154:
前記キットが、実施形態126〜142のいずれか1つに記載の方法を実施するためのプロトコールを提供する説明資料を含む、実施形態143〜153のいずれか1つに記載のキット。

0163

定義
ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。これらの用語は、天然起源アミノ酸ポリマーだけでなく、1つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然起源のアミノ酸人工的な化学的類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。

0164

本明細書の「核酸」もしくは「オリゴヌクレオチド」という用語または文法的同等形態は、共に共有結合で連結された少なくとも2つのヌクレオチドを指す。本発明の核酸は、好ましくは、一本鎖または二本鎖であり、一般に、ホスホジエステル結合を含むことになるが、場合によっては、以下に概要が示されるように、代替骨格を有し得る核酸類似体が含まれ、こうした核酸類似体は、例えば、ホスホラミド(Beaucage et al.(1993)Tetrahedron 49(10):1925)及びそこに含まれる参考文献、Letsinger(1970)J.Org.Chem.35:3800、Sprinzl et al.(1977)Eur.J.Biochem.81:579、Letsinger et al.(1986)Nucl.AcidsRes.14:3487、Sawai et al.(1984)Chem.Lett.805、Letsinger et al.(1988)J.Am.Chem.Soc.110:4470、ならびにPauwels et al.(1986)Chemica Scripta 26:141 9)、ホスホロチオエート(Mag et al.(1991)Nucleic Acids Res.19:1437、及び米国特許第5,644,048号)、ホスホロジチオエート(Briu et al.(1989)J.Am.Chem.Soc.111:2321)、O−メチルホスホロアミダイト結合(Eckstein,Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach,Oxford University Pressを参照のこと)、ならびにペプチド核酸の骨格及び結合(Egholm(1992)J.Am.Chem.Soc.114:1895、Meier et al.(1992)Chem.Int.Ed.Engl.31:1008、Nielsen(1993)Nature,365:566、Carlsson et al.(1996)Nature 380:207を参照のこと)を含む。他の類似核酸には、陽性骨格を有するもの(Denpcy et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:6097)、非イオン性骨格を有するもの(米国特許第5,386,023号、第5,637,684号、第5,602,240号、第5,216,141号、及び第4,469,863号、Angew.(1991)Chem.Intl.Ed.English 30:423、Letsinger et al.(1988)J.Am.Chem.Soc.110:4470、Letsinger et al.(1994)Nucleoside & Nucleotide 13:1597、Chapters 2 and 3,ASC Symposium Series 580,“Carbohydrate Modifications in Antisense Research”,Ed.Y.S.Sanghui and P.Dan Cook、Mesmaeker et al.(1994),Bioorganic & Medicinal Chem.Lett.4:395、Jeffs et al.(1994)J.Biomolecular NMR34:17、Tetrahedron Lett.37:743(1996))、ならびに非リボース骨格を有するもの(米国特許第5,235,033号及び第5,034,506号、ならびにChapters 6 and 7,ASC Symposium Series 580,Carbohydrate Modifications in Antisense Research,Ed.Y.S.Sanghui and P.Dan Cookに記載のものを含む)が含まれる。1つまたは複数の炭素環式糖を含む核酸もまた、核酸の定義に含まれる(Jenkins et al.(1995),Chem.Soc.Rev.pp169−176を参照のこと)。いくつかの核酸類似体は、Rawls,C & E News June 2,1997 page35に記載されている。リボース−ホスフェート骨格のこうした改変は、標識などの追加の部分の付加が容易になるように実施されるか、または生理学的環境下でのそのような分子の安定性及び半減期が向上するように実施され得る。さらに、本発明の核酸は、代替的に、三本鎖であり得ることが可能である。

0165

本明細書で使用される「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片によって実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を指す。認知されている免疫グロブリン遺伝子には、カッパーラムダアルファガンマデルタイプシロン、及びミューという定常領域遺伝子、ならびに無数免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパーまたはラムダのいずれかとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロンとして分類され、これらは、次に、それぞれIgGIgMIgAIgD、及びIgEという免疫グロブリンクラスを定義するものである。

0166

典型的な免疫グロブリン(抗体)構造単位は、四量体を含むことが知られている。それぞれの四量体は、ポリペプチド鎖の2つの同一対から構成され、それぞれの対が、1つの「軽」鎖(約25kD)及び1つの「重」鎖(約50〜70kD)を有する。それぞれの鎖のN末端は、主に抗原認識を担う約100〜110以上のアミノ酸の可変領域を定義する。可変軽鎖(VL)及び可変重鎖(VH)という用語は、それぞれこうした軽鎖及び重鎖を指す。

0167

抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして存在するか、またはさまざまなペプチダーゼ消化することによって生成する多くのよく特徴付けられた断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域のジスルフィド結合の下で抗体を消化することで、Fab二量体であるF(ab)’2を生成し、Fab自体は、ジスルフィド結合によって軽鎖がVH−CH1に連結されたものである。F(ab)’2は、穏和な条件下での還元によってヒンジ領域のジスルフィド結合が切断され、それによって(Fab’)2二量体がFab’単量体に変換され得る。Fab’単量体は、本質的には、Fabにヒンジ領域部分が加わったものである(他の抗体断片のより詳細な説明については、Fundamental Immunology,W.E.Paul,ed.,Raven Press,N.Y.(1993)を参照のこと)。さまざまな抗体断片が、インタクトな抗体の消化という観点から定義される一方で、そのようなFab’断片は、化学的にデノボ合成されるか、または組換えDNA手法を利用することによってデノボ合成され得ることを当業者であれば理解するであろう。したがって、本明細書で使用される抗体という用語は、全抗体の改変によって生成する抗体断片、または組換えDNA手法を使用してデノボ合成される抗体断片も含む。好ましい抗体には、一本鎖抗体(単一のポリペプチド鎖として存在する抗体)、より好ましくは、可変重鎖と可変軽鎖とが共に連結(直接的なもの、またはペプチドリンカーを介するもの)されることで連続ポリペプチドが形成される一本鎖Fv抗体(sFvまたはscFv)が含まれる。一本鎖Fv抗体は、共有結合で連結されたVH−VLヘテロ二量体であり、この二量体は、VHをコードする配列と、VLをコードする配列と、が直接的に連結されるか、またはペプチドをコードするリンカーによって連結されて含まれる核酸から発現し得る。Huston,etal.(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA,85:5879−5883。VHとVLとは、単一のポリペプチド鎖として互いに連結される一方で、VHドメインとVLドメインとは、非共有結合で結合する。繊維状ファージの表面に発現される最初の機能性抗体分子は一本鎖Fv’s(scFv)であったが、代替の発現方針も達成されている。例えば、Fab分子は、鎖(重鎖または軽鎖)の1つがg3カプシドタンパク質に融合され、相補鎖が可溶性分子としてペリプラズム輸送されるのであれば、ファージディスプレイされ得る。2つの鎖は、同一または異なるレプリコンにコードされ得る。重要な点は、それぞれのFab分子における2つの抗体鎖が翻訳後に会合し、この二量体が、例えばg3pに鎖の1つが結合されることを介してファージ粒子に組み込まれるということである(例えば、米国特許第5733743号を参照のこと)。scFv抗体に加えて、抗体のV領域に由来し、天然には集合するものだが、化学的には別々の軽ポリペプチド鎖及び重ポリペプチド鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に同様の三次元構造に折り畳まれる分子へと変換する他の構造が当業者には多く知られている(例えば、米国特許第5,091,513号、第5,132,405号、及び第4,956,778号を参照のこと)。特に好ましい抗体となれば、ファージにディスプレイされるもののすべてが含まれることになる(例えば、scFv、Fv、Fab、及びジスルフィドで連結されたFv(Reiter et al.(1995)Protein Eng.8:1323−1331)。

0168

アプタマーは、核酸から形成される抗体類似体である。アプタザイムは、核酸から形成される酵素類似体である。具体的には、アプタザイムは、第2の特定の分析対象物が存在するときにのみ、立体配置が変わることで特定の分子を捕捉するように機能することができる。アプタマーは、いくつかのアッセイ(ナノ−CHEM−FETなど)では、検出されることになる一次標識の結合さえ必要としない場合があり、立体配置の再配置が直接的に検出されることになる。

0169

「結合部分」という用語、または「結合対」のメンバーは、他の分子、細胞、微生物、及び同様のものに特異的に結合することで、抗体−抗原、レクチン−糖質、核酸−核酸、ビオチンアビジンなどの結合複合体を形成する分子を指す。そのような結合部分には、限定はされないが、単量体または多量体の核酸、アプタマー、アプタザイム、タンパク質、多糖、糖、レクチン、及び同様のもの(例えば、Haugland,“Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals”(Sixth Edition)を参照のこと)、ならびに上記の結合対を形成することができる分子のすべてが含まれる。

0170

「特異的に結合する」という語句は、分子が、目的の標的に優先的に結合するか、または他の分子と比較して高い親和性で標的(分析対象物)に結合することを示す。例えば、抗体は、抗原を標的として産生し、その抗原に選択的に結合することになる。DNA分子は、実質的に相補的な配列に結合することになり、厳密条件下では、無関係の配列には結合しない。特異的な結合は、分子(例えば、タンパク質及び他の生物製剤)の異種性集団に標的が存在することを決定付ける結合反応を指し得る。したがって、指定条件下(例えば、抗体の場合は、イムノアッセイ条件、または核酸の場合は、厳密なハイブリダイゼーション条件)では、特定のリガンドまたは抗体は、その特定の「標的」分子に結合し、試料に存在する他の分子には顕著な量で結合しない。

0171

小有機分子という用語は、医薬品において一般に使用される有機分子と同等サイズの分子を指す。生体巨大分子(例えば、タンパク質、核酸など)は、この用語から除外される。小有機分子の好ましいサイズ範囲は、最大で約5000Daであり、より好ましくは、最大で2000Daであり、最も好ましくは、最大で約1000Daである。

0172

分析対象物という用語は、検出すべき任意の部分を指す。分析対象物には、限定はされないが、特定の生体分子(タンパク質、抗体、核酸)、細菌またはその構成成分、ウイルスまたはその構成成分(例えば、コートタンパク質)、真菌またはその構成成分、原生動物またはその構成成分、薬物、毒素、食品病原体、及び同様のものが含まれる。

0173

本明細書で使用される「ペーパー」という用語は、木材のパルプまたは他の線維性植物物質に由来する薄いシートに限定されるものではなく、ある特定の実施形態では、本明細書に記載のデバイスにおいてそのようなペーパーを使用することが企図される。ペーパーは、より一般には、多孔性材料を指し、こうした多孔性材料は、シート形状であることが多いが、それに限定はされず、流体が通過可能なものである。

0174

いくつかの実施形態では、多孔性マトリックスは、水性二相系(ATPS)の混合相溶液、第1の相溶液、及び/または第2の相溶液、及び/または標的分析対象物がLFAを通過可能なほど十分に多孔性である。いくつかの実施形態では、多孔性マトリックスは、混合相溶液、第1の相溶液、及び/または第2の相溶液、及び/または標的分析対象物がLFAまたはスポットアッセイデバイス垂直方向及び/または水平方向に通過するのに十分なほど十分な長さ及び/または深さを有する。いくつかの実施形態では、第1の相溶液は、第1の速度で多孔性マトリックスを通過し、第2の相溶液は、第2の速度で多孔性マトリックスを通過し、第1の速度と第2の速度とは異なる。LFAまたはスポットアッセイの実施形態のいくつかでは、多孔性マトリックスは、数ある中でも特に、焼結ガラスセラミック、ミネラル、セルロース、ガラス繊維ニトロセルロース、フッ化ポリビニリデン、ナイロン、電荷改変ナイロン、ポリエーテルスルホン、それらの組み合わせ、及び同様のものなどの材料を含む。

図面の簡単な説明

0175

典型的なラテラルフローイムノアッセイ試験ストリップの模式図(上)及びラテラルフローイムノアッセイのサンドイッチ形式(下)示す。
ペーパーでの水性二相系(ATPS)分離をラテラルフローアッセイ(LFA)と併用する実施形態の1つを模式的に示すものであり、これによって標的分析対象物(例えば、バイオマーカー)が濃縮され、増進試薬が送達されることでシグナルが増強される。示されるように、LFAストリップがATPS溶液(1)に浸漬され、このATPS溶液は、標的分析対象物(例えば、バイオマーカー)、プローブ(例えば、比色プローブ)、及び1つまたは複数の増進試薬を含む。ATPSは、先行相と遅行相とに相分離することになる。最初に、先行相(2)が、濃縮された標的分析対象物(複数可)(例えば、バイオマーカー)及び比色プローブを検出領域に送達する。この次に、遅行相(3)が流れて検出ゾーン横断通過し、これによって増進試薬が送達されることでLFAシグナルが増強される。ピンク色は比色プローブに相当し、黄色は増進試薬に相当する。
PEG−塩ATPSの塩高含有相である下相にALP−GNPが極度に分配され(左)、PEG−塩ATPSのPEG高含有相である上相にNBT/BCIPが極度に分配される(右)ことを示す。
LFAのみ(左)と、LFA+ATPS+NBT/BCIPという新たな設計と、で低濃度モデルタンパク質トランスフェリン)を検出して比較したものを示し、使用者による追加の段階を全く伴うことなく、シグナルが良好に増強されたことが示される。
PEG−デキストランATPSにおける血液の分配を視覚的に実証したものを示す。
PEG/デキストランATPSにおいて乾燥濾紙血から溶出したDNAの濃度を示す。Quant−iT(商標蛍光アッセイを使用してDNA濃度を測定したところ、PEG/デキストランATPSの上相と比較して下相のDNA濃度が有意に高いことが示された(p<0.01、n=3)。こうした結果は、トレハロース及びウシ血清アルブミンBSA)で処理したガラス繊維ペーパー上で調製された乾燥濾紙血(DBS)からDNAが溶出することを示している。
PEG/デキストランATPSのデキストラン高含有相である下相、及びUCON/デキストランATPSの両方の相におけるDNA濃度を増幅前後で比較したものを示す。試験した相組成のすべてにおいて増幅が達成された。9:1及び1:9の比は、上相と下相との体積比を示す。
ATPSポリマーの存在下及び非存在下でのDNAの平均qPCR増幅サイクル数を示す。水におけるDNA、及びPEG/デキストランATPSのデキストラン高含有相である下相におけるDNAについて、レポーター色素蛍光強度から増幅プロット(紫色で示される)を作成した。プロット上の緑色線は、レポーター色素の閾値蛍光強度を示す。紫色の増幅曲線蛍光閾値とが交わる点におけるサイクル数は、閾値サイクルとしても知られており、qPCR反応における標的DNAの濃度を示す。水におけるDNAの増幅、及びPEG/デキストランATPSのデキストラン高含有相におけるDNAの増幅に要する平均閾値サイクル数は、それぞれ32及び31である。サイクル数は、スチューデントt検定を使用して比較し(p<0.01、n=3)、2つ方法の間に統計学差異が存在しないことが示された。
ATPS及びtHDAを含めたワンポット反応を使用するDNA増幅の実施形態の1つの模式図を示す。
ATPS及びtHDAを含めたワンポット反応とtHDAのみの反応とを比較したものを示す。レーン1は、tHDAのみでは7.7x104個の細胞から増幅が生じなかったことを示す。レーン2〜4は、それぞれ7.7x104個の細胞、1.6x104個の細胞、及び1.7x103個の細胞を含む試料で当該ワンポット反応を実施することで、100bpの標的産物が良好に増幅されたことを示す。レーン5及びレーン6では、102個の細胞で当該ワンポット反応が実施され、レーン6が100bpの標的バンドの存在を正確に示している。レーン5及びレーン6に見える第2のバンドは、閾値を下回る細胞数で増幅を実施すると生じる非特異的なアーティファクト副産物である。
標的分析対象物(例えば、生体分子)を検出するためのオールインワンスポット試験の実施形態の1つの模式図を示す。ATPS構成成分及び比色(または他の)指示薬は、それぞれ濃縮コンポーネント及び複合パッドに脱水吸着される。使用者は、単に試料溶液をデバイスに加えるだけでよく、その後、構成成分は再水和し、標的生体分子は濃縮コンポーネント内で濃縮される。その後、分析対象物は、複合パッド上の比色指示薬に結合することになると共に、得られる指示薬−標的複合体が反応パッドで捕捉されることになり、このことが可視スポットによって示される。
ワンポット系における3つのDNA型の分配係数を示す。ゲノムDNA及び100bpのDNA断片は、上相に優先的に分配された一方で、より小さな25bpのDNA断片は、2つの相に均等に分配された。
tHDAのみでのDNA増幅の結果(左)、及びワンポットプラットフォームでのDNA増幅の結果(右)を示す。tHDAのみの反応では、106cfu/mLのE.coliを含む試料からDNAが良好に増幅された一方で、ワンポットプラットフォームでは、106cfu/mL及び105cfu/mLのE.coliを含む試料からDNAが良好に増幅された。「L」は、DNAラダーを含むレーンを示す。
自動化され、かつシグナルが増強されたLFAを3.2ng/μLのCTで実施したときの画像を時系列で示すものである。バックグラウンドシグナルが最小限に抑制されつつ、試験ライン及び対照ラインが経時的に黒くなっており、このことは、ATPSがシグナル増強反応の自動化に使用可能なことができることを示している。
ATPS及びシグナル増強を含めたLFAにおいて、CTの検出限界が30倍改善したことを示す。従来のLFAでは、10ng/μLのCTが検出された一方で、増強LFAでは、0.32ng/μLのCTが検出された。

0176

ある特定の実施形態では、ラテラルフローアッセイの感度を顕著に向上させる方法及びデバイスが提供される。さまざまな実施形態において、水性二相系(ATPS)とシグナル増強反応とを統合することによってLFA(またはフロースルーアッセイ)の感度が顕著に向上する。ある特定の実施形態では、ATPSは、標的バイオマーカーを濃縮し、これに加えて、LFA(またはフロースルーアッセイ)の検出ゾーンを横断してシグナル増強試薬を連続的に送達するという2つの役割を担う。この新規の技術統合によって、使用者によって加える段階を1つにとどめ、デバイスのコストを低く維持しつつLFA(またはフロースルーアッセイ)の感度を改善することが可能になる。

0177

ある特定の実施形態では、単純かつ有効な核酸増幅検査(NAAT)のための方法及びデバイスも提供される。ある特定の実施形態では、方法によって、水性二相系(ATPS)がDNA増幅と組み合わさることで段階が顕著に減少し、その結果、携帯型のNAATが実現する。最終製品は、試料の調製とDNA増幅とが組み合わさって1段階にまとまる単一プラットフォームである。こうした試験は、単純化されているものの、複数の複雑な段階、機器、同一の結果を達成するための熟練人員を必要とする現在のNAATと比較すると、その感度及び精度が向上している。さらに、この1段階プラットフォームを用いると、パラメーターを調整することでさまざまな感染性疾患の検出にその用途を広げることが容易にでき、このことによって、この1段階プラットフォームが開発途上国において使用するための真に独立型のNAAT診断提供物となっている。

0178

ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法及びデバイスは、臨床用途のための、分析対象物の採取、抽出、濃縮、及び検出向けに提供され得る。ある特定の実施形態では、方法及びデバイスによって、生体試料(例えば、口腔液または組織試料、尿、血液または血液分画物、脳脊髄液リンパ液組織生検物、膣試料、及び同様のもの)、食品試料、環境試料、ならびに同様のものにおける細菌、真菌、及びウイルスを迅速に検出及び/または定量化することが可能になる。

0179

ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるアッセイ及びデバイスは、フィールド環境試験、フィールド食品試験、及び同様のものを行う上で、正確、高感度、携帯型、使い捨て、かつポイント・オブ・ケアでの使用に十分に適したものであり、伴う訓練または機器は最小限のものである。

0180

LFA(またはフロースルーアッセイ)の感度を向上させる方法及びデバイス
さまざまな実施形態において、ATPSの濃縮能力をLFA(またはフロースルーアッセイ)と併用し、これによってLFA(またはフロースルーアッセイ)の検出限界を顕著に(例えば、10〜100倍以上)改善することで、実験室ベースのアッセイの感度に近づけることができる。こうした実験室ベースのアッセイは、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)(例えば、PCT出願第WO2015/134938号(PCT/US2015/019297)、及び2015年9月4日出願の同時係属出願USSN62/214,801を参照のこと)(これらの文献は両方共、そこに開示される方法及びデバイスを対象として参照によって本明細書に組み込まれる)などである。分析対象物の濃縮にATPSを使用するために、目的の試料は、典型的には、ATPSに加えられ、添加された分析対象物は、そこでサイズ及び親水性などのさまざまな物理的特性及び化学的特性に基づいて2つの水性相分布または分配される。2つの相のうちの1つに極度に分配される分析対象物は、その相の体積を著しく減らすことによってその相に濃縮することができる。系の水性性質は、生体分子にとって穏和な環境を提供することにもなり得、これによってその構造及び生物学的活性が安定する。

0181

多くのタンパク質は、むしろATPSの2つの相に均等に分配されることが通常であり、結果的に得られる濃縮能力は不十分なものとなる。ATPSがタンパク質(または他の分析対象物)を濃縮する能力を増強するために、標的タンパク質(または他の分析対象物)を捕捉し、それを濃縮するために所望の相に誘導することができ、任意選択で、LFAのための比色指示薬として働くことができるさまざまなプローブ(例えば、目的の標的に特異的な抗体でコートされた金ナノプローブ(GNP))を利用することができる。さらに、ペーパーでのATPS分離は、相分離プロセスを大いに強化及び促進し得る方法を提供するものである。よく混合されたATPS溶液が多孔性ペーパーに加えられると、それがペーパーを通過するにつれてそのそれぞれの相へと分離し、粘性が低い相が先行相となり、粘性が高い相が遅行相となり得る。これは、PEG−塩ATPS系については、塩高含有相が先行し、PEG高含有相が遅行するということである。さらに、3−Dペーパー芯を使用することで、ペーパーでのATPS分離がさらに強化される。3−D芯の下流にLFAストリップを配置することによって、我々は、濃縮段階検出段階とを途切れることなく1つのデバイスに統合した。

0182

典型的なLFAは、試料が試験ストリップに加えられる場所である試料パッド、結合が生じ、結果が観測され得る場所である検出ゾーン、及び過剰な試料のシンクとして働く場所である吸収パッド(図1、上)という少なくとも3つのコンポーネントからなる。サンドイッチアッセイ形式では、結合分子(抗体、アプタマー、一本鎖DNAなどであることが多い)で修飾されたLFA指示薬(比色性蛍光性、及び放射性などであり得る)が最初に試料に添加される。標的分析対象物が存在するのであれば、抗体で修飾された指示薬にその標的分析対象物が結合することになる。こうした複合体は、例えば試料パッドを介して、LFA試験ストリップに加えられ、そのストリップを通過して吸収パッドに向かう。標的分析対象物が存在するのであれば、試験ラインに固定化された結合分子にその分析対象物が結合し、指示薬と膜との間に挟まれた状態となる。指示薬が比色性であるならば、その比色指示薬が強い色を示すことになり、分析対象物−指示薬複合体が試験ラインに蓄積するにつれて可視バンドが形成されることで、結果が陽性であることが示される。あるいは、分析対象物が存在しないのであれば、指示薬は試験ラインに付着せず、試験ラインが存在しないことで、結果が陰性であることが示される。分析対象物の存在の有無にかかわらず、指示薬に存在する修飾結合分子は、対照ライン(存在する場合)に結合及び蓄積し得る。対照ラインのバンドは、試料がストリップを通過したことを知らせており、これによって、試験が妥当であることが示される。したがって、結果が陽性であることは、バンドが2つ(1つは試験ラインのものであり、1つは対照ラインのものである)生じることによって示され、一方、結果が陰性であることは、対照ラインの単一のバンドによって示される。

0183

本明細書に記載されるように、LFA及びATPSが統合された我々の前述のデバイスの検出限界は、使用者による追加の段階を全く必要としないシグナル増強方策を加えることで改良されている。LFAシグナルを増強するための典型的なプロトコールでは、試料溶液を比色プローブと共にLFAストリップに加えることが最初に必要であり、これに10〜20分を要する。次に、プローブによって生成するシグナルを増強するためにLFA試験ストリップに増進試薬が加えられる。ある特定の実施形態では、この増強によって、LFAのみの場合の検出限界と比較して検出限界が10〜50倍改善され得る。

0184

ある特定の実施形態では、手動のATPS抽出を多段階のシグナル増強と組み合わせるための方法及びデバイスが本明細書で提供される。ATPSのバルク相の1つに分析対象物を添加及び濃縮すると、その相を手動(またはロボット制御)で抽出し、検出のためにLFAに加えることができる。例えば、10〜20分後に、使用者(またはロボット)が増進試薬を加えることでLFAシグナルが増強され得る。ATPSによる濃縮及びシグナル増強に起因して検出限界が複合的に改善するため、この多段階手法では、LFAの検出限界が100〜1000倍改善し得る。比色プローブと増進試薬溶液とは、互いに別々のままであることが重要であり、混合すると、増進が早発する結果としてバックグラウンドシグナルが高くなり得る。上記の手法は、試薬を別々の状態で良好に保つ一方で、複数の時限段階が必要であることから、試験のばらつきが増加し、使用者にとっての使いやすさは低下する。

0185

比色プローブと増進試薬とを依然として別々の状態に保ちつつ、使用者が複数段階を実行する手間をなくすために、ある特定の実施形態では、さまざまなATPSにおいてプローブと増進試薬とが逆に分配される挙動が利用され、これに加えて、ある特定の実施形態では、ペーパーでATPSが分離する現象が利用される。この手法では、プローブ(例えば、比色プローブ)は、そのサイズ及び/または親水性を増加させることによって、ATPSにおいて、より親水性であり、混雑度の低い相に極度に分配されるように操作することができる。これは、ポリマー−塩ATPSでは塩高含有相に相当し、またはミセルATPSではミセル低含有相に相当する。逆に、サイズ小さく、相対的に疎水性の増進試薬(複数)は、ATPSにおいて、より疎水性であり、より混雑した相に分配される。これは、ポリマー−塩ATPSのポリマー高含有相に相当し、またはミセルATPSのミセル高含有相に相当する。ペーパー基質にATPSが加えられると、相分離が促進され、より親水性の先行相及びより疎水の遅行相が形成されることになる。これは、ポリマー−塩ATPSについては、塩高含有相が先行し、ポリマー高含有相が遅行するということであり、ミセルATPSについては、ミセル低含有相が先行し、ミセル高含有相が遅行する。先行相は、濃縮されたバイオマーカー及び比色プローブをLFAの検出ゾーンに送達することになる。この後に、遅行相が増進試薬を送達することでシグナル増強が始まることになる(図2)。

0186

我々は、この手法の実現可能性を、モデルタンパク質であるトランスフェリン(Tf)を検出するために、アルカリホスファターゼ(ALP)酵素によるニトロ−ブルーテトラゾリウム/5−ブロモ−4−クロロ−3−イノジルインドリルホスフェート(NBT/BCIP)の発色に基づく酵素系を使用して実証した。ALP及び抗Tf抗体を金ナノ粒子複合化することでアルカリホスファターゼ−金ナノプローブ(ALP−GNP)を形成した。こうしたALP−GNPは、溶液中のTfを捕捉し、濃縮するために所望のATPS相にTfを誘導することができる。ALP−GNPは、LFAのための比色指示薬として働くだけでなく、NBT/BCIP基質溶液と反応して紫色の沈殿物を生成できるという能力を追加で有する。ALP−GNPは、PEG−塩ATPSに添加されると、塩高含有相である下相に分配される一方で、NBT/BCIP基質は、PEG高含有相である上相に分配される(図3)。ATPSは、LFA試験ストリップを下流に有する我々の3−Dペーパーウェルに加えられると、ALP−GNPが、目的のバイオマーカーを伴って、先行する塩高含有相に濃縮され、検出ゾーンに送達されることになる。この後に、PEG高含有相が検出ゾーンを横断して流れることで、NBT/BCIP基質が送達されることになる。基質は、検出ゾーンに結合したすべてのALP−GNPによって紫色の沈殿物へと変換されることになり、それによってシグナルが増強される(図4)。我々は、この手法の実現可能性を、ALPによるNBT/BCIPとの酵素反応と組み合わせてPEG−塩ATPSを使用することで実証してきたが、この技術は、他のATPS系(例えば、PPG−塩、PEG−デキストラン、TritonX−114、C10E4など)ならびにシグナル増強系(セイヨウワサビペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ様ナノ粒子とTMBまたはDABとの組み合わせ、金及び銀による増強など)に適用することができる。この手法は、使用者によって加える段階が1回のみであり、伝統的なLFAを上回って検出限界を100〜1000倍改善することができると考えられる。

0187

前述の方法は、LFAに関して記載されているが、こうした方法は、フロースルーアッセイ(例えば、図11に示されるものなどのアッセイ)にも容易に適用できることを認識されよう。

0188

ある特定の実施形態では、ATPS、プローブ、及び増進試薬(複数可)は、プローブが先行相に含まれ、増進試薬(複数可)が遅行相に含まれて提供されるように選択されるが、2つの相の間の界面にプローブ(複数可)が局在化し、増進試薬(複数可)が遅行相に含まれて提供される実施形態もまた企図される。

0189

核酸の増幅と、核酸の濃縮及び予備濃縮との組み合わせ
ある特定の実施形態では、DNA増幅技術と、DNAの抽出段階及び予備濃縮段階と、を組み合わせて、すべてを1つの統合プラットフォームに組み込む方法及びデバイスが提供される。ある特定の実施形態では、このプラットフォームは、水性二相系(ATPS)からなり、これによって、所与構成成分濃度及び温度で、ATPS混合物が2つの異なる相に分離することが可能となる。両方の相が水性であり、生体分子にとって安定な環境を提供する。

0190

ATPSは、さまざまな特性を有し、さまざまな生物学的目的に適合するものであり、こうした目的は、試料の精製及び細胞の溶解、ならびに生体分子の分離、選別、及び濃縮などである。例えば、Triton界面活性剤を含めて調製されたミセルATPSでは、DNAのような生体分子が1つの相に極度に分配され得る。さらに、Triton界面活性剤は、固有細胞溶解ことができることも知られている。あるいは、ポリエチレングリコール(PEG)及びデキストランから調製されたATPSは、乾燥濾紙血を再溶解し、1つの相に血液細胞を分配させるために使用することができる(例えば、図5を参照のこと)。その後、再溶解した血液細胞に由来するDNAは、デキストラン高含有相である下相に濃縮され得る(図6)。増幅するための複雑な生体試料からのDNAの調製及び抽出では、こうした細胞溶解段階、DNA精製段階、及び濃縮段階が必要になることが多い。ATPSを用いればこうした結果を達成することが可能であるため、このことによって、ATPSがDNA増幅及び/または他のプロトコールを統合するための適切な生体試料操作プラットフォームとなっている。

0191

ATPSによるDNA抽出/予備濃縮と、核酸(例えば、DNA)増幅と、を統合するための例示的な手法の1つでは、濃縮された核酸を含む、ATPSの相の1つまたは界面を抽出し、緩衝試薬塩溶液ヌクレオチド塩基、酵素、及び標的核酸(例えば、DNAテンプレート)を特異的に増幅するプライマーを含む核酸増幅反応に直接的に供すことができる。1つの例では、血液適合性のポリメラーゼを使用することで、デキストラン高含有相及びUCON高含有相から直接的にDNAが良好に増幅された。増幅に際して、DNA濃度を2〜7倍に増加させることが可能であり、このことは、試験したATPS系にポリメラーゼが適合することを示している(図7)。デキストラン高含有相に含まれるDNAに対して従来の定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)も直接的に実施し、純水に含まれるDNAからの増幅と同じくらい良好に当該反応を進行させることが可能であった(図8)。

0192

例示的であるが非限定的な別の手法では、ATPSと核酸(例えば、DNA)増幅とに必要な構成成分のすべてが1つの混合物に統合される。注目すべきは、この方法では、典型的には、核酸(例えば、DNA増幅)を等温で利用できるということである。一般に使用されるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅方法は、DNA増幅プロセスのそれぞれの段階について異なる温度を周期的に繰り返すものであるが、等温増幅では、DNA増幅プロセス全体を1つの設定温度で実施することが可能である。この一例は、好熱性ヘリカーゼ依存性増幅(tHDA)であり、これは、二本鎖DNAを分離するために熱サイクリングではなくヘリカーゼを使用するものであり、これによって、等温的(例えば、65℃)に増幅を実施することが可能になる。この温度でも相分離が生じるミセルATPSが存在するため、こうしたミセルATPSをtHDA反応の構成成分と組み合わせることでDNAの濃縮及び増幅を同時に促進することができる。

0193

これを実施するために、全細胞試料を統合溶液に添加することができ、その際、次に全溶液を混合することでミセルATPSを形成することができる。その後、この混合物を例えば、65℃で1時間加熱することで、相分離とDNA増幅とを両方生じさせることが可能である(図9)。核酸(例えば、DNA)は、2つの相のうちの1つに分配され、その後、そこから増幅DNAを抽出することができる。このワンポットプラットフォームには、核酸の濃縮と増幅とを両方同時に行う能力が存在し、この能力によって、現在のtHDA技術単独で可能なものと比較して、細胞数が少ない試料から増幅を行うことが可能になる。現在のtHDA技術では、試料に含まれる細胞数が10,000個超であれば、試料からDNAが良好に増幅される。対照的に、TritonX−100ATPSとtHDAとが統合されたワンポット系を使用すると、僅か100個の細胞しか含まない試料からDNAを良好に増幅できることが我々の予備結果によって示されている(図10)。一方、細胞試料が別に溶解され、商用のキット及び他の実験機器を介してDNAが精製及び濃縮されると、tHDA系自体は、単に、この同一の低い検出限界を達成し得るにすぎない。したがって、我々のワンポットプラットフォームが感度及び単純性を改善したことが、このプラットフォームをポイント・オブ・ケア核酸増幅検査(NAAT)に基づく疾患検出のための、競争力のある候補としている。我々の発明は、使用することができる可能なATPS及び等温増幅試薬が多く存在するため、非常に汎用的でもある。

0194

標的生体分子の濃縮
本明細書に記載のアッセイのさまざまな実施形態において、分析対象物(例えば、標的生体分子)は、水性二相系(ATPS)を使用して濃縮することができる。さまざまな実施形態において、ATPSは、バルクの液体形態(例えば、容器)において実施するか、またはラテラルフローアッセイもしくはフロースルーアッセイ(例えば、ペーパー膜)において試料溶液を流しながら実施することができる。

0195

液体ATPSにおける濃縮
採取した試料(例えば、組織試料、生体液(尿、唾液、及び血液、、膣液、精液、脳脊髄液、リンパ液など)、子宮頸管内スワブ、歯に由来するプラーク、食品試料、ならびに環境試料、ならびに同様のもの)は、任意選択で、懸濁液(例えば、緩衝液)と混合されるか、もしくはATPS溶液と直接的に混合されるか、もしくはペーパーに直接的に加えられるか、または試料を含む懸濁液がペーパーに加えられることで、事前にペーパーに乾燥吸着したATPS構成成分が再水和し得る。場合によっては、よく混合された均一溶液を得るために、使用者による混合が必要であり得る。例示的であるが非限定的なさまざまな実施形態において、ポリマー/塩、ポリマー/ポリマー、ミセル/ポリマー、またはミセルATPSが使用され得る。

0196

ペーパーでの流体が流れながらの濃縮
さまざまな実施形態において、濃縮段階は、ペーパーを用いても促進され得る。例えば、採取した検体をATPS構成成分と混合し、相分離を推進、強化、及び促進することができるペーパーデバイスに導入にすることができる。標的生体分子は、ペーパー膜での流れの先行前部において濃縮することができ、次の検出コンポーネントへと途切れることなく導入することができる。

0197

あるいは、ATPS構成成分は、ペーパー膜に事前に脱水吸着させることができる。この場合、採取した検体は、ATPS構成成分と事前に混合することなく、ペーパー膜に直接的に加えることができる。

0198

水性二相系(ATPS)
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のデバイスは、例えば、シリンジまたは他の容器における水性二相系(ATPS)と併せて働くように構成されるか、または水性二相系(ATPS)を支持するように構成される。いくつかの実施形態では、ATPSは、相溶液を含む。「相溶液」という用語は、一般に、ATPSの第1の相溶液または第2の相溶液を指す。いくつかの実施形態では、相溶液は、混合溶液(例えば、第1の相溶液/第2の相溶液との混合溶液)に存在する。いくつかの実施形態では、相溶液は、ATPSの混合溶液からそれが分配された後の第1の相溶液/第2の相溶液である。いくつかの実施形態では、相溶液は、LFAまたはフロースルーアッセイにおいて混合溶液からそれが分配された後の第1の相溶液/第2の相溶液である。ある特定の実施形態では、相溶液は、それが混合状態(例えば、第1の相溶液との混合状態)にある間、第2の相溶液と称され得る。いくつかの実施形態では、相溶液は、LFAまたはフロースルーアッセイにおける先行流体である。いくつかの実施形態では、相溶液は、LFAまたはフロースルーアッセイにおける遅行流体である。

0199

いくつかの実施形態では、ATPSは、第1の相溶液と第2の相溶液とが最初は混ざった状態のもの(例えば、混合相溶液)である2つの水性溶液を含む。いくつかの実施形態では、混合相溶液は、均一溶液であるが、ある特定の他の実施形態では、第1の相溶液と第2の相溶液とは、非混和性である。いくつかの実施形態では、第1の相溶液と第2の相溶液とは、非混和性であるが、第1の相溶液のドメインは、第2の相溶液のドメインと混ざる。いくつかの実施形態では、非混和性は、温度変化及び/または塩などの異なる構成成分の濃度変化によって促進される。いくつかの実施形態では、第1の相溶液/第2の相溶液は、ミセル、塩、及び/またはポリマーなどの構成成分を含む。いくつかの実施形態では、ATPSと接触する標的分析対象物(例えば、生体分子、細菌(もしくはその断片)、真菌(もしくはその断片)、またはウイルス、及び同様のもの)は、その物理的特性及び化学的特性(サイズ、形、疎水性、及び電荷など)に基づいて、第2の相溶液を上回って第1の相溶液に(またはその逆に)優先的に分布、分配、及び/または濃縮される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物(例えば、細菌、真菌、ウイルスなど)は、ATPSの第1の相溶液または第2の相溶液に主に(または極度に)分配され、それ故に、ATPSにおいて濃縮される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、第1の相溶液と第2の相溶液との体積比を調整することによって濃縮される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、分析対象物が分配される相の体積を減らすことによって濃縮される。例として、いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、例えば、第1の相溶液と第2の相溶液との体積比を1:9にすることによって第1の相溶液に10倍濃縮され、この濃縮は、分析対象物が極度に分配される相の体積が総体積の1/10であるために生じる。

0200

いくつかの実施形態では、他の濃縮が、他の比を使用することによって得られる。したがって、いくつかの実施形態では、第1の相溶液と第2の相溶液との比は、約1:1、約1:2、約1:3、約1:4、約1:5、約1:6、約1:7、約1:8、約1:9、または約1:10の比を含む。いくつかの実施形態では、第1の相溶液と第2の相溶液との比は、約1:20、約1:30、約1:40、約1:50、約1:60、約1:70、約1:80、約1:90、または約1:100の比を含む。いくつかの実施形態では、第1の相溶液と第2の相溶液との比は、約1:200、約1:300、約1:400、約1:500、約1:600、約1:700、約1:800、約1:900、または約1:1000の比を含む。

0201

いくつかの実施形態では、第2の相溶液と第1の相溶液との比は、約1:1、約1:2、約1:3、約1:4、約1:5、約1:6、約1:7、約1:8、約1:9、または約1:10の比を含む。いくつかの実施形態では、第2の相溶液と第1の相溶液との比は、約1:20、約1:30、約1:40、約1:50、約1:60、約1:70、約1:80、約1:90、または約1:100の比を含む。いくつかの実施形態では、第2の相溶液と第1の相溶液との比は、約1:200、約1:300、約1:400、約1:500、約1:600、約1:700、約1:800、約1:900、または約1:1000の比を含む。

0202

いくつかの実施形態では、分析対象物は、第1の相溶液と第2の相溶液とに実質的に均等に分配されることで、分析対象物の濃縮が阻止される。そのような系では、標的分析対象物の濃縮は、標的分析対象物を捕捉するプローブなどの、追加の構成成分を導入することによって達成され、プローブは、1つの相に主に分配され、それによって、標的分析対象物の濃縮を可能にする分配挙動が強化される。いくつかの実施形態では、濃縮された分析対象物を含む第1の相溶液/第2の相溶液が採取され、LFAまたはフロースルーアッセイデバイスに加えられる。

0203

いくつかの実施形態では、第1の相溶液/第2の相溶液は、ミセル溶液を含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、非イオン性界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、界面活性剤を含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、Triton−Xを含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、Triton−Xと同様のポリマー(例えば、Igepal CA−630及びNonidet P−40、ならびに同様のものなどであるが、これらに限定はされない)を含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、Triton−Xから本質的になる。

0204

いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、室温(約25℃)で、約0.01センチポアズ〜約5000センチポアズ、約0.01センチポアズ〜約4500センチポアズ、約0.01センチポアズ〜約4000センチポアズ、約0.01センチポアズ〜約3500センチポアズ、約0.01センチポアズ〜約3000センチポアズ、約0.01センチポアズ〜約2500センチポアズ、約0.01センチポアズ〜約2000センチポアズ、約0.01センチポアズ〜約1500センチポアズ、約0.01センチポアズ〜約1000センチポアズ、または約0.01センチポアズ〜約500センチポアズの粘度を有する。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、室温で、約0.01センチポアズ〜約450センチポアズ、約0.01センチポアズ〜約400センチポアズ、約0.01センチポアズ〜約350センチポアズ、約0.01センチポアズ〜約300センチポアズ、約0.01センチポアズ〜約250センチポアズ、約0.01センチポアズ〜約200センチポアズ、約0.01センチポアズ〜約150センチポアズ、または約0.01センチポアズ〜約100センチポアズの粘度を有する。

0205

いくつかの実施形態では、再水和した第1の相溶液/第2の相溶液は、ポリマー(例えば、ポリマー溶液)を含む。ある特定の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレンプロピレンコポリマー(例えば、UCON(商標)ポリマー)、プロピレングリコール(PPG)、メトキシポリエチレングリコールポリビニルピロリドン、及び同様のものからなる群から選択される1つまたは複数のポリマーを含む。ある特定の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)である。さまざまな実施形態において、PEGは、1000〜100,000の分子量を有し得る。ある特定の実施形態では、PEGは、PEG−4600、PEG−8000、またはPEG−20,000を含む。ある特定の実施形態では、ポリマーは、ポリプロピレングリコール(PPG)である。さまざまな実施形態において、PPGは、100〜10,000の分子量を有し得る。ある特定の実施形態では、PPGは、PPG425を含む。ある特定の実施形態では、ポリマーは、デキストランである。さまざまな実施形態において、デキストランは、1000〜1,000,000の分子量を有し得る。ある特定の実施形態では、デキストランは、デキストラン6000、デキストラン9000、デキストラン−35,000、またはデキストラン−200,000を含む。ある特定の実施形態では、ポリマーは、エチレン/プロピレンコポリマー(例えば、UCON(商標)ポリマー)を含む。例示的であるが非限定的なエチレン/プロピレンコポリマーには、限定はされないが、UCON(商標)50−HB−5100、UCON(商標)50−HB−3520、UCON(商標)50−HB−2000、UCON(商標)50−HB−660、UCON(商標)50−HB−400、UCON(商標)50−HB−260、UCON(商標)50−HB−170、UCON(商標)50−HB−100、UCON(商標)60−H−5300、UCON(商標)60−H2300、UCON(商標)60−H−1600、UCON(商標)60−H−1100、UCON(商標)60−H−760、UCON(商標)60−H−340、UCON(商標)75−H−9500、UCON(商標)75−H−1400、UCON(商標)75−H−450、及び同様のものが含まれる。

0206

いくつかの実施形態では、再水和したポリマー溶液は、ポリマー含量が約0.01%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.05%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.1%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.15%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.2%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.25%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.3%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.35%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.4%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.45%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.5%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.55%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.6%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.65%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.7%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.75%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.8%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.85%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.9%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約0.95%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約1%w/wのポリマー溶液を含む。いくつかの実施形態では、ポリマー溶液は、ポリマー含量が約1%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約2%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約3%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約4%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約5%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約6%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約7%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約8%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約9%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約10%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約11%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約12%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約13%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約14%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約15%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約16%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約17%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約18%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約19%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約20%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約21%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約22%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約23%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約24%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約25%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約26%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約27%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約28%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約29%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約30%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約31%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約32%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約33%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約34%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約35%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約36%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約37%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約38%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約39%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約40%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約41%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約42%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約43%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約44%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約45%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約46%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約47%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約48%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約49%w/wのポリマー溶液、または及びポリマー含量が約50%w/wのポリマー溶液を含む。いくつかの実施形態では、ポリマー溶液は、ポリマー含量が約10%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約20%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約30%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約40%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約50%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約60%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約70%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約80%w/wのポリマー溶液、またはポリマー含量が約90%w/wのポリマー溶液を含む。いくつかの実施形態では、ポリマー溶液は、ポリマー含量が約10%w/w〜約80%w/wのポリマー溶液を含む。いくつかの実施形態では、再水和したポリマー溶液は、ポリマー含量が約1%w/w〜約30%w/w、または約5%w/w〜約25%w/w、または約10%w/w〜約25%w/w、または約10%w/w〜約20%w/wのポリマー溶液を含む。

0207

いくつかの実施形態では、再水和した第1の相溶液及び/または第2の相溶液は、塩を含み、それによって塩溶液を形成する。いくつかの実施形態では、標的分析対象物(例えば、細菌、真菌、ウイルスなど)及び/またはプローブ−分析対象物複合体は、塩溶液に分配される。ある特定の実施形態では、塩溶液は、コスモトロピック塩を含む。いくつかの実施形態では、塩溶液は、カオトロピック塩を含む。いくつかの実施形態では、塩は、マグネシウム塩リチウム塩ナトリウム塩カリウム塩セシウム塩亜鉛塩、及びアルミニウム塩のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、塩は、臭化物塩ヨウ化物塩フッ化物塩、炭酸塩硫酸塩、クエン酸塩カルボン酸塩ホウ酸塩、またはリン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、塩は、リン酸カリウムである。いくつかの実施形態では、塩は、硫酸アンモニウムである。

0208

いくつかの実施形態では、再水和した塩溶液は、約0.01%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.05%w/wの塩を含む塩溶液、約0.1%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.15%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.2%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.25%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.3%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.35%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.4%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.45%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.5%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.55%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.6%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.65%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.7%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.75%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.8%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.85%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.9%w/wの塩を含む塩溶液、または約0.95%w/wの塩を含む塩溶液、または約もしくは約1%w/wの塩を含む塩溶液を含む。いくつかの実施形態では、再水和した塩溶液は、塩含量が約1%w/wの塩溶液、または塩含量が約2%w/wの塩溶液、または塩含量が約3%w/wの塩溶液、または塩含量が約4%w/wの塩溶液、または塩含量が約5%w/wの塩溶液、または塩含量が約6%w/wの塩溶液、または塩含量が約7%w/wの塩溶液、または塩含量が約8%w/wの塩溶液、または塩含量が約9%w/wの塩溶液、または塩含量が約10%w/wの塩溶液、または塩含量が約11%w/wの塩溶液、または塩含量が約12%w/wの塩溶液、または塩含量が約13%w/wの塩溶液、または塩含量が約14%w/wの塩溶液、または塩含量が約15%w/wの塩溶液、または塩含量が約16%w/wの塩溶液、または塩含量が約17%w/wの塩溶液、または塩含量が約18%w/wの塩溶液、または塩含量が約19%w/wの塩溶液、または塩含量が約20%w/wの塩溶液、または塩含量が約21%w/wの塩溶液、または塩含量が約22%w/wの塩溶液、または塩含量が約23%w/wの塩溶液、または塩含量が約24%w/wの塩溶液、または塩含量が約25%w/wの塩溶液、または塩含量が約26%w/wの塩溶液、または塩含量が約27%w/wの塩溶液、または塩含量が約28%w/wの塩溶液、または塩含量が約29%w/wの塩溶液、または塩含量が約30%w/wの塩溶液、または塩含量が約31%w/wの塩溶液、または塩含量が約32%w/wの塩溶液、または塩含量が約33%w/wの塩溶液、または塩含量が約34%w/wの塩溶液、または塩含量が約35%w/wの塩溶液、または塩含量が約36%w/wの塩溶液、または塩含量が約37%w/wの塩溶液、または塩含量が約38%w/wの塩溶液、または塩含量が約39%w/wの塩溶液、または塩含量が約40%w/wの塩溶液、または塩含量が約41%w/wの塩溶液、または塩含量が約42%w/wの塩溶液、または塩含量が約43%w/wの塩溶液、または塩含量が約44%w/wの塩溶液、または塩含量が約45%w/wの塩溶液、または塩含量が約46%w/wの塩溶液、または塩含量が約47%w/wの塩溶液、または塩含量が約48%w/wの塩溶液、または塩含量が約49%w/wの塩溶液、または及び塩含量が約50%w/wの塩溶液を含む。いくつかの実施形態では、再水和した塩溶液は、約0.1%w/w〜約40%w/w、または約1%w/w〜約30%w/w、または約5%w/w〜約25%w/w、または約10%w/w〜約20%w/wの範囲の塩溶液を含む。いくつかの実施形態では、再水和した塩溶液は、約0.1%w/w〜約10%の塩溶液を含む。いくつかの実施形態では、塩溶液は、約1%w/w〜約10%である。

0209

いくつかの実施形態では、第1の相溶液/第2の相溶液は、水と非混和性の溶媒を含む。いくつかの実施形態では、溶媒は、非極性有機溶媒を含む。いくつかの実施形態では、溶媒は、油を含む。いくつかの実施形態では、溶媒は、ペンタンシクロペンタンベンゼン、1,4−ジオキサンジエチルエーテルジクロロメタンクロロホルムトルエン、またはヘキサンを含む。

0210

いくつかの実施形態では、第1の相溶液は、ミセル溶液を含み、第2の相溶液は、ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、第2の相溶液は、ミセル溶液を含み、第1の相溶液は、ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、第1の相溶液は、ミセル溶液を含み、第2の相溶液は、塩を含む。いくつかの実施形態では、第2の相溶液は、ミセル溶液を含み、第1の相溶液は、塩を含む。いくつかの実施形態では、ミセル溶液は、Triton−X溶液である。いくつかの実施形態では、第1の相溶液は、第1のポリマーを含み、第2の相溶液は、第2のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、第1のポリマー/第2のポリマーは、ポリエチレングリコール及び/またはデキストランを含む。いくつかの実施形態では、第1の相溶液は、ポリマーを含み、第2の相溶液は、塩を含む。いくつかの実施形態では、第2の相溶液は、ポリマーを含み、第1の相溶液は、塩を含む。いくつかの実施形態では、第1の相溶液は、ポリエチレングリコールを含み、第2の相溶液は、リン酸カリウムを含む。いくつかの実施形態では、第2の相溶液は、ポリエチレングリコールを含み、第1の相溶液は、リン酸カリウムを含む。いくつかの実施形態では、第1の相溶液は、塩を含み、第2の相溶液は、塩を含む。いくつかの実施形態では、第1の相溶液は、コスモトロピック塩を含み、第2の相溶液は、カオトロピック塩を含む。いくつかの実施形態では、第2の相溶液は、コスモトロピック塩を含み、第1の相溶液は、カオトロピック塩を含む。

0211

いくつかの実施形態では、第1の相溶液は、表1に記載の構成成分1を含み、第2の相溶液は、表1に記載の構成成分2を含む。いくつかの実施形態では、第2の相溶液は、表1に記載の構成成分1を含み、第2の相溶液は、表1に記載の構成成分2を含む。

0212

いくつかの実施形態では、表1に記載の構成成分は、緩衝液に懸濁または溶解される。いくつかの実施形態では、表1に記載の構成成分は、試料の起源である生体系に適合する緩衝液に懸濁/溶解される。いくつかの実施形態では、表1に記載の構成成分は、生理食塩水に懸濁/溶解される。いくつかの実施形態では、表1に記載の構成成分は、PBSに懸濁/溶解される。いくつかの実施形態では、表1に記載の構成成分は、水に懸濁/溶解される。いくつかの実施形態では、表1に記載の構成成分は、生体液に懸濁/溶解される。

0213

0214

UCON(商標)ポリマーは、約100℃〜約150℃の温度で、アルカリ触媒を使用し、等重量のエチレンオキシド及びプロピレンオキシドブチルアルコールと反応させることによって生成するエチレン/プロピレンコポリマーを含むことに留意されたい。得られるUCON(商標)50−HBは、以下の一般構造を有するランダムコポリマーである:

0215

0216

上記のATPS系及び構成成分は、例示的かつ非限定的であることを認識されよう。本明細書で提供される教示内容を使用することで、当業者であれば多数の他のATPS系及び構成成分を利用可能であろう。

0217

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のデバイス(例えば、LFAまたはフロースルーアッセイデバイス)は、ATPSと接触するように配置構成されるコレクターをさらに含み得、標的分析対象物は、コレクターと第1の相溶液及び/または第2の相溶液との界面に分配される。いくつかの実施形態では、コレクターは、プラスチック、メソ多孔性材料シリカ、ポリプロピレン、磁石磁性粒子常磁性粒子、孔を有する材料、溝を有する材料、及び/またはそれらの任意の組み合わせである材料を含む。いくつかの実施形態では、コレクターは、ポリプロピレンを含む。いくつかの実施形態では、コレクターは、標的分析対象物の採取量が増えるように最適化される。いくつかの実施形態では、コレクターは、表面積最大化するための孔を含む。いくつかの実施形態では、孔の幅は、約1μm、約5μm、約10μm、約15μm、約20μm、約25μm、約30μm、約35μm、約40μm、約45μm、約50μm、約55μm、約60μm、約65μm、約70μm、約75μm、約80μm、約85μm、約90μm、約95μm、または約100μmである。いくつかの実施形態では、孔の幅は、約100μm、約200μm、約300μm、約400μm、約500μm、約600μm、約700μm、約800μm、約900μm、または約1mmである。いくつかの実施形態では、孔の深さは、約1μm、約5μm、約10μm、約15μm、約20μm、約25μm、約30μm、約35μm、約40μm、約45μm、約50μm、約55μm、約60μm、約65μm、約70μm、約75μm、約80μm、約85μm、約90μm、約95μm、または約100μmである。いくつかの実施形態では、孔の深さは、約100μm、約200μm、約300μm、約400μm、約500μm、約600μm、約700μm、約800μm、約900μm、または約1mmである。

0218

標的分析対象物(例えば、生体分子)の検出
さまざまな実施形態において、ペーパーベースの検出コンポーネントは、ラテラルフロー試験ストリップ(例えば、図1を参照のこと)またはフロースルーデバイス(スポット試験)(例えば、図11を参照のこと)の形態であり得る。さまざまな実施形態において、両方の形態要素は、下記のコンポーネントのうちの1つまたは複数を含み得る:

0219

試料パッド
ある特定の実施形態では、試料パッドは、存在するとき、濃縮コンポーネントを検出コンポーネントに連結することができる。試料パッドは、採取した流体に由来するデブリ混入物、及び粘液を除去することができるフィルターとして働くことができる。試料パッドは、乾燥試薬を保持することもでき、再水和時に、こうした試薬は、(i)検出条件(pH、イオン強度など)が最適となるように溶液を調整し、(ii)採取した検体に含まれ、検出に影響し得る粘液、糖タンパク質、及び他の粘性材料を分解することができる。試料パッドのための材料の例には、限定はされないが、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維、綿、織紙、または不織紙などが含まれる。パッドに加える試薬には、限定はされないが、界面活性剤(TritonX−100、Tween20、またはドデシル硫酸ナトリウムなど)、ポリマー(ポリエチレングリコール、ポロキサマー、ポリビニルピロリドン(PVP)など)、緩衝剤リン酸緩衝生理食塩水、4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン(トリス)、ホウ酸ナトリウムTRICINEなど)、タンパク質(アルブミンなど)、酵素(プロテアーゼなど)、塩(塩化ナトリウムリン酸ナトリウムコール酸ナトリウム、リン酸カリウムなど)が含まれ得る。さまざまな実施形態において、こうした試薬は、(i)試薬溶液へのペーパー材料の浸漬、または(ii)毛細管流動を介する膜の浸潤によって試料パッドに加えることができる。処理した試料パッドは、(i)風乾(室温に放置)、(ii)ベーキングオーブンもしくは加温デバイス使用し、高温下に置く)、(iii)減圧、または(iv)凍結乾燥によって乾燥させることができる。

0220

複合パッド
さまざまな実施形態において、複合パッドは、存在するとき、標的分析対象物(複数可)と結合する結合部分で修飾され、かつ脱水された比色指示薬を含み得る。ある特定の実施形態では、結合部分は、標的分析対象物(複数可)(例えば、細菌、真菌、ウイルス、タンパク質、DNAなど)に対して高親和性を有する特異的な結合部分である。試料溶液が複合パッドに到達すると、比色指示薬は再水和する。その後、比色指示薬に存在する結合部分は、標的分析対象物(複数可)に結合することができ、得られる複合体は、反応パッドへと流れることができる。ある特定の実施形態では、比色指示薬は、金属粒子金粒子銀粒子など)、多量体粒子ラテックスビーズなど)、及び可視色素または蛍光色素封入するポリスチレン粒子を含み得る。複合パッドのための材料の例には、限定はされないが、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維、綿、織紙、または不織紙などが含まれる。ある特定の実施形態では、比色指示薬は、上記のパッドに加え、脱水吸着させることができる。

0221

反応パッド
ある特定の実施形態では、反応パッドは、存在するとき、固定化された試薬を含み得、固定化された試薬は、試料溶液と反応すると、シグナル(例えば、視覚的シグナル)を生成することで標的分析対象物(複数可)の存在の有無またはその量を示し得る。反応パッドのための材料の例には、限定はされないが、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維、綿、織紙、または不織紙などが含まれる。

0222

ラテラルフロー形式
ある特定の実施形態では、ラテラルフロー試験ストリップについては、反応パッドに加える試薬は、流れの方向に対して垂直のラインの形態で固定化されることで、すべての試料が固定化試薬と確実に相互作用し得ることになる。試薬の濃度は、シグナル強度を制御し、したがって、アッセイの感度を制御するために最適化することができる。例えば、半定量的アッセイを、さまざまな濃度で同一の試薬を複数のラインとして固定化することによって設計できる。したがって、それぞれのラインは、特定濃度の標的生体分子が到達したときにのみ、シグナルを生成することになる。その後、視認可能なラインの数を数えることによって標的生体分子の濃度を解釈することができる(例えば、図2を参照のこと)。

0223

さらに、同一のストリップに異なる試薬を複数のラインとして固定化することで、複数の標的分析対象物(複数可)を検出することができる。これによって、マルチプレックスアッセイを開発することが可能になる。

0224

フロースルー形式
ある特定の実施形態では、フロースルー試験ついては、試薬は、ラインの代わりに、反応パッド全体に固定化することができる。標的分析対象物は、存在するのであれば、複合パッドに存在する比色指示薬に結合し、指示薬−標的複合体が固定化試薬に結合するにつれて反応パッドに捕捉されることになる。したがって、標的生体分子が存在するのであれば、可視スポットが出現することになる。この試験は、ラテラルフロー試験ストリップで吸い上げるには試料体積が小さすぎる場合に使用することができる。可視スポットの色の強度は、標的生体分子の濃度と相関し、スポットのサイズは、試料体積と相関する。ある特定の実施形態では、フロースルー試験の真上に濃縮コンポーネントを配置することで、抽出し、濃縮した試料を検出コンポーネントに加えるという手間を省くことができる。

0225

さまざまな実施形態において、固定化された試薬は、標的分析対象物に対する特異的な抗体(一次抗体)、一次抗体に対する抗体(二次抗体)、抗原、タンパク質、または抗原−タンパク質複合体を含み得る。反応パッドのための材料の例には、限定はされないが、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維、綿、織紙、及び不織紙などが含まれる。さまざまな実施形態において、試薬を上記のパッドに加え、脱水吸着させることができる。

0226

シンク
ある特定の実施形態では、シンクは、存在するとき、過剰な流体を回収し、試験性能に影響し得る逆流を防ぐ吸収パッドを含み得る。シンクのための材料の例には、限定はされないが、セルロース、ニトロセルロース、ガラス繊維、綿、織紙、及び不織紙などが含まれる。

0227

シグナル増強
上記のように、さまざまな実施形態において、可視シグナル強度を増強することによって検出アッセイの感度及び/または精度を改善することができる。これは、最初の検出アッセイ(分析対象物の結合)の後に、追加の増進(シグナル増強)試薬を反応パッドに導入することによって実施できる。上に説明されるように、プローブ及びATPSは、プローブが検出ゾーンに最初に送達され(例えば、ATPSの先行相または界面に含まれて送達される)、その後、増進試薬が遅れて送達される(例えば、ATPSの遅行相に含まれて送達される)ように設計することができる。

0228

ある特定の実施形態では、シグナル増強試薬は、例えば、比色指示薬の表面に修飾された酵素と反応する基質を含めることで強力な可視生成物を形成することができる。例として、比色指示薬が金プローブを含むのであれば、シグナル増強は、銀による増強標識化によって達成することができ、この場合、金プローブが固定化ライン/スポットに結合する場所である反応パッドに銀イオン含有増強試薬を加えることができる。このシナリオでは、金プローブは核形成部位として働くことができ、その結果、当該粒子に銀が沈着することでシグナル強度を増加させることができる。こうした例では、シグナル増強試薬は、最初の検出アッセイの後に別に添加するか、またはペーパーデバイスに保持/脱水吸着させることで自動/手動で放出させることができる。

0229

例示的であるが非限定的な他の実施形態では、増進試薬は、プローブ(複数可)と結合またはそれに付加された対応する酵素と反応することで検出可能なシグナルを増強する酵素(例えば、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビ(または他の)ペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼなど)の基質であり得る。あるいは、増進試薬が酵素を含み得、基質はプローブ(複数可)に付加または結合される。

0230

前述のコンポーネント及びアッセイ形式は、例示的かつ非限定的である。本明細書で提供される教示内容及び例を使用することで、当業者であれば多数の他のアッセイデバイス及び構成が利用可能であろう。設計考慮事項及びコンポーネントのいくつかが以下にさらに記載される。

0231

ラテラルフローアッセイ(LFA)またはフロースルー(スポット)アッセイ
上に説明されるように、ある特定の実施形態では、本明細書に記載のデバイス及び系は、試料における標的分析対象物を検出するためのラテラルフローアッセイ(LFA)またはフロースルー(スポット)アッセイを提供するように構成され、LFAまたはスポットアッセイは、単独で使用されるか、または水性二相系(ATPS)と併せて使用される。いくつかの実施形態では、LFAまたはスポットアッセイは、ATPSまたはその構成成分が流れ込む多孔性マトリックスを含み、多孔性マトリックスは、ATPSまたはその構成成分が流体相に含まれるとき、ATPSまたはその構成成分が多孔性マトリックスを通過することが可能なように構成されると共に、それを可能にする十分な多孔度を有する。そのような多孔性のLFAまたはスポットアッセイデバイスは、本明細書でペーパーデバイスまたはペーパー流動性デバイスと称され、これらの用語は、互換的に使用される。

0232

本明細書で使用される「ペーパー」という用語は、木材のパルプまたは他の線維性植物物質に由来する薄いシートに限定されるものではないが、ある特定の実施形態では、本明細書に記載のデバイスにおいてそのようなペーパーを使用することが企図される。ペーパーは、より一般には、多孔性材料を指し、こうした多孔性材料は、シート形状であることが多いが、それに限定はされず、流体が通過可能なものである。

0233

いくつかの実施形態では、多孔性マトリックスは、ATPSの混合相溶液、第1の相溶液、及び/または第2の相溶液、及び/または標的分析対象物がLFAを通過可能なほど十分に多孔性である。いくつかの実施形態では、多孔性マトリックスは、混合相溶液、第1の相溶液、及び/または第2の相溶液、及び/または標的分析対象物がLFAまたはスポットアッセイデバイスを垂直方向及び/または水平方向に通過するのに十分なほど十分な長さ及び/または深さを有する。いくつかの実施形態では、第1の相溶液は、第1の速度で多孔性マトリックスを通過し、第2の相溶液は、第2の速度で多孔性マトリックスを通過し、第1の速度と第2の速度とは異なる。LFAまたはスポットアッセイの実施形態のいくつかでは、多孔性マトリックスは、数ある中でも特に、焼結ガラスセラミック、ミネラル、セルロース、ガラス繊維、ニトロセルロース、フッ化ポリビニリデン、ナイロン、電荷改変ナイロン、ポリエーテルスルホン、それらの組み合わせ、及び同様のものなどの材料を含む。

0234

流れながら濃縮
ATPSは、当該溶液が多孔性基質(例えば、ペーパー)を通過するにつれて相分離し得ることが発見され、このことを我々は「流れながら濃縮」と命名した。さらに、ペーパーを通過することによって濃縮プロセスが顕著に迅速化することも発見された。この現象に基づくと、本明細書に記載のラテラルフローアッセイデバイス及びフロースルーアッセイデバイスは、ATPSによる濃縮をLFAまたはフロースルーによる検出と組み合わせるために必要なコンポーネントを完全に統合するペーパー流動性コンポーネントを含み得る。混合されたATPS溶液が、ある特定のペーパー材料に加えられると、当該溶液が流れるにつれて、相分離及び分析対象物の濃縮が生じることが発見された。我々は、ATPSにさまざまな体積比(例えば、上相の体積を下相の体積で割ったもの)を持たせたときでさえ、この現象が維持されることも実証した。

0235

いくつかの実施形態では、LFAまたはスポットアッセイ(例えば、スポットアッセイの濃縮コンポーネント)は、ペーパーを含む。いくつかの実施形態では、ペーパーは、流体がそれを通過することが可能な多孔性材料のシートを含む。いくつかの実施形態では、ペーパーは、流体がそれらを通過することが可能な多孔性材料の複数のシートを含む。いくつかの実施形態では、ペーパーは、セルロース、ガラス繊維、ニトロセルロース、フッ化ポリビニリデン、電荷改変ナイロン、ポリエーテルスルホン、及び同様のものなどの、1つまたは複数の材料を含む。いくつかの実施形態では、ペーパーは、HI−FLOWPLUS(登録商標)膜である。

0236

いくつかの実施形態では、ペーパーは、織紙である。いくつかの実施形態では、ペーパーは、Whatmanペーパーである。いくつかの実施形態では、Whatmanペーパーは、Whatman S17、WhatmanMF1、Whatman VF1、Whatman Fusion 5、Whatman GF/DVA、WhatmanLF1、Whatman CF1、及び/またはWhatman CF4を含む。

0237

いくつかの実施形態では、標的分析対象物が、LFAを通過するか、またはフロースルーアッセイの濃縮コンポーネント(例えば、「流れながら濃縮」ベースのデバイス)を通過するにつれて、ペーパーにおいて標的分析対象物が濃縮される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物がLFAを水平方向に通過するにつれて、ペーパーにおいて標的分析対象物が濃縮される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物がLFAまたはフロースルーアッセイを垂直方向に通過するにつれて、ペーパーにおいて標的分析対象物が濃縮される。

0238

いくつかの実施形態では、ペーパーは、どちらの相溶液が「先行流体」になるかということに影響を与える特性を有する。非限定的な例として、PEG−塩ATPSが使用されるとき、ガラス繊維ペーパーに当該溶液を添加すると、塩相が先行溶液となる一方で、セルロースペーパーを使用すると、PEG相が先行溶液となる。いくつかの実施形態では、ペーパー内で相分離すると、相分離が促進される。追加の非限定的な例として、ミセルATPSは、典型的には、流れの無いATPSでは相分離に数時間を要するが、ペーパーストリップに加えられると、この相分離は数分で生じる。このことによって、従来はこのプロセスにおける律速段階であったATPSが、我々の迅速ペーパー診断アッセイのための選択肢として、より実行可能なものになり、これによって診断プロセスが迅速化する。いくつかの実施形態では、「その流れながら濃縮」デバイスは、PEG−塩ATPS(例えば、実施例に示されるもの)を含む。いくつかの実施形態では、「流れながら濃縮」デバイスは、ミセルATPSを含む。いくつかの実施形態では、LFAデバイスまたはフロースルーアッセイデバイスは、ガラス繊維ペーパーまたはニトロセルロースペーパーを含む。

0239

ある特定の実施形態では、LFAまたはフロースルーアッセイデバイスは、デブリ(例えば、血液細胞または他の粒子)を除去するフィルター、標的分析対象物を含む試料がデバイスに加えられる場所である試料パッド、標的分析対象物が結合し、検出される場所である検出ゾーン(例えば、試験ライン及び対照ライン)、ならびにLFAまたはフロースルーデバイスに加えられる過剰な試料及び/または溶液を吸収することができる吸収パッド(例えば、乾燥した受入ペーパー)を含む(例えば、図1及び図11を参照のこと)。いくつかの実施形態では、対照ライン及び/または試験ラインは、本質的にはラインではなく、領域またはスポットである。

0240

いくつかの実施形態では、LFAは、LFAストリップを含む。「LFA」及び「LFAストリップ」という用語は、本明細書で互換的に使用される。いくつかの実施形態では、LFAストリップの長さは、その幅及び深さと比較して長い。いくつかの実施形態では、LFAは、矩形である。いくつかの実施形態では、LFAは、円形卵形方形多角形、または不規則形の形状を有する。いくつかの実施形態では、LFAは、複数の経路及び/または接合部を含む。いくつかの実施形態では、LFAストリップは、試料パッド、検出ゾーン、及び吸収パッドを含む。いくつかの実施形態では、検出ゾーンは、試料パッドと吸収パッドとの間に位置し、吸収パッドは、標的分析対象物を含む試料を吸って試料パッドから引き出し、検出ゾーンに向かわせる。

0241

サンドイッチアッセイ
いくつかの実施形態では、LFAまたはフロースルー(スポット)アッセイデバイスは、サンドイッチアッセイが提供または実施されるように構成される(例えば、本明細書の図1、及び2015年3月6日に出願された同時係属中のPCT出願第PCT/US2015/019297号(当該文献は、そこに記載のLFA構成を対象として参照によって本明細書に組み込まれる)の図1の左下を参照のこと)。いくつかの実施形態では、サンドイッチアッセイは、標的分析対象物と結合する捕捉部分を含む。いくつかの実施形態では、デバイスは、プローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブは、検出可能な特性(比色性、蛍光性、放射性など)を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、標的分析対象物と相互作用する結合部分(例えば、抗体)を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、試料に添加され、標的分析対象物と結合することでプローブ−分析対象物複合体を形成する。

0242

競合アッセイ
いくつかの実施形態では、LFAは、競合アッセイを含む。いくつかの実施形態では、プローブは、試料に添加され、標的分析対象物と結合することでプローブ−分析対象物複合体を形成する。いくつかの実施形態では、LFAは、試験ラインに固定化された標的分析対象物を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、試料における標的分析対象物によって飽和し、そのプローブは、試験ラインに固定化された標的分析対象物に結合しないことになる。いくつかの実施形態では、試験ラインに検出可能なシグナルが存在しないことによって結果が陽性であることが示される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物が試料に存在せず、試験ラインに存在する標的分析対象物にプローブが結合することによって結果が陰性であることが示される。いくつかの実施形態では、LFAは、対照ラインにプローブ捕捉部分を含み、このプローブ捕捉部分は、プローブと直接的に相互作用するものであり、標的分析対象物が試料に存在するか否かを問わず、プローブは、プローブ捕捉部分に結合し、対照ラインに蓄積することができる。いくつかの実施形態では、プローブが対照ラインで捕捉固定化及び検出されることによって、試験が有効であることが示される。いくつかの実施形態では、結果が陽性であること(例えば、試料に標的分析対象物が存在すること)は、試験ライン及び対照ラインにおける検出可能なシグナルによって示される。いくつかの実施形態では、結果が陰性であることは、対照ラインにおける検出可能なシグナルによって示される。

0243

いくつかの実施形態では、プローブ−分析対象物複合体が試料パッドに加えられ、LFAまたはフロースルーデバイスを通過し、吸収パッドに向かう。いくつかの実施形態では、プローブ−分析対象物複合体に含まれる標的分析対象物が捕捉部分に結合する。いくつかの実施形態では、捕捉部分は、試験ラインまたは試験領域(例えば、フロースルーデバイスにおける試験層)に固定化され、プローブ−分析対象物複合体は、試験ラインまたは試験領域に捕捉固定化される。いくつかの実施形態では、プローブは、比色性であり、プローブ−分析対象物複合体が試験ラインまたは試験領域に蓄積するにつれて、試験ラインまたは試験領域が強い色(例えば、検出可能なシグナル)を呈することになり、これによって結果が陽性であることが示される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物が試料に存在せず、プローブ−分析対象物複合体に含まれるプローブは捕捉部分と相互作用せず、試験ラインが存在しないか、または試験領域にシグナルが存在しないことによって結果が陰性であることが示される。いくつかの実施形態では、LFAは、対照ライン(または例えば、フロースルーアッセイデバイスの対照領域)にプローブ捕捉部分を含み、このプローブ捕捉部分は、プローブ及び/または結合部分と直接的に相互作用するものであり、したがって、標的分析対象物が試料に存在するか否かを問わず、プローブ/結合部分は、プローブ捕捉部分に結合し、対照ラインまたは対照領域に蓄積する。いくつかの実施形態では、プローブ捕捉部分は、結合部分に結合する二次抗体であり、結合部分は、標的分析対象物に結合する一次抗体である。いくつかの実施形態では、プローブが対照ラインまたは対照領域で捕捉固定化及び検出されることによって、試験が有効であることが示される。いくつかの実施形態では、結果が陽性であること(例えば、試料に標的分析対象物が存在すること)は、試験ライン(または試験領域)及び対照ライン(または対照領域)における検出可能なシグナルによって示される。いくつかの実施形態では、結果が陰性であることは、対照ラインまたは対照領域における検出可能なシグナルによって示される。

0244

LFAまたはフロースルー(スポット)アッセイデバイス中の脱水ATPS
いくつかの実施形態では、ATPSもしくはその構成成分及び/またはプローブ及び/または増進試薬は脱水されて、LFAを構成する多孔性マトリックスの少なくとも第1の部分に加えられ、及び/または含められるか、あるいはフロースルーアッセイデバイスの濃縮コンポーネントに含められる。いくつかの実施形態では、デバイスに試料が加えられると、ATPS、及び/またはプローブ及び/または増進試薬(複数可)が水和し、それによってATPSもしくはその構成成分及び/またはプローブ及び/または増進試薬(複数可)が流体相に変換される。使用者に必要なことは、デバイスに試料(例えば、唾液、血液、尿、膣液、精液、痰、脳脊髄液、リンパ液、または同様の流体)を添加することのみになるため、脱水しておくことは、使用者にとってのデバイスの使い勝手を向上させることになり得る。いくつかの実施形態では、使用者に必要なことは、標的分析対象物の存在/非存在を検出ために、または分析対象物を定量化するために、ストリップに試料の溶液を加えることのみである。いくつかの実施形態では、試料の溶液がLFAまたはフロースルーデバイスを通過し、ATPSが再溶解することで、LFAまたはフロースルーデバイスの中で相分離が誘発され、その結果、標的分析対象物が濃縮される。

0245

いくつかの実施形態では、所与のATPSに必要な構成成分はすべて、混合されることで混合溶液を形成し、デバイス(例えば、LFAまたはフロースルー(スポット)アッセイ)を構成するペーパーに加えられ、その後に脱水される。試料溶液が脱水ペーパーに添加されると、試料が流れるにつれてATPS構成成分が再水和し、その結果、相分離が生じる。濃縮された分析対象物を含む相の粘性が低いATPSのいくつかでは、その相は、より速く流れることになり、濃縮分析対象物は、先行流体に生じることになり、LFAまたはフロースルーアッセイの検出ゾーンに到達することで検出が始まることになる。さらに、脱水されたATPS構成成分のセグメント長(または厚さ)及び濃度は、異なる用途ごとに調整することができる。

0246

いくつかの実施形態では、ATPSの構成成分は両方共(すべて)脱水されて、LFAに加えられるか、またはフロースルーアッセイ(例えば、分離コンポーネント)に含められる。いくつかの実施形態では、第1のATPS構成成分が脱水されて、LFAに加えられるか(もしくは含められるか)、またはフロースルーアッセイに含められる。いくつかの実施形態では、第2のATPS構成成分が脱水されて、LFAまたはフロースルーアッセイに加えられるか、または含められる。いくつかの実施形態では、第1の相溶液構成成分及び/または第1のATPS構成成分が脱水されて、LFAの第1の部分に加えられるか、またはフロースルーアッセイの第1の層(分離コンポーネント)に含められる。いくつかの実施形態では、第2の相溶液構成成分及び/または第2のATPS構成成分が、脱水されて、LFAの第2の部分に加えられるか上、またはフロースルーアッセイ(分離コンポーネント)の第2の層に含められる内にで脱水されて含められる脱水される。いくつかの実施形態では、第1の部分と第2の部分とは同一である。いくつかの実施形態では、第1の部分と第2の部分とは異なる。非限定的な例として、PEG−塩ATPSでは、PEG溶液と塩溶液とを別々に脱水し、異なるペーパー部分もしくはセグメントに含めるか(例えば、2015年3月6日に出願された同時係属中のPCT出願第PCT/US2015/019297号(当該文献は、そこに記載のLFA構成を対象として参照によって本明細書に組み込まれる)の図16を参照のこと)、または例えば、フロースルーアッセイの分離コンポーネントを構成する別々の層に含めることができる(例えば、図11を参照のこと)。いくつかの実施形態では、第1の相溶液/第2の相溶液及び/またはATPS構成成分が脱水されて、LFAの異なる部分に加えられるか、またはフロースルーアッセイの異なる層に含められると、第1の相溶液/第2の相溶液の構成成分またはATPS構成成分の濃度の均一性が向上する。いくつかの実施形態では、第1の相溶液/第2の相溶液の構成成分及び/またはATPS構成成分を、脱水して異なる部分に加えることで、第1の相溶液またはATPS構成成分が水和後に第1の方向に流れ、第2の相溶液及び/またはATPS構成成分が水和後に第2の方向に流れるようになり、第1の方向と第2の方向とは、異なるものである。いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、第1の方向に濃縮されるが、第2の方向には濃縮されない。いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、第2の方向に濃縮されるが、第1の方向には濃縮されない。いくつかの実施形態では、第1の相/第2の相の構成成分及び/またはATPS構成成分が脱水されて、異なる部分に加えられると、第1の方向/第2の方向に試料を流す必要がなくなり、第1の方向/第2の方向に標的分析対象物が流れるようになる。いくつかの実施形態では、第1の相/第2の相の構成成分及び/またはATPS構成成分が脱水されて、異なる部分に加えられると、標的分析対象物がより速く流れるようになることで、検出が早まる。いくつかの実施形態では、第1の相/第2の相の構成成分及び/またはATPS構成成分が脱水されて、異なる部分に加えられると、結果の信頼性が向上する。いくつかの実施形態では、第1の相/第2の相の構成成分及び/またはATPS構成成分が脱水されて、異なる部分に加えられると、第1の相溶液/第2の相溶液の構成成分及び/またはATPS構成成分(例えば、PEG−塩ATPS)の凝集が阻止される。いくつかの実施形態では、第1の相/第2の相の構成成分及び/またはATPS構成成分は脱水されて、複数のセグメントに含められる。いくつかの実施形態では、第1の相/第2の相の構成成分及び/またはATPS構成成分は脱水されて、複数のセグメントに含められ、第1の相/第2の相の構成成分及び/またはATPS構成成分は、塩溶液を構成する。いくつかの実施形態では、第1の相/第2の相の構成成分及び/またはATPS構成成分は脱水されて、複数のセグメントに含められ、第1の相/第2の相の構成成分及び/またはATPS構成成分は、ポリマー(例えば、PEG)を含まない。いくつかの実施形態では、脱水されたPEGは、検出ゾーン付近には位置せず、この理由は、PEG高含有相が検出膜内の流れを遅延させ得るためである。いくつかの実施形態では、LFAストリップまたはフロースルーアッセイは、PEGまたは塩を含まないブランクスペーサーを検出ゾーン付近に含み得る。

0247

いくつかの実施形態では、プローブ(例えば、分析対象物結合部分であり、検出試薬/材料と結合される)は、プローブ緩衝液に含めて提供される。いくつかの実施形態では、プローブ緩衝液は脱水されて、LFAに加えられるか、またはフロースルーアッセイに含められる。

0248

いくつかの実施形態では、ATPS構成成分が脱水されると、ATPS構成成分が液体形態で添加されるデバイスと比較して、検出限界が改善する。いくつかの実施形態では、液体形態のATPS構成成分が添加されると、対象に由来する試料溶液が希釈される。いくつかの実施形態では、ATPS構成成分が脱水されると、流れの過程で、異なる第1の相溶液及び/または異なる第2の相溶液が生じるようになることで、試験ラインもしくは対照ラインまたはフロースルーアッセイの検出コンポーネントに到達することになる先行流体の前部に位置する小さな体積部に標的分析対象物またはプローブ−分析対象物複合体が濃縮される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物及びまたはプローブ−分析対象物複合体が先行流体の前部に濃縮されると、検出に必要な時間が短縮されることになる。

0249

プローブ
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の系及び/またはデバイス、及び/または本明細書に記載の方法では、プローブが利用され、プローブは、標的分析対象物に結合することでプローブ−分析対象物複合体を形成する結合部分を含む。

0250

いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、単独で第1の相溶液もしくは第2の相溶液、または第1の相溶液と第2の相溶液との界面に優先的に分配される。いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、単独で第1の相溶液もしくは第2の相溶液、または第1の相溶液と第2の相溶液との界面に極度に分配される。

0251

いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、単独で第1の相溶液もしくは第2の相溶液、または第1の相溶液と第2の相溶液との界面に優先的に分配されない。いくつかの実施形態では、標的分析対象物は、単独で第1の相溶液もしくは第2の相溶液、または第1の相溶液と第2の相溶液との界面に極度に分配されない。

0252

いくつかの実施形態では、プローブ−分析対象物複合体は、第1の相溶液もしくは第2の相溶液、または第1の相溶液と第2の相溶液との界面に優先的に分配され、それによって(プローブ−分析対象物複合体に含まれる)標的分析対象物が、第1の相溶液もしくは第2の相溶液、または第1の相溶液と第2の相溶液との界面に優先的に分配されるようになる。

0253

いくつかの実施形態では、プローブ−分析対象物複合体は、第1の相溶液もしくは第2の相溶液、または第1の相溶液と第2の相溶液との界面に極度に分配され、それによって(プローブ−分析対象物複合体に含まれる)標的分析対象物が、第1の相溶液もしくは第2の相溶液、または第1の相溶液と第2の相溶液との界面に極度に分配されるようになる。

0254

いくつかの実施形態では、「優先的に分配される」という語句は、ATPSの第1の相溶液/第2の相溶液への標的分析対象物(またはプローブ−分析対象物複合体)の分配に関して使用されるとき、ATPSの別の相溶液と比較して、優先する相溶液により多くの量の標的分析対象物が含まれるようになることを示す。

0255

いくつかの実施形態では、「極度に分配される」という語句は、ATPSの第1の相溶液/第2の相溶液への標的分析対象物(またはプローブ−分析対象物複合体)の分配に関して使用されるとき、ATPSの別の相溶液と比較して、優先する相溶液に約90%以上の標的分析対象物が含まれるようになることを示す。

0256

いくつかの実施形態では、より多くの量の標的分析対象物が第1の相溶液に分配される。いくつかの実施形態では、約50%超、または約55%超、または約60%超、または約65%超、または約70%超、または約75%超、または約80%超、または約85%超、または約90%超、または約95%超、または約98%超、または約99%超の標的分析対象物が第1の相溶液に分配される。いくつかの実施形態では、約99%超、または約99.1%超、または約99.2%超、または約99.3%超、または約99.4%超、または約99.5%超、または約99.6%超、または約99.7%超、または約99.8%超、または約99.9%超の標的分析対象物が第1の相溶液に分配される。

0257

いくつかの実施形態では、より多くの量の分析対象物が第2の相溶液に分配される。いくつかの実施形態では、約50%超、または約55%超、または約60%超、または約65%超、または約70%超、または約75%超、または約80%超、または約85%超、または約90%超、または約95%超、または約98%超、または約99%超の標的分析対象物が第2の相溶液に分配される。いくつかの実施形態では、約99%超、または約99.1%超、または約99.2%超、または約99.3%超、または約99.4%超、または約99.5%超、または約99.6%超、または約99.7%超、または約99.8%超、または約99.9%超の標的分析対象物が第2の相溶液に分配される。

0258

いくつかの実施形態では、より多くの量の分析対象物が、第1の相溶液と第2の相溶液との界面に分配される。いくつかの実施形態では、約50%超、または約55%超、または約60%超、または約65%超、または約70%超、または約75%超、または約80%超、または約85%超、または約90%超、または約95%超、または約98%超、または約99%超の標的分析対象物が界面に分配される。いくつかの実施形態では、約99%超、または約99.1%超、または約99.2%超、または約99.3%超、または約99.4%超、または約99.5%超、または約99.6%超、または約99.7%超、または約99.8%超、または約99.9%超の標的分析対象物が界面に分配される。

0259

いくつかの実施形態では、デバイスは、1つのプローブ(単一の分析対象物を対象とするプローブ)を含むか、もしくは利用するように構成され、及び/またはデバイスで実施されるアッセイでは、1つのプローブ(単一の分析対象物を対象とするプローブ)が利用される。いくつかの実施形態では、デバイスは、少なくとも2つの異なるプローブ(異なる分析対象物をそれぞれが対象とする)、もしくは少なくとも3つの異なるプローブ、もしくは少なくとも4つの異なるプローブ、もしくは少なくとも5つの異なるプローブ、もしくは少なくとも7つの異なるプローブ、もしくは少なくとも10の異なるプローブ、もしくは少なくとも15の異なるプローブ、もしくは少なくとも20の異なるプローブを含むか、もしくは利用するように構成され、及び/またはデバイスで実施されるアッセイでは、少なくとも2つの異なるプローブ(異なる分析対象物をそれぞれが対象とする)、もしくは少なくとも3つの異なるプローブ、もしくは少なくとも4つの異なるプローブ、もしくは少なくとも5つの異なるプローブ、もしくは少なくとも7つの異なるプローブ、もしくは少なくとも10の異なるプローブ、もしくは少なくとも15の異なるプローブ、もしくは少なくとも20の異なるプローブが利用される。

0260

いくつかの実施形態では、プローブは、合成ポリマー、金属、ミネラル、ガラス、石英、セラミック、生体ポリマー、プラスチック、及び/またはそれらの組み合わせのうちの1つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン(DELRIN(登録商標))、ポリテトラフルオロエチレン(TEFLON(登録商標))、デキストラン、及びポリ塩化ビニルを含むポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ポリエチレンは、ポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、ポリプロピレンは、ポリプロピレングリコールである。いくつかの実施形態では、プローブは、コラーゲン、セルロース、及び/またはキチンのうちの1つまたは複数を含む生体ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、プローブは、金属(例えば、金、銀、白金、パラジウム、セリウム、チタン、ステンレススチールアルミニウム、またはそれらの合金のうちの1つまたは複数を含むもの)を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、ナノ粒子(例えば、金ナノ粒子、銀ナノ粒子など)を含む。

0261

いくつかの実施形態では、プローブは、コーティングをさらに含む。いくつかの実施形態では、コーティングは、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、コーティングは、ポリプロピレンを含む。いくつかの実施形態では、コーティングは、ポリプロピレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、コーティングは、デキストランを含む。いくつかの実施形態では、コーティングは、親水性タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、コーティングは、血清アルブミンを含む。いくつかの実施形態では、コーティングは、第1の相溶液または第2の相溶液に対する親和性を有する。

0262

いくつかの実施形態では、試料に含まれる標的分析対象物の量は非常に少なく、その結果、LFAまたはフロースルーアッセイによる検出が可能なように分析対象物を十分に濃縮する必要がある。ある特定の実施形態では、十分な濃縮は、界面で達成されるものであり、この理由は、分析対象物の濃縮度は、その分析対象物が分配または濃縮される相の体積に依存し、界面の「体積」は、バルク相と比較して非常に小さいためである。

0263

いくつかの実施形態では、プローブは、標的分析対象物が界面に向かって誘導されるように、界面に優先的に(または極度に)分配される。いくつかの実施形態では、プローブは、その界面化学に起因して界面に優先的に(または極度に)分配され、界面化学は、プローブが界面に誘導されるように最適化される。非限定的な例として、ポリエチレングリコール−リン酸カリウム(PEG/塩)系などのポリマー−塩ATPS系の界面にプローブ−分析対象物複合体を誘導するために、プローブは、PEGに複合化(すなわちPEG化される)されることでPEG高含有相とのPEG間相互作用を促進し、及び/または親水性タンパク質で修飾されることでPEG低含有相との親水性相互作用を促進する。特異的な抗体、または標的に結合する他の分子で修飾されたそのような最適化プローブを使用すると、標的分析対象物が捕捉され、界面に収集される。界面の体積は非常に小さいため、分析対象物は高度に濃縮され、その後のLFA、またはフロースルーアッセイの検出領域に加えられる。

0264

いくつかの実施形態では、PEG/塩ATPSの界面に分配されることができる金ナノプローブ(GNP)が調製され、操作条件は、相分離時間が短縮され、GNP/分析対象物が非常に高度に回収されるように最適化される。

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